BR112019021378A2 - ortólogos de crispr tipo vi inovadores e sistemas - Google Patents

Abstract

trata-se de sistemas, métodos e composições para alvejar ácidos nucleicos. em particular, a invenção fornece sistemas de alvejamento de rna de ocorrência natural ou geneticamente modificado que compreende uma proteína efetora de crispr de alvejamento de rna inovadora e pelo menos um componente de ácido nucleico de alvejamento como um rna-guia.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: ORTÓLOGOS DE CRISPR TIPO VI INOVADORES E SISTEMAS

Pedidos relacionados e incorporação a titulo de referência [001] Este pedido reivindica a prioridade sobre o Pedido Provisório n° U.S. 62/484.791, depositado em 12 de abril de 2017, Pedido Provisório n° U.S. 62/561.662, depositado em 21 de setembro de 2017 e Pedido Provisório n° U.S. 62/568.129, depositado em 4 de outubro de 2017, cada um dos quais está incorporado ao presente documento a titulo de referência em sua totalidade.

[002] É feita referência ao pedido PCT que inclui uma vez que o mesmo designa, inter alia, pedido n° U.S. PCT/US2016/058302, depositado em 21 de outubro de 2016. É feita referência ao pedido de patente provisório n° U.S. 62/245.270 depositado em 22 de outubro de 2015, pedido de patente provisório n° U.S. 62/296.548 depositado em 17 de fevereiro de 2016 e pedidos de patente provisórios n° U.S. 62/376.367 e 62/376.382, depositados em 17 de agosto de 2016. Ainda é feita referência ao documento U.S. 62/471.792, depositado em 15 de março de 2017. Ainda é feita referência a pedido de patente provisório n° U.S. 62/471.170, depositado em 17 de março de 2017. Ainda é feita referência a pedido de patente provisório n° U.S. 62/484.791, depositado em quartafeira, 12 de abril de 2017. Ainda é feita referência a pedido

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2/776 de patente provisório n° U.S. 62/561.662, depositado em quinta-feira, 21 de setembro de 2017. É feita menção ao: Smargon et ai. (2017), CaslSb Is a Type VI-B CRISPRAssociated RNA-Guided RNase Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28, Molecular Cell 65, 618630 (16 de fevereiro de 2017) doi: 10.1016/j.molcel.2016.12.023 . Publicação Eletrônica 5 de janeiro de 2017 e Smargon et al. (2017), CaslSb Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNase Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28, bioRxiv 092577; doi: https://doi.org/10.1101/092577. Postado em 9 de dezembro de 2017. Cada um dos pedidos e citações de literatura anteriores são incorporados ao presente documento a título de referência.

[003] Todos os documentos citados ou referenciados como documentos citados no presente documento, juntamente com quaisquer instruções do fabricante, descrições, especificações de produto, e fichas de produto para quaisquer produtos mencionados no presente documento ou em qualquer documento incorporado a título de referência no presente documento, são incorporados ao presente documento a título de referência, e podem ser empregados na prática da invenção. Mais especificamente, todos os documentos referidos são incorporados a título de referência como se cada documento individual tivesse sido específica e individualmente

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3/ΊΊ6 indicado para ser incorporado a titulo de referência.

Declaração conforme pesquisa federalmente patrocinada [004] Esta invenção foi realizada com apoio governamental sob os números de concessão MH100706 e MH110049 concedidos pelos Institutos Nacionais de Saúde. O Governo tem determinados direitos na invenção.

Campo da Invenção [005] A presente invenção, em geral, se refere a sistemas, métodos e composições usados para o controle de expressão de gene que envolve alvejamento de sequência, como perturbação de transcrições de gene ou edição de ácido nucleico, que podem usar sistemas de vetor relacionados a Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR) e componentes dos mesmos.

Antecedentes da invenção [006] Avanços recentes em técnicas de sequenciamento de genoma e métodos de análise aceleraram significativamente a capacidade de catalogar e mapear fatores genéticos associados a uma diversa faixa de doenças e funções biológicas. As tecnologias de alvejamento preciso de genoma são necessárias para possibilitar modificação genética reversa sistemática de variações genéticas causais permitindo-se perturbação seletiva de elementos genéticos individuais, bem como avançar em aplicações de biologia sintética, de biotecnologia e médicas. Embora as técnicas de

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4/776 edição de genoma, como projetar dedos de zinco, atuadores similares a ativador de transcrição (TALEs), ou migrar meganucleases, estejam disponíveis para produzir perturbações específicas do genoma, permanece uma necessidade por novas tecnologias de modificação genética de transcritoma e genoma que empregam mecanismos moleculares e estratégicas inovadores e são acessíveis, fáceis de configurar, expansíveis e susceptíveis a múltiplas posições de alvejamento dentro do transcritoma e genoma eucariótico. Isso fornecería um maior recurso para novas aplicações em biotecnologia e modificação genética de genoma.

[007] Os sistemas de CRISPR-Cas de imunidade adaptativa de arquea e bacteriana mostram extrema diversidade de composição de proteína e arquitetura de loci genômicos. Os loci de sistema de CRISPR-Cas têm mais de 50 famílias de gene e não há genes estritamente universais que indicam evolução rápida e extrema diversidade de arquitetura de loci. Até o momento, ao adotar uma abordagem de múltiplas fases, é compreensivo identificação de gene cas de cerca de 395 perfis para 93 proteínas de Cas. A classificação inclui perfis de assinatura genética mais assinaturas de arquitetura de locus. Uma nova classificação de sistemas de CRISPR-Cas é proposta, na qual esses sistemas são amplamente divididos em duas classes, Classe 1 com complexos de atuador de múltiplas subunidades e Classe 2 com módulos de atuador

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5/776 de subunidade única exemplificados pela proteína Cas9. As proteínas efetoras inovadoras associadas a sistemas de CRISPR-Cas de Classe 2 podem ser desenvolvidas como ferramentas poderosas de modificação genética de genoma e a previsão de proteínas efetoras inovadoras putativas e sua modificação genética e otimização são importantes.

[008] O sistema imune adaptativo de CRISPR-Cas defende micróbios contra elementos genéticos externos por meio de interferência de DNA ou RNA-DNA. Atuadores de CRISPRCas de componente único do tipo VI de Classe 2 alvejam RNA. Um como CaslSa (também conhecido como C2c2; consulte Shmakov et ai. (2015) Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems; Molecular Cell 60:1-13; doi: http://dx.doi.Org/10.1016/j.molcel.2015.10.008), que foi caracterizado como um Rnase guiado por RNA (Abudayyeh et al. (2016), Science, [Publicação Eletrônica ahead de print], 2 de Junho; C2c2 is a single-component programmable RNAguided RNA-targeting CRISPR effector; doi: 10.1126/science.aaf5573). Mediante a classificação atual, Casl3a é um sistema de CRISPR-Cas de tipo VI de Classe 2. Uma alternativa é fornecida por Casl3b, uma proteína efetora do Tipo VI-B de Classe 2. As proteínas efetoras de Tipo VIB de Classe 2 incluem dois subgrupos, Tipo VI-B1 e Tipo VIB2, que também são chamados de proteínas de Grupo 2 9 e proteínas de Grupo 30, e incluem membros que são nucleases

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6/ΊΊ6 programáveis por RNA, interferência de RNA e podem estar envolvidas em imunidade adotiva bacterina contra fagos de RNA. (consultar Smargon A et al. Casl3b is a Type VI-B CRISPR-associated RNA-Guided RNAse differentially regulated by accessory proteins Csx27 and Csx28, online, 5 de janeiro de 2017. DOI: 10.1016/j.molcel.2016.12.023).

[009] Sistemas de grupo 29 e grupo 30 compreendem um único atuador grande (aproximadamente 1.100 aminoácidos em comprimento), denominado Casl3b, e uma ou nenhuma de duas pequenas proteínas acessórias putativas (aproximadamente 200 aminoácidos em comprimento, e chamadas de Csx27 e Csx28) próximas a um arranjo de CRISPR. Com base na pequena proteína próxima, o sistema é classificado como Tipo VI-B1 (Csx27) ou Tipo VI-B2 (Csx28). Nenhuma proteína adicional fora de 25 pares de quilobase a montante ou a jusante do arranjo são conservados através de espécies com cada locus. Com exceções menores, o arranjo de CRISPR compreende nucleotídeos de 36 sequências de repetição direta em comprimento e nucleotídeos de 30 sequências de espaçador em comprimento. A repetição direta é, em geral, bem conservada, especialmente nas extremidades, com uma GTTG/GUUG na extremidade reversa 5' complementar a uma CAAC na extremidade 3'. Essa conservação sugere emparelhamento de base forte para uma estrutura de alça de RNA que interage potencialmente com a proteína (ou proteínas) no locus. Uma busca de motivo complementar às

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7/776 repetições diretas revelou nenhum candidato tracrRNAs próximo aos arranjos, indicativo de um único crRNA similar

àquele constatado	no locus de citação ou	Cpf 1.	qualquer
[010]	A	identificação	de
documento	neste	pedido não	é uma admissão	de	que tal

documento está disponível como técnica anterior para a presente invenção.

Sumário da invenção [011] Há uma necessidade urgente por sistemas e técnicas robustos e alternativos para alvejamento de ácido nucleicos ou polinucleotídeos (por exemplo, DNA ou RNA ou qualquer híbrido ou derivado dos mesmos) com um amplo arranjo de aplicações, em particular, em sistemas eucarióticos, mais em particular, em sistemas de mamíferos. Esta invenção aborda essa necessidade e fornece vantagens relacionadas. Adicionar os sistemas inovadores de alvejamento de RNA do presente pedido ao repertório de tecnologias de alvejamento genômico, transcritômico e epigenômico pode transformar o estudo e perturbação ou edição de locais alvo específicos através de detecção direta, análise e manipulação, em particular, em sistemas eucarióticos, mais em particular, em sistemas de mamíferos (que incluem células, órgãos, tecidos ou organismos). Para utilizar os sistemas de alvejamento de RNA do presente pedido de modo eficaz para alvejamento de RNA sem efeitos prejudiciais, é crítico entender aspectos de

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8/776 modificação genética e otimização dessas ferramentas de alvejamento de RNA.

[012] A proteína efetora Casl3b do tipo VI-B de Classe 2 é um RNase guiado por RNA que pode ser programado de modo eficaz para degradar ssRNA. Os presentes inventores realizaram triagem para identificar um número representativo de ortólogos de Casl3b de espécies diferentes, e para determinar eficácia desses ortólogos em ambientes celulares eucarióticos. Em várias modalidades, a invenção refere-se a, inclui ou faz uso de uma proteína efetora CRISPR-Cas Tipo VI-B ou uma proteína efetora Casl3b; assim como ácidos nucleicos que codificam tais proteínas.

[013] Em algumas modalidades, a proteína efetora é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga ou idêntica a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem de um organismo procariótico selecionado a partir do grupo que consiste em Porphyromonas, Prevotella_r Bacteroides, Riemerella, Bergeyella , Alistipes, Myroides, Capnocytophaga e Flavobacteríum. Em algumas modalidades, a proteína efetora é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga ou idêntica a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem de um organismo procariótico selecionado a partir do grupo que consiste em Porphyromonas gulae, Prevotella sp. _r Porphyromonas

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 16/817 °>/ΊΊ6 gingivalis , Bacteroides pyogenes , Riemerella anatipestifer, Bergeyella zoohelcum, Prevotella intermedia , Prevotella buccae, Alistipes sp. _r Prevotella aurantiaca, Myroides odoratimimus, Capnocytophaga canimorsus_r Flavobacterium branchiophilum e Flavobacterium columnare. Em modalidades preferenciais, a proteína efetora é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga ou idêntica a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem selecionada a partir do grupo que consiste em Porphyromonas gulae Casl3b (número de acesso WP_039434803), Prevotella sp. P5-125 Casl3b (número de acesso WP_044065294), Porphyromonas gingivalis Casl3b (número de acesso WP_053444417), Porphyromonas sp. COT-052 OH4946 Casl3b (número de acesso WP_039428968), Bacteroides pyogenes Casl3b (número de acesso WP_034542281), Riemerella anatipestifer Casl3b (número de acesso WP_004919755). As proteína efetoras mais preferenciais são aquelas pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogas ou idênticas a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem selecionada a partir do grupo que consiste em Porphyromonas gulae Casl3b (número de acesso WP_039434803), Prevotella sp. P5-125 Casl3b (número de acesso WP_044065294), Porphyromonas gingivalis Casl3b (número de acesso WP_053444417), Porphyromonas sp. COT-052 OH4946 Casl3b (número de acesso WP 039428968); e, mais

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10/776 especificamente preferencial, são Porphyromonas gulae Casl3b (número de acesso WP_039434803) ou Prevotella sp. P5-125 Casl3b (número de acesso WP_044065294) . As sequências completas de aminoácido de cada uma dessas proteínas efetoras Casl3b, e outras, são dadas na Figura 1.

[014] Em algumas modalidades, a proteína efetora Casl3b (a) compreende 900 a 1.800 aminoácidos e dois domínios de HEPN, (b) está naturalmente presente em um genoma procariótico dentro de 10 quilopares de bases a montante ou a jusante de um arranjo CRISPR, (c) é a única proteína codificada que compreende mais do que 700 aminoácidos dentro de 10 quilopares de bases a montante ou a jusante do arranjo de CRISPR, e/ou (d) não há nenhum gene Casl ou gene Cas2 dentro de 10 quilopares de bases a montante ou a jusante do arranjo de CRISPR. Em algumas modalidades, pelo menos um dentre Csx27 ou Csx28 está também presente dentro de 10 quilopares de bases a montante ou a jusante do arranjo de CRISPR.

[015] Em determinadas modalidades, a proteína efetora Casl3b tem uma sequência modificada em comparação a uma proteína do tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a proteína efetora é idêntica a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem em pelo menos um ou mais motivos comuns dentre duas ou mais proteína efetoras Casl3b. Os motivos comuns podem ser determinados por ferramentas de alinhamento

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11/776 de sequência comum para identificar sequências consenso. Em modalidades particulares, a proteína efetora Casl3b é uma proteína que compreende uma sequência que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com uma ou mais das sequências que consistem em DKHXFGAFLNLARHN (SEQ ID NO:1), GLLFFVSLFLDK (SEQ ID NO: 2), SKIXGFK (SEQ ID NO: 3) , DMLNELXRCP (SEQ ID NO:4), RXZDRFPYFALRYXD (SEQ ID NO: 5) e LRFQVBLGXY (SEQ ID NO: 6) . Em modalidades particulares adicionais, a proteína efetora Casl3b compreende uma sequência que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com pelo menos 2, 3, 4, 5 ou todas as 6 dessas sequências. Em modalidades particulares adicionais, a identidade de sequência com essas sequências é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%. Em modalidades particulares adicionais, a proteína efetora Cas 13b é uma proteína que compreende uma sequência que tem 100% de identidade de sequência com GLLFFVSLFL (SEQ ID NO:7) e RHQXRFPYF (SEQ ID NO:8). Em modalidades particulares adicionais, o efetor Casl3b é uma proteína efetora Casl3b que compreende uma sequência que tem 100% de identidade de sequência com RHQDRFPY (SEQ ID NO:9).

[016] Será observado que os termos enzima de Cas, enzima de CRISPR, proteína Cas, proteína CRISPR e Cas CRISPR são, em geral, usadas de modo intercambiável e em todos os pontos de referência no presente documento, se referem, por analogia, às proteínas efetoras CRISPR adicionalmente

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12/776 descritas neste pedido, a menos que evidente de outro modo, como por referência especifica a Cas9.

[017] Nas modalidades da invenção, um sistema do Tipo VI-B compreende uma proteína efetora Casl3b e opcionalmente uma proteína acessória codificada a montante ou a jusante da proteína efetora Casl3b. Em determinadas modalidades, a proteína acessória pequena acentua a capacidade do efetor Casl3b para alvejar RNA.

[018] Em determinadas modalidades da invenção, um sistema do Tipo VI-B compreende uma proteína efetora Casl3b e opcionalmente uma proteína acessória codificada a montante ou a jusante da proteína efetora Casl3b. Em determinadas modalidades, a proteína acessória pequena reprime a capacidade do efetor Casl3b para alvejar RNA.

[019] A invenção fornece uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural que compreende i) uma proteína efetora CRISPR-Cas do Tipo VI-B, e ii) um crRNA de CRISPR-Cas do Tipo VI-B, em que o crRNA compreende a) uma sequência guia que tem capacidade de hibridização para uma sequência de RNA alvo, e b) uma sequência de repetição direta. A proteína efetora CRISPR-Cas do Tipo VI-B forma um complexo com o crRNA, e a sequência guia direciona ligação específica de sequência do complexo para a sequência de RNA alvo, em que é formado um complexo de CRISPR que compreende a proteína efetora CRISPR-Cas do

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Tipo VI-B complexada com a sequência guia que é hibridizada para a sequência de RNA alvo. 0 complexo que é formado quando a sequência guia hibridiza para a sequência de RNA alvo inclui a interação (reconhecimento) da sequência de flanqueamento de protoespaçador (PFS).

[020] Em algumas modalidades, uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural da invenção pode compreender uma proteína acessória CRISPR-Cas do Tipo VI-B que aperfeiçoa atividade de proteína efetora CRISPR-Cas do Tipo VI-B. Em determinadas modalidades, a proteína acessória que aperfeiçoa atividade de proteína efetora CRISPR-Cas do Tipo VI-B é uma proteína csx28. Em tais modalidades, a proteína efetora CRISPR-Cas do Tipo VIB e a proteína acessória CRISPR-Cas do Tipo VI-B podem ser da mesma fonte ou de uma fonte diferente.

[021] Em algumas modalidades, uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural da invenção compreende uma proteína acessória CRISPR-Cas do Tipo VI-B que reprime atividade de proteína efetora CRISPRCas do Tipo VI-B. Em determinadas modalidades, a proteína acessória que reprime atividade de proteína efetora CRISPRCas do Tipo VI-B é uma crRNAs de CRISPR-Cas do Tipo VI-B. Em tais modalidades, a proteína efetora CRISPR-Cas do Tipo VIB e a proteína acessória CRISPR-Cas do Tipo VI-B podem ser da mesma fonte ou de uma fonte diferente.

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14/776 [022] Em algumas modalidades, uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural da invenção compreende dois ou mais crRNAs de CRISPR-Cas do Tipo VI-B.

[023] Em algumas modalidades, uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural da invenção compreende uma sequência guia que hibridiza para uma sequência de RNA alvo em uma célula procariótica. Em algumas modalidades, uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural da invenção compreende uma sequência guia que hibridiza para uma sequência de RNA alvo em uma célula eucariótica. O sistema de CRISPR, como fornecido no presente documento, pode fazer uso de um crRNA ou polinucleotideo análogo que compreende uma sequência guia, em que o polinucleotideo é um RNA, um DNA ou uma mistura de RNA e DNA, e/ou em que o polinucleotideo compreende um ou mais análogos de nucleotideo. A sequência pode compreender qualquer estrutura, que inclui, porém, sem limitação uma estrutura de um crRNA nativo, como uma estrutura em abaulamento, uma estrutura de alça em formato de grampo ou uma estrutura de alça de haste. Em determinadas modalidades, o polinucleotideo que compreende a sequência guia forma um duplex com uma segunda sequência de polinucleotideos que pode ser um RNA ou uma sequência de DNA.

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15/776 [024] Em determinadas modalidades, os métodos fazem uso de RNAs guia quimicamente modificados. Exemplos de modificações químicas de RNA guia incluem, sem limitação, incorporação de 2'-0-metil (M) , 2'-0-metil 3'fosforotioato (MS), ou 2'-0-metil 3'tioPACE (MSP) em um ou mais nucleotídeos terminais. Tais RNAs guia quimicamente modificados podem compreender estabilidade aumentada e atividade aumentada em comparação com RNAs guia não modificados, embora especificidade no alvo versus fora do alvo não seja previsível. (Consulte, Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985 a 989, doi: 10.1038/nbt.3290, publicado online em 29 de junho de 2015) . Os RNAs guia quimicamente modificados incluem adicionalmente, sem limitação, RNAs com ligações de fosforotioato e nucleotídeos de ácido nucleico travados (LNA) que compreendem uma ponte de metileno entre os carbonos 2' e 4' do anel de ribose.

[025] Em algumas modalidades, a proteína efetora

CRISPR-Cas	do Tipo	VI-B compreende um	ou	mais	sinais	de
localização	nuclear	(NLSs).
[026]	Casl3b alcança divagem	de	RNA	através	de
resíduos básicos conservados dentro de seus	dois	domínios	de

HEPN, em comparação com os mecanismos catalíticos de outros RNases conhecidos constatados em sistemas de CRISPR-Cas. A mutação do domínio de HEPN, como (por exemplo, alanina) substituição de qualquer um dos quatro resíduos catalíticos

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16/776 de domínio de HEPN previstos pode converter Casl3b em uma proteína de ligação de RNA programável inativa (dCasl3b, análoga a dCas9).

[027] A capacidade de dCasl3b de se ligar a sequências especificadas podería ser usada em diversos aspectos de acordo com a invenção para (i) trazer módulos efetores para transcrições específicas para modular a função ou tradução, o que podería ser usado para triagem em larga escala, construção de circuitos reguladores sintéticos e outros propósitos; (ii) RNAs específicos de etiqueta fluorescente para visualizar seu tráfego e/ou localização;

(iii) alterar localização de RNA através de domínios com afinidade para compartimentos subcelulares específicos; e (iv) capturar transcrições específicas (através de retenção direta de dCasl3b ou uso de dCasl3b para localizar atividade de ligase de biotina para transcrições específicas) para enriquecimento para parceiros moleculares proximais, que incluem RNAs e proteínas.

[028] A Casl3b ativa também deve ter muitas aplicações. Um aspecto da invenção envolve alvejar uma transcrição específica para destruição. Além disso, Casl3b, uma vez preparada pelo alvo cognato, pode realizar divagem de outras moléculas de RNA (não complementares) in vitro e pode inibir crescimento de célula in vivo. Biologicamente, essa atividade promíscua de RNAase pode refletir em um

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17/776 mecanismo de proteção baseado em morte/dormência de célula programada (PCD/D) dos sistemas de CRISPR-Cas do tipo VI-B. Consequentemente, em um aspecto da invenção, a mesma pode ser usada para disparar PCD ou dormência em células específicas — por exemplo, células cancerígenas que expressam uma transcrição particular, neurônios de uma determinada classe, células infectadas por a patógeno específico, ou outras células aberrantes ou cuja células a presença é, de outro modo, indesejável.

[029] A invenção fornece um método de modificar sequências de ácido nucleico associadas a ou em um locus alvo de interesse, em particular, em células eucarióticas, tecidos, órgãos, ou organismos, mais em particular, em células de mamíferos, tecidos, órgãos, ou organismos, em que o método compreende a entrega para o dito locus de uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural que compreende uma proteína efetora de loci de CRISPR-Cas do Tipo VI-B e um ou mais componentes de ácido nucleico, em que a proteína efetora forma um complexo com o um ou mais componentes de ácido nucleico e, mediante ligação do dito complexo ao locus de interesse, a proteína efetora induz a modificação das sequências associadas a ou no locus alvo de interesse. Em uma modalidade preferencial, a modificação é a introdução de uma quebra de fita. Em uma modalidade preferencial, as sequências associadas a ou no

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18/776 locus alvo de interesse compreendem RNA e a proteína efetora é codificada por um locus de CRISPR-Cas do tipo VI-B. 0 complexo pode ser formado in vitro ou ex vivo e introduzido em uma célula ou colocado em contato com RNA; ou pode ser formado ín vivo.

[030] A invenção fornece um método de alvejar (como modificar) sequências associadas a ou em um locus alvo de interesse, em que o método compreende entregar para as ditas sequências associadas a ou no locus uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural que compreende uma proteína efetora de loci Casl3b (que pode ser cataliticamente ativa ou, de modo alternativo, cataliticamente inativa) e um ou mais componentes de ácido nucleico, em que a proteína efetora Casl3b forma um complexo com o um ou mais componentes de ácido nucleico e mediante a ligação do dito complexo ao locus de interesse, a proteína efetora induz a modificação de sequências associadas a ou no locus alvo de interesse. Em uma modalidade preferencial, a modificação é a introdução de uma quebra de fita. Em uma modalidade preferencial, a proteína efetora Casl3b forma um complexo com um componente de ácido nucleico; vantajosamente, um componente de ácido nucleico geneticamente modificado ou de ocorrência não natural. O complexo pode ser formado in vitro ou ex vivo e introduzido em uma célula ou colocado em contato com RNA; ou pode ser

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19/776 formado in vivo. A indução de modificação de sequências associada a ou no locus alvo de interesse pode ser guiada por ácido nucleico de proteína efetora Casl3b. Em uma modalidade preferencial, o um componente de ácido nucleico é um RNA de CRISPR (crRNA). Em uma modalidade preferencial, o um componente de ácido nucleico é um crRNA maduro ou RNA guia, em que o crRNA maduro ou RNA guia compreende uma sequência de espaçador (ou sequência guia) e uma sequência de repetição direta ou derivados dos mesmos. Em uma modalidade preferencial, a sequência de espaçador ou o derivado da mesma compreende uma sequência de semente, em que a sequência de semente é crítica para o reconhecimento e/ou hibridização para a sequência no locus alvo.

[031] Os aspectos da invenção se referem a complexos de proteína efetora Casl3b que têm um ou mais componentes de ácido nucleico otimizados ou modificados ou geneticamente modificados ou de ocorrência não natural. Em uma modalidade preferencial, o componente de ácido nucleico do complexo pode compreender uma sequência guia ligada a uma sequência de repetição direta, em que a sequência de repetição direta compreende uma ou mais alças de haste ou estruturas secundárias otimizadas. Em uma modalidade, a sequência de repetição direta pode ser cerca de 36 nucleotídeos em comprimento. Em uma modalidade específica, a repetição direta compreende um GTTG/GUUG na extremidade 5' que é

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20/776 reversa complementar a uma CAAC na extremidade 3' . Em determinadas modalidades, a repetição direta tem um comprimento mínimo de 16 nts, como pelo menos 28 nt, e uma única alça de haste. Em modalidades adicionais, a repetição direta tem um comprimento mais longo que 16 nts, de preferência, mais de 17 nts, como pelo menos 28 nt, e tem mais de uma alça de haste ou estruturas secundárias otimizadas. Em modalidades particulares, a repetição direta tem 25 ou mais nts, como 26 nt, 27 nt, 28 nt ou mais, e uma ou mais estruturas de alça de haste. Em uma modalidade preferencial, a repetição direta pode ser modificada para compreender um ou mais aptâmeros de RNA de ligação de proteína. Em uma modalidade preferencial, um ou mais aptâmeros podem ser incluídos como parte de estrutura secundária otimizada. Tais aptâmeros podem ter capacidade de ligação a uma proteína de revestimento bacteriófago. A proteína de revestimento bacteriófago pode ser selecionada a partir do grupo que compreende Qp, F2, GA, fr, JP501, MS2, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, Mil, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, φΕΒ5, (|)Cb8r, (|)Cbl2r, (|)Cb23r, 7s e PRR1. Em uma modalidade preferencial, a proteína de revestimento bacteriófago é MS2. A invenção também fornece o componente de ácido nucleico do complexo que tem 30 ou mais, 40 ou mais ou 50 ou mais nucleotídeos em comprimento.

[032] A invenção fornece células que compreendem

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21/776 proteína efetora Casl3b e/ou guias e/ou complexos das mesmas com ácidos nucleicos alvo, o que inclui células que compreendem proteína efetora Casl3b e/ou guias introduzidas ou expressadas de modo transitório e/ou complexos das mesmas. Em determinadas modalidades, a célula é uma célula eucariótica, que inclui, porém, sem limitação uma célula de levedura, uma célula de planta, uma célula de mamífero, uma célula de animal ou uma célula humana.

[033] A invenção também fornece um método de modificar um locus alvo de interesse, em particular, em células eucarióticas, tecidos, órgãos, ou organismos, mais em particular, em células de mamíferos, tecidos, órgãos, ou organismos, em que o método compreende entregar para o dito locus uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural que compreende uma proteína efetora de loci Casl3b e um ou mais componentes de ácido nucleico, em que a proteína efetora Casl3b forma um complexo com o um ou mais componentes de ácido nucleico e mediante ligação do dito complexo ao locus de interesse, a proteína efetora induz a modificação do locus alvo de interesse. Em uma modalidade preferencial, a modificação é a introdução de uma quebra de fita. O complexo pode ser formado in vitro ou ex vivo e introduzido em uma célula ou colocado em contato com RNA; ou pode ser formado in vivo.

[034] Em tais métodos, o locus alvo de interesse

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22/776 pode ser compreendido dentro de um módulo de RNA. Ademais, o locus alvo de interesse pode ser compreendido dentro de uma molécula de DNA e, em determinadas modalidades, dentro de uma molécula de DNA transcrita. Em tais métodos, o locus alvo de interesse pode ser compreendido em uma molécula de ácido nucleico in vitro.

[035] Em tais métodos, o locus alvo de interesse pode ser compreendido em uma molécula de ácido nucleico dentro de uma célula, em particular, uma célula eucariótica, como uma célula de mamífero ou uma célula de planta. A célula de mamífero poder uma célula de primata não humano, bovina, porcina, de roedor ou camundongo. A célula pode ser uma célula de mamífero não eucariótica como ave, peixe ou camarão. A célula de planta pode ser de uma planta de cultura, como aipim, milho, sorgo, trigo ou arroz. A célula de planta também pode ser de uma alga, árvore ou vegetal. A modificação introduzida na célula pela presente invenção pode ser de modo que a célula e progenitura da célula sejam alteradas para produção aprimorada de produtos biológicos, como um anticorpo, amido, álcool ou outras emissões celulares desejadas. A modificação introduzida na célula pela presente invenção pode ser de modo que a célula e a progenitura da célula incluam uma alteração que modifica o produto biológico produzido.

[036] A célula de mamífero pode ser um mamífero não

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23/776 humano, por exemplo, primata, bovino, ovino, porcino, canino, roedor, Leporidae, como célula de macaco, vaca, ovelha, porco, cachorro, coelho, rato ou camundongo. A célula pode ser uma célula de mamífero não eucariótica como célula de aves de criação (por exemplo, galinha), peixe vertebrado (por exemplo, salmão) ou marisco (por exemplo, ostra, amêijoa, lagosta, camarão). A célula também pode ser uma célula de planta. A célula de planta pode ser de uma monocotiledônia ou dicotiledônia ou de uma planta de cultura ou grão, como aipim, milho, sorgo, soja, trigo, aveia ou arroz. A célula de planta também pode ser de uma alga, árvore ou planta de produção, fruta ou vegetal (por exemplo, árvores como, árvores de cítricos, por exemplo, árvores de laranja, toranja ou limão; árvores de pêssego ou nectarina; árvores de maçã ou pêra; árvores de noz, como árvores de amêndoa ou nogueira ou pistache; plantas de erva moura; plantas do gênero Brassica; plantas do gênero Lactuca; plantas do gênero Spinacia; plantas dedo gênero Capsicum; algodão, tabaco, aspargo, cenoura, repolho, brócolis, couve-flor, tomate, beringela, pimenta, alface, espinafre, morango, mirtilo, framboesa, amora, uva, café, cacau, etc).

[037] A invenção fornece um método de modificar um locus alvo de interesse, em que o método compreende entregar para o dito locus uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural que compreende uma proteína efetora

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24/776 de loci de CRISPR-Cas do Tipo VI-B e um ou mais componentes de ácido nucleico, em que a proteína efetora forma um complexo com o um ou mais componentes de ácido nucleico e, mediante ligação do dito complexo ao locus de interesse, a proteína efetora induz a modificação do locus alvo de interesse. Em uma modalidade preferencial, a modificação é a introdução de uma quebra de fita.

[038] A invenção também fornece um método de modificar um locus alvo de interesse, em que o método compreende entregar para o dito locus uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural que compreende uma proteína efetora de loci Casl3b e um ou mais componentes de ácido nucleico, em que a proteína efetora Casl3b forma um complexo com o um ou mais componentes de ácido nucleico e mediante ligação do dito complexo ao locus de interesse, a proteína efetora induz a modificação do locus alvo de interesse. Em uma modalidade preferencial, a modificação é a introdução de uma quebra de fita.

[039] Em tais métodos, o locus alvo de interesse pode ser compreendido em uma molécula de ácido nucleico ín vitro. Em tais métodos, o locus alvo de interesse pode ser compreendido em uma molécula de ácido nucleico dentro de uma célula. De preferência, em tais métodos, o locus alvo de interesse pode ser compreendido em uma molécula de RNA ín vitro. Ademais, de preferência, em tais métodos, o locus

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25/776 alvo de interesse pode ser compreendido em uma molécula de RNA dentro de uma célula. A célula pode ser uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. A célula pode ser uma célula de mamífero. A célula pode ser uma célula de roedor. A célula pode ser uma célula de camundongo.

[040] Em qualquer um dos métodos descritos, o locus alvo de interesse pode ser um locus de interesse genômico ou epigenômico. Em qualquer um dos métodos descritos, o complexo pode ser entregue com múltiplas guias para uso multiplexado. Em qualquer um dos métodos descritos mais de uma proteína (ou proteínas) pode ser usada.

[041] Em aspectos adicionais da invenção, os componentes de ácido nucleico podem compreender uma sequência de RNA de CRISPR (crRNA) . Sem limitação, os Requerentes têm a hipótese de que, em tais exemplos, o précrRNA pode compreender estrutura secundária que é suficiente para processamento para produzir o crRNA maduro, bem como carregamento de crRNA na proteína efetora. A título de exemplificação e não de limitação, tal estrutura secundária pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em uma alça de haste dentro do pré-crRNA, mais particularmente, dentro da repetição direta.

[042] Em qualquer um dos métodos descritos, a proteína efetora e os componentes de ácido nucleico podem ser fornecidos por meio de uma ou mais moléculas de

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26/776 polinucleotideo que codificam a proteína e/ou componente (ou componentes) de ácido nucleico, e em que a m ou mais moléculas de polinucleotideo são configuradas de modo operável para expressar a proteína e/ou o componente (ou componentes) de ácido nucleico. A uma ou mais moléculas de polinucleotideo podem compreender um ou mais elementos reguladores configurados de modo operável para expressar a proteína e/ou o componente (ou componentes) de ácido nucleico. A uma ou mais moléculas de polinucleotideo podem ser compreendidas dentro de um ou mais vetores. Em qualquer um dos métodos descritos, o locus alvo de interesse pode ser um locus de interesse genômico ou epigenômico. Em qualquer um dos métodos descritos, o complexo pode ser entregue com múltiplas guias para uso multiplexado. Em qualquer um dos métodos descritos, mais de uma proteína (ou proteínas) pode ser usada.

[043] Os elementos reguladores podem compreender promotores induzíveis. Os polinucleotídeos e/ou sistemas de vetor podem compreender sistemas induzíveis.

[044] Em qualquer um dos métodos descritos, a uma ou mais moléculas de polinucleotideo podem ser compreendidas em um sistema de entrega, ou o um ou mais vetores podem ser compreendidos em um sistema de entrega.

[045] Em qualquer um dos métodos descritos, a composição geneticamente modificada ou de ocorrência não

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27/776 natural pode ser entregue por meio de lipossomas, partículas que incluem nanopartícuias, exossomos, microvesícuias, um gene injetor ou um ou mais vetores virais.

[046] A invenção também fornece uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural que é uma composição que tem as características conforme discutidas no presente documento ou definidas em qualquer um dos métodos descritos no presente documento.

[047] Em determinadas modalidades, a invenção, desse modo, fornece uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural, como particularmente uma composição com capacidade de ou configurada para modificar um locus alvo de interesse, em que a dita composição compreende uma proteína efetora de loci de CRISPR-Cas do Tipo VI-B e um ou mais componentes de ácido nucleico, em que a proteína efetora forma um complexo com o um ou mais componentes de ácido nucleico e, mediante a ligação do dito complexo ao locus de interesse, a proteína efetora induz a modificação do locus alvo de interesse. Em determinadas modalidades, a proteína efetora pode ser uma proteína efetora de loci CaslSb.

[048] A invenção também fornece em um aspecto adicional uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural, como particularmente uma composição com capacidade de ou configurada para modificar um locus

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28/776 alvo de interesse, em que a dita composição compreende: (a) uma molécula de RNA guia (ou uma combinação de moléculas de RNA guia, por exemplo, uma primeira molécula de RNA guia e uma segunda molécula de RNA guia, como para multiplexação) ou um ácido nucleico que codifica a molécula de RNA guia (ou um ou mais ácido nucleicos que codificam a combinação de moléculas de RNA guia); (b) uma proteína efetora de loci de CRISPR-Cas do Tipo VI-B ou um ácido nucleico que codifica a proteína efetora de loci de CRISPR-Cas do Tipo VI-B. Em determinadas modalidades, a proteína efetora pode ser uma proteína efetora de loci CaslSb.

[049] A invenção também fornece, em um aspecto adicional, uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural que compreende: (a) uma molécula de RNA guia (ou uma combinação de moléculas de RNA guia, por exemplo, uma primeira molécula de RNA guia e uma segunda molécula de RNA guia) ou um ácido nucleico que codifica a molécula de RNA guia (ou um ou mais ácido nucleicos que codificam a combinação de moléculas de RNA guia); (b) ser uma proteína efetora de loci CaslSb.

[050] A invenção também fornece um sistema de vetor que compreende um ou mais vetores, em que o um ou mais vetores compreendem uma ou mais moléculas de polinucleotídeo que codificam componentes de uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural que é uma composição

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29/776 que tem as características como definidas em qualquer um dos métodos descritos no presente documento.

[051] A invenção também fornece um sistema de entrega que compreende um ou mais vetores ou uma ou mais moléculas de polinucleotídeo, em que o um ou mais vetores ou moléculas de polinucleotídeo compreendem uma ou mais moléculas de polinucleotídeo que codificam componentes de uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural que é uma composição que tem as características discutidas no presente documento ou como definida em qualquer um dos métodos descritos no presente documento.

[052] A invenção também fornece uma composição geneticamente modificada ou de ocorrência não natural, ou um ou mais polinucleotídeos que codificam componentes da dita composição, ou sistemas de vetor ou entrega que compreendem um ou mais polinucleotídeos que codificam componentes da dita composição para uso em um método terapêutico de tratamento. O método terapêutico de tratamento pode compreender edição de gene ou transcritoma, ou terapia de gene.

[053] A invenção também fornece métodos e composições, em que um ou mais resíduos de aminoácido da proteína efetora podem ser modificados, por exemplo, uma proteína efetora ou Casl3b geneticamente modificação ou de ocorrência não natural. Em uma modalidade, a modificação

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30/776 pode compreender mutação de um ou mais resíduos de aminoácido da proteína efetora. A uma ou mais mutações podem estar em um ou mais domínios cataliticamente ativos da proteína efetora. A proteína efetora pode ter atividade de nuclease abolida ou reduzida em comparação com uma proteína efetora ausenta na dita uma ou mais mutações. A proteína efetora pode não direcionar divagem da fita de RNA no locus alvo de interesse. Em uma modalidade preferencial, a uma ou mais mutações podem compreender duas mutações. Em uma modalidade preferencial, o um ou mais resíduos de aminoácido são modificados em uma proteína efetora Casl3b, por exemplo, uma proteína efetora ou Casl3b geneticamente modificação ou de ocorrência não natural. Em determinadas modalidades, a proteína efetora compreende uma ou mais das seguintes mutações: R116A, H121A, R1177A, H1182A (em que posições de aminoácido correspondem a posições de aminoácido de proteína Casl3b que tem origem a partir de Bergeyella zoohelcum ATCC 43767), como R116A, H121A, R1177A, e H1182A; R116A, H121A, e R1177A; R116A, H121A, e H1182A; R116A, R1177A, e H1182A; H121A, R1177A, e H1182A; R116A e H121A; R116A e R1177A; R116A e H1182A; H121A e R1177A; H121A e H1182A; R1177A e H1182A; R116A; H121A; R1177A; H1182A. O indivíduo versado entenderá que posições correspondentes de aminoácido em diferentes proteínas Casl3b podem ser mutadas para o mesmo efeito. Em determinadas modalidades, uma ou mais das mutações R116A,

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H121A, R1177A, H1182A extinguem a atividade catalítica da proteína completa ou parcialmente (por exemplo, taxa de divagem alterada, especificidade alterada, etc.), tal como R116A, H121A, R1177A e H1182A; R116A, H121A e R1177A; R116A, H121A e H1182A; R116A, R1177A e H1182A; H121A, R1177A e H1182A; R116A e H121A; R116A e R1177A; R116A e H1182A; H121A e R1177A; H121A e H1182A; R1177A e H1182A; R116A; H121A; R1177A; H1182A. Em determinadas modalidades, quando as posições de aminoácido correspondem às posições de aminoácido da proteína Casl3b que se origina de Prevotella sp. P5-125, a proteína efetora compreende as mutações H133A e H1058A. Em determinadas modalidades, a proteína efetora conforme descrito no presente documento é uma proteína efetora morta, tal como uma proteína efetora Casl3b morta (isto é, dCasl3b). Em determinadas modalidades, a proteína efetora tem uma ou mais mutações no domínio de HEPN 1. Em determinadas modalidades, a proteína efetora tem uma ou mais mutações no domínio de HEPN 2. Em determinadas modalidades, a proteína efetora tem uma ou mais mutações no domínio de HEPN 1 domínio de HEPN 2. A proteína efetora pode compreender comprise um ou mais domínios funcionais heterólogos. 0 um ou mais domínios funcionais heterólogos podem compreender um ou mais domínios de sinal de localização nuclear (NLS). 0 um ou mais domínios funcionais heterólogos podem compreender pelo menos dois ou mais domínios de NLS. 0 um ou mais domínios de

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NLS podem ser posicionados em ou próximo ou em proximidade a um terminal da proteína efetora (por exemplo, proteína efetora Casl3b) e se forem dois ou mais NLSs, cada um dos dois pode ser posicionado em ou próximo ou em proximidade a um terminal da proteína efetora (por exemplo, proteína efetora Casl3b). 0 um ou mais domínios funcionais heterólogos podem compreender um ou mais domínios de ativação transcricional. Em uma modalidade preferencial, o domínio de ativação transcricional pode compreender VP64. 0 um ou mais domínios funcionais heterólogos podem compreender um ou mais domínios de repressão transcricional. Em uma modalidade preferencial, o domínio de repressão transcricional compreende um domínio KRAB ou um domínio SID (por exemplo, SID4X). 0 um ou mais domínios funcionais heterólogos podem compreender um ou mais domínios de nuclease. Em uma modalidade preferencial, um domínio de nuclease compreende Fokl.

[054] A invenção também fornece para o um ou mais domínios funcionais heterólogos para gue tenham uma ou mais das seguintes atividades: atividade de metilase, atividade de demetilase, atividade de ativação de tradução, atividade de repressão de tradução, atividade de ativação de transcrição, atividade de repressão de transcrição, atividade de fator de liberação de transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de nuclease, atividade de

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33/776 divagem de RNA de fita simples, atividade de divagem de RNA de fita dupla, atividade de divagem de DNA de fita simples, atividade de divagem de DNA de fita dupla e atividade de ligação de ácido nucleico. Pelo menos um ou mais domínios funcionais heterólogos podem estar no ou próximo ao terminal amino da proteína efetora e/ou em que pelo menos um ou mais domínios funcionais heterólogos estão no ou próximo ao terminal carbóxi da proteína efetora. 0 um ou mais domínios funcionais heterólogos podem ser fundidos à proteína efetora. 0 um ou mais domínios funcionais heterólogos podem ser ligados à proteína efetora. 0 um ou mais domínios funcionais heterólogos podem ser ligados à proteína efetora por uma porção química ligante.

[055] Em determinadas modalidades da invenção, o um ou mais domínios funcionais heterólogos podem compreender repórteres ou etiquetas de epítopo. Os exemplos não limitantes de etiquetas de epítopo incluem etiquetas de histidina (His), etiquetas V5, etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina da gripe (HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G e etiquetas de tioredoxina (Trx). Os exemplos de repórteres incluem, porém sem limitação, glutationa-S-transferase (GST), peroxidase de raiz-forte (HRP), cloroanfenicol acetiltransferase (CAT) beta-galactosidase, betaglucuronidase, luciferase, proteína verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteína ciano fluorescente (CFP),

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34/776 proteína amarelo fluorescente (YFP), e proteínas autofluorescente que incluem proteínas azul fluorescente (BFP).

[056] A invenção também fornece a proteína efetora que compreende uma proteína efetora que é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga ou idêntica a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem de um gênero procariótico selecionado a partir do grupo que consiste em Porphyromonas, Prevotella_r Bacteroides, Ríemerella, Bergeyella_r Alístípes, Myroides, Capnocytophaga e Flavobacteríum. A invenção fornece adicionalmente a proteína efetora que compreende uma proteína efetora que é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga ou idêntica a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem de uma espécie procariótica selecionada a partir do grupo que consiste em Porphyromonas gulae, Prevotella sp. _r Porphyromonas gíngívalís , Bacteroides pyogenes, Ríemerella anatipestifer, Bergeyella zoohelcum, Prevotella intermedia, Prevotella buccae, Alístípes sp. _r Prevotella aurantiaca_r Myroides odoratimimus, Capnocytophaga canimorsus, Flavobacteríum branchíophílum e Flavobacteríum columnare. A invenção fornece adicionalmente a proteína efetora que compreende uma proteína efetora que é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,

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99% ou mais homóloga ou idêntica a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem selecionado a partir do grupo que consiste em Porphyromonas gulae Casl3b (número de acesso WP_039434803) , Prevotella sp. P5-125 Casl3b (número de acesso WP_044065294), Porphyromonas gíngívalís Casl3b (número de acesso WP_053444417), Porphyromonas sp. COT-052 OH4946 Casl3b (número de acesso WP_039428968), Bacteroides pyogenes Casl3b (número de acesso WP_034542281), Riemerella anatipestifer Casl3b (número de acesso WP_004919755). As proteína efetoras mais preferenciais são aquelas pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogas ou idênticas a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem selecionada a partir do grupo que consiste em Porphyromonas gulae Casl3b (número de acesso WP_039434803), Prevotella sp. P5-125 Casl3b (número de acesso WP_044065294), Porphyromonas gíngívalís Casl3b (número de acesso WP_053444417), Porphyromonas sp. COT-052 OH4946 Casl3b (número de acesso WP_039428968); e são mais especificamente preferenciais aquelas pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogas ou idênticas a uma Porphyromonas gulae Casl3b do tipo selvagem (número de acesso WP_039434803) ou Prevotella sp. P5-125 Casl3b (número de acesso WP_044065294) . A proteína efetora pode compreender uma proteína efetora quimérica que compreende um primeiro

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36/776 fragmento de uma primeira proteína efetora ortóloga e um segundo fragmento de uma segunda proteína efetora ortóloga, e em que a primeira e a segunda proteínas efetoras ortólogas são diferentes.

[057] Em determinadas modalidades, a proteína efetora pode ter pelo menos 700 aminoácidos de comprimento. Em modalidades preferenciais, a proteína efetora pode ter cerca de 900 a cerca de 1.500 aminoácidos de comprimento,

por exemplo,	cerca	de	900	a cerca	de	1.000	aminoácidos	de
comprimento,	cerca	de	1.000	a cerca	de	1.100	aminoácidos	de
comprimento,	cerca	de	1.100	a cerca	de	1.200	aminoácidos	de
comprimento,	ou cerca	de 1.	200 a cerca	de 1.	300 aminoácidos

de comprimento, ou cerca de 1.300 a cerca de 1.400 aminoácidos de comprimento, ou cerca de 1.400 a cerca de

1.500 aminoácidos de comprimento, por exemplo, cerca de 900, cerca de 1.000, cerca de 1.100, cerca de 1.200, cerca de 1.300, cerca de 1.400, cerca de 1.500, cerca de 1.600, cerca de 1.700, ou cerca de 1.800 aminoácidos de comprimento.

[058] Em algumas modalidades, a proteína efetora Casl3b (a) compreende 900 a 1.800 aminoácidos e dois domínios de HEPN, (b) está naturalmente presente em um genoma procariótico dentro de 10 quilopares de bases a montante ou a jusante de um arranjo CRISPR, (c) é a única proteína que compreende mais do que 700 aminoácidos dentro de 10 quilopares de bases a montante ou a jusante do arranjo de

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CRISPR, e/ou (d) não há nenhum gene Casl ou gene Cas2 dentro de 10 quilopares de bases a montante ou a jusante do arranjo de CRISPR. Em algumas modalidades, Csx27 ou Csx28 está também presente dentro de 10 quilopares de bases a montante ou a jusante do arranjo de CRISPR.

[059] Em determinadas modalidades, a proteína efetora, particularmente uma proteína efetora de loci do Tipo VI-B, mais particularmente, uma Casl3b, compreende pelo menos um e, de preferência, pelo menos dois, como mais preferencialmente, exatamente dois, motivos de RxxxxH conservados. Os motivos de RxxxxH catalítico são característicos de domínios de HEPN (Maior Ligação de Nucleotídeo de Eucariontes e Procariontes). Consequentemente, em determinadas modalidades, a proteína efetora compreende pelo menos um e, de preferência, pelo menos dois, como mais preferencialmente, exatamente dois, domínios de HEPN. Em determinadas modalidades, o domínio de HEPNs pode possuir atividade de RNAse. Em outras modalidades, o domínio de HEPNs pode possuir atividade de DNAse.

[060] Em determinadas modalidades, as proteínas efetoras Casl3b, como pretendido no presente documento, podem ser associadas a um locus que compreende repetições curtas de CRISPR entre 30 e 40 bp de comprimento, mais tipicamente entre 34 e 38 bp de comprimento, ainda mais tipicamente, entre 36 e 37 bp de comprimento, por exemplo,

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30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40 bp de comprimento. Em determinadas modalidades, as repetições de CRISPR são longas ou duas repetições entre 80 e 350 bp de comprimento, como entre 80 e 200 bp de comprimento, ainda mais tipicamente, entre 86 e 88 bp de comprimento, por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ou 90 bp de comprimento.

[061] Em determinadas modalidades, um motivo adjacente de protoespaçador (PAM) ou motivo similar a PAM direciona ligação do complexo de proteína efetora (por exemplo, uma proteína efetora Casl3b), como revelado no presente documento para o locus alvo de interesse. Ο PAM pode ser chamado de um PFS, ou local de flanqueamento de protoespaçador. Em algumas modalidades, ο PAM pode ser um PAM 5' (isto é, localizado a montante da extremidade 5' do protoespaçador) . Em outras modalidades, o RAM pode ser um RAM 3' (isto é, localizado a jusante da extremidade 5' do protoespaçador). Em outras modalidades, tanto um RAM 5' quanto um RAM 3' são necessários. Em determinadas modalidades da invenção, um RAM ou motivo similar a RAM pode não ser necessário para direcionar ligação da proteína efetora (por

exemplo, uma	proteína	efetora	Casl3b).	Em	determinadas
modalidades,	um PAM 5'	é D (	isto	é,	A, G	ou U) .	Em
determinadas	modalidades	, um PAM 5'	é D	para	efetoras	do
Tipo VI-B1.	Consulte o	Exemplo	1,	Tabela 2.	Os métodos

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39/776 existem para determinar consenso de PAMs 5' e 3' para um determinado sistema de Casl3b. Em determinadas modalidades da invenção, a divagem em sequências de repetição pode gerar crRNAs (por exemplo, crRNAs curtos ou longos) que contêm uma sequência completa de espaçador flanqueado por uma repetição de sequência de nucleotídeo curto (por exemplo 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 nt ou mais longo, se for uma repetição dupla) na extremidade 5' (isso pode ser chamado de uma etiqueta de crRNA) e o restante da repetição na extremidade 3' . Em determinadas modalidades, alvejamento pelas proteínas efetoras descritas no presente documento pode necessitar da ausência de homologia entre a etiqueta de crRNA e a sequência de flanqueamento alvo 5'. Essa necessidade pode ser similar àquela descrita adicionalmente em Samai et ai. Cotranscriptional DNA and RNA Cleavage during Type TIT CRISPRCas Immunity Cell 161, 1164-1174, 21 de maio de 2015, em que a necessidade é pensada para distinguir entre alvos autênticos em ácido nucleicos invasores do próprio arranjo de CRISPR, e em que a presença de sequências de repetição levará a homologia completa da etiqueta de crRNA e impedirá autoimunidade.

[062] Em determinadas modalidades, a proteína efetora Casl3b é modificada geneticamente e pode compreender uma ou mais mutações que reduzem ou eliminam atividade de nuclease, reduzindo ou eliminando, dessa maneira, atividade

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40/776 de interferência de RNA. As mutações também podem ser realizadas em resíduos próximos, por exemplo, em aminoácidos próximos àqueles que participam na atividade de nuclease. Em algumas modalidades, um ou mais domínios de nuclease catalíticos putativos são inativados e o complexo de proteína efetora não tem atividade de divagem e funciona como um complexo de ligação de RNA. Em uma modalidade preferencial, o complexo de ligação de RNA resultante pode ser ligado com

um ou mais	domínios funcionais,	como descrito no	presente
documento.
[063]	Em determinadas	modalidades, a	proteína
efetora (enzima de CRISPR; Casl3;	proteína efetora)	de acordo

com a invenção como descrito no presente documento é uma proteína efetora Casl3 cataliticamente inativa ou morta (dCasl3). Em algumas modalidades, o efetor dCasl3 compreende mutações no domínio de nuclease. Em algumas modalidades, a proteína efetora dCasl3 foi truncada. Em algumas modalidades, para reduzir o tamanho de uma proteína de fusão da efetora Casl3b e o um ou mais domínios funcionais, o terminal C do efetor Casl3b pode ser truncado enquanto ainda mantém sua função de ligação de RNA. Por exemplo, pelo menos 20 aminoácidos, pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 80 aminoácidos, ou pelo menos 100 aminoácidos, ou pelo menos 150 aminoácidos, ou pelo menos 200 aminoácidos, ou pelo menos 250 aminoácidos, ou pelo menos 300 aminoácidos, ou pelo menos

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350 aminoácidos, ou até 120 aminoácidos, ou até 140 aminoácidos, ou até 160 aminoácidos, ou até 180 aminoácidos, ou até 200 aminoácidos, ou até 250 aminoácidos, ou até 300 aminoácidos, ou até 350 aminoácidos, ou até 400 aminoácidos podem ser truncados no terminal C do efetor Casl3b. Exemplos específicos de truncamentos de Casl3b incluem terminal C Δ984-1090, terminal C Δ1026-1090, e terminal C Δ1053-1090, terminal C Δ934-1090, terminal C Δ884-1090, terminal C Δ8341090, terminal C Δ784-1090 e terminal C Δ734-1090, em que as posições de aminoácido correspondem a posições de aminoácido de proteína Casl3b de Prevotella sp. P5-125. Consulte a Figura 15B.

[064] Em determinadas modalidades, o um ou mais domínios funcionais são controláveis, isto é, induzíveis.

[065] Em determinadas modalidades da invenção, o RNA guia ou crRNA maduro compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência de repetição direta e uma sequência guia ou sequência de espaçador. Em determinadas modalidades, o RNA guia ou crRNA maduro compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência de repetição direta ligada a uma sequência guia ou sequência de espaçador. Em modalidades preferenciais da invenção, o crRNA maduro compreende uma alça de haste ou uma estrutura de alça de haste otimizada ou uma estrutura secundária otimizada. Em modalidades preferenciais, o crRNA maduro compreende uma

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42/776 alça de haste ou uma estrutura de alça de haste otimizada na sequência de repetição direta, em que a alça de haste ou estrutura de alça de haste otimizada é importante para atividade de divagem. Em determinadas modalidades, o crRNA maduro, de preferência, compreende uma única alça de haste. Em determinadas modalidades, a seguência de repetição direta, de preferência, compreende uma única alça de haste. Em determinadas modalidades, a atividade de divagem do complexo de proteína efetora é modificada introduzindo-se mutações que afetam a estrutura duplex de alça de haste RNA. Em modalidades preferenciais, as mutações que mantêm o duplex de RNA da alça de haste podem ser introduzidas, em que a atividade de divagem do complexo de proteína efetora é mantida. Em outras modalidades preferenciais, as mutações que perturbam a estrutura de duplex de RNA da alça de haste podem ser introduzidas, em que a atividade de divagem do complexo de proteína efetora é completamente abolida.

[066] A invenção também fornece a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína efetora que é otimizada por códon para expressão em uma célula eucarionte ou eucariótica em qualquer um dos métodos ou composições descritas no presente documento. Em uma modalidade da invenção, a sequência de nucleotídeos otimizada por códon que codifica a proteína efetora codifica qualquer Casl3b discutida no presente documento e é otimizada por códon para

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43/776 operabilidade em um organismo ou célula eucariótica, por exemplo, tal célula ou organismo, como mencionado em outro lugar no presente documento, por exemplo, sem limitação, uma célula de levedura, ou uma célula de mamífero ou organismo, que inclui uma célula de camundongo, uma rato célula, e uma célula humana ou organismo eucarionte não humano, por exemplo, planta.

[067] Em determinadas modalidades da invenção, pelo menos um sinal de localização nuclear (NLS) é fixado às sequências de ácido nucleico que codificam as proteínas efetoras Casl3b. Em modalidades preferenciais pelo menos um ou mais NLSs de terminal C ou terminal N são fixados (e, consequentemente, molécula (moléculas) de ácido nucleico que codificam a proteína efetora Casl3b podem incluir codificação para NLS(s) de modo que o produto expressado tenha o NLS(s) fixado ou conectado). Em determinadas modalidades da invenção, pelo menos um sinal de exportação nuclear (NES) é fixado às sequências de ácido nucleico que codificam as proteínas efetoras Casl3b. Em modalidades preferenciais pelo menos um ou mais NESs de terminal C ou terminal N são fixados (e, consequentemente, molécula (moléculas) de ácido nucleico que codificam a proteína efetora Casl3b podem incluir codificação para NES(s) de modo que o produto expressado tenha o NES(s) fixado ou conectado). Em uma modalidade preferencial, um NLS ou NES de terminal C

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44/776 e/ou terminal N é fixado para expressão ideal e alvejamento nuclear em células eucarióticas, de preferência, células humanas. Em uma modalidade preferencial, a proteína efetora otimizada por códon é Casl3b e o comprimento de espaçador do RNA guia é de 15 a 35 nt. Em determinadas modalidades, o comprimento de espaçador do RNA guia é pelo menos 16 nucleotídeos, como pelo menos 17 nucleotídeos, de preferência, pelo menos 18 nt, como de preferência, pelo menos 19 nt, pelo menos 20 nt, pelo menos 21 nt, ou pelo menos 22 nt. Em determinadas modalidades, o comprimento de espaçador é de 15 a 17 nt, de 17 a 20 nt, de 20 a 24 nt, por exemplo, 20, 21, 22, 23, ou 24 nt, de 23 a 25 nt, por exemplo, 23, 24, ou 25 nt, de 24 a 27 nt, de 27 a 30 nt, de 30 a 35 nt, ou 35 nt ou mais longo. Em determinadas modalidades da invenção, a proteína efetora otimizada por códon é Casl3b e o comprimento de repetição direta do RNA guia é pelo menos 16 nucleotídeos. Em determinadas modalidades, a proteína efetora otimizada por códon é Casl3b e o comprimento de repetição direta do RNA guia é de 16 a 20 nt, por exemplo, 16, 17, 18, 19, ou 20 nucleotídeos. Em determinadas modalidades preferenciais, o comprimento de repetição direta do RNA guia é 19 nucleotídeos.

[068] A invenção também abrange métodos para entrega de múltiplos componentes de ácido nucleico, em que cada componente de ácido nucleico é específico para um

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45/776 diferente locus alvo de interesse, modificando, dessa maneira múltiplos loci alvo de interesse. 0 componente de ácido nucleico do complexo pode compreender um ou mais aptâmeros de RNA de ligação de proteína. 0 um ou mais aptâmeros podem ter capacidade de ligação com uma proteína de revestimento bacteriófago. A proteína de revestimento bacteriófago pode ser selecionada a partir do grupo que compreende <2β, F2, GA, fr, JP501, MS2, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, Mil, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, φΟΒ5, (|)Cb8r, (|)Cbl2r, (|)Cb23r, 7s e PRR1. Em uma modalidade preferencial, a proteína de revestimento bacteriófago é MS2. A invenção também fornece o componente de ácido nucleico do complexo que tem 30 ou mais, 40 ou mais ou 50 ou mais nucleotídeos em comprimento.

[069] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma célula eucariótica que compreende um locus alvo de interesse modificado, em que o locus alvo de interesse foi modificado de acordo com qualquer um dos métodos descritos no presente documento. Um aspecto adicional fornece uma linhagem celular da dita célula. Outro aspecto fornece um organismo multicelular que compreende uma ou mais das ditas células.

[070] Em determinadas modalidades, a modificação do locus alvo de interesse pode resultar em: a célula eucariótica que compreende expressão alterada de pelo menos

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46/776 um produto de gene; em que a célula eucariótica compreende expressão alterada de pelo menos um produto de gene, em que a expressão do pelo menos um produto de gene é aumentada; em que a célula eucariótica compreende expressão alterada de pelo menos um produto de gene, em que a expressão do pelo menos um produto de gene é reduzida; ou a célula eucariótica que compreende um genoma editado.

[071] Em determinadas modalidades, a célula eucariótica pode ser uma célula de mamífero ou uma célula humana.

[072] Em modalidades adicionais, as composições geneticamente modificadas ou de ocorrência não natural, os sistemas de vetor, ou os sistemas de entrega, como descrito no presente relatório descritivo podem ser usados para: knockout de gene específico de local; edição de genoma específico de local; interferência específica de sequência de RNA; ou modificação genética de genoma multiplexado.

[073] Ademais, é fornecido um produto de gene da célula, da linhagem celular ou do organismo, como descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, a quantidade de produto de gene expressada pode ser maior ou menor que a quantidade de produto de gene de uma célula que não tem expressão alterada ou genoma editado. Em determinadas modalidades, o produto de gene pode ser alterado em comparação com o produto de gene de uma célula que não tem

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47/776 expressão alterada ou genoma editado.

[074] Ademais, é fornecida uma célula eucariótica de ocorrência não natural ou geneticamente modificada, que compreende pelo menos um dentre (i) uma proteína efetora Casl3b, como descrito no presente documento, ou (ii) um RNA guia com capacidade de formar um complexo de CRISPR-Cas com uma proteína efetora Casl3b. Em algumas modalidades, (i) e/ou (ii) são expressados ou introduzidos de modo transiente na célula. Ademais, são fornecidos organismos que compreendem tais células, linhagens celulares, progenitura das ditas linhagens celulares ou organismos. O organismo pode ser um vertebrado, por exemplo, um mamífero. De modo alternativo, o organismo pode ser uma planta ou um fungo.

[075] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma célula eucariótica que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o sistema de CRISPR descrito no presente documento que garante a geração de um locus alvo de interesse modificado, em que o locus alvo de interesse é modificado de acordo com qualquer um dos métodos descritos no presente documento. Um aspecto adicional fornece uma linhagem celular da dita célula. Outro aspecto fornece um organismo multicelular que compreende uma ou mais das ditas células.

[076] Em determinadas modalidades, a modificação do locus alvo de interesse pode resultar em: a célula

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48/776 eucariótica que compreende expressão alterada (proteína) de pelo menos um produto de gene; em que a célula eucariótica compreende expressão alterada (proteína) de pelo menos um produto de gene, em que a expressão (proteína) do pelo menos um produto de gene é aumentada; em que a célula eucariótica compreende expressão alterada (proteína) de pelo menos um produto de gene, em que a expressão (proteína) do pelo menos um produto de gene é reduzida; ou a célula eucariótica que compreende um transcritoma editado.

[077]	Em	determinadas	modalidades,	a célula
eucariótica	pode	ser uma célula	de mamífero ou	uma célula
humana.
[078]	Em	modalidades adicionais, as	composições

geneticamente modificadas ou de ocorrência não natural, os sistemas de vetor, ou os sistemas de entrega, como descrito no presente relatório descritivo, podem ser usados para interferência específica de sequência de RNA, modulação específica de sequência de RNA de expressão (incluindo expressão específica de isoforma), estabilidade, localização, funcionalidade (por exemplo, RNAs ou miRNAs ribossomais), etc.; ou multiplexação de tais processos.

[079] Em modalidades adicionais, as composições geneticamente modificadas ou de ocorrência não natural, os sistemas de vetor, ou os sistemas de entrega, como descrito no presente relatório descritivo, podem ser usados para

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 56/817 detecção e/ou quantificação de RNA em uma amostra, como uma amostra biológica. Em determinadas modalidades, a detecção de RNA é em uma célula. Em uma modalidade, a invenção fornece um método de detectar um RNA alvo em uma amostra, que compreende (a) incubar a amostra com i) uma proteína efetora CRISPR-Cas do Tipo VI-B com capacidade de clivar RNA, ii) um RNA guia com capacidade de hibridização para o RNA alvo, e iii) um repórter induzível por divagem à base de RNA com capacidade de ser clivado de modo não específico e detectável pela proteína efetora, (b) detectar o dito RNA alvo com base no sinal gerado por divagem do dito repórter induzível por divagem à base de RNA.

[080] Em uma modalidade, a proteína efetora CRISPR-

Cas	do Tipo	VI-	-B é uma	proteína	efetora CaslSb;	por	exemplo,
uma	proteína	efetora	CaslSb,	como descrito	no	presente
documento.	Em	uma modalidade	, o construto	de	repórter

induzível por divagem à base de RNA compreende um fluorocromo e um arrefecedor brusco. Em determinadas modalidades, a amostra compreende uma amostra biológica livre de célula. Em outras modalidades, a amostra compreende ou uma amostra celular, por exemplo, sem limitação, uma célula de planta, ou uma célula de animal. Em uma modalidade da invenção, o RNA alvo compreende um RNA de patógeno, que inclui, porém, sem limitação um RNA alvo de um vírus, bactéria, fungo ou parasita. Em uma modalidade, o RNA guia

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50/776 é projetado para detectar um RNA alvo que compreende um polimorfismo de nucleotídeo único ou uma variante de emenda de uma transcrição de RNA. Em uma modalidade, o RNA guia compreende um ou mais nucleotídeos incompatíveis com o RNA alvo. Em determinadas modalidades, o RNA guia hibridiza para molécula alvo aa que é diagnóstico para um estado de doença, como, porém, sem limitação, câncer ou uma doença imune.

[081] A invenção fornece um sistema de detecção de riboácido nucleico (RNA), que compreende a) uma proteína efetora CRISPR-Cas do Tipo VI-B com capacidade de clivar RNA, b) um RNA guia com capacidade de se ligar a um RNA alvo, e c) um repórter induzível por divagem à base de RNA com capacidade de ser clivado de modo não específico e detectável pela proteína efetora. Além disso, a invenção fornece um kit para detecção de RNA, que compreende a) uma proteína efetora CRISPR-Cas do Tipo VI-B com capacidade de clivar RNA, e b) um repórter induzível por divagem à base de RNA com capacidade de ser clivado de modo não específico e detectável pela proteína efetora. Em determinadas modalidades, o construto de repórter induzível por divagem à base de RNA compreende um fluorocromo e um arrefecedor brusco.

[082] Em modalidades adicionais, as composições geneticamente modificadas ou de ocorrência não natural, os sistemas de vetor, ou os sistemas de entrega, como descrito no presente relatório descritivo, podem ser usados para gerar

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51/776 modelos de doença e/ou sistemas de triagem.

[083] Em modalidades adicionais, as composições geneticamente modificadas ou de ocorrência não natural, os sistemas de vetor, ou os sistemas de entrega, como descrito no presente relatório descritivo, podem ser usados para: edição de transcritoma específico de local ou perturbação; interferência específica de sequência de ácido nucleico; ou modificação genética de genoma multiplexado.

[084] Em aspectos da invenção, as proteínas efetoras Casl3b, ou sistemas descritos no presente documento, podem ser usados no tratamento, prevenção, profilaxia ou supressão de patogênese viral, infecção ou propagação em um indivíduo mamífero. Os aspectos da invenção fornecem um sistema de Casl3b de CRISPR que compreende (a) uma proteína efetora Casl3b CRISPR e/ou um ácido polinucleico que codifica uma proteína efetora Casl3b CRISPR e (b) um ou mais RNAs guia e/ou um ou mais ácidos polinucleicos que codificam um ou mais RNAs guia projetados para se ligar a uma ou mais moléculas alvo de um vírus para uso em tratamento, prevenção, supressão e/ou alívio de patogênese viral, infecção e/ou propagação em um indivíduo. A proteína efetora Casl3b pode ser como definida no presente documento, que inclui proteínas Casl3b do tipo selvagem preferenciais e derivados e modificações preferenciais das mesmas.

[085] Em algumas modalidades, as proteínas efetoras

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Casl3b, ou sistemas descritos no presente documento, podem ser usados no tratamento, prevenção, profilaxia ou supressão de patogênese de vírus Lassa, infecção ou propagação em um indivíduo mamífero. 0 vírus Lassa é associado a DCs e células endoteliais vasculares (consulte Kunz, S. et. ai. 2005. Journal of Virology) .

[086] Em algumas modalidades, as proteínas efetoras Casl3b, ou sistemas descritos no presente documento, podem ser usados no tratamento, prevenção, profilaxia ou supressão de patogênese de vírus Ebola, infecção ou propagação em um indivíduo mamífero. O vírus Ebola é associado a diversos tecidos e tipos de célula que incluem DCs, macrófagos, hepatócitos, etc. (consulte Martines, R.B. et. ai. 2015. Journal of Pathology) .

[087] Em algumas modalidades, as proteínas efetoras Casl3b, ou sistemas descritos no presente documento, podem ser usados no tratamento, prevenção, profilaxia ou supressão de patogênese de patogênese SARS-CoV, infecção ou propagação em um indivíduo mamífero. SARS-CoV é associado a tecidos e células pulmonares (consulte To, KF. et. ai. 2004. Journal of Pathology) .

[088] Em algumas modalidades, as proteínas efetoras Casl3b, ou sistemas descritos no presente documento, podem ser usados no tratamento, prevenção, profilaxia ou supressão de patogênese de vírus Zika, infecção ou propagação em um

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53/776 indivíduo mamífero. 0 vírus Zika é associado a diversos tecidos e tipos de célula, que incluem fluidos corporais, placenta, cérebro, etc. (consulte Miner, J.J. & Diamond, M.S. 2017. Cell Host & Microbe).

[089] Em algumas modalidades, as proteínas efetoras Casl3b, ou sistemas descritos no presente documento, podem ser usados no tratamento, prevenção, profilaxia ou supressão de patogênese de vírus da Dengue, infecção ou propagação em um indivíduo mamífero. O vírus da Dengue é associado a diversos tecidos e tipos de célula, que incluem DCs, macrófagos, fígado, etc. (consulte Elipse, J. et. ai. 2016. Journal of General Virology) .

[090] Em algumas modalidades, as proteínas efetoras Casl3b, ou sistemas descritos no presente documento, podem ser usados no tratamento, prevenção, profilaxia ou supressão de patogênese de vírus da Chikungunya, infecção ou propagação em um indivíduo mamífero. O vírus da Chikungunya é associado a diversos tecidos e tipos de célula, que incluem células imunes, fígado, sistema nervoso central, etc. (consulte Schwartz, O. & Albert, M.L. 2010. Nature Reviews) .

[091] Em algumas modalidades, as proteínas efetoras Casl3b, ou sistemas descritos no presente documento, podem ser usados no tratamento, prevenção, profilaxia ou supressão de patogênese de vírus da Influenza, infecção ou propagação em um indivíduo mamífero. O vírus Influenza é associado a

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54/776 células epiteliais pulmonares e macrófagos (consulte Medina, R.A. & Garcia-Sastre A. 2011 Nature Reviews') .

[092] Em algumas modalidades, as proteínas efetoras Casl3b, ou sistemas descritos no presente documento, podem ser usados no tratamento, prevenção, profilaxia ou supressão de patogênese de vírus HIV, infecção ou propagação em um indivíduo mamífero. O vírus HIV é associado a células T e macrófagos (consulte Weiss, R.A. 2002. IUBMB Life.) .

[093] Em algumas modalidades, as proteínas efetoras Casl3b, ou sistemas descritos no presente documento, podem ser usados no tratamento, prevenção, profilaxia ou supressão de patogênese de vírus Rotavirus, infecção ou propagação em um indivíduo mamífero. O vírus Rotavirus é associado a tecidos e células intestinais (consulte Lopez, S & Arias, C.F. 2 006. CTMI) .

[094] Em algumas modalidades, as proteínas efetoras Casl3b, ou sistemas descritos no presente documento, podem ser usados no tratamento, prevenção, profilaxia ou supressão de patogênese de Herpes Simples (HSV-1), infecção ou propagação em um indivíduo mamífero. 0 HSV-1 é associado a células epiteliais e células nervosas (consulte Schelhaas, M. et. ai. 2003. Journal of General Virology).

[095] Em algumas modalidades, as proteínas efetoras Casl3b, ou sistemas descritos no presente documento, podem ser usados no tratamento, prevenção, profilaxia ou supressão

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55/776 de patogênese de virus HCV, infecção ou propagação em um indivíduo mamífero. HCV é associado a tecidos e células do fígado (consulte Ding, Q, et. ai. 2014. Cell Host & Microbe) .

[096] Em algumas modalidades, as proteínas efetoras Casl3b, ou sistemas descritos no presente documento, podem ser usados no tratamento, prevenção, profilaxia ou supressão de patogênese de vírus HBV, infecção ou propagação em um indivíduo mamífero. HBV é associado a tecidos e células do fígado (consulte Schieck, A. et. ai. 2013. Hepatology) .

[097] Ademais, é fornecido um produto de gene da célula, da linhagem celular ou do organismo, como descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, a quantidade de produto de gene expressada pode ser maior ou menor que a quantidade de produto de gene de uma célula que não tem expressão alterada ou genoma editado. Em determinadas modalidades, o produto de gene pode ser alterado em comparação com o produto de gene de uma célula que não tem expressão alterada ou genoma editado.

[098] Essas e outras modalidades são reveladas ou são óbvias a partir de e abrangidas pela Descrição Detalhada a seguir.

[099] Consequentemente, é um objetivo da invenção não abranger dentro da invenção qualquer produto anteriormente conhecido, processo de produzir o produto, ou método de usar o produto de modo que o Requerentes reserve

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56/776 o direito e, dessa maneira, publique uma retratação de qualquer produto, processo, ou método anteriormente conhecido. É adicionalmente observado que a invenção não se destina a abranger dentro do escopo da invenção qualquer produto, processo, ou produzir do produto ou método de usar o produto, que não atendem à descrição escrita e exigências de capacitação do USPTO (Título 35 do USC § 119(e), primeiro parágrafo) ou o EPO (Artigo 83 do EPC) , de modo que os Requerentes se reservem ao direito e, dessa maneira, disponibilizar uma retratação de qualquer produto anteriormente descrito, processo de produzir o produto, ou método de usar o produto. Pode ser vantajoso na prática da invenção estar em conformidade com Art. 53(c) EPC e Regra 28(b) e (c) EPC. Nada no presente documento deve ser interpretado como uma promessa.

[100] É observado que, nesta revelação e particularmente nas reivindicações e/ou parágrafos, termos como compreende, compreendido, que compreende e similares podem ter o significado atribuído à mesma na lei de Patentes U.S.; por exemplo, os mesmos podem significar inclui, incluído, que inclui, e similares; e esses termos, como que consiste essencialmente em e consiste essencialmente em têm o significado atribuído ais mesmos nas leis de Patentes U.S., por exemplo, os mesmos permitem que os elementos não explicitamente citados, mas excluem

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57/776 elementos que são constatados na técnica anterior ou que afetam uma característica básica ou inovadora da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos [101] As características inovadoras da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Um entendimento melhor das características e vantagens da presente invenção será obtido por referência à descrição detalhada a seguir que apresenta modalidades ilustrativas, em que os princípios da invenção são utilizados, e os desenhos anexos dos quais:

[102] A Figura 1 mostra uma lista de ortólogos de Casl3b de tipo selvagem, bem como suas sequências de aminoácidos, juntamente com o organismo fonte e o número de acesso de proteína.

[103] A Figura 2 mostra uma classificação de cada um dos ortólogos de Casl3b da Figura 1 com sua eficácia relativa em knockdown de expressão de luciferase em cultura de célula de mamífero.

[104] A Figura 3 compara atividade de cada um dos ortólogos de Casl3b ativos, controlando para sequência guia.

[105] A Figura 4 compara atividade de dois dos ortólogos de Casl3b - Porphyromonas gulae WP_039434803 e Prevotella sp. P5-125 WP_044065294 - com atividade de C2c2/Casl3a em diversas sequências guia.

[106] Figura 5: Caracterização de um ortólogo de

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Casl3b altamente ativo para knockdown de RNA. (A) Esquemática de loci de Casl3 estereotipico e estrutura de crRNA correspondente. (B) Avaliação de ortólogos de 19 Casl3a, 15 Casl3b e 7 Casl3c para knockdown de luciferase com o uso de duas guias diferentes. Ortólogos com knockdown eficaz com o uso de ambas os guias são marcados com seu nome de organismo hospedeiro. (C) Atividades de knockdown de PspCasl3b e LwaCasl3a são comparadas por resolução de guias contra Gluc e medindo-se expressão de luciferase. (D) Atividades de knockdown de PspCasl3b e LwaCasl3a são comparadas por resolução de guias contra Cluc e medindo-se expressão de luciferase. (E) Níveis de expressão em valores de log2 (transcrições por milhão (TPM)) de todos os genes detectados em bibliotecas de seq de RNA de controle de não alvejamento (eixo geométrico x) em comparação com condição de alvejamento de Gluc (eixo geométrico y) para LwaCasl3a (vermelho) e shRNA (preto). É mostrado o meio de três réplicas biológicas. 0 ponto de dados de transcrição de Gluc é marcado. (F) Níveis de expressão em valores de log2 (transcrições por milhão (TPM)) de todos os genes detectados em bibliotecas de seq de RNA de controle de não alvejamento (eixo geométrico x) em comparação com condição de alvejamento de Gluc (eixo geométrico y) para PspCasl3b (azul) e shRNA (preto) . É mostrado o meio de três réplicas biológicas. 0 ponto de dados de transcrição de Gluc é marcado. (G) Número de fora de alvos

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59/776 significativos de knockdown de Glue para LwaCasl3a, PspCasl3b e shRNA da ampla análise de transcritoma em E e F.

[107] Figura 6: Modificações genéticas de fusões de dCasl3b-ADAR para edição de RNA. (A) Esquemático de edição de RNA por proteínas de fusão de dCasl3b-ADAR. (B) Esquemático alvo de W85X de luciferase de Cyprídína e alvejar modelo de guia. (C) Quantificação de restauração de atividade de para Casl3b-dADARl (esquerdo) e Casl3b-ADAR2-cd (direito) com resolução de guias de comprimento 30, 50, 70, ou 84 nt.

(D) Esquemático de local alvo para alvejamento de W85X de luciferase de Cyprídínía. (E) Quantificação de sequenciamento de edição de A->I para 50 nt de W85X de luciferase de Cyprídínía de alvejamento de guias.

[108] Figura 7: Medição de flexibilidade de sequência para edição de RNA por REPAIRvl. (A) Esquemático de tela para determinar preferências de Local de Flanqueamento de Protoespaçador (PFS) de edição de RNA por REPAIRvl. (B) Distribuições de eficácias de edição de RNA para todas as combinações de 4-N PFS em dois locais de edição diferentes (C) Quantificação da edição de porcentagem de REPAIRvl em W85 de Clue em todos os 3 motivos de base possíveis. (D) Mapa de calor de preferências de base 5' e 3' de edição de RNA em W85 de Clue para todos os 3 motivos de base possíveis [109] Figura 8: Correção de mutações relevantes

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60/776 para doença com REPAIRvl. (A) Esquemático de projeto guia e alvo para alvejamento de AVPR2 87 8OA. (B) A mutação 878G>A em AVPR2 é corrigida para porcentagens variadas com o uso de REPAIRvl com três projetos guia diferentes. (C) Esquemático de projeto guia e alvo para alvejamento de FANCC 1517OA. (D) A mutação 1517G>A em FANCC é corrigida para porcentagens variadas com o uso de REPAIRvl com três projetos guia diferentes. (E) Quantificação da porcentagem de edição de 34 mutações G>A relevantes para doença diferentes com o uso de REPAIRvl. (F) Análise de todas as possíveis mutações G>A que poderíam ser corrigidas conforme anotado pelo banco de dados ClinVar. (G) A distribuição de motivos de edição para todas as mutações G>A em ClinVar é mostrada versus a eficiência de edição por REPAIRvl por motivo, conforme quantificado na transcrição Gluc.

[110] Figura 9: Caracterização da especificidade de REPAIRvl. (A) Esquemático de projeto guia e sítio alvo KRAS. (B) Quantificação de porcentagem de edição para guias de alvejamento de KRAS organizado. As porcentagens de edição são mostradas nos sítios de adenosina vizinhos e no alvo. Para cada guia, a região de RNA duplex é indicada por um retângulo vermelho. (C) Sítios de transcriptoma amplo de edição de RNA significativa por REPAIRvl com guia de alvejamento de Gluc. O sítio no alvo Gluc (254 A>G) é destacado em laranja. (D) Sítios de transcriptoma amplo de

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61/776 edição de RNA significativa por REPAIRvl com guia de não alvejamento.

[111] Figura 10: Mutagênese racional de ADAR2 para aperfeiçoar a especificidade de REPAIRvl. (A) Quantificação de restauração de sinal de luciferase por diversos mutantes

dCasl3-ADAR2	, bem	como sua pontuação	de	especificidade
plotada ao	longo	de um esquema para	os	contatos entre
resíduos de	ADAR2	desaminase principal e	o	alvo de dsRNA. A

pontuação de especificidade é definida como a razão do sinal de luciferase entre as condições de guia de alvejamento e guia de não alvejamento. (B) Quantificação de restauração de sinal de luciferase por diversos mutantes dCasl3-ADAR2 versus sua pontuação de especificidade. (C) Medição da fração de edição no alvo, bem como o número de fora do alvo significativo para cada mutante dCasl3-ADAR2 por sequenciamento de transcriptoma amplo de mRNAs. (D) Sítios de transcriptoma amplo de edição de RNA significativa por REPAIRvl e REPAIRv2 com um guia que alveja um sítio de préterminação em Cluc. O sítio no alvo Cluc (254 A>G) é destacado em laranja. (E) Leituras de sequenciamento de RNA que circundam o sítio de edição de Cluc no alvo (254 A>G) destacando as diferenças na edição fora do alvo entre REPAIRvl e REPAIRv2. Todas as edições de A>G são destacadas em vermelho, enquanto os erros de sequenciamento são destacados em azul. (F) Edição de RNA por REPAIRvl e REPAIRv2

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62/776 com guias que alvejam um sítio UAG fora de quadro nas transcrições endógenas de KRAS e PPIB. A fração de edição no alvo é mostrada como um gráfico de barras lateral à direita para cada fileira de condição. A região duplex formada pelo RNA guia é mostrada por uma caixa de contorno vermelha.

[112] Figura 11: Triagem bacteriana de ortólogos CaslSb para eficiência ín vivo e determinação de PFS. (A) Esquemático de ensaio bacteriano para determinar o PFS de ortólogos Casl3b. Os ortólogos Casl3b com espaçadores de alvejamento de beta-lactamase são co-transformados com plasmídeos de expressão de beta-lactamase e submetidos à seleção dupla. (B) Quantificação da atividade de interferência de ortólogos Casl3b que alvejam betalactamase, conforme medido por unidades formadoras de colônias (ufc). (C) logotipos PFS para ortólogos Casl3b, conforme determinado por sequências esgotadas a partir do ensaio bacteriano.

[113] Figur 12: Otimização de knockdown de CaslSb e caracterização adicional de especificidade de incompatibilidade. (A) Knockdown de Glue com duas guias diferentes é medido com o uso dos 2 ortólogos CaslSa principais e dos 4 CaslSb principais fundidos a uma variedade de etiquetas de localização nuclear e exportação nuclear. (B) Knockdown de KRAS é medido para LwaCaslSa, RanCaslSb, PguCaslSb e PspCaslSb com quatro guias diferentes e comparado

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63/776 com quatro controles de shRNA correspondentes à posição. (C) Esquema das bibliotecas de plasmídeos de incompatibilidade simples e dupla usadas para avaliar a especificidade de knockdown de LwaCasl3a e PspCasl3b. Cada incompatibilidade simples e dupla possível está presente na sequência alvo, bem como em 3 posições que flanqueiam diretamente as extremidades 5' e 3' do sítio alvo. (D) 0 nível de depleção de transcrições com as incompatibilidades únicas indicadas é plotado como um mapa de calor tanto para as condições LwaCasl3a como PspCasl3b. (E) 0 nível de depleção de transcrições com as incompatibilidades duplas indicadas é plotado como um mapa de calor tanto para as condições LwaCasl3a como PspCasl3b.

[114] Figura 13: Caracterização de parâmetros de projeto para edição de RNA de dCasl3-ADAR2. (A) Eficiência de knockdown de alvejamento de Glue para Casl3b do tipo selvagem e H133A/H1058A Casl3b cataliticamente inativo (dCasl3b). (B) Quantificação de restauração de atividade de luciferase por dCasl3b fundida ao domínio catalítico ADAR2 do tipo selvagem ou ao domínio catalítico de ADAR2 mutante de E488Q hiperativo, testado com orientação de guias de alvejamento de Clue. (C) Projeto de guia e quantificação de sequenciamento da edição A->I para guias de 30 nt que alvejam Cyprídínía luciferase W85X. (D) Projeto de guia e quantificação de sequenciamento de edição A->I para guias de

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nt que alvejam PPIB. (E) Influência de escolha de ligante na restauração de atividade de luciferase por REPAIRvl. (F) Influência de identificação de base oposta à adenosina alvo na restauração de atividade de luciferase por REPAIRvl.

[115] Figura 14: Distribuição de motivo ClinVar para mutações G>A. O número de cada motivo tripleto possível observado no banco de dados ClinVar para todas as mutações G>A.

[116] Figura 15: (A) Truncamentos de dCasl3b ainda têm edição de RNA funcional. Vários truncamentos N-terminal e C-terminal de dCasl3b permitem a edição de RNA conforme medido pela restauração de sinal de luciferase. As Figuras 15: (B) Exemplos adicionais de construtos dCasl3b-ADAR com truncamentos C-terminais diferentes de dCasl3b.

[117] Figura 16: Comparação de outros sistemas ADAR programáveiscom o editor de dCasl3-ADAR2. (A) Esquemático de dois esquemas ADAR programáveis: Alvejamento à base de BoxB e alvejamento de ADAR2 de comprimento total. No esquema BoxB (topo), o domínio de deaminase ADAR2 (ADAR2dd (E488Q) ) é fundido a uma pequena proteína de vírus bacteriano chamada lambda N (ÀN), que se liga especificamente a uma sequência de RNA pequena chamada BoxB-À. Um RNA guia que contém dois grampos de BoxB-À pode guiar o ADAR2dd (E488Q) , -ÀN para edição sítio-específica. No esquema de ADAR2 de comprimento total (fundo), os domínios de ligação de dsRNA de ADAR2 ligam

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65/776 um grampo no RNA guia, permitindo a edição de ADAR2 programável. (B) Sítios de transcriptoma amplo de edição de RNA significativa por BoxB-ADAR2dd (E488Q) com um guia que alveja Cluc e um guia de não alvejamento. 0 sítio no alvo Cluc (254 A>G) é destacado em laranja. (C) Sítios de transcriptoma amplo de edição de RNA significativa por ADAR2 com um guia que alveja Cluc e um guia de não alvejamento. 0 sítio no alvo Cluc (254 A>G) é destacado em laranja. (D) Sítios de transcriptoma amplo de edição de RNA significativa por REPAIRvl com um guia que alveja Cluc e um guia de não alvejamento. 0 sítio no alvo Cluc (254 A>G) é destacado em laranja. (E) Quantificação de porcentagem de taxa de edição no alvo para BoxB-ADAR2dd (E488Q) , ADAR2 e REPAIRvl para guias de alvejamento contra Cluc. (F) Sobreposição de sítios fora do alvo entre condições de alvejamento e não alvejamento diferentes para sistemas de ADAR programáveis.

[118] Figura 17: Eficiência e especificidade de mutantes dCasl3b-ADAR2. (A) Quantificação de restauração de atividade de luciferase por mutantes dCasl3b-ADAR2DD (E488Q) para guias de não alvejamento e alvejamento de Cluc. (B) Relação entre a razão de guias de alvejamento e não alvejamento e o número de fora do alvo de edição de RNA, conforme quantificado pelo sequenciamento de transcriptoma amplo. (C) Quantificação de número de sítios de edição de RNA fora do alvo de transcriptoma amplo versus eficiência de

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66/776 edição de Clue no alvo para mutantes dCasl3b-ADAR2DD (E488Q) .

[119] Figura 18: Especificidade de transcriptoma amplo da edição de RNA por mutantes dCasl3b-ADAR2DD (E488Q) . (A) Sítios de transcriptoma amplo de edição de RNA significativa por mutantes dCasl3b-ADAR2DD (E488Q) com um guia que alveja Clue. 0 sítio no alvo Clue (254 A>G) é destacado em laranja. (B) Sítios de transcriptoma amplo de edição de RNA significativa por mutantes dCasl3b-ADAR2DD (E488Q) com um guia de não alvejamento.

[120] Figura 19: Caracterização de inclinações de motivo nos fora do alvo da edição de dCasl3b-ADAR2DD (E488Q) .

(A) Para cada mutante dCasl3b-ADAR2DD (E488Q) , é mostrado o motivo presente em todas as edições fora do alvo A>G no transcriptoma. (B) A distribuição de edições A>G fora do alvo por identidade de motivo é mostrada para REPAIRvl com guia de alvejamento e não alvejamento. (C) A distribuição de edições A>G fora do alvo por identidade de motivo é mostrada para REPAIRv2 com guia de alvejamento e não alvejamento.

[121] Figura 20: Caracterização adicional de fora do alvo de REPAIRvl e REPAIRv2. (A) Histograma do número de fora do alvo por transcrição para REPAIRvl. (B) Histograma do número de fora do alvo por transcrição para REPAIRv2. (C) Previsão de efeito variante de fora do alvo de REPAIRvl. (D) Distribuição de efeitos oncogênicos potenciais de fora do alvo de REPAIRvl. (E) Previsão de efeito variante de fora do

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67/776 alvo de REPAIRv2. (F) Distribuição de efeitos oncogênicos potenciais de fora do alvo de REPAIRv2.

[122] Figura 21: Eficiência de edição de RNA e especificidade de REPAIRvl e REPAIRv2. (A) Quantificação de porcentagem de edição de KRAS com o guia de alvejamento de KRAS 1 nos sítios de adenosina alvejados e vizinhos para REPAIRvl e REPAIRv2. (B) Quantificação de porcentagem de edição de KRAS com o guia de alvejamento de KRAS 3 nos sítios de adenosina alvejados e vizinhos para REPAIRvl e REPAIRv2. (C) Quantificação de porcentagem de edição de PPIB com o guia de alvejamento de PPIB 2 nos sítios de adenosina alvejados e vizinhos para REPAIRvl e REPAIRv2.

[123] Figura 22: Demonstração de todas as alterações potenciais de códon com um editor de RNA A>G. (A) Tabela de todas as transições potenciais de códon habilitadas pela edição A>I. (B) uma tabela de códons que demonstra todas as transições potenciais de códon habilitadas pela edição A>I.

[124] As figuras no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não são necessariamente desenhadas em escala.

Descrição detalhada da invenção [125] Em geral, um sistema CRISPR-Cas ou CRISPR conforme usado nos documentos anteriores, como WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667) se refere coletivamente a

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68/776 transcrições e outros elementos envolvidos na expressão ou no direcionamento da atividade de genes associados a CRISPR (Cas), incluindo sequências que codificam um gene Cas, uma sequência tracr (CRISPR de ativação trans) (por exemplo, tracrRNA ou um tracrRNA parcial ativo), uma sequência de tracr-mate (que abrange uma repetição direta e uma repetição direta parcial processada por tracrRNA no contexto de um sistema CRISPR endógeno) , uma sequência guia (também chamada de um espaçador no contexto de um sistema CRISPR endógeno) ou RNA(s), conforme termo é usado no presente documento (por exemplo, RNA(s) para guiar Cas, como Cas9, por exemplo, RNA CRISPR e RNA de ativação trans (tracr) ou um RNA guia único (sgRNA) (RNA quimérico)) ou outras sequências e transcrições a partir de um locus de CRISPR. Em geral, um sistema CRISPR é caracterizado por elementos que promovem a formação de um complexo CRISPR no sitio de uma sequência-alvo (também denominada protoespaçador no contexto de um sistema CRISPR endógeno).

[126] Quando a proteína CRISPR é um efetor Classe 2 Tipo VI-B (por exemplo, uma proteína efetora CaslSb), não é necessário um tracrRNA. Em um sistema de engenharia da invenção, a repetição direta pode abranger sequências de ocorrência natural ou sequências de ocorrência não natural. A repetição direta da invenção não se limita a comprimentos e sequências de ocorrência natural. Uma repetição direta

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69/776 pode ter 36 nt de comprimento, mas uma repetição direta mais longa ou mais curta pode variar. Por exemplo, uma repetição direta pode ter 30 nt ou mais, como 30 a 100 nt ou mais. Por exemplo, uma repetição direta pode ter 30 nt, 40 nt, 50 nt, 60 nt, 70 nt, 80 nt, 90 nt, 100 nt ou mais de comprimento. Em algumas modalidades, uma repetição direta da invenção pode incluir sequências de nucleotídeos sintéticas inseridas entre as extremidades 5' e 3' da repetição direta de ocorrência natural. Em determinadas modalidades, a sequência inserida pode ser autocomplementar, por exemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% autocomplementar. Adicionalmente, uma repetição direta da invenção pode incluir inserções de nucleotídeos, como um aptâmero ou sequências que se ligam a uma proteína adaptadora (para associação com domínios funcionais). Em determinadas modalidades, uma extremidade de uma repetição direta que contém tal inserção é aproximadamente a primeira metade de um DR curto e a outra extremidade é aproximadamente a segunda metade do DR curto.

[127] No contexto da formação de um complexo CRISPR, sequência-alvo refere-se a uma sequência a qual uma sequência guia é projetada para ter complementaridade, em que a hibridização entre uma sequência-alvo e uma sequência guia promove a formação de um complexo CRISPR. Uma sequência alvo pode compreender polinucleotídeos de RNA. Em algumas

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70/776 modalidades, uma sequência-alvo é localizada no núcleo ou citoplasma de uma célula. Em algumas modalidades, as repetições diretas podem ser identificadas ín sílíco mediante a pesquisa por motivos repetitivos que atendem todos ou qualquer um dos seguintes critérios: 1. Encontrado em uma janela de 2 Kb de sequência genômica que flanqueia o locus de CRISPR; 2. Alcance de 20 a 50 bp; e 3. Espaçado por 20 a 50 bp. Em algumas modalidades, 2 desses critérios podem ser usados, por exemplo le2, 2e3oule3. Em algumas modalidades, todos os 3 critérios podem ser usados.

[128] Nas modalidades da invenção, os termos sequência guia e RNA guia, isto é, o RNA com capacidade para guiar Casl3b para um locus genômico alvo, são usados de forma intercambiável, conforme nos documentos citados acima, como WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667) . Em geral, uma sequência guia é qualquer sequência de polinucleotídeos que tem complementaridade suficiente com uma sequência de polinucleotídeos alvo para hibridizar com a sequência-alvo e ligação específica para sequência direta de um complexo CRISPR à sequência-alvo. Em algumas modalidades, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e sua sequênciaalvo correspondente, quando idealmente alinhadas com o uso de um algoritmo de alinhamento adequado, é cerca de ou mais do que cerca de 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% ou mais. O alinhamento ideal pode ser determinado com o

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Ί1/ΊΊ6 uso de qualquer algoritmo adequado para alinhar sequências, o exemplo não limitante do qual inclui o algoritmo de SmithWaterman, o algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmos com base na Transformada de Burrows-Wheeler (por exemplo, o Alinhador Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponível em www.novocraft.com); ELAND (Illumina, San Diego, CA) e SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn) e Maq (disponível em maq.sourceforge.net). Em algumas modalidades, uma sequência

guia	tem cerca	de ou	mais do	que	cerca de 5, 10, 11,	12,	13,
14,	15, 16, 17	, 18,	19, 20,	21,	22, 23, 24, 25, 26,	27,	28,
29,	30, 35,	40,	45, 50,	75	ou mais nucleotídeos	de

comprimento. Em algumas modalidades, uma sequência guia tem menos do que cerca de 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 ou menos nucleotídeos de comprimento. De preferência, a sequência guia tem 10 a 40 nucleotídeos de comprimento, como 20 a 30 ou 20 a 40 nucleotídeos de comprimento ou mais, como 30 nucleotídeos de comprimento ou cerca de 30 nucleotídeos. Em determinadas modalidades, a sequência guia tem 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, como 20 a 30 ou 20 a 40 nucleotídeos de comprimento ou mais, como 30 nucleotídeos de comprimento ou cerca de 30 nucleotídeos de comprimento para efetores de Casl3b. Em determinadas modalidades, a sequência guia tem 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, como 20 a 30 nucleotídeos de comprimento, como 30 nucleotídeos de

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72/776 comprimento ou cerca de 30 nucleotídeos de comprimento para efetores de CaslSb que se originam de Bergeyella zoohelcum (como Bergeyella zoohelcum ATCC 43767). A capacidade de uma sequência guia de direcionar a ligação específica para sequência de um complexo CRISPR a uma sequência-alvo pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado. Por exemplo, os componentes de um sistema CRISPR suficientes para formar um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia a ser testada, podem ser fornecidos a uma célula hospedeira que tem a sequência-alvo correspondente, tal como pela transfecção com vetores que codificam os componentes da sequência CRISPR, seguida por uma avaliação da divagem preferencial dentro da sequência-alvo, tal como pelo ensaio Surveyor, conforme descrito no presente documento. Similarmente, a divagem de uma sequência de polinucleotídeos alvo pode ser avaliada em um tubo de teste fornecendo-se a sequência-alvo, os componentes de um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia a ser testada e uma sequência guia de controle diferente da sequência guia de teste, e comparando a ligação ou taxa de divagem na sequência-alvo entre as reações de sequência guia de teste e controle. Outros ensaios são possíveis e irão ocorrer àqueles versados na técnica.

[129] Em um sistema de CRISPR-Cas clássico, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e sua sequência-alvo correspondente pode ser de cerca de ou mais

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Ί3/ΊΊ6

que	cerca	de	50%, 60%, 75%,	80%, 85%, 90%,	95%,	97,5%,	99%,
ou	100%;	um	guia ou	RNA	ou	sgRNA pode ter	cerca	de ou	mais
que	cerca	de	5, 10,	11,	12,	13, 14, 15, 16,	17,	18, 19,	20,
21,	22, 2	3,	24, 25,	26,	27,	28, 29, 30, 35	, 40,	45, 50	, 75

ou mais nucleotídeos de comprimento; ou guia ou RNA ou sgRNA pode ter menos que cerca de 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 ou menos nucleotídeos de comprimento. Entretanto, em determinados aspectos da invenção, as interações fora do alvo podem ser reduzidas, por exemplo, reduzindo o guia que interage com uma sequência-alvo que tem baixa complementaridade. De fato, determinadas mutações podem resultar no sistema CRISPR-Cas tendo capacidade para distinguir entre sequências-alvo e fora do alvo que têm mais de 80% a cerca de 95% de complementaridade, por exemplo, 83% a 84% ou 88 a 89% ou 94 a 95% de complementaridade (por exemplo, distinguir entre um alvo que tem 18 nucleotídeos de um fora do alvo de 18 nucleotídeos que tem 1, 2 ou 3 incompatibilidades) . Consequentemente, no contexto da presente invenção, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e sua sequência-alvo correspondente pode ser maior que 94,5% ou 95% ou 95,5% ou 96,5% ou 96% ou 96,5% ou 97% ou 97,5% ou 98% ou 98,5% ou 99% ou 99,5% ou 99,9% ou 100%. Fora do alvo tem menos que 100% ou 99,9% ou 99,5% ou 99% ou 99% ou 98,5% ou 98% ou 97,5% ou 97% ou 96,5% ou 96% ou 95,5% ou 95% ou 94,5% ou 94% ou 93% ou 92% ou 91% ou 90%

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Ί^/ΊΊβ ou 89% ou 88% ou 87% ou 86% ou 85% ou 84% ou 83% ou 82% ou 81% ou 80% de complementaridade entre a sequência e o guia, vantajosamente fora do alvo tem 100% ou 99,9% ou 99,5% ou 99% ou 99% ou 98,5% ou 98% ou 97,5% ou 97% ou 96,5% ou 96% ou 95,5% ou 95% ou 94,5% de complementaridade entre a sequência e o guia.

[130] Em determinadas modalidades, as modulações de eficiência de divagem podem ser exploradas pela introdução de incompatibilidades, por exemplo, 1 ou mais incompatibilidades, como 1 ou 2 incompatibilidades entre a sequência de espaçador e a sequência-alvo, incluindo a posição da incompatibilidade ao longo do espaçador/alvo. Quanto mais central (isto é, não 3' ou 5'), por exemplo, uma incompatibilidade dupla, mais a eficiência de divagem é afetada. Consequentemente, mediante a escolha de posição de incompatibilidade ao longo do espaçador, a eficiência da divagem pode ser modulada. Por meio de exemplo, se for desejada uma divagem de alvos menor gue 100% (por exemplo, em uma população de células), 1 ou mais, como de preferência 2 incompatibilidades entre a sequência de espaçador e alvo podem ser introduzidas nas sequências de espaçador. Quanto mais central ao longo do espaçador da posição de incompatibilidade, menor a porcentagem de divagem.

[131] Os métodos de acordo com a invenção, conforme descrito no presente documento, compreendem induzir uma ou

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75/776 mais modificações de nucleotídeo em uma célula eucariótica (in vitro, isto é, em uma célula eucariótica isolada), conforme discutido no presente documento, que compreende a entrega à célula de um vetor conforme discutido no presente documento. A mutação (ou mutações) pode incluir a introdução, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos em cada sequência-alvo de célula (ou células) através do RNA guia (ou RNAs guia) ou sgRNA(s). As mutações podem incluir a introdução, deleção ou substituição de 1 a 75 nucleotídeos em cada sequência-alvo da dita célula (ou células) através do RNA guia (ou RNAs guia) . As mutações podem incluir a introdução, deleção ou substituição de 1, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 75 nucleotídeos em cada sequênciaalvo da dita célula (ou células) através do RNA guia (ou RNAs guia). As mutações podem incluir a introdução, deleção ou substituição de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 75 nucleotídeos em cada sequência-alvo da dita célula (ou células) através do RNA guia (ou RNAs guia). As mutações incluem a introdução, deleção ou substituição de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 75 nucleotídeos em cada sequência-alvo da dita célula (ou células) através do RNA guia (ou RNAs guia). As mutações podem incluir a introdução,

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Ί6/ΊΊ6 deleção ou substituição de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 75 nucleotídeos em cada sequência-alvo da dita célula (ou células) através do RNA guia (ou RNAs guia). As mutações podem incluir a introdução, deleção ou substituição de 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos em cada sequência-alvo da dita célula (ou células) através do RNA guia (ou RNAs guia).

[132] Para a minimização de toxicidade e efeito fora do alvo, será importante controlar a concentração de mRNA ou proteína Cas e RNA guia entregue. As concentrações ideais de mRNA ou proteína Cas e RNA guia podem ser determinadas testando diferentes concentrações em um modelo de animal eucariota celular ou não humano e com o uso de sequenciamento profundo para analisar a extensão da modificação em loci genômicos fora do alvo potencial.

[133] Tipicamente, no contexto de um sistema CRISPR endógeno, a formação de um complexo CRISPR (que compreende uma sequência guia hibridizada a uma sequência-alvo e complexada com uma ou mais proteínas Cas) resulta em divagem em ou próximo (por exemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 ou mais pares básicos da) sequência-alvo, mas pode depender, por exemplo, de estrutura secundária, em particular no caso de alvos de RNA.

[134] A molécula de ácido nucleico que codifica um Cas é vantajosamente Cas otimizado por códon. Um exemplo de

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77/776 uma sequência otimizada por códon é, nesse caso, uma sequência otimizada para expressão em um eucariota, por exemplo, seres humanos (isto é, sendo otimizada para expressão em seres humanos), ou para outro eucariota, animal ou mamífero, conforme discutido no presente documento; consultar, por exemplo, sequência otimizada por códon humano SaCas9 em WO 2014/093622 (PCT/US2013/07 46 67) . Embora isso seja preferencial, será observado que outros exemplos são possíveis e a otimização por códon para uma espécie hospedeira diferente de humana, ou a otimização por códon para órgãos específicos é conhecida. Em algumas modalidades, uma sequência de codificação de enzima que codifica um Cas é otimizada por códon para expressão em células particulares, como células eucarióticas. As células eucarióticas podem ser aquelas de ou derivadas de um organismo particular, como um mamífero, que inclui, porém sem limitação, mamífero, animal ou eucariota humano ou não humano, conforme discutido no presente documento, por exemplo, camundongo, rato, coelho, cachorro, gado ou primata ou mamífero não humano. Em algumas modalidades, os processos para modificar a identidade genética da linhagem germinativa de seres humanos e/ou processos para modificar a identidade genética de animais que são propensos a causar sofrimento sem qualquer benefício médico substancial para o homem ou animal, e também animais resultantes de tais processos, podem ser excluídos. Em geral,

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78/776 a otimização de códon se refere a um processo de modificação de uma sequência de ácidos nucleicos para expressão intensificada nas células hospedeiras de interesse, mediante a substituição de pelo menos um códon (por exemplo, cerca de ou mais que 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 ou mais códons) da sequência nativa por códons que são usados com mais ou máxima frequência nos genes dessa célula hospedeira, enquanto mantém a sequência de aminoácidos nativa. Várias espécies exibem inclinação particular para determinados códons de um aminoácido particular. A inclinação de códon (diferenças no uso de códon entre organismos) muitas vezes se correlaciona com a eficiência da tradução de RNA mensageiro (mRNA) , que, por sua vez, acredita-se que seja dependente, entre outras coisas, das propriedades dos códons que são traduzidos e da disponibilidade de moléculas de RNA de transferência (RNAt) particulares. A predominância de tRNAs selecionados em uma célula é geralmente um reflexo dos códons usadoscom máxima frequência na síntese de peptídeo. Consequentemente, os genes podem ser customizados para expressão ideal de genes em um determinado organismo com base na otimização de códons. As tabelas de uso de códon estão prontamente disponíveis, por exemplo, no Codon Usage Database disponível em www.kazusa.orjp/codon/ e essas tabelas podem ser adaptadas de várias formas. Consultar Nakamura, Y., et al. Codon usage tabulated from the

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Ί9/ΊΊ6 international DNA sequence databases: status for the year 2000 Nucl. Acids Res. 28:292 (2000) . Também estão disponíveis algoritmos de computador para a otimização por códon de uma sequência particular para a expressão em uma célula hospedeira particular, como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA). Em algumas modalidades, um ou mais códons (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 ou mais ou todos os códons) em uma sequência que codifica um Cas correspondem ao códon usado com máxima frequência para um aminoácido particular.

[135] Em determinadas modalidades, os métodos, conforme descritos no presente documento, podem compreender fornecer uma célula transgênica Cas, na qual um ou mais ácidos nucleicos que codificam um ou mais RNAs guia são fornecidos ou introduzidos operacionalmente conectados na célula com um elemento regulador que compreende um promotor de um ou mais genes de interesse. Como usado aqui, o termo célula transgênica Cas se refere a uma célula, como uma célula eucariótica, na qual um gene Cas foi genomicamente integrado. A natureza, tipo ou origem da célula não são particularmente limitadores de acordo com a presente invenção. Além disso, a maneira como o transgene Cas é introduzido na célula pode variar e pode ser qualquer método como é conhecido na técnica. Em determinadas modalidades, a célula transgênica Cas é obtida mediante a introdução do

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80/776 transgene Cas em uma célula isolada. Em determinadas outras modalidades, a célula transgênica Cas é obtida mediante o isolamento de células a partir de um organismo transgênico Cas. Por meio de exemplo, e sem limitação, a célula transgênica Cas, conforme aqui mencionado, pode ser derivada de um eucariota transgênico Cas, como um eucariota knockin de Cas. É feita referência ao documento n° WO 2014/093622 (PCT/US13/74667), aqui incorporada por referência. Os métodos das Publicações de Patente n° US 20120017290 e 20110265198 atribuídas à Sangamo BioSciences, Inc. direcionados para alvejar o locus Rosa podem ser modificados para usar o sistema CRISPR Cas da presente invenção. Os métodos da Publicação de Patente n° US 20130236946 atribuída à Cellectis, direcionados para alvejar o locus Rosa também podem ser modificados para usar o sistema CRISPR Cas da presente invenção. Por meio de outro exemplo, é feita referência a Platt et. al. (Cell; 159 (2) : 440 a 455 (2014) ) , que descrevem um camundongo knockin Cas9, que é incorporado ao presente documento por referência. O transgene Cas pode compreender adicionalmente um cassete Lox-Stop-polyALox(LSL), tornando assim a expressão de Cas induzível por Cre recombinase. Alternativamente, a célula transgênica Cas pode ser obtida mediante a introdução do transgene Cas em uma célula isolada. Os sistemas de entrega para transgenes são bem conhecidos na técnica. Por meio de exemplo, o

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81/776 transgene Cas pode ser entregue, por exemplo, em células eucarióticas por meio de vetor (por exemplo, AAV, adenovirus, lentivírus) e/ou entrega de partículas e/ou nanopartícuias, conforme também descrito no presente documento em outro lugar.

[136] Será entendido pelo versado na técnica que a célula, como a célula transgênica Cas, conforme mencionado no presente documento, pode compreender alterações genômicas adicionais, além de ter um gene Cas integrado ou as mutações decorrentes da ação específica da seguência de Cas quando complexada com RNA com capacidade para guiar Cas para um locus alvo, como, por exemplo, uma ou mais mutações oncogênicas, como, por exemplo e sem limitação, descrito em Platt et al. (2014), Chen et al. , (2014) ou Kumar et al. (2009) .

[137] Em algumas modalidades, a sequência Cas é fundida a uma ou mais sequências de localização nuclear (NLSs) ou sinais de exportação nuclear (NESs), como cerca de

OU	mais	que	cerca de 1,	2, 3, 4, 5,	6,	7,	8, 9, 10 ou	mais
NLSs ou	NESs	. Em algumas	modalidades,	o Cas	compreende	cerca
de	ou mais	que cerca de	1, 2, 3, 4,	5,	6,	7, 8, 9,	10 ou

mais NLSs ou NESs no ou próximo ao terminal amino, cerca de ou mais que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais NLSs ou NESs no ou próximo ao terminal carboxi ou uma combinação dos mesmos (por exemplo, zero ou pelo menos um ou

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82/776 mais NLS ou NES no terminal amino e zero ou em um ou mais

NLS ou NES no terminal carbóxi) . Quando mais de um NLS ou NES está presente, cada um pode ser selecionado independentemente dos outros, de modo que um único NLS ou NES possa estar presente em mais de uma cópia e/ou em combinação com um ou mais outros NLSs ou NESs presentes em um ou mais cópias. Em uma modalidade preferencial da invenção, o Cas compreende no máximo 6 NLSs. Em algumas modalidades, um NLS ou NES é considerado próximo ao terminal N ou C quando o aminoácido mais próximo do NLS ou NES está dentro de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 , 40, 50 ou mais aminoácidos ao longo da cadeia polipeptídica a partir do terminal N ou C. Os exemplos não limitadores de NLSs incluem uma sequência NLS derivada de: a NLS do antígeno T grande de vírus SV40, que tem a sequência de aminoácidos PKKKRKV (SEQ ID NO: X) ; a NLS de nucleoplasmina (por exemplo, a NLS bipartida de nucleoplasmina com a sequência

KRPAATKKAGQAKKKK)	(SEQ ID	NO: X) ; a c-myc	NLS	que	tem	a
sequência de	aminoácidos	PAAKRVKLD (SEQ	ID	NO:	X)	ou
RQRRNELKRSP i	(SEQ	ID NO:X)	; o hRNPAl M9	NLS	que	tem	a

sequência NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO: X) ; a sequência RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (SEQ ID NO: X) do domínio IBB de importina-alf a; as sequências VSRKRPRP (SEQ ID NO: X) e PPKKARED (SEQ ID NO: X) da proteína T de mioma; a sequência POPKKKPL (SEQ ID NO: X)

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83/776 de p53 humano; a sequência SALIKKKKKMAP (SEQ ID NO: X) de cabl IV de camundongo; as sequências DRLRR (SEQ ID NO: X) e PKQKKRK (SEQ ID NO: X) do virus influenza NS1; a sequência RKLKKKIKKL (SEQ ID NO: X) do antigeno delta de virus da hepatite; a sequência REKKKFLKRR (SEQ ID NO: X) da proteína Mxl de camundongo; a sequência KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (SEQ ID NO: X) da poll(ADP-ribose) polimerase humana; e a sequência RKCLQAGMNLEARKTKK (SEQ ID NO: X) dos receptores de hormônio esteroide (humano) glucocorticoide. Os exemplos não limitadores de NESs incluem uma sequência NES LYPERLRRILT (ctgtaccctgagcggctgcggcggatcctgacc) . Em geral, o um ou mais NLSs ou NESs têm resistência suficiente para conduzir o acúmulo do Cas em uma quantidade detectável, respectivamente, no núcleo ou no citoplasma de uma célula eucariótica. Em geral, a resistência da atividade de localização/exportação nuclear pode derivar do número de NLSs/NESs no Cas, do NLS(s) ou NES(s) particular usado ou uma combinação desses fatores. A detecção de acúmulo no núcleo/citoplasma pode ser realizada por qualquer técnica adequada. Por exemplo, um marcador detectável pode ser fundido ao Cas, de modo que a localização dentro de uma célula possa ser visualizada, como em combinação com um meio de detectar a localização do núcleo (por exemplo, uma mancha específica para o núcleo como DAPI) ou citoplasma. Os núcleos celulares também podem ser isolados das células, cujo

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84/776 conteúdo pode ser, então, analisado por qualquer processo adequado para a detecção de proteínas, como imunohistoquímica, Western blot ou ensaio de atividade enzimática. 0 acúmulo no núcleo também pode ser determinado indiretamente, como por meio de um ensaio para o efeito da formação de complexo CRISPR (por exemplo, ensaio para divagem ou mutação do DNA na sequência-alvo ou ensaio para atividade de expressão de gene alterada afetada pela formação de complexo CRISPR e/ou atividade enzimática de Cas), em comparação com um controle não exposto ao Cas ou complexo, ou exposto a um Cas desprovido do um ou mais NLSs ou NESs. Em determinadas modalidades, outras etiquetas de localização podem ser fundidas à proteína Cas, como, sem limitação, para localizar o Cas em sítios particulares em uma célula, como organelas, mitocôndrias, plastídeos, cloroplasto, vesículas, golgi (nuclear ou celular) membranas, ribossomas, nucléolo, ER, citoesqueleto, vacúolos, centrossoma, nucleossoma, grânulos, centríolos, etc.

[138] Em determinados aspectos, a invenção envolve vetores, por exemplo, para entregar ou introduzir em uma célula Cas e/ou RNA com capacidade para guiar Cas para um locus-alvo (isto é, RNA guia), mas também para propagar esses componentes (por exemplo, em células procarióticas). Conforme usado aqui, um vetor é uma ferramenta que permite ou facilita a transferência de uma entidade de um ambiente

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85/776 para outro. É um replicou, como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, em que um outro segmento de DNA pode ser inserido, a fim de provocar a replicação do segmento inserido. Em geral, um vetor tem capacidade para replicação quando associado aos elementos de controle adequados. Em geral, o termo vetor se refere a uma molécula de ácido nucleico que tem capacidade para transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Os vetores incluem, porém sem limitação, moléculas de ácido nucleico que são de fita simples, de fita dupla ou parcialmente de fita dupla; moléculas de ácido nucleico que compreendem uma ou mais extremidades livres, sem extremidades livres (por exemplo, circulares); moléculas de ácido nucleico que compreendem DNA, RNA ou ambos; e outras variedades de polinucleotídeos conhecidos na técnica. Um tipo de vetor é um plasmídeo, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular em que segmentos adicionais de DNA podem ser inseridos, como por meio de técnicas convencionais de clonagem molecular. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que sequências de DNA ou RNA derivadas de vírus estão presentes no vetor para embalagem em um vírus (por exemplo, retrovirus, retrovirus com defeito de replicação, adenovirus, adenovirus com defeito de replicação e virus adeno-associados (AAVs)). Os vetores virais também incluem polinucleotídeos transportados por um vírus para transfecção em uma célula hospedeira. Determinados vetores

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86/776 têm capacidade para replicação autônoma em uma célula hospedeira em que são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que têm uma origem bacteriana de replicação e vetores epissômicos de mamífero). Outros vetores (por exemplo, vetores não epissômicos de mamífero) são integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante introdução na célula hospedeira e são, assim, replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, determinados vetores têm capacidade para direcionar a expressão de genes aos quais estão ligados de maneira funcional. Tais vetores são referidos no presente documento como vetor de expressão. Os vetores de expressão comuns de utilidade em técnicas de DNA recombinantes estão frequentemente na forma de plasmídeos.

[139] Os vetores de expressão recombinantes podem compreender um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para a expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem um ou mais elementos reguladores, que podem ser selecionados com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, que está operacionalmente ligado à sequência de ácidos nucleicos a ser expressa. Dentro de um vetor de expressão recombinante, operacionalmente ligado significa que a sequência de nucleotídeos de interesse está ligada ao elemento regulador (ou elementos

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87/776 reguladores) de uma maneira que permita a expressão da sequência de nucleotídeos (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). Em relação aos métodos de recombinação e clonagem, é mencionado o pedido de patente US 10/815.730, publicado em 2 de setembro de 2004 como US 2004-0171156 Al, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[140] O vetor (ou vetores) pode incluir o elemento regulador (ou elementos reguladores), por exemplo, promotor (ou promotores). O vetor (ou vetores) pode compreender sequências de codificação Cas, e/ou uma única, mas possivelmente também pode compreender pelo menos 3, 8, 16, 32, 48 ou 50 sequências de codificação de RNAs guia (por exemplo, sgRNAs), como la2, la3, la4, la5, 3a6, 3 a 7, 3 a 8, 3 a 9, 3a 10, 3 a 8, 3a 16, 3 a 30, 3 a 32, 3 a 48, 3 a 50 RNAs (por exemplo, sgRNAs). Em um único vetor, pode haver um promotor para cada RNA (por exemplo, sgRNA), vantajosamente quando houver até cerca de 16 RNAs; e, quando um único vetor fornece mais de 16 RNAs, um ou mais promotores podem conduzir a expressão de mais de um dentre os RNAs, por exemplo, quando existem 32 RNAs, cada promotor pode conduzir a expressão de dois RNAs, e quando existem 48 RNAs, cada promotor pode conduzir a expressão de três RNAs. Por meio de

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88/776 aritmética simples e protocolos de clonagem bem estabelecidos e os ensinamentos nesta revelação, um versado na técnica pode praticar prontamente a invenção quanto ao RNA (ou RNAs) para um vetor exemplificador adequado, como AAV, e um promotor adequado, como o promotor U6. Por exemplo, o limite de embalagem de AAV é de ~4,7 kb. 0 comprimento de um único U6-gRNA (mais sítios de restrição para clonagem) é de 361 bp. Portanto, o versado na técnica pode ajustar prontamente cerca de 12 a 16, por exemplo, 13 cassetes de U6-gRNA em um único vetor. Isso pode ser montado por qualquer meio adequado, como uma estratégia de porta dourada usada para a montagem de TALE (http ://www. genomeengineering. org/taleff ectors/) . 0 versado na técnica também pode usar uma estratégia de guia em tandem para aumentar o número de U6-gRNAs em aproximadamente 1,5 vezes, por exemplo, para aumentar de 12 a 16, por exemplo, 13 a aproximadamente 18 a 24, por exemplo, cerca de 19 U6-gRNAs. Portanto, um versado na técnica pode prontamente alcançar aproximadamente 18 a 24, por exemplo, cerca de 19 promotor-RNAs, por exemplo, U6-gRNAs em um único vetor, por exemplo, um vetor AAV. Um meio adicional para aumentar o número de promotores e RNAs em um vetor é usar um único promotor (por exemplo, U6) para expressar uma matriz de RNAs separados por sequências cliváveis. E um outro meio adicional para aumentar o número de promotor-RNAs em um vetor é expressar uma matriz de

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89/776 promotor-RNAs separados por sequências cliváveis no intron de um gene ou sequência de codificação; e, nesse caso, é vantajoso usar um promotor de polimerase II, que pode ter expressão aumentada e possibilitar a transcrição de RNA longo de uma maneira específica de tecido. (Consultar, por exemplo, http ://nar.oxfordj ournals.org/content/34/7/e53. short, http://www. nature.com/mt/j ournal/vl6/n9/abs/mt2 008144a.html ). Em uma modalidade vantajosa, o AAV pode embalar o gRNA em tandem U6 alvejando até cerca de 50 genes. Consequentemente, a partir do conhecimento na técnica e dos ensinamentos nesta revelação, o versado na técnica pode prontamente fabricar e usar vetor (ou vetores), por exemplo, um único vetor, que expressa vários RNAs ou guias sob o controle ou operacional ou funcionalmente ligado a um ou mais promotores especialmente quanto aos números de RNAs ou guias discutidos no presente documento, sem qualquer experimentação indevida.

[141] As sequências de codificação de RNA guia (ou RNAs guia) e/ou as sequências de codificação Cas podem ser funcional ou operacionalmente ligadas ao elemento regulador (ou elementos reguladores) e, por conseguinte, o elemento regulador (ou elementos reguladores) conduz a expressão. O promotor (ou promotores) pode ser promotor constitutivo (ou promotores constitutivos) e/ou promotor condicional (ou promotores condicionais) e/ou promotor induzível (ou promotores induzíveis) e/ou promotor (ou promotores)

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90/776 especifico de tecido. O promotor pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em RNA polimerases, pol I, pol II, pol III, T7, U6, Hl, promotor LTR retroviral de vírus de sarcoma de Rous (RSV), o promotor de citomegalovírus (CMV), o promotor de SV40, o promotor de di-hidrofolato redutase, o promotor de β-actina, o promotor de fosfoglicerol quinase (PGK) e o promotor de EFla. Um promotor vantajoso é o promotor U6.

[142] Os aspectos da invenção se referem à identificação e engenharia de proteínas efetoras inovadoras associadas aos sistemas CRISPR-Cas Classe 2. Em uma modalidade preferencial, a proteína efetora compreende um módulo efetor de subunidade única. Em uma modalidade adicional, a proteína efetora é funcional em células procarióticas ou eucarióticas para aplicações in vitro, in vivo ou ex vivo.

[143] O termo sistema de alvejamento de ácido nucleico, em que o ácido nucleico é DNA ou RNA, e em alguns aspectos também pode se referir a híbridos de DNA-RNA ou derivados dos mesmos, se refere coletivamente a transcrições e outros elementos envolvidos na expressão ou direcionamento da atividade de genes associados a CRISPR (Cas) de alvejamento de DNA ou RNA, que podem incluir sequências que codificam uma proteína Cas de alvejamento de DNA ou RNA e um RNA guia de alvejamento de DNA ou RNA que compreende uma

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91/776 sequência de RNA CRISPR (crRNA) e (em alguns mas nem todos os sistemas) uma sequência de RNA de sistema CRISPR/Cas de ativação trans (tracrRNA), ou outras sequências e transcrições de um locus de CRISPR de alvejamento de DNA ou RNA. Em geral, um sistema de alvejamento de RNA é

caracterizado	por elementos	que	promovem	a	formação de	um
complexo	de	alvejamento de	DNA	ou RNA	no	sítio de	uma
sequência	de	DNA ou RNA alvo	. No	contexto	da	formação de	um

complexo de alvejamento de DNA ou RNA, sequência-alvo se refere a uma sequência de DNA ou RNA à qual um RNA guia de alvejamento de DNA ou RNA é projetado para ter complementaridade, em que a hibridização entre uma sequência-alvo e um RNA guia de alvejamento de RNA guia promove a formação de um complexo de alvejamento de RNA. Em algumas modalidades, uma sequência-alvo é localizada no núcleo ou citoplasma de uma célula.

[144] Em um aspecto da invenção, os sistemas de alvejamento de RNA também mencionados como CRISPR/Cas de alvejamento de RNA ou RNA ou o sistema de alvejamento de RNA de sistema CRISPR-Cas do presente pedido são baseados nas proteínas Cas do tipo VI-B identificadas que não exigem a geração de proteínas personalizadas para alvejar sequências de RNA específicas, mas, de preferência, uma única enzima pode ser programada por uma molécula de RNA para reconhecer um alvo de RNA específico; em outras palavras, a enzima pode

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92/776 ser recrutada para um alvo de RNA especifico com o uso da dita molécula de RNA.

[145] Em um aspecto da invenção, os novos sistemas de alvejamento de DNA também mencionados como CRISPR/Cas de alvejamento de DNA ou DNA ou o sistema de alvejamento de RNA de sistema CRISPR-Cas do presente pedido são baseados nas proteínas Cas do tipo VI-B identificadas que não exigem a geração de proteínas personalizadas para alvejar sequências de RNA específicas, mas, de preferência, uma única enzima pode ser programada por uma molécula de DNA para reconhecer um alvo de DNA específico; em outras palavras, a enzima pode ser recrutada para um alvo de RNA específico com o uso da dita molécula de RNA.

[146] Os sistemas de alvejamento de ácidos nucleicos, os sistemas de vetor, os vetores e as composições descritas no presente documento podem ser usados em várias aplicações de alvejamento de ácidos nucleicos, alteração ou modificação da síntese de um produto genético, como uma

proteína,	divagem	de	ácidos	nucleicos,	edição	de	ácidos
nucleicos,	splicing	de	ácidos	nucleicos;	tráfico	de	ácidos
nucleicos	alvo, rastreamento	de ácidos	nucleicos	alvo,
isolamento	de ácidos	nucleicos	alvo, visualização	de	ácidos
nucleicos	alvo, etc.

[147] Como usado aqui, uma proteína Cas ou uma enzima CRISPR se refere a qualquer uma das proteínas

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93/776 apresentadas na nova classificação de sistemas CRISPR-Cas.

Nucleases de Casl3b [148] A proteína efetora Casl3b da invenção é, compreende, consiste essencialmente em, consiste em, envolve ou se refere a tal proteína a partir de ou conforme apresentado na Figura 1. As proteínas preferenciais da Figura 1 são selecionadas a partir do grupo que consiste em Porphyromonas gulae Casl3b (número de acesso WP_039434803), Prevotella sp. P5-125 Casl3b (número de acesso WP_044065294), Porphyromonas gíngívalís Casl3b (número de acesso WP_053444417), Porphyromonas sp. COT-052 OH4946

Casl3b (número de acesso WP_039428968) , Bacteroides pyogenes Casl3b (número de acesso WP_034542281) , Ríemerella anatipestifer Casl3b (número de acesso WP_004919755). As proteínas mais preferenciais da Figura 1 são selecionadas a partir do grupo que consiste em Porphyromonas gulae Casl3b (número de acesso WP_039434803), Prevotella sp. P5-125 Casl3b (número de acesso WP_044065294), Porphyromonas gíngívalís Casl3b (número de acesso WP_053444417), Porphyromonas sp. COT-052 OH4946 Casl3b (número de acesso WP_039428968); e, mais especificamente preferencial, são Porphyromonas gulae Casl3b (número de acesso WP_039434803) ou Prevotella sp. P5-125 Casl3b (número de acesso WP_044065294) . Esta invenção é destinada a fornecer, se referir a, envolver, compreender, consistir essencialmente

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 101/817 em ou consistir em uma proteína a partir de ou conforme apresentado no presente documento, incluindo mutações ou alterações da mesma conforme apresentado no presente documento.

[149] Dessa forma, em algumas modalidades, a proteína efetora pode ser uma proteína de ligação de RNA, como uma proteína efetora do tipo Cas morto, que pode ser opcionalmente funcionalizada como descrito aqui, por exemplo, com um ativador transcricional ou domínio repressor, NLS ou outro domínio funcional. Em algumas modalidades, a proteína efetora pode ser uma proteína de ligação de RNA que cliva uma única fita de RNA. Se o RNA ligado for ssRNA, então, o ssRNA é totalmente clivado. Em algumas modalidades, a proteína efetora pode ser uma proteína de ligação de RNA que cliva uma fita dupla de RNA, por exemplo, se compreender dois domínios de RNase. Se o RNA ligado for dsRNA, então, o dsRNA é totalmente clivado.

[150] A função RNase em sistemas CRISPR é conhecida;

por exemplo, o alvejamento de mRNA foi relatado para determinados sistemas CRISPR-Cas tipo III (Hale et ai., 2014, Genes Dev, volume 28, 2.432 a 2.443; Hale et ai., 2009, Cell, volume 139, 945 a 956; Peng et ai., 2015, Nucleic acids research, volume 43, 406 a 417) e fornece vantagens significativas. Um sistema CRISPR-Cas, composição ou método de alvejamento de RNA através das presentes proteínas

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95/776 efetoras é, dessa forma, fornecido.

[151] 0 RNA-alvo, isto é, o RNA de interesse, é o RNA a ser alvejado pela presente invenção, levando ao recrutamento e à ligação da proteína efetora no sítio-alvo de interesse no RNA-alvo. 0 RNA-alvo pode ser qualquer forma adequada de RNA. Isso pode incluir, em algumas modalidades, mRNA. Em outras modalidades, o RNA-alvo pode incluir tRNA ou rRNA.

Guia de Casl3b [152] Como usado aqui, o termo crRNA ou RNA guia ou RNA guia único ou sgRNA ou um ou mais componentes de ácido nucleico de uma proteína efetora de locus de CRISPRCas tipo VI compreende qualguer sequência de polinucleotídeos que tem complementaridade suficiente com uma sequência de ácidos nucleicos alvo para hibridizar com a sequência de ácidos nucleicos alvo e ligação específica de sequência direta de um complexo de alvejamento de RNA à sequência de RNA-alvo.

[153] Em determinadas modalidades, o sistema de CRISPR, como fornecido no presente documento, pode fazer uso de um crRNA ou polinucleotídeo análogo que compreende uma sequência guia, em que o polinucleotídeo é um RNA, um DNA ou uma mistura de RNA e DNA, e/ou em que o polinucleotídeo compreende um ou mais análogos de nucleotídeo. A sequência pode compreender qualquer estrutura, que inclui, porém, sem

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96/776 limitação uma estrutura de um crRNA nativo, como uma estrutura em abaulamento, uma estrutura de alça em formato de grampo ou uma estrutura de alça de haste. Em determinadas modalidades, o polinucleotídeo que compreende a sequência

guia forma um	duplex com	uma segunda	sequência	de
polinucleotídeos	que pode ser	um RNA ou uma	sequência	de
DNA.
[154] Em	determinadas	modalidades,	os guias	da
invenção compreendem ácidos nucleicos de ocorrência	não

natural e/ou nucleotídeos de ocorrência não natural e/ou análogos de nucleotídeos e/ou modificações de maneira química. Os ácidos nucleicos de ocorrência não natural podem incluir, por exemplo, misturas de nucleotídeos de ocorrência natural e não natural. Os nucleotídeos de ocorrência não natural e/ou análogos de nucleotídeo podem ser modificados na porção química de ribose, fosfato e/ou base. Em uma modalidade da invenção, um ácido nucleico guia compreende ribonucleotídeos e não ribonucleotídeos. Em tal modalidade, um guia compreende um ou mais ribonucleotídeos e um ou mais desoxirribonucleotídeos. Em uma modalidade da invenção, o guia compreende um ou mais nucleotídeos de ocorrência não natural ou análogos de nucleotídeo, como um nucleotídeo com ligação de fosforotioato, ligação de boranofosfato, nucleotídeos de ácido nucleico bloqueado (LNA) que compreendem uma ponte de metileno entre os carbonos 2' e 4'

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97/776 do anel de ribose ou ácidos nucleicos em ponte (BNA). Outros exemplos de nucleotídeos modificados incluem análogos 2 '-0metil, análogos 2'-desoxi, análogos 2-tiouridina, análogos N6-metiladenosina ou análogos 2'-fluoro. Os exemplos adicionais de bases modificadas incluem, porém sem limitação, 2-aminopurina, 5-bromo-uridina, pseudouridina (Ψ) , Nl-metilpseudouridina (melW), 5-metoxiuridina (5moU), inosina, 7-metilguanosina. Exemplos de modificações químicas de RNA guia incluem, sem limitação, incorporação de 2'-0metil (M), 2'-0-metil 3'fosforotioato (MS), etil restringido em S (cEt) ou 2'-0-metil 3'tioPACE (MSP) em um ou mais nucleotídeos terminais. Tais RNAs guia quimicamente modificados podem compreender estabilidade aumentada e atividade aumentada em comparação com RNAs guia não modificados, embora especificidade no alvo versus fora do alvo não seja previsível. (Consultar Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985 a 989, doi: 10.1038/nbt.3290, publicado online em 29 de junho de 2015; Allerson et al. , J. Medição Chem. 2005, 48:901 a 904; Bramsen et al. , Front. Genet., 2012, 3:154; Deng et al., PNAS, 2015, 112:11.870 a 11.875; Sharma et al., MedChemComm., 2014, 5:1.454 a 1.471;

Li et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1, 0066

DOI :10.1038/s41551-017-0066) .

[155] Em algumas modalidades, a extremidade 5' e/ou 3' de um RNA guia é modificada por uma variedade de porções

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98/776 químicas funcionais, incluindo corantes fluorescentes, polietilenoglicol, colesterol, proteínas ou etiquetas de detecção. (Consultar Kelly et ai., 2016, J. Biotech. 233:74 a 83) . Em determinadas modalidades, um guia compreende ribonucleotídeos em uma região que se liga a um RNA alvo e um ou mais desoxirribonucletídeos e/ou análogos de nucleotídeo em uma região que se liga a CaslSb. Em uma modalidade da invenção, os desoxirribonucleotídeos e/ou análogos de nucleotídeo são incorporados em estruturas guia manipuladas, como, sem limitação, regiões 5' e/ou 3', regiões de haste-alça e região de semente. Em determinadas modalidades, a modificação não está na extremidade 3' das regiões de haste-alça. A modificação guímica na extremidade 3' da região de haste-alça de um guia pode abolir sua função. Em determinadas modalidades, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9, 10, 11,	12, 13, 14,	15, 16, 17, 18,	19, 20, 21,	22,
23, 24, 25,	26, 27, 28,	29, 30, 35, 40	, 45, 50 ou	75
nucleotídeos	de um guia	são quimicamente	modificados.	Em

algumas modalidades, 3 a 5 nucleotídeos na extremidade 3' ou 5' de um guia são quimicamente modificados. Em algumas modalidades, apenas pequenas modificações são introduzidas na região de semente, como modificações 2'-F. Em algumas modalidades, a modificação 2'-F é introduzida na extremidade 5' e/ou 3' de um guia. Em determinadas modalidades, três a cinco nucleotídeos na extremidade 5' e/ou 3' do guia são

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99/776 quimicamente modificados com 2'-0-metil (M), 2'-0-metil-3'fosforotioato (MS), etil restringido em S (cEt) ou 2'-0metil-3'-tioPACE (MSP). Tal modificação pode aperfeiçoar eficácia de edição de genoma (consulte Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33(9): 985 a 989). Em determinadas modalidades, todas as ligações de fosfodiéster de um guia são substituídas por fosforotioatos (PS) para intensificar os níveis de ruptura de gene. Em determinadas modalidades, mais de cinco nucleotídeos nas extremidades 5' e/ou 3' do guia são quimicamente modificados com etil restringido em 2'-0-Me, 2'-F ou S (cEt) . Tal guia quimicamente modificado pode mediar níveis intensificados de ruptura de gene (consultar Ragdarm et ai., 0215, PNAS, E7110-E7111). Em uma modalidade da invenção, um guia é modificado para compreender uma porção química em sua extremidade 3' e/ou 5'. Tais porções químicas incluem, porém sem limitação, amina, azida, alcino, tio, dibenzociclooctina (DBCO) ou Rodamina. Em determinada modalidade, a porção química é conjugada ao guia por um ligante, como uma cadeia de alguila. Em determinadas modalidades, a porção química do guia modificado pode ser usada para fixar o guia a uma outra molécula, como DNA, RNA, proteína ou nanopartícuias. Tal guia quimicamente modificado pode ser usado para identificar ou enriquecer células editadas genericamente por um sistema CRISPR (consultar Lee et ai., ELife, 2017, 6: e25312, DOI: 10.7554)

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100/776 [156] Em algumas modalidades, a modificação do guia é uma modificação química, uma inserção, uma deleção ou uma divisão. Em algumas modalidades, a modificação química inclui, sem limitação, incorporação de análogos 2'-0-metil (M), análogos 2'-desoxi, análogos 2-tiouridina, análogos N6metiladenosina, análogos 2'-fluoro, 2-aminopurina, 5-bromouridina, pseudouridina (Ψ), Nl-metilpseudouridina (melW), 5metoxiuridina (5moU), inosina, 7-metilguanosina, 2'-0-metil3'-fosforotioato (MS), etil restringido em S (cEt), fosforotioato (PS) ou 2'-0-metil-3'-tioPACE (MSP). Em algumas modalidades, o guia compreende uma ou mais modificações de fosforotioato. Em determinadas modalidades, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou 25 nucleotídeos do guia são quimicamente modificados. Em determinadas modalidades, um ou mais nucleotídeos na região de semente são quimicamente modificados. Em determinadas modalidades, um ou mais nucleotídeos no terminal 5' são quimicamente modificados. Em determinadas modalidades, nenhum dos nucleotídeos na extremidade 3' é quimicamente modificado. Em algumas modalidades, a modificação química na região de semente é uma modificação menor, como a incorporação de um análogo 2'fluoro. Em uma modalidade específica, um nucleotídeo da região de semente é substituído por um análogo 2'-fluoro. Em algumas modalidades, 5 ou 10 nucleotídeos no terminal 5' são

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101/776 quimicamente modificados. Tais modificações químicas no terminal 5' do Casl3b CrRNA podem aperfeiçoar a eficiência de corte de gene. Em uma modalidade específica, 5 nucleotídeos no terminal 5' são substituídos por análogos 2'-fluoro. Em uma modalidade específica, 10 nucleotídeos no terminal 5' são substituídos por análogos 2'-fluoro. Em uma modalidade específica, 5 nucleotídeos no terminal 5' são substituídos por análogos 2'-0-metil (M).

[157] Em algumas modalidades, a alça da extremidade 3' do guia é modificada. Em algumas modalidades, a alça da extremidade 3' do guia é modificada para ter uma deleção, uma inserção, uma divisão ou modificações químicas. Em determinadas modalidades, a alça compreende 3, 4, ou 5 nucleotídeos. Em determinadas modalidades, a alça compreende a sequência de UCUU, UUUU, UAUU ou UGUU.

[158] Em um aspecto, o guia compreende porções que são quimicamente ligadas ou conjugadas através de uma ligação de não fosfodiéster. Em um aspecto, o guia compreende, em exemplos não limitadores, uma porção de sequência de alvejamento e uma repetição direta que são quimicamente ligadas ou conjugadas através de uma alça não nucleotídica. Em algumas modalidades, as porções são unidas através de um ligante covalente não fosfodiéster. Os exemplos do ligante covalente incluem, porém sem limitação, uma porção química selecionada do grupo que consiste em carbamatos, éteres,

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102/776 ésteres, amidas, iminas, amidinas, aminotrizinas, hidrozona, dissulfetos, tioéteres, tioésteres, fosforotioatos, fosforoditioatos, sulfonamidas, sulfonatos, fulfonas, sulfóxidos, ureias, tioureias, hidrazida, oxima, triazol, ligações fotolábeis, grupos de formação de ligação C-C, como pares de ciclo-adição Diels-Alder ou pares de metátese de fechamento de anel e pares de reação de Michael.

[159] Em algumas modalidades, as porções do guia são primeiramente sintetizadas com o uso do protocolo sintético de fosforamidita padrão (Herdewijn, P., edição, Methods in Molecular Biology Col 288, Oligonucleotide Synthesis: Methods e Applications, Humana Press, New Jersey (2012)). Em algumas modalidades, as porções de guia de não alvejamento podem ser funcionalizadas para conter um grupo funcional adequado para ligação com o uso do protocolo padrão conhecido na técnica (Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press (2013)). Os exemplos de grupos funcionais incluem, porém sem limitação, hidroxila, amina, ácido carboxílico, haleto de ácido carboxílico, éster ativo do ácido carboxílico, aldeído, carbonila, clorocarbonila, imidazolilcarbonila, hidrozida, semicarbazida, tio semicarbazida, tiol, maleimida, haloalquila, sufonila, ali, propargila, dieno, alcino e azida. Uma vez que uma porção de não alvejamento de um guia é funcionalizada, uma ligação ou ligação química covalente pode ser formada entre os dois

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103/776 oligonucleotídeos. Os exemplos de ligações químicas incluem, porém sem limitação, aquelas com base em carbamatos, éteres, ésteres, amidas, iminas, amidinas, aminotrizinas, hidrozona, dissulfetos, tioéteres, tioésteres, fosforotioatos, fosforoditioatos, sulfonamidas, sulfonatos, fulfonas, sulfóxidos, ureias, tioureias, hidrazida, oxima, triazol, ligações fotolábeis, grupos de formação de ligação C-C, como pares de ciclo-adição Diels-Alder ou pares de metátese de fechamento de anel e pares de reação de Michael.

[160] Em algumas modalidades, uma ou mais porções de um guia podem ser sintetizadas quimicamente. Em algumas modalidades, a síntese química usa máquinas de síntese de oligonucleotídeo em fase sólida automatizadas com química de ortoéster 2’-acetoxietílico (2'-ACE) (Scaringe et al., J. Am. Chem. Soc. (1998) 120: 11.820 a 11.821; Scaringe, Methods Enzymol. (2000) 317: 3 a 18) ou 2'-tionocarbamato (2'-TC) (Dellinger et al., J. Am. Chem. Soc. (2011) 133: 11.540 a 11.546; Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33:985 a 989).

[161] Em algumas modalidades, as porções de guia podem ser ligadas covalentemente com o uso de várias reações de bioconjugação, alças, pontes e ligações não nucleotídicas através de modificações de açúcar, ligações fosfodiéster internucleotídicas, resíduos de purina e pirimidina. Sletten et ai., Angew. Chem. Int. Ed. (2009) 48:6.974 a 6.998; Manoharan, M. Curr. Opin. Chem. Biol. (2004) 8: 570 a 579;

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Behlke et al., Oligonucleotides (2008) 18: 305 a 319; Watts, et al., Drug. Discov. Today (2008) 13: 842 a 855; Shukla, et al., ChemMedChem (2010) 5: 328 a 349.

[162] Em algumas modalidades, as porções de guia podem ser ligadas covalentemente com o uso de química de cliques. Em algumas modalidades, as porções de guia podem ser ligadas covalentemente com o uso de um ligante de triazol. Em algumas modalidades, as porções de guia podem ser ligadas covalentemente com o uso da reação de cicloadição 1,3-dipolar de Huisgen que envolve um alcino e azida para render um ligante de triazol altamente estável (He et ai., ChemBioChem (2015) 17: 1.809 a 1.812; WO 2016/186745). Em algumas modalidades, as porções de guia são covalentemente ligadas pela ligação de uma porção 5'-hexina e uma porção 3'-azida. Em algumas modalidades, uma ou ambas dentre a porção de guia 5'-hexina e uma porção de guia 3'-azida podem ser protegidas com o grupo 2'-acetoxietil ortoéster (2 ' — ACE) , que pode ser subsequentemente removido com o uso do protocolo de Dharmacon (Scaringe et ai., J. Am. Chem. Soc.

(1998) 120: 11.820 a 11.821; Scaringe, Methods Enzymol. (2000) 317: 3 a 18).

[163] Em algumas modalidades, as porções de guia podem ser ligadas covalentemente através de um ligante (por exemplo, uma alça de não nucleotídeo) que compreende uma porção química como espaçadores, acessórios, bioconjugados,

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105/776 cromóforos, grupos repórteres, RNAs marcados com corantes e análogos de nucleotídeo de ocorrência não natural. Mais especificamente, os espaçadores adequados para os propósitos desta invenção incluem, porém sem limitação, poliéteres (por exemplo, polietilenoglicóis, poliálcoois, polipropilenoglicol ou misturas de etileno e propilenoglicóis), grupo poliaminas (por exemplo, esfenina, espermidina e derivados poliméricos dos mesmos), poliésteres (por exemplo, poli (acrilato de etila)), polifosfodiésteres, alquilenos e combinações dos mesmos. Os acessórios adequados incluem qualquer porção química que pode ser adicionada ao ligante para adicionar propriedades adicionais ao ligante, como, porém sem limitação, marcações fluorescentes. Os bioconjugados adequados incluem, porém sem limitação, peptídeos, glicosídeos, lipídios, colesterol, fosfolipídios, diacilgliceróis e dialquilgliceróis, ácidos graxos, hidrocarbonetos, substratos de enzima, esteroides, biotina, digoxigenina, carboidratos, polissacarídeos. Os cromóforos, grupos repórteres e RNAs marcados com corante adequados incluem, porém sem limitação, corantes fluorescentes, como fluoresceína e rodamina, compostos marcadores quimioluminescentes, eletroquimiluminescentes e bioluminescentes. O projeto de ligantes de exemplo que conjugam dois componentes de RNA também é descrito no documento n° WO 2004/015075.

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106/776 [164] 0 ligante (por exemplo, uma alça de não nucleotídeo) pode ter qualquer comprimento. Em algumas modalidades, o ligante tem um comprimento equivalente a cerca de 0 a 16 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ligante tem um comprimento equivalente a cerca de 0 a 8 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ligante tem um comprimento equivalente a cerca de 0 a 4 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ligante tem um comprimento equivalente a cerca de 2 nucleotídeos. O projeto de ligante de exemplo é também descrito no documento n° W02011/008730.

[165] Em algumas modalidades, o grau de complementaridade, quando idealmente alinhadas com o uso de um algoritmo de alinhamento adequado, é cerca de ou mais do que cerca de 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% ou mais. O alinhamento ideal pode ser determinado com o uso de qualquer algoritmo adequado para alinhar sequências, o exemplo não limitante do qual inclui o algoritmo de SmithWaterman, o algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmos com base na Transformada de Burrows-Wheeler (por exemplo, o Alinhador Burrows Wheeler) , ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponível em www.novocraft.com); ELAND (Illumina, San Diego, CA) e SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn) e Maq (disponível em maq.sourceforge.net) . A capacidade de uma sequência guia (dentro de um crRNA ou RNA-guia de alvejamento de RNA) de

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107/776 direcionar a ligação específica para sequência de um complexo de alvejamento de ácido nucleico para uma sequência de ácidos nucleicos alvo pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado. Por exemplo, os componentes de um sistema CRISPR Casl3b de alvejamento de RNA suficientes para formar um complexo de alvejamento de ácido nucleico, incluindo a sequência guia a ser testada, podem ser fornecidos para uma célula hospedeira que tem a sequência de ácidos nucleicos alvo correspondente, como por meio da transfecção com vetores que codificam os componentes do complexo de alvejamento de ácido nucleico, seguido de uma avaliação de alvejamento preferencial (por exemplo, divagem) dentro da sequência de ácidos nucleicos alvo, como por meio do ensaio Surveyor, conforme descrito no presente documento. De modo similar, a divagem de uma sequência de ácidos nucleicos alvo pode ser avaliada em um tubo de teste fornecendo a sequência de ácidos nucleicos alvo, componentes de um complexo de alvejamento de ácido nucleico, incluindo a sequência guia a ser testada e uma sequência guia de controle diferente da sequência guia de teste, e comparando a ligação ou taxa de divagem na sequência alvo entre as reações de sequência guia de teste e controle. Outros ensaios são possíveis e irão ocorrer àqueles versados na técnica. Uma sequência guia e, por conseguinte, um RNA guia de alvejamento de RNA ou crRNA podem ser selecionados para alvejar qualquer sequência de ácidos

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108/776 nucleicos alvo. A sequência alvo pode ser DNA. A sequência alvo pode ser qualquer sequência de RNA. Em algumas modalidades, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada a partir do grupo que consiste em RNA mensageiro (mRNA), pré-mRNA, RNA ribossômico (rRNA), RNA de transferência (tRNA), micro-RNA (miRNA), RNA de interferência pequeno (siRNA), RNA nuclear pequeno (snRNA), RNA nucleolar pequeno (snoRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), RNA de não codificação (ncRNA), RNA de não codificação longo (IncRNA) e RNA citoplasmático pequeno (scRNA). Em algumas modalidades preferenciais, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada a partir do grupo que consiste em mRNA, pré-mRNA e rRNA. Em algumas modalidades preferenciais, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada a partir do grupo que consiste em ncRNA e IncRNA. Em algumas modalidades mais preferenciais, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de mRNA ou uma molécula de pré-mRNA.

[166] Em algumas modalidades, o crRNA ou RNA guia de alvejamento de RNA é selecionado para reduzir o grau de estrutura secundária dentro do crRNA ou RNA guia de alvejamento de RNA. Em algumas modalidades, cerca de ou menos do que cerca de 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% ou menos dos nucleotídeos do RNA guia de alvejamento de

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RNA participam no pareamento de base autocomplementar quando idealmente enovelados. 0 dobramento ideal pode ser determinado por qualquer algoritmo de dobramento de polinucleotídeo adequado. Alguns programas são baseados no cálculo da energia livre de Gibbs mínima. Um exemplo de tal algoritmo é mFold, conforme descrito por Zuker e Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133 a 148). Outro algoritmo de dobramento exemplificativo é o RNAfold de servidor web online, desenvolvido no Institute for Theoretical Chemistry na University of Vienna, com o uso do algoritmo de previsão de estrutura centroide (consultar, por exemplo, A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1) : 23 a 24; e PA Carr e GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1.151 a 1.162).

[167] Em determinadas modalidades, um RNA guia ou crRNA pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de repetição direta (DR) e uma sequência guia ou sequência espaçadora. Em determinadas modalidades, o RNA guia ou crRNA pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de repetição direta fundida ou ligada a uma sequência guia ou sequência espaçadora. Em determinadas modalidades, a sequência de repetição direta pode estar situada a montante (isto é, 5') da sequência guia ou sequência espaçadora. Em outras modalidades, a sequência de repetição direta pode estar situada a jusante (isto é, 3') da sequência guia ou sequência

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110/776 espaçadora. Em outras modalidades, múltiplas DRs (como DRs duplas) podem estar presentes.

[168] Em determinadas modalidades, o crRNA compreende uma alça de haste, preferencialmente uma alça de haste única. Em determinadas modalidades, a sequência de repetição direta forma uma alça de haste, preferencialmente uma alça de haste única.

[169] Em determinadas modalidades, o comprimento de espaçador do RNA guia é de 15 a 35 nt. Em determinadas modalidades, o comprimento de espaçador do RNA guia é de pelo menos 15 nucleotídeos. Em determinadas modalidades, o comprimento de espaçador é de 15 a 17 nt, por exemplo, 15, 16, ou 17 nt, de 17 a 20 nt, por exemplo, 17, 18, 19, ou 20 nt, de 20 a 24 nt, por exemplo, 20, 21, 22, 23 ou 24 nt, de 23 a 25 nt, por exemplo, 23, 24 ou 25 nt, de 24 a 27 nt, por exemplo, 24, 25, 26 ou 27 nt, de 27 a 30 nt, por exemplo, 27, 28, 29 ou 30 nt, de 30 a 35 nt, por exemplo, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 nt, ou 35 nt ou mais longo.

RNA de interferência (RNAi) e microRNA (miRNA) [170] Em outras modalidades, o RNA alvo pode incluir RNA de interferência, isto é, RNA envolvido em uma via de interferência de RNA, como shRNA, siRNA e assim por diante, tanto em eucariotas quanto em procariotas. Em outras modalidades, o RNA alvo pode incluir microRNA (miRNA) . O controle sobre o RNA de interferência ou miRNA pode ajudar

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111/776 a reduzir os efeitos fora do alvo (OTE) observados com aquelas abordagens mediante a redução da longevidade do RNA de interferência ou miRNA in vivo ou in vitro.

[171] Em determinadas modalidades, o alvo não é o próprio miRNA, mas o sítio de ligação de miRNA de um alvo de miRNA.

[172] Em determinadas modalidades, os miRNAs podem ser sequestrados (como incluindo recolocados subcelularmente). Em determinadas modalidades, os miRNAs podem ser cortados, como sem limitação nos grampos.

[173] Em determinadas modalidades, o processamento de miRNA (como incluindo turnover) é aumentado ou diminuído.

[174] Se a proteína efetora e o guia adequado forem expressos de maneira seletiva (por exemplo, espacial ou temporalmente, sob o controle de um promotor adequado, por exemplo, um promotor e/ou intensificador específico de ciclo tecidual ou celular), então, isso podería ser usado para proteger as células ou sistemas (in vivo ou in vitro) do RNAi naquelas células. Isso pode ser útil em tecidos ou células vizinhas onde o RNAi não é necessário ou para fins de comparação das células ou tecidos em que a proteína efetora e o guia adequado estão e não são expressos (isto é, onde o RNAi não é controlado e onde está, respectivamente). A proteína efetora pode ser usada para controlar ou se ligar a moléculas que compreendem ou consistem em RNA, como

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112/776 ribozimas, ribossomas ou ribocomutadores. Nas modalidades da invenção, o guia de RNA pode recrutar a proteína efetora para essas moléculas, de modo que a proteína efetora tenha capacidade para se ligar às mesmas.

[175] 0 sistema de proteínas da invenção pode ser aplicado em áreas de tecnologias de RNAi, sem experimentação indevida, a partir desta revelação, incluindo aplicações terapêuticas, de ensaio e outras aplicações (consultar, por exemplo, Guidi et ai., PLoS Negl Trop Dis 9(5) : e0003801. doi:10.1371/journal.pntd; Crotty et ai., In vivo RNAi screens: concepts and applications. Shane Crotty ... 2015 Elsevier Ltd. publicado por Elsevier Inc., Pesticide Biochemistry and Physiology (Impact Factor: 2.01) . 01/2015; 120. DOI: 10.1016/j. pestbp .2015.01.002 e Makkonen et al., Viruses 2015, 7(4), 2.099 a 2.125; doi:10.3390/v7042099), devido ao fato de que o presente pedido fornece a base para engenharia informada do sistema.

RNA ribossômico (rRNA) [176] Por exemplo, os antibióticos de azalida, como azitromicina, são bem conhecidos. Os mesmos alvejam e rompem a subunidade ribossômica 50S. A presente proteína efetora, juntamente com um RNA guia adequado para alvejar a subunidade ribossômica 50S, pode ser, em algumas modalidades, recrutada para e se ligar à subunidade ribossômica 50S. Dessa forma, é fornecida a presente proteína efetora em conjunto com um

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113/776 guia adequado direcionado a um alvo ribossômico (especialmente a subunidade ribossômica 50s) . 0 uso dessa proteína efetora de uso em conjunto com o guia adequado direcionado ao alvo ribossômico (especialmente a subunidade ribossômica 50s) pode incluir o uso de antibiótico. Em particular, o uso de antibiótico é análogo à ação de antibióticos dea zalida, como azitromicina. Em algumas modalidades, as subunidades ribossômicas procarióticas, como a subunidade 70S em procariotas, a subunidade 50S mencionada acima, a subunidade 30S, bem como as subunidades 16S e 5S, podem ser alvejadas. Em outras modalidades, as subunidades ribossômicas eucarióticas, como a subunidade 80S em eucariotas, a subunidade 60S, a subunidade 40S, bem como as subunidades 28S, 18S, 5.8S e 5S podem ser alvejadas.

[177] Em algumas modalidades, a proteína efetora pode ser uma proteína de ligação de RNA, opcionalmente funcionalizada, conforme descrito aqui. Em algumas modalidades, a proteína efetora pode ser uma proteína de ligação de RNA que cliva uma única fita de RNA. Em ambos os casos, mas particularmente quando a proteína de ligação de RNA cliva uma única fita de RNA, então, a função ribossômica pode ser modulada e, em particular, reduzida ou destruída. Isto pode se aplicar a qualquer RNA ribossômico e qualquer subunidade ribossômica e as sequências de rRNA são bem conhecidas.

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114/776 [178] 0 controle da atividade ribossômica é, dessa forma, previsto através do uso da presente proteína efetora em conjunto com um guia adequado para o alvo ribossômico. Isso pode ser através da divagem de ou ligação ao ribossoma. Em particular, está prevista a redução da atividade ribossômica. Isso pode ser útil na avaliação da função ribossômica in vivo ou in vitro, mas também como um meio para controlar terapias com base na atividade ribossômica, ín vivo ou in vitro. Adicionalmente, está previsto o controle (isto é, redução) da síntese de proteína em um sistema in vivo ou in vitro, sendo que tal controle inclui uso em antibiótico, pesquisa e diagnóstico.

Ribocomutadores [179] Um ribocomutador (também conhecido como aptozima) é um segmento regulador de uma molécula de RNA mensageiro que liga uma molécula pequena. Isso tipicamente resulta em uma alteração na produção das proteínas codificadas pelo mRNA. Dessa forma, o controle da atividade de ribocomutador é assim previsto através do uso da presente proteína efetora em conjunto com um guia adequado para o alvo de ribocomutador. Isso pode ser através da divagem de ou ligação ao ribocomutador. Em particular, está prevista a redução da atividade de ribocomutador. Isso pode ser útil na avaliação da função de ribocomutador in vivo ou in vitro, mas também como um meio para controlar terapias com base na

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115/776 atividade de ribocomutador, in vivo ou in vitro. Adicionalmente, está previsto o controle (isto é, redução) da síntese de proteína em um sistema in vivo ou in vitro. Esse controle, como para rRNA, pode incluir uso em antibiótico, pesquisa e diagnóstico.

Ribozimas [180] As ribozimas são moléculas de RNA que têm propriedades catalíticas, análogas às enzimas (que são naturalmente proteínas) . À medida que as ribozimas, tanto de ocorrência natural como manipuladas, compreendem ou consistem em RNA, as mesmas também podem ser alvejadas pela presente proteína efetora de ligação de RNA. Em algumas modalidades, a proteína efetora pode ser uma proteína de ligação de RNA que diva a ribozima para assim desabilitar a mesma. O controle da atividade de ribozima é, dessa forma, previsto através do uso da presente proteína efetora em conjunto com um guia adequado para o alvo de ribozima. Isso pode ser através da divagem de ou ligação à ribozima. Em particular, está prevista a redução da atividade de ribozima. Isso pode ser útil na avaliação da função de ribozima in vivo ou in vitro, mas também como um meio para controlar terapias com base na atividade de ribozima, in vivo ou in vi tro.

Expressão de gene, incluindo processamento de RNA [181] A proteína efetora também pode ser usada,

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116/776 juntamente com um guia adequado, para alvejar a expressão de gene, incluindo através do controle do processamento de RNA. 0 controle do processamento de RNA pode incluir reações de processamento de RNA, como splicing de RNA, incluindo splicing alternativo, através do alvejamento de RNApol; replicação viral (em particular de vírus de satélite, bacterióf agos e retrovirus, como HBV, HBC e HIV e outros listados no presente documento) incluindo virioides em plantas; e biossíntese de tRNA. A proteína efetora e o guia adequado também podem ser usados para controlar a ativação de RNA (RNAa). A RNAa leva à promoção da expressão de gene, de modo que o controle da expressão de gene possa ser alcançado dessa maneira através da ruptura ou redução de RNAa e, dessa forma, menos promoção da expressão de gene. Isso é discutido em mais detalhes abaixo.

Triagens de RNAi [182] A identificação de produtos de gene cujo knockdown está associado a alterações fenotípicas, as vias biológicas podem ser interrogadas e as partes constituintes identificadas, através de triagens de RNAi. 0 controle também pode ser exercido sobre ou durante essas triagens com o uso da proteína efetora e guia adequado para remover ou reduzir a atividade do RNAi na triagem e, dessa forma, restabelecer a atividade do (anteriormente interferida com) produto de gene (mediante a remoção ou redução da

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117/776 interferência/repressão).

[183] RNAs de satélite (satRNAs) e vírus de satélite também podem ser tratados.

[184] 0 controle no presente documento com referência à atividade de RNase geralmente significa redução, rompimento negativo ou known-down ou knockout.

Aplicações de RNA ín vivo

Inibição de expressão de gene [185] As RNAses específicas de alvo fornecidas no presente documento permitem um corte muito específico de um RNA alvo. A interferência no nível de RNA permite a modulação tanto espacial como temporal e de maneira não invasiva, à medida que o genoma não é modificado.

[186] Demonstrou-se que várias doenças são tratáveis por alvejamento de mRNA. Embora a maioria desses estudos esteja relacionado à administração de siRNA, é evidente que as proteínas efetoras de alvejamento de RNA fornecidas no presente documento podem ser aplicadas de maneira similar.

[187] Os exemplos de alvos de mRNA (e tratamentos de doenças correspondentes) são VEGF, VEGF-R1 e RTP801 (no tratamento de AMD e/ou DME), Caspase 2 (no tratamento de Naion) ADRB2 (no tratamento de pressão intraocular), TRPVI (no tratamento da síndrome do olho seco, Syk quinase (no tratamento de asma) , Apo B (no tratamento da

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118/776 hipercolesterolemia ou hipobetalipoproteinemia), PLK1, KSP e VEGF (no tratamento de tumores sólidos), Ber-Abl (no tratamento de CML) (Burnett e Rossi Chem Biol. 2012, 19(1): 60 a 71)). De modo similar, demonstrou-se que o alvejamento de RNA é eficaz no tratamento de doenças mediadas por vírus de RNA, como HIV (alvejamento de HIV Tet e Rev) , RSV (alvejamento de nucleocapsídeo de RSV) e HCV (alvejamento de miR-122) (Burnett e Rossi Chem Biol. 2012, 19(1) : 60 a 71) .

[188] É adicionalmente previsto que a proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção possa ser usada para knockdown específico de mutação ou específico de alelo. Os RNAs-guia podem ser projetados para alvejar especificamente uma sequência no mRNA transcrito que compreende uma mutação ou uma sequência específica de alelo. Tal knockdown específico é particularmente adequado para aplicações terapêuticas relacionadas a distúrbios associados a produtos de gene específicos de alelo ou mutantes. Por exemplo, a maioria dos casos de familial hipobetalipoproteinemia familiar (FHBL) é causada por mutações no gene ApoB. Esse gene codifica duas versões da proteína apolipoproteína B: uma versão curta (ApoB-48) e uma versão mais longa (ApoB-100). Várias mutações de o gene ApoB que levam a FHBL fazem com que ambas as versões de ApoB sejam anormalmente curtas. Especificamente o alvejamento e knockdown de transcrições de mRNA de ApoB mutante com uma

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119/776 proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção podem ser benéficos no tratamento de FHBL. Como um outro exemplo, a doença de Huntington (HD) é causada por uma expansão de repetições triplas de CAG no gene que codifica a proteína Huntingtin, o que resulta em uma proteína anormal. Especificamente o alvejamento e knockdown de transcrições de mRNA específicas de alelo ou mutantes que codificam a proteína Huntingtin com uma proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção podem ser benéficos no tratamento de HD.

[189] É observado que, nesse contexto, e mais geralmente para várias aplicações, conforme descrito aqui, o uso de uma versão dividida da proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser previsto. De fato, isso pode não apenas permitir especificidade aumentada, mas também pode ser vantajoso para a entrega. A Casl3b é dividida no sentido de que as duas partes da enzima Casl3b compreendem substancialmente uma Casl3b funcionando. Idealmente, a divisão deve ser sempre para que o domínio (ou domínios) catalítico não seja afetado. Essa Casl3b pode funcionar como uma nuclease ou pode ser uma Casl3b morta, que é essencialmente uma proteína de ligação de RNA com muito pouca ou nenhuma atividade catalítica, devido tipicamente à mutação (ou mutações) em seus domínios catalíticos.

[190] Cada metade da Casl3b dividida pode ser fundida com um parceiro de dimerização. Por meio de exemplo,

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120/776 e sem limitação, o emprego de domínios de dimerização sensíveis à rapamicina, permite gerar um Casl3b dividido quimicamente induzível para controle temporal da atividade de Casl3b. A Casl3b pode assim se tornar quimicamente induzível ao ser dividida em dois fragmentos e esses domínios de dimerização sensíveis à rapamicina podem ser usados para a remontagem controlada da Casl3b. As duas partes da Casl3b dividida podem ser consideradas como a parte terminal Ν' e a parte terminal C da Casl3b dividida. A fusão está tipicamente no ponto de divisão da Casl3b. Em outras palavras, o terminal C' da parte terminal Ν' da Casl3b dividida é fundido a uma das metades de dímero, enquanto o terminal Ν' da parte terminal C é fundido à outra metade do dímero.

[191] A Casl3b não tem que ser dividida no sentido de que a quebra foi criada recentemente. O ponto de divisão é tipicamente projetado in silico e clonado nos construtos. Em conjunto, as duas partes da Casl3b dividida, o terminal Ν' e o terminal C, formam uma Casl3b completa, que compreende preferencialmente pelo menos 70% ou mais dos aminoácidos de tipo selvagem (ou nucleotídeos que codificam os mesmos), preferencialmente pelo menos 80% ou mais, preferencialmente pelo menos 90% ou mais, preferencialmente pelo menos 95% ou mais e com a máxima preferência pelo menos 99% ou mais dos aminoácidos de tipo selvagem (ou nucleotídeos

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121/776 que codificam os mesmos). Alguns cortes podem ser possíveis e estão previstos mutantes. Os domínios não funcionais podem ser removidos completamente. 0 importante é que as duas partes sejam reunidas e que a função de Casl3b desejada seja restaurada ou reconstituída. 0 dímero pode ser um homodímero ou um heterodímero.

[192] Em determinadas modalidades, o efetor de Casl3b como descrito aqui pode ser usado para alvejamento específico de mutação ou específico de alelo, como. Para knockdown específico de mutação ou específico de alelo.

[193] A proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser, ademais, fundida a um outro domínio de RNAse funcional, como uma RNase ou Argonauta 2 não específica, que atua em sinergia para aumentar a atividade da RNAse ou para assegurar a degradação adicionalmente da mensagem.

[194] Modulação da expressão de gene através da modulação da função de RNA [195] Além de um efeito direto na expressão de gene através da divagem do mRNA, o alvejamento de RNA também pode ser usado para impactar aspectos específicos do processamento de RNA dentro da célula, o que pode permitir uma modulação mais sutil da expressão de gene. Geralmente, a modulação pode, por exemplo, ser mediada mediante a interferência com a ligação de proteínas ao RNA, como por exemplo, bloqueando a ligação de proteínas ou recrutando

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122/776 proteínas de ligação ao RNA. De fato, as modulações podem ser asseguradas em diferentes níveis, como splicing, transporte, localização, tradução e turnover do mRNA. De modo similar, no contexto da terapia, pode ser previsto tratar do mau funcionamento (patogênico) em cada um desses níveis com o uso de moléculas de alvejamento específico de RNA. Nessas modalidades, é em muitos casos preferencial que a proteína de alvejamento de RNA seja uma Casl3b morta que perdeu a capacidade de cortar o alvo de RNA, mas mantém sua capacidade de se ligar ao mesmo, como as formas mutantes de Casl3b descritas neste documento.

[196] A) Splicing alternativo [197] Muitos dos genes humanos expressam múltiplos mRNAs como resultado de splicing alternativo. Demonstrou-se que diferentes doenças estão ligadas a splicing anormal, levando à perda de função ou ganho de função do gene expresso. Enquanto algumas dessas doenças são causadas por mutações que causam defeitos de splicing, várias delas não são. Uma opção terapêutica é alvejar o mecanismo de splicing diretamente. As proteínas efetoras de alvejamento de RNA descritas no presente documento podem, por exemplo, ser usadas para bloquear ou promover o splicing, incluir ou excluir éxons e influenciar a expressão de isoformas específicas e/ou estimular a expressão de produtos de proteína alternativos. Tais aplicações são descritas em mais

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123/776 detalhes abaixo.

[198] Uma proteína efetora de alvejamento de RNA que se liga a um RNA alvo pode bloguear estericamente o acesso de fatores de splicing à sequência de RNA. Uma proteína efetora de alvejamento de RNA alvejada para um sítio de splicing pode bloquear o splicing no sítio, opcionalmente redirecionando o splicing para um sítio adjacente. Por exemplo, a proteína efetora de alvejamento de RNA que se liga à ligação de sítio de splicing 5' pode bloquear o recrutamento do componente UI do spliceossoma, favorecendo o salto desse éxon. Alternativamente, uma proteína efetora de alvejamento de RNA alvejada para um intensificador ou silenciador de splicing pode impedir a ligação de fatores de splicing reguladores de transação no sítio alvo e eficazmente bloquear ou promover o splicing. A exclusão de éxon pode ser adicionalmente alcançada através do recrutamento de ILF2/3 para o mRNA precursor próximo a um éxon por uma proteína efetora de alvejamento de RNA, conforme descrito aqui. Como ainda outro exemplo, um domínio rico em glicina pode ser fixado para o recrutamento de hnRNP Al e exclusão de éxon (Del Gatto-Konczak et al. Mol Cell Biol. Janeiro de 1999,-19 (1) : 251 a 260) .

[199] Em determinadas modalidades, através da seleção adequada de gRNA, variantes de splicing específicas podem ser alvejadas, enquanto outras variantes de splicing

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124/776 não serão alvejadas.

[200] Em alguns casos, a proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser usada para promover o splicing (por exemplo, onde o splicing é defeituoso) . Por exemplo, uma proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser associada a um efetor com capacidade para estabilizar uma haste-alça regulador de splicing para o splicing adicional. A proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser ligada a uma sequência de sítio de ligação de consenso para um fator de splicing específico, a fim de recrutar a proteína para o DNA ou RNA alvo.

[201] Os exemplos de doenças que foram associadas ao splicing anormal incluem, porém sem limitação, ataxia paraneoplásica de Opsoclonus Myoclonus (ou POMA), que resulta de uma perda de proteínas Nova que regulam o splicing de proteínas que funcionam na sinapse, e fibrose cística, que é causada pelo splicing defeituoso de um regulador de condutância transmembranar de fibrose cística, que resulta na produção de canais de cloreto não funcionais. Em outras doenças, o splicing anormal de RNA resulta em ganho de função. Esse é o caso, por exemplo, da distrofia miotônica, que é causada por uma expansão de repetição tripla de CUG (de 50 a > 1.500 repetições) na 3'UTR de um mRNA, causando defeitos de splicing.

[202] A proteína efetora de alvejamento de RNA pode

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125/776 ser usada para incluir um éxon recrutando um fator de splicing (como Ul) para o sítio de splicing 5' para promover a excisão de introns ao redor de um éxon desejado. Tal recrutamento pode ser mediado através de uma fusão com um domínio rico em arginina/serina, que funciona como ativador de splicing (Gravely BR e Maniatis T, Mol Cell. 1998 (5):765 a 771) .

[203] É previsto que a proteína efetora de alvejamento de RNA possa ser usada para bloquear a máquina de splicing em um locus desejado, resultando na prevenção do reconhecimento de éxon e na expressão de um produto de proteína diferente. Um exemplo de um distúrbio que pode ser tratado é a distrofia muscular de Duchenne (DMD), que é causada por mutações no gene que codifica a proteína de distrofina. Quase todas as mutações de DMD levam a modificações de quadro, resultando em uma tradução de distrofina prejudicada. A proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser emparelhada com junções de splicing ou intensificadores de splicing exônico (ESEs), impedindo assim o reconhecimento de éxon, resultando na tradução de uma proteína parcialmente funcional. Isso converte o fenótipo letal de Duchenne no fenótipo menos grave de Becker.

[204] B) Modificação de RNA [205] A edição de RNA é um processo natural pelo qual a diversidade de produtos de gene de uma determinada

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126/776 sequência é aumentada por pequenas modificações no RNA. Tipicamente, a modificação envolve a conversão de adenosina (A) em inosina (I), resultando em uma sequência de RNA que é diferente daquela codificada pelo genoma. A modificação de RNA é geralmente assegurada pela enzima ADAR, pela qual o alvo pré-RNA forma um RNA duplex imperfeito por meio de emparelhamento de bases entre o éxon que contém a adenosina a ser editada e um elemento de não codificação intrônico. Um exemplo clássico de edição de A-I é o mRNA de receptor de glutamato GluR-B, pelo qual a alteração resulta em propriedades de condutância modificadas do canal (Higuchi M, et al. Cell. 1993;75:1361-70).

[206] De acordo com a invenção, as abordagens enzimáticas são usadas para induzir transições (alterações A <-> G ou C <-> U) ou transversões (qualquer purina para qualquer pirimidina ou vice-versa) nas bases de RNA de uma determinada transcrição. As transições podem ser induzidas diretamente com o uso de adenosina (ADAR1/2)) ou citosina desaminase (APOBEC, AID) que convertem A em I ou C em U, respectivamente. As transversões podem ser induzidas indiretamente pela localização de danos de espécies reativas de oxigênio nas bases de interesse, que causa modificações químicas a serem adicionadas às bases afetadas, como a conversão de guanina em oxo-guanina. Uma oxo-gaunina é reconhecida como um T e, portanto, será submetida ao

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127/776 emparelhamento de base com uma adenina, fazendo com que a tradução seja afetada. As proteínas que podem ser recrutadas para danos de base mediados por ERO incluem APEX e mini-SOG. Com ambas as abordagens, esses efetores podem ser fundidos a uma Casl3b cataliticamente inativa e recrutados para sítios em transcrições em que esses tipos de mutações são desejados.

[207] Em seres humanos, uma mutação nulo-funcional heterozigótica no gene ADAR1 leva a uma doença de pele, genodermatose pigmentar humana (Miyamura Y, et al. Am J Hum Genet. 2003;73:693 a 699) . É previsto que as proteínas efetoras de alvejamento de RNA da presente invenção possam ser usadas para corrigir modificações de RNA com mal funcionamento.

[208] É adicionalmente previsto que o RNA adenosina metilase (N(6)-metiladenosina) possa ser fundido às proteínas efetoras de alvejamento de RNA da invenção e alvejado para uma transcrição de interesse. Essa metilase causa metilação reversível, tem funções reguladoras e pode afetar a expressão de gene e decisões sobre o destino celular mediante a modulação de múltiplas vias celulares relacionadas ao RNA (Fu et al., Nat Rev Genet. 2014;15(5) :293 a 306) .

[209] C) Poliadenilação [210] A poliadenilação de um mRNA é importante para o transporte nuclear, a eficiência de tradução e a

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128/776 estabilidade do mRNA, e todos esses, bem como o processo de poliadenilação, dependem de RBPs específicas. A maioria dos mRNAs eucarióticos recebe uma cauda 3' poli(A) de cerca de 200 nucleotídeos após a transcrição. A poliadenilação envolve diferentes complexos de proteínas de ligação de RNA que estimulam a atividade de uma poli(A)polimerase (Minvielle-Sebastia L et al. Curr Opin Cell Biol. 1999;11:352 a 357) . É previsto que as proteínas efetoras de alveajamento de RNA fornecidas no presente documento possam ser usadas para interferir ou promover a interação entre as proteínas de ligação de RNA e o RNA.

[211] Os exemplos de doenças que foram ligadas a proteínas defeituosas envolvidas na poliadenilação são a distrofia muscular oculofaríngea (OPMD) (Brais B, et al. Nat Genet. 1998;18:164 a 167).

D) Exportação de RNA [212] Após o processamento de pré-mRNA, o mRNA é exportado do núcleo para o citoplasma. Isso é assegurado por um mecanismo celular que envolve a geração de um complexo carreador, que é então translocado através do poro nuclear e libera o mRNA no citoplasma, com reciclagem subsequente do carreador.

[213] Foi verificado que a superexpressão de proteínas (como TAP) que desempenha um papel na exportação de RNA aumenta a exportação de transcrições que são de outro

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129/776 modo exportadas de maneira ineficaz em Xenopus (Katahira J, et al. EMBO J. 1999;18:2.593 a 2.609).

[214] E) Localização de mRNA [215] A localização do mRNA assegura a produção de proteína espacialmente regulada. A localização das transcrições para uma região específica da célula pode ser assegurada por elementos de localização. Em modalidades particulares, é previsto que as proteínas efetoras descritas neste documento possam ser usadas para alvejar elementos de localização para o RNA de interesse. As proteínas efetoras podem ser projetadas para ligar a transcrição alvo e transportá-la para um local na célula determinado por sua etiqueta de sinal de peptídeo. Mais particularmente, por exemplo, uma proteína efetora de alvejamento de RNA fundida a um ou mais sinais de localização nuclear (NLS) e/ou um ou mais sinais de exportação nuclear (NES) pode ser usada para alterar a localização do RNA.

[216] Outros exemplos de sinais de localização incluem a proteína de ligação a zipcode (ZBP1), que assegura a localização de β-actina no citoplasma em vários tipos de células assimétricas, sequência de retenção de KDEL (localização no retículo endoplasmático), sinal de exportação nuclear (localização no citoplasma), sinal de alvejamento mitocondrial (localização para mitocôndrias), sinal de alvejamento peroxissômico (localização para

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130/776 peroxissoma) e marcação m6A/YTHDF2 (localização para corpos p) . Outras abordagens que estão previstas são a fusão da proteína efetora de alvejamento de RNA com proteínas de localização conhecida (por exemplo, membrana, sinapse).

[217] Alternativamente, a proteína efetora de acordo com a invenção pode, por exemplo, ser usada em knockdown dependente de localização. Mediante a fusão da proteína efetora a um sinal de localização adequado, a efetora é alvejada para um compartimento celular específico. Apenas os RNAs alvo que residem nesse compartimento serão eficazmente alvejados, enquanto outros alvos idênticos, mas que residem em um compartimento celular diferente, não serão alvejados, de modo que um knockdown dependente de localização possa ser estabelecido.

[218] F) Tradução [219] As proteínas efetoras de alvejamento de RNA aqui descritas podem ser usadas para intensificar ou reprimir a tradução. É previsto que a regulação ascendente da tradução seja uma maneira muito robusta de controlar circuitos celulares. Adicionalmente, para estudos funcionais, uma triagem de tradução de proteína pode ser favorável em relação às triagens de regulação ascendente de transcrição, que têm a desvantagem de que a regulação ascendente de transcrição não se traduz em produção de proteína aumentada.

[220] É previsto que as proteínas efetoras de

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131/776 alvejamento de RNA aqui descritas possam ser usadas para trazer fatores de iniciação de tradução, como EIF4G, nas proximidades da repetição não traduzida 5' (5'UTR) de um RNA mensageiro de interesse para conduzir a tradução (conforme descrito em De Gregorio et al. EMBO J. 1999;18(17): 4.865 a 4.874 para uma proteína de ligação de RNA não reprogramável) . Como um outro exemplo, GLD2, uma poli(A) polimerase citoplasmática, pode ser recrutado para o mRNA alvo por uma proteína efetora de alvejamento de RNA. Isto permitiría a poliadenilação dirigida do mRNA alvo, estimulando assim a tradução.

[221] De modo similar, as proteínas efetoras de alvejamento de RNA aqui previstas podem ser usadas para bloquear os repressores de tradução de mRNA, como ZBP1 (Huttelmaier S, et al. Nature. 2005;438:512 a 515). Mediante a ligação ao sítio de início de tradução de um RNA alvo, a tradução pode ser diretamente afetada.

[222] Além disso, a fusão das proteínas efetoras de alvejamento de RNA a uma proteína que estabiliza mRNAs, por exemplo, impedindo a degradação dos mesmos, como inibidores de RNase, é possível aumentar a produção de proteínas a partir das transcrições de interesse.

[223] É previsto que as proteínas efetoras de alvejamento de RNA aqui descritas possam ser usadas para reprimir a tradução por meio da ligação nas regiões 5ÚTR de

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132/776 uma transcrição de RNA e impedindo que o ribossoma forme e inicie a tradução.

[224] Adicionalmente, a proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser usada para recrutar Cafl, um componente do complexo CCR4-NOT desadenilase, para o mRNA alvo, resultando em desadenilação ou na transcrição alvo e inibição da tradução de proteína.

[225] Por exemplo, a proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção pode ser usada para aumentar ou diminuir a tradução de proteínas terapeuticamente relevantes. Os exemplos de aplicações terapêuticas em que a proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser usada para regular de forma ascendente ou descendente a tradução são em esclerose lateral amiotrófica (ELA) e distúrbios cardiovasculares. Os níveis reduzidos do transportador glutamato glial EAAT2 foram relatados em córtex motor e medula espinhal da ELA, bem como em múltiplas transcrições anormais de mRNA de EAAT2 no tecido cerebral de ELA. Acredita-se que a perda da proteína e função EAAT2 seja a principal causa de excitotoxicidade em ELA. A restauração de níveis e da função da proteína EAAT2 pode fornecer benefício terapêutico. Por conseguinte, a proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser beneficamente usada para regular de forma ascendente a expressão da proteína EAAT2, por exemplo, mediante o bloqueio de repressores de tradução ou

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133/776 estabilização de mRNA conforme descrito acima. A apolipoproteína Al é o principal componente de proteína da lipoproteína de alta densidade (HDL) e ApoAl e HDL são geralmente consideradas como ateroprotetoras. É previsto que

a proteína	efetora	de	alvej amento	de RNA possa ser
beneficamente	usada	para	regular	de	forma ascendente	a
expressão de	ApoAl,	por	exemplo,	mediante o bloqueio	de

repressores de tradução ou estabilização de mRNA conforme descrito acima.

[226] G) turnover de mRNA [227] A tradução é fortemente acoplada ao turnover de mRNA e à estabilidade regulada de mRNA. Foi descrito que proteínas específicas estão envolvidas na estabilidade de transcrições (como as proteínas ELAV/Hu em neurônios, Keene JD, 1999, Proc Natl Acad Sei USA, 96:5 a 7) e tristetraprolina (TTP). Essas proteínas estabilizam mRNAs alvo mediante a proteção das mensagens da degradação no citoplasma (Peng SS et ai., 1988, EMBO J. 17:3.461 a 3.470).

[228] Pode ser previsto que as proteínas efetoras de alvejamento de RNA da presente invenção possam ser usadas para interferir ou promover a atividade de proteínas que agem para estabilizar transcrições de mRNA, de modo que o turnover de mRNA seja afetado. Por exemplo, o recrutamento de TTP humana para o RNA alvo com o uso da proteína efetora de alvejamento de RNA permitiría a repressão de tradução

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134/776 mediada por elemento rico em adenilato-uridilato (elemento rico em AU) e da degradação de alvo. Os elementos ricos em AU são encontrados na 3'UTR de muitos mRNAs que codificam proto-oncogenes, fatores de transcrição nuclear e citocinas e promovem a estabilidade de RNA. Como um outro exemplo, a proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser fundida a HuR, uma outra proteína de estabilização de mRNA (Hinman MN e Lou H, Cell Mol Life Sci 2008; 65:3.168 a 3.181) e recrutar a mesma para uma transcrição alvo para prolongar sua vida útil ou estabilizar mRNA de vida curta.

[229] É previsto adicionalmente que as proteínas efetoras de alvejamento de RNA aqui descritas possam ser usadas para promover a degradação de transcrições alvo. Por exemplo, a m6A metiltransferase pode ser recrutada para a transcrição alvo, para localizar a transcrição para corpos P, levando à degradação do alvo.

[230] Como ainda outro exemplo, uma proteína efetora de alvejamento de RNA conforme descrito aqui pode ser fundida ao terminal N de domínio de endonuclease não específico PilT (PIN), para recrutá-la para uma transcrição alvo e permitir a degradação do mesmo.

[231] Os pacientes com neuropatia e encefalomielite associada a distúrbio neurológico paraneoplásico (PND) são pacientes que desenvolvem auto-anticorpos contra proteínas Hu em tumores fora do sistema nervoso central (Szabo A et

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135/776 al. 1991, Cell.; 67:325 a 333) que, então, atravessam a barreira sangue-cérebro. Pode ser previsto que as proteínas efetoras de alvejamento de RNA da presente invenção possam ser usadas para interferir com a ligação de auto-anticorpos a transcrições de mRNA.

[232] Os pacientes com distrofia tipo 1 (DM1), causada pela expansão de (CUG)n na 3'UTR do gene de distrofia miotonica-proteína quinase (DMPK), são caracterizados pelo acúmulo de tais transcrições no núcleo. É previsto que as proteínas efetoras de alvejamento de RNA da invenção fundidas com uma endonuclease alvejada para as repetições (CUG)n possam inibir tal acúmulo de transcrições anormais.

[233] H) Interação com proteínas multifuncionais [234] Algumas proteínas de ligação a RNA se ligam a múltiplos sítios em vários RNAs para funcionar em diversos processos. Por exemplo, foi verificado que a proteína hnRNP Al liga sequências silenciadoras de splicing exônico, antagonizando os fatores de splicing, se associa a extremidades de telômero (estimulando assim a atividade de telômero) e liga o miRNA para facilitar o processamento mediado por Drosha, afetando a maturação. É previsto que as proteínas efetoras de ligação a RNA da presente invenção possam interferir com a ligação de proteínas de ligação a RNA em um ou mais locais.

[235] I) Dobramento de RNA

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136/776 [236] 0 RNA adota uma estrutura definida para realizar suas atividades biológicas. As transições na conformação entre estruturas terciárias alternativas são críticas para a maioria dos processos mediados por RNA. Entretanto, o dobramento de RNA pode estar associado a vários problemas. Por exemplo, o RNA pode ter uma tendência a se enovelar e ser mantido em conformações alternativas impróprias e/ou a estrutura terciária correta pode não ser suficientemente favorecida de maneira termodinâmica sobre estruturas alternativas. A proteína efetora de alvejamento de RNA, em particular uma proteína de alvejamento de RNA morto ou deficiente de divagem, da invenção pode ser usada para direcionar o dobramento de (m)RNA e/ou capturar a estrutura terciária correta do mesmo.

Uso de proteína efetora de alvejamento de RNAs na modulação de status celular [237] Em determinadas modalidades, Casl3b em um complexo com crRNA é ativada após mediante a ligação ao RNA alvo e subsequentemente cliva quaisquer alvos de ssRNA próximos (isto é, efeitos colaterais ou espectadores). A Casl3b, uma vez preparada pelo alvo cognato, pode clivar outras moléculas de RNA (não complementares) . Tal divagem promíscua de RNA pode potencialmente causar toxicidade celular ou de outro modo afetar a fisiologia celular ou status celular.

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137/776 [238] Consequentemente, em determinadas modalidades, os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada conforme descrito no presente documento são usados para ou são para uso na indução de dormência celular. Em determinadas modalidades, os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada conforme descrito no presente documento são usados para ou são para uso na indução de parada do ciclo celular. Em determinadas modalidades, os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito aqui, são usados ou são para uso na redução do crescimento celular e/ou proliferação celular. Em determinadas modalidades, os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito aqui, são usadospara ou são para uso na indução de energia celular. Em determinadas modalidades, os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada conforme descrito no presente documento são usados para ou são para uso na indução de apoptose celular. Em determinadas modalidades, os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada conforme descrito no presente documento são usados para ou são para uso na indução de necrose celular. Em determinadas

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138/776 modalidades, os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada conforme descrito no presente documento são usados para ou são para uso na indução de morte celular. Em determinadas modalidades, os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada conforme descrito no presente documento são usados para ou são para uso na indução de morte celular programada.

[239] Em determinadas modalidades, a invenção se refere a um método para indução de dormência celular que compreende introduzir ou induzir os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, a invenção se refere a um método para indução de parada do ciclo celular que compreende introduzir ou induzir os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, a invenção se refere a um método para redução de crescimento celular e/ou proliferação celular que compreende introduzir ou induzir os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, a invenção se refere a um método para indução de energia celular que compreende

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139/776 introduzir ou induzir os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, a invenção se refere a um método para indução de apoptose celular que compreende introduzir ou induzir os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, a invenção se refere a um método para indução de necrose celular que compreende introduzir ou induzir os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, a invenção se refere a um método para indução de morte celular que compreende introduzir ou induzir os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, a invenção se refere a um método para indução de morte celular programada que compreende introduzir ou induzir os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descritos no presente documento.

[240] Os métodos e usos conforme descrito aqui podem ser terapêuticos ou profiláticos e podem alvejar células, (sub)populações de células ou tipos de células/tecidos

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140/776 particulares. Em particular, os métodos e usos conforme descrito aqui podem ser terapêuticos ou profiláticos e podem alvejar células, (sub)populações de células ou tipos de células/tecidos particulares que expressam uma ou mais sequências alvo, como um ou mais RNAs alvo particulares (por exemplo, ss RNA). Sem limitação, as células alvo podem ser, por exemplo, células cancerígenas que expressam uma transcrição particular, por exemplo, neurônios de uma determinada classe, células (imunes) que causam, por exemplo, autoimunidade ou células infectadas por um patógeno específico (por exemplo, viral), etc.

[241] Consequentemente, em determinadas modalidades, a invenção se refere a um método para tratar uma condição patológica caracterizada pela presença de células indesejáveis (células hospedeiras), que compreende introduzir ou induzir os sistemas de entrega, sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito aqui. Em determinadas modalidades, a invenção se refere ao uso dos sistemas de entrega, do sistema de vetor ou da composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito aqui, para tratar uma condição patológica caracterizada pela presença de células indesejáveis (células hospedeiras). Em determinadas modalidades, a invenção se refere aos sistemas de entrega, ao sistema de vetor ou à composição de ocorrência

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141/776 não natural ou manipulada, conforme descrito aqui, para uso no tratamento de uma condição patológica caracterizada pela presença de células indesejáveis (células hospedeiras). Deve ser entendido que preferencialmente o sistema CRISPR-Cas alveja um alvo específico para as células indesejáveis. Em determinadas modalidades, a invenção se refere ao uso dos sistemas de entrega, do sistema de vetor ou da composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito aqui, para tratar, prevenir ou aliviar o câncer. Em determinadas modalidades, a invenção se refere aos sistemas de entrega, ao sistema de vetor ou à composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito aqui, para uso no tratamento, prevenção ou alívio do câncer. Em determinadas modalidades, a invenção se refere a um método para tratar, prevenir ou aliviar o câncer que compreende introduzir ou induzir os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito no presente documento. Deve ser entendido que preferencialmente o sistema CRISPR-Cas alveja um alvo específico para as células cancerígenas. Em determinadas modalidades, a invenção se refere ao uso dos sistemas de entrega, do sistema de vetor ou da composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito aqui, para tratar, prevenir ou aliviar infecção de células por um patógeno. Em determinadas modalidades, a invenção se refere

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142/776 aos sistemas de entrega, ao sistema de vetor ou à composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito aqui, para uso no tratamento, prevenção ou alívio de infecção de células por um patógeno. Em determinadas modalidades, a invenção se refere a um método para tratar, prevenir ou aliviar infecção de células por um patógeno que compreende introduzir ou induzir os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito no presente documento. Deve ser entendido que preferencialmente o sistema CRISPR-Cas alveja um alvo específico para as células infectadas pelo patógeno (por exemplo, um alvo derivado de patógeno) . Em determinadas modalidades, a invenção se refere ao uso dos sistemas de entrega, do sistema de vetor ou da composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito aqui, para tratar, prevenir ou aliviar um distúrbio autoimune. Em determinadas modalidades, a invenção se refere aos sistemas de entrega, ao sistema de vetor ou à composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito aqui, para uso no tratamento, prevenção ou alívio de um distúrbio autoimune. Em determinadas modalidades, a invenção se refere a um método para tratar, prevenir ou aliviar um distúrbio autoimune que compreende introduzir ou induzir os sistemas de entrega, o sistema de vetor ou a composição de ocorrência não natural ou manipulada, conforme descrito no

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143/776 presente documento. Deve ser entendido que preferencialmente o sistema CRISPR-Cas alveja um alvo específico para as células responsáveis pelo distúrbio autoimune (por exemplo, células imunes específicas).

Uso de proteína efetora de alvejamento de RNA na detecção de RNA ou detecção de proteína [242] É previsto adicionalmente que a proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser usada para a detecção de ácidos nucleicos ou proteínas em uma amostra biológica. As amostras podem ser celulares ou isentas de células.

[243] É previsto adicionalmente que a proteína efetora de alvejamento de RNA possa ser usada em ensaios de Northern blot. 0 Northern blot envolve o uso de eletroforese para separar amostras de RNA por tamanho. A proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser usada para ligar e detectar especificamente a sequência de RNA alvo.

[244] Uma proteína efetora de alvejamento de RNA também pode ser fundida a uma proteína fluorescente (como GFP) e usada para rastrear a localização de RNA em células vivas. Mais particularmente, a proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser inativada de modo que não clive mais o RNA. Em modalidades particulares, é previsto que uma proteína efetora de alvejamento de RNA dividida possa ser usada, de modo que o sinal dependa da ligação de ambas as subproteínas, a fim de assegurar uma visualização mais

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144/776 precisa. Alternativamente, pode ser usada uma proteína fluorescente dividida que é reconstituída quando múltiplos complexos de proteínas efetoras de alvejamento de RNA se ligam à transcrição alvo. É previsto adicionalmente que uma transcrição é alvejada em múltiplos sítios de ligação ao longo do mRNA, assim o sinal fluorescente pode amplificar o sinal verdadeiro e permitir a identificação focal. Como ainda outra alternativa, a proteína fluorescente pode ser reconstituída a partir de uma inteína dividida.

[245] As proteínas efetoras de alvejamento de RNA são, por exemplo, usadas adequadamente para determinar a localização do RNA ou variantes de splicing específicas, o nível de transcrição de mRNA, a regulação ascendente ou descendente de transcrições e o diagnóstico específico de doença. As proteínas efetoras de alvejamento de RNA podem ser usadas para visualização de RNA em células (vivas) com o uso, por exemplo, de microscopia fluorescente ou citometria de fluxo, como a classificação celular ativada por fluorescência (FACS), que permite a triagem com alto rendimento de células e a recuperação de células vivas após a classificação celular. Adicionalmente, os níveis de expressão de transcrições diferentes podem ser avaliados simultaneamente sob estresse, por exemplo, inibição de crescimento de câncer com o uso de inibidores moleculares ou condições hipóxicas nas células. Uma outra aplicação seria

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rastrear a	localização de	transcrições	para	conexões
sinápticas durante um estímulo neural com o	uso de
microscopia de dois fótons.
[246]	Em determinadas	modalidades,	os componentes
ou complexos	de acordo com a	invenção, conforme	descrito
aqui, podem	ser usados na	hibridização	in	situ de
fluorescência	robusta com erro	multiplexada	(MERFISH; Chen

et al. Science; 2015; 348(6233)), como, por exemplo, com efetores Casl3b marcados (fluorescentemente).

Marcação de ápice in vitro [247] Os processos celulares dependem de uma rede de interações moleculares entre proteínas, RNA e DNA. A detecção precisa de interações proteína-DNA e proteína-RNA é essencial para entender tais processos. A tecnologia de marcação por proximidade in vitro emprega uma etiqueta de afinidade combinada com, por exemplo, uma sonda fotoativável para marcar polipeptídeos e RNAs nas proximidades de uma proteína ou RNA de interesse in vitro. Após a irradiação com UV, o grupo fotoativável reage com proteínas e outras moléculas que estão próximas à molécula etiquetada, marcando, assim, as mesmas. As moléculas de interação marcadas podem subsequentemente ser recuperadas e identificadas. A proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção pode ser, por exemplo, usada para alvejar uma sonda para uma sequência de RNA selecionada.

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[248]	Essas	aplicações	também	poderíam	ser
aplicadas	em modelos	animais para	imageamento	ín vivo	de
aplicações	relevantes	para doença	ou tipos	de	células	de

difícil cultivo.

[249] A invenção fornece agentes e métodos para diagnosticar e monitorar estados de saúde através de amostragem não invasiva de RNA isento de células, incluindo testes de risco e orientar terapias alvejadas para RNA, e é útil em situações em que a administração rápida da terapia é importante para os resultados do tratamento. Em uma modalidade, a invenção fornece métodos e agentes de detecção de câncer para o RNA tumoral circulante, incluindo o monitoramento de recorrência e/ou desenvolvimento de mutações comuns de resistência a fármaco. Em uma outra modalidade, a invenção fornece métodos e agentes de detecção para detecção e/ou identificação de espécies bacterianas diretamente do sangue ou soro para monitorar, por exemplo, progressão da doença e sepse. Em uma modalidade da invenção, as proteínas e derivados de CaslSb são usados para distinguir e diagnosticar doenças comuns, como rinovírus ou infecções do trato respiratório superior, de infecções mais graves, como bronquite.

[250] A invenção fornece métodos e agentes para genotipagem rápida para farmacogenômica de emergência, incluindo orientação para administração de anticoagulantes

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147/776 durante infarto do miocárdio ou tratamento de acidente vascular cerebral com base, por exemplo, na genotipagem VK0RC1, CYP2C9 e CYP2C19.

[251] A invenção fornece agentes e métodos para monitorar a contaminação de alimentos por bactérias em todos os pontos ao longo de uma cadeia de produção e entrega de alimentos. Em uma outra modalidade, a invenção fornece controle e monitoramento de qualidade, por exemplo, por meio da identificação de fontes de alimentos e determinação da pureza. Em um exemplo não limitador, a invenção pode ser usada para identificar ou confirmar fontes de alimentos, como uma espécie de carne de animal e frutos do mar.

[252] Em uma outra modalidade, a invenção é usada em determinações forenses. Por exemplo, as amostras da cena do crime que contêm sangue ou outros fluidos corporais. Em uma modalidade da invenção, a invenção é usada para identificar amostras de ácido nucleico a partir de impressões digitais.

Uso de proteína efetora de alvejamento de RNA em RNA origami/linhas de montagem in vitro - combinatória [253] RNA origami se refere a estruturas enoveladas em nanoescala para criar estruturas bidimensionais ou tridimensionais com o uso de RNA como modelo integrado. A estrutura enovelada é codificada no RNA e o formato do RNA resultante é, dessa forma, determinado pela sequência de RNA

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148/776 sintetizada (Geary, et al. 2014. Science, 345 (6.198), páginas 799 a 804). O RNA origami pode agir como arcabouço para dispor outros componentes, como proteínas, em complexos. A proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção pode ser, por exemplo, usada para alvejar proteínas de interesse para o RNA origami com o uso de um RNA guia adequado.

Uso de proteína efetora de alvejamento de RNA no isolamento ou purificação, enriquecimento ou depleção de RNA [254] É previsto adicionalmente que a proteína efetora de alvejamento de RNA quando complexada em RNA pode ser usada para isolar e/ou purificar o RNA. A proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser, por exemplo, fundida a uma etiqueta de afinidade que pode ser usada para isolar e/ou purificar o complexo de proteína efetora de alvejamento de RNA-RNA. Tais aplicações são, por exemplo, úteis na análise de perfis de expressão de gene nas células. Em modalidades particulares, pode ser previsto que as proteínas efetoras de alvejamento de RNA podem ser usadas para alvejar um RNA de não codificação específico (ncRNA), bloqueando assim sua atividade, fornecendo uma sonda funcional útil. Em determinadas modalidades, a proteína efetora, conforme descrito no presente documento, pode ser usada para enriquecer especificamente um RNA particular (incluindo, porém sem limitação, aumentar a estabilidade, etc.) ou,

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149/776 alternativamente, para esgotar especificamente um RNA particular (como, sem limitação, por exemplo, variantes de splicing particulares, isoformas etc.).

Interrogatório de função de lincRNA e outros RNAs nucleares [255] As estratégias atuais de knockdown de RNA, como o siRNA, têm a desvantagem de serem limitadas principalmente ao alvejamento de transcrições transcritos citosólicas, uma vez que o mecanismo de proteína é citosólico. A vantagem de uma proteína efetora de alvejamento de RNA da presente invenção, um sistema exógeno que não é essencial para a função celular, é que pode ser usada em qualquer compartimento na célula. Mediante a fusão de um sinal NLS à proteína efetora de alvejamento de RNA, pode ser guiado para o núcleo, permitindo que os RNAs nucleares sejam alvejados. Por exemplo, é previsto investigar a função de lincRNAs. Os RNAs de não codificação intergênicos longos (lincRNAs) são uma área de pesquisa muito pouco explorada.

A maioria dos lincRNAs tem ainda funções desconhecidas que poderíam ser estudas com o uso da proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção.

Identificação de proteínas de ligação de RNA [256] A identificação de proteínas ligadas a RNAs específicos pode ser útil para entender os papéis de muitos RNAs. Por exemplo, muitos lincRNAs se associam a reguladores

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150/776 transcricionais e epigenéticos para controlar a transcrição. O entendimento de quais proteínas se ligam a um determinado lincRNA pode ajudar a elucidar os componentes em uma determinada via regulatória. Uma proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção pode ser projetada para recrutar uma biotina ligase para uma transcrição específica, a fim de marcar proteínas localmente ligadas com biotina. As proteínas podem ser, então, retidas e analisadas por espectrometria de massa para identificar as mesmas.

Montagem de complexos em transporte de RNA e substrato [257] As proteínas efetoras de alvejamento de RNA da invenção podem ser adicionalmente usadas para montar complexos em RNA. Isso pode ser obtido funcionalizando a proteína efetora de alvejamento de RNA com múltiplas proteínas relacionadas (por exemplo, componentes de uma via de síntese particular). Alternativamente, múltiplas proteínas efetoras de alvejamento de RNA podem ser funcionalizadas com tais proteínas relacionadas diferentes e alvejadas para o mesmo ou para o RNA alvo adjacente. A aplicação útil de montagem de complexos em RNA está, por exemplo, facilitando o transporte de substrato entre proteínas.

Biologia sintética [258] O desenvolvimento de sistemas biológicos tem uma grande utilidade, inclusive em aplicações clínicas. É

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151/776 previsto que as proteínas efetoras de alvejamento de RNA programáveis da invenção podem ser usadas fundidas a proteínas divididas de domínios tóxicos para morte celular alvejada, por exemplo, com o uso de RNA ligado ao câncer como transcrição alvo. Adicionalmente, as vias que envolvem interação proteína-proteína podem ser influenciadas em sistemas biológicos sintéticos com, por exemplo, complexos de fusão com os efetores adequados, como quinases ou outras enzimas.

Splicing de proteína: inteínas [259] 0 splicing de proteína é um processo póstradução no qual um polipeptídeo interveniente, mencionado como uma inteína, catalisa sua própria excisão dos polipeptídeos que flanqueiam o mesmo, mencionados como exteínas, bem como a ligação subsequente das exteínas. A montagem de duas ou mais proteínas efetoras de alvejamento de RNA, conforme descrito aqui, em uma transcrição alvo, pode ser usada para direcionar a liberação de uma inteína dividida (Topilina e Mills Mob DNA. 4 de fevereiro de 2014; 5(1):5), permitindo assim a computação direta da existência de uma transcrição de mRNA e a liberação subsequente de um produto de proteína, como uma enzima metabólica ou um fator de transcrição (para atuação a jusante das vias de transcrição). Essa aplicação pode ter relevância significativa em biologia sintética (consultar acima) ou

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152/776 bioprodução em grande escala (produção apenas de produto sob determinadas condições).

Sistemas induziveis, dosados e autoinativadores [260] Em uma modalidade, os complexos de fusão que compreendem uma proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção e um componente efetor são projetados para serem induziveis, por exemplo, induziveis por luz ou induziveis quimicamente. Tal indutibilidade permite a ativação do componente efetor em um momento desejado no tempo.

[261] A indutibilidade por luz é alcançada, por exemplo, mediante o projeto de um complexo de fusão em que o emparelhamento CRY2PHR/CIBN é usado para fusão. Esse sistema é particularmente útil para indução por luz de interações proteicas em células vivas (Konermann S, et ai. Nature. 2013;500:472 a 476) .

[262] A indutibilidade química é, por exemplo, fornecida por meio do projeto de um complexo de fusão em que o emparelhamento de FKBP/FRB (proteína de ligação a FK506 / ligação a rapamicina FKBP) é usado para fusão. Com o uso desse sistema, a rapamicina é necessária para a ligação de proteínas (Zetsche et al. Nat Biotechnol. 2015;33(2):139 a 142 descrevem o uso desse sistema para Cas9).

[263] Adicionalmente, quando introduzida na célula como DNA, a proteína efetora de alvejamento de RNA das invenções pode ser modulada por promotores induziveis, como

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153/776 ativação transcricional controlada por tetraciclina ou doxiciclina (sistema de expressão Tet-On e Tet-Off), sistema de expressão de gene induzivel por hormônio como, por exemplo, um sistema de expressão de gene induzivel por ecdisona e um sistema de expressão de gene induzivel por arabinose. Quando entregue como RNA, a expressão da proteína efetora de alvejamento de RNA pode ser modulada através de um ribocomutador, que pode detectar uma molécula pequena como a tetraciclina (conforme descrito em Goldfless et ai. Nucleic Acids Res. 2012;40(9):e64).

[264] Em uma modalidade, a entrega da proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção pode ser modulada para alterar a quantidade de proteína ou crRNA na célula, alterando assim a magnitude do efeito desejado ou quaisquer efeitos fora do alvo indesejados.

[265] Em uma modalidade, as proteínas efetoras de alvejamento de RNA descritas no presente documento podem ser projetadas para serem autoinativadoras. Quando entregue a uma célula como RNA, mRNA ou um agente terapêutico de RNA de replicação (Wrobleska et al. Nat Biotechnol. Agosto de 2015; 33(8): 839 a 841), podem autoinativar a expressão e efeitos subsequentes mediante a destruição do próprio RNA, reduzindo assim a residência e efeitos indesejáveis potenciais.

[266] Para aplicações ín vivo adicionais de proteínas efetoras de alvejamento de RNA conforme descrito

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154/776 aqui, é feita referência a Mackay JP et al. (Nat Struct Mol Biol. Março de 2011; 18(3) : 256 a 261), Nelles et ai (Bioessays. Julho de 2015;37(7):732 a 739) e Abil Z e Zhao H (Mol Biosyst. Outubro de 2015;11(10):2.658 a 2.665), que estão incorporados aqui por referência. Em particular, as seguintes aplicações são previstas em determinadas modalidades da invenção, preferencialmente em determinadas modalidades com o uso de Casl3b cataliticamente inativo: intensificação de tradução (por exemplo, Casl3b - fusões do fator de promoção da tradução (por exemplo, fusões eIF4)); repressão de tradução (por exemplo, sítios de ligação de ribossoma de alvejamento de gRNA) ; salto de éxon (por exemplo, gRNA que alveja sítios doadores e/ou aceitadores de splicing); inclusão de éxon (por exemplo, gRNA que alveja um sítio doador e/ou aceitador de splicing de éxon particular a ser incluído ou Casl3b fundida a ou recrutando componentes de spliceossoma (por exemplo, UI snRNA)); acesso à localização de RNA (por exemplo, fusões de marcador-Casl3b (por exemplo, fusões de EGFP)); alteração de localização de RNA (por exemplo, fusões de sinal de Iocalização-Casl3b (por exemplo, fusões NLS ou NES)); degradação de RNA (nesse caso, nenhuma Casl3b cataliticamente inativa deve ser usado se depender da atividade de Casl3b, alternativamente e, para especificidade aumentada, uma Casl3b dividida pode ser usada) ; inibição da função de RNA de não codificação (por

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155/776 exemplo, miRNA), como por meio da degradação ou ligação de gRNA a sítios funcionais (possivelmente com a titulação em sítios específicos por relocalização por fusões de sequência de sinal Casl3b).

[267] A função Casl3b é robusta para as extensões 5' ou 3' do crRNA e para a extensão da alça de crRNA. Portanto, é previsto que as alças MS2 e outros domínios de recrutamento podem ser adicionados ao crRNA sem afetar a formação de complexo e a ligação a transcrições alvo. Tais modificações no crRNA para recrutamento de vários domínios efetores são aplicáveis nos usos de proteínas efetoras de alvejamento de RNA descritas acima.

[268] Casl3b tem capacidade para mediar a resistência a fagos de RNA. Portanto, é previsto que Casl3b pode ser usada para imunizar, por exemplo, animais, seres humanos e plantas, contra patógenos apenas de RNA, incluindo, porém sem limitação, retrovirus (por exemplo, lentivírus, como HIV), HCV, vírus Ebola e vírus Zika.

[269] Em determinadas modalidades, Casl3b pode processar (clivar) sua própria matriz. Isso se aplica tanto à proteína Casl3b de tipo selvagem quanto à proteína Casl3b mutante que contém um ou mais resíduos de aminoácidos mutantes, conforme aqui discutido. Portanto, é previsto que múltiplos crRNAs projetados para diferentes transcrições alvo e/ou aplicações podem ser entregues como um único pré

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156/776 crRNA ou como uma única transcrição conduzida por um promotor. Tal método de entrega tem as vantagens de ser substancialmente mais compacto, mais fácil de sintetizar e mais fácil de entregar em sistemas virais. Será entendido que as posições exatas de aminoácidos podem variar para ortólogos de uma CaslSb no presente documento e podem ser adequadamente determinadas pelo alinhamento de proteínas, como é conhecido na técnica, e conforme descrito no presente documento em outro lugar. Os aspectos da invenção também abrangem métodos e usos das composições e sistemas descritos no presente documento em engenharia de genoma, por exemplo, para alterar ou manipular a expressão de um ou mais genes ou do um ou mais produtos de gene, em células procarióticas ou eucarióticas, in vitro, in vivo ou ex vivo.

[270] Os aspectos da invenção também abrangem métodos e usos das composições e sistemas descritos no presente documento em engenharia de genoma ou transcriptoma, por exemplo, para alterar ou manipular a expressão (proteína) de um ou mais genes ou do um ou mais produtos de gene, em células procarióticas ou eucarióticas, in vitro, in vivo ou ex vi vo.

[271] Em um aspecto, a invenção fornece métodos e composições para modular, por exemplo, reduzir a expressão (proteína) de um RNA alvo nas células. Nos métodos em questão, é fornecido um sistema Casl3b da invenção que

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157/776 interfere com a transcrição, estabilidade e/ou tradução de um RNA.

[272] Em determinadas modalidades, uma quantidade eficaz de sistema Casl3b é usada para clivar o RNA ou de outro modo inibir a expressão de RNA. Nesse sentido, o sistema tem usos similares ao siRNA e shRNA, dessa forma, também pode ser substituído por tais métodos. 0 método inclui, sem limitação, o uso de um sistema Casl3b como um substituto para, por exemplo, um ácido ribonucleico interferente (como um siRNA ou shRNA) ou um modelo de transcrição do mesmo, por exemplo, um DNA que codifica um shRNA. 0 sistema Casl3b é introduzido em uma célula alvo, por exemplo, sendo administrado a um mamífero que inclui a célula alvo.

[273] Vantajosamente, um sistema Casl3b da invenção é específico. Por exemplo, enquanto os sistemas de polinucleotídico de ácido ribonucleico interferentes (como um siRNA ou shRNA) são afetados por problemas de projeto e estabilidade e ligação fora do alvo, um sistema Casl3b da invenção pode ser projetado com alta especificidade.

Casl3b desestabilizado [274] Em determinadas modalidades, a proteína efetora (enzima CRISPR; Casl3b) de acordo com a invenção, conforme descrito aqui, está associada ou fundida a um domínio de desestabilização (DD). Em algumas modalidades, o

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DD é ER50. Um ligante estabilizante correspondente para esse DD é, em algumas modalidades, 4HT. Como tal, em algumas modalidades, um do pelo menos um DD é ER50 e um ligante estabilizante para o mesmo é 4HT ou CMP8. Em algumas modalidades, o DD é DHFR50. Um ligante estabilizante correspondente para esse DD é, em algumas modalidades, TMP. Como tal, em algumas modalidades, um do pelo menos um DD é DHFR50 e um ligante estabilizante é TMP. Em algumas modalidades, o DD é ER50. Um ligante estabilizante correspondente para esse DD é, em algumas modalidades, CMP8. 0 CMP8 pode, portanto, ser um ligante estabilizante alternativo ao 4HT no sistema ER50. Embora seja possível que o CMP8 e ο 4HT possam/devam ser usados em questões competitivas, alguns tipos de células podem ser mais suscetíveis a um ou outro desses dois ligantes e, a partir desta revelação e do conhecimento na técnica, o versado na técnica pode usar CMP8 e/ou 4HT.

[275] Em algumas modalidades, um ou dois DDs podem ser fundidos à extremidade N-terminal da enzima CRISPR com um ou dois DDs fundidos à extremidade C-terminal da enzima CRISPR. Em algumas modalidades, os pelo menos dois DDs estão associados à enzima CRISPR e os DDs são os mesmos DDs, isto é, os DDs são homólogos. Dessa forma, ambos (ou dois ou mais) dos DDs podem ser DDs ER50. Isso é preferencial em algumas modalidades. Como alternativa, ambos (ou dois ou mais) dos

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DDs poderíam ser DDs DHFR50. Isso também é preferencial em algumas modalidades. Em algumas modalidades, os pelo menos dois DDs estão associados à enzima CRISPR e os DDs são DDs diferentes, isto é, os DDs são heterólogos. Dessa forma, um dos DDS pode ser ER50, enquanto um ou mais DDs ou quaisquer outros DDs podem ser DHFR50. 0 fato de ter dois ou mais DDs que são heterólogos pode ser vantajoso, à medida que fornece um nível maior de controle de degradação. Uma fusão em tandem de mais de um DD no termo N ou C pode intensificar a degradação; e tal fusão em tandem pode ser, por exemplo, ER50-ER50-Casl3b ou DHFR-DHFR-Cas13b. É previsto que altos níveis de degradação ocorreríam na ausência de qualquer ligante estabilizante, níveis intermediários de degradação ocorreríam na ausência de um ligante estabilizante e na presença do outro (ou um outro) ligante estabilizante, enquanto níveis baixos de degradação ocorreríam na presença de ambos (ou dois ou mais) dentre os ligantes estabilizantes. 0 controle também pode ser conferido com um DD ER50 Nterminal e um DD DHFR50 DD C-terminal.

[276] Em algumas modalidades, a fusão da enzima CRISPR com o DD compreende um ligante entre o DD e a enzima CRISPR. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante GlySer. Em algumas modalidades, a enzima DD-CRISPR compreende adicionalmente pelo menos um sinal de exportação nuclear (NES). Em algumas modalidades, a enzima DD-CRISPR

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160/776 compreende dois ou mais NESs. Em algumas modalidades, a enzima DD-CRISPR compreende pelo menos um sinal de localização nuclear (NLS). Isso pode ser adicionalmente a um NES. Em algumas modalidades, a enzima CRISPR compreende ou consiste essencialmente em ou consiste em um sinal de localização (importação ou exportação nuclear) como, ou como parte de, o ligante entre a enzima CRISPR e o DD. As etiquetas HA ou Flag também estão dentro do âmbito da invenção como ligantes. Os requerentes usam NLS e/ou NES como ligante e também usam ligantes de glicina serina tão curtos quanto GS até (GGGGS)₃.

[277] Os domínios desestabilizantes têm utilidade geral para conferir instabilidade a uma ampla gama de proteínas; consultar, por exemplo, Miyazaki, J Am Chem Soc. 7 de março de 2012; 134(9): 3.942 a 3.945, incorporado ao presente documento a título de referência. CMP8 ou 4hidroxitamoxifeno podem ser domínios desestabilizantes. De maneira mais geral, um mutante sensível à temperatura de DHFR de mamífero (DHFRts), um resíduo desestabilizante pela regra N-extremidade, mostrou-se estável a uma temperatura permissiva, mas instável a 37 °C. A adição de metotrexato, um ligando de alta afinidade para DHFR de mamífero, a células que expressam DHFRts inibiu parcialmente a degradação de proteína. Isso foi uma demonstração importante de que um ligando de molécula pequena pode estabilizar uma proteína de

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161/776 outro modo alvejada para a degradação em células. Um derivado de rapamicina foi usado para estabilizar um mutante instável do domínio FRB de mTOR (FRB*) e restaurar a função da quinase fundida, GSK-3p.6,7. Esse sistema demonstrou que a estabilidade dependente de ligando representou uma estratégia atraente para regular a função de uma proteína específica em um ambiente biológico complexo. Um sistema para controlar a atividade de proteína pode envolver o DD que se torna funcional quando a complementação da ubiquitina ocorre por meio de dimerização induzida por rapamicina da proteína de ligação de FK506 e FKBP12. Os mutantes da proteína FKBP12 ou ecDHFR humana podem ser modificados para serem metabolicamente instáveis na ausência de seus ligantes de alta afinidade, Shield-1 ou trimetoprina (TMP), respectivamente. Esses mutantes são alguns dos possíveis domínios desestabilizantes (DDs) úteis na prática da invenção e a instabilidade de um DD como uma fusão com uma enzima CRISPR confere à degradação de proteína CRISPR de toda a proteína de fusão pelo proteassoma. Shield-1 e TMP se ligam e estabilizam o DD de maneira dependente de dose. 0 domínio de ligação de ligando de receptor de estrogênio (ERLBD, resíduos 305 a 549 de ERS1) também pode ser manipulado como um domínio desestabilizante. Uma vez que a via de sinalização de receptor de estrogênio está envolvida em uma variedade de doenças como câncer de mama, a via foi

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162/776 amplamente estudada e numerosos agonistas e antagonistas de receptor de estrogênio foram desenvolvidos. Dessa forma, são conhecidos pares compatíveis de ERLBD e fármacos. Existem ligantes que se ligam a formas mutantes, mas não do tipo selvagem, do ERLBD. Com o uso de um desses domínios mutantes que codificam três mutações (L384M, M421G, G521R), é possível regular a estabilidade de um DD derivado de ERLBD com o uso de um ligando que não perturba redes sensíveis ao estrogênio endógeno. Uma mutação adicional (Y537S) pode ser introduzida para desestabilizar adicionalmente o ERLBD e configurá-lo como um candidato de DD potencial. Esse tetra-mutante é um desenvolvimento de DD vantajoso. 0 ERLBD mutante pode ser fundido a uma enzima CRISPR e sua estabilidade pode ser regulada ou perturbada com o uso de um ligando, pelo qual a enzima CRISPR tem um DD. Um outro DD pode ser uma etiqueta de 12 kDa (107 aminoácidos) com base em uma proteína FKBP mutante, estabilizada pelo ligando Shieldl; consultar, por exemplo, Nature Methods 5, (2008) . Por exemplo, um DD pode ser uma proteína de ligação FK506 modificada 12 (FKBP12) que se liga e é reversivelmente estabilizada por uma molécula pequena sintética, biologicamente inerte, Shield-1; consultar, por exemplo, Banaszynski LA, Chen LC, MaynardSmith LA, Ooi AG, Wandless TJ. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 2006;126:995 a 1.004;

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Banaszynski LA, Sellmyer MA, Contag CH, Wandless TJ, Thorne SH. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nat Medição 2008;14:1.123 a 1.127; MaynardSmith LA, Chen LC, Banaszynski LA, Ooi AG, Wandless TJ. A directed approach for engineering conditional protein stability using biologically silent small molecules. The Journal of biological chemistry. 2007;282:24.866 a 24.872; e Rodríguez, Chem Biol. 23 de março de 2012; 19(3) : 391 a 398 - todos os quais estão incorporados aqui por referência e podem ser empregados na prática da invenção em um DD selecionado para associar a uma enzima CRISPR na prática desta invenção. Como pode ser visto, o conhecimento na técnica inclui um número de DDs, e o DD pode ser associado a, por exemplo, fundido, vantajosamente com um ligante, a uma enzima CRISPR, pela qual o DD pode ser estabilizado na presença de um ligando e quando existe a ausência do mesmo, o DD pode ficar desestabilizado, de modo que a enzima CRISPR é totalmente desestabilizada, ou o DD pode ser estabilizado na ausência de um ligando e quando o ligando está presente, o DD pode ficar desestabilizado; o DD permite que a enzima CRISPR e, por conseguinte, o sistema ou complexo CRISPR-Cas sejam regulados ou controlados - ativados ou desativados, por assim dizer, para fornecer meios para regulação ou controle do sistema, por exemplo, em um ambiente in vivo ou in vitro. Por exemplo, quando uma proteína de interesse é

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164/776 expressa como uma fusão com a etiqueta de DD, é desestabilizada e rapidamente degradada na célula, por exemplo, por proteassomas. Dessa forma, a ausência de ligante estabilizante leva a uma Cas associada a D sendo degradada. Quando um novo DD é fundido a uma proteína de interesse, sua instabilidade é conferida à proteína de interesse, resultando na degradação rápida de toda a proteína de fusão. 0 pico de atividade para Cas é às vezes benéfico para reduzir os efeitos fora do alvo. Dessa forma, intermitências curtas de alta atividade são preferenciais. A presente invenção tem capacidade para fornecer tais picos. Em alguns sentidos, o sistema é induzível. @@@@Em alguns outros sentidos, o sistema é reprimido na ausência de ligante estabilizante e não reprimido na presença de ligante estabilizante.

Aplicação de sistema CRISPR de alvejamento de RNA em plantas e levedura

Definições:

[278] Em geral, o termo planta se refere a qualquer organismo fotossintético, eucariótico, unicelular ou multicelular do reino Plantae que cresce caracteristicamente por divisão celular, que contém cloroplastos e que tem paredes celulares compreendidas de celulose. 0 termo planta abrange plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Especificamente, as plantas são destinadas a compreender, sem limitação, plantas de angiosperma e

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165/776 gimnosperma, como acácia, alfafa, amaranto, maçã, damasco, alcachofra, freixo, aspargo, abacate, banana, cevada, feijão, beterraba, bétula, faia, amora, mirtilo, brócolis, couve de Bruxelas, couve, canola, melão, cenoura, mandioca, couve-flor, cedro, um cereal, aipo, castanha, cereja, couve chinesa, cítricos, Clementina, trevo, café, milho, algodão, feijão-caupi, pepino, cipreste, berinjela, olmo, endívia, eucalipto, erva-doce, figos, abeto, gerânio, uva, toranja, amendoim, cereja molda, cicuta de goma, nogueira, couve, kiwi, couve-rábano, lariço, alface, alho-poró, limão, lima, locusta, pinho, maidenhair, milho, manga, bordo, melão, milho, cogumelo, mostarda, nozes, carvalho, aveia, óleo de palma, quiabo, cebola, laranja, uma planta ornamental ou flor ou árvore, mamão, palmeira, salsa, pastinaga, ervilha, pêssego, amendoim, pera, turfa, pimenta, caqui, ervilha de pombo, pinho, abacaxi, banana, ameixa, romã, batata, abóbora, radicchio, rabanete, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, açafrão, salgueiro, soja, espinafre, abeto, abóbora, morango, beterraba sacarina, cana de açúcar, girassol, batata doce, milho doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, árvores, triticale, gramados, nabos, videira, nozes, agrião, melancia, trigo, inhame, teixo e abobrinha. 0 termo planta também abrange algas, que são principalmente fotoautotróficas unificadas principalmente por sua falta de raízes, folhas e outros órgãos que caracterizam plantas

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166/776 superiores .

[279] Os métodos para modular a expressão de gene com o uso do sistema de alvejamento de RNA, conforme descrito aqui, podem ser usados para conferir traços desejados em essencialmente qualquer planta. Uma ampla variedade de plantas e sistemas de célula vegetal pode ser geneticamente modificada para as características fisiológicas e agronômicas desejadas descritas no presente documento com o uso dos construtos de ácido nucléico da presente revelação e os vários métodos de transformação mencionados acima. Nas modalidades preferenciais, as plantas e as células vegetais alvo para modificação genética incluem, porém sem limitação, aquelas plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, tais como culturas, incluindo culturas de grãos (por exemplo, trigo, milho, arroz, milheto, cevada), culturas frutíferas (por exemplo, tomate, maçã, pera, morango, laranja), culturas forrageiras (por exemplo, alfafa), culturas de vegetais de raiz (por exemplo, cenoura, batata, beterrabas sacarinas, inhame), culturas de vegetais folhosos (por exemplo, alface, espinafre); plantas floridas (por exemplo, petúnia, rosa, crisântemo), coníferas e pinheiros (por exemplo, pinheiro, abato, beto vermelho), plantas usadas em fitorremediação (por exemplo, plantas que acumulam metal pesado); culturas oleosas (por exemplo, girassol, semente de colza) e plantas usadas para propósitos experimentais (por exemplo,

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Arabidopsis) . Assim, os métodos e sistemas de CRISPR-Cas podem ser usados ao longo de uma ampla gama de plantas, tais como, por exemplo, com plantas dicotiledôneas que pertencem às ordens Magniolales, Illiciales, Laurales, Piperales, Aristochiales, Nymphaeales, Ranunculales, Papeverales, Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Leitneriales, Myricales, Fagales, Casuarinales, Caryophyllales, Batales, Polygonales, Plumbaginales, Dilleniales, Theales, Malvales, Urticales, Lecythidales, Violales, Salicales, Capparales, Ericales, Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales, Podostemales, Haloragales, Myrtales, Cornales, Proteales, San tales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiales, Rhamnales, Sapindales, Juglandales, Geraniales, Polygalales, Umbellales, Gentianales, Polemoniales, Lamiales, Plantaginales, Scrophulariales, Campanulales, Rubiales, Dipsacales e Asterales; os métodos e sistemas de CRISPR-Cas podem ser usados com plantas monocotiledôneas, tais como aquelas que pertencem às ordens Alismatales, Hydrocharitales, Najadales, Triuridales, Commelinales, Eriocaulales, Restionales, Poales, Juncales, Cyperales, Typhales, Bromeliales, Zingiberales, Arecales, Cyclanthales, Pandanales, Arales, Lilliales e Orchid ales, ou com plantas que pertencem à Gymnospermae, por exemplo, aquelas que pertencem às ordens Pinales, Ginkgoales, Cycadales,

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Araucariales, Cupressales e Gnetales.

[280] Os sistemas CRISPR de alvejamento de RNA e métodos de uso descritos no presente documento podem ser usados em uma ampla gama de espécies de plantas, incluídas na lista não limitante dos gêneros dicot, monocot ou gimnospermas abaixo: Atropa, Alseodaphne , Anacardium, Arachis , Beilschmiedia, Brassica, Carthamus, Cocculus, Croton, Cucumis, Citrus, Citrullus, Capsicum, Catharanthus, Cocos, Coffea, Cucurbita, Daucus, Duguetia, Eschscholzia, Ficus, Fragaria, Glaucium, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hyoscyamus, Lactuca, Landolphia, Linum, Litsea, Lycopersicon, Lupinus, Manihot, Majorana, Malus, Medicago, Nicotiana, Olea, Parthenium, Papaver, Persea, Phaseolus, Pistacia, Pisum, Pyrus, Primus, Raphanus, Ricinus, Senecio, Sinomenium, Stephania, Sinapis, Solanum, Theobroma, Tri folium, Trigonella, Vicia, Vinca, Vilis, e Vigna; e the genera Allium, Andropogon, Aragrostis, Asparagus, Avena, Cynodon, Elaeis, Festuca, Festulolium, Heterocallis, Hordeum, Lemna, Lolium, Musa, Oryza, Panicum, Pannesetum, Phleum, Poa, Secale, Sorghum, Triticum, Zea, Abies, Cunninghamia, Ephedra, Picea, Pinus e Pseudotsuga.

[281] Os sistemas CRISPR de alvejamento de RNA e métodos de uso também pode ser usado em uma ampla gama de algas ou células de algas; incluindo, por exemplo, algas selecionadas a partir de vários filos eucarióticos,

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169/776 incluindo Rhodophyta (algas vermelhas) , Chlorophyta (algas verdes), Phaeophyta (algas marrons), Bacillariophyta (diatomáceas), Eustigmatophyta e dinoflagelados, bem como o filo procariótico Cyanobacteria (algas verde-azuladas). 0 termo algas inclui, por exemplo, algas selecionadas a partir de: Amphora, Anabaena, Anikstrodesmis, Botryococcus, Chaetoceros, Chlamydomonas_r Chlorella_r Chlorococcum_r Cyclotella, Cylíndrotheca_r Dunaliella, Emiliana, Euglena, Hematococcus_r Isochrysis_r Monochrysís_r Monoraphidium, Nannochloris, Nannnochloropsis, Navicula , Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Nodularia, Nostoc, Oochromonas_r Oocystís, Oscillartoria, Pavlova , Phaeodactylum, Playtmonas, Pleurochrysís_r Porhyra, Pseudoanabaena, Pyramimonas, Stichococcus, Synechococcus, Synechocystis, Tetraselmis, Thalassíosíra e Tríchodesmíum.

[282] Uma parte de uma planta, isto é, um tecido vegetal pode ser tratada de acordo com os métodos da presente invenção para produzir uma planta aperfeiçoada. 0 tecido vegetal também abrange células vegetais. 0 termo célula vegetal, conforme usado aqui, se refere a unidades individuais de uma planta viva, em uma planta inteira intacta ou em uma forma isolada cultivada em culturas de tecidos ín vitro, em meio ou ágar, em suspensão em um meio de crescimento ou tampão ou como uma parte de unidades organizadas superiores, como, por exemplo, tecido vegetal,

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170/776 um órgão vegetal ou uma planta inteira.

[283] Um protoplasto se refere a uma célula vegetal que teve sua parede celular protetora completa ou parcialmente removida com o uso, por exemplo, de meios mecânicos ou enzimáticos, resultando em uma unidade competente bioquímica intacta da planta viva que pode reformar sua parede celular, proliferar e regenerar o crescimento em uma planta inteira sob condições de crescimento adequadas.

[284] O termo transformação se refere amplamente ao processo pelo qual um hospedeiro de planta é geneticamente modificado pela introdução de DNA por meio de Agrobactería ou um de uma variedade de métodos químicos ou físicos. Como usado aqui, o termo hospedeiro de planta se refere a plantas, incluindo quaisquer células, tecidos, órgãos ou progênie das plantas. Muitos tecidos ou células vegetais adequadas podem ser transformados e incluem, porém sem limitação, protoplastos, embriões somáticos, pólen, folhas, mudas, caules, calos, estolões, microtubos e brotos. Um tecido vegetal também se refere a qualquer clone de tal planta, semente, progênie, propágulo, seja gerado sexualmente ou assexuadamente, e descendentes de qualquer um dos mesmos, como estacas ou sementes.

[285] O termo transformado como usado aqui, se refere a uma célula, tecido, órgão ou organismo em que uma

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171/776 molécula de DNA estranha, como um construto, foi introduzida.

A molécula de DNA introduzida pode ser integrada ao DNA genômico da célula, tecido, órgão ou organismo receptor, de modo que a molécula de DNA introduzida seja transmitida à progênie subsequente. Nessas modalidades, a célula ou planta transformada ou transgênica também pode incluir a progênie da célula ou planta e a progênie produzida a partir de um programa de melhoramento que emprega uma planta transformada como uma progenitora em um cruzamento e que exibe um fenótipo alterado que resulta da presença da molécula de DNA introduzida. De preferência, a planta transgênica é fértil e tem capacidade para transmitir o DNA introduzido à progênie através de reprodução sexual.

[286] 0 termo progênie, como a progênie de uma planta transgênica, é aquele nascido, gerado por ou derivado de uma planta ou da planta transgênica. A molécula de DNA introduzida também pode ser transitoriamente introduzida na célula receptora, de modo que a molécula de DNA introduzida não seja herdada pela progênie subsequente e, dessa forma, não seja considerada transgênica. Consequentemente, como usado aqui, uma planta ou célula vegetal não transgênica é uma planta que não contém um DNA estranho integrado de maneira estável em seu genoma.

[287] 0 termo promotor de planta, como usado aqui, é um promotor com capacidade para iniciar a transcrição em

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172/776 células vegetais, independentemente de sua origem ser uma célula vegetal. Os exemplos de promotores de plantas adequados incluem, porém sem limitação, aqueles que são obtidos a partir de plantas, vírus de planta e bactérias como Agrobacterium ou Rhizobium, que compreendem genes expressos em células vegetais.

[288] Como usado aqui, uma célula fúngica se refere a qualquer tipo de célula eucariótica dentro do reino dos fungos. Os filos no reino dos fungos incluem Ascomycota, Basidiomycota, Blastocladiomycota, Chytridiomycota, Glomeromycota, Microsporidia e Neocallimastigomycota. As células fúngicas podem incluir leveduras, bolores e fungos filamentosos. Em algumas modalidades, a célula fúngica é uma célula de levedura.

[289] Como usado aqui, o termo célula de levedura se refere a qualquer célula fúngica dentro dos filos Ascomycota e Basidiomycota. As células de levedura podem incluir células de levedura que brotam, células de levedura de fissão e células de bolor. Sem se limitar a esses organismos, muitos tipos de leveduras usadas em ambientes industriais e de laboratório fazem parte do filo Ascomycota. Em algumas modalidades, a célula de levedura é uma célula de S. cerervisiae, Kluyveromyces marxianus ou Issatchenkia orientalis. Outras células de levedura podem incluir, sem limitação, Candida spp. (por exemplo, Candida albicans),

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Yarrowia spp. (por exemplo, Yarrowia lipolytica) , Pichia spp. (por exemplo, Pichia pastoris), Kluyveromyces spp. (por exemplo, Kluyveromyces lactis e Kluyveromyces marxianus), Neurospora spp. (por exemplo, Neurospora crassa), Fusarium spp. (por exemplo, Fusarium oxysporum) e Issatchenkia spp. (por exemplo, Issatchenkia orientalis, também conhecida como Pichia kudriavzevii e Candida acidothermophilum) . Em algumas modalidades, a célula fúngica é uma célula fúngica filamentosa. Como usado aqui, o termo célula fúngica filamentosa se refere a qualquer tipo de célula fúngica que cresce em filamentos, isto é, hifas ou micélios. Os exemplos de células fúngicas filamentosas podem incluir, sem limitação, Aspergillus spp. (por exemplo, Aspergillus niger), Trichoderma spp. (por exemplo, Trichoderma reesei), Rhizopus spp. (por exemplo, Rhizopus oryzae) e Mortierella spp. (por exemplo, Mortierella isabellina).

[290] Em algumas modalidades, a célula fúngica é uma cepa industrial. Como usado aqui, cepa industrial se refere a qualquer cepa de célula fúngica usada ou isolada a partir de um processo industrial, por exemplo, produção de um produto em escala comercial ou industrial. A cepa industrial pode se referir a uma espécie fúngica que é tipicamente usada em um processo industrial ou pode se referir a um isolado de uma espécie fúngica que também pode ser usada para fins não industriais (por exemplo, pesquisa

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174/776 de laboratório). Os exemplos de processos industriais podem incluir fermentação (por exemplo, na produção de alimentos ou bebidas), destilação, produção de biocombustível, produção de um composto e produção de um polipeptídeo. Os exemplos de cepas industriais podem incluir, sem limitação, JAY270 e ATCC4124.

[291] Em algumas modalidades, a célula fúngica é uma célula poliploide. Como usado aqui, uma célula poliploide pode se referir a qualquer célula cujo genoma está presente em mais de uma cópia. Uma célula poliploide pode se referir a um tipo de célula que é naturalmente encontrada em um estado poliploide ou pode se referir a uma célula que foi induzida a existir em um estado poliploide (por exemplo, através de regulação específica, alteração, inativação, ativação ou modificação de meiose, citocinese ou replicação de DNA). Uma célula poliploide pode se referir a uma célula cujo genoma inteiro é poliploide ou pode se referir a uma célula que é poliploide em um locus genômico particular de interesse. Sem se ater à teoria, acredita-se que a abundância de RNA guia possa ser mais frequentemente um componente limitador de taxa na engenharia de genoma de células poliploides do que em células haploides e, dessa forma, os métodos que usam o sistema CaslSb CRISPR descrito no presente documento podem tirar vantagem do uso de um certo tipo de célula fúngica.

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175/776 [292] Em algumas modalidades, a célula fúngica é uma célula diploide. Como usado aqui, uma célula diploide pode se referir a qualquer célula cujo genoma está presente em duas cópias. Uma célula diploide pode se referir a um tipo de célula que é naturalmente encontrada em um estado diploide ou pode se referir a uma célula que foi induzida a existir em um estado diploide (por exemplo, através de regulação específica, alteração, inativação, ativação ou modificação de meiose, citocinese ou replicação de DNA) . Por exemplo, a cepa S228C de S. cerevisiae pode ser mantida em um estado haploide ou diploide. Uma célula diploide pode se referir a uma célula cujo genoma inteiro é diploide ou pode se referir a uma célula que é diploide em um locus genômico particular de interesse. Em algumas modalidades, a célula fúngica é uma célula haploide. Como usado aqui, uma célula haploide pode se referir a qualquer célula cujo genoma está presente em uma cópia. Uma célula haploide pode se referir a um tipo de célula que é naturalmente encontrada em um estado haploide ou pode se referir a uma célula que foi induzida a existir em um estado haploide (por exemplo, através de regulação específica, alteração, inativação, ativação ou modificação de meiose, citocinese ou replicação de DNA). Por exemplo, a cepa S228C de S. cerevisiae pode ser mantida em um estado haploide ou diploide. Uma célula haploide pode se referir a uma célula cujo genoma inteiro é

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176/776 haploide ou pode se referir a uma célula que é haploide em um locus genômico particular de interesse.

[293] Como usado aqui, um vetor de expressão de levedura se refere a um ácido nucleico que contém uma ou mais sequências que codificam um RNA e/ou polipeptídeo e pode conter adicionalmente quaisquer elementos desejados que controlem a expressão do ácido nucleico (ou ácidos nucleicos), bem como quaisquer elementos que possibilitam a replicação e manutenção do vetor de expressão dentro da célula de levedura. Muitos vetores de expressão de levedura adequados e características dos mesmos são conhecidos na técnica; por exemplo, vários vetores e técnicas são ilustrados em Yeast Protocols, 2^a edição, Xiao, W., edição (Humana Press, Nova Iorque, 2007) e Buckholz, R.G. e Gleeson, M.A. (1991) Biotechnology (NY) 9 (11) : 1.067 a 1.072. Os vetores de levedura podem conter, sem limitação, uma sequência centromérica (CEN), uma sequência de replicação autônoma (ARS), um promotor, como um promotor de RNA Polimerase III, operacionalmente ligado a uma sequência ou gene de interesse, um terminador como um terminador de RNA polimerase III, uma origem de replicação e um gene marcador (por exemplo, auxotróficos, antibióticos ou outros marcadores selecionáveis). Os exemplos de vetores de expressão para uso em levedura podem incluir plasmídeos, cromossomos artificiais de levedura, plasmídeos 2μ,

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177/776 plasmideos integrativos de levedura, plasmideos replicativos de levedura, vetores bifuncionais e plasmideos epissomais.

Integração estável de componentes de sistema CRISPR de alvejamento de RNA no genoma de plantas e células vegetais [294] Em modalidades particulares, é previsto que os polinucleotídeos que codificam os componentes do sistema CRISPR de alvejamento de RNA sejam introduzidos para integração estável no genoma de uma célula vegetal. Nessas modalidades, o projeto do vetor de transformação ou do sistema de expressão pode ser ajustado dependendo de quando, onde e sob quais condições o RNA guia e/ou o gene (ou genes) alvo de alvejamento de RNA são expressos.

[295] Em modalidades particulares, está previsto introduzir os componentes do sistema CRISPR de alvejamento de RNA de forma estável no DNA genômico de uma célula vegetal. Adicional ou alternativamente, é previsto introduzir os componentes do sistema CRISPR de alvejamento de RNA para integração estável no DNA de uma organela de planta, como, porém sem limitação, um plastídeo, mitocôndria ou um cloroplasto.

[296] 0 sistema de expressão para integração estável no genoma de uma célula vegetal pode conter um ou mais dentre os seguintes elementos: um elemento promotor que pode ser usado para expressar o RNA guia e/ou enzima de alvejamento de RNA em uma célula vegetal; uma região não

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178/776 traduzida 5' para intensificar a expressão; um elemento de intron para intensificar adicionalmente a expressão em determinadas células, como células monocotiledôneas; um sitio de clonagem múltipla para fornecer sítios de restrição convenientes para a inserção do um ou mais RNAs guia e/ou sequências de genes de alvejamento de RNA e outros elementos desejados; e uma região não traduzida 3' para fornecer uma terminação eficaz da transcrição expressa.

[297] Os elementos do sistema de expressão podem estar em um ou mais construtos de expressão que são circulares, como um plasmídeo ou vetor de transformação, ou não circulares, como o DNA de fita dupla linear.

Em uma modalidade particular, um sistema de expressão CRISPR de alvejamento de RNA compreende pelo menos:

(a) uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA guia (gRNA) que hibridiza com uma sequência alvo em uma planta e em que o RNA guia compreende uma sequência guia e uma sequência de repetição direta, e (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de alvejamento de RNA, em que os componentes (a) ou (b) estão situados em construtos iguais ou diferentes, e em que as sequências de nucleotídeos diferentes podem estar sob controle do mesmo ou de um elemento regulador diferente operacional em uma célula vegetal.

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179/776 [298] 0 construto (ou construtos) de DNA que contém os componentes do sistema CRISPR de alvejamento de RNA e, onde aplicável, a sequência de modelo pode ser introduzida no genoma de uma planta, parte da planta ou célula vegetal por uma variedade de técnicas convencionais. 0 processo geralmente compreende as etapas de selecionar uma célula hospedeira ou tecido hospedeiro adequado, introduzir o construto (ou construtos) na célula hospedeira ou tecido hospedeiro e regenerar células vegetais ou plantas a partir das mesmas. Em modalidades particulares, o construto de DNA pode ser introduzido na célula vegetal com o uso de técnicas como, porém sem limitação, eletroporação, microinjeção, injeção de feixe de aerossol de protoplastos de células vegetais, ou os construtos de DNA podem ser introduzidos diretamente no tecido de planta com o uso de métodos biolísticos, como como bombardeio de partículas de DNA (consultar também Fu et al., Transgenic Res. Fevereiro de 2000; 9(1):11 a 19). A base do bombardeio de partículas é a aceleração de partículas revestidas com gene (ou genes) de interesse em direção às células, resultando na penetração do protoplasma pelas partículas e tipicamente na integração estável no genoma. (Consultar, por exemplo, Klein et ai, Nature (1987), Klein et ai, Bio/Technology (1992), Casas et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1993) .) .

[299] Em modalidades particulares, os construtos de

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DNA que contêm componentes do sistema CRISPR de alvejamento de RNA podem ser introduzidos na planta por transformação mediada por Agrobacteríum. Os construtos de DNA podem ser combinados com regiões de flanqueamento de T-DNA adequadas e introduzidos em um vetor hospedeiro convencional de Agrobacteríum tumefacíens. O DNA estranho pode ser incorporado no genoma de plantas infectando as plantas ou incubando protoplastos vegetais com bactérias Agrobacteríum, que contêm um ou mais plasmídeos de Ti (indutores de tumor). (Consultar, por exemplo, Fraley et ai., (1985), Rogers et ai., (1987) e patente N° U.S. 5.563.055).

Promotores de planta [300] A fim de assegurar a expressão adequada em uma célula vegetal, os componentes do sistema Casl3b CRISPR descritos no presente documento são tipicamente colocados sob controle de um promotor vegetal, isto é, um promotor operacional em células vegetais. O uso de tipos diferentes de promotores é previsto.

[301] Um promotor constitutivo da planta é um promotor que tem capacidade para expressar o quadro de leitura aberto (ORF) que controla em todos ou quase todos os tecidos de planta durante todos ou quase todos os estágios de desenvolvimento da planta (mencionados como expressão constitutiva). Um exemplo não limitador de um promotor constitutivo é o promotor 35S do vírus do mosaico de couve

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181/776 flor. A presente invenção prevê métodos para modificar sequências de RNA e, como tal, também prevê a regulação da expressão de biomoléculas de plantas. Em modalidades particulares da presente invenção, é, dessa forma, vantajoso colocar um ou mais elementos do sistema CRISPR de alvejamento de RNA sob o controle de um promotor gue pode ser regulado. Promotor regulado se refere a promotores que direcionam a expressão de gene de modo não constitutivo, mas em de uma maneira regulada temporalmente e/ou espacialmente, e inclui promotores induzíveis, preferenciais para tecido e específicos para tecido. Promotores diferentes podem direcionar a expressão de um gene em tecidos ou tipos de células diferentes, ou em estágios de desenvolvimento diferentes, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Em modalidades particulares, um ou mais dos componentes de CRISPR direcionados ao RNA são expressos sob o controle de um promotor constitutivo, como o promotor 35S do vírus do mosaico de couve-flor, promotores preferenciais para tecido podem ser usados para alvejar a expressão intensificada em determinados tipos de célula dentro de um tecido de planta particular, por exemplo, células vasculares em folhas ou raízes ou em células específicas da semente. Os exemplos de promotores particulares para uso no sistema CRISPR de alvejamento de RNA são encontrados em Kawamata et ai., (1997) Plant Cell Physiol 38:792 a 803; Yamamoto et

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182/776 al., (1997) Plant J 12:255 a 265; Hire et al, (1992) Plant Mol Biol 20:207 a 218, Kuster et al, (1995) Plant Mol Biol 29:759 a 772, e Capana et al., (1994) Plant Mol Biol 25:681 a 691. Exemplos de promotores induzíveis e que permitem o controle espaço-temporal da edição ou expressão de gene podem usar uma forma de energia. A forma de energia pode incluir, porém sem limitação, energia sonora, radiação eletromagnética, energia química e/ou energia térmica. Os

exemplos	de	sistemas	induzíveis incluem	promotores
induzíveis	de	tetraciclina	(Tet-On ou Tet-Off)	, sistemas de
ativações	de	transcrição	de dois híbridos	de moléculas
pequenas i	[FKBP, ABA, etc	) ou sistemas induzíveis leves

(domínios de Fitocromo, LOV ou criptocromo), como um efetor transcricional induzível por luz (LITE) que direciona alterações em atividade transcricional de uma maneira específica de sequência. Os componentes de um sistema induzível por luz podem incluir uma enzima CRISPR de alvejamento de RNA, um heterodímero de citocromo responsive à luz (por exemplo, de Arabidopsis thaliana) e um domínio de ativação/repressão transcricional. Os exemplos adicionais de proteínas de ligação de DNA induzíveis e métodos para seu uso são fornecidos nos documentos n° US 61/736465 e US 61/721.283, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[302] Em modalidades particulares, a expressão

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183/776 transitória ou induzível pode ser alcançada com o uso, por exemplo, de promotores regulados por produtos químicos, isto é, de modo que a aplicação de um produto químico exógeno induza a expressão de gene. A modulação da expressão de gene também pode ser obtida por um promotor quimicamente reprimível, em que a aplicação do produto química reprime a expressão de gene. Os promotores quimicamente induzíveis incluem, porém sem limitação, o promotor ln2-2 de mais, ativado por protetor herbicida de benzeno sulfonamida (De Veylder et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:568 a 577), ο promotor GST de mais (GST-II-27, WO93/01294), ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos usados como herbicidas pré-emergentes e o promotor PR-la do tabaco (Ono et al., (2004) Biosci Biotechnol Biochem 68:803 a 807) ativado por ácido salicílico. Os promotores que são regulados por antibióticos, como promotores induzíveis por tetraciclina e reprimível por tetraciclina (Gatz et al. , (1991) Mol Gen Genet 227: 229 a 237; patente n° U.S. 5.814.618 e 5.789.156) também podem ser usados no presente documento.

Translocação para e/ou expressão em organelas vegetais específicas [303] O sistema de expressão pode compreender elementos para translocação para e/ou expressão em uma organela de planta específica.

Alvejamento de cloroplasto

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184/776 [304] Em modalidades particulares, é previsto que o sistema CRISPR de alvejamento de RNA é usado para modificar especificamente a expressão e/ou tradução de genes de cloroplasto ou para assegurar a expressão no cloroplasto. Para ess propósito, é feito uso de métodos de transformação de cloroplasto ou compartimentalização dos componentes CRISPR de alvejamento de RNA no cloroplasto. Por exemplo, a introdução de modificações genéticas no genoma de plastídeo pode reduzir problemas de biossegurança, como o fluxo de gene através do pólen.

[305] Os métodos de transformação de cloroplasto são conhecidos na técnica e incluem bombardeamento de partículas, tratamento com PEG e microinjeção. Adicionalmente, os métodos que envolvem a translocação de cassetes de transformação do genoma nuclear para o plastídeo podem ser usados, conforme descrito no documento n° WO2010061186.

[306] Alternativamente, é previsto alvejar um ou mais dos componentes CRISPR de alvejamento de RNA ao cloroplasto de planta. Isto é alcançado incorporando-se no construto de expressão uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP) ou peptídeo de trânsito de plastídeo, operacionalmente ligado à região 5' da sequência que codifica a proteína de alvejamento de RNA. O CTP é removido em uma etapa de processamento durante a translocação

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185/776 para o cloroplasto. 0 alvejamento de cloroplastos de proteínas expressas é bem conhecido pelo versado na técnica (consultar, por exemplo, Protein Transport into Chloroplasts, 2010, Annual Review of Plant Biology, volume 61: 157 a 180) . Em tais modalidades, também é desejado alvejar o um ou mais RNAs guia para o cloroplasto de planta. Os métodos e construtos que podem ser usados para translocar o RNA guia para o cloroplasto por meio de uma sequência de localização de cloroplasto são descritos, por exemplo, no

documento n	° US	20040142476,	aqui	incorporado	por
referência.	Tais	variações	de	construtos podem	ser
incorporadas	nos	sistemas de	expressão	da invenção	para
translocar de	modo	eficaz o RNA	(ou	RNAs)	guia de alvejamento

de RNA.

Introdução de polínucleotldeos que codificam o sistema de alvejamento de CRISPR-RNA em células de algas.

[307] As algas transgênicas (ou outras plantas, como colza) podem ser particularmente úteis na produção de óleos vegetais ou biocombustíveis, como álcoois (especialmente metanol e etanol) ou outros produtos. Esses podem ser manipulados para expressar ou superexpressar níveis altos de óleo ou álcoois para uso nas indústrias de petróleo ou biocombustíveis.

[308] O documento n° US 8945839 descreve um método para manipular espécies de microalgas (células de

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Chlamydomonas reinhardtii) com o uso de Cas9. Com o uso de ferramentas similares, os métodos do sistema CRISPR de alvejamento de RNA descritos no presente documento podem ser aplicados em espécies de Chiamydomonas e outras algas. Em modalidades particulares, a proteína de alvejamento de RNA e o RNA (ou RNAs) guia são introduzidos em algas expressas com o uso de um vetor que expressa a proteína de alvejamento de RNA sob o controle de um promotor constitutivo como Hsp70A-Rbc S2 ou Beta2 -tubulina. 0 RNA guia é opcionalmente entregue com o uso de um vetor que contém o promotor T7. Alternativamente, o mRNA de alvejamento de RNA e o RNA guia transcrito in vitro podem ser entregues às células de algas. Os protocolos de eletroporação estão disponíveis para o versado na técnica, como o protocolo padrão recomendado do kit de engenharia GeneArt Chlamydomonas.

Introdução___de polinucleotídeos___que___codificam componentes de alvejamento de RNA em células de levedura [309] Em modalidades particulares, a invenção se refere ao uso do sistema CRISPR de alvejamento de RNA para edição de RNA em células de levedura. Os métodos para transformar células de levedura que podem ser usados para introduzir polinucleotídeos que codificam os componentes do sistema CRISPR de alvejamento de RNA são bem conhecidos pelo versado na técnica e são revisados por Kawai et ai., 2010, Bioeng Bugs. Novembro a dezembro de 2010; 1(6): 395 a 403).

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Os exemplos não limitadores incluem transformação de células de levedura por tratamento com acetato de litio (que pode incluir adicionalmente tratamento com carreador de DNA e PEG), bombardeio ou por eletroporação.

Expressão transitória de componentes de sistema CRISPR de alvejamento de RNA em plantas e células vegetais [310] Em modalidades particulares, é previsto que o RNA guia e/ou o gene de alvejamento de RNA são transitoriamente expressos na célula vegetal. Nessas modalidades, o sistema CRISPR de alvejamento de RNA pode assegurar a modificação de moléculas alvo de RNA apenas quando o RNA guia e a proteína de alvejamento de RNA estão presentes em uma célula, de modo que a expressão de gene possa ser adicionalmente controlada. À medida que a expressão da enzima de alvejamento de RNA é transitória, as plantas regeneradas a partir de tais células vegetais tipicamente não contêm DNA estranho. Em modalidades particulares, a enzima de alvejamento de RNA é expressa de maneira estável pela célula vegetal e a sequência guia é expressa transitoriamente.

[311] Em modalidades particularmente preferenciais, os componentes de sistema CRISPR de alvejamento de RNA podem ser introduzidos nas células vegetais com o uso de um vetor viral de planta (Scholthof et ai. 1996, Annu Rev Phytopathol. 1996;34:299 a 323). Em modalidades particulares adicionais,

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188/776 o dito vetor viral é um vetor de um vírus de DNA. Por exemplo, geminivírus (por exemplo, vírus do enrolamento das folhas de repolho, vírus do nanismo amarelo do feijão, vírus do nanismo do trigo, vírus do enrolamento da folha do tomate, vírus do listrado do milho, vírus do enrolamento da folha do tabaco ou vírus do mosaico dourado do tomate) ou nanovírus (por exemplo, vírus do amarelo necrótico do feijão-fava). Em outras modalidades particulares, o dito vetor viral é um vetor de um vírus de RNA. Por exemplo, tobravírus (por exemplo, vírus do chocalho do tabaco, vírus do mosaico do tabaco), potexvírus (por exemplo, vírus da batata X) ou hordeivírus (por exemplo, vírus do mosaico da listra de cevada). Os genomas replicantes de vírus de planta são vetores não integrativos, o que é de interesse no contexto de evitar a produção de plantas GMO.

[312] Em modalidades particulares, o vetor usado para expressão transitória de construtos de CRISPR de alvejamento de RNA é, por exemplo, um vetor pEAQ, que é adaptado para a expressão transitória mediada por Agrobacterium (Sainsbury F. et al., Plant Biotechnol J. setembro de 2009; 7(7):682 a 693) no protoplasto. O alvejamento preciso de localizações genômicas foi demonstrado com o uso de um vetor do vírus de enrolamento de folha de repolho (CaLCuV) modificado para expressar gRNAs em plantas transgênicas estáveis que expressam uma enzima

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CRISPR (Scientific Reports 5, Número do artigo: 14926 (2015), doi:10.1038/srepl4926).

[313] Em modalidades particulares, os fragmentos de DNA de fita dupla que codificam o RNA guia e/ou o gene de alvejamento de RNA podem ser introduzidos transitoriamente na célula vegetal. Em tais modalidades, os fragmentos de DNA de fita dupla introduzidos são fornecidos em quantidade suficiente para modificar a molécula (ou moléculas) de RNA na célula, mas não persistem após um período de tempo contemplado ter passado ou após uma ou mais divisões celulares. Os métodos para transferência direta de DNA em plantas são conhecidos pelo versado na técnica (consultar, por exemplo, Davey et al. Plant Mol Biol. Setembro de 1989,-13 (3) :273 a 285. ) [314] Em outras modalidades, um polinucleotídeo de RNA que codifica a proteína de alvejamento de RNA é introduzido na célula vegetal, que é então traduzida e processada pela célula hospedeira que gera a proteína em quantidade suficiente para modificar a célula de molécula (ou moléculas) de RNA (na presença de pelo menos um RNA guia), mas que não persiste após um período de tempo contemplado ter passado ou após uma ou mais divisões celulares. Os métodos para introduzir o mRNA em protoplastos de planta para expressão transitória são conhecidos pelo versado na técnica (consultar, por exemplo, em Gallie, Plant

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Cell Reports (1993), 13;119 a 122). Também estão previstas combinações dos métodos diferentes descritos acima.

Entrega de componentes CRISPR de alvejamento de RNA para a célula vegetal [315] Em modalidades particulares, é de interesse entregar um ou mais componentes do sistema CRISPR de alvejamento de RNA diretamente para a célula vegetal. Isso é de interesse, inter alia, para a geração de plantas não transgênicas (consultar abaixo). Em modalidades particulares, um ou mais dos componentes de alvejamento de RNA são preparados fora da planta ou célula vegetal e entregues à célula. Por exemplo, em modalidades particulares, a proteína de alvejamento de RNA é preparada in vitro antes da introdução na célula vegetal. A proteína de alvejamento de RNA pode ser preparada por vários métodos conhecidos por um versado na técnica e incluem a produção recombinante. Após a expressão, a proteína de alvejamento de RNA é isolada, novamente enovelada, se necessário, purificada e opcionalmente tratada para remover quaisquer etiquetas de purificação, como uma etiqueta His. Uma vez que a proteína de alvejamento de RNA bruta, parcialmente purificada ou mais completamente purificada é obtida, a proteína pode ser introduzida na célula vegetal.

[316] Em modalidades particulares, a proteína de alvejamento de RNA é misturada com o RNA guia que alveja o

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RNA de interesse para formar uma ribonucleoproteina prémontada.

[317] Os componentes individuais ou ribonucleoproteina pré-montada podem ser introduzidos na célula vegetal através de eletroporação, por bombardeio com partículas revestidas com produto de gene associados ao alvejamento de RNA, por transfecção química ou por algum outro meio de transporte através de uma membrana celular. Por exemplo, a transfecção de um protoplasto de planta com uma ribonucleoproteina CRISPR pré-montada foi demonstrada como assegurando uma modificação alvejada do genoma de planta (conforme descrito por Woo et al. Nature Biotechnology, 2015; DOI: 10.1038/nbt.3389). Esses métodos podem ser modificados para obter uma modificação alvejada de moléculas de RNA nas plantas.

[318] Em modalidades particulares, os componentes de sistema CRISPR de alvejamento de RNA são introduzidos nas células vegetais com o uso de nanopartícuias. Os componentes, como proteína ou ácido nucleico ou em uma combinação dos mesmos, podem ser carregados ou embalados em nanopartícuias e aplicados às plantas (como, por exemplo, descrito nos documentos WO 2008042156 e US 20130185823). Em particular, as modalidades da invenção compreendem nanopartícuias carregadas ou embaladas com molécula (ou moléculas) de DNA que codifica a proteína de alvejamento de RNA, moléculas de

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DNA que codificam o RNA guia e/ou RNA guia isolado, conforme descrito no documento n° WC2015089419.

[319] Os meios adicionais de introdução de um ou mais componentes do sistema CRISPR de alvejamento de RNA na célula vegetal são o uso de peptídeos de penetração celular (CPP) . Por conseguinte, em modalidades particulares, a invenção compreende composições que compreendem um peptídeo de penetração celular ligado a uma proteína de alvejamento de RNA. Em modalidades particulares da presente invenção, uma proteína de alvejamento de RNA e/ou RNA (RNAs) guia é acoplada a um ou mais CPPs para transportá-los de modo eficaz efetivamente dentro de protoplastos de planta (Ramakrishna (2014, Genome Res. Junho de 2014;24(6) :1.020 a 1.027 para Cas9 em células humanas). Em outras modalidades, o gene de alvejamento de RNA e/ou RNA (ou RNAs) guia são codificados por uma ou mais molécula de DNA circulares ou não circulares que são acopladas a um ou mais CPPs para entrega de protoplasto de planta. Os protoplastos de planta são então regenerados para células vegetais e adicionalmente para plantas. Os CPPs são geralmente descritos como peptídeos curtos de menos de 35 aminoácidos derivados de proteínas ou de sequências quiméricas que têm capacidade para transportar biomoléculas através da membrana celular de uma maneira independente do receptor. O CPP pode ser peptídeos catiônicos, peptídeos que têm sequências hidrofóbicas,

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193/776 peptídeos anfipáticos, peptídeos que têm sequência rica em prolina e antimicrobiana e peptídeos quiméricos ou bipartidos (Pooga e Langel 2005). Os CPPs têm capacidade para penetrar nas membranas biológicas e, como tal, disparam o movimento de várias biomoléculas através das membranas celulares para o citoplasma e para aperfeiçoar seu encaminhamento intracelular e, por conseguinte, facilitar a interação da biolomolécula com o alvo. Os exemplos de CPP incluem, entre outros: Tat, uma proteína ativadora de transcrição nuclear necessária para replicação viral pela sequência do peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblastos Kaposi (FGF) do tipo 1 do HIV, penetratina, sequência do peptídeo sinal da integrina β3; sequência de Args do peptídeo de poliarginina, transportadores moleculares ricos em guanina, peptídeo SAP (Sweet Arrow Peptide), etc .

RNA alvo previsto para aplicações em plantas, algas ou fungos [320] O RNA-alvo, isto é, o RNA de interesse, é ο RNA a ser alvejado pela presente invenção, levando ao recrutamento e à ligação da proteína de alvejamento de RNA no sítio-alvo de interesse no RNA-alvo. O RNA-alvo pode ser qualquer forma adequada de RNA. Isso pode incluir, em algumas modalidades, mRNA. Em outras modalidades, o RNA alvo pode incluir RNA de transferência (tRNA) ou RNA ribossômico

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194/776 (rRNA). Em outras modalidades, o RNA alvo pode incluir RNA interferente (RNAi), microRNA (miRNA) , microcomutadores, microenzimas, RNAs de satélite e vírus de RNA. 0 RNA alvo pode estar situado no citoplasma da célula vegetal, ou no núcleo celular ou em uma organela da célula vegetal, como uma mitocôndria, cloroplasto ou plastídeo.

[321] Em modalidades particulares, o sistema CRISPR de alvejamento de RNA é usado para clivar o RNA ou de outro modo inibir a expressão do RNA.

Uso do sistema CRISPR de alvejamento de rna para modular a expressão de gene de planta através da modulação de RNA [322] A proteína de alvejamento de RNA também pode ser usada, juntamente com um RNA guia adequado, para alvejar a expressão de gene, através do controle do processamento de RNA. 0 controle do processamento de RNA pode incluir reações de processamento de RNA, como splicing de RNA, incluindo splicing alternativo ou que alveja especificamente certas variantes de splicing ou isoformas; replicação viral (em particular, de vírus de planta, incluindo viroides em plantas e biossíntese de tRNA). A proteína de alvejamento de RNA em combinação com um RNA guia adequado também pode ser usada para controlar a ativação de RNA (RNAa) . A RNAa leva à promoção da expressão de gene, de modo que o controle da expressão de gene possa ser alcançado dessa maneira através da ruptura ou redução de RNAa e, dessa forma, menos promoção

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195/776 da expressão de gene.

[323] A proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção pode ser adicionalmente usada para atividade antiviral em plantas, em particular contra vírus de RNA. A proteína efetora pode ser alvejada para o RNA viral com o uso de um RNA guia adequado seletivo para uma sequência de RNA viral selecionada. Em particular, a proteína efetora pode ser uma nuclease ativa que cliva o RNA, como o RNA de fita simples. Portanto, é fornecido o uso de uma proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção como um agente antiviral. Os exemplos de vírus que podem ser combatidos dessa maneira incluem, porém sem limitação, vírus do mosaico do tabaco (TMV), vírus da murcha do tomate (TSWV), vírus do mosaico do pepino (CMV), vírus da batata Y (PVY), vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (vírus RT) , vírus da ameixa (PPV), vírus do mosaico Brome (BMV) e vírus da batata X (PVX).

[324] Os exemplos de modulação da expressão de RNA em plantas, algas ou fungos, como uma alternativa da modificação de gene alvejado, são descritos no presente documento mais adiante.

[325] De interesse particular é o controle regulado da expressão de gene através da divagem regulada do mRNA. Isso pode ser obtido mediante a colocação de elementos do alvejamento de RNA sob o controle de promotores regulados,

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196/776 conforme descrito aqui.

Uso do sistema CRISPR de alvejamento de RNA para restaurar a funcionalidade de moléculas de tRNA.

[326] Pring et ai. descrevem a edição de RNA em mitocôndrias e cloroplastos vegetais que altera sequências de mRNA para codificar proteínas diferentes do DNA. (Plant Mol. Biol. (1993) 21 (6): 1.163 a 1.170.

doi:10.1007/BF00023611). Em modalidades particulares da invenção, os elementos do sistema CRISPR de alvejamento de RNA que alveja especificamente mRNA de mitocôndria e cloroplasto podem ser introduzidos em uma planta ou célula vegetal para expressar proteínas diferentes em tais organelas de célula vegetal simulando os processos que ocorrem m vivo.

Uso do sistema CRISPR de alvejamento de RNA como uma alternativa para interferência de RNA para inibir a expressão de RNA.

[327] O sistema CRISPR de alvejamento de RNA tem usos similares à inibição ou interferência de RNA, dessa forma, também pode ser substituído por tais métodos. Na modalidade particular, os métodos da presente invenção incluem o uso do CRISPR de alvejamento de RNA como um substituto para, por exemplo, um ácido ribonucleico interferente (como um siRNA ou shRNA ou um dsRNA) . Os exemplos de inibição da expressão de RNA em plantas, algas

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197/776 ou fungos, como uma alternativa da modificação de gene alvejado, são descritos no presente documento mais adiante.

Uso do sistema CRISPR de alvejamento de RNA para controlar a interferência de RNA.

[328] 0 controle sobre o RNA de interferência ou miRNA pode ajudar a reduzir os efeitos fora do alvo (OTE) observados com aquelas abordagens mediante a redução da longevidade do RNA de interferência ou miRNA ín vivo ou ín vitro. Em modalidades particulares, o RNA alvo pode incluir RNA de interferência, isto é, RNA envolvido em uma via de interferência de RNA, como shRNA, siRNA e assim por diante. Em outras modalidades, o RNA alvo pode incluir microRNA (miRNA) ou RNA de fita dupla (dsRNA).

[329] Em outras modalidades particulares, se a proteína de alvejamento de RNA e o RNA (ou RNAs) guia adequado forem expressos de maneira seletiva (por exemplo espacial ou temporalmente sob o controle de um promotor regulado, por exemplo, um promotor e/ou intensificador específico para o ciclo celular ou tecido) , isso pode ser usado para proteger as células ou sistemas (in vivo ou in vitro) do RNAi nessas células. Isso pode ser útil em tecidos ou células vizinhas onde o RNAi não é necessário ou para fins de comparação das células ou tecidos em que a proteína efetora e o guia adequado estão e não são expressos (isto é, onde o RNAi não é controlado e onde está, respectivamente).

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A proteína de alvejamento de RNA pode ser usada para controlar ou se ligar a moléculas que compreendem ou consistem em RNA, como ribozimas, ribossomas ou ribocomutadores. Nas modalidades da invenção, o RNA guia pode recrutar a proteína de alvejamento de RNA para essas moléculas, de modo que a proteína de alvejamento de RNA tenha capacidade para se ligar às mesmas.

[330] O RNA direcionado ao sistema CRISPR da invenção pode ser aplicado em áreas de tecnologias RNAi ínplanta, sem experimentação indevida, a partir desta revelação, incluindo gerenciamento de pragas de inseto, gerenciamento de doenças de planta e gerenciamento de resistência a herbicida, bem como em ensaios em planta e para outras aplicações (consultar, por exemplo, Kim et ai., em Pesticide Biochemistry and Physiology (Impact Factor: 2.01). 01/2015; 120. DOI: 10.1016/j.pestbp.2015.01.002; Sharma et al. in Academic Journals (2015), Vol.12(18) páginas 2.303 a 2.312); Green J.M, inPest Management Science, Vol 70(9), páginas 1.351 a 1.357), devido ao fato de que o presente pedido fornece a base para a engenharia informada do sistema.

Uso do sistema CRISPR de alvejamento de RNA para modificar ribocomutadores e controlar a regulação metabólica em plantas, algas e fungos [331] Os ribocomutadores (também conhecidos como

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199/776 aptozimas) são segmentos reguladores de RNA mensageiro que ligam moléculas pequenas e, por sua vez, regulam a expressão de gene. Esse mecanismo permite que a célula detecte a concentração intracelular dessas moléculas pequenas. Um ribocomutador especifico tipicamente regula seu gene adjacente mediante a alteração da transcrição, da tradução ou do splicing desse gene. Dessa forma, em modalidades particulares da presente invenção, o controle da atividade do ribocomutador é previsto através do uso da proteína de alvejamento de RNA em combinação com um RNA guia adequado para alvejar o ribocomutador. Isso pode ser através da divagem de ou ligação ao ribocomutador. Em modalidades particulares, está prevista a redução da atividade de ribocomutador. Recentemente, um ribocomutador que liga o tiamina-pirofosfato (TPP) foi caracterizado e encontrado como regulando a biossíntese de tiamina em plantas e algas. Adicionalmente, parece que esse elemento é um regulador essencial do metabolismo primário em plantas (Bocobza e Aharoni, Plant J. Agosto de 2014; 79 (4):693 a 703. 10.1111/tpj.12540. Publicação eletrônica 17 de junho de 2014). Os ribocomutadores de TPP também são encontrados em certos fungos, como em Neurospora crassa, onde controla o splicing alternativo para produzir condicionalmente um Quadro de Leitura Aberta a montante (uORF), afetando assim a expressão de genes a jusante (Cheah MT et ai., (2007)Nature

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447 (7143) : 497 a 500. doi:10.103 8/nature05769) . O sistema CRISPR de alvejamento de RNA descrito no presente documento pode ser usado para manipular a atividade endógena de ribocomutador em plantas, algas ou fungos e, como tal, alterar a expressão de genes a jusante controlados pelo mesmo. Em modalidades particulares, o sistema CRISPR de alvejamento de RNA pode ser usado no ensaio da função de ribocomutador in vivo ou in vitro e no estudo de sua relevância para a rede metabólica. Em modalidades particulares, o sistema CRISPR de alvejamento de RNA pode ser potencialmente usado para manipulação de ribocomutadores como sensores de metabólito em plantas e plataformas para controle de gene.

Uso do sistema CRISPR de alvejamento de RNA em triagens de RNAi para plantas, algas ou fungos [332] A identificação de produtos de gene cujo knockdown está associado a alterações fenotípicas, as vias biológicas podem ser interrogadas e as partes constituintes identificadas, através de triagens de RNAi. Em modalidades particulares da invenção, o controle também pode ser exercido sobre ou durante essas triagens com o uso da proteína Casl3b e do RNA guia adequado descrito no presente documento para remover ou reduzir a atividade do RNAi na triagem e, dessa forma, restabelecer a atividade do (anteriormente interferida com) produto do gene (removendo ou reduzindo a

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201/776 interferência/repressão).

Uso de proteínas de alvejamento de RNA para visualização de moléculas de RNA in vivo e in vitro [333] Em modalidades particulares, a invenção fornece um sistema de ligação de ácido nucleico. A hibridização in situ do RNA com sondas complementares é uma técnica poderosa. Os oligonucleotídeos de DNA tipicamente fluorescentes são usados para detectar ácidos nucleicos por hibridização. A eficiência aumentada foi alcançada por determinadas modificações, como os ácidos nucleicos bloqueados (LNAs), mas permanece a necessidade por alternativas eficazes e versáteis. Como tal, os elementos marcados do sistema de alvejamento de RNA podem ser usados como uma alternativa para um sistema eficaz e adaptável para a hibridização in situ.

Aplicações adicionais do sistema CRISPR de alvejamento de RNA em plantas e leveduras

Uso de sistema CRISPR de alvejamento de RNA na produção de blocombustível [334] O termo blocombustível, conforme usado aqui, é um combustível alternativo produzido a partir de plantas e recursos derivados de plantas. Os biocombustíveis renováveis podem ser extraídos da matéria orgânica cuja energia foi obtida através de um processo de fixação de carbono ou produzida através do uso ou conversão de biomassa.

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Essa biomassa pode ser usada diretamente para biocombustíveis ou pode ser convertida em energia conveniente que contém substâncias por conversão térmica, conversão química e conversão bioquímica. Essa conversão de biomassa pode resultar em combustível na forma sólida, líquida ou gasosa. Existem dois tipos de biocombustíveis: bioetanol e biodiesel. O bioetanol é produzido principalmente pelo processo de fermentação do açúcar de celulose (amido), que é principalmente derivada do milho e cana-de-açúcar. O biodiesel, por outro lado, é produzido principalmente a partir de oleaginosas, como colza, palma e soja. Os biocombustíveis são usados principalmente para transporte.

Intensificação de propriedades de planta para a produção de biocombustlvel [335] Em modalidades particulares, os métodos que usam o sistema CRISPR de alvejamento de RNA, conforme descrito aqui, são usados para alterar as propriedades da parede celular, a fim de facilitar o acesso dos principais agentes hidrolisantes para uma liberação mais eficaz de açúcares para fermentação. Em modalidades particulares, a biossíntese de celulose e/ou lignina é modificada. A celulose é o principal componente da parede celular. A biossíntese de celulose e lignina é corregulada. Mediante a redução da proporção de lignina em uma planta, a proporção de celulose

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203/776 pode ser aumentada. Em modalidades particulares, os métodos descritos no presente documento são usados para regular de modo descendente a biossíntese de lignina na planta, a fim de aumentar os carboidratos fermentáveis. Mais particularmente, os métodos descrito no presente documento são usados para regular de modo descendente pelo menos um primeiro gene de biossíntese de lignina selecionado do grupo que consiste em 4-cumarato 3-hidroxilase (C3H), fenilalanina amônia-liase (PAL), cinamato 4-hidroxilase (C4H), hidroxicinamoil transferase (HCT), ácido cafeico 0metiltransferase (COMT), cafeoil CoA 3-0-metiltransferase (CCoAOMT), ferulato 5- hidroxilase (F5H), cinamil álcool desidrogenase (CAD), cinamoil CoA-redutase (CCR), 4coumarato-CoA ligase (4CL), glicosil transferase específica de monolignol-lignina, e aldeído desidrogenase (ALDH), conforme revelado no documento n° WO 2008064289 A2.

[336] Em modalidades particulares, os métodos descritos no presente documento são usados para produzir massa vegetal que produz níveis mais baixos de ácido acético durante a fermentação (consultar também o documento n° WO 2010096488).

Modificação de levedura para produção de bíocombustlvel [337] Em modalidades particulares, a enzima de alvejamento de RNA fornecida no presente documento é usada para produção de bioetanol por micro-organismos

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204/776 recombinantes. Por exemplo, as enzimas de alvejamento de RNA podem ser usadas para manipular micro-organismos, como levedura, para gerar biocombustíveis ou biopolímeros a partir de açúcares fermentáveis e, opcionalmente, para terem capacidade para degradar a lignocelulose derivada de planta derivada de resíduos agrícolas como uma fonte de açúcares fermentáveis. Mais particularmente, a invenção fornece métodos de modo que o complexo CRISPR de alvejamento de RNA seja usado para modificar a expressão de genes endógenos necessários para a produção de biocombustíveis e/ou para modificar genes endógenos, devido ao fato de que pode interferir na síntese de biocombustível. Mais particularmente, os métodos envolvem estimular a expressão em um microrganismo, como uma levedura de uma ou mais enzimas que codificam a sequência de nucleotídeos envolvidas na conversão de piruvato em etanol ou um outro produto de interesse. Em modalidades particulares, os métodos asseguram a estimulação da expressão de uma ou mais enzimas que permitem que o microrganismo degrade celulose, como uma celulase. Em ainda outras modalidades, o complexo CRISPR de alvejamento de RNA é usado para suprimir vias metabólicas endógenas que competem com a via de produção de biocombustível.

Modificação de algas e plantas para produção de óleos vegetais ou biocombustíveis

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205/776 [338] As algas transgênicas ou outras plantas, como colza, podem ser particularmente úteis na produção de óleos vegetais ou biocombustíveis, como álcoois (especialmente metanol e etanol) por exemplo. Esses podem ser manipulados para expressar ou superexpressar níveis altos de óleo ou álcoois para uso nas indústrias de petróleo ou biocombustíveis.

[339] O documento n° US 8945839 descreve um método para manipular microalgas (células de Chlamydomonas reinhardtii) com o uso de Cas9. Com o uso de ferramentas similares, os métodos do sistema CRISPR de alvejamento de RNA descritos no presente documento podem ser aplicados em espécies de Chlamydomonas e outras algas. Em modalidades particulares, a proteína efetora de alvejamento de RNA e o RNA guia são introduzidos em algas expressas com o uso de um vetor que expressa a proteína efetora de alvejamento de RNA sob o controle de um promotor constitutivo como Hsp70A-Rbc S2 ou Beta2 -tubulina. O RNA guia será entregue com o uso de um vetor que contém o promotor T7. Alternativamente, o RNA guia transcrito in vitro pode ser entregue às células de algas. O protocolo de eletroporação segue o protocolo padrão recomendado do kit GeneArt Chlamydomonas Engineering.

Aplicações particulares das enzimas de alvejamento de RNA em plantas [340] Em modalidades particulares, a presente

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206/776 invenção pode ser usada como uma terapia para remoção de vírus em sistemas vegetais, à medida que tem capacidade para clivar o RNA viral. Os estudos anteriores em sistemas humanos demonstraram o sucesso do uso de CRISPR no alvejamento do vírus de RNA de fita simples, hepatite C (A. Price, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei, 2015). Esses métodos também podem ser adaptados para o uso do sistema CRISPR de alvejamento de RNA em plantas.

Plantas aperfeiçoadas [341] A presente invenção também fornece plantas e células de levedura obteníveis e obtidas pelos métodos aqui fornecidos. As plantas aperfeiçoadas obtidas pelos métodos descritos no presente documento podem ser úteis na produção de alimentos ou rações através da expressão modificada de genes que, por exemplo, asseguram tolerância a pragas de planta, herbicidas, seca, temperaturas baixas ou altas, excesso de água, etc.

[342] As plantas aperfeiçoadas obtidas pelos métodos descritos no presente documento, especialmente culturas e algas, podem ser úteis na produção de alimentos ou rações através da expressão, por exemplo, de níveis mais altos de proteína, carboidrato, nutriente ou vitamina do que seria normalmente visto no tipo selvagem. Sob esse aspecto, são preferenciais plantas aperfeiçoadas, especialmente leguminosas e tubérculos.

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207/776 [343] As algas aperfeiçoadas ou outras plantas, como colza, podem ser particularmente úteis na produção de óleos vegetais ou biocombustíveis, como álcoois (especialmente metanol e etanol) por exemplo. Esses podem ser manipulados para expressar ou superexpressar níveis altos de óleo ou álcoois para uso nas indústrias de petróleo ou biocombustíveis.

[344] A invenção também fornece partes aperfeiçoadas de uma planta. As partes de planta incluem, porém sem limitação, folhas, caules, raízes, tubérculos, sementes, endosperma, óvulo e pólen. As partes da planta conforme prevista na presente invenção podem ser viáveis, não viáveis, regeneráveis e/ou não regeneráveis.

[345] Também é abrangido no presente documento o fornecimento de células vegetais e plantas geradas de acordo com os métodos da invenção. Gametas, sementes, embriões, zigóticos ou somáticos, progênie ou híbridos de plantas que compreendem a modificação genética, que são produzidos pelos métodos tradicionais de reprodução, também estão incluídos no escopo da presente invenção. Tais plantas podem conter uma sequência de DNA heteróloga ou estranha inserida em ou em vez de uma sequência alvo. Alternativamente, tais plantas podem conter apenas uma alteração (mutação, deleção, inserção, substituição) em um ou mais nucleotídeos. Como tal, tais plantas serão apenas diferentes de suas plantas

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208/776 progenitoras pela presença da modificação particular.

[346] Em uma modalidade da invenção, um sistema Casl3b é usado para manipular plantas resistentes a patógeno, por exemplo, criando resistência contra doenças causadas por bactérias, fungos ou virus. Em determinadas modalidades, a resistência ao patógeno pode ser realizada por meio da manipulação de culturas para produzir um sistema Casl3b que será ingerido por uma praga de inseto, levando à mortalidade. Em uma modalidade da invenção, um sistema Casl3b é usado para manipular a tolerância ao estresse abiótico. Em uma outra modalidade, um sistema Casl3b é usado para manipular a tolerância ao estresse de seca ou tolerância ao estresse de sal, ou tolerância ao estresse de frio ou calor. Younis et ai. 2014, Int. J. Biol. Sei. 10; 1150 revisaram alvos potenciais de métodos de melhoramento de plantas, todos os quais são passíveis de correção ou aperfeiçoamento através do uso de um sistema Casl3b descrito no presente documento. Algumas culturas alvo não limitadoras incluem Oryza sativa L, Prunus domestica L., Gossypium hirsutum, Nicotiana rústica, Zea mays, Medicago sativa, Nicotiana benthamiana e Arabidopsis thaliana.

[347] Em uma modalidade da invenção, um sistema Casl3b é usado para o gerenciamento de pragas de cultura. Por exemplo, um sistema Casl3b operacional em uma praga de cultura pode ser expresso a partir de um hospedeiro de planta

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209/776 ou transferido diretamente para o alvo, por exemplo, com o uso de um vetor viral.

[348] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para produzir de modo eficaz organismos homozigotos a partir de um organismo inicial não humano heterozigoto. Em uma modalidade, a invenção é usada no melhoramento de plantas. Em uma outra modalidade, a invenção é usada na criação de animais. Em tais modalidades, um organismo homozigoto, como uma planta ou animal, é produzido impedindo ou suprimindo a recombinação por meio da interferência com pelo menos um gene alvo envolvido em rupturas de fita dupla, emparelhamento de cromossomos e/ou troca de fitas.

Aplicação das proteínas Casl3b em sistemas de alvejamento de RNA funcionais otimizados [349] Em um aspecto, a invenção fornece um sistema para entrega específica de componentes funcionais ao ambiente de RNA. Isso pode ser assegurado com o uso dos sistemas CRISPR que compreendem as proteínas efetoras de alvejamento de RNA da presente invenção, que permitem o alvejamento específico de componentes diferentes para o RNA. Mais particularmente, tais componentes incluem ativadores ou repressores, como ativadores ou repressores de tradução, degradação de RNA, etc. As aplicações desse sistema são descritas em outras partes no presente documento.

[350] De acordo com um aspecto, a invenção fornece

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210/776 uma composição de ocorrência não natural ou manipulada que compreende um RNA guia que compreende uma sequência guia com capacidade para hibridizar em uma sequência alvo em um locus genômico de interesse em uma célula, em que o RNA guia é modificado pela inserção de uma ou mais sequências de RNA distintas que se ligam a uma proteína adaptadora. Em modalidades particulares, as sequências de RNA podem se ligar a duas ou mais proteínas adaptadoras (por exemplo, aptâmeros) e em que cada proteína adaptadora está associada a um ou mais domínios funcionais. Os RNAs guia das enzimas Casl3b descritas no presente documento são mostrados como passíveis à modificação da sequência guia. Em modalidades particulares, o RNA guia é modificado pela inserção de sequência (ou sequências) de RNA distinta 5' da repetição direta, dentro da repetição direta ou 3' da sequência guia. Quando há mais de um domínio funcional, os domínios funcionais podem ser iguais ou diferentes, por exemplo, dois dos mesmos ou dois ativadores ou repressores diferentes. Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento, em que o um ou mais domínios funcionais são fixados à enzima de alvejamento de RNA, de modo que, mediante a ligação ao RNA alvo, o domínio funcional está em uma orientação espacial, permitindo que o domínio funcional funcione em sua função atribuída; Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento, em

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211/776 que a composição compreende um complexo CRISPR-Cas que tem pelo menos três domínios funcionais, pelo menos um dos quais está associado à enzima de alvejamento de RNA e pelo menos dois dos quais estão associados ao gRNA.

[351] Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece uma composição de complexo CRISPR-Casl3b manipulada ou de ocorrência não natural, que compreende o RNA guia conforme discutido no presente documento e um Casl3b que é uma enzima de alvejamento de RNA, em que opcionalmente a enzima de alvejamento de RNA compreende pelo menos uma mutação, de modo que a enzima de alvejamento de RNA tenha não mais que 5% da atividade de nuclease da enzima que não tem a pelo menos uma mutação e, opcionalmente, uma ou mais que compreendem pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear. Em modalidades particulares, o RNA guia é modificado adicional ou alternativamente, a fim de assegurar ainda a ligação da enzima de alvejamento de RNA, mas para impedir a divagem pela enzima de alvejamento de RNA (conforme detalhado em outra parte no presente documento).

[352] Em modalidades particulares, a enzima de alvejamento de RNA é uma enzima Casl3b que tem uma atividade de nuclease reduzida de pelo menos 97% ou 100% em comparação com a enzima Casl3b que não tem pelo menos uma mutação. Em um aspecto, a invenção fornece uma composição aqui discutida,

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212/776 em que a enzima Casl3b compreende duas ou mais mutações, conforme discutido de outro modo no presente documento.

[353] Em modalidades particulares, é fornecido um sistema de alvejamento de RNA conforme descrito no presente documento acima, que compreende dois ou mais domínios funcionais. Em modalidades particulares, os dois ou mais domínios funcionais são domínios funcionais heterólogos. Em modalidades particulares, o sistema compreende uma proteína adaptadora que é uma proteína de fusão que compreende um domínio funcional, a proteína de fusão que compreende opcionalmente um ligante entre a proteína adaptadora e o domínio funcional. Em modalidades particulares, o ligante inclui um ligante GlySer. Adicional ou alternativamente, um ou mais domínios funcionais são fixados à proteína efetora de RNA por meio de um ligante, opcionalmente um ligante GlySer. Em modalidades particulares, o um ou mais domínios funcionais são fixados à enzima ade alvejamento de RNA através de um ou de ambos os domínios HERN.

[354] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento, em que o um ou mais domínios funcionais associados à proteína adaptadora ou à enzima de alvejamento de RNA é um domínio com capacidade para ativar ou reprimir a tradução de RNA. Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento, em que pelo menos um dentre o um ou mais domínios

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213/776 funcionais associados à proteína adaptadora tem uma ou mais atividades que compreendem atividade metilase, atividade desmetilase, atividade de ativação de transcrição, atividade de repressão de transcrição, atividade de fator de liberação de transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de integração de DNA, atividade de divagem de RNA, atividade de divagem de DNA ou atividade de ligação de ácido nucleico ou atividade de comutação molecular ou indutibilidade química ou indutibilidade à luz.

[355] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento que compreende uma sequência de aptâmero. Em modalidades particulares, a sequência de aptâmero é duas ou mais sequências de aptâmero específicas para a mesma proteína adaptadora. Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento, em que a sequência de aptâmero é duas ou mais sequências de aptâmero específicas para diferentes proteínas adaptadoras. Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento, em que a proteína adaptadora compreende MS2, PP7, Οβ, F2, GA, fr, JP501, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, Mil, MX1, TW18, VK , SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, φΟΒ5, óCb8r, óCbl2r, óCb23r, 7s, PRR1. Consequentemente, em modalidades particulares, o aptâmero é selecionado a partir de uma proteína de ligação que liga especificamente qualquer uma das proteínas adaptadoras

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214/776 listadas acima. Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento, em que a célula é uma célula eucariótica. Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento, em que a célula eucariótica é uma célula de mamífero, uma célula vegetal ou uma célula de levedura, em que a célula de mamífero é opcionalmente uma célula de camundongo. Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento, em que a célula de mamífero é uma célula humana.

[356] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição aqui discutida acima, em que há mais de um gRNA, e os gRNAs alvejam sequências diferentes, de modo que, quando a composição é empregada, exista multiplexação. Em um aspecto, a invenção fornece uma composição em que existe mais de um gRNA modificado pela inserção de sequência (ou sequências) de RNA distinta que se liga a uma ou mais proteínas adaptadoras.

[357] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento, em que uma ou mais proteínas adaptadoras associadas a um ou mais domínios funcionais estão presentes e ligadas à sequência (ou sequências) de RNA distinta inserida no RNA (ou RNAs) guia.

[358] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento, em que o RNA

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215/776 guia é modificado para ter pelo menos uma alça funcional de não codificação; por exemplo, em que pelo menos uma alça funcional de não codificação é repressiva; por exemplo, em que pelo menos uma alça funcional de não codificação compreende Alu.

[359] Em um aspecto, a invenção fornece um método para modificar a expressão de gene que compreende a administração a um hospedeiro ou expressão em um hospedeiro ín vivo de uma ou mais das composições conforme discutido no presente documento.

[360] Em um aspecto, a invenção fornece um método discutido no presente documento que compreende a entrega da composição ou molécula (ou moléculas) de ácido nucleico que codifica a mesma, em que a dita molécula (ou moléculas) de ácido nucleico é operacionalmente ligada à sequência reguladora (ou sequências reguladoras) e expressa ín vivo. Em um aspecto, a invenção fornece um método discutido no presente documento, em que a expressão ín vivo é através de um lentivírus, um adenovirus ou um AAV.

[361] Em um aspecto, a invenção fornece uma linhagem de células de mamífero das células conforme discutido no presente documento, em que a linhagem de células é, opcionalmente, uma linhagem de células humanas ou uma linhagem de células de camundongo. Em um aspecto, a invenção fornece um modelo de mamífero transgênico, opcionalmente um

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216/776 camundongo, em que o modelo foi transformado com uma composição discutida no presente documento ou é uma progênie do dito transformante.

[362] Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula (ou moléculas) de ácido nucleico que codifica RNA guia ou o complexo CRISPR-Cas de alvejamento de RNA ou a composição conforme discutida no presente documento. Em um aspecto, a invenção fornece um vetor que compreende: uma molécula de ácido nucleico que codifica um RNA guia (gRNA) que compreende uma sequência guia com capacidade para hibridizar a uma sequência alvo em um locus genômico de interesse em uma célula, em que a repetição direta do gRNA é modificado pela inserção de sequência (ou sequências) de RNA distinta que se liga a duas ou mais proteínas adaptadoras e em que cada proteína adaptadora está associada a um ou mais domínios funcionais; ou, em que o gRNA é modificado para ter pelo menos uma alça funcional de não codificação. Em um aspecto, a invenção fornece vetor (ou vetores) que compreende molécula (ou moléculas) de ácido nucleico que codifica: composição de complexo de CRISPR-Cas de ocorrência não natural ou manipulada que compreende o gRNA discutido no presente documento e uma enzima de alvejamento de RNA, em que opcionalmente a enzima de alvejamento de RNA compreende pelo menos uma mutação, de modo que a enzima de alvejamento de RNA não tenha mais que 5% da atividade de nuclease da enzima

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217/776 de alvejamento de RNA que não tem a pelo menos uma mutação e, opcionalmente, um ou mais que compreendem pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear. Em um aspecto, um vetor pode compreender adicionalmente elemento regulador (ou elementos reguladores) operacional em uma célula eucariótica operacionalmente ligada à molécula de ácido nucleico que codifica o RNA guia (gRNA) e/ou a molécula de ácido nucleico que codifica a enzima de alvejamento de RNA e/ou a sequência (ou sequências) de localização de nuclear opcional.

[363] Em um aspecto, a invenção fornece um kit que compreende um ou mais dos componentes descritos acima. Em algumas modalidades, o kit compreende um sistema de vetor como descrito acima e instruções para usar o kit.

[364] Em um aspecto, a invenção fornece um método de triagem para ganho de função (GOF) ou perda de função (LOF) ou para triagem de RNAs de não codificação ou regiões reguladoras potenciais (por exemplo, intensificadores, repressores) que compreendem a linhagem de células conforme discutido no presente documento ou células do modelo discutido no presente documento que contêm ou expressam a enzima de alvejamento de RNA e introdução de uma composição conforme discutido no presente documento em células do modelo ou linhagem de células, de modo que o gRNA inclua um ativador ou um repressor, e monitoramento de GOF ou LOF, respectivamente, em relação àquelas células em que o gRNA

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218/776 introduzido inclui um ativador ou em relação àquelas células em que o gRNA introduzido inclui um repressor.

[365] Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca de composições manipuladas de ocorrência não natural, sendo que cada uma compreende um RNA guia de CRISPR de alvejamento de RNA (gRNA) que compreende uma sequência guia com capacidade para hibridizar a uma sequência de RNA alvo de interesse em uma célula, uma enzima de alvejamento de RNA, em que a enzima de alvejamento de RNA compreende pelo menos uma mutação, de modo que a enzima de alvejamento de RNA tenha não mais que 5% da atividade de nuclease da enzima de alvejamento de RNA que não tem a pelo menos uma mutação, em que o gRNA é modificado pela inserção de sequência (ou sequências) de RNA distinta que se liga a uma ou mais proteínas adaptadoras e em que a proteína adaptadora está associada a um ou mais domínios funcionais, em que a composição compreende uma ou mais ou duas ou mais proteínas adaptadoras, em que cada proteína está associada a um ou mais domínios funcionais, e em que os gRNAs compreendem uma biblioteca ampla de genoma que compreende uma pluralidade de RNAs guia de alvejamento de RNA (gRNAs) . Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que a enzima de alvejamento de RNA tem uma atividade de nuclease diminuída de pelo menos 97%, ou 100%, em comparação com a enzima de alvejamento de RNA

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219/776 que não tem a pelo menos uma mutação. Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que a proteína adaptadora é uma proteína de fusão que compreende o domínio funcional. Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que o gRNA não é modificado pela inserção de sequência (ou sequências) de RNA distinta que se ligam a uma ou duas ou mais proteínas adaptadoras. Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que o um ou dois ou mais domínios funcionais estão associados à enzima de alvejamento de RNA. Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que a população de células é uma população de células eucarióticas. Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que a célula eucariótica é uma célula de mamífero, uma célula vegetal ou uma célula de levedura. Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que a célula de mamífero é uma célula humana. Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que a população de células é uma população de células-tronco embrionárias (ES).

[366] Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que

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220/776 o alvejamento é de cerca de 100 ou mais sequências de RNA. Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que o alvejamento é de cerca de 1000 ou mais sequências de RNA. Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que o alvejamento é de cerca de 20.000 ou mais sequências. Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que o alvejamento é do transcriptoma inteiro. Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que o alvejamento é de um painel de sequências alvo focalizadas em uma via relevante ou desejável. Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que a via é uma via imune. Em um aspecto, a invenção fornece uma biblioteca conforme discutido no presente documento, em que a via é uma via de divisão celular.

[367] Em um aspecto, a invenção fornece um método para gerar uma célula eucariótica de modelo que compreende um gene com expressão modificada. Em algumas modalidades, um gene de doença é qualquer gene associado a um aumento no risco de ter ou desenvolver uma doença. Em algumas modalidades, o método compreende (a) introduzir um ou mais vetores que codificam os componentes do sistema descrito no presente documento acima em uma célula eucariótica e (b)

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221/776 permitir que um complexo CRISPR se ligue a um polinucleotídeo alvo, a fim de modificar a expressão de um gene, gerando assim uma célula eucariótica de modelo que compreende a expressão de gene modificada.

[368] As informações estruturais fornecidas no presente documento permitem interrogar a interação de RNA guia com o RNA alvo e a enzima de alvejamento de RNA, permitindo a manipulação ou alteração da estrutura de RNA guia para otimizar a funcionalidade de todo o sistema CRISPRCas de alvejamento de RNA. Por exemplo, o RNA guia pode ser estendido, sem colidir com a proteína de alvejamento de RNA pela inserção de proteínas adaptadoras que podem se ligar ao RNA. Essas proteínas adaptadoras podem adicionalmente recrutar proteínas efetoras ou fusões que compreendem um ou mais domínios funcionais.

[369] Um aspecto da invenção é que os elementos acima são compreendidos em uma única composição ou compreendidos em composições individuais. Essas composições podem ser vantajosamente aplicadas a um hospedeiro para elicitar um efeito funcional no nível genômico.

[370] O versado na técnica entenderá que modificações no RNA guia que permitem a ligação do adaptador + domínio funcional, mas não o posicionamento adequado do adaptador + domínio funcional (por exemplo, devido ao impedimento estérico dentro da estrutura tridimensional do

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222/776 complexo CRISPR) são modificações que não são pretendidas. 0 um ou mais RNAs guia modificados podem ser modificados, por meio da introdução de uma sequência (ou sequências) de RNA distinta 5' da repetição direta, dentro da repetição direta, ou 3' da sequência guia.

[371] 0 RNA guia modificado, a enzima de alvejamento de RNA inativado (com ou sem domínios funcionais) e a proteína de ligação com um ou mais domínios funcionais, podem ser, cada uma, individualmente compreendidas em uma composição e administradas a um hospedeiro individual ou coletivamente. Alternativamente, esses componentes podem ser fornecidos em uma única composição para administração a um hospedeiro. A administração a um hospedeiro pode ser realizada através de vetores virais conhecidos pelo versado na técnica ou descritos no presente documento para entrega a um hospedeiro (por exemplo, vetor lentiviral, vetor adenoviral, vetor AAV) . Conforme explicado no presente documento, o uso de marcadores de seleção diferentes (por exemplo, para seleção de gRNA lentiviral) e a concentração de gRNA (por exemplo, dependendo de se múltiplos gRNAs são usados) pode ser vantajoso para elicitar um efeito aperfeiçoado.

[372] Com o uso das composições fornecidas, o versado na técnica pode, de forma vantajosa e específica, alvejar loci únicos ou múltiplos com o mesmo ou diferentes

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223/776 domínios funcionais para elicitar um ou mais eventos genômicos. As composições podem ser aplicadas em uma ampla variedade de métodos para triagem em bibliotecas em células e modelagem funcional ín vivo (por exemplo, ativação de gene de lincRNA e identificação de função; modelagem de ganho de função; modelagem de perda de função; o uso das composições da invenção para estabelecer linhagens de células e animais transgênicos para fins de otimização e triagem).

[373] A presente invenção compreende o uso das composições da presente invenção para estabelecer e usar eventos de alvejamento de RNA por CRISPR condicional ou induzível. (Consultar, por exemplo, Platt et al., Cell (2014), http://dx.doi.Org/10.1016/j.cell.2014.09.014, ou publicações de patente PCT citadas no presente documento, como WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667 ) , que não são considerados antes da presente invenção ou pedido). Por exemplo, a célula alvo compreende enzima CRISPR de alvejamento de RNA de forma condicional ou induzível (por exemplo, na forma de construtos dependentes de Cre) e/ou a proteína adaptadora de forma condicional ou induzível e, na expressão de um vetor introduzido na célula alvo, o vetor expressa o que induz ou origina a condição da expressão da enzima de alvejamento de sRNA e/ou expressão de adaptador na célula alvo. A aplicação do ensinamento e das composições da presente invenção com o método conhecido para criar um

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224/776 complexo CRISPR, a expressão de gene induzível afetada por domínios funcionais também são um aspecto da presente invenção. Alternativamente, a proteína adaptadora pode ser fornecida como um elemento condicional ou induzível com uma enzima de alvejamento de sRNA condicional ou induzível para fornecer um modelo eficaz para fins de triagem, o que vantajosamente exige apenas um projeto e administração mínimos de gRNAs específicos para um grande número de aplicações.

RNA-guia de acordo com a invenção compreendendo uma sequência-guia morta [374] Em um aspecto, a invenção fornece sequências guia que são modificadas de uma maneira que permite a formação do complexo CRISPR e a ligação bem-sucedida ao alvo, enquanto ao mesmo tempo, não permite uma atividade de nuclease bem-sucedida (isto é, sem atividade de nuclease / sem atividade de indel). Por questões de explicação, tais sequências guia modificadas são mencionadas como guias mortos ou sequências guia mortas. Esses guias mortos ou sequências guia mortas podem ser consideradas como cataliticamente inativas ou conformacionalmente inativas em relação à atividade da nuclease. De fato, as sequências guia mortas podem não se envolver suficientemente no emparelhamento de bases produtivo com relação à capacidade de promover atividade catalítica ou de distinguir a atividade

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225/776 de ligação no alvo e fora do alvo. Brevemente, o ensaio envolve sintetizar um RNA alvo CRISPR e RNAs guias que compreendem incompatibilidades com o RNA alvo, combinar os mesmos com a enzima de alvejamento de RNA e analisar a divagem com base em géis com base na presença de bandas geradas por produtos de divagem e quantificar a divagem com base em intensidades de banda relativas.

[375] Por conseguinte, em um aspecto relacionado, a invenção fornece um sistema CRISPR-Cas de alvejamento de RNA de composição manipulada ou de ocorrência não natural que compreende um alvejamento de RNA funcional conforme descrito no presente documento, e um RNA guia (gRNA) em que o gRNA compreende uma sequência guia morta pela qual o gRNA tem capacidade para hibridizar com uma sequência alvo, de modo que o sistema CRISPR-Cas de alvejamento de RNA seja direcionado a um locus genômico de interesse em uma célula sem atividade de divagem de RNA detectável de uma enzima de alvejamento de RNA não mutante do sistema. Deve ser entendido que qualquer um dos gRNAs de acordo com a invenção, conforme descrito no presente documento em outro lugar pode ser usado como gRNAs mortos/gRNAs que compreendem uma sequência guia morta conforme descrito no presente documento abaixo. Qualquer um dos métodos, produtos, composições e usos conforme descrito no presente documento em outro lugar é igualmente aplicável aos gRNAs mortor/gRNAs que compreendem

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226/776 uma sequência guia morta, conforme detalhado adicionalmente abaixo. Por meio de orientação adicional, os seguintes aspectos e modalidades particulares são fornecidos.

[376] A capacidade de uma seguência guia morta de direcionar a ligação específica para sequência de um complexo CRISPR para uma sequência alvo de RNA pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado. Por exemplo, os componentes de um sistema CRISPR suficientes para formar um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia morta a ser testada, podem ser fornecidos a uma célula hospedeira que tem a sequência-alvo correspondente, tal como pela transfecção com vetores que codificam os componentes da sequência CRISPR, seguida por uma avaliação da divagem preferencial dentro da sequênciaalvo. Por exemplo, a divagem de uma sequência de polinucleotídeos de RNA alvo pode ser avaliada em um tubo de teste fornecendo-se a sequência-alvo, os componentes de um complexo CRISPR, incluindo a sequência-guia morta a ser testada e uma sequência-guia de controle diferente da sequência-guia morta de teste, e comparando a ligação ou taxa de divagem na sequência-alvo entre as reações de sequência-guia de teste e controle. Outros ensaios são possíveis e irão ocorrer àqueles versados na técnica. Uma sequência guia morta pode ser selecionada para alvejar qualquer sequência alvo. Em algumas modalidades, a sequência-alvo é uma sequência dentro de um genoma de uma

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227/776 célula .

[377] Como explicado adicionalmente no presente documento, vários parâmetros estruturais permitem que uma estrutura adequada chegue a tais guias mortos. As sequências guia mortas são tipicamente mais curtas que as respectivas sequências guia que resultam na divagem ativa do RNA. Em modalidades particulares, os guias mortos são 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% mais curtos que os respectivos guias direcionados aos mesmos.

[378] Conforme explicado abaixo e conhecido na técnica, um aspecto da especificidade de alvejamento de gRNA - RNA é a sequência de repetição direta, que deve ser adequadamente ligada a tais guias. Em particular, isso implica que as sequências de repetição direta são projetadas dependentes da origem da enzima de alvejamento de RNA. Dessa forma, os dados estruturais disponíveis para sequências guia mortas validadas podem ser usados para projetar equivalentes específicos de Casl3b. A similaridade estrutural entre, por exemplo, os domínios de nuclease ortólogos HERN de duas ou mais proteínas efetoras Casl3b pode ser usada para transferir guias mortos equivalentes de projeto. Dessa forma, o guia morto no presente documento pode ser adequadamente modificado em comprimento e sequência para refletir tais equivalentes específicos de Casl3b, permitindo a formação do complexo CRISPR e a ligação bem-sucedida ao RNA alvo, ao

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228/776 mesmo tempo em que não permite atividade de nuclease bemsucedida .

[379] 0 uso de guias mortos no contexto no presente documento, bem como no estado da técnica, fornece uma plataforma surpreendente e inesperada para a biologia de rede e/ou biologia de sistemas em aplicações in vitro, ex vivo e in vivo, permitindo o alvejamento de gene multiplex, e, em particular, o alvejamento de gene multiplex bidirecional. Antes do uso de guias mortos, tratar de vários alvos foi um desafio e, em alguns casos, não é possível. Com o uso de guias mortos, múltiplos alvos e, dessa forma, múltiplas atividades, podem ser tratados, por exemplo, na mesma célula, no mesmo animal ou no mesmo paciente. Tal multiplexação pode ocorrer ao mesmo tempo ou escalonada durante um período de tempo desejado.

[380] Por exemplo, os guias mortos permitem usar o gRNA como um meio para o alvejamento de gene, sem a consequência da atividade da nuclease, ao mesmo tempo em que fornecem meios direcionados para ativação ou repressão. O RNA guia que compreende um guia morto pode ser modificado para incluir adicionalmente elementos de uma maneira que permita a ativação ou repressão da atividade de gene, em particular adaptadores de proteínas (por exemplo, aptâmeros) conforme descrito no presente documento em outro lugar, permitindo a colocação funcional de efetores de gene (por

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229/776 exemplo, ativadores ou repressores da atividade de gene). Um exemplo é a incorporação de aptâmeros, conforme explicado aqui e no estado da técnica. Mediante a manipulação do gRNA que compreende um guia morto para incorporar aptâmeros de interação de proteína (Konermann et al., Genome-scale transcription activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex, doi: 10.1038/naturel4136, incorporado aqui por referência), pode-se montar múltiplos domínios efetores distintos. Tais podem ser modelados após processos naturais.

Provisões gerais [381] Em um aspecto, a invenção fornece um sistema de ligação de ácido nucleico. A hibridização in situ do RNA com sondas complementares é uma técnica poderosa. Os oligonucleotídeos de DNA tipicamente fluorescentes são usados para detectar ácidos nucleicos por hibridização. A eficiência aumentada foi alcançada por determinadas modificações, como os ácidos nucleicos bloqueados (LNAs), mas permanece a necessidade por alternativas eficazes e versáteis. A invenção fornece um sistema eficaz e adaptável para hibridização in sítu.

[382] Nas modalidades da invenção, os termos sequência guia e RNA guia são usados de forma intercambiável, conforme nos documentos citados acima, como WO 2014/093622 (PCT/US2013/07 46 67) . Em geral, uma sequência guia é qualquer sequência de polinucleotídeos que tem complementaridade

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230/776 suficiente com uma sequência de polinucleotídeos alvo para hibridizar com a sequência-alvo e ligação específica para sequência direta de um complexo CRISPR à sequência-alvo. Em algumas modalidades, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e sua sequência-alvo correspondente, quando idealmente alinhadas com o uso de um algoritmo de alinhamento adequado, é cerca de ou mais do que cerca de 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% ou mais. O alinhamento ideal pode ser determinado com o uso de qualquer algoritmo adequado para alinhar sequências, o exemplo não limitante do qual inclui o algoritmo de Smith-Waterman, o algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmos com base na Transformada de Burrows-Wheeler (por exemplo, o Alinhador Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponível em www.novocraft.com); ELAND (Illumina, San Diego, CA) e SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn) e Maq (disponível em maq.sourceforge.net). Em algumas modalidades, uma sequência guia tem cerca de ou mais do que cerca de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, uma sequência guia tem menos do que cerca de 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 ou menos nucleotídeos de comprimento. Preferencialmente, a sequência-guia tem 10 a 30 nucleotídeos de comprimento. A

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231/776 capacidade de uma sequência guia de direcionar a ligação específica para sequência de um complexo CRISPR a uma sequência-alvo pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado. Por exemplo, os componentes de um sistema CRISPR suficientes para formar um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia a ser testada, podem ser fornecidos a uma célula hospedeira que tem a sequência-alvo correspondente, tal como pela transfecção com vetores que codificam os componentes da sequência CRISPR, seguida por uma avaliação da divagem preferencial dentro da seguência-alvo, tal como pelo ensaio Surveyor, conforme descrito no presente documento. Similarmente, a divagem de uma sequência de polinucleotídeos alvo pode ser avaliada em um tubo de teste fornecendo-se a sequência-alvo, os componentes de um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia a ser testada e uma sequência guia de controle diferente da sequência guia de teste, e comparando a ligação ou taxa de divagem na sequência-alvo entre as reações de sequência guia de teste e controle. Outros ensaios são possíveis e irão ocorrer àqueles versados na técnica. Uma sequência guia pode ser selecionada para alvejar qualquer sequência alvo. Em algumas modalidades, a sequência-alvo é uma sequência dentro de um genoma de uma célula. As sequências-alvo exemplificativas incluem aquelas que são exclusivas no genoma-alvo.

[383] Em geral, e ao longo deste relatório

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232/776 descritivo, o termo vetor se refere a uma molécula de ácido nucleico que tem capacidade para transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Os vetores incluem, porém sem limitação, moléculas de ácido nucleico que são de fita simples, de fita dupla ou parcialmente de fita dupla; moléculas de ácido nucleico que compreendem uma ou mais extremidades livres, sem extremidades livres (por exemplo, circulares); moléculas de ácido nucleico que compreendem DNA, RNA ou ambos; e outras variedades de polinucleotídeos conhecidos na técnica. Um tipo de vetor é um plasmídeo, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular em que segmentos adicionais de DNA podem ser inseridos, como por meio de técnicas convencionais de clonagem molecular. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que sequências de DNA ou RNA derivadas de vírus estão presentes no vetor para embalagem em um vírus (por exemplo, retrovirus, retrovirus com defeito de replicação, adenovirus, adenovirus com defeito de replicação e virus adenoassociados). Os vetores virais também incluem polinucleotídeos transportados por um vírus para transfecção em uma célula hospedeira. Determinados vetores têm capacidade para replicação autônoma em uma célula hospedeira em que são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que têm uma origem bacteriana de replicação e vetores epissômicos de mamífero). Outros vetores (por exemplo, vetores não epissômicos de mamífero)

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233/776 são integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante introdução na célula hospedeira e são, assim, replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, determinados vetores têm capacidade para direcionar a expressão de genes aos quais estão ligados de maneira funcional. Tais vetores são referidos no presente documento como vetor de expressão. Os vetores para e que resultam na expressão em uma célula eucariótica podem ser mencionados no presente documento como vetores de expressão eucarióticos. Os vetores de expressão comuns de utilidade em técnicas de DNA recombinantes estão frequentemente na forma de plasmideos.

[384] Os vetores de expressão recombinantes podem compreender um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para a expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem um ou mais elementos reguladores, que podem ser selecionados com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, que está operacionalmente ligado à sequência de ácidos nucleicos a ser expressa. Dentro de um vetor de expressão recombinante, operacionalmente ligado significa que a sequência de nucleotídeos de interesse está ligada ao elemento regulador (ou elementos reguladores) de uma maneira que permita a expressão da sequência de nucleotídeos (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira

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234/776 quando o vetor é introduzido na célula hospedeira).

[385] 0 termo elemento regulador destina-se a incluir promotores, intensificadores, sítios de entrada ribossômica interna (IRES) e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de terminação de transcrição, como sinais de poliadenilação e sequências poli-U). Tais elementos reguladores são descritos, por exemplo, em Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Califórnia, EUA (1990). Os elementos reguladores incluem aqueles que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência nucleotídica em muitos tipos de células hospedeiras e aqueles que direcionam a expressão da sequência nucleotídica apenas em certas células hospedeiras (por exemplo, sequências reguladoras específicas de tecidos). Um promotor específico de tecido pode direcionar a expressão principalmente em um tecido de interesse desejado, como músculo, neurônio, osso, pele, sangue, órgãos específicos (por exemplo, fígado, pâncreas) ou tipos celulares específicos (por exemplo, linfócitos). Os elementos reguladores também podem direcionar a expressão de maneira dependente do tempo, como dependente do ciclo celular ou dependente do estágio de desenvolvimento, que pode ou não ser específico de tecido ou tipo de célula. Em algumas modalidades, um vetor compreende um ou mais promotores de pol III (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais promotores de

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235/776 pol III), um ou mais promotores de pol II (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, ou mais promotores de pol II), um ou mais promotores de pol I (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais promotores de pol I) ou combinações dos mesmos. Exemplos de promotores de pol III incluem, sem limitação, promotores U6 e H1. Exemplos de promotores de pol II incluem, entre outros, o promotor LTR do virus retroviral do sarcoma Rous (RSV) (opcionalmente com o intensificador de RSV), o promotor do citomegalovirus (CMV) (opcionalmente com o intensificador de CMV) [ver, por exemplo, Boshart et al, Cell, 41: 521 a 530 (1985)], o promotor SV40, o promotor de di-hidrofolato redutase, o promotor de β-actina, o promotor de fosfoglicerol quinase (PGK) e o promotor EFla. Também abrangidos pelo termo elemento regulador encontram-se os elementos de aprimoramento, como o WPRE; intensificadores de CMV; o segmento R-U5' em LTR de HTLV-I (Mol. Cell. Biol., Vol. 8 (1), páginas 466 a 472, 1988); intensificador SV40; e a sequência de introns entre os exons 2 e 3 da β-globina de coelho (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78 (3), páginas 1.527-31, 1981) . Será apreciado pelos versados na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nivel de expressão desejado, etc. Um vetor pode ser introduzido nas células hospedeiras para desse modo, produzem transcritos, proteínas ou peptídeos, incluindo

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236/776 proteínas ou peptídeos de fusão, codificados por ácidos nucleicos como aqui descrito (por exemplo, transcritos, repetições palindrômicas curtas, intercaladas regularmente intercaladas (CRISPR), proteínas, enzimas, formas mutantes, proteínas de fusão dos mesmos, etc.).

[386] Vetores vantajosos incluem lentivírus e vírus adenoassociados, e tipos desses vetores também podem ser selecionados para direcionar tipos específicos de células.

[387] Conforme usado no presente documento, o termo crRNA ou RNA guia ou RNA guia único ou sgRNA ou um ou mais componentes de ácido nucleico de uma proteína efetora de locus CRISPR-Cas de Tipo V ou Tipo VI compreende qualquer sequência polinucleotídica com complementaridade suficiente com uma sequência de ácidos nucleicos alvo para hibridizar com a sequência de ácidos nucleicos alvo e ligação direta específica à sequência de um complexo de direcionamento de ácido nucleico à sequência de ácidos nucleicos alvo.

[388] Em certas modalidades, o sistema CRISPR conforme aqui fornecido pode fazer uso de um crRNA ou polinucleotídeo análogo que compreende uma sequência guia, em que o polinucleotídeo é um RNA, um DNA ou uma mistura de RNA e DNA e/ou em que o polinucleotídeo compreende um ou mais análogos de nucleotídeos. A sequência pode compreender qualquer estrutura, incluindo, sem limitação, uma estrutura

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237/776 de um crRNA nativo, como uma protuberância, um gancho de cabelo ou uma estrutura de alça de haste. Em certas modalidades, o polinucleotideo que compreende a sequência guia forma um duplex com uma segunda sequência polinucleotidica que pode ser uma sequência de RNA ou DNA.

[389] Em certas modalidades, é feito uso de RNAs guia quimicamente modificados. Exemplos de modificações químicas de RNA guia incluem, sem limitação, incorporação de 2'-0-metila (M) , 2'-0-metil 3'fosforotioato (MS) ou 2'-0metil 3'thioPACE (MSP) em um ou mais nucleotídeos terminais. Esses RNAs guia quimicamente modificados podem compreender maior estabilidade e atividade aumentada em comparação com os RNAs guia não modificados, embora a especificidade no alvo versus fora do alvo não seja previsível. (Consultar Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985-9, doi: 10.1038/nbt.3290, publicado online em 29 de junho de 2015) . Os RNAs guia quimicamente modificados incluem ainda, sem limitação, RNAs com ligações fosforotioato e nucleotídeos de ácido nucleico bloqueado (LNA) que compreendem uma ponte de metileno entre os carbonos 2' e 4' do anel ribose.

[390] Em algumas modalidades, o grau de complementaridade, quando idealmente alinhado com o uso de um algoritmo de alinhamento adequado, é de cerca de 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% ou mais. O alinhamento ideal pode ser determinado com o uso de qualquer

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238/776 algoritmo adequado para o alinhamento de sequências, dos quais um exemplo não limitativo inclui o algoritmo SmithWaterman, o algoritmo Needleman-Wunsch, algoritmos baseados na Transformação Burrows-Wheeler (por exemplo, o Alinhador Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponível em www.novocraft.com), ELAND (Illumina, San Diego, CA, EUA), SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn) e Maq (disponível em maq.sourceforge.net). A capacidade de uma sequência guia (dentro de um RNA guia de direcionamento de ácido nucleico) de direcionar a ligação específica de sequência de um complexo de direcionamento de ácido nucleico a uma sequência de ácidos nucleicos alvo pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado. Por exemplo, os componentes de um sistema CRISPR direcionado a ácidos nucleicos suficientes para formar um complexo alvo de ácidos nucleicos, incluindo a sequência guia a ser testada, podem ser fornecidos a uma célula hospedeira com a sequência de ácidos nucleicos alvo correspondente, como por transfecção com vetores que codificam os componentes do complexo de direcionamento de ácidos nucleicos, seguidos de uma avaliação do direcionamento preferencial (por exemplo, divagem) dentro da sequência de ácidos nucleicos alvo, como pelo ensaio Surveyor, como descrito no presente documento. Da mesma forma, a divagem de uma sequência alvo de ácido nucleico

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239/776 pode ser avaliada em um tubo de ensaio, fornecendo a sequência alvo de ácido nucleico, componentes de um complexo alvo de ácido nucleico, incluindo a sequência guia a ser testada e uma sequência guia de controle diferente da guia de teste e comparando a ligação ou taxa de divagem na sequência alvo entre as reações da sequência guia de teste e controle. Outros ensaios são possíveis e ocorrerão para os versados na técnica. Uma sequência guia e, portanto, um RNA guia de direcionamento de ácido nucleico pode ser selecionado para direcionar qualquer sequência de ácidos nucleicos alvo. A sequência alvo pode ser DNA. A sequência alvo pode ser qualquer sequência de RNA. Em algumas modalidades, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada do grupo que consiste em RNA mensageiro (mRNA), pré-mRNA, RNA ribossômico (rRNA), RNA de transferência (tRNA), micro-RNA (miRNA), RNA interferente pequeno (siRNA), RNA nuclear pequeno (snRNA), RNA nucleolar pequeno (snoRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), RNA não codificante (ncRNA), RNA não codificante longo (IncRNA) e RNA citoplasmático pequeno (scRNA) Em algumas modalidades preferenciais, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada do grupo que consiste em mRNA, pré-mRNA e rRNA. Em algumas modalidades preferenciais, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada do grupo que consiste em ncRNA

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240/776 e IncRNA. Em algumas modalidades mais preferenciais, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de mRNA ou uma molécula pré-mRNA.

[391] Em algumas modalidades, um RNA guia de direcionamento de ácido nucleico é selecionado para reduzir a estrutura secundária em grau dentro do RNA guia de direcionamento de RNA. Em algumas modalidades, aproximadamente ou menos de cerca de 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% ou menos dos nucleotídeos de RNA guia de direcionamento de ácido nucleico guia participa do emparelhamento de bases autocomplementares quando é idealmente dobrado. A dobragem ideal pode ser determinada por qualquer algoritmo de dobragem de polinucleotideo adequado. Alguns programas são baseados no cálculo da energia livre mínima de Gibbs. Um exemplo de um desses algoritmos é o mFold, como descrito por Zuker e Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133 a 148) . Outro exemplo de algoritmo de dobragem é o servidor online RNAfold, desenvolvido no Instituto de Química Teórica da Universidade de Viena, com o uso do algoritmo de previsão da estrutura do centroide (veja, por exemplo, AR Gruber et ai., 2008, Cell 106(1): 23 e 24; e PA Carr e GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62).

[392] Em certas modalidades, um RNA guia ou crRNA pode compreender, consistir essencialmente em, ou consistir

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241/776 em uma sequência de repetição direta (DR) e uma sequência guia ou sequência espaçadora. Em certas modalidades, o RNA guia ou o crRNA pode compreender, consistir essencialmente em, ou consistir em uma sequência de repetição direta fundida ou ligada a uma sequência guia ou sequência espaçadora. Em certas modalidades, a sequência de repetição direta pode estar localizada a montante (isto é, 5') da sequência guia ou sequência espaçadora. Em outras modalidades, a sequência de repetição direta pode estar localizada a jusante (isto é, 3') da sequência guia ou sequência espaçadora.

[393] Em certas modalidades, o crRNA compreende uma alça de haste, preferencialmente uma alça de haste única. Em certas modalidades, a sequência de repetição direta forma uma alça de haste, preferencialmente uma alça de haste única.

[394] Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é de 15 a 35 nt. Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é de pelo menos 15 nucleotídeos, de preferência pelo menos 18 nt, como pelo menos 19, 20, 21, 22 ou mais nt. Em certas modalidades, o comprimento do espaçador é de 15 a 17 nt, por exemplo, 15, 16 ou 17 nt, de 17 a 20 nt, por exemplo, 17, 18, 19 ou 20 nt, de 20 a 24 nt, por exemplo, 20, 21, 22, 23 ou 24 nt, de 23 a 25 nt, por exemplo, 23, 24 ou 25 nt, de 24 a 27 nt, por exemplo, 24, 25, 26 ou 27 nt, de 27 a 30 nt, por exemplo, 27, 28, 29 ou 30 nt, de 30 a 35 nt, por exemplo, 30, 31, 32,

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33, 34 ou 35 nt, ou 35 nt ou mais.

[395] Para minimização de efeitos de toxicidade e fora do alvo, será importante para controlar a concentração de RNA guia de direcionamento de RNA entregue. Concentrações ideais de RNA guia de direcionamento de ácidos nucléicos podem ser determinadas testando diferentes concentrações em um modelo animal eucariota celular ou não humano e com o uso de sequenciamento profundo para analisar a extensão da modificação em possíveis loci genômicos fora do alvo. A concentração que fornece o nível mais alto de modificação no alvo, minimizando o nível de modificação fora do alvo, deve ser escolhida para entrega ín vivo. 0 sistema de direcionamento de RNA é derivado vantajosamente de um sistema CRISPR-Casl3b. Em algumas modalidades, um ou mais elementos de um sistema de direcionamento de RNA são derivados de um organismo particular que compreende um sistema de direcionamento de RNA endógeno de um sistema de proteína efetora Casl3b, conforme discutido aqui.

[396] Os termos ortólogos (também aqui referido como ortólogo) e homólogos (também aqui referido como homólogo) são bem conhecidos na técnica. Por meio de orientações adicionais, um homólogo de uma proteína como usado aqui é uma proteína da mesma espécie que desempenha a mesma função ou uma função similar à da qual é um homólogo. As proteínas homólogas podem, mas não precisam estar

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243/776 relacionadas estruturalmente, ou estão apenas parcialmente relacionadas estruturalmente. Um ortólogo de uma proteína como usado aqui é uma proteína de uma espécie diferente que desempenha a mesma função ou uma função similar à da qual é um ortólogo. As proteínas ortólogas podem, mas não precisam estar relacionadas estruturalmente, ou estão apenas parcialmente relacionadas estruturalmente. Em modalidades particulares, o homólogo ou ortólogo de uma proteína Casl3b como referido no presente documento tem uma homologia ou identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, com mais preferência pelo menos 85%, ainda com mais preferência pelo menos 90%, como, por exemplo, pelo menos 95% com uma proteína efetora Casl3b apresentada na Figura 1.

[397] Será observado que qualquer uma das funcionalidades aqui descritas pode ser manipulada em enzimas CRISPR de outros ortólogos, incluindo enzimas quiméricas que compreendem fragmentos de múltiplos ortólogos. Exemplos de tais ortólogos são descritos em outras partes deste documento. Assim, as enzimas quiméricas podem compreender fragmentos de ortólogos da enzima CRISPR de um organismo que inclui, sem limitação, Bergeyella_r Prevotella_r Porphyromonas_r Bacteroides, Alístípes, Ríemerella, Myroides, Flavobacteríum, Capnocytophaga, Chryseobacteríum, Phaeodactylíbacter_r Paludofactus. Uma enzima quimérica pode

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244/776 compreender um primeiro fragmento e um segundo fragmento, e os fragmentos, em que dentre o primeiro e segundo fragmentos é de ou proveniente de uma proteína efetiva Casl3b de uma primeira espécie (por exemplo, uma proteína efetiva Casl3b conforme listado na Figura 1) e o outro fragmento é de ou proveniente de um ortólogo da enzima CRISPR de uma espécie diferente.

[398] Em uma modalidade da invenção, é fornecida uma proteína efetora que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogas ou idênticas a uma proteína efetora Casl3b de tipo selvagem selecionada do grupo que consiste em Porphyromonas gulae Casl3b (número de acesso WP_039434803), Prevotella sp. P5125 Casl3b (número de acesso WP_044065294), Porphyromonas gíngívalís Casl3b (número de acesso WP_053444417), Porphyromonas sp. COT-052 OH4946 Casl3b (número de acesso WP_039428968), Bacteroídes pyogenes Casl3b (número de acesso WP_034542281), Ríemerella anatípestífer Casl3b (número de acesso WP_004919755). As proteínas efetoras com máxima preferência são aquelas de pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogos ou idênticos a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem selecionada do grupo que consiste em Porphyromonas gulae Casl3b (número de acesso WP_039434803),

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Prevotella sp. P5-125 Casl3b (número de acesso WP_044065294) , Porphyromonas gingivalis Casl3b (número de acesso WP_053444417), Porphyromonas sp. COT-052 OH4946 Casl3b (número de acesso WP_039428968); e mais especificamente preferenciais são Porphyromonas gulae Casl3b (número de acesso WP_039434803) ou Prevotella sp. P5-125 Casl3b (número de acesso WP_044065294) .

[399] Verificou-se que vários ortólogos Casl3b são caracterizados por motivos comuns. Por conseguinte, em modalidades particulares, a proteína efetora Casl3b é uma proteína que compreende uma sequência com pelo menos 70% de identidade de sequência com uma ou mais das sequências que consistem em DKHXFGAFLNLARHN (SEQ ID NO: 1), GLLFFVSLFLDK (SEQ ID NO: 2), SKIXGFK (SEQ ID NO: 3), DMLNELXRCP (SEQ ID NO: 4), RXZDRFPYFALRYXD (SEQ ID NO: 5) e LRFQVBLGXY (SEQ ID NO: 6) . Em outras modalidades particulares, a proteína efetora Casl3b compreende uma sequência com pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 2, 3, 4, 5 ou todas as 6 dessas sequências. Em outras modalidades particulares, a identidade de sequência com essas sequências é de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%. Em outras modalidades particulares, a proteína efetora Casl3b é uma proteína que compreende uma sequência que tem 100% de identidade de sequência com GLLFFVSLFL (SEQ ID NO: 7) e RHQXRFPYF (SEQ ID NO: 8). Em outras modalidades particulares, o efetor Casl3b

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246/776 é uma proteína efetora Casl3b que compreende uma sequência com 100% de identidade de sequência com RHQDRFPY (SEQ ID NO: 9) .

[400] Em uma modalidade da invenção, a proteína efetora compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de homologia ou identidade de sequência com uma sequência de consenso de proteínas efetoras do Tipo VIB, incluindo sem limitação uma sequência de consenso aqui descrita.

[401] Em uma modalidade da invenção, a proteína efetora compreende pelo menos um domínio HEPN, incluindo, sem limitação, domínios HEPN aqui descritos, domínios HEPN conhecidos na técnica e domínios reconhecidos como domínios HEPN em comparação com sequências de consenso e motivos. Em um exemplo não limitativo, uma sequência de consenso pode ser derivada das sequências de ortólogos Casl3b aqui fornecidas.

[402] Em uma modalidade da invenção, a proteína efetora compreende um ou mais domínios HEPN que compreendem uma sequência de motivos RxxxxH. A sequência de motivo RxxxxH pode ser, sem limitação, de um domínio HEPN aqui descrito ou um domínio HEPN conhecido na técnica. As sequências de motivos RxxxxH incluem ainda sequências de motivos criadas pela combinação de partes de dois ou mais domínios HEPN.

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247/776 [403] Em algumas modalidades, a proteína efetora compreende dois domínios HEPN. Em algumas modalidades, a proteína efetora compreende pelo menos um domínio HEPN cataliticamente ativo que compreende um motivo RxxxxH. Em algumas modalidades, a proteína efetora compreende dois domínios HEPN cataliticamente ativos, em que cada um compreende um motivo RxxxxH. Em algumas modalidades, a proteína efetora compreende pelo menos um domínio HEPN cataliticamente inativo obtido pela mutação de pelo menos um de R ou H de um motivo RxxxxH do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a proteína efetora compreende dois domínios HEPN cataliticamente inativos, cada um obtido pela mutação de pelo menos um de R ou H de um motivo RxxxxH do tipo selvagem.

[404] Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico que codificam a proteína efetora de direcionamento de RNA do tipo VI-B podem ser otimizadas por códon para expressão em uma célula eucariótica. Um eucarioto pode ser como aqui discutido. As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas ou não-naturais.

[405] Em uma modalidade, a proteína efetora de direcionamento de RNA do tipo VI-B, em particular Casl3b ou um ortólogo ou homólogo da mesma, pode compreender uma ou mais mutações (e, portanto, molécula (ou moléculas) de ácido nucleico que codifica para a mesma podem ter mutação (ou

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248/776 mutações)). As mutações podem ser mutações introduzidas artificialmente e podem incluir, sem limitação, uma ou mais mutações em um domínio catalítico. Exemplos de domínios catalíticos com referência a uma enzima Cas9 podem incluir, sem limitação, domínios RuvC I, RuvC II, RuvC III e HNH. Exemplos de domínios catalíticos com referência a uma enzima Casl3b podem incluir, sem limitação, domínios HEPN.

[406] Em uma modalidade, a proteína Tipo VI-B, como Casl3b, ou um ortólogo ou homólogo da mesma, pode compreender uma ou mais mutações. As mutações podem ser mutações introduzidas artificialmente e podem incluir, sem limitação, uma ou mais mutações em um domínio catalítico. Exemplos de domínios catalíticos com referência a uma enzima Cas podem incluir, sem limitação, domínios HEPN.

[407] Em uma modalidade, a proteína Tipo VI-B, como Casl3b, ou um ortólogo ou homólogo da mesma, pode ser usada como uma proteína genérica de ligação de ácido nucleico com fusão a ou ligada operacionalmente a um domínio funcional. Exemplos de domínios funcionais podem incluir, sem limitação, iniciador de tradução, ativador de tradução, repressor de tradução, nucleases, em particular ribonucleases, um spliceossoma, esferas, um domínio leve induzível/controlável ou um domínio quimicamente induzível/controlável.

[408] Em algumas modalidades, a proteína efetora de

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249/776 direcionamento de ácido nucleico não modificada pode ter atividade de divagem. Em algumas modalidades, a proteína efetora de direcionamento de RNA pode direcionar a divagem de uma ou ambas as fitas de ácido nucleico (DNA ou RNA) no local de ou próximo a uma sequência alvo, como dentro da sequência alvo e/ou dentro do complemento do alvo sequência ou em sequências associadas à sequência alvo. Em algumas modalidades, a proteína Cas segmentada por ácido nucleico pode direcionar a divagem de uma ou ambas as fitas de DNA ou RNA dentro de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 ou mais pares de bases do primeiro ou do último nucleotídeo de uma sequência alvo. Em algumas modalidades, um vetor codifica uma proteína Cas direcionada a ácidos nucleicos que pode ser mutada em relação a uma enzima de tipo selvagem correspondente, de modo que a proteína Cas segmentada por ácidos nucleicos mutada não possua a capacidade de clivar cadeias de RNA de um polinucleotídeo alvo contendo uma sequência alvo. Como outro exemplo, dois ou mais domínios catalíticos de Cas (por exemplo, domínio HEPN) podem ser mutados para produzir um Cas mutado sem substancialmente toda a atividade de divagem de RNA. Em algumas modalidades, pode considerar-se que uma proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico não tem substancialmente toda a atividade de divagem de RNA quando a atividade de divagem de RNA da enzima mutada é de cerca

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250/776 de 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% ou menos da atividade de divagem de ácido nucleico da forma não mutada da enzima; um exemplo pode ser quando a atividade de divagem de ácido nucleico da forma mutada é nula ou desprezível em comparação com a forma não mutada. Uma proteína efetora pode ser identificada com referência à classe geral de enzimas que compartilham homologia com a maior nuclease com múltiplos domínios de nuclease do sistema CRISPR Tipo VI-B. Por derivado, os Requerentes dão a entender que a enzima derivada é amplamente baseada, no sentido de ter um alto grau de homologia de sequência com uma enzima do tipo selvagem, mas que foi mutada (modificada) de alguma maneira, como conhecido na técnica ou como aqui descrito.

[409] Mais uma vez, será apreciado que os termos enzima Cas e CRISPR e proteína CRISPR e proteína Cas são geralmente usados de forma intercambiável e em todos os pontos de referência aqui referidos, por analogia, às novas proteínas efetoras CRISPR descritas neste pedido, a menos que aparente, como a título de referência específica ao Cas9. Como mencionado acima, muitas das numerações de resíduos usadas aqui se referem à proteína efetora do locus CRISPR do Tipo VI. No entanto, será apreciado que esta invenção inclui muito mais proteínas efetoras de outras espécies de micróbios. Em certas modalidades, Cas pode estar constitutivamente presente ou indutivelmente presente ou

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251/776 condicionalmente presente ou administrado ou entregue. A otimização de Cas pode ser usada para melhorar a função ou desenvolver novas funções, pode-se gerar proteínas Cas quiméricas. E Cas pode ser usado como uma proteína genérica de ligação a ácidos nucleicos.

[410] Em algumas modalidades, um ou mais vetores que direcionam a expressão de um ou mais elementos de um sistema de direcionamento de ácido nucleico são introduzidos em uma célula hospedeira, de modo que a expressão dos elementos do sistema de direcionamento de ácido nucleico formação direta de um ácido nucleico complexo de direcionamento em um ou mais sítios alvo. Por exemplo, uma enzima efetora de direcionamento de ácido nucleico e um RNA guia de direcionamento de ácido nucleico podem ser operacionalmente ligados a elementos reguladores separados em vetores separados. O RNA (ou RNAs) do sistema de direcionamento de ácido nucleico pode ser entregue a um animal ou mamífero proteico transgênico de proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico, por exemplo, um animal ou mamífero que expressa constitutiva, induzível ou condicionalmente a proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico; ou um animal ou mamífero que esteja de outra forma expressando a proteína efetor de direcionamento de ácido nucleico ou que tenha células que contenham proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico, como por meio

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252/776 de administração prévia ao mesmo de um vetor ou vetores que codificam e expressam ín vivo o direcionamento de ácido nucleico proteína efetora. Alternativamente, dois ou mais dos elementos expressos do mesmo ou de elementos reguladores diferentes, podem ser combinados em um único vetor, com um ou mais vetores adicionais fornecendo quaisquer componentes do sistema de direcionamento de ácido nucleico não incluído no primeiro vetor. Os elementos do sistema de direcionamento de ácido nucleico que são combinados em um único vetor podem ser dispostos em qualquer orientação adequada, como um elemento localizado 5' em relação a (a montante de) ou 3' em relação a (a jusante) de segundo elemento. A sequência de codificação de um elemento pode estar localizada na mesma ou oposta cadeia da sequência de codificação de um segundo elemento e orientada na mesma direção ou oposta. Em algumas modalidades, um único promotor direciona a expressão de um transcrito que codifica uma proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico e o RNA guia de direcionamento de ácido nucleico, incorporado em uma ou mais sequências de introns (por exemplo, cada um em um intron diferente, dois ou mais em menos um intron ou todos em um único intron). Em algumas modalidades, a proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico e o RNA guia de direcionamento de ácido nucleico podem estar operacionalmente ligados e expressos a partir do mesmo

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253/776 promotor. Veículos de entrega, vetores, partículas, nanopartícuias, formulações e componentes dos mesmos para expressão de um ou mais elementos de um sistema de direcionamento de ácido nucleico são como usados nos documentos anteriores, como WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667) . Em algumas modalidades, um vetor compreende um ou mais sítios de inserção, como uma sequência de reconhecimento de endonucleases de restrição (também chamada de local de clonagem). Em algumas modalidades, um ou mais sítios de inserção (por exemplo, aproximadamente ou mais que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sítios de inserção) estão localizados a montante e/ou a jusante de um ou mais elementos de sequência de um ou mais vetores. Em algumas modalidades, um vetor compreende dois ou mais sítios de inserção, de modo a permitir a inserção de uma sequência guia em cada sítio. Em tal arranjo, as duas ou mais sequências guia podem compreender duas ou mais cópias de uma única sequência guia, duas ou mais sequências guia diferentes ou combinações delas. Quando são usadas várias sequências guia diferentes, um único construto de expressão pode ser usado para direcionar a atividade de direcionamento de ácido nucleico para várias sequências alvo correspondentes diferentes dentro de uma célula. Por exemplo, um único vetor pode compreender cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou mais sequências guia. Em

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254/776 algumas modalidades, cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais desses vetores contendo sequência de guia podem ser fornecidos e opcionalmente entregues a uma célula. Em algumas modalidades, um vetor compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação enzimática que codifica uma proteína efetora direcionada a ácido nucleico. a proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico ou o RNA ou RNA (ou RNAs) guia de direcionamento de ácido nucleico podem ser entregues separadamente; e vantajosamente pelo menos um dos mesmos é entregue através de um complexo de partículas ou nanopartícuias. o mRNA da proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico pode ser entregue antes do RNA guia de direcionamento de ácido nucleico para dar tempo para a expressão da proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico. o mRNA da proteína efetora de direcionamento de

ácido nucleico pode	ser	administrado	1 a	12	horas
(preferencialmente em	torno	de	2 a 6	horas)	antes da
administração do RNA	guia	de	direcionamento	de	ácido

nucleico. Alternativamente, o mRNA da proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico e o RNA guia de direcionamento de ácido nucleico podem ser administrados juntos. Vantajosamente, uma segunda dose de reforço do RNA guia pode ser administrada 1 a 12 horas (preferencialmente em torno de 2 a 6 horas) após a administração inicial do

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255/776 mRNA da proteína efetiva direcionada a ácidos nucleicos ΠΑΝΑ guia. Administrações adicionais de mRNA da proteína efetora direcionada a ácido nucleico e/ou RNA guia podem ser úteis para alcançar os níveis mais eficientes de modificação do genoma e/ou transcriptoma.

[411] Em um aspecto, a invenção fornece métodos para o uso de um ou mais elementos de um sistema de direcionamento de ácido nucleico. 0 complexo de direcionamento de ácido nucleico da invenção fornece um meio eficaz para modificar um RNA alvo. 0 complexo de direcionamento de ácido nucleico da invenção tem uma ampla variedade de utilidades, incluindo a modificação (por exemplo, exclusão, inserção, translocação, inativação, ativação) de um RNA alvo em uma multiplicidade de tipos de células. Como tal, o complexo de direcionamento de ácidos nucleicos da invenção tem um amplo espectro de aplicações em, por exemplo, terapia gênica, triagem de medicamentos, diagnóstico de doenças e prognóstico. Um complexo exemplar de direcionamento de ácido nucleico compreende uma proteína efetora de direcionamento de RNA complexada com um RNA guia hibridizado com uma sequência alvo dentro do locus alvo de interesse.

[412] Em uma modalidade, esta invenção fornece um método de divagem de um RNA alvo. 0 método pode compreender a modificação de um RNA alvo com o uso de um complexo de direcionamento de ácido nucleico que se liga ao RNA alvo e

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256/776 efetua a divagem do dito RNA alvo. Em uma modalidade, o complexo de direcionamento de ácido nucleico da invenção, quando introduzido em uma célula, pode criar uma quebra (por exemplo, uma quebra de fita simples ou dupla) na sequência de RNA. Por exemplo, o método pode ser usado para clivar um RNA de doença em uma célula. Por exemplo, um modelo de RNA exógeno que compreende uma sequência a ser integrada flanqueada por uma sequência a montante e uma sequência a jusante pode ser introduzida em uma célula. As sequências a montante e a jusante compartilham semelhança de sequência com ambos os lados do sítio de integração no RNA. Onde desejado, um RNA doador pode ser mRNA. 0 gabarito de RNA exógeno compreende uma sequência a ser integrada (por exemplo, um RNA mutado). A sequência para integração pode ser uma sequência endógena ou exógena para a célula. Exemplos de uma sequência a ser integrada incluem RNA que codifica uma proteína ou um RNA não codificante (por exemplo, um microRNA). Assim, a sequência para integração pode ser operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle apropriadas. Alternativamente, a sequência a ser integrada pode fornecer uma função reguladora. As sequências a montante e a jusante no modelo de RNA exógeno são selecionadas para promover a recombinação entre a sequência de RNA de interesse e o RNA do doador. A sequência a montante é uma sequência de RNA que compartilha a similaridade da sequência com a

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257/776 sequência de RNA a montante do locus alvo para integração. Da mesma forma, a sequência a jusante é uma sequência de RNA que compartilha a similaridade da sequência com a sequência de RNA a jusante do sítio de integração direcionado. As sequências a montante e a jusante no modelo de RNA exógeno podem ter 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de RNA alvo. Preferencialmente, as sequências a montante e a jusante no modelo de RNA exógeno têm cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de RNA alvo. Em alguns métodos, as sequências a montante e a jusante no modelo de RNA exógeno têm cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de RNA alvo. Uma sequência a montante ou a jusante pode compreender de cerca de 20 pb a cerca de 2.500 pb, por exemplo, cerca de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400 ou 2.500 pb. Em alguns métodos, a sequência exemplar a montante ou a jusante tem cerca de 200 pb a cerca de 2.000 pb, cerca de 600 pb a cerca de 1.000 pb, ou mais particularmente cerca de 700 pb a cerca de 1.000 pb. Em alguns métodos, o gabarito de RNA exógeno pode ainda compreender um marcador. Esse marcador pode facilitar a seleção de integrações direcionadas. Exemplos de marcadores adequados incluem sítios de restrição, proteínas

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258/776 fluorescentes ou marcadores selecionáveis. 0 molde de RNA exógeno da invenção pode ser construído usando técnicas recombinantes (consulte, por exemplo, Sambrook et ai., 2001 e Ausubel et ai., 1996) . Em um método para modificar um RNA alvo, integrando um modelo de RNA exógeno, uma quebra (por exemplo, quebra de fita dupla ou única no DNA ou RNA de fita dupla ou única) é introduzida na sequência de DNA ou RNA pelo complexo de direcionamento de ácido nucleico, o intervalo é reparado por recombinação homóloga com um molde de RNA exógeno, de modo que o molde seja integrado ao alvo de RNA. A presença de uma quebra de cadeia dupla facilita a integração do modelo. Em outras modalidades, esta invenção fornece um método para modificar a expressão de um RNA em uma célula eucariótica. O método compreende aumentar ou diminuir a expressão de um polinucleotídeo alvo com o uso de um complexo de direcionamento de ácido nucleico que se liga ao RNA (por exemplo, mRNA ou pré-mRNA) . Em alguns métodos, um RNA alvo pode ser inativado para efetuar a modificação da expressão em uma célula. Por exemplo, após a ligação de um complexo de RNA-alvo a uma sequência-alvo em uma célula, o RNA-alvo é inativado de modo que a sequência não seja traduzida, a proteína codificada não seja produzida ou a sequência não funcione como a sequência de célula do tipo selvagem. Por exemplo, uma sequência de codificação de proteína ou microRNA pode ser inativada de modo que a

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259/776 proteína ou microRNA ou transcrito pré-microRNA não seja produzido. 0 RNA alvo de um complexo alvo de RNA pode ser qualquer RNA endógeno ou exógeno da célula eucariótica. Por exemplo, o RNA alvo pode ser um RNA que reside no núcleo da célula eucariótica. 0 RNA alvo pode ser uma sequência (por exemplo, mRNA ou pré- mRNA) que codifica um produto genético (por exemplo, uma proteína) ou uma sequência não codificante (por exemplo, ncRNA, IncRNA, tRNA ou rRNA). Exemplos de RNA alvo incluem uma sequência associada a uma via bioquímica de sinalização, por exemplo, um RNA associado à via bioquímica de sinalização. Exemplos de RNA alvo incluem um RNA associado a doença. Um RNA associado a doença se refere a qualquer RNA que esteja produzindo produtos de tradução em um nível anormal ou em uma forma anormal em células derivadas de tecidos afetados por uma doença em comparação com tecidos ou células de um controle não-patológico. Pode ser um RNA transcrito de um gene que se torna expresso em um nível anormalmente alto; pode ser um RNA transcrito de um gene que se expressa em um nível anormalmente baixo, onde a expressão alterada se correlaciona com a ocorrência e/ou progressão da doença. Um RNA associado à doença também se refere a um RNA transcrito a partir de um gene que tem mutação (ou mutações) ou variação genética diretamente responsável ou está em desequilíbrio de ligação com um ou mais genes responsáveis pela etiologia de uma doença. Os produtos traduzidos podem

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260/776 ser conhecidos ou desconhecidos e podem estar em um nível normal ou anormal. O RNA alvo de um complexo alvo de RNA pode ser qualquer RNA endógeno ou exógeno da célula eucariótica. Por exemplo, o RNA alvo pode ser um RNA que reside no núcleo da célula eucariótica. O RNA alvo pode ser uma sequência (por exemplo, mRNA ou pré-mRNA) que codifica um produto genético (por exemplo, uma proteína) ou uma sequência não codificante (por exemplo, ncRNA, IncRNA, tRNA ou rRNA).

[413] Em algumas modalidades, o método pode compreender permitir que um complexo de direcionamento de ácido nucleico se ligue ao RNA alvo para efetuar a divagem do dito RNA ou RNA alvo, modificando assim o RNA alvo, em que o complexo de direcionamento de ácido nucleico compreende uma proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico alvo complexada com um RNA guia hibridado com uma sequência alvo no dito RNA alvo. Em um aspecto, a invenção fornece um método para modificar a expressão do RNA em uma célula eucariótica. Em algumas modalidades, o método compreende permitir que um complexo de direcionamento de ácido nucleico se ligue ao RNA de modo que a dita ligação resulte em expressão aumentada ou diminuída do dito RNA; em que o complexo de direcionamento de ácido nucleico compreende uma proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico complexada com um RNA guia. Considerações e condições

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261/776 similares se aplicam como acima para métodos de modificação de um RNA alvo. De fato, essas opções de amostragem, cultura e reintrodução se aplicam aos aspectos da presente invenção. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para modificar um RNA alvo em uma célula eucariótica, que pode ser in vivo, ex vivo ou in vitro. Em algumas modalidades, o método compreende amostrar uma célula ou população de células de um animal humano ou não humano e modificar a célula ou células. A cultura pode ocorrer em qualquer estágio ex vivo. A célula ou células podem até ser reintroduzidas no animal ou planta não humana. Para células reintroduzidas, é particularmente preferencial que as células sejam células-tronco.

[414] De fato, em qualquer aspecto da invenção, o complexo de direcionamento de ácido nucleico pode compreender uma proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico complexada com um RNA guia hibridizado com uma sequência alvo.

[415] A invenção se refere à engenharia e otimização de sistemas, métodos e composições usados para o controle da expressão gênica envolvendo o direcionamento de sequência de RNA, que se relacionam com o sistema de direcionamento de ácido nucleico e seus componentes. Em modalidades vantajosas, a proteína efetora é uma proteína Tipo VI-B, como Casl3b. Uma vantagem dos presentes métodos é que o sistema CRISPR minimiza ou evita a ligação fora do alvo e seus

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262/776 efeitos colaterais resultantes. Isto é conseguido com o uso de sistemas dispostos para ter um alto grau de especificidade de sequência para o RNA alvo.

[416] 0 uso de dois aptâmeros diferentes (cada um associado a um RNA guia distinto de direcionamento de ácidos nucléicos) permite que uma fusão de proteínas adaptadorativador e uma fusão de proteínas repressoras-adaptadoras sejam usadas, com diferentes RNAs guias de direcionamento de ácidos nucléicos, para ativar a expressão de um DNA ou RNA, enquanto reprime outro. Eles, juntamente com seus diferentes RNAs guia, podem ser administrados juntos, ou substancialmente juntos, em uma abordagem multiplexada. Um grande número desses RNAs de guia de direcionamento de ácidos nucléicos modificados pode ser usado ao mesmo tempo, por exemplo 10 ou 20 ou 30 e assim por diante, enquanto apenas um (ou pelo menos um número mínimo) de moléculas efetoras de proteínas precisa ser entregue, como um número comparativamente pequeno de moléculas efetoras de proteína pode ser usado com um grande número de guias modificadas. A proteína adaptadora pode ser associada (de preferência ligada ou fundida a) um ou mais ativadores ou um ou mais repressores. Por exemplo, a proteína adaptadora pode ser associada a um primeiro ativador e um segundo ativador. O primeiro e o segundo ativadores podem ser os mesmos, mas são preferencialmente ativadores diferentes. Três ou mais ou

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263/776 mesmo quatro ou mais ativadores (ou repressores) podem ser usados, mas o tamanho da embalagem pode limitar o número a ser maior que 5 domínios funcionais diferentes. Os ligantes são preferencialmente usados, através de uma fusão direta com a proteína adaptadora, em que dois ou mais domínios funcionais estão associados à proteína adaptadora. Vinculadores adequados podem incluir o ligante GlySer.

[417] Também está previsto que o complexo de RNA guia de proteínas efetoras direcionadas a ácidos nucleicos como um todo possa estar associado a dois ou mais domínios funcionais. Por exemplo, pode haver dois ou mais domínios funcionais associados à proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico, ou pode haver dois ou mais domínios funcionais associados ao RNA guia (via uma ou mais proteínas adaptadoras) ou pode haver um ou domínios mais funcionais associados à proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico e um ou mais domínios funcionais associados ao RNA guia (via uma ou mais proteínas adaptadoras).

[418] A fusão entre a proteína adaptadora e o ativador ou repressor pode incluir um ligante. Por exemplo, os ligantes GlySer GGGS podem ser usados. Os mesmos podem ser usados em repetições de 3 ((GGGGS)s) ou 6, 9 ou mesmo 12 ou mais, para fornecer comprimentos adequados, conforme necessário. Os ligantes podem ser usados entre os RNAs guia e o domínio funcional (ativador ou repressor), ou entre a

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264/776 proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico e o domínio funcional (ativador ou repressor). Os ligantes permitem que o usuário projete quantidades apropriadas de flexibilidade mecânica.

[419] A invenção compreende um complexo de direcionamento de ácido nucleico que compreende uma proteína efetiva de direcionamento de ácido nucleico e um RNA guia, em que a proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico compreende pelo menos uma mutação, de modo que a proteína Cas de direcionamento de ácido nucleico não tem mais de 5% da atividade da proteína Cas direcionada a ácido nucleico que não tem pelo menos uma mutação e, opcionalmente, pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear; o RNA guia compreende uma sequência guia com a capacidade de hibridizar com uma sequência alvo em um RNA de interesse em uma célula; e em que: a proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico está associada a dois ou mais domínios funcionais; ou pelo menos um loop do RNA guia é modificado pela inserção de sequências distintas de RNA que se ligam a uma ou mais proteínas adaptadoras e em que a proteína adaptadora está associada a dois ou mais domínios funcionais; ou a proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico está associada a um ou mais domínios funcionais e pelo menos um loop do RNA guia é modificado pela inserção de sequências distintas de RNA que se ligam a uma ou mais proteínas

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265/776 adaptadoras e em que a proteína adaptadora está associada a um ou mais domínios funcionais.

Complexos de proteínas efetoras Casl3b podem entregar efetores funcionais [420] Ao contrário do knockout mediado por CRISPRCasl3b, que elimina a expressão por mutação no nível do RNA, o knockdown de CRISPR-Casl3b permite a redução temporária da expressão gênica através do uso de fatores de transcrição artificiais, por exemplo, através da mutação de resíduos no domínio (ou domínios) de divagem da proteína Casl3b resulta na geração de uma proteína Casl3b cataliticamente inativa. Um Casl3b cataliticamente inativo complexa com um RNA-guia ou crRNA e localiza-se na sequência de RNA especificada por esse domínio de direcionamento do RNA-guia ou crRNA, no entanto, não cliva o alvo. A fusão da proteína Casl3b inativa com um domínio efetor, por exemplo, um domínio de repressão da transcrição, permite o recrutamento do efetor para qualquer local especificado pelo RNA guia.

Sistemas de direcionamento de RNA funcionais otimizados [421] Em um aspecto, a invenção fornece, assim, um sistema para entrega específica de componentes funcionais ao ambiente de RNA. Isso pode ser assegurado com o uso dos sistemas CRISPR que compreendem as proteínas efetoras de direcionamento de RNA da presente invenção, que permitem

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266/776 direcionar especificamente o RNA de diferentes componentes. Mais particularmente, tais componentes incluem ativadores ou repressores, como ativadores ou repressores da tradução, degradação do RNA, etc.

[422] De acordo com um aspecto, a invenção fornece uma composição não natural ou manipulada que compreende um RNA guia ou crRNA que compreende uma sequência guia com capacidade de hibridizar com uma sequência alvo de interesse em uma célula, em que o RNA guia ou crRNA é modificado pela inserção de uma ou mais sequências distintas de RNA que se ligam a uma proteína adaptadora. Em modalidades particulares, as sequências de RNA podem se ligar a duas ou mais proteínas adaptadoras (por exemplo, aptâmeros) e em que cada proteína adaptadora está associada a um ou mais domínios funcionais. Quando houver mais de um domínio funcional, os domínios funcionais podem ser iguais ou diferentes, por exemplo, dois dos mesmos ou dois ativadores ou repressores diferentes. Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento, em que o um ou mais domínios funcionais são anexados à enzima de direcionamento de RNA, de modo que, após a ligação ao RNA alvo, o domínio funcional está em uma orientação espacial, permitindo que o domínio funcional funcione em sua função atribuída; Em um aspecto, a invenção fornece uma composição discutida no presente documento, em que a composição compreende um complexo CRISPR

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Casl3b com pelo menos três domínios funcionais, pelo menos um dos quais está associado à enzima alvo do RNA e pelo menos dois dos quais estão associados ao gRNA ou crRNA.

[423] Entrega do complexo de proteína efetora Casl3b ou componentes dos mesmos [424] Através desta revelação e do conhecimento na técnica, TALEs, sistemas CRISPR-Cas ou componentes dos mesmos ou moléculas de ácido nucleico dos mesmos (incluindo, por exemplo, modelo HDR) ou moléculas de ácido nucleico que codificam ou fornecem seus componentes podem ser entregues por um sistema de entrega aqui descrito de maneira geral e em detalhes.

[425] Entrega de vetores, por exemplo, plasmídeo, entrega viral: a enzima CRISPR e/ou qualquer um dos RNAs presentes, por exemplo, um RNA guia, podem ser entregues usando qualquer vetor adequado, por exemplo, plasmídeo ou vetores virais, como adenovirus associado (AAV), lentivírus, adenovirus ou outros tipos de vetores virais, ou combinações dos mesmos. Proteínas efetoras e um ou mais RNAs guia podem ser empacotados em um ou mais vetores, por exemplo, vetores plasmídicos ou virais. Em algumas modalidades, o vetor, por exemplo, vetor plasmídico ou viral é entregue ao tecido de interesse por, por exemplo, uma injeção intramuscular, enquanto outras vezes a entrega ocorre por via intravenosa, transdérmica, intranasal, oral, mucosa ou outros métodos de

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268/776 entrega. Essa entrega pode ser feita através de uma dose única ou de doses múltiplas. Um versado na técnica entende que a dosagem real a ser entregue aqui pode variar muito, dependendo de uma variedade de fatores, como a escolha do vetor, a célula alvo, organismo ou tecido, a condição geral do sujeito a ser tratado, a grau de transformação/modificação solicitada, via de administração, modo de administração, tipo de transformação/modificação solicitada etc.

[426] Essa dosagem pode ainda conter, por exemplo, um veículo (água, solução salina, etanol, glicerol, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrano, ágar, pectina, óleo de amendoim, óleo de gergelim, etc.), um diluente, um carreador farmaceuticamente aceitável (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), um excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou outros compostos conhecidos na técnica. A dosagem pode ainda conter um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis como, por exemplo, um sal de ácido mineral, como um cloridrato, um bromidrato, um fosfato, um sulfato, etc.; e os sais de ácidos orgânicos, como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, etc. Além disso, substâncias auxiliares, como agentes umectantes ou emulsificantes, substâncias tampão de pH, géis ou materiais gelificantes, aromas, corantes, microesferas, polímeros, agentes de suspensão, etc. também podem estar presentes aqui. Além disso, um ou mais ingredientes farmacêuticos

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269/776 convencionais, como conservantes, umectantes, agentes de suspensão, tensoativos, antioxidantes, agentes antiaglomerantes, cargas, agentes quelantes, agentes de revestimento, estabilizadores químicos, etc., também podem estar presentes, especialmente se a forma de dosagem é uma forma reconstituível. Ingredientes exemplares adequados incluem celulose microcristalina, carboximetilcelulose sódica, polissorbato 80, álcool feniletílico, clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, propil gaiato, parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol, paraclorofenol, gelatina, albumina e uma combinação dos mesmos. Uma discussão minuciosa dos excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., NJ 1991) que está aqui incorporado a título de referência.

[427] Em uma modalidade do presente documento, a entrega é através de um adenovirus, que pode estar a uma única dose de reforço, contendo pelo menos 1 x 10⁵ partículas (também referido como unidades de partículas, PU) de vetor adenoviral. Em uma modalidade aqui, a dose preferencialmente é pelo menos cerca de 1 x 10⁶ partículas (por exemplo, cerca de 1 x 10⁶ a 1 x 10¹² partículas), com mais preferência pelo menos cerca de 1 x 10⁷ partículas, com mais preferência pelo menos cerca de 1 x 10⁸ partículas (por exemplo, cerca de 1 x 10⁸ a 1 x 10¹¹ partículas ou cerca de 1 x 10⁸ a 1 x 10¹²

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270/776 partículas) e, com mais preferência, pelo menos cerca de 1 x IO¹⁰ partículas (por exemplo, cerca de 1 x 10⁹ a 1 x IO¹⁰ partículas ou cerca de 1 x 10⁹ a 1 x 10¹² partículas) ou mesmo pelo menos cerca de 1 x IO¹⁰ partículas (por exemplo, cerca de 1 x IO¹⁰ a 1 x 10¹² partículas) do vetor adenoviral. Alternativamente, a dose compreende não mais do que cerca de 1 x 10¹⁴ partículas, de preferência não mais do que cerca de 1 x 10¹³ partículas, ainda com mais preferência não mais do que cerca de 1 x 10¹² partículas, ainda com mais preferência não mais do que cerca de 1 x 10¹¹ partículas e, com mais preferência, não mais do que cerca de 1 x IO¹⁰ partículas (por exemplo, não mais do que cerca de 1 x 10⁹ partículas) .

Assim, a dose pode conter uma dose única do vetor adenoviral com, por exemplo, cerca de 1 x 10⁶ unidades de partículas (pu), cerca de 2 x 10⁶ pu, cerca de 4 x 10⁶ pu, cerca de 1 x 10⁷ pu, cerca de 2 x 10⁷ pu, cerca de 4 x 10⁷ pu, cerca de 1 x 10⁸ pu, cerca de 2 x 10⁸ pu, cerca de 4 x 10⁸ pu, cerca de 1 x 10⁹ pu, cerca de 2 x 10⁹ pu, cerca de 2 x 10⁹ pu, cerca de 4 x 10⁹ pu, cerca de 1 x IO¹⁰ pu, cerca de 2 x IO¹⁰ pu, cerca de 4 x IO¹⁰ pu, cerca de 1 x 10¹¹ pu, cerca de 2 x 10¹¹ pu, cerca de 4 x 10¹¹ pu, cerca de 1 x 10¹² pu, cerca de 2 x 10¹² pu ou cerca de 4 x 10¹² pu do vetor adenoviral. Consulte, por exemplo, os vetores adenovirais na Patente n° US 8.454.972 B2 de Nabel, et. ai., depositada em 4 de junho de 2013; aqui incorporado a título de referência, e as dosagens na col 29,

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271/776 linhas 36-58. Em uma modalidade aqui, o adenovirus é entregue através de doses múltiplas.

[428] Em uma modalidade aqui, a entrega é via um AAV. Um é acreditado de dosagem terapeuticamente eficaz para a entrega ín vivo do AAV para um ser humano para estar na faixa de desde cerca de 20 a cerca de 50 ml de solução salina contendo desde cerca de 1 x IO¹⁰ a cerca de 1 x IO¹⁰ de AAV funcional/ml de solução. A dosagem pode ser ajustada para equilibrar o benefício terapêutico contra quaisquer efeitos colaterais. Em uma modalidade aqui, a dose de AAV está geralmente na faixa de concentrações de cerca de 1 x 10⁵ a 1 x IO⁵⁰ genomas AAV, de cerca de 1 x 10⁸ a 1 x IO²⁰ genomas AAV, de cerca de 1 x IO¹⁰ para cerca de 1 x 10¹⁶ genomas, ou cerca de 1 x 10¹¹ a cerca de 1 x 10¹⁶ genomas AAV. Uma dosagem humana pode ser de cerca de 1 x 10¹³ genomas AAV. Tais concentrações podem ser entregues de cerca de 0,001 ml a cerca de 100 ml, cerca de 0,05 a cerca de 50 ml ou cerca de 10 a cerca de 25 ml de uma solução transportadora. Outras dosagens eficazes podem ser prontamente estabelecidas por um versado na técnica através de ensaios de rotina que estabelecem curvas de resposta à dose. Consulte, por exemplo, a patente n° US 8.404.658 B2 de Hajjar et ai., depositada em 26 de março de 2013, na col. 27, linhas 45-60.

[429] Em uma modalidade no presente documento, a entrega é via um plasmídeo. Em tais composições plasmídicas,

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272/776 a dosagem deve ser uma quantidade suficiente de plasmídeo para provocar uma resposta. Por exemplo, as quantidades adequadas de DNA de plasmídeo em composições de plasmídeo pode ser a partir de cerca de 0,1 a cerca de 2 mg, ou desde cerca de 1 pg a cerca de 10 pg por 70 kg de indivíduo. Os plasmídeos da invenção compreenderão geralmente (i) um promotor; (ii) uma sequência que codifica uma enzima CRISPR direcionada a ácidos nucleicos, operacionalmente ligada ao dito promotor; (iii) um marcador selecionável; (iv) uma origem de replicação; e (v) um terminador de transcrição a jusante e operacionalmente ligado a (ii). O plasmídeo também pode codificar os componentes de RNA de um complexo CRISPR, mas um ou mais destes podem, em vez disso, ser codificados em um vetor diferente.

[430] As doses aqui contidas são baseadas em um indivíduo médio de 70 kg. A frequência da administração está dentro do âmbito do médico ou veterinário (por exemplo, médico, veterinário) ou cientista versado na técnica. Notese também que os camundongos usados em experimentos são tipicamente cerca de 20g e a partir de experimentos com camundongos pode-se escalar até um indivíduo de 70 kg.

[431] Em algumas modalidades, as moléculas de RNA da invenção são entregues em formulações de lipossomo ou lipofectina e similares e podem ser preparadas por métodos bem conhecidos dos versados na técnica. Tais métodos estão

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273/776 descritos, por exemplo, nas Patentes n° US 5.593.972, 5.589.466 e 5.580.859, que estão aqui incorporadas a título de referência. Sistemas de entrega voltados especificamente para a entrega aprimorada e melhorada de siRNA nas células de mamíferos foram desenvolvidos (consulte, por exemplo, Shen et al. FEBS Let. 2003, 539: 111 a 114; Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20: 1.006 a 1.010; Reich et al., Mol. Vision. 2003, 9: 210 a 216; Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003, 327: 761 a 766; Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32: 107 e 108 e Simeon! et al., NAR 2003, 31, 11: 2.717 a 2.724) e podem ser aplicados à presente invenção. O siRNA foi recentemente usado com sucesso para inibição da expressão gênica em primatas (consulte, por exemplo, Tolentino et ai., Retina 24(4) :660, que também podem ser aplicados à presente invenção.

[432] De fato, a entrega de RNA é um método útil de entrega ín vivo. É possível entregar a proteína Cas direcionada a ácidos nucleicos e guiar o RNA (e, por exemplo, o modelo de reparo da FC) para as células usando lipossomas ou partículas. Assim, a entrega da proteína Casl3b direcionada a ácidos nucleicos e/ou a entrega dos RNAs ou crRNAs guia da invenção podem estar na forma de RNA e via microvesícuias, lipossomas ou partículas. Por exemplo, o mRNA de Cas13b e o RNA guia ou o crRNA podem ser empacotados em partículas lipossômicas para entrega ín vivo. Reagentes

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274/776 para transfecção lipossômica, como lipofectamina da Life Technologies e outros reagentes no mercado, podem efetivamente fornecer moléculas de RNA para o fígado.

[433] Os meios de entrega de RNA também preferenciais incluem a entrega de RNA via nanopartícuias (Cho, S., Goldberg, M., Son, S., Xu, Q., Yang, F., Mei, Y., Bogatyrev, S ., Langer, R. e Anderson, D., Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivery to endothelial cells, Advanced Functional Material, 19: 3.112 a 3.118, 2010) ou exossomos (Schroeder, A., Levins, C., Cortez, C., Langer, R. e Anderson, D., Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery, Journal of Internal Medicine, 267: 9 a 21, 2010, PMID: 20059641) . De fato, demonstrou-se que os exossomos são particularmente úteis na entrega do siRNA, um sistema com alguns paralelos ao sistema de direcionamento de RNA. Por exemplo, El-Andaloussi S, et al. (Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nat Protoc. dez 2012; 7(12):2112-26. Doi: 10.1038/nprot.2012.131. Publicação Eletrônica 15 de novembro de 2012.) descrevem como os exossomos são ferramentas promissoras para entrega de fármacos através de diferentes barreiras biológicas e pode ser aproveitado para entrega de siRNA in vitro e in vivo. Sua abordagem é gerar exossomos direcionados através da transfecção de um vetor de expressão, compreendendo uma proteína exossômica fundida com um ligante

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275/776 peptidico. Os exossomos são então purificados e caracterizados a partir do sobrenadante celular transfectado, e o RNA é carregado nos exossomos. A entrega ou administração de acordo com a invenção pode ser realizada com exossomos, em particular, sem limitação, cérebro. A vitamina E (α-tocoferol) pode ser conjugada com a proteína Cas direcionada a ácidos nucleicos e entregue ao cérebro juntamente com lipoproteína de alta densidade (HDL), por exemplo, de maneira similar à de Uno et al. (HUMAN GENE THERAPY 22: 711 A 719 (junho de 2011)) por fornecer RNA de interferência curta (siRNA) no cérebro. Os camundongos foram infundidos através de minibombas Osmóticas (modelo 1007D; Alzet, Cupertino, CA) preenchidas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou TocsiBACE ou Toc-siBACE/HDL livre e conectados ao Brain Infusion Kit 3 (Alzet) . Uma cânula de infusão cerebral foi colocada cerca de 0,5 mm posterior ao bregma na linha média para infusão no terceiro ventrículo dorsal. Uno et ai. constataram que apenas 3 nmol de Toc-siRNA com HDL poderíam induzir uma redução alvo em grau comparável pelo mesmo método de infusão de ICV. Uma dosagem similar de proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico conjugada com α-tocoferol e coadministrada com HDL direcionado ao cérebro pode ser contemplada para seres humanos na presente invenção, por exemplo, cerca de 3 nmol a cerca de 3 pmol de direcionamento de ácido nucleico

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276/776 pode ser contemplada uma proteína efetora direcionada ao cérebro. Zou et al. ((HUMAN GENE THERAPY 22: 465 a 475 (abril de 2011)) descreve um método de entrega mediada por lentivírus de RNAs de gancho de cabelo curto direcionados a PKCy para silenciamento genético ín vivo na medula espinhal de camundongos. Zou et ai. administraram cerca de 10 ui de um lentivírus recombinante que tem uma titulação de 1 x 10⁹ unidades de transdução (TU)/ml por um cateter intratecal. Uma dosagem similar de proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico expressa em um vetor lentiviral alvo para o cérebro podem ser contempladas para os seres humanos na presente invenção, por exemplo, cerca de 10 a 50 ml de proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico alvo para o cérebro em um lentivírus que tem uma titulação de 1 x 10⁹ unidades de transdução (TU)/ml pode ser contemplado.

[434] Em termos de entrega local ao cérebro, isso pode ser alcançado de várias maneiras. Por exemplo, o material pode ser entregue intraestaticamente, por exemplo, por injeção. A injeção pode ser realizada estereotaticamente através de uma craniotomia.

Empacotamento e promotores em geral [435] Formas de empacotar proteínas efetoras de direcionamento de RNA (proteínas Casl3b) que codificam moléculas de ácido nucleico, por exemplo, DNA, em vetores, por exemplo, vetores virais, para mediar genoma modificação

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277/776 in vivo incluem:

Vetor viral único:

Vetor contendo dois ou mais cassetes de expressão:

Proteínas efetoras de direcionamento de ácido nucleicopromotor que codificam a terminação da molécula de ácido nucleico

Promotor-terminador de RNA1 guia

Promotor- (N)-terminador de RNA guia (até o tamanho limite do vetor)

Vetor viral duplo:

Vetor 1 contendo um cassete de expressão para acionar a expressão da proteína efetora de direcionamento de RNA (Casl3b)

Promotor-proteína efetora de direcionamento de RNA (Casl3b) que codifica a terminação de molécula de ácido nucleico

Vetor 2 contendo mais um cassete de expressão para acionar a expressão de um ou mais RNAs guia ou crRNAs

Promotor-	terminador	crRNAl	ou	RNA1	guia
Promotor-	terminador	RNA1	(N)	ou	crRNAl	(N)	(até o
tamanho limite	do vetor).
[436]	0 promotor	usado para	conduzir a	expre	ssão da

molécula de ácido nucleico que codifica a proteína efetora de direcionamento de RNA pode incluir o AAV ITR pode servir como promotor: isso é vantajoso para eliminar a necessidade

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278/776 de um elemento promotor adicional (que pode ocupar espaço no vetor). 0 espaço adicional liberado pode ser usado para acionar a expressão de elementos adicionais (gRNA, etc.). Além disso, a atividade da ITR é relativamente mais fraca, portanto, pode ser usada para reduzir a toxicidade potencial devido à super expressão da proteína efetora direcionada a ácidos nucleicos. Para expressão onipresente, pode usar promotores: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, cadeias pesadas ou leves de ferritina, etc. Para expressão cerebral ou outra do SNC, pode usar promotores: SynapsinI para todos os neurônios, CaMKIIalpha para neurônios excitatórios, GAD67 ou GAD65 ou VGAT para neurônios GABAérgicos, etc. Para a expressão do fígado, pode usar o promotor de Albumina. Para expressão pulmonar, pode usar SP-B. Para células endoteliais, pode usar o ICAM. Para células hematopoiéticas pode usar IFNbeta ou CD45. Para os osteoblastos pode usar OG-2. 0 promotor usado para conduzir o RNA guia pode incluir: promotores de Pol III, como U6 ou Hl; Promotor Pol II e cassetes intrônicos para expressar RNA guia ou crRNA.

Adenovirus associado (AAV) [437] Casl3b e um ou mais RNA guia ou crRNA podem ser entregues usando adenovirus associado (AAV), lentivírus, adenovirus ou outros tipos de plasmídeo ou vetor viral, em particular, com o uso de formulações e doses, por exemplo, das Patentes n° US 8.454.972 (formulações, doses para

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279/776 adenovirus), 8.404.658 (formulações, doses para AAV) e 5.846.946 (formulações, doses para plasmideos de DNA) e de ensaios clínicos e publicações sobre os ensaios clínicos envolvendo lentivírus, AAV e adenovirus. Por exemplo, para o AAV, a via de administração, formulação e dose pode ser como na Patente n° US 8.454.972 e como em ensaios clínicos envolvendo AAV. Para o adenovirus, a via de administração, formulação e dose pode ser como na Patente n° US 8.404.658 e como em ensaios clínicos envolvendo adenovirus. Para entrega de plasmídeo, a via de administração, formulação e dose pode ser como na Patente n° US 5.846.946 e como em estudos clínicos envolvendo plasmideos. As doses podem ser baseadas ou extrapoladas para um indivíduo médio de 70 kg (por exemplo, um homem adulto masculino) e podem ser ajustadas para pacientes, indivíduos, mamíferos de diferentes pesos e espécies. A frequência da administração está no âmbito do médico ou veterinário (por exemplo, médico, veterinário), dependendo dos fatores usuais, incluindo idade, sexo, saúde geral, outras condições do paciente ou indivíduo e a condição ou sintomas específicos sendo tratados. Os vetores virais podem ser injetados no tecido de interesse. Para a modificação do genoma específico do tipo de célula, a expressão da proteína efetora de direcionamento de RNA (proteína efetora Casl3b) pode ser conduzida por um promotor específico do tipo celular. Por exemplo, a expressão

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280/776 especifica do fígado pode usar o promotor da Albumina e a expressão específica do neurônio (por exemplo, para direcionar os distúrbios do SNC) pode usar o promotor Synapsin I. Em termos de entrega in vivo, o AAV é vantajoso em relação a outros vetores virais por algumas razões: Baixa toxicidade (isso pode ser devido ao método de purificação que não requer ultra centrifugação de partículas celulares que podem ativar a resposta imune) e baixa probabilidade de causar mutagênese de inserção porque não se integra ao genoma do hospedeiro.

[438] O AAV tem um limite de embalagem de 4,5 ou

4,75 Kb. Isso significa que a sequência de codificação da proteína efetora de direcionamento de RNA (proteína efetora CaslSb), bem como um promotor e um terminador de transcrição, devem ser todos encaixados no mesmo vetor viral. Quanto ao AAV, o AAV pode ser AAV1, AAV2, AAV5 ou qualquer combinação dos mesmos. Pode-se selecionar o AAV do AAV em relação às células a serem direcionadas; por exemplo, pode-se selecionar os sorotipos 1, 2, 5 ou um capsídeo híbrido AAV1, AAV2, AAV5 ou qualquer combinação dos mesmos para direcionar células cerebrais ou neuronals; e pode-se selecionar o AAV4 para atingir o tecido cardíaco. O AAV8 é útil para entrega no fígado. Os promotores e vetores deste documento são preferenciais individualmente. Uma tabulação de certos sorotipos de AAV quanto a essas células (consulte Grimm, D.

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281/776 et al., J. Virol. 82: 5887-5911 (2008)) é a seguinte:

Linhagem celular	AAV-1	AAV-2	AAV-3	AAV-4	AAV-5	AAV-6	AAV-8	AAV-9
Huh-7	13	100	2,5	0, 0	0, 1	10	0,7	0, 0
HEK293	25	100	2,5	0, 1	0, 1	5	0,7	0, 1
HeLa	3	100	2,0	0, 1	6, 7	1	0,2	0, 1
HepG2	3	100	16,7	0,3	1,7	5	0,3	ND
HeplA	20	100	0,2	1, 0	0, 1	1	0,2	0, 0
911	17	100	11	0,2	0, 1	17	0, 1	ND
CHO	100	100	14	1,4	333	50,	10	1, 0
COS	33	100	33	3,3,	5, 0	14	2,0	0,5
MeWo	10	100	20	0,3	6, 7	10	1, 0	0,2
NIH3T3	10	100	2,9	2,9	0, 3	10	0,3	ND
A549	14	100	20	ND	0, 5	10	0,5	0, 1
HT1180	20	100	10	0, 1	0, 3	33	0,5	0, 1
Monócitos	1111	100	ND	ND	125	1429	ND	ND
CD imaturo	2500	100	ND	ND	222	2857	ND	ND
DC maduro	2222	100	ND	ND	333	3333	ND	ND

Lentivírus [439] Os lentivírus são retrovirus complexos que

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282/776 têm a capacidade de infectar e expressar seus genes em células mitóticas e pós-mitóticas. 0 lentivírus mais conhecido é o vírus da imunodeficiência humana (HIV), que usa as glicoproteínas do envelope de outros vírus para atingir uma ampla gama de tipos de células. Os lentivírus podem ser preparados da seguinte maneira. Após a clonagem do pCasESlO (que contém um esqueleto do plasmídeo de transferência lentiviral), o HEK293FT em baixa passagem (p = 5) foi semeado em um frasco T-75 até 50% de confluência no dia antes da transfecção em DMEM com soro fetal bovino a 10% e sem antibióticos. Após 20 horas, a mídia foi alterada para OptiMEM (sem soro) e a transfecção foi realizada 4 horas depois. As células foram transfectadas com 10 pg de plasmídeo de transferência lentiviral (pCasESlO) e os seguintes plasmídeos de empacotamento: 5 pg de pMD2.G (pseudotipo VSVg) e 7,5 ug de psPAX2 (gag/pol/rev/tat) . A transfecção foi realizada em OptiMEM de 4 ml com um agente de liberação lipídica catiônica (50 ui de Lipofectamine 2000 e 100 ui de reagente Plus) . Após 6 horas, o meio foi mudado para DMEM livre de antibióticos com soro fetal bovino a 10%. Esses métodos usam soro durante a cultura celular, mas são preferenciais métodos sem soro.

[440] O lentivírus pode ser purificado da seguinte forma. Os sobrenadantes virais foram colhidos após 48 horas. Os sobrenadantes foram limpos primeiro de detritos e

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283/776 filtrados através de um filtro de baixa ligação às proteínas (0,45 um) (PVDF). Eles foram girados em uma ultracentrífuga por 2 horas a 24.000 rpm. Os grânulos virais foram ressuspensos em 50 pL de DMEM de um dia para o outro a 4 °C. Os mesmos foram aliquotados e imediatamente congelados a 80 °C.

[441] Em outra modalidade, vetores lentivirais mínimos não primatas baseados no vírus da anemia infecciosa dos equídeos (EIAV) também são contemplados, especialmente para terapia genética ocular (consulte, por exemplo, Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 a 285). Em outra modalidade, RetinoStat®, um vetor de terapia gênica lentiviral à base de vírus da anemia ineficiente equina que expressa proteínas angiostáticas endostatina e angiostatina que é entregue via injeção sub-retiniana para o tratamento da forma de teia de degeneração macular relacionada à idade também é contemplado (consulte, por exemplo, Binley et ai., HUMAN GENE THERAPY 23: 980 a 991 (setembro de 2012)) e esse vetor pode ser modificado para o sistema de direcionamento de ácidos nucleicos da presente invenção.

[442] Em outra modalidade, vetores lentivirais auto-inativantes com um siRNA direcionado a um exon comum compartilhado por HIV tat/rev, um chamariz TAR de localização nucleolar e uma ribozima cabeça-de-martelo anti-CCR5 específica (consulte, por exemplo, DiGiusto et ai. (2010)

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Sei Transi Med 2: 36ra43) pode ser usado/e/ou adaptado ao sistema de direcionamento de ácidos nucleicos da presente invenção. Um mínimo de 2,5 x 10⁶ células CD34 + por quilograma de peso do paciente pode ser recolhido e pré-estimulado durante 16 a 20 horas em meio X-VIVO 15 (Lonza) contendo 2 pmol/L-glutamina, fator de células-tronco (100 ng/ml), ligante Flt-3 (Flt-3L) (100 ng/ml), e trombopoietina (10 ng/ml) (CellGenix) a uma densidade de 2 x 10⁶ células/ml. Células pré-estimuladas podem ser transduzidas com lentiviral a uma multiplicidade de infecção de 5, durante 16 a 24 horas em 75 cm² de tecido frascos de cultura revestidos com fibronectina (25 mg/cm²¹ (RetroNectin, Takara Bio Inc.).

[443] Os vetores lentivirais foram divulgados como no tratamento da Doença de Parkinson, consulte, por exemplo, a Publicação da Patente n° US 20120295960 e as Patentes n° US 7.303.910 e 7.351.585. Os vetores lentivirais também foram divulgados para o tratamento de doenças oculares, consulte, por exemplo, Publicações de Patente n° US 20060281180, 20090007284, US20110117189; US20090017543; US20070054961, US20100317109. Os vetores lentivirais também foram divulgados para entrega ao cérebro, consulte, por exemplo, as Publicações de Patentes n° US US20110293571; US20110293571, US20040013648, US20070025970, US20090111106 e Patente n2 US US7259015.

Entrega de RNA

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285/776 [444] Entrega de RNA: a proteína Casl3b direcionada a ácido nucleico e/ou RNA guia também pode ser entregue na forma de RNA. 0 mRNA pode ser sintetizado com o uso de um cassete de PCR contendo os seguintes elementos: sequência T7_promoter-kozak (GCCACC) -UTR de proteína efetora 3' da cauda beta globina-polyA (uma sequência de 120 ou mais adeninas) . O cassete pode ser usado para transcrição pela polimerase T7. Os RNAs guia ou crRNAs também podem ser transcritos com o uso da transcrição in vitro a partir de uma fita contendo sequência de RNA ou crRNA guia-T7-promotorGG-T7.

Sistemas de entrega de partículas e/ou formulações:

[445] Sabe-se que vários tipos de sistemas de entrega de partículas e/ou formulações são úteis em um espectro diverso de aplicações biomédicas. Em geral, uma partícula é definida como um pequeno objeto que se comporta como uma unidade inteira em relação ao seu transporte e propriedades. As partículas são ainda classificadas de acordo com o diâmetro. As partículas grossas cobrem uma faixa entre 2.500 e 10.000 nanômetros. As partículas finas são dimensionadas entre 100 e 2.500 nanômetros. Partículas ultrafinas, ou nanopartícuias, têm geralmente entre 1 e 100 nanômetros de tamanho. A base do limite de 100 nm é o fato de que novas propriedades que diferenciam partículas do material a granel geralmente se desenvolvem em uma escala

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286/776 critica de comprimento abaixo de 100 nm.

[446] Como usado aqui, um sistema/formulação de entrega de partículas é definido como qualquer sistema/formulação de entrega biológica que inclua uma partícula de acordo com a presente invenção. Uma partícula de acordo com a presente invenção é qualquer entidade com uma maior dimensão (por exemplo, diâmetro) inferior a 100 microns (pm) . Em algumas modalidades, as partículas da invenção têm uma maior dimensão inferior a 10 pm. Em algumas modalidades, as partículas inventivas têm uma maior dimensão inferior a 2000 nanômetros (nm). Em algumas modalidades, as partículas inventivas têm uma maior dimensão menor que 1.000 nanômetros (nm) . Em algumas modalidades, as partículas da invenção têm uma maior dimensão menor que 900 nm, 800 nm, 7 00 nm, 60 0 nm, 50 0 nm, 4 00 nm, 300 nm, 2 00 nm ou 100 nm. Normalmente, as partículas inventivas têm uma maior dimensão (por exemplo, diâmetro) de 500 nm ou menos. Em algumas modalidades, as partículas da invenção têm uma maior dimensão (por exemplo, diâmetro) de 250 nm ou menos. Em algumas modalidades, as partículas da invenção têm uma maior dimensão (por exemplo, diâmetro) de 200 nm ou menos. Em algumas modalidades, as partículas da invenção têm uma maior dimensão (por exemplo, diâmetro) de 150 nm ou menos. Em algumas modalidades, as partículas da invenção têm uma maior dimensão (por exemplo, diâmetro) de 100 nm ou menos. Partículas

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287/776 menores, por exemplo, tendo uma maior dimensão de 50 nm ou menos, são usadas em algumas modalidades da invenção. Em algumas modalidades, as partículas da invenção têm uma maior dimensão que varia entre 25 nm e 200 nm.

[447] A caracterização de partículas (incluindo, por exemplo, caracterizar morfologia, dimensão, etc.) é realizada com o uso de uma variedade de técnicas diferentes. Técnicas comuns são microscopia eletrônica (TEM, SEM), microscopia de força atômica (AEM), espalhamento dinâmico de luz (DLS), espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS), difração de raios X de pó (DRX) , espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), espectrometria de massa de dessorção/ionização por laser de assistida por matriz (MALDI-TOF), espectroscopia visível no ultravioleta, interferometria de polarização dupla e ressonância magnética nuclear (RMN). A caracterização (medidas dimensionais) pode ser feita quanto a partículas nativas (ou seja, pré-carregamento) ou após o carregamento da carga (aqui carregamento se refere, por exemplo, a um ou mais componentes do sistema CRISPR-Casl3b, por exemplo, enzima Casl3b ou mRNA ou RNA guia ou qualquer combinação dos mesmos e pode incluir carreadores e/ou excipientes adicionais) para fornecer partículas de tamanho ótimo para entrega a qualquer aplicação in vitro, ex vivo e/ou in vivo da presente invenção. Em certas modalidades preferenciais,

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288/776 a caracterização da dimensão de partícula (por exemplo, diâmetro) é baseada em medições usando espalhamento dinâmico de laser (DLS). É feita menção à Patente n° US 8.709.843; Patente n° US 6,007,845; Patente n° US 5,855,913; Patente n° US 5.985.309; Patente n° 5.543.158; e a publicação de James E. Dahlman e Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014) publicado online em 11 de maio de 2014, doi: 10.1038/nnano.2014.84, sobre partículas, métodos para fabricá-las e utilizá-las e suas medidas. Consulte também Dahlman et al. Orthogonal gene control with a catalytically active Cas9 nuclease, 33, 1.159 a 1.161 (novembro de 2015) [448] Os sistemas de entrega de partículas dentro do escopo da presente invenção podem ser fornecidos de qualquer forma, incluindo, sem limitação, partículas sólidas, semissólidas, emulsão ou coloidais. Como tal, qualquer um dos sistemas de entrega aqui descritos, incluindo, sem limitação, por exemplo, sistemas à base de lipídios, lipossomas, micelas, microvesícuias, exossomos ou pistola de genes, pode ser fornecido como sistemas de entrega de partículas dentro do escopo da presente invenção.

Partículas [449] O mRNA de Cas13b e o RNA guia ou o crRNA podem ser entregues simultaneamente usando partículas ou envelopes lipídicos; por exemplo, a enzima CRISPR e o RNA da invenção, por exemplo, como um complexo, podem ser entregues através

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289/776 de uma partícula como em Dahlman et al., WO2015089419 A2 e documentos citados no mesmo, como 7C1 (consulte, por exemplo, James E. Dahlman e Carmen Barnes et al., Nature Nanotechnology (2014) publicado online em 11 de maio de 2014, doi: 10.1038/nnano.2014.84), por exemplo, partícula de entrega que compreende polímero lipídico ou lipidoide e hidrofílico, por exemplo, lipídio catiônico e polímero hidrofílico, por exemplo, em que o polímero catiônico lipídio compreende 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP) ou 1,2-ditetradecanoil-sn-glicero-3-fosfocololina (DMPC) e/ou em que o polímero hidrofílico compreende etileno glicol ou polietileno glicol (PEG); e/ou em que a partícula compreende ainda colesterol (por exemplo, partícula da formulação 1 = DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, colesterol 0; número da formulação 2 = DOTAP 90, DMPC 0, PEG 10, colesterol 0; número da formulação 3 = DOTAP 90, DMPC 0, PEG 5, Colesterol 5) , em que as partículas são formadas com o uso de um processo eficiente em várias etapas, em que primeiro a proteína efetora e o RNA são misturados, por exemplo, na razão molar de 1:1, por exemplo, à temperatura ambiente, por exemplo, durante 30 minutos, por exemplo, em PBS IX estéril, livre de nuclease; e separadamente, DOTAP, DMPC, PEG e colesterol, conforme aplicável à formulação, são dissolvidos em álcool, por exemplo, 100% de etanol; e, as duas soluções são misturadas para formar partículas contendo os complexos) . O

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290/776 mRNA da proteína efetora Casl3b e o RNA guia podem ser entregues simultaneamente com o uso de partículas ou envelopes lipídicos. Essa tecnologia de Dahlman et al. pode ser aplicada na presente invenção. Um polímero lipidico modificado por epóxido pode ser usado para entregar o sistema de direcionamento de ácido nucleico da presente invenção para células pulmonares, cardiovasculares ou renais; no entanto, um versado na técnica pode adaptar o sistema para fornecer a outros órgãos alvo. Prevê-se uma dosagem compreendida entre cerca de 0,05 e cerca de 0,6 mg/kg. Também estão previstas doses durante vários dias ou semanas, com uma dose total de cerca de 2 mg/kg. Por exemplo, Su X, Fricke J, Kavanagh DG, Irvine DJ (In vitro and in vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymer nanoparticles Mol Pharm. 06 de junho de 2011; 8 (3): 77487. Doi: 10.1021/mpl00390w Publicação Eletrônica 1 de abril de 2011) descreve partículas estruturadas com carcaça-núcleo biodegradável com um núcleo de poli (β- amino-éster) (PBAE) envolvido por uma carcaça de bicamada fosfolipídica. Os mesmos foram desenvolvidos para entrega de mRNA ín vivo. O componente PBAE responsive ao pH foi escolhido para promover a ruptura do endossoma, enquanto a camada da superfície lipídica foi selecionada para minimizar a toxicidade do núcleo do policátion. Tais são, portanto, preferenciais para a entrega de RNA da presente invenção.

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291/776 [450] Em uma modalidade, são contempladas partículas à base de polímeros bioadesivos auto-montantes, que podem ser aplicadas à entrega oral de peptídeos, administração intravenosa de peptídeos e administração nasal de peptídeos, tudo para o cérebro. Outras modalidades, como absorção oral e entrega ocular de fármacos hidrofóbicas, também são contempladas. A tecnologia de envelope molecular envolve um envelope de polímero manipulado que é protegido e entregue no local da doença (consulte, por exemplo, Mazza, M. et ai. ACSNano, 2013. 7 (2): 1.016 a 1.026; Slew, A., et ai. Mol Pharm, 2012. 9 (1): 14 a 28; Lalatsa, A., et al., J Contr Rei, 2012. 161 (2): 523-36; Lalatsa, A., et ai., Mol Pharm, 2012. 9 (6): 1665-80; Lalatsa, A., et ai., Mol Pharm, 2012. 9 (6): 1764-74; Garrett, NL, et al., J. Biophotonics, 2012. 5 (5 -6): 458-68; Garrett, NL, et al., J. Raman Spect, 2012. 43 (5): 681 a 688; Ahmad, S., et al., Royal Soc Interface 2010. 7: S423-33; Uchegbu, IF Expert Opin Drug Deliv, 2006. 3 (5) : 629-40; Qu, X. et al., Biomacromolecules, 2006. 7(12):3452-9 e Uchegbu, IF, et al., Int J Pharm, 2001. 224:185 a 199). São contempladas doses de cerca de 5 mg/kg, com doses únicas ou múltiplas, dependendo do tecido alvo.

[451] Quanto às partículas, consulte também Alabi et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2013, 6 de agosto de 2013; 110 (32): 12881-6; Zhang et al., Adv Mater. 6 de setembro de 2013; 25 (33): 4641-5; Jiang et al., Nano Lett. 13 de março

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292/776 de 2013; 13 (3): 1059-64; Karagiannis et al., ACS Nano. 23 de outubro de 2012; 6 (10) : 8484-7; Whitehead et al., ACS Nano. 28 de agosto de 2012; 6 (8): 6922-9 e Lee et al., Nat Nanotechnol. 3 de junho de 2012; 7 (6): 389-93.

[452] O pedido de patente n° US 20110293703 se refere a compostos lipidoides também são particularmente úteis na administração de polinucleotídeos, que podem ser aplicados para distribuir o sistema de direcionamento de ácidos nucleicos da presente invenção. Em um aspecto, os compostos lipidoides de aminoálcool são combinados com um agente a ser entregue a uma célula ou a um indivíduo para formar micropartícuias, nanopartícuias, lipossomas ou micelas. O agente a ser entregue pelas partículas, lipossomas ou micelas pode estar na forma de um gás, líquido ou sólido, e o agente pode ser um polinucleotídeo, proteína, peptídeo ou molécula pequena. Os compostos lipidoides do álcool alcalino podem ser combinados com outros compostos lipidoides de aminoálcool, polímeros (sintéticos ou naturais), tensoativos, colesterol, carboidratos, proteínas, lipídios, etc. para formar as partículas. Estas partículas podem então ser opcionalmente combinadas com um excipiente farmacêutico para formar uma composição farmacêutica. A publicação da patente de invenção n° US 20110293703 também fornece métodos para preparar os compostos lipidoides de aminoálcool. É permitido que um ou mais equivalentes de uma

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293/776 amina reajam com um ou mais equivalentes de um composto terminado com epóxido sob condições adequadas para formar um composto lipidoide de aminoálcool da presente invenção. Em certas modalidades, todos os grupos amino da amina são totalmente reagidos com o composto terminado com epóxido para formar aminas terciárias. Em outras modalidades, todos os grupos amino da amina não reagem completamente com o composto terminado com epóxido para formar aminas terciárias, desse modo resultando em aminas primárias ou secundárias no composto lipidoide de aminoálcool. Essas aminas primárias ou secundárias são deixadas como estão ou podem ser reagidas com outro eletrófilo, como um composto terminado com epóxido diferente. Como será apreciado por um versado na técnica, a reação de uma amina com menos que o excesso de composto terminado com epóxido resultará em uma pluralidade de diferentes compostos lipidoides de aminoálcool com vários números de caudas. Certas aminas podem ser totalmente funcionalizadas com duas caudas de composto derivado de epóxido, enquanto outras moléculas não serão completamente funcionalizadas com caudas de composto derivado de epóxido. Por exemplo, uma diamina ou poliamina pode incluir um, dois, três ou quatro compostos derivados de epóxido caem das várias porções amino da molécula, resultando em aminas primárias, secundárias e terciárias. Em certas modalidades, todos os grupos amino não estão totalmente

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294/776 funcionalizados. Em certas modalidades, dois dos mesmos tipos de compostos terminados com epóxido são usados. Em outras modalidades, dois ou mais compostos diferentes terminados com epóxido são usados. A síntese dos compostos lipidoides de aminoálcool é realizada com ou sem solvente, e a síntese pode ser realizada a temperaturas mais altas, variando de 30 a 100 °C. De preferência a aproximadamente 50 a 90 °C. Os compostos lipidoides de aminoálcool preparados podem ser opcionalmente purificados. Por exemplo, a mistura de compostos lipidoides de aminoálcool pode ser purificada para produzir um composto lipidoide de aminoálcool com um número particular de caudas de compostos derivados de epóxido. Ou a mistura pode ser purificada para produzir um estereo- ou regioisômero particular. Os compostos lipidoides de aminoálcool também podem ser alquilados com o uso de um halogeneto de alquila (por exemplo, iodeto de metila) ou outro agente alquilante e/ou podem ser acilados.

[453] A publicação da patente nL US 20110293703 também fornece bibliotecas de compostos lipidoides de aminoálcool, preparados pelos métodos da invenção. Esses compostos lipidoides de aminoálcool podem ser preparados e/ou rastreados usando técnicas de alto rendimento que envolvem manipuladores de líquidos, robôs, placas de microtitulação, computadores etc. Em certas modalidades, os compostos lipidoides de aminoálcool são pesquisados quanto

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295/776 à sua capacidade de transfectar polinucleotídeos ou outros agentes (por exemplo, proteínas, peptídeos, moléculas pequenas) na célula. A Publicação de Patente n° US 20130302401 se refere a uma classe de poli (betaaminoálcoois) (PBAAs) que foi preparada com o uso de polimerização combinatória. Os PBAAs inventivos podem ser usados em aplicações biotecnológicas e biomédicas como revestimentos (como revestimentos de filmes ou filmes multicamadas para dispositivos ou implantes médicos), aditivos, materiais, excipientes, agentes que não são de biocombustíveis, agentes de micropadronização e agentes de empacotamento celular. Quando usados como revestimentos de superfície, esses PBAAs provocaram diferentes níveis de inflamação, tanto in vitro quanto ín vivo, dependendo de suas estruturas químicas. A grande diversidade química dessa classe de materiais nos permitiu identificar revestimentos poliméricos que inibem a ativação de macrófagos in vitro. Além disso, esses revestimentos reduzem o recrutamento de células inflamatórias e fibrose, após o implante subcutâneo de micropartícuias de poliestireno carboxilado. Esses polímeros podem ser usados para formar cápsulas complexas de polieletrólitos para encapsulação celular. A invenção também pode ter muitas outras aplicações biológicas, como revestimentos antimicrobianos, entrega de DNA ou siRNA e engenharia de tecidos de células-tronco. Os ensinamentos da

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Publicação de Patente n- US 20130302401 podem ser aplicados ao sistema de direcionamento de ácido nucleico da presente invenção.

[454] Em outra modalidade, são contempladas nanopartícuias lipídicas (LNPs). Um pequeno RNA interferente antitranstiretina foi encapsulado em nanopartícuias lipídicas e entregue ao homem (consulte, por exemplo, Coelho et al., N Engl J Med 2013; 369: 819-29), e esse sistema pode ser adaptado e aplicado ao núcleo sistema de direcionamento ácido da presente invenção. São contempladas doses de cerca de 0,01 a cerca de 1 mg por kg de peso corporal administradas por via intravenosa. São contemplados medicamentos para reduzir o risco de reações relacionadas à infusão, como dexametasona, acetampinofeno, difenidramina ou cetirizina e ranitidina. Também são contempladas doses múltiplas de cerca de 0,3 mg por quilograma a cada 4 semanas, durante cinco doses. Demonstrou-se que os LNPs são altamente eficazes na entrega de siRNAs no fígado (consulte, por exemplo, Tabernero et al., Cancer Discovery, abril de 2013, Vol. 3, n° 4, páginas 363 a 470) e, portanto, são contemplados na entrega de RNA que codifica a proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico para o fígado. Uma dosagem de cerca de quatro doses de 6 mg/kg de LNP a cada duas semanas pode ser contemplada. Tabernero et ai. demonstraram que a regressão tumoral foi observada após os 2 primeiros ciclos de LNPs doseados em 0,7

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297/776 mg/kg e, ao final de 6 ciclos, o paciente alcançou uma resposta parcial com regressão completa das metástases linfonodais e encolhimento substancial dos tumores hepáticos. Uma resposta completa foi obtida após 40 doses nesse paciente, que permaneceu em remissão e completou o tratamento após receber doses por 26 meses. Dois pacientes com CCR e sítios extra-hepáticos da doença, incluindo rins, pulmão e linfonodos que estavam progredindo após terapia prévia com inibidores da via do VEGF, apresentavam doença estável em todos os sítios por aproximadamente 8 a 12 meses, e um paciente com PNET e metástases hepáticas continuou em o estudo de extensão por 18 meses (36 doses) com doença estável. No entanto, a cobrança do LNP deve ser levada em consideração. Como lipídios catiônicos combinados com lipídios carregados negativamente para induzir estruturas não bicamadas que facilitam a entrega intracelular. Como os LNPs carregados são rapidamente eliminados da circulação após a injeção intravenosa, foram desenvolvidos lipídios catiônicos ionizáveis com valores de pKa abaixo de 7 (consulte, por exemplo, Rosin et ai., Molecular Therapy, volume 19, nL 12, páginas 1.286 a 2.200, dezembro de 2011) Polímeros carregados negativamente, como RNA, podem ser carregados em LNPs a valores baixos de pH (por exemplo, pH 4), onde os lipídios ionizáveis exibem uma carga positiva. No entanto, em valores fisiológicos de pH, os LNPs exibem

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298/776 uma carga superficial baixa compatível com tempos de circulação mais longos. Foram focalizadas quatro espécies de lipídios catiônicos ionizáveis, a saber: 1,2-dilinoil-3dimetilamônio-propano (DLinDAP), 1,2-dilinoliloxi-3-N, Ndimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinolililoxi-ceto-N, N-dimetil-3-aminopropano (DLinKDMA) e 1,2-dilinolil-4-(2dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLinKC2-DMA). Foi demonstrado que os sistemas LNP siRNA contendo esses lipídios exibem propriedades de silenciamento genético notavelmente diferentes nos hepatócitos in vivo, com potências variando de acordo com as séries DLinKC2-DMA> DLinKDMA> DLinDMA >> DLinDAP com o uso de um modelo de silenciamento genético do fator VII (consulte, por exemplo, Rosin et al., Molecular Therapy, volume 19, n° 12, páginas 1.286 a 2.200, dez. 2011) . Uma dosagem de 1 pg/ml de LNP ou CRISPR-cas de RNA no ou associado com o LNP pode ser contemplada, especialmente para uma formulação contendo DLinKC2-DMA.

[455] A preparação do LNPs e do empacotamento CRISPR-Casl3b pode ser usada/e/ou adaptada de Rosin et al., Molecular Therapy, volume 19, n° 12, páginas 1.286 a 2.200, dezembro de 2011). Os lipídios catiônicos 1,2-dilinolil-3dimetilamônio-propano (DLinDAP), 1,2-dilinoliloxi-3-N, Ndimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoliloxieto-N, Ndimetil-3-aminopropano (DLinK-DMA), 1,2-dilinolil-4-(2dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLinKC2-DMA), (3-o- [2-

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(metoxipolietilenoglicol	2000)	succinolil	]]-l,2-
dimiristoil-sn-glicol	(PEG-S-DMG)	e R-3- [ (ω-	metoxi-
poli(etileno glicol)	2000)	carbamoil]	-1,2-

dimiristiloxlpropil-3-amina (PEG-C -DOMG) pode ser fornecido pela Tekmira Pharmaceuticals (Vancouver, Canadá) ou sintetizado. 0 colesterol pode ser comprado na Sigma (St Louis, MO) . 0 RNA do complexo específico de direcionamento de ácidos nucleicos (CRISPR-Cas) pode ser encapsulado em LNPs contendo DLinDAP, DLinDMA, DLinK-DMA e DLinKC2-DMA (lipídio catiônico: DSPC: CHOL: PEGS-DMG ou PEG-C-DOMG com razões molares 40:10:40:10) quando necessário, SP-DÍOC18 a 0,2% (Invitrogen, Burlington, Canadá) podem ser incorporados para avaliar a incorporação celular, a entrega intracelular, e biodistribuição. A encapsulação pode ser realizada por dissolução de misturas lipidicas constituídas por lipídio catiônico:DSPC:colesterol:PEG-c-DOMG (razão molar 40:10:40:10) em etanol até uma concentração lipidica final de 10 mmol/1. Essa solução de lipídio em etanol pode ser adicionada por gotejamento a 50 mmol/1 de citrato, pH 4,0 para formar vesículas multilamelares para produzir uma concentração final de etanol a 30% em vol/volume Vesículas unilamelares grandes podem ser formadas após a extrusão de vesículas multilamelares através de dois filtros empilhados de policarbonato Nuclepore de 80 nm com o uso do Extrusor (Northern Lipids, Vancouver, Canadá). O empacotamento pode

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300/776 ser conseguido adicionando RNA dissolvido a 2 mg/ml em citrato a 50 mmol/1, pH 4,0 contendo etanol a 30% em vol/vol, por gotejamento, em vesículas unilamelares grandes préformadas e incubadas a 31 °C por 30 minutos, com mistura constante para uma razão final de RNA/peso lipídico de 0,06/1 em p/p. A remoção de etanol e a neutralização do tampão de formulação foram realizadas por diálise contra solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 por 16 horas usando membranas de diálise de celulose regenerada Spectra/Por 2. A distribuição do tamanho de partícula pode ser determinada por espalhamento dinâmico de luz com o uso de um calibrador de partículas NICOMP 370, modos de vesícula/intensidade e ajuste gaussiano (Nicomp Particle Sizing, Santa Barbara, CA, EUA) . O tamanho das partículas para todos os três sistemas LNP pode ter ~ 70 nm de diâmetro. A eficiência do empacotamento do RNA pode ser determinada por remoção do RNA livre usando colunas VivaPureD MiniH (Sartorius Stedim Biotech) de amostras coletadas antes e após a diálise. O RNA encapsulado pode ser extraído das partículas eluídas e quantificado a 260 nm. A razão RNA/lipídio foi determinada por medição do conteúdo de colesterol em vesículas com o uso do ensaio enzimático de Colesterol E da Wako Chemicals USA (Richmond, VA) . Em conjunto com a discussão aqui apresentada de LNPs e lipídios de PEG, lipossomas ou LNPs de PEGuilados são igualmente

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301/776 adequados para a entrega de um sistema de direcionamento de ácido nucleico ou de seus componentes. A preparação de LNPs grandes pode ser usada e/ou adaptada de Rosin et ai., Molecular Therapy, volume 19, n° 12, páginas 1.286 a 2.200, dez. 2011. Uma solução de pré-mistura lipídica (concentração lipídica total de 20,4 mg/ml) pode ser preparada em etanol contendo DLinKC2-DMA, DSPC e colesterol nas razões molares 50:10:38,5. O acetato de sódio pode ser adicionado à prémistura lipídica na razão molar de 0,75:1 (acetato de sódio:DLinKC2-DMA) . Os lípidios podem ser subsequentemente hidratados combinando a mistura com 1,85 volumes de tampão de citrato (10 mmol/1, pH 3,0) com agitação vigorosa, resultando na formação espontânea de lipossomas em tampão aquoso contendo etanol a 35%. A solução lipossômica pode ser incubada a 37 °C para permitir um aumento dependente do tempo no tamanho das partículas. As alíquotas podem ser removidas em vários momentos durante a incubação para investigar alterações no tamanho dos lipossomas por espalhamento dinâmico de luz (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido). Uma vez atingido o tamanho de partícula desejado, uma solução lipídica aquosa de PEG (estoque = 10 mg/ml de PEG-DMG em etanol a 35% (em vol/vol)) pode ser adicionada à mistura de lipossomas para produzir uma concentração molar final de PEG de 3,5% de lipídio total. Após a adição de lípidios de PEG, os lipossomas devem ter

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302/776 seu tamanho, impedindo efetivamente o crescimento adicional. O RNA pode então ser adicionado aos lipossomas vazios na razão RNA/lipídio total de aproximadamente 1:10 (em peso:peso), seguido de incubação por 30 minutos a 37 °C para formar LNPs carregados. A mistura pode ser posteriormente dialisada de um dia para o outro em PBS e filtrada com um filtro de seringa de 0,45 pm.

[456] Construtos de ácido nucleico esférico (SNA™) e outras partículas (particularmente partículas de ouro) também são contempladas como um meio de fornecer o sistema de direcionamento de ácido nucleico aos alvos pretendidos. Dados significativos mostram que as construções de Ácido Nucleico Esférico (SNA™) da AuraSense Therapeutics, com base em partículas de ouro funcionalizadas com ácido nucleico, são úteis.

[457] A literatura que pode ser empregada em conjunto com os ensinamentos deste documento inclui: Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2011 133: 9.254 a 9.257, Hao et al., Small. 2011 7: 3.158 a 3.162, Zhang et al., ACS Nano. 2011 5: 6.962 a 6.970, Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134: 1.376 a 1.391, Young et al., Nano Lett. 2012 12: 386771, Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA. 2012 109: 11975-80, Mirkin, Nanomedicine 2012 7: 635 a 638 Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134: 16488-1691, Weintraub, Nature 2013 495: S14-S16, Choi et al., Proc. Natl. Acad.

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Sei. EUA. 2013 110 (19): 7.625 a 7.630, Jensen et al., Sci. Transi. Medição 5, 209ral52 (2013) e Mirkin, et al., Small, 10: 186 a 192.

[458] As partículas de automontagem com RNA podem ser construídas com polietilenoimina (PEI) que é PEGuilada com um ligante peptídico Arg-Gly-Asp (RGD) anexado na extremidade distal do polietileno glicol (PEG). Este sistema foi utilizado, por exemplo, como um meio de direcionar a neovasculatura tumoral que expressa integrinas e fornecer o siRNA inibindo a expressão do receptor-2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF R2) e, assim, alcançar a angiogênese do tumor (consulte, por exemplo, Schiffelers et al., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, n° 19). Os nanoplexos podem ser preparados misturando volumes iguais de soluções aquosas de polímero catiônico e ácido nucleico para gerar um excesso molar líquido de nitrogênio ionizável (polímero) em fosfato (ácido nucleico) na faixa de 2 a 6. As interações eletrostáticas entre polímeros catiônicos e O ácido nucleico resultou na formação de poliplexos com distribuição média de tamanho de partícula de cerca de 100 nm, portanto, aqui denominados nanoplexos. Prevê-se uma dosagem de cerca de 100 a 200 mg de RNA complexo de direcionamento de ácido nucleico para entrega nas partículas de montagem automática de Schiffelers et ai.

[459] Os nanoplexos de Bartlett et al. (PNAS, 25 de

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304/776 setembro de 2007, volume 104, n° 39) também pode ser aplicado à presente invenção. Os nanoplexos de Bartlett et ai. são preparados misturando volumes iguais de soluções aquosas de polímero catiônico e ácido nucleico para fornecer um excesso molar líquido de nitrogênio ionizável (polímero) para fosfato (ácido nucleico) na faixa de 2 a 6. As interações eletrostáticas entre polímeros catiônicos e ácido nucleico resultou na formação de poliplexos com distribuição média de tamanho de partícula de cerca de 100 nm, portanto, aqui denominados nanoplexos. O DOTA-siRNA de Bartlett et ai. foi sintetizado da seguinte forma: O ácido 1,4,7,10tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético mono (éster Nhidroxissuccinimida) (DOTA-NHSester) foi encomendado à Macrocyclics (Dallas, TX) . A cadeia de detecção de RNA modificada por amina com um excesso molar de 100 vezes de éster de DOTA-NHS em tampão carbonato (pH 9) foi adicionada a um tubo de microcentrífuga. O conteúdo foi feito reagir por agitação durante 4 h à temperatura ambiente. O conjugado DOTA-RNAsense foi precipitado com etanol, ressuspenso em água e recozido na cadeia antissenso não modificada para produzir DOTA-siRNA. Todos os líquidos foram pré-tratados com Chelex-100 (Bio-Rad, Hercules, CA) para remover contaminantes de metais vestigiais. As partículas de siRNA direcionadas a Tf e não direcionadas podem ser formadas usando policátions contendo ciclodextrina. Tipicamente, as

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305/776 partículas foram formadas em água a uma taxa de carga de 3 ( + /-) e uma concentração de siRNA de 0,5 g/litro. Um por cento das moléculas de adamantano-PEG na superfície das partículas alvo foi modificado com Tf (adamantano-PEG-Tf) . As partículas foram suspensas em uma solução carreadora de glicose a 5% (em p/vol) de injeção.

[460] Davis et al. (Nature, Vol 464, 15 de abril de 2010) realiza um ensaio clínico de RNA que usa um sistema de entrega de partículas direcionado (número de registro do ensaio clínico NCT00689065) . Pacientes com câncer sólido refratário às terapias de atendimento padrão recebem doses de partículas direcionadas nos dias 1, 3, 8 e 10 de um ciclo de 21 dias por uma infusão intravenosa de 30 minutos. As partículas compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em um sistema de entrega sintético contendo: (1) um polímero linear à base de ciclodextrina (CDP) , (2) um ligante de direcionamento da proteína transferrina humana (TF) exibido no exterior da nanopartícuia para engatar receptores TF (TER) na superfície das células cancerígenas, (3) um polímero hidrofílico (polietileno glicol (PEG) usado para promover a estabilidade das nanopartícuias em fluidos biológicos) e (4) siRNA projetado para reduzir a expressão do RRM2 (a sequência utilizada na clínica foi anteriormente denominada siR2B + 5) . Sabe-se há muito que a TER está superregulada em células malignas e o RRM2 é um alvo

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306/776 anticâncer estabelecido. Foi demonstrado que essas partículas (versão clínica denominada CALAA-01) são bem toleradas em estudos de doses múltiplas em primatas não humanos. Embora um único paciente com leucemia mieloide crônica tenha sido administrado siRNA por entrega lipossômica, o ensaio clínico de Davis et ai. É o ensaio humano inicial para entregar sistemicamente siRNA com um sistema de entrega direcionado e para tratar pacientes com câncer sólido. Para verificar se o sistema de entrega direcionado pode fornecer entrega eficaz de siRNA funcional para tumores humanos, Davis et ai. biópsias investigadas de três pacientes de três coortes diferentes de dosagem; pacientes A, B e C, todos com melanoma metastático e que receberam doses CALAA-01 de 18, 24 e 30 mg nr² siRNA, respectivamente. Também podem ser contempladas doses similares para o sistema de direcionamento de ácidos nucleicos da presente invenção. A entrega da invenção pode ser alcançada com partículas contendo um polímero linear à base de ciclodextrina (CDP), um ligante de direcionamento de proteína de transferrina humana (TF) exibido no exterior da partícula para engatar receptores de TF (TFR) na superfície das células cancerígenas e/ou um polímero hidrofílico (por exemplo, polietileno glicol (PEG) usado para promover a estabilidade de partículas em fluidos biológicos).

[461] Nos termos desta invenção, é preferencial ter

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307/776 um ou mais componentes do complexo de direcionamento de RNA, por exemplo, proteína efetora de direcionamento de ácido nucleico (CaslSb) ou mRNA para o mesmo, ou guiar o RNA ou crRNA entregue usando partículas ou envelopes lipídicos. Outros sistemas ou vetores de entrega podem ser usados em conjunto com os aspectos das partículas da invenção. As partículas abrangidas na presente invenção podem ser fornecidas em diferentes formas, por exemplo, como partículas sólidas (por exemplo, metais como prata, ouro, ferro, titânio), sólidos não metálicos, à base de lipídios, polímeros), suspensões de partículas ou combinações dos mesmos. De metal, material dielétrico, e partículas semicondutores podem ser preparados, bem como estruturas híbridas (por exemplo, partículas de núcleo-revestimento) . Partículas feitas de material semicondutor também podem ser rotuladas como pontos quânticos se forem pequenas o suficiente (normalmente abaixo de 10 nm) para que ocorra a quantização dos níveis de energia eletrônica. Tais partículas em nanoescala são usadas em aplicações biomédicas como carreadores de fármacos ou agentes de imagem e podem ser adaptadas para fins similares na presente invenção.

[462] Partículas semissólidas e macias foram fabricadas e estão dentro do escopo da presente invenção. Uma partícula protótipo de natureza semissólida é o lipossomo. Atualmente, vários tipos de partículas de

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308/776 lipossomas são usados clinicamente como sistemas de administração de medicamentos e vacinas anticâncer. Partículas com uma metade hidrofílica e a outra metade hidrofóbica são denominadas partículas de Janus e são particularmente eficazes para estabilizar emulsões. Os mesmos podem se automontar nas interfaces água/óleo e atuar como tensoativos sólidos.

[463] A Patente nL US 8.709.843, aqui incorporada a título de referência, fornece um sistema de administração de medicamentos para a administração direcionada de partículas contendo agentes terapêuticos a tecidos, células e compartimentos intracelulares. A invenção fornece partículas direcionadas compreendendo polímero conjugado com um tensoativo, polímero hidrofílico ou lipídio. A Patente nL US 6.007.845, aqui incorporada a título de referência, fornece partículas que têm um núcleo de um copolímero multibloco formado pela ligação covalente de um composto multifuncional com um ou mais polímeros hidrofóbicos e um ou mais polímeros hidrofílicos, e contém um material biologicamente ativo. A Patente nL US 5.855.913, aqui incorporada a título de referência, fornece uma composição de partículas com partículas aerodinamicamente leves com uma densidade de derivação inferior a 0,4 g/cm3 com um diâmetro médio entre 5 pm e 30 pm, incorporando um tensoativo na sua superfície para administração de medicamentos ao sistema pulmonar. A

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Patente n- US 5.985.309, aqui incorporada a título de referência, fornece partículas que incorporam um tensoativo e/ou um complexo hidrofílico ou hidrofóbico de um agente terapêutico ou diagnóstico carregado positiva ou negativamente e uma molécula carregada de carga oposta para entrega ao sistema pulmonar. A Patente n° US 5.543.158, aqui incorporada a título de referência, fornece partículas injetáveis biodegradáveis que tem um núcleo sólido biodegradável contendo um material biologicamente ativo e porções de poli (alquilenoglicol) na superfície. O documento WO2012135025 (também publicado como US20120251560), incorporado aqui a título de referência, descreve polímeros de polietilenoimina conjugada (PEI) e aza-macrociclos conjugados (referidos coletivamente como lipômero conjugado ou lipômeros). Em certas modalidades, pode-se prever que esses métodos e materiais dos documentos citados no presente documento, por exemplo, lipômeros conjugados possam ser usados no contexto do sistema de direcionamento de ácido nucleico para obter perturbações genômicas in vitro, ex vivo e in vivo para modificar expressão gênica, incluindo modulação da expressão proteica.

Exossomos [464] Os exossomos são nano-vesícuias endógenas que transportam RNAs e proteínas, e que podem fornecer RNA ao cérebro e a outros órgãos-alvo. Para reduzir a

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310/776 imunogenicidade, Alvarez-Erviti et al. (2011, Nat Biotechnol 29: 341) usaram células dendriticas auto-derivadas para a produção de exossomos. O direcionamento para o cérebro foi alcançado através da engenharia das células dendriticas para expressar Lamp2b, uma proteína da membrana exossômica, fundida ao peptídeo RVG específico para o neurônio. Os exossomos purificados foram carregados com RNA exógeno por eletroporação. Os exossomos direcionados ao RVG injetados por via intravenosa entregaram o siRNA de GAPDH especificamente aos neurônios, microglia e oligodendrócitos no cérebro, resultando em um processo de nocaute genético específico. A pré-exposição aos exossomos RVG não atenuou o knockdown e não foi observada captação inespecífica em outros tecidos. O potencial terapêutico da administração de siRNA mediado por exossomo foi demonstrado pelo forte colapso de mRNA (60%) e proteína (62%) do BACE1, um alvo terapêutico na doença de Alzheimer.

[465] Para obter um pool de exossomos imunologicamente inertes, Alvarez-Erviti et ai. colheram medula óssea de camundongos C57BL/6 consanguíneos com um haplótipo homogêneo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Como células dendriticas imaturas produzem grandes quantidades de exossomos desprovidos de ativadores de células T, como MHC-II e CD86, Alvarez-Erviti et ai. selecionaram células dendriticas com

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311/776 fator estimulador de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) por 7 dias. Os exossomos foram purificados a partir do sobrenadante da cultura no dia seguinte com o uso de protocolos de ultracentrifugação bem estabelecidos. Os exossomos produzidos eram fisicamente homogêneos, com uma distribuição de tamanho chegando a 80 nm de diâmetro, conforme determinado pela análise de rastreamento de partículas (NTA) e microscopia eletrônica. Alvarez-Erviti et ai. obtiveram 6 a 12 pg de exossomos (medidos com base na concentração de proteínas) por 10⁶células. Em seguida, Alvarez-Erviti et ai. investigaram a possibilidade de carregar exossomos modificados com cargas exógenas com o uso de protocolos de eletroporação adaptados para aplicações em nanoescala. Como a eletroporação para partículas de membrana na escala nanométrica não é bem caracterizada, o RNA marcado com Cy5 não específico foi usado para a otimização empírica do protocolo de eletroporação. A quantidade de RNA encapsulado foi analisada após ultracentrifugação e lise de exossomos. A eletroporação a 400 V e 125 pF resultou na maior retenção de RNA e foi usada em todas as experiências subsequentes. Alvarez-Erviti et ai. administraram 150 pg de cada siRNA de BACE1 encapsulado em 150 pg de exossomos RVG a camundongos C57BL/6 normais e compararam a eficiência de knockdown a quatro controles: camundongos não tratados, camundongos injetados apenas com exossomos RVG, camundongos injetados

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312/776 com siRNA de BACE1 complexados com um catiônico in vivo reagente lipossômico e camundongos injetados com siRNA de BACE1 complexados com RVG-9R, o peptídeo RVG conjugado com 9-D-argininas que se liga eletrostaticamente ao siRNA. As amostras de tecido cortical foram analisadas 3 d após a administração e observou-se um knockdown significativo de proteínas (45%, P <0,05, versus 62%, P <0,01) em camundongos tratados com SÍRNA-RVG-9R e tratados com exossomo siRNARVG, resultante de uma diminuição significativa nos níveis de mRNA de BACE1 (66% [+ ou -] 15%, P <0,001 e 61% [+ ou -] 13% respectivamente, P <0,01). Além disso, os Requerentes demonstraram uma diminuição significativa (55%, P <0,05) nos níveis totais de [beta]-amiloide 1-42, um componente principal das placas amiloides na patologia de Alzheimer, nos animais tratados com RVG-exossomo. A diminuição observada foi maior que a diminuição de 1-40 dos β-amiloides demonstrada em camundongos normais após injeção intraventricular de inibidores de BACE1. Alvarez-Erviti et ai. realizaram amplificação 5'-rápida de extremidades de cDNA (RACE) no produto de divagem BACE1, que forneceu evidências de knockdown mediado por RNAi pelo siRNA. Por fim, Alvarez-Erviti et ai. investigaram se os exossomos de RNA-RVG induziram respostas imunes in vivo, avaliando as concentrações séricas de IL-6, IP-10, TNF α e IFN-α. Após o tratamento do exossomo, foram registradas alterações não

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313/776 significativas em todas as citocinas, similares ao tratamento com reagente de transfecção de siRNA, em contraste com o SÍRNA-RVG-9R, que estimulou potentemente a secreção de IL-6, confirmando o perfil imunologicamente inerte do

tratamento	de	exossomo	Dado	que	os exossomos	empacotam
apenas 20%	de	siRNA, a	entrega	com	RVG-exossomo	parece ser
mais eficiente	que a	entrega	de	RVG-9R, uma	vez que o

comparável knockdown de mRNA e maior knockout de proteínas foram alcançados com cinco vezes menos siRNA sem o nível correspondente de estimulação imune. Esse experimento demonstrou o potencial terapêutico da tecnologia do exossomo RVG, que é potencialmente adequada para silenciar a longo prazo de genes relacionados a doenças neurodegenerativas. 0 sistema de entrega de exossomos de Alvarez-Erviti et ai. pode ser aplicado para distribuir o sistema de direcionamento de ácido nucleico da presente invenção para alvos terapêuticos, especialmente doenças neurodegenerativas. Uma dosagem de cerca de 100 a 1.000 mg de sistema de direcionamento de ácido nucleico encapsulado em cerca de 100 a 1.000 mg de exossomos RVG pode ser contemplada para a presente invenção.

[466] El-Andaloussi et al. (Nature Protocols 7,2.112 a 2.126 (2012)) fornecem exossomos derivados de células cultivadas aproveitadas para a entrega de RNA ín vitro e in vivo. Esse protocolo descreve primeiro a geração

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314/776 de exossomos direcionados através da transfecção de um vetor de expressão, compreendendo uma proteína exossômica fundida com um ligante peptídico. Em seguida, El-Andaloussi et ai. explicam como purificar e caracterizar exossomos do sobrenadante celular transfectado. Em seguida, El-Andaloussi et ai. detalham etapas cruciais para carregar o RNA nos exossomos. Finalmente, El-Andaloussi et ai. descrevem como usar exossomos para fornecer RNA de maneira eficiente ín vitro e in vivo no cérebro de camundongos. Exemplos de resultados antecipados nos quais a entrega de RNA mediada por exossomo é avaliada por ensaios funcionais e imagens também são fornecidos. 0 protocolo inteiro leva aproximadamente 3 semanas. A entrega ou administração de acordo com a invenção pode ser realizada usando exossomos produzidos a partir de células dendríticas auto-derivadas. Dos ensinamentos deste documento, isso pode ser empregado na prática da invenção [467] Em outra modalidade, os exossomos plasmáticos de Wahlgren et al. (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, η- 17 e 130) são contemplados. Os exossomos são vesículas de tamanho nano (30 a 90 nm) produzidas por muitos tipos de células, incluindo células dendríticas (DC), células B, células T, mastócitos, células epiteliais e células tumorais. Essas vesículas são formadas pela brotação interna dos endossomos tardios e são liberadas no ambiente

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315/776 extracelular após a fusão com a membrana plasmática. Como os exossomos transportam naturalmente o RNA entre as células, essa propriedade pode ser útil na terapia gênica e a partir desta revelação pode ser empregada na prática da presente invenção. Os exossomos do plasma podem ser preparados por centrifugação de buffy coat a 900 g por 20 min para isolar o plasma seguido de colheita de sobrenadantes celulares, centrifugando a 300 g por 10 min para eliminar células e a 16 500g por 30 min, seguido de filtração através de um filtro de 0,22 mm. Os exossomos são sedimentados por ultracentrifugação a 120 000 g por 70 min. A transfecção química de siRNA em exossomos é realizada de acordo com as instruções do fabricante no RNAi Human/Mouse Starter Kit (Quiagen, Hilden, Alemanha) . O siRNA é adicionado a 100 ml de PBS a uma concentração final de 2 mmol/ml. Depois de adicionar o reagente de transfecção HiPerFect, a mistura é incubada por 10 min à temperatura ambiente. Para remover o excesso de micelas, os exossomos são re-isolados usando contas de látex de aldeído/sulfato. A transfecção química do sistema de direcionamento de ácido nucleico para exossomos pode ser conduzida de maneira similar ao siRNA. Os exossomos podem ser co-cultivados com monócitos e linfócitos isolados do sangue periférico de doadores saudáveis. Portanto, podese contemplar que exossomos contendo sistema de direcionamento de ácido nucleico podem ser introduzidos em

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316/776 monócitos e linfócitos e reintroduzidos autologicamente em um ser humano. Por conseguinte, a entrega ou administração de acordo com a invenção pode ser realizada usando exossomos de plasma.

Lipossomas [468] A entrega ou administração de acordo com a invenção pode ser realizada com lipossomas. Lipossomas são estruturas esféricas de vesículas compostas por uma bicamada lipídica uni ou multilamelar ao redor dos compartimentos aquosos internos e uma bicamada fosfolipídica lipofílica externa relativamente impermeável. Os lipossomas ganharam considerável atenção como carreadores de entrega de medicamentos porque são biocompatíveis, não tóxicos, podem fornecer moléculas de medicamentos hidrofílicos e lipofílicos, proteger sua carga da degradação pelas enzimas plasmáticas e transportar sua carga através das membranas biológicas e da barreira cerebral do sangue (BBB) (consulte, por exemplo, Spuch e Navarro, Journal of Drug Delivery, volume 2011, artigo ID 469679, 12 páginas, 2011. doi: 10.1155/2011/469679 para revisão). Os lipossomas podem ser produzidos a partir de vários tipos diferentes de lipídios; no entanto, os fosfolipídios são mais comumente usados para gerar lipossomas como carreadores de fármacos. Embora a formação de lipossomas seja espontânea quando um filme lipídico é misturado com uma solução aquosa, o mesmo também

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317/776 pode ser acelerado aplicando força na forma de agitação com o uso de um homogeneizador, sonicador ou um aparelho de extrusão (consulte, por exemplo, Spuch e Navarro, Journal). of Drug Delivery, volume 2011, artigo ID 469679, 12 páginas, 2011. doi: 10.1155/2011/469679 para revisão).

[469] Vários outros aditivos podem ser adicionados aos lipossomas para modificar sua estrutura e propriedades. Por exemplo, colesterol ou esfingomielina podem ser adicionados à mistura lipossômica para ajudar a estabilizar a estrutura lipossômica e impedir o vazamento da carga interna lipossômica. Além disso, os lipossomas são preparados a partir de fosfatidilcolina de ovo hidrogenada ou fosfatidilcolina de ovo, colesterol e fosfato de dicetil, e seus tamanhos médios de vesículas foram ajustados para cerca de 50 e 100 nm. (consulte, por exemplo, Spuch e Navarro, Journal of Drug Delivery, volume 2011, artigo ID 469679, 12 páginas, 2011. doi: 10.1155/2011/469679 para revisão). Uma formulação de lipossomas pode ser composta principalmente de fosfolipídios e lípidios naturais, como

1,2-distearoril-sn-glicero-3-fosfatidil colina (DSPC), esfingomielina, fosfatidilcolinas de ovo e monossialogangliosídeo. Como esta formulação é composta apenas por fosfolipídios, as formulações lipossômicas enfrentaram muitos desafios, em gue um deles é a instabilidade no plasma. Várias tentativas para superar

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318/776 esses desafios foram feitas, especificamente na manipulação da membrana lipídica. Uma dessas tentativas se concentrou na manipulação do colesterol. A adição de colesterol às formulações convencionais reduz a liberação rápida do composto bioativo encapsulado no plasma ou na 1,2-dioleoilsn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) aumenta a estabilidade (consulte, por exemplo, Spuch e Navarro, Journal of Drug Delivery, volume 2011, artigo ID 469679, 12 páginas, 2011. doi: 10.1155/2011/469679 para revisão). Em uma modalidade particularmente vantajosa, os lipossomas de Trojan Horse (também conhecidos como Cavalos de Trojan Moleculares) são desejáveis e protocolos podem ser encontrados em http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.1 ong. Essas partículas permitem a entrega de um transgene a todo o cérebro após uma injeção intravascular. Sem estar limitado por limitações, acredita-se que partículas lipídicas neutras com anticorpos específicos conjugados à superfície permitam o cruzamento da barreira hematoencefálica via endocitose. 0 requerente postula a utilização de lipossomas de cavalo de Tróia para entregar os complexos CRISPR-Casl3b ao cérebro através de uma injeção intravascular, o que permitiría animais transgênicos do cérebro inteiro sem a necessidade de manipulação embrionária. Cerca de 1 a 5 g de DNA ou RNA podem ser contemplados para administração ín vivo em lipossomas.

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319/776 [470] Em outra modalidade, o sistema de direcionamento de ácido nucleico ou seus componentes pode ser administrado em lipossomas, como uma partícula lipídica de ácido nucleico estável (SNALP) (consulte, por exemplo, Morrissey et al., Nature Biotechnology, volume 23, nL 8, agosto de 2005). São contempladas injeções intravenosas diárias de cerca de 1, 3 ou 5 mg/kg/dia de um sistema específico de direcionamento de ácido nucleico direcionado em um SNALP. O tratamento diário pode durar cerca de três dias e depois semanalmente por cerca de cinco semanas. Em outra modalidade, também é contemplado um sistema SNALP encapsulado de sistema de direcionamento de ácido nucleico administrado por injeção intravenosa a doses de cerca de 1 ou 2,5 mg/kg (consulte, por exemplo, Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 de maio de 2006) . A formulação SNALP pode conter os lipidios 3-N- (wmetoxipoli (etileno glicol) 2000) carbamoil] -1,2-dimiristiloxipropilamina (PEG-C-DMA),

1.2- dilinoleiloxi-N, N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA),

1.2- distearoil-sn-glicero-3-fosfocololina (DSPC) e colesterol, na razão percentual molar de 2:40:10:48 (consulte, por exemplo, Zimmerman et al., Nature Letters,

Vol. 441, 4 de maio de 2006) . Em outra modalidade, as partículas estáveis de lipidios de ácidos nucleicos (SNALPs) provaram ser moléculas de entrega eficazes para tumores hepáticos derivados de HepG2 altamente vascularizados, mas

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320/776 não em tumores hepáticos derivados de HCT-116 pouco vascularizados (veja, por exemplo, Li, Gene Therapy (2012) 19, 775 a 780) . Os lipossomas SNALP podem ser preparados através da formulação de D-Lin-DMA e PEG-C-DMA com distearoilfosfatidilcolina (DSPC), colesterol e siRNA com o uso de uma razão de lipídios/siRNA de 25:1 e uma razão molar de colesterol de 48/40/10/2/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA. Os lipossomas SNALP resultantes têm tamanho de 80 a 100 nm. Em ainda outra modalidade, um SNALP pode compreender colesterol sintético (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) , dipalmitoilfosfatidilcolina (lipídios polares da Avanti, Alabaster, AL, EUA), 3-N-[(w-metoxi poli (etileno glicol)) 2000) carbamoil] -1,2-dimirestiloxipropilamina e 1,2dilinoliloxi-3-N catiônico, Ndimetilaminopropano (consulte, por exemplo, Geisbert et al., Lancet 2010; 375: 1896-905). Uma dosagem de cerca de 2 mg/kg de sistema total de direcionamento de ácido nucleico por dose administrada como, por exemplo, uma infusão intravenosa em bolus pode ser contemplada. Em ainda outra modalidade, um SNALP pode compreender colesterol sintético (Sigma-Aldrich) , 1,2distearoil-sn-glicero-3-fosfocololina (DSPC; Avanti Polar Lipids Inc.), PEG-cDMA e 1,2-dilinoleiloxi -3- (N; Ndimetil) aminopropano (DLinDMA) (consulte, por exemplo, Judge, J. Clin. Invest. 119: 661 a 673 (2009)). As formulações usadas para estudos ín vivo podem compreender

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321/776 uma razão final de massa lipídica/RNA de cerca de 9:1.

[471] 0 perfil de segurança das nanomedicina RNAi foi revisado por Barros e Gollob da Alnylam Pharmaceuticals (consulte, por exemplo, Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 1.730 a 1.737). A partícula lipídica estável de ácido nucleico (SNALP) é composta por quatro lipídios diferentes - um lipídio ionizável (DLinDMA) que é catiônico a pH baixo, um lipídio auxiliar neutro, colesterol e um lipídio difusível de polietileno glicol (PEG). A partícula tem aproximadamente 8 0 nm de diâmetro e é neutra em termos de carga a pH fisiológico. Durante a formulação, o lipídio ionizável serve para condensar o lipídio com o RNA aniônico durante a formação de partículas. Quando carregado positivamente sob condições endossômicas cada vez mais ácidas, o lipídio ionizável também medeia a fusão do SNALP com a membrana endossômica, permitindo a liberação de RNA no citoplasma. O lipídio PEG estabiliza a partícula e reduz a agregação durante a formulação e subsequentemente fornece um exterior hidrofílico neutro que melhora as propriedades farmacocinéticas. Até o momento, dois programas clínicos foram iniciados usando formulações SNALP com RNA. A Tekmira Pharmaceuticals concluiu recentemente um estudo de dose única de fase I do SNALP-ApoB em voluntários adultos com colesterol LDL elevado. A ApoB é predominantemente expressa no fígado e no jejuno e é essencial para a montagem e secreção

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322/776 de VLDL e LDL. Dezessete indivíduos receberam uma dose única de SNALP-ApoB (aumento da dose em sete níveis de dose). Não houve evidência de toxicidade hepática (prevista como potencial toxicidade limitadora de dose com base em estudos pré-clínicos) . Um (de dois) indivíduos na dose mais alta apresentou sintomas similares aos da gripe, consistentes com a estimulação do sistema imunológico, e a decisão foi tomada para concluir o estudo. A Alnylam Pharmaceuticals também avançou o ALN-TTR01, que emprega a tecnologia SNALP descrita acima e tem como alvo a produção de hepatócitos do TTR mutante e do tipo selvagem para tratar a amiloidose do TTR (ATTR). Três síndromes de ATTR foram descritas: polineuropatia amiloidótica familiar (PAF) e cardiomiopatia amiloidótica familiar (FAE) - ambas causadas por mutações autossômicas dominantes na TTR; e amiloidose sistêmica senil (SSA) causada por TTR do tipo selvagem. Um estudo de fase I de escalonamento de dose única, controlado por placebo, de ALN-TTR01 foi recentemente concluído em pacientes com ATTR. 0 ALN-TTR01 foi administrado como uma infusão intravenosa de 15 minutos em 31 pacientes (23 com medicamento do estudo e 8 com placebo) dentro de um intervalo de doses de 0,01 a 1,0 mg/kg (com base no siRNA) . O tratamento foi bem tolerado, sem aumentos significativos nos testes de função hepática. As reações relacionadas à infusão foram observadas em 3 de 23 pacientes com >0,4 mg/kg; todos responderam ao

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323/776 abrandamento da taxa de infusão e todos continuaram no estudo. Elevações mínimas e transitórias das citocinas séricas IL-6, IP-10 e IL-lra foram observadas em dois pacientes na dose mais alta de 1 mg/kg (conforme antecipado em estudos pré-clínicos e NHP) . Foi observado um abaixamento da TTR sérica, o efeito farmacodinâmico esperado de ALNTTR01 a 1 mg/kg.

[472] Em ainda outra modalidade, um SNALP pode ser feito solubilizando um lipídio catiônico, DSPC, colesterol e lipídio PEG, por exemplo, em etanol, por exemplo, a uma razão molar de 40:10:40:10, respectivamente (consulte, Semple et al., Nature Niotechnology, Volume 28 Número 2 Fevereiro de 2010, páginas 172 a 177). A mistura lipídica foi adicionada a um tampão aquoso (citrato 50 mM, pH 4) com mistura para etanol e concentração lipídica final de 30% (em vol/vol) e 6,1 mg/ml, respectivamente, e deixada equilibrar a 22 °C por 2 minutos antes da extrusão. Os lipídios hidratados foram extrudados através de dois filtros empilhados do tamanho de poros de 80 nm (Nuclepore) a 22 °C, utilizando uma extrusora Lipex (Northern Lipids) até obter um diâmetro de vesícula de 70 a 90 nm, conforme determinado pela análise dinâmica de espalhamento de luz. Isso geralmente requer 1 a 3 passagens. O siRNA (solubilizado em uma solução aquosa de citrato 50 mM, pH 4 contendo 30% de etanol) foi adicionado às vesículas pré-equilibradas (35 °C) a uma taxa

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324/776 de ~ 5 ml/min com mistura. Após atingir a relação alvo final de siRNA/lipídio de 0,06 (em p/p), a mistura foi incubada por mais 30 minutos a 35 °C para permitir a reorganização da vesícula e o empacotamento do siRNA. O etanol foi então removido e o tampão externo substituído com PBS (NaCI a 155 mM, Na2HPO4 a 3 mM, KH2PO4 a 1 mM, pH 7,5) , quer por diálise ou diafiltração de fluxo tangencial. o siRNA foi encapsulado no SNALP com o uso de um processo controlado por método de diluição em etapas. Os constituintes lipídicos do KC2-SNALP foram DLin-KC2-DMA (lipídio catiônico), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC; Avanti Polar Lipids), colesterol sintético (Sigma) e PEG-C-DMA utilizados na razão molar de 57,1:7,1:34,3:1,4 Após a formação das partículas carregadas, o SNALP foi dializado contra PBS e o filtro esterilizado através de um filtro de 0,2 pm antes do uso. O tamanho médio das partículas foi de 75 a 85 nm e 90 a 95% do siRNA foi encapsulado nas partículas lipídicas. A razão final de siRNA/lipídio nas formulações usadas para testes ín vivo foi de ~ 0,15 (em p/p). Os sistemas LNP-siRNA contendo siRNA do fator VII foram diluídos para as concentrações apropriadas em PBS estéril imediatamente antes do uso e as formulações foram administradas por via intravenosa através da veia lateral da cauda em um volume total de 10 ml/kg. Esse método e esses sistemas de entrega podem ser extrapolados para o sistema de direcionamento de ácidos nucleicos da presente

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325/776 invenção .

Outros lipidios [473] Outros lipidios catiônicos, como o aminoácido 2,2-dilinolil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2DMA) podem ser usados para encapsular o sistema de direcionamento de ácidos nucleicos ou seus componentes ou nucleicos moléculas de ácido que codificam para isso, por exemplo, similares ao SiRNA (consulte, por exemplo, Jayaraman, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 8.529 a 8.533) e, portanto, podem ser empregues na prática da invenção. Uma vesícula pré-formada com a seguinte composição lipídica pode ser contemplada: amino lipídio, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), colesterol e (R) -2,3-bis (octadeciloxi) propil-1(metoxi poli (etileno glicol) 2000) propilcarbamato (PEGlipidio) na razão molar 40/10/40/10, respectivamente, e uma razão FVII siRNA/lípido total de aproximadamente 0,05 (em p/p). Para garantir uma distribuição estreita de tamanho de partícula na faixa de 70 a 90 nm e um baixo índice de polidispersividade de 0,11 d: 0,04 (n = 56), as partículas podem ser extrudadas até três vezes através de membranas de 80 nm antes de adicionar o RNA guia. Partículas contendo o aminoácido lipídico 16 altamente potente podem ser usadas, nas quais a razão molar dos quatro componentes lipídicos 16, DSPC, colesterol e lipídio PEG (50/10/38,5/1,5) pode ser ainda mais otimizada para aumentar a atividade ín vivo.

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326/776 [474] Michael SD Kormann et al. (Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice: Nature Biotechnology, Volume: 29, Páginas: 154 a 157 (2011)) descrevem o uso de envelopes lipidicos para fornecer RNA. 0 uso de envelopes lipidicos também é preferencial na presente invenção.

[475] Em outra modalidade, os lipídios podem ser formulados com o sistema de direcionamento de RNA (complexo CRISPR-Casl3b, isto é, o Casl3b complexado com crRNA) da presente invenção ou componente (s) ou moléculas de ácido nucleico que os codificam para formar nanoparticulas lipidicas (LNPs). Os lipídios incluem, sem limitação, DLinKC2-DMA4, C12-200 e colipídios disterilfosfatidil colina, colesterol e PEG-DMG podem ser formulados com sistema de direcionamento de RNA em vez de siRNA (consulte, por exemplo, Novobrantseva, Molecular Therapy - Nucleic Acids (2012) 1, e4; doi: 10.1038/mtna.2011.3) com o uso de um procedimento de formação espontânea de vesículas. A razão molar do componente pode ser de cerca de 50/10/38,5/1,5 (DLin-KC2-DMA ou C12-200/disterililfosfatidil colina/colesterol/PEG-DMG). A razão final de lipídios: siRNA pode ser de ~ 12:1 e 9:1 no caso das partículas lipidicas DLin-KC2-DMA e C12-200 (LNPs), respectivamente. As formulações podem ter diâmetros médios de partículas de ~80 nm com eficiência de aprisionamento >90%. Uma dose de 3 mg/kg pode ser contemplada. A Tekmira

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327/776 tem um portfolio de aproximadamente 95 famílias de patentes, nos EUA e no exterior, que são direcionadas a vários aspectos das formulações LNPs e LNP (consulte, por exemplo, patentes n£ 7.982.027; 7.799.565; 8.058.069; 8.283.333; 7.901.708; 7.745.651; 7.803.397; 8.101.741; 8.188.263; 7.915.399; 8.236.943 e 7.838.658 e Patentes EP 1766035; 1519714; 1781593 e 1664316), todos os quais podem ser usados e/ou adaptados à presente invenção.

[476] O sistema de direcionamento de RNA ou seus componentes ou molécula (ou moléculas) de ácido nucleico que codifica os mesmos podem ser entregues encapsulados em microesferas de PLGA, como a descrita em mais detalhes nos pedidos publicados n° US 20130252281 e 20130245107 e 20130244279 (atribuídos à Moderna Therapeutics) relacionados a aspectos da formulação de composições que compreendem moléculas de ácido nucleico modificadas que podem codificar uma proteína, um precursor de proteína ou uma forma parcial ou totalmente processada da proteína ou um precursor de proteína. A formulação pode ter uma razão molar de 50:10:38,5: 1,5-3,0 (lipídio catiônico: lipídio fusogênico:colesterol:lipídio PEG) . O lipídio do PEG pode ser selecionado, sem limitação, PEG-c-DOMG, PEG-DMG. O lipídio fusogênico pode ser DSPC. Consulte também Schrum et al., Delivery and Formulation of Engineered Nucleic Acids, pedido publicado n- US 20120251618.

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328/776 [477] A tecnologia da Nanomerics aborda desafios de biodisponibilidade para uma ampla gama de terapêuticas, incluindo fármacos hidrofóbicas de baixo peso molecular, peptídeos e terapêuticas baseadas em ácidos nucleicos (plasmídeo, siRNA, miRNA). As vias de administração específicas para as quais a tecnologia demonstrou vantagens claras incluem a via oral, transporte através da barreira hematoencefálica, entrega a tumores sólidos e também aos olhos. Ver, por exemplo, Mazza et ai., 2013, ACS Nano. 26 de fevereiro de 2013; 7 (2) : 1016-26; Uchegbu e Slew, 2013, J Pharm Sei. 102 (2): 305-10 e Lalatsa et ai., 2012, J Control Release. 2012 20 de julho; 161 (2) : 523-36.

[478] A Publicação de Patente n° US 20050019923 descreve dendrímeros catiônicos para fornecer moléculas bioativas, tais como moléculas de polinucleotídeo, peptídeos e polipeptídeos e/ou agentes farmacêuticos, a um corpo de mamífero. Os dendrímeros são adequados para direcionar a entrega das moléculas bioativas para, por exemplo, fígado, baço, pulmão, rim ou coração (ou mesmo o cérebro) . Os dendrímeros são macromoléculas tridimensionais sintéticas, preparadas passo a passo a partir de unidades simples de monômeros ramificados, cuja natureza e funcionalidade podem ser facilmente controladas e variadas. Os dendrímeros são sintetizados a partir da adição repetida de blocos de construção a um núcleo multifuncional (abordagem divergente

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329/776 à síntese) ou em direção a um núcleo multifuncional (abordagem convergente à síntese) e cada adição de uma concha tridimensional de blocos de construção leva à formação de uma maior geração dos dendrímeros. Os dendrímeros de polipropilenimina partem de um núcleo de diaminobutano ao qual é adicionado o dobro do número de grupos amino por uma dupla adição de acrilonitrila às aminas primárias, seguida pela hidrogenação dos nitrilos. Isso resulta na duplicação dos grupos amino. Os dendrímeros de polipropilenimina contêm nitrogênio 100% protonável e até 64 grupos amino terminais (geração 5, DAB 64) . Grupos protonáveis são geralmente grupos amina que têm capacidade de aceitar prótons em pH neutro. O uso de dendrímeros como agentes de entrega de genes tem se concentrado amplamente no uso da poliamidoamina e compostos contendo fósforo com uma mistura de amina/amida ou N--P(O2>S como as unidades de conjugação, respectivamente, sem trabalho a ser relatado sobre o uso dos dendrímeros de polipropilenimina de geração inferior para entrega de genes. Os dendrímeros de polipropilenimina também foram estudados como sistemas de liberação controlada sensíveis ao pH para administração de fármacos e para seu empacotamento de moléculas hóspedes quando modificadas quimicamente por grupos de aminoácidos periféricos. A citotoxicidade e interação de dendrímeros de polipropilenimina com DNA, bem como a eficácia de transfecção de DAB 64 também foram

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330/776 estudadas. A Publicação de Patente n- US 20050019923 é baseada na observação de que, ao contrário dos relatórios anteriores, os dendrímeros catiônicos, como os dendrímeros de polipropilenimina, exibem propriedades adequadas, como direcionamento específico e baixa toxicidade, para uso na entrega direcionada de moléculas bioativas, como material genético. Além disso, os derivados do dendrímero catiônico também exibem propriedades adequadas para a entrega direcionada de moléculas bioativas. Consulte também, Bioative Polymers, pedido publicado n° US 20080267903, que descreve Vários polímeros, incluindo polímeros de poliamina catiônicos e polímeros dendriméricos, demonstram ter atividade antiproliferativa e, portanto, podem ser úteis para o tratamento de distúrbios caracterizados por proliferação celular indesejável, como neoplasias e tumores, distúrbios inflamatórios (incluindo distúrbios autoimunes), psoríase e aterosclerose. Os polímeros podem ser usados isoladamente como agentes ativos ou como veículos de entrega de outros agentes terapêuticos, como moléculas de fármacos ou ácidos nucléicos para terapia gênica. A própria atividade antitumoral intrínseca dos polímeros pode complementar a atividade do agente a ser entregue. As revelações dessas publicações de patentes podem ser empregadas em conjunto com os ensinamentos aqui apresentados para a entrega de sistema (ou sistemas) alvo de ácido nucleico ou componente (ou

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331/776 componentes) do mesmo ou molécula (ou moléculas) de ácido nucleico que codifica o mesmo.

Proteínas supercarregadas [479] As proteínas supercarregadas são uma classe de proteínas manipuladas ou de ocorrência natural com carga teórica líquida positiva ou negativa incomumente alta e podem ser empregadas na entrega de sistema de direcionamento de ácidos nucleicos (ou sistema de direcionamento de ácidos nucleicos) ou componente (ou componentes) do mesmo ou molécula de ácidos nucléicos (ou moléculas de ácidos nucléicos) que os codificam. As proteínas carregadas de forma supernegativa e superpositiva exibem uma capacidade notável de suportar agregação induzida termicamente ou quimicamente. As proteínas com carga superpositiva também são capazes de penetrar nas células dos mamíferos. A associação de carga com essas proteínas, como DNA plasmídico, RNA ou outras proteínas, pode permitir a entrega funcional dessas macromoléculas nas células de mamíferos in vitro e in vivo. 0 laboratório de David Liu relatou a criação e caracterização de proteínas sobrecarregadas em 2007 (Lawrence et ai., 2007,

Journal of the American Chemical Society 129, 10.110 a

10.112).

[480] A entrega não viral de RNA e DNA plasmídico nas células de mamíferos é valiosa tanto para pesquisas quanto para aplicações terapêuticas (Akinc et ai., 2010,

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Nat. Biotech. 26, 561 a 569). A proteína GFP +36 purificada (ou outra proteína carregada sobreposta) é misturada com RNAs no meio livre de soro apropriado e deixada complexar antes da adição às células. A inclusão de soro nesta fase inibe a formação dos complexos proteina-RNA sobrecarregados e reduz a eficácia do tratamento. Verificou-se que o protocolo a seguir é eficaz para uma variedade de linhagens celulares (McNaughton et ai., 2009, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 106, 6.111 a 6.116). No entanto, experimentos piloto que variam a dose de proteína e RNA devem ser realizados para otimizar o procedimento para linhagens celulares específicas. (1) Um dia antes do tratamento, colocar 1 x 10⁵ células por poço em uma placa de 48 poços. (2) No dia do tratamento, diluir a proteína +36 GFP purificada em meio sem soro até uma concentração final de 200 nM. Adicionar RNA a uma concentração final de 50 nM. Vortex para misturar e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. (3) Durante a incubação, aspire o meio das células e lave uma vez com PBS. (4) Após a incubação de +36 GFP e RNA, adicione os complexos proteina-RNA às células. (5) Incubar células com complexos a 37 °C por 4h. (6) Após a incubação, aspirar o meio e lave três vezes com 20 U/ml de heparina PBS. Incubar as células com meio contendo soro por mais 48 horas ou mais, dependendo do teste de atividade. (7) Analisar as células por imunotransferência, qPCR, ensaio fenotipico ou outro

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333/776 método apropriado.

[481] Verificou-se que +36 GFP é um reagente eficaz de entrega de plasmideo em uma variedade de células. Veja também, por exemplo, McNaughton et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 106, 6.111 a 6.116 (2009); Cronican et al., ACS Chemical Biology 5, 747 a 752 (2010); Cronican et al., Chemistry & Biology 18, 833 a 838 (2011); Thompson et al., Methods in Enzymology 503, 293 a 319 (2012); Thompson, DB, et al., Chemistry & Biology 19 (7), 831 a 843 (2012). Os métodos das proteínas supercarregadas podem ser usados e/ou adaptados para a entrega do sistema (ou sistemas) alvo de RNA ou componente (ou componentes) ou molécula (ou moléculas) de ácido nucleico que codifica para a presente invenção.

Peptideos de penetração celular (CPPs) [482] Em ainda outra modalidade, os peptideos de penetração celular (CPPs) são contemplados para a entrega do sistema Cas CRISPR. Os CPPs são peptideos curtos que facilitam a captação celular de várias cargas moleculares (de partículas de tamanho nanométrico a pequenas moléculas químicas e grandes fragmentos de DNA) . O termo carga, conforme usado no presente documento, inclui, sem limitação, o grupo que consiste em agentes terapêuticos, sondas de diagnóstico, peptideos, ácidos nucleicos, oligonucleotideos antissenso, plasmideos, proteínas, partículas incluindo nanoparticuias, lipossomas, cromóforos, pequenas moléculas

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334/776 e materiais radioativos. Em aspectos da invenção, a carga também pode compreender qualquer componente do sistema CRISPR Cas ou todo o sistema CRISPR Cas funcional. Os aspectos da presente invenção ainda fornecem métodos para a entrega de uma carga desejada em um indivíduo que compreende: (a) preparar um complexo compreendendo o peptídeo de penetração celular da presente invenção e uma carga desejada; e (b) administrar oral, intra-articular, intraperitoneal, intratecal, intrarterial, intranasal, intraparenquimatosa, subcutânea, intramuscular, intravenosa, dérmica, intrarretal ou topicamente o complexo a um indivíduo. A carga está associada aos peptídeos por ligação química por meio de ligações covalentes ou por interações não covalentes. A função dos CPPs é entregar a carga nas células, um processo que geralmente ocorre através da endocitose com a carga entregue aos endossomos das células vivas dos mamíferos. Os peptídeos que penetram nas células são de diferentes tamanhos, sequências de aminoácidos e cargas, mas todos os CPPs têm uma característica distinta: a capacidade de translocar a membrana plasmática e facilitar a entrega de várias cargas moleculares ao citoplasma ou a uma organela. A translocação da CPP pode ser classificada em três mecanismos principais de entrada: penetração direta na membrana, entrada mediada por endocitose e translocação através da formação de uma estrutura transitória. Os CPPs

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335/776 encontraram inúmeras aplicações na medicina como agentes de administração de medicamentos no tratamento de diferentes doenças, incluindo inibidores de câncer e vírus, bem como agentes de contraste na marcação de células. Exemplos desse último incluem atuar como portador de GFP, agentes de contraste por ressonância magnética ou pontos quânticos. Os CPPs possuem um grande potencial como vetores de entrega ín vitro e ín vivo para uso em pesquisa e medicina. Os CPPs geralmente têm uma composição de aminoácidos que contém uma alta abundância relativa de aminoácidos carregados positivamente, como lisina ou arginina, ou têm sequências que contêm um padrão alternado de aminoácidos polares/carregados e aminoácidos hidrofóbicos não polares. Esses dois tipos de estruturas são referidos como policatiônicos ou anfipáticos, respectivamente. Uma terceira classe de CPPs são os peptídeos hidrofóbicos, contendo apenas resíduos apoiares, com baixa carga líguida ou com grupos de aminoácidos hidrofóbicos cruciais para a captação celular. Um dos CPPs iniciais revelados foi o ativador transcricional de ativação trans (Tat) do Vírus de Imunodeficiência Humana 1 (HIV-1), que foi encontrado eficientemente retirado da mídia circundante por vários tipos de células em cultura. Desde então, o número de CPPs conhecidos se expandiu consideravelmente e foram gerados análogos sintéticos de moléculas pequenas com propriedades de transdução de

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336/776 proteínas mais eficazes. Os CPPs incluem, sem limitação, Penetratin, Tat (48-60), Transportan e (R-AhX-R4) (Ahx = amino-hexanoil).

[483] A patente n° US 8.372.951 fornece um CPP derivado da proteína catiônica eosinofílica (ECP), que exibe uma eficiência altamente penetrante nas células e baixa toxicidade. Também são fornecidos aspectos da entrega do CPP com sua carga em um indivíduo vertebrado. Outros aspectos dos CPPs e sua entrega são descritos nas patentes n° US 8.575.305; 8.614.194 e 8.044.019. Os CPPs podem ser usados para fornecer o sistema CRISPR-Cas ou seus componentes. O fato de que os CPPs podem ser empregados para fornecer o sistema CRISPR-Cas ou seus componentes também é fornecido no manuscrito Gene disruption by cell-penetrating peptidemediated delivery of Cas9 protein and guide RNA, por Suresh Ramakrishna, Abu-Bonsrah Kwaku Dad, Jagadish Beloor, et al. Genome Res. 2 de abril de 2014 [Publicação Eletrônica antes da impressão], incorporado a título de referência na sua totalidade, em que é demonstrado que o tratamento com a proteína Cas9 recombinante conjugada com CPP e complexos de RNAs guia com CPP leva a rupturas de genes endógenos em linhagens celulares humanas. No artigo, a proteína Cas9 foi conjugada à CPP através de uma ligação tioéter, enquanto o RNA guia foi complexado com CPP, formando partículas condensadas e carregadas positivamente. Foi demonstrado que

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337/776 o tratamento simultâneo e sequencial de células humanas, incluindo células-tronco embrionárias, fibroblastos dérmicos, células HEK293T, células HeLa e células de carcinoma embrionário, com o Cas9 modificado e o RNA guia, levaram a interrupções genéticas eficazes com redução de mutações fora do alvo a transfecções de plasmídeo. A administração de CPP pode ser usada na prática da invenção.

Dispositivos Implantáveis [484] Em outra modalidade, dispositivos implantáveis também são contemplados para a distribuição do sistema de alvejamento de ácido nucleico ou componente (ou componentes) do mesmo ou molécula (ou moléculas) de ácido nucleico que codifica o mesmo. Por exemplo, a Publicação de Patente n° U.S. 20110195123 revela um dispositivo médico implantável que elui um fármaco localmente e é fornecido em período prolongado, que inclui diversos tipos do tal dispositivo, os modos de implantação do de tratamento e métodos de implantação. O dispositivo que compreende substrato polimérico, tal como uma matriz, por exemplo, que é usado como o corpo de dispositivo, e fármacos, e em alguns casos materiais estruturados adicionais, tais como metais ou polímeros adicionais, e materiais para aprimorar a visibilidade e imagem. Um dispositivo de distribuição implantável pode ser vantajoso para fornecer liberação localmente e durante um período prolongado, em que o fármaco

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338/776 é liberado diretamente na matriz extracelular (ECM) da área doente, tal como tumor, inflamação, degeneração ou para objetivos sintomáticos, ou em células do músculo liso lesionadas, ou para prevenção. Um tipo de fármaco é RNA, conforme revelado acima, e esse sistema pode ser usado e/ou adaptado ao sistema de alvejamento de ácido nucleico da presente invenção. Os modos de implantação, em algumas modalidades, são procedimentos de implantação existentes que são desenvolvidos e usados hoje para outros tratamentos, que incluem braquiterapia e biópsia com agulha. Em tais casos, as dimensões do novo implante descrito nesta invenção são similares ao implante original. Tipicamente, alguns dispositivos são implantados durante o mesmo procedimento de tratamento.

[485] A Publicação de Patente n° U.S. 20110195123, fornece um sistema inserível ou implantável de distribuição de fármaco, que inclui sistemas aplicáveis em uma cavidade, tal como a cavidade abdominal e/ou qualquer outro tipo de administração na qual o sistema de distribuição de fármaco não é ancorado ou fixada, que compreende um substrato polimérico bioestável e/ou degradável e/ou bioabsorvível, que pode, por exemplo, ser opcionalmente uma matriz. Devese notar que o termo inserção também inclui implantação. O sistema de distribuição de fármaco é preferencialmente implantado como um Loder, conforme descrito na Publicação

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339/776 de Patente n° U.S. 20110195123.

[486] O polímero ou a pluralidade de polímeros são biocompatíveis, os quais incorporam um agente e/ou uma pluralidade de agentes, permitem a liberação de agente em uma taxa controlada, em que o volume total do substrato polimérico, tal como uma matriz, por exemplo, em algumas modalidades, não é opcional e preferencialmente maior que um volume máximo que permite que um nível terapêutico do agente seja alcançado. Como um exemplo sem limitação, tal volume está preferencialmente dentro da faixa de 0,1 m³ a 1.000 mm³, conforme necessário pelo volume para a carga de agente. O Loder pode ser opcionalmente maior, por exemplo, quando incorporado com um dispositivo cujo tamanho é determinado pela funcionalidade, por exemplo, e sem limitação, uma

articulação	do joelho, um anel intrauterino	ou cervical e
semelhantes.
[487]	0 sistema de	distribuição de	fármaco (para
distribuir	a composição)	é projetado,	em algumas

modalidades, para empregar, preferencialmente, polímeros degradáveis, em que o mecanismo de liberação principal é erosão de volume; ou em algumas modalidades, polímeros não degradáveis ou lentamente degradados são usados, em que o mecanismo de liberação principal é difusão em vez de erosão de volume, de modo que a parte externa funcione como membrana, e sua parte interna funcione como um reservatório

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340/776 de fármaco, que praticamente não é afetado pelos arredores por um período prolongado (por exemplo, de cerca de uma semana a cerca de alguns meses). Combinações de diferentes polímeros com diferentes mecanismos de liberação também podem ser opcionalmente usadas. O gradiente de concentração na superfície se mantém, preferencialmente, constante de maneira eficaz durante um período significativo do período de liberação de fármaco total e, portanto, a taxa de difusão é contante de maneira eficaz (denominada difusão de modo zero). O termo constante significa uma taxa de difusão que se mantém preferencialmente acima do limite inferior da eficácia terapêutica, porém, que pode ainda opcionalmente apresentar uma ruptura inicial e/ou pode flutuar, por exemplo, aumentar e diminuir até um determinado grau. A taxa de difusão é preferencialmente mantida assim por um período prolongado, e pode ser considerada constante até um determinado nível para otimizar o período terapeuticamente eficaz, por exemplo, o período de silenciamento eficaz.

[488] O sistema de distribuição de fármaco opcional e preferencialmente é projetado para proteger o agente terapêutico à base de nucleotídeo da degradação, seja química em natureza ou devido ao ataque de enzimas e outros fatores no corpo do indivíduo.

[489] O sistema de distribuição de fármaco da Publicação de Patente n° U.S. 20110195123 está opcionalmente

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341/776 associado aos aparelhos de detecção e/ou ativação que são operados durante e/ou após implantação do dispositivo, através de métodos não e/ou minimamente invasivos de ativação e/ou aceleração/desaceleração, por exemplo, que incluem, opcionalmente, porém, sem limitação, métodos ou dispositivos

de aquecimento e	resfriamento	térmico,	raios	laser	e
ultrassônicos, que	incluem ultrassom	focado	e/ou	RF
(radiofrequência).
[490] De	acordo com	algumas	modalidades	da

Publicação de Patente n° U.S. 20110195123, o lugar para distribuição local pode incluir opcionalmente lugares-alvo caracterizados por alta proliferação anormal de células, e apoptose reprimida, que inclui tumores, inflamação ativa e/ou crônica e infecção que inclui estados de doenças autoimunes, tecido degenerados, que incluem tecido muscular e nervoso, dor crônica, locais degenerativos e localização de fraturas ósseas e outros locais de ferida para aprimoramento da regeneração do tecido, e músculo cardíaco, liso e estriado lesionado.

[491] O lugar para implantação da composição, ou lugar-alvo, apresenta, preferencialmente, um raio, área e/ou volume que é suficientemente pequeno para distribuição local alvejada. Por exemplo, o lugar-alvo tem, opcionalmente, um diâmetro em uma faixa de cerca de 0,1 mm a cerca de 5 cm.

[492] A localização do lugar-alvo é

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342/776 preferencialmente selecionada para eficácia terapêutica máxima. Por exemplo, a composição do sistema de distribuição de fármaco (opcionalmente com um dispositivo para implantação conforme descrito acima) é opcional e preferencialmente implantada dentro ou nas proximidades de um ambiente tumoral, ou no suprimento sanguíneo associado ao mesmo.

[493] Por exemplo, a composição (opcionalmente com o dispositivo) é opcionalmente implantada dentro ou nas proximidades do pâncreas, próstata, mama, fígado, através do mamilo, dentro do sistema vascular e assim por diante.

[494] A localização-alvo é opcionalmente selecionada a partir do grupo que compreende, consiste essencialmente em ou consiste em (apenas como exemplos sem limitação, na medida em que, opcionalmente, qualquer lugar dentro do corpo pode ser adequado para implantar um Loder):

1. cérebro em lugares degenerativos como em mal de Parkinson ou Alzheimer nos gânglios basais, massa branca e cinzenta;

2. coluna como no caso de esclerose lateral amiotrófica (ALS); 3. colo uterino para prevenir infecção HPV; 4. articulações inflamatórias ativas e crônicas; 5. derme como no caso de psoríase; 6. lugares nervosos simpáticos e sensoriais para efeito analgésico; 7. implantação intra óssea; 8. Lugares de infecção aguda e crônica; 9. intra vaginal; 10. sistema auditivo e ouvido interno, labirinto do

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343/776 ouvido interno, sistema vestibular; 11. intra traqueal; 12. intra cardíaco; coronário, epicardíaco; 13. bexiga; 14. sistema biliar; 15. tecido parenquimatoso que inclui e não se limita ao rim, fígado, baço; 16. gânglios linfáticos; 17. glândulas salivares; 18. gengivas dentárias; 19. intra articular (nas articulações); 20. intra ocular; 21. tecido cerebral; 22. ventrículos cerebrais; 23. cavidades, que incluem a cavidade abdominal (por exemplo, porém sem limitação, para câncer de ovário); 24. intra esofágica e 25. intra retal.

[495] Opcionalmente, a inserção do sistema (por exemplo, um dispositivo que contém a composição) está associada à injeção de material na ECM no lugar-alvo e nas proximidades daquele lugar para afetar o pH e/ou temperatura local e/ou outros fatores biológicos que afetam a difusão do fármaco e/ou cinética de fármaco na ECM, do lugar-alvo e das proximidades de tal lugar.

[496] Opcionalmente, de acordo com algumas modalidades, a liberação do dito agente podería estar associada aos aparelhos de detecção e/ou ativação que são operados antes e/ou durante e/ou após inserção, através de métodos não e/ou minimamente invasivos e/ou outros métodos de ativação e/ou aceleração/desaceleração, que incluem raio laser, radiação, aquecimento e resfriamento térmico, e métodos ou dispositivos ultrassônicos, que incluem ultrassom

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focado e/ou	RE	(radiofrequência),	e ativadores	químicos.
[497]		De acordo com	outras modalidades da
Publicação	de	Patente n° U.S.	20110195123,	o fármaco

compreende preferencialmente um RNA, por exemplo, para casos de câncer localizado na mama, pâncreas, cérebro, rim, bexiga, pulmão e próstata, conforme descrito abaixo. Embora exemplificado com RNAi, diversos fármacos são aplicáveis para ser encapsulados em Loder, e podem ser usados em associação com esta invenção, desde que tais fármacos possam ser encapsulados com o substrato de Loder, tal como uma matriz, por exemplo, e esse sistema possa ser usado e/ou adaptado para distribuir o sistema de alvejamento de ácido nucleico da presente invenção.

[498] Como outro exemplo de uma aplicação específica, doenças degenerativas neurológicas e musculares se desenvolvem devido à expressão de gene anormal. A distribuição local de RNAs pode ter propriedades terapêuticas para interferir em tal expressão de gene anormal. A distribuição local de fármacos antiapoptóticos, anti-inflamatórios e antidegenerativos que incluem pequenos fármacos e macromoléculas também pode ser opcionalmente terapêutica. Em tais casos o Loder é aplicado para liberação prolongada em taxa constante e/ou através de um dispositivo dedicado que é implantado separadamente. Tudo isso pode ser usado e/ou adaptado ao sistema de alvejamento de ácido

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345/776 nucleico da presente invenção.

[499] Como ainda outro exemplo de uma aplicação específica, distúrbios psiquiátricos e cognitivos são tratados com modificadores de gene. Knockdown de gene é uma opção de tratamento. Loders que distribuem localmente agentes nos locais do sistema nervoso central são opções terapêuticas para distúrbios psiquiátricos e cognitivos que incluem, porém, sem limitação à psicose, doenças bipolares, distúrbios neuróticos e doenças comportamentais. Os Loders também poderíam distribuir localmente fármacos que incluem pequenos fármacos e macromoléculas mediante implantação nos locais específicos do cérebro. Tudo isso pode ser usado e/ou adaptado ao sistema de alvejamento de ácido nucleico da presente invenção.

[500] Como outro exemplo de uma aplicação específica, silenciamento de mediadores imunológicos inatos e/ou adaptativos em lugares locais permite a prevenção de rejeição de transplante de órgão. A distribuição local de RNAs e reagentes de imunomodulação com o Loder implantado no órgão transplantado e/ou no local implantado gera supressão imunológica local repelindo-se células imunológicas, tais como CD8 ativada contra o órgão transplantado. Tudo isso pode ser usado e/ou adaptado ao sistema de alvejamento de ácido nucleico da presente invenção.

[501] Como outro exemplo de uma aplicação

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346/776 especifica, fatores de crescimento vasculares que incluem VEGFs e angiogenina e outros são essenciais para neovascularização. A distribuição local dos fatores, peptideos, miméticos de peptideo, ou supressão de seus repressores é uma importante modalidade terapêutica; silenciamento dos repressores e distribuição local dos fatores, peptideos, macromoléculas e pequenos fármacos que estimulam angiogênese com o Loder é terapêutico para doenças vasculares periféricas, sistemáticas e cardíacas.

[502] O método de inserção, tal como implantação, já pode ser opcionalmente usado para outros tipos de implantação de tecido e/ou para inserções e/ou para amostrar tecidos, opcionalmente sem modificações, ou da maneira alternativa apenas, opcionalmente, com modificações não significativas em tais métodos. Tais métodos incluem, opcionalmente, porém, não se limitam, métodos de braquiterapia, biópsia, endoscopia com e/ou sem ultrassom, tal como ERCP, métodos estereotáticos no tecido cerebral, Laparoscopia, que inclui implantação com um laparoscópio nas articulações, órgãos abdominais, na parede da bexiga e cavidades corporais.

[503] Tecnologia de dispositivo implantável abordada no presente documento pode ser empregada com os ensinamentos no presente documento e, portanto, através dessa revelação e do conhecimento na técnica, sistema de

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CRISPR-Cas ou componentes do mesmo ou moléculas de ácido nucleico do mesmo ou componentes de codificação ou fornecimento podem ser distribuídos por meio de um dispositivo implantável.

Métodos de triagem específicos do paciente [504] Um sistema de alvejamento de ácido nucleico que alveja RNA, por exemplo, repetições de trinucleotideos podem ser usadas para examinar os pacientes ou amostras de paciente para a presença de tais repetições. As repetições podem ser o alvo do RNA do sistema de alvejamento de ácido nucleico, e se houver ligação com o mesmo através do sistema de alvejamento de ácido nucleico, essa ligação pode ser detectada, para, desse modo, indicar gue tal repetição está presente. Assim, um sistema de alvejamento de ácido nucleico pode ser usado para examinar pacientes ou amostras de paciente para a presença da repetição. O paciente pode, então, ser administrado com o composto (ou compostos) adequado para tratar da afecção; ou, pode ser administrado com um sistema de alvejamento de ácido nucleico para se ligar à, e causar a inserção, deleção ou mutação e aliviar a afecção.

[505] A invenção usa ácidos nucleicos para ligar sequências de RNA-alvo.

mRNA de Proteína Efetora CRISPR e RNA guia [506] Proteína efetora CRISPR (Casl3b) ou mRNA da

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348/776 mesma (ou de modo mais geral uma molécula de ácido nucleico da mesma) e RNA guia ou crRNA também podem ser distribuídos separadamente, por exemplo, o primeiro 1 a 12 horas (preferencialmente por volta de 2 a 6 horas) antes da administração de RNA guia ou crRNA, ou juntos. Uma segunda dose intensificadora de RNA guia ou crRNA pode ser administrada 1 a 12 horas (preferencialmente por volta de 2 a 6 horas) após a administração inicial.

[507] A proteína efetora Casl3b é denominada, por vezes, no presente documento uma Enzima CRISPR. Será verificado que a proteína efetora é com base em ou derivada de uma enzima, assim, o termo 'proteína efetora' certamente inclui 'enzima' em algumas modalidades. No entanto, também será verificado que a proteína efetora pode, conforme necessário em algumas modalidades, ter ligação de DNA ou RNA, porém, não necessariamente atividade de corte ou recorte, que inclui uma função de proteína efetora Cas morta.

[508] Alvos celulares incluem Células Progenitoras/Tronco Hemopoiéticas (CD34+); Células T Humanas; e Olho (células retinianas) - por exemplo, células precursoras fotorreceptoras.

[509] Métodos da invenção podem compreender adicionalmente a distribuição de modelos. A distribuição de modelos pode ocorrer por meio da distribuição simultânea ou separada da distribuição de toda ou qualquer proteína efetora

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CRISPR (Casl3b) ou guia ou crRNA e por meio de mecanismo de distribuição igual ou diferente.

Sistemas Induziveis [510] Em algumas modalidades, uma proteína efetora CRISPR (Cas 13b) pode formar um componente de um sistema induzivel. A natureza induzivel do sistema permitiría controle espaçotemporal de edição genética ou expressão de gene com o uso de uma forma de energia. A forma de energia pode incluir, porém, sem limitação, radiação eletromagnética, energia sonora, energia química e energia térmica. Exemplos de sistema induzivel incluem promotores induziveis de tetraciclina (Tet-Ligado ou Tet-Desligado), dois sistemas de ativações de transcrição híbridos de molécula pequena (FKBP, ABA, etc), ou sistemas induziveis pela luz (Fitocromo, LOV domínios ou criptocromo) . Em uma modalidade, a proteína efetora CRISPR pode ser uma parte de um Efetor Transcricional Induzivel pela Luz (LITE) para direcionar alterações em atividade transcricional de uma maneira de sequência específica. Os componentes de uma luz podem incluir uma proteína efetora CRISPR, um heterodímero de citocromo responsive à luz (por exemplo, a partir da Arabídopsís thalíana), e um domínio de ativação/repressão transcricional. Exemplos adicionais de proteínas de ligação ao DNA induziveis e métodos para seu uso são fornecidos nos documentos n° U.S. 61/736465 e U.S. 61/721,283 e WO

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2014018423 A2 que estão incorporados aqui a titulo de referência em sua totalidade.

Sistemas de auto inativação [511] Uma vez que todas as copias de RNA em uma célula foram editadas, a expressão ou atividade de proteína efetora Casl3b contínua nessa célula não é mais necessária. Um sistema de auto inativação que depende do uso de RNA como em Casl3b ou crRNA como a sequência-alvo de guia pode desligar o sistema evitando-se a expressão de Casl3b ou formação de complexo.

Kits [512] Em um aspecto, a invenção fornece kits que contêm qualquer um ou mais dentre os elementos revelados nos métodos e composições acima. Em algumas modalidades, o kit compreende um sistema vetorial conforme pensado no presente documento ou um ou mais dentre os componentes do sistema de CRISPR/Casl3b ou complexo conforme pensado no presente documento, tal como proteína efetora crRNAs e/ou Casl3b ou proteína efetora Casl3b que codifica mRNA, e instruções para usar o kit. Elementos podem ser fornecidos individualmente ou em combinações, e podem ser fornecidos em qualquer recipiente adequado, tal como um frasco, uma garrafa ou um tubo. Em algumas modalidades, o kit inclui instruções em uma ou mais línguas, por exemplo, em mais de uma língua. As instruções podem ser específicas para as aplicações e métodos

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351/776 descritos no presente documento. Em algumas modalidades, um kit compreende um ou mais reagentes para uso em um processo que utiliza um ou mais dentre os elementos descritos no presente documento. Reagentes podem ser fornecidos em qualquer recipiente adequado. Por exemplo, um kit pode fornecer um ou mais tampões de reação ou armazenamento. Reagentes podem ser fornecidos em uma forma que é útil em um ensaio particular, ou em uma forma que necessita de adição de um ou mais outros componentes antes do uso (por exemplo, em forma concentrada ou liofilizada). Um tampão pode ser qualquer tampão, que inclui, porém, sem limitação, um tampão de carbonato de sódio, um tampão de bicarbonate de sódio, um tampão de borato, um tampão Tris, um tampão MOPS, um tampão HEPES e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o tampão é alcalino. Em algumas modalidades, o tampão tem um pH de cerca de 7 a cerca de 10. Em algumas modalidades, o kit compreende um ou mais oligonucleotídeos que correspondem a uma sequência de guia para inserção em um vetor de modo a ligar operacionalmente a sequência de crRNA ou guia e um elemento regulador. Em algumas modalidades, o kit compreende um polinucleotídeo de modelo de recombinação homólogo. Em algumas modalidades, o kit compreende um ou mais dentre os vetores e/ou um ou mais dentre os polinucleotídeos descritos no presente documento. O kit pode permitir de maneira vantajosa fornecer todos os elementos dos sistemas da

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352/776 invenção .

[513] A invenção tem um espectro amplo de aplicações, por exemplo, em terapia genética, triagem de fármaco, diagnóstico e prognóstico de doença.

[514] Os termos polinucleotídeo, nucleotídeo, sequência nucleotídica, ácido nucleico e oligonucleotídeo são usados intercambiavelmente. Os mesmos se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, sejam desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional, e podem realizar qualquer função, conhecida ou desconhecida. A seguir estão exemplos sem limitação de polinucleotídeos: regiões codificadoras ou não codificadoras de um gene ou fragmento de gene, loci (locus) definidos a partir da análise de ligação, éxons, introns, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, RNA de interferência curto (siRNA), RNA de grampo curto (shRNA), micro-RNA (miRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. 0 termo também engloba estruturas semelhantes ao ácido nucleico com cadeias principais sintéticas, consultar, por exemplo, Eckstein, 1991; Baserga et ai., 1992; Milligan, 1993; WO

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97/03211; WO 96/39154; Mata, 1997; Strauss-Soukup, 1997; e Samstag, 1996. Um polinucleotideo pode compreender um ou mais nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presentes, as modificações à estrutura do nucleotídeo podem ser conferidas antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeo. Um polinucleotideo pode ser, ainda, modificado após a polimerização, tal como por conjugação com um componente de identificação. Conforme usado no presente documento, o termo tipo selvagem é um termo da técnica entendido pelas pessoas habilidosas e significa a forma típica de um organismo, cepa, gene ou característica como ocorre na natureza distinguindo-se das formas mutante ou variante. Um tipo selvagem pode ser uma linha de base. Conforme usado no presente documento, o termo variante deve significar a exibição de qualidades que têm um padrão que desvia daquele que ocorre na natureza. Os termos de ocorrência não natural ou modificado são usados intercambiavelmente e indicam o envolvimento da mão do homem.

Os termos, quando se referem às moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos, significam que a molécula de ácido nucleico ou o polipeptídeo está, pelo menos substancialmente, livre de pelo menos um outro componente com o qual estão naturalmente associados na natureza e conforme encontrados

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354/776 na natureza. Complementaridade se refere à habilidade de um ácido nucleico em formar ligação (ou ligações) de hidrogênio com outra sequência de ácido nucleico através de emparelhamento de base Watson-Crick tradicional ou outros tipos não tradicionais. Um percentual de complementaridade indica a porcentagem de resíduos em uma molécula de ácido nucleico que podem formar ligações de hidrogênio (por exemplo, emparelhamento de base Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, em que 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 são 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% complementares). Perfeitamente complementar significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácido nucleico terão ligação de hidrogênio com o mesmo número de resíduos contíguos em uma segunda sequência de ácido nucleico. Substancialmente complementar, conforme usado no presente documento, se refere a um grau de complementaridade que é de pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% sobre uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ou mais nucleotídeos, ou se refere aos dois ácidos nucleicos que hibridizam sob condições estringentes. Conforme usado no presente documento, condições estringentes para hibridização se referem às condições sob as quais um ácido nucleico que tem complementaridade com uma sequência-alvo hibridiza predominantemente com a sequência

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355/776 alvo, e não hibridiza substancialmente com as sequências-não alvo. Condições estringentes são, geralmente, dependentes de sequência, e variam dependendo de diversos fatores. Em geral, quanto maior a sequência, maior a temperatura na qual a sequência especificamente hibridiza com sua sequência-alvo. Exemplos sem limitação de condições estringentes são descritos em detalhes em Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular BiologyHybridization With Nucleic Acid Probes Parte I, Capitulo Dois Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay, Elsevier, N.Y. Em que referência é feita a uma sequência de polinucleotideos, então, sequências complementares ou parcialmente complementares também estão previstas. As mesmas têm, preferencialmente, capacidade para hibridizar com a sequência de referência sob condições altamente estringentes. De modo geral, a fim de maximizar a taxa de hibridização, condições de hibridização de estringência relativamente baixa são selecionadas: cerca de 20 a 25 °C abaixo do ponto de fusão térmica (T_m) . O T_m é a temperatura na qual 50% da sequência-alvo especifica hibridiza em uma sonda perfeitamente complementar em solução a um pH e força iônica definidos. De modo geral, afim de exigir pelo menos cerca de 85% de complementaridade de nucleotideo das sequências hibridizadas, condições de lavagem altamente

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356/776 estringentes são selecionadas de modo a estarem de cerca de 5 a 15 °C abaixo do T_m. De modo a exigir pelo menos cerca de 70% de complementaridade de nucleotídeo das sequências hibridizadas, condições de lavagem moderadamente estringentes são selecionadas de modo a estarem cerca de 15 a 30 °C abaixo do T_m. Condições de lavagem altamente permissivas (estringência muito baixa) podem ser tão baixas quanto 50 °C abaixo do T_m, o que permite um nível alto de inadequação entre sequências hibridizadas. Aqueles versados na técnica reconhecerão que outros parâmetros físicos e químicos na hibridização e estágios de lavagem também podem ser alterados para afetar o resultado de um sinal de hibridização detectável a partir de um nível específico de homologia entre sequências-alvo e de sonda. Condições altamente estringentes preferenciais compreendem incubação em 50% de formamida, 5><SSC e 1% de SDS a 42° C, ou incubação em 5><SSC e 1% de SDS a 65 °C, com lavagem em 0,2*SSC e 0,1% de SDS a 65 °C. Hibridização se refere a uma reação na qual um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado por meio de ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeo. A ligação de hidrogênio pode ocorrer através de emparelhamento de base Watson Crick, ligação de Hoogstein ou de qualquer outra maneira de sequência específica. O complexo pode compreender duas fitas que formam uma estrutura duplex, três ou mais

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357/776 fitas que formam um complexo com múltiplas fitas, uma única fita de auto hibridização, ou qualquer combinação dessas. Uma reação de hibridização pode constituir uma etapa em um processo mais extensivo, tal como a iniciação de PCR, ou a divagem de um polinucleotídeo por uma enzima. Uma sequência que tem capacidade para hibridizar com uma dada sequência é denominada o complemento da dada sequência. Conforme usado no presente documento, o termo locus genômico ou locus (plural loci) é a localização específica de um gene ou sequência de DNA em um cromossomo. Um gene se refere aos trechos de DNA ou RNA que codificam um polipeptídeo ou uma cadeia de RNA que tem um papel funcional a atuar em um organismo e, portanto, é a unidade molecular de hereditariedade em organismos vivos. Com o propósito desta invenção pode-se considerar que os genes incluem regiões que regulam a produção do produto genético, sendo as tais sequências reguladoras adjacentes ou não às sequências codificadoras e/ou transcritas. Consequentemente, um gene inclui, porém sem limitação necessriamente, sequências promotoras, terminadores, sequências reguladoras traducionais, tais como sítios de ligação a ribossoma e sítios de entrada de ribossoma internos, intensificadores, silenciadores, isolantes, elementos de contorno, origens de replicação, sítios de ligação à matriz e regiões de controle de locus. Conforme usado no presente documento, expressão

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358/776 de um locus genômico ou expressão de gene é o processo pelo qual as informações de um gene são usadas na síntese de um produto genético funcional. Os produtos de expressão de gene são, frequentemente, proteínas, porém, em genes de codificação de não proteína, tais como genes de rRNA ou genes de tRNA, o produto é RNA funcional. 0 processo de expressão de gene é usado por toda vida conhecida - eucariontes (que incluem organismos multicelulares), procariontes (bactérias e archaea) e vírus para gerar produtos funcionais para sobreviver. Conforme usado no presente documento expressão de um gene ou ácido nucleico engloba não só a expressão de gene celular, mas também a transcrição e tradução de ácido nucleico (ou ácidos nucleicos) em sistemas de clonagem e em qualquer outro contexto. Conforme usado no presente documento, expressão também se refere ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um modelo de DNA (tal como em transcrição de mRNA e/ou outro RNA) e/ou ao processo pelo qual um mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Transcrições e polipeptídeos codificados podem ser coletivamente denominados produto genético. Se o polinucleotídeo é derivado de DNA genômico, a expressão pode incluir splicing do mRNA em uma célula eucariótica. Os termos polipeptídeo, peptídeo e proteína são usados de modo intercambiável no presente documento para se referir aos

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359/776 polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. 0 polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, formação de ligação de bissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação, tal como conjugação com um componente de identificação. Conforme usado no presente documento, o termo aminoácido inclui aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e os isômeros ópticos D ou L, e análogos de aminoácido e peptidomiméticos. Conforme usado no presente documento, o termo domínio ou domínio de proteína se refere a uma parte de uma sequência de proteínas que pode existir e funcionar independentemente do resto da cadeia de proteína. Conforme descrito em aspectos da invenção, a identidade de sequência está relacionada à homologia de sequência. Comparações de homologia podem ser conduzidas visualmente, ou mais normalmente, com o auxílio de programas de comparação de sequência prontamente disponíveis. Esses programas de computador comercialmente disponíveis podem calcular o percentual (%) de homologia entre duas ou mais sequências e também pode calcular a identidade de sequência compartilhada por duas ou mais sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos.

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360/776 [515] Conforme usado no presente documento, o termo tipo selvagem é um termo da técnica entendido pelas pessoas habilidosas e significa a forma típica de um organismo, cepa, gene ou característica como ocorre na natureza distinguindose das formas mutante ou variante. Um tipo selvagem pode ser uma linha de base.

[516] Conforme usado no presente documento, o termo variante deve significar a exibição de qualidades que têm um padrão que desvia daquele que ocorre na natureza. Os termos de ocorrência não natural ou modificado são usados intercambiavelmente e indicam o envolvimento da mão do homem. Os termos, quando se referem às moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos, significam que a molécula de ácido nucleico ou o polipeptídeo está, pelo menos substancialmente, livre de pelo menos um outro componente com o qual estão naturalmente associados na natureza e conforme encontrados na natureza. Em todos os aspectos e modalidades, em que os mesmos incluem ou não esses termos, será entendido que, preferencialmente, podem ser opcionais e, assim, preferencialmente incluídos ou preferencialmente não incluídos. Ademais, os termos de ocorrência não natural e modificado podem ser usados intercambiavelmente e, assim, podem ser, portanto, usados sozinhos ou em combinação, e um ou outro pode substituir a menção de ambos juntos. Em particular, modificado é preferencial em vez de de

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361/776 ocorrência não natural ou de ocorrência não natural e/ou modificado.

[517] Homologias de sequência podem ser geradas por

qualquer	um	dentre	diversos programas	de computador
conhecidos	na	técnica,	por	exemplo, BLAST ou	FASTA, etc. Um
programa	de	computador	adequado para	realizar tal

alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Universidade de Wisconsin, E.U.A.; Devereux, et ai., 1984, Nucleic Acids Research 12:387) . Exemplos de outro software que pode realizar comparações de sequência incluem, porém, sem limitação, o pacote BLAST (consultar Ausubel et ai., 1999 ibid - Capítulo 18), FASTA (Atschul et ai., 1990, J. Mol. Biol., 403 a 410) e o pacote GENEWORKS de ferramentas de comparação. Tanto BLAST quanto FASTA estão disponíveis para consulta offline e online (consultar Ausubel et ai., 1999 ibid, páginas 7 a 58 a 7 a 60) . No entanto, é preferencial usar o programa GCG Bestfit. A porcentagem (%) de homologia de sequência pode ser calculada sobre sequências contíguas, isto é, uma sequência é alinhada com a outra sequência e cada aminoácido ou nucleotídeo em uma sequência é diretamente comparado com o aminoácido ou nucleotídeo correspondente na outra sequência, um resíduo por vez. Isso se chama um alinhamento sem lacuna. Tipicamente, tais alinhamentos sem lacuna são realizados apenas sobre um número relativamente curto de resíduos. Embora esse seja um método muito simples

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362/776 e consistente, o mesmo falha em levar em consideração que, por exemplo, em um par, de outra forma idêntico, de sequências, uma inserção ou deleção pode fazer com que os seguintes resíduos de aminoácido sejam tirados do alinhamento, assim, se resulta potencialmente em uma grande redução em % de homologia quando um alinhamento global é realizado. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de sequência são projetados para produzir alinhamentos ideais que levam em consideração possíveis inserções e deleções sem penalizar indevidamente a pontuação de homologia ou identidade geral. Isso é alcançado inserindose lacunas no alinhamento de sequência para tentar maximizar a homologia ou identidade local. No entanto, estes métodos mais complexos atribuem penalidades por lacuna a cada lacuna que ocorra no alinhamento tal que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de sequências com tão poucas lacunas quanto possíveis refletindo relação mais elevada entre as duas sequências comparadas - alcançará uma pontuação mais elevada do que uma com muitas lacunas. Custos de lacuna de afinidade são tipicamente usados para cobrar um custo relativamente alto para a existência de uma lacuna e uma penalidade menor para cada resíduo subsequente na lacuna. Esse é o sistema de pontuação de lacuna normalmente mais usado. Altas penalidades de lacuna podem, obviamente, produzir

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363/776 alinhamentos otimizados com menos lacunas. A maioria dos programas de alinhamento permitem que as penalidades de lacuna sejam modificadas. No entanto, é preferencial usar os valores padrão ao usar tal software para comparações de sequência. Por exemplo, ao usar o pacote GCG Wisconsin Bestfit, a penalidade de lacuna padrão para as sequências de aminoácidos é -12 para uma lacuna e -4 para cada extensão. 0 cálculo de % de homologia máxima portanto exige primeiro a produção de um alinhamento ideal, que leve em consideração as penalidades de lacuna. Um programa de computador adequado para realizar tal alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et ai., 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Exemplos de outro software que pode realizar comparações de sequência incluem, porém, sem limitação, o pacote BLAST (consultar Ausubel et ai., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4- Edição - Capítulo 18), FASTA (Altschul et ai., 1990 J. Mol. Biol. 403 a 410) e o pacote GENEWORKS de ferramentas de comparação. Tanto BLAST quanto FASTA estão disponíveis para consulta offline e online (consultar Ausubel et ai., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7 a 58 a 7 a 60) . No entanto, para algumas aplicações, é preferencial usar o progama GCG Bestfit. Uma nova ferramenta, chamada BLAST 2 Sequences também está disponível para comparar sequências de proteínas e nucleotídeos (consultar FEMS Microbiol Lett. 1999 174(2): 247 a 50; FEMS

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Microbiol Lett. 1999 177 (1) : 187 a 8 e o site da web do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia no site da web dos Institutos Nacionais de Saúde) . Embora a % de homologia final possa ser medida em termos de identidade, o próprio processo de alinhamento não é tipicamente baseado em uma comparação de pares tudo-ou-nada. De fato, é geralmente usada uma matriz de pontuação de similaridade escalonada que atribui pontuações a cada comparação par a par com base na similaridade química ou distância evolutiva. Um exemplo de tal matriz normalmente usada é a matriz BLOSUM62 - a matriz padrão para o pacote BLAST de programas. Programas GCG Wisconsin geralmente usam os valores padrão públicos ou uma tabela de comparação de símbolo personalizada, se fornecida (consultar o manual do usuário para mais detalhes). Para algumas aplicações, é preferencial usar valores padrão públicos para o pacote GCG, ou no caso de outro software, a matriz padrão, tal como BLOSUM62. Alternativamente, a porcentagem de homologias pode ser calculada com o uso do recurso de alinhamento múltiplo em DNASIS™ (Software Hitachi), com base em um algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237 a 244). Uma vez que o software produziu um alinhamento ideal, é possível calcular a % de homologia, preferencialmente % de identidade de sequência. 0 software faz isso, tipicamente, como parte da comparação de sequência e gera um resultado numérico. As

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365/776 sequências também podem ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácido que produzem uma alteração silenciosa e resultam em uma substância funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácido deliberadas podem ser feitas com base na similaridade em propriedades de aminoácido (tais como polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos) e, portanto, são úteis para o grupo de aminoácidos juntos em grupos funcionais. Aminoácidos podem ser agrupados juntos com base nas propriedades de suas cadeias laterais apenas. No entanto, também é mais útil incluir dados de mutação. Os conjuntos de aminoácidos assim derivados são propensos a serem conservados por razões estruturais. Esses conjuntos podem ser descritos na forma de um diagrama de Venn (Livingstone C.D. e Barton G.J. (1993) Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation Comput. Appl. Biosci. 9: 745 a 756) (Taylor W.R. (1986) The classification of amino acid conservation J. Theor. Biol. 119; 205 a 218) . Substituições conservadoras podem ser feitas, por exemplo, de acordo com a tabela abaixo que descreve um diagrama de Venn geralmente aceito de agrupamento de aminoácidos.

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Conj unto	Subconj unto
Hidrofóbico	FWYHKMILVAGC	Aromático	F W Y H
Alifático	I L V
Polar	WYHKREDCSTNQ	Carregado	Η K R E D
Positivamente carregado	Η K R
Negativamente carregado	E D
Pequeno	VCAGSPTND	Muito pequeno	A G S

[518] Os termos sujeito, indivíduo e paciente são usados intercambiavelmente no presente documento para se referir a um vertebrado, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um ser humano. Mamíferos incluem, porém, sem limitação, murinos, símios, humanos, animais de criação, animais para fins esportivos e animais domésticos. Tecidos, células e sua progenitura de uma entidade biológica obtida ín vivo ou cultivada in vitro também são englobados.

[519] Os termos agente terapêutico, agente com capacidade terapêutica ou agente de tratamento são usados intercambiavelmente e se referem a uma molécula ou composto que confere algum efeito benéfico mediante administração a um indivíduo. 0 efeito benéfico inclui capacitação de determinações de diagnóstico; amenização de uma doença,

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367/776 sintoma, distúrbio ou afecção patológica; redução ou prevenção do inicio de uma doença, sintoma, distúrbio ou afecção; e geralmente combate a uma doença, sintoma, distúrbio ou afecção patológica. Conforme no presente documento, tratamento ou tratar ou paliar ou atenua são usados de forma intercambiável. Esses termos referem-se a uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados incluindo, porém sem limitação, um beneficio terapêutico e/ou um beneficio profilático. 0 termo beneficio terapêutico significa qualquer melhoramento terapeuticamente relevante em ou efeito sobre uma ou mais doenças, afecções ou sintomas sob tratamento. Para o beneficio profilático, as composições podem ser administradas a um indivíduo em risco de desenvolver uma doença, afecção ou sintoma particular, ou a um indivíduo que relata um ou mais dos sintomas fisiológicos de uma doença, mesmo que a doença, afecção ou sintoma possa não ter se manifestado ainda. 0 termo quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de um agente que é suficiente para o efeito beneficiai ou resultados desejados. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar dependendo de um ou mais dentre: o indivíduo e afecção de doença que é tratada, o peso e idade do indivíduo, a gravidade da afecção de doença, a maneira de administração e semelhantes, que podem ser prontamente determinados por uma pessoa de habilidade comum na técnica. 0 termo também se

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368/776 aplica a uma dose que fornecerá uma imagem para detecção através de qualquer um dos métodos de imaginologia descritos no presente documento. A dose específica pode variar dependendo de um ou mais dentre: o agente particular escolhido, o regime de dosagem a ser seguido, a possibilidade de ser administrada em combinação com outros compostos, o tempo de administração, o tecido a ser transformado em imagem e o sistema de distribuição física no qual é carregada.

[520] A prática da presente invenção emprega, a menos que seja indicado de outra forma, técnicas convencionais de imunologia, bioquímica, química, biologia molecular, microbiologia, biologia celular, genômica e DNA recombinante, que estão inseridas na habilidade da técnica. Consultar Sambrook, Fritsch e Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2^ edição (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et ai. eds., (1987)); a série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, edição (1987)). Diversos aspectos da invenção se referem aos sistemas vetoriais que compreendem um ou mais vetores, ou vetores propriamente ditos. Vetores podem ser projetados para a expressão de transcrições de CRISPR (por exemplo, transcrições de ácido nucleico, proteínas ou enzimas) em

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369/776 células procariontes ou eucariontes. Por exemplo, transcrições de CRISPR podem ser expressas em células bacterianas, tal como Escherichia coli, células de inseto (com o uso de vetores de expressão baculovírus), células de levedura ou células de mamíferos. Células hospedeiras adequadas são abordadas adicionalmente em Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo, com o uso de sequências promotoras reguladoras T7 e Τ7 polimerase. Modalidades da invenção incluem sequências (de polinucleotideo ou polipeptídeo) que podem compreender substituição homóloga (substituição e troca são ambas usadas no presente documento de modo a significar o intercâmbio de um resíduo de aminoácido ou nucleotídeo existente, por um resíduo ou nucleotídeo alternativo) que pode ocorrer, isto é, substituição de iguais por iguais no caso de aminoácidos, tais como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. A substituição não homóloga também pode ocorrer, isto é, de uma classe de resíduo para outra ou pode envolver, alternativamente, a inclusão de aminoácidos não naturais, tais como ornitina (doravante denominada Z), ornitina de ácido diaminobutírico (doravante denominado B), ornitina de norleucina (doravante denominada O), piri-ilalanina, tienilalanina, naftilalanina

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370/776 e fenilglicina. Sequências de aminoácidos variantes podem incluir grupos espaçadores adequados que podem ser inseridos entre quaisquer dois resíduos de aminoácido da sequência que inclui grupos alquila, tais como grupos metila, etila ou propila adicionalmente aos espaçadores de aminoácido, tais como resíduos de glicina ou β-alanina. Uma forma adicional de variação, que envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácido em forma de peptoide, pode ser bem entendida por aqueles versados na técnica. Para evitar dúvidas, o termo a forma peptoide é usado para se referir aos resíduos de aminoácido variantes em que o grupo substituinte de a-carbono está no átomo de nitrogênio do resíduo em vez do a-carbono. Processos para preparar peptídeos na forma peptoide são conhecidos na técnica, por exemplo, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9.367 a 9.371 e Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132 a 134. Modelagem de homologia: Resíduos correspondentes em outros ortólogos de Casl3b podem ser identificados através dos métodos de Zhang et ai., 2012 (Nature; 490(7421) : 556 a 60) e Chen et ai., 2015 (PLoS Comput Biol; 11(5): el004248)—a método de interação de proteína-proteína computacional (PPI) para prever interações mediadas por interfaces de domínio e motivo. PrePPI (PPI Preditiva) , um método de previsão de PPI com base em estrutura, combina evidência estrutural com evidência não

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371/776 estrutural com o uso de um quadro estatístico bayesiano. 0 método envolve pegar um par de proteínas de busca e usar o alinhamento estrutural para identificar representantes estruturais que correspondem às suas estruturas experimentalmente determinadas ou aos modelos de homologia. 0 alinhamento estrutural é mais usado para identificar os vizinhos estruturais tanto próximos quanto remotos considerando-se as relações geométricas globais e locais. Sempre que dois vizinhos dos representantes estruturais formam um complexo relatado no Banco de Dados de Proteína, isso define um modelo para modelar a interação entre as duas proteínas de busca. Modelos do complexo são criados sobrepondo-se as estruturas representativas em seu vizinho estrutural correspondente no modelo. Essa abordagem é descrita adicionalmente em Dey et ai., 2013 (Prot Sei; 22: 359 a 566).

[521] Com o propósito desta invenção, amplificação significa qualquer método que emprega um iniciador e uma polimerase que têm capacidade para replicar uma sequênciaalvo com uma fidelidade razoável. Amplificação pode ser conduzida através de DNA polimerases naturais ou recombinantes, tais como TaqGold™, DNA polimerase T7, fragmento Klenow de DNA polimerase de E.coli e transcriptase reversa. Um método de amplificação preferencial é PCR. Em determinados aspectos, a invenção envolve vetores. Conforme

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372/776 usado aqui, um vetor é uma ferramenta que permite ou facilita a transferência de uma entidade de um ambiente para outro. É um replicon, como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, em que um outro segmento de DNA pode ser inserido, a fim de provocar a replicação do segmento inserido. Em geral, um vetor tem capacidade para replicação quando associado aos elementos de controle adequados. Em geral, o termo vetor refere-se a uma molécula de ácido nucleico que tem capacidade para transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Os vetores incluem, porém sem limitação, moléculas de ácido nucleico que são de fita simples, de fita dupla ou parcialmente de fita dupla; moléculas de ácido nucleico que compreendem uma ou mais extremidades livres, sem extremidades livres (por exemplo, circulares); moléculas de ácido nucleico que compreendem DNA, RNA ou ambos; e outras variedades de polinucleotídeos conhecidos na técnica. Um tipo de vetor é um plasmídeo, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular em que segmentos adicionais de DNA podem ser inseridos, como por meio de técnicas convencionais de clonagem molecular. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que seqüências de DNA ou RNA derivadas de vírus estão presentes no vetor para embalagem em um vírus (por exemplo, retrovirus, retrovirus com defeito de replicação, adenovirus, adenovirus com defeito de replicação e virus adeno-associados (AAVs)). Os vetores virais também

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373/776 incluem polinucleotideos transportados por um virus para transfecção em uma célula hospedeira. Determinados vetores têm capacidade para replicação autônoma em uma célula hospedeira em que são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que têm uma origem bacteriana de replicação e vetores epissômicos de mamífero). Outros vetores (por exemplo, vetores não epissômicos de mamífero) são integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante introdução na célula hospedeira e são, assim, replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, determinados vetores têm capacidade para direcionar a expressão de genes aos quais estão ligados de maneira funcional. Tais vetores são referidos no presente documento como vetor de expressão. Os vetores de expressão comuns de utilidade em técnicas de DNA recombinantes estão frequentemente na forma de plasmídeos. Os vetores de expressão recombinantes podem compreender um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para a expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem um ou mais elementos reguladores, que podem ser selecionados com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, que está operacionalmente ligado à sequência de ácidos nucleicos a ser expressa. Dentro de um vetor de expressão recombinante, operacionalmente ligado significa que a sequência de nucleotídeos de

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ΙΊ^/ΊΊβ interesse está ligada ao elemento regulador (ou elementos reguladores) de uma maneira que permita a expressão da sequência de nucleotídeos (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). Em relação aos métodos de recombinação e clonagem, é mencionado o pedido de patente US 10/815.730, publicado em 2 de setembro de 2004 como US 2004-0171156 Al, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Aspectos da invenção se referem aos vetores bicistrônicos para RNA guia e proteínas/enzimas efetoras de CRISPR de tipo selvagem, modificadas ou mutadas (por exemplo, proteínas efetoras CaslSb). Vetores de expressão bicistrônicos RNA guia e proteínas/enzimas efetoras de CRISPR de tipo selvagem, modificadas ou mutadas (por exemplo, proteínas efetoras CaslSb) são preferenciais. Em geral e particularmente nessa modalidade, proteínas/enzimas efetoras de CRISPR de tipo selvagem, modificadas ou mutadas (por exemplo, proteínas efetoras CaslSb) são preferencialmente acionadas pelo promotor CBh. O RNA pode ser preferencialmente acionado por um promotor Pol III, tal como um promotor U6. De maneira ideal, os dois são combinados.

[522] Em algumas modalidades, uma alça no RNA guia ou crRNA é fornecida. A mesma pode ser uma alça e haste ou uma tetra alça. A alça é preferencialmente GAAA, porém, não

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375/776 se limita a essa sequência ou ter, de fato, apenas 4bp em comprimento. De fato, as sequências formadoras de alça preferenciais para uso em estruturas de grampo têm quatro nucleotídeos em comprimento e têm, com máxima preferência, a sequência GAAA. No entanto, sequências de alça mais longas ou mais curtas podem ser usadas, como podem ser usadas sequências alternativas. As sequências incluem, preferencialmente, um triplet de nucleotídeo (por exemplo, AAA) , e um nucleotídeo adicional (por exemplo, C ou G) . Exemplos de sequências formadoras de alça incluem GAAA e AAAG.

[523] Na prática de qualquer um dos métodos revelados no presente documento, um vetor adequado pode ser introduzido em uma célula ou um embrião por meio de um ou mais métodos conhecidos na técnica, que incluem sem limitação, microinjeção, eletroporação, sonoporação, biolística, transfecção mediada por fosfato de cálcio, transfecção catiônica, transfecção de lipossoma, transfecção de dendrímero, transfecção de choque térmico, transfecção de nucleofecção, magnetofecção, lipofecção, impalefecção, transfecção óptica, absorção de ácidos nucléicos aprimorada por agente proprietário e distribuição por meio de lipossomas, imunolipossomas, virossomas ou virions artificiais. Em alguns métodos, o vetor é introduzido em um embrião por microinjeção. 0 vetor ou os vetores podem ser

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376/776 microinjetados no núcleo ou no citoplasma do embrião. Em alguns métodos, o vetor ou os vetores podem ser introduzidos em uma célula por nucleofecção.

[524] Vetores podem ser projetados para a expressão de transcrições de CRISPR (por exemplo, transcrições de ácido nucleico, proteínas ou enzimas) em células procariontes ou eucariontes. Por exemplo, transcrições de CRISPR podem ser expressas em células bacterianas, tal como Escherichia coli, células de inseto (com o uso de vetores de expressão baculovírus) , células de levedura ou células de mamíferos. Células hospedeiras adequadas são abordadas adicionalmente em Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) . Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo, com o uso de sequências promotoras reguladoras T7 e Τ7 polimerase.

[525] Vetores podem ser introduzidos e propagados em um procarionte ou célula procarionte. Em algumas modalidades, um procarionte é usado para amplificar cópias de um vetor a ser introduzido em uma célula eucariótica ou como um vetor intermediário na produção de um vetor a ser introduzido em uma célula eucariótica (por exemplo, amplificar um plasmídeo como parte de um sistema de embalagem de vetor viral). Em algumas modalidades, um procarionte é usado para amplificar cópias de um vetor e expressar um ou

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377/776 mais ácidos nucleicos, tal como fornecer uma fonte de uma ou mais proteínas para distribuição a uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro. Expressão de proteínas em procariontes é conduzida com mais frequência em Escherichia coii com vetores que contêm promotores constitutivos ou induzíveis que direcionam a expressão de proteínas de fusão ou não fusão. Vetores de fusão adicionam diversos aminoácidos a uma proteína codificada nos mesmos, tal como à terminação amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão podem servir a um ou mais propósitos, tais como: (i) aumentar expressão de proteína recombinante; (ii) aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e (iii) auxiliar na purificação da proteína recombinante atuando-se como um ligante em purificação de afinidade. Frequentemente, em vetores de fusão de expressão, um local de divagem proteolítica é introduzido na junção da porção química de fusão e na proteína recombinante para permitir separação da proteína recombinante da porção química de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão. Tais enzimas, e suas sequências de reconhecimento cognatas, incluem Fator Xa, trombina e enteroquinase. Vetores de fusão de expressão exemplificativos incluem pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith e Johnson, 1988. Gene 67: 31 a 40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fundem glutationa S-transferase (GST), maltose E

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378/776 proteína de ligação, ou proteína A, respectivamente, à proteína recombinante-alvo. Exemplos de vetores de expressão de E. coli de não fusão induzíveis adequados incluem pTrc (Amrann et ai., (1988) Gene 69:301 a 315) e pET lld (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60 a 89). Em algumas modalidades, um vetor é um vetor de expressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão em levedura Saccharomyces cerívísae incluem pYepSecl (Baldari, et ai., 1987. EMBO J. 6: 229 a 234), pMFa (Kuijan e Herskowitz, 1982. Cell 30: 933 a 943), pJRY88 (Schultz et ai., 1987. Gene 54: 113 a 123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), e picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.). Em algumas modalidades, um vetor aciona a expressão de proteína em células de inseto com o uso de vetores de expressão de baculovírus. Vetores de baculovírus disponíveis para expressão de proteínas em células de inseto cultivadas (por exemplo, células SF9) incluem a série pAc (Smith, et ai., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2.156 a 2.165) e a série pVL (Lucklow e Summers, 1989. Virology 170: 31 a 39). Em algumas modalidades, um vetor tem capacidade para acionar a expressão de uma ou mais sequências em células de mamíferos com o uso de um vetor de expressão de mamífero. Exemplos de vetores de expressão de mamíferos incluem pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) e pMT2PC (Kaufman, et ai., 1987. EMBO J. 6: 187 a

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195). Quando usadas nas células de mamíferos, as funções de controle do vetor de expressão são tipicamente fornecidas por um ou mais elementos reguladores. Por exemplo, promotores normalmente usados são derivados de polioma, adenovirus 2, citomegalovírus, vírus símio 40, e outros revelados no presente documento e conhecidos na técnica. Para outros sistemas de expressão adequados para ambas as células procariontes e eucariontes consultar, por exemplo, Capítulos 16 e 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2- edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Em algumas modalidades, o vetor de expressão mamífero recombinante tem capacidade para direcionar expressão do ácido nucleico preferencialmente em um tipo de célula particular (por exemplo, elementos reguladores de tecido específico são usados para expressar o ácido nucleico). Elementos reguladores de tecido específico são conhecidos na técnica. Exemplos sem limitação de promotores de tecido específico adequados incluem o promotor de albumina (específico do fígado; Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268 a 277), promotores de linfoide específico (Calame e Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235 a 275), em particular, promotores de receptores de célula T (Winoto e Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729 a 733) e imunoglobulinas (Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729 a 740; Queen e Baltimore, 1983. Cell

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33: 741 a 748), promotores de neurônio específico (por exemplo, o promotor de neurofilamento; Byrne e Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5.473 a 5.477), promotores de pâncreas específico (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912 a 916), e promotores de glândula específica de mamífero (por exemplo, promotor de soro de leite; documento de Patente n° U.S. 4.873.316 e Publicação de Pedido Europeu n° 264,166) . Promotores regulados de maneira desenvolvimental também são englobados, por exemplo, os promotores murino hox (Kessel e Gruss, 1990. Science 249: 374 a 379) e o promotor αfetoproteina (Campes e Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537 a 546) . Com relação a esses vetores procariontes e eucariontes, menção é feita ao documento de Patente n° U.S. 6.750.059, cujo conteúdo está incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade. Outras modalidades da invenção podem se referir ao uso de vetores virais, com relação aos quais menção é feito no Pedido de Patente n° U.S. 13/092.085, cujo conteúdo está incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade. Elementos reguladores de tecido específico são conhecidos na técnica e com relação a isso, menção é feita ao documento de Patente n° U.S. 7.776.321, cujo conteúdo está incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade.

[526] Em algumas modalidades, um elemento regulador é operacionalmente ligado a um ou mais elementos de ou que

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381/776 codificam um sistema de CRISPR Casl3b ou complexo, de modo a acionar expressão do um ou mais elementos do sistema de CRISPR. Em geral, CRISPRs (Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Espaçadas Agrupadas), também conhecidas como SPIDRs (Repetições Diretas Espaçadas por Espaçador), constituem uma família de loci de DNA que são normalmente específicos a uma espécie bacteriana particular. 0 locus de CRISPR compreende uma classe distinta de repetições de sequência curtas espaçadas (SSRs) que foram reconhecidas em E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol., 169:5.429 a 5.433 [1987]; e Nakata et al., J. Bacteriol., 171:3.553 a 3.556 [1989]), e genes associados. SSRs espaçadas similares foram identificadas em Haloferax mediterranean Streptococcus pyogenesAnabaena e Mycobacterium tuberculosis (Consultar, Groenen et al., Mol. Microbiol., 10:1.057 a 1.065 [1993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254 a 263 [1999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1.307:26 a 30 [1996]; e Mojica et al., Mol. Microbiol., 17:85 a 93 [1995]). Os loci de CRISPR se diferem, tipicamente, de outras SSRs pela estrutura das repetições, que foram denominadas repetições regularmente espaçadas curtas (SRSRs) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23 a 33 [2002]; e Mojica et ai., Mol. Microbiol., 36:244 a 246 [2000]). Em geral, as repetições são elementos curtos que ocorrem em agrupamentos que são regularmente espaçados por sequências de intervenção únicas

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382/776 com um comprimento substancialmente constante (Mojica et al., [2000], supra) . Embora as sequências de repetição sejam altamente conservadas entre as cepas, o número de repetições intercaladas e as sequências das regiões espaçadoras diferese tipicamente de cepa para cepa (van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2.393 a 2.401 [2000]). Loci de CRISPR foram identificados em mais do que 40 procariotes (consultar, por exemplo, Jansen et al. , Mol. Microbiol., 43:1.565 a 1.575 [2002]; e Mojica et al. , [2005]) incluindo, porém sem limitação, Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina_r Methanopyrus, Pyrococcus, Pícrophílus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia , Escherichia , Legionella , Metilococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema e Thermotoga.

[527] Em geral, sistema de alvejamento de RNA conforme usado no presente pedido se refere coletivamente às transcrições e outros elementos envolvidos na expressão de ou direcionamento da atividade de genes 13b associados à

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CRISPR de alvejamento de RNA (Casl3b) (também denominados no presente documento uma proteína efetora), que incluem sequências que codificam uma proteína Cas de alvejamento de RNA (efetora) e um RNA guia (ou sequência de crRNA) , com referência à Figura 1, conforme abordado no presente documento. Em geral, um sistema de alvejamento de RNA é caracterizado por elementos que promovem a formação de um complexo de alvejamento de RNA no sítio de uma sequênciaalvo. No contexto de formação de um complexo de alvejamento de RNA, sequência-alvo se refere a uma sequência de RNA à qual uma sequência guia (ou o guia do crRNA) é projetada para ter complementaridade, em que a hibridização entre uma sequência-alvo e um RNA guia promove a formação de um complexo de alvejamento de RNA. Complementaridade completa não é necessariamente exigida, desde que haja complementaridade suficiente para provocar hibridização e promover formação de um complexo de alvejamento de RNA. Em algumas modalidades, uma sequência-alvo é localizada no núcleo ou citoplasma de uma célula. Em algumas modalidades, a sequência-alvo pode estar dentro de uma organela de uma célula eucariótica. Uma sequência ou modelo que pode ser usado para recombinação no locus alvejado que compreende as sequências-alvo é denominado um modelo de edição ou RNA de edição ou sequência de edição. Em aspectos da invenção, um RNA modelo exógeno pode ser denominado um modelo de

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384/776 edição. Em um aspecto da invenção, a recombinação é recombinação homóloga. Em geral, uma sequência-guia é qualquer sequência de polinucleotideos que tem complementaridade suficiente com uma sequência de polinucleotideos alvo para hibridizar com a sequência-alvo e ligação específica para sequência direta de um complexo de alvejamento de ácido nucleico à sequência-alvo. Em algumas modalidades, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e sua sequência-alvo correspondente, quando idealmente alinhadas com o uso de um algoritmo de alinhamento adequado, é cerca de ou mais do que cerca de 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% ou mais. O alinhamento ideal pode ser determinado com o uso de qualquer algoritmo adequado para alinhar sequências, o exemplo não limitante do qual inclui o algoritmo de Smith-Waterman, o algoritmo de NeedlemanWunsch, algoritmos com base na Transformada de BurrowsWheeler (por exemplo, o Alinhador Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies); ELAND (Illumina, San Diego, CA) e SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn) e Maq (disponível em maq.sourceforge.net). Em algumas modalidades, uma sequência guia tem cerca de ou mais do que cerca de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, uma sequência guia tem

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385/776 menos do que cerca de 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 ou menos nucleotídeos de comprimento. A capacidade de uma sequência-guia de direcionar a ligação específica para sequência de um complexo de alvejamento de RNA a uma sequência-alvo pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado. Um polinucleotídeo de modelo pode ter qualquer comprimento adequado, tal como cerca de ou mais do que cerca de 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1.000 ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo modelo é complementar a uma porção de um polinucleotídeo que compreende a sequência-alvo. Quando alinhado de maneira ideal, um polinucleotídeo modelo pode se sobrepor a um ou mais nucleotídeos de uma sequência-alvo (por exemplo, cerca de ou mais do que cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos). Em algumas modalidades, quando uma sequência modelo e um polinucleotídeo que compreende uma sequênciaalvo estão alinhados de maneira ideal, o nucleotídeo mais próximo do polinucleotídeo modelo está dentro de cerca de 1,

5, 10,	15, 20, 25, 50,	75, 100,	200, 300, 400, 500, 1.000,
5.000,	10.000 ou mais	nucleotídeos da	sequência-alvo. Em
algumas	modalidades, a	proteína	efetora	de alvejamento de

RNA é parte de uma proteína de fusão que compreende um ou mais domínios de proteína heteróloga (por exemplo, cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou

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386/776 mais domínios adicionalmente à proteína efetora de alvejamento de ácido nucleico). Em algumas modalidades, a proteína/enzima efetora de CRISPR Casl3b é parte de uma proteína de fusão que compreende um ou mais domínios de proteína heteróloga (por exemplo, cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais domínios adicionalmente à enzima de CRISPR Casl3b). Exemplos de domínios de proteína que podem ser fundidos em uma proteína efetora incluem, sem limitação, tags de epítopo, sequências de gene repórter e domínios de proteína que têm uma ou mais das seguintes atividades: atividade de metilase, atividade de demetilase, atividade de ativação de transcrição, atividade de repressão de transcrição, atividade de fator de liberação de transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de divagem de RNA e atividade de ligação de ácido nucleico. Os exemplos não limitantes de etiquetas de epítopo incluem etiquetas de histidina (His), etiquetas V5, etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina da gripe (HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G e etiquetas de tioredoxina (Trx) . Os exemplos de genes repórter incluem, porém sem limitação, glutationa-S-transferase (GST), peroxidase de raiz-forte (HRP), cloroanfenicol acetiltransferase (CAT) beta-galactosidase, beta-glucuronidase, luciferase, proteína verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteína ciano fluorescente (CEP), proteína amarelo fluorescente

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387/776 (YFP), e proteínas autofluorescente gue incluem proteínas azul fluorescente (BFP). Uma proteína efetora de alvejamento de ácido nucleico pode ser fundida a uma sequência de gene que codifica uma proteína ou um fragmento de uma proteína que se liga às moléculas de DNA ou liga outras moléculas celulares, que incluem, porém, sem limitação à proteína de ligação à maltose (MBP), tag S, fusões de domínio de ligação de DNA Lex A (DBD), fusões de domínio de ligação de DNA GAL4 e vírus herpes simplex (HSV) fusões de proteína BP16. Domínios adicionais que podem fazer parte de uma proteína de fusão que compreende uma proteína efetora de alvejamento de ácido nucleico são descritos no documento n° US20110059502, incorporado no presente documento a título de referência. Em algumas modalidades, uma proteína efetora de alvejamento de ácido nucleico com tag é usada para identificar a localização de uma sequência-alvo. Em algumas modalidades, uma enzima de CRISPR Casl3b pode formar um componente de um sistema induzível. A natureza induzível do sistema permitiría controle espaçotemporal de edição genética ou expressão de gene com o uso de uma forma de energia. A forma de energia pode incluir, porém, sem limitação, radiação eletromagnética, energia sonora, energia química e energia térmica. Exemplos de sistema induzível incluem promotores induzíveis de tetraciclina (Tet-Ligado ou Tet-Desligado), dois sistemas de ativações de transcrição híbridos de

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388/776 molécula pequena (FKBP, ABA, etc), ou sistemas induzíveis pela luz (Fitocromo, LOV domínios ou criptocromo) . Em uma modalidade, a enzima de CRISPR Casl3b pode ser uma parte de um Efetor Transcricional Induzível pela Luz (LITE) para direcionar alterações em atividade transcricional de uma maneira de sequência específica. Os componentes de uma luz podem incluir uma enzima de CRISPR, um heterodímero de citocromo responsive à luz (por exemplo, a partir da Arabídopsís thalíana), e um domínio de ativação/repressão transcricional. Exemplos adicionais de proteínas de ligação de DNA induzíveis e métodos para seu uso são fornecidos nos documentos n° U.S. 61/736465 e U.S. 61/721.283 e WO 2014/018423 e US8889418, US8895308, US20140186919, US20140242700, US20140273234, US20140335620, WC2014093635, que estão incorporados aqui a título de referência em sua totalidade. Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos que compreendem distribuir um ou mais polinucleotídeos, tal como um ou mais vetores, conforme descrito no presente documento, uma ou mais transcrições dos mesmos, e/ou uma ou proteínas transcritas a partir dos mesmos, para uma célula hospedeira. Em alguns aspectos, a invenção fornece adicionalmente células produzidas através de tais métodos, e organismos (tais como animais, plantas ou fungos) que compreendem ou são produzidos a partir de tais células. Em algumas modalidades, uma proteína efetora de alvejamento de

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RNA em combinação com (e opcionalmente complexada com) um RNA guia ou crRNA é distribuída a uma célula. Métodos de transferência de gene com base viral e não viral convencionais podem ser usados para introduzir ácidos nucleicos em células de mamíferos ou tecidos-alvo. Tais métodos podem ser usados para administrar componentes de codificação de ácidos nucleicos de um sistema de alvejamento de RNA em células em cultura, ou em um organismo hospedeiro. Sistemas de distribuição de vetor não viral incluem plasmídeos de DNA, RNA (por exemplo, uma transcrição de um vetor descrito no presente documento) , ácido nucleico nu e ácido nucleico complexado com um veículo de distribuição, tal como um lipossoma. Os sistemas de distribuição de vetor viral incluem vírus de DNA e RNA, que têm genomas epissômicos ou integrados após distribuição à célula. Para uma análise de procedimentos de terapia gênica, consultar Anderson, Science 256:808 a 813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211 a 217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162 a 166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167 a 175 (1993); Miller, Nature 357:455 a 460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1.149 a 1.154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35 a 36 (1995); Kremer e Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31 a 44 (1995); Haddada et al., em Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler e Bohm (eds) 1995); e Yu et al., Gene Therapy 1:13 a 26 (1994) Os métodos de

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390/776 distribuição não viral de ácidos nucleicos incluem lipofecção, nucleofecção, microinjeção, biolística, virossomos, lipossomos, imunolipossomos, conjugados de policátion ou lipídio:ácido nucleico, DNA nu, virions artificiais e absorção intensificada por agente de DNA. Lipofecção é descrita nos documentos, por exemplo, de Patente n° U.S. 5.049.386, 4.946.787; e 4.897.355 e reagentes de lipofecção são vendidos comercialmente (por exemplo, Transfectam™ e Lipofectin™). Lipídios catiônicos e neutros que são adequados para lipofecção por reconhecimento de receptor eficiente de polinucleotídeos incluem aqueles de Feigner, WO 91/17424; WO 91/16024. Substituição pode ocorrer em células (por exemplo, administração in vitro ou ex vivo) ou tecidos-alvo (por exemplo, administração ín vivo) .

Modelos de condições [528] Um método da invenção pode ser usado para criar uma planta, um animal ou célula que possa ser usada para modelar e/ou estudar condições genéticas ou epigenéticas de interesse, tais como através de um modelo de mutações de interesse ou um modelo de doença. Conforme usado no presente documento, o termo doença se refere a uma doença, distúrbio ou indicação em um indivíduo. Por exemplo, um método da invenção pode ser usado para criar um animal ou célula que compreende uma modificação em uma ou mais sequências de ácido nucleico associadas a uma doença, ou uma

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391/776 planta, animal ou célula na qual a expressão de uma ou mais sequências de ácido nucleico associadas a uma doença são alteradas. Tal sequência de ácido nucleico pode codificar ou traduzir uma sequência de proteínas associada à doença ou pode ser uma sequência de controle associada à doença. Consequentemente, é entendido que em modalidades da invenção, uma planta, indivíduo, paciente, organismo ou célula pode ser um indivíduo, paciente, organismo ou célula não humana. Assim, a invenção fornece uma planta, animal ou célula, produzida pelos presentes métodos, ou uma progenitura dos mesmos. A progenitura pode ser um clone da planta ou animal produzido, ou pode resultar da reprodução sexual cruzando-se com outros indivíduos da mesma espécie para introgressão de traços desejáveis adicionais em sua prole. A célula pode estar in vivo ou ex vivo nos casos de organismos multicelulares, particularmente animais ou plantas. No caso em que a célula está em cultura, uma linhagem celular pode ser estabelecida, caso apropriado, condições de cultivo são correspondidas e, preferencialmente, se a célula estiver adequadamente adaptada para esse propósito (por exemplo, uma célula tronco). Linhagens celulares bacteriana produzidas pela invenção também estão previstas. Portanto, linhagens celulares também são previstas. Em alguns métodos, o modelo de doença pode ser usado para estudar os efeitos de mutações,

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392/776 ou expressão mais geral alterada, tal como reduzida, de genes ou produtos genéticos no animal ou célula e desenvolvimento e/ou progressão da doença com o uso de medições normalmente usadas no estudo da doença. Alternativamente, tal modelo de doença é útil para estudar o efeito de um composto farmaceuticamente ativo na doença. Em alguns métodos, o modelo de doença pode ser usado para avaliar a eficácia de uma potencial estratégia de terapia de gene. Isto é, um RNA associado à doença pode ser modificado de modo que o desenvolvimento e/ou progressão da doença seja exibido ou inibido ou reduzido e, então, os efeitos de um composto na progressão ou inibição ou redução são testados.

[529] Útil na prática da presente invenção que utiliza proteínas efetoras Casl3b, e complexos das mesmas, e moléculas de ácido nucleico que codificam as mesmas, e métodos que usam as mesmas, referência é feita a: GenomeScale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Shalem, 0., Sanjana, NE., Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL., Root, DE., Doench, JG., Zhang, F. Science 12 de dezembro. (2013) . [Publicação eletrônica antes da impressão]; Oublicado na forma editada final como: Science. 3 de janeira de 2014; 343(6166) : 84-87. Shalem et al. envolvem um novo modo de interrogar a função de gene em uma escala genômica. Seus estudos mostraram que a entrega de uma biblioteca de knockout de CRISPR-Cas9 de

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393/776 escala genômica (GeCKO) teve como alvo 18.080 genes com 64.751 sequências guia exclusivas e possibilitou a triagem de seleção negativa e positiva em células humanas. Primeiro, os autores mostraram o uso da biblioteca de GeCKO para identificar genes essenciais para viabilidade celular em células-tronco de câncer e pluripotentes. Depois, em um modelo de melanoma, os autores triados para genes cuja perda está envolvida na resistência a vemurafenibe, um produto terapêutico que inibe BRAF de proteína quinase mutante. Seus estudos mostraram que os candidatos de maior classificação incluíram os genes anteriormente valiados NF1 e MED12 assim como NF2, CUL3, TADA2B e TADA1 inovadores. Os autores observaram um alto nível de consistência entre RNAs guia independentes que têm como alvo o mesmo gene e uma alta taxa de confirmação de ocorrência e, assim, demonstraram a promessa de triagem de escala genômica com Cas9. Referência também é feita à Publicação de Patente n° U.S. US20140357530; e Publicação de Patente PCT W02014093701, incorporadas no presente documento a título de referência.

[530] O termo associado ao é usado aqui em relação à associação do domínio funcional à proteína efetora Casl3b ou à proteína adaptadora. É usado em relação a como uma molécula 'se associa' em relação a outra, por exemplo, entre uma proteína adaptadora e um domínio funcional, ou entre a proteína efetora Casl3b e um domínio funcional. No caso de

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394/776 tais interações de proteína e proteína, essa associação pode ser vista em termos de reconhecimento na maneira que um anticorpo reconhece um epítopo. Alternativamente, uma proteína pode estar associada a outra proteína por meio de uma fusão das duas, por exemplo, uma subunidade que é fundida na outra subunidade. Fusão ocorre, tipicamente, através da adição da sequência de aminoácidos de uma àquela da outra, por exemplo, por meio de splicing junto das sequências de nucleotídeos que codificam cada proteína ou subunidade. Alternativamente, isso pode ser essencialmente visualizado como ligação entre duas moléculas ou ligação direta, tal como uma proteína de fusão. Em todo caso, a proteína de fusão pode incluir um ligante entre as duas subunidades de interesse (isto é, entre a enzima e o domínio funcional ou entre a proteína adaptadora e o domínio funcional). Assim, em algumas modalidades, a proteína efetora Casl3b ou proteína adaptadora é associada a um domínio funcional ligando-se ao mesmo. Em outras modalidades, a proteína efetora Casl3b ou proteína adaptadora está associada a um domínio funcional pois os dois estão fundidos, opcionalmente por meio de um ligante intermediário.

Complexos de proteína efetora Casl3b podem ser usados em plantas [531] A invenção, em algumas modalidades, compreende um método para modificar uma célula ou organismo.

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A célula pode ser uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. A célula pode ser uma célula de mamífero. A célula de mamífero poder uma célula de primata não humano, bovina, porcina, de roedor ou camundongo. A célula pode ser uma célula de mamífero não eucariótica como ave, peixe ou camarão. A célula também pode ser uma célula de planta. A célula de planta pode ser de uma planta de cultura, como aipim, milho, sorgo, trigo ou arroz. A célula de planta também pode ser de uma alga, árvore ou vegetal. A modificação introduzida na célula pela presente invenção pode ser de modo que a célula e progenitura da célula sejam alteradas para produção aprimorada de produtos biológicos, como um anticorpo, amido, álcool ou outras emissão celular desejada. A modificação introduzida na célula pela presente invenção pode ser de modo que a célula e a progenitura da célula incluam uma alteração que modifica o produto biológico produzido. 0 sistema pode compreender um ou mais vetores diferentes. Em um aspecto da invenção, a proteína efetora é de códon otimizado para expressão do tipo de célula desejado, preferencialmente uma célula eucariótica, preferencialmente um célula de mamífero ou uma célula humana. Sistema (ou sistemas) de Casl3b (por exemplo, únicos ou multiplexados) pode ser usado em conjunto com recentes avanços em genômica de cultura. Tal sistema (ou sistemas) de CRISPR pode ser usado para realizar interrogatório ou edição ou manipulação

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396/776 de gene ou genoma vegetal ou transcritoma eficiente e econômico — por exemplo, para rápida investigação e/ou seleção e/ou interrogatórios e/ou comparação e/ou manipulações e/ou transformação de genes ou genomas vegetais; por exemplo, para criar, identificar, desenvolver, otimizar ou conferir traço (ou traços) ou característica (ou características) à planta (ou plantas) ou para transformar um genoma vegetal. Consequentemente pode haver produção melhorada de plantas, novas plantas com novas combinações de traços ou características ou novas plantas com traços aprimorados. Tal sistema (ou sistemas) de CRISPR pode ser usado com relação às plantas em Integração de Sítio Direcionado (SDI) ou Edição Genética (GE) ou quaisquer técnicas de Melhoramento Quase Reverso (NRB) ou Melhoramento Reverso (RB). Consequentemente, referência no presente documento às células animais também podem se aplicar, mutatis mutandis, em células vegetais a menos gue esteja aparente de outra forma; e, em que as enzimas no presente documento têm efeitos fora do alvo reduzidos e sistemas que empregam tais enzimas podem ser usados em aplicações vegetais, que incluem aquelas mencionadas no presente documento. Plantas modificadas pela proteína efetora (Casl3b) e guia adequado (crRNA) e progenitura da mesma, conforme fornecidas. Essas podem incluir culturas resistentes à doença ou seca, tais como trigo, cevada, arroz, soja ou milho; plantas modificadas

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397/776 para remover ou reduzir a habilidade em auto polinizar (porém, que podem, em vez disso, opcionalmente, hibridizar); e alimentos alérgicos, tais como amendoins e nozes em que as proteínas imunogênicas foram incapacitadas, destruídas ou interrompidas alvejando-se por meio de uma proteína efetora e guia adequado. Qualquer aspecto do uso de sistemas de CRIPSR-Cas clássicos pode ser adaptado para usar em sistemas de CRISPR que são agnósticos à proteína Cas, por exemplo, sistemas de proteína efetora Casl3b.

Tratamento Terapêutico [532] 0 sistema da invenção pode ser aplicado em áreas de tecnologias de corte de RNA anteriores, sem experimentação indevida, a partir dessa revelação, que incluem terapêutica, ensaio e outras aplicações, pois a presente aplicação fornece a fundação para modificação informada do sistema. A presente invenção fornece tratamento terapêutico de uma doença provocada pela superexpressão de RNA, RNA tóxico e/ou RNA mutado (tal como, por exemplo, defeitos ou truncamentos de splicing). A expressão do RNA tóxico pode estar associada à formação de inclusões nucleares e alterações degenerativas de início tardio no cérebro, coração ou músculo esquelético. No exemplo melhor estudado, distrofia miotônica, parece que o principal efeito patogênico do RNA tóxico é sequestrar as proteínas de ligação e comprometer a regulação de splicing alternativo (Hum. Mol.

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Genet. (2006) 15 (suppl 2) : R162 a R169) . Distrofia miotônica [distrofia miotônica (DM)] é de interesse particular aos geneticistas pois produz uma faixa extremamente ampla de características clínicas. Uma listagem parcial incluiría desgaste muscular, catarata, resistência à insulina, atrofia testicular, desaceleração da condução cardíaca, tumores cutâneos e efeitos em cognição. A forma clássica de DM, que é chamada agora DM tipo 1 (DM1), é causada por uma expansão de repetições de CTG na região 3' não traduzida (UTR) de DMPK, um gene que codifica uma proteína quinase citosólica.

[533] O sistema imunológico inato detecta infecção viral principalmente reconhecendo-se os ácidos nucleicos virais dentro de uma célula infectada, denominada detecção de DNA ou RNA. Ensaios de detecção de RNA in vitro podem ser usados para detectar substratos de RNA específicos. A proteína efetora de alvejamento de RNA pode, por exemplo, ser usada para detecção com base em RNA em células vivas. Exemplos de aplicações são diagnósticos detectando-se, por exemplo, RNAs de doença específica. A proteína efetora (Casl3b) de alvejamento de RNA da invenção pode ser adicionalmente usada para atividade antiviral, em particular contra vírus de RNA. A proteína efetora (Casl3b) pode ser alvejada no RNA viral com o uso de um RNA guia adequado seletivo para uma sequência de RNA viral selecionada. Em particular, a proteína efetora pode ser uma nuclease ativa

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399/776 que cliva RNA, tal como RNA de fita única. Dosagens terapêuticas do sistema de enzima da presente invenção para RNA-alvo, em que os RNAs referenciados acima são contemplados de modo a serem cerca de 0,1 a cerca de 2 mg/kg, as dosagens podem ser administradas sequencialmente com uma resposta monitorada, e as dosagens repetidas, caso necessário, até cerca de 7 a 10 doses por paciente. Vantajosamente, amostras são coletadas a partir de cada paciente durante o regime de tratamento para determinar a eficácia de tratamento. Por exemplo, amostras de RNA podem ser isoladas e quantificadas para determinar se a expressão é reduzida ou amenizada. Tal diagnóstico está dentro da competência de uma pessoa versada na técnica.

Triagem de knockdown amplo de transcritoma [534] Os complexos de proteína efetora CRISPR descritos no presente documento podem ser usados para realizar triagens de transcritoma funcionais eficientes e econômicas. Tais triagens podem utilizar bibliotecas amplas de transcritoma com base em proteína efetora CRISPR. Tais triagens e bibliotecas podem fornecer a determinação da função dos genes, os genes de vias celulares que estão envolvidos e como qualquer alteração em expressão de gene pode resultar em um processo biológico particular. Uma vantagem da presente invenção é que o sistema de CRISPR evita ligação fora do alvo e seus efeitos colaterais resultantes.

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Isso é alcançado com o uso de sistemas disposto para ter um alto grau de especificidade de sequência para o RNA-alvo. Em modalidades preferenciais da invenção, os complexos de proteína efetora CRISPR são complexos de proteína efetora CaslSb.

[535] Em modalidades da invenção, uma biblioteca ampla de transcritoma pode compreender uma pluralidade de RNAs-guia Casl3b, conforme descrito no presente documento, que compreendem sequências guia que têm capacidade para alvejar uma pluralidade de sequências alvo em uma pluralidade de loci em uma população de células eucariontes. A população de células pode ser uma população de células tronco embrionárias (ES) . A sequência-alvo no locus pode ser uma sequência não codificadora. A sequência não codificadora pode ser um intron, sequência reguladora, sitio de splice, UTR 3', UTR 5' ou sinal de poliadenilação. A função genética de um ou mais produtos genéticos pode ser alterada pelo dito alvejamento. O alvejamento pode resultar em um knockout de função genética. O alvejamento de um produto genético pode compreender mais de um RNA guia. Um produto genético pode ser alvejado por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 RNAs guia, preferencialmente de 3 a 4 por gene. Modificações fora do alvo podem ser minimizadas explorando-se as quebras de fita dupla escalonadas geradas por complexos de proteína efetora Casl3b ou utilizando-se métodos análogos àqueles usados em

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401/776 sistemas de CRISPR-Cas9 (Consultar, por exemplo, DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X., Shalem, 0., Cradick, TJ., Marraffini, LA., Bao, G., & Zhang, F. Nat Biotechnol doi:10,1038/nbt.2647 (2013)), incorporado no presente documento a titulo de referência. 0 alvejamento pode ser de cerca de 100 ou mais sequências. 0 alvejamento pode ser de cerca de 1.000 ou mais sequências. 0 alvejamento pode ser de cerca de 20.000 ou mais sequências. 0 alvejamento pode ser do genoma inteiro. 0 alvejamento pode ser de um painel de sequências-alvo focado em uma via relevante ou desejada. A via pode ser uma via imunológica. A via pode ser uma via de divisão celular.

[536] Um aspecto da invenção compreende uma biblioteca ampla de transcritoma que pode compreender uma pluralidade de RNAs guia de casl3b que podem compreender sequências guia que têm capacidade para alvejar uma pluralidade de sequências-alvo em uma pluralidade de loci, em que o dito alvejamento resulta em um knockdown de função genética. Essa biblioteca pode compreender potencialmente RNAs-guia que alvejam todo e qualquer gene no genoma de um organismo.

[537] Em algumas modalidades da invenção o organismo ou indivíduo é um eucarionte (que inclui mamífero

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402/776 que inclui ser humano) ou um eucarionte não humano ou um animal não humano ou um mamífero não humano. Em algumas modalidades, o organismo ou indivíduo é um animal não humano, e pode ser um artropode, por exemplo, um inseto, ou pode ser um nemátodo. Em alguns métodos da invenção o organismo ou indivíduo é uma planta. Em alguns métodos da invenção o organismo ou indivíduo é um mamífero ou um mamífero não humano. Um mamífero não humano pode ser, por exemplo, um roedor (preferencialmente um camundongo ou um rato) , um ungulado, ou um primata. Em alguns métodos da invenção o organismo ou indivíduo é alga, que inclui microalga, ou é um fungo.

[538] O knockdown de função genética pode compreender: introduzir em cada célula na população de células um sistema vetorial de um ou mais vetores que compreende um sistema de proteína efetora Casl3b de ocorrência não natural modificado que compreende I. uma proteína efetora Casl3b, e II. um ou mais RNAs guia, em que os componentes I e II podem ser iguais ou em diferentes vetores do sistema, integrar os componentes I e II em cada célula, em que a sequência guia alveja um gene único em cada célula, em que a proteína efetora Casl3b está operacionalmente ligada a um elemento regulador, em que quando transcrito, o RNA guia que compreende a sequência guia direciona a ligação de sequência específica do sistema

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403/776 de proteína efetora Casl3b para uma sequência-alvo nos loci genômicoss do gene único, induzir divagem dos loci genômicoss através da proteína efetora Casl3b e confirmar diferentes eventos de knockdown em uma pluralidade de genes únicos em cada célula da população de células, desse modo, se gera uma biblioteca de células de knockdown de gene. A invenção compreende que a população de células é uma população de células eucariontes, e em uma modalidade preferencial, a população de células é uma população de células tronco embrionárias (ES).

[539] O um ou mais vetores podem ser vetores de plasmídeo. O vetor pode ser um único vetor que compreende uma proteína efetora Casl3b, um sgRNA e, opcionalmente, um marcador de seleção em células-alvo. Sem estar vinculado a uma teoria, a habilidade em distribuir simultaneamente uma proteína efetora Casl3b e sgRNA através de um único vetor permite a aplicação em qualquer tipo de célula de interesse, sem a necessidade de gerar primeiro linhagens celulares que expressam a proteína efetora Casl3b. O elemento regulador pode ser um promotor induzível. O promotor induzível pode ser um promotor induzível de doxiciclina. Em alguns métodos da invenção, a expressão da sequência guia é sob o controle do promotor T7 e é acionada pela expressão de T7 polimerase. A confirmação de diferentes eventos de knockdown pode ocorrer através de sequenciação de transcritoma completa. O evento

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404/776 de knockdown pode ser alcançado em 100 ou mais genes únicos. O evento de knockdown pode ser alcançado em 1.000 ou mais genes únicos. O evento de knockdown pode ser alcançado em 20.000 ou mais genes únicos. O evento de knockdown pode ser alcançado no transcritoma inteiro. O knockdown de função genética pode ser alcançado em uma pluralidade de genes únicos que funcionam em uma via ou condição fisiológica particular. A via ou condição pode ser uma via ou condição imunológica. A via ou condição pode ser uma via ou condição de divisão celular.

[540] A invenção também fornece kits que compreendem as bibliotecas amplas de transcritoma mencionadas no presente documento. O kit pode compreender um único recipiente que compreende vetores ou plasmídeos que compreendem a biblioteca da invenção. O kit também pode compreender um painel que compreende uma seleção de RNAs guia de sistema de proteína efetora Casl3b únicos que compreende sequências guia da biblioteca da invenção, em que a seleção é indicativa de uma condição fisiológica particular. A invenção compreende que o alvejamento seja de cerca de 100 ou mais sequências, cerca de 1.000 ou mais sequências ou cerca de 20.000 ou mais sequências ou o transcritoma inteiro. Ademais, um painel de sequências-alvo pode ser focado em uma via relevante ou desejada, tal como uma via imunológica ou divisão celular.

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405/776 [541] Em um aspecto adicional da invenção, a proteína efetora Casl3b pode compreender uma ou mais mutações e pode ser usada como uma proteína de ligação ao RNA genérica com ou sem fusão com um domínio funcional. As mutações podem ser mutações artificialmente introduzidas ou mutações de ganho ou perda de função. As mutações foram caracterizadas conforme descrito no presente documento. Em um aspecto da invenção, o domínio funcional pode ser um domínio de ativação transcricional, que pode ser VP64. Em outros aspectos da invenção, o domínio funcional pode ser um domínio repressor transcricional, que pode ser KRAB ou SID4X. Outros aspectos da invenção se referem à proteína efetora Casl3b mutada que é fundida em domínios que incluem, porém, sem limitação, um ativador transcricional, repressor, uma recombinase, uma transposase, um remodelador de histona, uma demetilase, uma DNA metiltransferase, um criptocromo, um domínio induzível/controlável pela luz ou um domínio quimicamente induzível/controlável. Alguns métodos da invenção podem incluir a indução de expressão de genes alvejados. Em uma modalidade, induzir a expressão alvejando-se uma pluralidade de sequências-alvo em uma pluralidade de loci genômicoss em uma população de células eucariontes ocorre através do uso de um domínio funcional.

[542] Úteis na prática da presente invenção que utiliza complexos de proteína efetora Casl3b são os métodos

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406/776 usados em sistemas de CRISPR-Cas9 e referência é feita a:

[543] Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Shalem, 0., Sanjana, NE. , Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL., Root, DE., Doench, JG., Zhang, F. Science Dec 12. (2013). [Publicação eletrônica antes da impressa]; Publicado na forma editada final como: Science. 3 de janeiro de 2014; 343(6166) : 84 a 87 .

[544] Shalem et al. envolve uma nova maneira de interrogar a função genética em uma escala genômica. Seus estudos mostraram que a distribuição de uma biblioteca de knockout de escala genômica de CRISPR-Cas9 (GeCKO) alvejou 18.080 genes com 64.751 sequências guia únicas permitiu triagem de seleção tanto negativa quanto positiva em células humanas. Primeiro, os autores mostraram o uso da biblioteca de GeCKO para identificar os genes essenciais para a viabilidade celular em câncer e células tronco pluripotentes. A seguir, em um modelo de melanoma, os autores examinaram genes cuja perda está envolvida na resistência ao vemurafenibe, um terapêutico que inibe a quinase de proteína mutante BRAF. Seus estudos mostraram que os candidatos mais bem classificados incluíram genes anteriormente validados NF1 e MED12 assim como os inovadores hitsNF2, CUL3, TADA2B e TADA1. Os autores observaram um alto nível de consistência entre RNAs guia independentes que alvejam o mesmo gene e uma

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407/776 alta taxa de confirmação de acerto e, assim, demonstraram a promessa de triagem de escala genômica com Cas9.

[545] Referência também é feita à Publicação de Patente n° U.S. US20140357530; e Publicação de Patente PCT W02014093701, incorporadas no presente documento a título de referência.

Alteração funcional e triagem [546] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de avaliação e triagem funcional de genes. O uso do sistema de CRISPR da presente invenção para distribuir precisamente domínios funcionais, para ativar ou reprimir genes ou alterar o estado epigenético alterando-se precisamente o sítio metilação em um locus específico de interesse, pode ser com um ou mais RNAs guia aplicados em uma única célula ou uma população de células ou com uma biblioteca aplicada em genoma em um pool de células ex vivo ou ín vivo que compreendem a administração ou expressão de uma biblioteca que compreende uma pluralidade de RNAs guia (sgRNAs) e em que a triagem compreende adicionalmente o uso de uma proteína efetora Casl3b, em que o complexo de CRISPR que compreende a proteína efetora Casl3b é modificado para compreender um domínio funcional heterólogo. Em um aspecto a invenção fornece um método para triagem de um genoma/transcritoma que compreende a administração em um hospedeiro ou expressão em um hospedeiro in vivo de uma

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408/776 biblioteca. Em um aspecto a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, que compreende adicionalmente um ativador administrado ao hospedeiro ou expresso no hospedeiro. Em um aspecto a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, em que o ativador é fixado a uma proteína efetora Casl3b. Em um aspecto a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, em que o ativador é fixado à terminação N ou à terminação C da proteína efetora Casl3b. Em um aspecto a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, em que o ativador é fixado a uma alça de sgRNA. Em um aspecto a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, que compreende adicionalmente um repressor administrado ao hospedeiro ou expresso no hospedeiro. Em um aspecto a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, em que a triagem compreende afetar e detectar a ativação de gene, inibição de gene ou divagem no locus.

[547] Em um aspecto, a invenção fornece atividade no alvo eficiente e minimiza a atividade fora do alvo. Em um aspecto, a invenção fornece divagem no alvo eficiente através da proteína efetora Casl3b e minimiza divagem fora do alvo através da proteína efetora Casl3b. Em um aspecto, a invenção fornece ligação de guia específico da proteína efetora Casl3b em um locus de gene sem divagem de DNA.

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Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece regulação de gene de alvo específico. Em um aspecto, a invenção fornece ligação de guia específico da proteína efetora Casl3b em um locus de gene sem divagem de DNA. Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece divagem em um locus e regulação de gene em um locus diferente com o uso de uma única proteína efetora Casl3b. Em um aspecto, a invenção fornece ativação e/ou inibição e/ou divagem ortogonal de múltiplos alvos com o uso de uma ou mais proteínas e/ou enzimas efetoras Casl3b.

[548] Em um aspecto, a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, em que o hospedeiro é uma célula eucariótica. Em um aspecto a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, em que o hospedeiro é uma célula de mamífero. Em um aspecto a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, em que o hospedeiro é um eucarionte não humano. Em um aspecto a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, em que o eucarionte não humano é um mamífero não humano. Em um aspecto a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, em que o mamífero não humano é um camundongo. Em um aspecto a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, que compreende a distribuição dos complexos de proteína efetora Casl3b ou componente (ou componentes) da mesma ou

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410/776 molécula (ou moléculas) de ácido nucleico que codifica a mesma, em que a dita molécula (ou moléculas) de ácido nucleico está operacionalmente ligada à sequência (ou sequências) reguladora e é expressa ín vivo. Em um aspecto a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, em que a expressão ín vivo é por meio de um lentivírus, um adenovirus ou um AAV. Em um aspecto a invenção fornece a método, conforme abordado no presente documento em que a distribuição é por meio de uma partícula, uma nanopartícuia, um lipídeo ou um peptídeo de penetração em célula (CPP).

[549] Em um aspecto, a invenção fornece um par de complexos de CRISPR que compreende a proteína efetora CaslSb, em que cada um compreende um RNA guia (sgRNA) que compreende uma sequência guia que tem capacidade para hibridizar para uma sequência-alvo em um locus genômico de interesse em uma célula, em que pelo menos uma alça de cada sgRNA é modificada pela inserção de sequência (ou sequências) de RNA distinto que se ligam a uma ou mais proteínas adaptadoras, e em que a proteína adaptadora é associada a um ou mais domínios funcionais, em que cada sgRNA de cada complexo de proteína efetora CaslSb compreende um domínio funcional que tem uma atividade de divagem de DNA.

[550] Em um aspecto a invenção fornece um método para cortar uma sequência-alvo em um locus de interesse que

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411/776 compreende distribuição para uma célula dos complexos de proteína efetora Casl3b ou componente (ou componentes) da mesma ou molécula (ou moléculas) de ácido nucleico que codifica a mesma, em que a dita molécula (ou moléculas) de ácido nucleico está operacionalmente ligada à sequência (ou sequências) reguladora e é expressa ín vivo. Em um aspecto a invenção fornece um método, conforme abordado no presente documento, em que a distribuição é por meio de um lentivírus, um adenovirus ou um AAV.

[551] Em um aspecto a invenção fornece uma biblioteca, método ou complexo, conforme abordado no presente documento, em que o sgRNA é modificado para ter pelo menos uma alça funcional não codificadora, por exemplo, em que a pelo menos uma alça funcional não codificadora é repressiva; por exemplo, em que a pelo menos uma alça funcional não codificadora compreende Alu.

[552] Em um aspecto, a invenção fornece um método para alterar ou modificar expressão de um produto genético. 0 dito método pode compreender introduzir em uma célula que contém e expressa uma molécula de DNA que codifica o produto genético um sistema de CRISPR de ocorrência não natural modificado que compreende uma proteína efetora Casl3b e RNA guia que alveja a molécula de RNA, desse modo o RNA guia alveja a molécula de RNA alvo que codifica o produto genético e a proteína efetora Casl3b diva a molécula de RNA que

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412/776 codifica o produto genético, em que a expressão do produto genético é alterada; e, em que a proteína efetora Casl3b e o RNA guia não ocorrem naturalmente juntos. A invenção compreende o RNA guia que compreende uma sequência guia ligada a uma sequência de repetição direta. A invenção compreende adicionalmente a proteína efetora Casl3b que é de códon otimizado para a expressão em uma célula eucariótica. Em uma modalidade preferencial, a célula eucariótica é uma célula de mamífero e em uma modalidade mais preferencial a célula de mamífero é uma célula humana. Em uma modalidade adicional da invenção, a expressão do produto genético é diminuída.

[553] Em algumas modalidades, um ou mais domínios funcionais estão associados à proteína efetora Casl3b. Em algumas modalidades, um ou mais domínios funcionais estão associados a uma proteína adaptadora, por exemplo, conforme usado com os guias modificados de Konnerman et al. (Nature 517, 583 a 588, 29 de janeiro de 2015). Em algumas modalidades, um ou mais domínios funcionais estão associados ao sgRNA morto (dRNA). Em algumas modalidades, um complexo de dRNA com proteína efetora Casl3b ativa direciona a regulação de gene através de um domínio funcional em um locus de gene enquanto um sgRNA direciona divagem de DNA através da proteína efetora Casl3b ativa em outro locus, por exemplo, conforme descrito analogamente em sistemas de CRISPR-Cas9

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413/776 por Dahlman et al., Orthogonal gene control with a catalytically active Cas9 nuclease', Nature Biotechnology 33, páginas 1.159 a 61 (novembro de 2015). Em algumas modalidades, dRNAs são selecionados para maximizar a seletividade de regulação para um locus de gene de interesse em comparação com a regulação fora do alvo. Em algumas modalidades, dRNAs são selecionados para maximizar regulação de gene-alvo e minimizar clivagem-alvo.

[554] Com o propósito da seguinte discussão, referência a um domínio funcional podería ser um domínio funcional associado à proteína efetora Casl3b ou um domínio funcional associado à proteína adaptadora.

[555] Em algumas modalidades, o um ou mais domínios funcionais é uma NLS (Sequência de Localização Nuclear) ou um NES (Sinal de Exportação Nuclear). Em algumas modalidades, os um ou mais domínios funcionais são um domínio de ativação transcricional que compreende VP64, p65, MyoDl, HSF1, RTA, SET7/9 e uma histona acetiltransferase. Outras referências no presente documento aos domínios de ativação (ou ativadores) em relação àqueles associados à enzima de CRISPR incluem qualquer domínio de ativação transcricional conhecido e especificamente VP64, p65, MyoDl, HSF1, RTA, SET7/9 ou uma histona acetiltransferase.

[556] Em algumas modalidades, o um ou mais domínios funcionais são um domínio repressor transcricional. Em

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414/776 algumas modalidades, o domínio repressor transcricional é um domínio KRAB. Em algumas modalidades, o domínio repressor transcricional é um domínio NuE, domínio NcoR, domínio SID ou um domínio SID4X.

[557] Em algumas modalidades, o um ou mais domínios funcionais têm uma ou mais atividades que compreendem a atividade de ativação de tradução, atividade de repressão de tradução, atividade de metilase, atividade de demetilase, atividade de ativação de transcrição, atividade de repressão de transcrição, atividade de fator de liberação de transcrição, atividade de modificação de histona, atividade

de	divagem de	RNA, atividade de divagem	de	DNA,	atividade
de	integração	de DNA ou atividade de	ligação	de ácido
nucleico.
	[558]	Em algumas modalidades,	a	atividade de

divagem de DNA ocorre devido a uma nuclease. Em algumas modalidades, a nuclease compreende uma Fokl nuclease. Consultar Dimeric CRISPR RNA-guided Fokl nucleases for highly specific genome editing, Shengdar Q. Tsai, Nicolas Wyvekens, Cyd Khayter, Jennifer A. Foden, Vishal Thapar, Deepak Reyon, Mathew J. Goodwin, Martin J. Aryee, J. Keith Joung Nature Biotechnology 32(6): 569 a 77 (2014), se refere às Fokl Nucleases guiadas por RNA diméricas que reconhecem sequências estendidas e podem editar genes endógenos com altas eficiências em células humanas.

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415/776 [559] Em algumas modalidades, o um ou mais domínios funcionais são fixados à proteína efetora Casl3b de modo que, mediante ligação ao sgRNA e alvo, o domínio funcional está em uma orientação espacial que permite que o domínio funcional funcione em sua função atribuída.

[560] Em algumas modalidades, o um ou mais domínios funcionais são fixados à proteína adaptadora de modo que, mediante ligação da proteína efetora Casl3b ao sgRNA e alvo, o domínio funcional esteja em uma orientação espacial que permite que o domínio funcional funcione em sua função atribuída.

[561] Em um aspecto a invenção fornece uma composição, conforme abordada no presente documento, em que o um ou mais domínios funcionais são fixados à proteína efetora Casl3b ou proteína adaptadora por meio de um ligante, opcionalmente um ligante GlySer, conforme abordado no presente documento.

[562] Também é preferencial alvejar elementos de controle endógenos (reguladores), tais como envolvidos na tradução, estabilidade, etc. Alvejamento de elementos de controle conhecidos pode ser usado para ativar ou reprimir o gene de interesse. Alvejamento de elementos de controle putativos, por outro lado, pode ser usado como um meio para verificar tais elementos (medindo-se a tradução do gene de interesse) ou para detectar elementos de controle

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416/776 inovadores. Adicionalmente, alvejamento de elementos de controle putativos pode ser útil no contexto de entender as causas genéticas da doença. Diversas mutações e variantes de SNP comuns associadas aos fenótipos da doença estão localizadas fora das regiões de codificação. Alvejamento de tais regiões com os sistemas de ativação ou repressão descritos no presente documento pode ser seguido por leitura de transcrição de a) um conjunto de alvos putativos (por exemplo, um conjunto de genes localizados nas maiores proximidades ao elemento de controle) ou b) leitura de transcritoma completo, por exemplo, por RNAseq ou micromatriz. Isso permitiría a identificação de genes candidatos prováveis envolvidos no fenótipo da doença. Tais genes candidatos poderíam ser úteis como alvos de fármaco inovadores.

[563] Inibidores de histona acetiltransferase (HAT) são mencionados no presente documento. No entanto, uma alternativa em algumas modalidades é para o um ou mais domínios funcionais compreenderem uma acetiltransferase, preferencialmente uma histona acetiltransferase. Essas são úteis no campo de epigenômica, por exemplo, nos métodos de interrogatório do epigenoma. Métodos de interrogação do epigenoma podem incluir, por exemplo, alvejar sequências epigenômicas. Alvejamento de sequências epigenômicas pode incluir o guia que é direcionado a uma sequência epigenômica

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417/776 alvo. A sequência epigenômica-alvo pode incluir, em algumas modalidades, um promotor, silenciador ou uma sequência aprimoradora.

[564] Uso de um domínio funcional ligado a uma proteína efetora Casl3b, conforme descrito no presente documento, preferencialmente uma proteína efetora Casl3b morta, mais preferencialmente uma proteína efetora FnCasl3b morta, em alvejamento de sequências epigenômicas pode ser usado para ativar ou reprimir promotores, silenciador ou aprimoradores.

[565] Exemplos de acetiltransferases são conhecidos, porém, podem incluir, em algumas modalidades, histona acetiltransferases. Em algumas modalidades, a histona acetiltransferase pode compreender o núcleo catalítico da acetiltransferase humana p300 (Gerbasch & Reddy, Nature Biotech, 6 de abril de 2015) .

[566] Em algumas modalidades preferenciais, ο domínio funcional é ligado a uma proteína efetora Casl3b morta para alvejar e ativar sequências epigenômicas, tais como promotores ou aprimoradores. Um ou mais guias direcionados a tais promotores ou aprimoradores também podem ser fornecidos para direcionar a ligação da enzima de CRISPR para tais promotores ou aprimoradores.

[567] Em determinadas modalidades, a proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção pode ser usada

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418/776 para interferir nas modificações cotranscricionais da estrutura de DNA/cromatina, metilação de DNA direcionada por RNA ou silenciamento/ativação de DNA/cromatina direcionada por RNA. Metilação de DNA direcionada por RNA (RdDM) é um processo epigenético constatado primeiro nas plantas. Durante RdDM, RNAs de fita dupla (dsRNAs) são processados em RNAs de interferência pequenos de 21 a 24 nucleotídeos (siRNAs) e metilação de guia de loci de DNA homólogo. Além das moléculas de RNA, uma infinidade de proteínas estão envolvidas no estabelecimento de RdDM, como Argonautas, DNA metiltransferases, complexos de remodelação de cromatina e as PolIV e PolV de planta específica. Todas essas atuam em conjunto para adicionar um grupo metila na posição 5' das citosinas. Pequenos RNAs podem modificar a estrutura de cromatina e silenciar a transcrição guiando-se complexos que contêm Argonauta para transcrições de RNA nascente (não codificante) complementares. Subsequentemente o recrutamento de complexos de modificação de cromatina, que incluem histona e DNA metiltransferases, é mediado. A proteína efetora de alvejamento de RNA da invenção pode ser usada para alvejar tais pequenos RNAs e interferir nas interações entre esses pequenos RNAs e as transcrições não codificantes nascentes.

[568] 0 termo associado ao é usado aqui em relação à associação do domínio funcional à proteína efetora Casl3b ou à proteína adaptadora. É usado em relação a como uma

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419/776 molécula 'se associa' em relação a outra, por exemplo, entre uma proteína adaptadora e um domínio funcional, ou entre a proteína efetora Casl3b e um domínio funcional. No caso de tais interações de proteína e proteína, essa associação pode ser vista em termos de reconhecimento na maneira que um anticorpo reconhece um epítopo. Alternativamente, uma proteína pode estar associada a outra proteína por meio de uma fusão das duas, por exemplo, uma subunidade que é fundida na outra subunidade. Fusão ocorre, tipicamente, através da adição da sequência de aminoácidos de uma àquela da outra, por exemplo, por meio de splicing junto das sequências de nucleotídeos que codificam cada proteína ou subunidade. Alternativamente, isso pode ser essencialmente visualizado como ligação entre duas moléculas ou ligação direta, tal como uma proteína de fusão. Em todo caso, a proteína de fusão pode incluir um ligante entre as duas subunidades de interesse (isto é, entre a enzima e o domínio funcional ou entre a proteína adaptadora e o domínio funcional). Assim, em algumas modalidades, a proteína efetora Casl3b ou proteína adaptadora é associada a um domínio funcional ligando-se ao mesmo. Em outras modalidades, a proteína efetora Casl3b ou proteína adaptadora está associada a um domínio funcional pois os dois estão fundidos, opcionalmente por meio de um ligante intermediário.

Mutagênese de Saturação

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420/776 [569] O sistema de proteína efetora Casl3b (ou sistemas de proteína efetora Casl3b) descrito no presente documento pode ser usado para realizar mutagênese de saturação ou de varredura intensa de loci genômicoss em combinação com um fenótipo celular, por exemplo, para determinar recursos mínimos cruciais e vulnerabilidades distintas de elementos funcionais necessários para resistência de gene, resistência ao fármaco e reversão da doença. Por mutagênese de saturação ou de varredura profunda entende-se que qualquer ou essencialmente qualquer base de RNA é cortada dentro dos loci genômicoss. Uma biblioteca de RNAs de proteína efetora Casl3b pode ser introduzida em uma população de células. A biblioteca pode ser introduzida, de modo que cada célula receba um único RNA guia (sgRNA) . No case em que a biblioteca é introduzida por transdução de um vetor viral, conforme descrito no presente documento, uma baixa multiplicidade de infecção (MOI) é usada. A biblioteca pode incluir sgRNAs que alvejam toda sequência a montante de uma sequência (motivo adjacente protoespaçador) (PAM) em um locus genômico. A biblioteca pode incluir pelo menos 100 sequências genômicas não sobrepostas a montante de uma sequência de PAM para todos os 1.000 pares de base dentro do locus genômico. A biblioteca pode incluir sgRNAs que alvejam sequências a montante de pelo menos uma sequência de PAM diferente. Os sistemas de proteína efetora Casl3b podem

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421/776 incluir mais de uma proteína Casl3b. Qualquer proteína efetora Casl3b, conforme descrita no presente documento, que inclui ortólogos ou proteínas efetoras Casl3b modificadas que reconhecem sequências de PAM diferentes pode ser usada. A frequência de sítios fora do alvo para um sgRNA pode ser menor que 500. Pontuações fora do alvo podem ser geradas para selecionar sgRNAs com os menores sítios fora do alvo. Qualquer fenótipo determinado a estar associado ao corte em um sítio-alvo de sgRNA pode ser confirmado com o uso de sgRNAs que alvejam o mesmo sítio em um único experimento. Validação de um sítio-alvo também pode ser realizada com o uso de uma proteína efetora Casl3b modificada, conforme descrito no presente documento, e dois sgRNAs que alvejam o sítio genômico de interesse. Sem vinculação a uma teoria, um sítio-alvo é um verdadeiro golpe se a alteração no fenótipo for observada em experimentos de validação.

[570] O sistema (ou sistemas) de proteína efetora Casl3b para saturar ou varrer profundamente mutagênese pode ser usado em uma população de células. O sistema (ou sistemas) de proteína efetora Casl3b pode ser usado em células eucariontes, que incluem, porém, sem limitação, células de mamíferos e vegetais. A população de células pode ser de células procariontes. A população de células eucariontes pode ser uma população de células tronco embrionárias (ES), células neuronals, células epiteliais,

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422/776 células imunológicas, células endócrinas, células musculares, eritrócitos, linfócitos, células vegetais ou células de levedura.

[571] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de triagem para elementos funcionais associados a uma alteração em um fenótipo. A biblioteca pode ser introduzida em uma população de células que são adaptadas para conter uma proteína efetora Casl3b. As células podem ser classificadas em pelo menos dois grupos com base no fenótipo. 0 fenótipo pode ser a expressão de um gene, crescimento de célula ou viabilidade de célula. A representação relativa dos RNAs guia presentes em cada grupo é determinada, em que os sítios genômicos associados à alteração no fenótipo são determinados pela representação de RNAs guia presentes em cada grupo. A alteração no fenótipo pode ser uma alteração na expressão de um gene de interesse. 0 gene de interesse pode ser de regulação ascendente, descendente ou submetido a knockout. As células podem ser classificadas em um grupo de alta expressão e um grupo de baixa expressão. A população de células pode incluir um construto de repórter que é usado para determinar o fenótipo. 0 construto de repórter pode incluir um marcador detectável. Células podem ser classificadas pelo uso do marcador detectável.

[572] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de triagem para loci associados à resistência a um

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423/776 composto químico. 0 composto químico pode ser um fármaco ou pesticida. A biblioteca pode ser introduzida em uma população de células que são adaptadas para conter uma proteína efetora Casl3b, em que cada célula da população contém não mais que um RNA guia; a população de células são tratadas com o composto químico; e a representação de RNAs guia é determinada após o tratamento com o composto químico em um ponto no tempo posterior em comparação com um ponto no tempo anterior, em que sítios genômicos associados à resistência ao composto químico são determinados por enriquecimento de RNAs guia. Representação de sgRNAs pode ser determinada por métodos de sequenciação profunda.

[573] Úteis na prática da presente invenção que utiliza complexos de proteína efetora Casl3b são os métodos usados em sistemas de CRISPR-Cas9 e referência é feita ao artigo intitulado BCL11A enhancer dissection by Cas9mediated in situ saturating mutagenesis. Canver, M.C., Smith,E.C., Sher, F., Pinello, L., Sanjana, N.E., Shalem, 0., Chen, D.D., Schupp, P.G., Vinjamur, D.S., Garcia, S.P., Luc, S., Kurita, R., Nakamura, Y., Fujiwara, Y., Maeda, T., Yuan, G., Zhang, F., Orkin, S.H., & Bauer, D.E. DOI:10.1038/naturel5521, publicado online em 16 de setembro de 2015, o artigo é incorporado ao presente documento a título de referência e é brevemente discutido abaixo:

[574] Canver et ai. envolve bibliotecas de RNA guia

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424/776 de CRISPR-Cas9 agrupadas inovadoras para realizar mutagênese de saturação in situ dos aprimoradores de eritroide BCL11A de ser humano e camundongo anteriormente identificados como um aprimorador associado ao nível de hemoglobina fetal (HbF) e cujo ortólogo de camundongo é necessário para expressão de eritroide BCL11A. Essa abordagem revelou recursos mínimos cruciais e vulnerabilidades discretas desses aprimoradores. Através da edição de progenitores humanos primários e transgênese de camundongo, os autores validaram o aprimorador de eritroide BCL11A como um alvo para reindução de HbF. Os autores geraram um mapa de aprimorador detalhado que informa a edição de genoma terapêutico.

Método para usar sistemas de Casl3b para modificar uma célula ou organismo [575] A invenção, em algumas modalidades, compreende um método para modificar uma célula ou organismo. A célula pode ser uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. A célula pode ser uma célula de mamífero. A célula de mamífero pode ser uma célula de primata não humano, bovino, suíno, roedor ou camundongo. A célula pode ser uma célula eucariótica de não mamífero, tal como ave, peixe ou camarão. A célula também pode ser uma célula vegetal. A célula vegetal pode ser de uma cultura, tal como mandioca, milho, sorgo, trigo ou arroz. A célula de planta também pode ser de uma alga, árvore ou vegetal. A modificação introduzida

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425/776 na célula pela presente invenção pode ser de modo que a célula e a progenitura da célula sejam alteradas para produção melhorada de produtos biológicos, tal como um anticorpo, amido, álcool ou outro rendimento celular desejado. A modificação introduzida na célula pela presente invenção pode ser de modo que a célula e a progenitura da célula incluam uma alteração que muda o produto biológico produzido.

[576] 0 sistema pode compreender um ou mais vetores diferentes. Em um aspecto da invenção, a proteína efetora é de códon otimizado para expressão do tipo de célula desejado, preferencialmente uma célula eucariótica, preferencialmente uma célula de mamífero ou uma célula humana.

[577] As células de empacotamento são tipicamente usadas para formar partículas virais que são capazes de infectar uma célula hospedeira. Tais células incluem células 293, que empacotam adenovirus, e células ψ2 ou células PA317, que empacotam retrovirus. Os vetores virais usados em terapia gênica são usualmente gerados produzindo-se uma linhagem de células que encapsula um vetor de ácido nucleico em uma partícula viral. Os vetores contêm tipicamente as sequências virais mínimas necessárias para embalagem e subsequente integração em um hospedeiro, em que outras sequências virais são substituídas por um cassete de expressão para o polinucleotideo (ou polinucleotídeos) a ser expresso. As

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426/776 funções virais ausentes são tipicamente fornecidas em trans pela linhagem celular de embalagem. Por exemplo, vetores AAV usados na terapia de gene têm, tipicamente, apenas sequências de ITR a partir do genoma AAV que são necessárias para embalagem e integração no genoma hospedeiro. 0 DNA viral é encapsulado em uma linhagem de células, que contém um plasmídeo auxiliar que codifica os outros genes de AAV, a saber, rep e cap, mas carecem de sequências de ITR. A linhagem celular também pode ser infectada com adenovirus como um auxiliar. 0 vírus auxiliar promove a replicação do vetor de AAV e a expressão de genes de AAV do plasmídeo auxiliar. 0 plasmídeo auxiliar não é encapsulado em quantidades significativas devido a uma carência de sequências de ITR. A contaminação com adenovirus pode ser reduzida, por exemplo, por tratamento térmico ao qual o adenovirus é mais sensível que AAV. Métodos adicionais para a distribuição de ácidos nucleicos em células são conhecidos por aqueles versados na técnica. Consultar, por exemplo, US20030087817, incorporado no presente documento a título de referência.

[578] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é transfectada transientemente ou não transientemente com um ou mais vetores descritos no presente documento. Em algumas modalidades, uma célula é transfectada conforme ocorre naturalmente em um indivíduo. Em algumas modalidades, uma

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427/776 célula que é transfectada é obtida a partir de um indivíduo. Em algumas modalidades, a célula é derivada de células obtidas a partir de um indivíduo, tal como uma linhagem celular. Uma ampla variedade de linhagens celulares para cultura de tecido é conhecidas na técnica. Os exemplos de linhagens de células incluem, porém sem limitação, 08161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huhl, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panel, PC-3, TF1, CTLL2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calul, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, 1021, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEE, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, BS-C-1 epitelial de rim de macaco, fibroblasto de embrião de camundongo BALB/ 3T3, 3T3 Swiss, 3T3-L1, fibroblastos fetais humanos 132-d5; fibroblastos de camundongo 10.1, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, BCP-1 cells, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, 06/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHOK2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML Tl, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepalclc7, HL60, HMEC, HT-29, Jurkat, células JY, células K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A,

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MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCIH69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW145, linhagens de células OPCN / OPCT, Peer, PNT-1A / PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, células Saos-2, Sf-9, SkBr3, T2, T47D, T84, linhagem de células THP1, U373, U87, U937, VCaP, células Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR e variedades transgênicas dos mesmos. Linhagens celulares estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes conhecidas por aqueles com habilidade na técnica (consultar, por exemplo, the American Type Culture Collection (ATCC) (Manassus, Va.)). Em algumas modalidades, uma célula transfectada com um ou mais vetores descritos no presente documento é usada para estabelecer uma nova linhagem celular que compreende uma ou mais sequências derivadas de vetor. Em algumas modalidades, uma célula transientemente transfectada com os componentes de um sistema de alvejamento de ácido nucleico conforme descrito no presente documento (tal como por transfecção transiente de um ou mais vetores, ou transfecção com RNA), e modificada através da atividade de um complexo de alvejamento de ácido nucleico, é usada para estabelecer uma nova linhagem celular gue compreende células que contêm a modificação, porém, carecem de qualquer outra sequência exógena. Em algumas modalidades, células transientemente ou não transientemente transfectadas com um

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429/776 ou mais vetores descritos no presente documento, ou linhagens celulares derivadas de tais células são usados na avaliação de um ou mais compostos de teste.

[579] Em algumas modalidades, um ou mais vetores descritos no presente documento são usados para produzir um animal não humano transgênico ou planta transgênica. Em algumas modalidades, o animal transgênico é um mamífero, tal como um camundongo, rato ou coelho. Em determinadas modalidades, o organismo ou indivíduo é uma planta. Em determinadas modalidades, o organismo ou indivíduo ou planta é alga. Métodos para produzir plantas e animais transgênicos são conhecidos na técnica, e geralmente começam com um método de transfecção de célula, tal como descrito no presente documento.

[580] Em um aspecto, a invenção fornece métodos para modificar um polinucleotídeo-alvo em uma célula eucariótica. Em algumas modalidades, o método compreende permitir que um complexo de alvejamento de ácido nucleico se liga ao polinucleotídeo-alvo para efetuar divagem do dito polinucleotídeo-alvo, desse modo, se modifica o polinucleotídeo-alvo, em que o complexo de alvejamento de ácido nucleico compreende uma proteína efetora de alvejamento de ácido nucleico complexada com um RNA guia hibridizado em uma sequência-alvo dentro do dito polinucleotídeo-alvo.

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430/776 [581] Em um aspecto, a invenção fornece um método para modificar a expressão de um polinucleotideo em uma célula eucariótica. Em algumas modalidades, o método compreende permitir que um complexo de alvejamento de ácido nucleico se ligue ao polinucleotideo, de modo que a dita ligação resulte em expressão aumentada ou diminuída do dito polinucleotideo; em que o complexo de alvejamento de ácido nucleico compreende uma proteína efetora de alvejamento de ácido nucleico complexada com um RNA guia hibridizado em uma sequência-alvo dentro do dito polinucleotideo.

Complexos de proteína efetora Casl3b podem ser usados em plantas [582] O sistema (ou sistemas) de proteína efetora Casl3b (por exemplo, único ou multiplexado) pode ser usado em conjunto com recentes avanços em genômica de cultura. Os sistemas descritos no presente documento podem ser usados para realizar interrogatório ou edição ou manipulação de gene ou genoma vegetal eficiente e econômico — por exemplo, para rápida investigação e/ou seleção e/ou interrogatórios e/ou comparação e/ou manipulações e/ou transformação de genes ou genomas vegetais; por exemplo, para criar, identificar, desenvolver, otimizar ou conferir traço (ou traços) ou característica (ou características) à planta (ou plantas) ou para transformar um genoma vegetal. Consequentemente pode haver produção melhorada de plantas,

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431/776 novas plantas com novas combinações de traços ou características ou novas plantas com traços aprimorados. 0 sistema (ou sistemas) de proteína efetora Casl3b pode ser usado com relação às plantas em Integração de Sítio Direcionado (SDI) ou Edição Genética (GE) ou quaisquer técnicas de Melhoramento Quase Reverso (NRB) ou Melhoramento Reverso (RB) . Aspectos de utilização dos sistemas de proteína efetora Casl3b descritos no presente documento podem ser análogos ao uso do sistema de CRISPR-Cas (por exemplo, CRISPR-Cas9) em plantas, e menção é feita no site da web da Universidade de Arizona GRISPR-PLANT (http://www.genome.arizona.edu/crispr/) (apoiado por Penn State e AGI). As modalidades da invenção podem ser usadas na edição de genoma em plants ou em que RNAi ou técnicas de edição de gnome semelhante foram usados anteriormente; consultar, por exemplo, Nekrasov, Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR-Cas system, Plant Methods 2013, 9:39 (doi:10.1186/1746-4811-9-39); Brooks, Efficient gene editing in tomato in the first generation using the CRISPRCas9 system, Plant Physiology setembro de 2014 páginas 114.247577; Shan, Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system, Nature Biotechnology 31, 686 a 688 (2013); Feng, Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system, Cell Research (2013) 23:1.229 a

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1.232. doi:10.1038/cr.2013.114 ; publicado on-line em 20 de agosto de 2013; Xie, RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system, Mol Plant. Nov de 2013;6(6):197583. doi: 10.1093/mp/sstll9. Publicação eletrônica 17 de agosto de 2013; Xu, Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice, Rice 2014, 7:5 (2014), Zhou et al., Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate: CoA ligase specificity e Redundancy, New Phytologist (2015) (Fórum) 1 a 4 (disponível on-line apensa em www.newphytologist.com); Caliando et al, Targeted DNA degradation using a CRISPR dispositivo stably carried in the host genoma, NATURE COMMUNICATIONS 6:6989, DOI: 10.103 8/ncomms7 98 9, www.nature . com/naturecommunications

DOI: 10.1038/ncomms7989; Patente n° U.S. 6.603.061 Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method; Patente n° U.S. 7,868,149 - Plant Genome Sequences and Uses Thereof e U.S. 2009/0100536 - Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits, das quais todo o conteúdo e revelação são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade. Na prática da invenção, o conteúdo e revelações de Morrell et al Crop genomics: advances e applications, Nat Rev Genet. 29 de dezembro de 2011;13(2):85 a 96; dentre os quais cada um é incorporado a título de referência no presente documento quanto a como as modalidades

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433/776 no presente documento podem ser usadas em relação às plantas. Consequentemente, referência no presente documento às células animais também podem se aplicar, mutatis mutandis, em células vegetais a menos que esteja aparente de outra forma; e, em que as enzimas no presente documento têm efeitos fora do alvo reduzidos e sistemas que empregam tais enzimas podem ser usados em aplicações vegetais, que incluem aquelas mencionadas no presente documento.

[583] Sugano et al. (Plant Cell Physiol. Mar de 2014;55 (3) :475-81. doi: 10.1093/pcp/pcu014. Publicação eletrônica 18 de janeiro de 2014) relata a aplicação de CRISPR-Cas9 a mutagênese de saturação alvejada na Marchantia polimorpha L. hepática, que emergiu como uma espécie de modelo para estudar evolução de planta terrestre. O promotor U6 de M. polimorpha foi identificado e clonado para expressar o gRNA. A sequência-alvo do gRNA foi projetada para romper o gene que codifica o fator 1 de resposta de auxina (ARF1) em M. polimorpha. Com o uso da transformação mediada por Agrobacterium, Sugano et ai. isolou mutantes estáveis na geração de gametogfito de M. polimorpha. A mutagênese sítiodirecionada à base de CRISPR-Cas9 ín vivo foi obtida com o uso ou do vírus do mosaico da Couve-flor 35S ou do promotor M. polimorpha EFla para expressar Cas9. Os indivíduos mutantes isolados que mostram que um fenótipo resistente à auxina não foram quiméricos. Ademais, os mutantes estáveis

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434/776 foram produzidos por reprodução assexual de plantas Tl. Múltiplos alelos arfl foram estabelecidos facilmente com o uso da mutagênese direcionada à base de CRIPSR/Cas9. Os sistemas CaslSb da presente invenção podem ser usados para regular os mesmos assim como outros genes, e sistemas de controle de expressão semelhantes, tais como RNAi e siRNA, em que o método da invenção pode ser induzível e reversível.

[584] Kabadi et al. (Nucleic Acids Res. 29 de outubro de 2014 29;42(19) :el47 . doi: 10.1093/nar/gku749 . A publicação eletrônica de 13 de agosto de 2014) desenvolveu um único sistema lentiviral para esperrrar uma variante Cas9, um gene repórter e até quatro sgRNAs de promotores independentes de RNA polimerase III que são incorporados no vetor por um método de clonagem conveniente Golden Gate. Cada sgRNA foi expresso significativamente e pode mediar edição de gene multiplicado e ativação de transcricional prolongada em células humanas imortalizadas e primárias. A presente invenção pode ser usada para regular os genes de planta de Kabadi.

[585] Xing et al. (BMC Plant Biology 2014, 14:327) desenvolveu um vetor binário CRISPR-Cas9 com base na cadeia principal de pGreen ou pCAMBIA, assim como um gRNA. Essa caixa de ferramentas não exige enzimas de restrição além de Bsal para gerar construtos finais que abrigam Cas9 otimizado por códon de mais e um ou mais gRNAs com alta eficiência

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435/776 igualmente ao mínimo de uma etapa de clonagem. A caixa de ferramentas foi validada com o uso de protoplastos de mais, linhagens de mais transgênicas e linhagens de Arabidopse transgênicas e exibiu eficiência e especificidade. Mais importante, com o uso dessa caixa de ferramentas, as mutações direcionadas de três genes de Arabidopse foram detectadas em mudas transgências da geração Tl. Ademais, as mutações de múltiplos genes podem ser herdadas pela próxima geração. 0 conjunto de vetores módulo (RNA-guia), com um kit de ferramentas para edição de genoma multiplicado em plantas. Os sistemas Casl3b e proteínas da presente invenção podem ser usados para direcionar os genes alvejados por Xing.

[586] Os sistemas Casl3b CRISPR da invenção podem ser usados na detecção de vírus de planta. Gambino et ai. (Phytopathology. Nov de 2006; 96(11) :1.223-9 . doi: 10.1094/PHYTO-96-1223) se baseou amplificação e PCR multiplicada para detecção simultânea de nove vírus de videira. Os sistemas Casl3b e proteínas da presente invenção podem ser usados semelhantemente para detectar múltiplos alvos em um hospedeiro. Ademais, os sistemas da invenção podem ser usados para submeter a knockdown simultaneamente a expressão de gene viral em cultivares valiosos e prevenir a ativação ou infecção adicional tendo-se como alvo o RNA viral expresso.

[587] Murray et al. (Proc Biol Sei. 26 de junho de

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2013,-280(1765):20130965. doi: 10.1098/rspb.2013.0965; publicado 22 de agosto de 2013) analizou 12 virus de RNA de planta a fim de investgiar taxas de evolução e constatou evidência de seleção possibilidade de seleção episódica devido às comutações entre diferentes genótipos ou espécies hospedeiras. Os sistemas Casl3b e proteínas da presente invenção podem ser usados para direcionar ou se imunizar contra tais vírus em um hospedeiro. Por exemplo, os sistemas da invenção podem ser usados para bloquear expressão viral de RNA, por conseguinte, replicação. Além disso, a invenção pode ser usada para direcionar ácidos nucleicos para divagem assim como para direcionar expressão ou ativação. Ademais, os sistemas da invenção podem ser multiplexados de modo a acertar vários alvos ou múltiplos isolados no mesmo vírus.

[588] Ma et al. (Mol Plant. 3 de agosto de 2015,-8(8):1.274 a 84. doi: 10.1016/j.molp.2015.04.007) relata um sistema vetorial robusto de CRISPR-Cas9, que utiliza um gene Cas9 otimizado por códon de planta, para edição de genoma multiplicado conveniente e de alta eficiência em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Ma et ai. projetou procedimentos com base em PCR para gerar rapidamente múltiplos cassetetes de expressão de sgRNA expressão que podem ser montados nos vetores CRISPR-Cas9 binários em um ciclo de clonagem pela ligação Golden Gate ou Montagem Gibson. Com esse sistema, Ma et ai. editou 46

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437/776 sitios-alvo no arroz com uma taxa média de mutação 85,4%, em maior parte em estado bialélico homozigoto. Ma et ai. fornece exemplos de perda de gene mutações em plantas de arroz TO e TIArabidopsis por direcionamento simultâneo de múltiplos (até oito) membros de uma família de gene, múltiplos genes em uma trajetória biossintética ou múltiplos sítios em um gene único. De modo semelhante, os sistemas Casl3b da presente invenção podem direcionar com eficiência a expressão-alvo de múltiplos genes simultaneaente.

[589] Lowder et al. (Plant Physiol. 21 de agosto de 2015 pii: páginas 00636.2015) também desenvolveu uma caixa de ferramentas de CRISPR-Cas9 que possibilita edição de genoma multiplex e regulação transcricional de genes expressos, silenciados ou de não codificação em plantas. Essa caixa de ferramentas fornece aos pesquisadores um protocolo e reagentes para montar rápida e eficientemente construtos CRISPR-Cas9 T-DNA funcionais para monocotiledôneas e dicotiledôneas com o uso dois métodos de clonagem Golden Gate e Gateway. É apresentado com um sítio completo de capacidades, incluindo edição de gene multiplexado e ativação transcricional A tecnologia de transformação à base de T-DNA é fundamental para biotecnologia de planta moderna, genética, biologia molecular e fisiologia. Desse modo, desenvolvemos um método para a montagem de Cas9 (WT, nickase ou dCas9) e gRNA (ou

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438/776 gRNAs) em um vetor-destino de interesse de T-DNA. 0 método de montagem se baseia tanto na montagem Golden Gate quanto na recombinação MultiSite Gateway. Três módulos são necessários para a montagem. 0 primeiro módulo é um vetor de entrada Cas9 que contém Cas9 sem promotor ou seus genes derivados flanqueados pelos sítios de attLl e attR5. 0 segundo módulo é um vetor de entrada de gRNA que contém cassetes de expressão de gRNA de entrada flanqueado por sítios de attL5 e attL2. 0 terceiro módulo inclui vetores de T-DNA de destino que contêm attRl-attR2 que fornecem promotores de escolha para a expressão Cas9. A caixa de ferramentas de Petersen e Hebelstrup podem ser aplicados ao sistema de proteína efetora Casl3b da presente invenção.

[590] Os organismos, tais como levedura e microalgas são amplamente usados para biologia sintética. Stovicek et al. (Metab. Eng. Comm., 2015; 2:13 descreve edição de genoma de levedura industrial, por exemplo, Saccharomyces cerevisae, a fim de produzir com eficiência cepas robustas para produção industrial. Stovicek usou um sistema CRISPR-Cas9 otimizado por códon para levedura a fim de perturbar simultanemaente ambos os alelos de um gene endógene e submeter a knockin um gene heterólogo. Cas9 e gRNA foram expressos a partir de localizações de vetor à base 2μ genômico ou epissômico. Os autores também mostraram que a eficiência de perturbação do gene pode ser aprimorada

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439/776 por otimização dos níveis de expressão de Cas9 e gRNA. Hlavová et ai. (Biotechnol. Adv. 2015) discute o desenvolvimento de espécies ou cepas de microalgas com o uso de técnicas, tais como CRISPR para ter como alvo genes nucleares e cloroplastos para mutagênese de inserção e triagem. Os mesmos plasmídeos e vetores podem ser aplicados a sistemas de Casl3b da presente invenção.

[591] Petersen (Towards precisely glycol engineered plants, Plant Biotech Denmark Annual meeting 2015, Copenhagen, Denmark) desenvolveu um método para usar CRISPR/Cas9 para modificar mudanças no genoma em Arabidopsis, por exemplo, para glicomodificar Arabidopsis para produção de proteínas e de produtos que têm modificações pós-traducionais desejadas. Hebelstrup et al. (Front Plant Sci. 23 de abril de 2015; 6:247) delineia biomodificação de amido em in planta, o que fornece culturas que expressam enzimas de modificação de amido e produzem diretamente produtos que são produzidos normalmente por tratamentos físicos e/ou químicos industriais de amidos. Os métodos de Petersen e Hebelstrup podem ser aplicados ao sistema de proteína efetora Casl3b da presente invenção.

[592] Kurth et al, J Virol. 2012 Jun;86(ll):6.002 a 9. doi: 10.1128/JVI.00436 a 12. Publicação eletrônica 12 de março de 2012) desenvolveram um vetor com base em vírus RNA para a introdução dos traços desejados em videira sem

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440/776 modificações hereditáveis o genoma. O vector forneceu a capacidade para regular a expressão de genes endógenos por silenciamento de gene induzido por vírus. Os sistemas Casl3b e proteínas da presente invenção podem ser usados para silenciar genes e proteínas sem modificação hereditária ao genoma.

[593] Em uma modalidade, a planta pode ser um legume. A presente invenção pode utilizar o sistema CRISPRCas revelado no presente documento para explorar e modificar, por exemplo, sem limitação, feijão-soja, ervilhas e amendoins. Curtin et ai. fornece uma caixa de ferramentas para genômica de função de legume. (Consultar Curtin et ai., A genome engineering toolbox for legume Functional genomics, International Plant and Animal genome Conference XXII 2014) . Curtin usou a transformação genética de CRISPR para cópia única knock-out/down e genes de legume duplicados em sistemas tanto de raiz peluda quanto planta inteira. Alguns dos genes-alvo foram escolhidos a fim de explicar e otimizar os recursos de sistemas de knock-out/down (por exemplo, fitoeno desaturase), ao passo que outros foram identificados por homologia a feijão-soja a genes do tipo Arabidopsis Dicer ou estudos por associação ampla de genoma de nodulação em Medicago. Os sistemas Casl3b e proteínas da presente invenção podem ser usados para sistema de knockout/knockdown.

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441/776 [594] As alergias de amendoins a legumes são geralmente uma preocupação séria e real de saúde. 0 sistema de proteína efetora Casl3b da presente invenção pode ser usado para identificar e, em seguida, editar ou silenciar genes que codificam proteínas alergênicas de tais legumes. Sem limitação em relação a tais genes e proteínas, Nicolaou et ai. identifica proteínas alergênicas em amendoins, feijões-soja, lentilhas, ervilhas, tremoceiro, feijões verdes e feijões mungu. Consultar, Nicolaou et al., Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 2011;ll(3) :222) .

[595] Em uma modalidade vantajosa, a planta pode ser uma árvore. A presente invenção também pode utilizar no presente documento o sistema CRISPR Cas revelado para sistemas herbáceos (consultar, por exemplo, Belhaj et ai., Plant métodos 9: 39 e Harrison et ai., Genes & Development 28: 1.859 a 1.872). Em uma modalidade particularmente vantajosa, o sistema CRISPR Cas da presente invenção pode direcionar polimorfismos-alvo únicos de nucleotídeo (SNPs) em árvores (consultar, por exemplo, Zhou et al., New Phytologist, Volume 208, Edição 2, páginas 298 a 301, outubro de 2015) . No estudo Zhou et ai., os autores aplicaram um sistema CRISPR Cas no Populus perenial de madeira com o uso da família 4-cumarato:CoA ligase (4CL) como um estudo de caso e obteve 100% de eficiência mutacional para dois genes 4CL direcionados, com todos os transformantes examinados

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442/776 carregando modificações bialélicas. No estudo de Zhou et ai., o sistema CRISPR-Cas9 foi altamente sensível para polimorfimos de nucleotídeo únicos (SNPs), uma vez que a divagem para um terceiro gene 4CL foi eliminada devido aos SNPs na sequência-alvo. Esses métodos podem ser aplicados ao sistema de proteína efetora CaslSb da presente invenção.

[596] Os métodos de Zhou et al. (New Phytologist, Volume 208, Edição 2, páginas 298 a 301, outubro de 2015) pode ser aplicado à presente invenção conforma a seguir. Dois genes 4CL, 4CL1 e 4CL2, associados a lignina e biossíntese de flavonoide, respectivamente são direcionados para edição de CRISPR-Cas9. O Populus tremula χ alba clone 717-1B4 usado rotineiramente para transformação é divergente da Populus trichocarpa sequenciado por genoma. Portanto, os gRNAs 4CL1 e 4CL2 projetados a partir do genoma de referência são interrogados com dados 717 RNA-Seq internos para garantir a ausência de SNPs que podem limitar a eficiência de Cas. O terceiro gRNA projetado para 4CL5, uma duplicada de 4CL1 também é incluído. As 717 sequências correspondentes abrigam um SNP em cada alelo próximo/dentro do PAM, dentre quais espera-se que dois elimine o direcionamento pelo 4CL5-gRNA. Todos os três sítios-alvo gRNA são localizados dentro do primeiro éxon. Para a transformação de 717, o gRNA é expresso a partir do promotor Medicago U6.6, junto de um Cas otimizado por códon humano sob controle do promotor CaMV 35S em um

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443/776 vetor binário. A transformação com o vetor de apenas Cas serve coo um controle. As linhagens selecionadas 4CL1 e 4CL2 são submetidas a sequenciamento de amplicon. Em seguida, os dados são processados, e as mutações bialélicas são confirmados em todos casos. Esses métodos podem ser aplicados ao sistema de proteína efetora CaslSb da presente invenção.

[597] Nas plantas, os patógenos são muitas vezes hospedeiro-especificos. Por exemplo, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici causam murchamento no tomate, porém ataca apenas o tomate, e F. oxysporum f. dianthii Puccinia graminis f. sp. tritici ataca apenas trigo. As plantas têm defesas existentes e induzidas para resistir à maioria dos patógenos. Os eventos de mutações e de recombinação ao longo da gerações de planta causam variabilidade genética que permite surgir suscetibilidade, especialmente à medida que os patógenos reproduzem dom mais frequência que outras plantas. Nas plantas, não pode haver resistência de não hospedeira, por exemplo, o hospedeiro e o patógeno são incompatíveis. Também pode haver Resistência Hoizontal, por exemplo, a resistência parcial contra todas as de um patógeno, tipicamente controlados por muitos genes e Resistência Vertical, por exemplo, resistência completa a algumas raças de um patógeno, porém não a outras raças, tipicamente controlados por alguns genes. Em um nível Gene-para-Gene, as plantas e patógenos envolvem juntos, e as mudanças genéticas em um equilíbrio

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444/776 mudam em ordem. Consequentemente, com o uso de Variabilidade Natural, os melhoristas combinam os genes mais recentes para Rendimento, Qualidade, Unifomidade, Dureza, Resistência. As fontes dos genes de resistência incluem Variedades nativas ou estranhas, Heirloom, Parentes de Plantas Selvagens e Mutações Induzidas, por exemplo, tratar vegetal com agentes mutagênicos. Com o uso da presente invenção, os melhoristas de planta são dotados de uma nova ferramenta para induzir mutações. Consequentemente, uma pessoa versada na técnica pode analisar o genoma de fontes de genes de resistência e em Variededes que têm características desejadas ou traços que empregam a presente invenção para induzir o surgimento de genes de resistência, com mais precisão que os agentes mutagênicos anteriores e, por conseguintes, aceleram e aprimoram e programas de melhoria de planta.

[598] Além das plantas de outro modo discutidas no presente documento e acima, as plantas modificadas pela proteína efetora e guia adequado, e progênie das mesmas, conforme fornecido. Essas podem incluir culturas resistentes à doença ou seca, tais como trigo, cevada, arroz, soja ou milho; plantas modificadas para remover ou reduzir a habilidade em auto polinizar (porém, que podem, em vez disso, opcionalmente, hibridizar); e alimentos alérgicos, tais como amendoins e nozes em que as proteínas imunogênicas foram incapacitadas, destruídas ou interrompidas alvejando-se por

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445/776 meio de uma proteína efetora e guia adequado.

Tratamento Terapêutico [599] 0 sistema da invenção pode ser aplicado em áreas de tecnologias de corte de RNA anteriores, sem experimentação indevida, a partir dessa revelação, que incluem terapêutica, ensaio e outras aplicações, pois a presente aplicação fornece a fundação para modificação informada do sistema. A presente invenção fornece tratamento terapêutico de uma doença provocada pela superexpressão de RNA, RNA tóxico e/ou RNA mutado (tal como, por exemplo, defeitos ou truncamentos de splicing). A expressão do RNA tóxico pode ser associada à formação de inclusões nucleares e mudanças degenerativas de início tardio no cérebro, coração ou músculo esquelético. No melhor exemplo estuado, distrofia miotônica, parece que o principal efeito patogênico do RNA tóxico é sequestrar proteínas de ligação e compreende a regulação de splicing alternativo (Hum. Mol. Genet. (2006) 15 (suppl 2): R162-R169). A distrofia miotônica [dystrophia myotonica (DM) ] é particularmente interessante a geneticistas devido ao fato de que produz uma faixa extremamente ampla de recursos clínicos. Uma listagem parcial inclui resíduo muscular, catarata, resistência à insula, atrofia testicular, desaceleração da condução cardíaca, tumores cutâneos e efeitos na cognição. A forma clássica de DM, que agora é denominada de DM tipo 1 (DM1),

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446/776 é causada por uma expansão de repetições de CTG na região 3' não traduzida (UTR) de DMPK, um gene que codifica uma quinase de proteína citosólica.

[ 600:	] A tabela abaixo apresenta uma lista de éxons
mostrados	como tendo splicing alternativo regulado de modo

errôneo no músculo esquelético de DM1, coração ou cérebro.

Tecido/gene Alvo Referência

Músculo esquelético

ALP	ex 5a, 5b Lin X., et al. Failure of MBNLl-dependent postnatal splicing transitions in myotonic dystrophy. Hum. Mol. Genet 2006,-15:2.087 a 2097
CAPN3	ex 16 Lin X., et al. Failure of MBNLl-dependent postnatal splicing transitions in myotonic dystrophy. Hum. Mol. Genet 2006,-15:2.087 a 2097
CLCN1	int 2, exMankodi A., et al. Expanded CUG repeats 7a, 8a trigger aberrant splicing of C1C-1 chloride channel pre-mRNA and hyperexcitability of skeletal muscle in myotonic dystrophy. Mol. Cell 2002,-10:35 a 44 Charlet-B N. , et al. Loss of the musclespecific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol. Cell

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Tecido/gene Alvo

Referência

Músculo esquelético

2002,-10:45 a 53

FHOS	ex	lla	Lin X., et al. Failure	of MBNLl-dependent
			postnatal splicing	transitions in
			myotonic dystrophy.	Hum. Mol. Genet
			2006,-15:2.087 a 2097
GFAT1	ex	10	Lin X., et al. Failure	of MBNLl-dependent
			postnatal splicing	transitions in
			myotonic dystrophy.	Hum. Mol. Genet
			2006,-15:2.087 a 2097
IR	ex	11	Savkur R.S., et al. Aberrant regulation

of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in

		myotonic dystrophy.	Nat. Genet.
		2001,-29:40 a 47
MBNL1	ex 7	Lin X., et al. Failure	of MBNLl-dependent
		postnatal splicing	transitions in
		myotonic dystrophy.	Hum. Mol. Genet
		2006,-15:2.087 a 2097
MBNL2	ex 7	Lin X., et al. Failure	of MBNLl-dependent
		postnatal splicing	transitions in
		myotonic dystrophy.	Hum. Mol. Genet
		2006,-15:2.087 a 2097

MTMR1 ex 2.1, Buj-Bello A., et al. Muscle-specific

2.2 alternative splicing of myotubularinPetição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 455/817

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Tecido/gene Alvo Referência

Músculo esquelético related 1 gene is impaired in DM1 muscle cells. Hum. Mol. Genet. 2002;11:2.297 a 2.307

NRAP ex 12 Lin X., et al. Failure of MBNLl-dependent postnatal splicing transitions in myotonic dystrophy. Hum. Mol. Genet 2006,-15:2.087 a 2097

RYR1 ex 7 0 Kimura T., et al. Altered mRNA splicing of the skeletal muscle ryanodine receptor and sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase in myotonic dystrophy type 1.

Hum. Mol. Genet. 2005,-14:2.18 9 a 2.200

SERCA1 ex 22 Kimura T., et al. Altered mRNA splicing of the skeletal muscle ryanodine receptor and sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase in myotonic dystrophy type 1.

Hum. Mol. Genet. 2005,-14:2.18 9 a 2.200

Lin X., et al. Failure of MBNLl-dependent postnatal splicing transitions in myotonic dystrophy. Hum. Mol. Genet 2006,-15:2.087 a 2097 z-Titina ex Zr4,Lin X., et al. Failure of MBNLl-dependent

Zr5 postnatal splicing transitions in myotonic dystrophy. Hum. Mol. Genet

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Tecido/gene Alvo

Músculo esquelético

Referência

2006,-15:2.087 a 2097 m-Titina linha ex 5

TNNT3 ex fetal

ZASP ex 11

Coração

TNNT2 ex 5

MLin X., et al. Failure postnatal splicing myotonic dystrophy. 2006,-15:2.087 a 2097 Kanadia R.N., et knockout model for

Science 2 003,-302:1.978 Lin X., et al. Failure postnatal splicing myotonic dystrophy. 2006,-15:2.087 a 2097

Philips A.V., et splicing regulated protein in myotonic 1998,-280:737 a 741 of MBNLl-dependent transitions in

Hum. Mol. Genet al. A muscleblind myotonic dystrophy.

a 1.980 of MBNLl-dependent transitions in

Hum. Mol. Genet al. Disruption of by a CUG-binding dystrophy. Science

ZASP ex 11 m-Titina linha ex 5

KCNAB1 ex 2

Mankodi A., et al. Nuclear RNA foci in the heart in myotonic dystrophy. Circ. Res. 2005,-97:1.152 a 1.155

MMankodi A., et al. Nuclear RNA foci in the heart in myotonic dystrophy. Circ. Res. 2005,-97:1.152 a 1.155

Mankodi A., et al. Nuclear RNA foci in

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Tecido/gene Alvo Referência

Músculo esquelético the heart in myotonic dystrophy. Circ.

Res. 2005,-97:1.152 a 1.155

ALP ex 5 (Mankodi A., et al. Nuclear RNA foci in the heart in myotonic dystrophy. Circ. Res. 2005,-97:1.152 a 1.155

Cérebro

TAU ex 2, exSergeant N. , et al. Dysregulation of human brain microtubule-associated tau mRNA maturation in myotonic dystrophy type 1. Hum. Mol. Genet. 2001,-10:2.143 a 2.155

Jiang H., et al. Myotonic dystrophy type associated with nuclear foci of mutant RNA, sequestration of muscleblind proteins, and deregulated alternative splicing in neurons. Hum. Mol. Genet. 2004,-13:3.079 a 3.088

APP ex 7 Jiang H., et al. Myotonic dystrophy type associated with nuclear foci of mutant RNA, sequestration of muscleblind proteins, and deregulated alternative splicing in neurons. Hum. Mol. Genet. 2004,-13:3.079 a 3.088

NMDAR1 ex 5 Jiang H., et al. Myotonic dystrophy type

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Tecido/gene Alvo Referência

Músculo esquelético associated with nuclear foci of mutant

RNA, sequestration of muscleblind proteins, and deregulated alternative splicing in neurons. Hum. Mol. Genet. 2004,-13:3.079 a 3.088 [601] As enzimas da presente invenção podem ter como alvo RNA superexpresso ou RNA tóxico, tal como, por exemplo, o gene de DMPK ou qualquer um dentre splicing alternativa regulado erroneamente no músculo esquelético de DM1, coração ou cérebro, por exemplo, a tabela acima.

[602] As enzimas da presente invenção também podem ter como alvo mutações de atuação trans que afetam mutações de atuação trans que causam a doença (resumida em Cell. 20 de fevereiro de 20; 136(4): 777 a 793) conforme indicado na tabela abaixo.

DOENÇA	GENE/MUTAÇÃO	FUNÇÃO
Síndrome de Prader: Willi	;SNORD116	;biogênese de ;ribossoma
Atrofia muscular; espinhal (SMA)	: SMN2	; splicing

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DOENÇA	GENE/MUTAÇÃO	FUNÇÃO
Disceratose congênita; (ligada a X)	;dkci	;telomerase/ ; tradução
Disceratose congênita; (dominante autossomal)	: TERC	; telomerase
Disceratose congênita: (dominante autossomal)	; TERT	;telomerase
anemia de Diamond-; Blackfan	:RPS19, RPS24	;biogênese de :ribossoma
sindrome de: Shwachman-Diamond	:sbds	;biogênese de ;ribossoma
sindrome de Treacher- Collins	:tcofi	;biogênese de :ribossoma
Câncer de próstata	:SNHG5	;biogênese de :ribossoma
Distrofia miotônica, ; tipo 1 (DM1)	;DMPK (ganho de: : função de RNA)	;proteína quinase
distrofia miotônica; tipo 2 (DM2)	:ZNF9 (ganho de: ; função de RNA)	; ligação de RNA

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DOENÇA	GENE/MUTAÇÃO	FUNÇÃO
Ataxia Espinocerebelar 8; (SCA8)	:ATXN8/ATXN8OS :(ganho de função: :de RNA)	:RNA desconhecido/ :de não codificação
Doença de Huntington: tipo 2 (HDL2)	: JPH3 (ganho de: : função de RNA)	: função de canal de : ions
síndrome de: tremor/ataxia associada ao X frágil: (FXTAS)	:FMR1 (ganho de: :função de RNA)	: transição/ :localização de :mRNA
Síndrome do X frágil	: FMR1	: transição/ :localização de :mRNA
Retardo mental ligado: ao X	:UPF3B	:Decaimento mediado :por tradução/não : senso
Distrofia muscular: oculofaríngea (OPMD)	:PABPN1	:Formação da :extrenidade 3'
Genodermatose de: pigmento humano	:DSRAD	: edição
Retinite pigmentosa	:PRPF31	: splicing

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DOENÇA	GENE/MUTAÇÃO FUNÇÃO
Retinite pigmentosa	:PRPF8 :í splicing
Retinite pigmentosa	:HPRP3 Hsplicing
Retinite pigmentosa	:papi	: splicing
hipoplasia do cabelo-: cartilagem(recessiva) :	:rmrp	: splicing
Autismo	:ponto de ruptura: : do locus 7q22-: : q33	:RNA de não : codificação
Síndrome de Beckwith-: Wiedemann (BWS)	:H19	:RNA de não : codificação
doença de Charcot- Marie-Tooth (CMT)	:grs	: tradução
doença de Charcot- Marie-Tooth (CMT)	: yrs	: tradução
Esclerose lateral: amiotrófica (ALS)	:TARDBP	: splicing, : transcrição
Leucoencefalopatia com matéria branca em: em desaparecimento	:EIF2B1	: tradução
síndrome de Wolcott-	:EIF2AK3	: tradução

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DOENÇA	GENE/MUTAÇÃO FUNÇÃO
Rallison	:í (protease)
Miopatia mitocondrial; e anemia: sideroblástica (MLASA)	:pusi	: tradução
Encefalomiopatia e: cardiomiopatia hipertrófica	: TSFM	: tradução :(mitocondrial)
paraplegia espástica: hereditária	:SPG7	:biogênese de :ribossoma
Leucoencefalopatia	:dars2	: tradução :(mitocondrial)
Suscetibilidade à: diabetes mellitus	:LARS2	: tradução : (mitocondrial)
Surdez	:mtrnri	:Biogênese de :ribossoma :(mitocondrial)
Síndrome de MELAS, : surdez	:MTRNR2	:Biogênese de :ribossoma :(mitocondrial)

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DOENÇA	GENE/MUTAÇÃO	FUNÇÃO
Câncer	;sfrsi	; splicing, ; tradução, export
Câncer	: RBM5	: splicing
Múltiplos transtornos :
;mitocondriais	:(mitocondrial)
Câncer	: agrupamento de) :miR-17-92	: interferência de :rna
Câncer	:miR-372/miR-373	; interferência de ;rna

[603] A enzima da presente invenção também pode ser usada no tratamento de várias taupatias, incluindo taupatias primárias e secundárias, tais como tauopatia relacionada a idade primária (PART)/demencia senil predominante nos emaranhados neurofibrilares, com NFTs semelhantes a AD, porém sem placas, demência pugilistica (encefalopatia traumática crônica), paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, demência frontotemporal e parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de lyticoBodig (Complexo Parkinson-demência de Guam), ganglioglioma e gangliocitoma, meningioangiomatose, parkinsonismo postencefalitico, panencefalite esclerosante subaguda, assim

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457/776 como encefalopatia por chumbo, esclorose tuberosa, doença de Hallervorden-Spatz e lipofuscinose, doença de Alzheimer. As enzimas da presente invenção também podem ter como alvo mutações que prejudicam o código de splicing de ação cis que casam defeitos no splicing e doença (resumidos em Cell. 20 de fevereiro de 20; 136(4) : 777 a 793) . A doença neurodegenerativa motora SMA resulta da deleção do gene SMN1. O gene SMN2 restante tem uma substituição C->T no éxon 7 que inativa um intensificador de splicing exônico (ESE) e cria um silenciador de splicing exônico (ESS), levando ao pulo do éxon 7 e uma proteína truncada (SMNA7). Uma substituição T>A no éxon 31 do gene distrofina cria simultaneamente um códon de terminação prematura (PARADA) e um ESS, que ao pulo do éxon 31. Essa mutação causa uma forma branda de DMD devido ao fato de que o éxon 31 que carece de mRNA produz uma proteína parcialmente funcional. As mutações dentro e a jusante do éxon 10 do gene MAPT que codifica a proteína tau afetam os elementos regulatórios splicing e prejudicam a razão normal 1:1 de mRNAs que incluem ou excluem o éxon 10. Isso resulta em um equilíbrio prejudicado entre proteínas tau que contêm ou quatro ou três domínios de ligação de microtúbulo (4R-tau e 3R-tau, respectivamente), causando o transtorno neuropatológico FTDP-17. O exemplo mostrado é a mutação N279K que intensifica uma função de ESE que promove a inclusão do éxon 10 e comuta o equilíbrio em direção à 4R

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458/776 tau aumentada. Os tratos (UG)m(U)n polimórficos dentro do sitio de splice 3 ' do éxon 9 do gene CFTR influenciam a externsão da inclusão do éxon 9 e o nível da proteína funcional de comprimento, modificando a gravidade da fibrose cística (CF) causada por uma mutação em outro local no gene de CFTR.

[604] O sistema imunológico inato detecta infecção viral primariamente reconhecendo-se ácidos nucleicos virais no interior de uma célula infectada, denominada de captação de DNA ou RNA. Os ensaios de captação de RNA in vitro podem ser usados para detectar substratos de RNA específicos. A proteína efetora que como alvo o RNA pode ser usada, por exemplo, para captação à base de RNA em células vivas. Exemplos de aplicações são diagnósticos por captação de, por exemplo, RNAs doença-específico.

[605] A proteína efetora que tem como alvo RNA da invenção pode ser usada adicionalmente para atividade antiviral, em particular, contra vírus de RNA. A proteína efetora pode ser direcionada para o RNA viral com o uso de um RNA-guia adequado seletivo para uma sequência de RNAs virais selecionados. Em particular, a proteína efetora pode ser uma nuclease ativa que cliva o RNA, tal como RNA fita única. Portanto, é fornecido o uso de uma proteína efetora que tem como alvo RNA da invenção como um agente antiviral.

[606] As dosagens terapêuticas do sistema de enzima

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459/776 da presente invenção para ter como alvo o RNA, os RNAs mencionados acima, são contempladas como cerca de 0, 1 a cerca de 2 mg/kg, em que as dosagens podem ser administradas sequencialmente com uma resposta monitorada, e as dosagens repetidas, caso necessário, até cerca de 7 a 10 doses por paciente. De maneira vantajosa, as amostras são coletadas de cada paciente durante o regime de tratamento para comprovar a eficácia do tratamento. Por exemplo, as amostras de RNA podem ser isoladas e quantificadas para determinar se a expressão é reduzida ou melhorada. Tal diagnóstico está dentro da previsão de uma pessoa versada na técnica.

Métodos de Detecção de transcrição [607] As proteínas efetoras e sistemas da invenção são úteis para detecção específica de RNAs em uma célula ou outra amostra. Na presença de um alvo de RNA de interesse, a atividade de nuclease CaslSb dependente de guia pode ser acompanhada por atividade de RNAse não específica contra alvos colaterais. A fim de obter vantagens da atividade de RNase, tudo o que é necessário é um substrato repórter que pode ser clivado de maneira detectável. Por exemplo, uma molécula repórter pode compreender RNA, com uma tag de molécula repórter fluorescente (flúor) em uma extremidade e um arrefecedor brusco na outra. Na ausência da atividade de CaslSb RNase, a proximidade física do arrefecedor brusco amortece a fluorescência do flúor a baixos níveis. Quando

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460/776 divagem Casl3b-alvo-específica é ativada pela presença de um RNA-alvo de interesse e um RNA-guia adequado, a molécula repórter que contém RNA é clivada de maneira não específica, e o flúor e arrefecedor brusco são separados espacialmente. Isso faz com que o flúor emita um sinal detectável quando excitado pela luz do comprimento de onda apropriado.

[608] Em um aspecto, a invenção se refere um sistema de detecção de RNA (alvo) que compreende um efetor que tem como alvo o RNA; um ou mais RNAs-guia projetado para se ligar ao alvo de RNA correspondente; e um construto de repórter induzivel por divagem à base de RNA. Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para detecção de RNA (alvo) em uma amostra que compreende adicionar um efetor que tem

como alvo RNA, um ou	mais	RNAs-guia projetados	para	se
ligarem ao dito RNA	(alvo)	e	um	construto	de	repórter
induzivel por divagem	à base	de	RNA	para a dita	amostra.	Em
aspecto adicional, a	invenção	se	refere a	um	kit	ou

dispositivo que compreende o sistema de detecção de RNA (alvo) conforme definido no presente documento, ou um kit ou dispositivo que compreende pelo menos o efetor que tem como alvo RNA e o construto de repórter induzivel por divagem à base de RNA. Em aspecto adicional, a invenção se refere ao uso do sistema que tem como alvo RNA ou kit ou dispositivo, conforme definido no presente documento, para detecção de RNA (alvo) . O efetor que tem como alvo RNA em determinadas

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461/776 modalidades é uma RNAse guiada por RNA. Em determinadas modalidades, o efetor que tem como alvo RNA é um efetor CRISPR. Em determinadas modalidades, o efetor que tem como alvo RNA é um efetor CRISPR de classe 2. Em determinadas modalidades, o efetor que tem como alvo RNA é um effector CRISPR do tipo VI-B de classe 2. Em uma modalidade preferencial, o efetor que tem como alvo RNA é CaslSb. Em determinadas modalidades, o efetor que tem como alvo RNA, de preferência, CaslSb, é derivado de uma espécie conforme descrito ao longo do presente documento. Será entendido que o RNA-guia projetado para se ligar ao RNA (alvo), conforme descrito no presente documento, tem capacidade para formar um complexo com o efetor que tem como alvo RNA, e em que o RNA-guia no dito complexo tem capacidade para se ligar a uma molécula de RNA-alvo e, por meio da qual, o RNA-alvo é clivado, conforme também descrito a longo do presente documento. Será entendido que o RNA-guia compreende tipicamente uma sequência-guia e uma repetição direta, conforme descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, o um ou mais RNAs-guia são projetados para se ligar a uma ou mais moléculas-alvo que são diagnósticos para um estado da doença. Em determinadas modalidades, o estado de doença é infecção, tal como viral, infecção bacteriana, fúngica ou parasitica. Em determinadas modalidades, o estado da doença é caracterizado por expressão aberrante de RNA

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462/776 (alvo). Em determinadas modalidades, o estado da doença é câncer. Em determinadas modalidades, o estado da doença é doença autoimune. 0 construto de repórter induzível por divagem à base de RNA compreende RNA, e divagem do RNA resulta em uma leitura detectável, isto é, um sinal detectável é gerado mediante a divagem do RNA. Em determinadas modalidades, o construto de repórter induzível por divagem à base de RNA compreende um fluorocromo e um arrefecedor brusco. A pessoa versada na técnica entenderá que diferentes tipos de fluorocromos e arrefecedores bruscos correspondentes podem ser usados. A pessoa versada na técnica poderá prever outros tipos de sistemas de repórter induzíveis que podem ser adaptados para uso nos construtos repórteres de divagem de RNA.

[609] Em um método de ensaio exemplificativo, o efetor Casl3b, RNA-guia-alvo específico de interesse, e a molécula repórter são adicionados a uma amostra celular. Um aumento em fluorescência indica a presença do RNA-alvo de interesse. Em outro método exemplificativo, um arranjo de detecção é fornecido. Cada localização do arranjo é dotada da Casl3b efetora, da molécula repórter e de um RNA-guiaalvo específico de interesse. Dependendo do ensaio a ser realizado, o RNAs-guia-alvo específicos de interesse em cada localização do arranjo podem ser iguais, diferentes ou uma combinação dos mesmos. RNAs-guia-alvo específicos de

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463/776 interesse diferentes podem ser fornecidos, por exemplo, quando se deseja testar um ou mais alvos em uma única amostra de fonte. 0 mesmo RNA-guia-alvo especifico de interesse pode ser fornecido em cada localização, por exemplo, quando se desejada testar múltiplas amostras para o mesmo alvo.

[610] Conforme usado no presente documento, um construto de mascaramento se refere a uma molécula que pode ser clivada ou, de outro modo, desativada por uma proteína efetora de sistema de CRISPR ativada descrita no presente documento. Em determinadas modalidades exemplificativas, o construto de mascaramento é um construto de mascaramento à base de RNA. O construto de mascaramento impede a geração ou detecção de um sinal detectável positivo. Um sinal detectável positivo pode ser qualquer sinal que pode ser detectado com o uso de métodos de detecção ópticos, fluorescentes, quimioluminescentes, eletroquímicos ou outros métodos de detecção conhecidos na técnica. O construto de mascaramento pode impedir a geração de um sinal positivo detectável ou mascarar a presença de um sinal positivo detectável até que o construto de mascaramento seja removido ou, de outro modo, silenciado. O termo sinal detectável positivo é usado para diferenciar de outros sinais detectáveis que podem ser detectáveis na presença do construto de mascaramento. Por exemplo, em determinadas modalidades, um primeiro sinal pode ser detectado quando o

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 471/817 agente de mascaramento está presente (isto é, um sinal detectável negativo) que, em seguida, se converte em um segundo sinal (por exemplo, o sinal detectável positivo) após a detecção das moléculas-alvo e após a divagem ou desativação do agente de mascaramento pela proteína efetora CRISPR ativada.

[611] Em determinadas modalidades exemplificativas, o construto de mascaramento pode suprimir a geração de um produto de gene. 0 produto de gene pode ser codificado por um construto repórter que é adicionado à amostra. 0 construto de mascaramento pode ser um RNA de interferência envolvido em uma via de interferência de RNA, tal como um shRHN ou siRNA. 0 construto de mascaramento também pode compreender microRNA (miRNA). Enquanto estiver presente, o construto de mascaramento suprime a expressão do produto de gene. 0 produto de gene pode ser uma proteína fluorescente ou outro transcrito de RNA ou proteínas que, de outro modo, seriam detectáveis por uma sonda ou anticorpo marcado, porém para a presença do construto de mascaramento. Após a ativação da proteína efetora, o construto de mascaramento é clivado ou, de outro modo, silenciado, o que permite a expressão e detecção do produto de gene como o sinal detectável positivo.

[612] Em determinadas modalidades exemplificativas, o construto de mascaramento pode sequestrar um ou mais reagentes necessários para gerar um sinal positivo

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465/776 detectável, de modo que a liberação do um ou mais reagentes do construto de mascaramento resulte na geração do sinal positivo detectável. 0 um ou mais reagentes podem se combinar para produzir um sinal calorimétrico, um sinal quimioluminescente, um sinal fluorescente ou qualquer outro sinal detectável e pode compreender quaisquer reagentes conhecidos como adequadas para tal propósito. Em determinadas modalidades exemplificativas, o um ou mais reagentes são sequestrados por aptâmeros de RNA que se ligam a um ou mais reagentes. 0 um ou mais reagentes são liberados quando a proteína efetora é ativada mediante a detecção de uma molécula-alvo. Em determinadas modalidades exemplificativas, o um ou mais reagentes é uma proteína, tal como uma enzima, com capacidade para facilitar geração de um sinal detectável, tal como um sinal colorimétrico, quimioluminescente ou fluorescente, que é inibido ou sequestrado de modo que a proteína não possa gerar o sinal detectável pela ligação de um ou mais aptâmeros de RNA à proteína. Após a ativação das proteínas efetoras revelados no presente documento, os aptâmeros de RNA são clivados ou degradas até o ponto em que não mais inibem a capacidade da proteína de gerar o sinal detectável.

[613] Em uma modalidade, a trombina é usada como uma enzima de amplificação de sinal com um aptâmero inibidor, por exemplo, que tem a seguinte sequência:

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GGGAACAAAGCUGAAGUACUUACCC. Quando esse aptâmero é clivado, a trombina se torna ativa e clivará um substrato calorimétrico de peptídeo (consultar, por exemplo, www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t3068?lang=en&re gion=US) ou substrato fluorescente (consultar, por exemplo, www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b9385?lang=en&re gion=US). 0 substrato calorimétrico, para-nitroanilida (pNA), é ligado de maneira covalente substrato de peptídeo para trombina. Após a divagem por trombina, o pNA é liberado e se torna amarelo e facilmente visível ao olho. 0 substrato fluorescente opera por um princípio semelhante e, após a divagem por trombina, libera 7-amino-4-metilcoumarina, um fluoróforo azul que pode ser detectado com o uso de um detector de fluorescência. As alternativas a trombina incluem peroxidase de raiz-forte (HRP), β-galactosidase e fosfatase alcalina de vitelo (CAP) que podem ser usadas semelhantemente para gerar um sinal calorimétrico ou fluorescente e ser inibidas por um aptâmero inibidor.

[614] Em determinadas modalidades exemplificativas, o construto de mascaramento pode ser imobilizado em um substrato sólido em um volume distinto individual (definido adicionalmente abaixo) e sequestra um único reagente. Por exemplo, o reagente pode ser uma microesfera que compreende um corante. Quando sequestrado pelo reagente imobilizado, as microesferas individuais são muito difusas para gerar um

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467/776 sinal detectável, porém após liberação do construto de mascaramento podem gerar um sinal detectável, por exemplo, por agregação ou simples aumento na concentração de solução. Em determinadas modalidades exemplificativas, o agente de mascaramento imobilizado é um aptâmero à base de RNA que pode ser clivado pela proteína efetora ativada mediante a detecção de uma molécula-alvo.

[615] Em determinadas outras modalidades exemplificativas, o construto de mascaramento se liga a um reagente imobilizado em solução, desse modo, bloqueando a capacidade do reagente de se ligar a um parceiro de ligação marcado separado que está livre em solução. Desse modo, após a aplicação de uma etapa de lavagem a uma amostra, o parceiro de ligação marcado pode ser removido por lavagem da amostra na ausência de uma molécula-alvo. No entanto, caso a proteína efetora seja ativada, o construto de mascaramento é clivado a um grau suficiente para interferir com a capacidade do construto de mascaramento para se ligar ao reagente, desse modo, permitindo que o parceiro de ligação marcado se liga ao reagente imobilizado. Desse modo, o parceiro de ligação marcado permanece após a etapa de lavagem, o que indica a presença da molécula-alvo na amostra. Em determinados aspectos, o construto de mascaramento que se liga ao reagente imobilizado é um aptâmero de RNA. 0 reagente imobilizado pode ser uma proteína, e o parceiro de ligação marcado pode

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468/776 ser um anticorpo marcado. Alternativamente, o reagente imobilizado pode ser uma estreptavidina, e o parceiro de ligação marcado pode ser biotina marcada. A marcação no parceiro de ligação usado nas modalidades acima pode ser qualquer marcação detectável conhecida na técnica. Além disso, outros parceiros de ligação conhecidos podem ser usados em conformidade com o modelo geral descrito no presente documento.

[616] Em determinadas modalidades exemplificativas, o construto de mascaramento pode compreender uma ribozima. As ribozimas são moléculas de RNA que têm propriedades catalíticas. Como ribozimas, tanto naturais quanto modificadas, compreendem ou consistem em RNA, que podem ser tidos como alvo pelas proteínas efetoras reveladas no presente documento. A ribozima pode ser selecionada ou modificada para catalisar uma reação que ou gera um sinal detectável negativo ou impede a geração de um sinal de controle positivo. Após a desativação da ribozima pela molécula de proteína efetora ativada, a reação que gera um sinal de controle negativo ou previne a geração de um sinal detectável positivo é removida, desse modo, permitindo que um sinal detectável positivo seja detectado. Em uma modalidade exemplificativa, a ribozima pode catalisar uma reação calorimétrica que faz com que uma solução apareça como uma primeira cor. Quando a ribozima é desativada, a

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469/776 solução, então, vira uma segunda cor, em que a segunda cor é o sinal positivo detectável. Um exemplo da maneira em que as ribozimas podem ser usadas para catalisador uma reação calorimétrica é descrito em Zhao et al. Signal amplification of glucosamine-6-phosphate based on ribozyme glmS, Biosens Bioelectron. 2014; 16:337 a 42, e fornece um exemplo de como tal sistema pode ser modificado para funcionar no contexto das modalidades reveladas no presente documento. Alternativamente, as ribozimas, quando presente, podem gerar produtos de divagem, por exemplo, de transcrições de RNA. Desse modo, a detecção de um sinal detectável positivo pode compreender detecção de transcrições de RNA não clivadas que são geradas apenas na ausência da ribozima.

[617] Em uma modalidade exemplificativa, o construto de mascaramento compreende um agente de detecção que muda de cor dependendo da possibilidade de o agente de detecção ser agregado ou disperso na solução. Por exemplo, determinadas nanoparticulas, tais como ouro coloidal, mudam de um roxo visível para a cor vermelha à medida que se movem de agregados para partículas dispersas. Consequentemente, em determinadas modalidades exemplificativas, tais agentes de detecção podem ser mantidos no agregado por uma ou mais moléculas em ponte. Pelo menos uma porção da molécula em ponte compreende RNA. Após a ativação das proteínas efetoras reveladas no presente documento, a porção de RNA da molécula

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470/776 de ponte é clivada, o que permite que o agente de detecção disperse e resulta na mudança correspondente de cor. Em determinadas modalidades exemplificativas, a molécula de ponte é uma molécula de RNA. Em determinadas modalidades exemplificativas, o agente de detecção é um metal coloidal. O material coloidal de metal pode incluir partículas de metal solúvel em água ou compostos metálicos dispersos em uma solução líquida, hidrossolução ou em uma solução de metal. O metal coloidal pode ser selecionado dentre os metais nos grupos IA, IB, IIB e IIIB da tabela periódica, assim como os metais de transição, especialmente aqueles do grupo VIII. Os metais preferenciais incluem ouro, prata, alumínio, rutênio, zinco, ferro, níquel e cálcio. Outros metais adequados também incluem o seguinte em todos os seus vários estados de oxidação: lítio, sódio, magnésio, potássio, escândio, titânio, vanádio, cromo, manganês, cobalto, cobre, gálio, estrôncio, bióbio, molibdênio, paládio, índio, estanho, tungstênio, rênio, platina e gadolínio. Os metais são fornecidos, de preferência, em forma iônica, derivados de um composto de metal apropriado, por exemplo, os ions Al³⁺, Ru³⁺, Zn²⁺, Fe³⁺, Ni²⁺ e Ca²⁺.

[618] Em algumas outras modalidades exemplificativas, o construto de mascaramento pode compreender um oligonucleotídeo de RNA ao qual são fixados um marcador detectável e um agente de mascaramento desse

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471/776 marcador detectável. Um exemplo de tal marcador detectável/ agente de mascaramento é um fluoróforo e um arrefecedor brusco do fluoróforo. 0 arrefecimento brusco do fluoróforo pode ocorrer como o resultado da formação de um complexo não fluorescente entre o fluoróforo e outro fluoróforo ou molécula não fluorescente. Esse mecanismo é conhecido como formação de complexo de estado triturado, arrefecimento brusco estático ou arrefecimento brusco por contato. Consequentemente, o oligonucleotideo de RNA pode ser projetado de modo que o fluoróforo e o arrefecedor brusco estão suficientemente próximos para arrefecimento brusco por contato ocorrer. Os fluóforos e seus arrefecedores bruscos por contato são conhecidos e podem ser selecionados para esse fim por uma pessoa de habilidade comum na técnica. 0 par particular de fluoróforo/arrefecedor brusco não é crucial no contexto na presente invenção, apenas essa seleção dos pares de fluoróforo/arrefecedor busco garante o mascaramento do fluoróforo. Após a ativação das proteínas efetoras reveladas no presente documento, o oligonucleotideo de RNA é clivado, desse modo diminuindo a proximidade entre o fluoróforo e o arrefecedor brusco necessários para manter o efeito de arrefecimento brusco por contato. Consequentemente, a detecção do fluoróforo pode ser usada para determinar a presença de uma molécula-alvo em uma amostra.

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472/776 [619] Em uma modalidade exemplificativa, ο construto de mascaramento pode compreender um ponto quântico. 0 ponto quântico pode ter múltiplas moléculas ligantes ligadas à superfície. Pelo menos uma porção da molécula de ligante compreende RNA. A molécula ligante é fixada ao ponto quântico em uma extremidade e para um ou mais arrefecedores bruscos ao longo do comprimento ou nas extremidades terminais do ligante de modo que os arrefecedores bruscos sejam mantidos próximos o suficiente para arrefecer bruscamente o ponto quântico para ocorrer. 0 ligante pode ser ramificado. Conforme acima, o par ponto quântico/arrefecedor brusco não é crucial, apenas essa seleção do par ponto quântico/arrefecedor brusco garante o mascaramento do fluoróforo. Os pontos quânticos e seus arrefecedores bruscos por contato são conhecidos e podem ser selecionados para esse fim por uma pessoa de habilidade comum na técnica. Após a ativação das proteínas efetoras reveladas no presente documento, a porção de RNA da molécula ligante é clivada, desse modo, eliminando a proximidade entre o ponto quântico e um ou mais arrefecedores bruscos necessários para manter o efeito de arrefecimento brusco. Em uma modalidade, o ponto quântico é estreptavidina conjugada, tal como Conjugado de Estreptavidina Qdot® 625 (www.thermofisher.com/order/catalog/product/A10196). 0 RNA é fixado por meio de ligantes de biotina e recrutam moléculas

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Μ3/ΊΊ6 de arrefecimento brusco, com a sequência /5Biosg/UCUCGUACGUUC/3TAbRQSp/ ou /5Biosg/UCUCGUACGUUCUCUCGUACGUUC/3TAbRQSp/ em que /5Biosg/ é uma tag de biotina e /3IAbRQSp/ é um arrefecedor brusco negro de Iowa. Após a divagem, o arrefecedor brusco será liberado, e o ponto quântico fluorescerá visivelmente.

[620] Semelhantemente, a transferência de energia de fluorescência (FRET) pode ser usada para gerar um sinal positivo detectável. A FRET é um processo não radiativo pelo qual um fóton de um fluoróforo energeticamente excitado (isto é fluoróforo doador) eleva o estado de energia de um elétron em outra molécula (isto é o aceitador) para níveis de vibração mais altos do estado único. O fluoróforo doador retorna para o estado triturado sem emitir uma característica de fluorescência desse fluoróforo. O aceitador pode ser outro fluoróforo ou molécula não fluorescente. Caso o aceitador seja um fluoróforo, a energia transferida é emitida como característica de fluorescência desse fluoróforo. Caso o aceitador seja uma molécula não fluorescente a energia absorvida é perdida como calor. Desse modo, no contexto das modalidades reveladas no presente documento, o par fluoróforo/arrefecedor brusco é substituído por um par fluoróforo doador/aceitador fixado à molécula de oligonucleotídeo. Quando intacto, o construto de mascaramento gera um primeiro sinal (sinal detectável

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474/776 negativo) como detectadas pela fluorescência ou calor emitido do aceitador. Após a ativação das proteínas efetoras reveladas no presente documento, o oligonucleotídeo de RNA é clivado, e a FRET é prejudicada de modo que a fluorescência do fluoróforo doador seja agora detectada (sinal detectável positivo).

[621] Um modo de leitura colorimétrica para a detecção de RNAses se baseia nos corantes de intercalação, que mudam sua absorbância em resposta à divagem de longos RNAs para nucleotídeos curtos. Os corantes existentes com essas propriedades existem. Segundo Wagner (1983), a Pironina-Y complexará com RNA e formará um complexo que tem uma absorbância a 572 nm; a divagem do RNA resulta na perda de absorbância e uma cor muda. Greiner-Stoeffele (1996) usou azul de metileno de maneira semelhante, com mudanças em absorbância a 688 nm mediante atividade de RNAse.

[622] Outro modo de leitura colorimétrica envolve substratos de ácido nucleico que mudam de cor após a divagem. Witmer (1991) utilizou um substrato de ribonucleotídeo sintético, U-3'-BCIP, que libera um grupo repórter após a divagem, o que resulta na geração de absorbância a 650 nm.

[623] CRISPR/Casl3 funcionalizado por Deaminase [624] Em determinados aspectos e modalidades da invenção, a proteína Casl3, conforme descrito no presente

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475/776 documento (incluindo, por exemplo, Casl3a, Casl3b ou Casl3c, incluindo qualquer ortólogo, tal como aquele descrito ao longo do presente documento), incluindo qualquer variante da proteína Casl3 (tal como variantes funcionais, mutantes (incluindo, porém sem limitação mutantes cataliticamente inativos), domínios (funcionais) ou truncamentos (incluindo Casl3 dividida), proteínas de fusão Casl3 (por exemplo, que compreende sequências de NLS ou NES ou quaisquer outras proteínas de fusão descritas ao longo do presente documento etc) , conforme descrito no presente documento, pode ser associada de maneira covalente ou não covalente ou associada a uma desaminase ou um fragmento funcional da mesma, tal como um fragmento cataliticamente ativo da mesma. A desaminase pode ser uma adenosina desaminase ou uma citidina desaminase, de preferência, qual desaminase for uma desaminase RNA-específica. A desaminase, conforme descrito no presente documento, pode ser uma desaminase truncada ou mutante. Será entendido que sempre que a referência é feita no presente documento à adenosina desaminase, considerações semelhantes à citidina desaminase (e, em vez de desaminar a adenina, a citidina é desaminada).

[625] Em determinados aspectos e modalidades, a invenção se refere a poliácidos nucleicos que codificam tais proteínas de fusão de desaminase Casl3, que podem ser vantajosamente otimizadas por códon (ou codificando

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 483/817 separadamente Casl3 e desaminase no caso de ligação não covalente), assim como vetores e sistemas vetoriais para propagação e/ou expressão, tais como propagação ou expressão procariótica ou eucariótica. Os poliácidos nucleicos exemplificativos, e vetores são descritos ao longo do presente documento.

[626] Em determinados aspectos e modalidades, a invenção se refere a células hospedeiras (ou progênie), órgãos ou organismos (ou a prole da mesma) que compreende as proteínas e/ou polinucleotídeos ou vetores ou sistemas vetoriais descritos acima. As células hospedeiras/órgãos/organismos exemplificativos, assim como sistemas de host cells são descritos ao longo do presente documento.

[627] Em determinados aspectos e modalidades, a invenção se refere a sistemas, complexos ou composições (incluindo kits), tais como composições farmacêuticas que compreendem tais proteínas, poliácidos nucleicos, vetores ou sistemas vetoriais, células hospedeiras, órgãos ou organismos. Os sistemas exemplificativos, complexos ou composições, tais como composições farmacêuticas são descritos ao longo do presente documento. Será entendido que tais sistemas, complexos ou composições podem incluem adicionalmente um RNA-guia, conforme descrito ao longo do presente documento, incluindo qualquer RNA-guia variante

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477/776 (tal como guias escortados, protegidos e mortos etc., incluindo guias que compreendem aptâmeros).

[628] Em determinados aspectos e modalidades, a invenção se refere a usos ou métodos que envolvem o uso de tais proteínas, poliácidos nucleicos, vetores ou sistemas vetoriais, células hospedeiras, órgãos, organismos, sistemas, complexos ou composições. Os métodos e usos exemplificativos são descritos ao longo do presente documento. Em modalidades particulares, os usos e métodos envolvem uma Adenina ou citidina em uma sequência de RNAsalvo de interesse. Em modalidades particulares, os usos ou métodos são terapêuticos ou profiláticos, assim como também descrito ao longo do presente documento. Vantajosamente, os usos e métodos podem envolver edição de base direcionada. Em um aspecto, a invenção descrito no presente documento fornece métodos para modificar um resíduo de adenosina em um locusalvo com o objetivo de remediar e/ou impedir uma afecção com doença que pode ou está propensa a ser causada apor uma mutação pontual G-para-A ou C-para-T ou um polimorfismo de nucleotídeo único patogênico (SNP). As mutações patogênicas G-para-A ou C-para-T/SNPs associadas a várias doenças que afetam o cerébro e o sistema nervoso central são relatados no banco de dados ClinVar. De acordo com a presente invenção, qualquer uma das mutações/SNPs pode ser direcionada.

[629] De modo geral, os sistemas revelados no

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478/776 presente documento compreendem um componente de direcionamento e um componente de edição de base. As funções de componente de direcionamento para direcionar o componente de edição de base para uma sequência de nucleotídeos-alvo na qual um ou mais nucleotídeos devem ser editados. Em seguida, o componente de edição de base pode catalisador uma reação química para converter um primeiro nucleotídeo na sequênciaalvo a um segundo nucleotídeo. Por exemplo, o editor de base pode catalisar a conversão de uma adenina de modo que seja lida como guanina por um maquinário de transcrição ou de tradução de células ou vice-versa. De igual modo, o componente de edição de base pode catalisar a conversão de citidina para uma uracila ou vice-versa. Em determinadas modalidades exemplificativas, o editor de base pode ser derivado pela iniciação com um editor de base conhecido, tal como uma adenina desaminase ou citodina desaminase e modificado com o uso de métodos, tais como evolução direcionada para derivar novas funcionalidades. As técnicas de evolução direcionadas são conhecidas na técnica e podem incluir aqueles descritos no documento n° WO 2015/184016 High-Throughput Assembly of Genetic Permuatations.

[630] Em um aspecto, a invenção se refere a uma proteína (fusão) ou complexo de proteína ou (a) polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) (incluindo vetores e sistemas vetoriais) que codifica tais que compreende (a) uma

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 486/817 proteína Casl3 (mostra) cataliticamente inativa; e (b) uma proteína de (adenosina) desaminase ou o domínio catalítico da mesma; em que a dita proteína de (adenosina) desaminase ou domínio catalítico da mesma é ligada de maneira covalente ou não covalente à dita proteína Casl3 morta ou é adaptada para se ligar à mesma após a entrega. Em determinadas modalidades, a proteína (fusão) ou complexo de proteína podem se ligar ou serem adaptados para se ligarem a uma moléculaguia que compreende uma sequência-guia ligada a uma sequência de repetição direta; em que a molécula-guia forma um complexo com a dita proteína Casl3 morta e direciona o dito complexo para se ligar à dita sequência de RNA-alvo de interesse, em que a dita sequência-guia tem capacidade para hibridização com uma sequência-alvo que compreende a dita Adenina para formar uma duplicação de RNA, em que a dita sequência-guia compreende uma Citosina de não pareamento a uma posição correspondente à dita Adenina que resulta em um meu pareamento A-C na duplicação de RNA formada; em que a dita proteína de (adenosina) desaminase ou domínio catalítico dos mesmos desamina a dita Adenina na dita duplicação de RNA.

[631] Em um aspecto, a invenção se refere a uma composição, complexo ou sistema que compreende (a) uma proteína Casl3 (mostra) cataliticamente inativa; (b) uma molécula-guia que compreende uma sequência-guia ligada a uma sequência de repetição direta; e (c) uma proteína de

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480/776 (adenosina) desaminase ou domínio catalítico da mesma; em que a dita proteína de (adenosina) desaminase ou domínio catalítico da mesma é ligado de maneira covalente ou não covalentemente à dita proteína Casl3 morta ou à dita molécula-guia ou é adaptada para se ligar à mesma após a entrega; em que a molécula-guia forma um complexo com a dita proteína Casl3 morta e direciona o dito complexo para se ligar à dita sequência de RNA-alvo de interesse, em que a dita sequência-guia tem capacidade para hibridizar com uma sequência-alvo que compreende a dita Adenina para formar uma duplicação de RNA, em que a dita sequência-guia compreende uma citosina de não pareamento em uma posição correspondente à dita Adenina que resulta de um meu pareamento de A-C na duplicação de RNA formada; em que a dita proteína de (adenosina) desaminase ou domínio catalítico da mesma desamina a dita Adenina duplicação de RNA. A invenção se refere adicionalmente a um sistema (vetorial) modificado de ocorrência não natural adequado para modificar uma Adenina em um locus-alvo de interesse, que compreende: uma moléculaguia que compreende uma sequência-guia ou uma sequência de nucleotídeos que codifica a molécula-guia; uma proteína de CRISPR-Cas ou uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam a proteína de CRISPR-Cas; uma proteína de (adenosina) desaminase ou domínio catalítico da mesma ou um ou mais sequências de nucleotídeos que codificam; em que a

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481/776 proteína de (adenosina) desaminase ou o domínio catalítico da mesma é ligada de maneira covalente ou não covalente à proteína de CRISPR-Cas ou a molécula-guia ou é adaptada para se ligar à mesma após a entrega; em que a sequência-guia tem capacidade para hibridizar com uma sequência-alvo que compreende uma Adenina dentro de um polinucleotideo de interesse de RNA, porém compreende uma Citosina na posição correspondente à Adenina.

[632] Em um aspecto, a invenção se refere a um sistema vetorial de ocorrência não natural modificada adequada para modificar uma Adenina em um locus-alvo de interesse, que compreende um ou mais vetores que compreendem: (a) um primeiro elemento regulador ligado de maneira operacional a uma sequência de nucleotídeos que codifica a dita molécula-guia que compreende a dita sequência-guia, (b) um segundo elemento regulador ligado de maneira operacional a uma sequência de nucleotídeos que codifica a dita proteína Casl3 cataliticamente inativa; e (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de (adenosina) desaminase ou domínio catalítico da mesma que está sob controle do dito primeiro ou segundo elemento regulador ou ligado de maneira operacional a um terceiro elemento regulador; em que, caso a dita sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de (adenosina) desaminase ou domínio catalítico da mesma seja ligado de maneira operacional a um

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482/776 terceiro elemento regulador, sendo que a dita proteína de (adenosina) desaminase ou domínio catalítico da mesma é adaptado para se ligar à dita molécula-guia ou à dita proteína Casl3 após a expressão; em que os componentes (a), (b) e (c) estão localizados nos mesmos vetores ou em vetores diferentes do sistema.

[633] Em um aspecto, a invenção se refere a um método de modificar uma Adenina em uma sequência de RNA-alvo de interesse. Em modalidades particulares, o método compreende entregar para dito RNA-alvo: (a) uma proteína Casl3 (mostra) cataliticamente inativa; (b) uma moléculaguia que compreende uma sequência-guia ligada a uma sequência de repetição direta; e (c) uma proteína de (adenosina) desaminase ou domínio catalítico da mesma; em que a dita proteína de (adenosina) desaminase ou domínio catalítico da mesma é ligado de maneira covalente ou não covalentemente à dita proteína Casl3 morta ou à dita molécula-guia ou é adaptada para se ligar à mesma após a entrega; em que a molécula-guia forma um complexo com a dita proteína Casl3 morta e direciona o dito complexo para se ligar à dita sequência de RNA-alvo de interesse, em que a dita sequênciaguia tem capacidade para hibridizar com uma sequência-alvo que compreende a dita Adenina para formar uma duplicação de RNA, em que a dita sequência-guia compreende uma citosina de não pareamento em uma posição correspondente à dita Adenina

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483/776 que resulta de um meu pareamento de A-C na duplicação de RNA formada; em que a dita proteína de (adenosina) desaminase ou domínio catalítico da mesma desamina a dita Adenina duplicação de RNA.

[634] A invenção se refere adicionalmente a um método para terapia celular que compreende administrara a um paciente com necessidade do mesmo a célula modificada descrita no presente documento, em que a presença da célula modificada remedia uma doença no paciente. Em uma modalidade, a célula modificada para terapia celular é uma CAR-T célula com capacidade para reconhecer e/ou atacar uma célula tumoral. Em outra modalidade, a célula modificada para terapia celular é uma célula tronco, como uma célula tronco neural, uma célula tronco mesenquimal, uma célula tronco hematopoiética, ou uma célula iPSC.

[635] A invenção também se refere a um método para realizar knockout ou knockdown de uma atividade indesejável de um gene, em que a desaminação do A na transcrição do gene resulta em uma perda de função. Por exemplo, em uma modalidade, a desaminação alvejada pelo sistema de CRISPR funcionalizado por desaminase pode ocasionar uma mutação sem sentido que resulta em um códon de interrupção prematura em um gene endógeno. Isso pode alterar a expressão do gene endógeno e pode levar a um trato desejável na célula editada. Em outra modalidade, a desaminação alvejada pelo sistema de

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CRISPR funcionalizado por desaminase pode ocasionar uma mutação missense não conservativa que resulta em um código para um resíduo de aminoácido diferente em um gene endógeno. Isso pode alterar a função do gene endógeno expressado e também pode levar a um trato desejável na célula editada.

[636] 0 sistema de CRISPR funcionalizado por desaminase descrito no presente documento pode ser usado para alvejar uma Adenina específica dentro de uma sequência de polinucleotídeo de RNA para desaminação. Por exemplo, a molécula guia pode formar um complexo com a proteína CRISPRCas e direciona o complexo para se ligar a uma sequência de RNA alvo no polinucleotídeo de RNA de interesse. Devido ao fato de que a sequência guia é projetada para ter um C de não pareamento, em que o duplex de RNA formado entre a sequência guia e a sequência alvo compreende uma incompatibilidade de A-C, que direciona a (adenosina) desaminase para contato e desaminação do A oposto ao C de não pareamento, que converte o mesmo em uma Inosina (I) . Visto que a base de Inosina (I) faz pareamento com C e funções similares G em processo celular, a desaminação alvejada de A descrita no presente documento é útil para correção de mutações de G-A e C-T indesejáveis, bem como para obter mutações de A-G e T-C desejáveis.

[637] Em determinada modalidade exemplificativa, a proteína Casl3 é Casl3a, Casl3b ou Cas 13c.

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485/776 [638] A proteína de desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma pode ser fundida a terminal C ou N da dita proteína Casl3 exterminada. Em determinadas modalidades exemplificativas, a proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma é fundido à dita proteína Casl3 exterminada por um ligante. 0 ligante pode ser (GGGGS)₃-n, GSG₅ ou LEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTR.

[639] Em determinadas modalidades exemplificativas, a proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma é ligada a uma proteína adaptadora e a dita molécula guia ou a dita proteína Casl3 exterminada compreende uma sequência de aptâmeros com capacidade de se ligar à dita proteína adaptadora. A sequência adaptadora pode ser selecionada dentre MS2, PP7, Qp, F2, GA, fr, JP501, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, Mil, MX1, TW18, VK, SP, EI, ID2, NL95, TW19, AP205, φΟο5, (|)Cb8r, (|)Cbl2r, (|)Cb23r, 7s e PRR1 .

[640] Em determinadas modalidades exemplificativas, a proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma é inserida em uma alça interna da dita proteína Casl3 exterminada. Em determinadas modalidades exemplificativas, a proteína Casl3a compreende uma ou mais mutações nos dois domínios de HEPN, particularmente na posição R474 e R1046 de proteína Cas 13a que se origina de Leptotríchía wadeí ou posições de aminoácido que correspondem às mesmas de um

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486/776 ortólogo de Casl3a.

[641] Em determinadas modalidades exemplificativas, a proteína Cas 13 é uma proteína CaslSb, e a CaslSb compreende uma mutação em uma ou mais dentre as posições R116, H121, R1177, H1182 de proteína CaslSb que se origina de Bergeyella zoohelcum ATCC 43767 ou posições de aminoácido que correspondem às mesmas de um ortólogo de CaslSb. Em determinadas outras modalidades exemplificativas, a mutação é uma ou mais dentre R116A, H121A, R1177A, H1182A de proteína CaslSb que se origina de Bergeyella zoohelcum ATCC 43767 ou posições de aminoácido que correspondem às mesmas de um ortólogo de CaslSb.

[642] Em determinadas modalidades exemplificativas, a sequência guia tem um comprimento de cerca de 29 a 53 nt com capacidade de formar o dito duplex de RNA com a dita sequência alvo. Em determinadas outras modalidades exemplificativas, a sequência guia tem um comprimento de cerca de 40 a 50 nt com capacidade de formar o dito duplex de RNA com a dita sequência alvo. Em determinadas modalidades exemplificativas, a distância entre o dito C de não pareamento e a extremidade 5' da dita sequência guia tem 20 a 30 nucleotídeos.

[643] Em determinadas modalidades exemplificativas, a proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma é uma proteína desaminase (adenosina) humana,

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487/776 cefalópode ou Drosphila ou domínio catalítico da mesma. Em determinadas modalidades exemplificativas, a proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma foi modificada para compreender uma mutação em ácido glutâmico⁴⁸⁸ da sequência de aminoácidos de hADAR2-D, ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em determinadas modalidades exemplificativas, o resíduo de ácido glutâmico pode estar na posição 488 ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga é substituído por um resíduo de glutamina (E488Q).

[644] Em determinadas outras modalidades exemplificativas, a proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma é um hADAR2d mutado que compreende mutação E488Q ou um hADARld mutado que compreende mutação E1008Q.

[645] Em determinadas modalidades exemplificativas, a sequência guia compreende mais de uma incompatibilidade que corresponde a sítios de adenosina diferentes na sequência de RNA alvo ou em que duas moléculas guia são usadas, em que cada uma compreende uma incompatibilidade que corresponde a sítios de adenosina diferentes na sequência de RNA alvo.

[646] Em determinadas modalidades exemplificativas, a proteína Casl3 e opcionalmente a dita proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma compreende um ou mais sinais de localização nuclear de heterólogo (NLS(s)).

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488/776 [647] Em determinadas modalidades exemplificativas, o método compreende ainda, determinar a sequência alvo de interesse e selecionar uma proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma que desamina de modo mais eficaz a dita Adenina presente na, então, sequência alvo.

[648] A sequência de RNA alvo de interesse pode estar dentro de uma célula. A célula pode ser uma célula eucariótica, uma célula de animal não humano, uma célula humana, uma célula de planta. 0 locus alvo de interesse pode estar dentro de um animal ou planta.

[649] A sequência de RNA alvo de interesse pode compreender um polinucleotídeo de RNA in vitro.

[650] Os componentes dos sistemas descritos no presente documento podem ser distribuídos para a dita célula como um complexo de ribonucleoproteína ou como uma ou mais moléculas de polinucleotídeo, ou qualquer outro método de distribuição, conforme descrito no presente documento em outro local, incluindo distribuição viral ou não viral. A uma ou mais moléculas de polinucleotídeo podem compreender uma ou mais moléculas de mRNA que codificam os componentes. A uma ou mais moléculas de polinucleotídeo podem ser compreendidas dentro de um ou mais vetores. A uma ou mais moléculas de polinucleotídeo podem compreender ainda um ou mais elementos reguladores configurados de modo operável para expressar a dita proteína Casl3, a dita molécula guia

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489/776 e a dita proteína de desaminase ou domínio catalítico da mesma, opcionalmente em que o dito um ou mais elementos reguladores compreendem promotores induzíveis. A um ou mais moléculas de polinucleotídeo ou o dito complexo de ribonucleoproteína podem ser distribuídos por meio de partículas, vesículas ou um ou mais vetores virais. As partículas podem compreender um lipídio, um açúcar, um metal ou uma proteína. As partículas podem compreender nanopartícuias de lipídio. As vesículas podem compreender exossomos ou lipossomos. 0 um ou mais vetores virais podem compreender um ou mais dentre adenovirus, um ou mais lentivírus ou um ou mais vírus associado a adeno.

[651] Os métodos revelados no presente documento podem ser usados para modificar uma célula, uma linhagem celular ou um organismo por manipulação de uma ou mais sequências de RNA alvo.

[652] Em determinadas modalidades exemplificativas, a desaminação da dita Adenina no dito RNA de interesse alvo remedia uma doença ocasionada por transcrições que contêm uma mutação de ponto patogênico G^A ou C^T.

[653] Os métodos podem ser usados para tratar ou prevenir uma doença ou, de outro modo, atenuar uma doença ou a gravidade de uma doença, como, em particular, pela desaminação alvejada com o uso do sistema de CRISPR funcionalizado por desaminase, em que a desaminação do A,

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490/776 que remedia uma doença ocasionada por transcrições contém uma mutação de ponto patogênico G^A ou C^T. Em determinadas modalidades exemplificativas, a doença é selecionada dentre síndrome de Meier-Gorlin, síndrome de Seckel 4, síndrome de Joubert 5, amaurose congênita de Leber 10; doença de CharcotMarie-Tooth, tipo 2; doença de Charcot-Marie-Tooth, tipo 2; síndrome de Usher, tipo 2C; ataxia espinocerebelar 28; ataxia espinocerebelar 28; ataxia espinocerebelar 28; síndrome de QT Longo 2; síndrome de Sjõgren-Larsson; fructosuria hereditária; fructosuria hereditária; Neuroblastoma; Neuroblastoma; síndrome de Kallmann 1; síndrome de Kallmann 1; síndrome de Kallmann 1; leucodistrofia metacromática, síndrome de Rett, esclerose lateral amiotrófica tipo 10, síndrome de Li-Fraumeni. A doença pode ser uma doença de terminação prematura.

[654] Os métodos revelados no presente documento, podem ser usados para realizar uma modificação que afeta a fertilidade de um organismo. A modificação pode afetar splicing da dita sequência de RNA alvo. A modificação pode introduzir uma mutação em uma transcrição que introduz uma alteração de aminoácido e ocasiona a expressão de um novo antígeno em uma célula cancerígena.

[655] Em determinadas modalidades exemplificativas, o RNA alvo pode ser um microRNA ou compreendido dentro de um microRNA. Em determinadas modalidades exemplificativas, a

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491/776 desaminação da dita Adenina no dito RNA alvo de interesse ocasiona um ganho de função ou uma perda de função de um gene. Em determinadas modalidades exemplificativas, o gene é um gene expressado por uma célula cancerígena.

[656] Em outro aspecto, a invenção compreende uma célula modificada ou progênie da mesma que é obtida com o uso dos métodos revelados no presente documento, em que a dita célula compreende uma hipoxantina ou uma guanina na substituição da dita Adenina no dito RNA de interesse alvo em comparação com uma célula correspondente não submetida ao método. A célula modificada ou progênie da mesma pode ser uma célula eucariótica, uma célula animal, uma célula humana, uma célula terapêutica T, uma célula B de produção de anticorpo, uma célula de planta.

[657] Em outro aspecto, a invenção compreende um animal não humano que compreende a dita célula modificada ou progênie da mesma. A modificada pode ser uma célula de planta.

[658] Em outro aspecto, a invenção compreende um método para terapia celular, que compreende administrar a um paciente que necessita das mesmas as células modificadas reveladas no presente documento, em que a presença da dita célula modificada remedia uma doença no paciente.

[659] Em outro aspecto, a invenção é direcionada a um sistema de ocorrência não natural, geneticamente

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492/776 modificado adequado para modificar uma Adenina em um locus de interesse alvo, que compreende A) uma molécula guia que compreende uma sequência guia ligada a uma sequência de repetição direta, ou uma sequência de nucleotídeos que codifica a dita molécula guia; B) uma proteína Casl3 cataliticamente inativa, ou uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína Casl3 cataliticamente inativa; C) uma proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma, ou uma sequência de nucleotídeos que codifica a dita proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma; em que a dita proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma é covalente ou não covalentemente ligada à dita proteína Casl3 ou à dita molécula guia ou é adaptada para se ligar na mesma após a distribuição; em que a dita sequência guia tem capacidade de hibridizar com uma sequência de RNA alvo que compreende uma Adenina para formar um duplex de RNA, em que a dita sequência guia compreende uma Citosina de não pareamento em uma posição que corresponde à dita Adenina que resulta em uma incompatibilidade de A-C no duplex de RNA formado.

[660] Em outro aspecto, a invenção é direcionada a um sistema de vetor de ocorrência não natural, geneticamente modificado adequado para modificar uma Adenina em um locus de interesse alvo, que compreende as sequências nucleotídeos de a), b) e ca

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493/776 [661] Em outro aspecto, a invenção é direcionada a um sistema de vetor de ocorrência não natural, geneticamente modificado, que compreende um ou mais vetores que compreendem: um primeiro elemento regulador ligado de modo operável a uma sequência de nucleotídeos que codifica a dita molécula guia que compreende a dita sequência guia, em que um segundo elemento regulador ligado de modo operável a uma sequência de nucleotídeos codifica a dita proteína Casl3 cataliticamente inativa; e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma está sob o controle do dito primeiro ou segundo elementos reguladores ou ligados de modo operacional a um terceiro elemento regulador; em que, se a dita sequência de nucleotídeos codificar uma proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma é ligado de modo operável a um terceiro elemento regulador, em que a dita proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma é adaptar para se ligar à dita molécula guia ou à dita proteína Casl3 após a expressão; em que componentes A) , B) e C) estão localizados no mesmo vetor ou em vetores diferentes do sistema.

[662] Em outro aspecto, a invenção é direcionada a célula hospedeira in vitro ou ex vivo ou progênie da mesma ou linhagem celular ou progênie da mesma que compreende os sistemas revelados no presente documento. A célula

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4°>4/ΊΊ6 hospedeira ou progênie da mesma pode ser a uma célula eucariótica, uma célula animal, uma célula humana ou uma célula de planta.

[663] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para desaminação alvejada de adenina em RNA, mais particularmente, em uma sequência de interesse de RNA. De acordo com os métodos da invenção, a proteína (adenosina) desaminase (AD) é recrutada especificamente para a Adenina relevante na sequência de interesse de RNA por um complexo CRISPR-Cas que pode se ligar especificamente a uma sequência alvo. A fim de alcançar o mesmo, a proteína desaminase (adenosina) pode ou ser covalentemente ligada à enzima CRISPR-Cas ou ser fornecida como uma proteína separada, mas adaptada, de modo a garantir recrutamento da mesma para o complexo de CRISPR-Cas.

[664] Em modalidades particulares, dos métodos da presente invenção, o recrutamento da (adenosina) desaminase para o locus alvo é garantido fundindo-se a (adenosina) desaminase ou domínio catalítico da mesma à proteína CRISPRCas, que é uma proteína Casl3. Métodos de gerar uma proteína de fusão a partir de duas proteínas separadas são conhecidos na técnica e envolvem tipicamente o uso de espaçadores ou ligantes. A proteína Casl3 pode ser fundida à proteína desaminase (adenosina) ou domínio catalítico da mesma ou na extremidade terminal C ou N da mesma. Em modalidades

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495/776 particulares, a proteína CRISPR-Cas é uma proteína Casl3 inativa ou exterminada e é ligada ao terminal N da proteína desaminase ou seu domínio catalítico.

[665] o termo adenosina desaminase ou proteína adenosina desaminase, conforme usado no presente documento, se refere a uma proteína, um polipeptídeo ou um ou mais domínios funcionais de uma proteína ou um polipeptídeo que tem capacidade de catalisar uma reação de desaminação hidrolítica que converte uma adenina (ou uma porção química de adenina de uma molécula) para uma hipoxantina (ou uma porção química de hipoxantina de uma molécula) , como mostrado abaixo. Em algumas modalidades, a molécula que contém adenina é uma adenosina (A), e a molécula que contém hipoxantina é uma inosina (I). A molécula que contém adenina pode ser ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA).

Adenina Hipoxantina [666] De acordo com a presente revelação, adenosina deaminases que pode ser usada na conexão com a presente revelação incluir, porém, sem limitação, membros da família de enzima conhecida como adenosina deaminases que atua sobre RNA (ADARs), membros da família de enzima conhecida como

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496/776 adenosina deaminases que atua sobre tRNA (ADATs), e outros membros de família que contêm domínio de adenosina desaminase. De acordo com a presente revelação, a adenosina desaminase tem capacidade de alvejar adenina em um RNA/DNA e duplexes de RNA. De fato, Zheng et al. (Nucleic Acids Res. 2017, 45(6): 3369-3377) demonstra que ADARs podem variar adenosina para inosina, editando reações em RNA/DNA e duplexes de RNA/RNA. Em modalidades particulares, a adenosina desaminase foi modificada para aumentar sua capacidade de editar DNA em um duplex de RNA RNA/DNAn, como detalhado no presente documento abaixo.

[667] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase é derivada de uma ou mais espécies de metazoa, incluindo, porém, sem limitação, mamíferos, aves, sapos, lulas, peixe, moscas e minhocas. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase é uma adenosina desaminase humana, de lula ou Drosophila.

[668] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase é uma ADAR humana, incluindo hADARl, hADAR2, hADAR3. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase é uma proteína ADAR de Caenorhabditis elegans, incluindo ADR-1 e ADR-2. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase é uma proteína ADAR de Drosophila, incluindo dAdar. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase é uma proteína de ADAR Loligo pealeii de lula, incluindo sqADAR2a e sqADAR2b. Em

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497/776 algumas modalidades, a adenosina desaminase é uma proteína ADAT humana. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase é uma proteína ADAT Drosophila. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase é uma proteína ADAD humana, incluindo TENR (hADADl) e TENRL (hADAD2).

[669] Em algumas modalidades, a proteína adenosina desaminase reconhece e converte um ou mais resíduos de adenosina alvo em um substrato de ácido nucleico de fita dupla em resíduo (ou resíduos) de inosina. Em algumas modalidades, o substrato de ácido nucleico de fita dupla é um duplex híbrido de RNA-DNA. Em algumas modalidades, a proteína adenosina desaminase reconhece uma janela de ligação no substrato de fita dupla. Em algumas modalidades, a janela de ligação contém pelo menos um resíduo (ou resíduos) de adenosina alvo. Em algumas modalidades, a janela de ligação está na faixa de cerca de 3 pares de bases a cerca de 100 pares de bases. Em algumas modalidades, a janela de ligação está na faixa de cerca de 5 pares de bases a cerca de 50 pares de bases. Em algumas modalidades, a janela de ligação está na faixa de cerca de 10 pares de bases a cerca de 30 pares de bases. Em algumas modalidades, a janela de ligação é cerca de 1 par de bases, 2 pares de bases, 3 pares

de bases,	5 pares <	de bases,	7	pares	de	bases,	10	pares	de
bases,	15	pares	de	bases,	20	pares	de	bases,	25	pares	de
bases,	30	pares	de	bases,	40	pares	de	bases,	45	pares	de

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498/776

bases,	50	pares	de	bases,	55	pares	de	bases,	60	pares	de
bases,	65	pares	de	bases,	70	pares	de	bases,	75	pares	de
bases,	80	pares	de	bases,	85	pares	de	bases,	90	pares	de
bases,	95	pares	de	bases ou	100 pares	: de	bases.

[670] Em algumas modalidades, a proteína adenosina desaminase compreende um ou mais domínios de desaminase. Sem pretender estar limitado pela teoria, é contemplado que o domínio de desaminase funciona para reconhecer e converter um ou mais resíduos de adenosina (A) alvo contidos em um substrato de ácido nucleico de fita dupla em resíduo (ou resíduos) de inosina (I). Em algumas modalidades, o domínio de desaminase compreende um centro ativo. Em algumas modalidades, o centro ativo compreende um íon de zinco. Em algumas modalidades, durante o processo de edição A-a-I, pareamento de base no resíduo de adenosina alvo é interrompido, e o resíduo de adenosina alvo é invertido do hélix duplo para se tornar acessível pela adenosina desaminase. Em algumas modalidades, resíduos de aminoácido em ou próximos ao centro ativo interagem com um ou mais nucleotídeo (ou nucleotídeos) 5' para um resíduo de adenosina alvo. Em algumas modalidades, resíduos de aminoácido em ou próximos ao centro ativo interagem com um ou mais nucleotídeo (ou nucleotídeos) 3' para um resíduo de adenosina alvo. Em algumas modalidades, resíduos de aminoácido em ou próximos ao centro ativo interragem ainda com o nucleotídeo

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499/776 complementar ao resíduo de adenosina alvo na fita oposta. Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácido formam ligações de hidrogênio com o grupo hidroxila 2' dos nucleotídeos.

[671] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende proteína ADAR2 humana completa (hADAR2) ou o domínio de desaminase da mesma (hADAR2-D). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase é um membro da família de ADAR que é homólogo a hADAR2 ou hADAR2-D.

[672] Particularmente, em algumas modalidades, a proteína ADAR homóloga é ADAR1 humana (hADARl) ou o domínio de desaminase da mesma (hADARl-D). Em algumas modalidades, glicina 1007 de hADARl-D corresponde à glicina 487 hADAR2D, e ácido glutâmico 1008 de hADARl-D corresponde a ácido glutâmico 488 de hADAR2-D.

[673] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a sequência de aminoácidos do tipo selvagem de hADAR2-D. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende uma ou mais mutações na sequência de hADAR2-D, de modo que a eficiência de edição e/ou preferência de edição de substrato de hADAR2-D sejam alteradas de acordo com as necessidades específicas.

[674] Determinadas mutações das proteínas hADARl e hADAR2 foram descritos em Kuttan et al., Proc Natl Acad Sei USA. (2012) 109(48):E3295 a 304; Want et al. ACS Chem Biol.

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500/776 (2015) 10(11):2.512 a 9; e Zheng et al. Nucleic Acids Res. (2017) 45(6):3.369 a 337, dentre os quais cad um é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[675] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação na glicina336 da sequência de aminoácidos de hADAR2-D ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em algumas modalidades, o resíduo de glicina na posição 336 é substituído por um resíduo de ácido aspártico (G336D).

[676] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação na Glicina487 da sequência de aminoácidos de hADAR2-D ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em algumas modalidades, o resíduo de glicina na posição 487 é substituído por um resíduo de aminoácido não polar com cadeias laterais relativamente pequenas. Por exemplo, em algumas modalidades, o resíduo de glicina na posição 487 é substituído por um resíduo de alanina (G487A). Em algumas modalidades, o resíduo de glicina na posição 487 é substituído por um resíduo de valina (G487V). Em algumas modalidades, o resíduo de glicina na posição 487 é substituído por um resíduo de aminoácido com cadeias laterais relativamente grandes. Em algumas modalidades, o resíduo de glicina na posição 487 é substituído por um resíduo de arginina (G487R). Em algumas

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501/776

modalidades,	o	resíduo	de	glicina	na posição	487	é
substituído	por	um resíduo de lisina	(G487K). Em	algumas
modalidades,	o	resíduo	de	glicina	na posição	487	é
substituído	por	um resíduo	de	triptofano	(G487W). Em	algumas
modalidades,	o	resíduo	de	glicina	na posição	487	é
substituído	por	um resíduo	de	tirosina	(G487Y).

[677] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação na ácido glutâmico488 da sequência de aminoácidos de hADAR2-D ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 488 é substituído por um resíduo de glutamina (E488Q). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 488 é substituído por um resíduo de histidina (E488H). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 488 é substituído por um resíduo de arginina (E488R). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 488 é substituído por um resíduo de lisina (E488K). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 488 é substituído por um resíduo de asparagina (E488N). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 488 é substituído por um resíduo de alanina (E488A). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 488 é substituído por um resíduo de metionina (E488M). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 488 é

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502/776 substituído por um resíduo de serina (E488S). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 488 é substituído por um resíduo de fenilalanina (E488F). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 488 é substituído por um resíduo de lisina (E488L) . Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 488 é substituído por um resíduo de triptofano (E488W).

[678] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação na treonina490 da sequência de aminoácidos de hADAR2-D ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em algumas modalidades, o resíduo de treonina na posição 490 é substituído por um resíduo de cisteína (T490C) . Em algumas modalidades, o resíduo de treonina na posição 490 é substituído por um resíduo de serina (T490S). Em algumas modalidades, o resíduo de treonina na posição 490 é substituído por um resíduo de alanina (T490A). Em algumas modalidades, o resíduo de treonina na posição 490 é substituído por um resíduo de fenilalanina (T490F). Em algumas modalidades, o resíduo de treonina na posição 490 é substituído por um resíduo de tirosina (T490Y). Em algumas modalidades, o resíduo de treonina na posição 490 é substituído por um resíduo de serina (T490R). Em algumas modalidades, o resíduo de treonina na posição 490 é substituído por um resíduo de alanina (T490K). Em algumas modalidades, o resíduo de treonina na posição 490 é

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503/776 substituído por um resíduo de fenilalanina (T490P). Em algumas modalidades, o resíduo de treonina na posição 490 é substituído por um resíduo de tirosina (T490E).

[679] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação na valina493 da sequência de aminoácidos de hADAR2-D ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em algumas modalidades, o resíduo de valina na posição 493 é substituído por um resíduo de alanina (V493A). Em algumas modalidades, o resíduo de valina na posição 493 é substituído por um resíduo de serina (V493S). Em algumas modalidades, o resíduo de valina na posição 493 é substituído por um resíduo de treonina (V493T). Em algumas modalidades, o resíduo de valina na posição 493 é substituído por um resíduo de arginina (V493R). Em algumas modalidades, o resíduo de valina na posição 493 é substituído por um resíduo de ácido aspártico (V493D). Em algumas modalidades, o resíduo de valina na posição 493 é substituído por um resíduo de prolina (V493P). Em algumas modalidades, o resíduo de valina na posição 493 é substituído por um resíduo de glicina (V493G).

[680] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação na alanina589 da sequência de aminoácidos de hADAR2-D ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em algumas modalidades, o resíduo de alanina na posição 589 é substituído por um resíduo de

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504/776 valina (A589V).

[681] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação na asparagina597 da sequência de aminoácidos de hADAR2-D ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em algumas modalidades, o resíduo de asparagina na posição 597 é substituído por um resíduo de lisina (N597K). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende uma mutação na posição 597 da sequência de aminoácidos, que tem um resíduo de asparagina na sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o resíduo de asparagina na posição 597 é substituído por um resíduo de arginina (N597R). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende uma mutação na posição 597 da sequência de aminoácidos, que tem um resíduo de asparagina na sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o resíduo de asparagina na posição 597 é substituído por um resíduo de alanina (N597A). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende uma mutação na posição 597 da sequência de aminoácidos, que tem um resíduo de asparagina na sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o resíduo de asparagina na posição 597 é substituído por um resíduo de ácido glutâmico (N597E). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende uma mutação na posição 597 da sequência de aminoácidos, que tem um resíduo de asparagina na sequência do tipo selvagem. Em

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505/776 algumas modalidades, o resíduo de asparagina na posição 597 é substituído por um resíduo de histidina (N597H). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende uma mutação na posição 597 da sequência de aminoácidos, que tem um resíduo de asparagina na sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o resíduo de asparagina na posição 597 é substituído por um resíduo de glicina (N597G). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende uma mutação na posição 597 da sequência de aminoácidos, que tem um resíduo de asparagina na sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o resíduo de asparagina na posição 597 é substituído por um resíduo de tirosina (N597Y). Em algumas modalidades, o resíduo de asparagina na posição 597 é substituído por um resíduo de fenilalanina (N597F).

[682] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação na serina599 da sequência de aminoácidos de hADAR2-D ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em algumas modalidades, o resíduo de serina na posição 599 é substituído por um resíduo de treonina (S599T).

[683] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação na asparagina613 da sequência de aminoácidos de hADAR2-D ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em algumas modalidades, o resíduo de asparagina na posição 613 é

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506/776 substituído por um resíduo de lisina (N613K). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende uma mutação na posição 613 da sequência de aminoácidos, que tem um resíduo de asparagina na sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o resíduo de asparagina na posição 613 é substituído por um resíduo de arginina (N613R). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende uma mutação na posição 613 da sequência de aminoácidos, que tem um resíduo de asparagina na sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o resíduo de asparagina na posição 613 é substituído por um resíduo de alanina (N613A). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende uma mutação na posição 613 da sequência de aminoácidos, que tem um resíduo de asparagina na sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o resíduo de asparagina na posição 613 é substituído por um resíduo de ácido glutâmico (N613E).

[684] Em algumas modalidades, para melhorar a eficiência de edição, a adenosina desaminase pode compreender uma ou mais das mutações: G336D, G487A, G487V,

E488Q,	E488H,	E488R,	E488N,	E488A,	E488S,	E488M,	T490C,
T490S,	V493T,	V493S,	V4 93A,	V493R,	V493D,	V493P,	V493G,
N597K,	N597R,	N597A,	N597E,	N597H,	N597G,	N597Y,	A589V,
S599T,	N613K,	N613R,	N613A, N613E, com base	nas posi	ções de
sequência de	aminoác	idos de	hADAR2-	D, e mutações	em uma

proteína ADAR homóloga que correspondem às anteriores.

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507/776 [685] Em algumas modalidades, para reduzir a eficiência de edição, a adenosina desaminase pode compreender uma ou mais das mutações: E488F, E488L, E488W, T490A, T490F, T490Y, T490R, T490K, T490P, T490E, N597F, com base nas posições de sequência de aminoácidos de hADAR2-D, e mutações em uma proteína ADAR homóloga que correspondem às anteriores. Em modalidades particulares, pode ser interessante usar uma enzima adenosina desaminase com eficácia reduzida para reduzir efeitos fora do alvo.

[686] Em determinadas modalidades, o aprimoramento da edição e da redução de modificação fora do alvo é obtido por modificação química de gRNAs. Os gRNAs que são quimicamente modificados conforme exemplificado em Vogei et ai. (2014), Angew Chem Int Ed, 53:6267-6271, doi:10.1002/anie.201402634 (incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade) reduzem a atividade fora do alvo e aprimoram eficiência no alvo. RNAs-guia modificados por 2'-O-metila e fosfotioato aprimoram de modo geral a eficiência de edição em células.

[687] Sabe-se que o ADAR demonstra uma preferência para nucleotídeos vizinhos em qualquer lado do A editado (www. nature.com/nsmb/j ournal/v2 3/n5/full/nsmb.32 03.html,

Matthews et ai. (2017), Nature Structural Mol Biol, 23(5): 426 a 433, incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade). Consequentemente, em

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508/776 determinadas modalidades, o gRNA, o alvo e/ou o ADAR são selecionados otimizados para preferência de motivo.

[688] Demonstrou-se in vitro que os maus pareamentos intencionais permitem a edição de motivos não preferenciais (https ://academic .oup. com/nar/articlelookup/doi/10.1093/nar/gku272; Schneider et al (2014), Nucleic Acid Res, 42(10):e87); Fukuda et al. (2017), Scienticic Reports, 7, doi:10.1038/srep41478, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Consequentemente, em determinadas modalidades, a fim de aperfeiçoar a eficiência da edição de RNA em bases vizinhas não preferenciais 5' ou 3' , são introduzidos maus pareamentos intencionais em bases vizinhas.

[689] Os resultados sugerem que Cs opostos a As na janela de direcionamento do domínio de desaminase ADAR sejam editados preferencialmente em relação a outras bases. Adicionalmente, base de As pareada com Us dentro de algumas bases da base direcionada mostra baixos níveis de edição por fusões de Casl3b-ADAR, o que seguere que há flexibilidade para que a enzima edite mutliplos As. Consultar, por exemplo, a Figura 18. Essas duas observações sugerem que múltiplos As na janela de atividade das fusões de Casl3b-ADAR podem ser especificadas para editar por mau pareamento de todos os As para serem editados com Cs. Consequentemente, em determinadas modalidades, múltiplos mau pareamentos A:C na

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509/776 janela de atividade são projetados para criar múltiplas edições A:I. Em determinadas modalidades, a fim de suprimir edição fora de alvo potencial na janela de atividade, os As não direcionados são pareados com As ou Gs.

[690] Os termos especificidade de edição e preferência de edição são usados de maneira intercambiável no presente documento para se referir á extensão da edição de A-a-I em um sítio de adenosina particular em um substrato dupla fita. Em algumas modalidades, a preferência de edição de substrato é determinada pelo vizinho mais próximo 5' e/ou o vizinho mais próximo 3' do resíduo de adenosina alvo. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase tem preferências para o vizinho mais próximo 5' do substrato classificado como U>A>C>G (> indica maior preferência). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase tem preferências para o vizinho mais próximo 3' do substrato classificado como G>C~A>U (> indica maior preferência; ~ indica preferência similar). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase tem preferências para o vizinho mais próximo 3' do substrato classificado como G>C>U~A (> indica maior preferência; ~ indica preferência similar). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase tem preferências para o vizinho mais próximo 3' do substrato classificado como G>C>A>U (> indica maior preferência). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase tem preferências para o

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510/776 vizinho mais próximo 3' do substrato classificado como C~G~A>U (> indica maior preferência; indica preferência similar). Em algumas modalidades, a adenosina desaminase têm preferência para uma sequência de tripleto que contém o resíduo de adenosina alvo classificado como TAG>AAG>CAC>AAT>GAA>GAC (> indica maior preferência), o centro A sendo o resíduo de adenosina alvo.

[691] Em algumas modalidades, a preferência de edição de substrato de uma adenosina desaminase é afetada pela presença ou ausência de um domínio de ligação de ácido nucleico na proteína adenosina desaminase. Em algumas modalidades, para modificar a preferência de edição de substrato, o domínio de desaminase é conectado com um domínio de ligação de RNA de fita dupla (dsRBD) ou um motivo de ligação de RNA de fita dupla (dsRBM). Em algumas modalidades, o dsRBD ou dsRBM pode ser derivado de uma proteína ADAR, tal como hADARl ou hADAR2. Em algumas modalidades, uma proteína ADAR de comprimento completo que compreende pelo menos um dsRBD e um domínio de desaminase é usada. Em algumas modalidades, o um ou mais dsRBM ou dsRBD estão no terminal N do domínio de desaminase. Em outras modalidades, o um ou mais dsRBM ou dsRBD estão no terminal C do domínio de desaminase.

[692] Em algumas modalidades, a preferência de edição de substrato de uma adenosina desaminase é afetada

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511/776 por resíduos de aminoácido próximos ao ou no centro ativo da enzima. Em algumas modalidades, para modificar a preferência de edição de substrato, a adenosina desaminase pode compreender uma ou mais das mutações: G336D, G487R, G487K, G487W, G487Y, E488Q, E488N, T490A, V493A, V493T, V493S, N597K, N597R, A589V, S599T, N613K, N613R, com base nas posições de sequência de aminoácidos de hADAR2-D, e mutações em uma proteína ADAR homóloga que correspondem às anteriores.

[693] Particularmente, em algumas modalidades, para reduzir a especificidade de edição, a adenosina desaminase pode compreender uma ou mais das mutações E488Q, V493A, N597K, N613K, com base nas posições de sequência de aminoácidos de hADAR2-D, e mutações em uma proteína ADAR homóloga que correspondem às anteriores. Em algumas modalidades, para aumentar a especificidade de edição, a adenosina desaminase pode compreender a mutação T490A.

[694] Em algumas modalidades, para reduzir os efeitos fora de alvo, a adenosina desaminase compreende uma ou mais das mutações em R348, V351, T375, K376, E396, C451, R455, N473, R474, K475, R477, R481, S486, E488, T490, S495, R510, com base nas posições de sequência de aminoácidos de hADAR2-D, e mutações em uma proteína ADAR homóloga que correspondem às anteriores. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende mutação em E488 e um ou mais posições adicionais selecionadas dentre R348, V351, T375,

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K376, E396, C451, R455, N473, R474, K475, R477, R481, S486, T490, S495, R510. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende mutação em T375 e opcionalmente em uma ou mais posições adicionais. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende mutação em N473 e opcionalmente em uma ou mais posições adicionais. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende mutação em V351 e opcionalmente em uma ou mais posições adicionais. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende mutação em E488 e T375 e opcionalmente em uma ou mais posições adicionais. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende mutação em E488 e N473 e opcionalmente em uma ou mais posições adicionais. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende mutação E488 e V351 e opcionalmente em uma ou mais posições adicionais. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende mutação em E488 e uma ou mais dentre T375, N473 e V351.

[695] Em algumas modalidades, para reduzir os efeitos fora de alvo, a adenosina desaminase compreende uma ou mais das mutações selecionadas dentre R348E, V351L, T375G, T375S, R455G, R455S, R455E, N473D, R474E, K475Q, R477E, R481E, S486T, E488Q, T490A, T490S, S495T, e R510E, b com base nas posições de sequência de aminoácidos de hADAR2-D, e mutações em uma proteína ADAR homóloga que correspondem às anteriores. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase

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513/776 compreende mutação E488Q e uma ou mais mutações adicionais selecionadas dentre R348E, V351L, T375G, T375S, R455G, R455S, R455E, N473D, R474E, K475Q, R477E, R481E, S486T, T490A, T490S, S495T e R510E. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação T375G ou T375S e opcionalmente uma ou mais additional mutações. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação N473D e opcionalmente uma ou mais additional mutações. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação V351L e opcionalmente uma ou mais additional mutações. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação E488Q e T375G ou T375G e opcionalmente uma ou mais additional mutações. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação E488Q e N473D e opcionalmente uma ou mais additional mutações. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação E488Q e V351L e opcionalmente uma ou mais additional mutações. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação E488Q e uma ou mais dentre T375G/S,

N473D e V351L.

[696] Em algumas modalidades, para aumentar a preferência de edição para adenosina-alvo (A) com uma G 5' imediata, tal como substratos que compreendem a sequência de tripleto GAC, o centro A sendo o resíduo de adenosina alvo, a adenosina desaminase pode compreender uma ou mais das

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514/776 mutações G336D, E488Q, E488N, V493T, V493S, V493A, A589V, N597K, N597R, S599T, N613K, N613R, com base nas posições de sequência de aminoácidos de hADAR2-D, e mutações em uma proteína ADAR homóloga que correspondem às anteriores.

[697] Particularmente, em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação E488Q ou uma mutação correspondente em uma proteína ADAR homóloga para editar substratos que compreendem as seguintes sequências de tripleto: GAC, GAA, GAU, GAG, GAU, AAU, UAC, o centro A sendo o resíduo de adenosina alvo.

[698] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a sequência de aminoácidos do tipo selvagem de hADARl-D. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende uma ou mais mutações na sequência de hADARl-D, de modo que a eficiência de edição e/ou preferência de edição de substrato de hADARl-D sejam alteradas de acordo com as necessidades específicas.

[699] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação na Glicinal007 da sequência de aminoácidos de hADARl-D ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em algumas modalidades, o resíduo de glicina na posição 1007 é substituído por um resíduo de aminoácido não polar com cadeias laterais relativamente pequenas. Por exemplo, em algumas modalidades, o resíduo de glicina na posição 1007 é substituído por um resíduo de

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515/776 alanina (G1007A) . Em algumas modalidades, o resíduo de glicina na posição 1007 é substituído por um resíduo de valina (G1007V) . Em algumas modalidades, o resíduo de glicina na posição 1007 é substituído por um resíduo de aminoácido

com cadeias	laterais relativamente	grandes. Em	algumas
modalidades,	o	resíduo	de	glicina	na posição	1007 é
substituído	por	um resíduo	> de arginina	(G1007R). Em	algumas
modalidades,	o	resíduo	de	glicina	na posição	1007 é
substituído	por	um resíduo <	de lisina	(G1007K). Em	algumas
modalidades,	o	resíduo	de	glicina	na posição	1007 é
substituído	por	um resíduo	de	triptofano (G1007W). Em	algumas
modalidades,	o	resíduo	de	glicina	na posição	1007 é

substituído por um resíduo de tirosina (G1007Y). Adicionalmente, em outras modalidades, o resíduo de glicina na posição 1007 é substituído por um resíduo de leucina

(G1007L)	. Em	outras	modalidades,	o	resíduo de	glicina na
posição	1007	é sub	stituído por	um	resíduo	de treonina
(G1007T)	. Em	outras	modalidades,	o	resíduo de	glicina na

posição 1007 é substituído por um resíduo de serina (G1007S).

[700] Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende a mutação na ácido glutâmicol008 da sequência de aminoácidos de hADARl-D ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de aminoácido polar que tem uma

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516/776 cadeia lateral relativamente grande. Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de glutamina (E1008Q). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de histidina (E1008H). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de arginina (E1008R). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de lisina (E1008K). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de aminoácido polar pegueno ou não polar. Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de fenilalanina (E1008F). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de triptofano (E1008W). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de glicina (E1008G). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de isoleucina (E1008I) . Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de valina (E1008V). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de prolina (E1008P). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo

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517/776 de serina (E1008S) . Em outras modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de asparagina (E1008N). Em outras modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de alanina (E1008A). Em outras modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de metionina (E1008M). Em algumas modalidades, o resíduo de ácido glutâmico na posição 1008 é substituído por um resíduo de leucina (E1008L).

[701] Em algumas modalidades, para melhorar a eficiência de edição, a adenosina desaminase pode compreender uma ou mais das mutações: E1007S, E1007A, E1007V, E1008Q, E1008R, E1008H, E1008M, E1008N, E1008K, com base nas posições de sequência de aminoácidos de hADARl-D, e mutações em uma proteína ADAR homóloga que correspondem às anteriores.

[702] Em algumas modalidades, para reduzir a eficiência de edição, a adenosina desaminase pode compreender uma ou mais das mutações: E1007R, E1007K, E1007Y, E1007L, E1007T, E1008G, E1008I, E1008P, E1008V, E1008F, E1008W, E1008S, E1008N, E1008K, com base nas posições de sequência de aminoácidos de hADARl-D, e mutações em uma proteína ADAR homóloga que correspondem às anteriores.

[703] Em algumas modalidades, a seletividade, eficiência e/ou preferência de edição de substrato de uma adenosina desaminase são afetadas por resíduos de aminoácido

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518/776 próximos ao ou no centro ativo da enzima. Em algumas modalidades, a adenosina desaminase compreende uma mutação na posição de ácido glutâmico 1008 na sequência de hADARl-D ou uma posição correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em algumas modalidades, a mutação é E1008R ou uma mutação correspondente em uma proteína ADAR homóloga. Em algumas modalidades, o mutante E1008R tem uma eficiência de edição aumentada para resíduo de adenosina alvo que tem um resíduo de G incompatível na fita oposta.

[704] Em algumas modalidades, a proteína adenosina desaminase compreende adicionalmente ou está conectada a um ou mais motivos (dsRBMs) ou domínios (dsRBDs) de ligação de RNA de fita dupla (dsRNA) para reconhecer e se ligar a substratos de ácido nucleico de fita dupla. Em algumas modalidades, a interação entre a adenosina desaminase e o substrato de fita dupla é mediada por um ou mais fatores de proteína adicionais, incluindo um fator de proteína CRISPR/CAS. Em algumas modalidades, a interação entre a adenosina desaminase e o substrato de fita dupla é mediada por um ou mais componentes de ácido nucleico, incluindo um RNA guia.

[705] Em determinadas modalidades exemplificativas, evolução direcionada pode ser usada para projetar proteínas ADAR modificadas com a capacidade para catalisar reações adicionais além da desaminação de uma adenina a uma

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519/776 hipoxantina. Por exemplo [706] De acordo com a presente invenção, o substrato da adenosina desaminase é um dúplex de RNA/DNAn RNA formado mediante a ligação da molécula guia a seu alvo de DNA que, então, forma o complexo de CRISPR-Cas com a enzima CRISPRCas. O dúplex de RNA/DNA ou DNA/RNAn RNA é também denominado no presente documento híbrido de RNA/DNA, híbrido de DNA/RNA ou substrato de fita dupla. Os recursos particulares da molécula guia e enzima CRISPR-Cas são detalhados abaixo.

[707] O termo seletividade de edição conforme usado no presente documento refere-se à fração de todos os sítios em um substrato de fita dupla que é editado por uma adenosina desaminase. Sem ater-se à teoria, é contemplado que a seletividade de edição de uma adenosina desaminase é

afetada pelo	comprimento	do	substrato de fita	dupla	e
estruturas se	cundárias,	tais	como a presença	de bases
incompatíveis,	saliências	e/ou	alças internas.
[708]	Em algumas	modalidades, quando o substrato	é
um dúplex com	bases perfeitamente pareadas maior	do que	50

pares de bases, a adenosina desaminase pode ter a capacidade de desaminar múltiplos resíduos de adenosina dentro do dúplex (por exemplo, 50% de todos os resíduos de adenosina) . Em algumas modalidades, quando o substrato é mais curto do que 50 pares de bases, a seletividade de edição de uma adenosina

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520/776 desaminase é afetada pela presença de uma incompatibilidade do sítio de adenosina alvo. Particularmente, em algumas modalidades, o resíduo de adenosina (A) que tem um resíduo de citidina (C) incompatível na fita oposta é desaminado com alta eficiência. Em algumas modalidades, o resíduo de adenosina (A) que tem um resíduo de guanosina (G) incompatível na fita oposta é pulado sem edição.

[709] Em relação às informações gerais sobre os sistemas de CRISPR-Cas, componentes dos mesmos e entrega de tais componentes, incluindo métodos, materiais, veículos de entrega, vetores, partículas, AAV, e produção e uso dos mesmos, incluindo quanto a quantidades e formulações, todos úteis na prática da presente invenção, é feita referência a: Patentes n£ US 8.999.641, 8.993.233, 8.945.839, 8.932.814, 8.906.616, 8.895.308, 8.889.418, 8.889.356, 8.871.445, 8.865.406, 8.795.965, 8.771.945 e 8.697.359; Publicações de Patente n° US 2014-0310830 (Pedido de n° de série US

14/105.031)	r	US	2014-0287938	Al	(Pedido	de	n2	de	série	US
14/213.991)	r	US	2014-0273234	Al	(Pedido	de	n2	de	série	US
14/293.674)	r	US	2014-0273232	Al	(Pedido	de	n2	de	série	US
14/290.575)	r	US	2014-0273231	(	Pedido de n	O	de	série	US
14/259.420)	r	US	2014-0256046	Al	(Pedido	de	n2	de	série	US
14/226.274)	r	US	2014-0248702	Al	(Pedido	de	n2	de	série	US
14/258.458)	r	US	2014-0242700	Al	(Pedido	de	n2	de	série	US
14/222.930)	r	US	2014-0242699	Al	(Pedido	de	n2	de	série	US

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521/776

14/183.512) ,	US	2014-0242664	Al	(Pedido	de	n2	de	série	US
14/104.990),	US	2014-0234972	Al	(Pedido	de	n2	de	série	US
14/183.471),	US	2014-0227787	Al	(Pedido	de	n2	de	série	US
14/256.912),	US	2014-0189896	Al	(Pedido	de	n2	de	série	US
14/105.035),	US	2014-0186958	(Pedido de n	O	de	série	US
14/105.017),	US	2014-0186919	Al	(Pedido	de	n2	de	série	US
14/104.977),	US	2014-0186843	Al	(Pedido	de	n2	de	série	US
14/104.900) ,	US	2014-0179770	Al	(Pedido	de	n2	de	série	Us
14/104,837)	e US	2014-0179006	Al	(Pedido	de	n£	de	série	US

14/183,486), US 2014-0170753 (US Pedido de n° de série 14/183.429); Patentes Européias EP 2.784.162 Bl e EP 2.771.468 Bl; Pedidos de Patente Europeus EP 2.771.468 (EP13818570.7), EP 2.764.103 (EP13824232.6), e EP 2.784.162 (EP14170383.5); e Publicações de Patente PCT WO 2014/093661 (PCT/US2013/074743), WO 2014/093694 (PCT/US2013/074790), WO 2014/093595 (PCT/US2013/074611), WO 2014/093718 (PCT/US2013/074825), WO 2014/093709 (PCT/US2013/074812), WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667), WO 2014/093635 (PCT/US2013/074691), WO 2014/093655 (PCT/US2013/074736), WO 2014/093712 (PCT/US2013/074819), WO 2014/093701 (PCT/US2013/074800), WO 2014/018423 (PCT/US2013/051418), WO 2014/204723 (PCT/US2014/041790), WO 2014/204724 (PCT/US2014/041800), WO 2014/204725 (PCT/US2014/041803), WO 2014/204726 (PCT/US2014/041804), WO 2014/204727 (PCT/US2014/041806), WO 2014/204728 (PCT/US2014/041808), WO

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522/776

2014/204729 (PCT/US2014/041809). É também feita referência a pedidos de patente provisórios n° US 61/758.468; 61/802.174; 61/806.375; 61/814.263; 61/819.803 e 61/828.130, depositados em 30 de janeiro de 2013; 15 de março de 2013; 28 de março de 2013; 20 de abril de 2013; 6 de maio de 2013 e 28 de maio de 2013, respectivamente. É também feita referência ao pedido de patente provisório n° US 61/836.123, depositado em 17 de junho de 2013. É feita referência adicionalmente a pedidos de patente provisórios n° US 61/835.931, 61/835.936, 61/836.127, 61/836.101, 61/836.080 e 61/835.973, cada um depositado em 17 de junho de 2013. É feita referência adicionalmente a pedidos de patente provisórios n° US 61/862.468 e 61/862.355 depositados em 5 de agosto de 2013; 61/871.301 depositado em 28 de agosto de 2013; 61/960.777 depositado em 25 de setembro de 2013 e 61/961.980 depositado em 28 de outubro de 2013. É feita referência ainda adicionalmente a: pedidos de patente PCT n2; PCT/US2014/041803, PCT/US2014/041800, PCT/US2014/041809, PCT/US2014/041804 e PCT/US2014/041806, cada um depositado em de junho de 2014 6/10/14; PCT/US2014/041808 depositado em de junho de 2014; e PCT/US2014/62558 depositado em 28 de junho de 2014, e Pedidos de Patente Provisórios de n° de série US: 61/915.150, 61/915.301, 61/915.267 e 61/915.260, cada um depositado em 12 de dezembro de 2013; 61/757.972 e 61/768.959, depositado em 29 de janeiro de 2013 e 25 de

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523/776 fevereiro de 2013; 61/835.936, 61/836.127, 61/836.101, 61/836.080, 61/835.973 e 61/835.931, depositado em 17 de junho de 2013; 62/010.888 e 62/010.879, ambos depositados em 11 de junho de 2014; 62/010.329 e 62/010.441, cada um depositado em 10 de junho de 2014; 61/939.228 e 61/939.242, cada um depositado em 12 de fevereiro de 2014; 61/980.012, depositado em 15 de abril de 2014; 62/038.358, depositado em 17 de agosto de 2014; 62/054.490, 62/055.484, 62/055.460 e 62/055.487, cada um depositado em 25 de setembro de 2014; e 62/069.243, depositado em 27 de outubro de 2014. É feita também referência a pedidos de patente provisórios n° US 62/055.484, 62/055.460 e 62/055.487, depositado em 25 de setembro de 2014; pedido de patente provisório n° US 61/980.012, depositado em 15 de abril de 2014; e pedido de patente provisório n° US 61/939.242 depositado em 12 de fevereiro de 2014. É feita referência ao pedido PCT designando, dentre outros, o pedido n° US PCT/US14/41806, depositado em 10 de junho de 2014. É feita referência um pedido de patente provisório n° US 61/930.214 depositado em 22 de janeiro de 2014. É feita referência a pedidos de patente provisórios n° US 61/915.251; 61/915.260 e 61/915.267, cada um depositado em 12 de dezembro de 2013. É feita referência um pedido de patente provisório n° US USSN 61/980.012 depositado em 15 de abril de 2014. É feita referência ao pedido PCT designando, dentre outros, o pedido

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524/776 n- US PCT/US14/41806, depositado em 10 de junho de 2014. É feita referência um pedido de patente provisório n° US 61/930.214 depositado em 22 de janeiro de 2014. É feita referência a pedidos de patente provisórios n° US 61/915.251; 61/915.260 e 61/915.267, cada um depositado em 12 de dezembro de 2013.

[710] A menção é feita, também, ao pedido n° U.S. 62/091.455, depositado em 12 de dezembro de 14, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); Pedido n° U.S. 62/096.708, 24 de dezembro de 14, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS) ; Pedido n° U.S. 62/091.462. 12 de dezembro de 14, DEAD GUIDES FOR CRISPR TRANSCRIPTION FACTORS; Pedido n° U.S. 62/096.324, 23 de dezembro de 14, DEAD GUIDES FOR CRISPR TRANSCRIPTION FACTORS; Pedido n° U.S. 62/091.456, 12 de dezembro de 14, ESCORTED AND FUNCTIONALIZED GUIDES FOR CRISPR-CAS SYSTEMS; Pedido n° U.S. 62/091.461.12 de dezembro de 14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR GENOME EDITING AS TO HEMATOPOETIC STEM CELLS (HSCs); Pedido n° U.S. 62/094.903, 19 de dezembro de 14, UNBIASED IDENTIFICATION OF DOUBLE-STRAND BREAKS AND GENOMIC REARRANGEMENT BY GENOME-WISE INSERT CAPTURE SEQUENCING; Pedido n° U.S. 62/096.761, 24 de dezembro de 14, ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS FOR SEQUENCE MANIPULATION; Pedido n° U.S. 62/098.059, 30 de dezembro de 14, RNA-TARGETING SYSTEM; Pedido n° U.S.

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62/096.656, 24 de dezembro de 14, CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH DESTABILIZATION DOMAINS; Pedido n° U.S. 62/096.697, 24 de dezembro de 14, CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH AAV; Pedido n° U.S. 62/098.158, 30 de dezembro de 14, ENGINEERED CRISPR COMPLEX INSERTIONAL TARGETING SYSTEMS; Pedido n° U.S. 62/151.052, 22 de abril de 15, CELLULAR TARGETING FOR EXTRACELLULAR EXOSOMAL REPORTING; Pedido n° U.S. 62/054.490, 24 de setembro de 14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS; Pedido n° U.S. 62/055.484, 25 de setembro de 14, SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; Pedido n° U.S. 62/087.537, 4 de dezembro de 14, SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; Pedido n° U.S. 62/054.651, 24 de setembro de 14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO; Pedido n° U.S. 62/067.886, 23 de outubro de 14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO; Pedido n° U.S. 62/054.675, 24 de setembro de 14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS IN NEURONAL

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526/776

CELLS/TISSUES; Pedido n° U.S. 62/054.528, 24 de setembro de 14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPRCAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS IN IMMUNE DISEASES OR DISORDERS; Pedido n° U.S. 62/055.454, 25 de setembro de 14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING CELL PENETRATION PEPTIDES (CPP); Pedido n° U.S. 62/055.460, 25 de setembro de 14, MULTIFUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKED FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; Pedido n° U.S. 62/087.475, 4 de dezembro de 14, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; Pedido n° U.S. 62/055.487, 25 de setembro de 14, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; Pedido n° U.S. 62/087.546, 4 de dezembro de 14, MULTIFUNCTIONAL CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKED FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; e Pedido n° U.S. 62/098.285, 30 de dezembro de 14, CRISPR MEDIATED IN VIVO MODELING AND GENETIC SCREENING OF TUMOR GROWTH AND METASTASIS .

[711] Cada uma dessas patentes, publicações de patente e pedidos e todos os documentos citados nos mesmos ou durante sua instauração de processo (documentos citados em pedidos) e todos os documentos citados ou referidos nos documentos citados em pedido, juntamente com quaisquer instruções, descrições, especificações de produto e folhas

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527/776 de produto para quaisquer produtos mencionados nos mesmos ou em qualquer documento nos mesmos e incorporados a título de referência nos mesmos, são incorporados ao presente documento a título de referência e podem ser empregados na prática da invenção. Todos os documentos (por exemplo, essas patentes, publicações de patente e pedidos e os documentos citados em pedido) são incorporados no presente documento a título de referência na mesma extensão como se cada documento individual estivesse específica e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.

[712] Também em relação às informações gerais em Sistemas de CRISPR-Cas, é feita menção dos seguintes (também incorporados ao presente documento a título de referência):

[713] > Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barrette, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., & Zhang, F. Science Feb 15;339(6121) :819 a 823 (2013);

[714] RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Jiang W., Bikard D., Cox D., Zhang F, Marraffini LA. Nat Biotechnol Mar;31(3):233 a 239 (2013);

[715] One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Wang H., Yang H., Shivalila CS., Dawlaty MM., Cheng AW., Zhang F., Jaenisch R. Cell May 9;153(4):910 a 918

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528/776 (2013);

[716] Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Hsu PD, Heidenreich M, Cong L, Platt RJ, Scott DA, Church GM, Zhang F. Nature. 22 de agosto;500(7463):472 a 476. doi: 10.1038/Naturel2466. Publicação eletrônica em 23 de agosto de 2013 (2013);

[717] Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Ran, FA., Hsu, PD., Lin, CY., Gootenberg, JS. , Konermann, S., Trevino, AE. , Scott, DA., Inoue, A., Matoba, S., Zhang, Y., & Zhang, F. Cell 28 de agosto, pii: S0092-8674 (13)01015-5 (2013-A) ;

[718] DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X., Shalem, 0., Cradick, TJ., Marraffini, LA., Bao, G., & Zhang, F. Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647 (2013);

[719] Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Ran, FA., Hsu, PD., Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA., Zhang, F. Nature Protocols Nov;8(11):2.281 a 2.308 (2013-B);

[720] Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Shalem, 0., Sanjana, NE. , Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL., Root, DE., Doench, JG., Zhang, F. Science 12 de dezembro.

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529/776 (2013) . [Publicação eletrônica antes da impressão];

[721] Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Nishimasu, H., Ran, FA., Hsu, PD., Konermann, S., Shehata, SI., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F., Nureki, 0. Cell Feb 27, 156(5):935 a 949 (2014);

[722] > Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Wu X., Scott DA., Kriz AJ., Chiu AC., Hsu PD., Dadon DB. , Cheng AW., Trevino AE. , Konermann S., Chen S., Jaenisch R., Zhang F., Sharp PA. Nat Biotechnol. 20 de abril, doi: 10.1038/nbt.2889 (2014);

[723] CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Platt RJ, Chen S, Zhou Y, Yim MJ, Swiech

L, Kempton HR, Dahlman JE, Parnas 0, Eisenhaure TM, Jovanovic

M, Graham DB, Jhunjhunwala S, Heidenreich M, Xavier RJ, Langer R, Anderson DG, Hacohen N, Regev A, Feng G, Sharp PA, Zhang F. Cell 159(2): 440 a 455 DOI: 10.1016/j.cell.2014.09.014(2014);

[724] Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering, Hsu PD, Lander ES, Zhang F., Cell. 5 de junho; 157(6) :1.262 a 1.278 (2014).

[725] Genetic screens in human cells using the CRISPR/Cas9 system, Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, Lander ES., Science. 3 de janeiro; 343(6166) : 80-84. doi:10.1126/science.1246981 (2014) ;

[726] Rational design of highly active sgRNAs for

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530/776

CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation, Doench JG, Hartenian E, Graham DB, Tothova Z, Hegde M, Smith I, Sullender M, Ebert BL, Xavier RJ, Root DE., (publicado online em 3 de setembro de 2014) Nat Biotechnol. Dezembro;32(12):1.262 a 1.267 (2014);

[727] In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9, Swiech L, Heidenreich

M, Banerjee A, Habib N, Li Y, Trombetta J, Sur M, Zhang F., (publicado online em 19 de outubro de 2014) Nat Biotechnol. Janeiro;33(1):102 a 106 (2015);

[728] 2* Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex, Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh 00, Barcena C, Hsu PD, Habib

N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki 0, Zhang F., Nature. 29 de janeiro;517(7536):583 a 588 (2015).

[729] A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation, Zetsche B, Volz SE, Zhang F., (publicado online em 02 de fevereiro de 2015) Nat Biotechnol. Fevereiro;33(2):139 a 142 (2015);

[730] Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis, Chen S, Sanjana NE, Zheng K, Shalem 0, Lee K, Shi X, Scott DA, Song J, Pan JQ, Weissleder R, Lee H, Zhang F, Sharp PA. Cell 160, 1.246 a 1.260, 12 de março de 2015 (tela multiplex em camundongo) e [731] ** In vivo genome editing using Staphylococcus

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531/776 aureus Cas9, Ran FA, Cong L, Yan WX, Scott DA, Gootenberg JS, Kriz AJ, Zetsche B, Shalem 0, Wu X, Makarova KS, Koonin EV, Sharp PA, Zhang F., (publicado online em 01 de abril de 2015), Nature. 9 de abril;520(7546):186 a 191 (2015).

[732] í'· Shalem et al., High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9, Nature Reviews Genetics 16, 299 a 311 (maio de 2015).

[733]		Xu	et al.,	Sequence determinants of
improved CRISPR	sgRNA	design,	Genome Research 25, 1.147 a
1.157 (agosto	de	2015)	•
[734]		Parna	s et al.,	A Genome-wide CRISPR Screen

in Primary Immune Cells to Dissect Regulatory Networks, Cell 162, 675 a 686 (30 de julho de 2015).

[735] Ramanan et al., CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus, Scientific Reports 5:10833. doi: 10.1038/srepl0833 (2 de junho de 2015) [736] Y' Nishimasu et al., Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9, Cell 162, 1.113 a 1.126 (27 de agosto de 2015) [737] Zetsche et al. (2015), Cpfl is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system, Cell 163, 759 a 771 (22 de outubro de 2015) doi: 10.1016/j. cell.2015.09.038. Publicação eletrônica em 25 de setembro de 2015

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532/776 [738] i*” Shmakov et al. (2015), Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems, Molecular Cell 60, 385 a 397 (5 de novembro de 2015) doi: 10.1016/j.molcel.2015.10.008 . Publicação eletrônica em 22 de outubro de 2015 [739] > Dahlman et al., Orthogonal gene control with a catalytically active Cas9 nuclease, Nature Biotechnology 33, 1.159 a 1.161 (novembro de 2015) [740] Gao et al, Engineered Cpfl Enzymes with Altered PAM Specificities, bioRxiv 091611; doi: http://dx.doi.org/10.1101/091611 Publicação eletrônica em 4 de dezembro de 2016 [741] Smargon et al. (2017), Casl3b Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNase Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28, Molecular Cell 65, 618 a 630 (16 de fevereiro de 2017) doi: 10.1016/j.molcel.2016.12.023. Publicação eletrônica em 5 de janeiro de 2017 cada um dos quais é incorporado ao presente a título de referência, pode ser considerado na prática da presente invenção e discutido brevemente abaixo:

[742] Cong et al. Modificou geneticamente sistemas de CRISPR-Cas do tipo II para uso em células eucarióticas com base em Streptococcus thermophilus Cas9 e também Streptococcus pyogenes Cas9 e demonstraram que Cas9

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533/776 nucleases podem ser direcionadas por RNAs curtos para induzir a divagem precisa de DNA em células humanas e de camundongo. Seu estudo mostrou adicionalmente que Cas9 como convertida em uma enzima de corte pode ser usada para facilitar o reparo direcionado à homologia em células eucarióticas com atividade mutagênica mínima. Adicionalmente, seu estudo demonstrou que múltiplas sequências guia podem ser codificadas em um único arranjo de CRISPR para permitir a edição simultânea de diversos em sítios de loci genômicoss endógenos dentro do genoma de mamífero, demonstrando fácil programabilidade e ampla aplicabilidade da tecnologia de nuclease guiada por RNA. Essa capacidade para usar RNA para programar divagem de DNA específica para sequência de programa em células definiu uma nova classe de ferramentas de engenharia de genoma. Esses estudos mostraram adicionalmente que outros loci de CRISPR têm a provabilidade de serem transplantáveis em células de mamífero e podem também mediar a divagem de genoma de mamífero. De modo importante, pode ser contemplado que diversos aspectos do sistema de CRISPR-Cas podem ser adicionalmente melhorados para aumentar sua eficiência e versatilidade.

[743] Jiang et al. Usaram a Cas9 endonuclease associada a repetições palindrômicas curtas agruapadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) complexada com RNAs duplos para introduzir mutações precisas nos genomas de

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Streptococcus pneumoniae e Escherichia coli. A abordagem dependeu da divagem direcionada à RNA duplo:Cas9 no sítio genômico alvejado para exterminar células que não sofreram mutação e contorna a necessidade de marcadores selecionáveis ou sistemas de contrasseleção. 0 estudo relatou a reprogramação da especificidade de RNA duplo:Cas9 alterandose a sequência de RNA de CRISPR curto (crRNA) para fazer alterações de único nucleotídeo ou múltiplos nucleotídeos portadas em modelos de edição. 0 estudo mostrou que o uso simultâneo de dois crRNAs possibilitou a mutagênese multiplex. Ademais, quando a abordagem foi usada em combinação com recombinação, em S. pneumoniae, quase 100% das células que foram recuperadas com o uso da abordagem continham a mutação desejada, e em E. coli, 65% que foram recuperadas continham a mutação.

[744] > Wang et al. (2013) usaram o sistema de CRISPR/Cas para a geração de uma etapa de camundongos que portam mutações em múltiplos genes que foram tradicionalmente gerados em múltiplas etapas por recombinação sequencial em células-tronco embrionárias e/ou intercruzamento demorado de camundongos com uma única mutação. O sistema de CRISPR/Cas acelerará significativamente o estudo in vivo de genes funcionalmente redundantes e de interações de genes epistáticas.

[745] Konermann et al. (2 013) abordaram a

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535/776 necessidade na técnica de tecnologias versáteis e robustas que possibilitem a modulação óptica e química de domínios de ligação de DNA com base em enzima CRISPR Cas9 e também Efetores Semelhantes a Ativador Transcricional

[746]	A Ran	et al. (	2013-A)	descreveram	uma
abordagem	que combinou	um mutante	de Cas9	nickase com	RNAs
guia pareados para	introduzir	quebras	de fita	dupla
alvej adas.	Isso soluciona o problema da	Cas9 nuclease do
sistema de	CRISPR-Cas	microbiano	sendo di	recionada a	loci
genômicoss	específicos	por uma	sequência	guia, que	pode

tolerar determinadas incompatibilidades ao alvo de DNA e, assim, promover mutagênese fora do alvo indesejada. Como cortes individuais no genoma são reparados com alta fidelidade, um corte simultâneo por meio de RNAs guia de desvio é exigido para quebras de fita dupla e estende o número de bases especificamente reconhecidas para divagem de alvo. Os autores demonstraram que usar corte pareado pode reduzir a atividade fora do alvo em 50 a 1.500 vezes em linhagens de células e facilitar o knockout de gene em zigotos de camundongo sem sacrificar a eficiência de divagem em alvo. Essa estratégia versátil possibilita uma ampla variedade de aplicações de edição de genoma que exigem alta especificidade.

[747] 'A Hsu et al. (2013) caracterizaram a especificidade de alvejamento de SpCas9 em células humanas

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536/776 para informar a seleção de sítios-alvo e evitar efeitos fora do alvo. 0 estudo avaliou >700 variantes de RNA guia, e níveis de mutação de indel induzidos por SpCas9 a >100 previram loci fora de alvo genômicos em células 293T e 293FT. Os autores mostraram que SpCas9 tolera incompatibilidades entre o RNA guia e o DNA-alvo em diferentes posições de uma maneira dependente de sequência, sensível ao número, posição e distribuição de incompatibilidades. Os autores mostraram adicionalmente que a divagem mediada por SpCas9 não é afetada pela metilação de DNA e que a dosagem de SpCas9 e sgRNA pode ser titulada para minimizar a modificação fora de alvo. Adicionalmente, para facilitar as aplicações de modificação genética de genoma de mamífero, os autores relataram o fornecimento de uma ferramenta de software baseada em web para guiar a seleção e a validação de sequências-alvo assim como análises fora de alvo.

[748] Ran et al. (2013-B) descreveram um conjunto de ferramentas para edição de genoma mediada por Cas9 por meio de junção de extremidades não homólogas (NHEJ) ou reparo direcionado à homologia (HDR) em células de mamífero, assim como a geração de linhagens de células modificadas para estudos funcionais a jusante. Para minimizar a divagem fora de alvo, os autores descreveram adicionalmente uma estratégia de corte duplo que usa o mutante de Cas9 com RNAs guia pareados. O protocolo fornecido pelos autores derivou

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537/776 experimentalmente diretrizes para a seleção de sitios-alvo, avaliação da eficiência de divagem e análise da atividade fora de alvo. Os estudos mostraram que, começando com projeto de alvo, modificações de gene podem ser alcançadas dentro de tão pouco quanto 1 a 2 semanas, e linhagens de células clonais modificadas podem ser derivadas dentro de 2 a 3 semanas.

[749] A Shalem et al. descreveram um novo modo de interrogar a função de gene em uma escala genômica. Seus estudos mostraram que a entrega de uma biblioteca de knockout de CRISPR-Cas9 de escala genômica (GeCKO) teve como alvo 18.080 genes com 64.751 sequências guia exclusivas e possibilitou a triagem de seleção negativa e positiva em células humanas. Primeiro, os autores mostraram o uso da biblioteca de GeCKO para identificar genes essenciais para viabilidade celular em células-tronco de câncer e pluripotentes. Depois, em um modelo de melanoma, os autores triados para genes cuja perda está envolvida na resistência a vemurafenibe, um produto terapêutico que inibe BRAF de proteína quinase mutante. Seus estudos mostraram que os candidatos de maior classificação incluíram os genes anteriormente valiados NF1 e MED12 assim como ocorrências inovadoras NF2, CUL3, TADA2B e TADA1. Os autores observaram um alto nível de consistência entre RNAs guia independentes que têm como alvo o mesmo gene e uma alta taxa de confirmação

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538/776 de ocorrência e, assim, demonstraram a promessa de triagem de escala genômica com Cas9.

[750] Nishimasu et al. relataram a estrutura de cristal de Streptococcus pyogenes Cas9 em complexo com sgRNA e seu DNA-alvo a uma resolução de 2,5 A°. A estrutura revelou uma arquitetura bilobada composta de lóbulos de nuclease e reconhecimento de alvo, acomodando o heterodúplex de sgRNA:DNA em um sulco positivamente carregado em sua interface. Enquanto que o lóbulo de reconhecimento é essencial para ligação de sgRNA e DNA, o lóbulo de nuclease contém os domínios de HNH e RuvC nuclease, que são apropriadamente posicionados para divagem das fitas complementares e não complementares do DNA alvo, respectivamente. O lóbulo de nuclease também contém um domínio carboxil-terminal responsável pela interação com o motivo adjacente protoespaçador (PAM). Essa estrutura de alta resolução e análises funcionais anexas revelaram o mecanismo molecular do alvejamento de DNA guiado por RNA por Cas9, pavimentando, assim, o caminho para o projeto racional de novas tecnologias de edição de genoma versáteis.

[751] Wu et al. mapearam sítios de ligação genômicos de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) de Streptococcus pyogenes carregados com RNAs guia únicos (sgRNAs) em células-tronco embrionárias de camundongo (mESCs). Os autores mostraram que cada um dos quatro sgRNAs

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539/776 testaram dCas9 alvos para entre dezenas e centenas de sítios genômicos, frequentemente caracterizados por uma região de semeadura de nucleotídeo no sgRNA e um NGG motivo adjacente de protoespaçador (PAM). A inacessibilidade de cromatina diminui a ligação de dCas9 a outros sítios com sequências de semeadura correspondentes; desse modo, 70% dos sítios fora de alvo são associados a genes. Os autores mostraram que o sequenciamento alvejado de 295 sítios de ligação de dCas9 em mESCs transfectados com Cas9 cataliticamente ativa identificaram somente um sítio mutado acima dos níveis de base. Os autores propuseram um modelo de dois estados para ligação e divagem de Cas9, no qual uma correspondência de semente dispara ligação, mas emparelhamento extensivo com DNA alvo é necessário para divagem.

[752] .> Platt et al. estabeleceu um camundongo que realiza knock de Cas9 dependente de Cre. Os autores demonstraram ín vivo assim como ex vivo edição de genoma com uso de vírus adeno-associado (AAV)-, lentivírus-, ou entrega mediada por partícula de RNA guia em nêurons, células imunes, e células endoteliais.

[753] Hsu et al. (2014) é um artigo de revisão que discute geralmente o histórico de CRISPR-Cas9 de iogurte à edição de genoma, incluindo triagem genética de células.

[754] Wang et al. (2014) se refere a uma abordagem de triagem genética de perda de função agrupadas adequadas

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540/776 tanto para seleção positiva quanto para seleção negativa que usa uma biblioteca de RNA guia único lentiviral de escala genômica (sgRNA).

[755] Doench et al. criou um pool de sgRNAs, orientando através de todos os sítios alvos possíveis de um painel de seis genes de camundongo endógeno e humano e humano endógeno e analisou de modo quantitativo sua capacidade de produzir alelos nulos de seu gene alvo por coloração de anticorpo e citometria de fluxo. Os autores mostraram que a otimização do RAM aprimorou a atividade e também forneceu uma ferramenta on-line para projetar sgRNAs.

[756] Swiech et al. demonstrou que a edição de genoma SpCas9 mediado por AAV pode possibilitar estudos genéticos reversos de função de gene no cérebro.

[757] Konermann et al. (2015) discutem a capacidade de se fixar a múltiplos domínios efetores, por exemplo, ativador transcripcional, reguladores funcionais e epigenômicos em posições apropriadas no guia tal como tronco ou tetra-alça com e sem ligantes.

[758] Zetsche et al. demonstra que a enzima Cas9 pode ser dividida em dois e, portanto, a montagem de Cas9 para ativação pode ser controlada.

[759] Chen et al. se refere à triagem de multiplexação demonstrando-se que uma triagem de CRISPR-Cas9 In vivo de tipo selvagem em camundongos revela genes que

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541/776 regulam metástase pulmonar.

[760] Ran et al. (2015) se refere a SaCas9 e sua capacidade de editar genomas e demonstra que não se pode extrapolar a partir de ensaios bioquímicos. Shalem et al. (2015) descreveu modos nos quais fusões de fusões de Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) são usados para reprimir sinteticamente (CRISPRi) ou ativar (CRISPRa) expressão mostrando avanços com uso de Cas9 para triagens de escala genômica, incluindo triagens dispostas e agrupadas, abordagens de knockout que inativam loci genômicoss e estratégias que modulam atividade transcripcional.

[761] Shalem et al. (2015) descreveu modos nos quais fusões de fusões de Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) são usados para reprimir sinteticamente (CRISPRi) ou ativar (CRISPRa) expressão mostrando avanços com uso de Cas9 para triagens de escala genômica, incluindo triagens dispostas e agrupadas, abordagens de knockout que inativam loci genômicoss e estratégias que modulam atividade transcripcional.

[762] Xu et al. (2015) analisou as características de sequência de DNA que contribuem para eficiência de RNA guia único (sgRNA) em triagens baseadas em CRISPR. Os autores exploraram a eficiência de knockout de CRISPR/Cas9 e preferência de nucleotídeo no sítio de divagem. Os autores também constataram que a preferência de

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542/776 sequência para CRISPRi/a é substancialmente diferente daquele para knockout de CRISPR/Cas9.

[763] Ϊ Parnas et al. (2015) apresentou bibliotecas de CRISPR-Cas9 agrupado de genoma selvagem em células dendriticas (DCs) para identificar genes que controlam a indução de fator de necrose de tumor (Tnf) por lipopolissacarideo bacteriano (LPS). Reguladores conhecidos de sinalização de Tlr4 e candidatos anteriormente conhecidos foram identificados e classificados em três módulos funcionais com efeitos distintos nas respostas canônicas a LPS .

[764] Ramanan et al (2015) demonstrou divagem de DNA episomal viral (cccDNA) em células infectadas. O genoma de HBV existe nos núcleos de hepatócitos infectados como uma espécie de DNA epissomal de fita dupla de 3,2kb chamado de DNA circular fechado de modo covalente (cccDNA) , que é um componente principal no ciclo de vida de HBV cuja replicação não é inibida por terapias atuais. Os autores mostraram que sgRNAs que alvejam especificamente regiões altamente conservadas de HBV suprime de forma robusta a replicação viral e cccDNA esgotado.

[765] Nishimasu et al. (2015) relatou as estruturas de cristal de SaCas9 em complexo com a RNA guia único (sgRNA) e seus alvos de DNA de fita dupla, que contém o 5’-TTGAAT-3’ PAM e o 5’-TTGGGT-3’ PAM. Uma comparação

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543/776 estrutural de SaCas9 com SpCas9 destacou tanto comparação estrutural e divergência, explicando suas especificidades de PAM distintos e reconhecimento de sgRNA ortólogo.

[766] Zetsche et al. (2015) relatou a caracterização de Cpfl, um efetor de 2 CRISPR de classe putativa. Foi demonstrado que Cpfl media interferência de DNA robusto com características distintas de Cas9. Identificar esse mecanismo de interferência amplia nosso entendimento de sistemas de CRISPR-Cas e avança suas aplicações de edição de genoma.

[767] Shmakov et al. (2015) relatou a caracterização de três sistemas de Classe 2 distintos de CRISPR-Cas. Os efetores de dois dos sistemas identificados, C2cl e C2c3, contêm domínios de endonuclease do tipo RuvC distantemente relacionados a Cpfl. O terceiro sistema,

Casl3b, contém um efetor	com	dois domínios de	RNase de HEPN
previstos.
[768]	.> Gao	et	al.	(2016) relatou	o uso de uma
triagem de	mutagênese	de	saturação orientada	por estrutura

para aumentar o alcance de alvejamento de Cpfl. Variantes de AsCpfl foram modificados com as mutações S542R/K607R e S542R/K548V/N552R que podem clivar sítios alvo com TYCV/CCCC e TATV PAMs, respectivamente, com atividades intensificadas in vitro e em células humanas.

[769] Além disso, Dimeric CRISPR RNA-guided Fokl

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544/776 nucleases for highly specific genome editing, Shengdar Q. Tsai, Nicolas Wyvekens, Cyd Khayter, Jennifer A. Foden, Vishal Thapar, Deepak Reyon, Mathew J. Goodwin, Martin J. Aryee, J. Keith Joung Nature Biotechnology 32(6): 569-77 (2014), se refere a Nucleases de Fokl orientadas por RNA dimétrico que reconhecem sequências estendidas e pode editar genes endógenos com altas eficiências em células humanas.

[770] Adicionalmente, é feita menção ao pedido de PCT PCT/US14/70057, Referência do Advogado 47627.99.2060 e BI-2013/107 intitulado DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS (que reivindica prioridade de um ou mais ou todos os pedidos de patente provisórios de n° US: 62/054.490, depositado em 24 de setembro de 2014; 62/010.441, depositado em 10 de junho de 2014; e 61/915,118, 61/915.215 e 61/915,148, cada um depositado em 12 de dezembro de 2013) (o PCT de Entrega de Partícula), incorporado ao presente documento a título de referência, em relação a um método de preparo de uma proteína de sgRNA-e-Cas9 que contém partícula que compreende misturar por adição uma mistura que compreende um proteína de sgRNA e Cas9 (e opcionalmente modelo de HDR) com uma mistura que compreende ou consiste essencialmente em ou consiste em tensoativo, fosfolipídio, polímero biodegradável, lipoproteína e álcool; e partículas de tal

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545/776 processo. Por exemplo, em que a proteína de Cas9 e sgRNA foram misturados em conjunto em uma razão molar adequada, por exemplo, 3:1 a 1:3 ou 2:1 a 1:2 ou 1:1, em uma temperatura adequada, por exemplo, 15 a 30° C, por exemplo, 20 a 25° C, por exemplo, temperatura ambiente, por um tempo adequado, por exemplo, 15 a 45, tal como 30 minutos, de modo vantajoso e, tampão livre de nuclease estéril, por exemplo, IX PBS. Separadamente, componentes de partícula tal como ou que compreende: um tensoativo, por exemplo, lipídio catiônico, por exemplo, 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP); fosfolipídio, por exemplo, dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC); polímero biodegradável, tal como um polímero de etileno-glicol ou PEG, e a lipoproteína, tal como uma lipoproteína de baixa intensidade, por exemplo, colesterol foram dissolvidos em um álcool, de modo vantajoso um álcool Ci-6 alquílico, tal como metanol, etanol, isopropanol, por exemplo, 100% de etanol. As duas soluções foram misturadas entre si para formar partículas que contém os complexos Cas9sgRNA. Consequentemente, sgRNA pode ser pré-complexado com a proteína de Cas9, antes de formular o complexo inteiro em uma partícula. Formulações podem ser produzidas com uma razão molar diferente de diferentes componentes conhecidos por promover a entrega de ácido nucleicos em células (por exemplo 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP), 1,2ditetradecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC),

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546/776 polietileno glicol (PEG), e colesterol) Por exemplo, DOTAP : DMPC : PEG : Razões Molares de Colesterol podem ser DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, Colesterol 0; ou DOTAP 90, DMPC 0, PEG 10, Colesterol 0; ou DOTAP 90, DMPC 0, PEG 5, Colesterol 5. DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, Colesterol 0. Essa aplicação compreende consequentemente misturar por adição sgRNA, proteína de Cas9 e componentes que formam uma partícula; assim como partículas de tal mistura por adição. Aspectos da presente invenção podem envolver partículas; por exemplo, partículas que usam um processo análogo ao do PCT de Entrega de Partícula, por exemplo, misturando por adição uma mistura que compreende sgRNA e/ou Cas9 como na presente invenção e componentes que formam uma partícula, por exemplo, como no PCT de Entrega de Partícula, para formar uma partícula e partículas a partir de tal mistura por adição (ou, evidentemente, outras partículas que envolvem sgRNA e/ou Cas9 como na presente invenção).

Exemplos

Exemplo 1: ortólogos de Casl3b [771] As proteínas Casl3b mostradas na Tabela 1 abaixo são vantajosamente produzidas a partir de construtos que têm otimização de códon para expressão em células de mamífero. As sequências abaixo são também dadas na Figura 1, juntamente com o número de acesso da sequência de proteínas. Os motivos de PFS dos ortólogos de Casl3b são fornecidos na

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Tabela 2.

Tabela 1
Bergeyella zoohelcum	1	MENKTSLGNNIYYNPFKPQDKSYFAGYFNAAMENTDSVFRELGKR LKGKEYTSENFFDAIFKENISLVEYERYVKLLSDYFPMARLLDKK EVPIKERKENFKKNFKGIIKAVRDLRNFYTHKEHGEVEITDEIFG VLDEMLKSTVLTVKKKKVKTDKTKEILKKSIEKQLDILCQKKLEY LRDTARKIEEKRRNQRERGEKELVAPFKYSDKRDDLIAAIYNDAF DVYIDKKKDSLKESSKAKYNTKSDPQQEEGDLKIPISKNGVVFLL SLFLTKQEIHAFKSKIAGFKATVIDEATVSEATVSHGKNSICFMA THEIFSHLAYKKLKRKVRTAEINYGEAENAEQLSVYAKETLMMQM LDELSKVPDVVYQNLSEDVQKTFIEDWNEYLKENNGDVGTMEEEQ VIHPVIRKRYEDKFNYFAIRFLDEFAQFPTLRFQVHLGNYLHDSR PKENLISDRRIKEKITVFGRLSELEHKKALFIKNTETNEDREHYW EIFPNPNYDFPKENISVNDKDFPIAGSILDREKQPVAGKIGIKVK LLNQQYVSEVDKAVKAHQLKQRKASKPSIQNIIEEIVPINESNPK EAIVFGGQPTAYLSMNDIHSILYEFFDKWEKKKEKLEKKGEKELR KEIGKELEKKIVGKIQAQIQQIIDKDTNAKILKPYQDGNSTAIDK EKLIKDLKQEQNILQKLKDEQTVREKEYNDFIAYQDKNREINKVR DRNHKQYLKDNLKRKYPEAPARKEVLYYREKGKVAVWLANDIKRF MPTDFKNEWKGEQHSLLQKSLAYYEQCKEELKNLLPEKVFQHLPF KLGGYFQQKYLYQFYTCYLDKRLEYISGLVQQAENFKSENKVFKK VENECFKFLKKQNYTHKELDARVQSILGYPIFLERGFMDEKPTII KGKT FKGNEAL FADW FRYY KEYQNFQT FY DT ENY PLVELEKKQAD RKRKTKIYQQKKNDVFTLLMAKHIFKSVFKQDSIDQFSLEDLYQS REERLGNQERARQTGERNTNYIWNKTVDLKLCDGKITVENVKLKN VGDFIKYEYDQRVQAFLKYEENIEWQAFLIKESKEEENYPYVVER

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Tabela 1
		EIEQYEKVRREELLKEVHLIEEYILEKVKDKEILKKGDNQNFKYY ILNGLLKQLKNEDVESYKVFNLNTEPEDVNINQLKQEATDLEQKA FVLTYIRNKFAHNQLPKKEFWDYCQEKYGKIEKEKTYAEYFAEVF KKEKEALIK
Prevotella intermedia	2	MEDDKKTTDSIRYELKDKHFWAAFLNLARHNVYITVNHINKILEE GEINRDGYETTLKNTWNEIKDINKKDRLSKLIIKHFPFLEAATYR LNPTDTTKQKEEKQAEAQSLESLRKSFFVFIYKLRDLRNHYSHYK HSKSLERPKFEEGLLEKMYNIFNASIRLVKEDYQYNKDINPDEDF KHLDRTEEEFNYYFTKDNEGNITESGLLFFVSLFLEKKDAIWMQQ KLRGFKDNRENKKKMTNEVFCRSRMLLPKLRLQSTQTQDWILLDM LNELIRCPKSLYERLREEDREKFRVPIEIADEDYDAEQEPFKNTL VRHQDRFPYFALRYFDYNEIFTNLRFQIDLGTYHFSIYKKQIGDY KESHHLTHKLYGFERIQEFTKQNRPDEWRKFVKTFNSFETSKEPY IPETTPHYHLENQKIGIRFRNDNDKIWPSLKTNSEKNEKSKYKLD KSFQAEAFLSVHELLPMMFYYLLLKTENTDNDNEIETKKKENKND KQEKHKIEEIIENKITEIYALYDTFANGEIKSIDELEEYCKGKDI EIGHLPKQMIAILKDEHKVMATEAERKQEEMLVDVQKSLESLDNQ INEEIENVERKNSSLKSGKIASWLVNDMMRFQPVQKDNEGKPLNN SKANSTEYQLLQRTLAFFGSEHERLAPYFKQTKLIESSNPHPFLK DTEWEKCNNILSFYRSYLEAKKNFLESLKPEDWEKNQYFLKLKEP KTKPKTLVQGWKNGFNLPRGIFTEPIRKWFMKHRENITVAELKRV GLVAKVIPLFFSEEYKDSVQPFYNYHFNVGNINKPDEKNFLNCEE RRELLRKKKDEFKKMTDKEKEENPSYLEFKSWNKFERELRLVRNQ DIVTWLLCMELFNKKKIKELNVEKIYLKNINTNTTKKEKNTEEKN GEEKNIKEKNNILNRIMPMRLPIKVYGRENFSKNKKKKIRRNTFF

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Tabela 1
		TVYIEEKGTKLLKQGNFKALERDRRLGGLFSFVKTPSKAESKSNT ISKLRVEYELGEYQKARIEIIKDMLALEKTLIDKYNSLDTDNFNK MLTDWLELKGEPDKASFQNDVDLLIAVRNAFSHNQYPMRNRIAFA NINPFSLSSANTSEEKGLGIANQLKDKTHKTIEKIIEIEKPIETK E
Prevotella buccae	3	MQKQDKLFVDRKKNAIFAFPKYITIMENKEKPEPIYYELTDKHFW AAFLNLARHNVYTTINHINRRLEIAELKDDGYMMGIKGSWNEQAK KLDKKVRLRDLIMKHFPFLEAAAYEMTNSKSPNNKEQREKEQSEA LSLNNLKNVLFIFLEKLQVLRNYYSHYKYSEESPKPIFETSLLKN MYKVFDANVRLVKRDYMHHENIDMQRDFTHLNRKKQVGRTKNIID SPNFHYHFADKEGNMTIAGLLFFVSLFLDKKDAIWMQKKLKGFKD GRNLREQMTNEVFCRSRISLPKLKLENVQTKDWMQLDMLNELVRC PKSLYERLREKDRESFKVPFDIFSDDYNAEEEPFKNTLVRHQDRF PYFVLRYFDLNEIFEQLRFQIDLGTYHFSIYNKRIGDEDEVRHLT HHLYGFARIQDFAPQNQPEEWRKLVKDLDHFETSQEPYISKTAPH YHLENEKIGIKFCSAHNNLFPSLQTDKTCNGRSKFNLGTQFTAEA FLSVHELLPMMFYYLLLTKDYSRKESADKVEGIIRKEISNIYAIY DAFANNEINSIADLTRRLQNTNILQGHLPKQMISILKGRQKDMGK EAERKIGEMIDDTQRRLDLLCKQTNQKIRIGKRNAGLLKSGKIAD WLVNDMMRFQPVQKDQNNIPINNSKANSTEYRMLQRALALFGSEN FRLKAYFNQMNLVGNDNPHPFLAETQWEHQTNILSFYRNYLEARK KYLKGLKPQNWKQYQHFLILKVQKTNRNTLVTGWKNSFNLPRGIF TQPIREWFEKHNNSKRIYDQILSFDRVGFVAKAIPLYFAEEYKDN VQPFYDYPFNIGNRLKPKKRQFLDKKERVELWQKNKELFKNYPSE KKKTDLAYLDFLSWKKFERELRLIKNQDIVTWLMFKELFNMATVE

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Tabela 1
		GLKIGEIHLRDIDTNTANEESNNILNRIMPMKLPVKTYETDNKGN ILKERPLATFYIEETETKVLKQGNFKALVKDRRLNGLFSFAETTD LNLEEHPISKLSVDLELIKYQTTRISIFEMTLGLEKKLIDKYSTL PTDSFRNMLERWLQCKANRPELKNYVNSLIAVRNAFSHNQYPMYD ATLFAEVKKFTLFPSVDTKKIELNIAPQLLEIVGKAIKEIEKSEN KN
Porphyromonas gíngívalís	4	MNTVPASENKGQSRTVEDDPQYFGLYLNLARENLIEVESHVRIKF GKKKLNEESLKQSLLCDHLLSVDRWTKVYGHSRRYLPFLHYFDPD SQIEKDHDSKTGVDPDSAQRLIRELYSLLDFLRNDFSHNRLDGTT FEHLEVSPDISSFITGTYSLACGRAQSRFAVFFKPDDFVLAKNRK EQLISVADGKECLTVSGFAFFICLFLDREQASGMLSRIRGFKRTD ENWARAVHETFCDLCIRHPHDRLESSNTKEALLLDMLNELNRCPR ILYDMLPEEERAQFLPALDENSMNNLSENSLDEESRLLWDGSSDW AEALTKRIRHQDRFPYLMLRFIEEMDLLKGIRFRVDLGEIELDSY SKKVGRNGEYDRTITDHALAFGKLSDFQNEEEVSRMISGEASYPV RFSLFAPRYAIYDNKIGYCHTSDPVYPKSKTGEKRALSNPQSMGF ISVHDLRKLLLMELLCEGSFSRMQSDFLRKANRILDETAEGKLQF SALFPEMRHRFIPPQNPKSKDRREKAETTLEKYKQEIKGRKDKLN SQLLSAFDMDQRQLPSRLLDEWMNIRPASHSVKLRTYVKQLNEDC RLRLRKFRKDGDGKARAIPLVGEMATFLSQDIVRMIISEETKKLI TSAYYNEMQRSLAQYAGEENRRQFRAIVAELRLLDPSSGHPFLSA TMETAHRYTEGFYKCYLEKKREWLAKIFYRPEQDENTKRRISVFF VPDGEARKLLPLLIRRRMKEQNDLQDWIRNKQAHPIDLPSHLFDS KVMELLKVKDGKKKWNEAFKDWWSTKYPDGMQPFYGLRRELNIHG KSVSYIPSDGKKFADCYTHLMEKTVRDKKRELRTAGKPVPPDLAA

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Tabela 1
		DIKRSFHRAVNEREFMLRLVQEDDRLMLMAINKMMTDREEDILPG LKNIDSILDEENQFSLAVHAKVLEKEGEGGDNSLSLVPATIEIKS KRKDWSKYIRYRYDRRVPGLMSHFPEHKATLDEVKTLLGEYDRCR IKIFDWAFALEGAIMSDRDLKPYLHESSSREGKSGEHSTLVKMLV EKKGCLTPDESQYLILIRNKAAHNQFPCAAEMPLIYRDVSAKVGS IEGSSAKDLPEGSSLVDSLWKKYEMIIRKILPILDPENRFFGKLL NNMSQPINDL
Bacteroides pyogenes	5	MESIKNSQKSTGKTLQKDPPYFGLYLNMALLNVRKVENHIRKWLG DVALLPEKSGFHSLLTTDNLSSAKWTRFYYKSRKFLPFLEMFDSD KKSYENRRETAECLDTIDRQKISSLLKEVYGKLQDIRNAFSHYHI DDQSVKHTALIISSEMHRFIENAYSFALQKTRARFTGVFVETDFL QAEEKGDNKKFFAIGGNEGIKLKDNALIFLICLFLDREEAFKFLS RATGFKSTKEKGFLAVRETFCALCCRQPHERLLSVNPREALLMDM LNELNRCPDILFEMLDEKDQKSFLPLLGEEEQAHILENSLNDELC EAIDDPFEMIASLSKRVRYKNRFPYLMLRYIEEKNLLPFIRFRID LGCLELASYPKKMGEENNYERSVTDHAMAFGRLTDFHNEDAVLQQ ITKGITDEVRFSLYAPRYAIYNNKIGFVRTSGSDKISFPTLKKKG GEGHCVAYTLQNTKSFGFISIYDLRKILLLSFLDKDKAKNIVSGL LEQCEKHWKDLSENLFDAIRTELQKEFPVPLIRYTLPRSKGGKLV SSKLADKQEKYESEFERRKEKLTEILSEKDFDLSQIPRRMIDEWL NVLPTSREKKLKGYVETLKLDCRERLRVFEKREKGEHPLPPRIGE MATDLAKDIIRMVIDQGVKQRITSAYYSEIQRCLAQYAGDDNRRH LDSIIRELRLKDTKNGHPFLGKVLRPGLGHTEKLYQRYFEEKKEW LEATFYPAASPKRVPRFVNPPTGKQKELPLIIRNLMKERPEWRDW KQRKNSHPIDLPSQLFENEICRLLKDKIGKEPSGKLKWNEMFKLY

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Tabela 1
		WDKEFPNGMQRFYRCKRRVEVFDKVVEYEYSEEGGNYKKYYEALI DEVVRQKISSSKEKSKLQVEDLTLSVRRVFKRAINEKEYQLRLLC EDDRLLFMAVRDLYDWKEAQLDLDKIDNMLGEPVSVSQVIQLEGG QPDAVIKAECKLKDVSKLMRYCYDGRVKGLMPYFANHEATQEQVE MELRHYEDHRRRVFNWVFALEKSVLKNEKLRRFYEESQGGCEHRR CIDALRKASLVSEEEYEFLVHIRNKSAHNQFPDLEIGKLPPNVTS GFCECIWSKYKAIICRIIPFIDPERRFFGKLLEQK
Alístipes sp. ZGR0009	6	MSNEIGAFREHQFAYAPGNEKQEEATFATYFNLALSNVEGMMFGE VESNPDKIEKSLDTLPPAILRQIASFIWLSKEDHPDKAYSTEEVK VIVTDLVRRLCFYRNYFSHCFYLDTQYFYSDELVDTTAIGEKLPY NFHHFITNRLFRYSLPEITLFRWNEGERKYEILRDGLIFFCCLFL KRGQAERFLNELRFFKRTDEEGRIKRTIFTKYCTRESHKHIGIEE QDFLIFQDIIGDLNRVPKVCDGVVDLSKENERYIKNRETSNESDE NKARYRLLIREKDKFPYYLMRYIVDFGVLPCITFKQNDYSTKEGR GQFHYQDAAVAQEERCYNFVVRNGNVYYSYMPQAQNVVRISELQG TISVEELRNMVYASINGKDVNKSVEQYLYHLHLLYEKILTISGQT IKEGRVDVEDYRPLLDKLLLRPASNGEELRRELRKLLPKRVCDLL SNRFDCSEGVSAVEKRLKAILLRHEQLLLSQNPALHIDKIKSVID YLYLFFSDDEKFRQQPTEKAHRGLKDEEFQMYHYLVGDYDSHPLA LWKELEASGRLKPEMRKLTSATSLHGLYMLCLKGTVEWCRKQLMS IGKGTAKVEAIADRVGLKLYDKLKEYTPEQLEREVKLVVMHGYAA AATPKPKAQAAIPSKLTELRFYSFLGKREMSFAAFIRQDKKAQKL WLRNFYTVENIKTLQKRQAAADAACKKLYNLVGEVERVHTNDKVL VLVAQ RYRERLLNVGS KCAVT L DN P E RQQ KLADVY EVQNAWL SIR FDDLDFTLTHVNLSNLRKAYNLIPRKHILAFKEYLDNRVKQKLCE

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Tabela 1
		ECRNVRRKEDLCTCCSPRYSNLTSWLKENHSESSIEREAATMMLL DVERKLLSFLLDERRKAIIEYGKFIPFSALVKECRLADAGLCGIR NDVLHDNVISYADAIGKLSAYFPKEASEAVEYIRRTKEVREQRRE ELMANSSQ
Prevotella sp. ΜΆ2016	7	MSKECKKQRQEKKRRLQKANFSISLTGKHVFGAYFNMARTNFVKT INYILPIAGVRGNYSENQINKMLHALFLIQAGRNEELTTEQKQWE KKLRLNPEQQTKFQKLLFKHFPVLGPMMADVADHKAYLNKKKSTV QTEDETFAMLKGVSLADCLDIICLMADTLTECRNFYTHKDPYNKP SQLADQYLHQEMIAKKLDKVVVASRRILKDREGLSVNEVEFLTGI DHLHQEVLKDE FGNAKVKDGKVMKT FVEYDDFY FKISGKRLVNGY TVTTKDDKPVNVNTMLPALSDFGLLYFCVLFLSKPYAKLFIDEVR LFEYSPFDDKENMIMSEMLSIYRIRTPRLHKIDSHDSKATLAMDI FGELRRCPMELYNLLDKNAGQPFFHDEVKHPNSHTPDVSKRLRYD DRFPTLALRYIDETELFKRIRFQLQLGSFRYKFYDKENCIDGRVR VRRIQKEINGYGRMQEVADKRMDKWGDLIQKREERSVKLEHEELY INLDQFLEDTADSTPYVTDRRPAYNIHANRIGLYWEDSQNPKQYK VFDENGMYIPELVVTEDKKAPIKMPAPRCALSVYDLPAMLFYEYL REQQDNEFPSAEQVIIEYEDDYRKFFKAVAEGKLKPFKRPKEFRD FLKKEYPKLRMADIPKKLQLFLCSHGLCYNNKPETVYERLDRLTL QHLEERELHIQNRLEHYQKDRDMIGNKDNQYGKKSFSDVRHGALA RYLAQSMMEWQPTKLKDKEKGHDKLTGLNYNVLTAYLATYGHPQV PEEGFTPRTLEQVLINAHLIGGSNPHPFINKVLALGNRNIEELYL HYLEEELKHIRSRIQSLSSNPSDKALSALPFIHHDRMRYHERTSE EMMALAARYTTIQLPDGLFTPYILEILQKHYTENSDLQNALSQDV PVKLNPTCNAAYLITLFYQTVLKDNAQPFYLSDKTYTRNKDGEKA

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Tabela 1
		ESFSFKRAYELFSVLNNNKKDTFPFEMIPLFLTSDEIQERLSAKL LDGDGNPVPEVGEKGKPATDSQGNTIWKRRIYSEVDDYAEKLTDR DMKISFKGEWEKLPRWKQDKIIKRRDETRRQMRDELLQRMPRYIR DIKDNE RTL RRY KTQ DMVL FLLAE KMFTNIISEQSSE FNWKQMRL SKVCNEAFLRQTLTFRVPVTVGETTIYVEQENMSLKNYGEFYRFL TDDRLMSLLNNIVETLKPNENGDLVIRHTDLMSELAAYDQYRSTI FMLIQSIENLIITNNAVLDDPDADGFWVREDLPKRNNFASLLELI NQLNNVELTDDERKLLVAIRNAFSHNSYNIDFSLIKDVKHLPEVA KGILQHLQSMLGVEITK
Ríemerella anatípestífer	8	MEKPLLPNVYTLKHKFFWGAFLNIARHNAFITICHINEQLGLKTP SNDDKIVDVVCETWNNILNNDHDLLKKSQLTELILKHFPFLTAMC YHPPKKEGKKKGHQKEQQKEKESEAQSQAEALNPSKLIEALEILV NQLHSLRNYYSHYKHKKPDAEKDIFKHLYKAFDASLRMVKEDYKA HFTVNLTRDFAHLNRKGKNKQDNPDFNRYRFEKDGFFTESGLLFF TNLFLDKRDAYWMLKKVSGFKASHKQREKMTTEVFCRSRILLPKL RLESRYDHNQMLLDMLSELSRCPKLLYEKLSEENKKHFQVEADGF LDEIEEEQNPFKDTLIRHQDRFPYFALRYLDLNESFKSIRFQVDL GTYHYCIYDKKIGDEQEKRHLTRTLLSFGRLQDFTEINRPQEWKA LTKDLDYKETSNQPFISKTTPHYHITDNKIGFRLGTSKELYPSLE IKDGANRIAKYPYNSGFVAHAFISVHELLPLMFYQHLTGKSEDLL KETVRHIQRIYKDFEEERINTIEDLEKANQGRLPLGAFPKQMLGL LQNKQPDLSEKAKIKIEKLIAETKLLSHRLNTKLKSSPKLGKRRE KLIKTGVLADWLVKD FMRFQ PVAY DAQNQ PIKS S KAN ST E FW FIR RALALYGGEKNRLEGYFKQTNLIGNTNPHPFLNKFNWKACRNLVD FYQQYLEQREKFLEAIKNQPWEPYQYCLLLKIPKENRKNLVKGWE

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Tabela 1
		QGGISLPRGLFTEAIRETLSEDLMLSKPIRKEIKKHGRVGFISRA ITLYFKEKYQDKHQSFYNLSYKLEAKAPLLKREEHYEYWQQNKPQ SPTESQRLELHTSDRWKDYLLYKRWQHLEKKLRLYRNQDVMLWLM TLELTKNHFKELNLNYHQLKLENLAVNVQEADAKLNPLNQTLPMV LPVKVYPATAFGEVQYHKTPIRTVYIREEHTKALKMGNFKALVKD RRLNGLFSFIKEENDTQKHPISQLRLRRELEIYQSLRVDAFKETL SLEEKLLNKHTSLSSLENEFRALLEEWKKEYAASSMVTDEHIAFI ASVRNAFCHNQYPFYKEALHAPIPLFTVAQPTTEEKDGLGIAEAL LKVLREYCEIVKSQI
Prevotella aurantiaca	9	MEDDKKTTGSISYELKDKHFWAAFLNLARHNVYITINHINKLLEI REIDNDEKVLDIKTLWQKGNKDLNQKARLRELMTKHFPFLETAIY TKNKEDKKEVKQEKQAEAQSLESLKDCLFLFLDKLQEARNYYSHY KYSEFSKEPEFEEGLLEKMYNIFGNNIQLVINDYQHNKDINPDED FKHLDRKGQFKYSFADNEGNITESGLLFFVSLFLEKKDAIWMQQK LNGFKDNLENKKKMTHEVFCRSRILMPKLRLESTQTQDWILLDML NELIRCPKSLYERLQGDDREKFKVPFDPADEDYNAEQEPFKNTLI RHQDRFPYFVLRYFDYNEIFKNLRFQIDLGTYHFSIYKKLIGGQK EDRHLTHKLYGFERIQEFAKQNRPDEWKAIVKDLDTYETSNKRYI SETTPHYHLENQKIGIRFRNGNKEIWPSLKTNDENNEKSKYKLDK QYQAEAFLSVHELLPMMFYYLLLKKEKPNNDEINASIVEGFIKRE IRNIFKLYDAFANGEINNIDDLEKYCADKGIPKRHLPKQMVAILY DE HKDMVKEAKRKQKEMVKDT KKLLATLE KQTQKE KE DDGRNVKL LKSGEIARWLVNDMMRFQPVQKDNEGKPLNNSKANSTEYQMLQRS LALYNNEEKPTRYFRQVNLIESNNPHPFLKWTKWEECNNILTFYY SYLTKKIEFLNKLKPEDWKKNQYFLKLKEPKTNRETLVQGWKNGF

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Tabela 1
		NLPRGIFTEPIREWFKRHQNNSKEYEKVEALDRVGLVTKVIPLFF KEEYFKDKEENFKEDTQKEINDCVQPFYNFPYNVGNIHKPKEKDF LHREERIELWDKKKDKFKGYKEKIKSKKLTEKDKEEFRSYLEFQS WNKFERELRLVRNQDIVTWLLCKELIDKLKIDELNIEELKKLRLN NIDTDTAKKEKNNILNRVMPMELPVTVYEIDDSHKIVKDKPLHTI YIKEAET KLLKQGNFKALVKDRRLNGL FS FVKTNS EAE S KRNPIS KLRVEYELGEYQEARIEIIQDMLALEEKLINKYKDLPTNKFSEML NSWLEGKDEADKARFQNDVDFLIAVRNAFSHNQYPMHNKIEFANI KPFSLYTANNSEEKGLGIANQLKDKTKETTDKIKKIEKPIETKE
Prevotella saccharolytíca	10	MEDKPFWAAFFNLARHNVYLTVNHINKLLDLEKLYDEGKHKEIFE REDIFNISDDVMNDANSNGKKRKLDIKKIWDDLDTDLTRKYQLRE LILKHFPFIQPAIIGAQTKERTTIDKDKRSTSTSNDSLKQTGEGD INDLLSLSNVKSMFFRLLQILEQLRNYYSHVKHSKSATMPNFDED LLNWMRYIFIDSVNKVKEDYSSNSVIDPNTSFSHLIYKDEQGKIK PCRYPFTSKDGSINAFGLLFFVSLFLEKQDSIWMQKKIPGFKKAS ENYMKMTNEVFCRNHILLPKIRLETVYDKDWMLLDMLNEVVRCPL SLYKRLTPAAQNKFKVPEKSSDNANRQEDDNPFSRILVRHQNRFP YFVLRFFDLNEVFTTLRFQINLGCYHFAICKKQIGDKKEVHHLIR TLYGFSRLQNFTQNTRPEEWNTLVKTTEPSSGNDGKTVQGVPLPY ISYTIPHYQIENEKIGIKIFDGDTAVDTDIWPSVSTEKQLNKPDK YTLTPGFKADVFLSVHELLPMMFYYQLLLCEGMLKTDAGNAVEKV LIDTRNAIFNLYDAFVQEKINTITDLENYLQDKPILIGHLPKQMI DLLKGHQRDMLKAVEQKKAMLIKDTERRLKLLDKQLKQETDVAAK NTGTLLKNGQIADWLVNDMMRFQPVKRDKEGNPINCSKANSTEYQ MLQRAFAFYATDSCRLSRYFTQLHLIHSDNSHLFLSRFEYDKQPN

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 564/817

557/776

Tabela 1
		LIAFYAAYLKAKLEFLNELQPQNWASDNYFLLLRAPKNDRQKLAE GWKNGFNLPRGLFTEKIKTWFNEHKTIVDISDCDIFKNRVGQVAR LIPVFFDKKFKDHSQPFYRYDFNVGNVSKPTEANYLSKGKREELF KSYQNKFKNNIPAEKTKEYREYKNFSLWKKFERELRLIKNQDILI WLMCKNLFDEKIKPKKDILEPRIAVSYIKLDSLQTNTSTAGSLNA LAKVVPMTLAIHIDSPKPKGKAGNNEKENKEFTVYIKEEGTKLLK WGNFKTLLADRRIKGLFSYIEHDDIDLKQHPLTKRRVDLELDLYQ TCRIDIFQQTLGLEAQLLDKYSDLNTDNFYQMLIGWRKKEGIPRN IKEDTDFLKDVRNAFSHNQYPDSKKIAFRRIRKFNPKELILEEEE GLGIATQMYKEVEKVVNRIKRIELFD
HMPREF9712_031 08 [Myroídes odoratimimus CCUG 10230]	11	MKDILTTDTTEKQNRFYSHKIADKYFFGGYFNLASNNIYEVFEEV NKRNT FGKLAKRDNGNLKNY11HVFKDEL SISD FEKRVAIFASY F PILETVDKKSIKERNRTIDLTLSQRIRQFREMLISLVTAVDQLRN FYTHYHHSDIVIENKVLDFLNSSFVSTALHVKDKYLKTDKTKEFL KETIAAELDILIEAYKKKQIEKKNTRFKANKREDILNAIYNEAFW SFINDKDKDKDKETVVAKGADAYFEKNHHKSNDPDFALNISEKGI VYLLSFFLTNKEMDSLKANLTGFKGKVDRESGNSIKYMATQRIYS FHTYRGLKQKIRTSEEGVKETLLMQMIDELSKVPNVVYQHLSTTQ QNSFIEDWNEYYKDYEDDVETDDLSRVIHPVIRKRYEDRFNYFAI RFLDEFFDFPTLRFQVHLGDYVHDRRTKQLGKVESDRIIKEKVTV FARLKDINSAKASYFHSLEEQDKEELDNKWTLFPNPSYDFPKEHT LQHQGEQKNAGKIGIYVKLRDTQYKEKAALEEARKSLNPKERSAT KASKYDIITQIIEANDNVKSEKPLVFTGQPIAYLSMNDIHSMLFS LLTDNAELKKTPEEVEAKLIDQIGKQINEILSKDTDTKILKKYKD NDLKETDTDKITRDLARDKEEIEKLILEQKQRADDYNYTSSTKFN

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 565/817

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Tabela 1
		IDKSRKRKHLLFNAEKGKIGVWLANDIKRFMFKESKSKWKGYQHT ELQKLFAYFDTSKSDLELILSNMVMVKDYPIELIDLVKKSRTLVD FLNKYLEARLEYIENVITRVKNSIGTPQFKTVRKECFTFLKKSNY TVVSLDKQVERILSMPLFIERGFMDDKPTMLEGKSYKQHKEKFAD WFVHYKENSNYQNFYDTEVYEITTEDKREKAKVTKKIKQQQKNDV FTLMMVNYMLEEVLKLSSNDRLSLNELYQTKEERIVNKQVAKDTQ ERNKNYIWNKVVDLQLCDGLVHIDNVKLKDIGN FRKY ENDS RVKE FLTYQSDIVWSAYLSNEVDSNKLYVIERQLDNYESIRSKELLKEV QEIECSVYNQVANKESLKQSGNENFKQYVLQGLLPIGMDVREMLI LSTDVKFKKEEIIQLGQAGEVEQDLYSLIYIRNKFAHNQLPIKEF FDFCENNYRSISDNEYYAEYYMEIFRSIKEKYAN
Prevotella intermedia	12	MEDDKKTTDSIRYELKDKHFWAAFLNLARHNVYITVNHINKILEE DEINRDGYENTLENSWNEIKDINKKDRLSKLIIKHFPFLEATTYR QNPTDTTKQKEEKQAEAQSLESLKKSFFVFIYKLRDLRNHYSHYK HSKSLERPKFEEDLQNKMYNIFDVSIQFVKEDYKHNTDINPKKDF KHLDRKRKGKFHYSFADNEGNITESGLLFFVSLFLEKKDAIWVQK KLEGFKCSNKSYQKMTNEVFCRSRMLLPKLRLESTQTQDWILLDM LNELIRCPKSLYERLQGVNRKKFYVSFDPADEDYDAEQEPFKNTL VRHQDRFPYFALRYFDYNEVFANLRFQIDLGTYHFSIYKKLIGGQ KEDRHLTHKLYGFERIQEFDKQNRPDEWKAIVKDSDTFKKKEEKE EEKPYISETTPHYHLENKKIGIAFKNHNIWPSTQTELTNNKRKKY NLGTSIKAEAFLSVHELLPMMFYYLLLKTENTKNDNKVGGKKETK KQGKHKIEAIIESKIKDIYALYDAFANGEINSEDELKEYLKGKDI KIVHLPKQMIAILKNEHKDMAEKAEAKQEKMKLATENRLKTLDKQ LKGKIQNGKRYNSAPKSGEIASWLVNDMMRFQPVQKDENGESLNN

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 566/817

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Tabela 1
		SKANSTEYQLLQRTLAFFGSEHERLAPYFKQTKLIESSNPHPFLN DTEWEKCSNILSFYRSYLKARKNFLESLKPEDWEKNQYFLMLKEP KTNRETLVQGWKNGFNLPRGFFTEPIRKWFMEHWKSIKVDDLKRV GLVAKVTPLFFSEKYKDSVQPFYNYPFNVGDVNKPKEEDFLHREE RIELWDKKKDKFKGYKAKKKFKEMTDKEKEEHRSYLEFQSWNKFE RELRLVRNQDIVTWLLCTELIDKLKIDELNIKELKKLRLKDINTD TAKKE KNNILNRVMPME L PVTVY KVNKGGYIIKNKPLHTIYIKE A ETKLLKQGNFKALVKDRRLNGLFSFVKTPSEAESESNPISKLRVE YELGKYQNARLDIIEDMLALEKKLIDKYNSLDTDNFHNMLTGWLE LKGEAKKARFQNDVKLLTAVRNAFSHNQYPMYDENLFGNIERFSL SSSNIIES KGL DIAAKL KE EVS KAAKKIQNEE DNKKE KE T
Capn o cy t oph a ga canimorsus	13	MKNIQRLGKGNEFSPFKKEDKFYFGGFLNLANNNIEDFFKEIITR FGIVITDENKKPKETFGEKILNEIFKKDISIVDYEKWVNIFADYF PFTKYLSLYLEEMQFKNRVICFRDVMKELLKTVEALRNFYTHYDH EPIKIEDRVFYFLDKVLLDVSLTVKNKYLKTDKTKEFLNQHIGEE LKELCKQRKDYLVGKGKRIDKESEIINGIYNNAFKDFICKREKQD DKENHNSVEKILCNKEPQNKKQKSSATVWELCSKSSSKYTEKSFP NRENDKHCLEVPISQKGIVFLLSFFLNKGEIYALTSNIKGFKAKI TKEEPVTYDKNSIRYMATHRMFSFLAYKGLKRKIRTSEINYNEDG QASSTYEKETLMLQMLDELNKVPDVVYQNLSEDVQKTFIEDWNEY LKENNGDVGTMEEEQVIHPVIRKRYEDKFNYFAIRFLDEFAQFPT LRFQVHLGNYLCDKRTKQICDTTTEREVKKKITVFGRLSELENKK AIFLNEREEIKGWEVFPNPSYDFPKENISVNYKDFPIVGSILDRE KQPVSNKIGIRVKIADELQREIDKAIKEKKLRNPKNRKANQDEKQ KERLVNEIVSTNSNEQGEPVVFIGQPTAYLSMNDIHSVLYEFLIN

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 567/817

560/776

Tabela 1
		KISGEALETKIVEKIETQIKQIIGKDATTKILKPYTNANSNSINR EKLLRDLEQEQQILKTLLEEQQQREKDKKDKKSKRKHELYPSEKG KVAVWLANDIKRFMPKAFKEQWRGYHHSLLQKYLAYYEQSKEELK NLLPKEVFKHFPFKLKGYFQQQYLNQFYTDYLKRRLSYVNELLLN IQNFKNDKDALKATEKECFKFFRKQNYIINPINIQIQSILVYPIF LKRGFLDEKPTMIDREKFKENKDTELADWFMHYKNYKEDNYQKFY AYPLEKVEEKEKFKRNKQINKQKKNDVYTLMMVEYIIQKIFGDKF VEENPLVLKGIFQSKAERQQNNTHAATTQERNLNGILNQPKDIKI QGKITVKGVKLKDIGNFRKYEIDQRVNTFLDYEPRKEWMAYLPND WKEKEKQGQLPPNNVIDRQISKYETVRSKILLKDVQELEKIISDE IKEEHRHDLKQGKYYNFKYYILNGLLRQLKNENVENYKVFKLNTN PEKVNITQLKQEATDLEQKAFVLTYIRNKFAHNQLPKKEFWDYCQ EKYGKIEKEKTYAEYFAEVFKREKEALIK
Porphyromonas gulae	14	MTEQSERPYNGTYYTLEDKHFWAAFLNLARHNAYITLTHIDRQLA YSKADITNDQDVLSFKALWKNFDNDLERKSRLRSLILKHFSFLEG AAYGKKLFESKSSGNKSSKNKELTKKEKEELQANALSLDNLKSIL FDFLQKLKDFRNYYSHYRHSGSSELPLFDGNMLQRLYNVFDVSVQ RVKIDHEHNDEVDPHYHFNHLVRKGKKDRYGHNDNPSFKHHFVDG EGMVTEAGLLFFVSLFLEKRDAIWMQKKIRGFKGGTETYQQMTNE VFCRSRISLPKLKLESLRMDDWMLLDMLNELVRCPKPLYDRLRED DRACFRVPVDILPDEDDTDGGGEDPFKNTLVRHQDRFPYFALRYF DLKKVFTSLRFHIDLGTYHFAIYKKMIGEQPEDRHLTRNLYGFGR IQDFAEEHRPEEWKRLVRDLDYFETGDKPYISQTSPHYHIEKGKI GLRFMPEGQHLWPSPEVGTTRTGRSKYAQDKRLTAEAFLSVHELM PMMFYYFLLREKYSEEVSAERVQGRIKRVIEDVYAVYDAFARDEI

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 568/817

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Tabela 1
		NTRDELDACLADKGIRRGHLPRQMIAILSQEHKDMEEKIRKKLQE MMADTDHRLDMLDRQTDRKIRIGRKNAGLPKSGVIADWLVRDMMR FQPVAKDASGKPLNNSKANSTEYRMLQRALALFGGEKERLTPYFR QMNLTGGNNPHPFLHETRWESHTNILSFYRSYLRARKAFLERIGR SDRVENRPFLLLKEPKTDRQTLVAGWKGEFHLPRGIFTEAVRDCL IEMGHDEVASYKEVGFMAKAVPLYFERACEDRVQPFYDSPFNVGN SLKPKKGRFLSKEERAEEWERGKERFRDLEAWSYSAARRIEDAFA GIEYASPGNKKKIEQLLRDLSLWEAFESKLKVRADRINLAKLKKE ILEAQEHPYHDFKSWQKFERELRLVKNQDIITWMMCRDLMEENKV EGLDTGTLYLKDIRPNVQEQGSLNVLNRVKPMRLPVVVYRADSRG HVHKEEAPLATVYIEERDTKLLKQGNFKSFVKDRRLNGLFSFVDT GGLAMEQYPISKLRVEYELAKYQTARVCVFELTLRLEESLLTRYP HLPDESFREMLESWSDPLLAKWPELHGKVRLLIAVRNAFSHNQYP MYDEAVFSSIRKYDPSSPDAIEERMGLNIAHRLSEEVKQAKETVE RIIQA
Prevotella sp. P5-125	15	MNIPALVENQKKYFGTYSVMAMLNAQTVLDHIQKVADIEGEQNEN NENLWFHPVMSHLYNAKNGYDKQPEKTMFIIERLQSYFPFLKIMA ENQREYSNGKYKQNRVEVNSNDIFEVLKRAFGVLKMYRDLTNHYK TYEEKLNDGCEFLTSTEQPLSGMINNYYTVALRNMNERYGYKTED LAFIQDKRFKFVKDAYGKKKSQVNTGFFLSLQDYNGDTQKKLHLS GVGIALLICLFLDKQYINIFLSRLPIFSSYNAQSEERRIIIRSFG INSIKLPKDRIHSEKSNKSVAMDMLNEVKRCPDELFTTLSAEKQS RFRIISDDHNEVLMKRSSDRFVPLLLQYIDYGKLFDHIRFHVNMG KLRYLLKADKTCIDGQTRVRVIEQPLNGFGRLEEAETMRKQENGT FGNSGIRIRDFENMKRDDANPANYPYIVDTYTHYILENNKVEMFI

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 569/817

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Tabela 1
		NDKEDSAPLLPVIEDDRYVVKTIPSCRMSTLEIPAMAFHMFLFGS KKTEKLIVDVHNRYKRLFQAMQKEEVTAENIASFGIAESDLPQKI LDLISGNAHGKDVDAFIRLTVDDMLTDTERRIKRFKDDRKSIRSA DNKMGKRGFKQISTGKLADFLAKDIVLFQPSVNDGENKITGLNYR IMQSAIAVYDSGDDYEAKQQFKLMFEKARLIGKGTTEPHPFLYKV FARSIPANAVEFYERYLIERKFYLTGLSNEIKKGNRVDVPFIRRD QNKWKTPAMKTLGRIYSEDLPVELPRQMFDNEIKSHLKSLPQMEG IDFNNANVTYLIAEYMKRVLDDDFQTFYQWNRNYRYMDMLKGEYD RKGSLQHCFTSVEEREGLWKERASRTERYRKQASNKIRSNRQMRN ASSEEIETILDKRLSNSRNEYQKSEKVIRRYRVQDALLFLLAKKT LTELADFDGERFKLKEIMPDAEKGILSEIMPMSFTFEKGGKKYTI TSEGMKLKNYGDFFVLASDKRIGNLLELVGSDIVSKEDIMEEFNK YDQCRPEISSIVFNLEKWAFDTYPELSARVDREEKVDFKSILKIL LNNKNINKEQSDILRKIRNAFDHNNYPDKGVVEIKALPEIAMSIK KAFGEYAIMK
Flavobacterium branchíophílum	16	MENLNKILDKENEICISKIFNTKGIAAPITEKALDNIKSKQKNDL NKEARLHYFSIGHSFKQIDTKKVFDYVLIEELKDEKPLKFITLQK DFFTKEFSIKLQKLINSIRNINNHYVHNFNDINLNKIDSNVFHFL KESFELAIIEKYYKVNKKYPLDNEIVLFLKELFIKDENTALLNYF TNLSKDEAIEYILTFTITENKIWNINNEHNILNIEKGKYLTFEAM LFLITIFLYKNEANHLLPKLYDFKNNKSKQELFTFFSKKFTSQDI DAEEGHLIKFRDMIQYLNHYPTAWNNDLKLESENKNKIMTTKLID SIIEFELNSNYPSFATDIQFKKEAKAFLFASNKKRNQTSFSNKSY NEEIRHNPHIKQYRDEIASALTPISFNVKEDKFKIFVKKHVLEEY FPNSIGYEKFLEYNDFTEKEKEDFGLKLYSNPKTNKLIERIDNHK

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 570/817

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Tabela 1
		LVKSHGRNQDRFMDFSMRFLAENNYFGKDAFFKCYKFYDTQEQDE FLQSNENNDDVKFHKGKVTTYIKYEEHLKNYSYWDCPFVEENNSM SVKISIGSEEKILKIQRNLMIYFLENALYNENVENQGYKLVNNYY RELKKDVEESIASLDLIKSNPDFKSKYKKILPKRLLHNYAPAKQD KAPENAFETLLKKADFREEQYKKLLKKAEHEKNKEDFVKRNKGKQ FKLHFIRKACQMMYFKEKYNTLKEGNAAFEKKDPVIEKRKNKEHE FGHHKNLNITREEFNDYCKWMFAFNGNDSYKKYLRDLFSEKHFFD NQEYKNLFESSVNLEAFYAKTKELFKKWIETNKPTNNENRYTLEN YKNLILQKQVFINVYHFSKYLIDKNLLNSENNVIQYKSLENVEYL ISDFYFQSKLSIDQYKTCGKLFNKLKSNKLEDCLLYEIAYNYIDK KNVHKIDIQKILTSKIILTINDANTPYKISVPFNKLERYTEMIAI KNQNNLKARFLIDLPLYLSKNKIKKGKDSAGYEIIIKNDLEIEDI NTINNKIINDSVKFTEVLMELEKYFILKDKCILSKNYIDNSEIPS LKQFSKVWIKENENEIINYRNIACHFHLPLLETFDNLLLNVEQKF IKEELQNVSTINDLSKPQEYLILLFIKFKHNNFYLNLFNKNESKT IKNDKEVKKNRVLQKFINQVILKKK
Myroides odoratimimus	17	MKDILTTDTTEKQNRFYSHKIADKYFFGGYFNLASNNIYEVFEEV NKRNT FGKLAKRDNGNLKNY11HVFKDEL SISD FEKRVAIFASY F PILETVDKKSIKERNRTIDLTLSQRIRQFREMLISLVTAVDQLRN FYTHYHHSDIVIENKVLDFLNSSFVSTALHVKDKYLKTDKTKEFL KETIAAELDILIEAYKKKQIEKKNTRFKANKREDILNAIYNEAFW SFINDKDKDKDKETVVAKGADAYFEKNHHKSNDPDFALNISEKGI VYLLSFFLTNKEMDSLKANLTGFKGKVDRESGNSIKYMATQRIYS FHTYRGLKQKIRTSEEGVKETLLMQMIDELSKVPNVVYQHLSTTQ QNSFIEDWNEYYKDYEDDVETDDLSRVTHPVIRKRYEDRFNYFAI

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 571/817

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Tabela 1
		RFLDEFFDFPTLRFQVHLGDYVHDRRTKQLGKVESDRIIKEKVTV FARLKDINSAKASYFHSLEEQDKEELDNKWTLFPNPSYDFPKEHT LQHQGEQKNAGKIGIYVKLRDTQYKEKAALEEARKSLNPKERSAT KASKYDIITQIIEANDNVKSEKPLVFTGQPIAYLSMNDIHSMLFS LLTDNAELKKTPEEVEAKLIDQIGKQINEILSKDTDTKILKKYKD NDLKETDTDKITRDLARDKEEIEKLILEQKQRADDYNYTSSTKFN IDKSRKRKHLLFNAEKGKIGVWLANDIKRFMFKESKSKWKGYQHI ELQKLFAYFDTSKSDLELILSNMVMVKDYPIELIDLVKKSRTLVD FLNKYLEARLEYIENVITRVKNSIGTPQFKTVRKECFTFLKKSNY TVVSLDKQVERILSMPLFIERGFMDDKPTMLEGKSYKQHKEKFAD WFVHYKENSNYQNFYDTEVYEITTEDKREKAKVTKKIKQQQKNDV FTLMMVNYMLEEVLKLSSNDRLSLNELYQTKEERIVNKQVAKDTQ ERNKNYIWNKVVDLQLCDGLVHIDNVKLKDIGN FRKY ENDS RVKE FLTYQSDIVWSAYLSNEVDSNKLYVIERQLDNYESIRSKELLKEV QEIECSVYNQVANKESLKQSGNENFKQYVLQGLLPIGMDVREMLI LSTDVKFKKEEIIQLGQAGEVEQDLYSLIYIRNKFAHNQLPIKEF FDFCENNYRSISDNEYYAEYYMEIFRSIKEKYAN
Flavobacterium columnare	18	MSSKNESYNKQKTFNHYKQEDKYFFGGFLNNADDNLRQVGKEFKT RINFNHNNNELASVFKDYFNKEKSVAKREHALNLLSNYFPVLERI QKHTNHNFEQTREIFELLLDTIKKLRDYYTHHYHKPITINPKIYD FLDDTLLDVLITIKKKKVKNDTSRELLKEKLRPELTQLKNQKREE LIKKGKKLLEENLENAVFNHCLIPFLEENKTDDKQNKTVSLRKYR KSKPNEETSITLTQSGLVFLMSFFLHRKEFQVFTSGLERFKAKVN TIKEEEISLNKNNIVYMITHWSYSYYNFKGLKHRIKTDQGVSTLE QNNTTHSLTNTNTKEALLTQIVDYLSKVPNEIYETLSEKQQKEFE

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 572/817

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Tabela 1
		EDINEYMRENPENEDSTFSSIVSHKVIRKRYENKFNYFAMRFLDE YAELPTLRFMVNFGDYIKDRQKKILESIQFDSERIIKKEIHLFEK LSLVTEYKKNVYLKETSNIDLSRFPLFPNPSYVMANNNIPFYIDS RSNNLDEYLNQKKKAQSQNKKRNLTFEKYNKEQSKDAIIAMLQKE IGVKDLQQRSTIGLLSCNELPSMLYEVIVKDIKGAELENKIAQKI REQYQSIRDFTLDSPQKDNIPTTLIKTINTDSSVTFENQPIDIPR LKNALQKELTLTQEKLLNVKEHEIEVDNYNRNKNTYKFKNQPKNK VDDKKLQRKYVFYRNEIRQEANWLASDLIHFMKNKSLWKGYMHNE LQSFLAFFEDKKNDCIALLETVFNLKEDCILTKGLKNLFLKHGNF IDFYKEYLKLKEDFLSTESTFLENGFIGLPPKILKKELSKRLKYI FIVFQKRQFIIKELEEKKNNLYADAINLSRGIFDEKPTMIPFKKP NPDEFASWFVASYQYNNYQSFYELTPDIVERDKKKKYKNLRAINK VKIQDYYLKLMVDTLYQDLFNQPLDKSLSDFYVSKAEREKIKADA KAYQKLNDSSLWNKVIHLSLQNNRITANPKLKDIGKYKRALQDEK IATLLTYDARTWTYALQKPEKENENDYKELHYTALNMELQEYEKV RSKELLKQVQELEKKILDKFYDFSNNASHPEDLEIEDKKGKRHPN FKLYITKALLKNESEIINLENIDIEILLKYYDYNTEELKEKIKNM DEDEKAKIINTKENYNKITNVLIKKALVLIIIRNKMAHNQYPPKF IYDLANRFVPKKEEEYFATYFNRVFETITKELWENKEKKDKTQV
Porphyromonas gíngívalís	19	MTEQNEKPYNGTYYTLEDKHFWAAFLNLARHNAYITLAHIDRQLA YSKADITNDEDILFFKGQWKNLDNDLERKARLRSLILKHFSFLEG AAY G KKL FESQSSGNKSSKKKELSKKEKEEL QANAL SLDNLKSIL FDFLQKLKDFRNYYSHYRHPESSELPLFDGNMLQRLYNVFDVSVQ RVKRDHEHNDKVDPHRHFNHLVRKGKKDKYGNNDNPFFKHHFVDR EGTVTEAGLLFFVSLFLEKRDAIWMQKKIRGFKGGTEAYQQMTNE

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 573/817

566/776

Tabela 1
		vfcrsrislpklkleslrtddwmlldmlnelvrcpkslydrlr.ee DRARFRVPVDILSDEDDTDGTEEDPFKNTLVRHQDRFPYFALRYF DLKKVFTSLRFHIDLGTYHFAIYKKNIGEQPEDRHLTRNLYGFGR IQDFAEEHRPEEWKRLVRDLDYFETGDKPYITQTTPHYHIEKGKI GLRFVPEGQHLWPSPEVGATRTGRSKYAQDKRLTAEAFLSVHELM PMMFYYFLLREKYSEEVSAEKVQGRIKRVIEDVYAVYDAFARDEI NTRDELDACLADKGIRRGHLPRQMIAILSQEHKDMEEKVRKKLQE MIADTDHRLDMLDRQTDRKIRIG RKNAGL P KS GWADWLVRDMMR FQPVAKDTSGKPLNNSKANSTEYRMLQRALALFGGEKERLTPYFR QMNLTGGNNPHPFLHETRWESHTNILSFYRSYLEARKAFLQSIGR SDRVENHRFLLLKEPKTDRQTLVAGWKGEFHLPRGIFTEAVRDCL IEMGY DEVG SY KEVG FMAKAVPLY FE RAS KDRVQ P FY DY P FNVGN SLKPKKGRFLSKEKRAEEWESGKERFRLAKLKKEILEAKEHPYHD FKSWQKFERELRLVKNQDIITWMMCRDLMEENKVEGLDTGTLYLK DIRT DVQ EQGS LNVLNRVKPMRL PVVVY RAD S RGHVH KE QAPLAT VYIEERDTKLLKQGNFKSFVKDRRLNGLFSFVDTGALAMEQYPIS KLRVEYELAKYQTARVCAFEQTLELEESLLTRYPHLPDKNFRKML ESWSDPLLDKWPDLHGNVRLLIAVRNAFSHNQYPMYDETLFSSIR KYDPSSPDAIEERMGLNIAHRLSEEVKQAKEMVERIIQA
Porphyromonas sp. COT-052 OH4946	20	MTEQSERPYNGTYYTLEDKHFWAAFLNLARHNAYITLTHIDRQLA YSKADITNDQDVLSFKALWKNFDNDLERKSRLRSLILKHFSFLEG AAYGKKLFESKSSGNKSSKNKELTKKEKEELQANALSLDNLKSIL FDFLQKLKDFRNYYSHYRHSESSELPLFDGNMLQRLYNVFDVSVQ RVKRDHEHNDKVDPHRHFNHLVRKGKKDRYGHNDNPSFKHHFVDS EGMVTEAGLLFFVSLFLEKRDAIWMQKKIRGFKGGTETYQQMTNE

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 574/817

567/776

Tabela 1
		VFCRSRISLPKLKLESLRTDDWMLLDMLNELVRCPKPLYDRLRED DRACFRVPVDILPDEDDTDGGGEDPFKNTLVRHQDRFPYFALRYF DLKKVFTSLRFHIDLGTYHFAIYKKMIGEQPEDRHLTRNLYGFGR IQDFAEEHRPEEWKRLVRDLDYFETGDKPYISQTTPHYHIEKGKI GLRFVPEGQHLWPSPEVGTTRTGRSKYAQDKRLTAEAFLSVHELM PMMFYYFLLREKYSEEVSAEKVQGRIKRVIEDVYAIYDAFARDEI NTLKELDACLADKGIRRGHLPKQMIGILSQERKDMEEKVRKKLQE MIADTDHRLDMLDRQTDRKIRIGRKNAGLPKSGVIADWLVRDMMR FQPVAKDTSGKPLNNSKANSTEYRMLQRALALFGGEKERLTPYFR QMNLTGGNNPHPFLHETRWESHTNILSFYRSYLRARKAFLERIGR SDRVENCPFLLLKEPKTDRQTLVAGWKGEFHLPRGIFTEAVRDCL IEMGYDEVGSYREVGFMAKAVPLYFERACEDRVQPFYDSPFNVGN SLKPKKGRFLSKEDRAEEWERGKERFRDLEAWSHSAARRIKDAFA GIEYASPGNKKKIEQLLRDLSLWEAFESKLKVRADKINLAKLKKE ILEAQEHPYHDFKSWQKFERELRLVKNQDIITWMMCRDLMEENKV EGLDTGTLYLKDIRPNVQEQGSLNVLNRVKPMRLPVVVYRADSRG HVHKEEAPLATVYIEERDTKLLKQGNFKSFVKDRRLNGLFSFVDT GGLAMEQYPISKLRVEYELAKYQTARVCVFELTLRLEESLLSRYP HLPDESFREMLESWSDPLLAKWPELHGKVRLLIAVRNAFSHNQYP MYDEAVFSSIRKYDPSSPDAIEERMGLNIAHRLSEEVKQAKETVE RIIQA
Prevotella intermedia	21	MEDDKKTKESTNMLDNKHFWAAFLNLARHNVYITVNHINKVLELK NKKDQD111DNDQ DILAIKT HWE KVNGDLNKT E RL RE LMT KH F P F LETAIYTKNKEDKEEVKQEKQAKAQSFDSLKHCLFLFLEKLQEAR NYYSHYKYSESTKEPMLEKELLKKMYNIFDDNIQLVIKDYQHNKD

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 575/817

568/776

Tabela 1
		INPDEDFKHLDRTEEEFNYYFTTNKKGNITASGLLFFVSLFLEKK DAIWMQQKLRGFKDNRESKKKMTHEVFCRSRMLLPKLRLESTQTQ DWILLDMLNELIRCPKSLYERLQGEYRKKFNVPFDSADEDYDAEQ EPFKNTLVRHQDRFPYFALRYFDYNEIFTNLRFQIDLGTYHFSIY KKLIGGQKEDRHLTHKLYGFERIQEFAKQNRTDEWKAIVKDFDTY ETSEEPYISETAPHYHLENQKIGIRFRNDNDEIWPSLKTNGENNE KRKYKLDKQYQAEAFLSVHELLPMMFYYLLLKKEEPNNDKKNASI VEGFIKREIRDIYKLYDAFANGEINNIDDLEKYCEDKGIPKRHLP KQMVAILY DE H KDMAE EAKRKQKEMVKDT KKLLAT LEKQTQGEIE DGGRNIRLLKSGEIARWLVNDMMRFQPVQKDNEGNPLNNSKANST EYQMLQRSLALYNKEEKPTRYFRQVNLINSSNPHPFLKWTKWEEC NNILSFYRSYLTKKIEFLNKLKPEDWEKNQYFLKLKEPKTNRETL VQGWKNGFNLPRGIFTEPIREWFKRHQNDSEEYEKVETLDRVGLV TKVIPLFFKKEDSKDKEEYLKKDAQKEINNCVQPFYGFPYNVGNI HKPDEKDFLPSEERKKLWGDKKYKFKGYKAKVKSKKLTDKEKEEY RSYLEFQSWNKFERELRLVRNQDIVTWLLCTELIDKLKVEGLNVE ELKKLRLKDIDTDTAKQEKNNILNRVMPMQLPVTVYEIDDSHNIV KDRPLHTVYIEETKTKLLKQGNFKALVKDRRLNGLFSFVDTSSET ELKSNPISKSLVEYELGEYQNARIETIKDMLLLEETLIEKYKTLP TDNFSDMLNGWLEGKDEADKARFQNDVKLLVAVRNAFSHNQYPMR NRIAFANINPFSLSSADTSEEKKLDIANQLKDKTHKIIKRIIEIE KPIETKE

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Tabela 2
Ortólogo	N-	Proteína acessória	5' PFS	3' PFS
Bergeyella zoohelcum	1		A	NGA
Bergeyella zoohelcum	1	csx27	A	NGA
Prevotella intermedia	2		A	NGA
Prevotella intermedia	2	csx2 8	A	NGA
Prevotella buccae	3		A	NGA
Prevotella buccae	3	csx2 8	A	NGA
Bacteroides pyogenes	5		A	NGA
Alistipes sp. ZOR0009	6		TG	NA(G)
Prevotella sp. MA2016	7		AT
Riemerella	8		A	NGA
anatipestifer
Riemerella	8	csx2 8	A	NGA
anatipestifer
Prevotella aurantiaca	9		G	NAA
Prevotella aurantiaca	9	csx2 8
Prevotella	10		AG
saccharolytica

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Tabela 2
Prevotella intermedia	12		AG
Capnocytophaga	13		A	NAA
canimorsus
Capnocytophaga	13	csx27	A	NAA
canimorsus
Porphyromonas gulae	14		A	NAA
Porphyromonas gulae	14	csx2 8	A	NGA
Prevotella sp. P5-125	15		AT
Fl a voba c t eri um	16		TG
branch!ophilum
Fl a voba c t eri um	16	csx27	TA
branch!ophilum
Myroides odoratimimus	17		T	NAA
Porphyromonas	19		A	NAA
gingivalis
Porphyromonas	19	csx2 8	A
gingivalis
Prevotella intermedia	21		A	NGA
Prevotella intermedia	21	csx2 8	A	NGA

Exemplo 2: atividade de Casl3b em células mamíferas

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571/776 [772] Células HEK293T foram transfectadas com uso do protocolo de lipofectamina 2000 padrão com os seguintes plasmideos:

[773] (a) plasmideo de expressão de CaslSb (ou C2c2 de controle) mamífero, com uma tag de Sequência de IX Nuclear Export no termo C do gene.

[774] (b) plasmideo de expressão de crRNA, cada um expressando tanto um crRNA de alvejamento contra Gaussia Luciferase ou um crRNA de não-alvejamento.

[775] (c) plasmideo repórter de Luciferase, que expressa Gaussia e Cypridinia luciferase de dois promotores separados.

[776] Gaussia luciferase foi alvejada para knockdown, e o nível de cypridinia luciferase foi usado para controle de eficiência de transfecção. Leptotríchía wadeíí C2c2 foi usado para comparação com ortólogos de C2c2.

[777] A seguintes sequências espaçadoras foram usadas nos respectivos guias:

Tabela 3:
Casl3b-guia 2	GGGCATTGGCTTCCATCTCTTTGAGCACCT
Casl3b-guia NT	GCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA
Experimento #2 (14 vs.
15 vs. C2c2)

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Tabela 3:
Casl3b-guia 0	GAAGTCTTCGTTGTTCTCGGTGGGCTTGGC
Casl3b-guia 1	GGGCATTGGCTTCCATCTCTTTGAGCACCT
Casl3b-guia 2	GACAGGCAGATCAGACAGCCCCTGGTGCAG
Casl3b-guia 3	GTAGGTGTGGCAGCGTCCTGGGATGAACTT
Casl3b-guia 4	GGAATGTCGACGATCGCCTCGCCTATGCCG
C2c2-guia 0	AGTCTTCGTTGTTCTCGGTGGGCTTGGC
C2c2-guia 1	GCATTGGCTTCCATCTCTTTGAGCACCT
C2c2-guia 2	CAGGCAGATCAGACAGCCCCTGGTGCAG
C2c2-guia 3	AGGTGTGGCAGCGTCCTGGGATGAACTT
C2c2-guia 4	AATGTCGACGATCGCCTCGCCTATGCCG
Casl3b-guia NT	GCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA
C2c2-guia NT	AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA

[778] Os resultados para os diferentes ortólogos de Casl3b são Fornecidos na Figura 2. Os ortólogos são classificados como Baixa/Nenhuma atividade, Médio, Alto, ou Ouro. Ortólogos Ouro forneceram >80% de knockdown de atividade de luciferase com a maioria dos guias testados. Ortólogos Altos forneceram >50% de knockdown de atividade de luciferase com a maioria dos guias testados. Ortólogos médios forneceram ~50% de knockdown de atividade de

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573/776 luciferase com a maioria dos guias testados. Baixo/nenhum ortólogos forneceram >80% de knockdown de atividade de luciferase com todos os guias testados.

[779] A Figura 3 mostra dados de comparação normalizada para a atividade de vários dos ortólogos testados, com uso do Guia 2 (GGGCATTGGCTTCCATCTCTTTGAGCACCT) e um guia de não-alvejamento como controle (GCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA). Pode-se observar que os ortólogos de Casl3b n° 14, 15, 19, e 20 (de Porphyromonas gulae, Prevotella sp. P5-125, Porphyromonas gingivalis, e Porphyromonas sp.COT-052OH4946) são particularmente ativos em células mamíferas.

[780]	A	Figura 4 mostra	dados normalizados	que
comparam os	dois	ortólogos mais	eficazes,	14 e 15,	com
C2c2/Casl3a,	com	uso de vários	guias de	alvejamento	de

luciferase e um guia de controle de não-alvejamento. Podese observar que os ortólogos de Casl3b n°14 e 15 (de Porphyromonas gulae e Prevotella sp. P5-125) são consistentemente mais ativos do que Leptotrichia wadeíí C2c2 em células mamíferas.

Exemplo 3 [781] A edição de ácido nucleico eficiente e precisa mantém grande premissa para tratar doença genética, particularmente no nível de RNA, em que transcrições relevantes de doença podem ser resgatadas para render

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574/776 produtos de proteína funcional. Sistemas de CRISPR-Cas do tipo VI contêm as RNases CaslS orientadas por RNA de efetor único programável. Aqui, é perfilada a diversidade de sistemas de Tipo VI para modificar um ortólogo de CaslS com capacidade de knockdown robusto e demonstrar edição de RNA com uso de CaslS cataliticamente inativa (dCaslS) para direcionar atividade de adenosina desaminase para transcrições em células mamíferas. Fundindo-se o domínio de ADAR2 desaminase a dCaslS e modificando-se RNAs-guia para criar um substrato de duplex de RNA ideal, foi alcançada a edição alvejada de adenosinas únicas específicas a inosinas (que é lida como guanosina durante translação) com eficiências de modo rotineiro variando de 20 a 40% e até 89%. Esse sistema, denominado como Edição de RNA para Substituição de A a I Programável (REPAIR), pode ser adicionalmente modificado para obter alta especificidade. Uma variante modificada, REPAIRv2, exibe aumento de mais do que 170 vezes em especificidade enquanto mantém edição de A a I em alvo robusta. Foi usado REPAIRv2 para editar transcrições de comprimento total que contêm mutações patogênicas conhecidas e criar versões truncadas funcionais adequadas para empacotamento em vetores virais adenoassociados (AAV). REPAIR apresenta uma plataforma de edição de RNA promissora com ampla aplicabilidade para pesquisa, terapêutica, e biotecnologia. Tecnologias de edição de ácido

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575/776 nucleico precisas são valiosas para estudar a função celular e como terapêutica inovadora. Embora ferramentas de edição atuais, tais como a Cas9 nuclease, possam alcançar modificação programável de loci genômicos, edições são frequentemente heterogêneas devido a inserções ou deleções ou exigem um modelo de doador para edição precisa. Editores de base, tais como fusões de dCas9-APOBEC, permite edição sem gerar uma quebra de fita dupla, mas pode carecer de precisão devido à natureza de atividade de citidina desaminase, o que edita qualquer citidina em uma janela alvo. Além disso, a necessidade de um motivo adjacente de protoespaçador (PAM) limita o número de sítios de edição possíveis. Aqui, é descrito o desenvolvimento de uma ferramenta de edição de base de RNA precisa e flexível com uso da enzima de Casl3 de alvejamento de RNA guiada por RNA do sistema imune adaptativo de repetições palindrômicas curtas interespaçadas de modo regular colocada em cluster procariótica (CRISPR) de tipo VI.

[782] Tecnologias de edição de ácido nucleico precisas são valiosos para estudar a função celular e como terapêutica inovadora. As ferramentas de edição atuais, com base em nucleases programáveis tal como as nucleases Cas9 (1-4) ou Cpfl(5) associadas a repetições palindrômicas curtas interespaçadas de modo regular colocada em cluster procariótica (CRISPR), foram amplamente adotadas para mediar

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576/776 divagem de DNA alvejada que, por sua vez, aciona a interrupção de gene alvejado através de união de terminação não-homóloga (NHEJ) ou edição de gene precisa através de reparo direcionado a homologia dependente de modelo (HDR) (6). NHEJ utiliza maquinários hospedeiros que são ativos tanto em células divididas quanto células pósmitóticas e fornece interrupção de gene eficiente gerandose uma mistura de mutações inserção ou deleção (indel) que pode causar deslocamentos de quadro em genes de codificação de proteína. HDR, em contraste, é mediado por maquinários hospedeiros cuja expressão é amplamente limitada às células replicantes. Sendo assim, o desenvolvimento de capacidades de edição de gene em células pós-mitóticas permanece um desafio principal. Recentemente, editores de base de DNA, tal como o uso de Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) para alvejar atividade de citidina desaminase aos alvos de genoma específicos para efetuar conversões de citosina em timina dentro de uma janela-alvo, permitem edição sem gerar uma quebra de fita dupla de DNA e reduz significativamente a formação de indels (7, 8). No entanto, o alcance de alvejamento de editores de base de DNA é limitado devido à necessidade de Cas9 para um motivo adjacente de protoespaçador (PAM) no sítio de edição (9) . Aqui, é descrito o desenvolvimento de uma tecnologia de edição de base de RNA precisa e flexível com uso do Casl3 de RNas guiado por RNA

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577/776 associado a CRISPR de tipo VI (10 a 13).

[783] Enzimas de Casl3 têm dois domínios de endoRNase com Eucariotos e Procariotos Superiores com ligação a Nucleotídeo (HEPN) que media divagem de RNA precisa (10, 11). Três famílias de proteína de Casl3 foram identificadas até agora: Casl3a (anteriormente conhecida como C2c2), CaslSb, e CaslSc (12, 13). Foram relatado recentemente que enzimas de CaslSa podem ser adaptadas como ferramentas para detecção de ácido nucleico(14) assim como knockdown de RNA de células mamíferas e vegetais e rastreameno de transcrição(15) . A natureza guiada de RNA de enzimas de CaslS torna as mesmas ferramenta atrativa para aplicações de ligação e perturbação de RNA.

[784] A adenosina desaminase gue atua em família de RNA (ADAR) de enzimas media a edição endógena de transcrições por meio de desaminação hidrolítica de adenosina para inosina, a nucleobase que é funcionalmente equivalente a guanosina em translação e splicing (16). Há dois ortólogos de ADAR humano funcionais, ADAR1 e ADAR2, que consistem em domínios de ligação de RNA de fita dupla de terminal N e um domínio de desanimação catalítica de terminal C. Sítios alvo endógenos de ADAR1 e ADAR2 contêm identidade de fita dupla substancial, e os domínios catalíticos exigem regiões duplexadas para edição suficiente in vitro e in vivo (17, 18). Embora proteínas de ADAR tenham motivos preferenciais

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578/776 para edição que podería restringir a flexibilidade potencial de alvo, mutantes hiperativos, tais como ADAR(E488Q)(19), aliviam restrições de sequência e aprimoram a inosina em taxas de edição de adenosina. ADARs desaminam preferencialmente adenosinas opostas a bases de citidina em duplexes de RNA(20), fornecendo uma oportunidade promissora para edição de base precisa. Embora abordagens precisas tenham fusões de ADAR alvejadas modificadas por meio de guias de RNA (21-24), a especificidade dessas abordagens não foi relatada e seus respectivos mecanismos de alvejamento se baseiam em hibridização de RNA-RNA sem o auxílio de parceiros de proteína que pode intensificar o reconhecimento alvo e severidade.

[785] Aqui, foi analisada a família inteira de enzimas de Casl3 para atividade de knockdown de RNA em células mamíferas e identificar o ortólogo de Casl3b de Prevotella sp. P5-125 (PspCasl3b) como a mais eficiente e específica para aplicações de célula mamífera. Então, foi fundido o domínio de ADAR2 desaminase (ADARDD) para inativar cataliticamente PspCasl3b e demonstrar edição de RNA para substituição (REPAIR) de A a I programável(G) de relatório e transcrições endógenas assim como mutações relevantes de doença. Por fim, foi empregado um esquema de mutagênese racional para aprimorar a especificidade de fusões de dCasl3b-ADAR2DD para gerar REPAIRv2 com aumento em mais do

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579/776 que 170 vezes em especificidade.

Projeto e clonagem de construtos bacterianos [786] Construtos de Casl3b otimizados de códon mamífero foram clonados no vetor de pACYC184 resistente a cloramf enicol sob o controle do promotor de Lac. Duas sequências de repetição direta (DR) correspondentes separadas por sítios de restrição de Bsal foram então inseridas a jusante de Casl3b, sob o controle do promotor de pJ23119. Por fim, oligos para espaçadores de alvejamento foram fosforilados com uso de T4 PNK (New England Biolabs), anelados e ligados em vetores digeridos de Bsal com uso de T7 ligase (Enzymatics) para gerar vetores de Casl3b de alvej amento.

Triagens de PFS bacteriano [787] Plasmideos de resistência de ampilicilina para triagens de PFS foram clonados inserindo-se produtos de PCR que contêm alvos de Casl3b com nucleotídeos 2 5' randomizados e nucleotídeos 4 3' randomizados separados por um sítio alvo imediatamente a jusante do códon inicial do gene bla de resistência a ampicilina com uso do NEB Gibson Assembly (New England Biolabs). 100 ng de plasmideos alvos resistentes a ampilicina foram então eletroporados com 65 a 100 ng de plasmideos de alvejamento de Casl3b resistentes a cloramfenicol em células de Endura Electrocompetent. Plasmideos de foram adicionados às células, incubados em 15

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580/776 minutos em ice, eletroporados com uso do protocolo do fabricante, e então 950 uL de meio de recuperação foi adicionado às células antes de um produto resultante de uma hora a 37 °C. O produto resultante foi plaqueado em placas de seleção dupla de cloramfenicol e ampicilina. Diluições em série do produto resultante foram usados para estimar o cfu/ng de DNA. 16 horas após o plaqueamento, células foram células removidas e DNA de plasmideo resultante coletados com uso do Kit Qiagen Plasmid Plus Maxi (Qiagen). Sequências alvo de Casl3b sobreviventes e suas regiões de flanqueamento foram amplificadas por PCR e sequenciadas com uso de um Illumina NextSeq. Para analisar preferências de PFS, as posições que contém nucleotídeos randomizados na biblioteca original foram extraídos, e sequências esgotadas relativas ao condição única de vetor que estavam presentes em ambas as biorréplicas foram extraídas com uso de scripts de piton personalizados. O -log2 da razão de abundância de PFS na condição de Casl3b em comparação ao controle único de vetor foi então usado para calcular motivos preferenciais. Especificamente, todas as sequências que têm razões de depleção de -log2(amostra/vetor) acima de um limiar específico foram usadas para gerar weblogos de motivos de sequência (weblogo.berkeley.edu). Os valores de razão de depleção específicos usados para gerar weblogos para cada ortólogo de Casl3b são listados na Tabela 7.

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Projeto e clonagem de construtos de mamífero para interferência de RNA [788] Para gerar vetores para testar ortólogos de Casl3 em células mamíferas, genes Casl3a, Casl3b, e Casl3c otimizados de códon mamífero foram amplificados com PCR e clonados com golden-gate em um vetor de expressão de mamífero que contém sequências de NLS duplas e um msfGFP de terminal C, sob o controle do promotor de EFlalpha. Para otimização adicional, ortólogos de Casl3 foram clonados com golden gate em vetores de destino que contém tags de localização de terminal C diferentes sob o controle do promotor de EFlalpha.

[789] 0 repórter de luciferase duplo foi clonado por amplificação de PCR de DNA de codificação de Gaussia e Cypridinia luciferase, os promotores de EFlalpha e CMV e montagem com uso da NEB Gibson Assembly (New England Biolabs).

[790] Para expressão de RNA de mamífero guia para ortólogos de Casl3a, Casl3b, ou Casl3c, as sequências de repetição direta correspondentes foram sintetizadas com sítios de aceptor de golden-gate e clonados sob expressão de U6 por meio de clonagem de digestão de restrição. Guias individuais foram então clonados nas colunas de expressão correspondentes para cada ortólogo por clonagem tipo golden gate .

Clonagem de bibliotecas incompatíveis agrupadas para

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582/776 especificidade de interferência de Casl3 [791] Sítios alvos de biblioteca incompatível agrupada foram criados por PCR. Oligos gue contém sequênciasalvo semidegeneradas em G-luciferase gue contém uma mistura de 94% da base correta e 2% de cada base incorreta em cada posição dentro do alvo foram usados como um iniciador, e um oligo correspondente a uma região não-alvejada de Gluciferase foi usado como o segundo iniciador na reação de PCR. 0 alvo de biblioteca incompatível foi então clonado no repórter de luciferase duplo no lugar da G-luciferase de tipo selvagem com uso de NEB Gibson assembly (New England Biolabs).

Projeto e clonagem de construtos de mamífero para edição de RNA [792] PspCasl3b foi feito cataliticamente inativo (dPspCasl3b) por meio de duas mutações de histidina a alanina (H133A/H1058A) no sítio catalítico do domínio de HEPNs. Os domínios de desaminase de ADAR1 e ADAR2 humano foram sintetizados e amplificados com PCR para clonagem gibson em colunas de vetor pcDNA-CMV e foram fundidos em dPspCasl3b no terminal C por meio de GS ou GSGGGGS ligantes. Para o experimento no qual foram testados diferentes ligantes, foram clonados os seguintes ligantes adicionais entre dPspCasl3b e ADAR2dd: GGGGSGGGGSGGGGS, EAAAK, GGSGGSGGSGGSGGSGGS, e SGSETPGTSESATPES (XTEN). Mutantes de

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583/776 especificidade foram gerados por clonagem gibson dos mutantes apropriados na coluna de dPspCasl3b-GSGGGGS.

[793] 0 vetor de repórter de luciferase para medir a atividade de edição de RNA foi gerado criando-se a mutação de W85X (TGG>TAG) no vetor de repórter de luciferase usado para experimentos de knockdown. Esse vetor de repórter expressa Gluc funcional como um controle de normalização, mas um Cluc defeituoso devido à adição de um sitio de prédeterminação. Para testar preferências de motivo de edição de ADAR, foi clonado cada motivo possível ao redor da adenosina no códon 85 (XAX) de Cluc.

[794] Para testar preferência de PFS de REPAIR, foi clonada uma biblioteca de plasmídeo agrupado que contém uma sequência de PFS de degeneração de 6 pares de base a montante de uma região alvo e sítio de edição de adenosina. A biblioteca foi sintetizada como um ultrâmero de Tecnologias de DNA integrados (IDT) e foi feita em fita dupla por meio de anelamento de um iniciador e fragmento de Klenow de preenchimento de polimerase de DNA I (New England Biolabs) da sequência. Esse fragmento de dsDNA gue contém a sequência de degeneração foi então clonada com gibson no vetor de repórter digerido e isso foi então precipitado com isopropanol e purificado. A biblioteca clonada foi então eletroporada em células de E. coli competentes de Endura (Lucigen) e plaqueadas em placas de bioensaio quadradas de

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245mm x 245mm (Nunc). Após 16 horas, colônias foram coletadas e submetidas a midiprep com uso de kit de midiprep MACHEREYNAGEL livre de endotoxina. Bibiotecas clonadas foram verificadas por sequenciamento de próxima geração.

[795] Para clonar mutações relevantes de doença para testar atividade de REPAIR, 34 G>A mutações relacionadas à patogênese de doença conforme definido em ClinVar foram selecionados e regiões de 200 bp que circundam essas mutações foram clonadas com golden gate entre mScarlett e EGFP sob um promotor de CMV. Duas mutações de G>A adicionais em AVPR2 e FANCC foram selecionadas para clonar com Gibson a sequência de gene inteira sob expressão de EFlalpha.

[796] Para expressão de RNA de mamífero guia para REPAIR, as sequências de repetição direta de PspCasl3b foram sintetizadas com sítios de aceptor de golden-gate e clonadas sob expressão de U6 por meio de clonagem de digestão de restrição. Guias individuais foram então clonados nessas colunas de expressão por clonagem tipo golden gate.

Cultura celular mamífera [797] Experimentos de cultura celular mamífera foram realizados na linhagem HEK293FT (Coleção de Culturas de Tipo Americano (ATCC) ) , que foi cultivada em Meio Eagle Modificado de Dulbecco com alto teor de glucose, piruvato de sódio, e GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), adicionalmente suplementado com 1* penicilina-estreptomicina (Thermo Fisher

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Scientific) e 10% de soro bovino (VWR Seradigm) . Células foram mantidas em confluência abaixo de 80%.

[798] A menos que notado de outro modo, todas as transfecções foram realizadas com Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) em placas de 96 poços revestidas com poliD-lisina (BD Biocoat). Células foram plaqueadas em aproximadamente 20,000 células/poço dezesseis horas antes da transfecção para garantir 90% de confluência no tempo de transfecção. Para cada poço na placa, plasmideos de transfecção foram combinados com Opti-MEM I Reduced Serum Medium (Thermo Fisher) a um total de 25 μΐ. Separadamente, 24,5 ul de Opti-MEM foi combinado com 0,5 ul de Lipofectamine 2000. As soluções de plasmideo e Lipofectamina foram então combinadas e incubadas por 5 minutos, dos quais os mesmos foram pipetados em células.

Ensaios de célula mamífera de knockdown de RNA [799] Para analisar alvejamento de RNA em células mamíferas com construtos repórter, 150 ng de construto de CaslS foi cotransfectado com 300 ng de plasmídeo de expressão de guia e 12,5 ng do construto repórter de knockdown. 48 horas após a transfecção, o meio que contém luciferase secretada foi removido de células, diluído em 1:5 em PBS, e medido para atividade com kits de ensaio de BioLux Cypridinia e Biolux Gaussia luciferase (New England Biolabs) em um leitor de placa (Biotek Synergy Neo2) com um protocolo de

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586/776 injeção. Todas as réplicas realizadas são réplicas biológicas.

[800] Para alvejamento de genes endógenos, 150 ng de construto de Casl3 foi cotransf ectado com 300 ng de plasmideo de expressão de guia. 48 horas após a transfecção, células foram Usadas e RNA foi coletado e transcritos de modo reverso com uso de uma modificação anteriormente descrita do kit de Células para Ct (Thermo Fisher Scientific) . A expressão de cDNA foi medida por meio de qPCR com uso de sondas de qPCR de TaqMan para a transcrição de KRAS (Thermo Fisher Scientific), sondas de controle de GAPDH (Thermo Fisher Scientific), e Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Reações de qPCR foram lidas em um LightCycler 480 Instrument II (Roche), com quatro réplicas técnicas de 5 ul em formato de 384 poços.

Avaliação de especificidade de RNA com uso de biblioteca agrupada de alvos incompatíveis [801] A capacidade de Casl3 de interferir com a biblioteca alvo incompatível foi testada com uso de células HEK293FT semeadas em placas de 6 poços. ~70% de células confluentes foram transfectadas com uso de 2400 ng de vetor de Casl3, 4800 ng de guia e 240 ng de biblioteca alvo incompatível. 48 horas após a transfecção, células foram coletadas e RNA extraído com uso do QIAshredder (Qiagen) e do Qiagen RNeasy Mini Kit. 1 ug de RNA extraído foi

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587/776 transcrito de modo reverso com uso do kit de síntese qScript Flex cDNA (Quantabio) seguindo o protocolo de iniciação específico de gene do fabricante e a iniciador RT específico de Gluc. cDNA foi então amplificado e sequenciado em um Illumina NextSeq.

[802] O sequenciamento foi analisado contando leituras por sequência e pontuação de depleção foram calculadas determinando-se o calor de log2(razão de contagem de leitura), em que a razão de contagem de leitura é a razão de contagens de leitura na condição de guia de alvejamento versus a condição de guia de não-alvejamento. Esse valor de pontuação representa o nível de atividade de Casl3 na sequência, com maiores valores que representam depleção mais forte e desse modo, maior atividade de divagem de Casl3. Distribuições separadas para as sequências de incompatibilidade única ou incompatibilidade dupla foram determinadas e plotadas como mapas térmicos com uma pontuação de depleção para cada identidade de incompatibilidade. Para sequências de incompatibilidade dupla, a média de todas as incompatibilidades duplas possíveis em uma dada posição foram plotados.

Perfilação de transcriptoma amplo de Casl3 em células mamíferas por sequenciamento de RNA [803] Para a medição de especificidade de transcriptoma amplo, 150 ng de construto de Casl3, 300 ng de

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588/776 plasmideo de expressão de guia e 15 ng do construto repórter de knockdown foram cotransfectados; para condições de shRNA, 300 ng de plasmideo de alvejamento de shRNA, 15 ng do construto repórter de knockdown, e 150 ng de mCherry acionado de EFl-alpha (para equilibrar a carga de repórter) foram cotransfectados. 48 horas após a transfecção, RNA foi purificado com o kit RNeasy Plus Mini (Qiagen) , mRNA foi selecionado para o uso de NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (New England Biolabs) e preparado para sequenciamento com o NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit para Illumina (New England Biolabs). Bibliotecas de sequenciamento de RNA foram então sequenciados em um NextSeq (Illumina).

[804] Para analisar dados de sequenciamento de transcriptoma amplo, leituras foram alinhadas com montagem de RefSeq GRCh38 com uso de Bowtie e RSEM versão 1.2.31 com parâmetros padrão. A expressão de transcrição foi quantificada como log2(TPM + 1), genes foram filtrados para log2 (TPM + 1) >2,5. Para a seleção de genes expressos de modo diferencial, somente genes com mudanças diferenciais de >2 ou <.75 foram considerados. A significância estatística de expressão diferencial foi avaliada por teste T de Estudante em três réplicas de alvejamento versus réplicas de não-alvejamento, e filtradas para uma taxa de falsa descoberta de <0,01% por procedimento de Benjamini-Hochberg.

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Edição de RNA de ADAR em transf ecções de células mamíferas [805] Para analisar a atividade de REPAIR em células mamíferas, foi transfectado 150 ng de vetor de REPAIR, 300 ng de plasmídeo de expressão de guia, e 40 ng do repórter de edição de RNA. Após 48 horas, RNA de células foram coletados e transcritos de modo reverso com uso de um método anteriormente descrito com um iniciador de transcrição reversa específica de gene. O cDNA extraído foi então submetido a duas rodadas de PCR para adicionar adaptadores de Illumina e códigos de barra de amostra com uso de NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix. A biblioteca foi então submetida a sequenciamento de próxima geração em um Illumina NextSeq ou MiSeq. As taxas de edição de edição de RNA foram então avaliadas em toda a adenosina dentro da janela de sequenciamento.

[806]	Em experimentos	em	que o	repórter de
luciferase	foi	alvejado para	edição	de RNA,	foi também
coletado o	meio	com luciferase	secretada antes	da coleta de
RNA. Nesse	caso,	devido ao fato	de que	o Cluc corrigido pode

estar em baixos níveis, o meio não foi diluído. Foi medida a atividade de luciferase com kits de ensaio de BioLux Cypridinia e Biolux Gaussia luciferase (New England Biolabs) em um leitor de placa (Biotek Synergy Neo2) com um protocolo de injeção. Todas as réplicas realizadas são réplicas

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590/776 biológicas .

Triagem de mamífero de ligação de PFS [807] Para determinar a contribuição do PFS para eficiência de edição, 625 ng de biblioteca alvo de PFS, 4,7 ug de guia, e 2,35 ug de REPAIR foram cotransfectadas em células HEK293FT plaqueadas em frascos de 225 cm2. Plasmideos foram misturados com 33 ul de reagente de PLUS (Thermo Fisher Scientific), colocado em 533 ul com Opti-MEM, incubado por 5 minutos, combinado com 30 ul de Lipofectamine 2000 e 500 ul de Opti-MEM, incubado por mais 5 minutos, e então pipetados em células. 48 horas após a transfecção, RNA foi coletado com o kit RNeasy Plus Mini (Qiagen), transcrito de modo reverso com qScript Flex (Quantabio) com uso de um iniciador de gene específico, e amplificado com duas rodadas de PCR com uso de NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix (New England Biolabs) para adicionar adaptadores de Illumina e códigos de barra de amostra. A biblioteca fol sequenciada em uma Illumina NextSeq, e taxas de edição de edição de RNA na adenosina alvo foram mapeadas para identidade de PFS. Para aumentar a cobertura, o PFS foi reduzido de modo computacional para 4 nucleotídeos. AS taxas de edição de REPAIR foram calculadas para cada PFS, promediado sobre réplicas biológicas com taxas de não-alvejamento para o PFS subtraído correspondente.

Sequenciamento de transcriptoma total para avaliar

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591/776 especificidade de edição de ADAR [808] Para analisar sítios de edição de RNA fora de alvo através do transcriptoma, RNA total foi coletado de células 48 horas após a transfecção com uso do kit RNeasy Plus Miniprep (Qiagen). A fração de mRNA é então enriquecida com uso de um NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (NEB) e esse RNA é então preparado para sequenciamento com uso de NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit para Illumina (NEB). As bibliotecas foram então sequenciadas em um Illumina NextSeq e carregadas de modo que houvesse pelo menos 5 milhões de leituras por amostra.

Análise de edição de RNA para experimentos alvejados e de transcriptoma amplo [809] Para analisar os dados de sequenciamento de RNA de edição de RNA de transcriptoma amplo, arquivos de sequência foram aleatoriamente reduzidos em amostra para 5 milhões de leituras. Um índice foi gerado com uso da montagem de RefSeq GRCh38 com sequências de Glue e Cluc adicionado e leituras foram alinhadas e quantificadas com uso de Bowtie/RSEM versão 1.3.0. BAMs de alinhamento foram então sortidos e analisados para sítios de edição de RNA com uso de ferramentas REDi [cite] com os seguintes parâmetros: -t 8 -e -d -1 -U [AG ou TC] -p -u -m20 -T6-0 -W -v 1 -n 0.0. Quaisquer edições significativas encontradas em condições não transf ectadas ou transf ectadas com EGFP foram

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592/776 consideradas como SNPs ou artefatos da transfecção e filtradas da análise de elementos fora de alvo. Elementos fora de alvo foram considerados signif icantes se o teste exato de Fisher rendesse um valor p menor do que 0,5 e que pelo menos 2 de 3 réplicas biológicas identificaram o sítio de edição.

[810] Para analisar os efeitos variantes previstos de cada elemento fora de alvo, a lista de sítios de edição fora de alvo foi analisada com uso do integrador de anotação variante (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgVai) como parte do pacote de navegador de genoma de UCSC de ferramentas com uso das anotações de SIFT e PolyPhen-2. Para declarar se os genes fora de alvo são oncogênicos, um banco de dados de anotações oncogênicas do catálogo de COSMIC de mutações somáticas em câncer (cancer.sanger.ac.uk).

[811] Para analisar se os construtos de REPAIR perturbaram os níveis de RNA, os valores de transcrição por milhão (TPM) emitidos da análise de RSEM foram usadas para contagens de expressão e transformados em espaços de log tomando o log2(TPM+l). Para encontrar genes regulados de modo diferencial, um teste T de Estudante foi realizado em três réplicas de guia de alvejamento versus três réplicas de guia de não-alvejamento. A análise estatística foi somente realizada em genes com valores de log2(TPM+l) maiores do que 2,5 e genes foram somente considerados regulados de modo

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593/776 diferencial se os mesmos tivessem uma fold change mais do que 2 ou menos do que 0,8. Genes foram relatados se os mesmos tivessem uma taxa de falta descoberta de menos do que 0,01.

Caracterização compreensiva de membros de família Casl3 em células mamíferas [812] Foi desenvolvido anteriormente LwaCasl3a para aplicações de knockdown de mamífero, mas foi necessário um domínio de estabilização de msfGFP para knockdown eficiente e, embora a especificidade tenha sido alta, eficiências de knockdown não foram consistentemente abaixo de 50%(15). Procurou-se identificar um sistema de CRISPR de alvejamento de RNA mais robusto caracterizando um conjunto geneticamente diverso de membros de família de Casl3 para analisar sua atividade de knockdown de RNA em células mamíferas (Figura 5A). Foram clonados os otólogos otimizados de códon mamíferos 21 Casl3a, 15 Casl3b, e 7 Casl3c (Tabela 4) em um vetor de expressão com sequências de sinal de exportação nuclear de terminal N e C (NES) e um msfGFP de terminal C para intensificar a estabilidade de proteína. Para analisar a interferência em células mamíferas, foi projetado um construto repórter duplo que expressa luciferases Gaussia (Gluc) e Cypridinia (Cluc) ortogonais sob promotores separados, que permite que uma luciferase funcione como uma medida de atividade de interferência de Casl3 e o outro para servir como um controle interno. Para cada ortólogo, foi

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594/776 projetado RNAs-guia compatíveis com PFS, com uso dos motivos de PFS de CaslSb derivados de um ensaio de interferência de ampicilina (Figura 11; Tabela 5) e o PFS 3' H de reporters anteriores de atividade de CaslSa(lO).

[813] Foram transfectadas as células HEK293FT com expressão de Casl3, RNA guia e plasmídeos reporters e níveis quantificados do Gluc alvejados 48 horas depois. 0 teste de dois RNAs-guia para cada ortólogo de Casl3 revelou uma faixa de níveis de atividade, incluindo cinco ortólogos de CaslSb com interferência similar ou aumentada através de ambos os RNAs-guia relativos ao LwaCaslSa caracterizado recentemente (Figura 5B) . Foram selecionados esses cinco ortólogos de CaslSb, assim como os dois ortólogos de CaslSa de topo para modificação adicional.

[814] Foi testado a seguir knockdown mediado por CaslS de Gluc sem msfGFP, de modo a selecionar ortólogos que não precisam de domínios de estabilização para atividade robusta. Foi hipotetizado que, adicionalmente a msfGFP, atividade de CaslS podería ser afetada por localização subcelular, conforme anteriormente relatado para otimização de LwaCaslSa(15). Portanto, foi testada a atividade de interferência dos sete ortólogos de CaslS selecionados fundidos com terminação C a uma das seis tags de localização diferentes sem msfGFP. Com uso do ensaio de repórter de luciferase, foi constatado que PspCaslSb e PguCaslSb

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595/776 fundidos com terminação C ao gene de Reve de HIV NES e RanCasl3b fundido com terminação C ao MARK NES teve os maiores níveis de atividade de interferência (Figura 12A). Para distinguir adicionalmente os níveis de atividade dos ortólogos de topo, foram comparados os três construtos de Casl3b otimizados à fusão de LwaCasl3a-msfGFP e shRNA para sua capacidade de knockdown da transcrição de KRAS com uso de guias de posição compatível (Figura 12B). Foram observados os maiores níveis de interferência para PspCasl3b (knockdown médio 62,9%) e desse modo, isso foi selecionado para comparação adicional a LwaCasl3a.

[815] Para definir mais rigorosamente o nível de atividade de PspCasl3b e LwaCasl3a, foram projetados guias compatíveis de posição que orientam tanto Gluc quanto Gluc e sua atividade foi analisada com uso do ensaio de repórter de luciferase. Foram testados 93 e 20 guias compatíveis de posição que alvejam Gluc e Gluc, respectivamente, e foi constatado que PspCasl3b aumentou consistentemente os níveis de knockdown relativos a LwaCasl3a (média de 92,3% para PspCasl3b vs. 40,1% de knockdown para LwaCasl3a) (Figura 5C,D) .

Especificidade de atividade de interferência de Casl3 mamífero [816] Para caracterizar as especificidades de interferência de PspCasl3b e LwaCasl3a, foi projetada uma

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596/776 biblioteca de plasmídeos de alvos de luciferase que contém incompatibilidades únicas e incompatibilidades duplas por toda a sequência-alvo e os três pares de base 5' e 3' de flanqueamento (Figura 12C). Foram transfectadas células HEK293FT tanto com LwaCasl3a quanto com PspCasl3b, um RNA guia fixado que alveja a sequência-alvo não modificada, e a biblioteca alvo incompatível correspondente ao sistema apropriado. Foi então realizado sequenciamento de RNA alvejado de transcrições não clivadas para quantificar a depleção de sequências-alvo não compatíveis. Foi constatado que LwaCasl3a e PspCasl3b tinham uma região central que foi relativamente intolerante a incompatibilidades únicas, se estendendo dos pares de base 12 a 26 para o alvo PspCasl3b e 13 a 24 para o alvo LwaCasl3a target (Figura 12D) . Incompatibilidades duplas foram ainda menos toleradas do que mutações únicas, com pouca atividade de knockdown observada sobre a janela mais larga, se estendendo dos pares de base 12 a 29 for PspCasl3b e 8 a 27 para LwaCasl3a em seus respectivos alvos (Figura 12E) . Adicionalmente, devido ao fato de que há incompatibilidades incluídas nos três nucleotídeos que flanqueiam terminações 5' e 3' da sequênciaalvo, poderia-se analisar restrições de PFS em atividade de knockdown de Casl3. 0 sequenciamento mostrou que quase todas as combinações de PFS permitiram knockdown robusto, indicando que uma restrição de PFS para interferência em

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597/776 células mamíferas provavelmente não existe para qualquer enzima testada. Esses resultados indicam que Casl3a e Casl3b exibem restrições de sequência similares e sensitividades contra incompatibilidades.

[817] Foi caracterizada em seguida a interferência especificidade de PspCasl3b e LwaCasl3a através da fração de mRNA do transcriptoma. Foi realizado sequenciamento de mRNA de transcriptoma amplo para detectar genes significativos expressos de modo diferencial. LwaCasl3a e PspCasl3b demonstraram knockdown robusto de Gluc (Figura 5E,F) e foram altamente específicos em comparação a um shRNA de posição compatível, que mostrou centenas de elementos fora de alvo (Figura 5G).

Fusões de Casl3-ADAR que possibilitam edição de RNA alvej ado [818] Dado que PspCasl3b alcançou knockdown consistente, robusto, e específico de mRNA em células mamíferas, foi previsto que o mesmo podería ser adaptado como uma plataforma de ligação de RNA para recrutar o domínio de desaminase de ADARs (ADARdd) para edição de RNA programável. Para modificar um PspCasl3b que carece de atividade de nuclease (dPspCasl3b, denominado como dCasl3b a partir daqui), foram mutados os resíduos catalíticos conservados no domínio de HEPNs e observada perda de atividade de luciferase de knockdown de RNA (Figura 13A) .

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Foi hipotetizado que uma fusão de dCasl3b-ADAR.DD podería ser recrutada por um RNA guia para alvejar adenosinas, com o RNA hibridizado que cria o substrato de duplex necessário para atividade de ADAR (Figura 6A). Para intensificar as taxas de desaminação de adenosina alvo, foram apresentados duas modificações adicionais ao projeto de edição de RNA inicial: foi apresentado uma citidina incompatível oposta à adenosina alvo, que foi anteriormente relatado por aumentar a frequência de desaminação, e dCasl3b fundido com o domínio de desaminase de ADAR1 ou ADAR2 humano que contém mutações de hiperativação para intensificar a atividade catalítica (ADARIdd (E1008Q) (25) ou ADAR2dd (E488Q) (19)) .

[819] Para testar a atividade de dCasl3b-ADARDD foi gerado um repórter de edição de RNA em Cluc apresentando-se uma mutação sem senso (W85X (UGG->UAG) ) , que podería ser funcionalmente reparada ao códon de tipo selvagem através de edição de A->I (Figura 6B) e então ser detectada como restauração de luminescência de Cluc. Os guias foram uniformemente orientados com espaçadores 30, 50, 70 ou 84 nucleotídeos de comprimento através da adenosina alvo para determinar a colocação e projeto de guia ideais (Figura 6C). Foi constatado que dCaslSb-ADARlnD exigiu guias maiores para reparar o repórter de Cluc, enquanto dCasl3b-ADAR2DD foi funcional com todos os comprimentos de guia testados (Figura 6C) . Foi também constatado que a mutação de E488Q hiperativa

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599/776 aprimorou a eficiência de edição, visto que a restauração de luciferase com o ADAR2dd de tipo selvagem foi reduzida (Figura 13B). A partir dessa demonstração de atividade, dCasl3bADAR2dd (E488Q) foi escolhido para caracterização adicional e essa abordagem foi designada como Edição de RNA para Substituição de A a Programável versão 1 (REPAIRvl) .

[820] Para validar que a restauração de atividade de luciferase foi devido a eventos de edição genuínos, foi medida a edição de transcrições de Cluc sujeitas a REPAIRvl diretamente por meio de transcrição reversa e sequenciamento de próxima geração alvejado. Foram testados espaçadores de 30 e 50 nt ao redor do sitio alvo e foi constatado que ambos os comprimentos de guia resultaram na edição de A a I esperada, com espaçadores de 50 nt alcançando maiores porcentagens de edição (Figura 6D,E, Figura 13C). Foi também observado que espaçadores de 50 nt tiveram uma propensão aumentada de edição em adenosinas não-alvejadas, provavelmente devido a regiões aumentadas de RNA de dúplex (Figura 6E, Figura 13C).

[821] Foi em seguida alvejado um gene endógeno, PPIB. Foram projetados espaçadores de 50 nt que orientam PPIB e foi constatado que poderia-se editar a transcrição de PPIB com até 28% de eficiência de edição (Figura 13D). Para testar se REPAIR podería ser adicionalmente otimizado, o ligante foi modificado entre dCasl3b e ADAR2dd (E488Q) (Figura

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13E, Tabela 6) e foi constatado que a escolha de ligante afetou modestamente a atividade de restauração de luciferase.

Definição dos parâmetros de sequência para edição de RNA [822] Dado que que poderia-se alcançar edição de RNA precisa em um sítio de teste, foi desejado caracterizar as restrições de sequência para programar o sistema contra qualquer RNA alvo no transcriptoma. Restrições de sequência poderíam surgir a partir de limitações de alvejamento de dCasl3b, tais como o PFS, ou de preferências de sequências de ADAR (26). Para investigar restrições de PFS em REPAIRvl, foi projetada uma biblioteca de plasmídeos que porta uma série de quatro nucleotídeos randomizados na terminação 5' de um sítio alvo na transcrição de Cluc (Figura 7A) . Foi alvejada a adenosina central dentro de qualquer um dentre um UAG ou motivo de AAC e constatado que, para ambos os motivos, todos os PFSs demonstraram níveis detectáveis de edição de RNA, com uma maior parte do PFSs que tem mais do que 50% de edição no sítio alvo (Figura 7B) . Em seguida, procurou-se determinar se o ADAR2dd em REPAIRvl teve quaisquer restrições de sequência imediatamente flanqueando a base alvejada, conforme foi relatado anteriormente para ADAR2dd (26) . Foi testada cada combinação possível de 5' e 3' flanqueando nucleotídeos que circundam diretamente a adenosina alvo

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601/776 (Figura 7C), e constatado que REPAIRvl teve capacidade de editar todos os motivos (Figura 7D). Por fim, foi analisado se a identidade da base oposta ao alvo A na sequência espaçadora afetou a eficiência de edição e foi constatado que uma incompatibilidade de A-C teve a maior restauração de luciferase com A-G, A-U, e A-A tendo reduzido drasticamente a atividade de REPAIRvl (Figura 13F).

Correção de mutações humanas relevantes a doença com uso de REPAIRvl [823] Para demonstrar a ampla aplicabilidade do sistema REPAIRvl para edição de RNA em células mamíferas, foram projetados guias de REPAIRvl contra duas mutações relevantes a doença: 878OA (AVPR2 W293X) em Diabetes insipidus nefrogênico, ligado a X e 1517OA (FANCC W506X) em anemia de Fanconi. Foram transfectados construtos de expressão para cDNA de genes que portam essas mutações em células HEK293FT e testado se REPAIRvl podería corrigir as mutações. Com o uso de RNAs-guia que contém espaçadores de 50 nt, pôde-se alcançar 35% de correção de AVPR2 e 23% de correção de FANCC (Figura 8A-D). Foi então testada a capacidade de REPAIRvl de corrigir 34 diferentes mutações de G>A relevantes a doença (Tabela 7) e foi constatado que pôdese alcançar edição significativa de 33 sítios com até 28% de eficiência de edição (Figura 8E). As mutações escolhidas são somente uma fração das mutações de G a A patogênicas (5,739)

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602/776 no banco de dados de ClinVar, que também inclui um adicional de 11,943 variantes de G a A (Figura 8F e Figura 14). Devido ao fato de que não há restrições de sequência, REPAIRvl tem capacidade de editar potencialmente todas essas mutações relevantes a doenças, especialmente dado que foi observada edição significativa independentemente do motivo alvo (Figura 7C e Figura 8G).

[824] Entregar o sistema REPAIRvl para células enfermas é um pré-requisito para uso terapêutico, e procurouse, portanto, projetar construtos de REPAIRvl que poderíam ser empacotados em vetores virais terapeuticamente relevantes, tais como vetores virais adeno-associados (AAV). Vetores AAV têm um limite de empacotamento de 4,7kb, que não pode acomodar o grande tamanho de dCasl3b-ADARDD (4473 pares de bases) junto com o promotor e elementos reguladores de expressão. Para reduzir o tamanho, foi testada uma variedade de truncações de terminal N e terminal C de dCasl3 fundidos a ADAR2dd (E488Q) para atividade de edição de RNA. Foi constatado que todas as truncações de terminal C testadas foram ainda funcionais e tiveram capacidade de restaurar sinal de luciferase (Figura 15), e a maior truncação, terminal C Δ984-1090 (tamanho total da proteína de fusão 4,152bp) foi pequena o suficiente para se encaixar dentro do limite de empacotamento de vetores de AAV.

Especificidade de transcriptoma amplo de REPAIRvl

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603/776 [825] Embora knockdown de RNA com PspCasl3b tenha sido altamente específico, nos experimentos de orientação de luciferase, foi observada edição de adesonisa fora de alvo dentro do guia: dúplex alvo (Figura 6E) . Para verificar se isso foi um fenômeno difundido, foi orientada uma transcrição endógena, KRAS, e medido o grau de edição fora de alvo próximo à adenosina alvo (Figura 9A) . Foi constatado que, para KRAS, embora a taxa de edição em alvo tenha sido 23%, houveram muitos sítios ao redor do sítio alvo que também teve edições de A a G detectáveis (Figura 9B).

[826] Devido à edição fora de alvo observada dentro da guia:duplex alvo, foram avaliados todos os elementos fora de alvo de transcriptoma possíveis realizando sequenciamento de RNA em todos os mRNAs. O sequenciamento de RNA revelou que houve um número significativo de eventos fora de alvo de A a G, com 1,732 elementos fora de alvo na condição de alvejamento e 925 elementos fora de alvo na condição de nãoalvej amento, com 828 elementos fora de alvo se sobrepondo (Figura 9C,D) . De todos os sítios de edição através do transcriptoma, o sítio de edição em alvo teve a maior taxa de edição, com 89% de conversão de A a G.

[827] Dada a alta especificidade de alvejamento de Casl3, foi percebido que os elementos fora de alvo podem surgir a partir de ADAR. Dois sistemas de ADAR guiados por RNA foram descritos anteriormente (Figura 16A). O primeiro

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604/776 utiliza uma função de ADAR2dd para a pequena proteína viral lambda N (ÀN) , que se liga ao grampo de RNA BoxB-À(22). Um RNA guia com guias de grampo BoxB-À ADAR2dd duplos para editar sítios codificados no RNA guia(23) . O segundo projeto utiliza ADAR2 de comprimento total (ADAR2) e um RNA guia com um grampo que os domínios de ligação de RNA de fita dupla (dsRBDs) de ADAR2 reconhecem (21, 24) . Foi analisada a eficiência de edição desses dois sistemas comparados a REPAIRvl e foi constatado que os sistemas BoxB-ADAR2 e ADAR2 sistemas demonstraram 63% e 36% de taxas de edição, respectivamente, em comparação à taxa de edição de 89% alcançada por REPAIRvl (Figura 16B-E). Adicionalmente, os sistemas BoxB e ADAR2 criaram 2018 e 174 elementos fora de alvo observados, respectivamente, nas condições de guia de alvejamento, em comparação aos 1.229 elementos fora de alvo na condição de guia de alvejamento de REPAIRvl. De modo notável, todas as condições com os dois sistemas baseados em ADAR2dd (REPAIRvl e BoxB) mostraram uma alta porcentagem de sobreposição em seus elementos fora de alvo enquanto o sistema ADAR2 teve um sistema amplamente distinto de elementos fora de alvo (Figura 16F) . A sobreposição de elementos fora de alvo entre as condições de alvejamento e de não-alvejamento e entre condições de REPAIRvl e BoxB sugerem elementos fora de alvo acionados por queADAR2nD independentes de alvejamento de dCasl3 (Figura 16F).

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Aprimoramento de especificidade de REPAIRvl através de modificação de proteína racional [828] Para aprimorar a especificidade de REPAIR, foi empregada modificação de proteína guiada por estrutura de ADAR2dd (E488Q) . Devido à natureza independente de guia de elementos fora de alvo, foi hipotetizado que desestabilizar ligação de ADAR2dd (E488Q)-RNA diminuiría seletivamente a edição fora de alvo, mas manteria edição em alvo devido à concentração local aumentada de constrição de dCasl3b de ADAR2dd (E488Q) ao sítio alvo. Foram mutagenados resíduos de ADAR2dd (E488Q) anteriormente determinados para contactar a região de dúplex do RNA-alvo (Figura 10A) (18) na base de ADAR2dd (E488Q) . Para analisar eficiência e especificidade, foram testados 17 mutantes únicos com tanto com guias de alvejamento quanto com guias de não-alvejamento, sob o pressuposto de que a restauração de luciferase de base na condição de não-alvejamento detectada seria indicativa de atividade fora de alvo mais ampla. Foi constatado que mutações nos resíduos selecionados tiveram efeitos significativos na atividade de luciferase para guias de alvejamento e não-alvejamento (Figura 10A,B, Figura 17A) . Uma maioria dos mutantes tanto aprimorou significativamente a atividade de luciferase para o guia de alvejamento como aumentou a razão de alvejamento para atividade de guia de não-alvejamento, que determinou a pontuação de

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606/776 especificidade (Figura 10A,B). Foi selecionado um subconjunto desses mutantes (Figura 10B) para especificidade de perfilação de transcriptoma amplo por sequenciamento de próxima geração. Conforme esperado, elementos fora de alvo medidos de sequenciamento de transcriptoma amplo se correlacionaram com oura pontuação de especificidade (Figura 17B) para mutantes. Foi constatado que, com a exceção de ADAR2dd (E488Q/R455E) , todos os mutantes de REPAIRvl sequenciados poderíam editar de modo eficaz o transcrito repórter (Figura 10C), com muitos mutantes que mostram a redução no número de elementos fora de alvo (Figura 17C e 18) . Foram também explorados os motivos circundantes de elementos fora de alvo para mutantes de especificidade, e foi constatado que REPAIRvl e a maior parte dos mutantes modificados exibiram uma forte preferência a 3' G para suas edições, de acordo com o motivo de ADAR2 caracterizado (Figura 19A)(26). Foi selecionado o mutante ADAR2dd (E488Q/T375G) para experimentos futuros, visto que o mesmo teve a maior porcentagem de edição dos quatro mutantes com o menor número de elementos fora de alvo de transcriptoma amplo e designou o mesmo como REPAIRv2. Em comparação a REPAIRvl, REPAIRv2 exibiu especificidade aumentada, com uma redução de 1732 a 10 elementos fora de alvo de transcriptoma (Figura 10D). Na região que circunda a adenosina alvejada em Cluc, REPAIRv2 teve edição fora de alvo reduzida, visível em

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607/776 traços de sequenciamento (Figura 10E). Em motivos derivados de sequenciamento de próxima geração, REPAIRvl apresentou uma forte preferência para 3' G, mas mostrou edições sem alvejamento para todos os motivos (Figura 19B) ; por contraste, REPAIRv2 somente editou os motivos fora de alvo mais fortes (Figura 19C) . A distribuição de edições em transcrições foi pesadamente desviada, com genes altamente desviados que têm mais de 60 edições (Figura 20A,B), enquanto REPAIRv2 somente editou uma transcrição (EEF1A1) múltiplas vezes (Figuras 20D a 20F). Edições fora de alvo de REPAIRvl foram previstas para resultar em inúmeras variantes, incluindo 1000 mutações misenso (Figura 20C) com 93 eventos oncogênicos (Figura 20D). Em contraste, REPAIRv2 teve somente 6 mutações misenso (Figura 20E), nenhum dos quais teve sequências oncogênicas (Figura 20F) . Essa redução de efeitos fora de alvo previstos distingue REPAIRv2 de outras abordagens de edição de RNA.

[829] Foi alvejado REPAIRv2 para genes endógenos para testar se as mutações de intensificação de especificidade reduziram edições próximas em transcrições alvo enquanto mantém edição em alvo de alta eficiência. Para guias que alvejam tanto KRAS como PPIB, foi constatado que REPAIRv2 não teve edições fora de alvo detectáveis, diferente de REPAIRvl, e pôde-se editar de modo eficaz a adenosina em alvo a 27,1% e 13%, respectivamente (Figura 10F,G) . Essa

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608/776 especificidade se estendeu a sítios alvo adicionais, incluindo regiões que demonstraram altos níveis de base em condições de não-alvejamento para REPAIRvl, tal como outros sítios alvo KRAS ou PPIB (Figura 21) . Em geral, REPAIRv2 eliminou elementos fora de alvo em regiões duplexadas ao redor de adenosina editada e mostrou especificidade de transcriptoma amplo drasticamente intensificada.

Conclusão [830] Foi mostrado aqui que o efetor tipo VI-B de alvejamento de RNA guiado por RNA Casl3b tem capacidade de knockdown de RNA altamente eficiente e específico, fornecendo a base para ferramentas aprimoradas para interrogar genes essenciais e RNA sem codificação assim como controlando processos celulares no nível transcriptômico. Casl3b (dCasl3b) cataliticamente ineficaz retém a ligação de capacidade de RNA programável, foi alavancado aqui fundindose dCasl3b à adenosina desaminase ADAR2 para alcançar edições de A a I precisas, um sistema designado como REPAIRvl (Edição de RNA para Substituição de A a I Programável versão 1). A modificação adicional de sistema produziu REPAIRv2, um método com atividade comparável ou aumentada relativa às plataformas de edição atuais com especificidade drasticamente aprimorada.

[831] Embora Casl3b exiba alta fidelidade, os resultados iniciais com fusões de dCasl3b-ADAR2DD revelou

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609/776 centenas de elementos fora de alvo. Para abordar isso, foi empregada uma estratégia de mutagênese racional para variar os resíduos de ADAR2dd que entram em contato com dúplex de RNA, identificando um variante, ADAR2dd (E488Q/T375G) , com capacidade de edição precisa, eficiente e altamente específica quando fundida a dCaslSb. A eficiência de edição com essa variante foi comparável ou melhor do que a alcançada com dois sistemas atualmente disponíveis, edição de BoxBADARdd ou ADAR2. Além disso, o sistema REPAIRv2 criou somente 10 elementos fora de alvo observáveis no transcriptoma inteiro, pelo menos uma ordem de magnitude melhor do que ambas as tecnologias de edição alternativas.

[832] O sistema REPAIR oferece muitas vantagens em comparação a outras ferramentas de edição de ácido nucleico. Primeiro, o sítio alvo exato pode ser codificado no guia colocando uma citidina dentro da extensão de guia da adenosina desejada para criar uma incompatibilidade de A-C favorável ideal para atividade de edição de ADAR. Segundo, Casl3 não tem restrições de sequência de alvejamento, tais como um PFS ou PAM, e nenhuma preferência de motivo circundando a adenosina alvo, permitindo que qualquer adenosina no transcriptoma seja potencialmente alvejada com o sistema REPAIR. É observado, no entanto, que editores de base de DNA podem alvejar tanto a fita senso como a fita antisenso, enquanto o sistema REPAIR é limitado a sequências

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610/776 transcritas, restringindo assim o número total de sítios de edição possíveis que é poderia-se alvejar. No entanto, devido à natureza mais flexível de alvejamento com REPAIR, esse sistema pode efetuar mais edições dentro de ClinVar (Figura 8C) do que editores de base de Cas9-DNA. Terceiro, o sistema REPAIR diretamente desamina adenosinas alvo em inosinas e não se baseia em vias de reparo endógenas, tais como reparo de excisão de base ou incompatibilidade, para gerar resultados de edição desejados. Desse modo, REPAIR deve ser possível em células não divisoras que não podem suportar outras formas de edição. Quarto, a edição de RNA pode ser transiente, permitindo o potencial para controle temporal sobre resultados de edição. Essa propriedade será provavelmente útil para tratar doenças causadas por mudanças temporais em estado celular, tal como inflamação local.

[833] O sistema REPAIR fornece múltiplas oportunidades para modificação adicional. Casl3b tem atividade de processamento de pre-crRNA(13), permitindo edição de multiplex de múltiplas variantes, que, por si só, podem não alterar o risco de doença, mas, em conjunto, podem ter efeitos aditivos e potencial de modificação de doença. A extensão da abordagem dee vejo projeto racional, tal como combinar mutações promissoras, podería também aumentar a especificidade e eficiência do sistema, enquanto abordagens de triagem não desviadas poderíam identificar resíduos

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611/776 adicionais para aprimorar a atividade de REPAIR e especificidade.

[834] Atualmente, as convenções de base alcançáveis por REPAIR são limitadas para gerar inosina a partir de adenosina; fusões adicionais de dCasl3 com outros domínios de edição de RNA catalíticos, tais como APOBEC, podería permitir edição de citidina a uridina. Adicionalmente, a mutagênese de ADAR podería relaxar a preferência de substrato de alvejar citidina, permitindo especificidade intensificada conferida por requisito de substrato de RNA duplexado a ser explorado por editores de C->U. A edição de Adenosina para inosina em substratos de DNA também pode ser possível com cataliticamente inativo efetores de CRISPR de alvejamento de DNA, tais como dCas9 ou dCpfl, tanto através de formação de

alvos de	heteroduplex	de DNA-RNA(2 7) como	através	de
mutagênese	do domínio de	ADAR.
[835]	REPAIR podería ser aplicado a	uma faixa	de
indicações	terapêuticas	em que a edição de A	a I (A a	G)

pode reverter ou retardar a progressão de doença (Figura 22). Primeiramente, a expressão de REPAIR para alvejamento causai, mutações de G a A mendelianas em tecidos relevantes de doença poderíam ser usadas para reverter mutações deletérias e tratar doença. Por exemplo, expressão de REPAIR estável por meio de AAV em tecido cerebral podería ser usado para corrigir a mutação de misenso GRIN2A C.2191OA

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612/776 (Asp731Asn) que causa epilepsia focal(28) ou a mutação de misenso APP c.2149G>A (Val717Ile) que causa mal de Alzheimer de início precoce(29). Segundo, REPAIR podería ser usado para tratar doença modificando-se a função de proteínas envolvidas em transdução de sinal relacionada a doença. Por exemplo, edição de REPAIR permitiría a recodificação de alguns resíduos de serina, treonina e tirosina que são os alvos de quinases (Figura 22). A fosforilação desses resíduos em proteínas relevantes a doenças afeta a progressão de doença para muitos distúrbios incluindo mal de Alzheimer e múltiplas afecções neurodegenerativas(30). Terceiro, REPAIR podería ser usado para mudar a sequência de variantes de G a A de modificação de risco expressos para diminuir de modo preventivo a chance de entrar em um estado de doença para pacientes. 0 caso mais intrigante são os alelos de modificação de risco protetores, que diminuem drasticamente a chance de entrar em um estado de doença e, em alguns casos, conferir benefícios de saúde adicionais. Por exemplo, REPAIR podería ser usado para simular funcionalmente alelos de A a G de PCSK9 e IFIH1 que protegem contra doença cardiovascular e artrite psoriática (31), respectivamente. Por fim, REPAIR pode ser usado para modificar terapeuticamente aceptor de splice e sítios de doador para terapias de modulação de exão. REPAIR pode mudar AU a IU ou AA a AI, o equivalente funcional do doador de

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613/776 splice de consenso 5' ou sítios de splice de aceptor 3' respectivamente, criando novas junções de splice. Adicionalmente, a edição de REPAIR pode mutar o sítio de splice de aceptor de consenso 3' de AG->IG para promover salto do exão adjacente a jusante, uma estratégia terapêutica que recebeu interesse significativo para o tratamento de DMD. A modulação de sítios de splice podería ter amplas aplicações em doenças em que oligos antisenso tiveram sucesso, tal como para modulação de splicing de SMN2 para o tratamento de atrofia muscular espinhal(32).

[836] Foi demonstrado o uso da enzima PspCasl3b tanto como um knockdown de RNA quanto como ferramenta de edição de RNA. A plataforma de dCasl3b para ligação de RNA programável tem muitas aplicações, incluindo imageamento de transcrição ao vivo, modificação de splicing, localização alvejada de transcrições, retenção de proteínas de ligação de RNA, e modificações epitranscriptômicas. Aqui, foi usado dCaslS para criar REPAIR, adicionando ao sítio existente de tecnologias de edição de ácido nucleico. REPAIR fornece uma nova abordagem para tratar doença genética ou simular alelos protetores, e estabelece edição de RNA como uma ferramenta útil para modificar função genética.

Tabela 4: Ortólogos de Casl3 usados nesse estudo

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ID de Casl3	Abreviação de Casl3	Organismo Hospedeiro	Acesso de Proteína
Casl3al	LshCasl3a	Leptotrichia shahii	WPJ018451595.1
Casl3a2	LwaCasl3a	Leptotrichia wadei (Lw2)	WP_021746774.1
Casl3a3	LseCasl3a	Listeria seeligeri	WP_012985477.1
Casl3a4	LbmCasl3a	Lachnospiraceae bacterium ΜΆ2020	WP_044921188.1
Casl3a5	LbnCasl3a	Lachnospiraceae bacterium NK4A179	WP_022785443.1
Casl3a6	CamCasl3a	[Clostridium] aminophilum DSM 10710	WP_031473346.1
Casl3a7	CgaCasl3a	Carnobacterium gallinarum DSM 4847	WP_034560163.1
Casl3a8	Cga2Casl3a	Carnobacterium gallinarum DSM 4847	WP_034563842.1
Casl3a9	Pprcasl3a	Paludibacter propion!cigenes WB4	WPJ013443710.1
Casl3al0	LweCasl3a	Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317	WPJ036059185.1
Casl3all	LbfCasl3a	Listeriaceae bacterium FSL M6-0635	WPJ036091002.1
Casl3al2	Lwa2casl3a	Leptotrichia wadei F0279	WP_021746774.1

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Casl3al3	RcsCasl3a	Rhodobacter capsulatus SB 1003	WP_013067728.1
Casl3al4	RcrCasl3a	Rhodobacter capsulatus R121	WPJ023911507.1
Casl3al5	RcdCasl3a	Rhodobacter capsulatus DE442	WPJ023911507.1
Casl3al6	LbuCasl3a	Leptotrichia buccalis C- 1013-b	WPJ015770004.1
Casl3al7	HheCasl3a	Herblnlx hemícellulosilytica	CRZ35554.1
Casl3al8	EreCasl3a	[Eubacteríum] rectale	WPJ055061018.1
Casl3al9	EbaCasl3a	Eubacteriaceae bacterium CHKCI004	WP_090127496.1
Casl3a2 0	BmaCasl3a	Blautia sp. Marseílle- P2398	WPJ062808098.1
Casl3a21	LspCasl3a	Leptotrichia sp. táxon oral 879 cepa F0557	WP_021744063.1
Casl3bl	BzoCasl3b	Bergeyella zoohelcum	WP_002664492
Casl3b2	PinCasl3b	Prevotella intermedia	WP 036860899
Casl3b3	PbuCasl3b	Prevotella buccae	WPJ004343973
Casl3b4	AspCasl3b	Alistipes sp. ZOR0009	WPJ047447901
Casl3b5	PsmCasl3b	Prevotella sp. ΜΆ2016	WPJ036929175
Casl3b6	RanCasl3b	Ríemerella anatipestifer	WPJ004919755

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Casl3b7	PauCasl3b	Prevotella aurantiaca	WP_025000926
Casl3b8	PsaCasl3b	Prevotella saccharolytica	WPJ051522484
Casl3b9	Pin2Casl3b	Prevotella intermedia	WPJ061868553
Casl3bl0	CcaCasl3b	Capnocytophaga canimorsus	WPJ013997271
Casl3bll	PguCasl3b	Porphyromonas gulae	WPJ039434803
Casl3bl2	PspCasl3b	Prevotella sp. P5-125	WP_044065294
Casl3bl3	FbrCasl3b	Flavobacterium branch!ophílum	WP_014084666
Casl3bl4	PgiCasl3b	Porphyromonas glnglvalls	WPJ053444417
Casl3bl5	Pin3Casl3b	Prevotella intermedia	WP 050955369
Casl3cl	FnsCasl3c	Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme ATCC 51357 contig00003	WP_005959231.1
Casl3c2	FndCasl3c	Fusobacterium necrophorum DJ-2 contig0065, sequência aleatória de genoma inteiro	WP_035906563.1
Casl3c3	FnbCasl3c	Fusobacterium necrophorum BFTR-1 contig0068	WP_035935671.1
Casl3c4	FnfCasl3c	Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme 1 1 36S contl.14	EHO19081.1
Casl3c5	FpeCasl3c	Fusobacterium perfoetens	WP_027128616.1

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		ATCC 29250 T364DRAFT scaffold00009. 9_C
Casl3c6	FulCasl3c	Fusobacterium ulcerans ATCC 49185 cont2.38	WP_040490876.1
Casl3c7	AspCasl3c	Anaerosalíbacter sp. ND1 montagem de genoma Anaerosalíbacter massiliensis ND1	WP_042678931.1

Tabela 5: Cortes de PFS em telas bacterianas

Ortólogo de Casl3b	Chave	Puntuação de depleção de -Log2 usada para gerar o motivo de PFS
Bergeyella zoohelcum	1	2
Locus 1 de Prevotella	2	1
intermedia
Prevotella buccae	3	3
Alistipes sp. ZOR0009	4	1
Prevotella sp. MA2016	5	2
Riemerella anatipestifer	6	4
Prevotella aurantiaca	7	1
Prevotella saccharolytica	8	0

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Ortólogo de Casl3b	Chave	Puntuação de depleção
de -Log2 gerar o m	usada para otivo de PFS
Locus 2 de Prevotella	9		0
intermedia
Capnocytophaga canimorsus	10	3
Porphyromonas gulae	11	4
Prevotella sp. P5-125	12	2,1
Flavobacteri um	13		1
branch!ophilum
Porphyromonas gingivalis	14	3
Locus 2 de Prevotella	15		4
intermedia

Tabela 6: Sequências ligantes de dcasl3b-ADAR usadas nesse estudo para edição de RNA em células de mamíferos.

Figura	Ligante
6C	GSGGGGS
6E	GS
13B	GSGGGGS
13C	GS
13D	GS

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Figura	Ligante
13E: GS	GS
13E: GSGGGGS	GSGGGGS
13E: (GGGS)3	GGGGSGGGGSGGGGS
13E: Rigid	EAAAK
13E: (GGS)6	GGSGGSGGSGGSGGSGGS
13E: XTEN	SGSETPGTSESATPES
7B	GS
13F	GS
7C	GS
8B	GS
8D	GS
8E	GS
7A: Δ984-1090, Δ1026-1090,	GS
Δ1053-1090
7A: Δ1-125, Δ1-88, Δ1-72	GSGGGGS
9B	GS
9C	GS
9D	GS
16A	GS

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Figura	Ligante
16C	GS
16D	GS
17D	GS
10A	GS
18A	GS
10B	GS
18B	GS
18C	GS
19A	GS
19B	GS
10C	GS
10D	GS
10E	GS
10F	GS
22A	GS
22A	GS

Tabela 7: Informações de doença para mutações relevantes para doença

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Candidatos de completo	comprimento	Gene	Doença
NM_000054.4(AVPR2	):c.878OA	AVPR2	Diabetes insipidus
(p.Trp2 93Ter)			nefrogênica, ligado a X
NM_000136.2(FANCC	):c.1517OA	FANCC	Anemia de Fanconi, grupo
(p.Trp5 0 6Ter)			de complementação C
Candidatos	simulados
adicionais
Candidato	Gene	Doença
NM_000206.2(IL2RG	):c.710G>A	IL2RG	Imunodeficiência
(p.Trp237Ter)			combinada grave ligada a
			X
NM_000132.3(F8) :c	.3144G>A	F8	Doença de deficiência de
(p.Trpl04 8Ter)			fator VIII hereditária
NM_000527.4(LDLR)	:c.l449G>A	LDLR	Hipercolesterolemia
(p.Trp4 83Ter)			familiar
NM_000071.2(CBS) :	c.162OA	CBS	Homocistinúria devido à
(p.Trp5 4Ter)			deficiência de CBS
NM_000518.4(HBB) :	c.114OA	HBB	betaA0A Talassemia|beta
(p.Trp38Ter)			Talassemia
NM_000035.3(ALDOB	):c.8 8 8OA	ALDOB	Fructosúria hereditária
(p.Trp2 96Ter)
NM_004006.2(DMD):	c.3747G>A	DMD	Distrofia muscular de
(p.Trpl2 4 9Ter)			Duchenne

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Candidatos de comprimento completo	Gene	Doença
NM_005359.5(SMAD4):c.906OA	SMAD4	Síndrome de polipose
(p.Trp302Ter)		juvenil
NM_000059.3(BRCA2):c.582G>A	BRCA2	Câncer de mama
(p.Trpl94Ter)		familiar|Câncer de mama- ovário, familiar 2
NM_000833.4(GRIN2A):c.3813G>	GRIN2A	Epilepsia, focal, com
A (p.Trpl27ITer)		distúrbio de fala e com ou sem retardo mental
NM_002977.3(SCN9A):c.2691G>A	SCN9A	Indiferença a dor,
(p.Trp8 97Ter)		congênita, autossômica recessiva
NM_007375.3(TARDBP):c.943G>A	TARDBP	Esclerose lateral
(p.Ala315Thr)		amiotrófica tipo 10
NM_000492.3(CFTR):c.3846G>A	CFTR	Fibrose
(p.Trpl282Ter)		cistica|Pancreatite hereditária|não fornecida|resposta de ataluren - Eficácia
NM_130838.1(UBE3A):c.2304G>A	UBE3A	Sindrome de Angelman
(p.Trp7 68Ter)		syndrome
NM_000543.4(SMPD1):c.168G>A	SMPD1	Doença de Niemann-Pick,
(p.Trp5 6Ter)		tipo A

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Candidatos de comprimento completo	Gene	Doença
NM_206933.2(USH2A):c.9390G>A (p.Trp3130Ter)	USH2A	Síndrome de Usher, tipo 2A
NM_130799.2(MEN1):c.1269G>A (p.Trp423Ter)	MEN1	Síndrome de predisposição hereditária ao câncer
NM_177965.3(C8orf37):c.555G> A (p.Trpl85Ter)	C8orf37	Retinite pigmentosa 64
NM_000249.3(MLH1):c.1998G>A (p.Trp666Ter)	MLH1	Síndrome de Lynch
NM_000548.4(TSC2):c.2108G>A (p.Trp703Ter)	TSC2	Esclerose tuberosa 2 | Síndrome de esclerose tuberosa
NM_000267.3(NF1):c.7044G>A (p.Trp2 34 8Ter)	NF1	Neurofibromatose, tipo 1
NM_000179.2(MSH6):c.3020G>A (p.Trpl007Ter)	MSH6	Síndrome de Lynch
NM_000344.3(SMN1):c.305G>A (p.TrplO2Ter)	SMN1	Atrofia muscular espinhal, tipo II|Doença de Kugelberg-Welander
NM_024577.3(SH3TC2):c.920G>A (p.Trp307Ter)	SH3TC2	Doença de Charcot-Marie- Tooth, tipo 4C
NM_001369.2(DNAH5):c.8465G>A	DNAH5	Discinesia ciliar

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Candidatos de completo	comprimento	Gene	Doença
(p.Trp2 82 2Ter)		primária
NM_004992.3(MECP2)	:c.311G>A	MECP2	Síndrome de Rett
(p.TrplO4Ter)
NM_032119.3(ADGRV1	):c. 7 40 60	ADGRV1	Síndrome de Usher, tipo
A (p.Trp2469Ter)			2C
NM_017651.4(AHI1):	C.217 4OA	AHI1	Síndrome de Joubert 3
(p.Trp725Ter)
NM_004562.2(PRKN):	c.1358G>A	PRKN	Doença de Parkinson 2
(p.Trp453Ter)
NM_000090.3(COL3A1	):c.38330	COL3A1	Síndrome de Ehlers-
A (p.Trpl278Ter)			Danlos, tipo 4
NM_007294.3(BRCA1)	:c.5511G>A	BRCA1	Câncer de mama
(p.Trpl837Ter)			familiar|Câncer de mama-
			ovário, familiar 1
NM_000256.3(MYBPC3	):c.32930	MYBPC3	Cardiomiopatia
A (p.TrplO98Ter)			hipertrófica familiar
			primária
NM_000038.5(APC):c	.12 62OA	APC	Polipose adenomatosa
(p.Trp421Ter)			familiar 1
NM_001204.6(BMPR2)	:c.8 93OA	BMPR2	Hipertensão pulmonar
(p.W298*)			primária

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Tabela 8: Plasmídeos chave usados nesse estudo

Nome do plasmídeo	Descrição
pAB0006	CMV-Cluciferase-poliA EFla-G-luciferase-poliA
pAB0040	CMV-Cluciferase(STOP85)-poliA EFla-G- luciferase-poliA
pAB0048	NES de B12-HIV pCDNA-ADAR2-N-terminal
pAB0050	pAB0001-A02 (cadeia principal de crRNA)
pAB0051	pAB0001-B06 (cadeia principal de crRNA)
pAB0052	pAB0001-Bll (cadeia principal de crRNA)
pAB0053	pAB0001-B12 (cadeia principal de crRNA)
pAB0014.B 6	EFla-BsiWI-Casl3b6-NES-mapk
pAB0013.B 11	EFla-BsiWI-Casl3bll-NES-HIV
pAB0013 . B 12	EFla-BsiWI-Casl3bl2-NES-HIV
pAB0051	pAB0001-B06 (cadeia principal de crRNA)
pAB0052	pAB0001-Bll (cadeia principal de crRNA)
pAB0053	pAB0001-B12 (cadeia principal de crRNA)
pAB0079	Vetor de destino pCDNA-ADARlhu-EQmutant-N-

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Nome do plasmideo	Descrição
	terminal
pAB0085	Vetor de destino pCDNA-ADAR2 (E488Q)hu-EQmutant- N-terminal
pAB0095	EFla-BsiWI-Casl3-B12-NES-HIV, com mutante de HEPN duplo H
pAB0114	Vetor de destino pCDNA-wtADAR2hu-EQmutant-Nterminal
pAB0120	Guia de Luciferase ADAR ideal (guia 24 de wC0054)
pAB0122	Guia pAB0001-B12 NT para experimentos de ADAR
pAB0151	vetor de destino de terminação pCDNA-ADAR2hu- EQmutant-N-terminal termo C delta 984-1090
pAB0180	Mutante de especificidade T375G
ρΑΒΟΙδΙ	T375G Casl3b termo C delta 984-1090

Tabela 9: Sequências guia/shRNA usadas nesse estudo para knockdown em células de mamíferos

Nome	Sequência espaçadora	Me cani smo de Interferência	Notas	Primeira figura
Guia de PFS	GCCAGCUUUCCGGG	Casl3b	Usado	para
bacteriano	CAUUGGCUUCCAUC		todos	os

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Nome	Sequência espaçadora	Me cani smo de Interferência	Notas	Primeira figura
			ortólogos
Guia 1 de	GCCAGCTTTCCGGG	Casl3a	Usado para	Figura
Casl3a-Gluc	CATTGGCTTCCATC		todos os ortólogos de Casl3a	5B
Guia 2 de	ACCCAGGAATCTCA	Casl3a	Usado para	Figura
Casl3a-Gluc	GGAATGTCGACGAT		todos os ortólogos de Casl3a	5B
Guia de não	AGGGTTTTCCCAGT	Casl3a	Usado para	Figura
alvejamento de Casl3a (LacZ)	CACGACGTTGTAAA		todos os ortólogos de Casl3a	5B
Guia 1.1 de	GGGCATTGGCTTCC	Casl3b	Usado para	Figura
Casl3b-Gluc	ATCTCTTTGAGCAC CT		os ortólogos 1 a 3, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15	5B
Guia 1.2 de	GUGCAGCCAGCUUU	Casl3b	Usado para o	Figura
Casl3b-Gluc	CCGGGCAUUGGCUU CC		ortólogo 4	5B
Guia 1.3 de	GCAGCCAGCUUUCC	Casl3b	Usado para o	Figura

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 635/817

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Nome	Sequência espaçadora	Me cani smo de Interferência	Notas	Primeira figura
Casl3b-Gluc	GGGCAUUGGCUUCC AU		ortólogo 5	5B
Guia 1.4 de	GGCUUCCAUCUCUU	Casl3b	Usado para o	Figura
Casl3b-Gluc	UGAGCACCUCCAGC GG		ortólogo 8, 9	5B
Guia 1.5 de	GGAAUGUCGACGAU	Casl3b	Usado para o	Figura
Casl3b-Gluc	CGCCUCGCCUAUGC CG		ortólogo 13	5B
Guia 2.1 de	GAAUGUCGACGAUC	Casl3b	Usado para	Figura
Casl3b-Gluc	GCCUCGCCUAUGCC GC		os ortólogos 1 a 3, 6, 7, 10, 11, 14, 15	5B
Guia 2.2 de	GACCUGUGCGAUGA	Casl3b	Usado para o	Figura
Casl3b-Gluc	ACUGCUCCAUGGGC UC		ortólogo 12	5B
Guia 2.2 de	GUGUGGCAGCGUCC	Casl3b	Usado para o	Figura
Casl3b-Gluc	UGGGAUGAACUUCU UC		ortólogo 4	5B
Guia 2.3 de	GUGGCAGCGUCCUG	Casl3b	Usado para o	Figura
Casl3b-Gluc	GGAUGAACUUCUUC AU		ortólogo 5	5B

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Nome	Sequência espaçadora	Me cani smo de Interferência	Notas	Primeira figura
Guia 2.4 de	GCUUCUUGCCGGGC	Casl3b	Usado para o	Figura
Casl3b-Gluc	AACUUCCCGCGGUC		ortólogo 8,	5B
	AG		9
Guia 2.6 de	GCAGGGUUUUCCCA	Casl3b	Usado para o	Figura
Casl3b-Gluc	GUCACGACGUUGUA		ortólogo 13	5B
	AAA
Guia de não	GCAGGGUUUUCCCA	Casl3b	Usado para	Figura
alvejamento	GUCACGACGUUGUA		todos os	5B
de Casl3b	AAA		ortólogos
Casl3a-Gluc	ACCCAGGAAUCUCA	Casl3a		Figura
guia-RNASeq	GGAAUGUCGACGAU			5E
Guia de	CAGCTTTCCGGGCA	shRNA		Figura
shRNA-Gluc	TTGGCTT			5F
Casl3b-Gluc	CCGCUGGAGGUGCU	Casl3b		Figura
guia-RNASeq	CAAAGAGAUGGAAG			5F
	CC
Casl3a-	GCCAGCTTTCCGGG	Casl3a		Figura
Gluc-guia-1	CATTGGCTTCCATC			12A
Casl3a-	ACCCAGGAATCTCA	Casl3a		Figura
Gluc-guia-2	GGAATGTCGACGAT			12A
Casl3b-	GGGCATTGGCTTCC	Casl3b		Figura
Gluc-opt-	ATCTCTTTGAGCAC			12A

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Nome	Sequência espaçadora	Me cani smo de Interferência	Notas	Primeira figura
guia-1	CT
Casl3b-		GAAUGUCGACGAUC	Casl3b		Figura
Gluc-opt		GCCUCGCCUAUGCC			12A
guia-2		GC
Casl3a	KRAS	CAAGGCACTCTTGC	Casl3a		Figura
guia 1		CTACGCCACCAGCT			12B
Casl3a	KRAS	TCATATTCGTCCAC	Casl3a		Figura
guia 2		AAAATGATTCTGAA			12B
Casl3a	KRAS	ATTATTTATGGCAA	Casl3a		Figura
guia 3		ATACACAAAGAAAG			12B
Casl3a	KRAS	GAATATCTTCAAAT	Casl3a		Figura
guia 4		GATTTAGTATTATT			12B
Casl3a	KRAS	ACCATAGGTACATC	Casl3a		Figura
guia 5		TTCAGAGTCCTTAA			12B
Guia 1	de	GTCAAGGCACTCTT	Casl3b		Figura
KRAS	de	GCCTACGCCACCAG			12B
Casl3b		CT
Guia 2	de	GATCATATTCGTCC	Casl3b		Figura
KRAS	de	ACAAAATGATTCTG			12B
Casl3b		AA
Guia 3	de	GTATTATTTATGGC	Casl3b		Figura
KRAS	de	AAATACACAAAGAA			12B

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 638/817

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Nome	Sequência espaçadora	Me cani smo de Interferência	Notas	Primeira figura
Casl3b	AG
Guia	4	de	GTGAATATCTTCAA	Casl3b		Figura
KRAS		de	ATGATTTAGTATTA			12B
Casl3b			TT
Guia	5	de	GGACCATAGGTACA	Casl3b		Figura
KRAS		de	TCTTCAGAGTCCTT			12B
Casl3b			AA
Guia	1	de	aagagtgccttgac	shRNA		Figura
KRAS		de	gatacagcCTCGAG			12B
shRNA			gctgtatcgtcaag
			gcactctt
Guia	2	de	aatcattttgtgga	shRNA		Figura
KRAS		de	cgaatatCTCGAGa			12B
shRNA			tattcgtccacaaa
			atgatt
Guia	3	de	aaataatactaaat	shRNA		Figura
KRAS		de	catttgaCTCGAGt			12B
shRNA			caaatgatttagta
			ttattt
Guia	4	de	aataatactaaatc	shRNA		Figura
KRAS		de	atttgaaCTCGAGt			12B
shRNA			tcaaatgatttagt

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Nome	Sequência espaçadora	Me cani smo de Interferência	Notas	Primeira figura
	attatt
Guia 5	de	aaggactctgaaga	shRNA		Figura
KRAS	de	tgtacctCTCGAGa			12B
shRNA		ggtacatcttcaga
		gtcctt

Tabela 10: Sequências guia usadas para knockdown de

Gluc

Nome	Sequência	Posição	Notas		Primeira
	espaçadora				figura
Guia 1 de	GAGATCAGGGCAA	2	Note que	OS	5C
organização	ACAGAACTTTGAC		espaçadores	de
de gluc	TCCC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 2 de	GGATGCAGATCAG	7	Note que	os	5C
organização	GGCAAACAGAACT		espaçadores	de
de gluc	TTGA		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 640/817

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Nome	Sequência	Posição	Notas		Primeira
	espaçadora				figura
Guia 3 de	GCACAGCGATGCA	13	Note que	OS	5C
organização	GATCAGGGCAAAC		espaçadores	de
de glue	AGAA		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 4 de	GCTCGGCCACAGC	19	Note que	os	5C
organização	GATGCAGATCAGG		espaçadores	de
de glue	GCAA		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 5 de	GGGGCTTGGCCTC	28	Note que	os	5C
organização	GGCCACAGCGATG		espaçadores	de
de glue	GAGA		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 6 de	GTGGGCTTGGCCT	29	Note que	os	5C
organização	CGGCCACAGCGAT		espaçadores	de
de glue	GCAG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 641/817

634/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
			extremidade 5'
Guia 7 de	GTCTCGGTGGGCT	35	Note que	OS	5C
organização	TGGCCTCGGCCAC		espaçadores	de
de glue	AGCG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 8 de	GTTCGTTGTTCTC	43	Note que	os	5C
organização	GGTGGGCTTGGCC		espaçadores	de
de glue	TCGG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 9 de	GGAAGTCTTCGTT	49	Note que	os	5C
organização	GTTCTCGGTGGGC		espaçadores	de
de glue	TTGG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 10 de	GATGTTGAAGTCT	54	Note que	os	5C
organização	TCGTTGTTCTCGG		espaçadores	de
de glue	TGGG		Casl3a	são
			truncados por	dois

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 642/817

635/776

Nome	Sequência	Posição	Notas		Primeira
	espaçadora				figura
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 11 de	GCGGCCACGATGT	62	Note que	os	5C
organização	TGAAGTCTTCGTT		espaçadores	de
de glue	GTTC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 12 de	GTGGCCACGGCCA	68	Note que	os	5C
organização	CGATGTTGAAGTC		espaçadores	de
de glue	TTCG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 13 de	GGTTGCTGGCCAC	73	Note que	os	5C
organização	GGCCACGATGTTG		espaçadores	de
de glue	AAGT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 14 de	GTCGCGAAGTTGC	80	Note que	os	5C
organização	TGGCCACGGCCAC		espaçadores	de
de glue	GATG		Casl3a	são

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 643/817

636/776

Nome	Sequência	Posição	Notas		Primeira
	espaçadora				figura
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 15 de	GCCGTGGTCGCGA	86	Note que	os	5C
organização	AGTTGCTGGCCAC		espaçadores	de
de glue	GGCC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 16 de	GCGAGATCCGTGG	92	Note que	os	5C
organização	TCGCGAAGTTGCT		espaçadores	de
de glue	GGCC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 17 de	GCAGCATCGAGAT	98	Note que	os	5C
organização	CCGTGGTCGCGAA		espaçadores	de
de glue	GTTG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 18 de	GGGTCAGCATCGA	101	Note que	os	5C
organização	GATCCGTGGTCGC		espaçadores	de

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 644/817

637/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
de glue		GAAG		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 19	de	GCTTCCCGCGGTC	109	Note que	os	5C
organização	AGCATCGAGATCC		espaçadores	de
de glue		GTGG		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 20	de	GGGGCAACTTCCC	115	Note que	os	5C
organização	GCGGTCAGCATCG		espaçadores	de
de glue		AGAT		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 21	de	GTCTTGCCGGGCA	122	Note que	os	5C
organização	ACTTCCCGCGGTC		espaçadores	de
de glue		AGCA		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 22	de	GGCAGCTTCTTGC	128	Note que	os	5C

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 645/817

638/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
organização	CGGGCAACTTCCC		espaçadores	de
de gluc	GCGG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 23 de	GCCAGCGGCAGCT	134	Note que	os	5C
organização	TCTTGCCGGGCAA		espaçadores	de
de gluc	CTTC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 24 de	GCACCTCCAGCGG	139	Note que	os	5C
organização	CAGCTTCTTGCCG		espaçadores	de
de gluc	GGCA		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 25 de	GCTTTGAGCACCT	146	Note que	os	5C
organização	CCAGCGGCAGCTT		espaçadores	de
de gluc	CTTG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 646/817

639/776

Nome	Sequência	Posição	Notas		Primeira
	espaçadora				figura
Guia 26 de	GCATCTCTTTGAG	151	Note que	OS	5C
organização	CACCTCCAGCGGC		espaçadores	de
de glue	AGCT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 27 de	GTCCATCTCTTTG	153	Note que	os	5C
organização	AGCACCTCCAGCG		espaçadores	de
de glue	GCAG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 28 de	GGGCATTGGCTTC	163	Note que	os	5C
organização	CATCTCTTTGAGC		espaçadores	de
de glue	ACCT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 29 de	GTCCGGGCATTGG	167	Note que	os	5C
organização	CTTCCATCTCTTT		espaçadores	de
de glue	GAGC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 647/817

640/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
			extremidade 5'
Guia 30 de	GGCCAGCTTTCCG	175	Note que	OS	5C
organização	GGCATTGGCTTCC		espaçadores	de
de glue	AT CT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotideos	na
			extremidade 5'
Guia 31 de	GGGTGCAGCCAGC	181	Note que	os	5C
organização	TTTCCGGGCATTG		espaçadores	de
de glue	GCTT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotideos	na
			extremidade 5'
Guia 32 de	GAGCCCCTGGTGC	188	Note que	os	5C
organização	AGCCAGCTTTCCG		espaçadores	de
de glue	GGCA		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotideos	na
			extremidade 5'
Guia 33 de	GATCAGACAGCCC	195	Note que	os	5C
organização	CTGGTGCAGCCAG		espaçadores	de
de glue	CTTT		Casl3a	são
			truncados por	dois

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 648/817

641/776

Nome	Sequência	Posição	Notas		Primeira
	espaçadora				figura
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 34 de	GGCAGATCAGACA	199	Note que	os	5C
organização	GCCCCTGGTGCAG		espaçadores	de
de glue	CCAG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 35 de	GACAGGCAGATCA	203	Note que	os	5C
organização	GACAGCCCCTGGT		espaçadores	de
de glue	GCAG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 36 de	GTGATGTGGGACA	212	Note que	os	5C
organização	GGCAGATCAGACA		espaçadores	de
de glue	GCCC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 37 de	GACTTGATGTGGG	215	Note que	os	5C
organização	ACAGGCAGATCAG		espaçadores	de
de glue	ACAG		Casl3a	são

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 649/817

642/776

Nome	Sequência	Posição	Notas		Primeira
	espaçadora				figura
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 38 de	GGGGCGTGCACTT	223	Note que	os	5C
organização	GATGTGGGACAGG		espaçadores	de
de glue	GAGA		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 39 de	GCTTCATCTTGGG	232	Note que	os	5C
organização	CGTGCACTTGATG		espaçadores	de
de glue	TGGG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 40 de	GTGAACTTCTTCA	239	Note que	os	5C
organização	TCTTGGGCGTGCA		espaçadores	de
de glue	CTTG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 41 de	GGGATGAACTTCT	242	Note que	os	5C
organização	TCATCTTGGGCGT		espaçadores	de

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 650/817

643/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
de glue		GCAC		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 42	de	GTGGGATGAACTT	244	Note que	os	5C
organização	CTTCATCTTGGGC		espaçadores	de
de glue		GTGC		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 43	de	GGGCAGCGTCCTG	254	Note que	os	5C
organização	GGATGAACTTCTT		espaçadores	de
de glue		CATC		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 44	de	GGGTGTGGCAGCG	259	Note que	os	5C
organização	TCCTGGGATGAAC		espaçadores	de
de glue		TTCT		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 45	de	GTTCGTAGGTGTG	265	Note que	os	5C

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 651/817

644/ΊΊ6

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
organização	GCAGCGTCCTGGG		espaçadores	de
de glue	AT GA		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 46 de	GCGCCTTCGTAGG	269	Note que	os	5C
organização	TGTGGCAGCGTCC		espaçadores	de
de glue	TGGG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 47 de	GTCTTTGTCGCCT	276	Note que	os	5C
organização	TCGTAGGTGTGGC		espaçadores	de
de glue	AGCG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 48 de	GCTTTGTCGCCTT	275	Note que	os	5C
organização	CGTAGGTGTGGCA		espaçadores	de
de glue	GCGT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 652/817

645/776

Nome	Sequência	Posição	Notas		Primeira
	espaçadora				figura
Guia 49 de	GTGCCGCCCTGTG	293	Note que	OS	5C
organização	CGGACTCTTTGTC		espaçadores	de
de glue	GCCT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 50 de	GTATGCCGCCCTG	295	Note que	os	5C
organização	TGCGGACTCTTTG		espaçadores	de
de glue	TCGC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 51 de	GCCTCGCCTATGC	302	Note que	os	5C
organização	CGCCCTGTGCGGA		espaçadores	de
de glue	CTCT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 52 de	GGATCGCCTCGCC	307	Note que	os	5C
organização	TATGCCGCCCTGT		espaçadores	de
de glue	GCGG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 653/817

646/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
			extremidade 5'
Guia 53 de	GATGTCGACGATC	315	Note que	OS	5C
organização	GCCTCGCCTATGC		espaçadores	de
de gluc	CGCC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 54 de	GCAGGAATGTCGA	320	Note que	os	5C
organização	CGATCGCCTCGCC		espaçadores	de
de gluc	TATG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 55 de	GAATCTCAGGAAT	325	Note que	os	5C
organização	GTCGACGATCGCC		espaçadores	de
de gluc	TCGC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 56 de	GCCCAGGAATCTC	331	Note que	os	5C
organização	AGGAATGTCGACG		espaçadores	de
de gluc	AT CG		Casl3a	são
			truncados por	dois

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 654/817

647/776

Nome	Sequência	Posição	Notas		Primeira
	espaçadora				figura
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 57 de	GCCTTGAACCCAG	338	Note que	os	5C
organização	GAATCTCAGGAAT		espaçadores	de
de glue	GTCG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 58 de	GCCAAGTCCTTGA	344	Note que	os	5C
organização	ACCCAGGAATCTC		espaçadores	de
de glue	AGGA		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 59 de	GTGGGCTCCAAGT	350	Note que	os	5C
organização	CCTTGAACCCAGG		espaçadores	de
de glue	AATC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 60 de	GCCATGGGCTCCA	353	Note que	os	5C
organização	AGTCCTTGAACCC		espaçadores	de
de glue	AGGA		Casl3a	são

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 655/817

648/776

Nome	Sequência	Posição	Notas		Primeira
	espaçadora				figura
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 61 de	GGAACTGCTCCAT	361	Note que	os	5C
organização	GGGCTCCAAGTCC		espaçadores	de
de glue	TTGA		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 62 de	GTGCGATGAACTG	367	Note que	os	5C
organização	CTCCATGGGCTCC		espaçadores	de
de glue	AAGT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 63 de	GGACCTGTGCGAT	373	Note que	os	5C
organização	GAACTGCTCCATG		espaçadores	de
de glue	GGCT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 64 de	GACAGATCGACCT	380	Note que	os	5C
organização	GTGCGATGAACTG		espaçadores	de

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 656/817

649/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
de glue		CTCC		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 65	de	GACACACAGATCG	384	Note que	os	5C
organização	ACCTGTGCGATGA		espaçadores	de
de glue		ACTG		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 66	de	GTGCAGTCCACAC	392	Note que	os	5C
organização	ACAGATCGACCTG		espaçadores	de
de glue		TGCG		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 67	de	GCCAGTTGTGCAG	399	Note que	os	5C
organização	TCCACACACAGAT		espaçadores	de
de glue		CGAC		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 68	de	GGGCAGCCAGTTG	404	Note que	os	5C

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 657/817

650/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
organização	TGCAGTCCACACA		espaçadores	de
de glue	GAGA		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotideos	na
			extremidade 5'
Guia 69 de	GTTTGAGGCAGCC	409	Note que	os	5C
organização	AGTTGTGCAGTCC		espaçadores	de
de glue	ACAC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotideos	na
			extremidade 5'
Guia 70 de	GAAGCCCTTTGAG	415	Note que	os	5C
organização	GCAGCCAGTTGTG		espaçadores	de
de glue	CAGT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotideos	na
			extremidade 5'
Guia 71 de	GCACGTTGGCAAG	424	Note que	os	5C
organização	CCCTTTGAGGCAG		espaçadores	de
de glue	CCAG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotideos	na
			extremidade 5'

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 658/817

651/776

Nome	Sequência	Posição	Notas		Primeira
	espaçadora				figura
Guia 72 de	GACTGCACGTTGG	428	Note que	OS	5C
organização	CAAGCCCTTTGAG		espaçadores	de
de glue	GCAG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 73 de	GGGTCAGAACACT	437	Note que	os	5C
organização	GCACGTTGGCAAG		espaçadores	de
de glue	CCCT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 74 de	GCAGGTCAGAACA	439	Note que	os	5C
organização	CTGCACGTTGGCA		espaçadores	de
de glue	AGCC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 75 de	GAGCAGGTCAGAA	441	Note que	os	5C
organização	GACTGCACGTTGG		espaçadores	de
de glue	CAAG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 659/817

652/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
			extremidade 5'
Guia 76 de	GGCCACTTCTTGA	452	Note que	OS	5C
organização	GCAGGTCAGAACA		espaçadores	de
de glue	CTGC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 77 de	GCGGCAGCCACTT	457	Note que	os	5C
organização	CTTGAGCAGGTCA		espaçadores	de
de glue	GAAC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 78 de	GTGCGGCAGCCAC	459	Note que	os	5C
organização	TTCTTGAGCAGGT		espaçadores	de
de glue	GAGA		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 79 de	GAGCGTTGCGGCA	464	Note que	os	5C
organização	GCCACTTCTTGAG		espaçadores	de
de glue	CAGG		Casl3a	são
			truncados por	dois

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 660/817

653/776

Nome	Sequência	Posição	Notas		Primeira
	espaçadora				figura
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 80 de	GAAAGGTCGCACA	475	Note que	os	5C
organização	GCGTTGCGGCAGC		espaçadores	de
de glue	CACT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 81 de	GCTGGCAAAGGTC	480	Note que	os	5C
organização	GCACAGCGTTGCG		espaçadores	de
de glue	GCAG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 82 de	GGGCAAAGGTCGC	478	Note que	os	5C
organização	ACAGCGTTGCGGC		espaçadores	de
de glue	AGCC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 83 de	GTGGATCTTGCTG	489	Note que	os	5C
organização	GCAAAGGTCGCAC		espaçadores	de
de glue	AGCG		Casl3a	são

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 661/817

654/776

Nome	Sequência	Posição	Notas		Primeira
	espaçadora				figura
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 84 de	GCACCTGGCCCTG	499	Note que	os	5C
organização	GATCTTGCTGGCA		espaçadores	de
de glue	AAGG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 85 de	GTGGCCCTGGATC	495	Note que	os	5C
organização	TTGCTGGCAAAGG		espaçadores	de
de glue	TCGC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 86 de	GTGATCTTGTCCA	509	Note que	os	5C
organização	CCTGGCCCTGGAT		espaçadores	de
de glue	CTTG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 87 de	GCCCCTTGATCTT	514	Note que	os	5C
organização	GTCCACCTGGCCC		espaçadores	de

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 662/817

655/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
de gluc		TGGA		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 88	de	GCCCTTGATCTTG	513	Note que	os	5C
organização	TCCACCTGGCCCT		espaçadores	de
de gluc		GGAT		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 89	de	GCCTTGATCTTGT	512	Note que	os	5C
organização	CCACCTGGCCCTG		espaçadores	de
de gluc		GATC		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 90	de	GGCAAAGGTCGCA	477	Note que	os	5C
organização	CAGCGTTGCGGCA		espaçadores	de
de gluc		GCCA		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 91	de	GCAAAGGTCGCAC	476	Note que	os	5C

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 663/817

656/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
organização	AGCGTTGCGGCAG		espaçadores	de
de glue	CCAC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 92 de	GAAGGTCGCACAG	474	Note que	os	5C
organização	CGTTGCGGCAGCC		espaçadores	de
de glue	ACTT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 93 de	GAGGTCGCACAGC	473	Note que	os	5C
organização	GTTGCGGCAGCCA		espaçadores	de
de glue	CTTC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia de não	GGTAATGCCTGGC	N/A	Note que	os	5C
alvejamento	TTGTCGACGCATA		espaçadores	de
1	GTCTG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 664/817

657/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
Guia de não	GGGAACCTTGGCC	N/A	Note que	OS	5C
alvejamento	GTTATAAAGTCTG		espaçadores	de
2	ACCAG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia de não	GGAGGGTGAGAAT	N/A	Note que	os	5C
alvejamento	TTAGAACCAAGAT		espaçadores	de
3	TGTTG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'

Tabela 11: Sequências guia usadas para knockdown de

Cluc

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
Guia 1 de	GAGTCCTGGCAAT	32	Note que	OS	5D
organização	GAACAGTGGCGCA		espaçadores	de
de Cluc	GTAG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 665/817

658/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
Guia 2 de	GGGTGCCACAGCT	118	Note que	OS	5D
organização	GCTATCAATACAT		espaçadores	de
de Clue	TCTC		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 3 de	GTTACATACTGAC	197	Note que	os	5D
organização	ACATTCGGCAACA		espaçadores	de
de Clue	TGTT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 4 de	GTATGTACCAGGT	276	Note que	os	5D
organização	TCCTGGAACTGGA		espaçadores	de
de Clue	AT CT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 5 de	GCCTTGGTTCCAT	350	Note que	os	5D
organização	CCAGGTTCTCCAG		espaçadores	de
de Clue	GGTG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 666/817

659/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
			extremidade 5'
Guia 6 de	GCAGTGATGGGAT	431	Note que	OS	5D
organização	TCTCAGTAGCTTG		espaçadores	de
de Clue	AGCG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 7 de	GAGCCTGGCATCT	512	Note que	os	5D
organização	CAACAACAGCGAT		espaçadores	de
de Clue	GGTG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 8 de	GTGTCTGGGGCGA	593	Note que	os	5D
organização	TTCTTACAGATCT		espaçadores	de
de Clue	TCCT		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 9 de	GCTGGATCTGAAG	671	Note que	os	5D
organização	TGAAGTCTGTATC		espaçadores	de
de Clue	TTCC		Casl3a	são
			truncados por	dois

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 667/817

660/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 10 de	GGCAACGTCATCA	747	Note que	os	5D
organização	GGATTTCCATAGA		espaçadores	de
de Clue	GTGG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 11 de	GAGGCGCAGGAGA	830	Note que	os	5D
organização	TGGTGTAGTAGTA		espaçadores	de
de Clue	GAAG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 13 de	GAGGGACCCTGGA	986	Note que	os	5D
organização	ATTGGTATCTTGC		espaçadores	de
de Clue	TTTG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 14 de	GGTAAGAGTCAAC	1066	Note que	os	5D
organização	ATTCCTGTGTGAA		espaçadores	de
de Clue	ACCT		Casl3a	são

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 668/817

661/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 15 de	GACCAGAATCTGT	1143	Note que	os	5D
organização	TTTCCATCAACAA		espaçadores	de
de Cluc	TGAG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 16 de	GATGGCTGTAGTC	1227	Note que	os	5D
organização	AGTATGTCACCAT		espaçadores	de
de Cluc	CTTG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 17 de	GTACCATCGAATG	1304	Note que	os	5D
organização	GATCTCTAATATG		espaçadores	de
de Cluc	TACG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotídeos	na
			extremidade 5'
Guia 18 de	GAGATCACAGGCT	1380	Note que	os	5D
organização	CCTTCAGCATCAA		espaçadores	de

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 669/817

662/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
de Clue		AAGA		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 19	de	GCTTTGACCGGCG	1461	Note que	os	5D
organização	AAGAGACTATTGC		espaçadores	de
de Clue		AGAG		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 20	de	GCCCCTCAGGCAA	1539	Note que	os	5D
organização	TACTCGTACATGC		espaçadores	de
de Clue		ATCG		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia 21	de	GCTGGTACTTCTA	1619	Note que	os	5D
organização	GGGTGTCTCCATG		espaçadores	de
de Clue		CTTT		Casl3a	são
				truncados por	dois
				nucleotídeos	na
				extremidade 5'
Guia de	não	GGTAATGCCTGGC	N/A	Note que	os	5D

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 670/817

663/776

Nome	Sequência espaçadora	Posição	Notas	Primeira figura
alvejamento	TTGTCGACGCATA		espaçadores	de
1	GTCTG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotideos	na
			extremidade 5'
Guia de não	GGGAACCTTGGCC	N/A	Note que	os	5D
alvejamento	GTTATAAAGTCTG		espaçadores	de
2	ACCAG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotideos	na
			extremidade 5'
Guia de não	GGAGGGTGAGAAT	N/A	Note que	os	5D
alvejamento	TTAGAACCAAGAT		espaçadores	de
3	TGTTG		Casl3a	são
			truncados por	dois
			nucleotideos	na
			extremidade 5'

Tabela 12: Sequências guia usadas nesse estudo para edição de RNA em células de mamíferos. FLIPS de base incompatíveis estão em caixa alta

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 671/817

664/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
Distância de	gCatcctgcggcctctac	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctgcattcaatt	expressão de U6
de 30 de 30 nt de
organização
Distância de	gacCatcctgcggcctct	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	actctgcattcaa	expressão de U6
de 30 de 28 nt de
organização
Distância de	gaaacCatcctgcggcct	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ctactctgcattc	expressão de U6
de 30 de 26 nt de
organização
Distância de	gctaaacCatcctgcggc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ctctactctgcat	expressão de U6
de 30 de 24 nt de
organização
Distância de	gttctaaacCatcctgcg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	gcctctactctgc	expressão de U6
de 30 de 22 nt de
organização
Distância de	gtgttctaaacCatcctg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cggcctctactct	expressão de U6
de 30 de 20 nt de

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 672/817

665/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
organização
Distância de	gaatgttctaaacCatcc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tgcggcctctact	expressão de U6
de 30 de 18 nt de
organização
Distância de	gagaatgttctaaacCat	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cctgcggcctcta	expressão de U6
de 30 de 16 nt de
organização
Distância de	gatagaatgttctaaacC	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	atcctgcggcctc	expressão de U6
de 30 de 14 nt de
organização
Distância de	gccatagaatgttctaaa	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cCatcctgcggcc	expressão de U6
de 30 de 12 nt de
organização
Distância de	gttccatagaatgttcta	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	aacCatcctgcgg	expressão de U6
de 30 de 10 nt de
organização
Distância de	gctttccatagaatgttc	Tem uma 5 ' G para	6C

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 673/817

666/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
incompatibilidade	taaacCatcctgc	expressão de U6
de 30 de 8 nt de
organização
Distância de	gctctttccatagaatgt	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctaaacCatcct	expressão de U6
de 30 de 6 nt de
organização
Distância de	gatctctttccatagaat	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	gttctaaacCatc	expressão de U6
de 30 de 4 nt de
organização
Distância de	ggaatctctttccataga	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	atgttctaaacCa	expressão de U6
de 30 de 2 nt de
organização
Distância de	gCatcctgcggcctctac	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctgcattcaattacata	expressão de U6
de 50 de 50 nt de	ctgacacattcggca
organização
Distância de	gacCatcctgcggcctct	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	actctgcattcaattaca	expressão de U6
de 50 de 48 nt de	tactgacacattcgg
organização

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 674/817

667/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
Distância de	gaaacCatcctgcggcct	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ctactctgcattcaatta	expressão de U6
de 50 de 46 nt de	catactgacacattc
organização
Distância de	gctaaacCatcctgcggc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ctctactctgcattcaat	expressão de U6
de 50 de 44 nt de	tacatactgacacat
organização
Distância de	gttctaaacCatcctgcg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	gcctctactctgcattca	expressão de U6
de 50 de 42 nt de	attacatactgacac
organização
Distância de	gtgttctaaacCatcctg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cggcctctactctgcatt	expressão de U6
de 50 de 40 nt de	caattacatactgac
organização
Distância de	gaatgttctaaacCatcc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tgcggcctctactctgca	expressão de U6
de 50 de 38 nt de	ttcaattacatactg
organização
Distância de	gagaatgttctaaacCat	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cctgcggcctctactctg	expressão de U6
de 50 de 36 nt de	cattcaattacatac

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 675/817

668/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
organização
Distância de	gatagaatgttctaaacC	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	atcctgcggcctctactc	expressão de U6
de 50 de 34 nt de	tgcattcaattacat
organização
Distância de	gccatagaatgttctaaa	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cCatcctgcggcctctac	expressão de U6
de 50 de 32 nt de	tctgcattcaattac
organização
Distância de	gttccatagaatgttcta	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	aacCatcctgcggcctct	expressão de U6
de 50 de 30 nt de	actctgcattcaatt
organização
Distância de	gctttccatagaatgttc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	taaacCatcctgcggcct	expressão de U6
de 50 de 28 nt de	ctactctgcattcaa
organização
Distância de	gctctttccatagaatgt	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctaaacCatcctgcggc	expressão de U6
de 50 de 26 nt de	ctctactctgcattc
organização
Distância de	gatctctttccatagaat	Tem uma 5 ' G para	6C

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 676/817

669/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
incompatibilidade	gttctaaacCatcctgcg	expressão de U6
de 50 de 24 nt de	gcctctactctgcat
organização
Distância de	ggaatctctttccataga	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	atgttctaaacCatcctg	expressão de U6
de 50 de 22 nt de	cggcctctactctgc
organização
Distância de	gtggaatctctttccata	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	gaatgttctaaacCatcc	expressão de U6
de 50 de 20 nt de	tgcggcctctactct
organização
Distância de	gactggaatctctttcca	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tagaatgttctaaacCat	expressão de U6
de 50 de 18 nt de	cctgcggcctctact
organização
Distância de	ggaactggaatctctttc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	catagaatgttctaaacC	expressão de U6
de 50 de 16 nt de	atcctgcggcctcta
organização
Distância de	gtggaactggaatctctt	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tccatagaatgttctaaa	expressão de U6
de 50 de 14 nt de	cCatcctgcggcctc
organização

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 677/817

670/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
Distância de	gcctggaactggaatctc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tttccatagaatgttcta	expressão de U6
de 50 de 12 nt de	aacCatcctgcggcc
organização
Distância de	gttcctggaactggaatc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctttccatagaatgttc	expressão de U6
de 50 de 10 nt de	taaacCatcctgcgg
organização
Distância de	gggttcctggaactggaa	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctctttccatagaatgt	expressão de U6
de 5 0 de 8 nt de	tctaaacCatcctgc
organização
Distância de	gcaggttcctggaactgg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	aatctctttccatagaat	expressão de U6
de 5 0 de 6 nt de	gttctaaacCatcct
organização
Distância de	gaccaggttcctggaact	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ggaatctctttccataga	expressão de U6
de 5 0 de 4 nt de	atgttctaaacCatc
organização
Distância de	ggtaccaggttcctggaa	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ctggaatctctttccata	expressão de U6
de 5 0 de 2 nt de	gaatgttctaaacCa

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 678/817

671/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
organização
Distância de	gCatcctgcggcctctac	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctgcattcaattacata	expressão de U6
de 70 de 70 nt de	ctgacacattcggcaaca
organização	tgtttttcctggtttat
Distância de	gacCatcctgcggcctct	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	actctgcattcaattaca	expressão de U6
de 70 de 68 nt de	tactgacacattcggcaa
organização	catgtttttcctggttt
Distância de	gaaacCatcctgcggcct	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ctactctgcattcaatta	expressão de U6
de 70 de 66 nt de	catactgacacattcggc
organização	aacatgtttttcctggt
Distância de	gctaaacCatcctgcggc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ctctactctgcattcaat	expressão de U6
de 70 de 64 nt de	tacatactgacacattcg
organização	gcaacatgtttttcctg
Distância de	gttctaaacCatcctgcg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	gcctctactctgcattca	expressão de U6
de 70 de 62 nt de	attacatactgacacatt
organização	cggcaacatgtttttcc
Distância de	gtgttctaaacCatcctg	Tem uma 5 ' G para	6C

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 679/817

672/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
incompatibilidade	cggcctctactctgcatt	expressão de U6
de 70 de 60 nt de	caattacatactgacaca
organização	ttcggcaacatgttttt
Distância de	gaatgttctaaacCatcc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tgcggcctctactctgca	expressão de U6
de 70 de 58 nt de	ttcaattacatactgaca
organização	cattcggcaacatgttt
Distância de	gagaatgttctaaacCat	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cctgcggcctctactctg	expressão de U6
de 70 de 56 nt de	cattcaattacatactga
organização	cacattcggcaacatgt
Distância de	gatagaatgttctaaacC	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	atcctgcggcctctactc	expressão de U6
de 70 de 54 nt de	tgcattcaattacatact
organização	gacacattcggcaacat
Distância de	gccatagaatgttctaaa	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cCatcctgcggcctctac	expressão de U6
de 70 de 52 nt de	tctgcattcaattacata
organização	ctgacacattcggcaac
Distância de	gttccatagaatgttcta	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	aacCatcctgcggcctct	expressão de U6
de 70 de 50 nt de	actctgcattcaattaca
organização	tactgacacattcggca

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 680/817

673/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
Distância de	gctttccatagaatgttc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	taaacCatcctgcggcct	expressão de U6
de 70 de 48 nt de	ctactctgcattcaatta
organização	catactgacacattcgg
Distância de	gctctttccatagaatgt	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctaaacCatcctgcggc	expressão de U6
de 70 de 46 nt de	ctctactctgcattcaat
organização	tacatactgacacattc
Distância de	gatctctttccatagaat	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	gttctaaacCatcctgcg	expressão de U6
de 70 de 44 nt de	gcctctactctgcattca
organização	attacatactgacacat
Distância de	ggaatctctttccataga	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	atgttctaaacCatcctg	expressão de U6
de 70 de 42 nt de	cggcctctactctgcatt
organização	caattacatactgacac
Distância de	gtggaatctctttccata	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	gaatgttctaaacCatcc	expressão de U6
de 70 de 40 nt de	tgcggcctctactctgca
organização	ttcaattacatactgac
Distância de	gactggaatctctttcca	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tagaatgttctaaacCat	expressão de U6
de 70 de 38 nt de	cctgcggcctctactctg

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 681/817 βΊ^/ΊΊβ

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
organização	cattcaattacatactg
Distância de	ggaactggaatctctttc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	catagaatgttctaaacC	expressão de U6
de 70 de 36 nt de	atcctgcggcctctactc
organização	tgcattcaattacatac
Distância de	gtggaactggaatctctt	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tccatagaatgttctaaa	expressão de U6
de 70 de 34 nt de	cCatcctgcggcctctac
organização	tctgcattcaattacat
Distância de	gcctggaactggaatctc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tttccatagaatgttcta	expressão de U6
de 70 de 32 nt de	aacCatcctgcggcctct
organização	actctgcattcaattac
Distância de	gttcctggaactggaatc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctttccatagaatgttc	expressão de U6
de 70 de 30 nt de	taaacCatcctgcggcct
organização	ctactctgcattcaatt
Distância de	gggttcctggaactggaa	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctctttccatagaatgt	expressão de U6
de 70 de 28 nt de	tctaaacCatcctgcggc
organização	ctctactctgcattcaa
Distância de	gcaggttcctggaactgg	Tem uma 5 ' G para	6C

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 682/817

675/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
incompatibilidade	aatctctttccatagaat	expressão de U6
de 70 de 26 nt de	gttctaaacCatcctgcg
organização	gcctctactctgcattc
Distância de	gaccaggttcctggaact	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ggaatctctttccataga	expressão de U6
de 70 de 24 nt de	atgttctaaacCatcctg
organização	cggcctctactctgcat
Distância de	ggtaccaggttcctggaa	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ctggaatctctttccata	expressão de U6
de 70 de 22 nt de	gaatgttctaaacCatcc
organização	tgcggcctctactctgc
Distância de	gatgtaccaggttcctgg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	aactggaatctctttcca	expressão de U6
de 70 de 20 nt de	tagaatgttctaaacCat
organização	cctgcggcctctactct
Distância de	ggtatgtaccaggttcct	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ggaactggaatctctttc	expressão de U6
de 70 de 18 nt de	catagaatgttctaaacC
organização	atcctgcggcctctact
Distância de	gacgtatgtaccaggttc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ctggaactggaatctctt	expressão de U6
de 70 de 16 nt de	tccatagaatgttctaaa
organização	cCatcctgcggcctcta

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 683/817

6Ί6/ΊΊ6

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
Distância de	gacacgtatgtaccaggt	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tcctggaactggaatctc	expressão de U6
de 70 de 14 nt de	tttccatagaatgttcta
organização	aacCatcctgcggcctc
Distância de	gcaacacgtatgtaccag	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	gttcctggaactggaatc	expressão de U6
de 70 de 12 nt de	tctttccatagaatgttc
organização	taaacCatcctgcggcc
Distância de	gcccaacacgtatgtacc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	aggttcctggaactggaa	expressão de U6
de 70 de 10 nt de	tctctttccatagaatgt
organização	tctaaacCatcctgcgg
Distância de	ggacccaacacgtatgta	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ccaggttcctggaactgg	expressão de U6
de 7 0 de 8 nt de	aatctctttccatagaat
organização	gttctaaacCatcctgc
Distância de	gttgacccaacacgtatg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	taccaggttcctggaact	expressão de U6
de 7 0 de 6 nt de	ggaatctctttccataga
organização	atgttctaaacCatcct
Distância de	gccttgacccaacacgta	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tgtaccaggttcctggaa	expressão de U6
de 7 0 de 4 nt de	ctggaatctctttccata

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 684/817

677/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
organização	gaatgttctaaacCatc
Distância de	gttccttgacccaacacg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tatgtaccaggttcctgg	expressão de U6
de 7 0 de 2 nt de	aactggaatctctttcca
organização	tagaatgttctaaacCa
Distância de	gCatcctgcggcctctac	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctgcattcaattacata	expressão de U6
de 84 de 84 nt de	ctgacacattcggcaaca
organização	tgtttttcctggtttatt
	ttcacacagtcca
Distância de	gacCatcctgcggcctct	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	actctgcattcaattaca	expressão de U6
de 84 de 82 nt de	tactgacacattcggcaa
organização	catgtttttcctggttta
	ttttcacacagtc
Distância de	gaaacCatcctgcggcct	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ctactctgcattcaatta	expressão de U6
de 84 de 80 nt de	catactgacacattcggc
organização	aacatgtttttcctggtt
	tattttcacacag
Distância de	gctaaacCatcctgcggc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ctctactctgcattcaat	expressão de U6
de 84 de 78 nt de	tacatactgacacattcg

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 685/817

678/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
organização	gcaacatgtttttcctgg
	tttattttcacac
Distância de	gttctaaacCatcctgcg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	gcctctactctgcattca	expressão de U6
de 84 de 76 nt de	attacatactgacacatt
organização	cggcaacatgtttttcct
	ggtttattttcac
Distância de	gtgttctaaacCatcctg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cggcctctactctgcatt	expressão de U6
de 84 de 74 nt de	caattacatactgacaca
organização	ttcggcaacatgtttttc
	ctggtttattttc
Distância de	gaatgttctaaacCatcc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tgcggcctctactctgca	expressão de U6
de 84 de 72 nt de	ttcaattacatactgaca
organização	cattcggcaacatgtttt
	tcctggtttattt
Distância de	gagaatgttctaaacCat	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cctgcggcctctactctg	expressão de U6
de 84 de 70 nt de	cattcaattacatactga
organização	cacattcggcaacatgtt
	tttcctggtttat
Distância de	gatagaatgttctaaacC	Tem uma 5 ' G para	6C

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 686/817

679/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
incompatibilidade	atcctgcggcctctactc	expressão de U6
de 84 de 68 nt de	tgcattcaattacatact
organização	gacacattcggcaacatg
	tttttcctggttt
Distância de	gccatagaatgttctaaa	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cCatcctgcggcctctac	expressão de U6
de 84 de 66 nt de	tctgcattcaattacata
organização	ctgacacattcggcaaca
	tgtttttcctggt
Distância de	gttccatagaatgttcta	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	aacCatcctgcggcctct	expressão de U6
de 84 de 64 nt de	actctgcattcaattaca
organização	tactgacacattcggcaa
	catgtttttcctg
Distância de	gctttccatagaatgttc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	taaacCatcctgcggcct	expressão de U6
de 84 de 62 nt de	ctactctgcattcaatta
organização	catactgacacattcggc
	aacatgtttttcc
Distância de	gctctttccatagaatgt	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctaaacCatcctgcggc	expressão de U6
de 84 de 60 nt de	ctctactctgcattcaat
organização	tacatactgacacattcg

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 687/817

680/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
	gcaacatgttttt
Distância de	gatctctttccatagaat	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	gttctaaacCatcctgcg	expressão de U6
de 84 de 58 nt de	gcctctactctgcattca
organização	attacatactgacacatt
	cggcaacatgttt
Distância de	ggaatctctttccataga	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	atgttctaaacCatcctg	expressão de U6
de 84 de 56 nt de	cggcctctactctgcatt
organização	caattacatactgacaca
	ttcggcaacatgt
Distância de	gtggaatctctttccata	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	gaatgttctaaacCatcc	expressão de U6
de 84 de 54 nt de	tgcggcctctactctgca
organização	ttcaattacatactgaca
	cattcggcaacat
Distância de	gactggaatctctttcca	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tagaatgttctaaacCat	expressão de U6
de 84 de 52 nt de	cctgcggcctctactctg
organização	cattcaattacatactga
	cacattcggcaac
Distância de	ggaactggaatctctttc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	catagaatgttctaaacC	expressão de U6

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 688/817

681/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
de 84 de 50 nt de	atcctgcggcctctactc
organização	tgcattcaattacatact
	gacacattcggca
Distância de	gtggaactggaatctctt	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tccatagaatgttctaaa	expressão de U6
de 84 de 48 nt de	cCatcctgcggcctctac
organização	tctgcattcaattacata
	ctgacacattcgg
Distância de	gcctggaactggaatctc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tttccatagaatgttcta	expressão de U6
de 84 de 46 nt de	aacCatcctgcggcctct
organização	actctgcattcaattaca
	tactgacacattc
Distância de	gttcctggaactggaatc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctttccatagaatgttc	expressão de U6
de 84 de 44 nt de	taaacCatcctgcggcct
organização	ctactctgcattcaatta
	catactgacacat
Distância de	gggttcctggaactggaa	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tctctttccatagaatgt	expressão de U6
de 84 de 42 nt de	tctaaacCatcctgcggc
organização	ctctactctgcattcaat
	tacatactgacac

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 689/817

682/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
Distância de	gcaggttcctggaactgg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	aatctctttccatagaat	expressão de U6
de 84 de 40 nt de	gttctaaacCatcctgcg
organização	gcctctactctgcattca
	attacatactgac
Distância de	gaccaggttcctggaact	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ggaatctctttccataga	expressão de U6
de 84 de 38 nt de	atgttctaaacCatcctg
organização	cggcctctactctgcatt
	caattacatactg
Distância de	ggtaccaggttcctggaa	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ctggaatctctttccata	expressão de U6
de 84 de 36 nt de	gaatgttctaaacCatcc
organização	tgcggcctctactctgca
	ttcaattacatac
Distância de	gatgtaccaggttcctgg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	aactggaatctctttcca	expressão de U6
de 84 de 34 nt de	tagaatgttctaaacCat
organização	cctgcggcctctactctg
	cattcaattacat
Distância de	ggtatgtaccaggttcct	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ggaactggaatctctttc	expressão de U6
de 84 de 32 nt de	catagaatgttctaaacC

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 690/817

683/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
organização	atcctgcggcctctactc
	tgcattcaattac
Distância de	gacgtatgtaccaggttc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ctggaactggaatctctt	expressão de U6
de 84 de 30 nt de	tccatagaatgttctaaa
organização	cCatcctgcggcctctac
	tctgcattcaatt
Distância de	gacacgtatgtaccaggt	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tcctggaactggaatctc	expressão de U6
de 84 de 28 nt de	tttccatagaatgttcta
organização	aacCatcctgcggcctct
	actctgcattcaa
Distância de	gcaacacgtatgtaccag	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	gttcctggaactggaatc	expressão de U6
de 84 de 26 nt de	tctttccatagaatgttc
organização	taaacCatcctgcggcct
	ctactctgcattc
Distância de	gcccaacacgtatgtacc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	aggttcctggaactggaa	expressão de U6
de 84 de 24 nt de	tctctttccatagaatgt
organização	tctaaacCatcctgcggc
	ctctactctgcat
Distância de	ggacccaacacgtatgta	Tem uma 5 ' G para	6C

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 691/817

684/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
incompatibilidade	ccaggttcctggaactgg	expressão de U6
de 84 de 22 nt de	aatctctttccatagaat
organização	gttctaaacCatcctgcg
	gcctctactctgc
Distância de	gttgacccaacacgtatg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	taccaggttcctggaact	expressão de U6
de 84 de 20 nt de	ggaatctctttccataga
organização	atgttctaaacCatcctg
	cggcctctactct
Distância de	gccttgacccaacacgta	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tgtaccaggttcctggaa	expressão de U6
de 84 de 18 nt de	ctggaatctctttccata
organização	gaatgttctaaacCatcc
	tgcggcctctact
Distância de	gttccttgacccaacacg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tatgtaccaggttcctgg	expressão de U6
de 84 de 16 nt de	aactggaatctctttcca
organização	tagaatgttctaaacCat
	cctgcggcctcta
Distância de	gggttccttgacccaaca	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cgtatgtaccaggttcct	expressão de U6
de 84 de 14 nt de	ggaactggaatctctttc
organização	catagaatgttctaaacC

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 692/817

685/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
	atcctgcggcctc
Distância de	gttggttccttgacccaa	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cacgtatgtaccaggttc	expressão de U6
de 84 de 12 nt de	ctggaactggaatctctt
organização	tccatagaatgttctaaa
	cCatcctgcggcc
Distância de	gccttggttccttgaccc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	aacacgtatgtaccaggt	expressão de U6
de 84 de 10 nt de	tcctggaactggaatctc
organização	tttccatagaatgttcta
	aacCatcctgcgg
Distância de	ggcccttggttccttgac	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	ccaacacgtatgtaccag	expressão de U6
de 8 4 de 8 nt de	gttcctggaactggaatc
organização	tctttccatagaatgttc
	taaacCatcctgc
Distância de	gccgcccttggttccttg	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	acccaacacgtatgtacc	expressão de U6
de 8 4 de 6 nt de	aggttcctggaactggaa
organização	tctctttccatagaatgt
	tctaaacCatcct
Distância de	gcgccgcccttggttcct	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	tgacccaacacgtatgta	expressão de U6

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 693/817

686/776

Nome		Sequência	Notas	Primeira
		espaçadora		figura
de 8 4 de 4 nt	de	ccaggttcctggaactgg
organização		aatctctttccatagaat
		gttctaaacCatc
Distância	de	ggtcgccgcccttggttc	Tem uma 5 ' G para	6C
incompatibilidade	cttgacccaacacgtatg	expressão de U6
de 8 4 de 2 nt	de	taccaggttcctggaact
organização		ggaatctctttccataga
		atgttctaaacCa
Guia de não	GTAATGCCTGGCTTGTCG	Tem uma 5 ' G para	6C
alvejamento	de	ACGCATAGTCTG	expressão de U6
ADAR
Guia de triagem	de	gaaaacgcaggttcctcC	Tem uma 5 ' G para	7B
ligação de PFS	agtttcgggagcagcgca	expressão de U6
para motivo TAG		cgtctccctgtagtc
Guia de triagem	de	gacgcaggttcctctagC	Tem uma 5 ' G para	7B
ligação de PFS	ttcgggagcagcgcacgt	expressão de U6
para motivo AAC		ctccctgtagtcaag
Não alvejamento	GTAATGCCTGGCTTGTCG	Tem uma 5 ' G para	7B
de triagem	de	ACGCATAGTCTG	expressão de U6
ligação de PFS
Guia	de	gatagaatgttctaaacC	Tem uma 5 ' G para	7C
alvejamento	de	atcctgcggcctctactc	expressão de U6

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 694/817

687/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
preferência de	tgcattcaattacat
motivo
Guia de não	GTAATGCCTGGCTTGTCG	Tem uma 5 ' G para	7C
alvejamento de	ACGCATAGTCTG	expressão de U6
preferência de
motivo
Distância de	gCaaggccacaaaattat	Tem uma 5 ' G para	13D
incompatibilidade	ccactgtttttggaacag	expressão de U6
de 5 0 de guia de	tctttccgaagagac
organização de
PPIB
Distância de	gcctgtagcCaaggccac	Tem uma 5 ' G para	13D
incompatibilidade	aaaattatccactgtttt	expressão de U6
de 42 de guia de	tggaacagtctttcc
organização de
PPIB
Distância de	gctttctctcctgtagcC	Tem uma 5 ' G para	13D
incompatibilidade	aaggccacaaaattatee	expressão de U6
de 34 de guia de	actgtttttggaaca
organização de
PPIB
Distância de	ggccaaatcctttctctc	Tem uma 5 ' G para	13D
incompatibilidade	ctgtagcCaaggccacaa	expressão de U6

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 695/817

688/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
de 2 6 de guia de	aattatccactgttt
organização de
PPIB
Distância de	gtttttgtagccaaatcc	Tem uma 5 ' G para	13D
incompatibilidade	tttctctcctgtagcCaa	expressão de U6
de 18 de guia de	ggccacaaaattatc
organização de
PPIB
Distância de	gatttgctgtttttgtag	Tem uma 5 ' G para	13D
incompatibilidade	ccaaatcctttctctcct	expressão de U6
de 10 de guia de	gtagcCaaggccaca
organização de
PPIB
Distância de	gacgatggaatttgctgt	Tem uma 5 ' G para	13D
incompatibilidade	ttttgtagccaaatcctt	expressão de U6
de 2 de guia de	tctctcctgtagcCa
organização de
PPIB
Guia de	gatagaatgttctaaacG	Tem uma 5 ' G para	13D
alvejamento, base	atcctgcggcctctactc	expressão de U6
oposta G	tgcattcaattacat
Guia de	gatagaatgttctaaacA	Tem uma 5 ' G para	13D
alvejamento, base	atcctgcggcctctactc	expressão de U6

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 696/817

689/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
oposta A	tgcattcaattacat
Guia de	gatagaatgttctaaacT	Tem uma 5 ' G para	13D
alvejamento, base	atcctgcggcctctactc	expressão de U6
oposta C	tgcattcaattacat
Distância de	ggtcccacgcggccCaca	Tem uma 5 ' G para	8A
incompatibilidade	gctgcaccaggaagaagg	expressão de U6
de 37 de guia de	gtgcccagcacagca
AVPR2
Distância de	ggggtcccacgcggccCa	Tem uma 5 ' G para	8A
incompatibilidade	cagctgcaccaggaagaa	expressão de U6
de 35 de guia de	gggtgcccagcacag
AVPR2
Distância de	gccgggtcccacgcggcc	Tem uma 5 ' G para	8A
incompatibilidade	Cacagctgcaccaggaag	expressão de U6
de 33 de guia de	aagggtgcccagcac
AVPR2
Distância de	gggtgatgacatccCagg	Tem uma 5 ' G para	8B
incompatibilidade	cgatcgtgtggcctccag	expressão de U6
de 37 de guia de	gagcccagagcagga
FANCC
Distância de	gagggtgatgacatccCa	Tem uma 5 ' G para	8B
incompatibilidade	ggcgatcgtgtggcctcc	expressão de U6

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 697/817

690/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
de 35 de guia de	aggagcccagagcag
FANCC
Distância de	gatcagggtgatgacatc	Tem uma 5 ' G para	8B
incompatibilidade	cCaggcgatcgtgtggcc	expressão de U6
de 32 de guia de	tccaggagcccagag
FANCC
Alvo de gene de	ggtggctccattcactcC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença sintética	aatgctgagcacttccac	expressão de U6
IL2RG	agagtgggttaaagc
Alvo de gene de	gtttctaatatattttgC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença sintética	cagactgatggactattc	expressão de U6
F8	tcaattaataatgat
Alvo de gene de	gagatgttgctgtggatC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença sintética	cagtccacagecageccg	expressão de U6
LDLR	tcgggggcctggatg
Alvo de gene de	gcaggceggcccagetgC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença sintética	caggtgcacctgctcgga	expressão de U6
CBS	gcatcgggccggatc
Alvo de gene de	gcaaagaacctctgggtC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença sintética	caagggtagaccaccagc	expressão de U6
HBB	agcctgcccagggcc
Alvo de gene de	gaagagaaacttagtttC	Tem uma 5 ' G para	8E

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 698/817

691/776

Nome		Sequência	Notas	Primeira
		espaçadora		figura
doença	sintética	cagggctttggtagaggg	expressão de U6
AL DOB		caaaggttgatagca
Alvo de	gene de	gtcagcctagtgcagagC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	cactggtagttggtggtt	expressão de U6
DMD		agagtttcaagttcc
Alvo de	gene de	ggctcattgtgaacaggC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	cagtaatgtccgggatgg	expressão de U6
SMAD4		ggcggcataggcggg
Alvo de	gene de	gtagctaaagaacttgaC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	caagacatatcaggatcc	expressão de U6
BRCA2		acctcagctcctaga
Alvo de	gene de	ggggcattgttctgtgcC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	cagtcctgctggtagacc	expressão de U6
GRIN2A		tgctccccggtggct
Alvo de	gene de	gagaagtcgttcatgtgC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	caccgtgggagcgtacag	expressão de U6
SCN9A		tcatcattgatcttg
Alvo de	gene de	gggattaatgctgaacgC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	accaaagttcatcccacc	expressão de U6
TARDBP		acccatattactacc
Alvo de	gene de	gctccaaaggctttcctC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	cactgttgcaaagttatt	expressão de U6

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 699/817

692/776

Nome		Sequência	Notas	Primeira
		espaçadora		figura
CFTR	gaatcccaagacaca
Alvo de	gene de	gatgaatgaacgatttcC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	cagaactccctaatcaga	expressão de U6
UBE3A		acagagtccctggta
Alvo de	gene de	ggagcctctgccggagcC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	cagagaacccgagagtca	expressão de U6
SMPD1		gacagagccagcgcc
Alvo de	gene de	ggcttccgtggagacacC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	caatcaatttgaagagat	expressão de U6
USH2A		cttgaagtgatgcca
Alvo de	gene de	gtgggactgccctcctcC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	catttgcagatgccgtcg	expressão de U6
MEN1		tagaatcgcagcagg
Alvo de	gene de	gcttcttcaatagttctC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	cagctacactggcaggca	expressão de U6
C8orf37		tatgcccgtgttcct
Alvo de	gene de	gattccttttcttcgtcC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	caattcacctcagtggct	expressão de U6
MLH1		agtcgaagaatgaag
Alvo de	gene de	gcagcttcagcaccttcC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	agtcagactcctgettea	expressão de U6
TSC2		agcactgcagcagga

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 700/817

693/776

Nome		Sequência	Notas	Primeira
		espaçadora		figura
Alvo de	gene de	gccatttgcttgcagtgC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	cactccagaggattccgg	expressão de U6
NF1		attgccataaatact
Alvo de	gene de	gttcaatagttttggtcC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	agtatcgtttacagccct	expressão de U6
MSH6		tcttggtagatttca
Alvo de	gene de	ggcaaccgtcttctgacC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	aaatggcagaacatttgt	expressão de U6
SMN1		ccccaactttccact
Alvo de	gene de	gcgactttccaatgaacC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	actgaagcccaggtatga	expressão de U6
SH3TC2		caaagccgatgatct
Alvo de	gene de	gtttacactcatgcttcC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	acagctttaacagatcat	expressão de U6
DNAH5		ttggttccttgatga
Alvo de	gene de	gcttaagcttccgtgtcC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	agccttcaggcagggtgg	expressão de U6
MECP2		ggtcatcatacatgg
Alvo de	gene de	ggacagctgggctgatcC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	atgatgtcatccagaaac	expressão de U6
ADGRV1		actggggaccctcag
Alvo de	gene de	gtctcatctcaactttcC	Tem uma 5 ' G para	8E

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 701/817

694/776

Nome		Sequência	Notas	Primeira
		espaçadora		figura
doença	sintética	atatccgtatcatggaat	expressão de U6
AHI1		catagcatcctgtaa
Alvo de	gene de	gcatgcagacgcggttcC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	actcgcagccacagttcc	expressão de U6
PRKN		agcaccactcgagcc
Alvo de	gene de	gttggttagggtcaaccC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	agtattctccactcttga	expressão de U6
COL3A1		gttcaggatggcaga
Alvo de	gene de	gctacactgtccaacacC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	cactctcgggtcaccaca	expressão de U6
BRCA1		ggtgcctcacacatc
Alvo de	gene de	gctgcactgtgtaccccC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	agagctccgtgttgccga	expressão de U6
MYBPC3		catcctggggtggct
Alvo de	gene de	gagcttcctgccactccC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	aacaggtttcacagtaag	expressão de U6
APC		cgcgtatctgttcca
Alvo de	gene de	gacggcaagagcttaccC	Tem uma 5 ' G para	8E
doença	sintética	agtcacttgtgtggagac	expressão de U6
BMPR2		ttaaatacttgcata
Distância de	gCaaggccacaaaattat	Tem uma 5 ' G para	9A
incompatibilidade	ccactgtttttggaacag	expressão de U6

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 702/817

695/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
de 5 0 de guia de	tctttccgaagagac
organização de
KRAS
Distância de	gcctgtagcCaaggccac	Tem uma 5 ' G para	9A
incompatibilidade	aaaattatccactgtttt	expressão de U6
de 42 de guia de	tggaacagtctttcc
organização de
KRAS
Distância de	gctttctctcctgtagcC	Tem uma 5 ' G para	9A
incompatibilidade	aaggccacaaaattatcc	expressão de U6
de 34 de guia de	actgtttttggaaca
organização de
KRAS
Distância de	ggccaaatcctttctctc	Tem uma 5 ' G para	9A
incompatibilidade	ctgtagcCaaggccacaa	expressão de U6
de 2 6 de guia de	aattatccactgttt
organização de
KRAS
Distância de	gtttttgtagccaaatcc	Tem uma 5 ' G para	9A
incompatibilidade	tttctctcctgtagcCaa	expressão de U6
de 18 de guia de	ggccacaaaattatc
organização de
KRAS

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 703/817

696/776

Nome		Sequência	Notas	Primeira
		espaçadora		figura
Distância	de	gatttgctgtttttgtag	Tem uma 5 ' G para	9A
incompatibilidade	ccaaatcctttctctcct	expressão de U6
de 10 de guia	de	gtagcCaaggccaca
organização	de
KRAS
Distância	de	gacgatggaatttgctgt	Tem uma 5 ' G para	9A
incompatibilidade	ttttgtagccaaatcctt	expressão de U6
de 2 de guia	de	tctctcctgtagcCa
organização	de
KRAS
Guia de	não	GTAATGCCTGGCTTGTCG	Tem uma 5 ' G para	9A
alvejamento	de	ACGCATAGTCTG	expressão de U6
organização	de
KRAS
Guia	de	gatagaatgttctaaacC	Tem uma 5 ' G para	53B
alvejamento	de	atcctgcggcctctactc	expressão de U6
luciferase W85X	tgcattcaattacat
para
especificidade	de
transcriptoma
Guia de	não	GCAGGGTTTTCCCAGTCA	Tem uma 5 ' G para	9C
alvejamento para	CGACGTTGTAAAGTTG	expressão de U6
especificidade	de

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 704/817

697/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
transcriptoma
Guia 2 de KRAS endógeno	gtcaaggcactcttgccC acgccaccagctccaact accacaagtttatat	Tem uma 5 ' G para expressão de U6	10F
Guia 1 de PPIB endógeno	gcaaagatcacccggccC acatcttcatctccaatt cgtaggtcaaaatac	Tem uma 5 ' G para expressão de U6	10G
Guia 1 de KRAS endógeno	GcgccaccagctccaacC accacaagtttatattea gtcattttcagcagg	Tem uma 5 ' G para expressão de U6	10F
Guia 3 de KRAS endógeno	GtttctccatcaattacC acttgcttcctgtaggaa tcctctattGTtgga	Tem uma 5 ' G para expressão de U6	10F
Guia 2 de PPIB endógeno	GctttctctcctgtagcC aaggccacaaaattatee actgtttttggaaca	Tem uma 5 ' G para expressão de U6	10G
Guia de não alvejamento endógeno	GTAATGCCTGGCTTGTCG ACGCATAGTCTG	Tem uma 5 ' G para expressão de U6	10F
Guia de BoxB Cluc	tctttccataGGCCCTGA AAAAGGGCCtgttctaaa cCatcctgcggcctctac	Tem uma 5 ' G para expressão de U6	18B

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 705/817

698/776

Nome	Sequência espaçadora	Notas	Primeira figura
	tcGGCCCTGAAAAAGGGC
	Cattcaattac
Guia de não	cagctggcgaGGCCCTGA	Tem uma 5 ' G para	18B
alvejamento de	AAAAGGGCCggggatgtg	expressão de U6
BoxB	cCgcaaggcgattaagtt
	ggGGCCCTGAAAAAGGGC
	Cacgccagggt
ADAR2 de	GT GGAAT AGT AT AAC AAT	Tem uma 5 ' G para	18C
comprimento total	ATGCTAAATGTTGTTATA	expressão de U6
de Stafforst de	GTATCCCACtctaaaCCA
guia 1	tcctgcgGGGCCCTCTTC
	AGGGCCC
ADAR2 de	GT GGAAT AGT AT AAC AAT	Tem uma 5 ' G para	18C
comprimento total	ATGCTAAATGTTGTTATA	expressão de U6
de Stafforst de	GTATCCCACaccctggcg
não-alvej amento	ttacccaGGGCCCTCTTC
de guia	AGGGCCC

Referências

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Exemplo 4 - Efetores do tipo VI-B adicionais

Tabela 13

Paludibacter propionicigenes WB4 (NC_014734.1) >WP_013446107

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Porphyromonas gingivalis W83 (NC_002950.2) >WP_005873511.1

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Porphyromonas gingivalis F0570 (NZ_KI259168.1) >WP_021665475.1

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Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 (NC_010729.1) >WP_012458151.1

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Porphyromonas gingivalis SJD2 (NZ_KI629875.1) >WP_023846767.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 720/817

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Porphyromonas gingivalis F0568 (AWUU01000145.1) >ERJ65637.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 721/817

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Porphyromonas gingivalis W4087 (AWVE01000130.1) >ERJ87335.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 722/817

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Porphyromonas gingivalis W4087 (NZ_KI260263.1) >WP_021680012.1	mntvpasenkgqsrtveddpqyfglylnlarenlieveshvrikfgkkkl neeslkqsllcdhllsvdrwtkvyghsrrylpfIhyfdpdsqiekdhdsk tgvdpdsaqrlirelyslldfIrndfshnrldgttfehlevspdiss fit gtyslacgraqsrfadffkpddfvlaknrkeqlisvadgkecltvsglaf ficlfIdreqasgmlsrirgfkrtdenwaravhetfcdlcirhphdrles sntkeallldmlnelnrcprilydmlpeeeraqfIpaldensmnnlsens Ineesrllwdgssdwaealtkrirhqdrfpylmlrfieemdllkgirfrv dlgeieldsyskkvgrngeydrtitdhalafgklsdfqneeevsrmisge asypvrfslfapryaiydnkigychtsdpvypksktgekralsnprsmgf isvhdlrklllmellcegs fsrmqsdfIrkanrildetaegklqfsalfp emrhrfippqnpkskdrrekaettlekykqeikgrkdklnsqllsafdmd qrqlpsrlldewmnirpashsvklrtyvkqlnedcrlrlqkfrkdgdgka raiplvgematfIsqdivrmiiseetkklitsayynemqrslaqyageen rhqfraivaelrlldpssghpfIsatmetahrytedfykcylekkrewla ktfyrpeqdentkrrisvffvpdgearkllpllirrrmkeqndlqdwirn kqahpidlpshlfdskvmellkvkdgkkkwneafkdwwstkypdgmqpfy glrrelnihgksvsyipsdgkkfadcythlmektvrdkkrelrtagkpvp pdlaayikrs fhravnerefmlrlvqeddrlmlmainkimtdreedilpg Iknidsildkenqfslavhakvlekegeggdnslslvpatieikskrkdw skyiryrydrrvpglmshfpehkatldevktllgeydrcrikifdwafal egaimsdrdlkpylhesssregksgehstlvkmlvekkgcltpdesqyli lirnkaahnqfpcaaeipliyrdvsakvgsiegssakdlpegsslvdslw kkyemiirkilpildpenrffgkllnnmsqpindl
Porphyromonas gingivalis F0568 (NZ_KI258981.1)	mntvpasenkgqsrtveddpqyfglylnlarenlieveshvrikfgkkkl neeslkqsllcdhllsvdrwtkvyghsrrylpfIhyfdpdsqiekdhdsk tgvdpdsaqrlirelyslldfIrndfshnrldgttfehlevspdiss fit

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 723/817

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>WP_021663197.1

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Porphyromonas gingivalis (NZ_LOEL01000010. 1) >WP_061156637.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 724/817

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Porphyromonas gulae (NZ_JRAQ01000019. 1) >WP_039445055.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 725/817

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Bacteroides pyogenes F0041 (KE993153.1) >ERI81700.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 726/817

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Bacteroides pyogenes JCM 10003 (NZ_BAIU01000001. 1) >WP_034542281.1	mesiknsqkstgktlqkdppyfglylnmallnvrkvenhirkwlgdvall peksgfhsllttdnlssakwtrfyyksrkfIpflemfdsdkksyenrret aecldtidrqkissllkevygklqdirnafshyhiddqsvkhtaliisse mhrfienays falqktrarftgvfvetdfIqaeekgdnkkffaiggnegi klkdnalifliclfIdreeafkfIsratgfkstkekgflavretfcalcc rqpherllsvnpreallmdmlnelnrcpdilfemldekdqks fIpllgee eqahilenslndelceaiddpfemiaslskrvryknrfpylmlryieekn llpfirfridlgclelasypkkmgeennyersvtdhamafgrltdfhned avlqqitkgitdevrfslyapryaiynnkigfvrtsgsdkis fptlkkkg geghcvaytlqntks fgfisiydlrkillls fIdkdkaknivsglleqce khwkdlsenlfdairtelqkefpvplirytlprskggklvsskladkqek yeseferrkeklteilsekdfdlsqiprrmidewlnvlptsrekklkgyv etlkldcrerlrvfekrekgehplpprigematdlakdiirmvidqgvkq ritsayyseiqrclaqyagddnrrhldsiirelrlkdtknghpfIgkvlr pglghteklyqryfeekkewleatfypaaspkrvprfvnpptgkqkelpl iirnlmkerpewrdwkqrknshpidlpsqlfeneicrllkdkigkepsgk Ikwnemfklywdkefpngmqrfyrckrrvevfdkvveyeyseeggnykky yealidevvrqkissskeksklqvedltlsvrrvfkrainekeyqlrllc eddrllfmavrdlydwkeaqldldkidnmlgepvsvsqviqleggqpdav ikaecklkdvsklmrycydgrvkglmpyfanheatqeqvemelrhyedhr rrvfnwvfaleksvlkneklrrfyeesqggcehrrcidalrkaslvseee yefIvhirnksahnqfpdleigklppnvtsgfceciwskykaiicriipf idperrffgklleqk
Alistipes sp. ZOR0009 (NZ_JTLD01000029.	msneigafrehqfayapgnekqeeatfatyfnlalsnvegmmfgevesnp dkieksldtlppailrqias fiwlskedhpdkaysteevkvivtdlvrrl cfyrnyfshcfyldtqyfysdelvdttaigeklpynfhhfitnrlfrysl

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 727/817

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D >WP_047447901.1

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Fl a vobacterium branchiophilum FL- 15 (NC_016001.1) >WP 014084666.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 728/817

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Prevotella sp. ΜΆ2016 (NZ_JHUW01000010 . 1) >WP_036929175.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 729/817

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Myroides odoratimimus CCUG 10230 (AGEC02000017.1) >EHO06562.1

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Myroides odoratimimus CCUG 3837 (AGZK01000016.1) >EKB06014.1

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Myroides	mkdilttdttekqnrfyshkiadkyffggyfnlasnniyevfeevnkrnt
odoratimimus CCUG	fgklakrdngnlknyiihvfkdelsisdfekrvaifasyfpiletvdkks
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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 733/817

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Myroides odoratimimus (NZ_CP013690.1) >WP_058700060.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 734/817

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Bergeyella zoohelcum ATCC 43767 (AGYA01000037.1) >EKB54193.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 735/817

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 737/817

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(NZ_JYGZ01000003. 1) >WP_045968377.1

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Psychroflexus torquis ATCC 700755 (NC_018721.1) >WP_015024765.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 738/817

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Fl a vobacterium columnare ATCC 49512 (NC_016510.2) >WP_014165541.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 739/817

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Fl a vobacterium columnare (NZ_CP013992.1) >WP_060381855.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 740/817

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Fl a vobacterium columnare (NZ_CP015107.1) >WP_063744070.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 741/817

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Fl a vobacterium columnare (NZ_CP016277.1) >WP_065213424.1

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Chryseobacteri um sp. YR4 7 7 (NZ_KN549099.1) >WP_047431796.1

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Riemerella anatipestifer ATCC 11845 = DSM 15868 (NC_014738.1) >WP_004919755.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 743/817

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Riemerella anatipestifer RACH-2 (NC_020125.1) >WP_015345620.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 744/817

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1) >WP_061710138.1

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Ríemerella anatipestifer (NZ_LUDI01000010 . 1) >WP_064970887.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 746/817

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Prevotella saccharolytica F0055 (ΆΜΕΡ01000091.1) >EKY00089.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 747/817

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Prevotella saccharolytica JCM 17484 (NZ_BAKN01000001. 1) >WP_051522484.1	medkpfwaaffnlarhnvyltvnhinklldleklydegkhkeiferedif nisddvmndansngkkrkldikkiwddldtdltrkyqlrelilkhfpfiq paiigaqtkerttidkdkrststsndslkqtgegdindllslsnvksmff rllqileqlrnyyshvkhsksatmpnfdedllnwmryifidsvnkvkedy ssnsvidpnts fshliykdeqgkikpcrypftskdgsinafgllffvslf lekqdsiwmqkkipgfkkasenymkmtnevfcrnhillpkirletvydkd wmlldmlnevvrcplslykrltpaaqnkfkvpekssdnanrqeddnpfsr ilvrhqnrfpyfvlrffdlnevfttlrfqinlgcyhfaickkqigdkkev hhlirtlygfsrlqnftqntrpeewntlvkttepssgndgktvqgvplpy isytiphyqienekigikifdgdtavdtdiwpsvstekqlnkpdkytltp gfkadvfIsvhellpmmfyyqlllcegmlktdagnavekvlidtrnaifn lydafvqekintitdlenylqdkpilighlpkqmidllkghqrdmlkave qkkamlikdterrlklldkqlkqetdvaakntgtllkngqiadwlvndmm rfqpvkrdkegnpincskansteyqmlqrafafyatdscrlsryftqlhl ihsdnshlfIsrfeydkqpnliafyaaylkaklefInelqpqnwasdnyf lllrapkndrqklaegwkngfnlprglftekiktwfnehktivdisdcdi fknrvgqvarlipvffdkkfkdhsqpfyrydfnvgnvskpteanylskgk reelfksyqnkfknnipaektkeyreyknfslwkkferelrliknqdili wlmcknlfdekikpkkdilepriavsyikldslqtntstagslnalakvv pmtlaihidspkpkgkagnnekenkeftvyikeegtkllkwgnfktllad rrikglfsyiehddidlkqhpltkrrvdleldlyqtcridifqqtlglea qlldkysdlntdnfyqmligwrkkegiprnikedtdfIkdvrnafshnqy pdskkiafrrirkfnpkelileeeeglgiatqmykevekvvnrikrielf d
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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 748/817

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ATCC 33574 (AEPD01000005.1) >EFU31981.1

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Prevotella buccae ATCC 33574 (NZ_GL586311.1) >WP_004343973.1

mqkqdklfvdrkknaifafpkyitimenkekpepiyyeltdkhfwaafIn larhnvyttinhinrrleiaelkddgymmgikgswneqakkldkkvrlrd limkhfpfleaaayemtnskspnnkeqrekeqsealslnnlknvlfifle klqvlrnyyshykyseespkpifetsllknmykvfdanvrlvkrdymhhe nidmqrdfthlnrkkqvgrtkniidspnfhyhfadkegnmtiagllffvs IfIdkkdaiwmqkklkgfkdgrnlreqmtnevfcrsrislpklklenvqt kdwmqldmlnelvrcpkslyerlrekdres fkvpfdifsddynaeeepfk

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 749/817

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Prevotella buccae D17 (NZ_GG739967.1) >WP_004343581.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 750/817

Ί Μ/ΊΊβ

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Prevotella sp. MSX73 (NZ_ALJQ01000043 . D >WP_007412163.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 751/817

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Prevotella pallens ATCC 700821 (AFPY01000052.1) >EGQ18444.1	mkeeekgktpvvstynkddkhfwaafInlarhnvyitvnhinkilgegei nrdgyentlekswneikdinkkdrlskliikhfpflevttyqrnsadttk qkeekqaeaqsleslkks ffvfiyklrdlrnhyshykhskslerpkfeed Iqekmynifdasiqlvkedykhntdikteedfkhldrkgqfkys fadneg nitesgllffvslflekkdaiwvqkklegfkcsnesyqkmtnevfcrsrm llpklrlqstqtqdwilldmlnelircpkslyerlreedrkkfrvpieia dedydaeqepfknalvrhqdrfpyfairyfdyneiftnlrfqidlgtyhf siykkqigdykeshhlthklygferiqeftkqnrpdewrkfvktfns fet skepyipettphyhlenqkigirfrndndkiwpslktnseknekskykld ks fqaeafIsvhellpmmfyylllktentdndneietkkkenkndkqekh kieeiienkiteiyalydafangkinsidkleeyckgkdieighlpkqmi ailksehkdmateakrkqeemladvqkslesldnqineeienverknssl ksgeiaswlvndmmrfqpvqkdnegnplnnskansteyqmlqrslalynk eekptryfrqvnliessnphpfInntewekcnnils fyrsyleakknfle slkpedweknqyfImlkepktncetlvqgwkngfnlprgiftepirkwfm ehrknitvaelkrvglvakviplffseeykdsvqpfynylfnvgninkpd eknfInceerrellrkkkdefkkmtdkekeenpsylefqswnkferelrl vrnqdivtwllcmelfnkkkikelnvekiylknintnttkkeknteekng eekiikeknnilnrimpmrlpikvygrenfsknkkkkirrntfftvyiee kgtkllkqgnfkalerdrrlgglfsfvkthskaesksntisksrveyelg eyqkarieiikdmlaleetlidkynsldtdnfhnmltgwlklkdepdkas fqndvdlliavrnafshnqypmrnriafaninpfslssantseekglgia nqlkdkthktiekiieiekpietke
Prevotella pallens	mkeeekgktpvvstynkddkhfwaafInlarhnvyitvnhinkilgegei

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 752/817

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ATCC 700821 (NZ_GL982513.1) >WP_006044833.1

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Prevotella intermedia ATCC 25611 = DSM 20706 (NZ_JAEZ01000017 . D >WP 036860899.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 753/817

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Prevotella intermedia (NZ_LBGT01000010. 1) >WP_061868553.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 754/817

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Prevotella intermedia 17 (CP003502.1) >AFJ07523.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 755/817

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Prevotella intermedia (NZ_AP014926.1) >WP_050955369.1	meddkktkestnmldnkhfwaafInlarhnvyitvnhinkvlelknkkdq diiidndqdilaikthwekvngdlnkterlrelmtkhfpfletaiytknk edkeevkqekqakaqs fdslkhclfIfleklqearnyyshykysestkep mlekellkkmynifddniqlvikdyqhnkdinpdedfkhldrteeefnyy fttnkkgnitasgllffvslflekkdaiwmqqklrgfkdnreskkkmthe vfcrsrmllpklrlestqtqdwilldmlnelircpkslyerlqgeyrkkf nvpfdsadedydaeqepfkntlvrhqdrfpyfairyfdyneiftnlrfqi dlgtyhfsiykkliggqkedrhlthklygferiqefakqnrtdewkaivk dfdtyetseepyisetaphyhlenqkigirfrndndeiwpslktngenne krkykldkqyqaeafIsvhellpmmfyylllkkeepnndkknasivegfi kreirdiyklydafangeinniddlekycedkgipkrhlpkqmvailyde hkdmaeeakrkqkemvkdtkkllatlekqtqgeiedggrnirllksgeia rwlvndmmrfqpvqkdnegnplnnskansteyqmlqrslalynkeekptr yfrqvnlinssnphpfIkwtkweecnnils fyrsyltkkiefInklkped weknqyfIklkepktnretlvqgwkngfnlprgiftepirewfkrhqnds eeyekvetldrvglvtkviplffkkedskdkeeylkkdaqkeinncvqpf ygfpynvgnihkpdekdfIpseerkklwgdkkykfkgykakvkskkltdk ekeeyrsylefqswnkferelrlvrnqdivtwllctelidklkveglnve elkklrlkdidtdtakqeknnilnrvmpmqlpvtvyeiddshnivkdrpl htvyieetktklIkqgnfkalvkdrrlnglfs fvdtssetelksnpisks Iveyelgeyqnarietikdmllleetliekyktlptdnfsdmlngwlegk deadkarfqndvkllvavrnafshnqypmrnriafaninpfslssadtse ekkldianqlkdkthkiikriieiekpietke
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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 756/817

Ί^/ΊΊβ

intermedia (AP014598.1) BAU18623.1

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Prevotella intermedia ZT (ATMK01000017.1) >KJJ86756.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 757/817

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Prevotella aurantiaca JCM 15754 (NZ_BAKF01000019. 1) >WP_025000926.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 758/817

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Prevotella pleuritidis F0068 (NZ_AWET01000045. 1) >WP_021584635.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 759/817

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Porphyromonas gulae (NZ_JRAT01000012. D >WP_039418912.1

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Porphyromonas sp. COT-052 OH4946 (NZ_JQZY01000014. D >WP_039428968.1

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Porphyromonas gulae (NZ_JRFD01000046. 1) >WP_039442171.1

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Porphyromonas gulae (NZ_JRAJ01000010 . 1) >WP_039431778.1

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Porphyromonas gulae	mteqserpyngtyytledkhfwaafInlarhnayitlthidrqlayskad itndqdvls fkalwknfdndlerksrlrslilkhfs flegaaygkklfes

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(NZ_JRAL01000022. 1) >WP_039434803.1

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Porphyromonas gulae (NZ_JRAI01000002. 1) >WP_039419792.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 766/817

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Porphyromonas gulae (NZ_JRAK01000129. 1) >WP_039426176.1

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Porphyromonas gulae (NZ_KN294104.1) >WP_039437199.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 769/817

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gingivalis ATCC 33277 (NC_010729.1) >WP_012458414.1

itndedilffkgqwknldndlerkarlrslilkhfs flegaaygkklfes qssgnksskkkeltkkekeelqanalsldnlksilfdfIqklkdfrnyys hyrhpesselplfdgnmlqrlynvfdvsvqrvkrdhehndkvdphrhfnh Ivrkgkkdrygnndnpffkhhfvdreekvteagllffvslflekrdaiwm qkkirgfkggtetyqqmtnevfcrsrislpklkleslrtddwmlldmlne Ivrcpkslydrlreedrarfrvpvdilsdeddtdgteedpfkntlvrhqd rfpyfalryfdlkkvftslrfhidlgtyhfaiykknigeqpedrhltrnl ygfgriqdfaeehrpeewkrlvrdldyfetgdkpyitqttphyhiekgki glrfvpegqhlwpspevgatrtgrskyaqdkrltaeafIsvhelmpmmfy yfllrekysdeasaervqgrikrviedvyavydafargeintrdeldacl adkgirrghlprqmigilsqehkdmeekvrkklqemivdtdhrldmldrq tdrkirigrknaglpksgviadwlvrdmmrfqpvakdtsgkplnnskans teyrmlqralalfggekerltpyfrqmnltggnnphpflhetrweshtni Is fyrsylkarkafIqsigrsdrvenhrflllkepktdrqtlvagwkgef hlprgifteavrdcliemgldevgsykevgfmakavplyferackdrvqp fydypfnvgnslkpkkgrfIskekraeewesgkerfrlaklkkeileake hpyldfkswqkferelrlvknqdiitwmicrdlmeenkvegldtgtlylk dirtdvqeqgnlnvlnrvkpmrlpvvvyradsrghvhkeqaplatvyiee rdtkllkqgnfks fvkdrrlnglfs fvdtgalameqypisklrveyelak yqtarvcafeqtleleeslltryphlpdknfrkmleswsdplldkwpdlh gnvrlliavrnafshnqypmydeavfssirkydpsspdaieermglniah rlseevkqakemaeriiqa

Porphyromonas gingivalis A7A1-28 (NZ_CP013131.1) >WP_058019250.1

mteqnekpyngtyytlkdkhfwaaffnlarhnayitlthidrqlayskad itndedilffkgqwknldndlerkarlrslilkhfs flegaaygkklfes qssgnksskkkeltkkekeelqanalsldnlksilfdfIqklkdfrnyys hyrhpesselpmfdgnmlqrlynvfdvsvqrvkrdhehndkvdphrhfnh Ivrkgkkdrcgnndnpffkhhfvdregkvteagllffvslflekrdaiwm qkkirgfkggtetyqqmtnevfcrsrislpklkleslrtddwmlldmlne Ivrcpkslydrlreedracfrvpvdilsdeddtdgaeedpfkntlvrhqd

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 770/817

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rfpyfalryfdlkkvftslrfhidlgtyhfaiykknigeqpedrhltrnl ygfgriqdfaeehrpeewkrlvrdldcfetgdkpyitqttphyhiekgki glrfvpegqhlwpspevgatrtgrskyaqdkrftaeafIsvhelmpmmfy yfllrekyseevsaervqgrikrviedvyavydafardeintrdeldacl adkgirrghlprqmiailsqkhkdmeekvrkklqemiadtdhrldmldrq tdrkirigrknaglpksgviadwlvrdmmrfqpvakdtsgkplnnskans teyrmlqralalfggekerltpyfrqmnltggnnphpflhetrweshtni Is fyrsylkarkafIqsigrsdrvenhrflllkepktdrqtlvagwkgef hlprgifteavrdcliemgldevgsykevgfmakavplyferackdrvqp fydypfnvgnslkpkkgrfIskekraeewesgkerfrdleawshsaarri edafagienasrenkkkieqllqdlslwetfesklkvkadkiniaklkke ileakehpyldfkswqkferelrlvknqdiitwmmcrdlmeenkvegldt gtlylkdirtdvqeqgslnvlnhvkpmrlpvvvyradsrghvhkeqapla tvyieerdtkllkqgnfks fvkdrrlnglfs fvdtgalameqypisklrv eyelakyqtarvcafeqtleleeslltryphlpdenfrkmleswsdplld kwpdlhrkvrlliavrnafshnqypmydeavfssirkydpsspdaieerm glniahrlseevkqakemaeriiqa

Porphyromonas gingivalis JCVI SC001 (APMB01000175.1) >EOA10535.1

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Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 771/817

Ί <0Α/ΊΊ <ò

tdrkirigrknaglpksgviadwlvrdmmrfqpvakdtsgkplnnskans teyrmlqralalfggekerltpyfrqmnltggnnphpflhetrweshtni Is fyrsylkarkafIqsigrsdrvenhrflllkepktdrqtlvagwkgef hlprgifteavrdcliemgldevgsykevgfmakavplyferackdrvqp fydypfnvgnslkpkkgrfIskekraeewesgkerfrdleawshsaarri edafagienasrenkkkieqllqdlslwetfesklkvkadkiniaklkke ileakehpyldfkswqkferelrlvknqdiitwmmcrdlmeenkvegldt gtlylkdirtdvheqgslnvlnrvkpmrlpvvvyradsrghvhkeqapla tvyieerdtkllkqgnfks fvkdrrlnglfs fvdtgalameqypisklrv eyelakyqtarvcafeqtleleeslltryphlpdknfrkmleswsdplld kwpdlhgnvrlliavrnafshnqypmydetlfssirkydpsspdaieerm glniahrlseevkqakemveriiqa

Porphyromonas gingivalis W50 (NZ_AJZS01000051. 1) >WP_005874195.1

mteqnekpyngtyytledkhfwaaffnlarhnayitlahidrqlayskad itndedilffkgqwknldndlerkarlrslilkhfs flegaaygkklfes qssgnksskkkeltkkekeelqanalsldnlksilfdfIqklkdfrnyys hyrhpesselplfdgnmlqrlynvfdvsvqrvkrdhehndkvdphrhfnh Ivrkgkkdkygnndnpffkhhfvdreekvteagllffvslflekrdaiwm qkkirgfkggteayqqmtnevfcrsrislpklkleslrtddwmlldmlne 1vrcpkslydrlreedrarfrvpvdilsdeddtdgteedpfkntlvrhqd rfpyfalryfdlkkvftslrfhidlgtyhfaiykknigeqpedrhltrnl ygfgriqdfaeehrpeewkrlvrdldyfetgdkpyitqttphyhiekgki glrfvpegqllwpspevgatrtgrskyaqdkrftaeafIsvhelmpmmfy yfllrekyseeasaekvqgrikrviedvyavydafardeintrdeldacl adkgirrghlprqmiailsqehkdmeekvrkklqemiadtdhrldmldrq tdrkirigrknaglpksgviadwlvrdmmrfqpvakdtsgkplnnskans teyrmlqralalfggekerltpyfrqmnltggnnphpflhetrweshtni Is fyrsylkarkafIqsigrsdreenhrflllkepktdrqtlvagwksef hlprgifteavrdcliemgydevgsykevgfmakavplyferackdrvqp fydypfnvgnslkpkkgrfIskekraeewesgkerfrdleawshsaarri

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 772/817

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edafvgieyaswenkkkieqllqdlslwetfesklkvkadkiniaklkke ileakehpyhdfkswqkferelrlvknqdiitwmmcrdlmeenkvegldt gtlylkdirtdvqeqgslnvlnhvkpmrlpvvvyradsrghvhkeeapla tvyieerdtkllkqgnfks fvkdrrlnglfs fvdtgalameqypisklrv eyelakyqtarvcafeqtleleeslltryphlpdes fremleswsdplld kwpdlqrevrlliavrnafshnqypmydetifssirkydpssldaieerm glniahrlseevklakemveriiqa

Porphyromonas gingivalis (NZ_CP011995.1) >WP_052912312.1

mteqnekpyngtyytledkhfwaaffnlarhnayitlahidrqlayskad itndedilffkgqwknldndlerkarlrslilkhfs flegaaygkklfes qssgnksskkkeltkkekeelqanalsldnlksilfdfIqklkdfrnyys hyrhpesselplfdgnmlqrlynvfdvsvqrvkrdhehndkvdphrhfnh Ivrkgkkdkygnndnpffkhhfvdreekvteagllffvslflekrdaiwm qkkirgfkggteayqqmtnevfcrsrislpklkleslrtddwmlldmlne Ivrcpkllydrlreedrarfrvpvdilsdeddtdgteedpfkntlvrhqd rfpyfalryfdlkkvftslrfhidlgtyhfaiykknigeqpedrhltrnl ygfgriqdfaeehrpeewkrlvrdldyfetgdkpyitqttphyhiekgki glrfvpegqllwpspevgatrtgrskyaqdkrftaeafIsvhelmpmmfy yfllrekyseeasaekvqgrikrviedvyavydafardeintrdeldacl adkgirrghlprqmiailsqehkdmeekvrkklqemiadtdhrldmldrq tdrkirigrknaglpksgviadwlvrdmmrfqpvakdtsgkplnnskans teyrmlqralalfggekerltpyfrqmnltggnnphpflhetrweshtni Is fyrsylkarkafIqsigrsdreenhrflllkepktdrqtlvagwksef hlprgifteavrdcliemgydevgsykevgfmakavplyferackdrvqp fydypfnvgnslkpkkgrfIskekraeewesgkerfrdleawshsaarri edafvgieyaswenkkkieqllqdlslwetfesklkvkadkiniaklkke ileakehpyhdfkswqkferelrlvknqdiitwmmcrdlmeenkvegldt gtlylkdirtdvqeqgslnvlnhvkpmrlpvvvyradsrghvhkeeapla tvyieerdtkllkqgnfks fvkdrrlnglfs fvdtgalameqypisklrv eyelakyqtarvcafeqtleleeslltryphlpdes fremleswsdplld

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 773/817

Ί66/ΊΊ6

	kwpdlqrevrlliavrnafshnqypmydetifssirkydpssldaieerm glniahrlseevklakemveriiqa
Porphyromonas gingivalis AJW4 (NZ_CP011996.1) >WP_053444417.1	mteqnekpyngtyytledkhfwaafInlarhnayitlahidrqlayskad itndedilffkgqwknldndlerkarlrslilkhfs flegaaygkklfes qssgnksskkkelskkekeelqanalsldnlksilfdflqklkdfrnyys hyrhpesselplfdgnmlqrlynvfdvsvqrvkrdhehndkvdphrhfnh Ivrkgkkdkygnndnpffkhhfvdregtvteagllffvslflekrdaiwm qkkirgfkggteayqqmtnevfcrsrislpklkleslrtddwmlldmlne Ivrcpkslydrlreedrarfrvpvdilsdeddtdgteedpfkntlvrhqd rfpyfalryfdlkkvftslrfhidlgtyhfaiykknigeqpedrhltrnl ygfgriqdfaeehrpeewkrlvrdldyfetgdkpyitqttphyhiekgki glrfvpegqhlwpspevgatrtgrskyaqdkrltaeafIsvhelmpmmfy yfllrekyseevsaekvqgrikrviedvyavydafardeintrdeldacl adkgirrghlprqmiailsqehkdmeekvrkklqemiadtdhrldmldrq tdrkirigrknaglpksgvvadwlvrdmmrfqpvakdtsgkplnnskans teyrmlqralalfggekerltpyfrqmnltggnnphpflhetrweshtni Is fyrsylearkafIqsigrsdrvenhrflllkepktdrqtlvagwkgef hlprgifteavrdcliemgydevgsykevgfmakavplyferaskdrvqp fydypfnvgnslkpkkgrfIskekraeewesgkerfrlaklkkeileake hpyhdfkswqkferelrlvknqdiitwmmcrdlmeenkvegldtgtlylk dirtdvqeqgslnvlnrvkpmrlpvvvyradsrghvhkeqaplatvyiee rdtkllkqgnfks fvkdrrlnglfs fvdtgalameqypisklrveyelak yqtarvcafeqtleleeslltryphlpdknfrkmleswsdplldkwpdlh gnvrlliavrnafshnqypmydetifssirkydpsspdaieermglniah rlseevkqakemveriiqa
Porphyromonas gingivalis (NZ_CP007756.1)	mteqnerpyngtyytledkhfwaaffnlarhnayitlahidrqlayskad itndedilffkgqwknldndlerkarlrslilkhfs flegaaygkklfes qssgnksskkkeltkkekeelqanalsldnlksilfdfIqklkdfrnyys

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 774/817

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>WP_039417390.1

hyrhpesselplfdgnmlqrlynvfdvsvqrvkrdhehndkvdphrhfnh Ivrkgkkdrygnndnpffkhhfvdregtvteagllffvslflekrdaiwm qkkirgfkggteayqqmtnevfcrsrislpklkleslrtddwmlldmlne Ivrcpkslydrlreedrarfrvpidilsdeddtdgteedpfkntlvrhqd rfpyfalryfdlkkvftslrfhidlgtyhfaiykknigeqpedrhltrnl ygfgriqdfaeehrpeewkrlvrdldyfetgdkpyitqttphyhiekgki glrfvpegqhlwpspevgatrtgrskyaqdkrltaeafIsvhelmpmmfy yfllrekyseevsaekvqgrikrviedvyavydafargeidtldrldacl adkgirrghlprqmiailsqehkdmeekvrkklqemiadtdhrldmldrq tdrkirigrknaglpksgviadwlvrdmmrfqpvakdtsgkplnnskans teyrmlqralalfggekerltpyfrqmnltggnnphpflhetrweshtni Is fyrsylkarkafIqsigrsdreenhrflllkepktdrqtlvagwksef hlprgifteavrdcliemgydevgsykevgfmakavplyferackdrvqp fydypfnvgnslkpkkgrfIskekraeewesgkerfrlaklkkeileake hpyldfkswqkferelrlvknqdiitwmmcrdlmeenkvegldtgtlylk dirtdvheqgslnvlnrvkpmrlpvvvyradsrghvhkeqaplatvyiee rdtkllkqgnfks fvkdrrlnglfs fvdtgalameqypisklrveyelak yqtarvcafeqtleleeslltryphlpdknfrkmleswsdplldkwpdlh rkvrlliavrnafshnqypmydeavfssirkydpsspdaieermglniah rlseevkqakemaeriiqv

Porphyromonas gingivalis (NZ_LOEL01000001. 1) >WP_061156470.1

mteqnerpyngtyytledkhfwaaffnlarhnayitlthidrqlayskad itndedilffkgqwknldndlerkarlrslilkhfs flegaaygkklfen kssgnksskkkeltkkekeelqanalsldnlksilfdfIqklkdfrnyys hyrhpesselplfdgnmlqrlynvfdvsvqrvkrdhehndkvdphrhfnh Ivrkgkkdrcgnndnpffkhhfvdregkvteagllffvslflekrdaiwm qkkirgfkggteayqqmtnevfcrsrislpklkleslrtddwmlldmlne Ivrcpkslydrlreedrarfrvpvdilsdeddtdgteedpfkntlvrhqd rfpyfalryfdlkkvftslrfhidlgtyhfaiykknigeqpedrhltrnl ygfgriqdfaeehrpeewkrlvrdldyfetgdkpyitqttphyhiekgki

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glrfvpegqhlwpspevgatrtgrskyaqdkrltaeafisvhelmpmmfy yfllrekyseevsaekvqgrikrviedvyavydafargeidtldrldacl adkgirrghlprqmiailsqehkdmeekvrkklqemiadtdhrldmldrq tdrkirigrknaglpksgviadwlvrdmmrfqpvakdtsgkplnnskans teyrmlqralalfggekerltpyfrqmnltggnnphpflhetrweshtni Is fyrsylkarkafIqsigrsdreenhrflllkepktdrqtlvagwksef hlprgifteavrdcliemgydevgsykevgfmakavplyferackdrvqp fydypfnvgnslkpkkgrfIskekraeewesgkerfrlaklkkeileake hpyldfkswqkferelrlvknqdiitwmmcrdlmeenkvegldtgtlylk dirtevqeqgslnvlnrvkpmrlpvvvyradsrghvhkeqaplatvyiee rdtkllkqgnfks fvkdrrlnglfs fvdtgglameqypisklrveyelak yqtarvcafeqtleleeslltrcphlpdknfrkmleswsdplldkwpdlq revwlliavrnafshnqypmydeavfssirkydpsspdaieermglniah rlseevkqakemaeriiqa

Tabela 14

Bacteroidetes	menqtqkgkgiyyyytknedkhyfgsfinlannnieqiieefrirlslkde
bacterium	knikeiinn
GWA2_31_9	yftdkksytdwerginilkeylpvidyldlaitdkefekidlkqketakrk
(proteína	yfrtnfsll
hipotética	idtiidlrnfythyfhkpisinpdvakfidknllnvcldikkqkmktdktk
A2033_10205)	qalkdgldk
>OFX18020	elkklielkkaelkekkiktwnitenvegavyndafnhmvyknnagvtilk
	dyhksilpd
	dkidselklnfsisglvfllsmfiskkeieqfksnlegfkgkvigengeye
	iskfnnslk
	ymathwifsyltfkglkqrvkntfdketllmqmidelnkvphevyqtlske
	qqnefledi

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neyvqdneenkksmensivvhpvirkryddkfnyfairfidefanfptlkf fvtagnfvh dkrekqiqgsmltsdrmikekinvfgklteiakyksdyfsnentletsewe Ifpnpsyll iqnnipvhidlihnteeakqcqiaidrikcttnpakkrntrkskeeiikii yqknkniky gdptallssnelpaliyellvnkksgkeleniivekivnqyktiagfekgq nlsnslitk klkksepnedkinaekiilainreleitenklniiknnraefrtgakrkhi fyskelgqe atwiaydlkrfmpeasrkewkgfhhselqkflafydrnkndakallnmfwn fdndqlign dinsafrefhfdkfyekylikrdeilegfksfisnfkdepkllkkgikdiy rvfdkryyi ikstnaqkeqllskpiclprgifdnkptyiegvkvesnsalfadwyqytys dkhefqs fy dmprdykeqfekfelnniksiqnkknlnksdkfiyfrykqdlkikqiksqd Ifiklmvde Ifnvvfknnielnlkklyqtsderfknqliadvqknrekgdtsdnkmnenf iwnmtipls Icngqieepkvklkdigkfrkletddkviqlleydkskvwkkleiedelen mpnsyerir rekllkgiqefehfllekekfdginhpkhfeqdlnpnfktyvingvlrkns klnyteidk lldlehisikdietsakeihlayflihvrnkfghnqlpkleafelmkkyyk knneetyae yfhkvssqivnefknslekhs

Chryseobacteri um jejuense (proteína

mektqtglgiyydhtklqdkyffggffnlaqnnidnvikafiikffperkd kdiniaqf1

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 777/817

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hipotética	dicfkdndadsdfqkknkfIrihfpvigfItsdndkagfkkkfalllktis
SAMN05421542_0666	elrnfythy
)	yhksiefpselfellddifvkttseikklkkkddktqqllnknlseeydir
>SDI27289.1	yqqqierlk elkaqgkrvsltdetairngvfnaafnhliyrdgenvkpsrlyqssysepd paengisls qnsilfllsmflerketedlksrvkgfkakiikqgeeqisglkfmathwvf sylcfkgik qklstefheetlliqiidelskvpdevysafdsktkekfledineymkegn adlsledsk vihpvirkryenkfnyfairfIdeylsstslkfqvhvgnyvhdrrvkhing tgfqteriv kdrikvfgrlsnisnlkadyikeqlelpndsngweifpnpsyifidnnvpi hvladeatk kgielfkdkrrkeqpeelqkrkgkiskynivsmiykeakgkdklridepla llslneipa llyqilekgatpkdieliiknklterfekiknydpetpapasqiskrlrnn ttakgqeal naeklslliereientetklssieekrlkakkeqrrntpqrsifsnsdlgr iaawladdi krfmpaeqrknwkgyqhsqlqqslayfekrpqeaflllkegwdtsdgssyw nnwvmns f1 ennhfekfyknylmkrvkyfselagnikqhthntkfIrkfikqqmpadlfp krhyilkdl eteknkvlskplvfsrglfdnnptfikgvkvtenpelfaewysygyktehv fqhfygwer dynelldselqkgns faknsiyynresqldliklkqdlkikkikiqdlfIk riaeklfen vfnypttlsldefyltqeeraekerialaqslreegdnspniikddfiwsk

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ΊΊ1/ΊΊ6

	tiafrskqi yepaiklkdigkfnrfvlddeeskaskllsydknkiwnkeqlerelsigen syevirrek Ifkeiqnlelqilsnwswdginhprefemedqkntrhpnfkmylvngilrk ninlykede dfwleslkendfktlpsevletksemvqllfIvilirnqfahnqlpeiqfy nfirknype iqnntvaelylnliklavqklkdns
Chryseobacteri um	mntrvtgmgvsydhtkkedkhffggflnlaqdnitavikafcikfdknpms
carnipullorum	svqfaescf
(proteína	tdkdsdtdfqnkvryvrthlpvigylnyggdrntfrqklstllkavdslrn
hipotética	fythyyhsp
SAMN05444360_1136	lalstelfelldtvfasvavevkqhkmkddktrqllskslaeeldirykqq
6)	lerlkelke
>SHM52812.1	qgknidlrdeagirngvlnaafnhliykegeiakptlsyss fyygadsaen gitisqsgl IfllsmfIgkkeiedlksrirgfkakivrdgeenisglkfmathwifsyls fkgmkqrls tdfheetlliqiidelskvpdevyhdfdtatrekfvedineyiregnedfs Igdstiihp virkryenkfnyfavrfIdefikfpslrfqvhlgnfvhdrrikdihgtgfq tervvkdri kvfgklseisslkteyiekeldldsdtgweifpnpsyvfidnnipiyistn ktfkngsse fiklrrkekpeemkmrgedkkekrdiasmignagslnsktplamlslnemp allyeilvk kttpeeieliikekldshfeniknydpekplpasqiskrlrnnttdkgkkv inpeklihl inkeidateakfallaknrkelkekfrgkplrqtifsnmelgreatwladd

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	ikrfmpdil rknwkgyqhnqlqqslaffnsrpkeaftilqdgwdfadgss fwngwiinsf vknrs feyf yeayfegrkeyfsslaenikqhtsnhrnlrrfidqqmpkglfenrhyllen leteknkil skplvfprglfdtkptfikgikvdeqpelfaewyqygystehvfqnfygwe rdyndlles elekdndfsknsihysrtsqleliklkqdlkikkikiqdlfikliaghife nifkypasf sldelyltqeerlnkeqealiqsqrkegdhsdniikdnfigsktvtyeskq isepnvklk digkfnrfllddkvktllsynedkvwnkndldlelsigensyevirreklf kkiqnfelq tltdwpwngtdhpeefgttdnkgvnhpnfkmyvvngilrkhtdwfkegedn wlenlneth fknls fqeletksksiqtafliimirnqfahnqlpavqffefiqkkypeiq gsttselyl nfinlavvellellek
Chryseobacteri um	metqilgngisydhtktedkhffggflntaqnnidllikayiskfessprk
ureilyticum	insvqfpdv
(proteína	cfkkndsdadfqhklqfirkhlpviqylkyggnrevlkekfrlllqavdsl
hipotética	rnfythfyh
SAMN05421786_1011	kpiqlpnelltlldtifgeignevrqnkmkddktrhllkknlseeldfryq
119)	eqlerlrkl
>31370481.1	ksegkkvdlrdteairngvlnaafnhlifkdaedfkptvsyssyyydsdta engisisqs gllfllsmfigrremedlksrvrgfkariikheeqhvsglkfmathwvfse fcfkgiktr inadyheetlliqlidelskvpdelyrs fdvatrerfiedineyirdgked

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773/776

kslieskiv hpvirkryeskfnyfairfIdefvnfptlrfqvhagnyvhdrriksiegtg fkterlvkd rikvfgklstisslkaeylakavnitddtgwellphpsyvfidnnipihlt vdps fkngv keyqekrklqkpeemknrqggdkmhkpaisskigkskdinpespvallsmn eipallyei Ivkkaspeeveakirqkltavferirdydpkvplpasqvskrlrnntdtls ynkeklvel ankeveqterklalitknrrecrekvkgkfkrqkvfknaelgteatwland ikrfmpeeq kknwkgyqhsqlqqslaffesrpgearsllqagwdfsdgss fwngwvmnsf ardntfdgf yesylngrmkyfIrladniaqqsstnklisnfikqqmpkglfdrrlymled lateknkil skplifprgifddkptfkkgvqvseepeafadwysygydvkhkfqefyawd rdyeellre elekdtaftknsihysresqiellakkqdlkvkkvriqdlylklmaefIfe nvfghelal pldqfyltqeerlkqeqeaivqsqrpkgddspnivkenfiwsktipfksgr vfepnvklk digkfrnlltdekvdillsynnteigkqvieneliigagsyefirreqlfk eiqqmkrls Irsvrgmgvpirlnlk

Sinomicrobium ocean! >WP_072319476.1

mestttlglhlkyqhdlfedkhyfgggvnlavqniesifqafaerygiqnp Irkngvpai nnifhdnisisnykeylkfIkqylpvvgfleksneinifefredfeilina iyklrhfyt hyyhspikledrfytclnelfvavaiqvkkhkmksdktrqllnknlhqllq

Petição 870200005376, de 13/01/2020, pág. 781/817

ΊΊ^/ΊΊβ

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[869] Ainda que as modalidades preferenciais da presente invenção tenham sido mostradas e descritas aqui, será óbvio para os versados na técnica que essas modalidades são apresentadas apenas a titulo de exemplo. Numerosas variações, alterações e substituições ocorrerão agora para os versados na técnica, sem desviar-se da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas às modalidades da invenção descritas no presente documento podem ser empregadas na prática da invenção. Entende-se que as reivindicações a seguir definem o escopo da invenção e que os métodos e as estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes podem ser convertidos assim.

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de modificação de um locus-alvo de interesse em uma célula eucarionte, de preferência, em uma célula de mamífero, o método caracterizado pelo fato de que compreende liberar para o referido locus uma composição de ocorrência natural ou geneticamente modificada que compreende uma proteína efetora CaslSb opcionalmente fundida a um ou mais sinais de localização, e um ou mais componentes de ácido nucleico, em que pelo menos o um ou mais componentes de ácido nucleico é geneticamente modificado, o um ou mais componentes de ácido nucleico direciona o complexo para o alvo de interesse e a proteína efetora forma um complexo com o um ou mais componentes de ácido nucleico e o complexo se liga ao locus-alvo de interesse.
2. 2. Composição de ocorrência natural ou geneticamente modificada caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína efetora CaslSb opcionalmente fundida a um ou mais sinais de localização, e um ou mais componentes de ácido nucleico, em que pelo menos o um ou mais componentes de ácido nucleico é geneticamente modificado para uso na modificação de um locus-alvo de interesse em uma célula eucarionte, o um ou mais componentes de ácido nucleico direciona o complexo para o alvo de interesse e a proteína efetora forma um complexo com o um ou mais componentes de ácido nucleico e o complexo se liga ao locus-alvo de interesse.

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   2/15

   3. Uso de uma composição de ocorrência natural ou

   geneticamente modificada caracterizado pelo fato de que compreende uma proteína efetora Casl3b opcionalmente fundida a um ou mais sinais de localização, e um ou mais componentes de ácido nucleico, em que pelo menos o um ou mais componentes de ácido nucleico é geneticamente modificado para a

   modificação de um locus-alvo de interesse em uma célula

   eucarionte, o um ou mais componentes de ácido nucleico direciona o complexo para o alvo de interesse e a proteína efetora forma um complexo com o um ou mais componentes de

   ácido nucleico e o complexo se liga ao locus-alvo de

   interesse.

   4 . Método, composição ou uso, de acordo com qualquer

   uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo

   fato de que a proteína efetora Casl3b é pelo menos 80%

   homóloga ou idêntica a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem de um organismo procarionte selecionado do grupo que consiste em Porphyromonas, Prevotella, Bacteroides, Riemerella, Bergeyella_r Alistipes, Myroides, Capnocytophaga e Flavobacterium.

   5. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer

   uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo

   fato de que a proteína efetora Casl3b é pelo menos 80%

   homóloga ou idêntica a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem de um organismo procarionte selecionado do grupo

   Petição 870190102075, de 10/10/2019, pág. 67/83
3. 3/15 que consiste em Porphyromonas gulae, Prevotella sp. , Porphyromonas gíngívalís, Bacteroídes pyogenes, Riemerella anatipestifer, Bergeyella zoohelcum, Prevotella intermedia, Prevotella buccae, Alistipes sp. _r Prevotella aurantiaca, Myroides odoratimimus, Capnocytophaga canimorsus, Flavobacteríum branch!ophilum e Fiavobacteríum columnare.

   6. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a proteína efetora CaslSb é pelo menos 80% homóloga ou idêntica a uma proteína efetora CaslSb do tipo selvagem selecionada do grupo que consiste em Porphyromonas gulae CaslSb (número de acesso WP_039434803) , Prevotella sp. P5-125 CaslSb (número de acesso WP_044065294), Porphyromonas gíngívalís CaslSb (número de acesso WP_053444417), Porphyromonas sp. COT-052 OH4946 CaslSb (número de acesso WP_039428968) , Bacteroídes pyogenes CaslSb (número de acesso WP_034542281), Riemerella anatipestifer CaslSb (número de acesso WP_004919755), Bergeyella zoohelcum CaslSb (número de acesso WP_0 026 64 492) , Prevotella intermedia CaslSb (número de acesso WP_036860899), Prevotella buccae CaslSb (número de acesso WP_004343973), Porphyromonas gíngívalís CaslSb (número de acesso WP_012458151), Alistipes sp. ZOR0009 CaslSb (número de acesso WP_047447901), Prevotella sp. ΜΆ2016 CaslSb (número de acesso WP_036929175), Prevotella aurantiaca CaslSb (número de acesso WP_025000926), Myroides

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4. 4/15 odoratimimus CCUG 10230 Casl3b (número de acesso EHO06562), Prevotella intermedia Casl3b (número de acesso WP_061868553), Capnocytophaga canimorsus Casl3b (número de acesso WP_013997271) , Flavobacterium branchiophilum Casl3b (número de acesso WP_014084666) , Myroides odoratimimus Casl3b (número de acesso WP_058700060), Flavobacterium columnare Casl3b (número de acesso WP_065213424) , e Prevotella intermedia Casl3b (número de acesso WP_050955369).

   7. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a proteína efetora Casl3b é pelo menos 80% homóloga a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem selecionada do grupo que consiste em Porphyromonas gulae Casl3b (número de acesso WP_039434803), Prevotella sp. P5125 Casl3b (número de acesso WP_044065294), Porphyromonas gingivalis Casl3b (número de acesso WP_053444417), Porphyromonas sp. COT-052 OH4946 Casl3b (número de acesso WP_039428968), Bacteroides pyogenes Casl3b (número de acesso WP_034542281), e Riemerella anatipestifer Casl3b (número de acesso WP 004919755).

   8. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a proteína efetora Casl3b é pelo menos 80% homóloga a uma proteína efetora Casl3b do tipo selvagem

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5. 5/15 selecionado do grupo que consiste em Porphyromonas gulae Casl3b (número de acesso WP_039434803) e Prevotella sp. P5125 Casl3b (número de acesso WP_044065294).

   9. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a proteína efetora Casl3b é uma proteína que compreende uma sequência que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com uma ou mais das sequências que consiste em DKHXFGAFLNLARHN (SEQ ID NO:1), GLLFFVSLFLDK (SEQ ID NO:2), SKIXGFK (SEQ ID NO:3), DMLNELXRCP (SEQ ID NO:4), RXZDRFPYFALRYXD (SEQ ID NO: 5) e LRFQVBLGXY (SEQ ID NO:6).

   10. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que o locus-alvo de interesse compreende RNA.

   11. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a proteína efetora Casl3b é fundida a pelo menos um sinal de localização, e em que o referido sinal de localização é um sinal de localização nuclear (NLS) ou um sinal de exportação nuclear (NES), de preferência, um NES.

   12. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a modificação do locus-alvo de interesse compreende uma ruptura de filamento.

   13. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer

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6. 6/15 uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a proteína efetora CaslSb é otimizada por códon para a expressão em uma célula de mamífero.

   14. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a proteína efetora CaslSb é associada a um ou mais domínios funcionais; e opcionalmente, a proteína efetora contém uma ou mais mutações opcionalmente em um Domínio de HEPN, tal como R116A, H121A, R1177A, H1182A (em que as posições de aminoácido correspondem às posições de aminoácido da proteína CaslSb que se origina a partir de Bergeyella zoohelcum ATCC 43767), em que o complexo pode liberar um modificador epigenético ou um sinal de ativação ou repressão transcricional ou traducional.

   15. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que o domínio funcional modifica a transcrição ou tradução do locus-alvo.

   16. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que o locus-alvo de interesse é compreendido em uma molécula de ácido nucleico dentro de uma célula.

   17. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a referida modificação é in vivo ou ex vivo.

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7. 7/15

   18. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que quando em complexo com a proteína efetora o componente (ou componentes) de ácido nucleico é capaz de efetuar a ligação específica a sequência do complexo a uma sequência-alvo do locus-alvo de interesse.

   19. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que o componente (ou componentes) de ácido nucleico compreende uma sequência de repetição direta dupla.

   20. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a proteína efetora e componente (ou componentes) de ácido nucleico é fornecido via uma ou mais moléculas de polinucleotídeo que codificam os polipeptídeos e/ou o componente (ou componentes) de ácido nucleico, e em que a uma ou mais moléculas de polinucleotídeo são operativamente configuradas para expressar os polipeptídeos e/ou o componente (ou componentes) de ácido nucleico.

   21. Método, composição ou uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado (a) pelo fato de que a uma ou mais moléculas de polinucleotídeo compreendem um ou mais elementos reguladores operativamente configurados para expressar os polipeptídeos e/ou o componente (ou componentes) de ácido nucleico, opcionalmente em que o um ou

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8. 8/15 mais elementos reguladores compreendem um promotor (ou promotores) ou promotor (ou promotores) induzíveis.

   22. Método, composição ou uso, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado(a) pelo fato de que a um ou mais moléculas de polinucleotídeo são compreendidas dentro de um ou mais vetores.

   23. Método, composição ou uso, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado(a) pelo fato de que a uma ou mais moléculas de polinucleotídeo são compreendidas dentro de um vetor.

   24. Método, composição ou uso, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado(a) pelo fato de que o um ou mais vetores compreendem vetores virais.

   25. Método, composição ou uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado(a) pelo fato de que o um ou mais vetores virais compreendem um ou mais vetores retrovirais, lentivirais, adenovirais, vetores virais adeno associados ou simples da herpes.

   26. Método, composição ou uso, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado(a) pelo fato de que a uma ou mais moléculas de polinucleotídeo são compreendidas em um sistema de distribuição, ou o método, composição ou uso, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, em que o um ou mais vetores são compreendidos em um sistema de distribuição, ou o método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma

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9. 9/15 das reivindicações anteriores, em que o complexo montado é compreendido em um sistema de distribuição.

   27. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a composição de ocorrência natural ou geneticamente modificada é liberada via um veículo de distribuição que compreende lipossoma (ou lipossomas), partícula (ou partículas), exossoma (ou exossomas), microvesícuia (ou microvesícuias), uma pistola de gene ou um ou mais vetores virais.

   28. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a composição compreende uma proteína acessório que intensifica a atividade da proteína efetora CaslSb, de preferência, uma proteína csx28.

   29. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a composição compreende uma proteína acessório que reprime a atividade da proteína efetora CaslSb, de preferência, uma proteína csx27.

   30. Método, composição ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado(a) pelo fato de que a proteína efetora CaslSb é ligada a pelo menos um domínio funcional; em que a proteína efetora CaslSb compreende uma ou mais mutações no Domínio de HEPN; e em que

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10. 10/15 a proteína efetora CaslSb é truncada em seu terminal C, sendo que o referido trauncamento é opcionalmente selecionado dentre Δ1053-1090, Δ1026-1090, Δ984-1090, Δ934-1090, Δ8841090, Δ834-1090, Δ784-1090, e Δ734-1090 que correspondem às posições de aminoácido da proteína P5-125 CaslSb de Prevotella sp.

    31. Célula de mamífero modificada de acordo com o método, ou geneticamente modificado caracterizada pelo fato de que compreende ou expressa, de modo opcionalmente induzível ou constituinte, a composição ou um componente da mesma conforme definida nas reivindicações anteriores ou subsequentes.

    32. Célula de mamífero, de acordo com a reivindicação

    31, caracterizada pelo fato de que a modificação resulta em:

    a célula que compreende transcrição ou tradução alterada de pelo menos um produto de RNA;

    - a célula que compreende a transcrição ou tradução alterada de pelo menos um produto de RNA, em que a expressão do pelo menos um produto é aumentada; ou

    - a célula que compreende a transcrição ou tradução alterada de pelo menos um produto de RNA, em que a expressão do pelo menos um produto é diminuída.

    33. Composição de ocorrência natural ou geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizada pelo fato de que é para uso in vivo ou

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11. 11/15 ex vivo em uma célula eucarionte, de preferência, em uma célula de mamífero:

    - interferência específica a sequência de RNA,

    - regulação de gene especifica a sequência de RNA,

    - triagem de RNA ou produtos de RNA ou lincRNA ou RNA não codificante, ou RNA nuclear ou mRNA,

    - mutagênese,

    - Fluorescência de hibridização in situ,

    - melhoramento,

    - introdução in vitro ou in vivo de dormência celular,

    - introdução in vitro ou in vivo de parada de ciclo celular,

    - redução in vitro ou in vivo de crescimento celular e/ou proliferação celular,

    - introdução in vitro ou in vivo de anergia celular, - introdução in vitro ou in vivo de apoptose celular, - introdução in vitro ou in vivo de necrose celular, - introdução in vitro ou in vivo de morte ce lular, ou

    introdução in vitro ou in vivo de morte celular programada .

    34. Linhagem celular caracterizada pelo fato de que é de ou compreende a célula conforme definida nas reivindicações 31 ou 32, ou progênie da mesma.

    35. Organismo eucarionte, de preferência, um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais células

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12. 12/15 conforme definida na reivindicação 31 ou 32.

    36. Modelo eucarionte, de preferência, um modelo de mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais células conforme definida na reivindicação 31 ou 32; sendo que a referida célula (ou células) expressa de modo opcionalmente induzível ou constituinte a composição ou um componente da mesma conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores.

    37. Produto caracterizado pelo fato de que é da célula conforme definida na reivindicação 31 ou 32, ou da linhagem celular ou o organismo conforme definido(a) na reivindicação 34 ou 35, ou do modelo de mamífero conforme definido na reivindicação 36; sendo que a referida célula ou célula (células) da linhagem celular ou mamífero do modelo de mamífero expressa de modo opcionalmente induzível ou constituinte a composição ou um componente da mesma conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores.

    38. Ensaio, método de triagem ou método de mutagênese caracterizado pelo fato de que compreende um método, composição ou uso cpnforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30.

    39. Ensaio baseado em RNA, método de triagem ou método de mutagênese, caracterizado pelo fato de que o aprimoramento compreende, ao invés de usar RNA, o método compreende usar a composição de ocorrência natural ou geneticamente

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13. 13/15 modificada, conforme reivindicado ou conforme referido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, em que, opcionalmente, o ensaio baseado em RNA, método de triagem ou método de mutagênese é um método de RNAi ou Fluorescência de hibridização in sítu.

    40. Método para modular a tradução de um locus-alvo de interesse eucarionte, o método caracterizado pelo fato de que compreende liberar ao referido locus uma composição de ocorrência natural ou geneticamente modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, e em que a proteína efetora Casl3b é fundida a um modulador de tradução (heterólogo) tal como um ativador de tradução ou um repressor de tradução e, opcionalmente, a um ou mais sinais de localização; em que pelo menos o um ou mais componentes de ácido nucleico é geneticamente modificado, o um ou mais componentes de ácido nucleico direciona o complexo para o alvo de interesse e a proteína efetora forma um complexo com o um ou mais componentes de ácido nucleico e o complexo se liga ao locus-alvo de interesse, de preferência, em que o referido domínio heterólogo é EIF4, tal como EIF4E.

    41. Método de detecção de um RNA-alvo em uma amostra caracterizado pelo fato de que compreende:

    (a) incubar a amostra com uma composição de ocorrência natural ou geneticamente modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, e um repórter

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14. 14/15 induzível por divagem baseado em RNA capaz de ser não específica ou detectavelmente clivado pela proteína efetora, (b) detectar o referido RNA-alvo com base no sinal gerado pela divagem do referido repórter induzível por divagem baseado em RNA.

    42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o construto de repórter induzível por divagem baseado em RNA compreende um fluorocromo e um arrefecedor brusco.

    43. Método, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, em caracterizado pelo fato de que o RNA-alvo compreende um RNA de patógeno.

    44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o patógeno compreende um vírus, bactérias, fungos ou parasita.

    45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 44, caracterizado pelo fato de que compreende um RNA-guia projetado para detectar um polimorfismo de único nucleotídeo em um RNA-alvo ou uma variante de splice de uma transcrição de RNA.

    46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 45, caracterizado pelo fato de que o RNA-guia compreende um ou mais nucleotídeos incompatíveis com o RNA· -alvo. 47 . Método, de acordo com qualquer uma das

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15. 15/15 reivindicações 41 a 46, caracterizado pelo fato de que o RNA-guia se liga a uma molécula-alvo gue é diagnostica para um estado da doença.

    48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o estado da doença compreende

    cancer.

    49. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o estado da doença compreende

    uma doença autoimune.

    50. Sistema de detecção de ácido ribonucleico (RNA) caracterizado pelo fato de que compreende:

    a) uma composição de ocorrência natural ou geneticamente modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, e

    c) um repórter induzível por divagem baseado em RNA capaz de ser clivado não específica e detectavelmente pela proteína efetora.