KR100374050B1 - 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 재조합폴리뉴클레오타이드 및 발현벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 발현벡터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 초파리 푸쉬-타라쭈 또는 인그레일드 단백질의 호메오도메인, 상기 호메오도메인의 아미노 말단 측의 다수개의 히스티딘 잔기 및 상기 호메오도메인의 카복시 말단 측에 융합된 이종 단백질을 포함하는 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 발현벡터에 관한 것이다. 본 발명은 이종 단백질을 초파리 푸쉬-타라쭈 또는 인그레일드 단백질의 호메오도메인과 융합단백질로 만들어 이종 단백질을 세포내로 효율적으로 침투시킬 수 있어, 호메오도메인을 치료용도의 단백질과 융합하여 융합단백질을 제조함으로써 세포침투성을 갖는 단백질 치료 의약품을 개발할 수 있다.

Description

세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 발현벡터{TRANSCELLULAR PENETRATION FUSION PROTEIN, RECOMBINANT POLYNUCLEOTIDE CODING THEREOF AND EXPRESSING VECTOR}

본 발명은 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 발현벡터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 초파리 푸쉬-타라쭈(Fushi-tarazu) 또는 인그레일드(Engrailed) 단백질의 호메오도메인, 상기 호메오도메인의 아미노 말단 측의 다수개의 히스티딘 잔기 및 상기 호메오도메인의 카복시 말단 측에 융합된 이종 단백질을 포함하는 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 발현벡터에 관한 것이다.

치료제로 사용되는 약물이나 단백질은 대개의 경우 자발적으로 세포막을 통과할 수 없다. 일반적으로 분자량 600 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다. 따라서 분자량 600 이상의 친수성 물질을 세포내로 투과시킬 수 있는 방법을 개발하면 세포 기능의 연구 및 새로운 치료법의 개발에 크게 기여할 것이다.

사람 면역결핍 바이러스 타입-1(Hunan Immunodeficiency Virus type-1) 단백질의 일종인 Tat(transactivator of transcription) 단백질은 효율적으로 세포막을 통과하여 세포질 내로 쉽게 이동한다는 것이 밝혀졌다(Green and Lowenstein, 1988; Frankel and Pabo, 1988). 이러한 기능은 Tat 단백질의 중간부위인 단백질 형질도입 부위(Protein Transduction Domain: PTD)의 특성 때문에 나타나며 아직 그 정확한 기전은 알려지지 않은 상태이다. 그러나 Tat 단백질의 세포막 통과에는 특정 수용체나 운반체가 관여하지 않는 것으로 보이며, 단백질 형질도입 부위가 직접 막의 지질 이중층과 작용함으로써 일어나는 것으로 이해되고 있다. 이것은 Tat 단백질이 세포막을 통과하여 모든 종류의 세포 내로 투과할 수 있음을 의미한다.

초파리(Drosophila)안테나페디아(Antennapedia: Antp) 단백질의 호메오도메인(homeodomain)도 Tat의 PTD와 같은 방식으로 세포내로 투과할 수 있음이 발견되었으며, 따라서 모든 종류의 세포내로 투과될 가능성이 있다(Joliot et al, 1991; Derossi et al, 1994; Derossi et al, 1996). 뿐만 아니라 Tat과 Antp 호메오도메인에서 발견된 PTD를 여러 종류의 이종단백질과 융합시켰을 때 그 융합단백질들이 세포내로 투과됨을 관찰할 수 있었다(Derossi et al, 1998; Schwarze and Dowdy, 2000). 안테나페디아(Antp) 단백질의 60개의 아미노산으로 이루어진 호메오도메인이 홀로, 또는 30 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드에 융합되었을 때 에너지 소비나 수용체 단백질을 필요로 하지 않는 방식으로 생체막을 통과할 수 있음이 보고된 바 있다. 그리고 페네트라틴(penetratin)이라 불리는 Antp 호메오도메인의 16개의 아미노산으로 이루어진 세 번째 헬릭스(helix)가 100개 이하의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드에 융합되었을 때에도 마찬가지로 세포막을 통과함이 알려져 있다.

그러나 안테나페디아 호메오도메인 이외의 다른 호메오도메인이 이종단백질과 융합되었을 때 세포투과성을 갖는지에 대해선 보고된 바가 없으며, 분자량 600 이상의 친수성 물질을 세포 내로 투과시킬 수 있는 방법도 보고된 바가 없다.

따라서 본 발명은 분자량 600 이상의 친수성 물질을 세포 내로 침투시킬 수 있는 방법을 개발하여 새로운 세포침투 융합단백질 및 단백질 치료법의 개발을 목적으로 한다. 즉, 본 발명의 목적은 특정의 호메오도메인을 이종단백질에 융합한 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 발현벡터를제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 일실시예에서의 PTD-GFP 융합단백질들을 도시한 것이다.

도 2는 S2 세포내로 PTD-GFP 융합단백질의 투과도를 나타내는 형광현미경 사진이다.

도 3은 PTD-GFP 융합단백질의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내는 사진이다.

도 4는 초파리 푸쉬-타라쭈 호메오도메인- GFP 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.

도 5는 인그레일드 호메오도메인- GFP 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.

본 발명의 세포침투성 융합단백질은 초파리 푸쉬-타라쭈 또는 인그레일드 단백질의 호메오도메인, 상기 호메오도메인의 아미노 말단 측의 다수개의 히스티딘 잔기 및 상기 호메오도메인의 카복시 말단 측에 융합된 이종 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 명세서에서 사용된 「이종 단백질」은 초파리 푸쉬-타라쭈 또는 인그레일드 단백질 이외의 단백질을 의미하여, 치료 용도로 사용할 수 있는 단백질, 특히 분자량 600 이상의 물질인 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 실시예에서는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein:GFP)에 대해 실시하였으나, 침투성의 측정을 위한 방편으로 상기 단백질을 사용한 것으로, 본 발명에 의한 융합단백질에 사용될 수 있는 이종단백질이 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 융합단백질에서 사용된 히스티딘 잔기는 6개인 것이 바람직하다. 또한 본 발명에서 의도한 이종단백질의 세포침투성을 위해 사용된 초파리 푸쉬-타라쭈 또는 인그레일드 단백질의 호메오도메인과 같은 효과를 나타내는 등가의 유도체를 사용할 수도 있다.

또한 본 발명은 상기 융합단백질의 약학적으로 유효한 양을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 융합단백질을 코딩하는 6개의 히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 초파리 푸쉬-타라쭈 또는 인그레일드 단백질의 호메오도메인을코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 이종 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 순차적으로 결합시킨 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 이 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.

본 발명에서는 초파리(Drosophila)의 푸쉬-타라쭈(Ftz)와 인그레일드(En) 단백질의 호메오도메인을 사용하였다. Ftz 호메오도메인은 En 호메오도메인에 비하여 Antp 호메오도메인과 유사성이 높다. 즉 Antp 호메오도메인과의 아미노산 서열 동일성이 Ftz 호메오도메인은 87%이고, En 호메오도메인은 50%로서 서로 차이가 나기 때문에 Antp 호메오도메인과의 유사성과 세포투과성 사이의 상관관계의 존재여부를 또한 알 수 있다.

Ftz와 En 단백질의 호메오도메인과 공유결합시킨 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사형태로 제형할 수 있다. 경구용 조성물로는, 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 텍스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀루로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 항미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.1~100 ㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예에 의하여 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서 사용된 실험방법은 다음과 같다.

융합단백질의 제조 및 정제 방법

pET-15b(Novagen)에 녹색 형광 단백질(GFP)의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 삽입하여 his-tag가 융합된 GFP를 대장균에서 대량 생산할 수 있는 pET15b-GFP를 제조한 후, 이 플라스미드로부터 본 실험에 사용된 다양한 융합단백질 발현 플라스미드를 제조하였다. Tat-GFP 융합단백질 발현 플라스미드인 pET15b-Tat-GFP는 Tat 단백질의 49번부터 57번까지의 아미노산을 코드하는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 합성하여 his-tag와 GFP를 코드하는 부위 사이에 삽입하여 제조하였다. 페네트라틴(Penetratin)-GFP 발현 용도의 pET15b-페네트라틴-GFP는 Antp 호메오도메인의 43번부터 58번까지의 아미노산을 코드하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 마찬가지 방법으로 제조하였다. Ftz 호메오도메인-GFP 융합단백질 발현용 pET15b-FtzHD-GFP는 PCR 증폭방법으로 Ftz 호메오도메인을 코드하는 뉴클레오타이드를 합성하여 위와 같은 방법으로 제조하였다. pET15b-EnHD-GFP는 FtzHD의 경우와 같은 방법으로 제조하였다. 이렇게 삽입된 DNA는 DNA 시퀀싱(sequencing) 방법으로 염기서열을 읽음으로써 확인하였다.

상기에서 제조한 플라스미드를E. coliBL21에 형질전환(transformation)하여 his-tag가 붙은 융합단백질을 발현시킨 다음, 노바겐(Novagen)에서 제시한 방법대로 변성 조건에서 세포를 깬 후 Ni 컬럼으로 정제하였다. 용출한 단백질은 같은 부피의 글리세롤(glycerol)과 잘 섞은 다음 -70℃ 디프 프리저(deep freezer)에 보관하였다. 정제한 단백질의 농도는 브래드포드 분석(Bradford assay)으로 측정하였다.

형광현미경을 사용한 융합단백질의 세포내 투과성 측정 방법

초파리(Drosophila)S2 세포 배양은 기존의 방법을 따랐다(Han, 1996). 스플리팅(Splitting)이 필요한 S2 세포와 4배 부피의 M3 배양액(Sigma)을 잘 섞은 다음 세포현탁액 0.5ml 씩을 24 웰(well) 컬처 플레이트(culture plate)의 각 웰로 옮겼다. 정제된 융합단백질 수 ㎕ (20 nM 내지 500 nM)를 배양액에 넣은 다음 잘 섞어주었다. 세포를 컬처 플레이트에 옮긴 다음 단백질을 넣어 줄 때까지의 시간은 즉시부터 약 12 시간까지 별 차이가 없었다. 단백질 처리 한시간 후 배양액을100㎕의 EDTA없는 트립신(trypsin without EDTA, Gibco)으로 바꾸어준 후 25℃에서 15분간 배양하였다. 400㎕의 PBS를 첨가한 후 마이크로피펫을 사용하여 원심분리기 튜브(microfuge tube)로 옮겼다. 2,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 침전된 세포를 500㎕의 PBS로 세 번 씻어주었다. 세포내의 형광은 형광현미경(Olympus)으로 관찰하였다.

웨스턴 블롯(Western blot)

융합단백질의 세포내 투과는 위와 같은 방법으로 수행하되 스케일(scale)을 10배 증가시켰다. 즉 60mm 컬처 디쉬를 사용하여 5ml의 세포현탁액을 사용하였다. 융합단백질은 최종 농도가 200nM이 되도록 첨가하였으며 다음 단계의 과정 모두 부피를 10배 증가시켜 수행하였다. 세포를 트립신으로 처리하고 PBS로 씻은 후 같은 부피의 2 × Laemmli 버퍼와 섞어서 세포추출물을 준비하였다. 브래드포드 분석으로 단백질의 농도를 측정한 후, 같은 양의 단백질이 되도록 각 세포추출물의 부피를 조정하여 10% SDS-PAG(polyacrylamide gel)에 로드(load)한 후 전기영동하였다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane, Amersham, UK)으로 옮긴후 5% BSA(in PBS)로 블록(block)하였다. 폴리클론 안티-GFP 항체(Polyclonal anti-GFP antibody)로 상온에서 한 시간 처리하고 세척(washing)한 후, 서양 고추냉이 페록시다제-융합 고우트 안티-마우스 IgG 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG antibody)와 상온에서 한 시간 반응시켰다. GFP 단백질의 위치는 아머샴(Amersham)에서 제공한 방법을 적용하여 ECL kit(Amersham)로 찾았다.

실시예 1: 재조합 PTD-GFP 융합단백질의 클로닝(cloning)과 발현

단백질 형질도입 부위(PTD)로서의 호메오도메인의 활성을 조사하는데 있어 PTD와 융합된 단백질의 세포내 투과를 간편하게 측정할 수 있도록, PTD를 아쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria)GFP에 융합한 단백질 발현 플라스미드를 제조하였다. 대조군으로는 S2 세포에서 세포투과성이 발견되었던 Tat-GFP 융합단백질을 사용하였다. PTD-GFP 융합단백질을 과대 발현시키기 위하여 상기와 같은 6개의 히스티딘(histidine)-tag가 아미노말단에 융합되어 있는 pET-PTD-GFP 발현벡터를 제조하였다(도 1 참조). 도 1에서 단백질 코딩 구역 밑의 숫자는 각각의 융합단백질의 N-말단의 아미노산의 수를 나타낸 것이며, 모든 PTD는 T7 프로모토(promoter) 및lacO-오퍼레이터(operator)을 포함하는 pET15b-GFP 플라스미드에 클론하였고, IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. 여기서 FtzHD는 Ftz의 호메오도메인을 나타낸 것이고, EnHD는 En의 호메오도메인을 나타낸 것이다.

IPTG로 융합단백질의 과대 발현을 유도한 대장균 세포를 6M 요소가 함유된 용액에서 초음파분쇄(sonication)로 파쇄한 다음, 즉시 정제과정으로 들어갔다. 융합단백질 아미노말단의 his-tag을 이용하여 Ni 컬럼으로 융합단백질을 거의 순수하게 (순도 >95%) 정제하였다.

실시예 2: PTD-GFP 융합단백질의 침투성 측정

융합단백질을 여러 농도(20nM부터 500nM까지)로 준비하여 초파리 S2 세포에25℃에서 한 시간동안 처리하여 세포내로 투과시켰다. 투과된 정도는 형광현미경으로 관찰함으로써 측정하였다. 모든 융합단백질은 대략 배양액에 넣어준 농도에 비례하여 투과도가 증가하였는데, PTD-GFP 융합단백질의 투과도는 서로 큰 차이가 없었다. 200nM에서의 결과는 도 2((A) GFP. (B) Tat-GFP. (C) penetratin-GFP. (D) FtzHD-GFP. (E) EnHD-GFP)에 도시하였다.

Tat(49-57)-GFP 융합단백질을 배양액에 처리한 결과 융합단백질은 S2 세포의 핵과 세포질에서 발견되었다(도 2B 참조). 반면에 PTD가 없는 GFP는 같은 실험조건에서 전혀 투과성이 없었다(도 2A참조). 융합단백질이 세포표면에 결합함으로써 생기는 형광은 융합단백질 첨가 한시간 후에 트립신을 처리함으로써 최소한으로 줄일 수 있었다. 다음으로는 페네트라틴-GFP 융합단백질의 투과성을 조사하였다. Tat PTD는 120kD의 단백질도 투과시키기 때문에(Schwarze et al, 1999), Tat-GFP가 투과하는 것은 당연하다 할 수 있다. 그러나 페네트라틴의 경우 100 아미노산 이하의 단백질은 쉽게 투과시키지만, 그 보다 큰 단백질의 경우 예측하기가 힘들다고 알려져 있다(Derossi et al, 1998). GFP는 238개의 아미노산으로 이루어져 있기 때문에 페네트라틴-GFP의 투과성을 예측할 수 없고, 투과되지 않을 가능성이 크다. 그러나 페네트라틴-GFP도 효율적으로 투과함을 관찰하였는데, GFP의 밀집된 구조가 투과에 도움이 되었을 가능성이 있다(도 2C). 그뿐만 아니라 두 종류의 호메오도메인-GFP 융합단백질(FtzHD-GFP와 EnHD-GFP)도 대조군의 융합단백질처럼 효율적으로 투과함을 발견하였다(도 2D, E). Tat 융합단백질은 변성 조건에서 정제되었을 경우에만 효율적으로 투과하는 사례가 발견되었지만, 호메오도메인-GFP 융합단백질의 경우 변성조건과 정상조건에서 융합단백질을 정제하여 투과효율을 비교한 결과 별 차이가 없었다(도시하지 않음).

실시예 3: PTD-GFP 융합단백질의 투과효율 비교 및 세포내에서의 안정성 측정

PTD-GFP 융합단백질의 투과효율을 보다 정량적으로 비교하기 위하여 상기의 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 융합단백질 1n몰을 200nM 농도로 60mm 컬처 디쉬(culture dish)의 S2 세포에 위에서와 같은 조건으로 처리한 다음 투과된 융합단백질의 양을 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯으로 비교하였다. 이 실험에서 수확한 세포의 반 정도로부터 세포추출액을 준비한 다음, SDS-PAGE에 서로 다른 세포추출액으로부터 같은 양의 단백질이 로드(load)되도록 세포추출액의 부피를 조정하였다.

GFP 단백질은 웨스턴 블롯에서 전혀 단백질 밴드가 관찰되지 않는 것으로 보아 전혀 투과성이 없었다(도 3 참조). 반면에 모든 PTD-GFP 융합단백질은 예측된 분자량 지점에서 비슷한 양으로 단백질 밴드를 형성하는 것으로 보아 투과효율이 서로 비슷한 것으로 보인다(도 3 참조).

그러나 PTD중에서 Tat와 다른 호메오도메인 종류는 두가지 면에서 다른 양상을 보였다. 첫째, 페테트라틴-GFP와 호메오도메인-GFP 융합단백질은 Tat-GFP 융합단백질에 비하여 투과효율이 약간 높았다. 단백질 밴드의 진한 정도로 판단하건대, 페네트라틴-GFP와 호메오도메인-GFP 융합단백질은 배양액에 처리한 단백질의 약 50% 정도가 세포내로 투과한 반면에 Tat-GFP 융합단백질은 약 30%가 투과하였다.

둘째, Tat-GFP 단백질은 원형 그대로 존재했지만, 다른 세 종류의 융합단백질은 세포내에서 일부 변화가 일어나는 것으로 보인다. 페네트라틴-GFP의 경우 감광시간을 줄였을 때 두껍게 관찰된 밴드가 실은 페네트라틴-GFP와 GFP에 해당하는 두 개의 밴드로 이루어졌음이 관찰되었다(도시하지 않음). 세 종류의 융합단백질에서 공통적으로 발견되는 아래쪽 밴드는 아미노말단의 PTD가 융합단백질로부터 분리되어 생성된 GFP인 것으로 추정된다. 따라서 호메오도메인으로부터 유래한 PTD는 세포내로 투과된 후 융합단백질로부터 제거됨으로써 이종단백질이 붙어있지 않은 자연상태의 운송된 단백질이 세포내에 생성되도록 하는 일종의 일시적 (transient) 벡터로 기능할 가능성이 있다.

또한 PTD로서의 두 호메오도메인을 비교하여 보면, Ftz 호메오도메인과 En 호메오도메인의 투과효율은 비슷한 수준이었는데, 이는 페네트라틴과의 아미노산 서열의 유사성과 투과효율 사이에 별 상관관계가 없음을 의미한다. 그러나 아미노산 서열의 유사성과 세포내에서의 안정성 사이에는 상관관계가 존재한다. 페네트라틴과 아미노산 서열이 94% 동일한 FtzHD-GFP와 페네트라틴-GFP는 각 융합단백질과 PTD가 없는 GFP가 대략 1 : 1의 비율로 생성되었다(도 3 참조). 반면에 페네트라틴과 아미노산 서열이 76% 동일한 EnHD-GFP는 세포내에서 거의 변화가 없었다 (도 3 참조).

상기와 같이, 푸쉬-타라쭈(Ftz)와 인그레일드(En) 단백질의 호메오도메인이 238개의 아미노산으로 이루어진 녹색 형광 단백질(GFP)을 세포내로 투과시킬 수 있었으며, 투과 효율은 현재 알려져 있는 두 종류의 다른 단백질 투과 구역(PTD)인 Tat 단백질 내부의 올리고펩타이드와 페네트라틴의 세포 투과효율과 유사하거나 조금 높았다.

즉, 본 발명의 투과방법은 비교적 분자량이 큰 238개의 아미노산으로 이루어진 이종단백질을 융합하여 세포내로 투과할 수 있게 한 최초의 발명이다. Antp 호메오도메인의 경우는 30 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 투과시키는 경우만 보고되어 있다. 또한 세포 내로 투과된 호메오도메인-GFP는 형광활성을 유지하는 것으로 보아 정상적인 3차구조를 유지할 뿐만 아니라, 투과된 GFP 단백질은 안정한 상태로 세포내에 존재한다. Ftz 호메오도메인과 페테크라틴의 경우 세포내로 투과된 후에 함께 융합되어 운송된 GFP 단백질로부터 분리되는 것으로 보이는데, 이는 이종단백질 부위가 최소한으로 융합된 단백질, 즉 보다 자연적인 상태로 단백질이 세포내에 존재하도록 하는 방법의 개발 가능성을 제시한다.

이상에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 융합단백질에 의해 이종 단백질을 세포내로 효율적으로 침투시킬 수 있어, 호메오도메인 또는 그 유도체를 치료용도의 단백질과 융합하여 융합단백질을 제조함으로써 세포침투성을 갖는 단백질 치료 의약품을 개발할 수 있다.

Claims (6)

1. 초파리 푸쉬-타라쭈 또는 인그레일드 단백질의 호메오도메인과 상기 호메오도메인의 카복시 말단 측에 공유결합으로 융합된 이종 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포침투성 융합단백질.
2. 제1항에 있어서, 이종 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP)인 것을 특징으로 하는 세포침투성 융합단백질.
3. 제1항 또는 제2항의 융합단백질의 약학적으로 유효한 양을 포함하는 약학 조성물.
4. 초파리 푸쉬-타라쭈 단백질의 호메오도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 이종 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 순차적으로 결합시킨 제1항 또는 제2항의 융합단백질을 코딩하는 서열번호 1의 재조합 폴리뉴클레오타이드.
5. 초파리 인그레일드 단백질의 호메오도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 이종 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 순차적으로 결합시킨 제1항 또는 제2항의 융합단백질을 코딩하는 서열번호 2의 재조합 폴리뉴클레오타이드.
6. 제4항 또는 제5항의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 융합단백질 발현벡터.