KR100844497B1

KR100844497B1 - 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드및 이를 발현하는 재조합 발현벡터

Info

Publication number: KR100844497B1
Application number: KR1020070006728A
Authority: KR
Inventors: 김명희; 공경아; 이미희; 김은신
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2007-01-22
Filing date: 2007-01-22
Publication date: 2008-07-08

Abstract

본 발명은 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 발현하는 재조합 발현벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생쥐 혹스 단백질 중 하나인 혹스씨-8 단백질의 호메오도메인에 속하는 16개의 아미노산으로 구성된 펩티드(PTD) 또는 상기 펩티드(PTD)가 연속적으로 1 ~ 5개 연결된 펩티드와 이종단백질을 포함하는 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 재조합 발현벡터에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 세포 내로 효과적으로 침투시킬 수 있어 살아있는 세포에 효율적으로 직접 전달하여 침투성을 갖는 단백질 치료약품 또는 화장품을 개발할 수 있다.

세포침투성 융합단백질, 폴리뉴클레오티드, 재조합 발현벡터, 혹스씨-8 단백질, 이종단백질

Description

세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 발현하는 재조합 발현벡터{Cell penetrating-polypeptide fusion protein, its coding sequences and the recombinant vector expressing this fusion protein}

도 1은 본 발명에 따른 재조합 발현벡터 pET-EGFP-PTD(n)의 제작과정을 나타낸 모식도이다.

도 2는 본 발명에 따른 융합단백질인 EGFP-PTD(1), EGFP-PTD(2), EGFP-PTD(3), EGFP-PTD(4) 및 EGFP-PTD(5)을 각각 도시한 그림이다.

도 3은 본 발명에 따른 융합단백질이 대장균 안에서 발현한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 다양한 농도에서 융합단백질, EGFP-PTD(1)의 세포 투과도를 나타내는 형광현미경 사진이다.

도 5는 다양한 세포에서 융합단백질, EGFP-PTD(1)의 세포 투과도를 나타내는 형광현미경 사진이다.

도 6은 단백질 형질도입 부위의 반복 개수에 따른 융합단백질의 투과도를 나타내는 형광현미경 사진이다.

본 발명은 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 발현하는 재조합 발현벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생쥐 혹스 단백질 중 하나인 혹스씨-8 단백질의 호메오도메인에 속하는 16개의 아미노산으로 구성된 펩티드(PTD) 또는 상기 펩티드(PTD)가 연속적으로 1 ~ 5개 연결된 펩티드와 이종단백질을 포함하는 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 재조합 발현벡터에 관한 것이다.

외래 유전자를 세포 안으로 전달하기 위해 일반적으로 칼슘 포스페이트(calcium phosphate)나 양이온성 리포솜(cationic liposomes), 혹은 바이러스성 벡터를 사용하거나 세포내로 직접 주입하는 방법인 미량 주사법(microinjection)이나 전기 천공법(electroporation)을 이용하나 그 효과에 비해 효율성과 안정성에 많은 문제가 있다. 또 유전자가 세포 안으로 들어갔다 하더라도 이것이 RNA로 전사되고 또 이 RNA가 다시 단백질로 번역되는 기작에 따라 실험이 달라지며, 이는 세포독성과 발현 시 문제를 일으키는 중요한 문제점이 된다. 따라서, 단백질의 직접적인 전달과 효율적인 세포내 흡수는 연구 또는 치료를 위한 방법으로 여러 가지 장점을 가진다.

일반적으로 진핵세포의 원형질막은 소수성이므로 친수성인 핵산이나 펩타이드, 그리고 단백질이 투과할 수 없지만, 1960년대 말에 폴리-오르니틴(poly- ornithine), 폴리-라이신(poly-lysine), 히스톤과 같은 다염기의 단백질이 세포 내로 들어갈 수 있다는 보고가 있었고, 최근 매우 작은 염기 펩타이드(basic peptide)가 동일한 특성이 있다는 사실이 알려졌다. 최근까지 가장 많이 연구되고 있는 단백질 형질도입 부위는 초파리의 호메오 번역 단백질(homeotic transcription protein)인 Antp(antennapedia)[Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1991), 88:1864], 단순 포진 바이러스 구조 단백질(herpes simplex virus structural protein)인 VP22[Elliott et al., Cell(1997), 88:223], 그리고 HIV-1(human immunodeficiency virus 1)의 전사 활성자(transcription activator)인 Tat 단백질[Green et al., Cell(1988), 55:1179 and Frankel et al., Cell(1988),55:1189]이다. 특히, Tat(transactivator of transcription) 단백질과 초파리 Antp 단백질은 효율적으로 세포막을 통과하여 세포질 내로 쉽게 이동한다는 것이 밝혀졌고, 이것은 호메오 단백질 안에 존재하는 단백질 형질도입 부위(Protein Transduction Domain: PTD)의 특성 때문인 것으로 나타났다. 또 이런 펩티드성 도메인이 BBB(blood-brain barrier)도 통과할 수 있다는 사실이 보고됨과 함께 목적 세포에 치료용 단백질을 피부, 코 점막, 경구, 복강, 혹은 정맥을 이용해 수월하게 전달할 수 있고, 크기와 상관없이(size independent) 고분자 단백질과 핵산의 운반도 가능하다고 알려져 있으나 이 자체가 세포의 생장, 분화, 그리고 증식에는 영향을 미치지는 않는다고 보고되고 있다.

국내 특허 등록된 제374050호에는 초파리의 푸쉬-타라쭈 또는 인그레일드 단백질의 호메오도메인, 상기 호메오도메인의 아미노 말단 측의 다수 개의 히스티딘 잔기 및 상기 호메오도메인의 카복시 말단 측에 융합된 이종단백질을 포함하는 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 발현벡터에 관한 것으로서, 초파리 푸쉬-타라쭈 또는 인그레일드 단백질의 호메오도메인이 세포투과성을 갖는 Antp의 호메오도메인과 87%의 아미노산 서열 동일성을 보임을 이용하여 세포내 침투가 가능한 벡터를 개발하였으나, 이는 단백질 또는 DNA와 결합할 수 있는 호메오도메인을 모두 사용하여 다른 부작용이 나타날 수 있다는 단점이 있다. 본 발명에서는 Antp의 PTD와 94%의 유사성을 보이는 혹스씨-8의 PTD만을 이용하여 세포내 부작용을 최소화하였으며, 아미노 말단에 싸이오레독신을 융합시킴으써 대장균으로부터의 단백질 수확을 용이하게 하였다.

또한, 혹스씨-8 융합단백질의 세포내 침투에 관한 논문[Life Sciendes/Mi Hee Lee, Hyoung Woo Park, and Myoung Hee Kim/Life Sci. (2006) 2345-2348]에는 혹스씨-8 단백질 전체가 사용되고 있어 융합된 이종단백질 이외에 혹스씨-8에 의한 다른 부작용을 간과한 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 외래 유전자 전달용으로 사용되는 미세 주입 시 수반되는 세포 혹은 세포막의 손상, 바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이나 리포솜을 이용한 유전자 전달 벡터가 갖고 있는 단점을 최소화시키고, 더 나아가 세포 내에서의 자연 퇴화됨으로서 세포증식과 분화, 발생에 전혀 해를 주지 않는 새로운 개념의 벡터를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 호메오도메인의 일부 단백질 서열만을 가지고 이종단백질에 융합한 세포침투성 융합단백질, 이을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 발현하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 펩타이드성 자가 전달 벡터는 생쥐 혹스씨-8 단백질의 호메오도메인 중 일부인 단백질 형질도입 부위와 아미노 말단 측의 다수개의 히스티딘 잔기 및 이종 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 생쥐 혹스씨-8 PTD(protein transduction domain)와 이의 아미노 말단에 공유결합으로 융합된 이종단백질을 포함하는 세포침투성 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

또한, 상기 세포침투성 융합단백질을 발현하는 재조합 발현벡터를 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 생쥐 혹스 단백질 중 하나인 혹스씨-8 단백질의 호메오도메인에 속하는 16개의 아미노산으로 구성된 펩티드(PTD) 또는 상기 펩티드(PTD)가 연속적으로 1 ~ 5개 연결된 펩티드와 이종단백질을 포함하는 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 재조합 발현벡터에 관한 것이다.

본 발명에 기재된 '이종 단백질'은 생쥐 혹스씨-8 호메오도메인의 단백질 형질도입 부위 이외의 단백질을 의미한다. 구체적으로는 전사조절 단백질, 각종 신호전달 체계에 속한 단백질 등의 세포내 작용 단백질이 바람직하며, 본 발명 의 실시예에서는 녹색 형광 단백질에 대해 실시하였으나, 침투성의 측정을 위한 방편으로 상기 단백질을 사용한 것으로, 본 발명에 의한 융합단백질에 사용될 수 있는 이종단백질이 이에 한정되지는 않는다.

또한, 본 발명의 융합단백질에서 사용된 싸이오레독신(thioredoxin) 단백질은 융합단백질을 균주에서 발현시킬 시 그 수용성을 높여 단백질 수거를 도우며, 히스티딘 잔기는 수거된 단백질의 정제를 위한 것이다. 또한 S 단백질은 추후 실험에서 단백질의 검출을 위해 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 혹스씨-8의 단백질 형질도입 부위는 Antp의 단백질 형질도입 부위와 유사하다.

본 발명에서 사용된 생쥐 혹스씨-8 PTD(protein transduction domain)는 생쥐 혹스씨-8 단백질의 호메오도메인 중 세번째 헬릭스에 해당하는 부위로서, 혹스씨-8의 191번부터 206번까지의 16개 아미노산[서열번호 3]에 해당한다. 클로닝을 위한 유전자를 얻기 위해, 대장균의 코돈 선호도(codon usage)를 바탕으로 하여 상기에 해당하는 부분의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 합성한다.

한편, 융합단백질을 제조하기 위한 플라스미드로는 융합단백질을 제조하기 위한 플라스미드로는 pET-32a(+)(Novagen)를 사용한다. 또한, 싸이오레독신에 연결되어 존재하는 6개의 히스티딘(histidine) 잔기는 융합단백질의 정제에 이용한다. 이종 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입하여 히스티딘-태그가 융합된 이종 단백질을 대장균에서 대량 생산할 수 있도록 발현벡터를 제작한다.

상기 올리고뉴클레오티드를 이종 단백질이 발현되는 벡터의 카복시 말단에 삽입함으로써 융합단백질을 발현하는 벡터를 제조한다. 본 발명의 실시예에서는 이종 단백질로 EGFP를 사용하였고, 합성 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 pET-EGFP-PTD(n-1)의 카복시 말단에 순차적으로 삽입하여 제조한다.

상기에서 제조한 발현벡터를 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환(transformation)하여 한국생명공학연구원 유전자은행에 2006년 12월 15일자로 기탁하여 다음과 같이 기탁번호를 부여받았다.

pET-EGFP-PTD(1): KCTC 11049BP

pET-EGFP-PTD(2): KCTC 11050BP

pET-EGFP-PTD(3): KCTC 11051BP

pET-EGFP-PTD(4): KCTC 11052BP

pET-EGFP-PTD(5): KCTC 11053BP

상기 발현벡터로부터 얻어진 융합 단백질의 세포 침투성을 측정한 결과, 융합 단백질이 세포 내로 침투됨을 확인하였고, 특히 PTD를 반복 결합시킴에 따라 그 투과성은 증가되었음을 확인하였다.

즉, 본 발명에서 형질도입 방법으로서 사용한 세포내 투과방법은, 생쥐 혹스씨-8 단백질의 PTD와 이종단백질을 융합하여 세포 내로 투과할 수 있게 한 최초의 발명이다. 또한, 세포 내로 투과된 융합단백질은, 이종단백질로 사용한 EGFP가 형광활성을 유지하는 것으로 보아 정상적인 3차 구조를 유지할 뿐만 아니라, 투과된 EGFP 단백질은 안정한 상태로 세포 내에 존재함을 알 수 있다. 또한, 외래 유전자를 세포로 전달하는데 있어서 사용 세포주에 따라 그 효율성이 제한되었지 만, 본 발명에서 사용한 PTD 융합 단백질은 프라이머리(primary) 세포에서도 높은 효율을 보이고 있다. 또한, 본 발명은 외래 유전자를 세포로 전달할 경우 세포배양 조건에서도 적합한 유연성을 보였는데, 무혈청 배지가 아닌 혈청 함유 배지에서도 높은 효율을 보였다.

따라서, 본 발명은 목적 세포에 치료용 단백질이나 핵산을 수월하게 투여하게 하여 치료용 거대분자(단백질 등)를 피부나 코점막, 경구, 복강, 혹은 정맥을 이용하여 투입하여 질병치료 분자의 새포 내 전달 벡터로의 이용이 가능하다.

이하, 다음 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 융합단백질 제조를 위한 재조합 발현벡터 제작

융합단백질을 제조하기 위한 플라스미드로는 pET-32a(+)(Novagen)를 사용하였다. 이 플라스미드는 아미노 말단에 대장균 싸이오레독신(thioredoxin)을 코딩하도록 고안되어, 대장균 균주에서 융합단백질의 융해성을 높인다. 또한, 싸이오레독신에 연결되어 존재하는 6개의 히스티딘(histidine) 잔기는 융합단백질의 정제에 이용하였다. 상기의 플라스미드에 pEGFP-C1(Clontech)로부터 유래한 강화된 녹색 형광 단백질(enhance green florescent protein: EGFP)[서열번호 1]을 코딩하는 유전자[서열번호 2]를 삽입하여 히스티딘-태그가 융합된 EGFP를 대장균에서 대량 생산할 수 있는 pET-EGFP를 제조한다.

PTD는 생쥐 혹스씨-8 단백질의 호메오도메인 중 세번째 헬릭스에 해당하는 부위로서, 혹스씨-8의 191번부터 206번까지의 16개 아미노산[서열번호 3]에 해당한다. 클로닝을 위한 유전자를 얻기 위해, 대장균의 코돈 선호도(codon usage)를 바탕으로 하여 상기에 해당하는 부분의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)[서열번호 4 및 5]를 합성하였다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 포스파이트 트리에스테르 합성방법을 이용하여 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열을 갖도록 제조하였다. 이때, 양 끝에 BglII와 BamHI 제한효소 인식서열을 첨가하여 추후 PTD 멀티머(multimer) 제작과 클로닝이 용이하게 하였다. 합성된 올리고뉴클레오티드는 95 ℃에서 5분간 변성시킨 후, 37 ℃까지 서서히 식힘으로 서열번호 4와 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드의 어닐링을 유도하였다. 상기 올리고뉴클레오티드를 pET-EGFP의 카복시 말단에 삽입함으로써 EGFP-PTD 융합단백질을 발현하는 벡터를 제조하였다. pET-EGFP-PTD(n)은 합성 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 pET-EGFP-PTD(n-1)의 카복시 말단에 순차적으로 삽입하여 제조하였다[도 1 참조].

상기에서 제조한 발현벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질전환(transformation)하여 한국생명공학연구원 유전자은행에 2006년 12월 15일자로 기탁하여 다음과 같이 기탁번호를 부여받았다.

pET-EGFP-PTD(1): KCTC 11049BP

pET-EGFP-PTD(2): KCTC 11050BP

pET-EGFP-PTD(3): KCTC 11051BP

pET-EGFP-PTD(4): KCTC 11052BP

pET-EGFP-PTD(5): KCTC 11053BP

상기 형질전환체를 액체 배지(2xYT)에 하루 밤 동안 배양한 후, 25배의 새 배지에 옮겨 OD₆₀₀이 0.8에 도달할 때까지 배양하였다. 이후, 1mM IPTG를 첨가하여 다시 3시간을 배양함으로써 히스티딘-태그가 붙은 융합단백질을 발현시킨 다음 니켈 컬럼(Qiagen)으로 정제하였다. 용출한 단백질은 PBS로 투석한 후, -70 ℃ 디프 프리저(deep freezer)에 보관하였다. 단백질의 농도는 브래드포드 분석(Bradford assay)으로 측정하였다.

실시예 2: 재조합 융합단백질의 클로닝과 발현

PTD와 융합된 단백질의 세포내 투과를 간편하게 측정할 수 있도록, EGFP와 PTD의 융합단백질을 발현할 수 있는 플라스미드를 제조하였다. 도 2는 융합단백질의 모식도이다. 본 발명에 사용한 혹스씨-8 PTD는 Antp PTD의 아미노산 서열을 비교하였을 때, 94%의 유사성을 갖는다. 각 단백질은 pET-32a(+) 벡터의 특징상, 아미노 말단에 싸이로레독신과 6개의 히스티딘, S 단백질을 순차적으로 부착한 형태로 발현된다. 모식도 옆의 숫자는 융합 단백질의 예상되는 분자량을 나타낸 것이다.

액체배지에 배양한 형질전환 균주의 흡광도가 0.8일 때, 1 mM의 IPTG를 첨가하여 3시간동안 배양하여 융합단백질의 과대 발현을 유도하였다. 도 3은 발현 유도된 형질전환 균주의 전체 단백질을 13.5% SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 도 2에서 예상된 크기의 융합단백질이 순차적 크기로 발현하는 것을 확인하였다.

이후 대량 배양한 형질전환 균주를 초음파분쇄(sonication)로 파쇄한 다음, 니켈 컬럼과 융합단백질을 결합시킨 후, 이미다졸(imidazole)의 농도를 점차 증가시켜 융합단백질을 정제하였고 즉시 PBS로 투석하여 다음 실시예를 진행하였다.

EGFP-PTD(1) 융합단백질 : 서열번호 6

EGFP-PTD(2) 융합단백질 : 서열번호 7

EGFP-PTD(3) 융합단백질 : 서열번호 8

EGFP-PTD(4) 융합단백질 : 서열번호 9

EGFP-PTD(5) 융합단백질 : 서열번호 10

EGFP-PTD(1) 융합단백질 코딩 염기서열 : 서열번호 11

EGFP-PTD(2) 융합단백질 코딩 염기서열 : 서열번호 12

EGFP-PTD(3) 융합단백질 코딩 염기서열 : 서열번호 13

EGFP-PTD(4) 융합단백질 코딩 염기서열 : 서열번호 14

EGFP-PTD(5) 융합단백질 코딩 염기서열 : 서열번호 15

실시예 3: 형광현미경을 사용한 융합단백질의 세포 내 투과성 측정방법

실시예에서 사용한 PPFF(porcine primary fetal fibroblast) 세포주는 10% 혈청, 100 ㎍/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배양액을 사용하여 5% CO₂ 공급 하에 37 ℃에서 습윤 배양하였다. 세포 현탁액 0.5 ml당 2 × 10⁴의 세포를 24-웰(well) 배양 플레이트(culture plate)에 씨딩(seeding)한 후, 24시간 배양하여 표본으로 사용할 세포를 준비하였다. 정제-투석 과정을 거친 융합단백질을 각 농도별로 배양액에 처리한 후, 24시간 동안 세포를 배양하였다. 각 표본은 PBS로 2회 씻어준 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 사용하여 세포를 고정하고 100% 메탄올로 세포 투과성을 높여준다. 이후 다시 PBS로 표본을 3회 씻어준 후, 0.12 ㎍/㎖의 Hoechst를 처리하여 핵을 염색하였다. 세포 내의 형광은 200배 확대한 크기로 형광현미경(Olympus) 상에서 관찰하였다.

실시예 4: 다양한 농도에서의 융합단백질의 침투성 측정

EGFP-PTD(1) 융합단백질을 여러 농도(50 nM부터 2 μM까지)로 준비하여 PPFF 세포에 37 ℃에서 24시간 동안 처리하여 세포 내로 투과시켰다. 융합단백질은 대략 배양액에 넣어준 농도에 비례하여 투과도가 증가하였는데, 특히 500 nM 이상일 때 초록색 형광이 강하게 관찰되었다[도 4]. 또한, 확립된 세포주인 쥐 기형암종(murine teratocarcinoma) F9와 사바나원숭이 신장 섬유아세포(monkey kidney fibroblast) COS7을 이용한 실시예에서도 동일한 결과를 얻었다. 본 실시예에서 사용한 융합단백질의 농도는 500 nM이며 37 ℃에서 24시간 동안 처리하여 세포 내로 투과시켰다. 단 F9 세포주에서는 COS7 세포주보다 낮은 투과도를 보 였다[도 5].

실시예 5: PTD의 개수에 따른 융합단백질들의 침투성 측정

실시예 1에서의 각 재조합 융합단백질들을 500 nM로 준비하여 PPFF 세포에 처리하여 투과시킨 결과, 대략 PTD의 개수에 비례하여 투과성이 증가하였고 이때 EGFP-PTD(3) 이상일 때 거의 모든 세포에서 초록색 형광이 관찰되었다[도 6].

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 융합 단백질은 PTD와의 융합을 통해 이종 단백질을 세포 내로 효과적으로 침투시킬 수 있었다. 이는 생쥐 혹스씨-8의 PTD와 연구ㆍ치료 등에 필수적인 단백질과의 융합단백질을 제조함으로써 살아있는 세포에 효율적으로 직접 전달하여 단백질 기능 연구와 치료에 기여할 것이다.

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서열번호 3으로 표시되는 생쥐 혹스씨-8 PTD(protein transduction domain)와 이의 아미노 말단에 공유결합으로 융합된 이종단백질을 포함하며, 서열번호 6, 7, 8, 9 또는 10의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 세포침투성 융합단백질.
삭제
청구항 4의 세포침투성 융합단백질을 코딩하며, 서열번호 11, 12, 13, 14 또는 15의 염기 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
청구항 4의 융합단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.