JP2023052236A - 新規ｖｉ型ｃｒｉｓｐｒオルソログ及び系 - Google Patents

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Feng Zhang
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Abstract

【課題】新規ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と、ガイドＲＮＡのような少なくとも１つのターゲティング核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたＲＮＡターゲティング系を提供する。【解決手段】真核細胞、好ましくは哺乳類細胞の目的の標的遺伝子座を改変する方法であって、任意選択で１つ以上の局在化シグナルに融合されたＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と、１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、少なくとも前記１つ以上の核酸成分は、エンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分は、複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質は、前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体は、前記目的の標的遺伝子座に結合する、方法である。【選択図】なし

Description

関連出願及び参照による援用
本願は、２０１７年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／４８４，７９１号明細書、２０１７年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／５６１，６６２号明細書及び２０１７年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６２／５６８，１２９号明細書に対する優先権を主張し、これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される。
２０１６年１０月２１日に出願された、特に米国を指定国とする出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０５８３０２号明細書を含むＰＣＴ出願が参照される。２０１５年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／２４５，２７０号明細書、２０１６年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／２９６，５４８号明細書並びに２０１６年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／３７６，３６７号明細書及び同第６２／３７６，３８２号明細書が参照される。更に、２０１７年３月１５日に出願された米国特許出願第６２／４７１，７９２号明細書が参照される。更に、２０１７年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４７１，１７０号明細書が参照される。更に、２０１７年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／４８４，７９１号明細書が参照される。更に、２０１７年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／５６１，６６２号明細書が参照される。Ｓｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），“Ｃａｓ１３ｂ Ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６５，６１８－６３０（Ｆｅｂ．１６，２０１７）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．１２．０２３．Ｅｐｕｂ Ｊａｎ ５，２０１７及びＳｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），“Ｃａｓ１３ｂ Ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８”，ｂｉｏＲｘｉｖ ０９２５７７；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０９２５７７．Ｐｏｓｔｅｄ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ９，２０１７が挙げられる。前述の出願及び文献引用の各々は、本明細書によって参照により本明細書に援用される。
本明細書に引用される文献中で引用又は参照される全ての文献は、本明細書で言及されるか又は本明細書に参照によって援用される任意の文献中にある任意の製品に関する任意の製造者の指示書、説明書、製品仕様書及びプロダクトシートと共に、本明細書によって参照により本明細書に援用され、且つ本発明の実施に用いられ得る。より具体的には、参照される全ての文献は、各個別の文献について参照によって援用されることが具体的且つ個別に指示されたものとするのと同程度に参照によって援用される。
連邦政府支援研究に関する記載事項
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から付与された助成金第ＭＨ１００７０６号及び第ＭＨ１１００４９号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、概して、遺伝子転写物の摂動又は核酸編集など、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）及びその構成成分に関するベクター系を使用し得る配列ターゲティングを含む遺伝子発現の制御に用いられる系、方法及び組成物に関する。
ゲノムシーケンシング技法及び解析方法の最近の進歩により、様々な生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子をカタログ化し及びマッピングする能力が急速に向上している。個々の遺伝エレメントを選択的に摂動させることによる原因遺伝的変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能にすると共に合成生物学、バイオテクノロジー的及び医学的応用を進歩させるには、正確なゲノムターゲティング技術が必要である。標的化したゲノム摂動を生じさせるためにデザイナージンクフィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）又はホーミングメガヌクレアーゼなどのゲノム編集技法が利用可能であるものの、新規戦略及び分子機構を利用し、及び安価で、セットアップし易く、スケーリングが可能であり、且つ真核生物ゲノム及びトランスクリプトーム内の複数の位置を標的化するのに適した新規のゲノム及びトランスクリプトームエンジニアリング技術が依然として必要とされている。それは、ゲノムエンジニアリング及びバイオテクノロジーにおける新規適用の主要なリソースとなるであろう。
細菌及び古細菌適応免疫のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、タンパク質組成及びゲノム遺伝子座構成に関して極めて高度な多様性を示す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系遺伝子座は、５０を超える遺伝子ファミリーを有し、厳密な意味で普遍的な遺伝子はないことから、急速な進化及び遺伝子座構成の極めて高度な多様性が示唆される。これまでのところ、多方向からの手法をとることにより、９３個のＣａｓタンパク質について約３９５個のプロファイルのｃａｓ遺伝子が包括的に同定されている。分類に含まれるのは、シグネチャ遺伝子プロファイル＋遺伝子座構成のシグネチャである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の新規分類が提案されており、ここで、これらの系は、大まかに２つのクラス、マルチサブユニットエフェクター複合体を有するクラス１と、Ｃａｓ９タンパク質に例示される単一サブユニットエフェクターモジュールを有するクラス２とに分けられる。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に関連する新規エフェクタータンパク質は、強力なゲノムエンジニアリングツールとして開発することができ、推定上の新規エフェクタータンパク質の予測並びにそれらのエンジニアリング及び最適化が重要である。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ適応免疫系は、微生物をＤＮＡ又はＲＮＡ－ＤＮＡ干渉によって外来遺伝要素から防御する。クラス２ ＶＩ型単一成分ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターは、ＲＮＡを標的化する。１つのそのようなものは、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２としても知られる：Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ”；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０：１－１３；ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８を参照されたい）であり、これは、ＲＮＡガイド下ＲＮアーゼとして特徴付けられた（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］，Ｊｕｎｅ ２；“Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ”；ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３）。現在の分類では、Ｃａｓ１３ａは、クラス２ ＶＩ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。他の選択肢は、Ｃａｓ１３ｂ、クラス２ ＶＩ－Ｂ型エフェクタータンパク質によって提供される。クラス２ ＶＩ－Ｂ型エフェクタータンパク質は、２つのサブグループ、グループ２９タンパク質及びグループ３０タンパク質とも称されるＶＩ－Ｂ１型及びＶＩ－Ｂ２型を含み、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼである、ＲＮＡ干渉性の且つＲＮＡファージに対する細菌性養子免疫に関わり得るメンバーを含む。（Ｓｍａｒｇｏｎ Ａ ｅｔ ａｌ．“Ｃａｓ１３ｂ ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡｓｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，ｏｎｌｉｎｅ Ｊａｎｕａｒｙ ５，２０１７．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．１２．０２３を参照されたい）。
グループ２９及びグループ３０系は、Ｃａｓ１３ｂと呼ばれる大型のシングルエフェクター（約１１００アミノ酸長）を含み、且つＣＲＩＳＰＲアレイに隣接して２つの低分子推定アクセサリータンパク質（約２００アミノ酸長、Ｃｓｘ２７及びＣｓｘ２８と呼ばれる）の一方を含むもの又はそのいずれも含まないものである。この隣接低分子タンパク質に基づき、この系は、ＶＩ－Ｂ１型（Ｃｓｘ２７）又はＶＩ－Ｂ２型（Ｃｓｘ２８）に分類される。アレイから上流又は下流に２５キロベース対まで、各遺伝子座を有する種間で保存されている追加的なタンパク質はない。僅かな例外はあるが、ＣＲＩＳＰＲアレイは、ダイレクトリピート配列３６ヌクレオチド長及びスペーサー配列３０ヌクレオチド長を含む。ダイレクトリピートは、概して良く保存されており、特に末端で良く保存され、５’末端のＧＴＴＧ／ＧＵＵＧは、３’末端のＣＡＡＣと逆相補的である。この保存は、遺伝子座内のタンパク質と相互作用する可能性のあるＲＮＡループ構造に向かう強力な塩基対合を示唆している。ダイレクトリピートに相補的なモチーフ検索から、アレイに隣接した候補ｔｒａｃｒＲＮＡは明らかになっておらず、Ｃｐｆ１遺伝子座に見られるような単一のｃｒＲＮＡを示すものである。
本願における任意の文献の引用又は特定は、かかる文献が本発明の先行技術として利用可能であることを承認するものではない。
多岐にわたる適用、詳細には真核生物系、より詳細には哺乳類系における適用を有し、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はこれらの任意のハイブリッド若しくは誘導体）を標的化するための代替的且つロバストなシステム及び技法が喫緊に必要とされている。本発明は、この必要性に応え、関連する利点を提供する。本願の新規ＲＮＡターゲティング系がゲノム、トランスクリプトーム及びエピゲノムターゲティング技術のレパートリーに加わることにより、詳細には真核生物系、より詳細には哺乳類系（細胞、器官、組織又は生物を含む）における、直接的な検出、分析及び操作を通じた特定の標的部位の研究及び摂動又は編集が変わり得る。本願のＲＮＡターゲティング系を有害作用なしにＲＮＡターゲティングに有効に利用するには、これらのＲＮＡターゲティングツールのエンジニアリング及び最適化の側面を理解することが決定的に重要である。
クラス２ ＶＩ－Ｂ型エフェクタータンパク質Ｃａｓ１３ｂは、ｓｓＲＮＡを分解するように効率的にプログラムすることのできるＲＮＡ誘導型ＲＮアーゼである。本発明者らは、スクリーニングを行って、異なる種からの代表的な幾つものＣａｓ１３ｂオルソログを特定し、真核細胞環境におけるそれらのオルソログの有効性を決定した。様々な実施形態において、本発明は、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質又はＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質並びにかかるタンパク質をコードする核酸を参照するか、それを含むか、又はそれを利用する。
一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、リエメレラ属（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ）、バージイエラ属（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ）、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）、ミロイデス属（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ）、キャプノサイトファーガ属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）及びフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される原核生物の野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超えて相同又は同一である。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、バクテロイデス・ピオゲネス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、プレボテラ・ブッカエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｅ）、アリスティペス属種（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｐ．）、プレボテラ・アウランティアカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ミロイデス・オドラティミマス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ ｏｄｏｒａｔｉｍｉｍｕｓ）、キャプノサイトファーガ・カニモルサス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ）、フラボバクテリウム・ブランキオフィルム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ）及びフラボバクテリウム・コルムナレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）からなる群から選択される原核生物の野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超えて相同又は同一である。好ましい実施形態において、エフェクタータンパク質は、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０５３４４４４１７）、ポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ－０５２ ＯＨ４９４６ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４２８９６８）、バクテロイデス・ピオゲネス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３４５４２２８１）、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿００４９１９７５５）からなる群から選択される野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超えて相同又は同一である。最も好ましいエフェクタータンパク質は、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０５３４４４４１７）、ポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ－０５２ ＯＨ４９４６ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４２８９６８）からなる群から選択される野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超えて相同又は同一のものであり、及び最も特別に好ましいのは、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）又はプレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）である。これらのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質の各々及び他の完全なアミノ酸配列を図１に提供する。
一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、（ａ）９００～１８００アミノ酸及び２つのＨＥＰＮドメインを含み、（ｂ）原核生物ゲノムにおいてＣＲＩＳＰＲアレイの上流又は下流１０ｋｂ以内に天然に存在し、（ｃ）ＣＲＩＳＰＲアレイの上流又は下流１０ｋｂ以内に７００アミノ酸超を含む唯一のコードされるタンパク質であり、及び／又は（ｄ）ＣＲＩＳＰＲアレイの上流又は下流１０ｋｂ以内にＣａｓ１遺伝子又はＣａｓ２遺伝子がない。一部の実施形態において、Ｃｓｘ２７又はＣｓｘ２８の少なくとも一方もＣＲＩＳＰＲアレイの上流又は下流１０ｋｂ以内に存在する。
特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、野生型タンパク質と比較したとき、改変配列を有する。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、２つ以上のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質で共有される少なくとも１つ以上の共通モチーフにおいて野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と同一である。共通モチーフは、コンセンサス配列を同定するための標準的な配列アラインメントツールによって決定され得る。詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ＤＫＨＸＦＧＡＦＬＮＬＡＲＨＮ（配列番号１）、ＧＬＬＦＦＶＳＬＦＬＤＫ（配列番号２）、ＳＫＩＸＧＦＫ（配列番号３）、ＤＭＬＮＥＬＸＲＣＰ（配列番号４）、ＲＸＺＤＲＦＰＹＦＡＬＲＹＸＤ（配列番号５）及びＬＲＦＱＶＢＬＧＸＹ（配列番号６）からなる配列の１つ以上と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質である。更なる詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、これらの配列の少なくとも２、３、４、５つ又は６つ全てと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。更なる詳細な実施形態において、これらの配列との配列同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である。更なる詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ＧＬＬＦＦＶＳＬＦＬ（配列番号７）及びＲＨＱＸＲＦＰＹＦ（配列番号８）と１００％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質である。更なる詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクターは、ＲＨＱＤＲＦＰＹ（配列番号９）と１００％の配列同一性を有する配列を含むＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質である。
用語のＣａｓ酵素、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、Ｃａｓタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓは、概して同義的に用いられ、Ｃａｓ９に具体的に言及することによるなど、特に明らかでない限り、本明細書で言及する際、常に類推から本願に更に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を指すことが理解されるであろう。
本発明の実施形態において、ＶＩ－Ｂ型系は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と、任意選択で、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質の上流又は下流にコードされる低分子アクセサリータンパク質とを含む。特定の実施形態において、低分子アクセサリータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂエフェクターがＲＮＡを標的化する能力を増強する。
本発明の特定の実施形態において、ＶＩ－Ｂ型系は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と、任意選択で、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質の上流又は下流にコードされる低分子アクセサリータンパク質とを含む。特定の実施形態において、低分子アクセサリータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂエフェクターがＲＮＡを標的化する能力を抑制する。
本発明は、ｉ）ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質と、ｉｉ）ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｃｒＲＮＡであって、ａ）標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする能力を有するガイド配列、及びｂ）ダイレクトリピート配列を含むｃｒＲＮＡとを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供する。ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ｃｒＲＮＡと複合体を形成し、及びガイド配列は、複合体による標的ＲＮＡ配列への配列特異的結合を導き、それにより、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体化したＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体が形成される。ガイド配列が標的ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズすると形成される複合体は、プロトスペーサーフランキング配列（ＰＦＳ）の相互作用（認識）を含む。
一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質活性を増強するＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓアクセサリータンパク質を含み得る。特定のかかる実施形態において、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質活性を増強するアクセサリータンパク質は、ｃｓｘ２８タンパク質である。かかる実施形態において、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質とＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓアクセサリータンパク質とは、同じ供給源由来又は異なる供給源由来であり得る。
一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質活性を抑制するＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓアクセサリータンパク質を含む。特定のかかる実施形態において、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質活性を抑制するアクセサリータンパク質は、ｃｓｘ２７タンパク質である。かかる実施形態において、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質とＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓアクセサリータンパク質とは、同じ供給源由来又は異なる供給源由来であり得る。
一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、２つ以上のＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｃｒＲＮＡを含む。
一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、原核細胞の標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズするガイド配列を含む。一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、真核細胞の標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズするガイド配列を含む。本明細書に提供されるとおりのＣＲＩＳＰＲ系は、ｃｒＲＮＡ又はガイド配列を含む類似のポリヌクレオチドを利用することができ、このポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡとの混合物であり、及び／又はこのポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチド類似体を含む。この配列は、限定はされないが、バルジ、ヘアピン又はステムループ構造などの天然ｃｒＲＮＡの構造を含め、任意の構造を含むことができる。特定の実施形態において、ガイド配列を含むポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列であり得る第２のポリヌクレオチド配列と二重鎖を形成する。
特定の実施形態において、本方法は、化学的に改変されたガイドＲＮＡを利用する。ガイドＲＮＡ化学的改変の例としては、限定なしに、１つ以上の末端ヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）又は２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の取り込みが挙げられる。かかる化学的に改変されたガイドＲＮＡは、非改変ガイドＲＮＡと比較したとき、安定性の増加及び活性の増加を含み得るが、オンターゲット対オフターゲット特異性は、予測不可能である（Ｈｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５－９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ｊｕｎｅ ２０１５を参照されたい）。化学的に改変されたガイドＲＮＡとしては、限定なしに、ホスホロチオエート結合を含むＲＮＡ及びリボース環の２’炭素と４’炭素との間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドが更に挙げられる。
一部の実施形態において、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。
Ｃａｓ１３ｂは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に見られる他の公知のＲＮアーゼの触媒機構と対照的に、その２つのＨＥＰＮドメイン内にある保存された塩基性残基によってＲＮＡ切断を実現する。４つの予測ＨＥＰＮドメイン触媒残基のいずれかの（例えば、アラニン）置換などのＨＥＰＮドメインの突然変異は、Ｃａｓ１３ｂを不活性プログラム可能ＲＮＡ結合タンパク質（ｄＣａｓ９に類似するｄＣａｓ１３ｂ）に変換することができる。
ｄＣａｓ１３ｂが指定した配列に結合可能であれば、その能力を本発明に係る幾つかの態様に用いることにより、（ｉ）エフェクターモジュールを特異的転写物に持ち込んで機能又は翻訳を調節し（これは、大規模スクリーニング、合成調節回路の構築及び他の目的に用い得る可能性がある）、（ｉｉ）特異的ＲＮＡに蛍光タグを付加してその輸送及び／又は局在を可視化し、（ｉｉｉ）特異的細胞内区画に親和性のあるドメインによってＲＮＡ局在を変化させ、及び（ｉｖ）特異的転写物を（ｄＣａｓ１３ｂを直接プルダウンするか、又はｄＣａｓ１３ｂを用いてビオチンリガーゼ活性を特異的転写物に局在させることにより）捕捉してＲＮＡ及びタンパク質を含めた近接分子パートナーをエンリッチすることができる。
活性Ｃａｓ１３ｂにも多くの適用があるはずである。本発明のある態様は、特異的転写物を破壊の標的にすることを含む。加えて、Ｃａｓ１３ｂは、コグネイト標的によってプライミングされると、インビトロで他の（非相補的）ＲＮＡ分子を切断することができ、且つインビボで細胞成長を阻害することができる。生物学的には、この雑多なＲＮアーゼ活性は、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のプログラム細胞死／休眠（ＰＣＤ／Ｄ）に基づく防御機構を反映し得る。従って、本発明のある態様では、それは、特異的細胞 － 例えば、特定の転写物を発現する癌細胞、所与のクラスのニューロン、特異的病原体に感染した細胞又は他の異常な細胞若しくはその存在が他に望ましくない細胞にＰＣＤ又は休眠を惹起するために使用し得る可能性がある。
本発明は、目的の標的遺伝子座、詳細には真核細胞、組織、器官又は生物、より詳細には哺乳類細胞、組織、器官又は生物の目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある核酸配列を改変する方法を提供し、この方法は、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで、エフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は、鎖切断の導入である。好ましい実施形態において、目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列は、ＲＮＡを含み、及びエフェクタータンパク質は、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座によってコードされる。複合体は、インビトロ又はエキソビボで形成されて細胞に導入されるか、又はＲＮＡと接触されるか、又はインビボで形成され得る。
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列を標的化（改変など）する方法を提供し、この方法は、Ｃａｓ１３ｂ遺伝子座エフェクタータンパク質（これは、触媒活性又は代わりに触媒不活性であり得る）と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を、遺伝子座に関連するか又はそこにある前記配列に送達することを含み、ここで、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は、鎖切断の導入である。好ましい実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つの核酸成分、有利にはエンジニアリングされた又は天然に存在しない核酸成分と複合体を形成する。複合体は、インビトロ又はエキソビボで形成されて細胞に導入されるか、又はＲＮＡと接触されるか、又はインビボで形成され得る。目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列の改変の誘導は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質－核酸ガイド下であり得る。好ましい実施形態において、１つの核酸成分は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である。好ましい実施形態において、１つの核酸成分は、成熟ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡであり、ここで、成熟ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡは、スペーサー配列（又はガイド配列）及びダイレクトリピート配列又はこれらの誘導体を含む。好ましい実施形態において、スペーサー配列又はその誘導体は、シード配列を含み、ここで、シード配列は、標的遺伝子座における配列の認識及び／又はそれとのハイブリダイゼーションに決定的に重要である。
本発明の態様は、１つ以上の天然に存在しない、又はエンジニアリングされた、又は改変された、又は最適化された核酸成分を有するＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体に関する。好ましい実施形態において、この複合体の核酸成分は、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含むことができ、ここで、ダイレクトリピート配列は、１つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を含む。一実施形態において、ダイレクトリピート配列は、約３６ヌクレオチド長であり得る。具体的な実施形態において、ダイレクトリピートは、５’末端に３’末端のＣＡＡＣと逆相補的なＧＴＴＧ／ＧＵＵＧを含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピートは、１６ｎｔ、例えば少なくとも２８ｎｔの最小長さ及び単一のステムループを有する。更なる実施形態において、ダイレクトリピートは、長さが１６ｎｔより長く、好ましくは１７ｎｔより長く、例えば少なくとも２８ｎｔであり、且つ２つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を有する。詳細な実施形態において、ダイレクトリピートは、２５ｎｔ以上、例えば２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ以上及び１つ以上のステムループ構造を有する。好ましい実施形態において、ダイレクトリピートは、１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含むように改変され得る。好ましい実施形態において、ダイレクトリピートは、１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含むように改変され得る。好ましい実施形態において、１つ以上のアプタマーは、最適化された二次構造の一部として含まれ得る。かかるアプタマーは、バクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。バクテリオファージコートタンパク質は、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、ＭＳ２、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１を含む群から選択され得る。好ましい実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質は、ＭＳ２である。本発明は、３０以上、４０以上又は５０以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分も提供する。
本発明は、一過性に発現するか又は導入されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、及び／又はガイド、及び／又はその複合体を含む細胞を含め、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、及び／又はガイド、及び／又は標的核酸とのその複合体を含む細胞を提供する。特定の実施形態において、この細胞は、限定はされないが、酵母細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞又はヒト細胞を含めた真核細胞である。
本発明は、目的の標的遺伝子座、詳細には真核細胞、組織、器官又は生物、より詳細には哺乳類細胞、組織、器官又は生物の目的の標的遺伝子座を改変する方法も提供し、この方法は、Ｃａｓ１３ｂ遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は、鎖切断の導入である。複合体は、インビトロ又はエキソビボで形成されて細胞に導入されるか、又はＲＮＡと接触されるか、又はインビボで形成され得る。
かかる方法において、目的の標的遺伝子座は、ＲＮＡ分子内に含まれ得る。また、目的の標的遺伝子座は、ＤＮＡ分子内及び特定の実施形態では転写されたＤＮＡ分子内に含まれ得る。かかる方法において、目的の標的遺伝子座は、インビトロで核酸分子に含まれ得る。
かかる方法において、目的の標的遺伝子座は、細胞内、詳細には真核細胞、例えば哺乳類細胞又は植物細胞内の核酸分子に含まれ得る。哺乳類細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類又はマウス細胞であり得る。細胞は、家禽、魚類又はエビなどの非哺乳類真核細胞であり得る。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ又はコメなどの作物植物であり得る。植物細胞は、藻類、樹木又は野菜でもあり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生向上のため細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。
哺乳類細胞は、非ヒト哺乳動物、例えば霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、げっ歯類、ウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ）、例えばサル、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット又はマウス細胞であり得る。細胞は、非哺乳類真核細胞、例えば家禽類のトリ（例えば、ニワトリ）、脊椎動物魚類（例えば、サケ）又は甲殻類（例えば、カキ、ハマグリ、ロブスター、エビ）細胞であり得る。細胞は、植物細胞でもあり得る。植物細胞は、単子葉植物又は双子葉植物のもの又は作物又は穀物植物のもの、例えばキャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、ダイズ、コムギ、オートムギ又はコメであり得る。植物細胞は、藻類、樹木又は生産植物、果実又は野菜のもの（例えば、柑橘類の木、例えばオレンジ、グレープフルーツ又はレモンの木などの木；モモ又はネクタリンの木；リンゴ又はセイヨウナシの木；アーモンド又はクルミ又はピスタチオの木などの堅果類の木；ナス科植物；アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物；アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物；ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココア等）でもあり得る。
本発明は、目的の標的遺伝子座を改変する方法を提供し、この方法は、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで、エフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は、鎖切断の導入である。
本発明は、目的の標的遺伝子座を改変する方法も提供し、この方法は、Ｃａｓ１３ｂ遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は、鎖切断の導入である。
かかる方法において、目的の標的遺伝子座は、インビトロで核酸分子に含まれ得る。かかる方法において、目的の標的遺伝子座は、細胞内の核酸分子に含まれ得る。好ましくは、かかる方法において、目的の標的遺伝子座は、インビトロでＲＮＡ分子に含まれ得る。また好ましくは、かかる方法において、目的の標的遺伝子座は、細胞内のＲＮＡ分子に含まれ得る。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞は、哺乳類細胞であり得る。細胞は、げっ歯類細胞であり得る。細胞は、マウス細胞であり得る。
記載される方法の任意のものにおいて、目的の標的遺伝子座は、目的のゲノム又はエピゲノム遺伝子座であり得る。記載される方法の任意のものにおいて、複合体は、多重化した使用向けに複数のガイドと共に送達され得る。記載される方法の任意のものにおいて、２つ以上のタンパク質が用いられ得る。
本発明の更なる態様において、核酸成分は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を含み得る。限定なしに、本出願人らは、かかる例において、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡが、成熟ｃｒＲＮＡを生じさせるプロセシング及びエフェクタータンパク質へのｃｒＲＮＡのローディングに十分な二次構造を含み得ると仮定する。例として及び限定ではなく、かかる二次構造は、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ内、より詳細にはダイレクトリピート内にあるステムループを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。
記載される方法の任意のものにおいて、エフェクタータンパク質及び核酸成分は、そのタンパク質及び／又は核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供され得、ここで、１つ以上のポリヌクレオチド分子は、タンパク質及び／又は核酸成分を発現するように作動可能に構成されている。１つ以上のポリヌクレオチド分子は、タンパク質及び／又は核酸成分を発現するように作動可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含み得る。１つ以上のポリヌクレオチド分子は、１つ以上のベクター内に含まれ得る。記載される方法のいずれにおいても、目的の標的遺伝子座は、目的のゲノム又はエピゲノム遺伝子座であり得る。記載される方法のいずれにおいても、複合体は、多重化用途のため複数のガイドを伴って送達され得る。記載される方法のいずれにおいても、２つ以上のタンパク質が用いられ得る。
調節エレメントは、誘導性プロモーターを含み得る。ポリヌクレオチド及び／又はベクター系は、誘導性系を含み得る。
記載される方法の任意のものにおいて、１つ以上のポリヌクレオチド分子が送達系に含まれ得るか、又は１つ以上のベクターが送達系に含まれ得る。
記載される方法の任意のものにおいて、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、リポソーム、ナノ粒子を含む粒子、エキソソーム、微小胞、遺伝子銃又は１つ以上のウイルスベクターによって送達され得る。
本発明は、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供する。
特定の実施形態において、従って、本発明は、特に目的の標的遺伝子座を改変する能力を有するか又は改変するように構成されている組成物など、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供し、前記組成物は、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含み、ここで、エフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂ遺伝子座エフェクタータンパク質であり得る。
本発明は、更なる態様において、特に目的の標的遺伝子座を改変する能力を有するか又は改変するように構成されている組成物など、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供し、前記組成物は、（ａ）ガイドＲＮＡ分子（又は多重化のためなどのガイドＲＮＡ分子の組み合わせ、例えば第１のガイドＲＮＡ分子及び第２のガイドＲＮＡ分子）又はガイドＲＮＡ分子をコードする核酸（又はガイドＲＮＡ分子の組み合わせをコードする１つ以上の核酸）、（ｂ）ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質又はＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質をコードする核酸を含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂ遺伝子座エフェクタータンパク質であり得る。
本発明は、更なる態様において、（ａ）ガイドＲＮＡ分子（又はガイドＲＮＡ分子の組み合わせ、例えば第１のガイドＲＮＡ分子及び第２のガイドＲＮＡ分子）又はガイドＲＮＡ分子をコードする核酸（又はガイドＲＮＡ分子の組み合わせをコードする１つ以上の核酸）、（ｂ）Ｃａｓ１３ｂ遺伝子座エフェクタータンパク質を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供する。
本発明は、１つ以上のベクターを含むベクター系も提供し、この１つ以上のベクターは、本明細書に記載される方法に定義されるとおりの特徴を有する組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。
本発明は、１つ以上のベクター又は１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む送達系も提供し、この１つ以上のベクター又はポリヌクレオチド分子は、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。
本発明は、療法的治療方法に用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター若しくは送達系も提供する。療法的治療方法には、遺伝子若しくはトランスクリプトーム編集又は遺伝子療法が含まれ得る。
本発明は、エフェクタータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基が改変され得る方法及び組成物、例えばエンジニアリングされた又は天然に存在しないエフェクタータンパク質又はＣａｓ１３ｂも提供する。ある実施形態において、改変は、エフェクタータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の突然変異を含み得る。１つ以上の突然変異は、エフェクタータンパク質の１つ以上の触媒活性ドメインにあり得る。このエフェクタータンパク質は、前記１つ以上の突然変異を欠くエフェクタータンパク質と比較してヌクレアーゼ活性が低下又は消失し得る。このエフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座におけるＲＮＡ鎖の切断を誘導しないことがあり得る。好ましい実施形態において、１つ以上の突然変異は、２つの突然変異を含み得る。好ましい実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、例えばエンジニアリングされた又は天然に存在しないエフェクタータンパク質又はＣａｓ１３ｂにおいて１つ以上のアミノ酸残基が改変される。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、以下の突然変異：Ｒ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ、Ｈ１１８２Ａの１つ以上（ここで、アミノ酸位置は、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）ＡＴＣＣ ４３７６７に由来するＣａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する）、例えばＲ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｒ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ及びＲ１１７７Ａ、Ｒ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｒ１１６Ａ、Ｒ１１７７Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｒ１１６Ａ及びＨ１２１Ａ、Ｒ１１６Ａ及びＲ１１７７Ａ、Ｒ１１６Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｈ１２１Ａ及びＲ１１７７Ａ、Ｈ１２１Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｒ１１７７Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｒ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ、Ｈ１１８２Ａを含む。当業者は、異なるＣａｓ１３ｂタンパク質における対応するアミノ酸位置を同じ効果となるように突然変異させ得ることを理解するであろう。特定の実施形態において、突然変異Ｒ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ、Ｈ１１８２Ａの１つ以上、例えばＲ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｒ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ及びＲ１１７７Ａ、Ｒ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｒ１１６Ａ、Ｒ１１７７Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｒ１１６Ａ及びＨ１２１Ａ、Ｒ１１６Ａ及びＲ１１７７Ａ、Ｒ１１６Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｈ１２１Ａ及びＲ１１７７Ａ、Ｈ１２１Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｒ１１７７Ａ及びＨ１１８２Ａ、Ｒ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ、Ｈ１１８２Ａは、タンパク質の触媒活性を完全に又は部分的に消失させる（例えば、切断速度の変化、特異性の変化等）。特定の実施形態において、ここで、アミノ酸位置は、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５に由来するＣａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応し、エフェクタータンパク質は、Ｈ１３３Ａ及びＨ１０５８Ａ突然変異を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのエフェクタータンパク質は、デッドＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質（即ちｄＣａｓ１３ｂ）など、「デッド」エフェクタータンパク質である。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＨＥＰＮドメイン１に１つ以上の突然変異を有する。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＨＥＰＮドメイン２に１つ以上の突然変異を有する。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＨＥＰＮドメイン１及びＨＥＰＮドメイン２に１つ以上の突然変異を有する。エフェクタータンパク質は、１つ以上の異種機能ドメインを含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは、少なくとも２つ以上のＮＬＳドメインを含み得る。１つ以上のＮＬＳドメインは、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）の末端に、又はその近傍に、又はそれに近接して位置し得、及び２つ以上のＮＬＳの場合、それらの２つの各々は、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）の末端に、又はその近傍に、又はそれに近接して位置し得る。１つ以上の異種機能ドメインは、１つ以上の転写活性化ドメインを含み得る。好ましい実施形態において、転写活性化ドメインは、ＶＰ６４を含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは、１つ以上の転写抑制ドメインを含み得る。好ましい実施形態において、転写抑制ドメインは、ＫＲＡＢドメイン又はＳＩＤドメイン（例えば、ＳＩＤ４Ｘ）を含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは、１つ以上のヌクレアーゼドメインを含み得る。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１を含む。
本発明は、１つ以上の異種機能ドメインが以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、翻訳活性化活性、翻訳抑制活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性及び核酸結合活性の１つ以上を有することも提供する。少なくとも１つ以上の異種機能ドメインは、エフェクタータンパク質のアミノ末端又はその近傍にあり得、及び／又は少なくとも１つ以上の異種機能ドメインは、エフェクタータンパク質のカルボキシ末端又はその近傍にある。１つ以上の異種機能ドメインは、エフェクタータンパク質に融合され得る。１つ以上の異種機能ドメインは、エフェクタータンパク質にテザー係留され得る。１つ以上の異種機能ドメインは、リンカー部分によってエフェクタータンパク質に連結され得る。
本発明の特定の実施形態において、１つ以上の異種機能ドメインは、エピトープタグ又はレポーターを含み得る。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーターの例としては、限定はされないが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及び自己蛍光タンパク質、例えば青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる。
本発明は、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、リエメレラ属（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ）、バージイエラ属（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ）、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）、ミロイデス属（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ）、キャプノサイトファーガ属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）及びフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される原核生物属の野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超えて相同又は同一のエフェクタータンパク質を含むエフェクタータンパク質も提供する。本発明は、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、バクテロイデス・ピオゲネス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、プレボテラ・ブッカエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｅ）、アリスティペス属種（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｐ．）、プレボテラ・アウランティアカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ミロイデス・オドラティミマス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ ｏｄｏｒａｔｉｍｉｍｕｓ）、キャプノサイトファーガ・カニモルサス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ）、フラボバクテリウム・ブランキオフィルム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ）及びフラボバクテリウム・コルムナレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）からなる群から選択される原核生物種の野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超えて相同又は同一のエフェクタータンパク質を含むエフェクタータンパク質を更に提供する。本発明は、加えて、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０５３４４４４１７）、ポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ－０５２ ＯＨ４９４６ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４２８９６８）、バクテロイデス・ピオゲネス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３４５４２２８１）、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿００４９１９７５５）からなる群から選択される野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超えて相同又は同一のエフェクタータンパク質を含むエフェクタータンパク質を提供する。最も好ましいエフェクタータンパク質は、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０５３４４４４１７）、ポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ－０５２ ＯＨ４９４６ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４２８９６８）からなる群から選択される野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超えて相同又は同一のものであり、及び最も特別に好ましいのは、野生型ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）又はプレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超えて相同又は同一のものである。エフェクタータンパク質は、第１のエフェクタータンパク質オルソログからの第１の断片と、第２のエフェクタータンパク質オルソログからの第２の断片とを含むキメラエフェクタータンパク質を含み得、ここで、第１及び第２のエフェクタータンパク質オルソログは、異なる。
特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、少なくとも７００アミノ酸長であり得る。好ましい実施形態において、エフェクタータンパク質は、約９００～約１５００アミノ酸長、例えば約９００～約１０００アミノ酸長、約１０００～約１１００アミノ酸長、約１１００～約１２００アミノ酸長、又は約１２００～約１３００アミノ酸長、又は約１３００～約１４００アミノ酸長、又は約１４００～約１５００アミノ酸長、例えば約９００、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００又は約１８００アミノ酸長であり得る。
一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、（ａ）９００～１８００アミノ酸及び２つのＨＥＰＮドメインを含み、（ｂ）原核生物ゲノムにおいてＣＲＩＳＰＲアレイの上流又は下流１０ｋｂ以内に天然に存在し、（ｃ）ＣＲＩＳＰＲアレイの上流又は下流１０ｋｂ以内に７００アミノ酸超を含む唯一のタンパク質であり、及び／又は（ｄ）ＣＲＩＳＰＲアレイの上流又は下流１０ｋｂ以内にＣａｓ１遺伝子又はＣａｓ２遺伝子がない。一部の実施形態において、Ｃｓｘ２７又はＣｓｘ２８もＣＲＩＳＰＲアレイの上流又は下流１０ｋｂ以内に存在する。
特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にＶＩ－Ｂ型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはＣａｓ１３ｂは、少なくとも１つ及び好ましくは少なくとも２つ、例えばより好ましくは正確に２つの保存されたＲｘｘｘｘＨモチーフを含む。触媒ＲｘｘｘｘＨモチーフは、ＨＥＰＮ（高等真核生物及び原核生物ヌクレオチド結合）ドメインに特有である。従って、特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、少なくとも１つ及び好ましくは少なくとも２つ、例えばより好ましくは正確に２つのＨＥＰＮドメインを含む。特定の実施形態において、ＨＥＰＮドメインは、ＲＮアーゼ活性を有し得る。他の実施形態において、ＨＥＰＮドメインは、ＤＮアーゼ活性を有し得る。
特定の実施形態において、本明細書で意図されるとおりのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、３０～４０ｂｐ長、より典型的には３４～３８ｂｐ長、更により典型的には３６～３７ｂｐ長、例えば３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ｂｐ長の短鎖ＣＲＩＳＰＲリピートを含む遺伝子座に関連し得る。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピートは、８０～３５０ｂｐ長、例えば８０～２００ｂｐ長、更により典型的には８６～８８ｂｐ長、例えば８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９又は９０ｂｐ長の長鎖又は二重リピートである。
特定の実施形態では、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）又はＰＡＭ様モチーフは、本明細書に開示されるとおりのエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）複合体による目的の標的遺伝子座への結合を導く。ＰＡＭは、ＰＦＳ又はプロトスペーサー隣接部位と称されることもある。一部の実施形態において、ＰＡＭは、５’ＰＡＭであり得る（即ちプロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）。他の実施形態において、ＰＡＭは、３’ＰＡＭであり得る（即ちプロトスペーサーの５’末端の下流に位置する）。他の実施形態において、５’ＰＡＭ及び３’ＰＡＭの両方が必要である。本発明の特定の実施形態において、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）の結合を導くのにＰＡＭ又はＰＡＭ様モチーフが必要でないこともある。特定の実施形態において、５’ＰＡＭは、Ｄ（即ちＡ、Ｇ又はＵ）である。特定の実施形態において、ＶＩ－Ｂ１型エフェクターについて、５’ＰＡＭは、Ｄである。実施例１、表２を参照されたい。所与のＣａｓ１３ｂ系についてコンセンサス５’及び３’ＰＡＭを決定する方法が存在する。本発明の特定の実施形態において、リピート配列における切断により、５’末端に短鎖ヌクレオチド（例えば、５、６、７、８、９又は１０ｎｔ又はそれが二重リピートの場合にはそれを超える）リピート配列（これは、ｃｒＲＮＡ「タグ」と称され得る）及び３’末端にリピートの残りの部分が隣接する完全スペーサー配列を含むｃｒＲＮＡ（例えば、短鎖又は長鎖ｃｒＲＮＡ）が生じ得る。特定の実施形態において、本明細書に記載されるエフェクタータンパク質によるターゲティングには、ｃｒＲＮＡタグと標的５’隣接配列との間に相同性がないことが必要であり得る。この要件は、Ｓａｍａｉ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｕｒｉｎｇ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”Ｃｅｌｌ １６１，１１６４－１１７４，Ｍａｙ ２１，２０１５に更に記載されているものと同様であり得、ここで、要件は、侵入核酸上の本当の標的をＣＲＩＳＰＲアレイ自体との間で区別すると考えられ、ここで、リピート配列の存在がｃｒＲＮＡタグとの完全な相同性につながり、自己免疫を防ぐことになる。
特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、エンジニアリングされ、ヌクレアーゼ活性を低下又は消失させることによりＲＮＡ干渉活性を低下又は消失させる１つ以上の突然変異を含むことができる。突然変異は、隣接残基、例えばヌクレアーゼ活性に関与するものの近傍にあるアミノ酸にも作られ得る。一部の実施形態では、１つ以上の推定触媒ヌクレアーゼドメインが不活性化され、エフェクタータンパク質複合体が切断活性及びＲＮＡ結合複合体としての機能を欠く。好ましい実施形態では、得られたＲＮＡ結合複合体は、本明細書に記載されるとおりの１つ以上の機能ドメインと連結され得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの本発明に係るエフェクタータンパク質（ＣＲＩＳＰＲ酵素、Ｃａｓ１３、エフェクタータンパク質）は、触媒不活性又はデッドＣａｓ１３エフェクタータンパク質（ｄＣａｓ１３）である。一部の実施形態において、ｄＣａｓ１３エフェクターは、ヌクレアーゼドメインに突然変異を含む。一部の実施形態において、ｄＣａｓ１３エフェクタータンパク質は、トランケートされている。一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクターと１つ以上の機能ドメインとの融合タンパク質のサイズを低減するため、そのＲＮＡ結合機能をなおも維持しつつ、Ｃａｓ１３ｂエフェクターのＣ末端をトランケートすることができる。例えば、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、又は少なくとも１００アミノ酸、又は少なくとも１５０アミノ酸、又は少なくとも２００アミノ酸、又は少なくとも２５０アミノ酸、又は少なくとも３００アミノ酸、又は少なくとも３５０アミノ酸、又は最大１２０アミノ酸、又は最大１４０アミノ酸、又は最大１６０アミノ酸、又は最大１８０アミノ酸、又は最大２００アミノ酸、又は最大２５０アミノ酸、又は最大３００アミノ酸、又は最大３５０アミノ酸、又は最大４００アミノ酸がＣａｓ１３ｂエフェクターのＣ末端でトランケートされ得る。Ｃａｓ１３ｂトランケーションの具体的な例としては、Ｃ末端Δ９８４～１０９０、Ｃ末端Δ１０２６～１０９０及びＣ末端Δ１０５３～１０９０、Ｃ末端Δ９３４～１０９０、Ｃ末端Δ８８４～１０９０、Ｃ末端Δ８３４～１０９０、Ｃ末端Δ７８４～１０９０及びＣ末端Δ７３４～１０９０（ここで、アミノ酸位置は、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する）が挙げられる。図１５Ｂを参照されたい。
特定の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、制御可能、即ち誘導可能である。
本発明の特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列及びガイド配列又はスペーサー配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡは、ガイド配列又はスペーサー配列に連結されたダイレクトリピート配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。本発明の好ましい実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡは、ステムループ、又は最適化ステムループ構造、又は最適化二次構造を含む。好ましい実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列中にステムループ又は最適化ステムループ構造を含み、ここで、ステムループ又は最適化ステムループ構造は、切断活性に重要である。特定の実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡは、好ましくは、単一のステムループを含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、好ましくは、単一のステムループを含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質複合体の切断活性は、ステムループＲＮＡ二重鎖構造に影響を及ぼす突然変異を導入することによって改変される。好ましい実施形態において、ステムループのＲＮＡ二重鎖を維持する突然変異が導入され得、それによってエフェクタータンパク質複合体の切断活性が維持される。他の好ましい実施形態において、ステムループのＲＮＡ二重鎖構造を破壊する突然変異が導入され得、それによってエフェクタータンパク質複合体の切断活性が完全に無効にされる。
本発明は、本明細書に記載される方法又は組成物のいずれかにおける真核生物又は真核細胞での発現にコドン最適化されたエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列も提供する。本発明のある実施形態において、コドン最適化されたエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書で考察されるいずれかのＣａｓ１３ｂをコードし、真核細胞又は生物、例えば本明細書の他の部分で挙げるような細胞又は生物、例えば、限定なしに、酵母細胞又は哺乳類細胞又は生物、例えばマウス細胞、ラット細胞及びヒト細胞又は非ヒト真核生物、例えば植物における作動性に関してコドン最適化される。
本発明の特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードする核酸配列に少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）が付加される。好ましい実施形態において、少なくとも１つ以上のＣ末端又はＮ末端ＮＬＳが付加される（従って、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードする核酸分子がＮＬＳのコーディングを含むことができ、そのため、発現した産物にはＮＬＳが付加又は接続されていることになる）。本発明の特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードする核酸配列に少なくとも１つの核外移行シグナル（ＮＥＳ）が付加される。好ましい実施形態では、少なくとも１つ以上のＣ末端又はＮ末端ＮＥＳが付加される（従って、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードする核酸分子がＮＥＳのコーディングを含むことができ、発現産物が付加又は接続されたＮＥＳを有することになる）。好ましい実施形態では、真核細胞、好ましくはヒト細胞における最適発現及び核ターゲティングのため、Ｃ末端及び／又はＮ末端ＮＬＳ又はＮＥＳが付加される。好ましい実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂであり、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは、１５～３５ｎｔである。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは、少なくとも１６ヌクレオチド、例えば少なくとも１７ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８ｎｔ、例えば好ましくは少なくとも１９ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２１ｎｔ又は少なくとも２２ｎｔである。特定の実施形態において、スペーサー長さは、１５～１７ｎｔ、１７～２０ｎｔ、２０～２４ｎｔ、例えば２０、２１、２２、２３又は２４ｎｔ、２３～２５ｎｔ、例えば２３、２４又は２５ｎｔ、２４～２７ｎｔ、２７～３０ｎｔ、３０～３５ｎｔ若しくは３５ｎｔ又はそれを超える。本発明の特定の実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂであり、ガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは、少なくとも１６ヌクレオチドである。特定の実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂであり、ガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは、１６～２０ｎｔ、例えば１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドである。特定の好ましい実施形態において、ガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは、１９ヌクレオチドである。
本発明は、複数の核酸成分を送達する方法も包含し、ここで、各核酸成分は、異なる目的の標的遺伝子座に特異的であり、それにより複数の目的の標的遺伝子座を改変する。複合体の核酸成分は、１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含み得る。１つ以上のアプタマーは、バクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。バクテリオファージコートタンパク質は、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、ＭＳ２、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１を含む群から選択され得る。好ましい実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質は、ＭＳ２である。本発明は、３０以上、４０以上又は５０以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分も提供する。
更なる態様において、本発明は、改変された目的の標的遺伝子座を含む真核細胞を提供し、ここで、目的の標的遺伝子座は、本明細書に記載される方法のいずれかによって改変される。更なる態様は、前記細胞の細胞株を提供する。別の態様は、１つ以上の前記細胞を含む多細胞生物を提供する。
特定の実施形態において、目的の標的遺伝子座の改変は、少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含む真核細胞、少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含む真核細胞であって、少なくとも１つの遺伝子産物の発現は、増加される、真核細胞、少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含む真核細胞であって、少なくとも１つの遺伝子産物の発現は、減少される、真核細胞又は編集されたゲノムを含む真核細胞をもたらし得る。
特定の実施形態において、真核細胞は、哺乳類細胞又はヒト細胞であり得る。
更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、部位特異的遺伝子ノックアウト、部位特異的ゲノム編集、ＲＮＡ配列特異的干渉又は多重ゲノムエンジニアリングに用いられ得る。
また、本明細書に記載されるとおりの細胞、細胞株又は生物からの遺伝子産物も提供される。特定の実施形態において、発現する遺伝子産物の量は、発現の変化又は編集されたゲノムを有しない細胞からの遺伝子産物の量より多いか又は少ないこともある。特定の実施形態において、遺伝子産物は、発現の変化又は編集されたゲノムを有しない細胞からの遺伝子産物と比較して変化したものであり得る。
また、（ｉ）本明細書に記載されるとおりのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、又は（ｉｉ）Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成する能力を有するガイドＲＮＡの少なくとも一方を含む、エンジニアリングされた及び天然に存在しない真核細胞も提供される。一部の実施形態において、（ｉ）及び／又は（ｉｉ）は、細胞において一過性に発現するか又は導入される。また、かかる細胞を含む生物、細胞株、前記細胞株又は生物の子孫も提供される。生物は、脊椎動物、例えば哺乳類であり得る。代わりに、生物は、植物又は真菌であり得る。
更なる態様において、本発明は、改変された目的の標的遺伝子座の生成を確実にする、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ系をコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞を提供し、ここで、目的の標的遺伝子座は、本明細書に記載される方法のいずれかによって改変される。更なる態様は、前記細胞の細胞株を提供する。別の態様は、１つ以上の前記細胞を含む多細胞生物を提供する。
特定の実施形態において、目的の標的遺伝子座の改変は、少なくとも１つの遺伝子産物の（タンパク質）発現の変化を含む真核細胞、少なくとも１つの遺伝子産物の（タンパク質）発現の変化を含む真核細胞であって、少なくとも１つの遺伝子産物の（タンパク質）発現は、増加される、真核細胞、少なくとも１つの遺伝子産物の（タンパク質）発現の変化を含む真核細胞であって、少なくとも１つの遺伝子産物の（タンパク質）発現は、減少される、真核細胞又は編集されたトランスクリプトームを含む真核細胞をもたらし得る。
特定の実施形態において、真核細胞は、哺乳類細胞又はヒト細胞であり得る。
更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、発現（アイソフォーム特異的発現を含む）、安定性、局在、機能性（例えば、リボソームＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）等のＲＮＡ配列特異的干渉、ＲＮＡ配列特異的改変又はかかるプロセスの多重化に使用され得る。
更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、生体試料などの試料中のＲＮＡ検出及び／又は定量化に使用され得る。特定の実施形態において、ＲＮＡ検出は、細胞におけるものである。ある実施形態において、本発明は、試料中の標的ＲＮＡを検出する方法を提供し、この方法は、（ａ）試料を、ｉ）ＲＮＡを切断する能力を有するＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、ｉｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡ、及びｉｉｉ）エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するＲＮＡベースの切断誘導可能レポーターと共にインキュベートすること、（ｂ）前記ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーターの切断によって生成されるシグナルに基づいて前記標的ＲＮＡを検出することを含む。
ある実施形態において、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質である。ある実施形態において、ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物は、蛍光色素及び消光剤を含む。特定の実施形態において、試料は、無細胞生体試料を含む。他の実施形態において、試料は、細胞試料、例えば、限定なしに植物細胞又は動物細胞を含む。本発明のある実施形態において、標的ＲＮＡは、限定はされないが、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫からの標的ＲＮＡを含め、病原体ＲＮＡを含む。ある実施形態において、ガイドＲＮＡは、一塩基変異多型を含む標的ＲＮＡ又はＲＮＡ転写物のスプライス変異体を検出するように設計される。ある実施形態において、ガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡとの１つ以上のミスマッチヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、限定はされないが、癌又は免疫疾患など、疾患状態の診断指標となる標的分子にハイブリダイズする。
本発明は、ａ）ＲＮＡを切断する能力を有するＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、ｂ）標的ＲＮＡに結合する能力を有するガイドＲＮＡ、及びｃ）エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するＲＮＡベースの切断誘導可能レポーターを含むリボ核酸（ＲＮＡ）検出系を提供する。更に、本発明は、ａ）ＲＮＡを切断する能力を有するＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びｂ）エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するＲＮＡベースの切断誘導可能レポーターを含むＲＮＡ検出用キットを提供する。特定の実施形態において、ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物は、蛍光色素及び消光剤を含む。
更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、疾患モデル及び／又はスクリーニング系の作成に用いられ得る。
更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、部位特異的トランスクリプトーム編集又は摂動、核酸配列特異的干渉又は多重ゲノムエンジニアリングに用いられ得る。
本発明の態様では、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又は系は、哺乳類対象におけるウイルス発病、感染又は伝播の治療、防御、予防又は抑制に使用され得る。本発明の態様は、対象におけるウイルス発病、感染及び／又は伝播の治療、防御、抑制及び／又は改善における使用のための、（ａ）Ｃａｓ１３ｂ ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及び／又はＣａｓ１３ｂ ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードするポリ核酸、及び（ｂ）ウイルスの１つ以上の標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ及び／又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のポリ核酸を含むＣａｓ１３ｂ ＣＲＩＳＰＲ系を提供する。Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、好ましい野生型Ｃａ１３ｂタンパク質並びにその好ましい誘導体及び改変体に関するものを含め、本明細書に定義されるとおりであり得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又は系は、哺乳類対象におけるラッサウイルス発病、感染又は伝播の治療、防御、予防又は抑制に使用され得る。ラッサウイルスは、ＤＣ及び血管内皮細胞に関連する（Ｋｕｎｚ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．２００５．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙを参照されたい）。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又は系は、哺乳類対象におけるエボラウイルス発病、感染又は伝播の治療、防御、予防又は抑制に使用され得る。エボラウイルスは、ＤＣ、マクロファージ、ヘパトサイト等を含めた多くの組織及び細胞型に関連する（Ｍａｒｔｉｎｅｓ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ．ａｌ．２０１５．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙを参照されたい）。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又は系は、哺乳類対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ発病、感染又は伝播の治療、防御、予防又は抑制に使用され得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶは、肺組織及び細胞に関連する（Ｔｏ，ＫＦ．ｅｔ．ａｌ．２００４．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙを参照されたい）。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又は系は、哺乳類対象におけるジカウイルス発病、感染又は伝播の治療、防御、予防又は抑制に使用され得る。ジカウイルスは、体液、胎盤、脳等を含め、多くの組織及び細胞型に関連する（Ｍｉｎｅｒ，Ｊ．Ｊ．＆Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｍ．Ｓ．２０１７．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅを参照されたい）。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又は系は、哺乳類対象におけるデングウイルス発病、感染又は伝播の治療、防御、予防又は抑制に使用され得る。デングウイルスは、ＤＣ、マクロファージ、肝臓等を含めた多くの組織及び細胞型に関連する（Ｆｌｉｐｓｅ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．２０１６．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙを参照されたい）。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又は系は、哺乳類対象におけるチクングニアウイルス発病、感染又は伝播の治療、防御、予防又は抑制に使用され得る。チクングニアウイルスは、免疫細胞、肝臓、中枢神経系等を含めた多くの組織及び細胞型に関連する（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｏ．＆Ａｌｂｅｒｔ，Ｍ．Ｌ．２０１０．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓを参照されたい）。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又は系は、哺乳類対象におけるインフルエンザウイルス発病、感染又は伝播の治療、防御、予防又は抑制に使用され得る。インフルエンザウイルスは、肺上皮細胞及びマクロファージに関連する（Ｍｅｄｉｎａ，Ｒ．Ａ．＆Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｓｔｒｅ Ａ．２０１１ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓを参照されたい）。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又は系は、哺乳類対象におけるＨＩＶウイルス発病、感染又は伝播の治療、防御、予防又は抑制に使用され得る。ＨＩＶウイルスは、Ｔ細胞及びマクロファージに関連する（Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ａ．２００２．ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ．を参照されたい）。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又は系は、哺乳類対象におけるロタウイルスのウイルス発病、感染又は伝播の治療、防御、予防又は抑制に使用され得る。ロタウイルスのウイルスは、腸組織及び細胞に関連する（Ｌｏｐｅｚ，Ｓ＆Ａｒｉａｓ，Ｃ．Ｆ．２００６．ＣＴＭＩを参照されたい）。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又は系は、哺乳類対象における単純ヘルペス（ＨＳＶ－１）発病、感染又は伝播の治療、防御、予防又は抑制に使用され得る。ＨＳＶ－１は、上皮細胞及び神経細胞に関連する（Ｓｃｈｅｌｈａａｓ，Ｍ．ｅｔ．ａｌ．２００３．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙを参照されたい）。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又は系は、哺乳類対象におけるＨＣＶ発病、感染又は伝播の治療、防御、予防又は抑制に使用され得る。ＨＣＶは、肝組織及び細胞に関連する（Ｄｉｎｇ，Ｑ，ｅｔ．ａｌ．２０１４．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅを参照されたい）。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又は系は、哺乳類対象におけるＨＢＶ発病、感染又は伝播の治療、防御、予防又は抑制に使用され得る。ＨＢＶは、肝組織及び細胞に関連する（Ｓｃｈｉｅｃｋ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．２０１３．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙを参照されたい）。
また、本明細書に記載されるとおりの細胞、細胞株又は生物からの遺伝子産物も提供される。特定の実施形態において、発現する遺伝子産物の量は、発現の変化又は編集されたゲノムを有しない細胞からの遺伝子産物の量より多いか又は少ないこともある。特定の実施形態において、遺伝子産物は、発現の変化又は編集されたゲノムを有しない細胞からの遺伝子産物と比較して変化したものであり得る。
上記及び他の実施形態が開示されるか又は以下の詳細な説明から明らかであり、それに包含される。
従って、本発明の目的は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に公知の製品、プロセス又は方法のディスクレーマーを本明細書によって開示するような以前に公知のいかなる製品、製品の作製プロセス又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないことである。更に、本発明は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に記載された製品、製品の作製プロセス又は製品の使用方法のディスクレーマーを本明細書によって開示するような、米国特許商標庁（ＵＳＰＴＯ）（米国特許法第１１２条第一段落）又は欧州特許庁（ＥＰＯ）（ＥＰＣ第８３条）の明細書の記載及び実施可能要件を満たさないいかなる製品、製品の作製プロセス又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないように意図されることが注記される。本発明の実施では、第５３条（ｃ）ＥＰＣ並びに規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣに準拠することが有利であり得る。本明細書におけるいかなる事項も、見込みであると解釈されてはならない。
本開示及び特に特許請求の範囲及び／又は段落において、「含む」、「含んだ」、「含んでいる」などの用語は、米国特許法においてそれに帰される意味を有し得る。例えば、これらは、「包含する」、「包含した」、「包含している」などを意味し得、及び「から本質的になっている」及び「から本質的になる」などの用語は、米国特許法におけるそれらに帰される意味を有し、例えば、これらの用語は、明示的に記載されていない要素を許容するが、先行技術に見られる要素又は本発明の基本的な若しくは新規の特徴に影響を及ぼす要素を除外することが注記される。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に示される。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明及びその添付の図面を参照することにより、本発明の特徴及び利点の更なる理解が得られるであろう。
野生型Ｃａｓ１３ｂオルソログの一覧並びにそのアミノ酸配列を供給源生物及びタンパク質受託番号と共に示す。 野生型Ｃａｓ１３ｂオルソログの一覧並びにそのアミノ酸配列を供給源生物及びタンパク質受託番号と共に示す。 野生型Ｃａｓ１３ｂオルソログの一覧並びにそのアミノ酸配列を供給源生物及びタンパク質受託番号と共に示す。 野生型Ｃａｓ１３ｂオルソログの一覧並びにそのアミノ酸配列を供給源生物及びタンパク質受託番号と共に示す。 野生型Ｃａｓ１３ｂオルソログの一覧並びにそのアミノ酸配列を供給源生物及びタンパク質受託番号と共に示す。 野生型Ｃａｓ１３ｂオルソログの一覧並びにそのアミノ酸配列を供給源生物及びタンパク質受託番号と共に示す。 野生型Ｃａｓ１３ｂオルソログの一覧並びにそのアミノ酸配列を供給源生物及びタンパク質受託番号と共に示す。 野生型Ｃａｓ１３ｂオルソログの一覧並びにそのアミノ酸配列を供給源生物及びタンパク質受託番号と共に示す。 野生型Ｃａｓ１３ｂオルソログの一覧並びにそのアミノ酸配列を供給源生物及びタンパク質受託番号と共に示す。
図１のＣａｓ１３ｂオルソログの各々の分類を哺乳類細胞培養物のルシフェラーゼ発現のノックダウンにおけるその相対的有効性と共に示す。
ガイド配列を制御して、活性Ｃａｓ１３ｂオルソログの各々の活性を比較する。
様々なガイド配列間でＣａｓ１３ｂオルソログの２つ － ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）ＷＰ＿０３９４３４８０３及びプレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ ＷＰ＿０４４０６５２９４ － の活性をＣ２ｃ２／Ｃａｓ１３ａの活性と比較する。
ＲＮＡノックダウンに関する高活性Ｃａｓ１３ｂオルソログの特徴付け。（Ａ）ステレオタイプのＣａｓ１３遺伝子座及び対応するｃｒＲＮＡ構造の概略図。（Ｂ）２つの異なるガイドを使用したルシフェラーゼノックダウンに関する１９個のＣａｓ１３ａ、１５個のＣａｓ１３ｂ及び７個のＣａｓ１３ｃオルソログの判定。両方のガイドを使用したノックダウンが効率的なオルソログについて、その宿主生物名を表示する。（Ｃ）Ｇｌｕｃに対してガイドをタイリングしてルシフェラーゼ発現を測定することにより、ＰｓｐＣａｓ１３ｂとＬｗａＣａｓ１３ａとのノックダウン活性を比較する。（Ｄ）Ｃｌｕｃに対してガイドをタイリングしてルシフェラーゼ発現を測定することにより、ＰｓｐＣａｓ１３ｂとＬｗａＣａｓ１３ａとのノックダウン活性を比較する。（Ｅ）ＬｗａＣａｓ１３ａ（赤色）及びｓｈＲＮＡ（黒色）についてのＧｌｕｃターゲティング条件（ｙ軸）と比較したノンターゲティング対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリに検出される全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３つのバイオロジカルレプリケートの平均値を示す。Ｇｌｕｃ転写物データ点に表示を付す。（Ｆ）ＰｓｐＣａｓ１３ｂ（青色）及びｓｈＲＮＡ（黒色）についてのＧｌｕｃターゲティング条件（ｙ軸）と比較したノンターゲティング対照（ｘ軸）のＲＮＡ－ｓｅｑライブラリに検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３つのバイオロジカルレプリケートの平均値を示す。Ｇｌｕｃ転写物データ点に表示を付す。（Ｇ）Ｅ及びＦにおけるトランスクリプトームワイド分析からのＬｗａＣａｓ１３ａ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びｓｈＲＮＡについてのＧｌｕｃノックダウンからの有意なオフターゲットの数。
ＲＮＡ編集用のｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物のエンジニアリング。（Ａ）ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合タンパク質によるＲＮＡ編集の概略図。（Ｂ）ウミホタルルシフェラーゼＷ８５Ｘ標的及びターゲティングガイド設計の概略図。（Ｃ）長さ３０、５０、７０又は８４ｎｔのガイドをタイリングしたＣａｓ１３ｂ－ｄＡＤＡＲ１（左）及びＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２－ｃｄ（右）についてのルシフェラーゼ活性回復の定量化。（Ｄ）ウミホタルルシフェラーゼＷ８５Ｘのターゲティングに関する標的部位の概略図。（Ｅ）ウミホタルルシフェラーゼＷ８５Ｘを標的とする５０ｎｔガイドについてのＡ→Ｉ編集のシーケンシング定量化。
ＲＥＰＡＩＲｖ１によるＲＮＡ編集についての配列柔軟性の測定。（Ａ）ＲＥＰＡＩＲｖ１によるＲＮＡ編集のプロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）優先性を決定するためのスクリーニングの概略図。（Ｂ）２つの異なる編集部位における４－Ｎ ＰＦＳの全ての組み合わせに関するＲＮＡ編集効率の分布。（Ｃ）可能な全ての３塩基モチーフでのＣｌｕｃ Ｗ８５におけるＲＥＰＡＩＲｖ１のパーセント編集率の定量化。（Ｄ）可能な全ての３塩基モチーフに関するＣｌｕｃ Ｗ８５におけるＲＮＡ編集の５’及び３’塩基優先性のヒートマップ
ＲＥＰＡＩＲｖ１による疾患関連突然変異の修正。（Ａ）ＡＶＰＲ２ ８７８Ｇ＞Ａのターゲティングに関する標的及びガイド設計の概略図。（Ｂ）ＡＶＰＲ２における８７８Ｇ＞Ａ突然変異は、３つの異なるガイド設計のＲＥＰＡＩＲｖ１を使用して様々なパーセンテージに修正される。（Ｃ）ＦＡＮＣＣ １５１７Ｇ＞Ａのターゲティングに関する標的及びガイド設計の概略図。（Ｄ）ＦＡＮＣＣにおける１５１７Ｇ＞Ａ突然変異は、３つの異なるガイド設計のＲＥＰＡＩＲｖ１を使用して様々なパーセンテージに修正される。（Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ１を使用した３４個の異なる疾患関連Ｇ＞Ａ突然変異のパーセント編集率の定量化。（Ｆ）ＣｌｉｎＶａｒデータベースによってアノテートされるとおりの修正し得る可能な全てのＧ＞Ａ突然変異の分析。（Ｇ）ＣｌｉｎＶａｒにおける全てのＧ＞Ａ突然変異に関する編集モチーフの分布を、Ｇｌｕｃ転写物で定量化したときのモチーフ毎のＲＥＰＡＩＲｖ１による編集効率に対して示す。
ＲＥＰＡＩＲｖ１の特異性の特徴付け。（Ａ）ＫＲＡＳ標的部位及びガイド設計の概略図。（Ｂ）タイリングしたＫＲＡＳターゲティングガイドに関するパーセント編集率の定量化。オンターゲット及び隣接アデノシン部位における編集率パーセンテージを示す。各ガイドについて、二重鎖ＲＮＡの領域を赤色の枠で示す。（Ｃ）ＣｌｕｃターゲティングガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ１による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲット部位Ｃｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。（Ｄ）ノンターゲティングガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ１による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。
ＲＥＰＡＩＲｖ１の特異性を向上させるＡＤＡＲ２の合理的な突然変異誘発。（Ａ）様々なｄＣａｓ１３－ＡＤＡＲ２突然変異体によるルシフェラーゼシグナル回復の定量化並びに主要なＡＤＡＲ２デアミナーゼ残基とｄｓＲＮＡ標的との間の接触に関する概略図に沿ってプロットしたその特異性スコア。特異性スコアは、ターゲティングガイド条件とノンターゲティングガイド条件との間のルシフェラーゼシグナル比として定義される。（Ｂ）その特異性スコアに対する様々なｄＣａｓ１３－ＡＤＡＲ２突然変異体によるルシフェラーゼシグナル回復の定量化。（Ｃ）オンターゲット編集割合の測定並びにｍＲＮＡのトランスクリプトームワイドシーケンシングによる各ｄＣａｓ１３－ＡＤＡＲ２突然変異体に関する有意なオフターゲットの数。（Ｄ）Ｃｌｕｃにおける中途終止部位を標的とするガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。（Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ１とＲＥＰＡＩＲｖ２との間のオフターゲット編集の差を強調表示するオンターゲットＣｌｕｃ編集部位（２５４ Ａ＞Ｇ）の周囲のＲＮＡシーケンシングリード。全てのＡ＞Ｇ編集を赤色で強調表示する一方、シーケンシングエラーを青色で強調表示する。（Ｆ）内因性ＫＲＡＳ及びＰＰＩＢ転写物のフレーム外ＵＡＧ部位を標的とするガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２によるＲＮＡ編集。各条件の行についてオンターゲット編集割合を右側に横棒グラフとして示す。ガイドＲＮＡによって形成された二重鎖領域は、赤色の囲み枠によって示す。
インビボ効率に関するＣａｓ１３ｂオルソログの細菌スクリーニング及びＰＦＳ決定。（Ａ）Ｃａｓ１３ｂオルソログのＰＦＳを決定するための細菌アッセイの概略図。β－ラクタマーゼターゲティングスペーサーを有するＣａｓ１３ｂオルソログをβ－ラクタマーゼ発現プラスミドと共形質転換し、二重選択に供する。（Ｂ）コロニー形成単位（ｃｆｕ）によって測定したときのβ－ラクタマーゼを標的とするＣａｓ１３ｂオルソログの干渉活性の定量化。（Ｃ）細菌アッセイからの枯渇配列によって決定したときのＣａｓ１３ｂオルソログのＰＦＳロゴ。
Ｃａｓ１３ｂノックダウンの最適化及びミスマッチ特異性の更なる特徴付け。（Ａ）種々の核局在化タグ及び核外移行タグに融合した上位２つのＣａｓ１３ａ及び上位４つのＣａｓ１３ｂオルソログを使用して、２つの異なるガイドによるＧｌｕｃノックダウンを測定する。（Ｂ）４つの異なるガイドでのＬｗａＣａｓ１３ａ、ＲａｎＣａｓ１３ｂ、ＰｇｕＣａｓ１３ｂ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂについてＫＲＡＳのノックダウンを測定し、４つの位置対応ｓｈＲＮＡ対照と比較する。（Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂノックダウンの特異性の評価に用いられるシングル及びダブルミスマッチプラスミドライブラリの概略図。標的配列並びに標的部位の５’末端及び３’末端に直接隣接する３つの位置に可能な全てのシングル及びダブルミスマッチが存在する。（Ｄ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂの両方の条件について、指示されるシングルミスマッチでの転写物の枯渇レベルをヒートマップとしてプロットする。（Ｅ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂの両方の条件について、指示されるダブルミスマッチでの転写物の枯渇レベルをヒートマップとしてプロットする。
ｄＣａｓ１３－ＡＤＡＲ２ ＲＮＡ編集の設計パラメータの特徴付け。（Ａ）野生型Ｃａｓ１３ｂ及び触媒不活性Ｈ１３３Ａ／Ｈ１０５８Ａ Ｃａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３ｂ）に関するＧｌｕｃターゲティングのノックダウン効率。（Ｂ）野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメイン又は高活性Ｅ４８８Ｑ突然変異体ＡＤＡＲ２触媒ドメインのいずれかに融合したｄＣａｓ１３ｂによるルシフェラーゼ活性回復の定量化、Ｃｌｕｃターゲティングガイドをタイリングして試験した。（Ｃ）ウミホタルルシフェラーゼＷ８５Ｘを標的とする３０ｎｔガイドに関するガイド設計及びＡ→Ｉ編集のシーケンシング定量化。（Ｄ）ＰＰＩＢを標的とする５０ｎｔガイドに関するガイド設計及びＡ→Ｉ編集のシーケンシング定量化。（Ｅ）リンカー選択がＲＥＰＡＩＲｖ１によるルシフェラーゼ活性回復に及ぼす影響。（Ｆ）標的アデノシンの対向する塩基アイデンティティがＲＥＰＡＩＲｖ１によるルシフェラーゼ活性回復に及ぼす影響。
Ｇ＞Ａ突然変異に関するＣｌｉｎＶａｒモチーフ分布を示す。全てのＧ＞Ａ突然変異についてのＣｌｉｎＶａｒデータベース中に観察される可能な各トリプレットモチーフの数。
（Ａ）Ｃａｓ１３ｂのトランケーションは、なおも機能性ＲＮＡ編集を有する。ルシフェラーゼシグナルの回復によって測定したとき、ｄＣａｓ１３ｂの様々なＮ末端及びＣ末端トランケーションがＲＮＡ編集を可能にする。（Ｂ）ｄＣａｓ１３ｂの異なるＣ末端トランケーションを有するｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ構築物の更なる例。
他のプログラム可能なＡＤＡＲ系とｄＣａｓ１３－ＡＤＡＲ２編集体との比較。（Ａ）２つのプログラム可能なＡＤＡＲスキーム：ＢｏｘＢベースのターゲティング及び完全長ＡＤＡＲ２ターゲティングの概略図。ＢｏｘＢスキーム（上）では、ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメイン（ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ））がラムダＮ（λＮ）と呼ばれる低分子細菌ウイルスタンパク質に融合しており、これはＢｏｘＢ－λと呼ばれる低分子ＲＮＡ配列に特異的に結合する。次に、２つのＢｏｘＢ－λヘアピンを含むガイドＲＮＡが部位特異的編集のためＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）、－λＮをガイドすることができる。完全長ＡＤＡＲ２スキーム（下）では、ＡＤＡＲ２のｄｓＲＮＡ結合ドメインがガイドＲＮＡのヘアピンに結合することにより、プログラム可能なＡＤＡＲ２編集が可能となる。（Ｂ）Ｃｌｕｃを標的とするガイド及びノンターゲティングガイドでのＢｏｘＢ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。（Ｃ）Ｃｌｕｃを標的とするガイド及びノンターゲティングガイドでのＡＤＡＲ２による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。（Ｄ）Ｃｌｕｃを標的とするガイド及びノンターゲティングガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ１による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。（Ｅ）Ｃｌｕｃに対するターゲティングガイドについてのＢｏｘＢ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）、ＡＤＡＲ２及びＲＥＰＡＩＲｖ１のオンターゲット編集率パーセンテージの定量化。（Ｆ）プログラム可能なＡＤＡＲ系に関する異なるターゲティング及びノンターゲティング条件間のオフターゲット部位のオーバーラップ。
ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２突然変異体の効率及び特異性。（Ａ）Ｃｌｕｃターゲティング及びノンターゲティングガイドに関するｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体によるルシフェラーゼ活性回復の定量化。（Ｂ）ターゲティング及びノンターゲティングガイドの比とトランスクリプトームワイドシーケンシングによって定量化したときのＲＮＡ編集オフターゲット数との間の関係。（Ｃ）ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体に関するオンターゲットＣｌｕｃ編集効率に対するトランスクリプトームワイドなオフターゲットＲＮＡ編集部位の数の定量化。
ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体によるＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイドな特異性。（Ａ）Ｃｌｕｃを標的とするガイドでのｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。（Ｂ）ノンターゲティングガイドでのｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。
ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）編集のオフターゲットにおけるモチーフバイアスの特徴付け。（Ａ）各ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体について、トランスクリプトーム内の全てのＡ＞Ｇオフターゲット編集にわたって存在するモチーフを示す。（Ｂ）ターゲティング及びノンターゲティングガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ１について、モチーフアイデンティティ毎のオフターゲットＡ＞Ｇ編集の分布を示す。（Ｃ）ターゲティング及びノンターゲティングガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ２について、モチーフアイデンティティ毎のオフターゲットＡ＞Ｇ編集の分布を示す。
ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２オフターゲットの更なる特徴付け。（Ａ）ＲＥＰＡＩＲｖ１についての１転写物当たりのオフターゲット数のヒストグラム。（Ｂ）ＲＥＰＡＩＲｖ２についての１転写物当たりのオフターゲット数のヒストグラム。（Ｃ）ＲＥＰＡＩＲｖ１オフターゲットの変異効果予測。（Ｄ）ＲＥＰＡＩＲｖ１オフターゲットの潜在的発癌効果の分布。（Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ２オフターゲットの変異効果予測。（Ｆ）ＲＥＰＡＩＲｖ２オフターゲットの潜在的発癌効果の分布。
ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２のＲＮＡ編集効率及び特異性。（Ａ）ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２についての標的アデノシン及び隣接部位におけるＫＲＡＳターゲティングガイド１によるＫＲＡＳのパーセント編集率の定量化。（Ｂ）ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２についての標的アデノシン及び隣接部位におけるＫＲＡＳターゲティングガイド３によるＫＲＡＳのパーセント編集率の定量化。（Ｃ）ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２についての標的アデノシン及び隣接部位におけるＰＰＩＢターゲティングガイド２によるＰＰＩＢのパーセント編集率の定量化。
Ａ＞Ｇ ＲＮＡ編集体によるあらゆる潜在的コドン変化の実証。（Ａ）Ａ＞Ｉ編集によって可能になる全ての潜在的コドン転換の表。（Ｂ）Ａ＞Ｉ編集によって可能になる全ての潜在的コドン転換を実証するコドン表。
本明細書の図は、例示を目的としているに過ぎず、且つ必ずしも一定の尺度で描かれているとは限らない。
一般に、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）などの前述の文献で用いられているとおりのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関連して「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡによってプロセシングされる部分的ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関連して「スペーサー」とも称される）又はこの用語が本明細書において使用されるとおりの「ＲＮＡ」（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓをガイドするＲＮＡ、例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡ又はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含めた、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか又はその活性を導く転写物及び他のエレメントをまとめて指す。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関連してプロトスペーサーとも称される）の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。
ＣＲＩＳＰＲタンパク質がクラス２ ＶＩ－Ｂ型エフェクター（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）であるとき、ｔｒａｃｒＲＮＡは、不要である。本発明のエンジニアリングされた系では、ダイレクトリピートは、天然に存在する配列又は天然に存在しない配列を含み得る。本発明のダイレクトリピートは、天然に存在する長さ及び配列に限定されない。ダイレクトリピートは、３６ｎｔ長であり得、しかし、それより長い又は短いダイレクトリピートが様々であり得る。例えば、ダイレクトリピートは、３０ｎｔ以上、例えば３０～１００ｎｔ又はそれを超え得る。例えば、ダイレクトリピートは、３０ｎｔ、４０ｎｔ、５０ｎｔ、６０ｎｔ、７０ｎｔ、８０ｎｔ、９０ｎｔ、１００ｎｔ長又はそれを超える長さであり得る。一部の実施形態において、本発明のダイレクトリピートは、天然に存在するダイレクトリピートの５’末端と３’末端との間に挿入された合成ヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態において、挿入された配列は、自己相補的、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％自己相補的であり得る。更に、本発明のダイレクトリピートは、アプタマー又はアダプタータンパク質に結合する配列など、ヌクレオチドの挿入を（機能ドメインとの会合のため）含み得る。特定の実施形態において、かかる挿入を含むダイレクトリピートの一方の末端は、短鎖ＤＲのおよそ前半分であり、他方の末端は、短鎖ＤＲのおよそ後ろ半分である。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関連して、「標的配列」とは、ガイド配列がそれに対して相補性を有するように設計される配列を指し、ここで、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核又は細胞質に位置する。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、以下の基準の一部又は全部を満たす繰り返しモチーフを検索することによりインシリコで同定され得る：１．ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接する２Ｋｂウィンドウのゲノム配列に存在し、２．２０～５０ｂｐにわたり、且つ３．２０～５０ｂｐの間隔が空いている。一部の実施形態では、これらの基準の２つ、例えば１及び２、２及び３又は１及び３が用いられ得る。一部の実施形態では、３つの基準の全てが用いられ得る。
本発明の実施形態において、用語のガイド配列及びガイドＲＮＡ、即ちＣａｓ１３ｂを標的ゲノム遺伝子座へとガイドする能力を有するＲＮＡは、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）などの前述の引用文献中にあるとおり、同義的に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス・ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン・ブンシュアルゴリズム、バローズ・ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか又はそれより長い。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満であるか又はそれより短い。好ましくは、ガイド配列は、１０～４０ヌクレオチド長、例えば２０～３０又は２０～４０ヌクレオチド長又はそれを超え、例えば３０ヌクレオチド長又は約３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクターに対するガイド配列は、１０～３０ヌクレオチド長、例えば２０～３０又は２０～４０ヌクレオチド長又はそれを超え、例えば３０ヌクレオチド長又は約３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）（バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）ＡＴＣＣ ４３７６７など）に由来するＣａｓ１３ｂエフェクターに対するガイド配列は、１０～３０ヌクレオチド長、例えば２０～３０ヌクレオチド長、例えば３０ヌクレオチド長又は約３０ヌクレオチド長である。ガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションなどにより対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内における優先的な切断を評価し得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験しようとするガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間の標的配列における結合又は切断速度を比較することにより試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者に想起されるであろう。
古典的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％又は１００％以上であり得、ガイド、又はＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか又はそれより長いことができるか、又はガイド、又はＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡは、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満であるか又はそれより短いことができる。しかしながら、本発明の特定の態様では、オフターゲット相互作用が低下され得、例えばガイドが相補性の低い標的配列と相互作用するのを低下させる。実際、特定の当然変異は、８０％～約９５％超の相補性、例えば８３％～８４％、又は８８～８９％、又は９４～９５％の相補性を有する標的配列とオフターゲット配列との間を区別する（例えば、１８ヌクレオチドを有する標的を、１、２又は３個のミスマッチを有する１８ヌクレオチドのオフターゲットと区別する）ことが可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系をもたらし得る。従って、本発明との関連において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％、又は９５％、又は９５．５％、又は９６％、又は９６．５％、又は９７％、又は９７．５％、又は９８％、又は９８．５％、又は９９％、又は９９．５％、又は９９．９％超、又は１００％であり得る。オフターゲットは、その配列とガイドとの間で１００％、又は９９．９％、又は９９．５％、又は９９％、又は９９％、又は９８．５％、又は９８％、又は９７．５％、又は９７％、又は９６．５％、又は９６％、又は９５．５％、又は９５％、又は９４．５％、又は９４％、又は９３％、又は９２％、又は９１％、又は９０％、又は８９％、又は８８％、又は８７％、又は８６％、又は８５％、又は８４％、又は８３％、又は８２％、又は８１％、又は８０％未満の相補性であり、有利には、オフターゲットは、その配列とガイドとの間で１００％、又は９９．９％、又は９９．５％、又は９９％、又は９９％、又は９８．５％、又は９８％、又は９７．５％、又は９７％、又は９６．５％、又は９６％、又は９５．５％、又は９５％、又は９４．５％の相補性である。
特定の実施形態において、スペーサー配列と標的配列との間にミスマッチ、例えば１つ又は２つのミスマッチなどの１つ以上のミスマッチを導入することにより、スペーサー／標的に沿ったミスマッチの位置を含め、切断効率の調節を利用することができる。例えば、ダブルミスマッチが中央寄りであるほど（即ち３’寄り又は５’寄りでない）、切断効率がより大きい影響を受ける。従って、スペーサーに沿ってミスマッチ位置を選択することにより、切断効率を調節することができる。例として、標的の１００％未満の切断が（例えば、ある細胞集団において）所望される場合、スペーサー配列にスペーサーと標的配列との間の１つ以上、例えば好ましくは２つのミスマッチが導入され得る。スペーサーに沿ってミスマッチ位置が中央寄りであるほど、切断割合が低くなる。
本明細書に記載されるとおりの本発明に係る方法は、本明細書に考察されるとおりのベクターを細胞に送達することを含む、本明細書に考察されるとおりの真核細胞において（インビトロで、即ち単離された真核細胞において）１つ以上のヌクレオチド改変を誘導することを包含する。この突然変異には、ガイドＲＮＡ又はｓｇＲＮＡを介した細胞の各標的配列における１つ以上のヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。この突然変異には、ガイドＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列における１～７５ヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。この突然変異には、ガイドＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列における１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は７５ヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。この突然変異には、ガイドＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列における５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は７５ヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。この突然変異には、ガイドＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列における１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は７５ヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。この突然変異には、ガイドＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列における２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は７５ヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。この突然変異には、ガイドＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列における４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００又は５００ヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。
毒性及びオフターゲット効果を最小限に抑えるため、送達されるＣａｓ ｍＲＮＡ又はタンパク質及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要となり得る。Ｃａｓ ｍＲＮＡ又はタンパク質及びガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞モデル又は非ヒト真核生物動物モデルにおける種々の濃度の試験及びディープシーケンシングを用いた潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度の分析によって決定することができる。
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関連して、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズし、且つ１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）が形成されると、標的配列又はその近傍（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対又はそれを超える範囲内）に切断が生じるが、特にＲＮＡ標的の場合、例えば二次構造に依存し得る。
Ｃａｓをコードする核酸分子は、有利には、コドン最適化されたＣａｓである。コドン最適化された配列の例は、この場合、真核生物、例えばヒトでの発現に最適化されるか（即ちヒトでの発現に最適化されている）又は本明細書で考察されるとおりの別の真核生物、動物若しくは哺乳動物に最適化された配列である。例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい。これが好ましいが、他の例が可能であることが理解され、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化又は特定の器官に対するコドン最適化が公知である。一部の実施形態において、Ｃａｓをコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば真核細胞での発現にコドン最適化される。真核細胞は、特定の生物、例えば、限定はされないが、ヒトを含めた哺乳動物又は本明細書で考察されるとおりの非ヒト真核生物又は動物又は哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜又は非ヒト哺乳動物又は霊長類のものであるか又はそれに由来し得る。一部の実施形態において、ヒト又は動物に対するいかなる実質的な医学的利益もなく、それらに苦痛を生じさせる可能性のあるヒトの生殖細胞系列遺伝子アイデンティティの改変方法及び／又は動物の遺伝子アイデンティティの改変方法、更にかかる方法から得られる動物は、除外され得る。一般に、コドン最適化とは、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個以上又はそれより多いコドン）を、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、その宿主細胞の遺伝子においてより高頻度で又は最も高頻度で使用されるコドンに置き換えることにより、目的の宿主細胞における発現を増強するための核酸配列の改変方法を指す。様々な種が特定のアミノ酸のある種のコドンについて特定のバイアスを呈する。コドンバイアス（生物間でのコドン使用の違い）は、多くの場合にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、次に、それは、数ある中でも特に、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択のｔＲＮＡが優勢であることは、概して、ペプチド合成で最も高頻度に使用されるコドンを反映するものである。従って、コドン最適化に基づき、所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせて遺伝子を調整することができる。コドン使用表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「コドン使用データベース」で容易に利用可能であり、これらの表を幾つもの方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の配列を特定の宿主細胞における発現にコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）なども利用可能である。一部の実施形態において、Ｃａｓをコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０以上又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も高頻度に使用されるコドンに対応する。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの方法は、１つ以上の目的の遺伝子のプロモーターを含む調節エレメントと細胞内で作動可能に接続した１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が提供又は導入されるＣａｓトランスジェニック細胞を提供することを含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「Ｃａｓトランスジェニック細胞」は、Ｃａｓ遺伝子がゲノム的に組み込まれている真核細胞などの細胞を指す。細胞の性質、タイプ又は起源は、本発明によれば、特に限定されない。また、Ｃａｓトランス遺伝子を細胞に導入する方法も様々であり得、当該技術分野において公知のとおりの任意の方法であり得る。特定の実施形態において、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、単離細胞にＣａｓトランス遺伝子を導入することによって得られる。特定の他の実施形態において、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓトランスジェニック生物から細胞を単離することによって得られる。例として及び限定なしに、本明細書において言及されるとおりのＣａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓノックイン真核生物など、Ｃａｓトランスジェニック真核生物に由来し得る。国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第１３／７４６６７号明細書）（参照により本明細書に援用される）が参照される。Ｒｏｓａ遺伝子座のターゲティングに関する、Ｓａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１２００１７２９０号明細書及び同第２０１１０２６５１９８号明細書の方法を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するように改変し得る。Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関する、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許出願公開第２０１３０２３６９４６号明細書の方法も、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するように改変し得る。更なる例として、Ｃａｓ９ノックインマウスについて記載しているＰｌａｔｔ ｅｔ．ａｌ．（Ｃｅｌｌ；１５９（２）：４４０－４５５（２０１４））（参照により本明細書に援用される）が参照される。Ｃａｓトランス遺伝子は、Ｌｏｘ－Ｓｔｏｐ－ポリＡ－Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを更に含み得、それによりＣａｓ発現をＣｒｅリコンビナーゼによって誘導可能なものにすることができる。代わりに、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、単離細胞にＣａｓトランス遺伝子を導入することによって得ることができる。トランス遺伝子の送達系は、当該技術分野において周知である。例として、Ｃａｓトランス遺伝子は、同様に本明細書の他の部分に記載されるとおり、例えば真核細胞においてベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス）、及び／又は粒子、及び／又はナノ粒子送達を用いて送達され得る。
当業者は、本明細書において参照されるとおりのＣａｓトランスジェニック細胞などの細胞が、例えば及び限定なしに、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）又はＫｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．．（２００９）に記載されるとおり、組み込まれたＣａｓ遺伝子を有することに加えて、更なるゲノム変化を含むか、又はＣａｓを標的遺伝子座にガイドすることが可能なＲＮＡと複合体を形成したとき、Ｃａｓの配列特異的作用によって生じる突然変異、例えば１つ以上の発癌突然変異などを含み得ることを理解するであろう。
一部の実施形態において、Ｃａｓ配列は、１個以上の核局在化配列（ＮＬＳ）又は核外移行配列（ＮＥＳ）、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上又はそれより多いＮＬＳ又はＮＥＳに融合される。一部の実施形態において、Ｃａｓは、アミノ末端又はその近傍に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上又はそれより多いＮＬＳ又はＮＥＳを含むか、カルボキシ末端又はその近傍に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上又はそれより多いＮＬＳ又はＮＥＳを含むか、又はこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端にゼロ個又は少なくとも１個以上のＮＬＳ又はＮＥＳ及びカルボキシ末端にゼロ個又は１個以上のＮＬＳ又はＮＥＳ）である。２個以上のＮＬＳ又はＮＥＳが存在する場合、各々を他と独立して選択し得、従って単一のＮＬＳ又はＮＥＳが２つ以上のコピーで存在し得、且つ／又は１つ以上のコピーで存在する１つ以上の他のＮＬＳ又はＮＥＳとの組み合わせで存在し得る。本発明の好ましい実施形態において、Ｃａｓは、最大で６個のＮＬＳを含む。一部の実施形態において、ＮＬＳ又はＮＥＳは、ＮＬＳ又はＮＥＳの最も近いアミノ酸がＮ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０又はそれより多いアミノ酸の範囲内にあるとき、Ｎ末端又はＣ末端の近傍にあると見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号Ｘ）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミンのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号Ｘ）を有するヌクレオプラスミンビパルタイトＮＬＳ、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号Ｘ）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号Ｘ）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号Ｘ）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチン－αのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号Ｘ）、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号Ｘ）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号Ｘ）、ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ（配列番号Ｘ）、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号Ｘ）、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号Ｘ）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号Ｘ）、肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号Ｘ）、マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号Ｘ）、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号Ｘ）及びステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号Ｘ）に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。ＮＥＳの非限定的な例としては、ＮＥＳ配列ＬＹＰＥＲＬＲＲＩＬＴ（ｃｔｇｔａｃｃｃｔｇａｇｃｇｇｃｔｇｃｇｇｃｇｇａｔｃｃｔｇａｃｃ）が挙げられる。一般に、１つ以上のＮＬＳ又はＮＥＳは、真核細胞のそれぞれ核又は細胞質における検出可能な量のＣａｓの蓄積をドライブするのに十分な強度である。一般に、核局在化／核外移行活性の強度は、Ｃａｓ内のＮＬＳ／ＮＥＳの数、用いられる詳細なＮＬＳ又はＮＥＳ又はこれらの組み合わせ要因から導き出すことができる。核／細胞質内での蓄積の検出は、任意の好適な技法によって実施し得る。例えば、検出可能なマーカーをＣａｓに融合し得、それにより、核（例えば、ＤＡＰＩなど、核に特異的な染色）又は細胞質の位置を検出する手段と組み合わせるなどして細胞内での位置を可視化し得る。細胞核はまた、細胞から単離され得、次にその内容物を免疫組織化学、ウエスタンブロット又は酵素活性アッセイなど、任意の好適なタンパク質検出方法によって分析し得る。核内における蓄積は、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の効果に関するアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡ切断又は突然変異に関するアッセイ又はＣＲＩＳＰＲ複合体形成及び／若しくはＣａｓ酵素活性の影響を受けて変化した遺伝子発現活性に関するアッセイ）によるなどして、Ｃａｓ若しくは複合体に曝露されていない対照又は１つ以上のＮＬＳ又はＮＥＳを欠くＣａｓに曝露された対照と比較して間接的にも決定され得る。特定の実施形態において、限定なしに、オルガネラ、例えばミトコンドリア、プラスチド、葉緑体、小胞、ゴルジ、（核又は細胞）膜、リボソーム、核小体、ＥＲ、細胞骨格、液胞、中心体、ヌクレオソーム、顆粒、中心小体などの細胞内の特定の部位にＣａｓを局在化させるためなど、他の局在化タグがＣａｓタンパク質に融合され得る。
特定の態様において、本発明は、例えば、Ｃａｓ及び／又はＣａｓを標的遺伝子座に案内する能力を有するＲＮＡ（即ちガイドＲＮＡ）を細胞に送達又は導入するための、またこれらの成分を（例えば、原核細胞において）増殖させるためのベクターに関する。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、ある実体を１つの環境から別の環境に移すことを可能にするか又は促進するツールである。これは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて挿入セグメントの複製をもたらし得るレプリコン、例えばプラスミド、ファージ又はコスミドである。概して、ベクターは、適切な制御エレメントと会合しているときに複製能を有する。一般に、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖、二本鎖又は部分的二本鎖の核酸分子、１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば、環状の）核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は両方を含む核酸分子及び当該技術分野において公知の他の各種ポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、ベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスが担持するポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含むことができ、これは、即ち、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択され得る）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。組換え及びクローニング方法に関しては、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４－０１７１１５６ Ａ１号明細書として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書（この内容は、本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。
ベクターは、調節エレメント、例えばプロモーターを含み得る。ベクターは、Ｃａｓコード配列及び／又は単一の、しかし少なくとも３、又は８、又は１６、又は３２、又は４８、又は５０個を含み得る可能性もあるガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）コード配列、例えば１～２、１～３、１～４、１～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～８、３～１６、３～３０、３～３２、３～４８、３～５０個のＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含み得る。単一のベクターには、有利には、約１６個以下のＲＮＡがある場合、各ＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）にプロモーターがあり得、及び単一のベクターが１６個より多いＲＮＡを提供する場合、１つ以上のプロモーターがそれらのＲＮＡの２個以上の発現をドライブし得、例えば３２個のＲＮＡがある場合、各プロモーターが２個のＲＮＡの発現をドライブし得、及び４８個のＲＮＡがある場合、各プロモーターが３個のＲＮＡの発現をドライブし得る。単純な算術的な十分に確立されたクローニングプロトコル及び本開示の教示により、当業者は、例えば、ＡＡＶなどの好適な例示的ベクターに対するＲＮＡ及びＵ６プロモーターなどの好適なプロモーターに関して本発明を容易に実施することができる。例えば、ＡＡＶのパッケージング限界は、約４．７ｋｂである。単一のＵ６－ｇＲＮＡ（＋クローニング用の制限部位）の長さは、３６１ｂｐである。従って、当業者は、単一のベクターに約１２～１６個、例えば１３個のＵ６－ｇＲＮＡカセットを容易に収めることができる。これは、ＴＡＬＥアセンブリに用いられるゴールデンゲート戦略（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｔａｌｅｆｆｅｃｔｏｒｓ／）など、任意の好適な手段によってアセンブルすることができる。当業者は、Ｕ６－ｇＲＮＡの数を約１．５倍増加させるため、例えば１２～１６、例えば１３から約１８～２４、例えば約１９個のＵ６－ｇＲＮＡに増加させるため、タンデムガイド戦略も用いることができる。従って、当業者は、単一のベクター、例えばＡＡＶベクター中に約１８～２４個、例えば約１９個のプロモーター－ＲＮＡ、例えばＵ６－ｇＲＮＡに容易に至ることができる。ベクター中のプロモーター及びＲＮＡの数を増加させる更なる手段は、単一のプロモーター（例えば、Ｕ６）を使用して、切断可能な配列によって分離されたＲＮＡのアレイを発現させることである。また、ベクター中のプロモーター－ＲＮＡの数を増加させる更に別の手段は、コード配列又は遺伝子のイントロンにおいて切断可能な配列によって分離されたプロモーター－ＲＮＡのアレイを発現させることであり、この場合、ポリメラーゼＩＩプロモーターを使用することが有利であり、それにより発現が増加し、組織特異的様式での長いＲＮＡの転写が可能となり得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｎａｒ．ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３４／７／ｅ５３．ｓｈｏｒｔ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｍｔ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ１６／ｎ９／ａｂｓ／ｍｔ２００８１４４ａ．ｈｔｍｌを参照されたい）。有利な実施形態において、ＡＡＶは、最大約５０遺伝子を標的とするＵ６タンデムｇＲＮＡをパッケージングし得る。従って、当該技術分野における知識及び本開示の教示から、当業者は、１つ以上のプロモーターの制御下にあるか、又はそれに作動可能に若しくは機能的に連結された複数のＲＮＡ又はガイドを発現するベクター、例えばシングルベクターを（特に本明細書で考察されるＲＮＡ又はガイドの数に関して）いかなる過度の実験もなく容易に作製及び使用することができる。
ガイドＲＮＡのコード配列及び／又はＣａｓコード配列は、調節エレメントに機能的に又は作動可能に連結され得、従って調節エレメントが発現をドライブする。プロモーターは、構成的プロモーター、及び／又は条件的プロモーター、及び／又は誘導性プロモーター、及び／又は組織特異的プロモーターであり得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＥＦ１αプロモーターからなる群から選択され得る。有利なプロモーターは、プロモーターであり、Ｕ６である。
本発明の態様は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に関連する新規エフェクタータンパク質の同定及びエンジニアリングに関する。好ましい実施形態において、このエフェクタータンパク質は、シングルサブユニットエフェクターモジュールを含む。更なる実施形態において、エフェクタータンパク質は、インビトロ、インビボ又はエキソビボ適用において原核細胞又は真核細胞で機能する。
核酸がＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び一部の態様においてＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド（ｈｙｂｉｒｄ）又はその誘導体も指し得る用語「核酸ターゲティング系」は、まとめて、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか又はその活性を誘導する転写物及び他のエレメントを指し、この遺伝子は、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質をコードする配列及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列と、（全ての系ではないが、一部において）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列とを含むＤＮＡ若しくはＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ又はＤＮＡ若しくはＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含み得る。一般に、ＲＮＡターゲティング系は、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の部位におけるＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング複合体の形成に関連して、「標的配列」は、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡがそれと相補性を有するように設計されるＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指し、ここで、標的配列とＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションがＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進する。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核又は細胞質に位置する。
本発明のある態様において、本願のＲＮＡ－又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡターゲティング系とも称される新規ＲＮＡターゲティング系は、同定されたＶＩ－Ｂ型Ｃａｓタンパク質をベースとし、これは、特異的ＲＮＡ配列を標的化するのにカスタマイズしたタンパク質を作成する必要はなく、むしろ単一の酵素をＲＮＡ分子によって特異的ＲＮＡ標的を認識するようにプログラムすることができ、換言すれば、前記ＲＮＡ分子を用いて酵素を特異的ＲＮＡ標的に動員することができる。
本発明のある態様において、本願のＤＮＡ－又はＤＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡターゲティング系とも称される新規ＤＮＡターゲティング系は、同定されたＶＩ－Ｂ型Ｃａｓタンパク質をベースとし、これは、特異的ＲＮＡ配列を標的化するのにカスタマイズしたタンパク質を作成する必要はなく、むしろ単一の酵素をＲＮＡ分子によって特異的ＤＮＡ標的を認識するようにプログラムすることができ、換言すれば、前記ＲＮＡ分子を用いて酵素を特異的ＤＮＡ標的に動員することができる。
本明細書に記載される核酸ターゲティング系、ベクター系、ベクター及び組成物は、様々な核酸ターゲティング適用、タンパク質などの遺伝子産物の合成の変化又は改変、核酸切断、核酸編集、核酸のスプライシング、標的核酸の輸送、標的核酸の追跡、標的核酸の単離、標的核酸の可視化等において用いられ得る。
本明細書で使用されるとき、Ｃａｓタンパク質又はＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の新規分類に提示されるタンパク質のいずれかを指す。
Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼ
本発明のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、図１からの又はそこに示されるとおりのかかるタンパク質であるか、又はそれを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなるか、又はそれが関わるか若しくはそれに関する。図１の好ましいタンパク質は、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０５３４４４４１７）、ポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ－０５２ ＯＨ４９４６ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４２８９６８）、バクテロイデス・ピオゲネス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３４５４２２８１）、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿００４９１９７５５）からなる群から選択される。図１の最も好ましいタンパク質は、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０５３４４４４１７）、ポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ－０５２ ＯＨ４９４６ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４２８９６８）からなる群から選択され、及び最も特別に好ましいのは、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）又はプレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）である。本発明は、本明細書からの又はそこに示されるとおりのタンパク質を、本明細書に示されるとおりのその突然変異又は改変を含めて提供するか、又はそれに関するか、又はそれに関わるか、又はそれを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなることが意図される。
従って、一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、デッドＣａｓ型エフェクタータンパク質などのＲＮＡ結合タンパク質であり得、これは、任意選択で本明細書に記載されるとおり、例えば転写アクチベーター又はリプレッサードメイン、ＮＬＳ又は他の機能ドメインで機能化され得る。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＲＮＡの一本鎖を切断するＲＮＡ結合タンパク質であり得る。結合するＲＮＡがｓｓＲＮＡである場合、そのｓｓＲＮＡは、完全に切断される。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、例えば、それが２つのＲＮアーゼドメインを含む場合、ＲＮＡの二本鎖を切断するＲＮＡ結合タンパク質であり得る。結合するＲＮＡがｄｓＲＮＡである場合、そのｄｓＲＮＡは、完全に切断される。
ＣＲＩＳＰＲ系におけるＲＮアーゼ機能は、公知であり、例えばある種のＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系についてｍＲＮＡターゲティングが報告されており（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，ｖｏｌ． ２８，２４３２－２４４３；Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１３９，９４５－９５６；Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．４３，４０６－４１７）、多大な利点をもたらす。従って、本エフェクタータンパク質によってＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、組成物又は方法が提供される。
標的ＲＮＡ、即ち目的のＲＮＡは、標的ＲＮＡ上の目的の標的部位へのエフェクタータンパク質の動員及び結合につながる本発明によって標的とされるべきＲＮＡである。標的ＲＮＡは、任意の好適な形態のＲＮＡであり得る。これには、一部の実施形態では、ｍＲＮＡが含まれ得る。他の実施形態において、標的ＲＮＡにはｔＲＮＡ又はｒＲＮＡが含まれ得る。
Ｃａｓ１３ｂガイド
本明細書で使用されるとき、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質の「ｃｒＲＮＡ」、又は「ガイドＲＮＡ」、又は「シングルガイドＲＮＡ」、又は「ｓｇＲＮＡ」、又は「１つ以上の核酸成分」という用語は、標的核酸配列とハイブリダイズして、標的ＲＮＡ配列へのＲＮＡターゲティング複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、本明細書に提供されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムは、ｃｒＲＮＡ又はガイド配列を含む類似のポリヌクレオチドを利用することができ、ここで、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡとの混合物であり、及び／又はポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチド類似体を含む。この配列は、限定はされないが、バルジ、ヘアピン又はステムループ構造など、天然ｃｒＲＮＡの構造を含め、任意の構造を含み得る。特定の実施形態において、ガイド配列を含むポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列であり得る第２のポリヌクレオチド配列と二重鎖を形成する。
特定の実施形態において、本発明のガイドは、天然に存在しない核酸、及び／又は天然に存在しないヌクレオチド、及び／又はヌクレオチド類似体、及び／又は化学的改変を含む。天然に存在しない核酸には、例えば、天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドとの混合物が含まれ得る。天然に存在しないヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体は、リボース、リン酸及び／又は塩基部分が改変され得る。本発明のある実施形態において、ガイド核酸は、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。１つのかかる実施形態において、ガイドは、１つ以上のリボヌクレオチド及び１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のある実施形態において、ガイドは、ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合を有するヌクレオチド、リボース環の２’及び４’炭素間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド又は架橋核酸（ＢＮＡ）など、１つ以上の天然に存在しないヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む。改変ヌクレオチドの他の例としては、２’－Ｏ－メチル類似体、２’－デオキシ類似体、２－チオウリジン類似体、Ｎ６－メチルアデノシン類似体又は２’－フルオロ類似体が挙げられる。改変塩基の更なる例としては、限定はされないが、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７－メチルグアノシンが挙げられる。ガイドＲＮＡの化学的改変の例としては、限定なしに、１つ以上の末端ヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）又は２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の取り込みが挙げられる。かかる化学的に改変されたガイドは、改変されていないガイドＲＮＡと比較したとき、高い安定性及び高い活性を含むことができ、しかしながら、オンターゲット対オフターゲット特異性は、予測不可能である（Ｈｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５－９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ｊｕｎｅ ２０１５；Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８：９０１－９０４；Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２，３：１５４；Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５，１１２：１１８７０－１１８７５；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ．，２０１４，５：１４５４－１４７１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１，００６６ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１７－００６６）。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡの５’及び／又は３’末端は、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質又は検出タグを含め、種々の機能性部分によって改変される（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３３：７４－８３を参照されたい）。特定の実施形態において、ガイドは、標的ＲＮＡに結合する領域にリボヌクレオチドを含み、Ｃａｓ１３ｂに結合する領域に１つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体を含む。本発明のある実施形態において、デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体は、限定なしに、５’及び／又は３’末端、ステム－ループ領域及びシード領域など、エンジニアリングされたガイド構造に組み込まれる。特定の実施形態において、改変は、ステム－ループ領域の３’－ハンドルにない。ガイドのステム－ループ領域の３’－ハンドルにおける化学的改変は、その機能を無効にし得る。特定の実施形態において、ガイドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は７５ヌクレオチドが化学的に改変される。一部の実施形態において、ガイドの３’又は５’末端のいずれかの３～５ヌクレオチドが化学的に改変される。一部の実施形態において、２’－Ｆ改変など、シード領域に軽微な改変のみが導入される。一部の実施形態において、２’－Ｆ改変は、ガイドの５’及び／又は３’末端に導入される。特定の実施形態において、ガイドの５’及び／又は３’末端の３～５ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）又は２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）で化学的に改変される。かかる改変は、ゲノム編集効率を亢進させ得る（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３（９）：９８５－９８９を参照されたい）。特定の実施形態において、遺伝子破壊レベルを亢進させるため、ガイドの全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート（ＰＳ）に置換される。特定の実施形態において、ガイドの５’及び／又は３’末端の５ヌクレオチド超が２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ又はＳ－拘束エチル（ｃＥｔ）で化学的に改変される。かかる化学的に改変されたガイドは、亢進したレベルの遺伝子破壊を媒介することができる（Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０－Ｅ７１１１を参照されたい）。本発明のある実施形態において、ガイドは、その３’及び／又は５’末端に化学的部分を含むように改変される。かかる部分としては、限定はされないが、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）又はローダミンが挙げられる。特定の実施形態において、化学的部分は、アルキル鎖などのリンカーによってガイドにコンジュゲートされる。特定の実施形態において、改変されたガイドの化学的部分は、ガイドをＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又はナノ粒子などの別の分子に取り付けるために使用することができる。かかる化学的に改変されたガイドは、ＣＲＩＳＰＲ系によって遺伝子編集された細胞の同定又は集積に使用することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ，２０１７，６：ｅ２５３１２，ＤＯＩ：１０．７５５４を参照されたい）。
一部の実施形態において、ガイドの改変は、化学的改変、挿入、欠失又は分割である。一部の実施形態において、化学的改変には、限定はされないが、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）類似体、２’－デオキシ類似体、２－チオウリジン類似体、Ｎ６－メチルアデノシン類似体、２’－フルオロ類似体、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）又は２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の取り込みが含まれる。一部の実施形態において、ガイドは、ホスホロチオエート改変の１つ以上を含む。特定の実施形態において、ガイドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２５ヌクレオチドが化学的に改変される。特定の実施形態において、シード領域の１ヌクレオチド以上が化学的に改変される。特定の実施形態において、５’末端の１ヌクレオチド以上が化学的に改変される。特定の実施形態において３’－ハンドルのいかなるヌクレオチドも化学的に改変されない。一部の実施形態において、シード領域の化学的改変は、２’－フルオロ類似体の取り込みなど、軽微な改変である。具体的な実施形態において、シード領域の１ヌクレオチドが２’－フルオロ類似体に置き換えられる。一部の実施形態において、５’末端の５又は１０ヌクレオチドが化学的に改変される。Ｃａｓ１３ｂ ＣｒＲＮＡの５’末端のかかる化学的改変により遺伝子切断効率が向上し得る。具体的な実施形態において、５’末端の５ヌクレオチドが２’－フルオロ類似体に置き換えられる。具体的な実施形態において、５’末端の１０ヌクレオチドが２’－フルオロ類似体に置き換えられる。具体的な実施形態において、５’末端の５ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル（Ｍ）類似体に置き換えられる。
一部の実施形態において、ガイドの３’－ハンドルのループが改変される。一部の実施形態において、ガイドの３’－ハンドルのループが欠失、挿入、分割又は化学的改変を有するように改変される。特定の実施形態において、ループは、３、４又は５ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ループは、ＵＣＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＡＵＵ又はＵＧＵＵの配列を含む。
一態様において、ガイドは、非リン酸ジエステル結合を介して化学的に連結又はコンジュゲートしている部分を含む。一態様において、ガイドは、非限定的な例において、非ヌクレオチドループを介して化学的に連結又はコンジュゲートしているダイレクトリピート及びターゲティング配列を含む。一部の実施形態において、これらの部分は、非リン酸ジエステル共有結合性リンカーを介してつなぎ合わされる。共有結合性リンカーの例としては、限定はされないが、カルバミン酸塩類、エーテル類、エステル類、アミド類、イミン類、アミジン類、アミノトリジン類（ａｍｉｎｏｔｒｉｚｉｎｅｓ）、ヒドロゾン（ｈｙｄｒｏｚｏｎｅ）、ジスルフィド類、チオエーテル類、チオエステル類、ホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、スルホンアミド類、スルホン酸塩類、フルホン類（ｆｕｌｆｏｎｅｓ）、スルホキシド類、尿素類、チオ尿素類、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、光解離性連結、ディールス・アルダー環化付加対又は閉環メタセシス対などのＣ－Ｃ結合形成基及びマイケル反応対からなる群から選択される化学的部分が挙げられる。
一部の実施形態において、ガイドの部分は、初めに標準的なホスホラミダイト合成プロトコルを用いて合成される（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌ ２８８，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（２０１２））。一部の実施形態において、ノンターゲティングガイド部分は、ライゲーションに適切な官能基を含むように、当該技術分野において公知の標準プロトコルを用いて官能化され得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３））。官能基の例としては、限定はされないが、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸活性エステル、アルデヒド、カルボニル、クロロカルボニル、イミダゾリルカルボニル、ヒドロジド（ｈｙｄｒｏｚｉｄｅ）、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオール、マレイミド、ハロアルキル、スホニル（ｓｕｆｏｎｙｌ）、アリ（ａｌｌｙ）、プロパルギル、ジエン、アルキン及びアジドが挙げられる。ガイドのノンターゲティング部分が官能化されると、２つのオリゴヌクレオチド間に共有結合性の化学結合又は連結が形成され得る。化学結合の例としては、限定はされないが、カルバミン酸塩類、エーテル類、エステル類、アミド類、イミン類、アミジン類、アミノトリジン類（ａｍｉｎｏｔｒｉｚｉｎｅｓ）、ヒドロゾン（ｈｙｄｒｏｚｏｎｅ）、ジスルフィド類、チオエーテル類、チオエステル類、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート類、スルホンアミド類、スルホン酸塩、フルホン類（ｆｕｌｆｏｎｅｓ）、スルホキシド類、尿素類、チオ尿素類、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、光解離性連結、ディールス・アルダー環化付加対又は閉環メタセシス対などのＣ－Ｃ結合形成基及びマイケル反応対をベースとするものが挙げられる。
一部の実施形態において、ガイドの１つ以上の部分は、化学的に合成することができる。一部の実施形態において、化学合成は、２’－アセトキシエチルオルトエステル（２’－ＡＣＥ）（Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１１８２０－１１８２１；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３１７：３－１８）又は２’－チオノカルバメート（２’－ＴＣ）化学（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０１１）１３３：１１５４０－１１５４６；Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３：９８５－９８９）を伴う自動化された固相オリゴヌクレオチド合成機を使用する。
一部の実施形態において、ガイド部分は、様々なバイオコンジュゲーション反応、ループ、架橋並びに糖修飾、インターヌクレオチドリン酸ジエステル結合、プリン及びピリミジン残基を介した非ヌクレオチド連結を用いて共有結合的に連結することができる。Ｓｌｅｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００９）４８：６９７４－６９９８；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００４）８：５７０－９；Ｂｅｈｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（２００８）１８：３０５－１９；Ｗａｔｔｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ（２００８）１３：８４２－５５；Ｓｈｕｋｌａ，ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ（２０１０）５：３２８－４９。
一部の実施形態において、ガイド部分は、クリック化学を用いて共有結合的に連結することができる。一部の実施形態において、ガイド部分は、トリアゾールリンカーを用いて共有結合的に連結することができる。一部の実施形態において、ガイド部分は、高度に安定したトリアゾールリンカーを生じさせるアルキン及びアジドが関わるヒュスゲン１，３－双極性環化付加反応を用いて共有結合的に連結することができる（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ（２０１５）１７：１８０９－１８１２；国際公開第２０１６／１８６７４５号パンフレット）。一部の実施形態において、ガイド部分は、５’－ヘキシン部分と３’－アジド部分とのライゲーションにより共有結合的に連結することができる。一部の実施形態において、５’－ヘキシンガイド部分及び３’－アジドガイド部分のいずれか一方又は両方を２’－アセトキシエチルオルトエステル（２’－ＡＣＥ）基で保護することができ、これは、続いてダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）プロトコルを用いて取り除くことができる（Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１１８２０－１１８２１；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３１７：３－１８）。
一部の実施形態において、ガイド部分は、スペーサー、アタッチメント、バイオコンジュゲート、発色団、レポーター群、色素標識ＲＮＡ及び天然に存在しないヌクレオチド類似体などの部分を含むリンカー（例えば、非ヌクレオチドループ）を介して共有結合的に連結することができる。より具体的には、本発明の目的に好適なスペーサーとしては、限定はされないが、ポリエーテル類（例えば、ポリエチレングリコール類、多価アルコール類、ポリプロピレングリコール又はエチレンとプロピレングリコール類との混合物）、ポリアミン基（例えば、スペンニン（ｓｐｅｎｎｉｎｅ）、スペルミジン及びそのポリマー誘導体）、ポリエステル類（例えば、ポリ（アクリル酸エチル））、ポリホスホジエステル類、アルキレン類及びこれらの組み合わせが挙げられる。好適なアタッチメントとしては、限定はされないが、蛍光標識など、リンカーに追加的な特性を加えるためリンカーに加えることのできる任意の部分が挙げられる。好適なバイオコンジュゲートとしては、限定はされないが、ペプチド、グリコシド、脂質、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロール類及びジアルキルグリセロール類、脂肪酸、炭化水素、酵素基質、ステロイド類、ビオチン、ジゴキシゲニン、炭水化物、多糖が挙げられる。好適な発色団、レポーター群及び色素標識ＲＮＡとしては、限定はされないが、フルオレセイン及びローダミンなどの蛍光色素、化学発光、電気化学発光及び生物発光マーカー化合物が挙げられる。２つのＲＮＡ成分をコンジュゲートする例示的なリンカーの設計については、国際公開第２００４／０１５０７５号パンフレットにも記載されている。
リンカー（例えば、非ヌクレオチドループ）は、任意の長さであり得る。一部の実施形態において、リンカーは、約０～１６ヌクレオチドに等しい長さを有する。一部の実施形態において、リンカーは、約０～８ヌクレオチドに等しい長さを有する。一部の実施形態において、リンカーは、約０～４ヌクレオチドに等しい長さを有する。一部の実施形態において、リンカーは、約２ヌクレオチドに等しい長さを有する。例示的なリンカー設計については、国際公開第２０１１／００８７３０号パンフレットにも記載されている。
一部の実施形態において、相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス－ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン－ブンシュアルゴリズム、バローズ－ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。ガイド配列（ＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ内にある）が標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価され得る。例えば、核酸ターゲティング複合体を形成するのに十分なＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ系の構成成分は、試験しようとするガイド配列を含め、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞へと、核酸ターゲティング複合体の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして提供され得、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的核酸配列内における優先的なターゲティング（例えば、切断）を評価し得る。同様に、標的核酸配列の切断は、標的核酸配列、試験しようとするガイド配列を含めた核酸ターゲティング複合体の構成成分及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間で標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者に想起されるであろう。ガイド配列、従ってＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、任意の標的核酸配列を標的化するように選択され得る。標的配列は、ＤＮＡであり得る。標的配列は、任意のＲＮＡ配列であり得る。一部の実施形態において、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）及び低分子細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ及びｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。一部のより好ましい実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ分子又はプレｍＲＮＡ分子内の配列であり得る。
一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、そのＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ内の二次構造度が低下するように選択される。一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡの約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％以下の又はそれより少ないヌクレオチドは、最適に折り畳まれたとき、自己相補的塩基対合に関与する。最適な折り畳みは、任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定され得る。一部のプログラムは、最小ギブズ自由エネルギーを計算することに基づく。１つのかかるアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３－１４８）によって記載されるとおりのｍＦｏｌｄである。別の例示的折り畳みアルゴリズムは、ウィーン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａ）の理論化学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で開発された、セントロイド構造予測アルゴリズムを用いるオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１－６２を参照されたい）。
特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列及びガイド配列又はスペーサー配列を含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、ガイド配列又はスペーサー配列に融合又は連結したダイレクトリピート配列を含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列又はスペーサー配列より上流（即ち５’側）に位置し得る。他の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列又はスペーサー配列より下流（即ち３’側）に位置し得る。他の実施形態において、複数のＤＲ（デュアルＤＲなど）が存在し得る。
特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ステムループ、好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、ステムループ、好ましくは単一のステムループを形成する。
特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは、１５～３５ｎｔである。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは、少なくとも１５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、スペーサー長さは、１５～１７ｎｔ、例えば１５、１６又は１７ｎｔ、１７～２０ｎｔ、例えば１７、１８、１９又は２０ｎｔ、２０～２４ｎｔ、例えば２０、２１、２２、２３又は２４ｎｔ、２３～２５ｎｔ、例えば２３、２４又は２５ｎｔ、２４～２７ｎｔ、例えば２４、２５、２６又は２７ｎｔ、２７～３０ｎｔ、例えば２７、２８、２９又は３０ｎｔ、３０～３５ｎｔ、例えば３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ｎｔ、又は３５ｎｔ以上である。
干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
他の実施形態において、標的ＲＮＡには、真核生物及び原核生物の両方の干渉性ＲＮＡ、即ちＲＮＡ干渉経路に関与するＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどが含まれ得る。他の実施形態において、標的ＲＮＡにはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれ得る。干渉性ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの制御は、インビボ又はインビトロで干渉性ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの寿命を短縮することによる手法で見られるオフターゲット効果（ＯＴＥ）を低減することを促進し得る。
特定の実施形態において、標的は、ｍｉＲＮＡ自体でなく、ｍｉＲＮＡ標的のｍｉＲＮＡ結合部位である。
特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、（細胞内で再配置されることを含むなど）隔離され得る。特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、限定なしにヘアピンなどで切断され得る。
特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡプロセシング（代謝回転を含むなど）は、増加又は減少する。
エフェクタータンパク質及び好適なガイドが（例えば、空間的又は時間的に好適なプロモーター、例えば組織特異的又は細胞周期特異的プロモーター及び／又はエンハンサーの制御下で）選択的に発現する場合、これを用いて細胞又は系を（インビボ又はインビトロで）その細胞におけるＲＮＡｉから「保護」することができるであろう。これは、ＲＮＡｉが必要ない隣接組織又は細胞において、又はエフェクタータンパク質及び好適なガイドが発現する及び発現しない（即ちそれぞれＲＮＡｉが制御されない及びそれが制御される）細胞又は組織を比較する目的で有用であり得る。エフェクタータンパク質を使用して、リボザイム、リボソーム又はリボスイッチなど、ＲＮＡを含むか又はそれからなる分子を制御するか又はそれに結合し得る。本発明の実施形態では、ＲＮＡガイドがエフェクタータンパク質をそうした分子に動員することにより、エフェクタータンパク質は、それらに結合することが可能になる。
本発明のタンパク質系は、本願がこの系を情報に基づいてエンジニアリングするための基礎を提供するため、本開示から、過度の実験を行うことなく、治療法、アッセイ及び他の適用を含め、ＲＮＡｉ技術の領域において適用することができる（例えば、Ｇｕｉｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ Ｄｉｓ ９（５）：ｅ０００３８０１．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｎｔｄ；Ｃｒｏｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎ ｖｉｖｏ ＲＮＡｉ ｓｃｒｅｅｎｓ：ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”．Ｓｈａｎｅ Ｃｒｏｔｔｙ．．．２０１５ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｌｔｄ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｎｃ．，Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｉｍｐａｃｔ Ｆａｃｔｏｒ：２．０１）．０１／２０１５；１２０．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｐｅｓｔｂｐ．２０１５．０１．００２及びＭａｋｋｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１５，７（４），２０９９－２１２５；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ７０４２０９９を参照されたい）。
リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）
例えば、アジスロマイシンなどのアザライド系抗生物質は、周知である。これは、５０Ｓリボソームサブユニットを標的としてそれを破壊する。本エフェクタータンパク質は、５０Ｓリボソームサブユニットを標的とする好適なガイドＲＮＡと共に、一部の実施形態において、５０Ｓリボソームサブユニットに動員されて、それに結合し得る。従って、リボソーム（特に５０ｓリボソームサブユニット）標的に向けられた好適なガイドと合わせた本エフェクタータンパク質が提供される。リボソーム（特に５０ｓリボソームサブユニット）標的に向けられた好適なガイドと合わせたこの使用エフェクタータンパク質の使用には、抗生物質としての使用が含まれ得る。詳細には、抗生物質としての使用は、アジスロマイシンなどのアザライド系抗生物質の機能と類似している。一部の実施形態では、原核生物リボソームサブユニット、例えば原核生物の７０Ｓサブユニット、上述の５０Ｓサブユニット、３０Ｓサブユニット並びに１６Ｓ及び５Ｓサブユニットが標的とされ得る。他の実施形態では、真核生物リボソームサブユニット、例えば真核生物の８０Ｓサブユニット、６０Ｓサブユニット、４０Ｓサブユニット並びに２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ及び５Ｓサブユニットが標的とされ得る。
一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、本明細書に記載されるとおりの任意選択で機能化されたＲＮＡ結合タンパク質であり得る。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＲＮＡの一本鎖を切断するＲＮＡ結合タンパク質であり得る。いずれの場合にも、しかし、特にＲＮＡ結合タンパク質がＲＮＡの一本鎖を切断する場合、リボソーム機能が調節され得、詳細にはそれが低減又は破壊され得る。これは、任意のリボソームＲＮＡ及び任意のリボソームサブユニットに適用され得、ｒＲＮＡの配列は、周知である。
従って、リボソーム標的に対する好適なガイドと合わせた本エフェクタータンパク質の使用によるリボソーム活性の制御が想定される。これは、リボソームの切断又はそれへの結合によるものであり得る。詳細には、リボソーム活性の低減が想定される。これは、リボソーム機能のインビボ又はインビトロアッセイにおいて、またリボソーム活性に基づく治療をインビボ又はインビトロで制御する手段としても有用であり得る。更に、インビボ系又はインビトロ系におけるタンパク質合成の制御（即ち低減）が想定され、かかる制御には抗生物質としての使用並びに研究及び診断上の使用が含まれる。
リボスイッチ
リボスイッチ（アプタザイムとしても知られる）は、小分子に結合するメッセンジャーＲＮＡ分子の調節性セグメントである。これは、典型的には、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生の変化をもたらす。従って、リボスイッチ標的に対する好適なガイドと合わせた本エフェクタータンパク質の使用によるリボスイッチ活性の制御が従って想定される。これは、リボスイッチの切断又はそれへの結合によるものであり得る。詳細には、リボスイッチ活性の低減が想定される。これは、リボスイッチ機能のインビボ又はインビトロアッセイにおいて、またリボスイッチ活性に基づく治療をインビボ又はインビトロで制御する手段としても有用であり得る。更に、インビボ系又はインビトロ系におけるタンパク質合成の制御（即ち低減）が想定される。この制御には、ｒＲＮＡに関する限り、抗生物質としての使用並びに研究及び診断上の使用が含まれ得る。
リボザイム
リボザイムは、酵素（これは、当然ながら、タンパク質である）と類似した、触媒特性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、天然に存在するもの及びエンジニアリングされたものの両方ともＲＮＡを含むか又はそれからなるため、同様に本ＲＮＡ結合エフェクタータンパク質の標的となり得る。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、リボザイムを切断して、それによりそれを無効にするＲＮＡ結合タンパク質であり得る。従って、リボザイム標的に対する好適なガイドと合わせた本エフェクタータンパク質の使用によるリボザイム活性の制御が想定される。これは、リボザイムの切断又はそれへの結合によるものであり得る。詳細には、リボザイム活性の低減が想定される。これは、リボザイム機能のインビボ又はインビトロアッセイにおいて、またリボザイム活性に基づく治療をインビボ又はインビトロで制御する手段としても有用であり得る。
ＲＮＡプロセシングを含めた遺伝子発現
エフェクタータンパク質は、好適なガイドと共に、ＲＮＡプロセシングの制御によることを含めた遺伝子発現のターゲティングにも使用され得る。ＲＮＡプロセシングの制御には、ＲＮＡｐｏｌのターゲティングによる選択的スプライシングを含めたＲＮＡスプライシング；植物のウイロイドを含め、ウイルス複製（詳細には、サテライトウイルス、バクテリオファージ及びレトロウイルス、例えばＨＢＶ、ＨＢＣ及びＨＩＶ並びに本明細書に挙げられる他のウイルスのもの）；及びｔＲＮＡ生合成などのＲＮＡプロセシング反応が含まれ得る。エフェクタータンパク質及び好適なガイドは、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）の制御にも使用され得る。ＲＮＡａは、遺伝子発現の促進につながり、そのため、遺伝子発現の制御は、ＲＮＡａの破壊又は低減、従って遺伝子発現の促進低下による形で実現し得る。これについて以下で更に詳細に考察する。
ＲＮＡｉスクリーン
ＲＮＡｉスクリーンにより、そのノックダウンが表現型の変化に関連する遺伝子産物を同定して、生物学的経路を調べ及び構成要素を同定することができる。エフェクタータンパク質及び好適なガイドを使用してスクリーンにおけるＲＮＡｉの活性を除去し又は低下させ、従って（それまで干渉を受けていた）遺伝子産物の活性を（干渉／抑制を除去するか又は低下させることで）回復させることにより、こうしたスクリーンにも又はスクリーンの間も制御を及ぼし得る。
サテライトＲＮＡ（ｓａｔＲＮＡ）及びサテライトウイルスも処理し得る。
ＲＮアーゼ活性に関連する本明細書の制御は、概して、低減、負の破壊又はノックダウン若しくはノックアウトを意味する。
インビボＲＮＡ適用
遺伝子発現の阻害
本明細書に提供される標的特異的ＲＮアーゼは、標的ＲＮＡの極めて特異的な切断が可能である。ＲＮＡレベルでの干渉は、空間的及び時間的の両方の、且つゲノムが改変されないため非侵襲的な方法での調節が可能である。
幾つもの疾患がｍＲＮＡターゲティングによって治療可能であることが実証されている。それらの研究のほとんどは、ｓｉＲＮＡの投与に関するが、本明細書に提供されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を同じように適用し得ることが明らかである。
ｍＲＮＡ標的（及び対応する疾患治療）の例は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ１及びＲＴＰ８０１（ＡＭＤ及び／又はＤＭＥの治療に）、カスパーゼ２（Ｎａｉｏｎの治療に）、ＡＤＲＢ２（眼圧の治療に）、ＴＲＰＶＩ（ドライアイ症候群の治療に、Ｓｙｋキナーゼ（喘息の治療に）、Ａｐｏ Ｂ（高コレステロール血症又は低βリポ蛋白血症の治療に）、ＰＬＫ１、ＫＳＰ及びＶＥＧＦ（固形腫瘍の治療に）、Ｂｅｒ－Ａｂｌ（ＣＭＬの治療に）である（Ｂｕｒｎｅｔｔ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１２，１９（１）：６０－７１））。同様に、ＲＮＡターゲティングは、ＨＩＶ（ＨＩＶ Ｔｅｔ及びＲｅｖのターゲティング）、ＲＳＶ（ＲＳＶヌクレオカプシドのターゲティング）及びＨＣＶ（ｍｉＲ－１２２のターゲティング）など、ＲＮＡウイルス媒介性疾患の治療に有効であることが実証されている（Ｂｕｒｎｅｔｔ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１２，１９（１）：６０－７１）。
更に、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を突然変異特異的又はアレル特異的ノックダウンに使用し得ることが想定される。突然変異を含む転写されたｍＲＮＡの配列又はアレル特異的配列を特異的に標的化するガイドＲＮＡを設計することができる。かかる特異的ノックダウンは、突然変異した又はアレル特異的な遺伝子産物に伴う障害に関する治療適用に特に好適である。例えば、家族性低βリポ蛋白血症（ＦＨＢＬ）のほとんどの症例は、ＡｐｏＢ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。この遺伝子は、２つのバージョンのアポリポタンパク質Ｂタンパク質：短いバージョン（ＡｐｏＢ－４８）及びより長いバージョン（ＡｐｏＢ－１００）をコードする。ＦＨＢＬにつながる幾つかのＡｐｏＢ遺伝子突然変異は、両方のバージョンのＡｐｏＢを異常に短くする。突然変異したＡｐｏＢ ｍＲＮＡ転写物を本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質で特異的にターゲティング及びノックダウンすることは、ＦＨＢＬの治療において有益であり得る。別の例として、ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチンチンタンパク質をコードする遺伝子のＣＡＧトリプレットリピートの伸長により異常なタンパク質が生じて引き起こされる。ハンチンチンタンパク質をコードする突然変異した又はアレル特異的なｍＲＮＡ転写物を本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質で特異的にターゲティング及びノックダウンすることは、ＨＤの治療において有益であり得る。
これに関連して及びより一般的に本明細書に記載されるとおりの様々な適用について、スプリットバージョンのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用を想定し得ることが注記される。実際、これは、特異性の増加を可能にし得るのみならず、送達にも有利であり得る。Ｃａｓ１３ｂは、Ｃａｓ１３ｂ酵素の２つのパートが実質的に機能性Ｃａｓ１３ｂをなすという意味でスプリットである。理想的には、スプリットは、常に、触媒ドメインが影響を受けないようなものでなければならない。このＣａｓ１３ｂは、ヌクレアーゼとして機能し得るか、又はそれは、典型的にはその触媒ドメインの突然変異に起因して、本質的に触媒活性をほぼ又は全く有さないＲＮＡ結合タンパク質であるデッドＣａｓ１３ｂであり得る。
スプリットＣａｓ１３ｂの各半分は、二量化パートナーに融合され得る。例として及び限定ではなく、ラパマイシン感受性二量化ドメインを用いると、Ｃａｓ１３ｂ活性を時間的に制御するための化学的に誘導可能なスプリットＣａｓ１３ｂの作成が可能となる。従って、Ｃａｓ１３ｂは、２つの断片に分割することにより化学的に誘導可能にすることができ、このラパマイシン感受性二量化ドメインを使用してＣａｓ１３ｂを制御された形で再アセンブルし得る。スプリットＣａｓ１３ｂの２つのパートは、スプリットＣａｓ１３ｂのＮ’末端パート及びＣ’末端パートと考えることができる。この融合は、典型的にはＣａｓ１３ｂのスプリット点である。換言すれば、スプリットＣａｓ１３ｂのＮ’末端パートのＣ’末端が二量体半体の一方に融合する一方、Ｃ’末端パートのＮ’末端が他方の二量体半体に融合する。
Ｃａｓ１３ｂは、切断点が新しく作り出されるという意味で分割される必要はない。スプリット点は、典型的にはインシリコで設計され、構築物にクローニングされる。一緒になって、スプリットＣａｓ１３ｂの２つのパート、Ｎ’末端パート及びＣ’末端パートは、好ましくは、野生型アミノ酸（又はそれをコードするヌクレオチド）の少なくとも７０％以上、好ましくは野生型アミノ酸（又はそれをコードするヌクレオチド）の少なくとも８０％以上、好ましくは少なくとも９０％以上、好ましくは少なくとも９５％以上及び最も好ましくは少なくとも９９％以上を含む完全なＣａｓ１３ｂを形成する。何らかのトリミングがある可能性があり得、突然変異体が想定される。非機能性ドメインは、完全に除去され得る。重要な点は、２つのパートが一体にされ得ること及び所望のＣａｓ１３ｂ機能が回復するか又は元に戻ることである。二量体は、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ１３ｂエフェクターは、突然変異特異的又はアレル特異的ノックダウンなど、突然変異特異的又はアレル特異的ターゲティングに用いられ得る。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、相乗作用してＲＮアーゼ活性を増加させるか又はメッセージの更なる分解を確実にする、非特異的ＲＮアーゼ又はアルゴノート２などの別の機能性ＲＮア－ゼドメインに更に融合することができる。
ＲＮＡ機能の調節による遺伝子発現の調節
ｍＲＮＡの切断による遺伝子発現への直接的な効果を別として、ＲＮＡターゲティングは、細胞内でのＲＮＡプロセシングの特定の側面に影響を与えるためにも使用することができ、これにより遺伝子発現をより繊細に調節することが可能となり得る。概して、調節は、例えば、タンパク質の結合を遮断するか、又はＲＮＡ結合タンパク質を動員するなど、例えばＲＮＡへのタンパク質の結合に干渉することにより媒介され得る。実際、調節は、ｍＲＮＡのスプライシング、輸送、局在、翻訳及び代謝回転など、種々のレベルで確実とし得る。治療のコンテクストでも同様に、ＲＮＡ特異的ターゲティング分子を使用することにより、これらのレベルの各々において（病原性の）機能不全に対処することが想定され得る。これらの実施形態では、多くの場合、ＲＮＡターゲティングタンパク質は、本明細書に記載される突然変異型のＣａｓ１３ｂなど、ＲＮＡ標的を切断する能力を失った、しかしそれに結合するその能力を維持している「デッド」Ｃａｓ１３ｂであることが好ましい。
Ａ）選択的スプライシング
ヒト遺伝子の多くは、選択的スプライシングの結果として複数のｍＲＮＡを発現する。種々の疾患は、発現した遺伝子の機能喪失又は機能獲得につながる異常なスプライシングに関係することが示されている。こうした疾患には、スプライシング欠損を引き起こす突然変異によって引き起こされるものもあるが、そうでないものも多数ある。１つの治療選択肢は、スプライシング機構を直接標的化することである。本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、例えば、スライシングの遮断又は促進、エクソンのインクルージョン又はエクスクルージョン及び特異的アイソフォームの発現への影響付与及び／又は代替的タンパク質産物の発現の刺激に使用することができる。かかる適用について、以下に更に詳細に記載する。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質が標的ＲＮＡに結合すると、ＲＮＡ配列へのスプライシング因子の接近を立体的に遮断することができる。スプライス部位を標的とするＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、その部位でスプライシングを遮断し、任意選択でスプライシングを隣接する部位に向け直し得る。例えば、５’スプライス部位に結合するＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の結合は、スプライソソームのＵ１成分の動員を遮断することができ、そのエクソンのスキッピングに有利である。代わりに、スプライシングエンハンサー又はサイレンサーを標的とするＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、標的部位におけるトランス作用性調節性スプライシング因子の結合を妨げ、スプライシングを有効に遮断又は促進することができる。更に、本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質によってＩＬＦ２／３を前駆ｍＲＮＡのエクソン近傍に動員することにより、エクソンエクスクルージョンを実現することができる。更に別の例として、ｈｎＲＮＰ Ａ１の動員及びエクソンエクスクルージョンのため、グリシンリッチドメインを付加することができる（Ｄｅｌ Ｇａｔｔｏ－Ｋｏｎｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９ Ｊａｎ；１９（１）：２５１－６０）。
特定の実施形態において、ｇＲＮＡの適切な選択により、特定のスプライス変異体が標的化され得る一方、他のスプライス変異体が標的化されないことになる。
ある場合には、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、スライシングを促進することができる（例えば、スプライシングが欠損している場合）。例えば、更なるスプライシングのため、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質をスプライシング調節性ステム－ループの安定化能のあるエフェクターに会合させることができる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を特定のスプライシング因子のコンセンサス結合部位配列に連結すると、タンパク質を標的ＤＮＡ又はＲＮＡに動員することができる。
異常なスプライシングと関連付けられている疾患の例としては、限定はされないが、シナプスで機能するタンパク質のスプライシングを調節するＮｏｖａタンパク質の喪失によって起こる傍腫瘍性眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調（又はＰＯＭＡ）及び非機能性クロライドチャネルの産生をもたらす、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子のスプライシング欠損によって引き起こされる嚢胞性線維症が挙げられる。他の疾患では、異常なＲＮＡスプライシングは、機能獲得をもたらす。これには、例えば、スプライシング欠損を生じさせるｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおけるＣＵＧトリプレットリピート伸長（５０～＞１５００リピート）によって引き起こされる筋強直性ジストロフィーが該当する。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、スプライシング因子（Ｕ１など）を５’スプライシング部位に動員して所望のエクソンの周りにあるイントロンの切出しを促進することにより、エクソンを除外することができる。かかる動員は、スプライシングアクチベーターとして機能するアルギニン／セリンリッチドメインとの融合によって媒介される可能性がある（Ｇｒａｖｅｌｙ ＢＲ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．１９９８（５）：７６５－７１）。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して所望の遺伝子座におけるスプライシング機構を遮断し、それによりエクソン認識及び別のタンパク質産物の発現を妨げ得ることが想定される。治療し得る障害の例は、ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。ほぼ全てのＤＭＤ突然変異がフレームシフトにつながり、ジストロフィン翻訳が障害されることになる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質をスプライスジャンクション又はエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）と組み合わせて、それによってエクソン認識を妨げることにより、部分的に機能性のタンパク質の翻訳をもたらすことができる。これは、致死性デュシェンヌ表現型を重篤度の低いベッカー表現型に変換する。
Ｂ）ＲＮＡ改変
ＲＮＡ編集は、ＲＮＡの小さい改変によって所与の配列の遺伝子産物の多様性が増加する自然の過程である。典型的には、この改変には、そのゲノムによってコードされるものと異なるＲＮＡ配列をもたらすアデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への変換が関わる。ＲＮＡ改変は、概してＡＤＡＲ酵素によって確実となり、これによれば、ｐｒｅ－ＲＮＡ標的は、編集されるアデノシンを含むエクソンとイントロン非コードエレメントとの間の塩基対合によって不完全な二重鎖ＲＮＡを形成する。Ａ－Ｉ編集の古典的な例は、グルタミン酸受容体ＧｌｕＲ－Ｂ ｍＲＮＡであり、これによれば、この変化によってチャネルのコンダクタンス特性が改変されることになる（Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．１９９３；７５：１３６１－７０）。
本発明によれば、酵素的手法を用いて所与の転写物のＲＮＡ塩基における転移（Ａ⇔Ｇ又はＣ⇔Ｕの変化）又は転換（任意のプリンから任意のピリミジン又はその逆）が誘導される。転移は、それぞれＡをＩに又はＣをＵに変換する、アデノシン（ＡＤＡＲ１／２））又はシトシンデアミナーゼ（ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤ）を使用して直接誘導することができる。転換は、目的の塩基に活性酸素種の損傷を局在させて、それによりグアニンからオキソグアニンへの変換など、影響を受けた塩基に化学修飾が加わることにより間接的に誘導することができる。オキソグアニンは、Ｔとして認識され、従ってアデニンと塩基対合して翻訳に影響を生じさせることになる。ＲＯＳ媒介性塩基損傷のために動員され得るタンパク質としては、ＡＰＥＸ及びｍｉｎｉ－ＳＯＧが挙げられる。両方の手法とも、これらのエフェクターを触媒不活性Ｃａｓ１３ｂに融合し、それらのタイプの突然変異が所望される転写物上の部位に動員することができる。
ヒトでは、ＡＤＡＲ１遺伝子におけるヘテロ接合機能的ヌル突然変異は、皮膚疾患、ヒト色素性遺伝性皮膚症につながる（Ｍｉｙａｍｕｒａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２００３；７３：６９３－９）。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して機能不全のＲＮＡ改変を修正し得ることが想定される。
更に、ＲＮＡアデノシンメチラーゼ（Ｎ（６）－メチルアデノシン）を本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質に融合して目的の転写物に標的化し得ることが想定される。このメチラーゼは、可逆的なメチル化を引き起こし、調節的役割を有し、且つ複数のＲＮＡ関連細胞経路を調節することにより遺伝子発現及び細胞運命決定に影響を及ぼし得る（Ｆｕ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１４；１５（５）：２９３－３０６）。
Ｃ）ポリアデニル化
ｍＲＮＡのポリアデニル化は、ｍＲＮＡの核輸送、翻訳効率及び安定性に重要であり、これらの全て並びにまたポリアデニル化の過程が特定のＲＢＰに依存する。多くの真核生物ｍＲＮＡは、転写後に約２００ヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）テールを受け取る。ポリアデニル化には、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの活性を刺激する種々のＲＮＡ結合タンパク質複合体が関わる（Ｍｉｎｖｉｅｌｌｅ－Ｓｅｂａｓｔｉａ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；１１：３５２－７）。本明細書に提供されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＲＮＡ結合タンパク質とＲＮＡとの間の相互作用に干渉するか又はそれを促進し得ることが想定される。
ポリアデニル化に関わる欠陥タンパク質と関係付けられている疾患の例は、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）である（Ｂｒａｉｓ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９８；１８：１６４－７）。
Ｄ）ＲＮＡ核外輸送
ｐｒｅ－ｍＲＮＡプロセシング後、ｍＲＮＡは、核から細胞質に輸送される。これは、キャリア複合体の生成を含む細胞機構によって確実となり、キャリア複合体は、次に、核膜孔を通って移動し、細胞質でｍＲＮＡを放出し、続いて、キャリアは、再利用される。
ＲＮＡの核外輸送において役割を果たすタンパク質（ＴＡＰなど）の過剰発現は、アフリカツメガエルにおいて本来非効率的に核外輸送される転写物の核外輸送を増加させることが分かっている（Ｋａｔａｈｉｒａ Ｊ， ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９；１８：２５９３－６０９）。
Ｅ）ｍＲＮＡ局在
ｍＲＮＡ局在は、空間的に調節されたタンパク質産生を確実にする。細胞の特定の領域への転写物の局在は、局在化エレメントによって確実となり得る。詳細な実施形態において、本明細書に記載されるエフェクタータンパク質を使用して局在化エレメントを目的のＲＮＡに標的化し得ることが想定される。エフェクタータンパク質は、標的転写物に結合して、それをそのペプチドシグナルタグによって決まる細胞内の位置にシャトル輸送するように設計することができる。例えば、より詳細には、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び／又は１つ以上の核外移行シグナル（ＮＥＳ）に融合したＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＲＮＡの局在性を変化させることができる。
局在化シグナルの更なる例としては、幾つかの非対称細胞型における細胞質へのβ－アクチンの局在を確実にするジップコード結合タンパク質（ＺＢＰ１）、ＫＤＥＬ保持配列（小胞体への局在化）、核外移行シグナル（細胞質への局在化）、ミトコンドリア標的シグナル（ミトコンドリアへの局在化）、ペルオキシソーム標的シグナル（ペルオキシソームへの局在化）及びｍ６Ａ標識／ＹＴＨＤＦ２（ｐボディへの局在化）が挙げられる。想定される他の手法は、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質と既知の局在（例えば、膜、シナプス）のタンパク質の融合である。
代わりに、本発明に係るエフェクタータンパク質は、例えば、局在依存性ノックダウンに使用し得る。エフェクタータンパク質を適切な局在化シグナルと融合することにより、エフェクターが特定の細胞内区画に標的化される。この区画にある標的ＲＮＡのみが有効に標的化されることになる一方、他の同一の、しかし別の細胞内区画にある標的が標的化されず、従って局在依存性ノックダウンを成立させることができる。
Ｆ）翻訳
本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して翻訳を増進させるか又は抑制することができる。翻訳の上方制御は、細胞回路を制御する極めてロバストな方法であることが想定される。更に、機能研究には、転写物の上方制御がタンパク質産生の増加につながらないという欠点がある転写上方制御スクリーンと比べてタンパク質翻訳スクリーンが有利であり得る。
本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＥＩＦ４Ｇなどの翻訳開始因子を目的のメッセンジャーＲＮＡの５’非翻訳リピート（５’ＵＴＲ）の近傍に持っていき、翻訳をドライブし得ることが想定される（非再プログラム可能ＲＮＡ結合タンパク質についてＤｅ Ｇｒｅｇｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９；１８（１７）：４８６５－７４に記載されるとおり）。別の例として、細胞質ポリ（Ａ）ポリメラーゼのＧＬＤ２をＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質によって標的ｍＲＮＡに動員することができる。これによれば、標的ｍＲＮＡの指向性のポリアデニル化と、それによる翻訳の刺激とが可能となり得る。
同様に、本明細書において想定されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ＺＢＰ１など、ｍＲＮＡの翻訳リプレッサーを遮断することができる（Ｈｕｔｔｅｌｍａｉｅｒ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００５；４３８：５１２－５）。標的ＲＮＡの翻訳開始部位への結合により、翻訳が直接影響を受け得る。
加えて、ＲＮアーゼ阻害薬など、ｍＲＮＡを例えばその分解の防止によって安定化させるタンパク質にＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を融合すると、目的の転写物からのタンパク質産生を増加させることが可能である。
本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ＲＮＡ転写物の５ＵＴＲ領域に結合し、且つリボソームの形成及び翻訳開始を妨げることにより翻訳を抑制し得ることが想定される。
更に、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＣＣＲ４－ＮＯＴデアデニラーゼ複合体の一成分であるＣａｆ１を標的ｍＲＮＡに動員することにより、標的転写物の脱アデニル化及びタンパク質翻訳の阻害をもたらすことができる。
例えば、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、治療的に関連性のあるタンパク質の翻訳を増加又は減少させることができる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して翻訳を下方制御又は上方制御し得る治療適用の例は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び心血管障害である。ＡＬＳ運動皮質及び脊髄では、グリアグルタミン酸トランスポーターＥＡＡＴ２レベルの低下が報告されていると共に、ＡＬＳ脳組織でも複数の異常なＥＡＡＴ２ ｍＲＮＡ転写物が報告されている。ＥＡＡＴ２タンパク質及び機能の喪失は、ＡＬＳにおける興奮毒性の主な原因であると考えられている。ＥＡＡＴ２タンパク質レベル及び機能の回復は、治療利益をもたらし得る。従って、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を例えば上記に記載したとおりの翻訳リプレッサーの遮断又はｍＲＮＡの安定化によるＥＡＡＴ２タンパク質の発現の上方制御に有益に使用することができる。アポリポタンパク質Ａ１は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要なタンパク質成分であり、ＡｐｏＡ１及びＨＤＬは、概してアテローム形成抑制性であると考えられる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を、例えば上記に記載したとおりの翻訳リプレッサーの遮断又はｍＲＮＡの安定化によるＡｐｏＡ１の発現の上方制御に有益に使用し得ることが想定される。
Ｇ）ｍＲＮＡ代謝回転
翻訳は、ｍＲＮＡ代謝回転及び調節性ｍＲＮＡ安定性と密接に結び付いている。転写物の安定性には特異的タンパク質が関わることが記載されている（ニューロンにおけるＥＬＡＶ／Ｈｕタンパク質、Ｋｅｅｎｅ ＪＤ，１９９９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９６：５－７）及びトリステトラプロリン（ＴＴＰ）など。これらのタンパク質は、細胞質におけるメッセージの分解を保護することにより標的ｍＲＮＡを安定化させる（Ｐｅｎｇ ＳＳ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３４６１－７０）。
本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ｍＲＮＡ代謝回転が影響を受けるように、ｍＲＮＡ転写物を安定化させる役割を果たすタンパク質の活性に干渉し得るか、又はそれを促進し得ることが想定され得る。例えば、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してヒトＴＴＰを標的ＲＮＡに動員すれば、アデニル酸－ウリジル酸リッチエレメント（ＡＵリッチエレメント）媒介性翻訳抑制及び標的分解が可能となり得る。ＡＵリッチエレメントは、癌原遺伝子をコードする多くのｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、核内転写因子及びサイトカインに見られ、ＲＮＡ安定性を促進する。別の例として、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を、別のｍＲＮＡ安定化タンパク質であるＨｕＲ（Ｈｉｎｍａｎ ＭＮ ａｎｄ Ｌｏｕ Ｈ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００８；６５：３１６８－８１）に融合してそれを標的転写物に動員することにより、その寿命を延ばすか、又は短命なｍＲＮＡを安定化させることができる。
更に、本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して標的転写物の分解を促進し得ることが想定される。例えば、ｍ６Ａメチルトランスフェラーゼを標的転写物に動員して転写物をＰボディに局在させることにより、標的の分解をもたらすことができる。
更に別の例として、本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を非特異的エンドヌクレアーゼドメインＰｉｌＴ Ｎ末端（ＰＩＮ）に融合することにより、それを標的転写物に動員し、且つその分解を可能にすることができる。
傍腫瘍性神経障害（ＰＮＤ）関連脳脊髄炎及びニューロパチーの患者は、中枢神経系外の腫瘍におけるＨｕタンパク質に対する自己抗体を生成し（Ｓｚａｂｏ Ａ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｃｅｌｌ．；６７：３２５－３３、それは、次に、血液脳関門を通過する患者である。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してｍＲＮＡ転写物への自己抗体の結合に干渉し得ることが想定され得る。
筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’ＵＴＲにおける（ＣＵＧ）ｎの伸長によって引き起こされるジストロフィー１型（ＤＭ１）の患者は、核内へのかかる転写物の蓄積によって特徴付けられる。（ＣＵＧ）ｎリピートを標的とするエンドヌクレアーゼと融合した本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質であれば、かかる異常な転写物の蓄積を阻害し得ることが想定される。
Ｈ）多機能タンパク質との相互作用
一部のＲＮＡ結合タンパク質は、多くのＲＮＡ上の複数の部位に結合して多様な過程で機能する。例えば、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質は、エクソンスプライシングサイレンサー配列に結合してスプライシング因子をアンタゴナイズし、テロメア末端に会合し（それによりテロメア活性を刺激する）、且つｍｉＲＮＡに結合してドローシャ媒介性プロセシングを促進し、それにより成熟に影響を及ぼすことが分かっている。本発明のＲＮＡ結合エフェクタータンパク質が１つ以上の位置でＲＮＡ結合タンパク質の結合に干渉し得ることが想定される。
Ｉ）ＲＮＡフォールディング
ＲＮＡは、その生物学的活性を発揮するため、定義付けられた構造をとる。代替的三次構造間でのコンホメーションの移行は、多くのＲＮＡ媒介性プロセスに決定的に重要である。しかしながら、ＲＮＡフォールディングは、幾つかの問題に関連し得る。例えば、ＲＮＡは、不適切な代替的コンホメーションへと折り畳まれて、それに維持される傾向があることもあり、且つ／又は正しい三次構造が代替的構造と比べて十分に熱力学的に好ましいといえないこともある。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質、詳細には切断欠損又はデッドＲＮＡターゲティングタンパク質を使用して（ｍ）ＲＮＡのフォールディングを仕向け且つ／又はその正しい三次構造を確保し得る。
特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡと複合体化したＣａｓ１３ｂは、標的ＲＮＡへの結合時に活性化され、続いて任意の近接したｓｓＲＮＡ標的を切断する（即ち「コラテラル」又は「バイスタンダー」効果）。Ｃａｓ１３ｂは、コグネイト標的によってプライミングされると、他の（非相補的な）ＲＮＡ分子を切断することができる。このような無差別的なＲＮＡ切断は、潜在的に細胞毒性を引き起こすか、又は他に細胞生理若しくは細胞状態に影響を及ぼす可能性がある。
従って、特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞の休眠の誘導に使用されるか又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞周期停止の誘導に使用されるか又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞成長及び／又は細胞増殖の低減に使用されるか又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞アネルギーの誘導に使用されるか又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞アポトーシスの誘導に使用されるか又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞壊死の誘導に使用されるか又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞死の誘導に使用されるか又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、プログラム細胞死の誘導に使用されるか又はそれにおける使用のためのものである。
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞の休眠の誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞周期停止の誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞成長及び／又は細胞増殖の低減方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞アネルギーの誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞アポトーシスの誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞壊死の誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞死の誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、プログラム細胞死の誘導方法に関する。
本明細書に記載されるとおりの方法及び使用は、治療的又は予防的であり得、特定の細胞、細胞（部分）集団又は細胞型／組織型を標的とし得る。詳細には、本明細書に記載されるとおりの方法及び使用は、治療的又は予防的であり得、１つ以上の標的配列、例えば１つ以上の特定の標的ＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡ）を発現する特定の細胞、細胞（部分）集団又は細胞型／組織型を標的とし得る。限定なしに、標的細胞は、例えば、特定の転写物を発現する癌細胞、例えば所与のクラスのニューロン、例えば自己免疫を引き起こす（免疫）細胞又は特異的な（例えば、ウイルス性の）病原体に感染した細胞等であり得る。
従って、特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、望ましくない細胞（宿主細胞）の存在によって特徴付けられる病的状態を治療する方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、望ましくない細胞（宿主細胞）の存在によって特徴付けられる病的状態を治療するための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系の使用に関する。特定の実施形態において、本発明は、望ましくない細胞（宿主細胞）の存在によって特徴付けられる病的状態の治療における使用のための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系に関する。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、望ましくない細胞に特異的な標的を標的とすることが理解されるべきである。特定の実施形態において、本発明は、癌を治療、予防又は軽減するための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系の使用に関する。特定の実施形態において、本発明は、癌の治療、予防又は軽減における使用のための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、癌を治療、予防又は軽減する方法に関する。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、癌細胞に特異的な標的を標的とすることが理解されるべきである。特定の実施形態において、本発明は、病原体による細胞の感染を治療、予防又は軽減するための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系の使用に関する。特定の実施形態において、本発明は、病原体による細胞の感染の治療、予防又は軽減における使用のための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、病原体による細胞の感染を治療、予防又は軽減する方法に関する。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、病原体に感染した細胞に特異的な標的（例えば、病原体由来の標的）を標的とすることが理解されるべきである。特定の実施形態において、本発明は、自己免疫障害を治療、予防又は軽減するための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系の使用に関する。特定の実施形態において、本発明は、自己免疫障害の治療、予防又は軽減における使用のための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、自己免疫障害を治療、予防又は軽減する方法に関する。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、自己免疫障害に関与する細胞に特異的な標的（例えば、特異的免疫細胞）を標的とすることが理解されるべきである。
ＲＮＡ検出又はタンパク質検出におけるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用
更に、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を生体試料中の核酸又はタンパク質の検出に使用し得ることが想定される。試料は、細胞又は無細胞であり得る。
更に、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質をノーザンブロットアッセイにおいて使用し得ることが想定される。ノーザンブロッティングには、電気泳動を用いたＲＮＡ試料のサイズによる分離が関わる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して標的ＲＮＡ配列を特異的に結合し、検出することができる。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、蛍光タンパク質（ＧＦＰなど）に融合して、生細胞におけるＲＮＡ局在の追跡に使用することもできる。より詳細には、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、それがもはやＲＮＡを切断しない点で不活性化することができる。詳細な実施形態では、より精密な可視化を確保するため、スプリットＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用し得ることが想定され、これによれば、シグナルが両方のサブタンパク質の結合に依存する。代わりに、複数のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質複合体が標的転写物に結合すると再構成されるスプリット蛍光タンパク質を使用することができる。更に、転写物がｍＲＮＡに沿った複数の結合部位で標的とされ、そのため蛍光シグナルが真のシグナルを増幅して限局的な識別を可能にし得ることが想定される。更に別の代替形態として、蛍光タンパク質がスプリットインテインから再構成され得る。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、例えば、ＲＮＡ又は特異的スプライス変異体の局在、ｍＲＮＡ転写物のレベル、転写物の上方又は下方制御及び疾患特異的診断の決定に好適に使用される。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、例えば、蛍光顕微鏡法又はフローサイトメトリー、例えば細胞のハイスループットスクリーニング及び細胞選別後の生細胞の回収を可能にする蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などを用いた（生）細胞におけるＲＮＡの可視化に使用することができる。更に、種々の転写物の発現レベルをストレス下、例えば分子阻害薬又は細胞に対する低酸素条件を用いた癌成長の阻害下で同時に評価することができる。別の適用は、２つの光子顕微鏡を用いて神経刺激中のシナプス結合への転写物の局在を追跡することであり得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの本発明に係る成分又は複合体は、例えば、（蛍光）標識したＣａｓ１３ｂエフェクターによるなど、多重化エラーロバスト蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＭＥＲＦＩＳＨ；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ；２０１５；３４８（６２３３））において使用することができる。
インビトロＡＰＥＸ標識
細胞過程は、タンパク質、ＲＮＡ及びＤＮＡ間の分子相互作用のネットワークに依存する。タンパク質－ＤＮＡ及びタンパク質－ＲＮＡ相互作用の正確な検出は、かかる過程の理解に重要である。インビトロ近接標識技術は、アフィニティータグを例えば光活性化可能なプローブと組み合わせて利用して、インビトロで目的のタンパク質又はＲＮＡの近くにあるポリペプチド及びＲＮＡを標識する。ＵＶ照射後、光活性化可能な基が、タグ付加分子にごく近接しているタンパク質及び他の分子と反応し、それによりそれらを標識する。標識された相互作用分子は、続いて回収して同定することができる。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、例えばプローブを選択のＲＮＡ配列に標的化することができる。
これらの適用は、疾患に関連する適用又は培養が困難な細胞型のインビボイメージングのため動物モデルにおいても適用し得る可能性がある。
本発明は、リスクの検査及びＲＮＡ標的療法の手引きを含め、無細胞ＲＮＡの非侵襲的試料採取によって健康状態を診断及びモニタリングするための薬剤及び方法を提供し、治療の急速投与が治療成績に重要な状況で有用である。一実施形態において、本発明は、再発及び／又は一般的な薬剤耐性突然変異の発生をモニタリングすることを含め、循環腫瘍ＲＮＡに関する癌検出方法及び薬剤を提供する。別の実施形態において、本発明は、血液又は血清から直接細菌種を検出及び／又は同定して、それにより例えば疾患の進行及び敗血症をモニタするための検出方法及び薬剤を提供する。本発明のある実施形態では、Ｃａｓ１３ｂタンパク質及び誘導体を使用して、ライノウイルス感染症又は上気道感染症などの一般病が気管支炎などのより重篤な感染症と区別され、診断される。
本発明は、心筋梗塞又は脳卒中治療時の例えばＶＫＯＲＣ１、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子タイピングに基づく抗凝固薬の投与の手引きを含め、救急ファーマコゲノミクスに向けた迅速遺伝子タイピングのための方法及び薬剤を提供する。
本発明は、食品製造及び配送チェーンに沿ったあらゆるポイントでの食品の細菌汚染を監視するための薬剤及び方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、例えば、食品原料の特定及び純度の決定による、品質管理及び監視を提供する。１つの非限定的な例では、本発明を使用して、動物肉及び海産物の種など、食品原料を特定又は確認し得る。
別の実施形態において、本発明は法医学的決定において使用される。例えば、血液又は他の体液を含む犯罪現場試料。本発明のある実施形態では、本発明を使用して指紋から核酸試料が同定される。
ＲＮＡ折り紙／インビトロアセンブリラインにおけるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用 － コンビナトリクス
ＲＮＡ折り紙とは、ＲＮＡを組み込まれた鋳型として使用して二次元又は三次元構造を作り出すためのナノスケールの折り畳み構造を指す。折り畳み構造はＲＮＡにコードされ、従って得られるＲＮＡの形状は合成されるＲＮＡ配列によって決まる（Ｇｅａｒｙ，ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４５（６１９８）．ｐｐ．７９９－８０４）。ＲＮＡ折り紙は、タンパク質などの他の成分を複合体となるように配列するための足場としての役割を果たし得る。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用すると、例えば好適なガイドＲＮＡを使用して目的のタンパク質をＲＮＡ折り紙に標的化することができる。
ＲＮＡ単離又は精製、エンリッチメント又は枯渇におけるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用
更に、ＲＮＡと複合体化したときのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＲＮＡを単離及び／又は精製し得ることが想定される。例えば、ＲＮＡ－ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質複合体の単離及び／又は精製に使用し得るアフィニティータグにＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を融合することができる。かかる適用は、例えば、細胞における遺伝子発現プロファイルの分析において有用である。詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して特異的非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を標的化し、それによりその活性を遮断して、有用な機能性プローブを提供し得ることが想定され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるとおりのエフェクタータンパク質（ｅｆｆｅｃｅｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）を使用して特定のＲＮＡを特異的にエンリッチし得る（限定はされないが、安定性を増加させることなどを含む）か、又は代わりに特定のＲＮＡ（限定なしに、例えば特定のスプライス変異体、アイソフォームなど）を特異的に枯渇させ得る。
ｌｉｎｃＲＮＡ機能及び他の核ＲＮＡの検査
ｓｉＲＮＡなどの現在のＲＮＡノックダウン戦略は、タンパク質機構が細胞質性であるため、ほとんどが細胞質転写物のターゲティングに限られるという不都合さがある。細胞機能に必須でない外因系である本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の利点は、それを細胞のどの区画においても使用できることである。ＮＬＳシグナルをＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質に融合することにより、それを核に誘導することができ、核ＲＮＡのターゲティングが可能となる。例えば、ｌｉｎｃＲＮＡの機能をプローブすることが想定される。長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）は、極めて広範に調査されている研究分野である。多くのｌｉｎｃＲＮＡが、今のところ依然として解明されていない機能を有し、これは本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用した研究となる可能性がある。
ＲＮＡ結合タンパク質の同定
特異的ＲＮＡに結合するタンパク質の同定は、多くのＲＮＡの役割を理解するのに有用であり得る。例えば、多くのｌｉｎｃＲＮＡは転写の制御に転写及び後成的調節因子が関連する。どのようなタンパク質が所与のｌｉｎｃＲＮＡに結合するかを理解することは、所与の調節経路の構成成分を解明することを促進し得る。結合したタンパク質をビオチンで局所的に標識するため、ビオチンリガーゼを特異的転写物に動員するように本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を設計することができる。次に、タンパク質をプルダウンし、質量分析法により分析して、それを同定することができる。
ＲＮＡへの複合体のアセンブリ及び基質シャトリング
更に、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ＲＮＡに複合体をアセンブルすることができる。これは、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を複数の関連するタンパク質（例えば、特定の合成経路の構成成分）で機能化することにより実現し得る。代わりに、かかる種々の関連するタンパク質で複数のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を機能化して、同じ又は隣接する標的ＲＮＡに標的化し得る。ＲＮＡへの複合体のアセンブリの有用な適用は、例えば、タンパク質間の基質シャトリングの促進である。
合成生物学
生物学的システムの開発には、臨床応用を含め、広い有用性がある。本発明のプログラム可能なＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、例えば癌関連ＲＮＡを標的転写物として使用した標的細胞死のため毒性ドメインのスプリットタンパク質に融合し得ることが想定される。更に、合成生物学的システムにおいて、例えばキナーゼ又は他の酵素などの適切なエフェクターとの融合複合体により、タンパク質間相互作用を含む経路に影響を与えることができる。
タンパク質スプライシング：インテイン
タンパク質スプライシングは、インテインと称される介在ポリペプチドが、エクステインと称される、それに隣接するポリペプチドからのそれ自体の切出し、且つ続くエクステインのライゲーションを触媒する翻訳後プロセスである。本明細書に記載されるとおりの２つ以上のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を標的転写物にアセンブルすることを用いてスプリットインテインの放出を仕向け（Ｔｏｐｉｌｉｎａ ａｎｄ Ｍｉｌｌｓ Ｍｏｂ ＤＮＡ．２０１４ Ｆｅｂ ４；５（１）：５）、それによりｍＲＮＡ転写物の存在に関する直接計算及び続く代謝酵素又は転写因子などの（転写経路の下流作動のための）タンパク質産物の放出を可能にし得る。本願は合成生物学（上記を参照されたい）又は大規模バイオ生産（一定の条件下でのみ産物を産生する）において多大な意義を有し得る。
誘導性システム、投与システム及び自己不活性化システム
一実施形態において、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質及びエフェクター成分を含む融合複合体は、誘導性、例えば光誘導性又は化学誘導性となるように設計される。かかる誘導能により、エフェクター成分を所望の時点で活性化させることが可能となる。
光誘導能は、例えば、融合にＣＲＹ２ＰＨＲ／ＣＩＢＮ対形成が用いられる融合複合体を設計することにより実現される。このシステムは、生細胞におけるタンパク質相互作用の光誘導に特に有用である（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；５００：４７２－４７６）。
化学誘導能は、例えば、融合にＦＫＢＰ／ＦＲＢ（ＦＫ５０６結合タンパク質／ＦＫＢＰラパマイシン結合）対形成が用いられる融合複合体を設計することにより提供される。このシステムを使用すると、タンパク質の結合にラパマイシンが必要である（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；３３（２）：１３９－４２が、Ｃａｓ９へのこのシステムの使用について記載している）。
更に、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、細胞にＤＮＡとして導入すると、テトラサイクリン又はドキシサイクリン制御転写活性化（Ｔｅｔ－Ｏｎ及びＴｅｔ－Ｏｆｆ発現系）、例えばエクジソン誘導性遺伝子発現系などのホルモン誘導性遺伝子発現系及びアラビノース誘導性遺伝子発現系など、誘導性プロモーターによって調節することができる。ＲＮＡとして送達すると、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の発現をリボスイッチで調節することができ、これはテトラサイクリンのような小分子を検知することができるものである（Ｇｏｌｄｆｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１２；４０（９）：ｅ６４に記載されるとおり）。
一実施形態において、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の送達を調節して細胞内のタンパク質又はｃｒＲＮＡの量を変化させ、それにより所望の効果又は任意の望ましくないオフターゲット効果の大きさを変化させることができる。
一実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は自己不活性化するように設計することができる。これは、ｍＲＮＡ又は複製ＲＮＡ治療薬（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＲＮＡ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）（Ｗｒｏｂｌｅｓｋａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ａｕｇ；３３（８）：８３９－８４１）のいずれかの、ＲＮＡとして細胞に送達すると、自己ＲＮＡを破壊して、それにより常在性及び潜在的に望ましくない効果を低減することにより、発現及び続く効果を自己不活性化し得る。
本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の更なるインビボ適用については、Ｍａｃｋａｙ ＪＰ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１ Ｍａｒ；１８（３）：２５６－６１）、Ｎｅｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．２０１５ Ｊｕｌ；３７（７）：７３２－９）及びＡｂｉｌ Ｚ ａｎｄ Ｚｈａｏ Ｈ（Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ．２０１５ Ｏｃｔ；１１（１０）：２６５８－６５）が参照され、これらは参照により本明細書に援用される。詳細には、本発明の特定の実施形態において、好ましくは触媒不活性Ｃａｓ１３ｂを使用することによる特定の実施形態において以下の適用が想定される：翻訳の亢進（例えば、Ｃａｓ１３ｂ－翻訳促進因子融合物（例えば、ｅＩＦ４融合物））；翻訳の抑制（例えば、リボソーム結合部位を標的とするｇＲＮＡ）；エクソンスキッピング（例えば、スプライスドナー及び／又はアクセプター部位を標的とするｇＲＮＡ）；エクソンインクルージョン（例えば、特定のエクソンスプライスドナー及び／又はアクセプター部位が含まれるように標的化するｇＲＮＡ又はスプライソソーム成分（例えば、Ｕ１ ｓｎＲＮＡ）に融合した若しくはそれを動員するＣａｓ１３ｂ）；ＲＮＡ局在への接近（例えば、Ｃａｓ１３ｂ－マーカー融合物（例えば、ＥＧＦＰ融合物））；ＲＮＡ局在の変化（例えば、Ｃａｓ１３ｂ－局在化シグナル融合物（例えば、ＮＬＳ又はＮＥＳ融合物））；ＲＮＡ分解（この場合、Ｃａｓ１３ｂの活性に依存する場合、触媒不活性Ｃａｓ１３ｂは使用されないものとし、代わりに及び特異性の増加のため、スプリットＣａｓ１３ｂが使用され得る）；ｇＲＮＡの分解又は機能部位への結合によるなど（恐らくＣａｓ１３ｂ－シグナル配列融合物による再局在化によって特異的部位でタイトレートアウトする）、非コードＲＮＡ機能（例えば、ｍｉＲＮＡ）の阻害。
Ｃａｓ１３ｂ機能は、ｃｒＲＮＡの５’又は３’伸長及びｃｒＲＮＡループの伸長に対してロバストである。従って、複合体形成及び標的転写物への結合に影響を及ぼすことなくｃｒＲＮＡにＭＳ２ループ及び他の動員ドメインを付加し得ることが想定される。様々なエフェクタードメインを動員するためのｃｒＲＮＡに対するかかる改変は、上記に記載したＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質の使用において適用可能である。
Ｃａｓ１３ｂは、ＲＮＡファージ耐性を媒介する能力を有する。従って、Ｃａｓ１３ｂを使用して、限定はされないが、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶなどのレンチウイルス）、ＨＣＶ、エボラウイルス及びジカウイルスを含めたＲＮＡ単独病原体に対して例えば動物、ヒト及び植物を免疫し得ることが想定される。
特定の実施形態では、Ｃａｓ１３ｂは、それ自体のアレイをプロセシング（切断）できる。これは、野生型Ｃａｓ１３ｂタンパク質と、本明細書に記載される１つ以上の突然変異アミノ酸残基を含む突然変異Ｃａｓ１３ｂタンパク質との両方に適用される。従って、種々の標的転写物及び／又は適用に向けて設計された複数のｃｒＲＮＡを単一のｐｒｅ－ｃｒＲＮＡとして又は１つのプロモーターによってドライブされる単一の転写物として送達し得ることが想定される。かかる送達方法には、実質的によりコンパクトで、合成がより容易で、且つウイルス系での送達がより容易であるという利点がある。本明細書におけるＣａｓ１３ｂのオルソログについて、正確なアミノ酸位置は、異なることもあり、これは、当該技術分野において公知のとおり且つ本明細書において他の部分に記載されるとおり、タンパク質アラインメントによって適切に決定し得ることが理解されるであろう。本発明の態様は、原核細胞又は真核細胞におけるインビトロ、インビボ又はエキソビボでのゲノムエンジニアリングにおける、例えば１つ以上の遺伝子又は１つ以上の遺伝子産物の発現を変化させるか又は操作するための、本明細書に記載される組成物及び系の方法及び使用も包含する。
本発明の態様は、原核細胞又は真核細胞におけるインビトロ、インビボ又はエキソビボでのゲノム又はトランスクリプトームエンジニアリングにおける、例えば１つ以上の遺伝子又は１つ以上の遺伝子産物の（タンパク質）発現を変化させる又は操作するための、本明細書に記載される組成物及び系の方法及び使用も包含する。
ある態様において、本発明は、細胞における標的ＲＮＡの（タンパク質）発現を調節する、例えば低下させるための方法及び組成物を提供する。本方法では、ＲＮＡの転写、安定性及び／又は翻訳に干渉する本発明のＣａｓ１３ｂ系が提供される。
特定の実施形態において、有効量のＣａｓ１３ｂ系を使用してＲＮＡが切断されるか、又は他にＲＮＡ発現が阻害される。これに関連して、この系はｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡと同様の使用を有し、従ってまた、かかる方法に代えることもできる。この方法は、限定なしに、例えば、干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなど）又はその転写鋳型、例えばｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡの代わりとしてのＣａｓ１３ｂ系の使用を含む。Ｃａｓ１３ｂ系は、例えば、標的細胞を含む哺乳類への投与によって標的細胞に導入される。
有利には、本発明のＣａｓ１３ｂ系は特異的である。例えば、干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなど）ポリヌクレオチド系は設計及び安定性の問題並びにオフターゲット結合に悩まされるが、本発明のＣａｓ１３ｂ系は高い特異性で設計することができる。
不安定化Ｃａｓ１３ｂ
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの本発明に係るエフェクタータンパク質（ＣＲＩＳＰＲ酵素；Ｃａｓ１３ｂ）は、不安定化ドメイン（ＤＤ）に会合又は融合される。一部の実施形態において、ＤＤはＥＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態において４ＨＴである。そのため、一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＤのうちの１つがＥＲ５０であり、従って安定化リガンドが４ＨＴ又はＣＭＰ８である。一部の実施形態において、ＤＤはＤＨＦＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態においてＴＭＰである。そのため、一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＤのうち１つがＤＨＦＲ５０であり、従って安定化リガンドがＴＭＰである。一部の実施形態において、ＤＤはＥＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態においてＣＭＰ８である。従ってＣＭＰ８は、ＥＲ５０系における４ＨＴの代替となる安定化リガンドであり得る。ＣＭＰ８及び４ＨＴを競合的に使用し得る／使用すべきである可能性があり得るが、一部の細胞型はこれらの２つのリガンドのいずれか一方の影響を受け易いこともあり、本開示及び当該技術分野における知識から、当業者はＣＭＰ８及び／又は４ＨＴを使用することができる。
一部の実施形態において、１つ又は２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ端側末端に融合され、１つ又は２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＣ端側に融合され得る。一部の実施形態では、少なくとも２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素と会合し、且つそれらのＤＤは同じＤＤであり、即ちＤＤは同種である。従って、ＤＤの両方（又は２つ以上）がＥＲ５０ ＤＤであり得る。一部の実施形態ではこれが好ましい。代わりに、ＤＤの両方（又は２つ以上）がＤＨＦＲ５０ ＤＤであり得る。これも一部の実施形態では好ましい。一部の実施形態において、少なくとも２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素と会合し、且つそれらのＤＤは異なるＤＤであり、即ちＤＤは異種である。従って、ＤＤの１つがＥＲ５０であり得る一方、ＤＤの１つ以上又は任意の他のＤＤがＤＨＦＲ５０であり得る。異種である２つ以上のＤＤを有することは、より高い分解制御レベルをもたらし得るため有利であり得る。Ｎ端又はＣ端における２つ以上のＤＤのタンデム融合が分解を増強し得、及びかかるタンデム融合は、例えば、ＥＲ５０－ＥＲ５０－Ｃａｓ１３ｂ又はＤＨＦＲ－ＤＨＦＲ－Ｃａｓ１３ｂであり得る。いずれの安定化リガンドも存在しない場合に高レベルの分解が起こり、一方の安定化リガンドが存在せず、他方の（又は別の）安定化リガンドが存在する場合に中間レベルの分解が起こり得る一方、安定化リガンドの両方（又は２つ以上）が存在する場合に低レベルの分解が起こり得ることが想定される。制御はまた、Ｎ端側ＥＲ５０ ＤＤ及びＣ端側ＤＨＦＲ５０ ＤＤを有することによってもたらされ得る。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素とＤＤの融合は、ＤＤとＣＲＩＳＰＲ酵素との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーはＧｌｙＳｅｒリンカーである。一部の実施形態において、ＤＤ－ＣＲＩＳＰＲ酵素は少なくとも１つの核外移行シグナル（ＮＥＳ）を更に含む。一部の実施形態において、ＤＤ－ＣＲＩＳＰＲ酵素は２つ以上のＮＥＳを含む。一部の実施形態において、ＤＤ－ＣＲＩＳＰＲ酵素は少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。これは、ＮＥＳに加えて含むのであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素とＤＤとの間のリンカーとして又はその一部として、局在化（核内移行又は核外移行）シグナルを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなる。ＨＡ又はＦｌａｇタグもリンカーとしての本発明の範囲内にある。本出願人らは、ＮＬＳ及び／又はＮＥＳをリンカーとして使用し、また、ＧＳほどの短さのものから最大（ＧＧＧＧＳ）３に至るまでのグリシンセリンリンカーも使用する。
不安定化ドメインには、広範囲のタンパク質に不安定性を付与する一般的な有用性がある。例えば、Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｍａｒ ７，２０１２；１３４（９）：３９４２－３９４５（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。ＣＭＰ８又は４－ヒドロキシタモキシフェンは不安定化ドメインであり得る。より一般的には、Ｎ末端規則による不安定化残基である哺乳類ＤＨＦＲの温度感受性突然変異体（ＤＨＦＲｔｓ）が、許容温度で安定であるが、３７℃で不安定であることが分かった。ＤＨＦＲｔｓを発現する細胞に哺乳類ＤＨＦＲの高親和性リガンドであるメトトレキサートを加えると、タンパク質の分解が部分的に阻害された。これは、細胞において本来分解の標的となるタンパク質を小分子リガンドが安定化させ得るという重要な実証であった。ラパマイシン誘導体を使用すると、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインの不安定突然変異体（ＦＲＢ＊）が安定化し、融合したキナーゼＧＳＫ－３βの機能が回復した６，７。この系は、リガンド依存的な安定性が、複雑な生物学的環境にある特異的タンパク質の機能を調節する魅力的な戦略に相当することを実証した。タンパク質活性の制御系には、ラパマイシンによって誘導されたＦＫ５０６結合タンパク質とＦＫＢＰ１２との二量体化によってユビキチン相補性が生じると機能性になるＤＤが関与し得る。ヒトＦＫＢＰ１２又はｅｃＤＨＦＲタンパク質の突然変異体は、その高親和性リガンド、それぞれＳｈｉｅｌｄ－１又はトリメトプリム（ＴＭＰ）が存在しない場合には代謝的に不安定であるようにエンジニアリングすることができる。これらの突然変異体は、本発明の実施において有用な可能な不安定化ドメイン（ＤＤ）の一部であり、及びＣＲＩＳＰＲ酵素との融合物としてのＤＤの不安定性がプロテアソームによる融合タンパク質全体のＣＲＩＳＰＲタンパク質分解をもたらす。Ｓｈｉｅｌｄ－１及びＴＭＰは用量依存的にＤＤに結合してそれを安定化させる。エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲＬＢＤ、ＥＲＳ１の残基３０５～５４９）も不安定化ドメインとしてエンジニアリングすることができる。エストロゲン受容体シグナル伝達経路は乳癌などの種々の疾患に関与するため、この経路は広く研究されており、多くのエストロゲン受容体作動薬及び拮抗薬が開発されている。従って、ＥＲＬＢＤと薬物との適合性のあるペアが公知である。突然変異形態のＥＲＬＢＤに結合するが、野生型形態のＥＲＬＢＤには結合しないリガンドがある。３つの突然変異（Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ）をコードするこれらの突然変異ドメインの１つを使用することにより、内因性エストロゲン感受性ネットワークを乱すことのないリガンドを用いてＥＲＬＢＤ由来のＤＤの安定性を調節することが可能である。追加の突然変異（Ｙ５３７Ｓ）を導入してＥＲＬＢＤを更に不安定化させ、それを潜在的なＤＤ候補として構成することができる。この四重突然変異体は、有利なＤＤ展開である。この突然変異ＥＲＬＢＤをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、且つリガンドを用いてその安定性を調節し又は撹乱させることができ、これによりＣＲＩＳＰＲ酵素がＤＤを有する。別のＤＤは、Ｓｈｉｅｌｄ１リガンドによって安定化する、突然変異ＦＫＢＰタンパク質をベースとする１２ｋＤａ（１０７アミノ酸）タグであり得る。例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５，（２００８）を参照されたい。例えば、ＤＤは、合成の生物学的に不活性な小分子、Ｓｈｉｅｌｄ－１に結合し、且つそれによって可逆的に安定化される、改変されたＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）であり得、例えば、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ＬＡ，Ｃｈｅｎ ＬＣ，Ｍａｙｎａｒｄ－Ｓｍｉｔｈ ＬＡ，Ｏｏｉ ＡＧ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ ＴＪ．“Ａ ｒａｐｉｄ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ，ａｎｄ ｔｕｎａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”．Ｃｅｌｌ．２００６；１２６：９９５－１００４；Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ＬＡ，Ｓｅｌｌｍｙｅｒ ＭＡ，Ｃｏｎｔａｇ ＣＨ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ ＴＪ，Ｔｈｏｒｎｅ ＳＨ．“Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｍｉｃｅ”．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００８；１４：１１２３－１１２７；Ｍａｙｎａｒｄ－Ｓｍｉｔｈ ＬＡ，Ｃｈｅｎ ＬＣ，Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ＬＡ，Ｏｏｉ ＡＧ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ ＴＪ．“Ａ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｓｉｌｅｎｔ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００７；２８２：２４８６６－２４８７２；及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．Ｍａｒ ２３，２０１２；１９（３）：３９１－３９８（これらは、全て参照により本明細書に援用される）を参照されたく、及び本発明の実施においてＣＲＩＳＰＲ酵素と会合させるＤＤの選択において本発明の実施で用いられ得る。理解し得るとおり、当該技術分野における知識には幾つものＤＤが含まれ、及びＤＤは、ＣＲＩＳＰＲ酵素と、有利にはリンカーを伴い会合させる、例えば融合することができ、それによってＤＤをリガンドの存在下で安定化させることができ、且つそれが存在しないとき、ＤＤを不安定化させることができ、それによってＣＲＩＳＰＲ酵素が全体として不安定化するか、又はＤＤはリガンドが存在しない場合に安定化させることができ、且つリガンドが存在するときにＤＤを不安定化させることができ、ＤＤによってＣＲＩＳＰＲ酵素、従ってＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体又は系を調節又は制御する － いわばオン・オフを切り替えることが可能となり、それにより系を例えばインビボ又はインビトロ環境で調節又は制御する手段が提供される。例えば、目的のタンパク質をＤＤタグとの融合物として発現させると、それは細胞内で不安定化し、例えばプロテアソームによって急速に分解される。従って、安定化リガンドが存在しないと、Ｄが会合したＣａｓの分解につながる。新規ＤＤを目的のタンパク質に融合させると、その不安定性が目的のタンパク質に付与され、融合タンパク質全体の急速な分解が生じる。Ｃａｓのピーク活性は、時にオフターゲット効果の低減に有益である。従って、高い活性の短いバーストが好ましい。本発明はかかるピークを提供することが可能である。ある意味では、この系は誘導性である。別の意味では、この系は安定化リガンドの非存在下で抑制され、且つ安定化リガンドの存在下で抑制が解除される。
植物及び酵母へのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の適用
定義：
一般に、用語「植物」は、細胞分裂によって特徴的に成長し、葉緑体を含有し、且つセルロースで構成された細胞壁を有する植物界（Ｐｌａｎｔａｅ）の任意の様々な光合成生物、真核生物、単細胞生物又は多細胞生物に関する。用語の植物には単子葉及び双子葉植物が包含される。具体的には、植物には、限定なしに、アカシア、アルファルファ、アマランス、リンゴ、アンズ、チョウセンアザミ、トネリコの木、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ類、テンサイ、カバノキ、ブナノキ、クロイチゴ、ブルーベリー、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタループ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、ヒマラヤスギ、穀物、セロリ、クリ、サクランボ、ハクサイ、柑橘類、クレメンタイン、クローバ、コーヒー、トウモロコシ、ワタ、ササゲ、キュウリ、イトスギ、ナス、ニレ、エンダイブ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、モミ、ゼラニウム、ブドウ、グレープフルーツ、ラッカセイ類、ホオズキ、ガムヘムロック（ｇｕｍ ｈｅｍｌｏｃｋ）、ヒッコリー、ケール、キーウィフルーツ、コールラビ、カラマツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、ニセアカシア、マツ、メイデンヘア、トウモロコシ、マンゴー、カエデ、メロン、キビ、キノコ、カラシ、堅果類、オーク、オートムギ、油ヤシ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞植物又は装飾花又は観賞樹、パパイヤ、ヤシ、パセリ、パースニップ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、セイヨウナシ、ピート、コショウ、カキ、キマメ、マツ、パイナップル、オオバコ、セイヨウスモモ、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、赤チコリ、ダイコン、ナタネ、キイチゴ、コメ、ライムギ、モロコシ、ベニバナ、サルヤナギ、ダイズ、ホウレンソウ、エゾマツ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、スイートコーン、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、樹木、ライ小麦、芝草、カブ、つる植物、クルミ、オランダガラシ、スイカ、コムギ、ヤムイモ、イチイ及びズッキーニなどの被子植物及び裸子植物が含まれることが意図される。用語の植物には、それらに根、葉及び高等植物を特徴付ける他の器官がないことによって主に統一された、大部分が光独立栄養生物である藻類も包含される。
本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティング系を使用した遺伝子発現の調節方法を使用して、本質的にいかなる植物にも所望の形質を付与することができる。本明細書に記載される所望の生理学的及び農学的特性について、本開示の核酸構築物及び上述の様々な形質転換方法を用いて多種多様な植物及び植物細胞系をエンジニアリングし得る。好ましい実施形態において、エンジニアリングの標的となる植物及び植物細胞としては、限定はされないが、穀類作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、コメ、キビ、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）；顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹及びマツの木（例えば、モミ、エゾマツ）；ファイトレメディエーションで用いられる植物（例えば、重金属蓄積植物）；油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）及び実験目的で用いられる植物（例えば、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ））を含めた作物など、単子葉及び双子葉植物が挙げられる。従って、本方法及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は広範囲の植物にわたり、例えばモクレン目（Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ）、シキミ目（Ｉｌｌｉｃｉａｌｅｓ）、クスノキ目（Ｌａｕｒａｌｅｓ）、コショウ目（Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ）、ウマノスズクサ目（Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ）、スイレン目（Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ）、キンポウゲ目（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）、ケシ目（Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ）、サラセニア科（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ）、ヤマグルマ目（Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）、マンサク目（Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ）、トチュウ目（Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ）、レイトネリア目（Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ）、ヤマモモ目（Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ）、ブナ目（Ｆａｇａｌｅｓ）、モクマオウ目（Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ）、ナデシコ目（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ）、バティス目（Ｂａｔａｌｅｓ）、タデ目（Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ）、イソマツ目（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｌｅｓ）、ビワモドキ目（Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ）、ツバキ目（Ｔｈｅａｌｅｓ）、アオイ目（Ｍａｌｖａｌｅｓ）、イラクサ目（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）、サガリバナ目（Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ）、スミレ目（Ｖｉｏｌａｌｅｓ）、ヤナギ目（Ｓａｌｉｃａｌｅｓ）、フウチョウソウ目（Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ）、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、イワウメ目（Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ）、カキノキ目（Ｅｂｅｎａｌｅｓ）、サクラソウ目（Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ）、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）、マメ目（Ｆａｂａｌｅｓ）、カワゴケソウ目（Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ）、アリノトウグサ目（Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ）、フトモモ目（Ｍｙｒｔａｌｅｓ）、ミズキ目（Ｃｏｒｎａｌｅｓ）、ヤマモガシ目（Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ビャクダン目（Ｓａｎ ｔａｌｅｓ）、ラフレシア目（Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ）、ニシキギ目（Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ）、トウダイグサ目（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ）、クロウメモドキ目（Ｒｈａｍｎａｌｅｓ）、ムクロジ目（Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ）、クルミ目（Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ）、フウロソウ目（Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ）、ヒメハギ目（Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ）、セリ目（Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ）、リンドウ目（Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ）、ハナシノブ目（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ）、シソ目（Ｌａｍｉａｌｅｓ）、オオバコ目（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ）、ゴマノハグサ目（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ）、キキョウ目（Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ）、アカネ目（Ｒｕｂｉａｌｅｓ）、マツムシソウ目（Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ）及びキク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）に属する双子葉植物などで用いることができる。本方法及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、オモダカ目（Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ）、トチカガミ目（Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ）、イバラモ目（Ｎａｊａｄａｌｅｓ）、ホンゴウソウ目（Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ）、ツユクサ目（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ）、ホシクサ目（Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ）、サンアソウ目（Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ）、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）、イグサ目（Ｊｕｎｃａｌｅｓ）、カヤツリグサ目（Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ）、ガマ目（Ｔｙｐｈａｌｅｓ）、パイナップル目（Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ）、ショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、ヤシ目（Ａｒｅｃａｌｅｓ）、パナマソウ目（Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ）、タコノキ目（Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ）、サトイモ目（Ａｒａｌｅｓ）、ユリ目（Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ）及びラン目（Ｏｒｃｈｉｄ ａｌｅｓ）に属するものなどの単子葉植物又は裸子植物類（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅ）に属する植物、例えばマツ目（Ｐｉｎａｌｅｓ）、イチョウ目（Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ）、ソテツ目（Ｃｙｃａｄａｌｅｓ）、ナンヨウスギ目（Ａｒａｕｃａｒｉａｌｅｓ）、ヒノキ目（Ｃｕｐｒｅｓｓａｌｅｓ）及びグネツム目（Ｇｎｅｔａｌｅｓ）に属するもので用いることができる。
本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系及び使用方法は、以下の双子葉類、単子葉類又は裸子植物の属の非限定的なリストに含まれる広範囲にわたる植物種に用いることができる：オオカミナスビ属（Ａｔｒｏｐａ）、アルセオダフネ属（Ａｌｓｅｏｄａｐｈｎｅ）、カシューナットノキ属（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ）、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）、ベイルシュミエディア属（Ｂｅｉｌｓｃｈｍｉｅｄｉａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、アオツヅラフジ属（Ｃｏｃｃｕｌｕｓ）、クロトン属（Ｃｒｏｔｏｎ）、ククミス属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）、ココヤシ属（Ｃｏｃｏｓ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）、ククルビタ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、ドゥグエティア属（Ｄｕｇｕｅｔｉａ）、ハナビシソウ属（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｚｉａ）、イチジク属（Ｆｉｃｕｓ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ツノゲシ属（Ｇｌａｕｃｉｕｍ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、ランドルフィア属（Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ）、アマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ハマビワ属（Ｌｉｔｓｅａ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、キャッサバ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、マジョラナ属（Ｍａｊｏｒａｎａ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、オリーブ属（Ｏｌｅａ）、パルセニウム属（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ワニナシ属（Ｐｅｒｓｅａ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、カイノキ属（Ｐｉｓｔａｃｉａ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、キオン属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、ツヅラフジ属（Ｓｉｎｏｍｅｎｉｕｍ）、ハスノハカヅラ属（Ｓｔｅｐｈａｎｉａ）、シロガラシ属（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、ジャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、フェヌグリーク属（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）、ツルニチニチソウ属（Ｖｉｎｃａ）、ブドウ属（Ｖｉｌｉｓ）及びササゲ属（Ｖｉｇｎａ）；及びネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、スズメガヤ属（Ａｒａｇｒｏｓｔｉｓ）、アスパラガス属（Ａｒａｇｒｏｓｔｉｓ）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、フェストロリウム属（Ｆｅｓｔｕｌｏｌｉｕｍ）、ワスレグサ属（Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、アオウキクサ属（Ｌｅｍｎａ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、イチゴツナギ属（Ｐｏａ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）、コウヨウザン属（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）、トウヒ属（Ｐｉｃｅａ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）及びトガサワラ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ）。
ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系及び使用方法は、例えば、紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）（紅藻類）、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）（緑藻類）、褐藻植物門（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）（褐藻類）、珪藻植物門（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）（珪藻類）、真正眼点藻植物門（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）及び渦鞭毛藻類を含む幾つかの真核生物の門並びに原核生物の門、藍色植物門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）（藍藻類）から選択される藻類（ａｌｇａｅ）を含め、広範囲にわたる「藻類」又は「藻類細胞」にも用いることができる。用語「藻類」には、例えば、アンフォラ属（Ａｍｐｈｏｒａ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アンキストロデスムス属（Ａｎｉｋｓｔｒｏｄｅｓｍｉｓ）、ボトリオコッカス属（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、キートケロス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロロコックム属（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、キクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、シリンドロテカ属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ）、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、エミリアニア属（Ｅｍｉｌｉａｎａ）、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ヘマトコッカス属（Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、モノクリシス属（Ｍｏｎｏｃｈｒｙｓｉｓ）、モノラフィディウム属（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ナンノクロリス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、フナガタケイソウ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ネフロクロリス属（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス属（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、ニッチア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、ノドゥラリア属（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、オクロモナス属（Ｏｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、オオキスティス属（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オシラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌａｒｔｏｒｉａ）、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）、フェオダクチラム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、プラチモナス属（Ｐｌａｙｔｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス属（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、アマノリ属（Ｐｏｒｈｙｒａ）、シュードアナベナ属（Ｐｓｅｕｄｏａｎａｂａｅｎａ）、ピラミモナス属（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、スチココッカス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、タラシオシラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）及びアイアカシオ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）から選択される藻類が含まれる。
植物の一部、即ち「植物組織」を本発明の方法に従い処理して改良された植物を作り出し得る。植物組織は植物細胞も包含する。用語「植物細胞」は、本明細書で使用されるとき、インタクトな全植物であるか、又は代わりにインビトロ組織培養下に培地又は寒天上で、成長培地又は緩衝液中の懸濁液中で、又は高度に組織化された単位、例えば植物組織、植物器官又は全植物などの一部として成長した単離された形態であるかのいずれかの、生きている植物の個々の単位を指す。
「プロトプラスト」は、その細胞壁を再形成し、増殖し及び再生して適切な成長条件下で全植物に成長することのできる生きている植物のインタクトな生化学的にコンピテントな単位をもたらす機械的又は酵素的手段を例えば用いてその保護細胞壁が完全に又は部分的に除去された植物細胞を指す。
用語「形質転換」は、広義には、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）又は種々の化学的若しくは物理的方法の１つを用いたＤＮＡの導入によって植物宿主が遺伝子改変される方法を指す。本明細書で使用されるとき、用語「植物宿主」は、植物の任意の細胞、組織、器官又は子孫を含め、植物を指す。多くの好適な植物組織又は植物細胞を形質転換することができ、限定はされないが、プロトプラスト、体細胞胚、花粉、葉、実生、茎、カルス、走根、微小管及び苗条が挙げられる。植物組織は、有性生殖的に生成されたか、それとも無性生殖的に生成されたかに関わらず、かかる植物、種子、子孫、ムカゴの任意のクローン及び挿し木又は種子など、これらのいずれかの子孫も指す。
用語「形質転換された」は、本明細書で使用されるとき、構築物などの外来性ＤＮＡ分子が導入されている細胞、組織、器官又は生物を指す。導入されたＤＮＡ分子は、導入されたＤＮＡ分子が後続の子孫に伝わるようにレシピエント細胞、組織、器官又は生物のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。これらの実施形態において、「形質転換」又は「トランスジェニック」細胞又は植物には、その細胞又は植物の子孫及び交雑でかかる形質転換植物を親として用いる育種計画から作り出された、且つ導入されたＤＮＡ分子の存在によって生じる表現型の変化を呈する子孫も含まれ得る。好ましくは、トランスジェニック植物は稔性であり、導入されたＤＮＡを、有性生殖を通じて子孫に伝えることが可能である。
トランスジェニック植物の子孫など、用語「子孫」は、植物又はトランスジェニック植物から生まれるか、それから作り出されたか、又はそれに由来するものである。導入ＤＮＡ分子は、レシピエント細胞に一過性にも導入され得、そのため、導入ＤＮＡ分子は、後続の子孫によって受け継がれないことになり、従って「トランスジェニック」とは見なされない。従って、本明細書で使用されるとき、「非トランスジェニック」植物又は植物細胞は、そのゲノムに安定に組み込まれた外来ＤＮＡを含有しない植物である。
用語「植物プロモーター」は、本明細書で使用されるとき、その起源が植物細胞であるか否かに関わらず、植物細胞において転写を開始させる能力を有するプロモーターである。例示的な適した植物プロモーターとしては、限定はされないが、植物、植物ウイルス及び植物細胞で発現する遺伝子を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などの細菌から得られるものが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「真菌細胞」は、真菌類の界内にある任意の種類の真核細胞を指す。真菌類の界内にある門としては、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、コウマクノウキン門（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、グロムス門（Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ）、微胞子虫門（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）及びネオカリマスティクス門（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａ）が挙げられる。真菌細胞には、酵母、カビ及び糸状菌類が含まれ得る。一部の実施形態において、真菌細胞は酵母細胞である。
本明細書で使用されるとき、用語「酵母細胞」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）及び担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の範囲内にある任意の真菌細胞を指す。酵母細胞には、出芽酵母細胞、分裂酵母細胞及びカビ細胞が含まれ得る。これらの生物に限定されないが、研究室及び工業環境で使用される多くの種類の酵母が、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の一部である。一部の実施形態において、酵母細胞はＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・マルクシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）又はイサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）細胞である。他の酵母細胞としては、限定なしに、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）（例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ））、ヤロウイア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．）（例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））、クルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）（例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）及びクルイベロミセス・マルクシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ））、アカパンカビ属種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）（例えば、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ））、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ））及びイサチェンキア属種（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｓｐｐ．）（例えば、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、別名ピキア・クドリャフツェフィイ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）及びカンジダ・アシドサーモフィルム（Ｃａｎｄｉｄａ ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））を挙げることができる。一部の実施形態において、真菌細胞は糸状菌細胞である。本明細書で使用されるとき、用語「糸状菌細胞」は、フィラメント状に、即ち菌糸又は菌糸体として成長する任意の種類の真菌細胞を指す。糸状菌細胞の例としては、限定なしに、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ））、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））、リゾプス属種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ））及びモルティエレラ属種（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えば、モルティエレラ・イザベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ））を挙げることができる。
一部の実施形態において、真菌細胞は、工業用菌株である。本明細書で使用されるとき、「工業用菌株」は、工業的プロセス、例えば商業的又は工業的規模での製品の生産において使用されるか又はそれから単離される真菌細胞の任意の株を指す。工業用菌株は、典型的に工業的プロセスで使用される真菌種を指し得るか、又はそれは、非工業目的（例えば、実験研究）にも使用され得る真菌種の分離株を指し得る。工業的プロセスの例としては、発酵（例えば、食品又は飲料製品の生産における）、蒸留、バイオ燃料生産、化合物の生産及びポリペプチドの生産を挙げることができる。工業用菌株の例としては、限定なしに、ＪＡＹ２７０及びＡＴＣＣ４１２４を挙げることができる。
一部の実施形態において、真菌細胞は、倍数体細胞である。本明細書で使用されるとき、「倍数体」細胞は、ゲノムが２つ以上のコピーで存在する任意の細胞を指し得る。倍数体細胞は、天然で倍数体状態において見られる種類の細胞を指し得るか、又はそれは、倍数体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂又はＤＮＡ複製の特異的な調節、変化、不活性化、活性化又は改変によって）誘導された細胞を指し得る。倍数体細胞は、ゲノム全体が倍数体である細胞を指し得るか、又はそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において倍数体である細胞を指し得る。理論に拘束されることを望むものではないが、一倍体細胞と比べて倍数体細胞のゲノムエンジニアリングではガイドＲＮＡの存在量が律速成分となることが多くなり得るため、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂ ＣＲＩＳＰＲ系を用いた方法は特定の真菌細胞タイプの使用を生かし得ると考えられる。
一部の実施形態において、真菌細胞は、二倍体細胞である。本明細書で使用されるとき、「二倍体」細胞は、ゲノムが２つのコピーで存在する任意の細胞を指し得る。二倍体細胞は、天然で二倍体状態において見られる種類の細胞を指し得るか、又はそれは、二倍体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂又はＤＮＡ複製の特異的な調節、変化、不活性化、活性化又は改変によって）誘導された細胞を指し得る。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｓ２２８Ｃは、一倍体又は二倍体状態で維持され得る。二倍体細胞は、ゲノム全体が二倍体である細胞を指し得るか、又はそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において二倍体である細胞を指し得る。一部の実施形態において、真菌細胞は一倍体細胞である。本明細書で使用されるとき、「一倍体」細胞は、ゲノムが１つのコピーで存在する任意の細胞を指し得る。一倍体細胞は、天然で一倍体状態において見られる種類の細胞を指し得るか、又はそれは、一倍体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂又はＤＮＡ複製の特異的な調節、変化、不活性化、活性化又は改変によって）誘導された細胞を指し得る。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｓ２２８Ｃは、一倍体又は二倍体状態で維持され得る。一倍体細胞は、ゲノム全体が一倍体である細胞を指し得るか、又はそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において一倍体である細胞を指し得る。
本明細書で使用されるとき、「酵母発現ベクター」は、ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードする１つ以上の配列を含有する核酸であって、且つその核酸の発現を制御する任意の所望のエレメント並びに酵母細胞内部における発現ベクターの複製及び維持を可能にする任意のエレメントを更に含有し得る核酸を指す。多くの好適な酵母発現ベクター及びそれらの特徴が当該技術分野において公知である。例えば、様々なベクター及び技法が、Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｘｉａｏ，Ｗ．，ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７）及びＢｕｃｋｈｏｌｚ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｍ．Ａ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９（１１）：１０６７－７２に例示されている。酵母ベクターは、限定なしに、セントロメア（ＣＥＮ）配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、目的の配列又は遺伝子に作動可能に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターなどのターミネーター、複製起点及びマーカー遺伝子（例えば、栄養要求体、抗生物質又は他の選択可能マーカー）を含有し得る。酵母において用いられる発現ベクターの例としては、プラスミド、酵母人工染色体、２μプラスミド、酵母組込みプラスミド、酵母複製プラスミド、シャトルベクター及びエピソームプラスミドを挙げることができる。
植物及び植物細胞のゲノムにおけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系構成成分の安定組込み
詳細な実施形態では、植物細胞のゲノムへの安定組込みのためＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分をコードするポリヌクレオチドを導入することが想定される。これらの実施形態において、形質転換ベクター又は発現系の設計は、いつ、どこで及びどのような条件下でガイドＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング遺伝子を発現させるかに応じて調整することができる。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を植物細胞のゲノムＤＮＡに安定に導入することが想定される。それに加えて又は代えて、限定はされないがプラスチド、ミトコンドリア又は葉緑体などの植物細胞小器官のＤＮＡへの安定組込みのためＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を導入することが想定される。
植物細胞のゲノムに安定に組み込むための発現系は、以下のエレメントの１つ以上を含有し得る：植物細胞においてガイドＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング酵素を発現させるために使用し得るプロモーターエレメント；発現を増強する５’非翻訳領域；単子葉植物細胞など、特定の細胞における発現を更に増強するイントロンエレメント；１つ以上のガイドＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング遺伝子配列及び他の所望のエレメントを挿入するのに好都合な制限部位を提供する多クローニング部位；及び発現した転写物の効率的な終結をもたらす３’非翻訳領域。
発現系のエレメントは、プラスミド又は形質転換ベクターのように環状又は線状二本鎖ＤＮＡのように非環状のいずれかである１つ以上の発現構築物上にあり得る。詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ発現系は、少なくとも、
（ａ）植物の標的配列とハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、ガイド配列とダイレクトリピート配列とを含むガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び
（ｂ）ＲＮＡターゲティングタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含み、ここで、構成成分（ａ）又は（ｂ）は、同じ又は異なる構築物上に位置し、これにより、異なるヌクレオチド配列は、植物細胞において作動可能な同じ又は異なる調節エレメントの制御下にあることができる。
ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分及び該当する場合には鋳型配列を含有するＤＮＡ構築物は、種々の従来技術によって植物、植物部位又は植物細胞のゲノムに導入し得る。このプロセスには、概して、好適な宿主細胞又は宿主組織を選択するステップ、宿主細胞又は宿主組織に構築物を導入するステップ及びそれから植物細胞又は植物を再生するステップが含まれる。
詳細な実施形態では、ＤＮＡ構築物は、限定はされないが、電気穿孔、マイクロインジェクション、植物細胞プロトプラストのエアロゾルビーム注入などの技法を用いて植物細胞に導入し得るか、又はＤＮＡ構築物は、ＤＮＡパーティクルボンバードメントなどの微粒子銃法を用いて植物組織に直接導入することもできる（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２０００ Ｆｅｂ；９（１）：１１－９も参照されたい）。パーティクルボンバードメントの基本は、目的の遺伝子で被覆された粒子を細胞に向けて加速させることにより粒子を原形質に侵入させて、典型的にはゲノムへの安定組込みを得るというものである（例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）、Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）を参照されたい）。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を含有するＤＮＡ構築物は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換によって植物に導入し得る。ＤＮＡ構築物を好適なＴ－ＤＮＡフランキング領域と組み合わせて、従来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主ベクターに導入し得る。外来ＤＮＡは、植物を感染させることによるか、又は植物プロトプラストを、１つ以上のＴｉ（腫瘍誘発）プラスミドを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌と共にインキュベートすることにより、植物のゲノムに取り入れることができる（例えば、Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８５），Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）及び米国特許第５，５６３，０５５号明細書を参照されたい）。
植物プロモーター
植物細胞における適切な発現を確実にするため、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂ ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分は、典型的には植物プロモーター、即ち植物細胞において作動可能なプロモーターの制御下に置かれる。様々な種類のプロモーターの使用が想定される。
構成的植物プロモーターは、それが制御するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を植物の全て又はほぼ全ての発生段階において全て又はほぼ全ての植物組織で発現（「構成的発現」と称される）させることが可能なプロモーターである。構成的プロモーターの非限定的な１つの例はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターである。本発明は、ＲＮＡ配列の改変方法を想定し、そのため植物生体分子の発現を調節することも想定する。従って、本発明の詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを調節型であり得るプロモーターの制御下に置くことが有利である。「調節型プロモーター」は、構成的でないものの時間的及び／又は空間的に調節された形で遺伝子発現を導くプロモーターを指し、組織特異的、組織優先的及び誘導性プロモーターが含まれる。異なるプロモーターは、異なる組織又は細胞型において、又は異なる発生段階で、又は異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を導き得る。詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構成成分の１つ以上がカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下で発現し、組織優先的（ｉｓｓｕｅ－ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターを利用することにより、特定の植物組織内のある種の細胞型、例えば葉又は根の維管束細胞又は種子の特異的細胞における発現の増強を標的化することができる。ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系において用いられる詳細なプロモーターの例については、Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：７９２－８０３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ １２：２５５－６５；Ｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０：２０７－１８、Ｋｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９：７５９－７２及びＣａｐａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：６８１－９１が参照される。誘導性で、且つ遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御を可能にするプロモーターの例は、ある形態のエネルギーを使用し得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、音響エネルギー、電磁放射線、化学エネルギー及び／又は熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ－Ｏｎ又はＴｅｔ－Ｏｆｆ）、小分子ツーハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン又はクリプトクロム）、例えば転写活性の配列特異的変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）が挙げられる。光誘導性系の構成成分には、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来）及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例が、米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。
詳細な実施形態では、例えば化学物質調節型プロモーターを使用して一過性又は誘導性発現を実現することができ、即ちこれによれば外因性化学物質を加えると遺伝子発現が誘導される。遺伝子発現の調節は、化学物質抑制性プロモーターによっても達成することができ、ここで、化学物質を加えると遺伝子発現が抑制される。化学物質誘導性プロモーターとしては、限定はされないが、ベンゼンスルホンアミド系除草剤解毒剤によって活性化するトウモロコシｌｎ２－２プロモーター（Ｄｅ Ｖｅｙｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：５６８－７７）、発芽前除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化するトウモロコシＧＳＴプロモーター（ＧＳＴ－ＩＩ－２７、国際公開第９３／０１２９４号パンフレット）及びサリチル酸によって活性化するタバコＰＲ－１ａプロモーター（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６８：８０３－７）が挙げられる。テトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモーターなど、抗生物質によって調節されるプロモーター（Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２７：２２９－３７；米国特許第５，８１４，６１８号明細書及び同第５，７８９，１５６号明細書）も本明細書において使用することができる。
特定の植物細胞小器官における移行及び／又はそこでの発現
発現系は、特定の植物細胞小器官への移行及び／又はそこでの発現のためのエレメントを含み得る。
葉緑体ターゲティング
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を使用して葉緑体遺伝子の発現及び／又は翻訳を特異的に改変するか、又は葉緑体での発現を確実にすることが想定される。この目的で、葉緑体形質転換方法又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構成成分の葉緑体への区画化が用いられる。例えば、プラスチドゲノムに遺伝子改変を導入すると、花粉を通じた遺伝子流動などのバイオセーフティ問題を軽減することができる。
葉緑体形質転換方法は、当該技術分野において公知であり、パーティクルボンバードメント、ＰＥＧ処理及びマイクロインジェクションが挙げられる。加えて、国際公開第２０１００６１１８６号パンフレットに記載されるとおり、核ゲノムからプラスチドへの形質転換カセットの移行が関わる方法を用いることができる。
代わりに、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構成成分の１つ以上を植物葉緑体に標的化することが想定される。これは、ＲＮＡターゲティングタンパク質をコードする配列の５’領域に作動可能に連結された、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）又はプラスチド輸送ペプチドをコードする配列を発現構築物に取り込むことにより実現する。ＣＴＰは葉緑体への移行中にプロセシング段階で除去される。発現タンパク質の葉緑体ターゲティングは当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｔｏ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ，２０１０，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１：１５７－１８０を参照されたい）。かかる実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡを植物葉緑体に標的化することも望ましい。葉緑体局在化配列を用いてガイドＲＮＡを葉緑体に移行させるために用いることのできる方法及び構築物については、例えば、米国特許出願公開第２００４０１４２４７６号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されている。かかる各種構築物を本発明の発現系に取り込むことにより、ＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡを効率的に移行させることができる。
藻類細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡターゲティング系をコードするポリヌクレオチドの導入
トランスジェニック藻類（又はセイヨウアブラナなどの他の植物）は、植物油又はバイオ燃料、例えばアルコール類（特にメタノール及びエタノール）又は他の生産物の生産に特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される高レベルの油又はアルコールを発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
米国特許第８９４５８３９号明細書は、Ｃａｓ９を用いた微細藻類（コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）細胞）種）のエンジニアリング方法について記載している。同様のツールを使用して、本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の方法をクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）種及び他の藻類に適用することができる。詳細な実施形態では、Ｈｓｐ７０Ａ－Ｒｂｃ Ｓ２又はβ２－チューブリンなどの構成的プロモーターの制御下でＲＮＡターゲティングタンパク質を発現するベクターを使用して藻類にＲＮＡターゲティングタンパク質及びガイドＲＮＡを導入し、発現させる。ガイドＲＮＡは、任意選択で、Ｔ７プロモーターを含有するベクターを使用して送達される。代わりに、藻類細胞にＲＮＡターゲティングｍＲＮＡ及びインビトロ転写ガイドＲＮＡが送達され得る。当業者には、ＧｅｎｅＡｒｔクラミドモナスエンジニアリングキットからの標準的な推奨プロトコルなど、電気穿孔プロトコルが利用可能である。
酵母細胞におけるＲＮＡターゲティング構成成分をコードするポリヌクレオチドの導入
詳細な実施形態では、本発明は、酵母細胞におけるＲＮＡ編集のためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用に関する。ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系構成成分をコードするポリヌクレオチドの導入に用いることのできる酵母細胞の形質転換方法は当業者に周知であり、Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｕｇｓ．２０１０ Ｎｏｖ－Ｄｅｃ；１（６）：３９５－４０３）によってレビューされている。非限定的な例としては、酢酸リチウム処理による酵母細胞の形質転換（これはキャリアＤＮＡ及びＰＥＧ処理を更に含み得る）、ボンバードメント又は電気穿孔によるものが挙げられる。
植物及び植物細胞におけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系構成成分の一過性発現
詳細な実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング遺伝子を植物細胞において一過性に発現させることが想定される。これらの実施形態では、細胞内にガイドＲＮＡ及びＲＮＡターゲティングタンパク質の両方が存在するときに限りＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系がＲＮＡ標的分子を改変することが確実となり、従って遺伝子発現を更に制御することができる。ＲＮＡターゲティング酵素の発現は一過性であるため、かかる植物細胞から再生した植物は、典型的には外来ＤＮＡを含有しない。詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティング酵素は植物細胞によって安定に発現し、ガイド配列が一過性に発現する。
特に好ましい実施形態において、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系構成成分は植物ウイルスベクターを使用して植物細胞に導入することができる（Ｓｃｈｏｌｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．１９９６；３４：２９９－３２３）。更なる詳細な実施形態では、前記ウイルスベクターはＤＮＡウイルス由来のベクターである。例えば、ジェミニウイルス（例えば、キャベツ巻葉ウイルス、マメ萎黄ウイルス、コムギ萎縮ウイルス、トマト巻葉ウイルス、トウモロコシ条斑ウイルス、タバコ巻葉ウイルス又はトマトゴールデンモザイクウイルス）又はナノウイルス（例えば、ソラマメ黄化えそウイルス）。他の詳細な実施形態では、前記ウイルスベクターはＲＮＡウイルス由来のベクターである。例えば、トブラウイルス（例えば、タバコ茎えそウイルス、タバコモザイクウイルス）、ポテックスウイルス（例えば、ジャガイモＸウイルス）又はホルデイウイルス（例えば、ムギ斑葉モザイクウイルス）。植物ウイルスの複製ゲノムは非組込みベクターであり、これはＧＭＯ植物の作製の回避との関連で有利である。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構築物の一過性発現に使用されるベクターは、例えばｐＥＡＱベクターであり、これはプロトプラストにおけるアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性一過性発現に合わせて調整されているものである（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２００９ Ｓｅｐ；７（７）：６８２－９３）。ＣＲＩＳＰＲ酵素を発現する安定トランスジェニック植物において改変キャベツ巻葉ウイルス（ＣａＬＣｕＶ）ベクターを使用してｇＲＮＡを発現させた、ゲノム位置の正確なターゲティングが実証された（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１４９２６（２０１５），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１４９２６）。
詳細な実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング遺伝子をコードする二本鎖ＤＮＡ断片を植物細胞に一過性に導入することができる。かかる実施形態において、導入される二本鎖ＤＮＡ断片は、細胞においてＲＮＡ分子を改変するのに十分な、しかし企図された時間が経った後又は１回以上の細胞分裂後に残らない量で提供される。植物においてＤＮＡトランスファーを導く方法は当業者に公知である（例えば、Ｄａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８９ Ｓｅｐ；１３（３）：２７３－８５を参照されたい）
他の実施形態では、ＲＮＡターゲティングタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドが、ＲＮＡ分子細胞を（少なくとも１つのガイドＲＮＡの存在下で）改変するのに十分な、しかし企図された時間が経った後又は１回以上の細胞分裂後に残らない量で植物細胞に導入され、次にこれが宿主細胞によって翻訳及びプロセシングされて、タンパク質が生成される。植物プロトプラストにｍＲＮＡを一過性発現のため導入する方法は当業者に公知である（例えば、Ｇａｌｌｉｅ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９３），１３；１１９－１２２を参照されたい）。上記に記載される異なる方法の組み合わせも想定される。
植物細胞へのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構成成分の送達
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の構成成分を植物細胞に直接送達することが有益である。これは特に、非トランスジェニック植物の作成に有益である（下記を参照されたい）。詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティング構成成分の１つ以上が植物又は植物細胞の外部で調製され、細胞に送達される。例えば、詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングタンパク質がインビトロで調製された後、植物細胞に導入される。ＲＮＡターゲティングタンパク質は当業者に公知の、組換え産生を含めた様々な方法によって調製することができる。発現後、ＲＮＡターゲティングタンパク質が単離され、必要に応じてリフォールディングされ、精製され、且つ任意選択でＨｉｓタグなどの任意の精製タグを除去するため処理される。粗製の、部分的に精製された又はより完全に精製されたＲＮＡターゲティングタンパク質が得られると、そのタンパク質が植物細胞に導入され得る。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングタンパク質が、目的のＲＮＡを標的とするガイドＲＮＡと混合されて、予めアセンブルされたリボ核タンパク質が形成される。
個々の構成成分又は予めアセンブルされたリボ核タンパク質は、電気穿孔を用いるか、ＲＮＡターゲティング関連遺伝子産物で被覆した粒子のボンバードメントによるか、化学的トランスフェクションによるか、又は細胞膜を越えて輸送する他の何らかの手段によって植物細胞に導入することができる。例えば、予めアセンブルされたＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質による植物プロトプラストのトランスフェクションは、植物ゲノムの標的化した改変を確実にすることが実証されている（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５；ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３８９による記載のとおり）。これらの方法を修正して、植物におけるＲＮＡ分子の標的化した改変を実現することができる。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系構成成分はナノ粒子を用いて植物細胞に導入される。構成成分は、タンパク質又は核酸のいずれとしても、又は代わりにそれらの組み合わせでも、ナノ粒子上にアップロードするか又はそれにパッケージングして植物に適用することができる（例えば、国際公開第２００８０４２１５６号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１３０１８５８２３号明細書の記載など）。詳細には、本発明の実施形態は、国際公開第２０１５０８９４１９号パンフレットに記載されるとおり、ＲＮＡターゲティングタンパク質をコードするＤＮＡ分子、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子及び／又は単離ガイドＲＮＡがアップロード又はパッケージングされたナノ粒子を含む。
ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の構成成分を植物細胞に導入する更なる手段は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を用いることによるものである。従って、詳細には、本発明の実施形態は、ＲＮＡターゲティングタンパク質に連結された細胞透過性ペプチドを含む組成物を含む。本発明の詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングタンパク質及び／又はガイドＲＮＡは、それらを植物プロトプラストの内部に有効に輸送するため１つ以上のＣＰＰにカップリングされる（ヒト細胞におけるＣａｓ９については、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ（２０１４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ｊｕｎ；２４（６）：１０２０－７）。他の実施形態において、ＲＮＡターゲティング遺伝子及び／又はガイドＲＮＡは、植物プロトプラスト送達のため１つ以上のＣＰＰにカップリングされた１つ以上の環状又は非環状ＤＮＡ分子によってコードされる。次に、植物プロトプラストは、植物細胞及び更に植物に再生される。ＣＰＰは、概して、生体分子を、受容体非依存的に細胞膜を越えて輸送する能力を有するタンパク質又はキメラ配列のいずれかに由来する３５アミノ酸未満の短鎖ペプチドとして記載される。ＣＰＰは、カチオン性ペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリンリッチな抗微生物性の配列を有するペプチド及びキメラ又は二部ペプチドであり得る（Ｐｏｏｇａ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｌ ２００５）。ＣＰＰは生体膜を透過することが可能であり、そのため様々な生体分子の細胞膜を越えて細胞質に入る移動を引き起こし、且つそれらの細胞内輸送を改善することが可能であり、従って生体分子（ｂｉｏｌｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）と標的の相互作用を促進する。ＣＰＰの例としては、中でも特に、ＨＩＶ １型によるウイルス複製に必要な核内転写活性化タンパク質であるＴａｔ、ペネトラチン、カポジ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナルペプチド配列、インテグリンβ３シグナルペプチド配列；ポリアルギニンペプチドＡｒｇ配列、グアニンリッチ分子輸送体、スイートアローペプチド等が挙げられる。
植物、藻類又は真菌適用が想定される標的ＲＮＡ
標的ＲＮＡ、即ち目的のＲＮＡは、本発明によって標的化されるＲＮＡであり、標的ＲＮＡ上の目的の標的部位へのＲＮＡターゲティングタンパク質の動員及びそこにおける結合につながる。標的ＲＮＡは、任意の好適な形態のＲＮＡであり得る。これには、一部の実施形態では、ｍＲＮＡが含まれ得る。他の実施形態では、標的ＲＮＡにはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）又はリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）が含まれ得る。他の実施形態では、標的ＲＮＡには、干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、マイクロスイッチ、マイクロザイム、サテライトＲＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれ得る。標的ＲＮＡは植物細胞の細胞質に、又は細胞核に、又はミトコンドリア、葉緑体若しくはプラスチドなどの植物細胞小器官に位置し得る。
詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を使用してＲＮＡが切断されるか、又は他にＲＮＡ発現が阻害される。
ＲＮＡ調節による植物遺伝子発現の調節のためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
ＲＮＡターゲティングタンパク質は、好適なガイドＲＮＡと共に、ＲＮＡプロセシングの制御による遺伝子発現のターゲティングにも使用され得る。ＲＮＡプロセシングの制御には、選択的スプライシング又は特定のスプライス変異体若しくはアイソフォームの特異的ターゲティングを含めたＲＮＡスプライシング；ウイルス複製（詳細には、植物のウイロイドを含めた植物ウイルスのもの及びｔＲＮＡ生合成などのＲＮＡプロセシング反応が含まれ得る。好適なガイドＲＮＡと組み合わせたＲＮＡターゲティングタンパク質は、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）の制御にも使用され得る。ＲＮＡａは遺伝子発現の促進につながり、そのため遺伝子発現の制御はＲＮＡａの破壊又は低減、従って遺伝子発現の促進低下による形で実現し得る。
本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、更に、植物における、特にＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性に使用することができる。エフェクタータンパク質は、選択のウイルスＲＮＡ配列に選択的な好適なガイドＲＮＡを使用してウイルスＲＮＡに標的化することができる。詳細には、エフェクタータンパク質は、一本鎖ＲＮＡなど、ＲＮＡを切断する活性ヌクレアーゼであり得る。従って、抗ウイルス剤としての本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用が提供される。このように拮抗し得るウイルスの例としては、限定はされないが、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマト黄化えそウイルス（ＴＳＷＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）（ＲＴウイルス）、プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）及びジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）が挙げられる。
標的遺伝子改変の代替手段としての、植物、藻類又は真菌におけるＲＮＡ発現の調節の例は、本明細書に更に記載される。
特に、調節されたｍＲＮＡ切断による調節された遺伝子発現制御が興味深い。これは、ＲＮＡターゲティングのエレメントを本明細書に記載されるとおりの調節型プロモーターの制御下に置くことにより実現し得る。
ｔＲＮＡ分子の機能を回復させるためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
Ｐｒｉｎｇ ｅｔ ａｌが、ＤＮＡと異なるタンパク質をコードするようにｍＲＮＡ配列を変化させる植物ミトコンドリア及び葉緑体におけるＲＮＡ編集について記載している。（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９３）２１（６）：１１６３－１１７０．ｄｏｉ：１０．１００７／ＢＦ０００２３６１１）。本発明の詳細な実施形態において、ミトコンドリア及び葉緑体ｍＲＮＡを特異的に標的化するＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系のエレメントを植物又は植物細胞に導入することにより、かかる植物細胞小器官で異なるタンパク質を発現させて、インビボで起こる過程を模倣することができる。
ＲＮＡ発現を阻害するためのＲＮＡ干渉の代替手段としてのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＮＡ阻害又はＲＮＡ干渉と同様の用途があり、従ってかかる方法に代えることもできる。詳細な実施形態において、本発明の方法は、例えば、干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ又はｄｓＲＮＡなど）の代わりとしてのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲの使用を含む。標的遺伝子改変の代替手段としての植物、藻類又は真菌におけるＲＮＡ発現の阻害の例は、本明細書に更に記載される。
ＲＮＡ干渉を制御するためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
干渉性ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの制御は、インビボ又はインビトロで干渉性ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの寿命を短縮することによる手法で見られるオフターゲット効果（ＯＴＥ）を低減することを促進し得る。詳細な実施形態において、標的ＲＮＡには干渉性ＲＮＡ、即ちＲＮＡ干渉経路に関与するＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどが含まれ得る。他の実施形態において、標的ＲＮＡにはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が含まれ得る。
他の詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングタンパク質及び好適なガイドＲＮＡが（例えば、空間的又は時間的に調節型プロモーター、例えば組織特異的又は細胞周期特異的プロモーター及び／又はエンハンサーの制御下で）選択的に発現する場合、これを用いて細胞又は系を（インビボ又はインビトロで）その細胞におけるＲＮＡｉから「保護」することができる。これは、ＲＮＡｉが必要ない隣接組織又は細胞において、又はエフェクタータンパク質及び好適なガイドが発現する及び発現しない（即ちそれぞれＲＮＡｉが制御されない及びそれが制御される）細胞又は組織を比較する目的で有用であり得る。ＲＮＡターゲティングタンパク質を使用して、リボザイム、リボソーム又はリボスイッチなど、ＲＮＡを含むか又はそれからなる分子を制御するか又はそれに結合し得る。本発明の実施形態では、ガイドＲＮＡがＲＮＡターゲティングタンパク質をそうした分子に動員することにより、ＲＮＡターゲティングタンパク質はそれらに結合することが可能になる。
本発明のＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系は、本願がこの系を情報に基づいてエンジニアリングするための基礎を提供するため、本開示から、過度の実験を行うことなく、害虫管理、植物病害管理及び除草剤耐性管理を含めた、且つ植物アッセイにおける及び他の適用に向けたインプランタＲＮＡｉ技術の領域において適用することができる（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｉｍｐａｃｔ Ｆａｃｔｏｒ：２．０１）．０１／２０１５；１２０．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｐｅｓｔｂｐ．２０１５．０１．００２；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌｓ（２０１５），Ｖｏｌ．１２（１８）ｐｐ２３０３－２３１２）；Ｇｒｅｅｎ Ｊ．Ｍ，ｉｎＰｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ ７０（９），ｐｐ １３５１－１３５７を参照されたい）。
植物、藻類及び真菌においてリボスイッチを改変し、且つ代謝調節を制御するためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
リボスイッチ（アプタザイムとしても知られる）はメッセンジャーＲＮＡの調節性セグメントであり、小分子に結合して、従って遺伝子発現を調節する。この機構により、細胞はそれらの小分子の細胞内濃度を検知することが可能になる。特定のリボスイッチは、典型的にはその隣接遺伝子を、その遺伝子の転写、翻訳又はスプライシングを変化させることによって調節する。従って、本発明の詳細な実施形態では、リボスイッチを標的とする好適なガイドＲＮＡと組み合わせたＲＮＡターゲティングタンパク質を使用することによるリボスイッチ活性の制御が想定される。これは、リボスイッチの切断又はそれへの結合によるものであり得る。詳細な実施形態では、リボスイッチ活性の低減が想定される。最近になってチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）に結合するリボスイッチが特徴付けられ、植物及び藻類におけるチアミン生合成を調節することが分かった。更に、このエレメントは植物における一次代謝の必須調節因子であるものと見られる（Ｂｏｃｏｂｚａ ａｎｄ Ａｈａｒｏｎｉ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２０１４ Ａｕｇ；７９（４）：６９３－７０３．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｔｐｊ．１２５４０．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｊｕｎ １７）。ＴＰＰリボスイッチは、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）など、ある種の真菌にも見られ、ここで、それは、選択的スプライシングを制御して上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）を条件的に産生し、それにより下流遺伝子の発現に影響を及ぼす（Ｃｈｅａｈ ＭＴ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４４７（７１４３）：４９７－５００．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０５７６９）。本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を使用して植物、藻類又は真菌の内因性リボスイッチ活性を操作し、そのようにしてそれにより制御される下流遺伝子の発現を変化させ得る。詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系は、インビボ又はインビトロでのリボスイッチ機能のアッセイ及び代謝ネットワークに対するその関連性の研究において使用し得る。詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系は、潜在的には、植物及び遺伝子制御プラットフォームにおける代謝産物センサーとしてのリボスイッチのエンジニアリングに使用し得る。
植物、藻類又は真菌のＲＮＡｉスクリーンにおけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
ＲＮＡｉスクリーンにより、そのノックダウンが表現型の変化に関連する遺伝子産物を同定して、生物学的経路を調べ及び構成要素を同定することができる。本発明の詳細な実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂタンパク質及び好適なガイドＲＮＡを使用してスクリーンにおけるＲＮＡｉの活性を除去し又は低下させ、従って（それまで干渉を受けていた）遺伝子産物の活性を（干渉／抑制を除去し又は低下させることで）回復させることにより、こうしたスクリーンにも又はスクリーンの間も制御を及ぼし得る。
インビボ及びインビトロでＲＮＡ分子を可視化するためのＲＮＡターゲティングタンパク質の使用
詳細な実施形態において、本発明は核酸結合系を提供する。ＲＮＡと相補的プローブとのインサイチュハイブリダイゼーションは、強力な技法である。典型的には、ハイブリダイゼーションによる核酸の検出には蛍光ＤＮＡオリゴヌクレオチドが使用される。ロックド核酸（ＬＮＡ）など、ある種の改変によって効率の増加が達成されているが、効率的且つ汎用的な代替手段が依然として必要とされている。このように、インサイチュハイブリダイゼーション用の効率的且つ適合可能な系の代替手段として、ＲＮＡターゲティング系の標識エレメントを使用することができる。
植物及び酵母におけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の更なる適用
バイオ燃料生産におけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
用語「バイオ燃料」は、本明細書で使用されるとき、植物及び植物由来の資源から作られる代替燃料である。再生可能バイオ燃料は、炭素固定の過程を通じてエネルギーを得てきた有機物から抽出することができるか、又はバイオマスの使用若しくは変換によって作られる。このバイオマスはバイオ燃料に直接使用し得るか、又は熱変換、化学変換及び生化学変換によって好都合なエネルギー含有物質に変換され得る。このバイオマス変換により、固体、液体又は気体形態の燃料が得られ得る。バイオ燃料には、バイオエタノールとバイオディーゼルとの２種類がある。バイオエタノールは、主として、大部分がトウモロコシ及びサトウキビに由来するセルロース（デンプン）の糖発酵プロセスによって生産される。他方でバイオディーゼルは、主として、ナタネ、ヤシ及びダイズなどの油料作物から生産される。バイオ燃料は主として輸送機関に用いられる。
バイオ燃料生産のための植物特性の増強
詳細な実施形態において、発酵に際して糖類がより効率的に放出されるよう主要な加水分解剤を到達し易くするため、本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲを使用する方法を用いて細胞壁の特性を変化させる。詳細な実施形態では、セルロース及び／又はリグニンの生合成が改変される。セルロースは細胞壁の主要な構成成分である。セルロース及びリグニンの生合成は共調節される。植物中のリグニンの割合を低下させることにより、セルロースの割合が増加し得る。詳細な実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて植物におけるリグニン生合成が下方制御され、それにより発酵性糖質を増加させる。より詳細には、国際公開第２００８０６４２８９ Ａ２号パンフレットに開示されるとおり、本明細書に記載される方法を用いて、４－クマル酸３－ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、桂皮酸－４－ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＨＣＴ）、コーヒー酸Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、カフェオイルＣｏＡ３－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）、フェルラ酸５－ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナモイルＣｏＡ－レダクターゼ（ＣＣＲ）、４－クマル酸－ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、モノリグノール－リグニン特異的グリコシルトランスフェラーゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）からなる群から選択される少なくとも第１のリグニン生合成遺伝子が下方制御される。
詳細な実施形態において、本明細書に記載される方法を用いて、発酵中に発生する酢酸レベルがより低い植物マスが作製される（国際公開第２０１００９６４８８号パンフレットも参照されたい）。
バイオ燃料生産のための酵母の改変
詳細な実施形態において、本明細書に提供されるＲＮＡターゲティング酵素は組換え微生物によるバイオエタノールの生産に使用される。例えば、ＲＮＡターゲティング酵素を使用して酵母などの微生物をエンジニアリングすることにより、発酵性糖類からバイオ燃料又はバイオポリマーを作成することができ、且つ任意選択で発酵性糖類の供給源としての農業廃棄物から得られた植物由来のリグノセルロースを分解することが可能である。より詳細には、本発明は、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ複合体を使用してバイオ燃料生産に必要な内因性遺伝子の発現を改変し、且つ／又はバイオ燃料合成を妨げ得る内因性遺伝子を改変する方法を提供する。より詳細には、本方法は、ピルビン酸からエタノール又は別の目的産物への変換に関与する酵素をコードする１つ以上のヌクレオチド配列の酵母などの微生物における発現を刺激することを含む。詳細な実施形態では、本方法は、セルラーゼなど、微生物によるセルロースの分解を実現する１つ以上の酵素の発現の刺激を確実にする。更に別の実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して、バイオ燃料生産経路と競合する内因性代謝経路が抑制される。
植物油又はバイオ燃料の生産のための藻類及び植物の改変
トランスジェニック藻類又はセイヨウアブラナなどの他の植物は、植物油又はバイオ燃料、例えばアルコール類（特にメタノール及びエタノール）の生産に特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される高レベルの油又はアルコールを発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
米国特許第８９４５８３９号明細書は、Ｃａｓ９を用いた微細藻類（コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）細胞）のエンジニアリング方法について記載している。同様のツールを使用して、本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の方法をクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）種及び他の藻類に適用することができる。詳細な実施形態では、Ｈｓｐ７０Ａ－Ｒｂｃ Ｓ２又はβ２－チューブリンなどの構成的プロモーターの制御下でＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を発現するベクターを使用して藻類にＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡを導入し、発現させる。ガイドＲＮＡは、Ｔ７プロモーターを含有するベクターを使用して送達されることになる。代わりに、インビトロ転写されたガイドＲＮＡが藻類細胞に送達され得る。電気穿孔プロトコルは、ＧｅｎｅＡｒｔクラミドモナスエンジニアリングキットの標準的な推奨プロトコルに従う。
植物におけるＲＮＡターゲティング酵素の詳細な適用
詳細な実施形態では、本発明は、ウイルスＲＮＡを切断することが可能であるため、植物系におけるウイルス除去用治療薬として使用することができる。ヒト系における先行研究は、一本鎖ＲＮＡウイルス、Ｃ型肝炎（Ａ．Ｐｒｉｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，２０１５）のターゲティングにおけるＣＲＩＳＰＲの利用の成功を実証している。これらの方法は、植物におけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用にも適合させ得る。
改良植物
本発明は、本明細書に提供される方法によって得ることのできる及びそれによって得られた植物及び酵母細胞も提供する。本明細書に記載される方法によって得られた改良植物は、例えば、植物害虫、除草剤、乾燥、低温又は高温、過剰な水等に対する耐性を確実にする遺伝子の発現の改変により、食品又は飼料製造において有用となり得る。
本明細書に記載される方法によって得られた改良植物、特に作物及び藻類は、例えば、通常野生型に見られるであろうよりも高いタンパク質、炭水化物、栄養素又はビタミンレベルの発現により、食品又は飼料製造において有用となり得る。この点で、改良植物、特に豆類及び塊茎が好ましい。
改良藻類又はセイヨウアブラナなどの他の植物は、植物油又はバイオ燃料、例えばアルコール類（特にメタノール及びエタノール）の生産に特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される高レベルの油又はアルコールを発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
本発明は、植物の改良された部位も提供する。植物部位としては、限定はされないが、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠及び花粉が挙げられる。本明細書において想定されるとおりの植物部位は、生育可能、生育不能、再生可能及び／又は再生不能であり得る。
また、本明細書には、本発明の方法によって作成された植物細胞及び植物を提供することも包含される。従来の育種方法によって作製された、遺伝子改変を含む植物の配偶子、種子、胚（接合胚であれ又は体細胞胚であれ）、子孫又は雑種も本発明の範囲内に含まれる。かかる植物は、標的配列に挿入されるか又はそれの代わりに挿入された異種又は外来性ＤＮＡ配列を含有し得る。代わりに、かかる植物は、１つ以上のヌクレオチドに、ある変化（突然変異、欠失、挿入、置換）のみを含有し得る。そのため、かかる植物はその先祖植物と特定の改変の存在のみが異なるに過ぎないことになる。
本発明のある実施形態では、Ｃａｓ１３ｂ系を使用して、例えば細菌、真菌又はウイルスによって引き起こされる疾患に対する抵抗性を作り出すことにより、病原体抵抗性植物がエンジニアリングされる。特定の実施形態において、病原体抵抗性は、害虫が摂取して死亡につながるであろうＣａｓ１３ｂ系が作り出されるように作物をエンジニアリングすることにより達成され得る。本発明のある実施形態では、Ｃａｓ１３ｂ系を使用して非生物的ストレス耐性がエンジニアリングされる。別の実施形態では、Ｃａｓ１３ｂ系を使用して干ばつストレス耐性又は塩ストレス耐性又は低温若しくは熱ストレス耐性がエンジニアリングされる。Ｙｏｕｎｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１０；１１５０は植物育種方法の潜在的標的をレビューしており、その全てが本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂ系を使用した修正又は改良に適している。一部の非限定的な標的作物としては、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ）、セイヨウスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｌ．）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）が挙げられる。
本発明のある実施形態では、Ｃａｓ１３ｂ系は作物害虫の管理に使用される。例えば、作物害虫において作動可能なＣａｓ１３ｂ系を植物宿主から発現させるか、又は例えばウイルスベクターを使用して標的に直接トランスファーすることができる。
ある実施形態において、本発明は、ヘテロ接合非ヒト出発生物からホモ接合生物を効率的に作製する方法を提供する。ある実施形態において、本発明は植物育種に使用される。別の実施形態において、本発明は動物育種に使用される。かかる実施形態において、植物又は動物などのホモ接合生物は、二本鎖切断、染色体対合及び／又は鎖交換に関与する少なくとも１つの標的遺伝子への干渉によって組換えを防止又は抑制することにより作られる。
最適化された機能性ＲＮＡターゲティング系におけるＣａｓ１３ｂタンパク質の適用
ある態様において、本発明は、機能性構成成分をＲＮＡ環境に特異的に送達するための系を提供する。これは、ＲＮＡへの種々の構成成分の特異的ターゲティングを可能にする本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用して確実にすることができる。より詳細には、かかる構成成分には、ＲＮＡ翻訳、分解等のアクチベーター又はリプレッサーなど、アクチベーター又はリプレッサーが含まれる。この系の適用については、本明細書の他の部分に記載される。
一態様によれば、本発明は、細胞の目的のゲノム遺伝子座内にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供し、ここで、ガイドＲＮＡは、アダプタータンパク質に結合する１つ以上の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変される。詳細な実施形態において、ＲＮＡ配列は２つ以上のアダプタータンパク質（例えば、アプタマー）に結合することができ、且つ各アダプタータンパク質が１つ以上の機能ドメインと会合している。本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂ酵素のガイドＲＮＡは、ガイド配列の改変に適していることが示される。詳細な実施形態において、ガイドＲＮＡは、ダイレクトリピートの５’側、ダイレクトリピート内又はガイド配列の３’側への個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変される。２つ以上の機能ドメインがあるとき、それらの機能ドメインは、同じであるか又は異なり得、例えば同じ２つの又は２つの異なるアクチベーター又はリプレッサーであり得る。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、１つ以上の機能ドメインがＲＮＡターゲティング酵素に付加されているため、機能ドメインは標的ＲＮＡに結合すると、機能ドメインがその帰属機能で機能することが可能な空間的配置となる。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、組成物は、少なくとも３つの機能ドメインであって、その少なくとも１つがＲＮＡターゲティング酵素と会合し、且つその少なくとも２つがｇＲＮＡと会合している機能ドメインを有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を含む。
従って、ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのガイドＲＮＡとＲＮＡターゲティング酵素であるＣａｓ１３ｂとを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ複合体組成物を提供し、ここで、任意選択で、ＲＮＡターゲティング酵素は、ＲＮＡターゲティング酵素がその少なくとも１つの突然変異を有しない酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有することになる少なくとも１つの突然変異及び任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む１つ以上を含む。詳細な実施形態において、ガイドＲＮＡは、それに加えて又は代えて、ＲＮＡターゲティング酵素の結合はなおも確実にするが、ＲＮＡターゲティング酵素による切断は防ぐように（本明細書の他の部分で詳説するとおり）改変される。
詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティング酵素は、少なくとも１つの突然変異を有しないＣａｓ１３ｂ酵素と比較したとき、少なくとも９７％又は１００％の低下したヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ１３ｂ酵素である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、Ｃａｓ１３ｂ酵素は、本明細書で他に記載されるような２つ以上の突然変異を含む。
詳細な実施形態において、２つ以上の機能ドメインを含む本明細書において上記に記載されるとおりのＲＮＡターゲティング系が提供される。詳細な実施形態において、２つ以上の機能ドメインは異種機能ドメインである。詳細な実施形態において、この系は、機能ドメインを含む融合タンパク質であるアダプタータンパク質を含み、融合タンパク質は、任意選択で、アダプタータンパク質と機能ドメインとの間にリンカーを含む。詳細な実施形態において、リンカーはＧｌｙＳｅｒリンカーを含む。それに加えて又は代えて、１つ以上の機能ドメインがリンカー、任意選択でＧｌｙＳｅｒリンカーによってＲＮＡエフェクタータンパク質に付加される。詳細な実施形態において、１つ以上の機能ドメインはＨＥＰＮドメインの一方又は両方でＲＮＡターゲティング酵素に付加される。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、アダプタータンパク質又はＲＮＡターゲティング酵素と会合している１つ以上の機能ドメインは、ＲＮＡ翻訳を活性化又は抑制する能力を有するドメインである。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、アダプタータンパク質に会合している１つ以上の機能ドメインの少なくとも１つは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＤＮＡ組込み活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性又は核酸結合活性又は分子スイッチ活性又は化学誘導能若しくは光誘導能を含む１つ以上の活性を有する。
ある態様において、本発明は、アプタマー配列を含む本明細書において考察される組成物を提供する。詳細な実施形態において、アプタマー配列は、同じアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、アプタマー配列は、異なるアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、アダプタータンパク質は、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、ＰＲＲ１を含む。従って、詳細な実施形態では、アプタマーは、上記に列挙するアダプタータンパク質のいずれか１つを特異的に結合する結合タンパク質から選択される。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、細胞は、真核細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、真核細胞は、哺乳類細胞、植物細胞又は酵母細胞であり、それによって哺乳類細胞は、任意選択で、マウス細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、哺乳類細胞は、ヒト細胞である。
ある態様において、本発明は、本明細書において上記で考察した組成物を提供し、ここで、２つ以上のｇＲＮＡがあり、及びこれらのｇＲＮＡは、異なる配列を標的化し、それによって本組成物が用いられるとき、多重化がある。ある態様において、本発明は、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変された２つ以上のｇＲＮＡがある組成物を提供する。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、１つ以上の機能ドメインと会合した１つ以上のアダプタータンパク質が存在して、ガイドＲＮＡに挿入された個別のＲＮＡ配列に結合する。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの非コード機能性ループを有するように改変され、例えば、少なくとも１つの非コード機能性ループは、抑制性であり、例えば、少なくとも１つの非コード機能性ループは、Ａｌｕを含む。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの組成物の１つ以上の宿主への投与又は宿主におけるインビボ発現を含む遺伝子発現の改変方法を提供する。
ある態様において、本発明は、組成物又はそれをコードする核酸分子の送達を含む、本明細書において考察される方法を提供し、ここで、前記核酸分子は、調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される方法を提供し、ここで、インビボでの発現は、レンチウイルス、アデノウイルス又はＡＡＶを介する。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの細胞の哺乳類細胞株を提供し、ここで、細胞株は、任意選択で、ヒト細胞株又はマウス細胞株である。ある態様において、本発明は、トランスジェニック哺乳類モデル、任意選択でマウスを提供し、ここで、このモデルは、本明細書において考察される組成物で形質転換されているか、又は前記形質転換体の子孫である。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのガイドＲＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体又は組成物をコードする核酸分子を提供する。ある態様において、本発明は、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子を含むベクターを提供し、ここで、ｇＲＮＡのダイレクトリピートは、２つ以上のアダプタータンパク質に結合する個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及び各アダプタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合しているか、又はｇＲＮＡは、少なくとも１つの非コード機能性ループを有するように改変される。ある態様において、本発明は、本明細書において考察されるｇＲＮＡと、ＲＮＡターゲティング酵素［任意選択でＲＮＡターゲティング酵素は少なくとも１つの突然変異を含み、そのためＲＮＡターゲティング酵素は少なくとも１つの突然変異を有しないＲＮＡターゲティング酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し、且つ任意選択で、少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む１つ以上を含む］とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体組成物をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。ある態様において、ベクターは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子及び／又はＲＮＡターゲティング酵素をコードする核酸分子及び／又は任意選択の核局在化配列に作動可能に連結された真核細胞において作動可能な調節エレメントを更に含み得る。
一態様において、本発明は、上記に記載した構成成分の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットは、上記に記載したとおりのベクター系とキットの使用説明書とを含む。
ある態様において、本発明は、機能獲得（ＧＯＦ）又は機能喪失（ＬＯＦ）に関してスクリーニングする方法又は非コードＲＮＡ又は潜在的な調節領域（例えば、エンハンサー、リプレッサー）のスクリーニング方法を提供し、この方法は、ＲＮＡターゲティング酵素を含有し又はそれを発現する本明細書において考察するとおりの細胞株又は本明細書において考察されるモデルの細胞及び本明細書において考察するとおりの組成物を細胞株又はモデルの細胞に導入し、それによってｇＲＮＡがアクチベーター又はリプレッサーのいずれかを含むこと、及びそれらの細胞に関して導入されたｇＲＮＡがアクチベーターを含むのはどれかに関して又はそれらの細胞に関して導入されたｇＲＮＡがリプレッサーを含むのはどれかに関して、それぞれＧＯＦ又はＬＯＦをモニタすることを含む。
ある態様において、本発明は、細胞の目的の標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ＲＮＡターゲティング酵素を各々が含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物のライブラリを提供し、ここで、ＲＮＡターゲティング酵素は、少なくとも１つの突然変異を含み、そのため、ＲＮＡターゲティング酵素は、少なくとも１つの突然変異を有しないＲＮＡターゲティング酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し、ｇＲＮＡは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びアダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合し、この組成物は、１つ以上又は２つ以上のアダプタータンパク質を含み、各タンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合し、及びｇＲＮＡは、複数のＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むゲノムワイドライブラリを含む。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、ＲＮＡターゲティングＲＮＡターゲティング酵素は、少なくとも１つの突然変異を有しないＲＮＡターゲティング酵素と比較したとき、少なくとも９７％又は１００％の低下したヌクレアーゼ活性を有する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、アダプタータンパク質は、機能ドメインを含む融合タンパク質である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで、ｇＲＮＡは、１つ又は２つ以上のアダプタータンパク質に結合する個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変されない。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、１つ又２つ以上の機能ドメインは、ＲＮＡターゲティング酵素と会合している。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで、細胞の細胞集団は、真核細胞の集団である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで、真核細胞は、哺乳類細胞、植物細胞又は酵母細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで、哺乳類細胞は、ヒト細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで、細胞の集団は、胚性幹（ＥＳ）細胞の集団である。
ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、ターゲティングは、約１００以上のＲＮＡ配列である。ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、ターゲティングは、約１０００以上のＲＮＡ配列である。ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、ターゲティングは、約２０，０００以上の配列である。ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、ターゲティングは、トランスクリプトーム全体である。ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、ターゲティングは、関連性のある又は望ましい経路に焦点を置いた標的配列のパネルである。ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、経路は、免疫経路である。ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、経路は、細胞分裂経路である。
一態様において、本発明は、発現が改変された遺伝子を含むモデル真核細胞を作成する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患の罹患又は発症リスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、本方法は、（ａ）本明細書において上記に記載される系の構成成分をコードする１つ以上のベクターを真核細胞に導入すること、及び（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて遺伝子の発現を改変し、それにより遺伝子発現の改変を含むモデル真核細胞を作成することを含む。
本明細書に提供される構造情報により、標的ＲＮＡ及びＲＮＡターゲティング酵素とのガイドＲＮＡ相互作用を調べることが可能であり、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系全体の機能性が最適化されるようにガイドＲＮＡ構造をエンジニアリングし又は変化させることが可能になる。例えば、ＲＮＡに結合することのできるアダプタータンパク質の挿入によりＲＮＡターゲティングタンパク質との衝突なしにガイドＲＮＡを伸長させることができる。これらのアダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインを含むエフェクタータンパク質又は融合物を更に動員することができる。
本発明のある態様は、上記のエレメントが単一の組成物に含まれるか、又は個々の組成物に含まれるものである。これらの組成物は、有利には、ゲノムレベルで機能的効果を誘発するため宿主に適用され得る。
当業者は、ガイドＲＮＡに対する改変で、アダプター＋機能ドメインの結合を可能にするが、アダプター＋機能ドメインを適切に位置させることは（例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の三次元構造（ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）内の立体障害に起因して）できないものは、意図されない改変であることを理解するであろう。１つ以上の改変ガイドＲＮＡは、ダイレクトリピートの５’側、ダイレクトリピート内又はガイド配列の３’側への個別のＲＮＡ配列の導入によって改変され得る。
改変ガイドＲＮＡ、不活性化ＲＮＡターゲティング酵素（機能ドメインを有する又は有しない）及び１つ以上の機能ドメインを有する結合タンパク質は、各々が個別に組成物中に含まれ、宿主に個別に又はまとめて投与され得る。代わりに、これらの構成成分は、宿主への投与用の単一の組成物中に提供され得る。宿主への投与は、宿主への送達に関して当業者に公知の又は本明細書に記載されるウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター）を用いて実施し得る。本明細書に説明されるとおり、異なる選択マーカー（例えば、レンチウイルスｇＲＮＡ選択用のもの）及びｇＲＮＡの濃度（例えば、複数のｇＲＮＡが用いられるかどうかに依存する）を使用することが、向上した効果を生じさせるのに有利であり得る。
当業者は、提供される組成物を用いて、同じ又は異なる機能ドメインで単一又は複数の遺伝子座を有利に且つ特異的に標的化して、１つ以上のゲノムイベントを誘発することができる。本組成物は、細胞のライブラリにおけるスクリーニング及びインビボでの機能モデリング（例えば、ｌｉｎｃＲＮＡの遺伝子活性化及び機能の同定（ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）；機能獲得モデリング；機能喪失モデリング；最適化及びスクリーニング目的の細胞株及びトランスジェニック動物を樹立するための本発明の組成物の使用）のための多種多様な方法に適用され得る。
本発明は、条件的又は誘導性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡターゲティングイベントを樹立し及び利用するための本発明の組成物の使用を包含する。（例えば、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４又は本明細書に引用されるＰＣＴ特許公報、例えば国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）（これらは本発明若しくは本願に先行するとは考えられない）を参照されたい）。例えば、標的細胞がＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ酵素を条件的に又は誘導性に（例えば、Ｃｒｅ依存性構築物の形態で）含み、且つ／又はアダプタータンパク質を条件的に又は誘導性に含み、及び標的細胞に導入されたベクターの発現時、ベクターは、標的細胞におけるＲＮＡターゲティング酵素発現及び／又はアダプター発現を誘導するか、又はその条件を生じるように発現する。ＣＲＩＳＰＲ複合体を作成する公知の方法と共に本発明の教示及び組成物を適用することにより、機能ドメインによって影響を受ける誘導性遺伝子発現も本発明の態様である。代わりに、条件的又は誘導性ＲＮＡターゲティング酵素と共にアダプタータンパク質が条件的又は誘導性エレメントとして提供されることにより、スクリーニング目的に有効なモデルが提供され得、これは有利には、多種多様な適用に対して、特異的なｇＲＮＡの最小限の設計及び投与のみを必要とするものである。
デッドガイド配列を含む本発明に係るガイドＲＮＡ
一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成及び標的への結合の成功を可能にすると同時にヌクレアーゼ活性の成功を許容しない（即ちヌクレアーゼ活性がない／インデル活性がない）ように改変されるガイド配列を提供する。説明上の問題で、かかる改変ガイド配列は「デッドガイド」又は「デッドガイド配列」と称される。これらのデッドガイド又はデッドガイド配列は、ヌクレアーゼ活性の点で触媒的に不活性である又は立体構造的に不活性であると考えることができる。実際、デッドガイド配列は、触媒活性を促進する能力又はオンターゲットとオフターゲットとの結合活性を区別する能力の点で生産的な塩基対合に十分に関与しないものであり得る。簡潔に言えば、このアッセイには、ＣＲＩＳＰＲ標的ＲＮＡ及び標的ＲＮＡとのミスマッチを含むガイドＲＮＡを合成すること、それらをＲＮＡターゲティング酵素と組み合わせて、切断産物によって生成されるバンドの存在に基づいたゲルに基づいて切断を分析すること、及び相対バンド強度に基づいて切断を定量化することが関わる。
従って、関連する態様において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの機能性ＲＮＡターゲティング及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供し、ここで、ｇＲＮＡは、デッドガイド配列を含み、それにより、ｇＲＮＡは、この系の非突然変異ＲＮＡターゲティング酵素の検出可能なＲＮＡ切断活性なしにＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が細胞内の目的のゲノム遺伝子座へと導かれるような標的配列へのハイブリダイゼーション能力を有するものとなる。本明細書の他の部分に記載されるとおりの本発明に係るｇＲＮＡのいずれも、本明細書において以下に記載するとおりのデッドｇＲＮＡ／デッドガイド配列を含むｇＲＮＡとして使用し得ることが理解されるべきである。本明細書の他の部分に記載されるとおりの方法、生成物、組成物及び使用のいずれも、以下に更に詳述するとおりのデッドｇＲＮＡ／デッドガイド配列を含むｇＲＮＡで等しく適用可能である。更なる指針として、以下の詳細な態様及び実施形態を提供する。
ＲＮＡ標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くデッドガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするデッドガイド配列を含め、対応する標的配列を有する宿主細胞へと、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして提供され得、続いて標的配列内における優先的な切断が評価され得る。例えば、標的ＲＮＡポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験しようとするデッドガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分及び供試デッドガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間で標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者に想起されるであろう。デッドガイド配列は、任意の標的配列を標的化するように選択し得る。一部の実施形態において、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。
本明細書に更に説明されるとおり、幾つかの構造パラメータによって適切なフレームワークをかかるデッドガイドに至らせることが可能である。デッドガイド配列は、典型的には、活性ＲＮＡ切断をもたらすそれぞれのガイド配列よりも短い。詳細な実施形態において、デッドガイドは、同じものに対するそれぞれのガイドよりも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％短い。
以下に説明し且つ当該技術分野において公知のとおり、ｇＲＮＡの一態様 － ＲＮＡターゲティング特異性はダイレクトリピート配列であり、これはかかるガイドに適切に連結されるべきである。詳細には、これは、ダイレクトリピート配列がＲＮＡターゲティング酵素の起源に応じて設計されることを含意する。従って、Ｃａｓ１３ｂ特異的均等物の設計には、検証されたデッドガイド配列に利用可能な構造データが用いられ得る。例えば、２つ以上のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質のオルソロガスなヌクレアーゼドメインＨＥＰＮの間の構造的類似性を用いることにより、均等な設計のデッドガイドをトランスファーし得る。従って、本明細書におけるデッドガイドは、かかるＣａｓ１３ｂ特異的均等物を反映するように長さ及び配列が適切に改変され得、それによりＣＲＩＳＰＲ複合体の形成及び標的ＲＮＡへの結合の成功が実現すると同時に、ヌクレアーゼ活性の成功が許容されなくなる。
本明細書並びに当該技術分野の技術水準に関連して、デッドガイドの使用は、インビトロ、エキソビボ及びインビボ適用の両方でのネットワーク生物学及び／又はシステム生物学の意外且つ予想外のプラットフォームをもたらして、多重遺伝子ターゲティング、詳細には両方向性多重遺伝子ターゲティングを可能にする。デッドガイドを使用する以前は、複数の標的に対処することは難題であり、場合により不可能であった。デッドガイドを使用すると、例えば同じ細胞、同じ動物又は同じ患者における複数の標的、従って複数の活性に対処し得る。かかる多重化は同時に起こり得るか、又は所望の時間フレームで時差的に起こり得る。
例えば、デッドガイドは、ヌクレアーゼ活性を伴うことのない、遺伝子ターゲティングの手段としてのｇＲＮＡの使用を可能にすると同時に、誘導的な活性化又は抑制手段を提供する。デッドガイドを含むガイドＲＮＡは、遺伝子活性の活性化又は抑制を可能にする形でエレメント、詳細には遺伝子エフェクター（例えば、遺伝子活性のアクチベーター又はリプレッサー）を機能的に置くことを可能にする本明細書の他の部分に記載されるとおりのタンパク質アダプター（例えば、アプタマー）を更に含むように改変し得る。一例は、本明細書及び当該技術分野の技術水準で説明されるとおりの、アプタマーの取込みである。デッドガイドを含むｇＲＮＡがタンパク質相互作用性アプタマーを取り込むようにエンジニアリングすることにより（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｏｍｐｌｅｘ”，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４１３６、参照により本明細書に援用される）、複数の個別のエフェクタードメインをアセンブルし得る。これは、天然の過程の後にモデル化し得る。
提供概要
ある態様において、本発明は核酸結合系を提供する。ＲＮＡと相補的プローブとのインサイチュハイブリダイゼーションは、強力な技法である。典型的には、ハイブリダイゼーションによる核酸の検出には蛍光ＤＮＡオリゴヌクレオチドが使用される。ロックド核酸（ＬＮＡ）など、ある種の改変によって効率の増加が達成されているが、効率的且つ汎用的な代替手段が依然として必要とされている。本発明は、インサイチュハイブリダイゼーションのための効率的且つ適合可能な系を提供する。
本発明の実施形態において、用語のガイド配列及びガイドＲＮＡは、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）などの前述の引用文献にあるとおり同義的に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス－ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン－ブンシュアルゴリズム、バローズ・ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか又はそれより長い。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満であるか又はそれより短い。好ましくは、ガイド配列は、１０～３０ヌクレオチド長である。ガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内における優先的な切断を評価し得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験しようとするガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間の標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者に想起されるであろう。ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するように選択することができる。一部の実施形態において、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的標的配列には、標的ゲノムにおいてユニークなものが含まれる。
一般に且つ本明細書全体を通じて、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖、二本鎖又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば、環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここで、ベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって担持されるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。真核細胞における発現用の及びそこでの発現をもたらすベクターは、本明細書では、「真核細胞発現ベクター」と称することができる。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含むことができ、これは、即ち、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択され得る）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。
用語「調節エレメント」には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）が含まれることが意図される。かかる調節エレメントについては、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として、所望の目的組織、例えば筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）において発現を導き得る。調節エレメントは、細胞周期依存的又は発生段階依存的様式など、時間依存的様式でも発現を導き得、この発現も組織又は細胞型特異的であることも又はそうでないこともある。一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個又はそれより多いｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個又はそれより多いｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個又はそれより多いｐｏｌ Ｉプロモーター）又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、Ｕ６及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、用語「調節エレメント」には、ＷＰＲＥなどのエンハンサーエレメント；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６－４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ－グロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７－３１，１９８１）も包含される。当業者によれば、発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存し得ることが理解されるであろう。ベクターは宿主細胞に導入することができ、それにより、本明細書に記載されるとおりの核酸によってコードされる転写物、タンパク質又はペプチドが、融合タンパク質又はペプチド（例えば、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異型、それらの融合タンパク質等）を含め、産生され得る。
有利なベクターとしては、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが挙げられ、かかるベクターのタイプも、特定のタイプの細胞を標的化するように選択することができる。
本明細書で使用されるとき、Ｖ型又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質の「ｃｒＲＮＡ」又は「ガイドＲＮＡ」又は「シングルガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」又は「１つ以上の核酸成分」という用語には、標的核酸配列とハイブリダイズして標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列が含まれる。
特定の実施形態において、本明細書に提供されるとおりのＣＲＩＳＰＲ系は、ｃｒＲＮＡ又はガイド配列を含む同様のポリヌクレオチドを利用することができ、ここで、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡとの混合物であり、及び／又はポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチド類似体を含む。この配列は、限定はされないが、バルジ、ヘアピン又はステムループ構造など、天然ｃｒＲＮＡの構造を含め、任意の構造を含み得る。特定の実施形態において、ガイド配列を含むポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列であり得る第２のポリヌクレオチド配列と二重鎖を形成する。
特定の実施形態において、化学的に改変されたガイドＲＮＡが利用される。ガイドＲＮＡの化学的改変の例としては、限定なしに、１つ以上の末端ヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）又は２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の取込みが挙げられる。かかる化学的に改変されたガイドＲＮＡは、改変されていないガイドＲＮＡと比較したとき、高い安定性及び高い活性を含むことができ、しかしながら、オンターゲット対オフターゲット特異性は、予測不可能である（Ｈｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５－９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ｊｕｎｅ ２０１５を参照されたい）。化学的に改変されたガイドＲＮＡには、限定なしに、ホスホロチオエート結合を有するＲＮＡ及びリボース環の２’及び４’炭素間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドが更に含まれる。
一部の実施形態において、相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス－ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン－ブンシュアルゴリズム、バローズ－ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。ガイド配列（核酸ターゲティングガイドＲＮＡ内にある）が標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、核酸ターゲティング複合体を形成するのに十分な核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞へと、核酸ターゲティング複合体の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして提供され得、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的核酸配列内における優先的なターゲティング（例えば、切断）を評価し得る。同様に、標的核酸配列の切断は、標的核酸配列、試験しようとするガイド配列を含めた核酸ターゲティング複合体の構成成分及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間で標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者に想起されるであろう。ガイド配列、従って核酸ターゲティングガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列を標的化するように選択し得る。標的配列はＤＮＡであり得る。標的配列は、任意のＲＮＡ配列であり得る。一部の実施形態において、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）及び小さい細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ及びｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。一部のより好ましい実施形態において、標的配列はｍＲＮＡ分子又はプレｍＲＮＡ分子内の配列であり得る。
一部の実施形態において、核酸ターゲティングガイドＲＮＡは、ＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ内の二次構造度が低下するように選択される。一部の実施形態において、核酸ターゲティングガイドＲＮＡのヌクレオチドのうち、最適に折り畳まれたとき、自己相補性塩基対合に関与するのは約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％以下であるか又はそれより少ない。最適な折り畳みは、任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定し得る。一部のプログラムは最小ギブズ自由エネルギーの計算に基づく。かかる１つのアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３－１４８）により記載されるとおりのｍＦｏｌｄである。別の例示的な折り畳みアルゴリズムは、ウィーン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて開発された、セントロイド構造予測アルゴリズムを用いるオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１－６２を参照されたい）。
特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列とガイド配列又はスペーサー配列とを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、ガイド配列又はスペーサー配列に融合又は連結したダイレクトリピート配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列はガイド配列又はスペーサー配列の上流（即ち５’側）に位置し得る。他の実施形態において、ダイレクトリピート配列はガイド配列又はスペーサー配列の下流（即ち３’側）に位置し得る。
特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡはステムループ、好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列はステムループ、好ましくは単一のステムループを形成する。
特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは１５～３５ｎｔである。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８ｎｔ、例えば少なくとも１９、２０、２１、２２ｎｔ又はそれを超える。特定の実施形態において、スペーサー長さは、１５～１７ｎｔ、例えば１５、１６又は１７ｎｔ、１７～２０ｎｔ、例えば１７、１８、１９又は２０ｎｔ、２０～２４ｎｔ、例えば２０、２１、２２、２３又は２４ｎｔ、２３～２５ｎｔ、例えば２３、２４又は２５ｎｔ、２４～２７ｎｔ、例えば２４、２５、２６又は２７ｎｔ、２７～３０ｎｔ、例えば２７、２８、２９又は３０ｎｔ、３０～３５ｎｔ、例えば３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ｎｔ、又は３５ｎｔ以上である。
毒性及びオフターゲット効果を最小限に抑えるため、送達されるＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要となり得る。核酸ターゲティングガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞モデル又は非ヒト真核動物モデルにおける種々の濃度の試験及びディープシーケンシングを用いた潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度の分析によって決定することができる。インビボ送達には、最も高いレベルのオンターゲット改変をもたらす一方、オフターゲット改変レベルを最小限に抑える濃度が選択されるべきである。ＲＮＡターゲティング系は、有利には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ系から送達される。一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティング系の１つ以上のエレメントは、本明細書において考察するとおりのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系の内因性ＲＮＡターゲティング系を含む特定の生物に由来する。
用語「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも称される）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも称される）は、当該技術分野において周知である。更なる指針として、本明細書で使用されるとおりのタンパク質の「ホモログ」は、それがそのホモログであるところのタンパク質と同じ又は同様の機能を果たす同じ種のタンパク質である。しかし、ホモログタンパク質は、構造上関係がなくてもよく、又は構造上部分的にのみ関係している。本明細書で使用されるとおりのタンパク質の「オルソログ」は、それがそのオルソログであるところのタンパク質と同じ又は同様の機能を果たす異なる種のタンパク質である。しかし、オルソログタンパク質は、構造上関係がなくてもよく、又は構造上部分的にのみ関係している。詳細な実施形態において、本明細書で言及されるとおりのＣａｓ１３ｂタンパク質のホモログ又はオルソログは、図１に示されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列相同性又は同一性を有する。
本明細書に記載される機能のいずれも、複数のオルソログ由来の断片を含むキメラ酵素を含め、他のオルソログ由来のＣＲＩＳＰＲ酵素にエンジニアリングし得ることが理解されるであろう。かかるオルソログの例は、本明細書の他の部分に記載される。従って、キメラ酵素は、限定はされないが、バージイエラ属（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）、リエメレラ属（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ）、ミロイデス属（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、キャプノサイトファーガ属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、クリセオバクテリウム属（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フェオダクチリバクター属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｉｂａｃｔｅｒ）、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）又はサイクロフレクサス属（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ）を含む生物のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログの断片を含み得る。キメラ酵素は、第１の断片と第２の断片とを含むことができ、これらの断片、ここでは第１及び第２の断片の一方は、第１の種のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質（例えば、図１に掲載するとおりのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）のもの又はそれ由来であり、他方の断片は、別の種のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログのもの又はそれ由来である。
本発明のある実施形態において、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０５３４４４４１７）、ポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ－０５２ ＯＨ４９４６ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４２８９６８）、バクテロイデス・ピオゲネス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３４５４２２８１）、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿００４９１９７５５）からなる群から選択される野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超えて相同又は同一のアミノ酸配列を含むエフェクタータンパク質が提供される。最も好ましいエフェクタータンパク質は、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０５３４４４４１７）、ポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ－０５２ ＯＨ４９４６ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４２８９６８）からなる群から選択される野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超えて相同又は同一のものであり、及び最も特別に好ましいのは、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）又はプレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）である。
幾つものＣａｓ１３ｂオルソログが共通のモチーフによって特徴付けられることが分かっている。従って、詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ＤＫＨＸＦＧＡＦＬＮＬＡＲＨＮ（配列番号１）、ＧＬＬＦＦＶＳＬＦＬＤＫ（配列番号２）、ＳＫＩＸＧＦＫ（配列番号３）、ＤＭＬＮＥＬＸＲＣＰ（配列番号４）、ＲＸＺＤＲＦＰＹＦＡＬＲＹＸＤ（配列番号５）及びＬＲＦＱＶＢＬＧＸＹ（配列番号６）からなる配列の１つ以上と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質である。更なる詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、これらの配列の少なくとも２、３、４、５つ又は６つ全てと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。更なる詳細な実施形態において、これらの配列との配列同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である。更なる詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ＧＬＬＦＦＶＳＬＦＬ（配列番号７）及びＲＨＱＸＲＦＰＹＦ（配列番号８）と１００％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質である。更なる詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクターは、ＲＨＱＤＲＦＰＹ（配列番号９）と１００％の配列同一性を有する配列を含むＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質である。
本発明のある実施形態において、エフェクタータンパク質は、限定はされないが本明細書に記載されるコンセンサス配列を含め、ＶＩ－Ｂ型エフェクタータンパク質コンセンサス配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれを超える配列相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明のある実施形態において、エフェクタータンパク質は、限定はされないが、本明細書に記載されるＨＥＰＮドメイン、当該技術分野において公知のＨＥＰＮドメイン並びにコンセンサス配列及びモチーフとの比較によってＨＥＰＮドメインと認識されるドメインを含め、少なくとも１つのＨＥＰＮドメインを含む。１つの非限定的な例において、コンセンサス配列は、本明細書に提供されるＣａｓ１３ｂオルソログの配列に由来することができる。
本発明のある実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列を含む１つ以上のＨＥＰＮドメインを含む。ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列は、限定なしに、本明細書に記載されるＨＥＰＮドメイン又は当該技術分野において公知のＨＥＰＮドメインからのものであり得る。ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列には、２つ以上のＨＥＰＮドメインの一部を組み合わせることにより作り出されるモチーフ配列が更に含まれる。
一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、２つのＨＥＰＮドメインを含む。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＲｘｘｘｘＨモチーフを含む少なくとも１つの触媒活性ＨＥＰＮドメインを含む。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＲｘｘｘｘＨモチーフをそれぞれ含む２つの触媒活性ＨＥＰＮドメインを含む。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、野生型ＲｘｘｘｘＨモチーフのＲ又はＨの少なくとも一方の突然変異から得られる少なくとも１つの触媒不活性ＨＥＰＮドメインを含む。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、野生型ＲｘｘｘｘＨモチーフのＲ又はＨの少なくとも一方の突然変異からそれぞれ得られる２つの触媒不活性ＨＥＰＮドメインを含む。
ある実施形態において、ＶＩ－Ｂ型ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質をコードする核酸分子は、真核細胞での発現にコドン最適化され得る。真核生物は、本明細書に考察されるとおりのものであり得る。核酸分子は、エンジニアリングされたもの又は天然に存在しないものであり得る。
ある実施形態において、ＶＩ－Ｂ型ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質、詳細にはＣａｓ１３ｂ又はそのオルソログ若しくはホモログは１つ以上の突然変異を含み得る（従って、それをコードする核酸分子が突然変異を有し得る）。突然変異は人工的に導入された突然変異であり得、限定はされないが、触媒ドメインにおける１つ以上の突然変異が含まれ得る。Ｃａｓ９酵素に関連する触媒ドメインの例としては、限定はされないが、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、ＲｕｖＣ ＩＩＩ及びＨＮＨドメインを挙げることができる。Ｃａｓ１３ｂ酵素に関連する触媒ドメインの例としては、限定はされないが、ＨＥＰＮドメインを挙げることができる。
ある実施形態において、Ｃａｓ１３ｂなどのＶＩ－Ｂ型タンパク質又はそのオルソログ若しくはホモログは１つ以上の突然変異を含み得る。突然変異は人工的に導入された突然変異であり得、限定はされないが、触媒ドメインにおける１つ以上の突然変異を挙げることができる。Ｃａｓ酵素に関連する触媒ドメインの例としては、限定はされないがＨＥＰＮドメインを挙げることができる。
ある実施形態において、Ｃａｓ１３ｂ又はそのオルソログ若しくはホモログなどのＶＩ－Ｂ型タンパク質は、機能ドメインと融合した又はそれに作動可能に連結された汎用核酸結合タンパク質として用いられ得る。例示的機能ドメインとしては、限定はされないが、翻訳開始因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、ヌクレアーゼ、詳細にはリボヌクレアーゼ、スプライソソーム、ビーズ、光誘導性／制御性ドメイン又は化学物質誘導性／制御性ドメインを挙げることができる。
一部の実施形態において、非改変核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は切断活性を有し得る。一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内又は標的配列と会合した配列においてなど、標的配列の位置又はその近傍における一方又は両方の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）鎖の切断を導き得る。一部の実施形態において、核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００又はそれを超える塩基対以内にあるＲＮＡ鎖の切断を導き得る。一部の実施形態において、ベクターは、対応する野生型酵素と比べて突然変異し得る核酸ターゲティングＣａｓタンパク質をコードし、そのため突然変異型核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方又は両方のＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖を切断する能力を欠くことになる。更なる例として、Ｃａｓの２つ以上の触媒ドメイン（例えば、ＨＥＰＮドメイン）を突然変異させることにより、実質的に全てのＲＮＡ切断活性を欠く突然変異型Ｃａｓが作製され得る。一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、突然変異酵素のＲＮＡ切断活性が非突然変異型の酵素の核酸切断活性の約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％以下又はそれ未満であるとき、実質的に全てのＲＮＡ切断活性を欠いていると見なされ得る。一例は、突然変異型の核酸切断活性が非突然変異型と比較したときにゼロ又は無視できる程度のときであり得る。エフェクタータンパク質は、ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最も大型のヌクレアーゼと相同性を共有する一般的な酵素クラスを参照して同定し得る。由来するとは、本出願人らは、由来酵素が野生型酵素と高度な配列相同性を有するという意味で概して野生型酵素をベースとするが、しかし、それは、当該技術分野において公知のとおりの又は本明細書に記載されるとおりの何らかの方法で突然変異している（改変されている）ことを意味する。
この場合にも、用語のＣａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素及びＣＲＩＳＰＲタンパク質及びＣａｓタンパク質は、概して同義的に用いられ、Ｃａｓ９に具体的に言及することによるなど、特に明らかでない限り、本明細書で言及する際には常に類推から、本願に更に記載される新規ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を指すことが理解されるであろう。上述のとおり、本明細書において用いられる残基付番の多くは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのエフェクタータンパク質を参照する。しかしながら、本発明には、他の微生物種由来の更に多くのエフェクタータンパク質が含まれることが理解されるであろう。特定の実施形態において、Ｃａｓは構成的に存在するか、又は誘導可能に存在するか、又は条件的に存在するか、又は投与されるか、又は送達され得る。Ｃａｓ最適化を用いて機能を増強するか又は新規機能を開発し得、キメラＣａｓタンパク質を作成することができる。及びＣａｓを汎用核酸結合タンパク質として用いられ得る。
一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントの発現をドライブする１つ以上のベクターが宿主細胞に導入され、核酸ターゲティング系のエレメントが発現すると、１つ以上の標的部位において核酸ターゲティング複合体の形成が導かれる。例えば、核酸ターゲティングエフェクター酵素及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡが、各々別個のベクター上で別個の調節エレメントに作動可能に連結され得る。核酸ターゲティング系のＲＮＡは、トランスジェニック核酸ターゲティングエフェクタータンパク質動物又は哺乳動物、例えば核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を構成的に又は誘導性に又は条件的に発現する動物又は哺乳動物；又は本来核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を発現しているか又は核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含有する細胞を有する動物又は哺乳動物へと、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をインビボでコードし及び発現するベクターをそれに事前投与するなどして送達することができる。代わりに、同じ又は異なる調節エレメントから発現するエレメントの２つ以上が単一のベクターに組み合わされ得、１つ以上の追加のベクターが、第１のベクターに含まれない核酸ターゲティング系の任意の構成成分を提供する。単一のベクターに組み合わされる核酸ターゲティング系エレメントは、あるエレメントが第２のエレメントに対して５’側（その「上流」）に位置するか、又はそれに対して３’側（その「下流」）に位置するなど、任意の好適な向きで配置され得る。あるエレメントのコード配列は第２のエレメントのコード配列と同じ鎖上又は逆鎖上に位置し得、同じ又は逆の方向に向き得る。一部の実施形態において、単一のプロモーターが、１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、各々が異なるイントロンにあるか、２つ以上が少なくとも１つのイントロンにあるか、又は全てが単一のイントロンにある）、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡをコードする転写物の発現をドライブする。一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と核酸ターゲティングガイドＲＮＡとは同じプロモーターに作動可能に連結されていて、そこから発現し得る。核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントを発現させるための送達媒体、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤及びその構成成分については、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）など、前述の文献で使用されているとおりである。一部の実施形態において、ベクターは制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つ以上の挿入部位（「クローニング部位」とも称される）を含む。一部の実施形態において、１つ以上の挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上又はそれより多い挿入部位）は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置する。一部の実施形態において、ベクターは２つ以上の挿入部位を含み、従って各部位へのガイド配列の挿入が可能である。かかる構成において、２つ以上のガイド配列は、単一のガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列又はこれらの組み合わせを含み得る。複数の異なるガイド配列を使用すると、単一の発現構築物を用いて細胞内の複数の異なる対応する標的配列へと核酸ターゲティング活性を標的化させることができる。例えば、単一のベクターが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個以上又はそれより多いガイド配列を含み得る。一部の実施形態において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上又はそれより多いかかるガイド配列含有ベクターが提供され、且つ任意選択で細胞に送達され得る。一部の実施形態において、ベクターは、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含む。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質又は核酸ターゲティングガイドＲＮＡは別個に送達し得、及び有利には、これらの少なくとも１つが粒子又はナノ粒子複合体によって送達される。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質に発現する時間を与えるため、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡを核酸ターゲティングガイドＲＮＡより先に送達し得る。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡは核酸ターゲティングガイドＲＮＡの投与の１～１２時間前（好ましくは約２～６時間前）に投与され得る。代わりに、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡは一緒に投与され得る。有利には、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初回投与から１～１２時間後（好ましくは約２～６時間後）にガイドＲＮＡの第２のブースター用量が投与され得る。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率的なゲノム及び／又はトランスクリプトーム改変レベルを達成するのに有用であり得る。
一態様において、本発明は、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントの使用方法を提供する。本発明の核酸ターゲティング複合体は、標的ＲＮＡを改変する有効な手段を提供する。本発明の核酸ターゲティング複合体は、非常に多数の細胞型における標的ＲＮＡの改変（例えば、欠失、挿入、転位、不活性化、活性化）を含め、多岐にわたる有用性を有する。このように本発明の核酸ターゲティング複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断及び予後判定において、広範な適用性を有する。例示的核酸ターゲティング複合体は、目的の標的遺伝子座内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成したＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を含む。
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡを切断する方法を提供する。本方法は、標的ＲＮＡに結合して前記標的ＤＮＡの切断を生じさせる核酸ターゲティング複合体を用いて標的ＲＮＡを改変するステップを含み得る。ある実施形態において、本発明の核酸ターゲティング複合体は、細胞に導入されると、ＲＮＡ配列に切断（例えば、一本鎖又は二本鎖切断）を作り出し得る。例えば、本方法を用いて細胞内の疾患ＲＮＡを切断することができる。例えば、組み込もうとする配列に上流配列及び下流配列が隣接した外因性ＲＮＡ鋳型が細胞に導入され得る。これらの上流及び下流配列は、ＲＮＡにおける組込み部位の両側と配列類似性を共有している。必要に応じて、ドナーＲＮＡはｍＲＮＡであり得る。外因性ＲＮＡ鋳型は、組み込もうとする配列（例えば、突然変異型ＲＮＡ）を含む。組込み配列は、細胞にとって内因性又は外因性の配列であり得る。組み込もうとする配列の例としては、タンパク質をコードするＲＮＡ又は非コードＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）が挙げられる。従って、組込み配列は、適切な制御配列に作動可能に連結され得る。代わりに、組込み配列が調節機能を提供し得る。外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、目的のＲＮＡ配列とドナーＲＮＡとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、標的組込み部位の上流のＲＮＡ配列と配列類似性を共有するＲＮＡ配列である。同様に、下流配列は、標的組込み部位の下流のＲＮＡ配列と配列類似性を共有するＲＮＡ配列である。外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。一部の方法において、外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と約９９％又は１００％の配列同一性を有する。上流又は下流配列は、約２０ｂｐ～約２５００ｂｐ、例えば約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００又は２５００ｂｐを含み得る。一部の方法において、例示的上流又は下流配列は、約２００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ～約１０００ｂｐ又はより詳細には約７００ｂｐ～約１０００ｂｐを有する。一部の方法において、外因性ＲＮＡ鋳型はマーカーを更に含み得る。かかるマーカーは標的組込みのスクリーニングを容易にし得る。好適なマーカーの例としては、制限部位、蛍光タンパク質又は選択可能マーカーが挙げられる。本発明の外因性ＲＮＡ鋳型は組換え技術を用いて構築することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照されたい）。外因性ＲＮＡ鋳型を組み込むことによる標的ＲＮＡの改変方法では、核酸ターゲティング複合体によってＤＮＡ又はＲＮＡ配列に切断（例えば、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡにおける二本鎖又は一本鎖切断）が導入され、外因性ＲＮＡ鋳型との相同組換えによってこの切断が修復されると、鋳型がＲＮＡ標的に組み込まれる。二本鎖切断の存在が鋳型の組込みを促進する。他の実施形態において、本発明は、真核細胞におけるＲＮＡの発現を改変する方法を提供する。本方法は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）に結合する核酸ターゲティング複合体を用いて標的ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させるステップを含む。一部の方法では、標的ＲＮＡを不活性化させて細胞の発現の改変を生じさせることができる。例えば、ＲＮＡターゲティング複合体が細胞内の標的配列に結合すると、標的ＲＮＡが不活性化され、そのためその配列は翻訳されないか、コードされたタンパク質が産生されないか、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡをコードする配列を不活性化して、タンパク質又はマイクロＲＮＡ又はプレマイクロＲＮＡ転写物が産生されないようにし得る。ＲＮＡターゲティング複合体の標的ＲＮＡは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のＲＮＡであり得る。例えば、標的ＲＮＡは、真核細胞の核に存在するＲＮＡであり得る。標的ＲＮＡは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）又は非コード配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｒＲＮＡ）であり得る。標的ＲＮＡの例としては、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列、例えば生化学的シグナル伝達経路関連ＲＮＡが挙げられる。標的ＲＮＡの例としては、疾患関連ＲＮＡが挙げられる。「疾患関連」ＲＮＡは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して罹患組織に由来する細胞において翻訳産物を異常なレベルで又は異常な形態で産生している任意のＲＮＡを指す。それは異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子から転写されるＲＮＡであり得、それは、異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子から転写されるＲＮＡであり得、ここで、発現の変化は、疾患の発生率及び／又は進行と相関する。疾患関連ＲＮＡは、疾患の病因に直接関与するか、又はそれに関与する遺伝子との連鎖不平衡がある突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子から転写されるＲＮＡも指す。翻訳産物は既知又は未知であり得、且つ正常レベル又は異常レベルであり得る。ＲＮＡターゲティング複合体の標的ＲＮＡは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のＲＮＡであり得る。例えば、標的ＲＮＡは、真核細胞の核に存在するＲＮＡであり得る。標的ＲＮＡは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）又は非コード配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｒＲＮＡ）であり得る。
一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体を標的ＲＮＡに結合させて前記標的ＲＮＡ又はＲＮＡの切断を生じさせ、それにより標的ＲＮＡを改変するステップを含むことができ、ここで、核酸ターゲティング複合体は、前記標的ＲＮＡ内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。一態様において、本発明は、真核細胞におけるＲＮＡの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体をＲＮＡに結合させて、前記結合により前記ＲＮＡの発現の増加又は減少を生じさせるステップを含み、ここで、核酸ターゲティング複合体は、ガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。同様の考察及び条件が、標的ＲＮＡを改変する方法にも上記のとおり適用される。実際上、これらの試料採取、培養及び再導入の選択肢は本発明の全態様に適用される。一態様において、本発明は、真核細胞の標的ＲＮＡを改変する方法を提供し、これはインビボ、エキソビボ又はインビトロであり得る。一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団を試料採取するステップ及び１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は、任意の段階においてエキソビボで行われ得る。この１つ又は複数の細胞が更に非ヒト動物又は植物に再導入され得る。再導入される細胞について、細胞は幹細胞であることが特に好ましい。
実際、本発明の任意の態様において、核酸ターゲティング複合体は、標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含み得る。
本発明は、核酸ターゲティング系及びその構成成分に関係した、ＲＮＡ配列ターゲティングが関わる遺伝子発現の制御に用いられる系、方法及び組成物のエンジニアリング及び最適化に関する。有利な実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂなどのＶＩ－Ｂ型タンパク質である。本方法の利点は、ＣＲＩＳＰＲ系がオフターゲット結合及びその結果として生じる副作用を最小限に抑えるか又はそれを回避することである。これは、標的ＲＮＡに対して高度な配列特異性を有するように構成された系を用いて達成される。
２つの異なるアプタマー（各々が個別の核酸ターゲティングガイドＲＮＡと会合している）を用いると、アクチベーター－アダプタータンパク質融合物及びリプレッサー－アダプタータンパク質融合物を異なる核酸ターゲティングガイドＲＮＡと共に使用して、１つのＤＮＡ又はＲＮＡの発現を活性化する一方、別のＤＮＡ又はＲＮＡの発現を抑制することが可能になる。これらは、その異なるガイドＲＮＡと共に、多重化手法で一緒に又は実質的に一緒に投与することができる。比較的少数のエフェクタータンパク質分子を多数の改変ガイドと共に使用することができるため、例えば１０又は２０又は３０個など、多数のかかる改変された核酸ターゲティングガイドＲＮＡを全て同時に使用し得る一方、１つのみの（又は少なくとも最小数の）エフェクタータンパク質分子を送達するのみで十分である。アダプタータンパク質は１つ以上のアクチベーター又は１つ以上のリプレッサーと会合（好ましくは連結又は融合）し得る。例えば、アダプタータンパク質は第１のアクチベーター及び第２のアクチベーターと会合し得る。第１及び第２のアクチベーターは同じであり得るが、これらは、好ましくは、異なるアクチベーターである。３つ以上又は更に４つ以上のアクチベーター（又はリプレッサー）を使用し得、しかし、パッケージサイズにより、個数が５を超える異なる機能ドメインとなることは制限され得る。アダプタータンパク質との直接的な融合と比べて、好ましくはリンカーが用いられ、ここで、２つ以上の機能ドメインがアダプタータンパク質と会合する。好適なリンカーとしてはＧｌｙＳｅｒリンカーを挙げることができる。
核酸ターゲティングエフェクタータンパク質－ガイドＲＮＡ複合体が全体として２つ以上の機能ドメインと会合し得ることも想定される。例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と会合した２つ以上の機能ドメインがあり得るか、又はガイドＲＮＡと（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）会合した２つ以上の機能ドメインがあり得るか、又は核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と会合した１つ以上の機能ドメイン及びガイドＲＮＡと（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）会合した１つ以上の機能ドメインがあり得る。
アダプタータンパク質とアクチベーター又はリプレッサーとの間の融合は、リンカーを含み得る。例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーＧＧＧＳを使用することができる。これらを３個（（ＧＧＧＧＳ）３）又は６個、９個又は更に１２個又はそれを超える反復で使用することにより、必要に応じて好適な長さを提供することができる。リンカーは、ガイドＲＮＡと機能ドメイン（アクチベーター又はリプレッサー）との間又は核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と機能ドメイン（アクチベーター又はリプレッサー）との間に使用することができる。リンカー、使用者は適切な量の「機械的柔軟性」を操作する。
本発明は、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質とガイドＲＮＡとを含む核酸ターゲティング複合体を包含し、ここで、核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は、少なくとも１つの突然変異［そのため、核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は、その少なくとも１つの突然変異を有しない核酸ターゲティングエフェクタータンパク質の５％以下の活性を有する］及び任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、ガイドＲＮＡは、細胞内の目的のＲＮＡにおける標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含み、ここで、核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は、２つ以上の機能ドメインと会合するか、又はガイドＲＮＡの少なくとも１つのループが、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する個別的なＲＮＡ配列の挿入によって改変され、ここで、アダプタータンパク質は、２つ以上の機能ドメインと会合するか、又は核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合し、及びガイドＲＮＡの少なくとも１つのループが、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、ここで、アダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合する。
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体は機能エフェクターを送達することができる
ＲＮＡレベルで突然変異させることにより発現を消失させるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ媒介性ノックアウトと異なり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂノックダウンは、例えば、Ｃａｓ１３ｂタンパク質の切断ドメインにある突然変異残基を介して、人工転写因子を用いて遺伝子発現を一時的に低下させることが可能であり、触媒的に不活性なＣａｓ１３ｂが生成される。触媒的に不活性なＣａｓ１３ｂは、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡと複合体を形成し、そのガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのターゲティングドメインによって特定されるＲＮＡ配列に局在化するが、しかしながら、これは、標的を切断しない。不活性Ｃａｓ１３ｂタンパク質をエフェクタードメイン、例えば転写抑制ドメインと融合させると、ガイドＲＮＡによって特定される任意の部位へとそのエフェクターをリクルートすることが可能になる。
最適化された機能性ＲＮＡターゲティング系
ある態様において、従って、本発明は、機能性構成成分をＲＮＡ環境に特異的に送達するための系を提供する。これは、ＲＮＡへの種々の構成成分の特異的ターゲティングを可能にする本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用して確実にすることができる。より詳細には、かかる構成成分には、ＲＮＡ翻訳、分解等のアクチベーター又はリプレッサーなど、アクチベーター又はリプレッサーが含まれる。
一態様によれば、本発明は、細胞内の目的の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供し、ここで、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、アダプタータンパク質に結合する１つ以上の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変される。詳細な実施形態において、ＲＮＡ配列は、２つ以上のアダプタータンパク質に結合し得（例えば、アプタマー）、ここで、各アダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合している。２つ以上の機能ドメインがあるとき、それらの機能ドメインは、同じであるか又は異なり得、例えば２つの同じ又は２つの異なるアクチベーター又はリプレッサーであり得る。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、１つ以上の機能ドメインがＲＮＡターゲティング酵素に付加されているため、機能ドメインは、標的ＲＮＡへの結合時、機能ドメインがその帰属機能で機能することが可能な空間的配置となる。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、組成物は、少なくとも３つの機能ドメインであって、その少なくとも１つがＲＮＡターゲティング酵素と会合し、且つその少なくとも２つがｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡと会合している機能ドメインを有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ複合体を含む。
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体又はその構成成分の送達
本開示及び当該技術分野における知識から、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系又はその構成成分、若しくはその核酸分子（例えば、ＨＤＲ鋳型を含む）、若しくはその構成成分をコードし又は提供する核酸分子は、本明細書に概略的にも詳細にも記載される送達系によって送達し得る。
ベクター送達、例えばプラスミド、ウイルス送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素及び／又は任意の本ＲＮＡ、例えばガイドＲＮＡは、任意の適切なベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス若しくは他の種類のウイルスベクター又はこれらの組み合わせを用いて送達することができる。エフェクタータンパク質及び１つ以上のガイドＲＮＡを１つ以上のベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターにパッケージングすることができる。一部の実施形態において、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターは、例えば筋肉注射によって目的の組織に送達される一方、送達は、静脈内、経皮、鼻腔内、口腔、粘膜又は他の送達方法によることもある。かかる送達は、単回投与又は複数回投与によるものであり得る。当業者は、本明細書で送達される実際の投薬量が、ベクターの選択、標的細胞、生物又は組織、治療する対象の全身状態、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与様式、求められる形質転換／改変の種類など、種々の要因に応じて大きく異なり得ることを理解する。
かかる用量は、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容可能な担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容可能な賦形剤及び／又は当該技術分野で公知の他の化合物を更に含み得る。投薬量は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩を更に含み得る。加えて、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲル又はゲル化物質、香料、着色剤、ミクロスフェア、ポリマー、懸濁剤などの補助物質もこの中に存在し得る。加えて、１つ以上の他の従来の医薬成分、例えば防腐剤、湿潤剤、懸濁剤、界面活性剤、酸化防止剤、固化防止剤、充填剤、キレート化剤、コーティング剤、化学安定剤なども、特に投薬形態が再構成可能な形態である場合に存在し得る。好適な例示的成分として、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン及びこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容可能な賦形剤の徹底的な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）（参照により本明細書に援用される）において利用可能である。
本明細書のある実施形態において、送達はアデノウイルスを介し、これは、少なくとも１×１０５粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）のアデノウイルスベクターを含有する単回ブースター用量であり得る。本明細書のある実施形態において、用量は、好ましくは、少なくとも約１×１０６粒子（例えば、約１×１０６～１×１０１２粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８粒子（例えば、約１×１０８～１×１０１１粒子又は約１×１０８～１×１０１２粒子）及び最も好ましくは少なくとも約１×１００粒子（例えば、約１×１０９～１×１０１０粒子又は約１×１０９～１×１０１２粒子）又は更に少なくとも約１×１０１０粒子（例えば、約１×１０１０～１×１０１２粒子）のアデノウイルスベクターである。代わりに、用量は、約１×１０１４粒子以下、好ましくは約１×１０１３粒子以下、更により好ましくは約１×１０１２粒子以下、更により好ましくは約１×１０１１粒子以下及び最も好ましくは約１×１０１０粒子以下（例えば、約１×１０９粒子（ａｒｔｉｃｌｅｓ）以下）を含む。従って、用量は、例えば、約１×１０６粒子単位（ｐｕ）、約２×１０６ｐｕ、約４×１０６ｐｕ、約１×１０７ｐｕ、約２×１０７ｐｕ、約４×１０７ｐｕ、約１×１０８ｐｕ、約２×１０８ｐｕ、約４×１０８ｐｕ、約１×１０９ｐｕ、約２×１０９ｐｕ、約４×１０９ｐｕ、約１×１０１０ｐｕ、約２×１０１０ｐｕ、約４×１０１０ｐｕ、約１×１０１１ｐｕ、約２×１０１１ｐｕ、約４×１０１１ｐｕ、約１×１０１２ｐｕ、約２×１０１２ｐｕ又は約４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含む単回用量のアデノウイルスベクターを含有し得る。例えば、２０１３年６月４日に付与されたＮａｂｅｌ，ｅｔ．ａｌ．に対する米国特許第８，４５４，９７２ Ｂ２号明細書（参照によって本明細書に援用される）のアデノウイルスベクター及びその第２９欄第３６～５８行にある投薬量を参照されたい。本明細書のある実施形態において、アデノウイルスは複数回用量で送達される。
本明細書のある実施形態において、送達はＡＡＶを介する。ヒトに対するＡＡＶのインビボ送達についての治療上有効な投薬量は、約１×１０１０～約１×１０１０の機能性ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含有する約２０～約５０ｍｌの生理食塩水の範囲であると考えられる。投薬量は、治療利益と任意の副作用との均衡がとれるように調整され得る。本明細書のある実施形態において、ＡＡＶ用量は、概して、約１×１０５～１×１０５０ゲノムＡＡＶ、約１×１０８～１×１０２０ゲノムＡＡＶ、約１×１０１０～約１×１０１６ゲノム又は約１×１０１１～約１×１０１６ゲノムＡＡＶの濃度範囲である。ヒト投薬量は約１×１０１３ゲノムＡＡＶであり得る。かかる濃度は、約０．００１ｍｌ～約１００ｍｌ、約０．０５～約５０ｍｌ又は約１０～約２５ｍｌの担体溶液で送達され得る。他の効果的な投薬量が、当業者により、用量反応曲線を作成するルーチンの試験を用いて容易に確立され得る。例えば、２０１３年３月２６日に付与されたＨａｊｊａｒ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第８，４０４，６５８ Ｂ２号明細書、第２７欄、第４５～６０行を参照されたい。
本明細書のある実施形態において、送達はプラスミドを介する。かかるプラスミド組成物では、投薬量は、反応を誘発するのに十分な量のプラスミドでなければならない。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの好適な分量は、個体７０ｋｇ当たり約０．１～約２ｍｇ又は約１μｇ～約１０μｇであり得る。本発明のプラスミドは、概して、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）前記プロモーターに作動可能に連結された、核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列；（ｉｉｉ）選択可能マーカー；（ｉｖ）複製起点；及び（ｖ）（ｉｉ）の下流で（ｉｉ）に作動可能に連結された転写ターミネーターを含み得る。プラスミドはＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ構成成分もコードし得るが、これらの１つ以上は、代わりに異なるベクター上にコードされ得る。
本明細書の用量は、平均７０ｋｇの個体に基づく。投与頻度は医学又は獣医学の実務者（例えば、医師、獣医師）又は当該技術分野の科学者の裁量の範囲内にある。また、実験に使用されるマウスは、典型的には約２０ｇであり、マウス実験から７０ｋｇの個体にスケールアップし得ることも注記される。
一部の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子はリポソーム製剤又はリポフェクチン製剤などで送達され、当業者に周知の方法により調製することができる。かかる方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書及び同第５，５８０，８５９号明細書（これらは参照により本明細書に援用される）に記載されている。特に哺乳類細胞へのｓｉＲＮＡ送達の増強及び改良を目的とした送達系が開発されており（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１－１１４；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６－１０１０；Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ．２００３，９：２１０－２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３２７：７６１－７６６；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７－１０８及びＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２００３，３１，１１：２７１７－２７２４を参照されたい）、本発明に適用し得る。ｓｉＲＮＡは近年、霊長類における遺伝子発現の抑制への使用が成功しており（例えば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２４（４）：６６０を参照されたい）、これは本発明にも適用し得る。
実際、ＲＮＡ送達はインビボ送達の有用な方法である。リポソーム又は粒子を用いて核酸ターゲティングＣａｓ１３ｂタンパク質及びガイドＲＮＡ若しくはｃｒＲＮＡ（及び例えばＨＲ修復鋳型）を細胞内に送達することが可能である。従って、核酸ターゲティングＣａｓ１３ｂタンパク質の送達及び／又は本発明のガイドＲＮＡ若しくはｃｒＲＮＡの送達は、ＲＮＡ形態で、微小胞、リポソーム又は粒子を介することができる。例えば、Ｃａｓ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡをインビボ送達用にリポソーム粒子にパッケージングすることができる。リポソームトランスフェクション試薬、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのリポフェクタミン及び市販の他の試薬は、ＲＮＡ分子を肝臓に効果的に送達することができる。
同様に好ましいＲＮＡの送達手段としては、ＲＮＡのナノ粒子による送達（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，“Ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９：３１１２－３１１８，２０１０）又はエキソソームによる送達（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，“Ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９－２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）も挙げられる。実際、エキソソームは、ＲＮＡターゲティング系とある程度の類似性を有する系であるｓｉＲＮＡの送達に特に有用であることが示されている。例えば、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（“Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２－２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １５）は、エキソソームがいかに種々の生物学的障壁を越えた薬物送達に有望なツールであるか、及びｓｉＲＮＡのインビトロ及びインビボ送達に利用できるかを記載している。その手法は、発現ベクターのトランスフェクションにより、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む標的エキソソームを作成するものである。次に、トランスフェクト細胞上清からエキソソームが精製され、特徴付けられた後、ＲＮＡがエキソソームにロードされる。本発明に係る送達又は投与はエキソソームを用いて、詳細には、限定はされないが脳に対して行うことができる。ビタミンＥ（α－トコフェロール）を核酸ターゲティングＣａｓタンパク質にコンジュゲートさせて、例えばＵｎｏ ｅｔ ａｌ．（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：７１１－７１９（Ｊｕｎｅ ２０１１））によって行われた脳への低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達と同じように、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と共に脳に送達することができる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はフリーＴｏｃｓｉＢＡＣＥ又はＴｏｃ－ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬが充填され且つＢｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ ３（Ａｌｚｅｔ）に接続された浸透圧ミニポンプ（モデル１００７Ｄ；Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）でマウスが注入された。背側第三脳室内への注入のため、正中線上でブレグマから約０．５ｍｍ後方に脳注入カニューレが留置された。Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．は、ＨＤＬを含む僅か３ｎｍｏｌのＴｏｃ－ｓｉＲＮＡが、同じＩＣＶ注入法による同程度の標的の減少を誘導可能であったことを見出した。脳を標的としてＨＤＬと共投与される、α－トコフェロールにコンジュゲートされた同様の投薬量の核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を本発明においてヒトで企図することができ、例えば脳を標的とする約３ｎｍｏｌ～約３μｍｏｌの核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を企図し得る。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：４６５－４７５（Ａｐｒｉｌ ２０１１））は、ラットの脊髄におけるインビボでの遺伝子サイレンシングのためのＰＫＣγを標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス媒介送達方法を記載している。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．は、１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスをくも膜下カテーテルによって投与した。脳を標的とするレンチウイルスベクターにおいて発現する同様の投薬量の核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を本発明においてヒトに企図することができ、例えば１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有するレンチウイルスにおける脳を標的とする約１０～５０ｍｌの核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を企図し得る。
脳への局所送達に関して、これは様々な方法で達成することができる。例えば、物質を線条体内に例えば注入によって送達することができる。注入は、開頭により定位的に行うことができる。
パッケージング及びプロモーター概要
インビボでゲノム改変を媒介するためにＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂタンパク質）コード核酸分子、例えばＤＮＡをベクター、例えばウイルスベクターにパッケージングする方法は、以下を含む：
シングルウイルスベクター：
２つ以上の発現カセットを含むベクター：
プロモーター－核酸ターゲティングエフェクタータンパク質コード核酸分子－ターミネーター
プロモーター－ガイドＲＮＡ１－ターミネーター
プロモーター－ガイドＲＮＡ（Ｎ）－ターミネーター（ベクターサイズの限界まで）
ダブルウイルスベクター：
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂ）の発現をドライブするための１つの発現カセットを含むベクター１
プロモーター－ＲＮＡターゲティングエフェクター（Ｃａｓ１３ｂ）タンパク質コード核酸分子－ターミネーター
１つ以上のガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの発現をドライブするためのもう１つの発現カセットを含むベクター２
プロモーター－ガイドＲＮＡ１又はｃｒＲＮＡ１－ターミネーター
プロモーター－ガイドＲＮＡ１（Ｎ）又はｃｒＲＮＡ１（Ｎ）－ターミネーター（ベクターサイズの限界まで）。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質コード核酸分子発現のドライブに用いられるプロモーターには、以下が含まれ得る。ＡＡＶ ＩＴＲはプロモーターとして役立ち得る：これは、追加のプロモーターエレメント（ベクター内で場所をとり得る）の必要性がなくなるため有利である。空いた追加のスペースを用いて、追加のエレメント（ｇＲＮＡなど）の発現をドライブすることができる。また、ＩＴＲ活性は比較的弱いため、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質の過剰発現による潜在的な毒性を低減するために用いることができる。偏在発現には、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖又は軽鎖等のプロモーターを使用し得る。脳又は他のＣＮＳでの発現には、プロモーター：全てのニューロン用のシナプシンＩ、興奮性ニューロン用のＣａＭＫＩＩα、ＧＡＢＡ作動性ニューロン用のＧＡＤ６７又はＧＡＤ６５又はＶＧＡＴ等を使用することができる。肝臓での発現には、アルブミンプロモーターを使用することができる。肺での発現には、ＳＰ－Ｂを使用することができる。内皮細胞には、ＩＣＡＭを使用することができる。造血細胞には、ＩＦＮβ又はＣＤ４５を使用することができる。骨芽細胞には、ＯＧ－２を使用することができる。ガイドＲＮＡのドライブに用いられるプロモーターには、以下が含まれ得る：Ｕ６又はＨ１などのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを発現させるためのＰｏｌ ＩＩプロモーター及びイントロンカセット。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
Ｃａｓ１３ｂ及び１つ以上のガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス又は他のプラスミド又はウイルスベクタータイプを使用して、詳細には、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルス用の製剤、用量）、同第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶ用の製剤、用量）及び同第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミド用の製剤、用量）並びにレンチウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルスが関わる臨床試験及びそのような臨床試験に関する刊行物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、ＡＡＶについて、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書及びＡＡＶが関わる臨床試験にあるとおりであり得る。アデノウイルスについて、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書及びアデノウイルスが関わる臨床試験にあるとおりであり得る。プラスミド送達について、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書及びプラスミドが関わる臨床試験にあるとおりであり得る。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、男性成人ヒト）に基づくか又はそれに当てはめられ得、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳動物用に調整することができる。投与頻度は、患者又は対象の年齢、性別、全般的な健康、他の条件並びに対処される特定の状態又は症状を含めた通常の要因に応じて、医学又は獣医学実務者（例えば、医師、獣医師）の範囲内である。ウイルスベクターは、目的の組織に注射することができる。細胞型特異的ゲノム改変について、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）の発現は、細胞型特異的プロモーターによってドライブすることができる。例えば、肝臓特異的発現にはアルブミンプロモーターが用いられ得、及びニューロン特異的発現には（例えば、ＣＮＳ障害を標的化するため）シナプシンＩプロモーターが用いられ得る。インビボ送達に関して、他のウイルスベクターと比べて幾つかの理由でＡＡＶが有利である：低毒性（これは、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心が不要な精製方法に起因し得る）、及び宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異誘発を引き起こす確率の低さ。
ＡＡＶのパッケージング限界は、４．５又は４．７５Ｋｂである。これは、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）コード配列並びにプロモーター及び転写ターミネーターを全て同じウイルスベクターに収める必要があることを意味する。ＡＡＶに関して、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はこれらの任意の組み合わせであり得る。標的化しようとする細胞に関連するＡＡＶのＡＡＶを選択することができる。例えば、脳又は神経細胞の標的化にはＡＡＶ血清型１、２、５又はハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はこれらの任意の組み合わせを選択することができ、及び心臓組織の標的化にはＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は肝臓への送達に有用である。本明細書におけるプロモーター及びベクターが個々に好ましい。これらの細胞に関する特定のＡＡＶ血清型の一覧は以下のとおりである（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８）を参照されたい）。
Figure 2023052236000001
レンチウイルス
レンチウイルスは、有糸分裂細胞及び分裂終了細胞の両方でその遺伝子の感染能及び発現能を有する複合的レトロウイルスである。最も一般的には、公知のレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、これは他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を用いて広範囲の細胞型を標的化する。レンチウイルスは以下のとおり調製し得る。ｐＣａｓＥＳ１０（これはレンチウイルストランスファープラスミド骨格を含有する）のクローニング後、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴをＴ－７５フラスコに５０％コンフルエンスとなるように播種し、その翌日、１０％ウシ胎仔血清含有及び抗生物質不含のＤＭＥＭ中でトランスフェクトした。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞に１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）及び以下のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－ｇシュードタイプ）及び７．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）をトランスフェクトした。トランスフェクションは、カチオン性脂質デリバリー剤（５０ｕＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及び１００ｕｌ Ｐｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬ ＯｐｔｉＭＥＭ中で行った。６時間後、培地を、１０％ウシ胎仔血清を含む抗生物質不含ＤＭＥＭに交換した。これらの方法では細胞培養中に血清を使用するが、無血清方法が好ましい。
レンチウイルスは以下のとおり精製し得る。４８時間後にウイルス上清を回収した。初めに上清から残屑を除去し、０．４５ｕｍ低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルタでろ過した。次に、それを超遠心機において２４，０００ｒｐｍで２時間スピンした。ウイルスペレットを５０ｕｌのＤＭＥＭ中に４℃で一晩再懸濁した。次に、それをアリコートに分け、直ちに－８０℃で凍結した。
別の実施形態において、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとする最小限の非霊長類レンチウイルスベクターも特に眼遺伝子療法に企図される（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５－２８５を参照されたい）。別の実施形態において、滲出型（ｗｅｂ ｆｏｒｍ）の加齢黄斑変性症の治療のため網膜下注射によって送達される血管新生抑制タンパク質エンドスタチン及びアンジオスタチンを発現するウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子療法ベクターであるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）も企図され（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０－９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１２）を参照されたい）、このベクターは本発明の核酸ターゲティング系向けに改変し得る。
別の実施形態において、ＨＩＶ ｔａｔ／ｒｅｖによって共有される共通のエクソンを標的化するｓｉＲＮＡと、核小体局在ＴＡＲデコイと、抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムとを含む自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：３６ｒａ４３を参照されたい）を本発明の核酸ターゲティング系に使用及び／又は適合され得る。患者の体重１キログラム当たり最低２．５×１０６個のＣＤ３４＋ 細胞を収集し、２μｍｏｌ／Ｌ－グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）及びトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含有するＸ－ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）中２×１０６細胞／ｍｌの密度でで１６～２０時間予備刺激し得る。フィブロネクチン（２５ｍｇ／ｃｍ２）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）で被覆した７５ｃｍ２組織培養フラスコにおいて、予備刺激した細胞をレンチウイルスによって感染多重度５で１６～２４時間にわたって形質導入し得る。
レンチウイルスベクターについては、パーキンソン病の治療にあるとおり開示されており、例えば米国特許出願公開第２０１２０２９５９６０号明細書及び米国特許第７３０３９１０号明細書及び同第７３５１５８５号明細書を参照されたい。レンチウイルスベクターは、眼疾患の治療についても開示されており、例えば米国特許出願公開第２００６０２８１１８０号明細書、２００９０００７２８４号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１１７１８９号明細書；米国特許出願公開第２００９００１７５４３号明細書；米国特許出願公開第２００７００５４９６１号明細書、米国特許出願公開第２０１００３１７１０９号明細書を参照されたい。レンチウイルスベクターは、脳への送達についても開示されており、例えば米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書；米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書、米国特許出願公開第２００４００１３６４８号明細書、米国特許出願公開第２００７００２５９７０号明細書、米国特許出願公開第２００９０１１１１０６号明細書及び米国特許第７２５９０１５号明細書を参照されたい。
ＲＮＡ送達
ＲＮＡ送達：核酸ターゲティングＣａｓ１３ｂタンパク質及び／又はガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で送達することもできる。ｍＲＮＡは、以下のエレメントを含むＰＣＲカセットを用いて合成することができる：βグロビン－ポリＡテール（１２０以上の一連のアデニン）由来のＴ７＿プロモーター－コザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）－エフェクタータンパク質－３’ＵＴＲを含有するＰＣＲカセットを用いて合成することができる。このカセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、Ｔ７＿プロモーター－ＧＧ－ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ配列を含有するカセットからのインビトロ転写を用いて転写することもできる。
粒子送達系及び／又は製剤：
幾つかのタイプの粒子送達系及び／又は製剤が、多様な生物医学的適用において有用であることが知られている。一般に、粒子は、その輸送及び特性の点で一単位として挙動する小さい物体として定義される。粒子は、更に直径に基づいて分類される。粗粒子は２，５００～１０，０００ナノメートルの範囲を包含する。微粒子は１００～２，５００ナノメートルのサイズを有する。超微粒子又はナノ粒子は、概して１～１００ナノメートルのサイズである。１００ｎｍ限度の基準は、粒子をバルク材料と区別する新規特性が典型的には１００ｎｍ未満の臨界長さスケールで生じるという事実である。
本明細書で使用されるとき、粒子送達系／製剤は、本発明における粒子を含む任意の生物学的送達系／製剤として定義される。本発明における粒子は、１００ミクロン（μｍ）未満の最大径（例えば、直径）を有する任意の実体である。一部の実施形態において、本発明の粒子は１０μｍ未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は２０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ又は１００ｎｍ未満の最大径を有する。典型的には、本発明の粒子は５００ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は２５０ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は２００ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は１５０ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は１００ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。より小さい粒子、例えば５０ｎｍ以下の最大径を有する粒子が、本発明の一部の実施形態で使用される。一部の実施形態において、本発明の粒子は２５ｎｍ～２００ｎｍの範囲の最大径を有する。
粒子の特徴付け（例えば、形態、寸法等を特徴付けることを含む）は種々の異なる技法を用いて行われる。一般的な技法は、電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、紫外・可視分光法、二重偏光干渉法及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。特徴付け（寸法計測）は、天然粒子（即ち負荷前）に関して行われるか又はカーゴの負荷後に行われ得（本明細書においてカーゴとは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ系の１つ以上の構成成分、例えばＣａｓ１３ｂ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡ又はこれらの任意の組み合わせを指し、且つ更なる担体及び／又は賦形剤を含み得る）、それにより本発明の任意のインビトロ、エキソビボ及び／又はインビボ適用のための送達に最適なサイズの粒子が提供される。特定の好ましい実施形態において、粒子寸法（例えば、直径）の特徴付けは、動的レーザー散乱法（ＤＬＳ）を用いた計測に基づく。粒子、その作製及び使用方法並びにその計測に関して、米国特許第８，７０９，８４３号明細書；米国特許第６，００７，８４５号明細書；米国特許第５，８５５，９１３号明細書；米国特許第５，９８５，３０９号明細書；米国特許第５，５４３，１５８号明細書；及びＪａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４による発表が挙げられる。Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｉｔｈ ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，１１５９－１１６１（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１５）も参照されたい。
本発明の範囲内の粒子送達系は、限定はされないが、固体、半固体、エマルション又はコロイド粒子を含め、任意の形態で提供され得る。従って、限定はされないが、例えば脂質ベースのシステム、リポソーム、ミセル、微小胞、エキソソーム又は遺伝子銃を含め、本明細書に記載される送達系の任意のものが、本発明の範囲内の粒子送達系として提供され得る。
粒子
Ｃａｓ１３ｂ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、粒子又は脂質エンベロープを使用して同時に送達し得る。例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ酵素及びＲＮＡ（例えば、複合体としての）は、７Ｃ１など、Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開第２０１５０８９４１９ Ａ２号パンフレット及びその引用文献にあるとおりの粒子によって送達することができ（例えば、Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照されたい）、例えば送達粒子は脂質又はリピドイド及び親水性ポリマー、例えばカチオン性脂質及び親水性ポリマーを含み、例えば、カチオン性脂質には、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）又は１，２－ジテトラデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）が含まれ、及び／又は親水性ポリマーには、エチレングリコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ、及び／又は粒子は、コレステロール（例えば、製剤１＝ＤＯＴＡＰ １００、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ０、コレステロール ０；製剤番号２＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ １０、コレステロール ０；製剤番号３＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ５、コレステロール ５からの粒子）を更に含み、粒子は効率的な多段階プロセスを用いて形成され、ここで、初めに、エフェクタータンパク質及びＲＮＡを、例えば１：１モル比で、例えば室温で、例えば３０分間、例えば無菌ヌクレアーゼフリー１×ＰＢＳ中において共に混合し、及びそれとは別に、製剤に適用し得るとおりＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ及びコレステロールをアルコール、例えば１００％エタノール中に溶解し、及びこれらの２つの溶液を共に混合して、複合体を含有する粒子を形成する）。Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、粒子又は脂質エンベロープを使用して同時に送達し得る。このＤａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌの技術は、本発明に適用することができる。エポキシド改変脂質ポリマーを利用して本発明の核酸ターゲティング系を肺細胞、心血管細胞又は腎細胞に送達し得、しかしながら、当業者は、この系を他の標的器官への送達にも応用し得る。約０．０５～約０．６ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬量が想定される。数日間又は数週間にわたる、合計投薬量を約２ｍｇ／ｋｇとする投薬も想定される。例えば、Ｓｕ Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ ＤＪ（“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ－ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｐＨ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４－８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ １）は、ポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアがリン脂質二重層シェルによって被包された生分解性コア－シェル構造化粒子について記載している。これらはインビボｍＲＮＡ送達のために開発された。ｐＨ応答性ＰＢＡＥ成分はエンドソーム破壊を促進するように選択される一方、脂質表面層はポリカチオンコアの毒性を最小限に抑えるように選択された。従って、これは本発明のＲＮＡの送達に好ましい。
一実施形態において、自己集合生体付着性ポリマーをベースとする粒子が企図され、これは、ペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達及びペプチドの経鼻送達、脳への全てに適用し得る。疎水性薬物の経口吸収及び眼内送達など、他の実施形態も企図される。分子エンベロープ技術は、保護され且つ疾患部位に送達されるエンジニアリングされたポリマーエンベロープを含む（例えば、Ｍａｚｚａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１３．７（２）：１０１６－１０２６；Ｓｉｅｗ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（１）：１４－２８；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ，２０１２．１６１（２）：５２３－３６；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１６６５－８０；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１７６４－７４；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，２０１２．５（５－６）：４５８－６８；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔ，２０１２．４３（５）：６８１－６８８；Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ２０１０．７：Ｓ４２３－３３；Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ，２００６．３（５）：６２９－４０；Ｑｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６．７（１２）：３４５２－９及びＵｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００１．２２４：１８５－１９９を参照されたい）。標的組織に応じて単回又は複数回用量での約５ｍｇ／ｋｇの用量が企図される。
粒子に関して、Ａｌａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ａｕｇ ６；１１０（３２）：１２８８１－６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．２０１３ Ｓｅｐ ６；２５（３３）：４６４１－５；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１３ Ｍａｒ １３；１３（３）：１０５９－６４；Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ｏｃｔ ２３；６（１０）：８４８４－７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ａｕｇ ２８；６（８）：６９２２－９及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ ３；７（６）：３８９－９３も参照されたい。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書は、リピドイド化合物に関し、同様にポリヌクレオチドの投与に特に有用であり、これは、本発明の核酸ターゲティング系の送達に適用し得る。一態様において、アミノアルコールリピドイド化合物が、細胞又は対象に送達される薬剤と組み合わされて、マイクロパーティクル、ナノ粒子、リポソーム又はミセルを形成する。粒子、リポソーム又はミセルによって送達される薬剤は、気体、液体又は固体の形態であり得、及び薬剤はポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド又は小分子であり得る。アミノアルコール（ｍｉｎｏａｌｃｏｈｏｌ）リピドイド化合物は、他のアミノアルコールリピドイド化合物、ポリマー（合成又は天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質等と組み合わされて粒子を形成し得る。次に、これらの粒子が任意選択で医薬賦形剤と組み合わされて医薬組成物を形成し得る。米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書は、アミノアルコールリピドイド化合物を調製する方法も提供する。アミンの１つ以上の均等物をエポキシド末端化合物の１つ以上の均等物と好適な条件下で反応させると、本発明のアミノアルコールリピドイド化合物が形成される。特定の実施形態において、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全に反応して第三級アミンを形成する。他の実施形態において、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全には反応せずに第三級アミンを形成し、それによりアミノアルコールリピドイド化合物に第一級又は第二級アミンが生じる。これらの第一級又は第二級アミンはそのままにされるか、又は異なるエポキシド末端化合物などの別の求電子剤と反応させ得る。当業者によって理解されるであろうとおり、アミンが過剰未満のエポキシド末端化合物と反応すると、様々な数の末端部を有する複数の異なるアミノアルコールリピドイド化合物が生じることになる。ある種のアミン類は２つのエポキシド由来化合物末端部で完全に官能化され得る一方、他の分子はエポキシド末端化合物末端部で完全には官能化されない。例えば、ジアミン又はポリアミンは、分子の様々なアミノ部分の１、２、３又は４つのエポキシド由来化合物末端部を含んで第一級、第二級及び第三級アミンを生じ得る。特定の実施形態において、全てのアミノ基が完全には官能化されない。特定の実施形態において、同じタイプのエポキシド末端化合物の２つが使用される。他の実施形態において、２つ以上の異なるエポキシド末端化合物が使用される。アミノアルコールリピドイド化合物の合成は溶媒有り又は無しで実施され、及び合成は３０～１００℃、好ましくは約５０～９０℃の範囲の高温で実施され得る。調製されたアミノアルコールリピドイド化合物は、任意選択で、精製され得る。例えば、アミノアルコールリピドイド化合物の混合物を精製して、特定の数のエポキシド由来化合物末端部を有するアミノアルコールリピドイド化合物を得ることができる。又は混合物を精製して、特定の立体又は位置異性体を得ることができる。アミノアルコールリピドイド化合物は、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）又は他のアルキル化剤を用いてもアルキル化され得、及び／又はそれらは、アシル化され得る。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書は、本発明の方法によって調製されたアミノアルコールリピドイド化合物のライブラリも提供する。これらのアミノアルコールリピドイド化合物は、液体ハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピュータ等が関わるハイスループット技法を用いて調製され及び／又はスクリーニングされ得る。特定の実施形態において、アミノアルコールリピドイド化合物は、ポリヌクレオチド又は他の薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を細胞にトランスフェクトする能力に関してスクリーニングされる。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書は、コンビナトリアル重合を用いて調製されたポリ（β－アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）類の一クラスに関する。本発明のＰＢＡＡは、コーティング（医療器具又はインプラントのフィルム又は多層フィルムコーティングなど）、添加剤、材料、賦形剤、生物付着防止剤、マイクロパターニング剤及び細胞封入剤など、バイオテクノロジー及び生物医学的適用において用いられ得る。表面コーティングとして使用される場合、これらのＰＢＡＡは、インビトロ及びインビボの両方で、その化学構造に応じて様々なレベルの炎症を誘発した。この材料クラスの化学的多様性は大きいため、インビトロでマクロファージ活性化を阻害するポリマーコーティングを同定することが可能であった。更に、これらのコーティングは、カルボキシル化ポリスチレンマイクロパーティクルの皮下移植後の炎症細胞の動員を低減し、且つ線維症を低減する。これらのポリマーを使用して、細胞封入用の高分子電解質複合体カプセルを形成し得る。本発明も、抗菌性コーティング、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ送達及び幹細胞組織工学など、他の多くの生物学的適用を有し得る。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書の教示は、本発明の核酸ターゲティング系に適用し得る。
別の実施形態において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が企図される。抗トランスサイレチン低分子干渉ＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入され、ヒトに送達されており（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６９：８１９－２９を参照されたい）、及びかかるシステムを本発明の核酸ターゲティング系に適合させて応用し得る。静脈内投与される約０．０１～約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量が企図される。注入関連反応のリスクを低下させる薬物投与が企図され、デキサメタゾン、アセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｐｉｎｏｐｈｅｎ）、ジフェンヒドラミン又はセチリジン及びラニチジンなどが企図される。４週間毎の５用量にわたる約０．３ｍｇ／キログラムの複数回用量も企図される。ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡの肝臓への送達に極めて有効であることが示されており（例えば、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ ３６３－４７０を参照されたい）、従って核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をコードするＲＮＡの肝臓への送達に企図される。２週間毎に６ｍｇ／ｋｇのＬＮＰの約４用量の投薬量が企図され得る。Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．は、０．７ｍｇ／ｋｇで投与するＬＮＰの最初の２サイクル後に腫瘍退縮が観察され、及び６サイクルの終わりまでに患者がリンパ節転移の完全退縮及び肝腫瘍の実質的な縮小を伴う部分奏効を達成したことを実証した。この患者では４０用量後に完全奏効が得られ、２６ヵ月間にわたって投与を受けた後も患者は寛解を保ったまま治療を完了した。ＶＥＧＦ経路阻害薬による先行治療後に進行していた、腎臓、肺及びリンパ節を含めた肝外疾患部位を有する２人のＲＣＣ患者は、約８～１２ヵ月間全ての部位で疾患の安定が得られ、及びＰＮＥＴ及び肝転移患者は１８ヵ月間（３６用量）にわたって延長試験を継続し、疾患は安定していた。しかしながら、ＬＮＰの電荷が考慮されなければならない。カチオン性脂質を負電荷脂質と組み合わせると、細胞内送達を促進する非二重層構造が誘導されるためである。荷電ＬＮＰは静脈内注射後に循環から急速に除去されるため、ｐＫａ値が７未満のイオン化可能なカチオン性脂質が開発された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。ＲＮＡなどの負電荷ポリマーは低ｐＨ値（例えば、ｐＨ４）でＬＮＰに負荷することができ、ここで、イオン化可能な脂質は、正電荷を呈する。しかしながら、生理的ｐＨ値では、ＬＮＰは、より長い循環時間と適合する低い表面電荷を呈する。４種のイオン化可能なカチオン性脂質、即ち１，２－ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－ケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）及び１，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）が着目されている。これらの脂質を含有するＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムは、インビボで肝細胞において著しく異なる遺伝子サイレンシング特性を呈し、効力は、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングモデルを用いて系列ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ＞ＤＬｉｎＫＤＭＡ＞ＤＬｉｎＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰに従い様々であることが示されている（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。ＬＮＰ又はＬＮＰ中の又はそれに関連するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡの１μｇ／ｍｌの投薬量が、特にＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡを含有する製剤について企図され得る。
ＬＮＰ及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ封入の調製は、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１）を使用し及び／又は適合させ得る。カチオン性脂質１，２－ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）、（３－ｏ－［２”－（メトキシポリエチレングリコール２０００）サクシノイル］－１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリコール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）及びＲ－３－［（ω－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオクスルプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）－３－アミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）がＴｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）によって供給又は合成され得る。コレステロールはＳｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る。特定の核酸ターゲティング複合体（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ＲＮＡは、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ及びＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡを含有するＬＮＰに封入し得る（４０：１０：４０：１０モル比のカチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ－ＤＭＧ又はＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）。必要な場合、０．２％ＳＰ－ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を取り入れて細胞取込み、細胞内送達及び体内分布を評価する。封入は、カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０モル比）で構成される脂質混合物をエタノール中に１０ｍｍｏｌ／ｌの最終脂質濃度となるように溶解することにより実施し得る。このエタノール脂質溶液を５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０に滴下して加えると、多層小胞が形成され、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌの最終濃度が生じ得る。エクストルーダ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して２つの積み重ねた８０ｎｍ Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルタで多層小胞を押し出した後、大きい単層小胞が形成され得る。封入は、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌを含有する５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０中に２ｍｇ／ｍｌのＲＮＡを、押し出されて予め形成された大きい単層小胞に滴下して加え、０．０６／１ｗｔ／ｗｔの最終ＲＮＡ／脂質重量比となるように常に混合しながら３１℃で３０分間インキュベートすることにより達成し得る。Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２再生セルロース透析膜を使用したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４での１６時間の透析によってエタノールの除去及び製剤化緩衝液の中和を実施した。粒径分布はＮＩＣＯＭＰ ３７０粒径測定機、小胞／強度モード及びガウスフィッティング（Ｎｉｃｏｍｐ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用した動的光散乱によって決定し得る。３つ全てのＬＮＰ系の粒径が直径約７０ｎｍであり得る。ＲＮＡ封入効率は、透析前及び透析後に収集した試料からＶｉｖａＰｕｒｅＤ ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して遊離ＲＮＡを除去することにより決定し得る。溶出した粒子から封入されたＲＮＡを抽出し、２６０ｎｍで定量化し得る。Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）からのコレステロールＥ酵素アッセイを用いて小胞中のコレステロール含有量を計測することにより、ＲＮＡ対脂質比を決定した。本明細書におけるＬＮＰ及びＰＥＧ脂質の考察と併せて、ＰＥＧ化リポソーム又はＬＮＰも同様に核酸ターゲティング系又はその構成成分の送達に好適である。大きいＬＮＰの調製は、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用し及び／又は応用し得る。エタノール中にＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ及びコレステロールを５０：１０：３８．５モル比で含有する脂質プレミックス溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌ総脂質濃度）を調製し得る。酢酸ナトリウムを０．７５：１（酢酸ナトリウム：ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）のモル比でこの脂質プレミックスに加え得る。続いて混合物を１．８５容積のクエン酸塩緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．０）と激しく撹拌しながら合わせることにより脂質を水和させると、３５％エタノールを含有する水性緩衝液中でリポソームの自然形成が起こり得る。このリポソーム溶液を３７℃でインキュベートして、粒径を時間依存的に増加させ得る。インキュベーション中様々な時点でアリコートを取り出して、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によってリポソームサイズの変化を調べ得る。所望の粒径に達したところで、総脂質の３．５％の最終ＰＥＧモル濃度が得られるようにリポソーム混合物にＰＥＧ脂質水溶液（ストック＝３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール中１０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ－ＤＭＧ）を加え得る。ＰＥＧ－脂質を加えると、リポソームはそのサイズで、更なる成長が事実上クエンチされるはずである。次に、空のリポソームに約１：１０（ｗｔ：ｗｔ）のＲＮＡ対総脂質でＲＮＡを加え、続いて３７℃で３０分間インキュベートすると、負荷されたＬＮＰが形成され得る。続いてこの混合物をＰＢＳで一晩透析し、０．４５μｍシリンジフィルタでろ過し得る。
球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物及び他の粒子（特に金粒子）も、核酸ターゲティング系を意図した標的に送達する手段として企図される。多量のデータが、核酸機能化金粒子をベースとするＡｕｒａＳｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物が有用であることを示している。
本明細書の教示と併せて用い得る文献としては、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１ １３３：９２５４－９２５７、Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１ ７：３１５８－３１６２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１１ ５：６９６２－６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１３７６－１３９１、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１２ １２：３８６７－７１、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２ １０９：１１９７５－８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ ７：６３５－６３８ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１６４８８－１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ４９５：Ｓ１４－Ｓ１６、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３ １１０（１９）：７６２５－７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６－１９２が挙げられる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端に結合したＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドによってポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をＰＥＧ化して、ＲＮＡを含む自己集合性粒子を構築し得る。この系は、例えば、インテグリンを発現する腫瘍新生血管系を標的化し、且つ血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦ Ｒ２）の発現を阻害して、それにより腫瘍血管新生を達成するｓｉＲＮＡを送達する手段として用いられている（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１９を参照されたい）。ナノプレックスは、等容積のカチオン性ポリマーと核酸との水溶液を混合して２～６の範囲にわたって正味モル過剰のイオン化可能窒素（ポリマー）対リン酸（核酸）を得ることにより調製し得る。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用によって平均粒径分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従ってここではナノプレックスと称された。Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．の自己集合性粒子での送達には、約１００～２００ｍｇの投薬量の核酸ターゲティング複合体ＲＮＡが想定される。
Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３９）のナノプレックスも本発明に適用され得る。Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．のナノプレックスは、等容積のカチオン性ポリマーと核酸との水溶液を混合して２～６の範囲にわたって正味モル過剰のイオン化可能な窒素（ポリマー）対リン酸（核酸）を得ることにより調製される。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用によって平均粒径分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従ってここではナノプレックスと称された。Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．のＤＯＴＡ－ｓｉＲＮＡは、以下のとおり合成された：１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸モノ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＯＴＡ－ＮＨＳエステル）をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）から注文した。カーボネート緩衝液（ｐＨ９）中１００倍モル過剰のＤＯＴＡ－ＮＨＳ－エステルを有するアミン改変ＲＮＡセンス鎖を微量遠心管に加えた。室温で４時間撹拌することにより内容物を反応させた。ＤＯＴＡ－ＲＮＡセンスコンジュゲートをエタノール沈殿させて、水中に再懸濁し、且つ非改変アンチセンス鎖とアニーリングさせることにより、ＤＯＴＡ－ｓｉＲＮＡを得た。液体は、全てＣｈｅｌｅｘ－１００（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で前処理して微量金属の汚染が除去された。シクロデキストリン含有ポリカチオンを使用することにより、Ｔｆ標的及び非標的ｓｉＲＮＡ粒子を形成し得る。典型的には、３（±）の電荷比及び０．５ｇ／リットルのｓｉＲＮＡ濃度で水中に粒子が形成された。標的粒子の表面上にある１パーセントのアダマンタン－ＰＥＧ分子をＴｆ（アダマンタン－ＰＥＧ－Ｔｆ）で改変した。注射用に５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース担体溶液中に粒子を懸濁した。
Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４６４，１５ Ａｐｒｉｌ ２０１０）は、標的粒子送達系を使用するＲＮＡ臨床試験を行う（臨床試験登録番号ＮＣＴ００６８９０６５）。標準ケア療法に抵抗性の固形癌患者に対し２１日間サイクルの１、３、８及び１０日目に用量の標的粒子を３０分間静脈内注入によって投与する。粒子は、（１）線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、（２）癌細胞の表面上のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に会合するようにナノ粒子の外側に提示されたヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンド、（３）親水性ポリマー（生体液中でのナノ粒子の安定性を促進するために用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、及び（４）ＲＲＭ２の発現を低下させるように設計されたｓｉＲＮＡ（臨床で使用された配列は、以前はｓｉＲ２Ｂ＋５と称された）を含有する合成送達系を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。ＴＦＲは悪性細胞で上方制御されることが長く知られており、及びＲＲＭ２は確立された抗癌標的である。これらの粒子（臨床版はＣＡＬＡＡ－０１と称される）は、非ヒト霊長類における複数回投与試験で良好に忍容されることが示されている。１人の慢性骨髄性白血病患者にｓｉＲＮＡがリポソーム送達によって投与されているが、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．の臨床試験は、ｓｉＲＮＡを標的送達系で全身送達して固形癌患者を治療する初期ヒト試験である。標的送達系がヒト腫瘍への機能性ｓｉＲＮＡの有効な送達を提供し得るかどうかを確かめるため、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．は、３つの異なる投与コホートからの３人の患者の生検を調べた。患者Ａ、Ｂ及びＣ、全員が転移性黒色腫を有し、それぞれ１８、２４及び３０ｍｇ・ｍ－２ ｓｉＲＮＡのＣＡＬＡＡ－０１の投与を受けた。同程度の用量が本発明の核酸ターゲティング系にも企図され得る。本発明の送達は、線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、癌細胞の表面上のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に会合するように粒子の外側に提示されたヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンド及び／又は親水性ポリマー（例えば、生体液中での粒子の安定性を促進するために用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含有する粒子で達成され得る。
本発明に関して、ＲＮＡターゲティング複合体の１つ以上の構成成分、例えばその核酸ターゲティングエフェクター（Ｃａｓ１３ｂ）タンパク質若しくはｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡ若しくはｃｒＲＮＡを粒子又は脂質エンベロープを用いて送達することが好ましい。他の送達系又はベクターを本発明の粒子の態様と併せて用い得る。本発明に包含される粒子は、例えば、固体粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー）、粒子の懸濁液又はこれらの組み合わせとして、種々の形態で提供され得る。金属、誘電体及び半導体粒子並びにハイブリッド構造（例えば、コアシェル粒子）を調製し得る。半導体材料でできている粒子は、電子エネルギーレベルの量子化が起こるのに十分に小さい（典型的には１０ｎｍ未満）場合、標識量子ドットでもあり得る。かかるナノスケール粒子は、生物医学的適用において薬物担体又は造影剤として用いられ、本発明における同様の目的に応用し得る。
半固体及び軟質粒子が製造されており、本発明の範囲内にある。半固体の性質のプロトタイプ粒子がリポソームである。各種のリポソーム粒子が現在、抗癌薬及びワクチンの送達系として臨床で用いられている。一方の親水性の半体と他方の疎水性の半体とを有する粒子はヤヌス粒子と呼ばれ、特にエマルションを安定化させるのに有効である。ヤヌス粒子は水／油界面で自己集合して、固体界面活性剤としての役割を果たし得る。
米国特許第８，７０９，８４３号明細書（参照により本明細書に援用される）は、治療剤含有粒子を組織、細胞及び細胞内区画に標的化して送達するための薬物送達システムを提供する。本発明は、界面活性剤、親水性ポリマー又は脂質にコンジュゲートしたポリマーを含む標的粒子を提供する。米国特許第６，００７，８４５号明細書（参照により本明細書に援用される）は、多官能化合物を１つ以上の疎水性ポリマー及び１つ以上の親水性ポリマーと共有結合的に連結することにより形成されたマルチブロック共重合体のコアを有し、且つ生物学的に活性な材料を含有する粒子を提供する。米国特許第５，８５５，９１３号明細書（参照により本明細書に援用される）は、肺系統への薬物送達のためその表面上に界面活性剤を取り込んだ、タップ密度が０．４ｇ／ｃｍ３未満で平均直径が５μｍ～３０μｍの空気力学的に軽い粒子を有する粒子状組成物を提供する。米国特許第５，９８５，３０９号明細書（参照により本明細書に援用される）は、界面活性剤及び／又は正電荷又は負電荷治療薬又は診断薬と肺系統への送達用の逆の電荷の荷電分子との親水性又は疎水性複合体を取り込んだ粒子を提供する。米国特許第５，５４３，１５８号明細書（参照により本明細書に援用される）は、生物学的に活性な材料を含有する生分解性固体コア及び表面上のポリ（アルキレングリコール）部分を有する生分解性注射用粒子を提供する。国際公開第２０１２１３５０２５号パンフレット（米国特許出願公開第２０１２０２５１５６０号明細書としても公開されている）（参照により本明細書に援用される）は、コンジュゲート型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー及びコンジュゲート型アザ大環状分子（まとめて「コンジュゲート型リポマー」又は「リポマー」と称される）について記載している。特定の実施形態において、本明細書に記載のかかる方法及び材料、例えばコンジュゲート型リポマーを、インビトロ、エキソビボ及びインビボゲノム摂動を達成してタンパク質発現の改変を含めた遺伝子発現の改変を行うため核酸ターゲティング系のコンテクストで使用し得ることを想定し得る。
エキソソーム
エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送する内因性のナノ小胞であり、これはＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達することができる。免疫原性を低下させるため、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：３４１）はエキソソーム産生に自己由来の樹状細胞を使用した。ニューロン特異的ＲＶＧペプチドに融合したエキソソーム膜タンパク質Ｌａｍｐ２ｂを発現するように樹状細胞をエンジニアリングすることにより、脳への標的化が達成された。精製エキソソームに電気穿孔によって外因性ＲＮＡが負荷された。静脈内注射されるＲＶＧ標的化エキソソームが、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを脳内のニューロン、ミクログリア、オリゴデンドロサイトに特異的に送達し、特異的遺伝子ノックダウンが得られた。ＲＶＧエキソソームに予め曝露してもノックダウンは減弱しなかったと共に、他の組織における非特異的取込みは観察されなかった。アルツハイマー病の治療標的であるＢＡＣＥ１の強力なｍＲＮＡ（６０％）及びタンパク質（６２％）ノックダウンにより、エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達の治療可能性が実証された。
免疫学的に不活性なエキソソームのプールを得るため、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、同種主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプの近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を採取した。未熟樹状細胞は、ＭＨＣ－ＩＩ及びＣＤ８６など、Ｔ細胞アクチベーターを欠くエキソソームを多量に産生するため、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、顆粒球／マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を有する樹状細胞を７日間選択した。翌日、十分に確立された超遠心法プロトコルを用いて培養上清からエキソソームを精製した。産生されたエキソソームは物理的に均一であり、粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）及び電子顕微鏡法によって決定したとき、分布サイズのピークが直径８０ｎｍであった。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、１０６細胞当たり（タンパク質濃度に基づいて計測して）６～１２μｇのエキソソームを得た。次に、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ナノスケール適用に適合させた電気穿孔プロトコルを用いて改変エキソソームに外因性カーゴを負荷する可能性を調べた。ナノメートルスケールでの膜粒子に対する電気穿孔は十分に特徴付けられていないため、非特異的Ｃｙ５標識ＲＮＡを使用して電気穿孔プロトコルを経験的に最適化した。超遠心法及びエキソソームの溶解後に、封入されるＲＮＡの量をアッセイした。４００Ｖ及び１２５μＦでの電気穿孔が最大のＲＮＡ保持をもたらし、以降の全ての実験でこれを使用した。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、１５０μｇのＲＶＧエキソソームに封入された１５０μｇの各ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、４つの対照とノックダウン効率を比較した：未治療マウス、ＲＶＧエキソソームのみを注入したマウス、インビボカチオン性リポソーム試薬と複合体化したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを注入したマウス及びＲＶＧ－９Ｒ（ｓｉＲＮＡに静電的に結合する９つのＤ－アルギニンとコンジュゲートしたＲＶＧペプチド）と複合体化したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを注入したマウス。投与３日後に皮質組織試料を分析し、ｓｉＲＮＡ－ＲＶＧ－９Ｒ治療マウス及びｓｉＲＮＡＲＶＧエキソソーム治療マウスの両方で有意なタンパク質ノックダウン（４５％、Ｐ＜０．０５、対６２％、Ｐ＜０．０１）が観察され、ＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡレベルの有意な低下がもたらされた（それぞれ６６％±１５％、Ｐ＜０．００１及び６１％±１３％、Ｐ＜０．０１）。更に、本出願人らは、ＲＶＧ－エキソソーム治療動物においてアルツハイマー病におけるアミロイド斑の主要な構成成分である総β－アミロイド１－４２レベルの有意な低下（５５％、Ｐ＜０．０５）を実証した。観察された低下は、正常マウスでＢＡＣＥ１阻害薬の脳室内注射後に実証されたβ－アミロイド１－４０の低下よりも大きかった。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．はＢＡＣＥ１切断産物でｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）を実施し、これは、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ媒介性ノックダウンのエビデンスを提供した。最後に、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ＩＬ－６、ＩＰ－１０、ＴＮＦα及びＩＦＮ－α血清濃度を評価することにより、ＲＮＡ－ＲＶＧエキソソームがインビボで免疫応答を誘導したかどうかを調べた。エキソソーム治療後、ｓｉＲＮＡ－ＲＶＧ－９Ｒと対照的にｓｉＲＮＡ－トランスフェクション試薬治療と同様に全てのサイトカインにおける有意でない変化を記録し、これはＩＬ－６分泌を強力に刺激したことから、エキソソーム治療の免疫学的に不活性なプロファイルが確認された。エキソソームがｓｉＲＮＡの２０％のみを封入することを所与とすれば、対応するレベルの免疫刺激なしに５分の１のｓｉＲＮＡで同等のｍＲＮＡノックダウン及びより大きいタンパク質ノックダウンが達成されたため、ＲＶＧ－エキソソームによる送達はＲＶＧ－９Ｒ送達よりも効率的であるように見える。この実験は、ＲＶＧ－エキソソーム技術の治療可能性を実証したものであり、これは潜在的に神経変性疾患に関連する遺伝子の長期サイレンシングに適している。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．のエキソソーム送達系は、治療標的、特に神経変性疾患への本発明の核酸ターゲティング系の送達に適用し得る。約１００～１０００ｍｇのＲＶＧエキソソームに封入された約１００～１０００ｍｇの核酸ターゲティング系の投薬量が本発明に企図され得る。
Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，２１１２－２１２６（２０１２））は、インビトロ及びインビボでのＲＮＡの送達に利用される、培養細胞に由来するエキソソームを提供している。このプロトコルは、初めに、ペプチドリガンドと融合したエキソソームタンパク質を含む、発現ベクターのトランスフェクションによる標的エキソソームの作成を記載している。次に、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、トランスフェクト細胞上清からエキソソームをどのように精製し及び特徴付けるかを説明する。次に、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、ＲＮＡをエキソソームに負荷するために重要なステップを詳説する。最後に、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、どのようにエキソソームを使用してインビトロで及びマウス脳においてインビボでＲＮＡを効率的に送達するかを概説する。エキソソーム媒介性ＲＮＡ送達の見込まれた結果の例が機能アッセイによって評価され、イメージングも提供される。プロトコル全体は約３週間かかる。本発明に係る送達又は投与は、自己由来樹状細胞から産生されたエキソソームを使用して実施され得る。本明細書における教示から、これを本発明の実施において用いることができる。
別の実施形態において、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ ｅ１３０）の血漿エキソソームが企図される。エキソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、上皮細胞及び腫瘍細胞を含めた多くの細胞型によって産生されるナノサイズの小胞（３０～９０ｎｍサイズ）である。これらの小胞は後期エンドソームの内向きの出芽によって形成され、次に細胞膜との融合時に細胞外環境へと放出される。エキソソームは天然で細胞間にＲＮＡを有するため、この特性は遺伝子療法に有用であり得ると共に、本開示から、本発明の実施に用いることができる。血漿からのエキソソームは、バフィーコートを９００ｇで２０分間遠心して血漿を単離し、続いて細胞上清を回収し、３００ｇで１０分間遠心して細胞を除去し、１６ ５００ｇで３０分間遠心し、続いて０．２２ｍｍフィルタでろ過することにより調製することができる。１２０ ０００ｇで７０分間の超遠心によってエキソソームをペレット化する。エキソソームへのｓｉＲＮＡの化学的トランスフェクションをＲＮＡｉヒト／マウススターターキット（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造者の指示に従い実施する。ｓｉＲＮＡを１００ｍｌ ＰＢＳに２ｍｍｏｌ／ｍｌの最終濃度で加える。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬を加えた後、混合物を室温で１０分間インキュベートする。過剰なミセルを除去するため、アルデヒド／硫酸塩ラテックスビーズを使用してエキソソームを再単離する。エキソソームへの核酸ターゲティング系の化学的トランスフェクションをｓｉＲＮＡと同様に行い得る。エキソソームを健常ドナーの末梢血から単離した単球及びリンパ球と共培養し得る。従って、核酸ターゲティング系を含有するエキソソームをヒトの単球及びリンパ球に導入し、且つヒトに自己再導入し得ることが企図され得る。従って、本発明に係る送達又は投与を、血漿エキソソームを用いて実施し得る。
リポソーム
本発明に係る送達又は投与は、リポソームで実施することができる。リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単層又は多重膜脂質二重層及び比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層からなる球形の小胞構造である。リポソームは、生体適合性であり、非毒性であり、親水性及び親油性の両方の薬物分子を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、且つ生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を越えてそのロードを輸送するため、薬物送達担体として大いに注目を集めてきた（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。リポソームは、幾つかの異なるタイプの脂質から作製することができる。しかしながら、薬物担体としてのリポソームの作成には、リン脂質が最も一般的に用いられている。脂質薄膜が水溶液と混合されたときにリポソーム形成は自然に起こるが、また、ホモジナイザー、ソニケーター又は押出し装置を使用して振盪の形態の力を加えることによっても促進し得る（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。
その構造及び特性を改変するため、リポソームに幾つかの他の添加剤を加え得る。例えば、リポソーム構造の安定化を促進するため及びリポソームの内部カーゴの漏出を防ぐため、リポソーム混合物にコレステロール又はスフィンゴミエリンのいずれかを加え得る。更に、リポソームは、水素化卵ホスファチジルコリン又は卵ホスファチジルコリン、コレステロール及びジセチルリン酸から調製され、その平均小胞サイズは約５０及び１００ｎｍに調整された（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。リポソーム製剤は、主に、１，２－ジステアロイル（ｄｉｓｔｅａｒｏｒｙｌ）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン及びモノシアロガングリオシドなどの天然リン脂質及び脂質で構成され得る。この製剤はリン脂質のみでできているため、リポソーム製剤は多くの難題に直面しており、その１つが血漿中での不安定性である。これらの難題を解消しようとする幾つかの試みが、特に脂質膜の操作においてなされている。これらの試みの１つは、コレステロールの操作に着目するものであった。従来の製剤にコレステロールを加えると、封入された生物学的活性化合物が血漿又は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）中に急速に放出されることが抑えられ、安定性が増す（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。特に有利な実施形態において、トロイの木馬リポソーム（分子トロイの木馬としても知られる）が望ましく、ｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇにおいてプロトコルを参照し得る。これらの粒子は、トランス遺伝子を血管内注射後に脳全体に送達することが可能である。制約により拘束されるものではないが、特異抗体が表面にコンジュゲートした中性脂質粒子はエンドサイトーシスによって血液脳関門を通過することが可能であると考えられる。本出願人は、トロイの木馬リポソームを利用してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ複合体を血管内注射によって脳に送達することを仮定し、これにより、胚を操作する必要なしに全脳トランスジェニック動物が実現し得る。リポソームでの生体内投与には、約１～５ｇのＤＮＡ又はＲＮＡが企図され得る。
別の実施形態において、核酸ターゲティング系又はその構成成分は安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）などのリポソームで投与され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ ２００５を参照されたい）。ＳＮＡＬＰで標的化される特定の核酸ターゲティング系の毎日の約１、３又は５ｍｇ／ｋｇ／日の静脈内注射が企図される。毎日の治療は約３日間にわたり、次に毎週、約５週間にわたり得る。別の実施形態において、特定の核酸ターゲティング系が封入されたＳＮＡＬＰの約１又は２．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注射による投与も企図される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ製剤は、脂質３－Ｎ－［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシ－プロピルアミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びコレステロールを２：４０：１０：４８モルパーセント比で含有し得る（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。別の実施形態において、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、高度に血管新生したＨｅｐＧ２由来肝腫瘍への分子の送達に有効であるが、血管新生が不十分なＨＣＴ－１１６由来肝腫瘍では有効でないことが分かっている（例えば、Ｌｉ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１９，７７５－７８０を参照されたい）。ＳＮＡＬＰリポソームは、Ｄ－Ｌｉｎ－ＤＭＡ及びＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及びｓｉＲＮＡと共に２５：１脂質／ｓｉＲＮＡ比及び４８／４０／１０／２モル比のコレステロール／Ｄ－Ｌｉｎ－ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡを用いて製剤化することにより調製し得る。得られたＳＮＡＬＰリポソームは約８０～１００ｎｍサイズである。更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）、３－Ｎ－［（ｗ－メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミレスチルオキシプロピルアミン（ｄｉｍｙｒｅｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）及びカチオン性１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎジメチルアミノアミノプロパンを含み得る（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７５：１８９６－９０５を参照されたい）。例えば、ボーラス静脈内注入として投与される１用量当たり合計約２ｍｇ／ｋｇの核酸ターゲティング系の投薬量が企図され得る。更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ及び１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ；Ｎ－ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る（例えば、Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１－６７３（２００９）を参照されたい）。インビボ研究に用いられる製剤は、約９：１の最終脂質／ＲＮＡ質量比を含み得る。
ＲＮＡｉナノメディシンの安全性プロファイルが、Ａｌｎｙｌａｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢａｒｒｏｓ ａｎｄ Ｇｏｌｌｏｂによってレビューされている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６４（２０１２）１７３０－１７３７を参照されたい）。安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、４つの異なる脂質 － 低ｐＨでカチオン性のイオン化可能な脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、中性ヘルパー脂質、コレステロール及び拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質で構成される。この粒子は直径約８０ｎｍであり、生理的ｐＨで電荷的に中性である。製剤化時、イオン化可能な脂質が粒子形成の間に脂質をアニオン性ＲＮＡと凝縮させる役割を果たす。漸進的に酸性になるエンドソーム条件下で正電荷のとき、イオン化可能な脂質は、ＳＮＡＬＰとエンドソーム膜との融合も媒介し、細胞質中へのＲＮＡの放出を可能にする。ＰＥＧ－脂質は粒子を安定化させ、製剤化時の凝集を低減し、続いて薬物動態特性を改善する中性の親水性外部を提供する。現在までに、ＲＮＡを有するＳＮＡＬＰ製剤を使用して２つの臨床プログラムが開始されている。Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、最近、高ＬＤＬコレステロールの成人ボランティアにおけるＳＮＡＬＰ－ＡｐｏＢの第Ｉ相単回投与試験を完了した。ＡｐｏＢは、主に肝臓及び空腸に発現し、ＶＬＤＬ及びＬＤＬのアセンブリ及び分泌に必須である。１７人の対象に単一用量のＳＮＡＬＰ－ＡｐｏＢが投与された（７用量レベルにわたる用量漸増）。肝毒性（前臨床試験に基づいて潜在的用量制限毒性として予想された）のエビデンスはなかった。（２人中）１人の対象が最も高い用量で免疫系刺激と一致してインフルエンザ様症状を起こし、試験終了が決定された。Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓも同様にＡＬＮ－ＴＴＲ０１を進めており、これは上記に記載されるＳＮＡＬＰ技術を用い、ＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）の治療のため突然変異体及び野生型の両方のＴＴＲの肝細胞産生を標的化する。３つのＡＴＴＲ症候群が記載されている：家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）－ 両方ともＴＴＲの常染色体優性突然変異によって引き起こされ、及び野生型ＴＴＲによって引き起こされる老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）。ＡＬＮ－ＴＴＲ０１のプラセボ対照単回用量漸増第Ｉ相試験が最近、ＡＴＴＲ患者で完了した。ＡＬＮ－ＴＴＲ０１が１５分間の静脈内注入として３１人の患者に（２３人は試験薬物及び８人はプラセボ）０．０１～１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲内で（ｓｉＲＮＡに基づく）投与された。治療は良好に忍容され、肝機能検査値の重大な増加はなかった。≧０．４ｍｇ／ｋｇで２３人中３人の患者に注入関連反応が認められた。全員が注入速度の減速に応答し、全員が試験を続行した。２人の患者に１ｍｇ／ｋｇの最も高い用量で血清サイトカインＩＬ－６、ＩＰ－１０及びＩＬ－１ｒａの最小限且つ一過性の上昇が認められた（前臨床及びＮＨＰ試験から予想されたとおり）。ＡＬＮ－ＴＴＲ０１の期待された薬力学的効果である血清ＴＴＲの低下が１ｍｇ／ｋｇで観察された。
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、例えば、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ－脂質をエタノール中に例えばそれぞれ４０：１０：４０：１０のモル比で可溶化させることにより作製し得る（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８ Ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０，ｐｐ．１７２－１７７を参照されたい）。水性緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４）にそれぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び６．１ｍｇ／ｍｌの最終エタノール及び脂質濃度となるように混合しながら脂質混合物を加え、２２℃で２分間平衡化させた後、押し出した。水和した脂質を、２つの積み重ねた８０ｎｍ細孔径フィルタ（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）で２２℃においてＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、動的光散乱分析によって決定したとき、７０～９０ｎｍの小胞直径が観察されるまで押し出した。これには、概して１～３回のパスが必要であった。ｓｉＲＮＡ（３０％エタノールを含有する５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４水溶液中に可溶化した）を、予め平衡化した（３５℃）小胞に約５ｍｌ／分の速度で混合しながら加えた。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終目標ｓｉＲＮＡ／脂質比に達した後、混合物を３５℃で更に３０分間インキュベートして小胞再構築及びｓｉＲＮＡの封入を可能にした。次に、エタノールを除去し、外部緩衝液を透析又はタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションのいずれかによってＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）と交換した。制御された段階的希釈方法プロセスを用いてｓｉＲＮＡをＳＮＡＬＰに封入した。ＫＣ２－ＳＮＡＬＰの脂質構成要素は、５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で用いられたＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（カチオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ）及びＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡであった。負荷粒子が形成されたところで、ＳＮＡＬＰをＰＢＳで透析し、使用前に０．２μｍフィルタで滅菌ろ過した。平均粒径は７５～８５ｎｍであり、ｓｉＲＮＡの９０～９５％が脂質粒子内に封入された。インビボ試験に使用した製剤中の最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は約０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。使用直前に、第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含有するＬＮＰ－ｓｉＲＮＡ系を滅菌ＰＢＳ中に適切な濃度に希釈し、製剤を１０ｍｌ／ｋｇの合計容積で外側尾静脈から静脈内投与した。この方法及びこれらの送達系は、本発明の核酸ターゲティング系に当てはめることができる。
他の脂質
アミノ脂質２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）などの他のカチオン性脂質を利用して、例えばＳｉＲＮＡと同様に、核酸ターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子を封入し得（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９－８５３３を参照されたい）、従って本発明の実施に用い得る。以下の脂質組成を有する予め形成された小胞が企図され得る：アミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及び（Ｒ）－２，３－ビス（オクタデシルオキシ）プロピル－１－（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ－脂質）、それぞれモル比４０／１０／４０／１０及び約０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ／総脂質比。７０～９０ｎｍの範囲の狭い粒径分布及び０．１１±０．０４の低い多分散性指数（ｎ＝５６）が確実となるように、粒子を最大３回まで８０ｎｍ膜で押し出し、その後ガイドＲＮＡに加えた。極めて強力なアミノ脂質１６を含有する粒子を使用し得、ここで、４つの脂質構成成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ－脂質のモル比（５０／１０／３８．５／１．５）は、インビボ活性を増強させるため更に最適化され得る。
Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｄ Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（「マウスにおける化学的に改変されたｍＲＮＡの送達後の治療用タンパク質の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ）：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４－１５７（２０１１））は、脂質エンベロープを用いたＲＮＡの送達について記載している。脂質エンベロープの使用は本発明においても好ましい。
別の実施形態では、脂質を本発明のＲＮＡターゲティング系（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ複合体、即ちｃｒＲＮＡと複合体化されたＣａｓ１３ｂ）又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子と共に製剤化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成し得る。脂質としては、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ４、Ｃ１２－２００及びコリピド（ｃｏｌｉｐｉｄ）ジステロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）、コレステロールが挙げられ、且つＰＥＧ－ＤＭＧを、小胞自然形成手順を用いてｓｉＲＮＡの代わりにＲＮＡターゲティング系と共に製剤化し得る（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照されたい）。構成成分のモル比は約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ又はＣ１２－２００／ジステロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ）であり得る。最終的な脂質：ｓｉＲＮＡ重量比は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ及びＣ１２－２００脂質粒子（ＬＮＰ）の場合、それぞれ約１２：１及び９：１であり得る。製剤は、＞９０％の捕捉効率で約８０ｎｍの平均粒子直径を有し得る。３ｍｇ／ｋｇ用量が企図され得る。Ｔｅｋｍｉｒａは、米国及び米国外に、ＬＮＰ及びＬＮＰ製剤の様々な態様に関する約９５のパテントファミリーのポートフォリオを有し（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号明細書；同第７，７９９，５６５号明細書；同第８，０５８，０６９号明細書；同第８，２８３，３３３号明細書；同第７，９０１，７０８号明細書；同第７，７４５，６５１号明細書；同第７，８０３，３９７号明細書；同第８，１０１，７４１号明細書；同第８，１８８，２６３号明細書；同第７，９１５，３９９号明細書；同第８，２３６，９４３号明細書及び同第７，８３８，６５８号明細書及び欧州特許第１７６６０３５号明細書；同第１５１９７１４号明細書；同第１７８１５９３号明細書及び同第１６６４３１６号明細書を参照されたい）、これらは、全て本発明に使用及び／又は応用することができる。
ＲＮＡターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子は、タンパク質、タンパク質前駆体又は部分的又は完全にプロセシングされた形態のタンパク質又はタンパク質前駆体をコードし得る改変核酸分子を含む組成物の製剤の態様に関する米国特許出願公開第２０１３０２５２２８１号明細書及び同第２０１３０２４５１０７号明細書及び同第２０１３０２４４２７９号明細書（Ｍｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡された）に更に記載されるものなど、ＰＬＧＡミクロスフェアに封入して送達し得る。製剤は、モル比５０：１０：３８．５：１．５～３．０（カチオン性脂質：膜融合性脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）を有し得る。ＰＥＧ脂質は、限定はされないが、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧから選択され得る。膜融合性脂質はＤＳＰＣであり得る。また、Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、米国特許出願公開第２０１２０２５１６１８号明細書も参照されたい。
Ｎａｎｏｍｅｒｉｃｓの技術は、低分子量疎水性薬物、ペプチド及び核酸ベースの治療薬（プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含めた広範囲の治療薬に関するバイオアベイラビリティの難題に対処している。この技術が明らかな利点を実証している特定の投与経路には、経口経路、血液脳関門を越える輸送、固形腫瘍への送達並びに眼への送達が含まれる。例えば、Ｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１３ Ｆｅｂ ２６；７（２）：１０１６－２６；Ｕｃｈｅｇｂｕ ａｎｄ Ｓｉｅｗ，２０１３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０２（２）：３０５－１０及びＬａｌａｔｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２ Ｊｕｌ ２０；１６１（２）：５２３－３６を参照されたい。
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、ポリヌクレオチド分子、ペプチド及びポリペプチド及び／又は医薬品などの生理活性分子を哺乳類の体に送達するためのカチオン性デンドリマーについて記載している。デンドリマーは、生理活性分子の送達を例えば肝臓、脾臓、肺、腎臓又は心臓に（又は更に脳までも）標的化するのに好適である。デンドリマーは、単純な分岐単量体単位から段階的に調製される合成三次元巨大分子であり、その性質及び機能は容易に制御し、変化させることができる。デンドリマーは、構成要素を多機能コアに（ダイバージェント合成手法）又は多機能コアに向かって（コンバージェント合成手法）反復的に加えることによって合成され、構成要素の三次元シェルを加える毎に、より高世代のデンドリマーの形成につながる。ポリプロピレンイミンデンドリマーはジアミノブタンコアから開始され、それに第一級アミンへのアクリロニトリルの二重マイケル付加によって２倍の数のアミノ基が加えられ、続いてニトリルが水素化される。この結果、アミノ基の倍増がもたらされる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは１００％プロトン化可能な窒素及び最大６４個の末端アミノ基（第５世代、ＤＡＢ ６４）を含有する。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨでプロトンを受け取ることが可能なアミン基である。デンドリマーの遺伝子デリバリー剤としての使用は、大部分が、コンジュゲート単位としてそれぞれアミン／アミド又はＮ－－Ｐ（Ｏ２）Ｓの混合物を有するポリアミドアミン及び亜リン酸含有化合物の使用に着目したものであり、それより低い世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの遺伝子送達への使用に関して報告がない。ポリプロピレンイミンデンドリマーも、周囲アミノ酸性基によって化学的に改変されたとき、薬物送達及びゲスト分子のそれらの封入のためのｐＨ感受性制御放出系として研究されている。ＤＮＡを有するポリプロピレンイミンデンドリマーの細胞傷害性及び相互作用並びにＤＡＢ ６４のトランスフェクション有効性も研究されている。米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、先行の報告に反して、ポリプロピレンイミンデンドリマーなどのカチオン性デンドリマーが、特異的標的化及び低毒性など、遺伝物質など、生理活性分子の標的化した送達において用いるのに好適な特性を示すという観察に基づく。加えて、カチオン性デンドリマーの誘導体も、生理活性分子の標的化された送達に好適な特性を示す。また、「カチオン性ポリアミンポリマー及びデンドリマーポリマーを含めた様々なポリマーは抗増殖活性を有することが示され、従って、新生物及び腫瘍、炎症性障害（自己免疫障害を含む）、乾癬及びアテローム性動脈硬化症など、望ましくない細胞増殖によって特徴付けられる障害の治療に有用であり得る。ポリマーは単独で活性薬剤として用いられ得るか、又は遺伝子療法用の薬物分子又は核酸など、他の治療剤の送達ビヒクルとして用いられ得る。そのような場合、ポリマー自体の固有の抗腫瘍活性が、送達される薬剤の活性を補完し得る」ことを開示するＢｉｏａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，米国特許出願公開第２００８０２６７９０３号明細書も参照されたい。これらの特許公報の開示は、核酸ターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子の送達に関する本明細書における教示と併せて用いられ得る。
超荷電タンパク質
超荷電タンパク質は、異常に高い理論上の正味正電荷又は負電荷を有するエンジニアリングされた又は天然に存在するタンパク質の一クラスであり、核酸ターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子の送達に用いられ得る。超負電荷及び超正電荷の両方のタンパク質とも、熱的又は化学的に誘導される凝集に耐える著しい能力を呈する。超正電荷タンパク質は、哺乳類細胞に侵入することも可能である。プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ又は他のタンパク質など、これらのタンパク質と関連付けるカーゴが、インビトロ及びインビボの両方でこれらの巨大分子を哺乳類細胞に機能的に送達することを可能にし得る。Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕの研究室は、２００７年に超荷電タンパク質の作成及び特徴付けを報告した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２９，１０１１０－１０１１２）。
哺乳類細胞へのＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの非ウイルス性送達は、研究及び治療適用の両方に価値がある（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６，５６１－５６９）。精製＋３６ ＧＦＰタンパク質（又は他の超正電荷タンパク質）を適切な無血清培地中でＲＮＡと混合して複合体化させた後、細胞に加える。この段階で血清を含めると、超荷電タンパク質－ＲＮＡ複合体の形成が阻害され、治療の有効性が低下する。以下のプロトコルが種々の細胞株に有効であることが分かっている（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１－６１１６。しかしながら、具体的な細胞株に対して手順を最適化するには、タンパク質及びＲＮＡの用量を変化させるパイロット実験を行わなければならない）。
（１）処理前日、４８ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０５細胞をプレーティングする。
（２）処理当日、最終濃度２００ｎＭとなるように精製＋３６ ＧＦＰタンパク質を無血清培地中に希釈する。５０ｎＭの最終濃度となるようにＲＮＡを加える。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（３）インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（４）＋３６ ＧＦＰ及びＲＮＡのインキュベーション後、細胞にタンパク質－ＲＮＡ複合体を加える。
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、２０Ｕ／ｍＬヘパリンＰＢＳで３回洗浄する。細胞を血清含有培地と共に、活性に関するアッセイに応じて更に４８時間又はそれを超えてインキュベートする。
（７）免疫ブロット、ｑＰＣＲ、表現型アッセイ又は他の適切な方法によって細胞を分析する。
＋３６ ＧＦＰは、様々な細胞において有効なプラスミド送達試薬であることが分かった。また、例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１－６１１６（２００９）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，７４７－７５２（２０１０）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ １８，８３３－８３８（２０１１）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０３，２９３－３１９（２０１２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ １９（７），８３１－８４３（２０１２）も参照されたい。超荷電タンパク質の方法は、本発明のＲＮＡターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子の送達に使用及び／又は応用することができる。
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
更に別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が企図される。ＣＰＰは、（ナノサイズ粒子から化学的小分子及び大型ＤＮＡ断片に至るまでの）様々な分子カーゴの細胞取込みを促進する短鎖ペプチドである。用語「カーゴ」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、治療剤、診断プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、ナノ粒子を含めた粒子、リポソーム、発色団、小分子及び放射性物質からなる群を含む。本発明の態様では、カーゴには、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の任意の構成成分又は機能性ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系全体も含まれ得る。本発明の態様は、所望のカーゴを対象に送達する方法を更に提供し、この方法は、（ａ）本発明の細胞透過性ペプチドと所望のカーゴとを含む複合体を調製するステップ、及び（ｂ）複合体を対象に経口的に、関節内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、動脈内に（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌｌｙ）、鼻腔内に、実質内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、直腸内に又は局所的に投与するステップを含む。カーゴは、共有結合を介した化学的連結によるか又は非共有結合性の相互作用によるかのいずれかでペプチドと会合している。ＣＰＰの機能は、カーゴを細胞内に送達することであり、これは、一般的にはエンドサイトーシスを通じて起こるプロセスであって、カーゴは哺乳類生細胞のエンドソームに送達される。細胞透過性ペプチドのサイズ、アミノ酸配列及び電荷は様々であるが、全てのＣＰＰが、細胞膜を移行し且つ細胞質又は細胞小器官への様々な分子カーゴの送達を促進する能力である１つの個別的な特徴を有する。ＣＰＰの移行は３つの主な侵入機構に分類し得る：膜における直接の透過、エンドサイトーシスを介する侵入及び一過性構造の形成を通じた移行。ＣＰＰは、癌及びウイルス阻害薬並びに細胞標識用の造影剤を含め、種々の疾患の治療におけるドラッグデリバリー剤として医薬において多くの適用が見出されている。後者の例としては、ＧＦＰ、ＭＲＩ造影剤又は量子ドットの担体としての機能が挙げられる。ＣＰＰには、研究及び医薬に用いられるインビトロ及びインビボ送達ベクターとして大きい可能性がある。ＣＰＰのアミノ酸組成は、典型的には、リジン又はアルギニンなど正電荷アミノ酸の高い相対存在量を含むか、又は極性／荷電アミノ酸と非極性疎水性アミノ酸との交互のパターンを含む配列を有するかのいずれかである。これらの２つの構造タイプは、それぞれポリカチオン性又は両親媒性と称される。第３のＣＰＰクラスは、非極性残基のみを含む疎水性ペプチドであり、これは正味電荷が低いか又は細胞取込みに重要な疎水性アミノ酸基を有する。発見当初のＣＰＰの１つはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）由来のトランス活性化転写アクチベーター（Ｔａｔ）であり、これは多数の培養下細胞型によって周囲の培地から効率的に取り込まれることが見出された。それ以降、既知のＣＰＰの数は大幅に増え続け、より有効なタンパク質形質導入特性を有する小分子合成類似体が作成されている。ＣＰＰとしては、限定はされないが、ペネトラチン、Ｔａｔ（４８－６０）、トランスポータン及び（Ｒ－ＡｈＸ－Ｒ４）（Ａｈｘ＝アミノヘキサノイル）が挙げられる。
米国特許第８，３７２，９５１号明細書は、高い細胞透過性効率及び低毒性を呈する好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）から送達されるＣＰＰを提供する。ＣＰＰをそのカーゴで脊椎動物対象に送達する態様も提供されている。ＣＰＰ及びそれらの送達の更なる態様は、米国特許第８，５７５，３０５号明細書；８；同第６１４，１９４号明細書及び同第８，０４４，０１９号明細書に記載されている。ＣＰＰはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系又はその構成成分の送達に使用することができる。ＣＰＰを用いてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系又はその構成成分を送達できることは、論稿“Ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｂｙ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ”，Ｓｕｒｅｓｈ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ａｂｕ－Ｂｏｎｓｒａｈ Ｋｗａｋｕ Ｄａｄ，Ｊａｇａｄｉｓｈ Ｂｅｌｏｏｒ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ａｐｒ ２．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］（全体として参照により援用される）にも提供されており、ここで、ＣＰＰコンジュゲート組換えＣａｓ９タンパク質及びＣＰＰ複合体化ガイドＲＮＡによる処理がヒト細胞株における内因性遺伝子破壊につながることが実証されている。この論文では、Ｃａｓ９タンパク質はチオエーテル結合によってＣＰＰにコンジュゲートされた一方、ガイドＲＮＡはＣＰＰと複合体化され、縮合した正電荷粒子を形成した。胚性幹細胞、皮膚線維芽細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞及び胚性癌腫細胞を含めたヒト細胞を改変Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡで同時に及び逐次的に処理すると、プラスミドトランスフェクションと比べてオフターゲット突然変異が低下した効率的な遺伝子破壊につながったことが示された。本発明の実施では、ＣＰＰ送達を用いることができる。
植込み型デバイス
別の実施形態において、植込み型デバイスも、核酸ターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子の送達に企図される。例えば、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書は、薬物を局所的に長時間溶出する植込み型医療器具を、幾つかのタイプのかかるデバイス、治療の実装形態及び植え込み方法を含めて開示しており、それが提供される。デバイスは、例えば、デバイス本体として用いられるマトリックスなどのポリマー基質及び薬物並びに場合により金属又は更なるポリマーなどの追加的な足場材料及び可視性及びイメージングを増強する材料を含む。植込み型送達デバイスは局所的な長期間にわたる放出を提供するのに有利であり得、ここで、薬物は、腫瘍、炎症、変性などの罹患範囲の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に直接又は症候性の対象のため、又は損傷した平滑筋細胞に、又は予防のため放出される。薬物の一種は上記に開示されるとおりＲＮＡであり、このシステムは本発明の核酸ターゲティング系に使用及び／又は応用することができる。一部の実施形態において植え込み方法は、小線源照射療法及び針生検を含め、現在他の治療向けに開発及び使用されている既存の植え込み手技である。そのような場合、本発明に記載される新規インプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には、同じ治療手技中に数個のデバイスが植え込まれる。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書は、例えば、任意選択でマトリックスであり得る生体安定性及び／又は分解性及び／又は生体吸収性ポリマー基質を含む、腹腔などの体腔及び／又は薬物送達システムが繋留されたり又は付着したりしない任意の他のタイプの投与に適用可能なシステムを含め、薬物送達植込み型又は挿入型システムを提供する。用語「挿入」には植込みも含まれることに留意しなければならない。薬物送達システムは、好ましくは米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書に記載されるとおりの「Ｌｏｄｅｒ」として植え込まれる。
ポリマー又は複数のポリマーが生体適合性であり、薬剤及び／又は複数の薬剤を取り入れ、且つ制御された速度での薬剤の放出を可能にし、ここで、マトリックスなどのポリマー基質の総容積は、例えば、一部の実施形態では、任意選択で及び好ましくは、治療レベルの薬剤の放出を可能にする最大容積以下である。非限定的な例として、かかる容積は、薬剤負荷容積による必要に応じて好ましくは０．１ ｍ３～１０００ｍｍ３の範囲内である。Ｌｏｄｅｒは、任意選択で、例えば及び限定なしに膝関節、子宮内又は子宮頸部リングなど、そのサイズが機能によって決まるデバイスで例えば取り込まれるとき、より大きいことができる。
薬物送達システム（組成物を送達するための）は、一部の実施形態において、好ましくは分解性ポリマーを用いるように設計され、ここで、主な放出機構は、バルク侵食であるか、又は一部の実施形態において、非分解性の又は徐々に分解されるポリマーが使用され、ここで、主な放出機構は、バルク侵食よりむしろ拡散であり、従って外側部分が膜として機能し、及びその内側部分が、実質的に長期間にわたって（例えば、約１週間～約数ヵ月）周囲からの影響を受けない薬物リザーバとして機能する。異なる放出機構を有する異なるポリマーの組み合わせも任意選択で用いられ得る。表面の濃度勾配は、好ましくは相当な期間の全薬物放出期間にわたって事実上一定に維持され、従って拡散速度は事実上一定である（「ゼロモード」拡散と呼ばれる）。用語「一定」とは、好ましくは治療有効性の下限閾値より高く維持されるが、しかし、なおも任意選択で初期バーストを特徴とし得るか、及び／又は変動し得る、例えば一定限度増加及び減少し得る拡散速度が意味される。拡散速度は、好ましくは長期間そのように維持され、及び治療上有効な期間、例えば有効なサイレンシング期間を最適化するのに特定のレベルで一定であると見なすことができる。
薬物送達システムは、本質的に化学的であるか、それとも酵素及び対象の体内にある他の因子からの攻撃に起因するかに関わらず、任意選択で及び好ましくは分解からヌクレオチドベースの治療剤を遮蔽するように設計される。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の薬物送達システムは、例えば、任意選択で、限定はされないが、熱的加熱及び冷却、レーザービーム及び集束超音波を含めた超音波及び／又はＲＦ（高周波）による方法又はデバイスを含め、非侵襲性及び／又は最小侵襲性の起動及び／又は加速／速度方法によって任意選択でデバイスの植込み時及び／又は植込み後に動作させる検知及び／又は起動器具と関連付けられる。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の一部の実施形態によれば、局所送達部位には、任意選択で、腫瘍、自己免疫疾患状態を含めた活性化及び／又は慢性的炎症及び感染、筋肉及び神経組織を含めた変性組織、慢性痛、変性部位及び骨折箇所及び組織の再生強化のための他の創傷箇所及び傷害された心筋、平滑筋及び横紋筋を含め、細胞の高度な異常増殖及び抑制されたアポトーシスによって特徴付けられる標的部位が含まれ得る。
組成物の植込み部位又は標的部位は、好ましくは標的局所送達に十分に小さい半径、面積及び／又は容積を特徴とする。例えば、標的部位は、任意選択で、約０．１ｍｍ～約５ｃｍの範囲の直径を有する。
標的部位の位置は、好ましくは治療有効性を最大化するように選択される。例えば、薬物送達システム（任意選択で上記に記載したとおりの植込み用デバイスを伴う）の組成物は、任意選択で及び好ましくは、腫瘍環境又はそれに関連する血液供給の範囲内又はその近くに植え込まれる。
例えば、組成物（任意選択でデバイスを伴う）は、任意選択で、脈管系の範囲内などでニップルを用いて膵臓、前立腺、乳房、肝臓の範囲内又はその近くに植え込まれる。
標的の位置は、任意選択で、（任意選択で体内の任意の部位がＬｏｄｅｒの植込みに好適であり得るように、あくまでも非限定的な例として）：１．基底核、白質及び灰白質におけるパーキンソン病又はアルツハイマー病のような変性部位の脳；２．筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合のような脊椎；３．ＨＰＶ感染症予防のための子宮頸部；４．活性化及び慢性的炎症関節；５．乾癬の場合のような真皮；６．鎮痛効果のための交感神経及び感覚神経部位；７．骨内植え込み；８．急性及び慢性感染部位；９．腟内；１０．内耳－聴覚系、内耳の迷路、前庭系；１１．気管内；１２．心内；冠動脈、心外膜；１３．膀胱；１４．胆管系；１５．限定されないが、腎臓、肝臓、脾臓を含む実質組織；１６．リンパ節；１７．唾液腺；１８．歯肉；１９．関節内（関節の中）；２０．眼内；２１．脳組織；２２．脳室；２３．腹腔を含む腔（例えば、限定されないが、卵巣癌について）；２４．食道内及び２５．直腸内を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる群から選択される。
任意選択で、システム（例えば、組成物を含有するデバイス）の挿入は、標的部位及びその部位の近傍におけるＥＣＭへの材料の注射により、標的部位及びかかる部位の近傍の局所ｐＨ及び／又は温度及び／又はＥＣＭにおける薬物の拡散及び／又は薬物動態に影響を及ぼす他の生物学的因子に影響を及ぼすことを伴う。
任意選択で、一部の実施形態によれば、前記薬剤の放出は、挿入前及び／又は挿入時及び／又は挿入後に、非侵襲性及び／又は最小侵襲性及び／又は他の起動及び／又は加速／減速方法、例えばレーザービーム、放射線照射、熱的加熱及び冷却及び集束超音波を含めた超音波及び／又はＲＦ（高周波）方法又はデバイス及び化学的アクチベーターによって動作させるアプライアンスを検知及び／又は起動することを伴い得る。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の他の実施形態によれば、薬物は、好ましくは、例えば以下に記載するとおり乳房、膵臓、脳、腎臓、膀胱、肺及び前立腺における限局性の癌の場合、ＲＮＡを含む。ＲＮＡｉで例示されるが、多くの薬物がＬｏｄｅｒへの封入に適用可能であり、かかる薬物を、例えばマトリックスなど、Ｌｏｄｅｒ基質で封入することができる限り、本発明に関連して使用することができ、このシステムは本発明の核酸ターゲティング系の送達に使用及び／又は応用することができる。
特定の適用の別の例として、異常な遺伝子発現に起因して神経及び筋肉変性疾患が発生する。ＲＮＡの局所送達は、かかる異常な遺伝子発現に干渉する治療特性を有し得る。小薬物及び巨大分子を含めた抗アポトーシス、抗炎症性及び抗変性薬物の局所送達も場合により治療効果があり得る。そのような場合、Ｌｏｄｅｒは、一定の速度での及び／又は別途植え込まれる専用のデバイスを介した長期放出に適用される。これは、全て本発明の核酸ターゲティング系に使用及び／又は応用することができる。
特定の適用の更に別の例として、精神障害及び認知障害が遺伝子修飾薬で治療される。遺伝子ノックダウンは治療の選択肢である。薬剤を中枢神経系部位に局所的に送達するＬｏｄｅｒは、限定はされないが、精神病、双極性疾患、神経症性障害及び行動疾患を含めた精神障害及び認知障害に対する治療選択肢である。Ｌｏｄｅｒは、特定の脳部位における植込み時に小薬物及び巨大分子を含めた薬物を局所的に送達することもできる。これは、全て本発明の核酸ターゲティング系に使用及び／又は応用することができる。
特定の適用の別の例として、局所部位における自然及び／又は適応免疫メディエーターのサイレンシングにより、移植臓器拒絶反応の予防が可能となる。移植臓器及び／又は移植部位に植え込まれたＬｏｄｅｒによるＲＮＡ及び免疫調節試薬の局所送達が、移植臓器に対して活性化したＣＤ８などの免疫細胞を撃退することにより局所免疫抑制を与える。これは、全て本発明の核酸ターゲティング系に使用及び／又は応用することができる。
特定の適用の別の例として、ＶＥＧＦ及びアンジオゲニンなどを含む血管成長因子は、血管新生に不可欠である。因子、ペプチド、ペプチド模倣体の局所送達又はそれらのリプレッサーの抑制は、重要な治療モダリティである。Ｌｏｄｅｒによるリプレッサーのサイレンシング並びに血管新生を刺激する因子、ペプチド、巨大分子及び小薬物の局所送達は、末梢、全身及び心血管疾患に治療効果がある。
植込みなどの挿入方法は、任意選択で、かかる方法において任意選択で改変なしに又は代わりに任意選択で重要でない改変のみを伴い、他のタイプの組織移植及び／又は挿入及び／又は組織試料採取に既に用いられているものであり得る。かかる方法としては、任意選択で、限定はされないが、小線源照射療法、生検、ＥＲＣＰなど、超音波を伴う及び／又は伴わない内視鏡検査、脳組織への定位的方法、関節、腹部器官、膀胱壁及び体腔への腹腔鏡の植え込みを含む腹腔鏡検査が挙げられる。
本明細書において考察される植込み型デバイス技術は、本明細書における教示と共に用いることができ、従って本開示及び当該技術分野における知識により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系又はその構成成分又は構成成分をコードするか又はそれを提供するその核酸分子を植込み型デバイスによって送達し得る。
患者特異的スクリーニング方法
ＲＮＡ、例えばトリヌクレオチドリピートを標的とする核酸ターゲティング系を使用して、かかるリピートの存在に関して患者又は患者の試料をスクリーニングすることができる。このリピートは核酸ターゲティング系のＲＮＡの標的であることができ、その核酸ターゲティング系によるこのリピートへの結合がある場合、その結合を検出して、それによりかかるリピートの存在を示すことができる。従って、核酸ターゲティング系を使用して、リピートの存在に関して患者又は患者試料をスクリーニングすることができる。次に、患者に好適な化合物を投与して状態に対応し得るか、又は核酸ターゲティング系を投与して結合させ、挿入、欠失又は突然変異を生じさせて、状態を緩和し得る。
本発明は、核酸を使用して標的ＲＮＡ配列を結合する。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲエフェクター（Ｃａｓ１３ｂ）タンパク質又はそのｍＲＮＡ（又はより一般的にはその核酸分子）及びガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡはまた、別々に、例えば前者がガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの投与の１～１２時間前に（好ましくは約２～６時間前に）送達されるか又は一緒に送達され得る。ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの第２のブースター用量を初回投与の１～１２時間後に（好ましくは約２～６時間後に）投与することができる。
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、時に本明細書においてＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と称される。エフェクタータンパク質は酵素をベースとし又はそれに由来し、従って一部の実施形態において用語「エフェクタータンパク質」は必ず「酵素」を含むことが理解されるであろう。しかしながら、また、エフェクタータンパク質は、一部の実施形態において必要に応じてＤＮＡ又はＲＮＡ結合を有し得るが、デッドＣａｓエフェクタータンパク質機能を含め、必ずしも切断又はニッキング活性を有するとは限らないことも理解されるであろう。
細胞標的としては、造血幹／前駆細胞（ＣＤ３４＋）、ヒトＴ細胞及び眼（網膜細胞） － 例えば、光受容前駆細胞が挙げられる。
本発明の方法は、鋳型の送達を更に含むことができる。鋳型の送達は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂ）、又はガイド、又はｃｒＲＮＡの一部又は全部の送達と同時又は別個によるものであり得、且つ同じ又は異なる送達機構によるものであり得る。
誘導性系
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクター（Ｃａｓ１３ｂ）タンパク質は、誘導性系の一成分を形成し得る。この系の誘導可能な性質により、エネルギーの形態を用いた遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となり得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ－Ｏｎ又はＴｅｔ－Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン又はクリプトクロム）が含まれる。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、配列特異的に転写活性の変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分には、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来）及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例は、米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書及び国際公開第２０１４０１８４２３ Ａ２号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。
自己不活性化系
細胞内のＲＮＡの全てのコピーが編集された後、もはやその細胞においてＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質発現又は活性が続行する必要はない。ガイド標的配列としてＣａｓ１３ｂに関するＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの使用に依存する自己不活性化系は、Ｃａｓ１３ｂの発現又は複合体形成を妨げることにより、その系を停止させることができる。
キット
ある態様において、本発明は、上記の方法及び組成物に開示される要素の任意の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に教示されるとおりのベクター系又は本明細書に教示されるとおりのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｂ系若しくは複合体の構成成分の１つ以上、例えばｃｒＲＮＡ及び／若しくはＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又はＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードするｍＲＮＡなど、及びキットの使用説明書を含む。要素は、個々に又は組み合わせで提供され得、且つ任意の好適な容器、例えばバイアル、ボトル又はチューブに提供され得る。一部の実施形態において、本キットは、１つ以上の言語、例えば２つ以上の言語による説明書を含む。説明書は、本明細書に記載される適用及び方法に特異的であり得る。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載される要素の１つ以上を利用するプロセスで使用するための１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の好適な容器中に提供され得る。例えば、キットは、１つ以上の反応又は保存緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイで使用可能な形態で提供され得るか、又は使用前に１つ以上の他の構成成分の添加が必要な形態（例えば、濃縮形態又は凍結乾燥形態）で提供され得る。緩衝液は、限定はされないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びこれらの組み合わせを含めた任意の緩衝液であり得る。一部の実施形態において、緩衝液は、アルカリ性である。一部の実施形態において、緩衝液は、ｐＨが約７～約１０である。一部の実施形態において、本キットは、ガイド又はｃｒＲＮＡ配列と調節エレメントとを作動可能に連結するためベクターに挿入されるガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本キットは、相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に記載されるベクターの１つ以上及び／又はポリヌクレオチドの１つ以上を含む。本キットは、有利には、本発明の系の全てのエレメントを提供することが可能であり得る。
本発明は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断及び予後判定において、広範な適用性を有する。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は同義的に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドであれ又はリボヌクレオチドであれ、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド又はその類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知又は未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析によって定義される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。この用語は、合成骨格を有する核酸様構造も包含し、例えばＥｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１；Ｂａｓｅｒｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９３；国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；国際公開第９６／３９１５４号パンフレット；Ｍａｔａ，１９９７；Ｓｔｒａｕｓｓ－Ｓｏｕｋｕｐ，１９９７；及びＳａｍｓｔａｇ，１９９６を参照されたい。ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変はポリマーをアセンブルする前又はその後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成成分で中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識構成成分とのコンジュゲーションによるなどして更に改変され得る。本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、突然変異体又は変異体形態とは区別されるものとして天然に存在するとおりの、典型的な形態の生物、菌株、遺伝子又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の呈示を意味するものと解釈されなければならない。用語「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」は同義的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この用語は、核酸分子又はポリペプチドに言及するとき、核酸分子又はポリペプチドが、自然中ではそれと天然に結び付いている、且つ自然中に見られるとおりの少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する「相補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型の対合のいずれかによって核酸が別の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。「相補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型のいずれかによって核酸が別の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性は、核酸分子中で第２の核酸配列と水素結合を形成（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）することのできる残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個のうちの５、６、７、８、９、１０個は、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の相補性である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書で使用されるとき、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド又はそれを超える領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である相補性の程度を指すか、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。本明細書で使用されるとき、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列と相補性を有する核酸が標的配列に優先的にハイブリダイズし、且つ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、概して配列依存性であり、幾つもの要因に応じて異なる。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。ポリヌクレオチド配列に言及する場合、相補配列又は部分的相補配列も想定される。これらは、好ましくは、高度にストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズ可能なものである。概して、ハイブリダイゼーション速度を最大にするには、比較的低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（熱融点（Ｔｍ）より約２０～２５℃低い）が選択される。Ｔｍは、特定の標的配列の５０％が規定のイオン強度及びｐＨの溶液中で完全に相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。概して、ハイブリダイズした配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を要求する場合、Ｔｍより約５～１５℃低くなるよう高度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。ハイブリダイズした配列の少なくとも約７０％のヌクレオチド相補性を要求する場合、Ｔｍより約１５～３０℃低くなるよう中程度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。高度に許容的な（極めて低いストリンジェンシーの）洗浄条件はＴｍより５０℃も低いものであり得、ハイブリダイズした配列間に高レベルのミスマッチが許容される。当業者は、ハイブリダイゼーション段階及び洗浄段階における他の物理的及び化学的パラメータも、標的配列とプローブ配列との間の特定の相同性レベルからの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響を与えるよう変更し得ることを認識するであろう。好ましい高度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％ ＳＤＳ中４２℃でのインキュベーション又は５×ＳＳＣ及び１％ ＳＤＳ中６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ中６５℃での洗浄を含む。「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応することによりヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定した複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグステイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合によるか、又は任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体には、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖又はこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始又は酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より大規模なプロセスで一ステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズ可能な配列は、その所与の配列の「相補体」と称される。本明細書で使用されるとき、用語「ゲノム遺伝子座」又は「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数形ｌｏｃｉ）は、染色体上の遺伝子又はＤＮＡ配列の特定の位置である。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする一続きのＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は生物において機能的役割を果たし、従って生体における分子的遺伝単位であるＲＮＡ鎖を指す。本発明の目的上、遺伝子は、遺伝子産物の産生を調節する領域を含むと（かかる調節配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているか否かに関わらず）見なし得る。従って、遺伝子には、必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位及び遺伝子座制御領域が含まれる。本明細書で使用されるとき、「ゲノム遺伝子座の発現」又は「遺伝子発現」は、機能的遺伝子産物の合成に遺伝子からの情報が用いられる過程である。遺伝子発現の産物は、多くの場合にタンパク質であるが、ｒＲＮＡ遺伝子又はｔＲＮＡ遺伝子などの非タンパク質コード遺伝子では、産物は機能性ＲＮＡである。遺伝子発現の過程は、あらゆる既知の生命 － 真核生物（多細胞生物を含む）、原核生物（細菌及び古細菌）及びウイルスによって生存のための機能性産物の産生に用いられている。本明細書で使用されるとき、遺伝子又は核酸の「発現」には、細胞遺伝子発現のみならず、クローニング系及び任意の他のコンテクストにおける核酸の転写及び翻訳も包含される。本明細書で使用されるとき、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物などに）転写される過程及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳される過程も指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して同義的に使用される。ポリマーは線状又は分枝状であり得、それは修飾アミノ酸を含み得、及びそれは非アミノ酸が割り込み得る。これらの用語は、改変されているアミノ酸ポリマー（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化又は他に任意の、標識成分とのコンジュゲーションなどの操作）も包含する。本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」には、グリシン及びＤ又はＬの両方の光学異性体及びアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含め、天然及び／又は非天然又は合成のアミノ酸が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」は、タンパク質配列のうち、残りのタンパク質鎖と独立に存在し及び機能し得る一部分を指す。本発明の態様に記載されるとおり、配列同一性は配列相同性と関係する。相同性比較は目測で行われ得るか、又はより通例では、容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて行われ得る。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算することができ、また２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列が共有する配列同一性も計算することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、突然変異体又は変異体の形態とは区別されるものとして天然に存在するとおりの、典型的な形態の生物、菌株、遺伝子又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の呈示を意味するものと解釈されなければならない。用語「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」は同義的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この用語は、核酸分子又はポリペプチドに言及しているとき、核酸分子又はポリペプチドが、自然中ではそれと天然に結び付いている、且つ自然中に見られるとおりの少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。これらの用語を含むか否かに関わらず、あらゆる態様及び実施形態において、好ましくは、それは、任意選択であり得、従って好ましくは含まれるか、又は含まれないことは、好ましくないことが理解されるであろう。更に、用語「天然に存在しない」及び「エンジニアリングされた」は同義的に用いられ得、そのため、従って単独で又は組み合わせで用いることができ、いずれか一方を両方とも併せた記述に置き換え得る。詳細には、「天然に存在しない」又は「天然に存在しない及び／又はエンジニアリングされた」の代わりに「エンジニアリングされた」が好ましい。
配列相同性は、当該技術分野において公知の幾つものコンピュータプログラムのいずれか、例えばＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどによって求めることができる。かかるアラインメントの実施に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、限定はされないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 前掲 － Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３－４１０）及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは、いずれもオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 前掲，７－５８～７－６０頁を参照されたい）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。パーセンテージ（％）配列相同性は連続配列に関して計算され得、即ち一方の配列を他方の配列とアラインメントして、一方の配列の各アミノ酸又はヌクレオチドが他方の配列の対応するアミノ酸又はヌクレオチドと１残基ずつ直接比較される。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。かかるギャップなしアラインメントは比較的少数の残基にのみ行われる。これは極めて単純で一貫した方法であるが、例えば本来は同一の配列ペアにおいて、１つの挿入又は欠失があるために以降のアミノ酸残基がアラインメントから外れる点を考慮に入れることができず、従って大域的アラインメントを行うと潜在的に％相同性が大きく低下し得る。結果的に、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性又は同一性スコアに過度のペナルティーを与えることなく、可能性のある挿入又は欠失を考慮に入れる最適アラインメントを生成するように設計される。これは、局所的な相同性又は同一性を最大化しようと配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。しかしながら、これらの複雑性の高い方法は、アラインメント内に出現する各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てるため、同数の同一アミノ酸について、ギャップが可能な限り少ない配列アラインメント（２つの比較される配列間の高い関連性を反映する）の方が、ギャップの多い配列よりも高いスコアを達成し得る。典型的には、あるギャップの存在に比較的高いコストを課し、且つそのギャップにおけるそれぞれの後続残基のペナルティーを小さくする「アフィニティギャップコスト」が用いられる。これが、最も一般的に用いられているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然ながらギャップがより少ない最適化されたアラインメントを生成し得る。多くのアラインメントプログラムで、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかしながら、配列比較にかかるソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティーは、ギャップが－１２で各伸長が－４である。従って、最大％相同性の計算には、初めにギャップペナルティーを考慮して最適アラインメントを生成する必要がある。かかるアラインメントの実行に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ ｐ３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、限定はされないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．－Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３－４１０）及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは、いずれもオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７－５８～７－６０頁を参照されたい）。しかしながら、一部の適用には、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新規ツールもタンパク質及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７４（２）：２４７－５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７７（１）：１８７－８及び米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ）のウェブサイトにある国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを参照されたい）。最終的な％相同性は同一性の点で計測され得るが、アラインメント過程自体は、典型的にはオール・オア・ナッシングのペア比較に基づくわけではない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づき、各ペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケーリング型類似性スコア行列が概して用いられる。一般的に用いられるかかる行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列 － ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルト行列 － である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、概して公式のデフォルト値又は供給がある場合にはカスタムの記号比較テーブルのいずれかを使用する（更なる詳細については、ユーザマニュアルを参照されたい）。適用によっては、ＧＣＧパッケージについて公式のデフォルト値を使用するか、又は他のソフトウェアの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。代わりに、パーセンテージ相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ＆Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７－２４４）と同様のアルゴリズムに基づくＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の多重アラインメント機能を用いて計算し得る。ソフトウェアが最適アラインメントを生成すると、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能になる。ソフトウェアは、典型的には配列比較の一部としてこれを行い、数値的な結果を出す。配列は、サイレントな変化を生じて機能的に均等な物質をもたらすようなアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換も有し得る。アミノ酸特性（残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の性質など）の類似性に基づいて計画的なアミノ酸置換が作製され得、従ってアミノ酸を機能的なグループにまとめることが有用である。アミノ酸は、その側鎖の特性のみに基づいてまとめられ得る。しかしながら、突然変異データも同様に含めることが更に有用である。このように得られたアミノ酸の組は、構造上の理由から保存されているものと思われる。これらの組はベン図の形式で記述することができる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ Ｇ．Ｊ．（１９９３）“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５－７５６）（Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．（１９８６）“Ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５－２１８）。保存的置換は、例えば、一般に認められているベン図によるアミノ酸分類を記載する下記の表に従い作製し得る。
Figure 2023052236000002
用語「対象」、「個体」及び「患者」は、本明細書では、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指して同義的に使用される。哺乳類としては、限定はされないが、ネズミ科動物、サル類、ヒト、農業動物、競技動物及びペットが挙げられる。インビボで得られたか又はインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞及びそれらの子孫も包含される。
用語「療法薬剤」、「療法的能力のある薬剤」又は「治療薬剤」は同義的に使用され、対象への投与時に何らかの有益な効果を付与する分子又は化合物を指す。有益な効果には、診断上の判断の実施可能性；疾患、症状、障害又は病的状態の改善；疾患、症状、障害又は病態の発症の低減又は予防；及び疾患、症状、障害又は病的状態への一般的な対抗が含まれる。本明細書で使用されるとき、「治療」又は「治療する」又は「緩和する」又は「改善する」は同義的に使用される。これらの用語は、限定はされないが治療利益及び／又は予防利益を含めた有益な又は所望の結果を達成するための手法を指す。治療利益とは、治療下の１つ以上の疾患、病態又は症状における任意の治療的に関連性のある向上又はそれに対する効果を意味する。予防的利益について、組成物は、特定の疾患、病態又は症状を発症するリスクのある対象、又は疾患、病態又は症状が依然として現れていないことがあり得るにしろ、疾患の生理学的症状の１つ以上を訴えている対象に投与され得る。用語「有効量」又は「治療有効量」は、有益な又は所望の結果を生じさせるのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療下の対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などの１つ以上に応じて異なり得るが、当業者はこれを容易に判断することができる。この用語は、本明細書に記載されるイメージング方法のいずれか１つによる検出用の画像を提供し得る用量にも適用される。具体的な用量は、詳細な選択の薬剤、従うべき投与レジメン、他の化合物と併用して投与されるかどうか、投与タイミング、イメージングする組織及びそれが担持される物理的送達系の１つ以上に応じて異なり得る。
本発明の実施では、特に指示されない限り、当該技術分野の技術の範囲内にある免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス及び組換えＤＮＡの従来技術を利用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照されたい。本発明の幾つかの態様は、１つ以上のベクターを含むベクター系又はベクター自体に関する。ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質又は酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞又は哺乳類細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳述されている。代わりに、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写及び翻訳され得る。本発明の実施形態は、起こり得る相同置換（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の両方は、本明細書では既存のアミノ酸残基又はヌクレオチドと代替の残基又はヌクレオチドとの相互交換を意味して用いられる）、即ちアミノ酸の場合に塩基性同士、酸性同士、極性同士等、同種のもの同士の置換を含み得る配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの両方）を含む。非相同置換、即ちあるクラスから別のクラスの残基への置換又は代わりにオルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の取り込みが関わる置換も起こり得る。変異体アミノ酸配列は、グリシン又はβ－アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加え、メチル基、エチル基又はプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る好適なスペーサー基を含み得る。更に別の形態（これにはペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在が関わる）について、当業者は十分に理解し得る。誤解を避けるため、「ペプトイド形態」は、α－炭素置換基がα－炭素上ではなく、むしろ残基の窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を指して使用される。ペプトイド形態のペプチドの調製方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７－９３７１及びＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２－１３４）。相同性モデリング：他のＣａｓ１３ｂオルソログにおける対応する残基は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２（Ｎａｔｕｒｅ；４９０（７４２１）：５５６－６０）及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５（ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ；１１（５）：ｅ１００４２４８）の方法－ドメイン－モチーフ界面によって媒介される相互作用を予測する計算的タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）方法によって同定することができる。構造に基づくＰＰＩ予測方法であるＰｒｅＰＰＩ（予測ＰＰＩ）は、ベイズ統計学の枠組みを用いて構造的エビデンスを非構造的エビデンスと組み合わせる。この方法は、クエリタンパク質のペアをとり、構造アラインメントを用いることにより、それらの実験的に決定された構造又は相同性モデルのいずれかに対応する構造表現を同定することを含む。構造アラインメントは、更に、大域的及び局所的幾何学関係を考慮することによって近く及び遠くの両方の隣接構造を同定するのに用いられる。構造表現の２つの隣接構造がタンパク質データバンクに報告されている複合体を形成する場合には常に、これが、これらの２つのクエリタンパク質間の相互作用をモデル化するための鋳型を定義付ける。複合体のモデルは、鋳型内の対応する隣接構造上の代表的な構造を重ね合わせることにより作成される。この手法は、Ｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３（Ｐｒｏｔ Ｓｃｉ；２２：３５９－６６）に更に記載される。
本発明の目的上、増幅は、妥当なフィデリティで標的配列を複製する能力を有するプライマー及びポリメラーゼを用いる任意の方法を意味する。増幅は、天然又は組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片及び逆転写酵素によって行われ得る。好ましい増幅方法はＰＣＲである。特定の態様において、本発明はベクターに関する。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、ある実体を１つの環境から別の環境に移すことを可能にする又は促進するツールである。これは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて挿入セグメントの複製をもたらし得るレプリコン、例えばプラスミド、ファージ又はコスミドである。概して、ベクターは適切な制御エレメントと会合しているとき、複製能を有する。一般に、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖、二本鎖又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば、環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここで、ベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって担持されるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含むことができ、これは、即ち、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択され得る）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。組換え及びクローニング方法に関しては、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４－０１７１１５６ Ａ１号明細書として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書（この内容は、本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。本発明の態様は、ガイドＲＮＡ及び野生型、改変若しくは突然変異ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／酵素（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）用のバイシストロニックベクターに関する。ガイドＲＮＡ及び野生型、改変若しくは突然変異ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／酵素（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）用のバイシストロニック発現ベクターが好ましい。概して且つ特に、この実施形態において野生型、改変又は突然変異ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／酵素（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）は、好ましくは、ＣＢｈプロモーターによってドライブされる。ＲＮＡは、好ましくはＵ６プロモーターなどのＰｏｌ ＩＩＩプロモーターによってドライブされ得る。理想的にはこの２つが組み合わされる。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ中のループが提供される。これは、ステムループ又はテトラループであり得る。ループは、好ましくは、ＧＡＡＡであるが、この配列に限定されるものではなく、又は実際には、４ｂｐ長であることのみに限定されるものではない。実際には、ヘアピン構造における使用に好ましいループ形成配列は４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、代替的な配列であり得るとおり、より長い又は短いループ配列が使用され得る。配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）及び更なるヌクレオチド（例えば、Ｃ又はＧ）を含む。ループ形成配列の例にはＣＡＡＡ及びＡＡＡＧが含まれる。
本明細書に開示される任意の方法の実施では、限定なしに、マイクロインジェクション、電気穿孔、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペイルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、専売薬剤により増強される核酸取り込み及びリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム又は人工ビリオンを介した送達を含めた当該技術分野で公知の１つ以上の方法によって細胞又は胚に好適なベクターを導入することができる。一部の方法において、ベクターはマイクロインジェクションによって胚に導入される。ベクターが胚の核又は細胞質に微量注入され得る。一部の方法において、ベクターは、ヌクレオフェクションによって細胞に導入され得る。
ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質又は酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞又は哺乳類細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳しく考察されている。代わりに、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写及び翻訳され得る。
ベクターは、原核生物又は原核細胞に導入して増殖させ得る。一部の実施形態において、真核細胞に導入するベクターのコピーを増幅させるため又は真核細胞に導入するベクターの産生における中間ベクターとして（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてプラスミドを増幅する）、原核生物が使用される。一部の実施形態において、原核生物を用いてベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させて、それにより例えば宿主細胞又は宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供する。原核生物でのタンパク質の発現は、多くの場合、融合タンパク質又は非融合タンパク質のいずれかの発現を導く構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で行われる。融合ベクターが、そこでコードされるタンパク質、例えば組換えタンパク質のアミノ末端に幾つものアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは、（ｉ）組換えタンパク質の発現の増加；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度の増加；及び（ｉｉｉ）アフィニティー精製でリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製の促進など、１つ以上の目的を果たし得る。多くの場合、融合発現ベクターでは、融合タンパク質の精製後に組換えタンパク質を融合部分と分離することができるように、融合部分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質分解切断部位が導入される。かかる酵素及びそのコグネイト認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例としては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらは、それぞれグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質又はプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。好適な誘導性非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０－８９）が挙げられる。一部の実施形態において、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）における発現用のベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。一部の実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞でのタンパク質発現をドライブする。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）が挙げられる。一部の実施形態において、ベクターは、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞での１つ以上の配列の発現をドライブする能力を有する。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７－１９５）が挙げられる。哺乳類細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には１つ以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０及び本明細書に開示される及び当該技術分野において公知の他のウイルスに由来する。原核細胞及び真核細胞の両方に好適な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９のＣｈａｐｔｅｒｓ １６及び１７を参照されたい。一部の実施形態において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を導くことが可能である（例えば、組織特異的調節エレメントが核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは、当該技術分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、詳細にはＴ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）及び乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーター、例えばマウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９）及びαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６）も包含される。これらの原核生物及び真核生物ベクターに関しては、米国特許第６，７５０，０５９号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。本発明の他の実施形態はウイルスベクターの使用に関し得、それについては、米国特許出願第１３／０９２，０８５号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。組織特異的調節エレメントは、当該技術分野において公知であり、この点で、米国特許第７，７７６，３２１号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ系又は複合体の又はそれをコードする１つ以上のエレメントの発現をドライブするため、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに調節エレメントが作動可能に連結される。一般に、ＳＰＩＤＲ（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔ、スペーサー散在型ダイレクトリピート）としても知られるＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復）は、通常特定の細菌種に特異的なＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９－５４３３［１９８７］；及びＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３－３５５６［１９８９］）に認められた特徴的なクラスの散在型短鎖配列リピート（ＳＳＲ）及び関連遺伝子を含む。同様の散在型ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）及び結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７－１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４－２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６－３０［１９９６］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５－９３［１９９５］を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的にはリピートの構造が他のＳＳＲと異なり、短い規則的な間隔のリピート（ＳＲＳＲ）と呼ばれている（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３－３３［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４－２４６［２０００］）。一般に、このリピートは、実質的に一定長さのユニークな介在配列によって規則的な間隔が置かれたクラスター内に存在する短いエレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］、前掲）。リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在するリピートの数及びスペーサー領域の配列は、典型的には株毎に異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３－２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、限定はされないが、アエロピルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルホロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピュルス属（Ｍｅｔｈａｎｏナシ属（Ｐｙｒｕｓ））、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミキソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）及びサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）を含め、４０を超える原核生物において同定されている（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５－１５７５［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］を参照されたい）。
一般に、「ＲＮＡターゲティング系」は、本願で使用されるとき、まとめて、本明細書で考察するとおりの図１に関連した、ＲＮＡターゲティングＣａｓ（エフェクター）タンパク質及びガイドＲＮＡ（又はｃｒＲＮＡ配列）をコードする配列を含めた、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ関連１３ｂ（「Ｃａｓ１３ｂ」）遺伝子（本明細書ではエフェクタータンパク質とも称される）の発現又はその活性の誘導に関わる転写物及び他のエレメントを指す。一般に、ＲＮＡターゲティング系は、標的配列の部位でＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＲＮＡターゲティング複合体の形成の文脈では、「標的配列」は、ガイド配列（又はガイド又はｃｒＲＮＡの）がそれと相補性を有するように設計されるＲＮＡ配列を指し、ここで、標的配列とガイドＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションがＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを生じさせ且つＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進するのに十分な相補性がある場合、完全な相補性は、必ずしも必要でない。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核又は細胞質に位置する。一部の実施形態において、標的配列は、真核細胞の細胞小器官内にあり得る。標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに用いられ得る配列又は鋳型は、「編集用鋳型」、又は「編集用ＲＮＡ」、又は「編集用配列」と称される。本発明の態様では、外因性鋳型ＲＮＡが編集用鋳型と称され得る。本発明のある態様では、組換えは、相同組換えである。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして標的配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス－ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン－ブンシュアルゴリズム、バローズ・ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ－ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか又はそれより長い。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満であるか又はそれより短い。ガイド配列が標的配列へのＲＮＡターゲティング複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。鋳型ポリヌクレオチドは、約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００ヌクレオチド長以上又はそれより長いなど、任意の好適な長さであり得る。一部の実施形態において、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部分に相補的である。最適にアラインメントされたとき、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド以上又はそれより長い）と重複し得る。一部の実施形態において、鋳型配列と、標的配列を含むポリヌクレオチドとが最適にアラインメントされたとき、鋳型ポリヌクレオチドのうち、最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００ヌクレオチド以内又はそれを超える範囲内にある。一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質に加えて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上又はそれより多いドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質／酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ酵素に加えて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上又はそれより多いドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。エフェクタータンパク質に融合させ得るタンパク質ドメインの例としては、限定なしに、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列及び以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性及び核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定はされないが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及び自己蛍光タンパク質、例えば青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、ＤＮＡ分子に結合するか、又は限定はされないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含めた他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片をコードする遺伝子配列と融合し得る。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加的なドメインは、米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されている。一部の実施形態では、タグ付加核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を使用して標的配列の位置が同定される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ酵素は、誘導性系の一成分を形成し得る。この系の誘導可能な性質により、エネルギーの形態を用いた遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となり得る。
エネルギーの形態としては、限定はされないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ－Ｏｎ又はＴｅｔ－Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン又はクリプトクロム）が含まれる。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ酵素は、配列特異的に転写活性の変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分には、ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来）及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例は、米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書及び国際公開第２０１４／０１８４２３号パンフレット及び米国特許第８８８９４１８号明細書、米国特許第８８９５３０８号明細書、米国特許出願公開第２０１４０１８６９１９号明細書、米国特許出願公開第２０１４０２４２７００号明細書、米国特許出願公開第２０１４０２７３２３４号明細書、米国特許出願公開第２０１４０３３５６２０号明細書、国際公開第２０１４０９３６３５号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。一部の態様において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、又は例えば本明細書に記載されるとおりの１つ以上のベクター、その１つ以上の転写物及び／又はそれから転写されるもの又はタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、かかる方法によって作製される細胞及びかかる細胞を含むか、又はそれから作製される生物（動物、植物又は真菌類など）を更に提供する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡと組み合わせた（及び任意選択でそれと複合体を形成した）ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質が細胞に送達される。哺乳類細胞又は標的組織における核酸の導入には、従来のウイルスベース及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いることができる。かかる方法を用いて、ＲＮＡターゲティング系の構成成分をコードする核酸を培養下の細胞又は宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸及び送達ビヒクルと複合体を形成した核酸、例えばリポソームが含まれる。ウイルスベクター送達系にはＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれ、これは細胞への送達後にエピソームゲノム又は組込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子療法手順のレビューに関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９－１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１－４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６（１９９４）を参照されたい。核酸の非ウイルス送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン及び薬剤で促進するＤＮＡ取込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；及び同第４，８９７，３５５号明細書に記載され）及びリポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが含まれる。送達は、細胞に対してであり得る（例えば、インビトロ又はエキソビボ投与）か、又は標的組織に対してであり得る（例えば、生体内投与）。
状態のモデル
本発明の方法を用いることにより、目的の突然変異のモデル又は疾患モデルによるなど、目的の遺伝的又は後成的条件のモデル化及び／又は研究に使用し得る植物、動物又は細胞を作り出すことができる。本明細書で使用されるとき、「疾患」は、対象における疾患、障害又は徴候を指す。例えば、本発明の方法を用いて、疾患に関連する１つ以上の核酸配列に改変を含む動物若しくは細胞又は疾患に関連する１つ以上の核酸配列の発現が変化している植物、動物若しくは細胞を作り出すことができる。かかる核酸配列は疾患関連タンパク質配列をコードし得るか若しくは翻訳され得るか、又は疾患関連制御配列であり得る。従って、本発明の実施形態において植物、対象、患者、生物又は細胞は、非ヒトの対象、患者、生物又は細胞であり得ることが理解される。従って、本発明は、本方法により作製された植物、動物若しくは細胞又はその子孫を提供する。子孫は、作製された植物又は動物のクローンであり得るか、又は更に望ましい形質をその子孫に遺伝子移入させるため同じ種の他の個体と交配させることによる有性生殖から生じ得る。細胞は、多細胞生物、特に動物又は植物の場合にインビボ又はエキソビボであり得る。細胞が培養下にある例では、適切な培養条件が満たされる場合、且つ好ましくは細胞がこの目的に好適に適合する場合（例えば、幹細胞）、細胞系が樹立され得る。本発明によって作製される細菌細胞系も想定される。従って、細胞系も想定される。一部の方法において、疾患モデルを使用することにより、疾患の研究で一般的に用いられる尺度を用いて突然変異又はより一般的に遺伝子又は遺伝子産物の発現の変化、例えば低下が動物又は細胞及び疾患の発症及び／又は進行に及ぼす効果を研究することができる。代わりに、かかる疾患モデルは、薬学的に活性な化合物が疾患に及ぼす効果の研究に有用である。一部の方法において、疾患モデルを使用して、見込みのある遺伝子療法戦略の有効性を評価することができる。即ち、疾患の発症及び／又は進行が呈示、又は阻害、又は低減されるように疾患関連ＲＮＡを改変することができ、次に化合物が進行又は阻害又低減に及ぼす効果が試験される。
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質及びその複合体及びそれをコードする核酸分子並びにそれを使用した方法を利用する本発明の実施に有用である、以下が参照される：“Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ”．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；最終的な改訂版が以下として発表された：Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４ Ｊａｎ ３；３４３（６１６６）：８４－８７。Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．は、ゲノムワイド規模で遺伝子機能を探索する新規方法に関する。その研究は、６４，７５１個のユニークなガイド配列で１８，０８０個の遺伝子を標的化するゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリを送達することにより、ヒト細胞におけるネガティブ選択及びポジティブ選択の両方のスクリーニングが可能になったことを示した。第一に、この著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリを用いて癌及び多能性幹細胞における細胞生存能力に必須の遺伝子を同定することを示した。次に、この著者らは、メラノーマモデルにおいて、その欠損がベムラフェニブ（突然変異プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬）に対する耐性に関わる遺伝子をスクリーニングした。その研究は、最も上位に位置付けられる候補に、既に検証されている遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２並びに新規ヒットＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ及びＴＡＤＡ１が含まれたことを明らかにした。この著者らは、同じ遺伝子を標的化する独立したガイドＲＮＡ間における高度な一貫性及び高いヒット確認率を観察し、従ってＣａｓ９によるゲノム規模のスクリーニングの有望さを実証した。米国特許出願公開第２０１４０３５７５３０号明細書及び国際公開第２０１４０９３７０１号パンフレット（本明細書によって参照により本明細書に援用される）も参照される。
用語「会合している」は、ここで、機能ドメインとＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質との会合に関して用いられる。これは、例えば、アダプタータンパク質と機能ドメインとの間又はＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と機能ドメインとの間で１つの分子がどのように別の分子と「会合」するかに関して用いられる。かかるタンパク質間相互作用の場合、この会合は、抗体がエピトープを認識する方法における認識の観点で考えられ得る。代わりに、１つのタンパク質が別のタンパク質とそれらの２つの融合物によって会合し得、例えば１つのサブユニットが別のサブユニットに融合し得る。融合は、典型的には、例えば各タンパク質又はサブユニットをコードするヌクレオチド配列の併せたスプライシングにより、一方のアミノ酸配列が他方のアミノ酸配列に付加されることによって起こる。代わりに、これは、本質的に、融合タンパク質など、２つの分子間の結合又は直接的な連結と考えられ得る。いずれにしろ、融合タンパク質は、２つの目的のサブユニット間（即ち酵素と機能ドメインとの間又はアダプタータンパク質と機能ドメインとの間）にリンカーを含み得る。従って、一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質は、機能ドメインへの結合によってそれと会合する。他の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質は、機能ドメインと、それらの２つが任意選択で中間リンカーを介して一体に融合されるため、会合する。
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体は、植物において使用することができる
一部の実施形態における本発明は、細胞又は生物を改変する方法を包含する。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞は、哺乳類細胞であり得る。哺乳類細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類又はマウス細胞であり得る。細胞は、家禽、魚類又はエビなどの非哺乳類真核細胞であり得る。細胞は、植物細胞でもあり得る。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ又はコメなどの作物植物であり得る。植物細胞は、藻類、樹木又は野菜でもあり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物など、生物学的産物の産生向上のため細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。本系は、１つ以上の異なるベクターを含み得る。本発明のある態様において、エフェクタータンパク質は、所望の細胞型、優先的に真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。Ｃａｓ１３ｂ系（例えば、単一の又は多重化した）は、作物ゲノミクスにおける近年の進歩と併せて用いることができる。かかるＣＲＩＳＰＲ系を使用して、効率的で且つ対費用効果の高い植物遺伝子又はゲノム又はトランスクリプトームの探索又は編集又は操作を － 例えば、植物遺伝子又はゲノムの迅速な調査、及び／又は選択、及び／又は探索、及び／又は比較、及び／又は操作、及び／又は形質転換のために実施することができ、例えば形質又は特徴を作出するか、同定するか、開発するか、最適化するか、又は植物に付与するか、又は植物ゲノムを形質転換することができる。従って、植物の生産の向上、新規組み合わせの形質又は特徴を有する新規植物又は形質が増強された新規植物があり得る。かかるＣＲＩＳＰＲ系は、植物に関して、部位特異的組込み（ＳＤＩ）、又は遺伝子編集（ＧＥ）、又は任意の準逆育種（ＮＲＢ）、又は逆育種（ＲＢ）技術において使用することができる。従って、本明細書における動物細胞への言及は、特に明らかでない限り、適宜修正して植物細胞にも適用され得、且つオフターゲット効果が低下した本明細書における酵素及びかかる酵素を利用する系は、本明細書に記載するものを含め、植物適用に用いることができる。提供されるとおりの、エフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂ）及び好適なガイド（ｃｒＲＮＡ）によって改変されたエンジニアリング植物及びその子孫である。これには、コムギ、オオムギ、コメ、ダイズ又はトウモロコシなど、病害又は干ばつ耐性作物、自家授粉能力が取り除かれ又は低下するように改変された（しかし、代わりに、任意選択で代わりに雑種形成することができる）植物及びエフェクタータンパク質及び好適なガイドによるターゲティングによって免疫原性タンパク質が無効になった、破壊された又は断たれたピーナッツ及び堅果などのアレルギー誘発性食品が含まれ得る。古典的ＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓ系を使用する任意の態様をＣａｓタンパク質非依存的なＣＲＩＳＰＲ系、例えばＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系における使用に適合させることができる。
治療処置
本発明の系は、本願がこの系を情報に基づいてエンジニアリングするための基礎を提供するため、本開示から、過度の実験を行うことなく、治療、アッセイ及び他の適用を含めた旧ＲＮＡ切断技術の領域において適用することができる。本発明は、ＲＮＡの過剰発現、毒性ＲＮＡ及び／又は突然変異したＲＮＡ（例えば、スプライシング欠損又はトランケーションなど）によって引き起こされる疾患の治療処置を提供する。毒性ＲＮＡの発現は、核封入体の形成及び脳、心臓又は骨格筋における遅発性変性変化に関連し得る。最もよく研究された例、筋強直性ジストロフィーでは、毒性ＲＮＡの主要な病原性効果は、結合タンパク質を隔離し、且つ選択的スプライシングの調節を損なうことと見られる（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（２００６）１５（ｓｕｐｐｌ ２）：Ｒ１６２－Ｒ１６９）。筋強直性ジストロフィー［筋緊張性異栄養症（ＤＭ）］は、極めて幅広い臨床的特徴を生じるため、遺伝学者にとって特に興味深い。一部を挙げるとすれば、筋肉の消耗、白内障、インスリン抵抗性、精巣萎縮、心伝導の減速、皮膚腫瘍及び認知への効果であり得る。現在ＤＭ１型（ＤＭ１）と呼ばれている古典的形態のＤＭは、細胞質タンパク質キナーゼをコードする遺伝子ＤＭＰＫの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるＣＴＧリピートの伸長によって引き起こされる。
自然免疫系は、主に感染細胞内部のウイルス核酸を認識することによりウイルス感染を検出し、これは、ＤＮＡ又はＲＮＡセンシングと称される。インビトロＲＮＡセンシングアッセイを用いると、特異的ＲＮＡ基質を検出することができる。例えば、生細胞におけるＲＮＡベースのセンシングにＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用することができる。適用の例は、例えば、疾患特異的ＲＮＡのセンシングによる診断法である。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂ）は、抗ウイルス活性、詳細にはＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性に更に使用することができる。選択のウイルスＲＮＡ配列に選択的な好適なガイドＲＮＡを使用してエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂ）をウイルスＲＮＡに標的化することができる。詳細には、エフェクタータンパク質は、一本鎖ＲＮＡなどのＲＮＡを切断する活性ヌクレアーゼであり得る。ＲＮＡ、上記で言及したＲＮＡを標的化するための本発明の酵素系の治療投薬量は、約０．１～約２ｍｇ／ｋｇであることが企図され、これらの投薬量は、応答をモニタしながら、必要に応じて繰り返しの投薬量で患者１人当たり約７～１０用量まで逐次的に投与され得る。有利には、治療レジメン中に各患者から試料が採取され、治療の有効性が確認される。例えば、ＲＮＡ試料が分離及び定量化され、発現が低下しているか又は改善しているかどうかが判断され得る。かかる診断法は、当業者の範囲内にある。
トランスクリプトームワイドノックダウンスクリーニング
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質複合体は、効率的で対費用効果の高い機能性トランスクリプトニックスクリーニングの実施に用いることができる。かかるスクリーニングは、トランスクリプトームワイドライブラリベースのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を用いることができる。かかるスクリーニング及びライブラリにより、遺伝子の機能、遺伝子が関与する細胞経路及び遺伝子発現の任意の変化が如何に特定の生物学的過程をもたらし得るかを決定することが可能となり得る。本発明の利点は、ＣＲＩＳＰＲ系がオフターゲット結合及びその結果として生じる副作用を回避することである。これは、標的ＲＮＡに対して高度な配列特異性を有するように構成された系を用いて達成される。本発明の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質複合体はＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体である。
本発明の実施形態において、トランスクリプトームワイドライブラリは、本明細書に記載されるとおりの、真核細胞集団内の複数の遺伝子座における複数の標的配列を標的化可能なガイド配列を含む複数のＣａｓ１３ｂ系ガイドＲＮＡを含み得る。細胞集団は胚性幹（ＥＳ）細胞集団であり得る。遺伝子座にある標的配列は非コード配列であり得る。非コード配列は、イントロン、調節配列、スプライス部位、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ又はポリアデニル化シグナルであり得る。前記標的化により、１つ以上の遺伝子産物の遺伝子機能が変化し得る。標的化は遺伝子機能のノックアウトをもたらし得る。遺伝子産物の標的化は２つ以上のガイドＲＮＡを含み得る。遺伝子産物は、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のガイドＲＮＡ、好ましくは１遺伝子当たり３～４個によって標的化され得る。オフターゲット改変は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体によって作成される付着末端型の二本鎖切断を利用することによるか、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系で用いられるものと類似の方法を利用することにより、最小限に抑えることができる（例えば、参照により本明細書に援用される“Ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｍａｙ ｂｅ ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ（Ｓｅｅ，ｅ．ｇ．，ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ”．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）を参照されたい）。約１００個以上の配列の標的化であり得る。約１０００個以上の配列の標的化であり得る。約２０，０００個以上の配列の標的化であり得る。ゲノム全体の標的化であり得る。関連性のある又は望ましい経路に焦点を置いた標的配列のパネルの標的化であり得る。経路は免疫経路であり得る。経路は細胞分裂経路であり得る。
本発明の一態様は、複数の遺伝子座の複数の標的配列を標的化可能なガイド配列を含み得る複数のＣａｓ１３ｂガイドＲＮＡを含み得るトランスクリプトームワイドライブラリを包含し、ここで、前記標的化により遺伝子機能のノックダウンが生じる。このライブラリは、生物のゲノム内の１つ１つの遺伝子を標的化するガイドＲＮＡを潜在的に含み得る。
本発明の一部の実施形態において、生物又は対象は真核生物（ヒトを含めた哺乳動物を含む）又は非ヒト真核生物又は非ヒト動物又は非ヒト哺乳動物である。一部の実施形態において、生物又は対象は非ヒト動物であり、節足動物、例えば昆虫であり得るか、又は線虫であり得る。本発明の一部の方法において、生物又は対象は植物である。本発明の一部の方法において、生物又は対象は哺乳動物又は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物は、例えば、げっ歯類（好ましくはマウス又はラット）、有蹄類又は霊長類であり得る。本発明の一部の方法において、生物又は対象は微細藻類を含む藻類であるか又は真菌類である。
遺伝子機能のノックダウンには、Ｉ．Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質及びＩＩ．１つ以上のガイドＲＮＡを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系を含む１つ以上のベクターのベクター系を細胞集団における各細胞に導入するステップ［構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクター上にあり得る］、構成成分Ｉ及びＩＩを各細胞に組み込むステップ［ガイド配列は各細胞内のユニークな遺伝子を標的化し、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は調節エレメントに作動可能に連結されており、ガイド配列を含むガイドＲＮＡは、転写されると、ユニークな遺伝子のゲノム遺伝子座における標的配列へのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系の配列特異的結合を導く］、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質によるゲノム遺伝子座の切断を誘導するステップ及び細胞集団の各細胞内の複数のユニークな遺伝子における異なるノックダウンイベントを確認するステップが含まれ得、それにより遺伝子ノックダウン細胞ライブラリが生成される。本発明は、細胞集団が真核細胞集団であり、及び好ましい実施形態において、細胞集団が胚性幹（ＥＳ）細胞の集団であることを包含する。
１つ以上のベクターは、プラスミドベクターであり得る。ベクターは、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、ｇＲＮＡ及び任意選択で選択マーカーを含む標的細胞への単一のベクターであり得る。理論によって拘束されないが、単一のベクターでＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質及びｇＲＮＡを同時に送達可能であることにより、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を発現する細胞株を初めに作成する必要なしに、いかなる目的の細胞型にも適用することができる。調節エレメントは誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターはドキシサイクリン誘導性プロモーターであり得る。本発明の一部の方法において、ガイド配列の発現はＴ７プロモーターの制御下にあり、Ｔ７ポリメラーゼの発現によってドライブされる。種々のノックダウンイベントの確認は全トランスクリプトームシーケンシングによることができる。ノックダウンイベントは１００個以上のユニークな遺伝子において実現し得る。ノックダウンイベントは１０００個以上のユニークな遺伝子において実現し得る。ノックダウンイベントは２０，０００個以上のユニークな遺伝子において実現し得る。ノックダウンイベントはトランスクリプトーム全体で実現し得る。遺伝子機能のノックダウンは、特定の生理学的経路又は条件において機能する複数のユニークな遺伝子に実現し得る。経路又は条件は免疫経路又は条件であり得る。経路又は条件は細胞分裂経路又は条件であり得る。
本発明は、本明細書に記載するトランスクリプトームワイドライブラリを含むキットも提供する。本キットは、本発明のライブラリを含むベクター又はプラスミドを含む単一の容器を含み得る。本キットは、本発明のライブラリからのガイド配列を含むユニークなＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系ガイドＲＮＡの選択された一部を含むパネルも含むことができ、ここで、選択された一部は、特定の生理的条件を示すものである。本発明は、標的化が約１００配列以上、約１０００配列以上又は約２０，０００配列以上又はトランスクリプトーム全体であることを包含する。更に、標的配列のパネルは、免疫経路又は細胞分裂など、関連性のある又は望ましい経路に焦点が置かれ得る。
本発明の更なる態様において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質酵素は１つ以上の突然変異を含み得、機能ドメインへの融合を伴う又は伴わない一般的なＲＮＡ結合タンパク質として用いられ得る。突然変異は人工的に導入された突然変異か又は機能獲得型若しくは機能喪失型突然変異であり得る。本明細書に記載のとおり突然変異が特徴付けられている。本発明の一態様において、機能ドメインは転写活性化ドメインであり得、これはＶＰ６４であり得る。本発明の他の態様において、機能ドメインは転写リプレッサードメインであり得、これはＫＲＡＢ又はＳＩＤ４Ｘであり得る。本発明の他の態様は、限定はされないが、転写アクチベーター、リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、デメチラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御性ドメイン又は化学物質誘導性／制御性ドメインを含むドメインに融合した変異Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質酵素に関する。本発明の一部の方法は、標的遺伝子の発現を誘導するステップを含み得る。一実施形態において、真核細胞集団内の複数のゲノム遺伝子座における複数の標的配列を標的化することによる発現の誘導は、機能ドメインの使用による。
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体を利用する本発明の実施では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系で用いられる方法が有用であり、以下が参照される。
Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；最終的な改訂版が以下として発表された：Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４ Ｊａｎ ３；３４３（６１６６）：８４－８７。
Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．は、ゲノムワイド規模で遺伝子機能を探索する新規方法に関する。その研究は、６４，７５１個のユニークなガイド配列で１８，０８０個の遺伝子を標的化するゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリを送達することにより、ヒト細胞におけるネガティブ選択及びポジティブ選択の両方のスクリーニングが可能になったことを示した。第一に、この著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリを用いて癌及び多能性幹細胞における細胞生存能力に必須の遺伝子を同定することを示した。次に、この著者らはメラノーマモデルにおいて、その欠損がベムラフェニブ（突然変異プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬）に対する耐性に関わる遺伝子をスクリーニングした。その研究は、最も上位に位置付けられる候補には、既に検証されている遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２並びに新規ヒットＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ及びＴＡＤＡ１が含まれたことを明らかにした。この著者らは、同じ遺伝子を標的化する独立したガイドＲＮＡ間における高度な一貫性及び高いヒット確認率を観察し、従ってＣａｓ９によるゲノム規模のスクリーニングの有望さを実証した。
また、米国特許出願公開第２０１４０３５７５３０号明細書；及び国際公開第２０１４０９３７０１号パンフレット（本明細書によって参照により本明細書に援用される）も参照される。
機能的変化及びスクリーニング
別の態様において、本発明は、遺伝子の機能的評価及びスクリーニング方法を提供する。機能ドメインを正確に送達するため、遺伝子を活性化若しくは抑制するため又は目的の特定の遺伝子座上のメチル化部位を正確に変化させることによりエピジェネティック状態を変化させるための本発明のＣＲＩＳＰＲ系の使用は、単細胞又は細胞集団に適用される１つ以上のガイドＲＮＡを伴うか、又は複数のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むライブラリの投与又は発現を含む、エキソビボ又はインビボで細胞のプール内のゲノムに適用されるライブラリを伴うことができ、ここで、スクリーニングは、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質の使用を更に含み、ここで、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、異種機能ドメインを含むように改変される。ある態様において、本発明は、ライブラリの宿主への投与又は宿主におけるインビボ発現を含む、ゲノム／トランスクリプトームのスクリーニング方法を提供する。ある態様において、本発明は、宿主に投与される又は宿主で発現するアクチベーターを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで、アクチベーターは、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで、アクチベーターは、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで、アクチベーターは、ｓｇＲＮＡループに付加される。ある態様において、本発明は、宿主に投与される又は宿主で発現するリプレッサーを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで、スクリーニングは、遺伝子活性化、遺伝子阻害又は遺伝子座における切断に影響を及ぼし、且つそれを検出することを含む。
ある態様において、本発明は、効率的なオンターゲット活性を提供し、且つオフターゲット活性を最小限に抑える。ある態様において、本発明は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質による効率的なオンターゲット切断を提供し、且つＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質によるオフターゲット切断を最小限に抑える。ある態様において、本発明は、ＤＮＡ切断のない、遺伝子座におけるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質のガイド特異的結合を提供する。従って、ある態様において、本発明は、標的特異的遺伝子調節を提供する。ある態様において、本発明は、ＤＮＡ切断のない、遺伝子座におけるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質のガイド特異的結合を提供する。従って、ある態様において、本発明は、単一のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を使用したある遺伝子座における切断及び別の遺伝子座における遺伝子調節を提供する。ある態様において、本発明は、１つ以上のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質及び／又は酵素を使用した複数の標的の直交性の活性化及び／又は阻害及び／又は切断を提供する。
ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで、宿主は、真核細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで、宿主は、哺乳類細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで、宿主は、非ヒト真核生物である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで、非ヒト真核生物は、非ヒト哺乳類である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで、非ヒト哺乳類は、マウスである。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、この方法は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子の送達を含み、ここで、前記核酸分子は、調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで、インビボ発現は、レンチウイルス、アデノウイルス又はＡＡＶを介する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで、送達は、粒子、ナノ粒子、脂質又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を介する。
ある態様において、本発明は、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を各々が含む、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の対を提供し、ここで、各ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、ここで、アダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合し、ここで、各Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体の各ｓｇＲＮＡは、ＤＮＡ切断活性を有する機能ドメインを含む。
ある態様において、本発明は、目的のゲノム遺伝子座にある標的配列の切断方法を提供し、この方法は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子を細胞に送達することを含み、ここで、前記核酸分子は、調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの方法を提供し、ここで、送達は、レンチウイルス、アデノウイルス又はＡＡＶを介する。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリ、方法又は複合体を提供し、ここで、ｓｇＲＮＡは、少なくとも１つの非コード機能性ループを有するように改変され、例えば少なくとも１つの非コード機能性ループが抑制性であり、例えば少なくとも１つの非コード機能性ループがＡｌｕを含む。
一態様において、本発明は、遺伝子産物の発現を変化させ又は改変する方法を提供する。前記方法は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有し及び発現する細胞に、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質とＲＮＡ分子を標的化するガイドＲＮＡとを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ系を導入するステップを含むことができ、それによってガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＲＮＡ標的分子を標的化し、及びＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質が、遺伝子産物をコードするＲＮＡ分子を切断し、それによって遺伝子産物の発現が変化し、ここで、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質とガイドＲＮＡとは、天然では一緒に存在しない。本発明は、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明は、真核細胞での発現にコドン最適化されたＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を更に包含する。好ましい実施形態において、真核細胞は、哺乳類細胞であり、より好ましい実施形態において、哺乳類細胞は、ヒト細胞である。本発明の更なる実施形態において、遺伝子産物の発現は減少する。
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインがＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質に会合する。一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、例えば、Ｋｏｎｎｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ５１７，５８３－５８８，２９ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５）の改変ガイドと共に使用されるとおり、アダプタータンパク質に会合する。一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインがデッドｇＲＮＡ（ｄＲＮＡ）に会合する。一部の実施形態において、例えばＤａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｉｔｈ ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ”（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，ｐ．１１５９－６１（２０１５年１１月））によるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系に類似的に記載のとおり、活性Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含むｄＲＮＡ複合体が、ある遺伝子座上で機能ドメインによる遺伝子調節を導く一方、ｓｇＲＮＡが別の遺伝子座で活性Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質によるＤＮＡ切断を導く。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、オフターゲット調節と比較して目的の遺伝子座に関する調節の選択性が最大となるように選択される。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、標的遺伝子調節が最大となり、且つ標的切断が最小限に抑えられるように選択される。
以下の考察の目的上、機能ドメインへの言及は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と会合した機能ドメイン又はアダプタータンパク質と会合した機能ドメインのことであり得る。
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインはＮＬＳ（核局在化配列）又はＮＥＳ（核外移行シグナル）である。一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは転写活性化ドメインであり、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９及びヒストンアセチルトランスフェラーゼを含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合したものに関する活性化（又はアクチベーター）ドメインへの本明細書中の他の言及には、任意の公知の転写活性化ドメイン及び具体的には、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９又はヒストンアセチルトランスフェラーゼが含まれる。
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは転写リプレッサードメインである。一部の実施形態において、転写リプレッサードメインはＫＲＡＢドメインである。一部の実施形態において、転写リプレッサードメインは、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメイン又はＳＩＤ４Ｘドメインである。
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、翻訳活性化活性、翻訳抑制活性、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ組込み活性又は核酸結合活性を含む１つ以上の活性を有する。
一部の実施形態において、ＤＮＡ切断活性はヌクレアーゼに起因する。一部の実施形態において、ヌクレアーゼはＦｏｋ１ヌクレアーゼを含む。“Ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ”，Ｓｈｅｎｇｄａｒ Ｑ．Ｔｓａｉ，Ｎｉｃｏｌａｓ Ｗｙｖｅｋｅｎｓ，Ｃｙｄ Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ａ．Ｆｏｄｅｎ，Ｖｉｓｈａｌ Ｔｈａｐａｒ，Ｄｅｅｐａｋ Ｒｅｙｏｎ，Ｍａｔｈｅｗ Ｊ．Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ａｒｙｅｅ，Ｊ．Ｋｅｉｔｈ Ｊｏｕｎｇ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（６）：５６９－７７（２０１４）を参照されたく、これは、伸長配列を認識し、且つヒト細胞において内因性遺伝子を高効率で編集することのできる二量体ＲＮＡガイド下ＦｏｋＩヌクレアーゼに関する。
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、ｓｇＲＮＡ及び標的への結合時に機能ドメインがその帰属機能で機能することが可能な空間的配置に機能ドメインが置かれるようにＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質に付加される。
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質がｓｇＲＮＡ及び標的に結合すると、機能ドメインがその帰属機能で機能することが可能な空間的配置に機能ドメインが置かれるようにアダプタータンパク質に付加される。
ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの組成物を提供し、ここで、１つ以上の機能ドメインは、本明細書で考察するとおりのリンカー、任意選択でＧｌｙＳｅｒリンカーを介してＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質に付加される。
また、翻訳、安定性等に関わるものなど、内因性（調節性）制御エレメントを標的化することも好ましい。公知の制御エレメントのターゲティングを用いて目的の遺伝子を活性化又は抑制し得る。他方で推定制御エレメントのターゲティングは、かかるエレメントの確認手段（目的の遺伝子の翻訳を計測することによる）又は新規制御エレメントの検出手段として用いることができる（。加えて、推定制御エレメントのターゲティングは、疾患の遺伝的原因を解明することに関連して有用であり得る。疾患表現型に関連する多くの突然変異及び共通ＳＮＰ変異体が、コード領域外に位置する。他方で推定制御エレメントの標的化は、かかるエレメントの確認手段（目的の遺伝子の翻訳を計測することによる）又は新規制御エレメントの検出手段として用いることができる。加えて、推定制御エレメントの標的化は、疾患の遺伝的原因を解明することに関連して有用であり得る。疾患表現型に関連する多くの突然変異及び共通ＳＮＰ変異体が、コード領域外に位置する。本明細書に記載される活性化系又は抑制系のいずれかによるかかる領域の標的化は、その後に、ａ）推定標的（例えば、制御エレメントにごく近接して位置する遺伝子）の組、又はｂ）例えばＲＮＡｓｅｑ又はマイクロアレイによる全トランスクリプトーム読取りのいずれかの転写の読取りが続き得る。これにより、疾患表現型に関わると見込まれる候補遺伝子の同定が可能となり得る。かかる候補遺伝子は、新規薬物標的として有用であり得る。
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）阻害因子が本明細書において言及される。しかしながら、一部の実施形態における代替形態は、１つ以上の機能ドメインがアセチルトランスフェラーゼ、好ましくはヒストンアセチルトランスフェラーゼを含むものである。これらはエピゲノミクスの分野において、例えばエピゲノムの探索方法で有用である。エピゲノムの探索方法には、例えば、エピゲノム配列の標的化が含まれ得る。エピゲノム配列の標的化には、ガイドがエピゲノム標的配列に向けられることが含まれ得る。エピゲノム標的配列には、一部の実施形態において、プロモーター、サイレンサー又はエンハンサー配列が含まれ得る。
本明細書に記載されるとおりのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、好ましくはデッドＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、より好ましくはデッドＦｎＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質に連結した機能ドメインを用いることによるエピゲノム配列の標的化は、プロモーター、サイレンサー又はエンハンサーを活性化し又は抑制するために用いることができる。
アセチルトランスフェラーゼの例は公知であり、しかし、一部の実施形態ではヒストンアセチルトランスフェラーゼを含み得る。一部の実施形態において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼはヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００の触媒コアを含み得る（Ｇｅｒｂａｓｃｈ＆Ｒｅｄｄｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ６ｔｈ Ａｐｒｉｌ ２０１５）。
一部の好ましい実施形態では、機能ドメインがデッドＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質に連結され、プロモーター又はエンハンサーなどのエピゲノム配列を標的化及び活性化する。かかるプロモーター又はエンハンサーに向けられる１つ以上のガイドも提供されて、かかるプロモーター又はエンハンサーへのＣＲＩＳＰＲ酵素の結合を導き得る。
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ＤＮＡ／クロマチン構造の同時転写改変、ＲＮＡ依存性ＤＮＡメチル化又はＤＮＡ／クロマチンのＲＮＡ依存性サイレンシング／活性化に干渉することができる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡメチル化（ＲｄＤＭ）は、当初植物で発見されたエピジェネティック過程である。ＲｄＤＭの間、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が２１～２４ヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にプロセシングされ、相同ＤＮＡ遺伝子座のメチル化を誘導する。ＲＮＡ分子に加えて、アルゴノート、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クロマチンリモデリング複合体及び植物特異的ＰｏｌＩＶ及びＰｏｌＶなど、多量のタンパク質がＲｄＤＭの確立に関わる。これら全てが協調して機能し、シトシンの５’位にメチル基を付加する。低分子ＲＮＡはアルゴノート含有複合体を相補的な新生（非コード）ＲＮＡ転写物（ｔｒａｎｃｒｉｐｔ）にガイドすることによりクロマチン構造を改変し、転写をサイレンシングし得る。続いてヒストン及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含むクロマチン修飾複合体の動員が媒介される。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してかかる低分子ＲＮＡを標的化し、それらの低分子ＲＮＡと新生非コード転写物との間の相互作用に干渉し得る。
用語「会合している」は、ここで、機能ドメインとＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質との会合に関して用いられる。これは、例えば、アダプタータンパク質と機能ドメインとの間又はＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と機能ドメインとの間で、１つの分子がどのように別の分子と「会合」しているかに関して用いられる。かかるタンパク質間相互作用の場合、この会合は、抗体がエピトープを認識する方法における認識の観点で考えられ得る。代わりに、１つのタンパク質が別のタンパク質と、それら２つの融合物を介して会合し得、例えば１つのサブユニットが別のサブユニットに融合し得る。融合は、典型的には、例えば、各タンパク質又はサブユニットをコードするヌクレオチド配列を併せてスプライシングすることにより、一方のアミノ酸配列を他方のアミノ酸配列に加えることによって起こる。代わりに、これは、本質的に、融合タンパク質など、２つの分子間の結合又は直接的な連結と考えられ得る。いずれにしろ、融合タンパク質は２つの目的のサブユニット間（即ち酵素と機能ドメインとの間又はアダプタータンパク質と機能ドメインとの間）にリンカーを含み得る。従って、一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質は機能ドメインへの結合によってそれと会合している。他の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質は機能ドメインと、それらの２つが任意選択で中間リンカーを介して一体に融合されているため、会合している。リンカーの例としては、本明細書で考察されるＧｌｙＳｅｒリンカーが挙げられる。
飽和突然変異誘発
本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系は、例えば、遺伝子発現、薬剤耐性及び疾患の好転に必要な機能性エレメントの重要な最小限の特徴及び個別的な脆弱性を決定するための、細胞表現型と併せたゲノム遺伝子座における飽和又はディープスキャニング突然変異誘発の実施に用いることができる。飽和又はディープスキャニング突然変異誘発とは、ゲノム遺伝子座内であらゆる又は本質的にあらゆるＲＮＡ塩基が切断されることを意味する。Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質ガイドＲＮＡのライブラリが細胞集団に導入される。このライブラリは、各細胞がシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を受け取るように導入され得る。本明細書に記載されるとおり、ライブラリがウイルスベクターの形質導入によって導入される場合、低い感染多重度（ＭＯＩ）が用いられる。ライブラリは、ゲノム遺伝子座において（プロトスペーサー隣接モチーフ）（ＰＡＭ）配列の上流にある全ての配列を標的化するｓｇＲＮＡを含み得る。ライブラリは、ゲノム遺伝子座内の１０００塩基対毎にＰＡＭ配列の上流に少なくとも１００個の非重複ゲノム配列を含み得る。ライブラリは、少なくとも１つの異なるＰＡＭ配列の上流の配列を標的化するｓｇＲＮＡを含み得る。Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系は２つ以上のＣａｓ１３ｂタンパク質を含み得る。異なるＰＡＭ配列を認識するオルソログ又はエンジニアリングされたＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含め、本明細書に記載されるとおりの任意のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を用いることができる。ｓｇＲＮＡに関するオフターゲット部位の頻度は５００未満であり得る。オフターゲットスコアを作成して、最も低いオフターゲット部位のｓｇＲＮＡを選択し得る。単一の実験で同じ部位を標的化するｓｇＲＮＡを用いることにより、ｓｇＲＮＡ標的部位における切断に関連すると決定された任意の表現型を確認し得る。標的部位の検証は、本明細書に記載されるとおりの改変Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質及び目的のゲノム部位を標的化する２つのｓｇＲＮＡを用いることにより行い得る。理論によって拘束されないが、標的部位は、検証実験で表現型の変化が観察された場合に真のヒットである。
飽和又はディープスキャニング突然変異誘発のためにＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系を細胞集団で使用することができる。Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系は、限定はされないが哺乳類細胞及び植物細胞を含め、真核細胞で使用することができる。細胞集団は原核細胞であり得る。真核細胞集団は胚性幹（ＥＳ）細胞、神経細胞、上皮細胞、免疫細胞、内分泌細胞、筋細胞、赤血球、リンパ球、植物細胞又は酵母細胞の集団であり得る。
一態様において、本発明は、表現型の変化に関連する機能性エレメントのスクリーニング方法を提供する。Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含むように適合された細胞集団にライブラリを導入し得る。細胞を表現型に基づいて少なくとも２つの群に分類し得る。表現型は、遺伝子の発現、細胞成長又は細胞生存度であり得る。各群に存在するガイドＲＮＡの相対的表現を決定し、それによって表現型の変化に関連するゲノム部位を、各群に存在するガイドＲＮＡの表現によって決定する。表現型の変化は、目的の遺伝子の発現の変化であり得る。目的の遺伝子は上方制御されるか、下方制御されるか、又はノックアウトされ得る。細胞は高発現群と低発現群とに分類され得る。細胞集団は、表現型の決定に用いられるレポーター構築物を含み得る。レポーター構築物は検出可能なマーカーを含み得る。細胞は、検出可能なマーカーを用いることによって分類し得る。
別の態様において、本発明は、化学的化合物耐性に関連するゲノム部位のスクリーニング方法を提供する。化学的化合物は薬物又は農薬であり得る。Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含むように適合された細胞集団にライブラリを導入することができ、ここで、集団の各細胞は、１つ以下のガイドＲＮＡを含有し、細胞集団を化学的化合物で処理し、及び化学的化合物による処理後、早い時点と比較した遅い時点におけるガイドＲＮＡの表現を決定し、それによって化学的化合物耐性に関連するゲノム部位をガイドＲＮＡのエンリッチメントによって決定する。ｓｇＲＮＡの表現はディープシーケンシング方法によって決定し得る。
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体を利用する本発明の実施では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系で用いられる方法が有用であり、“ＢＣＬ１１Ａ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”という名称の論文が参照される。Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｈｅｒ，Ｆ．，Ｐｉｎｅｌｌｏ，Ｌ．，Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｃｈｕｐｐ，Ｐ．Ｇ．，Ｖｉｎｊａｍｕｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｓ．Ｐ．，Ｌｕｃ，Ｓ．，Ｋｕｒｉｔａ，Ｒ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．，Ｍａｅｄａ，Ｔ．，Ｙｕａｎ，Ｇ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｏｒｋｉｎ，Ｓ．Ｈ．，＆Ｂａｕｅｒ，Ｄ．Ｅ．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１５５２１，オンライン発行 Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １６，２０１５が参照され、この論文は本明細書において参照により援用され、且つ以下に簡単に考察する。
Ｃａｎｖｅｒ ｅｔ ａｌ．は、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）レベルに関連する且つそのマウスオルソログが赤血球ＢＣＬ１１Ａ発現に必要であるエンハンサーとして既に同定されたヒト及びマウスＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーのインサイチュ飽和突然変異誘発を実施するための新規プールＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ガイドＲＮＡライブラリについて包含している。この手法から、これらのエンハンサーの重要な最小限の特徴及び個別的な脆弱性が明らかになった。この著者らは、初代ヒト前駆細胞の編集及びマウストランスジェネシスを用いて、ＨｂＦ再誘導の標的としてのＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーを実証した。この著者らは、治療的ゲノム編集についての情報を与える詳細なエンハンサーマップを作成した。
Ｃａｓ１３ｂ系を用いて細胞又は生物を改変する方法
一部の実施形態における本発明は、細胞又は生物を改変する方法を包含する。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞は、哺乳類細胞であり得る。哺乳類細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類又はマウス細胞であり得る。細胞は、家禽、魚類又はエビなどの非哺乳類真核細胞であり得る。細胞は、植物細胞でもあり得る。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ又はコメなどの作物植物であり得る。植物細胞は、藻類、樹木又は野菜でもあり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生向上のため細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。
本系は、１つ以上の異なるベクターを含み得る。本発明のある態様において、エフェクタータンパク質は、所望の細胞型、優先的に真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞への感染能を有するウイルス粒子の形成に使用される。かかる細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞及びレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞又はＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞株を作製することにより作成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及び続く宿主中への組込みに必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるポリヌクレオチド用の発現カセットに置き換えられる。欠損ウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージング及び宿主ゲノム中への組込みに必要なＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、即ちｒｅｐ及びｃａｐをコードするもののＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株中にパッケージングされる。この細胞株もヘルパーとしてアデノウイルスに感染させ得る。ヘルパーウイルスはＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列がないため、大きい量でパッケージングされることはない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも高い感受性を有する熱処理によって低減することができる。核酸を細胞に送達する更なる方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００３００８７８１７号明細書を参照されたい。
一部の実施形態において、宿主細胞が本明細書に記載の１つ以上のベクターによって一過性に又は非一過性にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、それが対象において天然に存在するとおりにトランスフェクトされる。一部の実施形態において、トランスフェクトされる細胞は対象から採取される。一部の実施形態において、細胞は、細胞株など、対象から採取された細胞に由来する。組織培養向けの広範な細胞株が、当技術分野において公知である。細胞株の例としては、限定はされないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ－３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ－Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ－３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ－２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ－７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ－ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ－Ｋ２、ＷＥＨＩ－２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、ジャーカット、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ－１、ＢＣ－３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ－５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－６、ＣＯＳ－Ｍ６Ａ、ＢＳ－Ｃ－１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３スイス、３Ｔ３－Ｌ１、１３２－ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３－Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ－５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ－１細胞、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ－２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ－２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ－７、ＣＨＯ－ＩＲ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｋ２、ＣＨＯ－Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ－／－、ＣＯＲ－Ｌ２３、ＣＯＲ－Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ－Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ－Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ－７、ＣＯＶ－４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ－６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ－２９、ジャーカット、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ－Ｍｅｌ１－４８、ＭＣ－３８、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－１０Ａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ６、ＭＴＤ－１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＮＡＬＭ－１、ＮＷ－１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ－１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ－５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｓｆ－９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ－４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、ベロ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ－４９、Ｘ６３、ＹＡＣ－１、ＹＡＲ及びそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞株は、当業者に公知の種々の供給元から入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）を参照されたい）。一部の実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のベクターによってトランスフェクトされた細胞を使用して、１つ以上のベクター由来配列を含む新規の細胞株が樹立される。一部の実施形態において、本明細書に記載される核酸ターゲティング系の構成成分によって一過性にトランスフェクトされ（例えば、１つ以上のベクターの一過性のトランスフェクション又はＲＮＡによるトランスフェクションによる）、且つ核酸ターゲティング複合体の活性を通して改変された細胞を使用して、改変は含むものの他のあらゆる外因性配列を欠く細胞を含む新規の細胞株が樹立される。一部の実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のベクターによって一過性に又は非一過性にトランスフェクトされた細胞又はかかる細胞から誘導される細胞株が、１つ以上の試験化合物の評価において使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のベクターを用いて非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物が作製される。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、マウス、ラット又はウサギなどの哺乳動物である。特定の実施形態において、生物又は対象は植物である。特定の実施形態において、生物又は対象又は植物は藻類である。トランスジェニック植物及び動物の作製方法は、当該技術分野において公知であり、一般には、本明細書に記載されるものなど、細胞トランスフェクション方法から始まる。
一態様において、本発明は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドの改変方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変することを含み、ここで、核酸ターゲティング複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。
一態様において、本発明は、真核細胞内のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体をポリヌクレオチドに結合させて、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現の増加又は減少を生じさせることを含み、ここで、核酸ターゲティング複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体は、植物で使用することができる
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系（例えば、単一の又は多重化した）は、作物ゲノミクスにおける近年の進歩と併せて用いることができる。本明細書に記載される系を使用して、効率的で且つ対費用効果の高い植物遺伝子又はゲノムの探索又は編集又は操作を － 例えば、植物遺伝子又はゲノムの迅速な調査及び／又は選択及び／又は探索及び／又は比較及び／又は操作及び／又は形質転換のため、実施することができ、例えば、形質又は特徴を作出するか、同定するか、開発するか、最適化するか、又は植物に付与するか、又は植物ゲノムを形質転換することができる。従って、植物の生産の向上、新規組み合わせの形質又は特徴を有する新規植物又は形質が増強された新規植物があり得る。Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系は、植物に関して、部位特異的組込み（ＳＤＩ）又は遺伝子編集（ＧＥ）又は任意の準逆育種（ＮＲＢ）又は逆育種（ＲＢ）技術において使用することができる。本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系を利用する態様は、植物におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）系の使用と同様であり得、アリゾナ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ）ウェブサイト「ＣＲＩＳＰＲ－ＰＬＡＮＴ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｒｉｚｏｎａ．ｅｄｕ／ｃｒｉｓｐｒ／）（後援Ｐｅｎｎ Ｓｔａｔｅ及びＡＧＩ）が挙げられる。本発明の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔｓ）は、植物におけるゲノム編集で、又はＲＮＡｉ若しくは同様のゲノム編集技法が既に用いられているところで用いることができる。例えば、Ｎｅｋｒａｓｏｖ，“Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｍａｄｅ ｅａｓｙ：ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３，９：３９（ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４６－４８１１－９－３９）；Ｂｒｏｏｋｓ，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４ ｐｐ １１４．２４７５７７；Ｓｈａｎ，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，６８６－６８８（２０１３）；Ｆｅｎｇ，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）２３：１２２９－１２３２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１３．１１４；オンライン発行 ２０ Ａｕｇｕｓｔ ２０１３；Ｘｉｅ，“ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３ Ｎｏｖ；６（６）：１９７５－８３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｐ／ｓｓｔ１１９．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ １７；Ｘｕ，“Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｒｉｃｅ”，Ｒｉｃｅ ２０１４，７：５（２０１４）、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ＳＮＰｓ ｆｏｒ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ ｗｏｏｄｙ ｐｅｒｅｎｎｉａｌ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｒｅｖｅａｌｓ ４－ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ ｌｉｇａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ”，Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ（２０１５）（Ｆｏｒｕｍ）１－４（ｗｗｗ．ｎｅｗｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ．ｃｏｍにおいてオンラインでのみ入手可能）；Ｃａｌｉａｎｄｏ ｅｔ ａｌ，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＤＮＡ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｖｉｃｅ ｓｔａｂｌｙ ｃａｒｒｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｇｅｎｏｍｅ”，ＮＡＴＵＲＥ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ ６：６９８９，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９，ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９；米国特許第６，６０３，０６１号明細書 － Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ；米国特許第７，８６８，１４９号明細書 － Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ及び米国特許出願公開第２００９／０１００５３６号明細書 － Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｔｒａｉｔｓ（これらの各々の内容及び開示は、全て本明細書において全体として参照により援用される）を参照されたい。本発明の実施では、Ｍｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ“Ｃｒｏｐ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ｄｅｃ ２９；１３（２）：８５－９６の内容及び開示；その各々が、本明細書における実施形態が植物に関してどのように用いられ得るかに関してを含め、参照により本明細書に援用される。従って、本明細書において動物細胞への言及は、特に明らかでない限り、適宜修正して植物細胞にも適用し得、及びオフターゲット効果が低下した本明細書における酵素及びかかる酵素を利用する系は、本明細書に記載するものを含め、植物適用（ａｐｐｌｃｉａｔｉｏｎｓ）に用いることができる。
Ｓｕｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４ Ｍａｒ；５５（３）：４７５－８１．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｃｐ／ｐｃｕ０１４．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｊａｎ １８）は、陸上植物進化の研究向けのモデル種として浮上しているゼニゴケのマルカンティア・ポリモルファ・Ｌ．（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ Ｌ．）における標的突然変異誘発へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の適用を報告している。Ｍ．ポリモルファ（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のＵ６プロモーターが同定及びクローニングされ、ｇＲＮＡが発現された。ｇＲＮＡの標的配列は、Ｍ．ポリモルファ（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のオーキシン応答因子１（ＡＲＦ１）をコードする遺伝子を破壊するように設計された。Ｓｕｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換を用いてＭ．ポリモルファ（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の配偶体世代における安定突然変異体を単離した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースのインビボ部位特異的突然変異誘発が、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ又はＭ．ポリモルファ（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＥＦ１αのいずれかのプロモーターを用いてＣａｓ９を発現させることにより達成された。オーキシン耐性表現型を示す単離された突然変異個体はキメラではなかった。更に、Ｔ１植物の無性生殖によって安定突然変異体が産生された。ＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓ９ベースの標的突然変異誘発を用いて複数のａｒｆ１対立遺伝子が容易に構築された。本発明のＣａｓ１３ｂ系を使用して同じ並びに他の遺伝子を調節することができ、ＲＮＡｉ及びｓｉＲＮＡなどの発現制御系（ｓｙｓｔｅｓｍ）と同様に、本発明の方法は誘導可能且つ可逆である。
Ｋａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｏｃｔ ２９；４２（１９）：ｅ１４７．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ７４９．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ａｕｇ １３）は、好都合なゴールデンゲートクローニング方法によってベクターに取り込まれた独立したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからＣａｓ９変異体、レポーター遺伝子及び最大４つのｓｇＲＮＡを発現する単一レンチウイルス系を開発した。各ｓｇＲＮＡが効率的に発現しており、不死化及び初代ヒト細胞において多重遺伝子編集及び持続的な転写活性化を媒介することができる。本発明を使用してＫａｂａｄｉの植物遺伝子を調節することができる。
Ｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１４，１４：３２７）は、ｐＧｒｅｅｎ又はｐＣＡＭＢＩＡ骨格並びにｇＲＮＡをベースとしてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９バイナリーベクターセットを開発した。このツールキットは、ＢｓａＩの他には制限酵素を必要とすることなしに、トウモロコシコドン最適化Ｃａｓ９及び１つ以上のｇＲＮＡを有する最終構築物を僅か１回のクローニングステップで効率良く生成する。このツールキットはトウモロコシプロトプラスト、トランスジェニックトウモロコシ株及びトランスジェニックアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）株を用いて実証され、高い効率及び特異性を呈することが示された。更に重要なことには、このツールキットを使用して、Ｔ１世代のトランスジェニック実生で３つのアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子の標的突然変異が検出された。更に、複数の遺伝子突然変異を次世代に受け継ぐことができた。植物における多重ゲノム編集用のツールキットとして、（ガイドＲＮＡ）モジュールベクターセット。本発明のＣａｓ１３ｂ系及びタンパク質を使用して、Ｘｉｎｇが標的とする遺伝子を標的化し得る。
本発明のＣａｓ１３ｂ ＣＲＩＳＰＲ系は、植物ウイルスの検出に使用し得る。Ｇａｍｂｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２００６ Ｎｏｖ；９６（１１）：１２２３－９．ｄｏｉ：１０．１０９４／ＰＨＹＴＯ－９６－１２２３）は増幅及びマルチプレックスＰＣＲに依存して９つのブドウウイルスを同時検出する。本発明のＣａｓ１３ｂ系及びタンパク質を同様に使用して、宿主における複数の標的を検出し得る。更に、本発明の系を使用して高価値な栽培品種におけるウイルス遺伝子発現を同時にノックダウンし、且つ発現したウイルスＲＮＡ（ｖｉａｌ ＲＮＡ）のターゲティングにより活性化又は更なる感染を防ぐことができる。
Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ． ２０１３ Ｊｕｎ ２６；２８０（１７６５）：２０１３０９６５． ｄｏｉ： １０．１０９８／ｒｓｐｂ．２０１３．０９６５；２０１３年８月２２日発表）は１２の植物ＲＮＡウイルスを分析して進化速度を調べ、恐らく異なる宿主遺伝子型間又は種間でのシフトに起因する一時的選択のエビデンスを見出した。本発明のＣａｓ１３ｂ系及びタンパク質を使用して宿主におけるかかるウイルスを標的化するか、又はそれに対して免疫を付与し得る。例えば、本発明の系を使用して、ウイルスＲＮＡ発現、従って複製を遮断することができる。また、本発明を使用して切断のため核酸（ｎｕｃｌｉｃ ａｃｉｄｓ）を標的化し、且つ発現又は活性化を標的化することもできる。更に、本発明の系は多重化することができ、そのため同じウイルスの複数の標的又は複数の分離株に当てることができる。
Ｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１５ Ａｕｇ ３；８（８）：１２７４－８４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｐ．２０１５．０４．００７）は、単子葉及び双子葉植物における簡便で高効率な多重ゲノム編集のための、植物コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子を利用したロバストなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクター系を報告している。Ｍａ ｅｔ ａｌ．は、複数のｓｇＲＮＡ発現カセットを迅速に作成するためのＰＣＲベースの手順を設計しており、これはゴールデンゲートライゲーション又はギブソンアセンブリにより１ラウンドのクローニングでバイナリーＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクターにアセンブルすることができる。この系で、Ｍａ ｅｔ ａｌ．はコメの４６ヵ所の標的部位を編集し、平均８５．４％の突然変異率で、ほとんどが二アレル及びホモ接合状態であった。Ｍａ ｅｔ ａｌ．は、遺伝子ファミリーの複数の（最大８個の）メンバー、生合成経路の複数の遺伝子又は単一遺伝子内の複数の部位を同時に標的化することにより、Ｔ０コメ及びＴ１アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の機能喪失型遺伝子突然変異の例を提供している。同様に、本発明のＣａｓ１３ｂ系は複数の遺伝子の発現を同時に差次的に（ｄｆｆｉｅｉｃｎｅｌｔｙ）標的化することができる。
Ｌｏｗｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１５ Ａｕｇ ２１．ｐｉｉ：ｐｐ．００６３６．２０１５）も植物における発現した、サイレンシングされた又は非コードの遺伝子の多重ゲノム編集及び転写調節を可能にするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ツールボックスを開発した。このツールボックスは、ゴールデンゲート及びゲートウェイクローニング方法を用いて単子葉類及び双子葉類のための機能性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｔ－ＤＮＡ構築物を迅速且つ効率的にアセンブルするためのプロトコル及び試薬を研究者に提供する。これは、植物内因性遺伝子の多重遺伝子編集及び転写活性化又は抑制を含め、完全な一揃いの能力を備えている。Ｔ－ＤＮＡベースの形質転換技術は、現代の植物バイオテクノロジー、遺伝学、分子生物学及び生理学の基礎である。そのため、本発明者らは、Ｃａｓ９（ＷＴ、ニッカーゼ又はｄＣａｓ９）及びｇＲＮＡを目的のデスティネーションＴ－ＤＮＡベクターにアセンブルする方法を開発した。このアセンブル方法は、ゴールデンゲートアセンブリ及びマルチサイトゲートウェイ組換えの両方に基づく。アセンブリには３つのモジュールが必要である。第１のモジュールはＣａｓ９エントリーベクターであり、これは、ａｔｔＬ１及びａｔｔＲ５部位が隣接したプロモーターレスＣａｓ９又はその誘導遺伝子を含有する。第２のモジュールはｇＲＮＡエントリーベクターであり、これは、ａｔｔＬ５及びａｔｔＬ２部位が隣接したエントリーｇＲＮＡ発現カセットを含有する。第３のモジュールは、Ｃａｓ９発現用に選択されたプロモーターを提供するａｔｔＲ１－ａｔｔＲ２含有デスティネーションＴ－ＤＮＡベクターを含む。Ｌｏｗｄｅｒ ｅｔ ａｌ．のツールボックスは、本発明のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系に適用し得る。
酵母及び微細藻類などの生物は、合成生物学に広く用いられている。Ｓｔｏｖｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．，２０１５；２：１３は、工業生産用のロバストな株を効率的に作製するための工業用酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のゲノム編集について記載している。Ｓｔｏｖｉｃｅｋは、酵母にコドン最適化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を使用して内因性遺伝子の両方のアレルを同時に破壊し、異種遺伝子をノックインした。ゲノム又はエピソーム２μ系ベクター位置からＣａｓ９及びｇＲＮＡを発現させた。この著者らは、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ発現レベルを最適化することにより遺伝子破壊効率を改善できたことも示した。Ｈｌａｖｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２０１５）は、挿入突然変異誘発及びスクリーニングのため核及び葉緑体遺伝子を標的化するＣＲＩＳＰＲなどの技法を用いた微細藻類の種又は株の開発を考察している。本発明のＣａｓ１３ｂ系に同じプラスミド及びベクターを適用することができる。
Ｐｅｔｅｒｓｅｎ（“Ｔｏｗａｒｄｓ ｐｒｅｃｉｓｅｌｙ ｇｌｙｃｏｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｌａｎｔｓ”，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｄｅｎｍａｒｋ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ２０１５，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）は、所望の翻訳後修飾を有するタンパク質及び産物の産生のため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるゲノム変化をエンジニアリングする方法、例えばアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）を糖鎖エンジニアリングする方法を開発した。Ｈｅｂｅｌｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．２０１５ Ａｐｒ ２３；６：２４７）は、デンプン修飾酵素を発現し、且つ通常はデンプンを工業的に化学処理及び／又は物理処理することによって作られる生産物を直接産生する作物を提供するインプランタでのデンプンバイオエンジニアリングを概説している。Ｐｅｔｅｒｓｅｎ及びＨｅｂｅｌｓｔｒｕｐの方法は、本発明のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系に適用し得る。
Ｋｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ；８６（１１）：６００２－９．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００４３６－１２．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｍａｒ ２１）は、ゲノムの遺伝的改変なしにブドウに所望の形質を導入するためのＲＮＡウイルスベースのベクターを開発した。このベクターは、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシングによって内因性遺伝子の発現を調節する能力をもたらした。本発明のＣａｓ１３ｂ系及びタンパク質を使用して、ゲノムの遺伝的改変なしに遺伝子及びタンパク質をサイレンシングすることができる。
ある実施形態において、植物はマメ科植物であり得る。本発明は、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰ－Ｃａｓ系を利用して、例えば、限定なしに、ダイズ、エンドウマメ及びピーナッツを調査及び改変し得る。Ｃｕｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．がマメ科植物機能ゲノミクス用のツールボックスを提供している（Ｃｕｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｌｅｇｕｍｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ＸＸＩＩ ２０１４を参照されたい）。ＣｕｒｔｉｎはＣＲＩＳＰＲの遺伝子形質転換を用いて単一コピーをノックアウト／ノックダウンし、毛状根及び全植物系の両方でマメ科植物遺伝子を複製した。標的遺伝子のうちのあるものは、ノックアウト／ノックダウン系（例えば、フィトエンデサチュラーゼ）の特徴を調査し及び最適化するために選択される一方、別のものは、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ダイサー様遺伝子とのダイズ相同性によるか、又はウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）における根粒形成のゲノムワイド関連分析によって同定された。本発明のＣａｓ１３ｂ系及びタンパク質をノックアウト／ノックダウン系に使用することができる。
ピーナッツアレルギー及び一般にマメ科植物に対するアレルギーは、実在する重大な健康問題である。本発明のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系を使用して、かかるマメ科植物のアレルゲンタンパク質をコードする遺伝子を同定し、次にそれを編集し又はサイレンシングすることができる。かかる遺伝子及びタンパク質に関して限定なしに、Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．が、ピーナッツ、ダイズ、レンズマメ、エンドウマメ、ルピナス、サヤマメ及びヤエナリのアレルゲンタンパク質を同定している。Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１１（３）：２２２）を参照されたい。
有利な実施形態において、植物は樹木であり得る。本発明は、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を草本系にも利用し得る（例えば、Ｂｅｌｈａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：３９及びＨａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２８：１８５９－１８７２を参照されたい）。特に有利な実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系は樹木における一塩基変異多型（ＳＮＰ）を標的化し得る（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０８，Ｉｓｓｕｅ ２，ｐａｇｅｓ ２９８－３０１，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５を参照されたい）。Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．の研究では、著者らは事例研究として４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）遺伝子ファミリーを用いて木本多年生ポプルス属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）でＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を適用し、標的化した２つの４ＣＬ遺伝子について１００％の突然変異効率を達成しており、ここで、調べた形質転換体は、全て二対立遺伝子改変を有していた。Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．の研究では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は一塩基変異多型（ＳＮＰ）に対する感受性が極めて高く、標的配列中のＳＮＰに起因して３番目の４ＣＬ遺伝子の切断が無効になった。これらの方法は、本発明のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系に適用し得る。
Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０８，Ｉｓｓｕｅ ２，ｐａｇｅｓ ２９８－３０１，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５）の方法は、以下のとおり本発明に適用し得る。それぞれリグニン及びフラボノイド生合成に関連する２つの４ＣＬ遺伝子、４ＣＬ１及び４ＣＬ２が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集の標的とされる。ルーチンで形質転換に用いられるポプルス・トレムラ×アルバクローン（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ ｘ ａｌｂａ ｃｌｏｎｅ）７１７－１Ｂ４は、ゲノムシーケンシングされたポプルス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）からの分岐である。従って、参照ゲノムから設計された４ＣＬ１及び４ＣＬ２ ｇＲＮＡをインハウスの７１７ ＲＮＡ－Ｓｅｑデータで調べることにより、Ｃａｓ効率を制限し得るＳＮＰがないことを確認する。４ＣＬ５用に設計された、４Ｌ１のゲノムデュプリケートである第３のｇＲＮＡも含める。対応する７１７配列は各対立遺伝子のＰＡＭの近傍／その内部に１つのＳＮＰを有し、これらの両方は、４ＣＬ５－ｇＲＮＡによるターゲティングを無効にするものと思われる。３つ全てのｇＲＮＡ標的部位が第１のエクソン内に位置する。７１７形質転換について、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）Ｕ６．６プロモーターからｇＲＮＡが、バイナリーベクター中でＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下にあるコドン最適化ヒトＣａｓと共に発現する。Ｃａｓのみのベクターによる形質転換が対照としての役割を果たし得る。無作為に選択した４ＣＬ１及び４ＣＬ２株をアンプリコンシーケンシングに供する。次に、データを処理し、全ての場合において二対立遺伝子突然変異を確認する。これらの方法は、本発明のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系に適用し得る。
植物では、病原体は多くの場合に宿主特異的である。例えば、フザリウム・オキシスポラム・ｆ・エスピー・リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）はトマト萎凋病を引き起こすが、攻撃するのはトマトのみであり、Ｆ．オキシスポラム・ｆ・ジアンチ（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｄｉａｎｔｈｉｉ）、プクシニア・グラミニス・ｆ・エスピー・トリチシ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ）はコムギのみを攻撃する。植物は既存の誘導防御を有して多くの病原体に抵抗する。特に病原体が植物より高い頻度で複製することに伴い、植物世代間での突然変異及び組換えイベントが、感受性を生じさせる遺伝的変異性をもたらす。植物には非宿主抵抗性が存在することもあり、例えばその宿主と病原体とが適合しない。また、水平抵抗性、例えば典型的には多くの遺伝子によって制御される、あらゆる病原体系統に対する部分抵抗性及び垂直抵抗性、例えば典型的には数個の遺伝子によって制御される、他の系統に対しては存在しない、一部の病原体系統に対する完全抵抗性も存在し得る。遺伝子対遺伝子レベルでは、植物と病原体とは共に進化し、一方の遺伝的変化が他方の変化と均衡する。従って、育種家は自然変異性を用いて、収穫量、品質、均一性、耐寒性、抵抗性に関して最も有用な遺伝子をかけ合わせる。抵抗性遺伝子の供給源には、天然又は外来品種、在来品種、野生植物の近縁種及び誘発突然変異（例えば、突然変異誘発物質による植物材料の処理）が含まれる。本発明を用いることで、突然変異を誘発する新規の手段が植物育種家に提供される。従って、当業者は抵抗性遺伝子の供給源のゲノムを分析し、且つ所望の特性又は形質を有する品種において本発明を用いることにより、これまでの突然変異誘発物質より高い精度で抵抗性遺伝子の産生を誘発し、従って植物育種プログラムを加速及び改善することができる。
本明細書及び上記で他に考察される植物に加えて、提供されるとおりの、エフェクタータンパク質及び好適なガイドによって改変されたエンジニアリング植物及びその子孫。これには、コムギ、オオムギ、コメ、ダイズ又はトウモロコシなど、病害又は干ばつ耐性作物；自家授粉能力を取り除き又は低下させるように改変された（しかし、代わりに、任意選択で、代わりに雑種形成する）植物；及びエフェクタータンパク質及び好適なガイドによるターゲティングによって免疫原性タンパク質が無効になった、破壊された、又は断たれたピーナッツ及び堅果などのアレルギー誘発性食品が含まれる。
治療処置
本発明の系は、本願がこの系を情報に基づいてエンジニアリングするための基礎を提供するため、本開示から、過度の実験を行うことなく、治療、アッセイ及び他の適用を含めた旧ＲＮＡ切断技術の領域において適用することができる。本発明は、ＲＮＡの過剰発現、毒性ＲＮＡ及び／又は突然変異したＲＮＡ（例えば、スプライシング欠損又はトランケーションなど）によって引き起こされる疾患の治療処置を提供する。毒性ＲＮＡの発現は、核封入体の形成及び脳、心臓又は骨格筋における遅発性変性変化に関連し得る。最もよく研究された例、筋強直性ジストロフィーでは、毒性ＲＮＡの主要な病原性効果は、結合タンパク質を隔離し、且つ選択的スプライシングの調節を損なうことと見られる（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（２００６）１５（ｓｕｐｐｌ ２）：Ｒ１６２－Ｒ１６９）。筋強直性ジストロフィー［筋緊張性異栄養症（ＤＭ）］は、極めて幅広い臨床的特徴を生じるため、遺伝学者にとって特に興味深い。一部を挙げれば、筋肉の消耗、白内障、インスリン抵抗性、精巣萎縮、心伝導の減速、皮膚腫瘍及び認知への効果であろう。現在ＤＭ１型（ＤＭ１）と呼ばれている古典的形態のＤＭは、細胞質タンパク質キナーゼをコードする遺伝子ＤＭＰＫの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるＣＴＧリピートの伸長によって引き起こされる。
以下の表は、ＤＭ１骨格筋、心臓又は脳に選択的スプライシングの誤調節があることが示されているエクソンのリストを提示する。
Figure 2023052236000003
Figure 2023052236000004
本発明の酵素は、過剰発現ＲＮＡ又は毒性ＲＮＡ、例えばＤＭＰＫ遺伝子など、又は例えば上記の表にある、ＤＭ１骨格筋、心臓又は脳における誤調節された選択的スプライシングのいずれかを標的化し得る。
本発明の酵素は、以下の表に示されるとおりの疾患を引き起こすＲＮＡ依存的機能に影響を及ぼすトランス作用性突然変異も標的化し得る（Ｃｅｌｌ．２００９ Ｆｅｂ ２０；１３６（４）：７７７－７９３に要約されている）。
Figure 2023052236000005
Figure 2023052236000006
本発明の酵素は、原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）／神経原線維変化優位型老年性認知症（ＡＤと同様のＮＦＴを伴うがプラークがない）、ボクサー痴呆（慢性外傷性脳症）、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、１７番染色体に連鎖する前頭側頭型認知症及びパーキンソニズム、リティコ－ボディグ病（グアム島パーキンソン認知症複合）、神経節膠腫及び神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎並びに鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病及びリポフスチン沈着症、アルツハイマー病など、原発性及び二次性タウオパチーを含め、様々なタウオパチーの治療においても使用し得る。本発明の酵素は、スプライシング欠損及び疾患を引き起こす、シス作用スプライシングコードを破壊する突然変異も標的とし得る（Ｃｅｌｌ．２００９ Ｆｅｂ ２０；１３６（４）：７７７－７９３に要約されている）。運動ニューロン変性疾患ＳＭＡはＳＭＮ１遺伝子の欠失によって起こる。残るＳＭＮ２遺伝子はエクソン７にＣ→Ｔ置換を有し、これがエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）を不活性化してエクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）を作り出し、エクソン７のスキッピング及びトランケート型タンパク質（ＳＭＮΔ７）につながる。同時にジストロフィン遺伝子のエクソン３１におけるＴ→Ａ置換が未熟終止コドン（ＳＴＯＰ）及びＥＳＳを作り出し、エクソン３１のスキッピングにつながる。エクソン３１が欠損したｍＲＮＡは部分的に機能性のタンパク質を産生するため、この突然変異は軽症型のＤＭＤを引き起こす。タウタンパク質をコードするＭＡＰＴ遺伝子のエクソン１０の範囲内及び下流における突然変異はスプライシング調節エレメントに影響を及ぼし、エクソン１０をインクルージョン又はエクスクルージョンするｍＲＮＡの正常な１：１比を破綻させる。この結果、４つ又は３つのいずれかの微小管結合ドメインを含有するタウタンパク質（それぞれ４Ｒタウ及び３Ｒタウ）の間の均衡が乱れ、神経病理学的障害ＦＴＤＰ－１７が引き起こされる。示される例はＮ２７９Ｋ突然変異であり、これはＥＳＥ機能を亢進させて、エクソン１０のインクルージョン及び４Ｒタウが増加する方への均衡のシフトを促進する。ＣＦＴＲ遺伝子エクソン９の３’スプライス部位内における多型（ＵＧ）ｍ（Ｕ）ｎトラクトはエクソン９インクルージョンの程度及び完全長機能タンパク質のレベルに影響を与え、ＣＦＴＲ遺伝子の他の部分の突然変異によって引き起こされる嚢胞性線維症（ＣＦ）の重症度を改変する。
自然免疫系は、主に感染細胞内部のウイルス核酸を認識することによりウイルス感染を検出し、これはＤＮＡ又はＲＮＡセンシングと称される。インビトロＲＮＡセンシングアッセイを用いると、特異的ＲＮＡ基質を検出することができる。例えば、生細胞におけるＲＮＡベースのセンシングにＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用することができる。適用の例は、例えば、疾患特異的ＲＮＡのセンシングによる診断法である。
本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、抗ウイルス活性、詳細にはＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性に更に使用することができる。選択のウイルスＲＮＡ配列に選択的な好適なガイドＲＮＡを使用してエフェクタータンパク質をウイルスＲＮＡに標的化することができる。詳細には、エフェクタータンパク質は、一本鎖ＲＮＡなどのＲＮＡを切断する活性ヌクレアーゼであり得る。従って、抗ウイルス剤としての本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用が提供される。
ＲＮＡ、上記で言及したＲＮＡを標的化するための本発明の酵素系の治療投薬量は、約０．１～約２ｍｇ／ｋｇであることが企図され、これらの投薬量は、応答をモニタしながら、必要に応じて繰り返しの投薬量で患者１人当たり約７～１０用量まで逐次的に投与され得る。有利には、治療レジメン中に各患者から試料が採取され、治療の有効性が確認される。例えば、ＲＮＡ試料は分離及び定量化され、発現が低下しているか、又は改善しているかどうかが判断され得る。かかる診断法は当業者の範囲内にある。
転写物検出方法
本発明のエフェクタータンパク質及び系は、細胞又は他の試料中のＲＮＡの特異的検出に有用である。目的のＲＮＡ標的の存在下では、ガイド依存性Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼ活性に、コラテラル標的に対する非特異的ＲＮアーゼ活性が付随し得る。このＲＮアーゼ活性を利用するには、検出可能に切断されることのできるレポーター基質があれば十分である。例えば、レポーター分子は、一端に蛍光レポーター分子（ｆｌｕｏｒ）及び他端に消光剤のタグを付加したＲＮＡを含み得る。Ｃａｓ１３ｂ ＲＮアーゼ活性が存在しない場合、消光剤が物理的に近接しているため、ｆｌｕｏｒからの蛍光は低レベルに抑えられる。目的のＲＮＡ標的及び好適なガイドＲＮＡの存在によってＣａｓ１３ｂの標的特異的切断が活性化されると、ＲＮＡ含有レポーター分子は非特異的に切断され、ｆｌｕｏｒと消光剤とが空間的に分離される。これにより、適切な波長の光で励起したとき、ｆｌｕｏｒが検出可能シグナルを発する。
ある態様において、本発明は、ＲＮＡターゲティングエフェクター；対応するＲＮＡ標的に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ；及びＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物を含む（標的）ＲＮＡ検出系に関する。別の態様において、本発明は、試料中の（標的）ＲＮＡの検出方法に関し、この方法は、ＲＮＡターゲティングエフェクター、前記（標的）ＲＮＡに結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ及びＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物を前記試料に加えることを含む。更なる態様において、本発明は、本明細書に定義するとおりの（標的）ＲＮＡ検出系を含むキット又は装置又は少なくともＲＮＡターゲティングエフェクターとＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物とを含むキット又は装置に関する。更なる態様において、本発明は、（標的）ＲＮＡ検出のための本明細書に定義するとおりのＲＮＡターゲティング系又はキット又は装置の使用に関する。ＲＮＡターゲティングエフェクターは、特定の実施形態では、ＲＮＡガイド下ＲＮアーゼである。特定の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクターはＣＲＩＳＰＲエフェクターである。特定の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクターはクラス２ ＣＲＩＳＰＲエフェクターである。特定の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクターはクラス２ ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲエフェクターである。好ましい実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクターはＣａｓ１３ｂである。特定の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクター、好ましくはＣａｓ１３ｂは、本明細書において他の部分に記載されるとおりの種に由来する。本明細書に記載されるとおりの前記（標的）ＲＮＡに結合するように設計されたガイドＲＮＡはＲＮＡターゲティングエフェクターと複合体を形成可能であり、及び前記複合体中のガイドＲＮＡは標的ＲＮＡ分子に結合可能であり、同様に本明細書の他の部分に記載されるとおり、それにより標的ＲＮＡが切断されることが理解されるであろう。ガイドＲＮＡは、典型的には、本明細書において他の部分に記載されるとおり、ガイド配列及びダイレクトリピートを含むことが理解されるであろう。特定の実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡは、疾患状態の診断指標となる１つ以上の標的分子に結合するように設計される。特定の実施形態において、疾患状態は、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫感染症など、感染症である。特定の実施形態において、疾患状態は異常な（標的）ＲＮＡ発現によって特徴付けられる。特定の実施形態において、疾患状態は癌である。特定の実施形態において、疾患状態は自己免疫疾患である。ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物はＲＮＡを含み、ＲＮＡが切断されると検出可能なリードアウトが生じ、即ちＲＮＡの切断時に検出可能シグナルが生成される。特定の実施形態において、ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物は蛍光色素及び消光剤を含む。当業者は、種々のタイプの蛍光色素及び対応する消光剤が使用され得ることを理解するであろう。当業者は、本ＲＮＡ切断レポーター構築物での使用に適し得る他のタイプの誘導可能レポーター系を容易に想定するであろう。
１つの例示的アッセイ方法では、Ｃａｓ１３ｂエフェクター、目的の標的に特異的なガイドＲＮＡ及びレポーター分子が細胞試料に加えられる。蛍光の増加が目的のＲＮＡ標的の存在を示す。別の例示的な方法では、検出アレイが提供される。アレイ上の各位置にＣａｓ１３ｂエフェクター、レポーター分子及び目的の標的に特異的なガイドＲＮＡが提供される。実施するアッセイに応じて、アレイの各位置における目的の標的に特異的なガイドＲＮＡは同じであるか、異なるか、又はこれらの組み合わせであり得る。例えば、単一の供給源試料中にある１つ以上の標的を試験することが所望される場合、目的の標的に特異的なガイドＲＮＡは異なるものが提供され得る。例えば、同じ標的に関して複数の試料を試験することが所望される場合、目的の標的に特異的なガイドＲＮＡは各位置に同じものが提供され得る。
本明細書で使用されるとき、「マスキング構築物」は、本明細書に記載される活性化ＣＲＩＳＰＲ系エフェクタータンパク質によって切断されるか、又は他の方法で不活性化されることのできる分子を指す。特定の例示的実施形態において、マスキング構築物はＲＮＡベースのマスキング構築物である。マスキング構築物は正の検出可能シグナルの生成又は検出を防ぐ。正の検出可能シグナルは、当該技術分野において公知の光学、蛍光、化学発光、電気化学又は他の検出方法を用いて検出し得る任意のシグナルであり得る。マスキング構築物は、マスキング構築物が除去されるか、又は他の方法でサイレンシングされるまで、検出可能な正のシグナルの生成を防ぐか、又はその存在をマスキングし得る。用語「正の検出可能シグナル」は、マスキング構築物の存在下で検出可能であり得る他の検出可能シグナルと区別するために使用される。例えば、特定の実施形態において、マスキング剤が存在するとき、第１のシグナルが検出され得（即ち負の検出可能シグナル）、これは、次に、活性化ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質による標的分子の検出並びにマスキング剤の切断又は不活性化に伴い第２のシグナル（例えば、正の検出可能シグナル）に変換される。
特定の例示的実施形態において、マスキング構築物は遺伝子産物の生成を抑制し得る。遺伝子産物は、試料に加えられるレポーター構築物によってコードされ得る。マスキング構築物は、ｓｈＲＨＮ又はｓｉＲＮＡなど、ＲＮＡ干渉経路に関わる干渉性ＲＮＡであり得る。マスキング構築物は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）も含み得る。存在する間は、マスキング構築物は遺伝子産物の発現を抑制する。遺伝子産物は、マスキング構築物の存在がなければ本来標識プローブ又は抗体によって検出可能であろう蛍光タンパク質又は他のＲＮＡ転写物若しくはタンパク質であり得る。エフェクタータンパク質の活性化に伴いマスキング構築物が切断されるか、又は他の方法でサイレンシングされて、正の検出可能シグナルとしての遺伝子産物の発現及び検出が可能となる。
特定の例示的実施形態において、マスキング構築物は、検出可能な正のシグナルを生成するのに必要な１つ以上の試薬を隔離し得、従ってマスキング構築物から１つ以上の試薬が放出されると、検出可能な正のシグナルが生成されることになる。１つ以上の試薬を組み合わせて比色シグナル、化学発光シグナル、蛍光シグナル又は任意の他の検出可能シグナルを生じさせ得、かかる目的に好適であることが公知の任意の試薬を含み得る。特定の例示的実施形態において、１つ以上の試薬は、１つ以上の試薬に結合するＲＮＡアプタマーによって隔離される。１つ以上の試薬は、標的分子の検出に伴いエフェクタータンパク質が活性化されると放出される。特定の例示的実施形態において、１つ以上の試薬は、１つ以上のＲＮＡアプタマーをタンパク質に結合させることによってタンパク質が検出可能シグナルを生成できないように阻害又は隔離される検出可能シグナル、例えば比色、化学発光又は蛍光シグナルなどの生成を促進可能な酵素などのタンパク質である。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質が活性化すると、ＲＮＡアプタマーは、タンパク質が検出可能シグナルを生成する能力をもはや阻害しない程度まで切断又は分解される。
一実施形態において、シグナル増幅酵素としてトロンビンが、例えば以下の配列：ＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣを有する阻害性アプタマーと共に使用される。このアプタマーが切断されるとトロンビンが活性になり、ペプチド比色基質（例えば、ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｉｇｍａ／ｔ３０６８？ｌａｎｇ＝ｅｎ＆ｒｅｇｉｏｎ＝ＵＳを参照されたい）又は蛍光基質（例えば、ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｉｇｍａ／ｂ９３８５？ｌａｎｇ＝ｅｎ＆ｒｅｇｉｏｎ＝ＵＳを参照されたい）を切断することになる。比色基質のパラニトロアニリド（ｐＮＡ）が、トロンビンのペプチド基質に共有結合的に連結される。トロンビンによって切断されると、ｐＮＡが放出されて色が黄色に変わり、肉眼で容易に見ることができる。蛍光基質も同様の原理によって機能し、トロンビンによって切断されると、蛍光検出器を使用して検出することのできる青色フルオロフォア、７－アミノ－４－メチルクマリンを放出する。トロンビンの代替としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β－ガラクトシダーゼ及び仔ウシアルカリホスファターゼ（ＣＡＰ）が挙げられ、これらも同様に比色又は蛍光シグナルの生成に使用し、阻害性アプタマーによって阻害することができる。
特定の例示的実施形態では、マスキング構築物が個々の個別的な容量（以下に更に定義する）で固体基質上に固定化されて、単一の試薬を隔離し得る。例えば、試薬は、色素を含むビーズであり得る。固定化された試薬によって隔離されると、個々のビーズが過剰に拡散しているため検出可能シグナルは生成されないが、マスキング構築物から放出されると、例えば凝集によるか、又は単純に溶液濃度の増加により、検出可能シグナルの生成が可能となる。特定の例示的実施形態において、固定化されるマスキング剤は、標的分子の検出に伴い活性化エフェクタータンパク質によって切断されることができるＲＮＡベースのアプタマーである。
特定の他の例示的実施形態において、マスキング構築物は溶液中の固定化試薬に結合し、それにより溶液中に遊離している別個の標識結合パートナーに結合する試薬の能力を遮断する。従って、試料に洗浄ステップを適用すると、標的分子が存在しない場合、標識結合パートナーを試料から洗い流すことができる。しかしながら、エフェクタータンパク質が活性化された場合、マスキング構築物は、マスキング構築物が試薬に結合する能力に干渉するのに十分な程度に切断され、それにより標識結合パートナーによる固定化試薬への結合が可能となる。従って、標識結合パートナーは洗浄ステップの後も残り、試料中の標的分子の存在を指示する。特定の態様において、固定化試薬に結合するマスキング構築物はＲＮＡアプタマーである。固定化試薬はタンパク質であり得、標識結合パートナー（ｍｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）は標識抗体であり得る。代わりに、固定化試薬はストレプトアビジンであり得、標識結合パートナーは標識ビオチンであり得る。上記の実施形態において使用される結合パートナーの標識は、当該技術分野において公知の任意の検出可能標識であり得る。加えて、本明細書に記載される全体的な設計に従い他の公知の結合パートナーが使用され得る。
特定の例示的実施形態において、マスキング構築物はリボザイムを含み得る。リボザイムは、触媒特性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、天然のもの及びエンジニアリングされたものの両方ともＲＮＡを含むか又はそれからなるため、これは本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の標的となり得る。リボザイムは、負の検出可能シグナルを生成するか、又は正の対照シグナルの生成を妨げるかのいずれかの反応を触媒するように選択又はエンジニアリングされ得る。活性化エフェクタータンパク質分子によりリボザイムが失活すると、負の対照シグナルを生成するか、又は正の検出可能シグナルの生成を妨げる反応が取り除かれ、それにより正の検出可能シグナルを検出することが可能となる。一例示的実施形態において、リボザイムは比色反応を触媒して、溶液を第１の色として見えさせる。リボザイムが失活すると、次に溶液が第２の色に変わり、この第２の色が検出可能な正のシグナルである。どのようにリボザイムを比色反応の触媒に使用し得るかの例が、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．“Ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｇｌｍＳ”，Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１４；１６：３３７－４２に記載され、どのようにかかるシステムを本明細書に開示される実施形態のコンテクストで機能するように改変し得るかの例を提供する。代わりに、リボザイムは、存在する場合、例えばＲＮＡ転写物の切断産物を生成することができる。従って、正の検出可能シグナルの検出は、リボザイムの非存在下に限り生成される非切断ＲＮＡ転写物の検出を含み得る。
一例示的実施形態において、マスキング構築物は、検出剤が溶液中で凝集しているか、それとも分散しているかに応じて色を変える検出剤を含む。例えば、コロイド金などの特定のナノ粒子は、凝集体から分散粒子へと移るに従い、目に見える紫色から赤色への色シフトを起こす。従って、特定の例示的実施形態では、かかる検出剤が１つ以上の架橋分子によって凝集体として保持され得る。架橋分子の少なくとも一部分はＲＮＡを含む。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質が活性化されると、架橋分子のＲＮＡ部分が切断されて検出剤が分散することが可能となり、対応する色の変化が起こる。特定の例示的実施形態において、架橋分子はＲＮＡ分子である。特定の例示的実施形態において、検出剤はコロイド金属である。コロイド金属材料としては、液体、ヒドロゾル又は金属ゾルに分散した水不溶性金属粒子又は金属化合物を挙げることができる。コロイド金属は、周期表のＩＡ、ＩＢ、ＩＩＢ及びＩＩＩＢ族の金属並びに遷移金属、特にＶＩＩＩ族のものから選択され得る。好ましい金属には、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケル及びカルシウムが含まれる。他の好適な金属には、そのあらゆる様々な酸化状態の以下：リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、インジウム、スズ、タングステン、レニウム、白金及びガドリニウムも含まれる。金属は、好ましくは適切な金属化合物に由来するイオン形態、例えばＡ１３＋、Ｒｕ３＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｎｉ２＋及びＣａ２＋イオンで提供される。
特定の他の例示的実施形態において、マスキング構築物は、検出可能標識及びその検出可能標識のマスキング剤が付加されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み得る。かかる検出可能標識／マスキング剤の組み合わせの例は、フルオロフォア及びフルオロフォアの消光剤である。フルオロフォアの消光は、フルオロフォアと別のフルオロフォア又は非蛍光性分子との間で非蛍光性複合体が形成される結果として起こり得る。この機構は、基底状態複合体形成、静的消光又は接触消光として知られる。従って、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、接触消光が起こるのにフルオロフォアと消光剤とが十分に近接しているように設計され得る。フルオロフォア及びそのコグネイト消光剤は、当該技術分野において公知であり、この目的で当業者が選択することができる。本発明に関連して、詳細なフルオロフォア／消光剤の組み合わせは重要でなく、フルオロフォア／消光剤の組み合わせの選択がフルオロフォアのマスキングを確実にすることのみである。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質が活性化すると、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが切断されて、それにより接触消光効果を維持するのに必要なフルオロフォアと消光剤との間の近接性が断たれる。従って、フルオロフォアの検出を用いて試料中の標的分子の存在を決定し得る。
一例示的実施形態において、マスキング構築物は量子ドットを含み得る。量子ドットは、表面に付加された複数のリンカー分子を有し得る。リンカー分子の少なくとも一部分はＲＮＡを含む。リンカー分子は一端で量子ドットに付加され、且つその長さに沿って又はリンカーの終端で１つ以上の消光剤に付加され、そのため消光剤は量子ドットの消光が起こるのに十分に近接して維持される。リンカーは分枝状であり得る。上記のとおり、量子ドット／消光剤の組み合わせは重要でなく、量子ドット／消光剤の組み合わせの選択がフルオロフォアのマスキングを確実にすることのみである。量子ドット及びそのコグネイト消光剤は、当該技術分野において公知であり、この目的で当業者が選択することができる。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質が活性化すると、リンカー分子のＲＮＡ部分が切断されて、それにより消光効果を維持するのに必要な量子ドットと１つ以上の消光剤との間の近接性がなくなる。一実施形態において、量子ドットは、Ｑｄｏｔ（登録商標）６２５ストレプトアビジンコンジュゲート（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／Ａ１０１９６）など、コンジュゲートされたストレプトアビジンである。ＲＮＡはビオチンリンカーを介して付加され、消光分子を動員し、配列／５Ｂｉｏｓｇ／ＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／又は／５Ｂｉｏｓｇ／ＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／［式中、／５Ｂｉｏｓｇ／はビオチンタグであり、／３ＩＡｂＲＱＳｐ／はアイオワブラック消光剤である］である。切断に伴い消光剤が放出されることになり、量子ドットが目に見える蛍光を発することになる。
同様に、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いて検出可能な正のシグナルを生成し得る。ＦＲＥＴは、エネルギー的に励起されたフルオロフォア（即ち「ドナーフルオロフォア」）からの光子によって別の分子（即ち「アクセプター」）の電子のエネルギー状態が上がり、より高い励起した一重項状態の振動準位になる無放射過程である。ドナーフルオロフォアは基底状態に戻り、そのフルオロフォアに特有の蛍光を発しなくなる。アクセプターは別のフルオロフォア又は非蛍光性分子であり得る。アクセプターがフルオロフォアである場合、移動したエネルギーは、そのフルオロフォアに特有の蛍光として放たれる。アクセプターが非蛍光性分子である場合、吸収されたエネルギーが熱として失われる。従って、本明細書に開示される実施形態のコンテクストでは、フルオロフォア／消光剤の組み合わせは、オリゴヌクレオチド分子に付加されたドナーフルオロフォア／アクセプターの組み合わせに置き換えられる。インタクトな場合、マスキング構築物は、アクセプターが発する蛍光又は熱によって検出されるとおりの第１のシグナル（負の検出可能シグナル）を生成する。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質が活性化すると、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが切断されてＦＲＥＴが破綻するため、ここで、ドナーフルオロフォアの蛍光が検出される（正の検出可能シグナル）。
ＲＮアーゼを検出するための１つの比色リードアウトモードは、インターカレート色素に基づき、これは、長いＲＮＡから短いヌクレオチドへの切断に応答してその吸光度を変化させる。このような特性を備える既存の色素が幾つか存在する。Ｗａｇｎｅｒ（１９８３）によれば、ピロニンＹはＲＮＡとの複合体であり、５７２ｎｍの吸光度を有する複合体を形成することになる。ＲＮＡの切断により吸光度が失われ、色が変化する。Ｇｒｅｉｎｅｒ－Ｓｔｏｅｆｆｅｌｅ（１９９６）は同様にメチレンブルーを使用しており、ＲＮアーゼ活性化に伴い６８８ｎｍの吸光度の変化があった。
別の比色リードアウトモードには、切断に伴い色が変化する核酸基質が関わる。Ｗｉｔｍｅｒ（１９９１）は、切断後にレポーター基を放出する合成リボヌクレオチド基質、Ｕ－３’－ＢＣＩＰを利用しており、６５０ｎｍの吸光度の生成がもたらされた。
デアミナーゼ機能化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３
本発明の特定の態様及び実施形態において、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ１３タンパク質（例えば、本明細書の他の部分に記載されるものなどの任意のオルソログを含めた、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ又はＣａｓ１３ｃを含む）は、本明細書に記載されるとおりの任意のＣａｓ１３タンパク質変異体（機能変異体、突然変異体（限定はされないが触媒不活性突然変異体を含む）、（機能性）ドメイン又はトランケーション（スプリットＣａｓ１３を含む）、Ｃａｓ１３融合タンパク質（例えば、ＮＬＳ若しくはＮＥＳ配列を含むもの又は本明細書の他の部分に記載される任意の他の融合タンパク質など）を含め、デアミナーゼ又はその機能的断片、例えばその触媒活性断片に共有結合的又は非共有結合的に会合又は融合され得る。デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼであり得、好ましくは、このデアミナーゼは、ＲＮＡ特異的デアミナーゼである。本明細書に記載されるとおりのデアミナーゼは、トランケート型又は突然変異型デアミナーゼであり得る。本明細書においてアデノシンデアミナーゼを参照する場合には常に、シチジンデアミナーゼにも同様の考察が適用される（及びアデニンの脱アミノ化に代えてシチジンが脱アミノ化される）ことが理解されるであろう。
特定の態様及び実施形態において、本発明は、有利には、コドン最適化され得る、かかるＣａｓ１３－デアミナーゼ融合タンパク質をコードする（又は非共有結合性の連結の場合にはＣａｓ１３とデアミナーゼとを別々にコードする）ポリ核酸並びに増殖及び／又は発現、例えば原核生物又は真核生物増殖又は発現用のベクター及びベクター系に関する。例示的ポリ核酸及びベクターについては、本明細書の他の部分に記載される。
特定の態様及び実施形態において、本発明は、上記に記載されるタンパク質及び／若しくはポリヌクレオチド又はベクター若しくはベクター系を含む宿主細胞（又はその子孫）、器官又は生物（又はその子供）に関する。例示的宿主細胞／器官／生物並びに発現系については、本明細書の他の部分に記載される。
特定の態様及び実施形態において、本発明は、かかるタンパク質、ポリ核酸、ベクター又はベクター系、宿主細胞、器官又は生物を含む系、複合体又は組成物（キットを含む）、例えば医薬組成物に関する。例示的系、複合体又は組成物、例えば医薬組成物については、本明細書の他の部分に記載される。かかる系、複合体又は組成物は、任意の変異ガイドＲＮＡ（アプタマーを含むガイド誘導型を含めた、エスコート型、保護型、デッドガイド等）を含め、本明細書において他の部分に記載されるとおりのガイドＲＮＡを更に含み得ることが理解されるであろう。
特定の態様及び実施形態において、本発明は、かかるタンパク質、ポリ核酸、ベクター又はベクター系、宿主細胞、器官、生物、系、複合体又は組成物の使用又はその使用が関わる方法に関する。例示的方法及び使用については、本明細書の他の部分に記載される。詳細な実施形態において、本使用及び方法は、目的の標的ＲＮＡ配列中のアデニン又はシチジンを改変することを含む。詳細な実施形態において、本使用又は方法は、本明細書の他の部分にも記載されるとおり、治療的又は予防的である。有利には、本使用及び方法は、標的化した塩基編集を含み得る。一態様において、本明細書に記載される発明は、ＧからＡ若しくはＣからＴへの点突然変異又は病原性一塩基変異多型（ＳＮＰ）によって引き起こされるか又はその可能性が高い疾患状態を修復し且つ／又は予防することを目的として、標的遺伝子座におけるアデノシン残基を改変する方法を提供する。脳及び中枢神経系に発症する様々な疾患に関連する病原性のＧからＡ又はＣからＴへの突然変異／ＳＮＰがＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告されている。本発明によれば、そうした突然変異／ＳＮＰの任意のものを標的とすることができる。
一般に本明細書に開示される系は、ターゲティング成分と塩基編集成分とを含む。ターゲティング成分は、その中の１つ以上のヌクレオチドを編集しようとする標的ヌクレオチド配列へと塩基編集成分を特異的に標的化させる役割を果たす。次に、塩基編集成分が化学反応を触媒して標的配列中の第１のヌクレオチドを第２のヌクレオチドに変換し得る。例えば、塩基編集体は、アデニンが細胞の転写又は翻訳機構によってグアニンとして読み取られるようなアデニンの変換又はその逆を触媒し得る。同様に、塩基編集成分は、シチジンからウラシルへの変換又はその逆を触媒し得る。特定の例示的実施形態において、塩基編集体は、アデニンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼなどの既知の塩基編集体から出発することにより得られ、定向進化などの方法を用いて改変されて新規機能が得られる。定向進化技法は、当該技術分野において公知であり、国際公開第２０１５／１８４０１６号パンフレット「Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｅｒｍｕａｔａｔｉｏｎｓ」に記載されるものを挙げることができる。
ある態様において、本発明は、（ａ）触媒不活性（デッド）Ｃａｓ１３タンパク質、及び（ｂ）（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインであって、前記デッドＣａｓ１３タンパク質に共有結合的又は非共有結合的に連結されているか又は送達後にそれに連結するように適合されている（アデノシン）デアミナーゼタンパク質、又はその触媒ドメインを含む（融合）タンパク質、又はタンパク質複合体、又はそれをコードするポリヌクレオチド（ベクター及びベクター系を含む）に関する。特定の実施形態において、（融合）タンパク質又はタンパク質複合体は、ダイレクトリピート配列に連結したガイド配列を含むガイド分子に結合しているか又は結合するように適合されることができ、ここで、ガイド分子は、前記デッドＣａｓ１３タンパク質と複合体を形成して前記複合体による前記目的の標的ＲＮＡ配列への結合を導き、前記ガイド配列は、前記アデニンを含む標的配列にハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖を形成する能力を有し、前記ガイド配列は、前記アデニンに対応する位置に非対合シトシンを含むため、形成されるＲＮＡ二重鎖にＡ－Ｃミスマッチが生じ、前記（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインが前記ＲＮＡ二重鎖の前記アデニンを脱アミノ化する。
ある態様において、本発明は、（ａ）触媒不活性（デッド）Ｃａｓ１３タンパク質、（ｂ）ダイレクトリピート配列に連結したガイド配列を含むガイド分子、及び（ｃ）（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインを含む組成物、複合体又は系に関し、ここで、前記（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、前記デッドＣａｓ１３タンパク質又は前記ガイド分子に共有結合的又は非共有結合的に連結されているか、又は送達後にそれに連結するように適合され、ガイド分子は、前記デッドＣａｓ１３タンパク質と複合体を形成して前記複合体による前記目的の標的ＲＮＡ配列への結合を導き、前記ガイド配列は、前記アデニンを含む標的配列にハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖を形成する能力を有し、前記ガイド配列は、前記アデニンに対応する位置に非対合シトシンを含むため、形成されるＲＮＡ二重鎖にＡ－Ｃミスマッチが生じ、前記（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインが前記ＲＮＡ二重鎖の前記アデニンを脱アミノ化する。本発明は、ガイド配列を含むガイド分子又はガイド分子をコードするヌクレオチド配列、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質若しくはその触媒ドメイン又はコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む、目的の標的遺伝子座にあるアデニンの改変に好適である、エンジニアリングされた天然に存在しない（ベクター）系に更に関し、ここで、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はガイド分子に共有結合的又は非共有結合的に連結されているか、又は送達後にそれに連結するように適合され、ガイド配列は、目的のＲＮＡポリヌクレオチド内にあるアデニンを含む標的配列とハイブリダイズする能力を有するが、アデニンに対応する位置にシトシンを含む。
ある態様において、本発明は、（ａ）前記ガイド配列を含む前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメント、（ｂ）前記触媒不活性Ｃａｓ１３タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメント、及び（ｃ）前記第１又は第２の調節エレメントの制御下にあるか、又は第３の調節エレメントに作動可能に連結された、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上のベクターを含む、目的の標的遺伝子座にあるアデニンの改変に好適である、エンジニアリングされた天然に存在しないベクター系に関し、ここで、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が第３の調節エレメントに作動可能に連結されている場合、前記（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、発現後に前記ガイド分子又は前記Ｃａｓ１３タンパク質に連結するように適合され、ここで、成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、系の同じ又は異なるベクター上に位置する。
ある態様において、本発明は、目的の標的ＲＮＡ配列にあるアデニンを改変する方法に関する。詳細な実施形態において、この方法は、前記標的ＲＮＡに、（ａ）触媒不活性（デッド）Ｃａｓ１３タンパク質、（ｂ）ダイレクトリピート配列に連結したガイド配列を含むガイド分子、及び（ｃ）（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインを送達することを含み、ここで、前記（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、前記デッドＣａｓ１３タンパク質又は前記ガイド分子に共有結合的又は非共有結合的に連結されているか、又は送達後にそれに連結するように適合され、ガイド分子は前記デッドＣａｓ１３タンパク質と複合体を形成して前記複合体による前記目的の標的ＲＮＡ配列への結合を導き、前記ガイド配列は、前記アデニンを含む標的配列にハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖を形成する能力を有し、前記ガイド配列は、前記アデニンに対応する位置に非対合シトシンを含むため、形成されるＲＮＡ二重鎖にＡ－Ｃミスマッチが生じ、前記（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインが前記ＲＮＡ二重鎖の前記アデニンを脱アミノ化する。
本発明は、本明細書に記載される改変細胞を、それを必要としている患者に投与することを含む、細胞療法の方法に更に関し、ここで、改変細胞の存在が患者の疾患を修復する。一実施形態において、細胞療法用の改変細胞は、腫瘍細胞を認識し及び／又は攻撃する能力を有するＣＡＲ－Ｔ細胞である。別の実施形態において、細胞療法用の改変細胞は、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞又はｉＰＳＣ細胞などの幹細胞である。
本発明は、遺伝子の望ましくない活性をノックアウト又はノックダウンする方法にも関し、ここで、遺伝子の転写物におけるＡの脱アミノ化が機能喪失をもたらす。例えば、一実施形態では、デアミナーゼ機能化ＣＲＩＳＰＲ系による標的化した脱アミノ化がナンセンス突然変異を引き起こし、内因性遺伝子に未成熟終止コドンを生じさせ得る。これにより内因性遺伝子の発現を変化させ得、編集された細胞における望ましい形質につながり得る。別の実施形態では、デアミナーゼ機能化ＣＲＩＳＰＲ系による標的化した脱アミノ化が非保存的ミスセンス突然変異を引き起こし、内因性遺伝子に異なるアミノ酸残基のコードを生じさせ得る。これにより発現した内因性遺伝子の機能を変化させ得、同様に編集された細胞における望ましい形質につながり得る。
本明細書に記載されるデアミナーゼ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、ＲＮＡポリヌクレオチド配列内にある特定のアデニンを脱アミノ化の標的にすることができる。例えば、ガイド分子がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、目的のＲＮＡポリヌクレオチドにある標的ＲＮＡ配列への複合体の結合を導くことができる。ガイド配列は、非対合Ｃを有するように設計されるため、ガイド配列と標的配列との間で形成されるＲＮＡ二重鎖は、Ａ－Ｃミスマッチを含み、これによって（アデノシン）デアミナーゼが非対合Ｃに対向するＡに接触してそれを脱アミノ化するように導かれ、Ａがイノシン（Ｉ）に変換される。イノシン（Ｉ）は、Ｃと塩基対合し、細胞過程でＧのように機能するため、本明細書に記載されるＡの標的化した脱アミノ化は、望ましくないＧ－Ａ及びＣ－Ｔ突然変異の修正並びに望ましいＡ－Ｇ及びＴ－Ｃ突然変異の獲得に有用である。
特定の例示的実施形態において、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ又はＣａｓ１３ｃである。
（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、前記デッドＣａｓ１３タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合され得る。特定の例示的実施形態において、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、リンカーによって前記デッドＣａｓ１３タンパク質に融合される。リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３～１１、ＧＳＧ５又はＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲであり得る。
特定の例示的実施形態において、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、アダプタータンパク質に連結され、前記ガイド分子又は前記デッドＣａｓ１３タンパク質は、前記アダプタータンパク質への結合能を有するアプタマー配列を含む。アダプター配列は、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１から選択され得る。
特定の例示的実施形態において、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、前記デッドＣａｓ１３タンパク質の内部ループに挿入される。特定の例示的実施形態において、Ｃａｓ１３ａタンパク質は、２つのＨＥＰＮドメイン、特にレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）由来のＣａｓ１３ａタンパク質の位置Ｒ４７４及びＲ１０４６又はＣａｓ１３ａオルソログのそれに対応するアミノ酸位置に１つ以上の突然変異を含む。
特定の例示的実施形態において、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ｂタンパク質であり、このＣａｓ１３ｂは、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）ＡＴＣＣ ４３７６７由来のＣａｓ１３ｂタンパク質の位置Ｒ１１６、Ｈ１２１、Ｒ１１７７、Ｈ１１８２の１つ以上又はＣａｓ１３ｂオルソログのそれに対応するアミノ酸位置に突然変異を含む。特定の他の例示的実施形態において、突然変異は、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）ＡＴＣＣ ４３７６７由来のＣａｓ１３ｂタンパク質のＲ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ、Ｈ１１８２Ａの１つ以上又はＣａｓ１３ｂオルソログのそれに対応するアミノ酸位置である。
特定の例示的実施形態において、ガイド配列は、前記標的配列と前記ＲＮＡ二重鎖を形成する能力を有する約２９～５３ｎｔの長さを有する。特定の他の例示的実施形態において、ガイド配列は、前記標的配列と前記ＲＮＡ二重鎖を形成する能力を有する約４０～５０ｎｔの長さを有する。特定の例示的実施形態において、前記ガイド配列の前記非対合Ｃと５’末端との間の距離は、２０～３０ヌクレオチドである。
特定の例示的実施形態において、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、ヒト、頭足類又はショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインである。特定の例示的実施形態において、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のグルタミン酸４８８又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置に突然変異を含むように改変されている。特定の例示的実施形態において、グルタミン酸残基は、位置４８８にあり得、又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置がグルタミン残基に置き換えられ得る（Ｅ４８８Ｑ）。
特定の他の例示的実施形態において、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、突然変異Ｅ４８８Ｑを含む突然変異型ｈＡＤＡＲ２ｄ又は突然変異Ｅ１００８Ｑを含む突然変異型ｈＡＤＡＲ１ｄである。
特定の例示的実施形態において、ガイド配列は、標的ＲＮＡ配列における異なるアデノシン部位に対応する２つ以上のミスマッチを含み、又は２つのガイド分子が使用され、各々は、標的ＲＮＡ配列における異なるアデノシン部位に対応するミスマッチを含む。
特定の例示的実施形態において、Ｃａｓ１３タンパク質及び任意選択で前記（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、１つ以上の異種核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。
特定の例示的実施形態において、本方法は、目的の標的配列を決定すること、及び次に標的配列に存在する前記アデニンを最も効率的に脱アミノ化する（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインを選択することを更に含む。
目的の標的ＲＮＡ配列は、細胞内にあり得る。細胞は、真核細胞、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、植物細胞であり得る。目的の標的遺伝子座は、動物又は植物体内にあり得る。
目的の標的ＲＮＡ配列は、インビトロでＲＮＡポリヌクレオチドに含まれ得る。
本明細書に記載される系の成分は、リボ核タンパク質複合体として、又は１つ以上のポリヌクレオチド分子として、又はウイルス若しくは非ウイルス送達を含めた本明細書の他の部分に記載されるとおりの任意の他の送達方法で前記細胞に送達され得る。１つ以上のポリヌクレオチド分子は、成分をコードする１つ以上のｍＲＮＡ分子を含み得る。１つ以上のポリヌクレオチド分子は、１つ以上のベクター内に含まれ得る。１つ以上のポリヌクレオチド分子は、前記Ｃａｓ１３タンパク質、前記ガイド分子及び前記デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインを発現するように作動可能に構成された１つ以上の調節エレメントを更に含み得、任意選択で、ここで、前記１つ以上の調節エレメントは、誘導性プロモーターを含む。１つ以上のポリヌクレオチド分子又は前記リボ核タンパク質複合体は、粒子、小胞又は１つ以上のウイルスベクターによって送達され得る。粒子は、脂質、糖、金属又はタンパク質を含み得る。粒子は、脂質ナノ粒子を含み得る。小胞は、エキソソーム又はリポソームを含み得る。１つ以上のウイルスベクターは、アデノウイルス、１つ以上のレンチウイルス又は１つ以上のアデノ随伴ウイルスの１つ以上を含み得る。
本明細書に開示される方法は、１つ以上の標的ＲＮＡ配列の操作による細胞、細胞株又は生物の改変に使用し得る。
特定の例示的実施形態において、前記目的の標的ＲＮＡにある前記アデニンの脱アミノ化は、病原性Ｇ→Ａ又はＣ→Ｔ点突然変異を含む転写物によって引き起こされる疾患を修復する。
本方法は、詳細にはデアミナーゼ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用した標的化した脱アミノ化によるなど、疾患の治療若しくは予防又は他に疾患若しくは疾患の重症度の改善に使用することができ、ここで、Ａの脱アミノ化であり、これは、病原性Ｇ→Ａ又はＣ→Ｔ点突然変異を含む転写物によって引き起こされる疾患を修復するものである。特定の例示的実施形態において、疾患は、マイヤー・ゴーリン症候群、ゼッケル症候群４、ジュベール症候群５、レーベル先天黒内障１０；シャルコー・マリー・トゥース病、２型；シャルコー・マリー・トゥース病、２型；アッシャー症候群、２Ｃ型；脊髄小脳失調症２８；脊髄小脳失調症２８；脊髄小脳失調症２８；ＱＴ延長症候群２；シェーグレン・ラルソン症候群；遺伝性果糖尿症；遺伝性果糖尿症；神経芽細胞腫；神経芽細胞腫；カルマン症候群１；カルマン症候群１；カルマン症候群１；異染性白質ジストロフィー、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症１０型、リー・フラウメニ症候群から選択される。疾患は未成熟終止疾患（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）であり得る。
本明細書に開示される方法は、生物の受胎能に影響を及ぼす改変の作成に使用され得る。この改変は、前記標的ＲＮＡ配列のスプライシングに影響を及ぼし得る。この改変は、アミノ酸変化を導入して癌細胞に新規抗原の発現を生じさせる突然変異を転写物に導入し得る。
特定の例示的実施形態において、標的ＲＮＡは、マイクロＲＮＡであるか又はマイクロＲＮＡ内に含まれ得る。特定の例示的実施形態において、前記目的の標的ＲＮＡにある前記アデニンの脱アミノ化は、遺伝子の機能獲得又は機能喪失を引き起こす。特定の例示的実施形態において、遺伝子は、癌細胞が発現する遺伝子である。
別の態様において、本発明は、本明細書に開示される方法を用いて得られる改変細胞又はその子孫を含み、ここで、前記細胞は、本方法に供されていない対応する細胞と比較して前記目的の標的ＲＮＡに前記アデニンの代わりにヒポキサンチン又はグアニンを含む。改変細胞又はその子孫は、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、治療用Ｔ細胞、抗体産生Ｂ細胞、植物細胞であり得る。
別の態様において、本発明は、前記改変細胞又はその子孫を含む非ヒト動物を含む。改変されるのは、植物細胞であり得る。
別の態様において、本発明は細胞療法の方法を含み、この方法は、本明細書に開示される改変細胞を、それを必要としている患者に投与することを含み、ここで、前記改変細胞の存在が患者の疾患を修復する。
別の態様において、本発明は、Ａ）ダイレクトリピート配列に連結したガイド配列を含むガイド分子又は前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列、Ｂ）触媒不活性Ｃａｓ１３タンパク質又は前記触媒不活性Ｃａｓ１３タンパク質をコードするヌクレオチド配列、Ｃ）（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメイン又は前記（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、目的の標的遺伝子座にあるアデニンの改変に好適である、エンジニアリングされた天然に存在しない系に関し、ここで、前記（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、前記Ｃａｓ１３タンパク質又は前記ガイド分子に共有結合的又は非共有結合的に連結されているか、又は送達後にそれに連結するように適合され、前記ガイド配列は、アデニンを含む標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖を形成する能力を有し、前記ガイド配列は、前記アデニンに対応する位置に非対合シトシンを含むため、形成されるＲＮＡ二重鎖にＡ－Ｃミスマッチが生じる。
別の態様において、本発明は、ａ）、ｂ）及びｃａのヌクレオチド配列を含む、目的の標的遺伝子座にあるアデニンの改変に好適である、エンジニアリングされた天然に存在しないベクター系に関する。
別の態様において、本発明は、前記ガイド配列を含む前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメント、前記触媒不活性Ｃａｓ１３タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメント及び前記第１又は第２の調節エレメントの制御下にあるか、又は第３の調節エレメントに作動可能に連結された、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上のベクターを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないベクター系に関し、ここで、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が第３の調節エレメントに作動可能に連結されている場合、前記（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインは、発現後に前記ガイド分子又は前記Ｃａｓ１３タンパク質に連結するように適合され、ここで、成分Ａ）、Ｂ）及びＣ）は、系の同じ又は異なるベクター上に位置する。
別の態様において、本発明は、本明細書に開示される系を含むインビトロ又はエキソビボ宿主細胞若しくはその子孫又は細胞株若しくはその子孫に関する。宿主細胞又はその子孫は、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞又は植物細胞であり得る。
一態様において、本発明は、ＲＮＡ、より詳細には目的のＲＮＡ配列にあるアデニンの標的化した脱アミノ化方法を提供する。本発明の方法によれば、（アデノシン）デアミナーゼ（ＡＤ）タンパク質は、標的配列に特異的に結合し得るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体によって目的のＲＮＡ配列にある関連するアデニンに特異的に動員される。これを実現するため、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素に共有結合的に連結されるか、又は別個のタンパク質として提供されるかのいずれでもあり得、但しＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体へのその動員が確実となるように適合され得る。
本発明の方法の詳細な実施形態において、標的遺伝子座への（アデノシン）デアミナーゼの動員は、（アデノシン）デアミナーゼ又はその触媒ドメインをＣａｓ１３タンパク質であるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質に融合することにより確実とされる。２つの別個のタンパク質から融合タンパク質を作成する方法は、当該技術分野において公知であり、典型的にはスペーサー又はリンカーの使用が関わる。Ｃａｓ１３タンパク質は、（アデノシン）デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインにそのＮ端側又はＣ端側のいずれかの末端で融合することができる。詳細な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、不活性又はデッドＣａｓ１３タンパク質であり、デアミナーゼタンパク質又はその触媒ドメインのＮ末端に連結される。
用語「アデノシンデアミナーゼ」又は「アデノシンデアミナーゼタンパク質」は、本明細書で使用されるとき、以下に示すとおりの、アデニン（又は分子のアデニン部分）をヒポキサンチン（又は分子のヒポキサンチン部分）に変換する加水分解性脱アミノ化反応の触媒能を有するタンパク質、ポリペプチド又はタンパク質若しくはポリペプチドの１つ以上の機能ドメインを指す。一部の実施形態において、アデニン含有分子は、アデノシン（Ａ）であり、ヒポキサンチン含有分子は、イノシン（Ｉ）である。アデニン含有分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。
Figure 2023052236000007
本開示によれば、本開示に関連して使用することのできるアデノシンデアミナーゼとしては、限定はされないが、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）として知られる酵素ファミリーのメンバー、ｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）として知られる酵素ファミリーのメンバー及び他のアデノシンデアミナーゼドメイン含有（ＡＤＡＤ）ファミリーメンバーが挙げられる。本開示によれば、アデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡ／ＤＮＡ及びＲＮＡ二重鎖のアデニンを標的化する能力を有する。実際、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１７，４５（６）：３３６９－３３７７）は、ＡＤＡＲがＲＮＡ／ＤＮＡ及びＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖上でのアデノシンからイノシンへの編集反応を遂行し得ることを実証している。詳細な実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、本明細書において以下に詳述するとおり、ＲＮＡ／ＤＮＡｎ ＲＮＡ二重鎖におけるＤＮＡを編集する能力が増加するように改変されている。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、限定はされないが、哺乳類、鳥類、カエル、イカ、魚類、ハエ及び虫を含めた１つ以上の後生動物種に由来する。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ヒト、イカ又はショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アデノシンデアミナーゼである。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、ｈＡＤＡＲ３を含めたヒトＡＤＡＲである。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ＡＤＲ－１及びＡＤＲ－２を含めたカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＤＡＲタンパク質である。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｄＡｄａｒを含めたショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＡＤＡＲタンパク質である。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｓｑＡＤＡＲ２ａ及びｓｑＡＤＡＲ２ｂを含めたイカのアメリカケンサキイカ（Ｌｏｌｉｇｏ ｐｅａｌｅｉｉ）ＡＤＡＲタンパク質である。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＴタンパク質である。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＡＤＡＴタンパク質である。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ＴＥＮＲ（ｈＡＤＡＤ１）及びＴＥＮＲＬ（ｈＡＤＡＤ２）を含めたヒトＡＤＡＤタンパク質である。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、二本鎖核酸基質中の１つ以上の標的アデノシン残基を認識してイノシン残基に変換する。一部の実施形態において、二本鎖核酸基質は、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド二重鎖である。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、二本鎖基質上の結合ウィンドウを認識する。一部の実施形態において、結合ウィンドウは、少なくとも１つの標的アデノシン残基を含む。一部の実施形態において、結合ウィンドウは、約３ｂｐ～約１００ｂｐの範囲である。一部の実施形態において、結合ウィンドウは、約５ｂｐ～約５０ｂｐの範囲である。一部の実施形態において、結合ウィンドウは、約１０ｂｐ～約３０ｂｐの範囲である。一部の実施形態において、結合ウィンドウは、約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、５ｂｐ、７ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ又は１００ｂｐである。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、１つ以上のデアミナーゼドメインを含む。理論によって拘束されることは意図されないが、デアミナーゼドメインが二本鎖核酸基質に含まれる１つ以上の標的アデノシン（Ａ）残基を認識してそれをイノシン（Ｉ）残基に変換する役割を果たすことが企図される。一部の実施形態において、デアミナーゼドメインは、活性中心を含む。一部の実施形態において、活性中心は、亜鉛イオンを含む。一部の実施形態において、ＡからＩへの編集過程で標的アデノシン残基における塩基対合が破壊され、標的アデノシン残基が二重らせんから「フリップ」アウトしてアデノシンデアミナーゼが接触できるようになる。一部の実施形態において、活性中心又はその近傍にあるアミノ酸残基は、標的アデノシン残基の５’側で１つ以上のヌクレオチドと相互作用する。一部の実施形態において、活性中心又はその近傍にあるアミノ酸残基は、標的アデノシン残基の３’側で１つ以上のヌクレオチドと相互作用する。一部の実施形態において、活性中心又はその近傍にあるアミノ酸残基は、逆鎖上にある標的アデノシン残基と相補的なヌクレオチドと更に相互作用する。一部の実施形態において、アミノ酸残基は、ヌクレオチドの２’ヒドロキシル基と水素結合を形成する。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＲ２完全タンパク質（ｈＡＤＡＲ２）又はそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＤＡＲ２－Ｄ）を含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２又はｈＡＤＡＲ２－Ｄと相同のＡＤＡＲファミリーメンバーである。
特に、一部の実施形態において、相同ＡＤＡＲタンパク質は、ヒトＡＤＡＲ１（ｈＡＤＡＲ１）又はそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＤＡＲ１－Ｄ）である。一部の実施形態において、ｈＡＤＡＲ１－Ｄのグリシン１００７は、グリシン４８７ ｈＡＤＡＲ２－Ｄに対応し、ｈＡＤＡＲ１－Ｄのグルタミン酸１００８は、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのグルタミン酸４８８に対応する。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄの野生型アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄ配列に１つ以上の突然変異を含み、ｈＡＤＡＲ２－Ｄの編集効率及び／又は基質編集優先性が具体的な必要性に応じて変更されることになる。
ｈＡＤＡＲ１及びｈＡＤＡＲ２タンパク質の特定の突然変異について、Ｋｕｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．（２０１２）１０９（４８）：Ｅ３２９５－３０４；Ｗａｎｔ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２０１５）１０（１１）：２５１２－９；及びＺｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１７）４５（６）：３３６９－３３７（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のグリシン３３６又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置３３６のグリシン残基は、アスパラギン酸残基に置き換えられる（Ｇ３３６Ｄ）。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のグリシン４８７又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置４８７のグリシン残基は、比較的小さい側鎖の非極性アミノ酸残基に置き換えられる。例えば、一部の実施形態において、位置４８７のグリシン残基は、アラニン残基に置き換えられる（Ｇ４８７Ａ）。一部の実施形態において、位置４８７のグリシン残基は、バリン残基に置き換えられる（Ｇ４８７Ｖ）。一部の実施形態において、位置４８７のグリシン残基は、比較的大きい側鎖のアミノ酸残基に置き換えられる。一部の実施形態において、位置４８７のグリシン残基は、アルギニン残基に置き換えられる（Ｇ４８７Ｒ）。一部の実施形態において、位置４８７のグリシン残基は、リジン残基に置き換えられる（Ｇ４８７Ｋ）。一部の実施形態において、位置４８７のグリシン残基は、トリプトファン残基に置き換えられる（Ｇ４８７Ｗ）。一部の実施形態において、位置４８７のグリシン残基は、チロシン残基に置き換えられる（Ｇ４８７Ｙ）。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のグルタミン酸４８８又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置４８８のグルタミン酸残基は、グルタミン残基に置き換えられる（Ｅ４８８Ｑ）。一部の実施形態において、位置４８８のグルタミン酸残基は、ヒスチジン残基に置き換えられる（Ｅ４８８Ｈ）。一部の実施形態において、位置４８８のグルタミン酸残基は、アルギニン残基に置き換えられる（Ｅ４８８Ｒ）。一部の実施形態において、位置４８８のグルタミン酸残基は、リジン残基に置き換えられる（Ｅ４８８Ｋ）。一部の実施形態において、位置４８８のグルタミン酸残基は、アスパラギン残基に置き換えられる（Ｅ４８８Ｎ）。一部の実施形態において、位置４８８のグルタミン酸残基は、アラニン残基に置き換えられる（Ｅ４８８Ａ）。一部の実施形態において、位置４８８のグルタミン酸残基は、メチオニン残基に置き換えられる（Ｅ４８８Ｍ）。一部の実施形態において、位置４８８のグルタミン酸残基は、セリン残基に置き換えられる（Ｅ４８８Ｓ）。一部の実施形態において、位置４８８のグルタミン酸残基は、フェニルアラニン残基に置き換えられる（Ｅ４８８Ｆ）。一部の実施形態において、位置４８８のグルタミン酸残基は、リジン残基に置き換えられる（Ｅ４８８Ｌ）。一部の実施形態において、位置４８８のグルタミン酸残基は、トリプトファン残基に置き換えられる（Ｅ４８８Ｗ）。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のスレオニン４９０又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置４９０のスレオニン残基は、システイン残基に置き換えられる（Ｔ４９０Ｃ）。一部の実施形態において、位置４９０のスレオニン残基は、セリン残基に置き換えられる（Ｔ４９０Ｓ）。一部の実施形態において、位置４９０のスレオニン残基は、アラニン残基に置き換えられる（Ｔ４９０Ａ）。一部の実施形態において、位置４９０のスレオニン残基は、フェニルアラニン残基に置き換えられる（Ｔ４９０Ｆ）。一部の実施形態において、位置４９０のスレオニン残基は、チロシン残基に置き換えられる（Ｔ４９０Ｙ）。一部の実施形態において、位置４９０のスレオニン残基は、セリン残基に置き換えられる（Ｔ４９０Ｒ）。一部の実施形態において、位置４９０のスレオニン残基は、アラニン残基に置き換えられる（Ｔ４９０Ｋ）。一部の実施形態において、位置４９０のスレオニン残基は、フェニルアラニン残基に置き換えられる（Ｔ４９０Ｐ）。一部の実施形態において、位置４９０のスレオニン残基は、チロシン残基に置き換えられる（Ｔ４９０Ｅ）。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のバリン４９３又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置４９３のバリン残基は、アラニン残基に置き換えられる（Ｖ４９３Ａ）。一部の実施形態において、位置４９３のバリン残基は、セリン残基に置き換えられる（Ｖ４９３Ｓ）。一部の実施形態において、位置４９３のバリン残基は、スレオニン残基に置き換えられる（Ｖ４９３Ｔ）。一部の実施形態において、位置４９３のバリン残基は、アルギニン残基に置き換えられる（Ｖ４９３Ｒ）。一部の実施形態において、位置４９３のバリン残基は、アスパラギン酸残基に置き換えられる（Ｖ４９３Ｄ）。一部の実施形態において、位置４９３のバリン残基は、プロリン残基に置き換えられる（Ｖ４９３Ｐ）。一部の実施形態において、位置４９３のバリン残基は、グリシン残基に置き換えられる（Ｖ４９３Ｇ）。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のアラニン５８９又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置５８９のアラニン残基は、バリン残基に置き換えられる（Ａ５８９Ｖ）。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のアスパラギン５９７又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置５９７のアスパラギン残基は、リジン残基に置き換えられる（Ｎ５９７Ｋ）。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列ではアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置５９７に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置５９７のアスパラギン残基は、アルギニン残基に置き換えられる（Ｎ５９７Ｒ）。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列ではアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置５９７に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置５９７のアスパラギン残基は、アラニン残基に置き換えられる（Ｎ５９７Ａ）。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列ではアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置５９７に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置５９７のアスパラギン残基は、グルタミン酸残基に置き換えられる（Ｎ５９７Ｅ）。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列ではアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置５９７に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置５９７のアスパラギン残基は、ヒスチジン残基に置き換えられる（Ｎ５９７Ｈ）。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列ではアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置５９７に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置５９７のアスパラギン残基は、グリシン残基に置き換えられる（Ｎ５９７Ｇ）。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列ではアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置５９７に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置５９７のアスパラギン残基は、チロシン残基に置き換えられる（Ｎ５９７Ｙ）。一部の実施形態において、位置５９７のアスパラギン残基は、フェニルアラニン残基に置き換えられる（Ｎ５９７Ｆ）。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のセリン５９９又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置５９９のセリン残基は、スレオニン残基に置き換えられる（Ｓ５９９Ｔ）。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のアスパラギン６１３又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置６１３のアスパラギン残基は、リジン残基に置き換えられる（Ｎ６１３Ｋ）。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列ではアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置６１３に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置６１３のアスパラギン残基は、アルギニン残基に置き換えられる（Ｎ６１３Ｒ）。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列ではアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置６１３に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置６１３のアスパラギン残基は、アラニン残基に置き換えられる（Ｎ６１３Ａ）。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列ではアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置６１３に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置６１３のアスパラギン残基は、グルタミン酸残基に置き換えられる（Ｎ６１３Ｅ）。
一部の実施形態において、編集効率を改善するため、アデノシンデアミナーゼは、突然変異：Ｇ３３６Ｄ、Ｇ４８７Ａ、Ｇ４８７Ｖ、Ｅ４８８Ｑ、Ｅ４８８Ｈ、Ｅ４８８Ｒ、Ｅ４８８Ｎ、Ｅ４８８Ａ、Ｅ４８８Ｓ、Ｅ４８８Ｍ、Ｔ４９０Ｃ、Ｔ４９０Ｓ、Ｖ４９３Ｔ、Ｖ４９３Ｓ、Ｖ４９３Ａ、Ｖ４９３Ｒ、Ｖ４９３Ｄ、Ｖ４９３Ｐ、Ｖ４９３Ｇ、Ｎ５９７Ｋ、Ｎ５９７Ｒ、Ｎ５９７Ａ、Ｎ５９７Ｅ、Ｎ５９７Ｈ、Ｎ５９７Ｇ、Ｎ５９７Ｙ、Ａ５８９Ｖ、Ｓ５９９Ｔ、Ｎ６１３Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６１３Ａ、Ｎ６１３Ｅ（ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置を基準とする）の１つ以上及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質における突然変異を含み得る。
一部の実施形態において、編集効率を低下させるため、アデノシンデアミナーゼは、突然変異：Ｅ４８８Ｆ、Ｅ４８８Ｌ、Ｅ４８８Ｗ、Ｔ４９０Ａ、Ｔ４９０Ｆ、Ｔ４９０Ｙ、Ｔ４９０Ｒ、Ｔ４９０Ｋ、Ｔ４９０Ｐ、Ｔ４９０Ｅ、Ｎ５９７Ｆ（ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置を基準とする）の１つ以上及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質における突然変異を含み得る。詳細な実施形態において、オフターゲット効果を低下させるため効率が低下したアデノシンデアミナーゼ酵素を使用することが有利であり得る。
特定の実施形態において、オフターゲット改変の編集の改善及び低減は、ｇＲＮＡの化学的改変によって実現する。Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ，５３：６２６７－６２７１，ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１４０２６３４（全体として参照により本明細書に援用される）に例示されるとおり化学的に改変されているｇＲＮＡはオフターゲット活性を低減し、オンターゲット効率を改善する。２’－Ｏ－メチル及びホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）改変ガイドＲＮＡは、一般に細胞における編集効率を改善する。
ＡＤＡＲは、編集されたＡの両側の隣接ヌクレオチドに優先性を示すことが知られている（ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｓｍｂ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ２３／ｎ５／ｆｕｌｌ／ｎｓｍｂ．３２０３．ｈｔｍｌ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２３（５）：４２６－４３３、全体として参照により本明細書に援用される）。従って、特定の実施形態において、ｇＲＮＡ、標的及び／又はＡＤＡＲは、モチーフ優先性に関して最適化されるように選択される。
インビトロで、意図的なミスマッチが好ましくないモチーフの編集を可能にすることが実証されている（ｈｔｔｐｓ：／／ａｃａｄｅｍｉｃ．ｏｕｐ．ｃｏｍ／ｎａｒ／ａｒｔｉｃｌｅ－ｌｏｏｋｕｐ／ｄｏｉ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ２７２；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，４２（１０）：ｅ８７）；Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｓｃｉｅｎｔｉｃｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４１４７８、全体として参照により本明細書に援用される）。従って、特定の実施形態において、好ましくない５’又は３’隣接塩基に関するＲＮＡ編集効率を亢進させるため、隣接塩基に意図的なミスマッチが導入される。
結果から、ＡＤＡＲデアミナーゼドメインのターゲティングウィンドウにおけるＣに対向するＡが他の塩基と比べて優先的に編集されることが示唆される。加えて、標的塩基から数塩基以内にあるＵと塩基対合したＡは、Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物による低い編集レベルを示し、この酵素に複数のＡを編集する柔軟性があることが示唆される。例えば、図１８を参照されたい。これらの２つの観察は、Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物の活性ウィンドウにおける複数のＡが、編集されるべき全てのＡとＣとのミスマッチによって編集に指定され得ることを示唆している。従って、特定の実施形態では、活性ウィンドウにおける複数のＡ：Ｃミスマッチは、複数のＡ：Ｉ編集を作り出すように設計される。活性ウィンドウにおける潜在的なオフターゲット編集を抑制する特定の実施形態において、非標的Ａは、Ａ又はＧと対合する。
用語「編集特異性」及び「編集優先性」は、本明細書では、二本鎖基質における特定のアデノシン部位のＡからＩへの編集の程度を指して同義的に使用される。一部の実施形態において、基質編集優先性は、標的アデノシン残基の５’側隣接塩基及び／又は３’側隣接塩基によって決まる。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、基質の５’側隣接塩基についてＵ＞Ａ＞Ｃ＞Ｇ（「＞」はより高い優先性を示す）と順位付けされる優先性を有する。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、基質の３’側隣接塩基についてＧ＞Ｃ～Ａ＞Ｕ（「＞」は、より高い優先性を示し、「～」は、同程度の優先性を示す）と順位付けされる優先性を有する。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、基質の３’側隣接塩基についてＧ＞Ｃ＞Ｕ～Ａ（「＞」は、より高い優先性を示し、「～」は、同程度の優先性を示す）と順位付けされる優先性を有する。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、基質の３’側隣接塩基についてＧ＞Ｃ＞Ａ＞Ｕ（「＞」は、より高い優先性を示す）と順位付けされる優先性を有する。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、基質の３’側隣接塩基についてＣ～Ｇ～Ａ＞Ｕ（「＞」は、より高い優先性を示し、「～」は、同程度の優先性を示す）と順位付けされる優先性を有する。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、標的アデノシン残基を含有するトリプレット配列について、中央のＡが標的アデノシン残基の、ＴＡＧ＞ＡＡＧ＞ＣＡＣ＞ＡＡＴ＞ＧＡＡ＞ＧＡＣ（「＞」は、より高い優先性を示す）と順位付けされる優先性を有する。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼの基質編集優先性は、アデノシンデアミナーゼタンパク質に核酸結合ドメインが存在するか否かの影響を受ける。一部の実施形態において、基質編集優先性を改変するため、デアミナーゼドメインが二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）又は二本鎖ＲＮＡ結合モチーフ（ｄｓＲＢＭ）に接続される。一部の実施形態において、ｄｓＲＢＤ又はｄｓＲＢＭは、ｈＡＤＡＲ１又はｈＡＤＡＲ２など、ＡＤＡＲタンパク質に由来し得る。一部の実施形態において、少なくとも１つのｄｓＲＢＤ及びデアミナーゼドメインを含む完全長ＡＤＡＲタンパク質が使用される。一部の実施形態において、１つ以上のｄｓＲＢＭ又はｄｓＲＢＤは、デアミナーゼドメインのＮ末端にある。他の実施形態において、１つ以上のｄｓＲＢＭ又はｄｓＲＢＤは、デアミナーゼドメインのＣ末端にある。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼの基質編集優先性は、酵素の活性中心の近傍又は活性中心にあるアミノ酸残基の影響を受ける。一部の実施形態において、基質編集優先性を改変するため、アデノシンデアミナーゼは、突然変異：Ｇ３３６Ｄ、Ｇ４８７Ｒ、Ｇ４８７Ｋ、Ｇ４８７Ｗ、Ｇ４８７Ｙ、Ｅ４８８Ｑ、Ｅ４８８Ｎ、Ｔ４９０Ａ、Ｖ４９３Ａ、Ｖ４９３Ｔ、Ｖ４９３Ｓ、Ｎ５９７Ｋ、Ｎ５９７Ｒ、Ａ５８９Ｖ、Ｓ５９９Ｔ、Ｎ６１３Ｋ、Ｎ６１３Ｒ（ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置を基準とする）の１つ以上及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質における突然変異を含み得る。
特に、一部の実施形態において、編集特異性を低下させるため、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｅ４８８Ｑ、Ｖ４９３Ａ、Ｎ５９７Ｋ、Ｎ６１３Ｋ（ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置を基準とする）の１つ以上及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質における突然変異を含むことができる。一部の実施形態において、編集特異性を増加させるため、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｔ４９０Ａを含むことができる。
一部の実施形態において、オフターゲット効果を低下させるため、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ３４８、Ｖ３５１、Ｔ３７５、Ｋ３７６、Ｅ３９６、Ｃ４５１、Ｒ４５５、Ｎ４７３、Ｒ４７４、Ｋ４７５、Ｒ４７７、Ｒ４８１、Ｓ４８６、Ｅ４８８、Ｔ４９０、Ｓ４９５、Ｒ５１０（ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置を基準とする）における突然変異の１つ以上及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質における突然変異を含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８と、Ｒ３４８、Ｖ３５１、Ｔ３７５、Ｋ３７６、Ｅ３９６、Ｃ４５１、Ｒ４５５、Ｎ４７３、Ｒ４７４、Ｋ４７５、Ｒ４７７、Ｒ４８１、Ｓ４８６、Ｔ４９０、Ｓ４９５、Ｒ５１０から選択される１つ以上の追加的な位置とに突然変異を含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５と、任意選択で１つ以上の追加的な位置とに突然変異を含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ４７３と、任意選択で１つ以上の追加的な位置とに突然変異を含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１と、任意選択で１つ以上の追加的な位置とに突然変異を含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８及びＴ３７５と、任意選択で１つ以上の追加的な位置とに突然変異を含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８及びＮ４７３と、任意選択で１つ以上の追加的な位置とに突然変異を含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８及びＶ３５１と、任意選択で１つ以上の追加的な位置とに突然変異を含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８と、Ｔ３７５、Ｎ４７３及びＶ３５１の１つ以上とに突然変異を含む。
一部の実施形態において、オフターゲット効果を低下させるため、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ３４８Ｅ、Ｖ３５１Ｌ、Ｔ３７５Ｇ、Ｔ３７５Ｓ、Ｒ４５５Ｇ、Ｒ４５５Ｓ、Ｒ４５５Ｅ、Ｎ４７３Ｄ、Ｒ４７４Ｅ、Ｋ４７５Ｑ、Ｒ４７７Ｅ、Ｒ４８１Ｅ、Ｓ４８６Ｔ、Ｅ４８８Ｑ、Ｔ４９０Ａ、Ｔ４９０Ｓ、Ｓ４９５Ｔ及びＲ５１０Ｅ（ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置を基準とする）から選択される突然変異の１つ以上及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質における突然変異を含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｅ４８８Ｑと、Ｒ３４８Ｅ、Ｖ３５１Ｌ、Ｔ３７５Ｇ、Ｔ３７５Ｓ、Ｒ４５５Ｇ、Ｒ４５５Ｓ、Ｒ４５５Ｅ、Ｎ４７３Ｄ、Ｒ４７４Ｅ、Ｋ４７５Ｑ、Ｒ４７７Ｅ、Ｒ４８１Ｅ、Ｓ４８６Ｔ、Ｔ４９０Ａ、Ｔ４９０Ｓ、Ｓ４９５Ｔ及びＲ５１０Ｅから選択される１つ以上の追加的な突然変異とを含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｔ３７５Ｇ又はＴ３７５Ｓと、任意選択で１つ以上の追加的な突然変異とを含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｎ４７３Ｄと、任意選択で１つ以上の追加的な突然変異とを含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｖ３５１Ｌと、任意選択で１つ以上の追加的な突然変異とを含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｅ４８８Ｑ及びＴ３７５Ｇ又はＴ３７５Ｇと、任意選択で１つ以上の追加的な突然変異とを含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｅ４８８Ｑ及びＮ４７３Ｄと、任意選択で１つ以上の追加的な突然変異とを含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｅ４８８Ｑ及びＶ３５１Ｌと、任意選択で１つ以上の追加的な突然変異とを含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｅ４８８Ｑと、Ｔ３７５Ｇ／Ｓ、Ｎ４７３Ｄ及びＶ３５１Ｌの１つ以上とを含む。
一部の実施形態において、中央のＡが標的アデノシン残基であるトリプレット配列ＧＡＣを含む基質など、直接５’側にＧを有する標的アデノシン（Ａ）に対する編集優先性を増加させるため、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｇ３３６Ｄ、Ｅ４８８Ｑ、Ｅ４８８Ｎ、Ｖ４９３Ｔ、Ｖ４９３Ｓ、Ｖ４９３Ａ、Ａ５８９Ｖ、Ｎ５９７Ｋ、Ｎ５９７Ｒ、Ｓ５９９Ｔ、Ｎ６１３Ｋ、Ｎ６１３Ｒ（ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置を基準とする）の１つ以上及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質における突然変異を含むことができる。
特に、一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、中央のＡが標的アデノシン残基である以下のトリプレット配列：ＧＡＣ、ＧＡＡ、ＧＡＵ、ＧＡＧ、ＣＡＵ、ＡＡＵ、ＵＡＣを含む基質を編集するための突然変異Ｅ４８８Ｑ又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する突然変異を含む。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄの野生型アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄ配列に１つ以上の突然変異を含み、ｈＡＤＡＲ１－Ｄの編集効率及び／又は基質編集優先性が具体的な必要性に応じて変更されることになる。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄアミノ酸配列のグリシン１００７又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置１００７のグリシン残基は、比較的小さい側鎖の非極性アミノ酸残基に置き換えられる。例えば、一部の実施形態において、位置１００７のグリシン残基は、アラニン残基に置き換えられる（Ｇ１００７Ａ）。一部の実施形態において、位置１００７のグリシン残基は、バリン残基に置き換えられる（Ｇ１００７Ｖ）。一部の実施形態において、位置１００７のグリシン残基は、比較的大きい側鎖のアミノ酸残基に置き換えられる。一部の実施形態において、位置１００７のグリシン残基は、アルギニン残基に置き換えられる（Ｇ１００７Ｒ）。一部の実施形態において、位置１００７のグリシン残基は、リジン残基に置き換えられる（Ｇ１００７Ｋ）。一部の実施形態において、位置１００７のグリシン残基は、トリプトファン残基に置き換えられる（Ｇ１００７Ｗ）。一部の実施形態において、位置１００７のグリシン残基は、チロシン残基に置き換えられる（Ｇ１００７Ｙ）。加えて、他の実施形態において、位置１００７のグリシン残基は、ロイシン残基に置き換えられる（Ｇ１００７Ｌ）。他の実施形態において、位置１００７のグリシン残基は、スレオニン残基に置き換えられる（Ｇ１００７Ｔ）。他の実施形態において、位置１００７のグリシン残基は、セリン残基に置き換えられる（Ｇ１００７Ｓ）。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄアミノ酸配列のグルタミン酸１００８又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置に突然変異を含む。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、比較的大きい側鎖の極性アミノ酸残基に置き換えられる。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、グルタミン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｑ）。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、ヒスチジン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｈ）。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、アルギニン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｒ）。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、リジン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｋ）。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、非極性アミノ酸残基又は小さい極性アミノ酸残基に置き換えられる。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、フェニルアラニン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｆ）。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、トリプトファン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｗ）。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、グリシン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｇ）。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、イソロイシン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｉ）。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、バリン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｖ）。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、プロリン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｐ）。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、セリン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｓ）。他の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、アスパラギン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｎ）。他の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、アラニン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ａ）。他の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、メチオニン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｍ）。一部の実施形態において、位置１００８のグルタミン酸残基は、ロイシン残基に置き換えられる（Ｅ１００８Ｌ）。
一部の実施形態において、編集効率を改善するため、アデノシンデアミナーゼは、突然変異：Ｅ１００７Ｓ、Ｅ１００７Ａ、Ｅ１００７Ｖ、Ｅ１００８Ｑ、Ｅ１００８Ｒ、Ｅ１００８Ｈ、Ｅ１００８Ｍ、Ｅ１００８Ｎ、Ｅ１００８Ｋ（ｈＡＤＡＲ１－Ｄのアミノ酸配列位置を基準とする）の１つ以上及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質における突然変異を含み得る。
一部の実施形態において、編集効率を低下させるため、アデノシンデアミナーゼは、突然変異：Ｅ１００７Ｒ、Ｅ１００７Ｋ、Ｅ１００７Ｙ、Ｅ１００７Ｌ、Ｅ１００７Ｔ、Ｅ１００８Ｇ、Ｅ１００８Ｉ、Ｅ１００８Ｐ、Ｅ１００８Ｖ、Ｅ１００８Ｆ、Ｅ１００８Ｗ、Ｅ１００８Ｓ、Ｅ１００８Ｎ、Ｅ１００８Ｋ（ｈＡＤＡＲ１－Ｄのアミノ酸配列位置を基準とする）の１つ以上及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質における突然変異を含み得る。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼの基質編集優先性、効率及び／又は選択性は、酵素の活性中心の近傍にある又は活性中心にあるアミノ酸残基の影響を受ける。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄ配列のグルタミン酸１００８位置又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置に突然変異を含む。一部の実施形態において、突然変異は、Ｅ１００８Ｒ又は相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する突然変異である。一部の実施形態において、Ｅ１００８Ｒ突然変異体は、逆鎖にミスマッチＧ残基を有する標的アデノシン残基に対する編集効率が増加している。
一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、二本鎖核酸基質を認識してそれに結合するための１つ以上の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合モチーフ（ｄｓＲＢＭ）又はドメイン（ｄｓＲＢＤ）を更に含むか又はそれに結び付けられている。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼと二本鎖基質との間の相互作用は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳタンパク質因子を含め、１つ以上の追加的なタンパク質因子によって媒介される。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼと二本鎖基質との間の相互作用は、ガイドＲＮＡを含め、１つ以上の核酸成分によって更に媒介される。
特定の例示的実施形態では、定向進化を用いることにより、アデニンからヒポキサンチンへの脱アミノ化以外にも追加的な反応の触媒能を有する改変ＡＤＡＲタンパク質が設計され得る。例えば。
本発明によれば、アデノシンデアミナーゼの基質は、ガイド分子がそのＤＮＡ標的に結合すると形成され、次にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成するＲＮＡ／ＤＮＡｎ ＲＮＡ二重鎖である。このＲＮＡ／ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡｎ ＲＮＡ二重鎖は、本明細書では「ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド」、「ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド」又は「二本鎖基質」とも称される。ガイド分子及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の詳細な特徴については、以下に詳説する。
用語「編集選択性」は、本明細書で使用されるとき、二本鎖基質上の全ての部位のうち、アデノシンデアミナーゼによって編集される割合を指す。理論によって拘束されるものではないが、アデノシンデアミナーゼの編集選択性は、二本鎖基質の長さ並びにミスマッチ塩基、バルジ及び／又は内部ループの存在など、二次構造の影響を受けることが企図される。
一部の実施形態において、基質が５０ｂｐより長い完全に塩基対合する二重鎖であるとき、アデノシンデアミナーゼは、二重鎖内の複数のアデノシン残基を脱アミノ化することが可能であり得る（例えば、全アデノシン残基の５０％）。一部の実施形態において、基質が５０ｂｐより短いとき、アデノシンデアミナーゼの編集選択性は、標的アデノシン部位におけるミスマッチの存在の影響を受ける。特に、一部の実施形態において、逆鎖にミスマッチシチジン（Ｃ）残基を有するアデノシン（Ａ）残基は、高効率で脱アミノ化される。一部の実施形態において、逆鎖にミスマッチグアノシン（Ｇ）残基を有するアデノシン（Ａ）残基は、編集されずにスキップされる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、その構成成分及びかかる構成成分の送達に関する一般的な情報に関して、量及び製剤に関することを含めた、全て本発明の実施において有用な、方法、材料、送達ビヒクル、ベクター、粒子、ＡＡＶ並びにその作製及び使用を含め、米国特許第８，９９９，６４１号明細書、同第８，９９３，２３３号明細書、同第８，９４５，８３９号明細書、同第８，９３２，８１４号明細書、同第８，９０６，６１６号明細書、同第８，８９５，３０８号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書及び同第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願公開第２０１４－０３１０８３０号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３１号明細書）、同第２０１４－０２８７９３８ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２１３，９９１号明細書）、同第２０１４－０２７３２３４ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９３，６７４号明細書）、同第２０１４－０２７３２３２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９０，５７５号明細書）、同第２０１４－０２７３２３１号明細書（米国特許出願第１４／２５９，４２０号明細書）、同第２０１４－０２５６０４６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２６，２７４号明細書）、同第２０１４－０２４８７０２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５８，４５８号明細書）、同第２０１４－０２４２７００ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２２，９３０号明細書）、同第２０１４－０２４２６９９ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，５１２号明細書）、同第２０１４－０２４２６６４ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９９０号明細書）、同第２０１４－０２３４９７２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４７１号明細書）、同第２０１４－０２２７７８７ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５６，９１２号明細書）、同第２０１４－０１８９８９６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３５号明細書）、同第２０１４－０１８６９５８号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０１７号明細書）、同第２０１４－０１８６９１９ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９７７号明細書）、同第２０１４－０１８６８４３ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９００号明細書）、同第２０１４－０１７９７７０ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，８３７号明細書）及び同第２０１４－０１７９００６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４８６号明細書）、同第２０１４－０１７０７５３号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４２９号明細書）；欧州特許第２ ７８４ １６２ Ｂ１号明細書及び同第２ ７７１ ４６８ Ｂ１号明細書；欧州特許出願公開第２ ７７１ ４６８号明細書（ＥＰ１３８１８５７０．７号明細書）、同第２ ７６４ １０３号明細書（ＥＰ１３８２４２３２．６号明細書）及び同第２ ７８４ １６２号明細書（ＥＰ１４１７０３８３．５号明細書）；及びＰＣＴ特許公報、国際公開第２０１４／０９３６６１号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４７４３号明細書）、同第２０１４／０９３６９４号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４７９０号明細書）、同第２０１４／０９３５９５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６１１号明細書）、同第２０１４／０９３７１８号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４８２５号明細書）、同第２０１４／０９３７０９号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４８１２号明細書）、同第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）、同第２０１４／０９３６３５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６９１号明細書）、同第２０１４／０９３６５５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４７３６号明細書）、同第２０１４／０９３７１２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４８１９号明細書）、同第２０１４／０９３７０１号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４８００号明細書）、同第２０１４／０１８４２３号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０５１４１８号明細書）、同第２０１４／２０４７２３号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１７９０号明細書）、同第２０１４／２０４７２４号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８００号明細書）、同第２０１４／２０４７２５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０３号明細書）、同第２０１４／２０４７２６号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０４号明細書）、同第２０１４／２０４７２７号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０６号明細書）、同第２０１４／２０４７２８号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０８号明細書）、同第２０１４／２０４７２９号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０９号明細書）が参照される。また、それぞれ２０１３年１月３０日；２０１３年３月１５日；２０１３年３月２８日；２０１３年４月２０日；２０１３年５月６日及び２０１３年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書；同第６１／８０２，１７４号明細書；同第６１／８０６，３７５号明細書；同第６１／８１４，２６３号明細書；同第６１／８１９，８０３号明細書及び同第６１／８２８，１３０号明細書も参照される。また、２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３６，１２３号明細書も参照される。加えて、各々２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３５，９３１号明細書、同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書及び同第６１／８３５，９７３号明細書が参照される。更に、２０１３年８月５日に出願された米国仮特許出願第６１／８６２，４６８号明細書及び同第６１／８６２，３５５号明細書；２０１３年８月２８日に出願された同第６１／８７１，３０１号明細書；２０１３年９月２５日に出願された同第６１／９６０，７７７号明細書及び２０１３年１０月２８日に出願された同第６１／９６１，９８０号明細書が参照される。なおも更に、各々２０１４年６月１０日、６／１０／１４に出願されたＰＣＴ特許出願：ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０３号明細書、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８００号明細書、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０９号明細書、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０４号明細書及びＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０６号明細書；２０１４年６月１１日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０８号明細書；及び２０１４年１０月２８日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／６２５５８号明細書及び各々２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，１５０号明細書、同第６１／９１５，３０１号明細書、同第６１／９１５，２６７号明細書及び同第６１／９１５，２６０号明細書；２０１３年１月２９日及び２０１３年２月２５日に出願された同第６１／７５７，９７２号明細書及び同第６１／７６８，９５９号明細書；２０１３年６月１７日に出願された同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、同第６１／８３５，９７３号明細書及び同第６１／８３５，９３１号明細書；両方とも２０１４年６月１１日に出願された同第６２／０１０，８８８号明細書及び同第６２／０１０，８７９号明細書；各々２０１４年６月１０日に出願された同第６２／０１０，３２９号明細書及び同第６２／０１０，４４１号明細書；各々２０１４年２月１２日に出願された同第６１／９３９，２２８号明細書及び同第６１／９３９，２４２号明細書；２０１４年４月１５日に出願された同第６１／９８０，０１２号明細書；２０１４年８月１７日に出願された同第６２／０３８，３５８号明細書；各々２０１４年９月２５日に出願された同第６２／０５４，４９０号明細書、同第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書及び同第６２／０５５，４８７号明細書；及び２０１４年１０月２７日に出願された同第６２／０６９，２４３号明細書が参照される。また、２０１４年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書及び同第６２／０５５，４８７号明細書；２０１４年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／９８０，０１２号明細書；及び２０１４年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３９，２４２号明細書も参照される。特に米国を指定するＰＣＴ出願、２０１４年６月１０日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第１４／４１８０６号明細書が参照される。２０１４年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書が参照される。各々２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書及び同第６１／９１５，２６７号明細書が参照される。２０１４年４月１５日に出願された米国特許出願第６１／９８０，０１２号明細書が参照される。特に米国を指定するＰＣＴ出願、２０１４年６月１０日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第１４／４１８０６号明細書が参照される。２０１４年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書が参照される。各々２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書及び同第６１／９１５，２６７号明細書が参照される。
また、１４年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／０９１，４５５号明細書、「ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ）」；米国仮特許出願第６２／０９６，７０８号明細書、１４年１２月２４日、「ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ）」；米国仮特許出願第６２／０９１，４６２号明細書、１４年１２月１２日、「ＤＥＡＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲＳ」；米国仮特許出願第６２／０９６，３２４号明細書、１４年１２月２３日、「ＤＥＡＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲＳ」；米国仮特許出願第６２／０９１，４５６号明細書、１４年１２月１２日、「ＥＳＣＯＲＴＥＤ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＩＺＥＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ」；米国仮特許出願第６２／０９１，４６１号明細書、１４年１２月１２日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＧＥＮＯＭＥ ＥＤＩＴＩＮＧ ＡＳ ＴＯ ＨＥＭＡＴＯＰＯＥＴＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ（ＨＳＣｓ）」；米国仮特許出願第６２／０９４，９０３号明細書、１４年１２月１９日、「ＵＮＢＩＡＳＥＤ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＯＵＢＬＥ－ＳＴＲＡＮＤ ＢＲＥＡＫＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＩＣ ＲＥＡＲＲＡＮＧＥＭＥＮＴ ＢＹ ＧＥＮＯＭＥ－ＷＩＳＥ ＩＮＳＥＲＴ ＣＡＰＴＵＲＥ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ」；米国仮特許出願第６２／０９６，７６１号明細書、１４年１２月２４日、「ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＡＮＤ ＧＵＩＤＥ ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ」；米国仮特許出願第６２／０９８，０５９号明細書、１４年１２月３０日、「ＲＮＡ－ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ」；米国仮特許出願第６２／０９６，６５６号明細書、１４年１２月２４日、「ＣＲＩＳＰＲ ＨＡＶＩＮＧ ＯＲ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＤＥＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ ＤＯＭＡＩＮＳ」；米国仮特許出願第６２／０９６，６９７号明細書、１４年１２月２４日、「ＣＲＩＳＰＲ ＨＡＶＩＮＧ ＯＲ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＡＡＶ」；米国仮特許出願第６２／０９８，１５８号明細書、１４年１２月３０日、「ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸ ＩＮＳＥＲＴＩＯＮＡＬ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ」；米国仮特許出願第６２／１５１，０５２号明細書、１５年４月２２日、「ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＦＯＲ ＥＸＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ ＥＸＯＳＯＭＡＬ ＲＥＰＯＲＴＩＮＧ」；米国仮特許出願第６２／０５４，４９０号明細書、１４年９月２４日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ」；米国仮特許出願第６２／０５５，４８４号明細書、１４年９月２５日、「ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ」；米国仮特許出願第６２／０８７，５３７号明細書、１４年１２月４日、「ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ」；米国仮特許出願第６２／０５４，６５１号明細書、１４年９月２４日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＡＮＣＥＲ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＶＩＶＯ」；米国仮特許出願第６２／０６７，８８６号明細書、１４年１０月２３日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＡＮＣＥＲ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＶＩＶＯ」；米国仮特許出願第６２／０５４，６７５号明細書、１４年９月２４日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＩＮ ＮＥＵＲＯＮＡＬ ＣＥＬＬＳ／ＴＩＳＳＵＥＳ」；米国仮特許出願第６２／０５４，５２８号明細書、１４年９月２４日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＥ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＯＲ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」；米国仮特許出願第６２／０５５，４５４号明細書、１４年９月２５日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＣＥＬＬ ＰＥＮＥＴＲＡＴＩＯＮ ＰＥＰＴＩＤＥＳ（ＣＰＰ）」；米国仮特許出願第６２／０５５，４６０号明細書、１４年９月２５日、「ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ ＡＮＤ／ＯＲ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＬＩＮＫＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ」；米国仮特許出願第６２／０８７，４７５号明細書、１４年１２月４日、「ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ」；米国仮特許出願第６２／０５５，４８７号明細書、１４年９月２５日、「ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ」；米国仮特許出願第６２／０８７，５４６号明細書、１４年１２月４日、「ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ ＡＮＤ／ＯＲ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＬＩＮＫＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ」；及び米国仮特許出願第６２／０９８，２８５号明細書、１４年１２月３０日、「ＣＲＩＳＰＲ ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＩＮ ＶＩＶＯ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＯＦ ＴＵＭＯＲ ＧＲＯＷＴＨ ＡＮＤ ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳ」も挙げられる。
これらの特許、特許公報及び出願の各々並びにそれらの中に又はそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）及び出願引用文献において引用又は参照される全ての文献は、それらの中で言及される又はそれらの中にある任意の文献において言及される及び参照によって本明細書に援用される任意の製品に関する任意の指示書、説明書、製品仕様書及びプロダクトシートと共に、本明細書によって参照により本明細書に援用され、且つ本発明の実施に用いられ得る。全ての文献（例えば、これらの特許、特許公報及び出願並びに出願引用文献）は、各個別の文献が参照によって援用されることが具体的且つ個別的に示されたものとみなすのと同程度に参照により本明細書に援用される。
また、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に関する一般情報に関しては、以下を挙げることができる（同様に参照により本明細書に援用される）：
・“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ”．Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９－２３（２０１３）；
・“ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ”．Ｊｉａｎｇ Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ Ｄ．，Ｃｏｘ Ｄ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ＬＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｍａｒ；３１（３）：２３３－９（２０１３）；
・“Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”．Ｗａｎｇ Ｈ．，Ｙａｎｇ Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ ＣＳ．，Ｄａｗｌａｔｙ ＭＭ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．Ｃｅｌｌ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０－８（２０１３）；
・“Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ”．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ．Ａｕｇ ２２；５００（７４６３）：４７２－６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ ２３（２０１３）；
・“Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｌｉｎ，ＣＹ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，ＡＥ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｃｅｌｌ Ａｕｇ ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２－８６７４（１３）０１０１５－５（２０１３－Ａ）；
・“ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ”．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；
・“Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ”．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１－３０８（２０１３－Ｂ）；
・“Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ”．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；
・“Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ”．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｔａ，ＳＩ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．Ｃｅｌｌ Ｆｅｂ ２７，１５６（５）：９３５－４９（２０１４）；
・“Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ”．Ｗｕ Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ．，Ｋｒｉｚ ＡＪ．，Ｃｈｉｕ ＡＣ．，Ｈｓｕ ＰＤ．，Ｄａｄｏｎ ＤＢ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ．，Ｃｈｅｎ Ｓ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｒ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９（２０１４）；
・“ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ”．Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｙｉｍ ＭＪ，Ｓｗｉｅｃｈ Ｌ，Ｋｅｍｐｔｏｎ ＨＲ，Ｄａｈｌｍａｎ ＪＥ，Ｐａｒｎａｓ Ｏ，Ｅｉｓｅｎｈａｕｒｅ ＴＭ，Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ Ｍ，Ｇｒａｈａｍ ＤＢ，Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａ Ｓ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｘａｖｉｅｒ ＲＪ，Ｌａｎｇｅｒ Ｒ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＧ，Ｈａｃｏｈｅｎ Ｎ，Ｒｅｇｅｖ Ａ，Ｆｅｎｇ Ｇ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｃｅｌｌ １５９（２）：４４０－４５５ ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４（２０１４）；
・“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｃｅｌｌ．Ｊｕｎ ５；１５７（６）：１２６２－７８（２０１４）
・“Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｗａｎｇ Ｔ，Ｗｅｉ ＪＪ，Ｓａｂａｔｉｎｉ ＤＭ，Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｊａｎｕａｒｙ ３；３４３（６１６６）：８０－８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１（２０１４）；
・“Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｇＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，Ｄｏｅｎｃｈ ＪＧ，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ Ｅ，Ｇｒａｈａｍ ＤＢ，Ｔｏｔｈｏｖａ Ｚ，Ｈｅｇｄｅ Ｍ，Ｓｍｉｔｈ Ｉ，Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒ Ｍ，Ｅｂｅｒｔ ＢＬ，Ｘａｖｉｅｒ ＲＪ，Ｒｏｏｔ ＤＥ．，（オンライン発行 ３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｄｅｃ；３２（１２）：１２６２－７（２０１４）；
・“Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９”，Ｓｗｉｅｃｈ Ｌ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ａ，Ｈａｂｉｂ Ｎ，Ｌｉ Ｙ，Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ Ｊ，Ｓｕｒ Ｍ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（オンライン発行 １９ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊａｎ；３３（１）：１０２－６（２０１５）；
・“Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｏｍｐｌｅｘ”，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｊｏｕｎｇ Ｊ，Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ＯＯ，Ｂａｒｃｅｎａ Ｃ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈａｂｉｂ Ｎ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＳ，Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ Ｈ，Ｎｕｒｅｋｉ Ｏ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｊａｎ ２９；５１７（７５３６）：５８３－８（２０１５）
・“Ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ”，Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｖｏｌｚ ＳＥ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ０２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｆｅｂ；３３（２）：１３９－４２（２０１５）；
・“Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ”，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｓａｎｊａｎａ ＮＥ，Ｚｈｅｎｇ Ｋ，Ｓｈａｌｅｍ Ｏ，Ｌｅｅ Ｋ，Ｓｈｉ Ｘ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｐａｎ ＪＱ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ Ｒ，Ｌｅｅ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｃｅｌｌ １６０，１２４６－１２６０，Ｍａｒｃｈ １２，２０１５（マウスにおける多重スクリーニング）、及び
・“Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９”，Ｒａｎ ＦＡ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｙａｎ ＷＸ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＳ，Ｋｒｉｚ ＡＪ，Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｓｈａｌｅｍ Ｏ，Ｗｕ Ｘ，Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ０１ Ａｐｒｉｌ ２０１５），Ｎａｔｕｒｅ．Ａｐｒ ９；５２０（７５４６）：１８６－９１（２０１５）
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，２９９－３１１（Ｍａｙ ２０１５）
・Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ”，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５，１１４７－１１５７（Ａｕｇｕｓｔ ２０１５）
・Ｐａｒｎａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｄｉｓｓｅｃｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ”，Ｃｅｌｌ １６２，６７５－６８６（Ｊｕｌｙ ３０，２０１５）
・Ｒａｍａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：１０８３３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０８３３（Ｊｕｎｅ ２，２０１５）
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９”，Ｃｅｌｌ １６２，１１１３－１１２６（Ａｕｇ．２７，２０１５）
・Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５），“Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｃｅｌｌ １６３，７５９－７７１（Ｏｃｔ．２２，２０１５）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０９．０３８．Ｅｐｕｂ Ｓｅｐ．２５，２０１５
・Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５），“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０，３８５－３９７（Ｎｏｖ．５，２０１５）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８．Ｅｐｕｂ Ｏｃｔ ２２，２０１５
・Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｉｔｈ ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，１１５９－１１６１（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１５）
・Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃｐｆ１ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ”，ｂｉｏＲｘｉｖ ０９１６１１；ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０９１６１１ Ｅｐｕｂ Ｄｅｃ．４，２０１６
・Ｓｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），“Ｃａｓ１３ｂ Ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６５，６１８－６３０（Ｆｅｂ．１６，２０１７）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．１２．０２３．Ｅｐｕｂ Ｊａｎ ５，２０１７
この各々が参照により本明細書に援用され、本発明の実施において考慮され得、及び以下に簡単に考察する：
・Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．は、サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９及びまた化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の両方に基づき、真核細胞で使用されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をエンジニアリングし、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが低分子ＲＮＡの指図を受けてヒト及びマウス細胞で正確なＤＮＡ切断を誘導し得ることを実証した。この著者らの研究は、ニッキング酵素に変換されるＣａｓ９を使用して、最小限の変異原活性を有する真核細胞での相同性組換え修復を促進し得ることを更に示した。加えて、この著者らの研究は、複数のガイド配列を単一のＣＲＩＳＰＲ配列にコードすることによって哺乳類ゲノム内の内在性ゲノム遺伝子座部位で幾つかを同時に編集することが可能となり得ることを実証し、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ技術の容易なプログラム可能性及び広範な適用性を実証した。このようにＲＮＡを使用して細胞における配列特異的ＤＮＡ切断をプログラムすることが可能となり、ゲノムエンジニアリングツールの新しいクラスが定義された。これらの研究は、他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が哺乳類細胞に移植可能である可能性があり、哺乳類ゲノム切断も媒介し得ることを更に示した。重要なことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の幾つかの側面を更に改良してその効率及び多用途性を高め得ることが想定され得る。
・Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、デュアルＲＮＡと複合体を形成したクラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のゲノムに正確な突然変異を導入した。この手法は、標的ゲノム部位におけるデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９誘導切断によって非突然変異細胞を死滅させることに依存するものであり、選択可能マーカー又は対抗選択系の必要性が回避される。この研究は、単一及び複数のヌクレオチド変化が生じるように短鎖ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の配列を変えることによってデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９特異性を再プログラム化すると、鋳型の編集が行われることを報告した。この研究は、２つのｃｒＲＮＡを同時に使用すると突然変異誘発の多重化が可能であることを示した。更に、この手法を組換えと組み合わせて用いたとき、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）では、記載される手法を用いて回収された細胞のほぼ１００％が所望の突然変異を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では回収された細胞の６５％が突然変異を含んだ。
・Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いることにより、胚性幹細胞における逐次的組換え及び／又は及び／又は時間のかかる単一突然変異を有するマウスの交雑による複数の段階で従来作成された複数の遺伝子に突然変異を保有するマウスを一段階で作成した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は機能的に重複する遺伝子及び上位遺伝子相互作用のインビボ研究を大幅に加速させ得る。
・Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素及びまた転写活性化因子様エフェクターに基づくＤＮＡ結合ドメインの光学的及び化学的調節を可能にする多用途の且つロバストな技術が当該技術分野で必要とされていることに対処した。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３－Ａ）は、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体を対のガイドＲＮＡと組み合わせて標的二本鎖切断を導入するという手法を記載した。これは、微生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のＣａｓ９ヌクレアーゼがガイド配列によって特異的なゲノム遺伝子座に標的化されるが、ガイド配列はＤＮＡ標的との幾らかのミスマッチに耐えることができるため、従って望ましくないオフターゲット突然変異誘発を促進し得るという問題に対処する。ゲノム中の個々のニックは高いフィデリティで修復されるため、二本鎖切断には適切にオフセットしたガイドＲＮＡによる同時のニッキングが必要であり、標的切断のために特異的に認識される塩基の数が大きくなる。この著者らは、対のニッキングを使用して細胞系におけるオフターゲット活性を５０～１，５００分の１に減らし、オンターゲット切断効率を犠牲にすることなしにマウス接合体における遺伝子ノックアウトを促進し得ることを実証した。この多用途戦略により、高い特異性が要求される多種多様なゲノム編集適用が可能となる。
・Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、標的部位の選択を知らせ、且つオフターゲット効果を回避するためのヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９ターゲティングの特異性を特徴付けた。この研究は、７００個を超えるガイドＲＮＡ変異体並びに２９３Ｔ及び２９３ＦＴ細胞の１００個を超える予測ゲノムオフターゲット遺伝子座におけるＳｐＣａｓ９誘導インデル突然変異レベルを評価した。この著者ら、ＳｐＣａｓ９が、ミスマッチの数、位置及び分布に感受性を示して配列依存的に種々の位置におけるガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチに耐えること。この著者らは、ＳｐＣａｓ９媒介性切断がＤＮＡメチル化の影響を受けないこと、ＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの投与量を滴定してオフターゲット改変を最小限に抑え得ることを更に示した。加えて、哺乳類ゲノムエンジニアリング適用を促進するため、この著者らは、標的配列の選択及び検証並びにオフターゲット解析をガイドするウェブベースのソフトウェアツールの提供を報告した。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３－Ｂ）は、哺乳類細胞における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同性組換え修復（ＨＤＲ）を用いたＣａｓ９媒介性ゲノム編集用並びに下流機能研究のための改変細胞系作成用のツールの組を記載した。オフターゲット切断を最小限に抑えるため、この著者らは、対のガイドＲＮＡを含むＣａｓ９ニッカーゼ突然変異体を使用した二重ニッキング戦略を更に記載した。この著者らによって提供されるプロトコルから、標的部位の選択、切断効率の評価及びオフターゲット活性の分析に関する指針が実験的に導かれた。この研究は、標的設計から始めて、僅か１～２週間以内に遺伝子改変を達成し得ると共に、２～３週間以内に改変クローン細胞系を誘導し得ることを示した。
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．は、ゲノムワイドな規模で遺伝子機能を調べる新しい方法を記載した。この著者らの研究は、６４，７５１個のユニークなガイド配列で１８，０８０個の遺伝子を標的化するゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリの送達が、ヒト細胞におけるネガティブ選択及びポジティブ選択の両方のスクリーニングを可能にしたことを示した。第一に、この著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリを使用した、癌及び多能性幹細胞における細胞生存にとって不可欠な遺伝子の同定を示した。次に、この著者らは黒色腫モデルにおいて、その欠損が突然変異体プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬ベムラフェニブに対する耐性に関わる遺伝子をスクリーニングした。この著者らの研究は、最も上位にランク付けされた候補に、以前検証された遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２並びに新規ヒットＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ及びＴＡＤＡ１が含まれたことを示した。この著者らは、同じ遺伝子を標的化する独立したガイドＲＮＡ間における高度な一致及び高率のヒット確認を観察し、従ってＣａｓ９によるゲノム規模スクリーニングの有望さを実証した。
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．は、２．５Åの分解能でｓｇＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体形成する化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造を報告した。この構造から、標的認識ローブとヌクレアーゼローブとで構成された、それらの界面にある正電荷の溝にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖を受け入れる２ローブ構成が明らかになった。認識ローブはｓｇＲＮＡ及びＤＮＡの結合に決定的に重要であるのに対し、ヌクレアーゼローブはＨＮＨ及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、これらのドメインは標的ＤＮＡのそれぞれ相補鎖及び非相補鎖の切断に適切な位置にある。ヌクレアーゼローブは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）との相互作用に関与するカルボキシル末端ドメインも含む。この高分解能構造解析及び付随する機能解析により、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイド下ＤＮＡターゲティングの分子機構が明らかになることで、従って新規の多用途ゲノム編集技術の合理的な設計への道が開かれつつある。
・Ｗｕ ｅｔ ａｌ．は、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）においてシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を負荷した化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のゲノムワイドな結合部位をマッピングした。この著者らは、試験した４つのｓｇＲＮＡの各々が、多くの場合にｓｇＲＮＡにおける５ヌクレオチドシード領域及びＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）によって特徴付けられる数十個ないし数千個のゲノム部位にｄＣａｓ９を標的化することを示した。クロマチンが接触不可能であることにより、一致するシード配列を含む他の部位に対するｄＣａｓ９結合が減少し、従ってオフターゲット部位の７０％が遺伝子と会合する。この著者らは、触媒活性Ｃａｓ９を形質移入したｍＥＳＣにおける２９５個のｄＣａｓ９結合部位の標的シーケンシングから、バックグラウンドレベルを上回って突然変異した部位は１つのみ同定されたことを示した。この著者らは、Ｃａｓ９結合及び切断の２状態モデルを提案しており、このモデルではシードの一致が結合を引き起こすが、切断には標的ＤＮＡとの広範な対合が必要である。
・Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．はＣｒｅ依存性Ｃａｓ９ノックインマウスを樹立した。この著者らは、ニューロン、免疫細胞及び内皮細胞においてガイドＲＮＡのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性、レンチウイルス媒介性又は粒子媒介性送達を用いたインビボ並びにエキソビボゲノム編集を実証した。
・Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、細胞の遺伝子スクリーニングを含めたヨーグルトからゲノム編集に至るまでのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の歴史を広く考察するレビュー論文である。
・Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、ゲノム規模のレンチウイルスシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ライブラリを使用するポジティブ選択及びネガティブ選択の両方に好適なプールされた機能喪失型遺伝子スクリーニング手法に関する。
・Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．は、６個の内因性マウス遺伝子及び３個の内因性ヒト遺伝子のパネルの可能な全ての標的部位にわたってタイリングするｓｇＲＮＡのプールを作成し、その標的遺伝子のヌル対立遺伝子を産生するそれらの能力を抗体対比染色及びフローサイトメトリーによって定量的に評価した。この著者らは、ＰＡＭの最適化により活性が向上することを示し、また、ｓｇＲＮＡを設計するためのオンラインツールも提供した。
・Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ．は、ＡＡＶ媒介性ＳｐＣａｓ９ゲノム編集により脳における遺伝子機能の逆遺伝学研究が可能となり得ることを実証している。
・Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、複数のエフェクタードメイン、例えば転写アクチベーター、機能及びエピゲノム調節因子をステム又はテトラループなどのガイド上の適切な位置にリンカーを伴い及び伴わず付加する能力を考察している。
・Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．は、Ｃａｓ９酵素が２つにスプリットされることができ、従って活性化のためのＣａｓ９のアセンブリを制御し得ることを実証している。
・Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．は、マウスにおけるゲノムワイドなインビボＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９スクリーニングによって肺転移の調節遺伝子が明らかになることを実証することによる多重スクリーニングに関する。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）はＳａＣａｓ９及びそのゲノム編集能力に関し、生化学アッセイからは推定できないことを実証している。Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）融合物を使用して発現を合成的に抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）する方法を記載し、アレイ化且つプール化されたスクリーンを含め、ゲノムスケールのスクリーン用のＣａｓ９を使用した進歩、ゲノム遺伝子座を不活性化するノックアウト手法及び転写活性を調節する戦略を示している。
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）の融合物を用いて発現を合成的に抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）する方法について記載し、アレイ化及びプール化されたスクリーニングを含めたゲノム規模のスクリーニング、ゲノム遺伝子座を不活性化させるノックアウト手法及び転写活性を調節するストラテジーにＣａｓ９を用いる進歩を示している。
・Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、ＣＲＩＳＰＲベースのスクリーニングにおけるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の効率に寄与するＤＮＡ配列特徴を評価した。この著者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトの効率及び切断部位におけるヌクレオチド優先度を調査した。この著者らは、ＣＲＩＳＰＲｉ／ａの配列優先度がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトのものと実質的に異なることも見出した。
・Ｐａｒｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、ゲノムワイドなプールＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ライブラリを樹状細胞（ＤＣ）に導入することにより、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）による腫瘍壊死因子（Ｔｎｆ）の誘導を制御する遺伝子を同定した。Ｔｌｒ４シグナル伝達の既知の調節因子及びこれまで知られていない候補が同定され、ＬＰＳに対するカノニカルな応答への個別的な効果を有する３つの機能モジュールに分類された。
・Ｒａｍａｎａｎ ｅｔ ａｌ（２０１５）は、感染細胞におけるウイルスエピソームＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の切断を実証した。ＨＢＶゲノムは感染ヘパトサイトの核に、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）と呼ばれる３．２ｋｂの二本鎖エピソームＤＮＡ種として存在し、ｃｃｃＤＮＡは、現在の治療法によってはその複製が阻害されないＨＢＶライフサイクルの主要な構成成分である。この著者らは、ＨＢＶの高度に保存された領域を特異的に標的化するｓｇＲＮＡがウイルス複製をロバストに抑制し、ｃｃｃＤＮＡを枯渇させることを示した。
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、５’－ＴＴＧＡＡＴ－３’ＰＡＭ及び５’－ＴＴＧＧＧＴ－３’ＰＡＭを含有する、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及びその二本鎖ＤＮＡ標的との複合体中のＳａＣａｓ９の結晶構造を報告した。ＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９の構造比較により、構造的保存及び多様性の両方が明らかとなり、それらの特徴的なＰＡＭ特異性及びオルソロガスｓｇＲＮＡ認識が説明された。
・Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、推定クラス２ ＣＲＩＳＰＲエフェクターであるＣｐｆ１の特徴付けを報告した。Ｃｐｆ１はＣａｓ９と異なる特徴をもってロバストなＤＮＡ干渉を媒介することが実証された。この干渉機構の同定により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に関する本発明者らの理解が深まり、そのゲノム編集適用が進歩する。
・Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、３つの異なるクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の特徴付けを報告した。同定された系の２つのエフェクター、Ｃ２ｃ１及びＣ２ｃ３は、Ｃｐｆ１と遠縁のＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含む。第３の系、Ｃａｓ１３ｂは、２つの予測ＨＥＰＮ ＲＮアーゼドメインを有するエフェクターを含む。
・Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）は、構造誘導型飽和突然変異誘発スクリーンを用いてＣｐｆ１のターゲティング範囲を増加させることを報告した。ＡｓＣｐｆ１変異体が、それぞれＴＹＣＶ／ＣＣＣＣ及びＴＡＴＶ ＰＡＭを有する標的部位を切断することのできる突然変異Ｓ５４２Ｒ／Ｋ６０７Ｒ及びＳ５４２Ｒ／Ｋ５４８Ｖ／Ｎ５５２Ｒによってエンジニアリングされ、インビトロ及びヒト細胞における活性が増進した。
また、“Ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ”，Ｓｈｅｎｇｄａｒ Ｑ．Ｔｓａｉ，Ｎｉｃｏｌａｓ Ｗｙｖｅｋｅｎｓ，Ｃｙｄ Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ａ．Ｆｏｄｅｎ，Ｖｉｓｈａｌ Ｔｈａｐａｒ，Ｄｅｅｐａｋ Ｒｅｙｏｎ，Ｍａｔｈｅｗ Ｊ．Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ａｒｙｅｅ，Ｊ．Ｋｅｉｔｈ Ｊｏｕｎｇ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（６）：５６９－７７（２０１４）は、伸長した配列を認識し、且つヒト細胞において内因性遺伝子を高効率で編集することのできる二量体ＲＮＡガイド下ＦｏｋＩヌクレアーゼに関する。
加えて、ｓｇＲＮＡ・Ｃａｓ９タンパク質含有粒子を調製する方法であって、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質（及び任意選択でＨＤＲ鋳型）を含む混合物を界面活性剤、リン脂質、生分解性ポリマー、リポタンパク質及びアルコールを含むか又はそれらから本質的になるか又はそれらからなる混合物と混合することを含む方法；及びかかる方法からの粒子に関して、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ」という名称のＰＣＴ出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第１４／７００５７号明細書、代理人整理番号４７６２７．９９．２０６０及びＢＩ－２０１３／１０７（２０１４年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／０５４，４９０号明細書；２０１４年６月１０日に出願された同第６２／０１０，４４１号明細書；及び各々２０１３年１２月１２日に出願された同第６１／９１５，１１８号明細書、同第６１／９１５，２１５号明細書及び同第６１／９１５，１４８号明細書の１つ以上又は全てからの優先権を主張する）（「粒子送達ＰＣＴ」）（参照により本明細書に援用される）が挙げられる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとが、有利には滅菌ヌクレアーゼフリー緩衝液、例えば１×ＰＢＳ中に、好適な、例えば３：１～１：３又は２：１～１：２又は１：１のモル比で、好適な温度、例えば１５～３０℃、例えば２０～２５℃、例えば室温で、好適な時間、例えば１５～４５、例えば３０分間にわたり共に混合された。それとは別に、界面活性剤、例えばカチオン性脂質、例えば１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；リン脂質、例えばジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）；生分解性ポリマー、例えばエチレングリコールポリマー又はＰＥＧ及びリポタンパク質、例えば低密度リポタンパク質、例えばコレステロールなど又はそれらを含む粒子構成成分が、アルコール、有利にはＣ１～６アルキルアルコール、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、例えば１００％エタノール中に溶解された。これらの２つの溶液が共に混合され、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体を含有する粒子が形成された。従って、複合体全体を粒子に製剤化する前に、ｓｇＲＮＡをＣａｓ９タンパク質と予め複合体化し得る。製剤は、細胞への核酸の送達を促進することが知られる種々のモル比の種々の構成成分（例えば、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジテトラデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びコレステロール）で作製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ：ＰＥＧ：コレステロールのモル比はＤＯＴＡＰ１００、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ０、コレステロール０；又はＤＯＴＡＰ９０、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ１０、コレステロール０；又はＤＯＴＡＰ９０、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ５、コレステロール５、ＤＯＴＡＰ１００、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ０、コレステロール０であり得る。従って、本出願は、ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質及び粒子を形成する構成成分を混合すること；並びにかかる混合からの粒子を包含する。本発明の態様は、粒子；例えば、本発明にあるようなｓｇＲＮＡ及び／又はＣａｓ９を含む混合物と、例えば粒子送達ＰＣＴにあるような、粒子を形成する構成成分とを混合して粒子を形成することにより、例えば、粒子送達ＰＣＴと同様の方法を使用する粒子及びかかる混合からの粒子（又は当然ながら本発明にあるようなｓｇＲＮＡ及び／又はＣａｓ９を含む他の粒子）を含み得る。
実施例１：Ｃａｓ１３ｂオルソログ
以下の表１に示すＣａｓ１３ｂタンパク質は、有利には、哺乳類細胞での発現にコドン最適化される構築物から作製される。以下の配列は、タンパク質配列の受託番号と共に図１にも示す。Ｃａｓ１３ｂオルソログのＰＦＳモチーフを表２に提供する。
Figure 2023052236000008
Figure 2023052236000009
Figure 2023052236000010
Figure 2023052236000011
Figure 2023052236000012
Figure 2023052236000013
Figure 2023052236000014
Figure 2023052236000015
Figure 2023052236000016
Figure 2023052236000017
Figure 2023052236000018
Figure 2023052236000019
Figure 2023052236000020
Figure 2023052236000021
実施例２：哺乳類細胞におけるＣａｓ１３ｂの活性
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に以下のプラスミドを標準的なリポフェクタミン２０００プロトコルを用いてトランスフェクトした。
（ａ）Ｃａｓ１３ｂ（又は対照Ｃ２ｃ２）哺乳類発現プラスミド、遺伝子のＣ末端に１×核外移行配列タグを有する。
（ｂ）ｃｒＲＮＡ発現プラスミド、各々がガウシアルシフェラーゼに対するターゲティングｃｒＲＮＡ又はノンターゲティングｃｒＲＮＡのいずれかを発現する。
（ｃ）ルシフェラーゼレポータープラスミド、２つの別個のプロモーターからガウシア及びウミホタルルシフェラーゼを発現する。
ガウシアルシフェラーゼをノックダウンの標的とし、ウミホタルルシフェラーゼのレベルを用いてトランスフェクション効率の対照をとった。レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｃ２ｃ２をＣ２ｃ２オルソログとの比較に使用した。
それぞれのガイドに以下のスペーサー配列を使用した。
Figure 2023052236000022
種々のＣａｓ１３ｂオルソログの結果を図２に提供する。オルソログは、活性が低い／なし、中程度、高い又はゴールドに分類される。「ゴールド」のオルソログは、試験したガイドの大多数でルシフェラーゼ活性の＞８０％のノックダウンをもたらした。「高い」オルソログは、試験したガイドの大多数でルシフェラーゼ活性の＞５０％のノックダウンをもたらした。「中程度」のオルソログは、試験したガイドの大多数でルシフェラーゼ活性の約５０％のノックダウンをもたらした。「低い／なし」のオルソログは、試験した全てのガイドでルシフェラーゼ活性の＜８０％のノックダウンをもたらした。
図３は、ガイド２（ＧＧＧＣＡＴＴＧＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＣＣＴ）及び対照としてのノンターゲティングガイド（ＧＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡ）を使用した、試験したオルソログの幾つかの活性に関する正規化比較データを示す。Ｃａｓ１３ｂオルソログ１４、１５、１９及び２０番（ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）及びポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ－０５２ＯＨ４９４６由来）が哺乳類細胞において特に活性であることが分かる。
図４は、幾つかのルシフェラーゼターゲティングガイド及びノンターゲティング対照ガイドを使用した、２つの最も有効なオルソログ１４及び１５をＣ２ｃ２／Ｃａｓ１３ａと比較する正規化データを示す。Ｃａｓ１３ｂオルソログ１４及び１５番（ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）及びプレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５由来）が一貫して哺乳類細胞においてレプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｃ２ｃ２よりも高活性であることが分かる。
実施例３
効率的で正確な核酸編集は、特にＲＮＡレベルでの遺伝性疾患の治療に大いに有望であり、ここで、疾患関連転写物がレスキューされて機能性タンパク質産物が生じ得る。ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、プログラム可能なシングルエフェクターＲＮＡ誘導型ＲＮアーゼＣａｓ１３を含有する。ここで、本発明者らは、ロバストなノックダウン能を有するＣａｓ１３オルソログをエンジニアリングするためＶＩ型系の多様性をプロファイリングし、哺乳類細胞において触媒不活性Ｃａｓ１３（ｄＣａｓ１３）を使用してアデノシンデアミナーゼ活性を転写物に向けることによるＲＮＡ編集を実証する。ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインをｄＣａｓ１３と融合し、最適なＲＮＡ二重鎖基質が作り出されるようにガイドＲＮＡをエンジニアリングすることにより、本発明者らは、特異的な単一のアデノシンからイノシン（これは、翻訳中、グアノシンとして読み取られる）への標的化した編集をルーチンでは２０～４０％の範囲及び最高８９％の効率で実現する。プログラム可能なＡからＩへの置換のためのＲＮＡ編集（ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａ ｔｏ Ｉ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ＲＥＰＡＩＲ）と称されるこの系は、高い特異性を実現するように更にエンジニアリングすることができる。エンジニアリングされた変異体、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、ロバストなオンターゲットのＡからＩへの編集を維持しつつ、１７０倍を超える特異性の増加を呈する。本発明者らは、ＲＥＰＡＩＲｖ２を使用して、既知の病原性突然変異を含む完全長転写物を編集し、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにおけるパッケージングに好適な機能性のトランケート型を作り出す。ＲＥＰＡＩＲは、研究、治療及びバイオテクノロジーへの幅広い適用性を備えた有望なＲＮＡ編集プラットフォームを提供する。正確な核酸編集技術は、細胞機能の研究に及び新規治療法として価値がある。Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどの現在の編集ツールは、ゲノム遺伝子座のプログラム可能な改変を実現できるが、挿入又は欠失に起因して編集が不均一なことも多いか、又は正確な編集にドナー鋳型が必要である。ｄＣａｓ９－ＡＰＯＢＥＣ融合物などの塩基編集体は、二本鎖切断を生成することなく編集が可能であるが、標的ウィンドウ内の任意のシチジンを編集するシチジンデアミナーゼ活性の性質に起因して、正確さに欠くものとなり得る。更に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の要件により、可能な編集部位の数が制限される。ここで、本発明者らは、ＶＩ型の原核生物のクラスター化した規則的間隔の短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）適応免疫系からのＲＮＡ誘導型ＲＮＡターゲティングＣａｓ１３酵素を使用した正確で柔軟性のあるＲＮＡベースの編集ツールの開発について記載する。
正確な核酸編集技術は、細胞機能の研究にとって及び新規治療法として価値がある。現在の編集ツールは、原核生物のクラスター化した規則的間隔の短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼＣａｓ９（１～４）又はＣｐｆ１（５）などのプログラム可能なヌクレアーゼをベースとするものであり、標的化したＤＮＡ切断の媒介、次に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を通じた標的化した遺伝子破壊又は鋳型依存的相同組換え修復（ＨＤＲ）を介した正確な遺伝子編集のドライブに幅広く採用されている（６）。ＮＨＥＪは、分裂細胞及び分裂終了細胞の両方で活性な宿主の機構を利用するものであり、タンパク質コード遺伝子のフレームシフトにつながり得る挿入又は欠失（インデル）突然変異混合物の生成によって効率的な遺伝子破壊を提供する。対照的に、ＨＤＲは、発現の大部分が複製細胞に限られている宿主の機構によって媒介される。このように、分裂終了細胞における遺伝子編集能力の開発は、依然として大きい課題である。最近では、触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を使用してシチジンデアミナーゼ活性を特定のゲノム標的に標的化させることにより標的ウィンドウ内でシトシンからチミンへの変換を生じさせるなど、ＤＮＡベースの編集体により、ＤＮＡ二本鎖切断を生成することなく編集が可能であり、インデルの形成が有意に低下する（７、８）。しかしながら、ＤＮＡベースの編集体の標的範囲は、編集部位におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に関するＣａｓ９の要件に起因して制限される（９）。ここで、本発明者らは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ誘導型ＲＮアーゼＣａｓ１３を使用した正確で柔軟性のあるＲＮＡベースの編集技術の開発について記載する（１０～１３）。
Ｃａｓ１３酵素は、正確なＲＮＡ切断を媒介する２つの高等真核生物及び原核生物ヌクレオチド結合（ＨＥＰＮ）エンドＲＮアーゼドメインを有する（１０、１１）。現在までに３つのＣａｓ１３タンパク質ファミリーが同定されている：Ｃａｓ１３ａ（旧称Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｃ（１２、１３）。本発明者らは、最近になって、Ｃａｓ１３ａ酵素を核酸検出用（１４）並びに哺乳類及び植物細胞ＲＮＡノックダウン及び転写物トラッキング用（１５）のツールとして適合させ得ることを報告した。Ｃａｓ１３酵素は、そのＲＮＡ誘導型の性質により、ＲＮＡ結合及び摂動適用に魅力的なツールとなる。
ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）酵素ファミリーは、翻訳及びスプライシングにおいて機能上はグアノシンと均等な核酸塩基であるイノシンへとアデノシンを加水分解的に脱アミノ化することによる転写物の内因性編集を媒介する（１６）。２つの機能性のヒトＡＤＡＲオルソログ、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２があり、これらは、Ｎ末端二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン及びＣ末端触媒脱アミノ化ドメインからなる。ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２の内因性標的部位は、実質的な二本鎖同一性を含み、触媒ドメインは、インビトロ及びインビボでの効率的な編集に二重鎖化した領域を必要とする（１７、１８）。ＡＤＡＲタンパク質は編集に好ましいモチーフを有し、それが潜在的なターゲティング柔軟性を制限し得るが、ＡＤＡＲ（Ｅ４８８Ｑ）などの高活性突然変異体（１９）は、配列制約を緩和し、アデノシンからイノシンへの編集率を向上させる。ＡＤＡＲは、ＲＮＡ二重鎖においてシチジン塩基に対向するアデノシンを優先的に脱アミノ化し（２０）、正確な塩基編集の有望な機会を提供する。これまでの手法ではＲＮＡガイドによって標的のＡＤＡＲ融合物がエンジニアリングされているが（２１～２４）、これらの手法の特異性は報告されておらず、そのそれぞれのターゲティング機構は、標的認識及びストリンジェンシーを亢進させ得るタンパク質パートナーの補助なしにＲＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーションに依存するものである。
ここで、本発明者らは、哺乳類細胞におけるＲＮＡノックダウン活性に関してＣａｓ１３酵素ファミリー全体をアッセイし、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ）からのＣａｓ１３ｂオルソログを哺乳類細胞適用に最も効率的且つ特異的なものと同定する。次に、本発明者らは、ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメイン（ＡＤＡＲＤＤ）を触媒不活性ＰｓｐＣａｓ１３ｂに融合させて、レポーター及び内因性転写物並びに疾患関連突然変異のプログラム可能なＡからＩ（Ｇ）への置換のためのＲＮＡ編集（ＲＥＰＡＩＲ）を実証する。最後に、本発明者らは、合理的な突然変異誘発スキームを用いてｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ融合物の特異性を向上させることにより、特異性が１７０倍超増加したＲＥＰＡＩＲｖ２を作成する。
細菌構築物の設計及びクローニング
哺乳類コドン最適化Ｃａｓ１３ｂ構築物をＬａｃプロモーターの制御下にクロラムフェニコール耐性ｐＡＣＹＣ１８４ベクターにクローニングした。次に、ＢｓａＩ制限部位によって分けられた２つの対応するダイレクトリピート（ＤＲ）配列をｐＪ２３１１９プロモーターの制御下にＣａｓ１３ｂの下流に挿入した。最後に、Ｔ４ ＰＮＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してターゲティングスペーサー用のオリゴをリン酸化し、Ｔ７リガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を使用してＢｓａＩ消化ベクターにアニール及びライゲートすることにより、ターゲティングＣａｓ１３ｂベクターを生成した。
細菌ＰＦＳスクリーニング
ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、アンピシリン耐性遺伝子ｂｌａの開始コドンの直接下流にある標的部位によって分かれた２つの５’ランダム化ヌクレオチド及び４つの３’ランダム化ヌクレオチドと共にＣａｓ１３ｂ標的を含有するＰＣＲ産物を挿入することにより、ＰＦＳスクリーニング用のアンピシリン耐性プラスミドをクローニングした。次に、１００ｎｇのアンピシリン耐性標的プラスミドを６５～１００ｎｇクロラムフェニコール耐性Ｃａｓ１３ｂ細菌ターゲティングプラスミドと共にＥｎｄｕｒａエレクトロコンピテント細胞に電気穿孔した。プラスミドを細胞に加え、氷上で１５分間インキュベートし、製造者のプロトコルを用いて電気穿孔し、次に細胞に９５０ｕＬの回復培地を加えた後、３７℃で１時間アウトグロースさせた。このアウトグロースをクロラムフェニコール及びアンピシリン二重選択プレートにプレーティングした。アウトグロースの段階希釈物を使用してｃｆｕ／ｎｇ ＤＮＡを推定した。プレーティングから１６時間後、プレートから細胞を掻き取り、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して生存プラスミドＤＮＡを回収した。生存Ｃａｓ１３ｂ標的配列及びその隣接領域をＰＣＲ増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑを用いてシーケンシングした。ＰＦＳ優先性を評価するため、カスタムのｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して元のライブラリでランダム化ヌクレオチドを含有する位置を抽出し、両方のバイオレプリケートに存在するベクター単独条件と比べて枯渇している配列を抽出した。次に、ベクター単独対照と比較したＣａｓ１３ｂ条件におけるＰＦＳ存在量の比の－ｌｏｇ２を使用して好ましいモチーフを計算した。具体的には、特定の閾値を上回る－ｌｏｇ２（試料／ベクター）枯渇比を有する全ての配列を使用して配列モチーフのｗｅｂｌｏｇｏ（ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ）を生成した。各Ｃａｓ１３ｂオルソログのｗｅｂｌｏｇｏの生成に使用した特定の枯渇比値を表７に掲載する。
ＲＮＡ干渉用の哺乳類構築物の設計及びクローニング
哺乳類細胞でＣａｓ１３オルソログを試験するためのベクターを作成するため、哺乳類コドン最適化Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｃ遺伝子をＰＣＲ増幅し、ＥＦ１αプロモーターの制御下において、デュアルＮＬＳ配列及びＣ末端ｍｓｆＧＦＰを含有する哺乳類発現ベクターにゴールデンゲートクローニングした。更に最適化するため、ＥＦ１αプロモーターの制御下において、異なるＣ末端局在化タグを含有するデスティネーションベクターにＣａｓ１３オルソログをゴールデンゲートクローニングした。
ガウシア及びウミホタルルシフェラーゼコードＤＮＡ、ＥＦ１α及びＣＭＶプロモーターをＰＣＲ増幅し、ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してアセンブルすることにより、デュアルルシフェラーゼレポーターをクローニングした。
Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ又はＣａｓ１３ｃオルソログ用の哺乳類ガイドＲＮＡの発現のため、対応するダイレクトリピート配列をゴールデンゲートアクセプター部位と共に合成し、制限消化クローニングによってＵ６発現下にクローニングした。次に、個々のガイドをゴールデンゲートクローニングによって各オルソログの対応する発現骨格にクローニングした。
Ｃａｓ１３干渉特異性のためのプールミスマッチライブラリのクローニング
プールミスマッチライブラリ標的部位をＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ反応では、標的内の各位置に９４％の正しい塩基と２％の各々正しくない塩基との混合物を含む半縮重標的配列をＧ－ルシフェラーゼに含むオリゴを１つのプライマーとして使用し、Ｇ－ルシフェラーゼの非標的領域に対応するオリゴを第２のプライマーとして使用した。次に、ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して野生型Ｇ－ルシフェラーゼの代わりにデュアルルシフェラーゼレポーターにミスマッチライブラリ標的をクローニングした。
ＲＮＡ編集用の哺乳類構築物の設計及びクローニング
ＨＥＰＮドメインの触媒部位における２つのヒスチジンからアラニンへの突然変異（Ｈ１３３Ａ／Ｈ１０５８Ａ）により、ＰｓｐＣａｓ１３ｂを触媒不活性にした（ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ）。ヒトＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインを合成し、ＰＣＲ増幅してｐｃＤＮＡ－ＣＭＶベクター骨格にギブソンクローニングし、ＧＳ又はＧＳＧＧＧＧＳリンカーを介してＣ末端でｄＰｓｐＣａｓ１３ｂに融合した。本発明者らが異なるリンカーを試験した実験について、本発明者らは、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂとＡＤＡＲ２ｄｄとの間に以下の追加的なリンカーをクローニングした：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＥＡＡＡＫ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ及びＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（ＸＴＥＮ）。適切な突然変異体をｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ－ＧＳＧＧＧＧＳ骨格にギブソンクローニングすることにより、特異性突然変異体を作成した。
ノックダウン実験に使用したルシフェラーゼレポーターベクターにＷ８５Ｘ突然変異（ＴＧＧ＞ＴＡＧ）を作り出すことにより、ＲＮＡ編集活性の測定用のルシフェラーゼレポーターベクターを作成した。このレポーターベクターは、正規化対照としての機能性Ｇｌｕｃを発現するが、中途終止部位を付加したため、Ｃｌｕｃ欠損である。ＡＤＡＲ編集モチーフ優先性を試験するため、本発明者らは、Ｃｌｕｃのコドン８５におけるアデノシンの周りの可能な全てのモチーフ（ＸＡＸ）をクローニングした。
ＲＥＰＡＩＲのＰＦＳ優先性を試験するため、本発明者らは、標的領域及びアデノシン編集部位の上流に６塩基対縮重ＰＦＳ配列を含むプールプラスミドライブラリをクローニングした。このライブラリは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）からのｕｌｔｒａｍｅｒとして合成し、プライマーのアニーリング及び配列のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）フィルインによって二本鎖にした。次に、縮重配列を含むこのｄｓＤＮＡ断片を消化したレポーターベクターにギブソンクローニングし、次にこれをイソプロパノール沈殿させて精製した。次に、クローニングしたライブラリをＥｎｄｕｒａコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に電気穿孔し、２４５ｍｍ×２４５ｍｍ正方形バイオアッセイプレート（Ｎｕｎｃ）にプレーティングした。１６時間後、コロニーを回収し、エンドトキシン不含ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬミディプレップキットを使用してミディプレップした。クローニングしたライブラリは、次世代シーケンシングによって確認した。
ＲＥＰＡＩＲ活性の試験用の疾患関連突然変異をクローニングするため、ＣｌｉｎＶａｒに定義されるとおりの疾患病因に関係する３４個のＧ＞Ａ突然変異を選択し、これらの突然変異を囲む２００ｂｐ領域をＣＭＶプロモーター下でｍＳｃａｒｌｅｔｔとＥＧＦＰとの間にゴールデンゲートクローニングした。ＡＶＰＲ２及びＦＡＮＣＣにおける２つの追加的なＧ＞Ａ突然変異をＥＦ１α発現下での全遺伝子配列のギブソンクローニングに選択した。
ＲＥＰＡＩＲ用の哺乳類ガイドＲＮＡの発現のため、ＰｓｐＣａｓ１３ｂダイレクトリピート配列をゴールデンゲートアクセプター部位と共に合成し、制限消化クローニングによってＵ６発現下にクローニングした。次に、ゴールデンゲートクローニングによってこの発現骨格に個々のガイドをクローニングした。
哺乳類細胞培養
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））で哺乳類細胞培養実験を実施し、この細胞株を、高グルコース、ピルビン酸ナトリウム及びＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有の、１×ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１０％ウシ胎仔血清（ＶＷＲ Ｓｅｒａｄｉｇｍ）を更に補足したダルベッコ変法イーグル培地で成長させた。細胞は、８０％未満のコンフルエンシーに維持した。
特に注記されない限り、トランスフェクションの全ては、ポリ－Ｄ－リジン（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ）がコートされた９６ウェルプレートにおいてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。トランスフェクション時点で９０％のコンフルエンシーが確実となるように、トランスフェクションの１６時間前に細胞を約２０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。プレートの各ウェルについて、トランスフェクションプラスミドを総量が２５μｌとなるようにＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と合わせた。別途、２４．５ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭを０．５ｕｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と合わせた。次に、プラスミド及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ溶液を合わせ、５分間インキュベートし、その後、細胞にピペッティングした。
ＲＮＡノックダウン哺乳類細胞アッセイ
レポーター構築物で哺乳類細胞におけるＲＮＡターゲティングを評価するため、１５０ｎｇのＣａｓ１３構築物を３００ｎｇのガイド発現プラスミド及び１２．５ｎｇのノックダウンレポーター構築物と共にコトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で細胞から分泌ルシフェラーゼ含有培地を取り出し、ＰＢＳ中に１：５希釈し、ＢｉｏＬｕｘウミホタル及びＢｉｏｌｕｘガウシアルシフェラーゼアッセイキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によってプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２）において注入プロトコルで活性に関して測定した。実施したレプリケートの全ては、バイオロジカルレプリケートである。
内因性遺伝子のターゲティングのため、１５０ｎｇのＣａｓ１３構築物を３００ｎｇのガイド発現プラスミドと共にコトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で細胞を溶解させ、ＲＮＡを回収し、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の以前記載されている改変を用いて逆転写した。ＫＲＡＳ転写物に対するＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧＡＰＤＨ対照プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃＤＮＡ発現をｑＰＣＲで測定した。ｑＰＣＲ反応は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）で読み取り、３８４ウェルフォーマットにおいて４つの５ｕｌテクニカルレプリケートとした。
ミスマッチ標的のプールライブラリを使用したＲＮＡ特異性の評価
６ウェルプレートに播いたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を使用して、Ｃａｓ１３がミスマッチ標的ライブラリに干渉する能力を試験した。２４００ｎｇ Ｃａｓ１３ベクター、４８００ｎｇのガイド及び２４０ｎｇのミスマッチ標的ライブラリを使用して、約７０％コンフルエント細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で細胞を回収し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）及びＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを使用してＲＮＡを抽出した。製造者の遺伝子特異的プライミングプロトコルに従いｑＳｃｒｉｐｔ Ｆｌｅｘ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）及びＧｌｕｃ特異的ＲＴプライマーを使用して、１ｕｇの抽出したＲＮＡを逆転写した。次に、ｃＤＮＡを増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングした。
１配列当たりのリードをカウントすることによりシーケンシングを分析し、ｌｏｇ２（－リードカウント比）値を決定することにより枯渇スコアを計算した。ここで、リードカウント比は、ターゲティングガイド条件対ノンターゲティングガイド条件におけるリードカウントの比である。このスコア値は、配列上でのＣａｓ１３活性レベルを表し、値が高いほど枯渇が強い、従ってＣａｓ１３切断活性が高いことを表す。シングルミスマッチ及びダブルミスマッチ配列について個別の分布を決定し、各ミスマッチアイデンティティについての枯渇スコアによるヒートマップとしてプロットした。ダブルミスマッチ配列について、所与の位置における可能な全てのダブルミスマッチの平均値をプロットした。
ＲＮＡシーケンシングによる哺乳類細胞におけるＣａｓ１３のトランスクリプトームワイドプロファイリング
トランスクリプトームワイドな特異性を測定するため、１５０ｎｇのＣａｓ１３構築物、３００ｎｇのガイド発現プラスミド及び１５ｎｇのノックダウンレポーター構築物をコトランスフェクトした。ｓｈＲＮＡ条件について、３００ｎｇのｓｈＲＮＡターゲティングプラスミド、１５ｎｇのノックダウンレポーター構築物及び１５０ｎｇのＥＦ１－αドライブｍＣｈｅｒｒｙ（レポーター負荷の均衡をとるため）をコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）でＲＮＡを精製し、ＮＥＢＮｅｘｔポリ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気分離モジュール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｍＲＮＡを選択し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＲＮＡライブラリプレップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）でシーケンシング用に調製した。次に、ＲＮＡシーケンシングライブラリをＮｅｘｔＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシーケンシングした。
トランスクリプトームワイドなシーケンシングデータを分析するため、Ｂｏｗｔｉｅ及びＲＳＥＭバージョン１．２．３１をデフォルトパラメータで使用してリードをＲｅｆＳｅｑ ＧＲＣｈ３８アセンブリとアラインメントした。転写物発現をｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）として定量化し、ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）＞２．５で遺伝子をフィルタリングした。差次的に発現した遺伝子を選択するため、＞２又は＜０．７５の差次的変化のある遺伝子のみを考慮した。差次的発現の統計的有意性は、３つのターゲティングレプリケート対ノンターゲティングレプリケートでのスチューデントｔ検定で判定し、ベンジャミン・ホッホバーグ法（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって＜０．０１％の偽発見率でフィルタリングした。
哺乳類細胞トランスフェクションにおけるＡＤＡＲ ＲＮＡ編集
哺乳類細胞におけるＲＥＰＡＩＲ活性を評価するため、本発明者らは、１５０ｎｇのＲＥＰＡＩＲベクター、３００ｎｇのガイド発現プラスミド及び４０ｎｇのＲＮＡ編集レポーターをトランスフェクトした。４８時間後、細胞からＲＮＡを回収し、遺伝子特異的逆転写プライマーで以前記載された方法を用いて逆転写した。次に、抽出したｃＤＮＡをＮＥＢＮｅｘｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ ＰＣＲマスターミックスを使用して２ラウンドのＰＣＲに供することによりＩｌｌｕｍｉｎａアダプター及び試料バーコードを付加した。次に、ライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ又はＭｉＳｅｑで次世代シーケンシングに供した。次に、シーケンシングウィンドウ内にある全てのアデノシンでＲＮＡ編集率を判定した。
ルシフェラーゼレポーターをＲＮＡ編集の標的とした実験では、本発明者らは、ＲＮＡ回収前に、分泌ルシフェラーゼを含む培地も回収した。この場合、補正後のＣｌｕｃは、低レベルである可能性があるため、本発明者らは、培地を希釈しなかった。本発明者らは、ＢｉｏＬｕｘウミホタル及びＢｉｏｌｕｘガウシアルシフェラーゼアッセイキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によってプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２）において注入プロトコルでルシフェラーゼ活性を測定した。実施したレプリケートの全ては、バイオロジカルレプリケートである。
ＰＦＳ結合哺乳類スクリーニング
編集効率に対するＰＦＳの寄与を決定するため、２２５ｃｍ２フラスコにプレーティングしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に６２５ｎｇのＰＦＳ標的ライブラリ、４．７ｕｇのガイド及び２．３５ｕｇのＲＥＰＡＩＲをコトランスフェクトした。プラスミドを３３ｕｌのＰＬＵＳ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで５３３ｕｌにし、５分間インキュベートし、３０ｕｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及び５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと合わせ、更に５分間インキュベートし、次に細胞にピペッティングした。トランスフェクション後４８時間でＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）によってＲＮＡを回収し、ｑＳｃｒｉｐｔ Ｆｌｅｘ（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）により遺伝子特異的プライマーを使用して逆転写し、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ ＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用した２ラウンドのＰＣＲで増幅することによりＩｌｌｕｍｉｎａアダプター及び試料バーコードを付加した。ライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングし、標的アデノシンにおけるＲＮＡ編集率をＰＦＳアイデンティティにマッピングした。カバレッジを増加させるため、ＰＦＳは、計算的に４ヌクレオチドに縮小した。各ＰＦＳについてＲＥＰＡＩＲ編集率を計算し、対応するＰＦＳのノンターゲティング率を差し引いてバイオロジカルレプリケートで平均した。
全トランスクリプトームシーケンシングによるＡＤＡＲ編集特異性の評価
トランスクリプトームにわたるオフターゲットＲＮＡ編集部位を分析するため、本発明者らは、トランスフェクション後４８時間にＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞から全ＲＮＡを回収した。次に、ＮＥＢＮｅｘｔポリ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気分離モジュール（ＮＥＢ）を使用してｍＲＮＡ画分を集積し、次にＩｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＲＮＡライブラリプレップキット（ＮＥＢ）を使用してこのＲＮＡをシーケンシング用に調製する。次に、ライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングし、１試料当たり少なくとも５００万リードとなるようにロードした。
標的化したトランスクリプトームワイドな実験についてのＲＮＡ編集分析
トランスクリプトームワイドなＲＮＡ編集ＲＮＡシーケンシングデータを分析するため、配列ファイルを５００万リードにランダムにダウンサンプリングした。Ｇｌｕｃ及びＣｌｕｃ配列を加えてＲｅｆＳｅｑ ＧＲＣｈ３８アセンブリを使用してインデックスを生成し、Ｂｏｗｔｉｅ／ＲＳＥＭバージョン１．３．０を使用してリードをアラインメントし、定量化した。次に、アラインメントＢＡＭをソートし、ＲＥＤｉｔｏｏｌｓ［ｃｉｔｅ］を以下のパラメータで使用してＲＮＡ編集部位に関して分析した：－ｔ ８ －ｅ －ｄ －ｌ －Ｕ ［ＡＧ ｏｒ ＴＣ］ －ｐ －ｕ －ｍ２０ －Ｔ６－０ －Ｗ －ｖ １ －ｎ ０．０。非トランスフェクト条件又はＥＧＦＰトランスフェクト条件に見られる任意の有意な編集は、ＳＮＰ又はトランスフェクションのアーチファクトと見なし、オフターゲットの分析から除外した。オフターゲットは、フィッシャーの正確確率検定によって０．５未満のｐ値が得られ、且つ３つのバイオロジカルレプリケートの少なくとも２つで編集部位が同定された場合に有意と見なした。
各オフターゲットの予測変異効果を分析するため、ＳＩＦＴ及びＰｏｌｙＰｈｅｎ－２アノテーションを使用してＵＣＳＣゲノムブラウザツールスイートの一部としての変異体アノテーションインテグレーター（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｈｇＶａｉ）を使用してオフターゲット編集部位のリストを分析した。オフターゲット遺伝子が発癌性であるかどうかを宣言するため、癌における体細胞突然変異のＣＯＳＭＩＣカタログ（ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）からの発癌アノテーションのデータベースである。
ＲＥＰＡＩＲ構築物がＲＮＡレベルに摂動を与えたかどうかを分析するため、ＲＳＥＭ分析から出力された転写物百万分率（ＴＰＭ）値を発現カウントに使用し、ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）をとることにより対数空間に変換した。差次的に調節された遺伝子を見つけ出すため、３つのターゲティングガイドレプリケート対３つのノンターゲティングガイドレプリケートに対してスチューデントｔ検定を実施した。統計的分析は、ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）値が２．５より大きい遺伝子に関してのみ実施し、遺伝子は、その倍率変化が２より大きいか又は０．８より小さかった場合にのみ、差次的に調節されたと見なした。遺伝子は、その偽発見率が０．０１未満の場合に報告した。
哺乳類細胞におけるＣａｓ１３ファミリーメンバーの包括的特徴付け
本発明者らは、以前、哺乳類ノックダウン適用のためのＬｗａＣａｓ１３ａを開発したが、それは、効率的なノックダウンにｍｓｆＧＦＰ安定化ドメインが必要であったと共に、特異性は高かったものの、ノックダウン効率は、一貫して５０％を下回った（１５）。本発明者らは、遺伝的に多様なＣａｓ１３ファミリーメンバーの組を特徴付けて哺乳類細胞におけるそのＲＮＡノックダウン活性を評価することにより、よりロバストなＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を同定しようとした（図５Ａ）。本発明者らは、Ｎ末端及びＣ末端核外移行シグナル（ＮＥＳ）配列並びにタンパク質安定性を高めるためＣ末端ｍｓｆＧＦＰと共に発現ベクターに２１個のＣａｓ１３ａ、１５個のＣａｓ１３ｂ及び７個のＣａｓ１３ｃ哺乳類コドン最適化オルソログ（表４）をクローニングした。哺乳類細胞における干渉をアッセイするため、本発明者らは、別個のプロモーターの下に直交性ガウシア（Ｇｌｕｃ）及びウミホタル（Ｃｌｕｃ）ルシフェラーゼを発現する、それにより一方のルシフェラーゼがＣａｓ１３干渉活性の尺度として機能し、他方が内部対照としての役割を果たすことが可能なデュアルレポーター構築物を設計した。各オルソログについて、本発明者らは、アンピシリン干渉アッセイから導き出されたＣａｓ１３ｂ ＰＦＳモチーフ（図１１；表５）及び以前のＣａｓ１３ａ活性の報告からの３’Ｈ ＰＦＳを使用してＰＦＳ適合性ガイドＲＮＡを設計した（１０）。
本発明者らは、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にＣａｓ１３発現、ガイドＲＮＡ及びレポータープラスミドをトランスフェクトし、４８時間後に標的Ｇｌｕｃレベルを定量化した。各Ｃａｓ１３オルソログについて２つのガイドＲＮＡを試験することにより、最近特徴付けられたＬｗａＣａｓ１３ａと比べて両方のガイドＲＮＡで干渉が同程度であるか又はより高い５つのＣａｓ１３ｂオルソログを含め、ある範囲の活性レベルが明らかになった（図５Ｂ）。本発明者らは、これらの５つのＣａｓ１３ｂオルソログ並びに上位２つのＣａｓ１３ａオルソログを更なるエンジニアリングに選択した。
本発明者らは、次に、ロバストな活性に安定化ドメインが必要でないオルソログを選択するため、ｍｓｆＧＦＰがない場合のＣａｓ１３媒介性Ｇｌｕｃノックダウンを試験した。本発明者らは、ＬｗａＣａｓ１３ａの最適化に関して既報告のとおり、Ｃａｓ１３活性がｍｓｆＧＦＰに加えて細胞内局在性の影響を受ける可能性があると仮定した（１５）。従って、本発明者らは、ｍｓｆＧＦＰなしに６つの異なる局在化タグの１つをＣ末端に融合した７つの選択のＣａｓ１３オルソログの干渉活性を試験した。本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、ＨＩＶ Ｒｅｖ遺伝子ＮＥＳをＣ末端に融合したＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＰｇｕＣａｓ１３ｂ並びにＭＡＰＫ ＮＥＳをＣ末端に融合したＲａｎＣａｓ１３ｂの干渉活性レベルが最も高かったことを見出した（図１２Ａ）。上位オルソログの活性レベルを更に区別するため、本発明者らは、位置対応ガイドを使用してＫＲＡＳ転写物をノックダウンするその能力に関して、これらの３つの最適化Ｃａｓ１３ｂ構築物を最適ＬｗａＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰ融合物及びｓｈＲＮＡと比較した（図１２Ｂ）。本発明者らは、ＰｓｐＣａｓ１３ｂについて最も高い干渉レベルを観察し（平均ノックダウン６２．９％）、従ってこれをＬｗａＣａｓ１３ａとの更なる比較に選択した。
ＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＬｗａＣａｓ１３ａの活性レベルを更に厳密に定義付けるため、本発明者らは、Ｇｌｕｃ及びＣｌｕｃの両方に沿ってタイリングする位置対応ガイドを設計し、本発明者らのルシフェラーゼレポーターアッセイを用いてその活性をアッセイした。本発明者らは、Ｇｌｕｃ及びＣｌｕｃを標的とするそれぞれ９３個及び２０個の位置対応ガイドを試験し、ＰｓｐＣａｓ１３ｂのノックダウンレベルがＬｗａＣａｓ１３ａと比べて一貫して増加したことを見出した（ＰｓｐＣａｓ１３ｂについて平均９２．３％、対してＬｗａＣａｓ１３ａについて４０．１％のノックダウン）（図５Ｃ、図５Ｄ）。
Ｃａｓ１３哺乳類干渉活性の特異性
ＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＬｗａＣａｓ１３ａの干渉特異性を特徴付けるため、本発明者らは、標的配列及び３つの隣接５’及び３’塩基対にわたってシングルミスマッチ及びダブルミスマッチを含むルシフェラーゼ標的のプラスミドライブラリを設計した（図１２Ｃ）。本発明者らは、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に、ＬｗａＣａｓ１３ａ又はＰｓｐＣａｓ１３ｂのいずれか、非改変標的配列を標的とする固定的ガイドＲＮＡ及び適切な系に対応するミスマッチ標的ライブラリをトランスフェクトした。本発明者らは、次に、非切断転写物の標的化したＲＮＡシーケンシングを実施して、ミスマッチ標的配列の枯渇を定量化した。本発明者らは、ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂが、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ標的について塩基対１２～２６及びＬｗａＣａｓ１３ａ標的について１３～２４に延在するシングルミスマッチ寛容性が比較的低い中心領域を有したことを見出した（図１２Ｄ）。ダブルミスマッチは、シングル突然変異と比べて寛容性が更に低く、そのそれぞれの標的におけるＰｓｐＣａｓ１３ｂについて塩基対１２～２９及びＬｗａＣａｓ１３ａについて８～２７に延在するより大きいウィンドウにかけてノックダウン活性は、ほとんど観察されなかった（図１２Ｅ）。加えて、標的配列の５’末端及び３’末端に隣接する３ヌクレオチドにもミスマッチが含まれるため、本発明者らは、Ｃａｓ１３ノックダウン活性に対するＰＦＳ制約を評価することができた。シーケンシングが示したところによれば、ほぼ全てのＰＦＳの組み合わせがロバストなノックダウンを実現したことから、試験したいずれの酵素についても、哺乳類細胞における干渉に関するＰＦＳ制約は存在しない可能性があることが指摘される。これらの結果から、Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ｂが同様の配列制約及びミスマッチに対する感度を呈することが指摘される。
本発明者らは、次に、トランスクリプトームのｍＲＮＡ画分にわたるＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＬｗａＣａｓ１３ａの干渉特異性を特徴付けた。本発明者らは、トランスクリプトームワイドｍＲＮＡシーケンシングを実施して、有意な差次的発現遺伝子を検出した。ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂはＧｌｕｃのロバストなノックダウンを実証し（図５Ｅ、図５Ｆ）、数百個のオフターゲットを示した位置対応ｓｈＲＮＡと比較して高度に特異的であった（図５Ｇ）。
Ｃａｓ１３－ＡＤＡＲ融合物は標的ＲＮＡ編集を可能にする
ＰｓｐＣａｓ１３ｂが哺乳類細胞において一貫したロバストで特異的なｍＲＮＡノックダウンを実現したことを踏まえて、本発明者らは、プログラム可能なＲＮＡ編集のためＡＤＡＲのデアミナーゼドメイン（ＡＤＡＲＤＤ）をリクルートするＲＮＡ結合プラットフォームとしてこれを適合させることができると想定した。ヌクレアーゼ活性が欠損したＰｓｐＣａｓ１３ｂ（ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ、以下ｄＣａｓ１３ｂと称する）をエンジニアリングするため、本発明者らは、ＨＥＰＮドメインにおける保存された触媒残基を突然変異させて、ルシフェラーゼＲＮＡノックダウン活性の喪失を観察した（図１３Ａ）。本発明者らは、ガイドＲＮＡによってｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲＤＤ融合物を標的アデノシンにリクルートでき、ハイブリダイズしたＲＮＡがＡＤＡＲ活性に必要な二重鎖基質を作り出すと仮定した（図６Ａ）。標的アデノシン脱アミノ化率を亢進させるため、本発明者らは、本発明者らの当初のＲＮＡ編集設計に２つの追加的な改変を導入した。本発明者らは、標的アデノシンの反対側に、脱アミノ化頻度を増加させることが以前報告されているミスマッチシチジンを導入し、且つｄＣａｓ１３ｂを、高活性突然変異を含むヒトＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインと融合させて触媒活性を亢進させた（ＡＤＡＲ１ＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）（２５）又はＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）（１９））。
ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲＤＤの活性を試験するため、本発明者らは、ナンセンス突然変異（Ｗ８５Ｘ（ＵＧＧ－＞ＵＡＧ））を導入することによりＣｌｕｃ上にＲＮＡ編集レポーターを作成し、これは、Ａ→Ｉ編集を通じて機能的に野生型コドンに修復され（図６Ｂ）、次にＣｌｕｃ発光の回復として検出することができるものであった。本発明者らは、標的アデノシンにわたってスペーサー３０、５０、７０又は８４ヌクレオチド長のガイドを均等にタイリングして、最適なガイド配置及び設計を決定した（図６Ｃ）。本発明者らは、ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ１ＤＤがＣｌｕｃレポーターの修復に長いガイドを必要とした一方、ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤが、試験した全てのガイド長さで機能性であったことを見出した（図６Ｃ）。本発明者らは、野生型ＡＤＡＲ２ＤＤによるルシフェラーゼ回復が低下したとおり、高活性Ｅ４８８Ｑ突然変異が編集効率を改善したことも見出した（図１３Ｂ）。このような活性の実証から、本発明者らは、更なる特徴付けにｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）を選択し、この手法を、プログラム可能なＡからＩへの置換のためのＲＮＡ編集バージョン１（ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａ ｔｏ Ｉ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｖｅｒｓｉｏｎ １：ＲＥＰＡＩＲｖ１）と命名した。
ルシフェラーゼ活性の回復が本当に編集イベントに起因したことを確認するため、本発明者らは、逆転写及び標的化した次世代シーケンシングによって直接ＲＥＰＡＩＲｖ１に供したＣｌｕｃ転写物の編集を測定した。本発明者らは、標的部位を囲む３０ｎｔ及び５０ｎｔスペーサーを試験し、両方のガイド長さとも期待されたＡからＩへの編集をもたらし、５０ｎｔスペーサーの方が高い編集パーセンテージを実現したことを見出した（図６Ｄ、図６Ｅ、図１３Ｃ）。本発明者らは、５０ｎｔスペーサーには、恐らく二重鎖ＲＮＡ領域の増加に起因した非標的アデノシンにおける編集傾向の増加があったことも観察した（図６Ｅ、図１３Ｃ）。
本発明者らは、次に、内因性遺伝子ＰＰＩＢを標的とした。本発明者らは、ＰＰＩＢをタイリングする５０ｎｔスペーサーを設計し、本発明者らが最高２８％の編集効率でＰＰＩＢ転写物を編集できたことを見出した（図１３Ｄ）。ＲＥＰＡＩＲを更に最適化することができるかどうかを試験するため、本発明者らは、ｄＣａｓ１３ｂとＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）との間のリンカーを改変し（図１３Ｅ、表６）、リンカー選択がルシフェラーゼ活性回復にやや影響を及ぼしたことを見出した。
ＲＮＡ編集用の配列パラメータの定義付け
本発明者らが試験部位で正確なＲＮＡ編集を実現できたことを踏まえ、本発明者らは、トランスクリプトームにおける任意のＲＮＡ標的に対する系をプログラムする際の配列制約を特徴付けようとした。配列制約は、ＰＦＳなど、ｄＣａｓ１３ｂターゲティング制限によるか、又はＡＤＡＲ配列優先性によって生じ得た（２６）。ＲＥＰＡＩＲｖ１に関するＰＦＳ制約を調べるため、本発明者らは、Ｃｌｕｃ転写物上の標的部位の５’末端に一連の４つのランダム化ヌクレオチドを担持するプラスミドライブラリを設計した（図７Ａ）。本発明者らは、ＵＡＧ又はＡＡＣのいずれかのモチーフ内にある中央のアデノシンを標的とし、両方のモチーフについて、全てのＰＦＳが検出可能なレベルのＲＮＡ編集を実証し、大部分のＰＦＳが標的部位において５０％より高い編集であったことを見出した（図７Ｂ）。次に、本発明者らは、ＲＥＰＡＩＲｖ１中のＡＤＡＲ２ＤＤが、以前ＡＤＡＲ２ＤＤについて報告されているとおり、標的塩基に直接隣接するいずれかの配列制約を有するかどうかを決定しようとした（２６）。本発明者らは、標的アデノシンを直接囲む５’及び３’隣接ヌクレオチドの可能なあらゆる組み合わせを試験し（図７Ｃ）、ＲＥＰＡＩＲｖ１があらゆるモチーフを編集する能力を有したことを見出した（図７Ｄ）。最後に、本発明者らは、スペーサー配列における標的Ａに対向する塩基のアイデンティティが編集効率に影響を及ぼしたかどうかを分析し、Ａ－Ｃミスマッチが最も高いルシフェラーゼ回復を呈し、Ａ－Ｇ、Ａ－Ｕ及びＡ－ＡではＲＥＰＡＩＲｖ１活性が大幅に低下したことを見出した（図１３Ｆ）。
ＲＥＰＡＩＲｖ１を使用した疾患関連ヒト突然変異の修正
哺乳類細胞におけるＲＮＡ編集へのＲＥＰＡＩＲｖ１系の幅広い適用性を実証するため、本発明者らは、２つの疾患関連突然変異：Ｘ連鎖性腎性尿崩症における８７８Ｇ＞Ａ（ＡＶＰＲ２ Ｗ２９３Ｘ）及びファンコニー貧血における１５１７Ｇ＞Ａ（ＦＡＮＣＣ Ｗ５０６Ｘ）に対するＲＥＰＡＩＲｖ１ガイドを設計した。本発明者らは、これらの突然変異を有する遺伝子のｃＤＮＡ用の発現構築物をＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、ＲＥＰＡＩＲｖ１がこれらの突然変異を修正することができたかどうかを試験した。５０ｎｔスペーサーを含むガイドＲＮＡを使用して、本発明者らは、３５％のＡＶＰＲ２の修正及び２３％のＦＡＮＣＣの修正を実現することが可能であった（図８Ａ～図８Ｄ）。次に、本発明者らは、ＲＥＰＡＩＲｖ１が３４個の異なる疾患関連Ｇ＞Ａ突然変異を修正する能力を試験し（表７）、本発明者らが３３部位において最高２８％の編集効率で有意な編集を実現可能であったことを見出した（図８Ｅ）。本発明者らが選択した突然変異は、ＣｌｉｎＶａｒデータベース中にある病原性のＧからＡへの突然変異のあくまでも一部に過ぎず（５，７３９個）、このデータベースには、更なる１１，９４３個のＧからＡへの変異体も含まれる（図８Ｆ及び図１４）。配列制約がないため、特に本発明者らが標的モチーフに関わらず有意な編集を観察したことを踏まえると、ＲＥＰＡＩＲｖ１は、これらの疾患関連突然変異の全てを編集する能力を潜在的に有する（図７Ｃ及び図８Ｇ）。
ＲＥＰＡＩＲｖ１系を罹患細胞に送達することは、治療用途に必須であり、従って、本発明者らは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの治療的に関連性のあるウイルスベクターにパッケージング可能なＲＥＰＡＩＲｖ１構築物を設計しようとした。ＡＡＶベクターは、４．７ｋｂのパッケージング限界を有し、これは、ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲＤＤ（４４７３ｂｐ）の大きいサイズをプロモーター及び発現調節エレメントと共に収容することができないものである。サイズを低減するため、本発明者らは、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）に融合したｄＣａｓ１３の種々のＮ末端及びＣ末端トランケーションについてＲＮＡ編集活性を試験した。本発明者らは、試験した全てのＣ末端トランケーションがなおも機能性で、ルシフェラーゼシグナルを回復させることが可能であった（図１５）と共に、最も大きいトランケーション、Ｃ末端Δ９８４～１０９０（融合タンパク質の総サイズ４，１５２ｂｐ）がＡＡＶベクターのパッケージング限界の範囲内に収まるのに十分な小ささであったことを見出した。
ＲＥＰＡＩＲｖ１のトランスクリプトームワイド特異性
ＰｓｐＣａｓ１３ｂによるＲＮＡノックダウンは、高度に特異的であったが、本発明者らのルシフェラーゼタイリング実験では、本発明者らは、ガイド：標的二重鎖内にオフターゲットアデノシン編集を観察した（図６Ｅ）。これが広範囲に及ぶ現象であったかどうかを確かめるため、本発明者らは、内因性転写物ＫＲＡＳをタイリングし、標的アデノシンの近傍におけるオフターゲット編集の程度を測定した（図９Ａ）。本発明者らは、ＫＲＡＳについて、オンターゲット編集率は２３％であったが、標的部位の周りに同様に検出可能なＡからＧへの編集を有した部位が多くあったことを見出した（図９Ｂ）。
ガイド：標的二重鎖内にオフターゲット編集が観察されたため、本発明者らは、全てのｍＲＮＡに関してＲＮＡシーケンシングを実施することにより、可能な全てのトランスクリプトームオフターゲットを評価した。ＲＮＡシーケンシングにより、ＡからＧへのオフターゲットイベントが多数あり、ターゲティング条件で１，７３２個のオフターゲット及びノンターゲティング条件で９２５個のオフターゲットがあり、８２８個のオフターゲットが重複していることが明らかになった（図９Ｃ、図９Ｄ）。トランスクリプトームにわたる全ての編集部位のうち、オンターゲット編集部位が最も高い編集率を有し、８９％のＡからＧへの変換であった。
Ｃａｓ１３ターゲティングの高い特異性を踏まえて、本発明者らは、オフターゲットがＡＤＡＲから生じ得ることが妥当と考えた。２つのＲＮＡ誘導型ＡＤＡＲ系が以前記載されている（図１６Ａ）。第１のものは、ＡＤＡＲ２ＤＤと、ＢｏｘＢ－λ ＲＮＡヘアピンに結合する低分子ウイルスタンパク質ラムダＮ（λＮ）との融合物を利用する（２２）。二重ＢｏｘＢ－λヘアピンを有するガイドＲＮＡが、ガイドＲＮＡにコードされた編集部位にＡＤＡＲ２ＤＤを誘導する（２３）。第２の設計は完全長ＡＤＡＲ２（ＡＤＡＲ２）と、ＡＤＡＲ２の二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）が認識するヘアピンを有するガイドＲＮＡとを利用する（２１、２４）。本発明者らは、ＲＥＰＡＩＲｖ１と比較したこれらの２つの系の編集効率を分析し、ＲＥＰＡＩＲｖ１によって達成された８９％の編集率と比較して、ＢｏｘＢ－ＡＤＡＲ２及びＡＤＡＲ２系がそれぞれ６３％及び３６％の編集率を実証したことを見出した（図１６Ｂ～図１６Ｅ）。加えて、ＢｏｘＢ及びＡＤＡＲ２系は、ＲＥＰＡＩＲｖ１ターゲティングガイド条件での１，２２９個のオフターゲットと比較して、ターゲティングガイド条件でそれぞれ２０１８個及び１７４個の観察されたオフターゲットを作り出した。特に、ＡＤＡＲ２系は大部分が異なるオフターゲットの組を有した一方、２つのＡＤＡＲ２ＤＤベースの系（ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＢｏｘＢ）を含む条件の全ては、そのオフターゲットに高い割合の重複を示した（図１６Ｆ）。ターゲティング条件とノンターゲティング条件との間及びＲＥＰＡＩＲｖ１条件とＢｏｘＢ条件との間のオフターゲットの重複は、ＡＤＡＲ２ＤＤがｄＣａｓ１３ターゲティングと無関係にオフターゲットをドライブしたことを示唆している（図１６Ｆ）。
合理的プロテインエンジニアリングによるＲＥＰＡＩＲｖ１の特異性の改善
ＲＥＰＡＩＲの特異性を改善するため、本発明者らは、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）の構造誘導型プロテインエンジニアリングを用いた。オフターゲットのガイド非依存的性質のため、本発明者らは、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）－ＲＮＡ結合を不安定化させればオフターゲット編集を選択的に低下させ得るが、標的部位へのＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）のｄＣａｓ１３ｂ係留からの局所濃度の増加に起因してオンターゲット編集が維持され得ると仮定した。本発明者らは、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）バックグラウンドで標的ＲＮＡの二重鎖領域に接触することが以前決定されたＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）残基を突然変異誘発した（図１０Ａ）（１８）。効率及び特異性を評価するため、本発明者らは、ノンターゲティング条件でバックグラウンドルシフェラーゼ回復が検出されれば、より広いオフターゲット活性の指標となり得るという想定の下、ターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドの両方で１７個の単一突然変異体を試験した。本発明者らは、ターゲティング及びノンターゲティングガイドについて、選択の残基における突然変異がルシフェラーゼ活性に有意な効果を及ぼしたことを見出した（図１０Ａ、図１０Ｂ、図１７Ａ）。大部分の突然変異体は、ターゲティングガイドについてルシフェラーゼ活性を有意に改善したか、又はターゲティング対ノンターゲティングガイド活性比（本発明者らはこれを特異性スコアと称した）を増加させたかのいずれかであった（図１０Ａ、図１０Ｂ）。本発明者らは、次世代シーケンシングによるトランスクリプトームワイドな特異性のプロファイリングにこれらの突然変異体のサブセットを選択した（図１０Ｂ）。予想どおり、トランスクリプトームワイドなシーケンシングから測定されたオフターゲットは、突然変異体についての本発明者らの特異性スコアと相関した（図１７Ｂ）。本発明者らは、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ／Ｒ４５５Ｅ）を例外として、シーケンシングした全てのＲＥＰＡＩＲｖ１突然変異体がレポーター転写物を有効に編集することができ（図１０Ｃ）、多くの突然変異体がオフターゲット数の減少を示した（図１７Ｃ及び図１８）ことを見出した。本発明者らは、特異性突然変異体のオフターゲットの周囲モチーフを更に調べ、ＲＥＰＡＩＲｖ１及びほとんどのエンジニアリングした突然変異体が、特徴付けられたＡＤＡＲ２モチーフと一致して、その編集について強力な３’Ｇ優先性を呈したことを見出した（図１９Ａ）（２６）。本発明者らは、更なる実験に、それが４つの突然変異体のうち、最も高いパーセント編集率を有しつつトランスクリプトームワイドなオフターゲットの数が最も少なかったことに伴い突然変異体ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ／Ｔ３７５Ｇ）を選択し、これをＲＥＰＡＩＲｖ２と名付けた。ＲＥＰＡＩＲｖ１と比較して、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、特異性の増加を呈し、トランスクリプトームオフターゲットが１７３２個から１０個に減少した（図１０Ｄ）。Ｃｌｕｃにおける標的アデノシンを囲む領域において、ＲＥＰＡＩＲｖ２ではオフターゲット編集が減少し、これは、シーケンシングトレースに見ることができた（図１０Ｅ）。次世代シーケンシングから導き出されたモチーフにおいて、ＲＥＰＡＩＲｖ１は３’Ｇに強力な優先性を呈したが、全てのモチーフについてオフターゲット編集を示した（図１９Ｂ）。対照的に、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、最も強力なオフターゲットモチーフを編集したのみであった（図１９Ｃ）。転写物上の編集分布は、重度に偏っていて、高度に編集された遺伝子は、６０個を超える編集を有する（図２０Ａ、図２０Ｂ）一方、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、１個の転写物（ＥＥＦ１Ａ１）のみを複数回編集した（図２０Ｄ～図２０Ｆ）。ＲＥＰＡＩＲｖ１オフターゲット編集は、１０００個のミスセンス突然変異（図２０Ｃ）と９３個の発癌イベント（図２０Ｄ）を含め、多数の変異体をもたらすと予測された。対照的に、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、６個のミスセンス突然変異を有したのみで（図２０Ｅ）、その中に発癌転帰を有するものはなかった（図２０Ｆ）。予測オフターゲット効果のこの減少は、ＲＥＰＡＩＲｖ２を他のＲＮＡ編集手法と区別するものである。
本発明者らは、ＲＥＰＡＩＲｖ２を内因性遺伝子に標的化させて、特異性を亢進する突然変異が高効率オンターゲット編集を維持しつつ標的転写物における近隣編集を低減するかどうかを試験した。ＫＲＡＳ又はＰＰＩＢのいずれかを標的とするガイドについて、本発明者らは、ＲＥＰＡＩＲｖ２が、ＲＥＰＡＩＲｖ１と異なり、検出可能なオフターゲット編集を有さず、オンターゲットアデノシンをそれぞれ２７．１％及び１３％で有効に編集できたことを見出した（図１０Ｆ、図１０Ｇ）。この特異性は、他のＫＲＡＳ又はＰＰＩＢ標的部位など、ＲＥＰＡＩＲｖ１についてノンターゲティング条件で高レベルのバックグラウンドを示す領域を含め、追加的な標的部位にまで及んだ（図２１）。全体的に見て、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、編集されたアデノシンを囲む二重鎖領域でのオフターゲットを消失させ、トランスクリプトームワイドな特異性の劇的な亢進を示した。
結論
本発明者らは、ここで、ＲＮＡ誘導型ＲＮＡターゲティングＶＩ－Ｂ型エフェクターＣａｓ１３ｂが極めて効率的且つ特異的なＲＮＡノックダウン能力を有することを明らかにし、必須遺伝子及び非コードＲＮＡの調査並びに細胞過程のトランスクリプトームレベルでの制御のための改良されたツールの基礎を提供した。触媒不活性Ｃａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３ｂ）は、プログラム可能なＲＮＡ結合能力を保持し、本発明者らは、ここで、ｄＣａｓ１３ｂをアデノシンデアミナーゼＡＤＡＲ２に融合することによりこれを利用して、本発明者らがＲＥＰＡＩＲｖ１（プログラム可能なＡからＩへの置換のためのＲＮＡ編集バージョン１）と称する系である正確なＡからＩへの編集を実現した。この系の更なるエンジニアリングにより、特異性が劇的に改善された、現在の編集プラットフォームと比べて同等の又は増加した活性を有する方法であるＲＥＰＡＩＲｖ２が生み出された。
Ｃａｓ１３ｂは、高忠実度を呈するが、ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ融合物による本発明者らの初期の結果から、数千個のオフターゲットが明らかになった。これに対処するため、本発明者らは、合理的突然変異誘発戦略を用いてＲＮＡ二重鎖と接触するＡＤＡＲ２ＤＤ残基を変異させることにより、ｄＣａｓ１３ｂと融合したとき、正確で、効率的で、且つ高度に特異的な編集能力を有する変異体ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ／Ｔ３７５Ｇ）を同定した。この変異体による編集効率は、現在利用可能な２つの系、ＢｏｘＢ－ＡＤＡＲＤＤ又はＡＤＡＲ２編集で実現したものと同等であるか又はそれより良好であった。更に、ＲＥＰＡＩＲｖ２系は、全トランスクリプトームにおいて観察可能なオフターゲットを１０個のみ作り出し、両方の代替的編集技術と比べて少なくとも良好といえる程度であった。
ＲＥＰＡＩＲ系は、他の核酸編集ツールと比較して多くの利点を提供する。第一に、所望のアデノシンにわたってガイド伸長部内にシチジンを置いてＡＤＡＲ編集活性に理想的な有利なＡ－Ｃミスマッチを作り出すことにより、ガイドに正確な標的部位をコードすることができる。第二に、Ｃａｓ１３は、ＰＦＳ又はＰＡＭなどのターゲティング配列制約を有さず、標的アデノシンの周りのモチーフ優先性がないため、トランスクリプトーム内の任意のアデノシンを潜在的にＲＥＰＡＩＲ系による標的とすることが可能である。しかしながら、本発明者らは、ＤＮＡベースの編集体がセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれも標的とすることができる一方、ＲＥＰＡＩＲ系は、転写された配列に限られ、そのため標的とすることのできる可能な編集部位の総数が制約を受けることを実に注記しておく。しかしながら、ＲＥＰＡＩＲによるターゲティングのより柔軟性の高い性質に起因して、この系は、ＣｌｉｎＶａｒ内にＣａｓ９－ＤＮＡベースの編集体よりも多くの編集を生じさせることができる（図８Ｃ）。第三に、ＲＥＰＡＩＲ系は、標的アデノシンをイノシンに直接脱アミノ化し、塩基除去修復又はミスマッチ修復などの内因性修復経路に依存することなく所望の編集結果を生じさせる。従って、ＲＥＰＡＩＲは、他の形態の編集をサポートできない非分裂細胞で可能なはずである。第四に、ＲＮＡ編集は、一過性であり得、編集結果を一時的に制御する可能性を許容する。この特性は、局所炎症など、細胞状態の一時的な変化によって引き起こされる疾患の治療に有用であると見込まれ得る。
ＲＥＰＡＩＲ系は、更なるエンジニアリング機会を複数提供する。Ｃａｓ１３ｂは、プレｃｒＲＮＡプロセシング活性を有し（１３）、そのため、単独では疾患リスクを変化させない可能性があるが、一緒になると相加効果及び疾患修飾の可能性を有し得る複数の変異体の多重編集が可能である。有望な突然変異を組み合わせるなど、本発明者らの合理設計手法を拡張すれば、この系の特異性及び効率を更に増加させることができる一方、偏りのないスクリーニング手法によってＲＥＰＡＩＲ活性及び特異性を改善するための追加的な残基を同定できる可能性がある。
現在、ＲＥＰＡＩＲによって実現可能な塩基変換は、アデノシンからのイノシンの生成に限られている。ｄＣａｓ１３をＡＰＯＢＥＣなどの他の触媒ＲＮＡ編集ドメインと更に融合すれば、シチジンからウリジンへの編集を実現できる可能性がある。加えて、ＡＤＡＲを突然変異誘発すれば、シチジンを標的とするように基質優先性が緩和され、二重鎖化したＲＮＡ基質要件によって付与される亢進した特異性がＣ→Ｕ編集体によって利用可能となる可能性がある。ＤＮＡ基質上におけるアデノシンからイノシンへの編集は、ＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二重鎖標的の形成（２７）又はＡＤＡＲドメインの突然変異誘発のいずれかを通じて、ｄＣａｓ９又はｄＣｐｆ１など、触媒不活性ＤＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターでも可能であり得る。
ＲＥＰＡＩＲは、ＡからＩへの（ＡからＧへの）編集が疾患の進行を逆転又は減速させ得る様々な適応疾患に適用できる可能性がある（図２２）。第一に、疾患関連組織における原因となるメンデルのＧからＡへの突然変異を標的とするためのＲＥＰＡＩＲの発現を用いれば、有害な突然変異を復帰させ、疾患を治療できる可能性がある。例えば、脳組織におけるＡＡＶによる安定なＲＥＰＡＩＲ発現を用いれば、焦点性癲癇を引き起こすＧＲＩＮ２Ａミスセンス突然変異ｃ．２１９１Ｇ＞Ａ（Ａｓｐ７３１Ａｓｎ）（２８）又は早期発症型アルツハイマー病を引き起こすＡＰＰミスセンス突然変異ｃ．２１４９Ｇ＞Ａ（Ｖａｌ７１７Ｉｌｅ）（２９）を修正できる可能性がある。第二に、ＲＥＰＡＩＲを用いれば、疾患関連シグナル伝達に関与するタンパク質の機能を改変することにより疾患を治療できる可能性がある。例えば、ＲＥＰＡＩＲ編集によれば、キナーゼの標的である一部のセリン、スレオニン及びチロシン残基の再コーディングが可能となり得る（図２２）。疾患関連タンパク質におけるこれらの残基のリン酸化は、アルツハイマー病及び多発神経変性病態を含め、多くの障害についての疾患の進行に影響を及ぼす（３０）。第三に、ＲＥＰＡＩＲを用いれば、発現したリスク修飾性のＧからＡへの変異体の配列を変化させることにより、患者が疾患状態に入る可能性を先制して低下させることができる可能性がある。最も興味深いケースは、「防御性」リスク修飾アレルであり、これは、疾患状態に入る可能性を劇的に低下させ、場合により更なる健康上の利益を付与する。例えば、ＲＥＰＡＩＲを用いれば、それぞれ心血管疾患及び乾癬性関節炎を防御するＰＣＳＫ９及びＩＦＩＨ１のＡからＧへのアレルを機能的に模倣できる可能性がある（３１）。最後に、ＲＥＰＡＩＲを用いて、エクソン調節療法のためスプライスアクセプター及びドナー部位を治療的に改変することができる。ＲＥＰＡＩＲは、それぞれコンセンサス５’スプライスドナー又は３’スプライスアクセプター部位と機能的に均等なものである、ＡＵをＩＵに又はＡＡをＡＩに変化させて、新規スプライスジャンクションを作り出すことができる。加えて、ＲＥＰＡＩＲ編集は、コンセンサス３’スプライスアクセプター部位をＡＧ→ＩＧに突然変異させて、隣接下流エクソンのスキッピングを促進することができ、これは、ＤＭＤの治療に多大な関心を集めている治療戦略である。スプライス部位の調節には、脊髄性筋萎縮症の治療に向けたＳＭＮ２スプライシングの調節のためなど、アンチセンスオリゴが何らかの成功を収めている疾患において幅広い適用性があり得る（３２）。
本発明者らは、ＲＮＡノックダウン及びＲＮＡ編集の両方のツールとしてのＰｓｐＣａｓ１３ｂ酵素の使用を実証した。プログラム可能なＲＮＡ結合のためのｄＣａｓ１３ｂプラットフォームには、ライブ転写物イメージング、スプライシング改変、標的化した転写物局在化、ＲＮＡ結合タンパク質のプルダウン及びエピトランスクリプトーム改変を含め、多くの適用性がある。ここで、本発明者らは、ｄＣａｓ１３を用いて、既存の核酸編集技術スイートに加わるＲＥＰＡＩＲを作り出した。ＲＥＰＡＩＲは、遺伝性疾患の治療又は防御アレルの模倣の新規手法を提供し、ＲＮＡ編集を遺伝子機能の改変に有用なツールとして確立する。
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実施例４ － 追加的なＶＩ－Ｂ型エフェクター
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本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明したが、当業者には、かかる実施形態が単に例として提供されるに過ぎないことが明らかであろう。ここで、当業者には、本発明から逸脱することなく多数の変形形態、変更形態及び置換形態が想起されるであろう。本発明の実施では、本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替形態を用い得ることが理解されなければならない。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、並びにこの特許請求の範囲内にある方法及び構造並びにその均等物が本発明に包含されることが意図される。

Claims (50)

  1. 真核細胞、好ましくは哺乳類細胞の目的の標的遺伝子座を改変する方法であって、任意選択で１つ以上の局在化シグナルに融合されたＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と、１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、少なくとも前記１つ以上の核酸成分は、エンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分は、複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質は、前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体は、前記目的の標的遺伝子座に結合する、方法。
  2. 任意選択で１つ以上の局在化シグナルに融合されたＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と、１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、少なくとも前記１つ以上の核酸成分は、真核細胞中の目的の標的遺伝子座の改変における使用のためにエンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分は、複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質は、前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体は、前記目的の標的遺伝子座に結合する、組成物。
  3. 任意選択で１つ以上の局在化シグナルに融合されたＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と、１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の使用であって、少なくとも前記１つ以上の核酸成分は、真核細胞中の目的の標的遺伝子座を改変するためにエンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分は、複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質は、前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体は、前記目的の標的遺伝子座に結合する、使用。
  4. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、リエメレラ属（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ）、バージイエラ属（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ）、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）、ミロイデス属（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ）、キャプノサイトファーガ属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）及びフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される原核生物の野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも８０％相同又は同一である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  5. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、バクテロイデス・ピオゲネス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、プレボテラ・ブッカエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｅ）、アリスティペス属種（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｐ．）、プレボテラ・アウランティアカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ミロイデス・オドラティミマス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ ｏｄｏｒａｔｉｍｉｍｕｓ）、キャプノサイトファーガ・カニモルサス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ）、フラボバクテリウム・ブランキオフィルム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ）及びフラボバクテリウム・コルムナレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）からなる群から選択される原核生物の野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも８０％相同又は同一である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  6. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０５３４４４４１７）、ポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ－０５２ ＯＨ４９４６ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４２８９６８）、バクテロイデス・ピオゲネス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３４５４２２８１）、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿００４９１９７５５）、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿００２６６４４９２）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３６８６０８９９）、プレボテラ・ブッカエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿００４３４３９７３）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０１２４５８１５１）、アリスティペス属種（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｐ．）ＺＯＲ０００９ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４７４４７９０１）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）ＭＡ２０１６ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３６９２９１７５）、プレボテラ・アウランティアカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０２５０００９２６）、ミロイデス・オドラティミマス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ ｏｄｏｒａｔｉｍｉｍｕｓ）ＣＣＵＧ １０２３０ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＥＨＯ０６５６２）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０６１８６８５５３）、キャプノサイトファーガ・カニモルサス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０１３９９７２７１）、フラボバクテリウム・ブランキオフィルム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０１４０８４６６６）、ミロイデス・オドラティミマス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ ｏｄｏｒａｔｉｍｉｍｕｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０５８７０００６０）、フラボバクテリウム・コルムナレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０６５２１３４２４）及びプレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０５０９５５３６９）からなる群から選択される野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも８０％相同又は同一である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  7. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０５３４４４４１７）、ポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ－０５２ ＯＨ４９４６ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４２８９６８）、バクテロイデス・ピオゲネス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３４５４２２８１）及びリエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿００４９１９７５５）からなる群から選択される野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも８０％相同である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  8. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０３９４３４８０３）及びプレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂ（受託番号ＷＰ＿０４４０６５２９４）からなる群から選択される野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも８０％相同である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  9. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ＤＫＨＸＦＧＡＦＬＮＬＡＲＨＮ（配列番号１）、ＧＬＬＦＦＶＳＬＦＬＤＫ（配列番号２）、ＳＫＩＸＧＦＫ（配列番号３）、ＤＭＬＮＥＬＸＲＣＰ（配列番号４）、ＲＸＺＤＲＦＰＹＦＡＬＲＹＸＤ（配列番号５）及びＬＲＦＱＶＢＬＧＸＹ（配列番号６）からなる配列の１つ以上と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  10. 前記目的の標的遺伝子座は、ＲＮＡを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  11. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、少なくとも１つの局在化シグナルに融合され、前記局在化シグナルは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）又は核外移行シグナル（ＮＥＳ）、好ましくはＮＥＳである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  12. 前記目的の標的遺伝子座の前記改変は、鎖切断を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  13. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、哺乳類細胞における発現にコドン最適化される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  14. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合され、及び任意選択で、前記エフェクタータンパク質は、Ｒ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ、Ｈ１１８２Ａ（ここで、アミノ酸位置は、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）ＡＴＣＣ ４３７６７に由来するＣａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する）など、１つ以上の突然変異を任意選択でＨＥＰＮドメイン内に含有し、それにより、前記複合体は、後成的改変因子又は転写、若しくは翻訳活性化、若しくは抑制シグナルを送達することができる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  15. 前記機能ドメインは、前記標的遺伝子座の転写又は翻訳を改変する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  16. 前記目的の標的遺伝子座は、細胞内の核酸分子に含まれる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  17. 前記改変は、インビボ又はエキソビボである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  18. 前記エフェクタータンパク質と複合体化したとき、前記核酸成分は、前記目的の標的遺伝子座の標的配列に対する前記複合体の配列特異的結合を生じさせる能力を有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  19. 前記核酸成分は、デュアルダイレクトリピート配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  20. 前記エフェクタータンパク質及び前記核酸成分は、前記ポリペプチド及び／又は前記核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供され、前記１つ以上のポリヌクレオチド分子は、前記ポリペプチド及び／又は前記核酸成分を発現するように作動可能に構成される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  21. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子は、前記ポリペプチド及び／又は前記核酸成分を発現するように作動可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含み、任意選択で、前記１つ以上の調節エレメントは、プロモーター又は誘導性プロモーターを含む、請求項２０に記載の方法、組成物又は使用。
  22. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子は、１つ以上のベクター内に含まれる、請求項２０又は２１に記載の方法、組成物又は使用。
  23. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子は、１つのベクター内に含まれる、請求項２０又は２１に記載の方法、組成物又は使用。
  24. 前記１つ以上のベクターは、ウイルスベクターを含む、請求項２２又は２３に記載の方法、組成物又は使用。
  25. 前記１つ以上のウイルスベクターは、１つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む、請求項２４に記載の方法、組成物又は使用。
  26. 前記１つ以上のポリヌクレオチド分子は、送達系に含まれる、請求項２０若しくは２１に記載の方法、組成物若しくは使用、又は前記１つ以上のベクターは、送達系に含まれる、請求項２２若しくは２３に記載の方法、組成物若しくは使用、又は前記アセンブルされた複合体は、送達系に含まれる、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法、組成物若しくは使用。
  27. 前記天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、リポソーム、粒子、エキソソーム、微小胞、遺伝子銃又は１つ以上のウイルスベクターを含む送達媒体によって送達される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  28. 前記組成物は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を増強するアクセサリータンパク質、好ましくはｃｓｘ２８タンパク質を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  29. 前記組成物は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を抑制するアクセサリータンパク質、好ましくはｃｓｘ２７タンパク質を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  30. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、少なくとも１つの機能ドメインに連結され、前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、前記ＨＥＰＮドメインに１つ以上の突然変異を含み、前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、そのＣ末端でトランケートされ、前記トランケーションは、任意選択で、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応するΔ１０５３～１０９０、Δ１０２６～１０９０、Δ９８４～１０９０、Δ９３４～１０９０、Δ８８４～１０９０、Δ８３４～１０９０、Δ７８４～１０９０及びΔ７３４～１０９０から選択される、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
  31. 先行する若しくは後続の請求項のいずれか一項に記載の方法によって改変されているか、又は先行する若しくは後続の請求項のいずれか一項に記載の組成物若しくはその構成成分を任意選択で誘導的又は構成的に含むか若しくは発現するようにエンジニアリングされている哺乳類細胞。
  32. 前記改変は、
    － 少なくとも１つのＲＮＡ産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞、
    － 少なくとも１つのＲＮＡ産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞であって、前記少なくとも１つの産物の発現は、増加される、前記細胞、又は
    － 少なくとも１つのＲＮＡ産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞であって、前記少なくとも１つ産物の発現は、減少される、前記細胞
    をもたらす、請求項３１に記載の哺乳類細胞。
  33. 真核細胞、好ましくは哺乳類細胞におけるインビボ又はエキソビボでの使用：
    － ＲＮＡ配列特異的干渉、
    － ＲＮＡ配列特異的遺伝子調節、
    － ＲＮＡ若しくはＲＮＡ産物、又はｌｉｎｃＲＮＡ若しくは非コードＲＮＡ、又は核ＲＮＡ、又はｍＲＮＡのスクリーニング、
    － 突然変異誘発、
    － 蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、
    － 育種、
    － 細胞休眠のインビトロ又はインビボ誘導、
    － 細胞周期停止のインビトロ又はインビボ誘導、
    － 細胞成長及び／又は細胞増殖のインビトロ又はインビボ低下、
    － 細胞アネルギーのインビトロ又はインビボ誘導、
    － 細胞アポトーシスのインビトロ又はインビボ誘導、
    － 細胞壊死のインビトロ又はインビボ誘導、
    － 細胞死のインビトロ又はインビボ誘導、又は
    － プログラム細胞死のインビトロ又はインビボ誘導
    のための、請求項１～３０のいずれか一項に記載の又は請求項１～３０のいずれか一項で言及される天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  34. 請求項３１又は３２に記載の細胞の若しくはそれを含む細胞株又はその子孫。
  35. 請求項３１又は３２に記載の１つ以上の細胞を含む真核生物、好ましくは哺乳類。
  36. 請求項３１又は３２に記載の１つ以上の細胞を含む真核生物モデル、好ましくは哺乳類モデルであって、前記細胞は、任意選択で、請求項１～３５のいずれか一項に記載の組成物又はその成分を誘導的又は構成的に発現する、真核生物モデル、好ましくは哺乳類モデル。
  37. 請求項３１若しくは３２の細胞、又は請求項３４若しくは３５に記載の細胞株若しくは生物、又は請求項３６に記載の哺乳類モデルからの産物であって、前記細胞株又は哺乳類モデルの哺乳類の前記１つ又は複数の細胞は、任意選択で、請求項１～３６のいずれか一項に記載の組成物又はその成分を誘導的又は構成的に発現する、産物。
  38. 請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用を含むアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法。
  39. ＲＮＡベースのアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法であって、改善は、ＲＮＡを使用する代わりに、含み、前記方法は、請求項１～３０のいずれか一項に記載の又は請求項１～３０のいずれか一項で言及される天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を使用することを含み、任意選択で、前記ＲＮＡベースのアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法は、ＲＮＡｉ又は蛍光インサイチュハイブリダイゼーション方法である、ＲＮＡベースのアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法。
  40. 目的の真核生物標的遺伝子座の翻訳を調節する方法であって、請求項１～３０のいずれか一項に記載の又は請求項１～３０のいずれか一項で言及される天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、翻訳アクチベーター又は翻訳リプレッサーなどの（異種）翻訳調節因子及び任意選択で１つ以上の局在化シグナルに融合され、少なくとも前記１つ以上の核酸成分は、エンジニアリングされ、前記１つ以上の核酸成分は、複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質は、前記１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体は、前記目的の標的遺伝子座に結合し、好ましくは、前記異種ドメインは、ＥＩＦ４ＥなどのＥＩＦ４である、方法。
  41. 試料中の標的ＲＮＡを検出する方法であって、
    （ａ）前記試料を、請求項１～３０のいずれか一項に記載の又は請求項１～３０のいずれか一項で言及される天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物及び前記エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するＲＮＡベースの切断誘導可能レポーターとインキュベートすること、
    （ｂ）前記ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーターの切断によって生成されるシグナルに基づいて前記標的ＲＮＡを検出すること
    を含む方法。
  42. 前記ＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター構築物は、蛍光色素及び消光剤を含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記標的ＲＮＡは、病原体ＲＮＡを含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
  44. 前記病原体は、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 標的ＲＮＡの一塩基変異多型又はＲＮＡ転写物のスプライス変異体を検出するように設計されたガイドＲＮＡを含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡとの１つ以上のミスマッチヌクレオチドを含む、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記ガイドＲＮＡは、疾患状態の診断指標となる標的分子に結合する、請求項４１～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記疾患状態は、癌を含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記疾患状態は、自己免疫疾患を含む、請求項４７に記載の方法。
  50. リボ核酸（ＲＮＡ）検出系であって、
    ａ）請求項１～３０のいずれか一項に記載の又は請求項１～３０のいずれか一項で言及される天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、及び
    ｃ）前記エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するＲＮＡベースの切断誘導可能レポーター
    を含むリボ核酸（ＲＮＡ）検出系。
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