WO2007049731A1 - 新規細胞膜透過ペプチド - Google Patents

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WO2007049731A1
WO2007049731A1 PCT/JP2006/321465 JP2006321465W WO2007049731A1 WO 2007049731 A1 WO2007049731 A1 WO 2007049731A1 JP 2006321465 W JP2006321465 W JP 2006321465W WO 2007049731 A1 WO2007049731 A1 WO 2007049731A1
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WO
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peptide
ksh1
cells
amino acid
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/321465
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shusei Uno
Kaeko Kamide
Hiroshi Nakakubo
Original Assignee
Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation
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Filing date
Publication date
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Priority to US12/091,807 priority patent/US8044019B2/en
Priority to JP2007542671A priority patent/JP5043672B2/ja
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Priority to US13/242,463 priority patent/US8691528B2/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Definitions

  • the present invention relates to a novel cell membrane permeation peptide and a pharmaceutical containing the peptide.
  • ⁇ peptides that transport proteins and nucleic acids into cells and nuclei in vivo
  • Non-Patent Document 1 to Non-Patent Document 3
  • PTD Protein Transduction Peptide
  • Patent Document 1 a specific partial polypeptide of HIV-1 TAT protein
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 10-33186
  • Non-patent literature l Green, M. et al. Cell 55, 1179-1188 (1988)
  • Non-Patent Document 2 Frankel, A.D. et al. Cell 55, 1189-1193 (1988)
  • Non-patent literature 3 Fawell, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 664-668 (1994)
  • Non-patent literature 4 Nagahra, H. et al. Nature Medicine 4, 1449-1452 (1998)
  • An object of the present invention is to provide a novel cell membrane-penetrating peptide and a medicament containing the peptide. It is to provide.
  • the present invention is as follows.
  • B is arginine or lysine
  • at least one of O 1 or 0 2 is arginine
  • Z is a hydrophobic amino acid
  • J is serine or Aranin
  • X is any amino acid.
  • a transformant comprising the recombinant vector according to (6) above.
  • the physiologically active substance is a physiologically active protein, a physiologically active polypeptide, a drug-encapsulated ribosome, a polyethylene glycol ⁇ drug-encapsulated ribosome, a low molecular compound, a nucleic acid, a magnetic bead, a nanogauge particle, or a phage
  • the peptide-binding substance according to (8) is a physiologically active protein, a physiologically active polypeptide, a drug-encapsulated ribosome, a polyethylene glycol ⁇ drug-encapsulated ribosome, a low molecular compound, a nucleic acid, a magnetic bead, a nanogauge particle, or a phage
  • the peptide-binding substance according to (8) above, wherein the protein having physiological activity is a protein of about lOKDa to about 120 KDa or 4 to 30 polypeptides.
  • a medicament comprising the peptide-binding substance according to (8) above.
  • a cell membrane-penetrating peptide that transports proteins into cells and / or nuclei at a higher frequency and a pharmaceutical containing the peptide are provided. it can.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of an intracellular translocation test of fluorescently labeled peptides.
  • the top row shows FITC fluorescence, and the bottom row shows the combined differential interference microscopic image of the cells and fluorescence.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of an intracellular translocation test of a fluorescent-labeled peptide using a slide chamber.
  • the upper part of the photo shows the fluorescence of FITC, and the lower part shows a combination of the differential interference microscopic image of the cells and the fluorescence.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of analysis by flow cytometry.
  • FIG. 4 A diagram showing the results of an eGFP fusion protein translocation test using a confocal microscope.
  • FIG. 5 is a diagram showing the wheel structure of peptides KSH1 and KSH1-1 to 1-9. Less than In the figure, the abbreviations of amino acids used in the Wheel structure are as follows. A: Alanine, V: Palin, L: Leucine, I: Isoleucine, P: Proline, F: Ferallan, W: Tryptophan, M: Methionine, G: Glycine, S: Serine, T: Threonine, C: Cysteine, Y: Tyrosine, N: Asparagine, Q: Glutamine, E: Glutamic acid, K: Lysine, R: Argin, H: Histidine, D: Aspartic acid.
  • A Alanine
  • V Palin
  • L Leucine
  • I Isoleucine
  • P Proline
  • F Ferallan
  • W Tryptophan
  • M Methionine
  • G Glycine
  • S Serine
  • T Threonine
  • C Cysteine
  • Y Ty
  • FIG. 6 shows the results of flow cytometry (FACS) analysis of fluorescently labeled peptides KSH1 and KSH1-1 to 1-9 in CHO cells.
  • FIG. 7 is a diagram showing the wheel structure of peptides KSH1-1 to 1-24 and KSH1-35.
  • FIG. 8 shows the results of flow cytometry analysis of fluorescently labeled peptides KSH1-11 to 1-24 and KSH1-35 in CHO cells.
  • FIG. 9 is a diagram showing the wheel structure of peptides KSH1-24 to 1-26 and KSH1-28 to 1-30.
  • FIG. 10 shows the results of flow cytometry analysis of fluorescently labeled peptides KSH1-1, KSH1-24 to 1-26 and KSH1-28 to 1-30 in CHO cells.
  • FIG. 11 is a diagram showing the wheel structure of peptides KSH1-27, KSH1-33, KSH1-34 and KSH1-36.
  • FIG. 12 shows the results of flow cytometry analysis of fluorescently labeled peptides of KSH1-27, KSH1-33, KSH1-34 and KSH1-36 in CHO cells.
  • FIG. 13 is a diagram showing the wheel structure of a peptide having an amino acid sequence obtained from the examination result of a variant of KSH1 peptide.
  • FIG. 14 is a view showing an insert configuration when expressing an eGFP fusion protein.
  • FIG. 15 is a vector map of an eGFP fusion protein.
  • FIG. 16 is a diagram showing a method for incorporating a synthetic oligo into a vector. This figure uses a D-type vector.
  • FIG. 17 shows the results of an eGFP fusion protein translocation test using a confocal microscope.
  • the upper row shows the FITC fluorescence, and the lower row shows the fluorescence of the cell with a differential interference microscope image.
  • FIG. 18 is a diagram showing the wheel structure of peptides KSH3 to KSH10.
  • FIG. 19 shows the results of an intracellular migration test when 25 ⁇ of fluorescently labeled peptide was added.
  • the upper row shows the FITC fluorescence, and the lower row shows the fluorescence with the differential interference microscopic image of the cells.
  • FIG. 20 is a diagram showing the wheel structure of peptides KSH2 and KSH2-1 to 2-4.
  • FIG. 21 is a view showing the results of intracellular translocation test when fluorescently labeled peptides were added at 50 M, 25 M and 12.5 ⁇ .
  • the top row shows the FITC fluorescence, and the bottom row shows the combined differential interference microscopic image of the cells and fluorescence.
  • a peptide means ⁇ - X- ⁇ - X- Arg- T- Tyr- J- X- 0 1 -X- Arg- 0 2 -X- X or X- X- O 1-
  • Examples include L- or D-form peptides having the amino acid sequence of Arg-X-O 2 -X-J-Tyr-Z-Arg-X-Z-X-B.
  • B is arginine or lysine
  • at least one of 0 1 or 0 2 is arginine
  • Z is a hydrophobic amino acid
  • J is serine or alanine
  • B is preferably arginine.
  • the other may be any amino acid.
  • the hydrophobic amino acid of Z refers to any of oral isine, ferrolanine, isoleucine, parin, tyrosine, or tryptophan, preferably leucine, phenylalanine, isoleucine, or tryptophan, most preferably Is isoleucine or tributophan.
  • B- X- Z- X- Arg- Z- Tyr- J- X- O 1 -X- Arg- O 2 -X- X or X- X- O 1 -Arg- X- O 2 -X -Having the amino acid sequence of J-TyrZ-Arg-XZXB may have only the 15 amino acid sequences represented by the above sequence, or may be the C-terminal side of the amino acid of the above sequence and It is also possible to optionally have one or more amino acids on the N-terminal side. It also means that the peptide can transport proteins into cells and / or nuclei.
  • Any amino acid is not particularly limited, but desirable are basic amino acids (arginine, histidine, lysine), tryptophan, proline, glycine, cysteine, and ara. Nin, more preferred are glycine, cysteine and arginine. The number is not particularly limited.
  • the reverse-chain peptide means that the N-terminal force of a certain sequence, for example, (N-terminal) -ABCD- (C-terminal) also reverses the C-terminal amino acid sequence, ie ) Refers to -DCBA- (C-terminal) peptide.
  • the peptide also means a peptide having an L-form or D-form peptide represented by any one of SEQ ID NOs: 35 to 47 in the sequence listing and its reverse chain peptide in addition to the aforementioned peptides. Is mentioned. Particularly desirable in this peptide is the L-form or D-form peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35, 36, 38, 39, 42, 43, 45, 46 or 47 in the sequence listing.
  • L-form or D-form peptide and its reverse chain peptide means that the C-terminal side and / or the N-terminal of the 15 amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 35 to 47 in the sequence listing It means having one or more amino acids arbitrarily on the end side. And it means that the peptide can transport proteins into cells and / or nuclei.
  • Any amino acid is not particularly limited, but preferred are basic amino acids (arginine, histidine, lysine), tryptophan, proline, glycine, cysteine and alanine, and more desirable are glycine, cysteine and arginine. is there. The number is not particularly limited.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 1 to 47 in the sequence listing of the present invention includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted, or substituted with other amino acids. Or a peptide having an amino acid sequence obtained by combining them. And it means that the peptide has cell migration ability. In this case
  • amino acid sequence capable of transporting proteins into cells and / or nuclei with the same frequency as the peptides described in SEQ ID NOs: 1 to 47 of the Sequence Listing, even if amino acids are inserted, deleted or substituted There are cases.
  • amino acid is inserted, deleted or substituted, the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the peptide having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NOs: 1 to 47 in the sequence listing has been reported so far, and is a novel sequence that is not homologous to the known PTD. Until now, no homology was found with the reported human cDNA sequences.
  • the peptide of the present invention can be prepared according to a known peptide synthesis method, and substitution, addition or deletion can be easily performed by changing the type of protected amino acid. It is also possible to introduce special amino acids such as D-amino acid and sarcosine (N-methylglycine). Examples of peptide synthesis methods include solid phase synthesis methods, liquid phase synthesis methods, and the like. After the synthesis reaction, ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, or liquid chromatography are used. By combining recrystallization and the like, the peptide used in the present invention can be purified and isolated.
  • Examples of known peptide synthesis methods include the methods described in the following (i) to (V).
  • DNA refers to DNA consisting of a base sequence encoding a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 47 in the sequence listing, or any one of them.
  • Examples thereof include, but are not limited to, DNA having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 48 or 49 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 48 or 49 in the sequence listing encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 or 34 in the sequence listing, respectively.
  • DNA refers to a complementary strand of DNA having a nucleotide sequence that encodes the peptide of SEQ ID NO: 1 to 47 in the Sequence Listing, or a peptide described in any of them, under stringent conditions. It contains DNA consisting of the base sequence that is to be used for hybrids.
  • the base sequence that is neutralized under stringent conditions means about 80% or more of the complementary strand of the base sequence encoding the peptide shown in SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing, It preferably contains a base sequence having a homology of about 90% or more, more preferably about 95% or more.
  • Hybridization is carried out according to a known method or a method according thereto, such as the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be done.
  • Stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 mM force about 40 mM, preferably about 19 mM to about 20 mM, and a temperature of about 50 ° C. to about 70 ° C., preferably about 60 ° C. to about The condition at 65 ° C is shown. In particular, power is most preferred when the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • the base sequence of the present invention includes a sequence having about 50% or more identity with the base sequence encoding the peptide described in SEQ ID NO: 1 to 47 in the sequence listing. Preferably, it contains a nucleotide sequence having an identity of about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more. It is a thing.
  • the base sequence of the present invention includes a base sequence in which a base is inserted, deleted or substituted into the base sequence encoding the peptide set forth in SEQ ID NOs: 1 to 47 in the sequence listing.
  • Examples of the number of base sequences lost or substituted include 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 10 bases, preferably 1 base to 5 bases.
  • the protein is intracellularly and / or intranuclearly at the same frequency as the base sequence encoding the peptide described in SEQ ID NO: 1 to 47 in the sequence listing.
  • a base sequence that can be transported to When the base is inserted, deleted or substituted the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the DNA of the present invention can be synthesized according to a known method.
  • it when preparing cDNA encoding the fusion protein, it can be obtained by amplifying by PCR using primers.
  • Examples of the primer that can be used in the present invention include a primer for preparing cDNA encoding a fusion protein with eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), which is a green fluorescent protein.
  • eGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • Examples of the recombinant vector used in the present invention include vectors that can be expressed in prokaryotic cells such as Escherichia coli (for example, pBR322, pUC119, or a derivative thereof).
  • examples of yeast expression vectors include plasmid vectors such as pAURl12 (Tacarano).
  • Examples of vectors that can be expressed in mammalian cells include plasmid vectors such as pcDNA3.1 (lnvitrogen) and viral vectors such as pDON-AI DNA (Takara Bio).
  • the recombinant vector of the present invention is obtained by recombining all or part of the DNA having the base sequence of the present invention with these recombinant vectors by a known method.
  • the transformant of the present invention refers to a transformant containing the recombinant vector of the present invention.
  • Escherichia coli, yeast, animal cells and the like can be used. Preferably, it is a colon bacterium.
  • An auxotrophic strain or antibiotic-sensitive strain can also be used as a host.
  • the transformant of the present invention can be prepared according to a known method. For example, as described in Molecular Cloning 2nd (J-Sambrook et al., Old bpnng Harbor Lab. Press, 1989), such as the protoplast polyethylene glycol method and the electopore position method. It can be performed according to a method or the like.
  • the peptide bond material the following amino acid sequence: BXZX-Arg-ZT yr- J- X- O 1 - X- Arg- O 2 - X- X or X- X- O 1 - Arg- X -O 2 -X- J- Tyr- Z- Arg- X- Z- X- B Peptide or a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 to 47 in the Sequence Listing and a physiologically active substance Is mentioned.
  • a physiologically active substance is transported into the cell.
  • the cells include animal cells, and particularly human cells. As long as it is a human cell, it may be an adherent cell or a floating cell, or it may be a cell that constitutes each organ in vivo.
  • the physiologically active substance means a protein having physiological activity, a peptide having physiological activity, a drug-encapsulated ribosome, a polyethylene glycol enamel drug-encapsulated ribosome (hereinafter referred to as "PEGylated drug-encapsulated ribosome”).
  • PEGylated drug-encapsulated ribosome a polyethylene glycol enamel drug-encapsulated ribosome
  • low molecular weight compounds nucleic acids, magnetic beads, nanogauge particles or phages.
  • the protein having physiological activity includes a protein for treatment, prevention, Z or diagnosis of a disease, and the like, and includes a protein of about lOKDa to about 500 KDa, and particularly desirable is about lOKDa. To about 120 KDa of protein.
  • Specific examples include enzymes, antibodies, transcription factors, and partial peptides thereof, but are not limited thereto. Examples of the enzyme include SOD (Molecules and Cells 2005, 19, 191-197, WSEum et al.).
  • Examples of antibodies include antibodies against intracellular proteins, antibodies against foreign proteins such as single chain antibodies and viruses (Current Molecular Medicine 200 4, 4, 519-528, MN Lobato and THRabbitts, Molecular Therapy 2003, 8, 355-366, YY Wheeler et al.
  • transcription factors include mi transcription factor (microphthalmia-associated transcripution factor: hereinafter also referred to as “MITF”).
  • Ml TF is a kind of transcriptional regulatory factor existing in the living body, and is a protein having the ability to regulate the expression of c-kit gene unique to mast cells.
  • the force includes various MITFs described in JP 2004-201547 A, but is not limited thereto.
  • the polypeptide having physiological activity includes a peptide for treatment, prevention and / or diagnosis of a disease, and includes a peptide having 2 to 100 amino acids. Particularly preferred is a peptide of 4 amino acids with 30 amino acids.
  • HSP Heat Shock Protein
  • KLAK antibacterial peptide Cancer Research 61, 7709-7712, 2001
  • HIF-1a Pro c Natl Acad Sci USA 99: 10423-10428, 2002
  • PKC Protein Kinase C
  • VIVIT Neture Medicine 10: 305-309, 2004
  • the ribosome is a small single membrane ribosome (hereinafter also referred to as “SUV”), a large single membrane ribosome (hereinafter also referred to as “LUV”), or Multilayer liposomes (hereinafter sometimes referred to as “MLV”) and the like, preferably SUV or LUV.
  • SUV small single membrane ribosome
  • LUV large single membrane ribosome
  • MUV Multilayer liposomes
  • drug-encapsulated ribosomes include those in which anti-inflammatory drugs such as diclofenac sodium and dobramycin are encapsulated in the ribosome as described above.
  • the PEG ⁇ drug-encapsulated ribosome includes an agent-encapsulated ribosome in which polyethylene glycol (PEG) is bound to the surface of the ribosome.
  • PEG polyethylene glycol
  • the low molecular weight compound in the present invention examples include anti-inflammatory drugs such as diclofenac sodium, dopramycin, and cyclosporine.
  • the nucleic acid includes, for example, a plasmid and siRNA antigen DNA related to a disease-related gene.
  • magnetic beads include, for example, introducing supermagnetic ion oxide particles into T cells, B cells, and macrophages and tracking cell localization by MRI (Advanced Drug (Delivery Reviews 57: 637-651, 2005)
  • examples of the nanogauge particles include those in which proteins, low molecular compounds, nucleic acids, polysaccharides and the like are encapsulated in nanosized particles. (Advanced Drug Delivery Reviews 57: 0 ⁇ 7-651, 2005).
  • examples of the phage include M13 phage incorporating various cDNA expression units (Advanced Drug Delivery Reviews 57: 529-546, 2005).
  • the peptide-binding substance containing the peptide of the present invention and the protein having the physiological activity as described above is a recombinant vector containing DNA encoding the substance. It is possible to obtain the protein produced by culturing the host cell transformed with the product and isolating the protein produced thereby by a method such as high performance liquid chromatography (HPLC).
  • the DNA used at this time may be a DNA obtained by fusing a gene encoding the peptide of the present invention and a gene encoding a protein having physiological activity or a polypeptide having physiological activity as described above.
  • the peptide-binding substance containing the peptide of the present invention and the protein having biological activity expresses the respective genes to express the peptide of the present invention and the protein having physiological activity or the polypeptide having physiological activity, respectively.
  • the peptide-binding substance containing the peptide of the present invention and a protein having physiological activity can be prepared by a method using a chemical crosslinking agent. In this case, a chemical cross-linking method that preferably prevents cross-linking of the functionally active site of the peptide of the present invention and a protein having physiological activity is described in JP-A-10-33186. And the like.
  • the peptide of the present invention is converted into a drug-encapsulated liposome.
  • PEG drug-encapsulated ribosomes or low molecular weight compounds.
  • the drug encapsulated in the ribosome can be delivered into the cell by binding the peptide of the present invention to the drug-encapsulated ribosome or the PEGy drug-encapsulated ribosome.
  • Examples of the method of binding the peptide in the present invention include a method of introducing a cysteine residue at the N-terminus or C-terminus and binding to a drug-encapsulated liposome having a maleimide group or a PEGylated drug-encapsulated ribosome via an SH group. Etc.
  • the peptide-binding substance of the present invention can be used as a medicine. Furthermore, by binding the peptide of the present invention to a physiologically active substance, the target physiologically active substance can be transported into the cell, Z, or nucleus, so that there are various types depending on the type of physiologically active substance to be bound. It can be used as a therapeutic and Z or preventive for diseases.
  • the physiologically active substance to be bound to the peptide of the present invention is preferably a protein having physiological activity. More preferably, the peptide of the present invention can be used as an antiallergic agent by binding to a MITF variant.
  • the peptide-binding substance of the present invention when used as a medicine, it can be formulated and administered according to a known method. For example, it can be administered to humans or mammals orally or parenterally as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form.
  • An appropriate solvent or suspending agent can be used for the production of the liquid agent and the like.
  • suitable excipients can be used.
  • Liquid preparations for oral administration i.e. syrups, suspensions, liquids, etc. contain commonly used inert diluents.
  • this preparation may contain adjuvants such as wetting agents, suspending aids, sweetening agents, flavoring agents, coloring agents, preservatives, stabilizers and the like.
  • the dose of the peptide-binding substance in the present invention to humans is age, weight, general health status, sex, meal, administration time, administration method, excretion rate, combination of drugs, and treatment of the patient at that time. Depending on the severity of the disease, it can be determined by considering these and other factors. For example, dosages include about 0.01 mg / Kg to about 1.0 mg / Kg Once per dose, it can be administered in divided doses.
  • PTD derived from HIV TAT protein shown in SEQ ID NO: 50 of the Sequence Listing is positive control (referred to as “Positive” or “TAT” in FIGS. 1 to 3), and described in SEQ ID NO: 51 of the Sequence Listing. Ulo Langel. Et al. Reported that ell— Penetrating Peptides: Processes and Applications, Series: Pharmacology and Toxicology: Basic and Clinical Aspects Volume: 3,2002) In FIG. 1, it is described as “Negative”), and peptides having 11 sequences selected in Example 1-1 were evaluated.
  • Example 1-1 The peptides having 11 sequences selected in Example 1-1 were synthesized by a solid phase method, and fluorescently labeled by coupling 5,6-Carboxyfluorescein to the N-terminus of each peptide. Furthermore, it was purified with HPL C to a purity of 70% or more. Thereafter, each fluorescently labeled peptide was dissolved in 10% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) to 1 mM (hereinafter referred to as peptide solution). Called liquid).
  • DMSO Dimethyl Sulfoxide
  • CHO cells ATCC.NO. CCL-61
  • HeLa cells HeLa cells
  • Jurkat cells Three cells, CHO cells (ATCC.NO. CCL-61), HeLa cells, and Jurkat cells, were used as cells for taking up the peptide.
  • 10 4 cells each of CHO cells and HeLa cells and 10 5 Jurkat cells were implanted in a 96-well plate and cultured for 2 to 3 days. Thereafter, when the cells became confluent, a peptide solution was added to each cell and incubated for 1 hour. Each cell was washed 3 times with PBS, 100 L of 0.25% trypsin-ImM EDTA solution was added, and trypsinization was performed at room temperature for 5 minutes.
  • HBSS Hanks' Balanced Salt Solution Zlnvitrogen
  • FIGS. 1 to 3 show the peptide strength of the novel PTD candidate sequence (denoted as “KS H1” in FIGS. 1 to 3) described in SEQ ID NO: 33 in the sequence listing showed the highest intracellular translocation.
  • Figure 1 shows the results of KSH1 peptide, positive control and negative control. Fluorescence derived from KSH1 peptide was also observed in CHO cells, HeLa cells, and Jurkat cells! /. The fluorescence intensity derived from the KSH1 peptide exceeded that of the positive control. Furthermore, the peptides transported into the cells were detected even in the nuclei and cytoplasm where they were not localized.
  • CHO cells were implanted in a slide chamber (Nunc), and 25 ⁇ K each of KSH1 peptide and positive control peptide was added to CHO cells, and intracellular migration was confocal. Confirmed by
  • Example 3 Flow cytometry analysis Each peptide solution adjusted to 1 mM was diluted with a medium at 100 M, 50 M, and 25 ⁇ in three stages and added to the cells. Three types of cells were used: CHO cells, HeLa cells, and Jurkat cells. The peptide solution was added to the cells and incubated for 1 hour. The cells were washed 3 times with PBS, 100 ⁇ L of 0.25% trypsin-ImM EDTA solution was added, and trypsinization was performed at room temperature for 5 minutes. 400 1/3 (10% FCS) was added, and after trypsinization was stopped, it was washed 3 times with 1 mL of HBSS. After washing, the cells were suspended in 500 ⁇ L of PBS (10% FCS) and subjected to flow cytometry (hereinafter referred to as FACS) analysis using FACS Calibur (Becton Dickinson).
  • FACS flow cytometry
  • His-eGFP expression vector having a His-Tag and a restriction enzyme recognition site was constructed by PCR using eGFP cDNA (eGFP- ⁇ ) (manufactured by Amersham Pharmacia) as a saddle type.
  • PCR was performed using Easy-A PCR kit (manufactured by Stratagene).
  • the template eGF P cDNA (eGFP_NII) DNA was diluted to 200 ng / mL.
  • the synthetic DNA used as a primer was adjusted to 20 ⁇ .
  • the female was up.
  • PCR amplification conditions were as follows. 1 cycle for 2 minutes at 94 ° C, 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 60 ° C, 30 cycles at 72 ° C for 2 minutes.
  • PCR was performed using the Fw primer (Nco-His-GFP-f) described in SEQ ID NO: 116 of the sequence listing and the Rv primer (GFP-Rev-Bam) described in SEQ ID NO: 117 of the sequence listing. went.
  • the “His-eGFP expression vector” constructed in this way is a vector that expresses the His-e GFP fusion protein under the control of the T7 promoter.
  • eGFP cDNA (eGFP- ⁇ ) is converted into a saddle shape, His-Tag, and a new PTD candidate sequence.
  • His-KHSl-eGFP expression vector having a restriction enzyme recognition site was constructed.
  • PCR was performed using the Fw primer (KSH-kp-nd-GF-f) described in SEQ ID NO: 118 in the sequence listing and the Rv primer (GFP- Rev-Bam) described in SEQ ID NO: 117 in the sequence listing. .
  • Fw primer KSH-kp-nd-GF-f
  • Rv primer GFP- Rev-Bam
  • the PCR-amplified fragment was digested with restriction enzymes Ncol and Bam HI for cloning into a vector, and a 0.8-kb DNA fragment was recovered. The recovered DNA fragment was inserted into pET14b.
  • the "His-KHSl-eGFP expression vector" constructed in this way expresses a His-KSHl-eGFP fusion protein under the control of the T7 promoter.
  • 2% of the preculture was inoculated into 1 L of LB and cultured at 37 ° C for 2.5 hours. IPTG with a final concentration of 1 mM was added, and further cultured for 4 hours. The cells were collected by centrifugation (4000 rpm, 20 min Hitachi himac CR7), and then suspended in 50 mL of PBS. Further, the cells were collected by centrifugation (3500 rpm, 20 min KUBOTA 5200). Thereafter, the cells were suspended in 30 mL of PBS and freeze-thawed three times.
  • DNase solution (Benzone Takara Bio NV677) was incubated at 15 ⁇ L for 10 minutes at room temperature, then centrifuged (18000 rpm, 20 min TOMY UD-201), and the supernatant was collected. The supernatant was applied to an N-to-NTA column (Qiagen 30430) equilibrated with PBS. The column was washed with PBS containing 50 mL of 10 mM imidazole and then eluted with 4 mL of PBS containing 200 mM imidazole.
  • CHO cells and HeLa cells were implanted in a 96-well plate at 10 4 cells per well and used in a confluent state 2 days later. After washing the cells three times with MEM medium, add His-new PTD candidate sequence-peptide solution containing eGFP fusion protein and peptide solution containing His-eGFP fusion protein, respectively, and add for 1 hour at 37 ° C. Incubated. After washing 3 times with PBS, cells were collected by trypsinization. The collected cells were washed once with MEM medium and three times with PBS (10% FCS), suspended in 1/3 of 100 (10% FCS), and subjected to confocal microscopy.
  • the His-new PTD candidate sequence-eGFP fusion protein was detected in the form of dots, and it became clear that it was localized in the endonome. This is different from the fact that the peptide alone as shown in Example 1-2 is delocalized in the cell. PTD fusion proteins have been reported to be taken up into cells by macropinocytosis and localized to endonomes (J Control Release. 2005 Jan 20; 102 (1): 247-53 Catio nic TAT peptide transduction domain enters cells by macropinocytosis. Kaplan IM, Wadia JS, Dowdy SF.). That is, it was suggested that the novel PTD candidate sequence permeates the cell membrane by the same mechanism as other PTD peptides.
  • SEQ ID NOs in the sequence listing corresponding to the names of the respective peptides are as shown in Tables 11 and 12.
  • Wheel structure prediction of the primary sequence of KSH1 peptide (SEQ ID NO: 33 in the Sequence Listing) (Trends Gene t. 16 (6): 276-7, 2000) shows that a lysine / arginine cluster is formed and that tributophane is 2
  • the presence of arginine located next to tributophan was characteristic, although it was not present in the cluster, and it contained the rigid amino acid proline and was not involved in cluster formation. Therefore, we confirmed the significance of these characteristic sequences in the intracellular translocation. In order to do so, SEQ ID NOS: 1 to 9 in the sequence listing were designed (FIG. 5).
  • Example 1-3 Each peptide was synthesized, fluorescently labeled, purified and dissolved in the same manner as in Example 1-2, transferred to CHO cells, and evaluated by confocal microscopic analysis and FACS. FACS analysis was performed as in Example 1-3.
  • FIG. 6 shows the fluorescence intensity of the KSH1 peptide and the modified PTD sequences KSH1-1 to KSH1-9 (SEQ ID NOS: 1 to 9 in the Sequence Listing) by FACS analysis.
  • Peptide concentrations were 50 ⁇ ⁇ , 25 ⁇ , 12.5 ⁇ , and 6.5 ⁇ .
  • the 6th tributophane was more important for intracellular translocation than the 3rd (KSH1-13, KSHl-6). From these facts, the 13th arginine, the 6th arginine and the 7th tycoin are thought to play an important role in intracellular translocation, and other amino acids are considered to contribute little to the intracellular translocation. (KSHl-11, KSH1-1 2, KSH1-14, KSH1-19, KSH1-20, KSH1-23, KSH1-35).
  • Each peptide was synthesized, fluorescently labeled, purified and dissolved in the same manner as in Example 1-2, transferred into CHO cells, and evaluated by confocal microscopy and FACS analysis. Went. FACS analysis was performed as in Example 1-3.
  • Fig. 10 shows the fluorescence intensity of KSH1 and the modified PTD sequences KSH11-24 to 1-26 and KSH1-28 to 1-30, as determined by FACS analysis. Peptide addition concentrations were 50 ⁇ , 25 ⁇ , 12.5 ⁇ , and 6.5 ⁇ .
  • KSH1-24 leucine
  • KSH1-25 ferrolanine
  • KSH1-26 isoleucine
  • KSHl-27 (SEQ ID NO: 26 in the sequence listing), KSHl-33 (SEQ ID NO: 30 in the sequence listing), KSHl-34 (SEQ ID NO: 31 in the sequence listing) and KSH1-36 (SEQ ID NO: 34 in the sequence listing) were designed. ( Figure 11).
  • Each peptide was synthesized, fluorescently labeled, purified and dissolved in the same manner as in Example 1-2, transferred into CHO cells, and evaluated by confocal microscopic analysis and FACS analysis. Went. FACS analysis was performed as in Example 1-3. KSH1 and modified PTD sequences KSH1-27, KSH1-33, KSH1-34 and KSH1-36! /, And fluorescence by FACS analysis The strength is shown in Figure 12. Peptide addition concentrations were 50 ⁇ , 25 ⁇ , 12.5 ⁇ , and 6.5 ⁇ .
  • KSH1-36 is a reverse-chain peptide of KSH1, but compared to KSH1, the intracellular translocation at a high concentration is enhanced, but the intracellular translocation tends to decrease at a low concentration. It was.
  • HeLa cells Similar to CHO cells, HeLa cells were subjected to confocal microscopy analysis of intracellular translocation of synthetic peptides with modified PTD sequences. Compared with CHO cells, the overall tendency of intracellular translocation was low. However, in HeLa cells, the intracellular transfer of KSH1-7 was lower than that of CHO cells, whereas the intracellular transfer of KSH1-16 was slightly higher. In conclusion, the modified peptides that showed better intracellular translocation in HeLa cells compared to KSH1 were KSH1-1, KSH1-8, KSH1-9, KSH1-1, KSH1-20 and KSH1-33.
  • FIG. 13 The arrangement shown in Fig. 13 was derived from the results of Examples 3-1 to 3-5.
  • B in the drawing is Arugininma other is lysine, either 0 1 or 0 2 is arginine, Z is a hydrophobic amino acid, J is serine or Aranin, and X is any amino acid.
  • the primer for insert amplification was designed so that the His-Tag, PTD sequence could be inserted in-frame at the N-terminus or C-terminus of eGFP.
  • the GGGS or GGGSS linker was designed before and after the His-Tag and PTD sequences, respectively.
  • the PTD portion a DNA sequence encoding PTD1 derived from HIV TAT was used.
  • the recognition sequences for the restriction enzymes BamHI and Xhol were added to the DNA sequence parts of the GGGS and GGGSS linkers that encode the PTD part, respectively.
  • Reverse primer C- Rl (SEQ ID NO: 53 in the sequence listing) 5,-CAC CGC GGC GAC GTT GTC GTC GTT TCT TCC TGC CGT AGG ATC CCC CTC CCT TGT ACA GCT CGT CCA TGC C-3 '
  • Reverse primer C-R2 (SEQ ID NO: 54 in the sequence listing) 5,-CGC TCA GCG TCG ACT C AC CCG TGA TGA TGG TGG TGA TGA CTC GAG CCG CCA CCG CGG CGA CGT TGT-3
  • Reverse primer D-R (SEQ ID NO: 56 in the sequence listing) 5,-CCG CTC AGC GTC GAC TC
  • the modified PTD sequence was inserted by the method shown in Fig. 16 using the synthetic oligos shown in Tables 2-1 and 2-2.
  • eGFP was used in a cocoon type and amplified with the primer set of SEQ ID NOs: 52 and 56 in the sequence listing, and only His was added to the C-terminus.
  • each transformant was pre-cultured with 20 mL of LB (37 ° C, 15 hours). 2% of the preculture was inoculated into 1 L of LB and cultured at 37 ° C for 2.5 hours. IPTG with a final concentration of 1 mM was added and further cultured for 4 hours. The cells were collected by centrifugation (4000 rpm, 20 min Hitachi himac CR7), and then suspended in 50 mL of PBS. The cells were collected by centrifugation (3500 rpm, 20 min KUBOTA 5200). The cells were suspended in 30 mL of HBS S and freeze-thawed three times.
  • Example 4-2 3 ⁇ 4 ⁇ PTDffi row eGFP fusion Intra-cell migration in birch CHO cell
  • CHO cells were used to investigate the intracellular transfer of the fusion protein.
  • CHO cells were implanted in a 48-well plate, 4 x 2xl0 per well, and used in a confluent state. The cells were washed 3 times with MEM medium, supplemented with a 150 / zL protein solution, and incubated at 37 ° C for 3 hours. After washing with PBS three times, 0.25% trypsin / EDTA was added at 100 L / well, MEM medium containing 10% FCS was added at 400 / z L / well, and the cells were collected. The collected cells were washed 3 times with HBSS, suspended in 100 L of HBSS containing 10% FCS, and subjected to confocal microscope observation.
  • the fluorescence amount of concentration from eGFP when added Caro was measured with ARVO (Perkin Elmer one company) (measurement time 1 second), the fluorescence intensity is 10 6, 5xl0 5, the 2.5Xl0 5 It was prepared as follows.
  • the eGFP fusion protein was produced in Example 3 because KSH1-1, KSH1-7, KSH1-8, KSH1-9, KSH1-18, KSH1-3, plus KSH1-20, KSH1-21, KSH1-26, KSH1-27, KSH1-28, KSH1-30 and KS HI-36.
  • C-type fusion proteins were prepared for KSH1, KSH1-1, KSH1-7 and KSH1-8, and D-type fusion proteins were prepared for the other peptides.
  • Fig. 17 shows the result of the intracellular translocation test using CHO cells for the prepared eGFP fusion protein.
  • the upper row shows the fluorescence of the eGFP protein transferred into the cell, and the lower row shows the fluorescence combined with the differential interference microscopic image of the cell.
  • the fusion protein was added to the cells with the same fluorescence intensity of 10 6 .
  • fluorescence is detected in the cell and all KSH-1 variants have the ability to transfer the fusion protein into the cell. It became clear that it was held.
  • the difference in migration efficiency was small in the fusion protein.
  • the intracellular migration was enhanced compared to KSH1.
  • threonine and serine modified with alanine also showed strong enhancement in the fusion protein with no apparent enhancement of intracellular translocation.
  • KSHl-27 when all threonine and serine were changed to alanine (KSHl-27), the intracellular translocation was clearly enhanced, and in order to change the intracellular translocation efficiency of the fusion protein, compared to the case of the peptide alone. It was concluded that a large structural change of the peptide part was necessary.
  • the KSH1 peptide was obtained from a 7-fold enriched library in Jurkat cells. Therefore, the base sequence was confirmed by arbitrarily picking up 1000 IVVs contained in the Jurkat 7-fold enriched library. From the analysis of KSH1, it was predicted that the presence of lysine / arginine clusters and tryptophan would be important when the peptide sequence was applied to the wheel structure. I went. As a result, 60 sequences met the criteria. In addition, one kind of duplicated sequence was found in the 1000 sequences. Based on these sequences, we synthesized fluorescently labeled peptides and analyzed their ability to migrate into cells.
  • Example 5-2 Analysis of cell migration of new PTD sequence by confocal microscopic observation
  • KSH2 to KSH10 SEQ ID NOs: 35 to 43 in the sequence listing
  • CHO cells were transferred to CHO cells in the same manner as in Example 1-2, and confocal microscope analysis was performed.
  • As a positive control a PTD sequence derived from HIV TAT (SEQ ID NO: 50 in the sequence listing) and a peptide of KSH1 were used, and as a negative control, a peptide sequence with no intracellular migration (SEQ ID NO: 57 in the sequence listing) was used. .
  • knock ground was corrected using cells supplemented with the peptide of the negative control (SEQ ID NO: 57 in the sequence listing). Thereafter, a peptide of Positive control PTD1 (SEQ ID NO: 50 in the sequence listing) was added, and the fluorescence in the cells was observed.
  • the peptides were analyzed in a 3-fold 2-fold dilution series from 50 ⁇ to 12.5 ⁇ .
  • the analysis results with the confocal microscope showed the same tendency as the FACS analysis results.
  • the results of analysis using the confocal microscope for four types of KSH2, KSH3, KSH4, KSH6, KSH7, and KSH10 showed a better intracellular migration profile compared to PTD1 (Fig. 19, upper panel).
  • the lower part of the figure shows the fluorescence of the differential interference microscopic image of the cells combined with the fluorescence.
  • the addition concentration of the peptide was 25 ⁇ .) 0
  • the PTD candidate sequence identified this time is It clearly retained the ability to move into cells.
  • no homologous sequences were found, and all were new PTD sequences.
  • KSH2 the peptide was localized in the HeLa cell so as to border the surface of the cell membrane, and showed a different migration from other PTDs.
  • Example 5-3 New parent PTDffi-line eGFP fusion Trial migration test in birch CHO cell
  • eGFP fusion proteins for 6 types of KSH2, KSH3, KSH4, KSH6, KSH7 and KSH10, and confirmed whether they have the ability to transfer a novel PTD sequence and eGFP fusion protein into cells.
  • a molecular type with a high solubility As a result, the C type in Fig. 14 was selected for KSH2 and KSH6, and the D type molecular type in Fig. 14 was selected for the remaining four types.
  • the fusion protein was prepared as in Example 4-1.
  • the annealing oligo sequences used here are as shown in Table 3. After using eGFP-His as a negative control and aligning each fluorescence intensity, C Added to HO cells.
  • KSH7 peptide has only one basic amino acid, such as arginine, common to the known PTDs reported so far, and is a new category of PTD.
  • KSH4 and KSH2 are proteins that move more into cells than other new PTDs and KSH1 peptides, especially when eGFP is used as cargo. It was a useful PTD.
  • Example 6-1 B BPTD ⁇ R-sequence peptide 'transfer test in confinement microscope using confocal microscope Among the new PTD sequences found in Example 5, KSH2 peptide transferred eGFP into cells. Modification was attempted because of its high ability. Peptides KSH2-1 to KSH2-4 (SEQ ID NOs: 44 to 47 in the sequence listing) were synthesized, fluorescently labeled, purified and dissolved in the same manner as in Example 1-2, and then transferred to CHO cells. And conducted confocal microscopic analysis.
  • the peptide of KSH2 is characterized by the formation of lysine arginine clusters on the Wheel structure and the presence of tryptophan anchors. Another characteristic is that there are about three cystine forces across Tributophane. It has become clear that the basic amino acid clusters and tryptophan are also important in the analytical power so far. Therefore, we examined the effect of substituting two cysteines with other amino acids when modifying the peptide of KSH2 (Fig. 20).
  • KSH2-1 and KSH2-2 at a concentration of 50 ⁇ were higher than KSH2, and when KSH2-1 was diluted to a force of 25 ⁇ indicating intracellular translocation, KSH2-1 significantly decreased intracellular translocation. did.
  • KSH2-2 was diluted to 25 ⁇ or 12.5 ⁇ the intracellular transfer efficiency was higher than that of KSH2.
  • There were several tryptophans in KSH2-2 which promoted intracellular translocation. The greater the number of tryptophans, the greater the peptide translocation into the cell.
  • two cysteines were converted into one alanine. Replacement (KSH2-3 and KSH2-4) was examined for intracellular translocation. The ability of FITC-labeled peptides to translocate into CHO, HeLa, and Jurkat cells was found to be enhanced in both cells compared to KSH2.
  • Example 6-2 3 ⁇ 4 ⁇ PTDffi row eGFP fusion Trial migration test in white CHO cell KSH2-3 and KSH2-4 (SEQ ID NOs: 46 and 47 in the sequence listing)! /, Preparing eGFP fusion protein and transferring PTD sequence and eGFP fusion protein into cells KTD2 And the transferability of eGFP fusion protein.
  • the C type shown in Fig. 14 was created for KSH2
  • the D type shown in Fig. 14 was created for KSH2-3 and KSH2-4.
  • the fusion protein was prepared in the same manner as in Example 4-1.
  • the annealing oligo sequences used here are shown in Table 4.

Abstract

　本発明によれば、従来に細胞膜透過ペプチドに比べて、高い頻度で蛋白質を細胞内および/または核内に輸送する、新規な細胞膜透過ペプチドおよび当該ペプチドを含有する医薬を提供することができる。

Description

新規細胞膜透過ペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、新規な細胞膜透過ペプチド及び当該ペプチドを含有する医薬に関する 背景技術
[0002] 治療や診断に用いられる通常のタンパク質や核酸等は、細胞膜は透過しないが、 近年、生体内でタンパク質や核酸等を、細胞内や核内へ輸送するペプチド（以下「τ
ATタンパク質」と称することもある。）が存在することが明らかとなった (非特許文献 1か ら非特許文献 3)。さらに、 TATタンパク質の特定の 11アミノ酸力もなるペプチドと他の タンパク質との融合タンパク質が、細胞膜を透過することが明らかとなり、この細胞膜 透過に必須な領域、すなわち、細胞膜透過ペプチドは、 PTD (Protein Transduction Domain)と称されて ヽる（非特許文献 4)。
[0003] 現在までに、種々の細胞膜透過ペプチドを利用してタンパク質や核酸等を細胞内 へ輸送する方法が開発されている。具体的には、 HIV-1 TATタンパク質の特定部分 ポリペプチドを利用する方法 (特許文献 1)等が提案されて ヽる。
[0004] しかし、従来用いられてきた細胞膜透過ペプチドは、天然に存在するものであり、輸 送効率が低いという問題点があった。そのため、高い輸送効率を有するペプチドの 開発が望まれていた。
特許文献 1：特開平 10— 33186号公報
非特許文献 l : Green, M. et al. Cell 55, 1179-1188 (1988)
非特許文献 2 : Frankel, A.D. et al. Cell 55, 1189-1193 (1988)
非特許文献 3 : Fawell, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 664-668(1994) 非特許文献 4 : Nagahra, H. et al. Nature Medicine 4, 1449-1452 (1998)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の課題は、新規な細胞膜透過ペプチド及び当該ペプチドを含有する医薬を 提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、細胞膜透過ペプチドとして有用な、新規なアミノ酸配列からなるぺ プチドを提供すべく鋭意検討した結果、従来の細胞膜透過ペプチドに比べて、高い 頻度でタンパク質を細胞内に輸送するペプチドのアミノ酸配列を同定して、本発明を 完成するに至った。具体的には、 1012分子のランダムペプチドライブラリーの中から網 羅的なスクリーニングを行うことによって細胞内移行性の高いペプチドを見出した。こ のような手法を用いることにより選択されたペプチドは、細胞内移行能を持ったぺプ チドの中でも特に移行性が高いものであると考えられる。
[0007] すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)下記のアミノ酸配列を有するペプチド。
B- X- Z- X- Arg- Z- Tyr- J- X- O1- X- Arg- O2- X- Xまたは X- X- O1- Arg- X- O2- X- J- Tyr- Z-Arg-X-Z-X-B
ただし、（i)Bはアルギニンまたはリジンであり、（ii)O1または 02の少なくとも一方がアル ギニンであり、（iii)Zが疎水性アミノ酸であり、（iv)Jがセリンまたはァラニンであり、かつ（ v)Xが任意のアミノ酸である。
(2)配列表の配列番号 1から 34のいずれかで表されるアミノ酸配列のうち 1個または複 数個のアミノ酸を置換、欠失、付加または挿入されることによってなる、（1)記載のぺプ チド。
(3)配列表の配列番号 35から 47の 、ずれかで表されるアミノ酸配列のうち 1個または 複数個のアミノ酸を置換、欠失、付加または挿入されることによってなるペプチドおよ びその逆鎖ペプチド。
(4)配列表の配列番号 1から 47のいずれかで表されるアミノ酸配列力 なるペプチドお よびその逆鎖ペプチド。
(5)上記 (1)から (4)のいずれかに記載のペプチドをコードする塩基配列力 なる DNA。
(6)上記 (5)に記載の DNAを含有する組換えベクター。
(7)上記 (6)に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
(8)上記 (1)から (4)のいずれかに記載のペプチド及び生理活性物質を含有するぺプ チド結合物質。
(9)生理活性物質が、生理活性を有するタンパク質、生理活性を有するポリペプチド、 薬剤封入リボソーム、ポリエチレングリコールイ匕薬剤封入リボソーム、低分子化合物、 核酸、マグネティックビーズ、ナノゲージパーティクルまたはファージである上記 (8)に 記載のペプチド結合物質。
(10)生理活性を有するタンパク質が約 lOKDaから約 120KDaのタンパク質または 4個か ら 30個のポリペプチドである上記 (8)に記載のペプチド結合物質。
(11)生理活性を有するタンパク質が mi転写因子 (MITF)である上記 (8)に記載のぺプ チド結合物質。
(12)細胞内及び Z又は核内に輸送される上記 (8)から (11)のいずれかに記載のぺプ チド結合物質。
(13)細胞内に輸送される上記 (8)から (11)のいずれかに記載のペプチド結合物質。
(14)上記 (8)に記載のペプチド結合物質を含有する医薬。
(15)抗アレルギー薬として使用する上記 (14)に記載の医薬。
発明の効果
[0008] 本発明によれば、従来の細胞膜透過ペプチドに比べて、高 、頻度でタンパク質を 細胞内及び/又は核内に輸送する細胞膜透過ペプチド及び当該ペプチドを含有す る医薬を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]蛍光標識ペプチドの細胞内移行試験の結果を示した図である。上段は FITCの 蛍光を示し、下段は細胞の微分干渉顕微鏡像と蛍光をあわせたものを示す。
[図 2]スライドチャンバ一を用いた蛍光標識ペプチドの細胞内移行試験の結果を示し た図である。写真の上段は FITCの蛍光を示し、下段は細胞の微分干渉顕微鏡像と 蛍光をあわせたものを示す。
[図 3]フローサイトメトリーによる解析の結果を示す図である。
[図 4]共焦点顕微鏡による eGFP融合タンパク質の細胞内移行試験の結果を示した図 である。
[図 5]KSH1および KSH1-1から 1-9のペプチドの、 Wheel構造を表した図である。以下 の図において、 Wheel構造にて用いられるアミノ酸の略語が表す内容は下記の通りで ある。 A:ァラニン、 V：パリン、 L:ロイシン、 I：イソロイシン、 P:プロリン、 F:フエ-ルァラ- ン、 W:トリプトファン、 M:メチォニン、 G:グリシン、 S:セリン、 T:スレオニン、 C:システィン 、 Y:チロシン、 N:ァスパラギン、 Q:グルタミン、 E:グルタミン酸、 K:リジン、 R:アルギ-ン 、 H:ヒスチジン、 D:ァスパラギン酸。
[図 6]KSH1および KSH1-1から 1-9の蛍光標識ペプチドの CHO細胞におけるフローサ ィトメトリー (FACS)による解析結果を示す図である。
[図 7]KSH1- 11から 1-24および KSH1- 35のペプチドの、 Wheel構造を表した図である
[図 8]KSH1- 11から 1- 24および KSH1- 35の蛍光標識ペプチドの CHO細胞におけるフ ローサイトメトリーによる解析結果を示す図である。
[図 9]KSH1- 24から 1-26および KSH1- 28から 1-30のペプチドの、 Wheel構造を表した 図である。
[図 10]KSH1-1、 KSH1-24から 1-26および KSH1-28から 1-30の蛍光標識ペプチドの C HO細胞におけるフローサイトメトリーによる解析結果を示す図である。
[図 11]KSH1- 27,KSH1- 33,KSH1- 34および KSH1- 36のペプチドの、 Wheel構造を表 した図である。
[図 12]KSH1- 27,KSH1- 33,KSH1- 34および KSH1- 36の蛍光標識ペプチドの CHO細 胞におけるフローサイトメトリーによる解析結果を示す図である。
[図 13]KSH1のペプチドの改変体検討結果より得られたアミノ酸配列のペプチドの、 W heel構造を表した図である。
圆 14]eGFP融合蛋白質を発現させる際の、インサート構成を示した図である。
[図 15]eGFP融合蛋白質のベクターマップである。
[図 16]合成オリゴのベクターへの組み込み方法を示した図である。この図は、 Dタイプ のベクターを用いたものである。
[図 17]共焦点顕微鏡による eGFP融合タンパク質の細胞内移行試験の結果を示した 図である。上段は FITCの蛍光を示し、下段は細胞の微分干渉顕微鏡像と蛍光をあ わせたものを示す。 [図 18]KSH3から KSH10のペプチドの、 Wheel構造を表した図である。
[図 19]蛍光標識ペプチドを 25 μ Μ添加した際の細胞内移行試験の結果を示した図 である。上段は FITCの蛍光を示し、下段は細胞の微分干渉顕微鏡像と蛍光をあわ せたものを示す。
[図 20]KSH2および KSH2- 1から 2- 4のペプチドの、 Wheel構造を表した図である。
[図 21]蛍光標識ペプチドを 50 M、 25 Mおよび 12.5 μ Μ添カ卩した際の細胞内移行 試験の結果を示した図である。上段は FITCの蛍光を示し、下段は細胞の微分干渉 顕微鏡像と蛍光をあわせたものを示す。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0011] (1)ペプチド
本発明にお 、てペプチドとは、 Β- X- Ζ- X- Arg- Ζ- Tyr- J- X- 01- X- Arg- 02- X- Xまた は X- X- O1- Arg- X- O2- X- J- Tyr- Z- Arg- X- Z- X- Bのアミノ酸配列を有する L体もしく は D体のペプチドが挙げられる。このアミノ酸配列において、 Bはアルギニンまたはリ ジンであり、かつ、 01または 02の少なくとも一方がアルギニンであり、かつ、 Zが疎水 性アミノ酸であり、かつ Jがセリンまたはァラニンであり、かつ Xが任意のアミノ酸である 。ここで、 Bは、望ましくはアルギニンである。 01または 02は、少なくとも一方がアルギ ニンであれば、もう一方は任意のアミノ酸でよい。また、 Zの疎水性アミノ酸とは口イシ ン、フエ-ルァラニン、イソロイシン、パリン、チロシン、またはトリプトファンのいずれか を指し、望ましいのはロイシン、フエ二ルァラニン、イソロイシンまたはトリプトファンであ り、最も望ましいのはイソロイシンまたはトリブトファンである。
[0012] B- X- Z- X- Arg- Z- Tyr- J- X- O1- X- Arg- O2- X- Xまたは X- X- O1- Arg- X- O2- X- J- Ty r-Z-Arg-X-Z-X-Bのアミノ酸配列を有するとは、上記配列で表される 15個のアミノ酸 配列のみのアミノ酸を有することでも良ぐある 、は上記配列のアミノ酸の C末端側お よび/または N末端側に任意にアミノ酸を 1個あるいは複数有することでも良い。かつ、 当該ペプチドがタンパク質を細胞内及び/又は核内に輸送することができることを意 味する。任意のアミノ酸とは特に限定されないが、望ましいのは塩基性アミノ酸 (アル ギニン、ヒスチジン、リジン）、トリプトファン、プロリン、グリシン、システィンおよびァラ ニンであり、さらに望ましいのはグリシン、システィンおよびアルギニンである。その個 数は特に限定されない。
[0013] B- X- Z- X- Arg- Z- Tyr- J- X- O1- X- Arg- O2- X- Xまたは X- X- O1- Arg- X- O2- X- J- Ty r-Z-Arg-X-Z-X-Bのアミノ酸配列によって表されるペプチドの中でさらに望ま Uヽぺ プチドとしては、配列表の配列番号 1から 34で示されるアミノ酸配列力 なる L体もしく は D体のペプチドおよびその逆鎖ペプチドが挙げられる。さらに望まし 、ペプチドとし ては、配列表の配列番号 1、 2、 4、 7、 8、 9、 10、 11、 13、 17、 18、 19、 20、 22、 24、 25、 2 6、 27、 28、 29、 30、 32、 33または 34で示されるアミノ酸配列からなる L体もしくは D体の ペプチドが挙げられる。最も望ましいのは、配列表の配列番号 1、 7、 8、 9、 11、 13、 17 、 18、 19、 20、 22、 25、 26、 27、 29、 30、 32、 33または 34で示されるアミノ酸である。
[0014] 本発明にお 、て逆鎖ペプチドとは、ある配列、例えば (N末端) -A-B-C-D- (C末端 )の N末端力も C末端のアミノ酸の並びを逆にすること、すなわち（N末端) -D-C-B-A- (C末端)としたペプチドのことを指す。
[0015] 本発明にお 、てペプチドとはまた、前述のペプチド以外に配列表の配列番号 35か ら 47のいずれかで示される L体もしくは D体のペプチドおよびその逆鎖ペプチドを有 するペプチドが挙げられる。このペプチドにおいて特に望ましいのは、配列表の配列 番号 35、 36、 38、 39、 42、 43、 45、 46または 47で示されるアミノ酸配列からなる L体もし くは D体のペプチドである。
[0016] L体もしくは D体のペプチドおよびその逆鎖ペプチドを有するとは、配列表の配列番 号 35から 47のいずれかで表される 15個のアミノ酸配列の C末端側および/または N末 端側に任意にアミノ酸を 1個あるいは複数個有することを意味する。かつ、当該ぺプ チドがタンパク質を細胞内及び/又は核内に輸送することができることを意味する。任 意のアミノ酸とは特に限定されないが、望ましいのは塩基性アミノ酸 (アルギニン、ヒス チジン、リジン）、トリプトファン、プロリン、グリシン、システィンおよびァラニンであり、さ らに望ましいのはグリシン、システィンおよびアルギニンである。その個数は特に限定 されない。
[0017] さらに、本発明の配列表の配列番号 1から 47で示されるペプチドとしては、 1個又は 2個以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を 有するペプチド又はそれらを組み合わせたアミノ酸配列を有するペプチド等が含ま れる。かつ、当該ペプチドが細胞移行能を有することを意味する。この場合において
、アミノ酸が挿入、欠失若しくは置換していても配列表の配列番号 1から 47に記載の ペプチドと同等程度の頻度でタンパク質を細胞内及び/又は核内に輸送することが できるアミノ酸配列である場合が挙げられる。アミノ酸が挿入、欠失又は置換されてい る場合、その挿入、欠失又は置換の位置としては、特に限定されない。
[0018] 本発明にお 、ては特に、 B-X-Z-X-Arg-Z-Tyr-J-X-O -X-Arg-O'-X-Xの配列で 表されるアミノ酸の C末端のアミノ酸を、 3個欠失させたペプチドも含まれる。 C末端の アミノ酸を、 1個または 2個欠失させたペプチドでも良 、。
[0019] ここで、配列表の配列番号 1から 47で示されるアミノ酸配列力 なるペプチドは、こ れまで報告されて 、る既知の PTDとはホモロジ一のな!、新規の配列であり、これまで 報告されているヒト cDNA配列とも相同性は認められなカゝつた。
[0020] 本発明のペプチドは、公知のペプチドの合成法に従って作製することができ、置換 、付加又は欠失は、保護アミノ酸の種類を変えることによって容易に行うことが出来る 。また、 D-アミノ酸やサルコシン (N-メチルグリシン)等の特殊なアミノ酸を導入するこ ともできる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法等が挙げ られ、合成反応後は、通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフ ィー、液体クロマトグラフィー又は再結晶などを組み合わせることにより、本発明で用 V、られるペプチドを精製単離することができる。
[0021] 公知のペプチド合成法としては、例えば、以下の (i)〜 (V)に記載された方法が挙 げられる。
(i) M.Bodanszkyおよび M.A.Ondettiゝペプチド 'シンセシス (Peptide Synthesis) , In terscience Publishers, New York, (19o6年)
Schroederおよび Luebke、ザ、ペプチド (The Peptide, Academic Press, NewYorkl 965年）
(iii)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善 (株）（1975年）
(iv)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学 IV、 205、 (1 (v)矢島治明監修、続医薬品の開発、第 14卷、ペプチド合成、広川書店 (2)塩基配列及び DNA
本発明にお 、て DNAとは、配列表の配列番号 1から 47の!、ずれかに記載のァミノ 酸配列で表されるペプチドをコードする塩基配列からなる DNAが挙げられ、具体的に は、配列表の配列番号 48又は 49で示される塩基配列力 なる DNAが挙げられるが、 これに限定されるものではない。配列表の配列番号 48または 49で示される塩基配 列は、それぞれ配列表の配列番号 33または 34で示されるアミノ酸配列をコードするも のである。
[0022] 本発明にお 、て DNAとは、配列表の配列番号 1から 47の!、ずれかに記載のぺプチ ドをコードする塩基配列力 なる DNAの相補鎖とストリンジヱントな条件下でノヽイブリ ダイズする塩基配列カゝらなる DNAを含有するものである。
[0023] 本発明にお 、てストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする塩基配列とは、配列 表の配列番号 1又は 2に記載のペプチドをコードする塩基配列の相補鎖と約 80%以 上、好ましくは約 90%以上、さらに好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列 を含有するものである。ハイブリダィゼーシヨンは、公知の方法あるいはそれに準じる 方法、例えば、モレキュラー 'クロー-ング（Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al ., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法等に従って行うことが出来る。 ストリンジ ントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約 19mM力 約 40 mM、好ましく は約 19 mMから約 20 mMで、温度が約 50°Cから約 70°C、好ましくは約 60°Cから約 65 °Cの条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 65°Cの場合力もっとも 好ましい。
[0024] なお、本発明の塩基配列は、配列表の配列番号 1から 47に記載のペプチドをコード する塩基配列と約 50%以上の同一性が認められる配列を含む。好ましくは約 60%以 上、さらに好ましくは約 70%以上、さらに好ましくは約 80%以上、さらに好ましくは約 9 0%以上、より好ましくは約 95%以上の同一性を有する塩基配列を含有するものであ る。
[0025] また、本発明の塩基配列は、配列表の配列番号 1から 47に記載のペプチドをコード する塩基配列に塩基が挿入、欠失又は置換した塩基配列を含む。ここで、挿入、欠 失又は置換した塩基配列の数としては 1塩基又は 2塩基以上が挙げられ、例えば 1塩 基から 10塩基、好ましくは 1塩基から 5塩基が挙げられる。この場合において、塩基が 挿入、欠失若しくは置換していても配列表の配列番号 1から 47に記載のペプチドをコ ードする塩基配列と同等程度の頻度でタンパク質を細胞内及び/又は核内に輸送す ることができる塩基配列である場合が挙げられる。塩基が挿入、欠失又は置換されて いる場合、その挿入、欠失又は置換の位置としては、特に限定されない。
[0026] 本発明の DNAは、公知の方法に従い、合成が可能である。また、融合蛋白質をコ ードする cDNAを作成する場合にはプライマーを用いて PCR法で増幅することにより 得ることができる。
[0027] 本発明において使用することができるプライマーとしては、例えば、緑色蛍光蛋白 質である eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein)との融合蛋白質をコードする c DNAを作成する場合のプライマーが挙げられる。
(3)組換えベクター及び形質転換体
本発明において使用される組換えベクターとは、大腸菌（Escherichia coli)のような 原核細胞において発現可能なベクター（例えば、 pBR322、 pUC119又はこれらの派 生物）を挙げることができる。更に、真核細胞においては、酵母用発現ベクターとして は、例えば、 pAURl 12 (タカラノィォ社)等のプラスミドベクターを挙げることができる。 哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターとしては、例えば、 pcDNA3.1 (lnv itrogen社）のようなプラスミドベクター、 pDON- AI DNA (タカラバイオ社）等のウィルス ベクターを挙げることができる。
[0028] 本発明の組換えベクターは、これらの組換えベクターに、公知の方法により、本発 明の塩基配列を有する DNAの全部又は一部が組換えられたものである。
[0029] 組換えベクターを得るための方法としては、例えば、モレキユラ一 ·クロー-ング（Mo lecular Cloning) 2nd (J. sambrook et al.,し old Spring Harbor Lab. Press, 1989)【こ g己 載の方法等に従って行うことが出来る。
[0030] 本発明の形質転換体とは、本発明の組換えベクターを含有する形質転換体を示す 。宿主としては、大腸菌、酵母、動物細胞などを用いることができる。好ましくは大腸 菌である。また、栄養要求株、抗生物質感受性株を宿主とすることもできる。 [0031] 本発明の形質転換体は、公知の方法に従って作製することができる。例えば、プロ トプラストポリエチレングリコール法やエレクト口ポレーシヨン法等、モレキュラ^ ~ ·クロ ~~ニング (Molecular Cloning) 2nd (J- Sambrook et al., し old bpnng Harbor Lab. Pre ss, 1989)に記載の方法等に従って行うことが出来る。
[0032] (4)ペプチド結合物質
本発明において、ペプチド結合物質とは、下記のアミノ酸配列： B-X-Z-X-Arg-Z-T yr- J- X- O1- X- Arg- O2- X- Xまたは X- X- O1- Arg- X- O2- X- J- Tyr- Z- Arg- X- Z- X- Bで 示されるペプチドまたは配列表の配列番号 1から 47で示されるアミノ酸配列からなる ペプチド及び生理活性物質を含有するものが挙げられる。
[0033] 本発明における下記のアミノ酸配列： B- X- Z- X- Arg- Z- Tyr- J- X- 01- X- Arg- 02- X - Xまたは X- X- O1- Arg- X- O2- X- J- Tyr- Z- Arg- X- Z- X- Bで示されるペプチドまたは 配列表の配列番号 1から 47で示されるペプチドは、細胞膜透過ペプチドとして利用 することができ、本発明のペプチドを生理活性物質に結合させることにより、当該生 理活性物質を細胞内及び Z又は核内に輸送することができる。より好ましくは、生理 活性物質を細胞内に輸送することが挙げられる。ここで細胞としては動物細胞が挙げ られ、特にヒト細胞が挙げられる。ヒト細胞であれば、付着性細胞でも浮遊細胞でもよ く、生体内で各器官を構成して 、る細胞であっても良 、。
[0034] 本発明にお ヽて、生理活性物質とは、生理活性を有するタンパク質、生理活性を 有するペプチド、薬剤封入リボソーム、ポリエチレングリコールイ匕薬剤封入リボソーム（ 以下「PEG化薬剤封入リボソーム」と称することもある。）、低分子化合物、核酸、マグ ネティックビーズ、ナノゲージパーティクルまたはファージが挙げられる。
[0035] ここで、生理活性を有するタンパク質とは、疾患の治療、予防及び Z又は診断用の ためのタンパク質等が挙げられ、約 lOKDaから約 500KDaのタンパク質が挙げられ、 特に望ましいのは約 lOKDaから約 120KDaのタンパク質が挙げられる。具体的には、 酵素、抗体、転写因子等やその部分ペプチドが挙げられるが、これに限定されるもの ではない。酵素としては、 SOD (Molecules and Cells 2005, 19, 191-197, W.S.Eum et al.)等が挙げられる。抗体としては、細胞内の蛋白質に対する抗体、単鎖抗体やウイ ルス等の外来蛋白質に対する抗体等が挙げられる（Current Molecular Medicine 200 4, 4, 519-528, M.N. Lobato and T.H.Rabbitts, Molecular Therapy 2003, 8, 355—366 , Y.Y. Wheeler et al.等）。転写因子としては mi転写因子（microphthalmia- associated transcripution factor :以下「MITF」と称することもある。）等が挙げられる。ここで、 Ml TFとは、生体内に存在する転写制御因子の一種であり、マスト細胞に特有な c-kit遺 伝子発現調節能を有するタンパク質である。具体的には、特開 2004 - 201547号公 報に記載の各種 MITFが挙げられる力 これに限定されるものではない。
[0036] 本発明にお 、て生理活性を有するポリペプチドとは、疾患の治療、予防及び/又は 診断用のためのペプチド等が挙げられ、 2個から 100個のアミノ酸数のペプチドが挙 げられ、特に望ましいのは 4個力 30個のアミノ酸数のペプチドが挙げられる。具体的 には、 HSP(Heat Shock Protein)20アナログペプチド（J Appl Physiol 98: 1836-1845, 2005)、 KLAK抗菌ペプチド（Cancer Research 61 , 7709-7712, 2001)、 HIF- 1 a (Pro c Natl Acad Sci USA 99: 10423-10428, 2002)、 PKC (Protein Kinase C) δ阻害ぺプ チド（Proc Natl Acad Sci USA 98: 11114-11119, 2001)、 VIVIT (Nature Medicine 10: 305-309, 2004)などが挙げられる力 これに限定されるものではない。
[0037] 本発明にお 、てリボソームとは、小さな一枚膜リボソーム（以下「SUV」と称することも ある。）、大きな一枚膜リボソーム（以下「LUV」と称することもある。）、または多重層リ ポソーム（以下「MLV」と称することもある。）等が挙げられ、好ましくは SUVまたは LUV が挙げられる。さらに、薬剤封入リボソームとしては、ジクロフェナクナトリウム、ドブラ マイシン等の抗炎症薬等が上記のようなリボソーム内に封入されたものが挙げられる
[0038] 本発明において PEGィ匕薬剤封入リボソームとは、リボソームの表面にポリエチレング リコール (PEG)が結合した薬剤封入リボソームが挙げられる。
[0039] 本発明における薬剤封入リボソーム又は PEG化薬剤封入リボソームは、特開平 4—
346918号公報、特開平 10— 29930号公報、国際公開第 97/29128号パンフレツ ト又は国際公開第 01/064743号パンフレットなどに記載の方法により作製すること ができる。
[0040] 本発明において低分子化合物としては、例えば、ジクロフェナクナトリウム、ドプラマ イシン、サイクロスポリン等の抗炎症薬等が挙げられる。 [0041] 本発明にお 、て核酸とは、例えばプラスミド、疾患関連遺伝子に関する siRNAゃァ ンチセンス DNAが挙げられる。
[0042] 本発明にお 、てマグネティックビーズとは、例えばスーパーマグネティックイオンォ キサイドパーティクルを T細胞、 B細胞、マクロファージに導入して細胞の局在を MRI で追跡することが挙げられる（Advanced Drug Delivery Reviews 57: 637-651, 2005)
[0043] 本発明においてナノゲージパーティクルとは、例えばナノサイズのパーティクル内に 蛋白質、低分子化合物、核酸、多糖類等を封入したものが挙げられる。（Advanced D rug Delivery Reviews 57: 0ύ7- 651, 2005)。
[0044] 本発明にお 、てファージとは、例えば種々の cDNA発現ユニットを組み込んだ M13 ファージが挙げられる（Advanced Drug Delivery Reviews 57: 529-546, 2005)。
[0045] 本発明にお 、て、本発明のペプチド、及び、上記のような生理活性を有するタンパ ク質を含有するペプチド結合物質は、当該物質をコードする DNAを含む組換えべク ターを用いて形質転換された宿主細胞を培養し、それにより産生されたタンパク質を 高速液体クロマトグラフィー（HPLC)等の方法により単離することにより得ることができ る。このとき用いられる DNAとしては、本発明のペプチドをコードする遺伝子と、上記 のような生理活性を有するタンパク質または生理活性を有するポリペプチドをコード する遺伝子を融合させた DNAであっても良い。あるいは、本発明のペプチド及び生 理活性を有するタンパク質を含有するペプチド結合物質は、それぞれの遺伝子を発 現させて本発明のペプチド、および、生理活性を有するタンパク質または生理活性を 有するポリペプチドをそれぞれ取得し、化学反応による融合を行っても良い。化学反 応による融合としては、システィン残基を利用したジスルフイド結合等が挙げられる。 その他、本発明のペプチド及び生理活性を有するタンパク質を含有するペプチド結 合物質は、化学的架橋剤を用いる方法により作製することができる。この場合におい て、本発明のペプチド及び生理活性を有するタンパク質の機能活性部位を架橋する ことがないようにすることが好ましぐ化学的架橋方法としては、特開平 10— 33186 号公報に記載されている方法等が挙げられる。
[0046] さらに、化学的架橋方法を用いることにより、本発明のペプチドを、薬剤封入リポソ ーム、 PEGィ匕薬剤封入リボソーム又は低分子化合物に結合させることもできる。
[0047] 本発明におけるペプチドを薬剤封入リボソーム又は PEGィ匕薬剤封入リボソームに結 合させることによってリボソーム内に封入した薬剤を細胞内にデリバリーすることがで きる。本発明におけるペプチドを結合させる方法としては、例えば、 N末端あるいは C 末端にシスティン残基を導入し、 SH基を介してマレイミド基を持つ薬剤封入リポソ一 ムもしくは PEG化薬剤封入リボソームに結合する方法等が挙げられる。
(5)医薬
本発明のペプチド結合物質は、医薬として利用することが可能である。さらに、本発 明におけるペプチドを、生理活性物質に結合させることにより、目的の生理活性物質 を細胞内及び Z又は核内に輸送することができるため、結合させる生理活性物質の 種類により、様々な疾患の治療薬及び Z又は予防薬として利用することができる。本 発明のペプチドに結合させる生理活性物質としては、好ましくは、生理活性を有する タンパク質が挙げられる。より好ましくは、本発明のペプチドを MITF変異体に結合さ せることにより、抗アレルギー薬として利用することができる。
[0048] 本発明におけるペプチド結合物質を医薬として用いる場合には、公知の方法に従 つて製剤化し、投与することができる。例えば、そのまま液剤として又は適当な剤型の 医薬組成物として、ヒト又は哺乳類に対して経口的又は非経口的に投与することがで きる。
[0049] 液剤等の製造には、適当な溶剤または懸濁化剤を用いることができる。
[0050] 適当な剤型として、錠剤やカプセル剤を製造する際には、適当な賦形剤を用いるこ とができる。経口投与のための液体製剤、すなわちシロップ剤、懸濁剤、液剤等は、 一般的に用いられる不活性な希釈剤を含む。この製剤は、不活性な希釈剤以外に 補助剤、例えば湿潤剤、懸濁補助剤、甘味剤、香味剤、着色剤、保存剤、安定剤等 を含むことちできる。
[0051] 本発明におけるペプチド結合物質のヒトに対する投与量は年齢、体重、一般的健 康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組合せ、患者のその 時に治療を行って 、る病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して 決められる。例えば、投与量としては、約 0.01mg/Kg〜約 1.0mg/Kgが挙げられ、一日 あたり 1回ある 、はそれ以上に分けて投与することができる。
実施例
[0052] 以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に 限定されるものではない。
[0053] 実施例 1 合成ペプチドを用いた細胞膜透過試験
¾施例 1 -1 細胞内移行件ペプチド ,列の抽出
細胞内移行性ペプチド配列の濃縮は、特開 2005— 13073号公報に記載の方法 に従い、 Jurkat細胞（ATCC.NO.TIB-152)のライブラリーを用いて実施した。即ち、 15 アミノ酸のランダムペプチドを提示させたインビトロバイラス（以降 IVVと略す)ライブラ リー（ライブラリースケール 1012)を調整した後、 HeLa細胞 (ATCC.NO.CCL2)または Ju rkat細胞にライブラリーを添カ卩した。細胞内に移行した IWの cDNAを PCR法によって 回収した後、再度 IWを調製し、細胞に添加した。添カ卩回収の操作を繰り返すこと〖こ よって、ライブラリ一中に存在する「細胞内に移行するペプチド」の濃縮を行った。各 濃縮操作段階のどのライブラリーに細胞内移行ペプチドが濃縮されているカゝ確認す るために、濃縮操作 5回目から 8回目のライブラリーより任意に 11種類のアミノ酸配列 を選択し、ペプチドの細胞内移行能を調べた。
[0054] 実施例 1-2 共焦点顕微鎗解析
配列表の配列番号 50に記載の HIV TATタンパク質由来の PTDをポジティブコント口 ール（図 1から図 3中、「Positive」又は「TAT」と記載する）、配列表の配列番号 51に記 載の Ulo Langel.らによって報告 れて ヽる (し ell— Penetrating Peptides: Processes an d Applications, Series: Pharmacology and Toxicology: Basic and Clinical Aspects Vol ume:3,2002) TAT由来 PTDの変異体をネガティブコントロール（図 1中、「Negative」と 記載する）として、実施例 1-1にて選択された 11個の配列のペプチドの評価を行った
[0055] 実施例 1-1にて選択された 11個の配列のペプチドは、固相法により合成し、各ぺプ チドの N末端に 5,6-Carboxyfluoresceinをカップリングして蛍光標識した。さらに、 HPL Cによって純度が 70%以上になるように精製した。その後、蛍光標識した各ペプチド を 1 mMとなるように、 10% Dimethyl Sulfoxide(DMSO)に溶解した（以下、ペプチド溶 液という）。
[0056] ペプチドを取り込むための細胞としては、 CHO細胞 (ATCC.NO. CCL-61)、 HeLa 細胞、 Jurkat細胞の 3種を用いた。 CHO細胞、 HeLa細胞それぞれ 104個、及び、 Jurka t細胞 105個を 96穴プレートに植え込み 2、 3日培養した。その後、細胞がコンフルェン トになったところに、ペプチド溶液を各細胞に添加し、 1時間インキュベートした。各細 胞を PBSで 3回洗浄後、 100 Lの 0.25%トリプシン- ImM EDTA溶液を加え、トリプシ ン処理を室温で 5分間行った。 400 しの1¾3 (10% FCS)をカ卩え、トリプシンを中和し た後、 lmLの HBSS (Hanks' Balanced Salt SolutionZlnvitrogen社製）で 3回洗浄した 。洗浄後、細胞を Lの HBSSに懸濁し、共焦点顕微鏡で解析した。測定及び解析 は、共焦点微分干渉レーザー顕微鏡システム（Bio- Rad社， Radience2100/Green He -Ne, 488nm,顕微鏡： Nikon社， ECLIPSE E600)を用いて行った。
[0057] その結果、配列表の配列番号 33に記載の新規 PTD候補配列（図 1から図 3中、「KS Hl」と記載する）のペプチド力 最も細胞内移行性が高力つた。 KSH1ペプチド、ポジ ティブコントロールおよびネガティブコントロールの結果を図 1に示す。 CHO細胞、 He La細胞及び Jurkat細胞!/、ずれの細胞にお 、ても、 KSH1ペプチド由来の蛍光が観察 された。また、 KSH1ペプチド由来の蛍光強度は、ポジティブコントロールの蛍光強度 を上回っていた。さらに、細胞内に輸送されたペプチドは局在することはなぐ核、細 胞質の 、ずれにぉ 、ても検出された。
[0058] この結果より、 KSH1ペプチドは、細胞内へ移行することが明らかになった。また、そ の量は、従来知られている PTDである HIV由来の TATペプチドを上回ることが明らか となった。
[0059] さらに、 CHO細胞をスライドチャンバ一（Nunc社製）に植え込み、 KSH1ペプチド及 びポジティブコントロールの各ペプチドを 25 μ Μずつ CHO細胞に添カ卩し、細胞内移 行性を共焦点顕微鏡により確認した。
[0060] 結果を図 2に示す。
[0061] この結果より、 KSH1ペプチドは全ての CHO細胞内へ輸送されていることが明らか になった。
[0062] 実施例ト 3 フローサイトメトリー解析 1 mMに調整した各ペプチド溶液を、培地で 100 M、 50 M、 25 μ Μと 3段階希釈し て細胞に添カ卩した。細胞は CHO細胞、 HeLa細胞、 Jurkat細胞の 3種を用いた。ぺプ チド溶液を細胞に添加した後、 1時間インキュベートした。細胞を PBSで 3回洗浄後、 1 00 μ Lの 0.25%トリプシン- ImM EDTA溶液を加え、トリプシン処理を室温で 5分間行 つた。 400 しの1¾3 (10% FCS)をカ卩え、トリプシン処理をとめた後、 1 mLの HBSSで 3 回洗浄した。洗浄後、細胞を 500 μ Lの PBS (10% FCS)に懸濁して、 FACS Calibur(B ecton Dickinson)を用いてフローサイトメトリー (以下、 FACS)解析に供した。
[0063] 結果を図 3に示す。縦軸は細胞数を示し、横軸は蛍光強度を示す。
[0064] この結果より、 KSH1ペプチドはポジティブコントロールに比べ 3から 10倍の細胞内移 行性を示し、強力な移行能を持っていることが明らかになった。
[0065] M2 eGFP融合タンパク皙 用いた細胞内移行件の確認
¾施例 2- 1 His- eGFP 現ベクターの構签
PCR法により、 eGFP cDNA(eGFP- ΝΠ) (アマシャムフアルマシア社製）を铸型にして 、 His-Tagと制限酵素認識部位を有する「His-eGFP発現ベクター」の構築を行った。
[0066] PCRは、 Easy- A PCR kit (Stratagene社製）を用いて行った。テンプレートとなる eGF P cDNA(eGFP_NII)DNAを 200 ng/mLに希釈した。プライマーとして使用する合成 DN Aを 20 μ Μに調整した。テンプレート、 Fwプライマー、 RVプライマーを各 1 1、 10 1の Easy— A PCR buffer、 8 μ Lの dNTPs(2.5 mM)、 0.5 μ Lの Easy— Aを混合し、滅菌蒸留 水で 100 μ Lにメスアップした。 PCRによる増幅条件は以下の様に行った。 94°Cで 2分 間を 1 cycle、 94°Cで 30秒間、 60°Cで 30秒間、 72°Cで 2分間を 30 cycle行った。
[0067] ここでは、配列表の配列番号 116に記載の Fwプライマー（Nco- His-GFP-f)と配列 表の配列番号 117に記載の Rvプライマー（GFP-Rev-Bam)を用いて PCRを行った。
[0068] 次に、ベクターへのクローユングのために、 PCR増幅断片を制限酵素 Ncolと BamHI で消化し、 0.8kbの DNA断片を回収した。回収した DNA断片を pET14bに挿入した。こ のようにして構築した「His-eGFP発現ベクター」は、 T7プロモーターの制御下に His-e GFP融合タンパク質が発現するベクターである。
[0069] 実施例 2- 2 His-新規 PTD候補配列- eGFP発現ベクターの構築
PCR法により、 eGFP cDNA(eGFP- ΝΠ)を铸型にして、 His- Tag、新規 PTD候補配列 及び制限酵素認識部位を有する「His-KHSl-eGFP発現ベクター」の構築を行った。
[0070] 配列表の配列番号 118に記載の Fwプライマー（KSH-kp-nd-GF-f)と配列表の配列 番号 117に記載の Rvプライマー（GFP- Rev- Bam)を用い PCRを行った。増幅断片を铸 型として更に、配列表の配列番号 119に記載の Fwプライマー（KSH-kp-nd-f2)と配列 表の配列番号 117に記載の Rvプライマー（GFP-Rev-Bam)を用いて PCRを行った。
[0071] その後、ベクターへのクローユングのために、 PCR増幅断片を制限酵素 Ncolと Bam HIで消化し、 0.8kbの DNA断片を回収した。回収した DNA断片を pET14bに挿入した。
[0072] このようにして構築した「His-KHSl-eGFP発現ベクター」は、 T7プロモーターの制御 下に His- KSHl-eGFP融合タンパク質が発現する。
[0073] ¾施例 2-3 eGFP融合タンパク皙の調製
実施例 2-1及び 2-2でそれぞれ構築した「His-eGFP発現ベクター」及び「His- KSH ト eGFP発現ベクター」で、大腸菌 B株由来 BL21LysS株をそれぞれ形質転換した後、 各形質転換体を 20 mLの LBで前培養した (37°C、 15時間）。
[0074] 前培養液を 1 Lの LBに 2%植菌し、 37°Cで 2.5時間培養した。終濃度 1 mMの IPTGを 添加し、更に 4時間培養を行った。遠心（4000 rpm、 20 min 日立 himac CR7)して菌 体を集めた後、 50 mLの PBSに懸濁した。さらに遠心（3500 rpm、 20 min KUBOTA 52 00)し菌体を集めた。その後、菌体を 30 mLの PBSに懸濁し、凍結融解を 3回行った。 DNase溶液（ベンゾネース タカラバイオ NV677)を 15 μ Lカ卩ぇ室温で 10分間インキュ ペートした後、遠心（18000 rpm、 20 min TOMY UD-201)し、上清を回収した。上清 を PBSで平衡化した Nト NTAカラム（キアゲン 30430)にアプライした。 50 mLの 10 mM イミダゾールを含む PBSでカラムを洗浄した後、 200 mMイミダゾールを含む PBS 4 mL で溶出した。溶出液 15 μ LをSDS-PAGE (PAGミ-、 4-20% gradien t gel、第一化学薬 品）により電気泳動を行い、泳動後のゲルをクイック CBB (和光純薬、 299-50101)を 用いて染色し、タンパク質の検出を行った。
[0075] この結果、 His-KSHl-eGFP融合タンパク質及び His-eGFP融合タンパク質に相当 する目的のサイズのバンドが検出された。
実施例 2- 4 KSH1融合タンパク皙の細胞内移行の確認
CHO細胞を用 、て各融合タンパク質の細胞内移行試験を行つた。 [0076] CHO細胞、 HeLa細胞を 96穴プレートに 1穴当り 104個植え込み 2日後にコンフルェ ントになった状態で使用した。細胞を MEM培地で 3回洗浄後、 His-新規 PTD候補配 列- eGFP融合タンパク質を含むペプチド溶液及び His-eGFP融合タンパク質を含む ペプチド溶液をそれぞれ 100 L添カ卩し、 37°Cで 1時間インキュベートした。 PBSで 3回 洗浄後、トリプシン処理によって細胞を回収した。回収した細胞を MEM培地で 1回、 P BS (10% FCS)で 3回洗浄後、 100 しの1¾3 (10% FCS)に懸濁し共焦点顕微鏡観察 に供した。
[0077] 共焦点顕微鏡観察の結果、 His-新規 PTD候補配列- eGFP融合タンパク質を含む ペプチド溶液を添加した細胞においては、細胞内に eGFPに由来する蛍光が検出さ れた。
[0078] 結果を図 4に示す。
[0079] この結果より、当該 His-新規 PTD候補配列- eGFP融合タンパク質（図 4中、「KSH1」 と記載する）力 細胞内に輸送されることが明らかになった。一方、 His-eGFP (図 4中 、「His」と記載する）の細胞内への輸送は検出されなかった。
[0080] さらに、 His-新規 PTD候補配列 -eGFP融合タンパク質は、ドット状に検出されたこと より、エンドノームに局在していることが明ら力となった。これは、実施例 1-2に示すよう なペプチド単体が細胞内において非局在化することとは異なるものである。 PTD融合 タンパク質は、マクロピノサイト一シスによって細胞内へ取り込まれエンドノームに局 在化することが報告されている（J Control Release. 2005 Jan 20;102(1):247-53 Catio nic TAT peptide transduction domain enters cells by macropinocytosis . Kaplan IM, Wadia JS, Dowdy SF.)。すなわち、新規 PTD候補配列は、他の PTDペプチドと同様 のメカニズムによって細胞膜を透過することが示唆された。
[0081] 実窗列 3 B 栾 PTD§R列の合成ペプチド 用いた細朐内移行試験
以下実施例中および図中にお 、て、各ペプチドの名称に対応する配列表の配列 番号は、表 1 1および表 1 2に示す通りである。
[0082] [表 1] 表 1一
荬施例及び図における
配列表の配列番号 表 δ
KSHt-1 ί
KSH卜 2 2
KSH -3 3
KSH1-4 4
KSH1-5 5
KSH1-6 6 SH1-7 7
KSH1-8 8
KSH1-9 9
KSH1-11 10
KSH1-12 11
KSH1-13 12
KSH1-14 13
KSH1-15 14
KSH1-16 15
KSH1-17 16
KSH -18 17
KSH1-19 18
KSH1-20 19
KSH1 21 20
KSH1-22 21
KSH1-23 22
KSH1-24 23
KSH1-25 24
KSH1-26 25
KSH1-27 26 2] 表 1 2
KSH1-28 27
KSHト 29 28
KSH1-30 29
KSH1-33 30
KSH1-34 31
KSH1-35 32
KSH1 33
KSH1-36 34
KSH3 35
KSH4 36
KSH5 37
KSH6 38
KSH7 39
KSH8 40
KSH9 41
KSH10 42
KSH2 43
KSH2-1 44
KSH2-2 45
KSH2-3 46
KSH2-4 47
Positive 又は TAT 50
Negative 51 実施例 3-1 KSH1- 1から KSH1- 9についての解析
KSH1ペプチド（配列表の配列番号 33)の一次配列を Wheel構造予測（Trends Gene t. 16(6): 276-7, 2000)したところ、リジン/アルギニンクラスターが形成されること、トリ ブトファンが 2個存在すること、リジッドなアミノ酸であるプロリンが含まれることおよびク ラスター形成には関与しないが、トリブトファンの隣に位置するアルギニンの存在が特 徴的であった。そこでこれらの特徴的な配列の細胞内移行における意味合 、を確認 するために、配列表の配列番号 1から 9を設計した（図 5)。それぞれのペプチドを実施 例 1-2と同様の方法で合成、蛍光標識、精製および溶解し、 CHO細胞内への移行試 験を行い、共焦点顕微鏡解析および FACSによって評価を行った。 FACS解析は実施 例 1-3と同様に行った。 KSH1ペプチドと、改変 PTD配列である KSH1-1から KSH1-9の ペプチド (配列表の配列番号 1から 9)について、 FACS解析による蛍光強度を図 6に 示す。ペプチドの添加濃度は 50 μ Μ, 25 μ Μ、 12.5 μ Μおよび 6.5 μ Μであった。
[0085] リジン/アルギニンクラスターのリジンをアルギニンに置換する（KSH1-1)と 50 μ Μの 濃度では KSH1に比べ移行効率が約 20%減少したが、ペプチドの濃度を下げると、 Κ SH1に比べ細胞内移行は亢進された（25 Μでは約 2倍、 12.5 Μでは約 8倍、 6.25 μ Μでは約 2倍)。このことからリジン/アルギニンクラスターの重要性が明らかになつ た。
[0086] 次に KSH1に 3個存在するアルギニンの中でクラスター形成に関与して 、な 、アル ギニンの役割を調べるためにァラニンに置換した。アルギニンをァラニンに置換する と細胞内移行は著しく低下し、 50 Μでの細胞内移行が検出されたのみであった (Κ SHl-3)。このトリブトファンの近傍に存在するアルギニンが細胞内移行に重要な役割 を果たしていることが明らかになった。
[0087] ペプチドの立体構造に影響すると考えられるプロリンの意義を調べるためにァラ- ンに置換した力 細胞内移行性に影響は認められな力つた。 （KSHト 2)。
[0088] KSH1に特徴的なアミノ酸であるトリプトファンは 2個存在しており、 Wheel構造上はリ ジン/アルギニンクラスターの対極にスレオニンを挟んで位置して!/、る。 2個のトリプト ファンを両方ァラニンに置換すると全く細胞内移行が認められなくなった (KSH1-6)。 このことからトリブトファンが細胞内移行に重要であることが分力つた。
[0089] トリブトファンの数を増やすことによって細胞内移行性に変化が認められるかどうか を調べた。スレオニンをトリブトファンに置換して、トリブトファンクラスターを形成させる と（KSH1- 7)細胞内移行性は著しく亢進した。 KSH1と比べると 25 μ Μ〜6.15 μ Μの間 では 3倍以上、 12.5 Μでは 10倍以上の細胞内移行が検出された。移行性の亢進は KSH1-1と同様のプロファイルを示した。一方、 3個のトリプトファンを Wheel構造上、均 等に配置しても細胞内移行は変化しな力つた (KSHl-4)。このことから、トリブトファン クラスターを形成させたことによって細胞内移行性が亢進したと考えられた。
[0090] トリブトファンクラスターを形成することによって移行性が亢進したので、さらに、 KSH 1-1の結果を踏まえて、リジンをアルギニンに置換したところ（KSHl-8)、 での 細胞内移行は低下した力 25 M以下での移行が亢進した。トリブトファンクラスター を大きくすることによって細胞内移行が亢進すると予想されたので、トリブトファンを 4 個に増やしたが（KSH1-9)、 KSH1-8と同様の傾向を示した。
[0091] 実施例 3- 2 KSH1- 11から 1- 23および KSH1- 35についての解析
どのアミノ酸が細胞内移行に重要であるかを調べるために、 KSH1-1を基本として網 羅的なァラニン置換を行い、 KSH1-11 (配列表の配列番号 11)から KSHl-23 (配列表 の配列番号 22)および KSH1-35 (配列表の配列番号 32)を設計した（図 7)。それぞれ のペプチドを実施例ト 2と同様の方法で合成、蛍光標識、精製および溶解し、 CHO 細胞内への移行試験を行 ヽ、共焦点顕微鏡解析および FACSによって評価を行った 。 FACS解析は実施例 1-3と同様に行った。 KSH1と、改変 PTD配列である KSH11-11 力も 23および KSH1-35について、 FACS解析による蛍光強度を図 8に示す。ペプチド の添加濃度は 50 M、 25 M、 12.5 μ Μおよび 6.5 μ Μであった。
[0092] アルギニンおよびトリブトファンをァラニンに置換した場合、明らかに細胞内移行が 低下した。また、 7番目のタイ口シンをァラニンに置換すると殆ど細胞内移行が見られ なくなり（KSH1-17)、細胞内移行に重要であることがわかった。 1番目のアルギニンを ァラニンに置換してもそれほど細胞内移行は低下しな力つた (KSH1-11)。他のアル ギニンについてはァラニンへの置換によって細胞内移行は低下したものの（KSH1-1 5および KSH 1-22)、 13番目のアルギニンの置換（KSH1-3)に比べると細胞内移行の 低下は小さ力つた。
[0093] トリブトファンに関しても 3番目より 6番目のトリブトファンの方が細胞内移行に重要で あった（KSH1-13、 KSHl-6)。これらのことから 13番目のアルギニンと 6番目のアルギ ニンおよび 7番目のタイ口シンが細胞内移行に重要な役割を果たしていると考えられ 、その他のアミノ酸は細胞内移行には寄与が小さいと考えられた（KSHl-11, KSH1-1 2, KSH1-14, KSH1-19, KSH1-20, KSH1-23, KSH1— 35)。
[0094] 唯一、ァラニン置換で細胞内移行が亢進したのは 8番目のセリンをァラニンに置換 した場合のみであった。
[0095] 実施例 3- 3 KSH1- 24から 1- 26および KSH1- 28から 1- 30につ ヽての解析
2個のトリプトファンを他の疎水性アミノ酸に置換する試みを行 、、 KSH11-24(配列 表の配列番号 23)から KSHl-26(配列表の配列番号 25)および KSHl-28(配列表の配 列番号 27)から KSH1-30 (配列表の配列番号 29)を設計した（図 9)。
[0096] それぞれのペプチドを実施例 1-2と同様の方法で合成、蛍光標識、精製および溶 解し、 CHO細胞内への移行試験を行い、共焦点顕微鏡解析および FACS解析によつ て評価を行った。 FACS解析は実施例 1-3と同様に行った。 KSH1と、改変 PTD配列で ある KSH11-24から 1-26および KSH1- 28から 1-30について、 FACS解析による蛍光強 度を図 10に示す。ペプチドの添加濃度は 50 μ Μ, 25 μ Μ、 12.5 μ Μおよび 6.5 μ Μで あった。
[0097] まず、ロイシン（KSH1- 24)、フエ-ルァラニン（KSH1- 25)およびイソロイシン（KSH1- 26)に置換したところ、ロイシンでは細胞内移行は低下した力 フエ-ルァラニンおよ びイソロイシンでは KSH1-1とほぼ同等であった。そこで、 KSH1-18を参考に KSH1-26 の 8番目のセリンをァラニンに置換したものを設計してみた力 細胞内移行は殆ど亢 進しなかった。
[0098] さらに、 2個のトリプトファンを別の疎水性アミノ酸であるパリンおよびタイ口シンに置 換したところ（KSHl-29、 KSH1-30)、パリンでは若干細胞内移行は低下した力 タイ 口シンでは良好な細胞内移行を示した。これらの結果をまとめると、トリブトファンに変 わる疎水性アミノ酸ではイソロイシン、タイ口シン、フエ-ルァラニン、ノ リン、ロイシン の順に細胞内移行が良好であった。実施例 3- 4 KSH1- 27.KSH1- 33.KSH1- 34およ び KSH1-36についての解析
KSHl-27 (配列表の配列番号 26)、 KSHl-33 (配列表の配列番号 30)、 KSHl-34 ( 配列表の配列番号 31)および KSH1-36 (配列表の配列番号 34)を設計した（図 11)。
[0099] それぞれのペプチドを実施例 1-2と同様の方法で合成、蛍光標識、精製および溶 解し、 CHO細胞内への移行試験を行い、共焦点顕微鏡解析および FACS解析によつ て評価を行った。 FACS解析は実施例 1-3と同様に行った。 KSH1と、改変 PTD配列で ある KSH1- 27,KSH1- 33,KSH1- 34および KSH1- 36につ!/、て、 FACS解析による蛍光 強度を図 12に示す。ペプチドの添加濃度は 50 μ Μ, 25 μ Μ、 12.5 μ Μおよび 6.5 μ Μ であった。
[0100] KSH1-18の結果を参考に、セリンおよびスレオニンをすベてァラニンに置換したが
(KSHl-27)、 KSH1-1に比べると細胞内移行は若干低下した力 低濃度での移行は ほぼ同等であった。
[0101] KSH1-3で、 Wheel構造上 6番目のトリプトファンの近傍に存在するアルギニン（13 番目）をァラニンに置換することによって、細胞内移行が殆ど認められなくなった。そ こで KSH1-33では Wheel構造上でアルギニンがトリプトファンの近傍にあることが重要 であるのか、 13番目の位置にあることが重要であるのかを調べるため、 13番目のアル ギニンをァラニンに置換し、 10番目のスレオニンをアルギニンに置換した。その結果、 細胞内移行は殆ど配列表の KSH1-1と同等以上であった。このことから、 Wheel構造 上で 6番目のトリプトファンの近傍にアルギニンがあることが重要であることと結論され た。
[0102] さらに KSH1-34では 3番目のトリプトファン近傍にアルギニンが存在すれば 13番目 のアルギニンは必要なくなるか否かを調べるため、 Wheel構造上、 3番目のトリプトファ ンの近傍に存在する 14番目のタイ口シンをアルギニンに置換してみた。その結果細 胞内移行はかなり低下したため、 Wheel構造上で 6番目のトリブトファンの近傍にアル ギニンが存在することが細胞内移行には必須であると結論された。
[0103] KSH1-36は KSH1の逆鎖ペプチドであるが、 KSH1に比べると、高濃度での細胞内 移行は亢進して 、るが、低濃度では逆に細胞内移行は低下する傾向が認められた。
[0104] 実施例 3-5 HeLa細朐および. Turkat細朐における細朐内移行実験
CHO細胞と同様に HeLa細胞でも改変 PTD配列の合成ペプチドの細胞内移行実験 を、共焦点顕微鏡解析によって行った。 CHO細胞と比較すると全体的に細胞内移行 は低かった力 傾向は CHO細胞とほぼ同じであった。但し、 HeLa細胞では CHO細胞 に比べて KSH1-7の細胞内移行が低ぐ逆に KSH1-16の細胞内移行が若干高かった 。結論として HeLa細胞で KSH1に比べて良好な細胞内移行が認められた改変体ぺ プチドは KSH1- 1 , KSH1-8, KSH1-9, KSH1- 18, KSH1- 20および KSH1- 33であった。
[0105] Jurkat細胞でも同様に、改変 PTD配列の合成ペプチドの細胞内移行実験を、共焦 点顕微鏡解析によって行った。 CHO細胞と比較すると全体的に細胞内移行はかなり 低くかった力 傾向は CHO細胞および HeLa細胞とほぼ同じであった。ただし、トリプト ファンを他の疎水性アミノ酸に置換した場合はかなり細胞内移行が低下した。結論と して Jurkat細胞で配列表の配列番号 37に比べて良好な細胞内移行が認められた改 変体ペプチドは配列表の配列番号 KSH1-1, KSH1-7, KSH1-8, KSH1-9, KSH1-12, KSH1-14, KSH1-18, KSH1-20, KSH1- 21および KSH1- 33であった。
[0106] 実施例 3-1から 3-5の結果から図 13に示す配列が導かれた。図中 Bはアルギニンま たはリジンであり、 01または 02のいずれかがアルギニンであり、 Zは疎水性アミノ酸で あり、 Jはセリンまたはァラニンであり、かつ Xは任意のアミノ酸である。
[0107] m 改 PTDPP,歹 II^GFP融合 白皙の CHO細胞における細胞内移行試験
¾施例 4-1 eGFP融合 白皙発現ベクター構签
eGFP融合タンパク質を用いた細胞内移行の評価に際しては、 2種類のインサート（ 図 14における Cおよび Dタイプ）を作成した。
[0108] インサート増幅のためのプライマー設計に当たっては、 eGFPの N末または C末に His -Tag, PTD配列がインフレーム付カ卩できるように設計した。また、 His-Tagおよび PTD 配列の前後にはそれぞれ GGGSまたは GGGSSのリンカ一をコードするように設計を行 つた。 PTD部分は HIV TAT由来の PTD1をコードする DNA配列を用いた。さらに、 PT D部分をコードする GGGSおよび GGGSSリンカ一の DNA配列部分にはそれぞれ制限 酵素 BamHI、 Xholの認識配列ができるようにした。
[0109] プライマー設計
インサート構成 C (図 14の Cタイプ）
フォワードプライマー C-F (配列表の配列番号 52) 5， -GCC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC- 3'
リバースプライマー C- Rl (配列表の配列番号 53) 5，- CAC CGC GGC GAC GTT GTC GTC GTT TCT TCC TGC CGT AGG ATC CCC CTC CCT TGT ACA GCT CGT CCA TGC C-3'
リバースプライマー C-R2 (配列表の配列番号 54) 5，- CGC TCA GCG TCG ACT C AC CCG TGA TGA TGG TGG TGA TGA CTC GAG CCG CCA CCG CGG CGA CGT TGT CGT-3
インサート構成 D (図 14の Dタイプ）
フォワードプライマー D-F (配列表の配列番号 55) 5， -AAG CCA TGGGAG GGG G ATCCT ACG GCA GGA AGA AAC GAC GAC AAC GTC GCC GCG GTG GCG GCT CGA GTA TGG TGA GCA AGG GCG AGG A- 3'
リバースプライマー D-R (配列表の配列番号 56) 5，- CCG CTC AGC GTC GAC TC
ACCC GTG ATG ATG GTG GTG ATG AGA ACC ACC ACC CTT GTA CAG CT
C GTC CAT GCC- 3'
これによつて、 PTD部分を BamHIと Xholで切断し、合成 DNAと入れ替えることが可能 である。 eGFPを铸型として上記配列表の配列番号 52から 56を用い、 pET14bの Ncolと
Bpull02淛限酵素認識配列間に挿入した（図 15)。
[0110] 改変 PTD配列の挿入に当たっては表 2— 1および表 2— 2に示した合成オリゴを用 い、図 16に示した方法で行った。
[0111] [表 3]
*2 - 1
Figure imgf000028_0001
4]
表 2— 2
Figure imgf000029_0001
[0113] ネガティブコントロールとしては、 eGFPを铸型に配列表の配列番号 52と 56のプライ マーセットで増幅した C末端に Hisだけを付加したものを用いた。
[0114] 構築した発現ベクターで大腸菌 B株由来 BL21/LysS株を形質転換した後、各形質 転換体を 20 mLの LBで前培養した (37°C、 15時間）。前培養液を 1 Lの LBに 2%植菌 し、 37°Cで 2.5時間培養した。終濃度 1 mMの IPTGを添カ卩し、更に 4時間培養を行った 。遠心（4000 rpm、 20 min 日立 himac CR7)し菌体を集めた後、 50 mLの PBSに懸濁 した。遠心（3500 rpm、 20 min KUBOTA 5200)し菌体を集めた。菌体を 30 mLの HBS Sに懸濁後、凍結融解を 3回行った。 DNase溶液（ベンゾネース タカラバイオ NV677 )を 15 μ L加え室温で 10分間インキュベートした。遠心（18000 rpm、 20min TOMY UD -201)し、上清を回収した。上清を HBSSで平衡ィ匕した Ni-NTAカラムにアプライした。 カラムを 50 mLの 10 mMイミダゾールを含む HBSSでカラムを洗浄した後、 200 mMイミ ダゾールを含む HBSS 4 mLで溶出した。
[0115] 実施例 4- 2 ¾^PTDffi列 eGFP融合 白皙の CHO細朐における細朐内移行
CHO細胞を用いて融合蛋白質の細胞内移行を調査した。 CHO細胞を 48穴プレー トに 1穴当り 2xl04個植え込み、コンフルェントになった状態で使用した。細胞を MEM 培地で 3回洗浄後、 150 /z Lの蛋白質溶液を添カ卩し、 37°Cで 3時間インキュベートした 。 PBSで 3回洗浄後、 0.25%トリプシン/ EDTAを 100 L/well添カ卩し、 10%FCSを含む M EM培地を 400 /z L/well添カ卩し、細胞を回収した。回収した細胞は HBSS 3回洗浄後、 10% FCSを含む HBSS 100 Lで懸濁し、共焦点顕微鏡観察に供した。なお、添カロ 時の濃度は eGFP由来の蛍光量（Ex485nm/Em535nm)を ARVO (パーキンエルマ一 社)で測定し (測定時間 1秒)、蛍光強度が 106、 5xl05、 2.5xl05となるよう調製した。
[0116] eGFP融合タンパク質を作成したのは、実施例 3にて KSH1のペプチドより明らかに細 胞内移行が亢進した KSH1- 1, KSH1-7, KSH1-8, KSH1- 9, KSH1- 18および KSH1- 3 3、加えて KSH1— 20, KSH1-21, KSH1-26, KSH1-27, KSH1-28, KSH1— 30および KS HI- 36である。解析には、 KSH1, KSH1-1, KSH1- 7および KSH1- 8には Cタイプの融 合蛋白質を、その他のペプチドについては Dタイプの融合蛋白質を調製した。
[0117] 調製した eGFP融合蛋白質について CHO細胞を用いた細胞内移行試験を行った 結果を図 17に示した。上段は細胞内へ移行した eGFP蛋白質の蛍光を示し、下段は 細胞の微分干渉顕微鏡像と蛍光を合わせたものを示した。融合蛋白質は蛍光強度 を全て 106に揃えて細胞に添カ卩した。細胞内移行が認められた KSH-1改変体と eGFP の融合蛋白質を CHO細胞に添加すると、細胞内に蛍光が検出され、全ての KSH-1 改変体が融合蛋白質を細胞内へ移行させる能力を保持していることが明らかになつ た。ペプチド単体での比較に比べると、融合蛋白質では移行効率の差は小さ力つた 1S KSH1-1、 KSH1-7及び KSH1-27との融合蛋白質については、 KSH1に比べ細胞 内移行が亢進した。
[0118] 付加するペプチドの疎水性が高いほど融合蛋白質での細胞内移行がペプチドの 結果を反映しない傾向が認められた。 KSH1-30では 2つのトリプトファンをタイ口シン に改変している力 ペプチドで良好な結果が得られているにもかかわらず、融合蛋白 質ではかなり細胞内移行が低下したことから、 2つのトリブトファンを改変する場合は イソロイシン（KSH1- 26)がもっとも適していた。
[0119] また、スレオニンおよびセリンをァラニンに改変したもの（KSH1-18, KSH1-20, KSH 1-21)についても融合蛋白質では細胞内移行の明らかな亢進は認められな力つた。 ただし、すべてのスレオニンおよびセリンをァラニンに改変すると (KSHl-27)、細胞内 移行は明らかに亢進する傾向が認められたため、融合蛋白質の細胞内移行効率を 変化させるためにはペプチド単体の場合よりもペプチド部分の大きな構造変化が必 要であると結論された。
[0120] 以上より、 KSH1の改変ペプチドの付カ卩によって蛋白質は細胞内へ移行した力 融 合蛋白質の移行効率についてはペプチド単体の結果とは異なっていた。
[0121] i 亲斤親 PTDffi歹 ll (西 R列表の西 R列番^ ·39から 47)の糸田 H q 移行試,験
¾施例 5- 1 FACS解析による新親 PTDffi列の撰択
KSH1ペプチドは Jurkat細胞における 7回濃縮ライブラリ一中から得られた配列であ つた。そこで、 Jurkat細胞 7回濃縮ライブラリーに含まれる IVVを 1000個任意にピックァ ップして塩基配列を確認した。 KSH1の解析から、ペプチドの配列を Wheel構造に当 てはめたときにリジン/アルギニンのクラスターおよびトリプトファンの存在が重要であ ることが予想されたので、これらの条件をクライテリアとして 1000配列の絞込みを行つ た。その結果、 60配列がクライテリアを満たしていた。また、 1000配列の中には重複し て出現する配列が 1種類認められた。これらの配列につ!、て蛍光標識したペプチドを 合成して、細胞内への移行能を解析した。
[0122] 実施例ト 2と同様の方法で合成、蛍光標識、精製および溶解し、 CHO細胞におけ る細胞内移行試験を FACS解析にて行った。 Positiveコントロールとして HIV TAT由来 の PTD配列（配列表の配列番号 51)及び KSH1のペプチド、 Negativeコントロールとし ては、細胞内移行性のな!、ペプチド配列（配列表の配列番号 57)を用いた。
[0123] FACS解析の結果、 CHO細胞においては、 KSH1と同等の移行性を示す配列が 1種 類、 TAT由来の PTDと同等の移行性を示す配列が 9種類同定された。こ 9種類のぺプ チド配列は、 KSH3から 10および KSH2 (配列表の配列番号 35から 43)に示す通りであ る（図 18)。
[0124] 実施例 5-2 共焦点顕微鎗観察による新規 PTD配列の細胞移行件解析 KSH2から KSH10 (配列表の配列番号 35から 43)について実施例 1-2と同様の方法 で CHO細胞内への移行試験を行い、共焦点顕微鏡解析を行った。 Positiveコント口 ールとして HIV TAT由来の PTD配列（配列表の配列番号 50)及び KSH1のペプチド、 Negativeコントロールとしては、細胞内移行性のないペプチド配列（配列表の配列番 号 57)を用いた。
[0125] 共焦点顕微鏡解析に当たっては、 Negativeコントロール（配列表の配列番号 57)の ペプチドを添カ卩した細胞を用いて、ノ ックグラウンドの補正を行った。その後、 Positiv eコントロールの PTD1 (配列表の配列番号 50)のペプチドを添カ卩し、細胞内における 蛍光を観察した。
[0126] 新規 PTD配列に関しては、ペプチドを 50 μ Μから 12.5 μ Μまで 3段階の 2倍希釈系 列で解析を行った。その結果、共焦点顕微鏡による解析結果は、 FACS解析の結果 と同様の傾向を示した。 KSH2, KSH3, KSH4, KSH6, KSH7および KSH10の 4種類に ついての共焦点顕微鏡による解析結果は FACS解析同様、 PTD1と比べ良好な細胞 内移行プロファイルを示した（図 19、上段は細胞内へ移行した蛍光標識ペプチドの 蛍光を示し、下段は細胞の微分干渉顕微鏡像と蛍光を合わせたものを示した。ぺプ チドの添加濃度は 25 Μであった。 ) 0今回同定された PTD候補配列は、明らかな細 胞内移行能を保持していた。データベースサーチを行った結果、相同配列は認めら れず、いずれも新規の PTD配列であった。また KSH2については HeLa細胞では細胞 膜の表面を縁取るようにペプチドが局在しており、他の PTDと異なる移行性を示した。
[0127] 実施例 5- 3 新親 PTDffi列 eGFP融合 白皙の CHO細朐における細朐内移行試
KSH2, KSH3, KSH4, KSH6, KSH7および KSH10の 6種類について eGFP融合蛋白 質を調製し、新規 PTD配列と eGFP融合蛋白質を細胞内へ移行させる PTD様活性が ある力否かを確認した。融合蛋白質については、可溶ィ匕状態の高い分子型を選択す ることとした。その結果、 KSH2および KSH6については図 14における Cタイプを、残り の 4種類については図 14における Dタイプの分子型を選択した。融合蛋白質は実施 例 4-1と同様に作成した。ここで用いたアニーリングオリゴ配列は、表 3の通りである。 ネガティブコントロールとして eGFP-Hisを用い、それぞれの蛍光強度を揃えた後、 C HO細胞に添カ卩した。
[0128] [表 5]
Figure imgf000033_0001
[0129] 1時間 37°Cでインキュベートした後、トリプシン処理を行って細胞を回収した。洗浄操 作の後、共焦点顕微鏡によって細胞内への移行が認められるかどうかの確認を行つ た。測定に当たってはネガティブコントロールである eGFP-Hisを添カ卩した CHO細胞 での蛍光が検出されない条件を設定した後、各新規 PTD融合 eGFP蛋白質を添加し た細胞の測定を行った。その結果、調製したすべての新規 PTD融合 eGFP蛋白質を 添カ卩した CHO細胞において、細胞内に蛍光が観察され、融合蛋白質の細胞内への 移行が観察された。
[0130] このことから上記 6種類の新規 PTD配列は 、ずれも PTD様活性を持って 、ることが 明らかになった。 KSH7のペプチドについては、これまでに報告された既知 PTDに共 通のアルギニン等の塩基性アミノ酸が 1個のみであり、新たなカテゴリーの PTDであつ た。 6種類の新規 PTDのうち、 KSH4および KSH2については他の新規 PTDや KSH1の ペプチドに比べて細胞内への移行が高ぐ蛋白質特に eGFPをカーゴとした場合には 有用な PTDであった。
[0131] 実施例 6 配列番晉 47の改変 PTD配列ペプチドの CHO細朐における細朐内移行 試験
実施例 6-1 共焦点顕微鏡による B 栾 PTD§R列ペプチド'の細朐内移行試,験 実施例 5で見出された新規 PTD配列のうち、 KSH2のペプチドは eGFPを細胞内へ移 行させる能力が高いことから、改変を試みた。 KSH2-1から KSH2-4 (配列表の配列番 号 44から 47)のペプチドを実施例 1-2と同様の方法で合成、蛍光標識、精製および溶 解し、 CHO細胞内への移行試験を行い、共焦点顕微鏡解析を行った。
[0132] KSH2のペプチドの特徴は、 Wheel構造上にリジンアルギニンクラスターが形成され ることおよびトリプトフアンカ ¾個存在することである。また、トリブトファンを挟んでシス ティン力 ¾個存在することも特徴的である。これまでの解析力も塩基性のアミノ酸のク ラスターおよびトリプトファンが重要であることが明らかになつている。そこで KSH2の ペプチドの改変に当たっては 2個存在するシスティンを他のアミノ酸に置換することの 影響を調べた (図 20)。
[0133] まず、 2個のシスティンをァラニンに置換した場合 (KSH2-1)とトリブトファンに置換し た (KSH2-2)について調べた。 FITCで標識したペプチドを合成し、細胞内移行効率 を CHO、 HeLa、 Jurkat細胞で調べた（図 21、ペプチド添加濃度は 50 μ Μ, 25 μ Μある いは 12.5 Μである）。
[0134] その結果、 50 μ Μの濃度では KSH2-1および KSH2-2 、ずれも KSH2よりも高!、細胞 内移行を示した力 25 Μに希釈すると KSH2-1は著しく細胞内移行が低下した。一 方 KSH2- 2は 25 μ Μ、 12.5 μ Μと希釈しても細胞内移行効率は KSH2よりも高かった。 細胞内移行が促進されていた KSH2-2ではトリプトファンの数力 個であった。トリプト ファンの数が多いほどペプチドの細胞内移行は亢進するが、融合タンパク質を調製 する場合は不溶ィ匕の原因になる可能性が高いと考えられたため、 2個のシスティンを 1つずっァラニンに置換し（KSH2-3および KSH2-4)、細胞内移行を調べた。 FITCで 標識したペプチドの CHO、 HeLa、 Jurkat細胞での細胞内移行能を調べたところ、い ずれも KSH2に比べて細胞内移行能が亢進することが明らかになった。
[0135] 実施例 6- 2 ¾^PTDffi列 eGFP融合 白皙の CHO細朐における細朐内移行試 KSH2-3および KSH2-4 (配列表の配列番号 46および 47)につ!/、て eGFP融合蛋白 質を調製し、新規 PTD配列と eGFP融合蛋白質を細胞内へ移行させる PTD様活性に ついて KSH2と eGFP融合蛋白質の移行性と比較した。融合蛋白質については、 KSH 2については図 14の Cタイプを、 KSH2- 3および KSH2- 4については図 14の Dタイプを 作成した。融合蛋白質は実施例 4-1と同様に作成した。ここで用いたアニーリングオリ ゴ配列は、表 4の通りである。
[0136] [表 6] フォワードオリゴマー（F)
改変 PTDペプチドの名称 または 配列表の配列番号
リバースオリゴマー（R)
112
KSH2-3
1 13
1 14
SH2 4
1 15
[0137] CHO細胞内への移行能を調べたところ、 KSH2-3および KSH2-4の eGFPとの融合蛋 白質は共に細胞内への移行が確認された。細胞内移行効率に関しては、 KSH2のぺ プチドと eGFP融合蛋白質に比べると移行能は劣っていたものの、 TAT由来の PTD1 とは同等であった。
[0138] 以上より、カーゴとして高分子の蛋白質を用いる場合は KSH2、ペプチド程度の低 分子を用いる場合は、 KSH2-3および KSH2-4の改変体を選択するのが効率的であ ると結論された。
産業上の利用可能性
[0139] 本発明によれば、新規なアミノ酸配列力 なる細胞膜透過ペプチド及び当該ぺプ チドを含有する医薬を提供することができる。なお、本願は、特願 2005-314355号を 優先権主張して出願されたものである。

Claims

請求の範囲
[I] 下記のアミノ酸配列を有するペプチド。
B- X- Z- X- Arg- Z- Tyr- J- X- O1- X- Arg- O2- X- Xまたは X- X- O1- Arg- X- O2- X- J- Tyr- Z-Arg-X-Z-X-B
ただし、（1)Bはアルギニンまたはリジンであり、 または 02の少なくとも一方がアル ギニンであり、（3)Zが疎水性アミノ酸であり、（4)Jがセリンまたはァラニンであり、かつ (5) Xが任意のアミノ酸である。
[2] 配列表の配列番号 1から 34のいずれかで表されるアミノ酸配列のうち 1個または複数 個のアミノ酸を置換、欠失、付加または挿入されることによってなる、請求項 1記載の ペプチド。
[3] 配列表の配列番号 35力 47のいずれかで表されるアミノ酸配列のうち 1個または複数 個のアミノ酸を置換、欠失、付加または挿入されることによってなるペプチドおよびそ の逆鎖ペプチド。
[4] 配列表の配列番号 1から 47の 、ずれかで表されるアミノ酸配列力 なるペプチドおよ びその逆鎖ペプチド。
[5] 請求項 1から 4の!、ずれかに記載のペプチドをコードする塩基配列力もなる DNA。
[6] 請求項 5記載の DNAを含有する組換えベクター。
[7] 請求項 6に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
[8] 請求項 1から 4の 、ずれかに記載のペプチド及び生理活性物質を含有するペプチド 結合物質。
[9] 生理活性物質が、生理活性を有するタンパク質、生理活性を有するポリペプチド、薬 剤封入リボソーム、ポリエチレングリコールイ匕薬剤封入リボソーム、低分子化合物、核 酸、マグネティックビーズ、ナノゲージパーティクルまたはファージである請求項 8に記 載のペプチド結合物質。
[10] 生理活性を有するタンパク質が約 lOKDaから約 120KDaのタンパク質または 4個から 3 0個のポリペプチドである請求項 8に記載のペプチド結合物質。
[II] 生理活性を有するタンパク質が mi転写因子 (MITF)である請求項 8に記載のペプチド 結合物質。
[12] 細胞内及び Z又は核内に輸送される請求項 8から 11のいずれかに記載のペプチド 結合物質。
[13] 細胞内に輸送される請求項 8から 11のいずれかに記載のペプチド結合物質。
[14] 請求項 8に記載のペプチド結合物質を含有する医薬。
[15] 抗アレルギー薬として使用する請求項 14に記載の医薬。
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