CN108707187A - 一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用,所述细胞穿膜肽包括第一序列RRRRRKQARRPRRRRAR,或包含第二序列RSSRRRRRRRRRKQRKVKR。且所述细胞穿膜肽安全,穿膜效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域,尤其涉及一种人源性细胞穿膜肽及其制备方法、应用。
背景技术
由于细胞膜的屏障作用,多种具有治疗功效的蛋白质、多肽和寡聚核苷酸难以进入细胞发挥药效。因而如何把有生物活性的物质直接从细胞外导入细胞内,是一个很有意义的研究课题。近年来,一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽(其长度一般不超过30个氨基酸)相继被发现,可有效携带比其分子质量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞,并对宿主细胞没有显著毒副作用。这些具有细胞穿透功能的多肽,被称为细胞穿膜肽(cellpenetratingpeptide,CPPs)。
细胞穿膜肽(Cell Penetrating Peptide,CPPs)是一类能够穿膜的小分子多肽,如TAT,transportan,HIV-1等,能作为一个载体高效运送多种不同大小和性质的生物活性物质(包括蛋白、多肽、核酸分子、脂质体、小分子有机化合物等)进入几乎所有的哺乳动物细胞,并对宿主细胞没有显著毒副作用。CPPs的种类繁多,其分类依据有物理化学特性、来源、摄入机制、生物医学应用等,目前尚没有统一的定论。根据其物理化学特性,CPPs可以分为三种类型:阳离子型、两亲型和疏水型,其中以阳离子型和两亲型CPPs为主,约占85%,而疏水型CPPs仅占15%。
阳离子穿膜肽是一类富含正电荷的穿膜肽,TAT是第一条被发现的穿膜肽,属于典型的阳离子穿膜肽。在生物体内,蛋白质带正电荷的区域能够帮助蛋白质跨膜或者锚定在细胞表面,从而帮助蛋白质更好地与细胞表面的多糖或者受体结合。
发明内容
针对上述现有技术中的缺陷,本发明提供了一种人源性细胞穿膜肽及其制备方法、应用,且所述细胞穿膜肽安全,穿膜效果显著。
本发明为解决上述技术问题所提供的技术方案如下:
一方面,提供了一种细胞穿膜肽,其所述细胞穿膜肽包括第一序列
RRRRRKQARRPRRRRAR,或包含第二序列RSSRRRRRRRRRKQRKVKR。
另一方面,还提供了一种上述细胞穿膜肽的制备方法,其包括如下步骤:
S1、提供树脂,且将所述树脂在第一溶剂中浸泡至所述树脂溶胀;
S2、将缩合剂、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、脯氨酸或缩合剂、精氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸溶于第二溶剂中,形成混合物;
S3、在所述混合物加入溶胀的树脂中形成反应体系,反应时间为1-4h;
S4、去除反应后所述反应体系中的溶液,对残留物洗涤1-5次,气体鼓动,抽干;
S5、在所述残留物中加入脱帽液,气体鼓动,抽干;
S6、去除经由步骤S5后的反应体系中的溶液,洗涤1-10次,气体鼓动,抽干,由此获得合成的多肽链;
S7、在所述多肽链中加入切割液,在4-30℃下搅拌1-4h,过滤得滤液,且洗涤所述滤液;
S8、对经洗涤过的滤液进行萃取,离心得到细胞穿膜肽粗品;
以及S9、对所述细胞穿膜肽粗品进行鉴定和纯化。
优选的,所述树脂包括Fmoc-Wang树脂。
优选的,在步骤S2中,所述缩合剂包括苯并三唑鎓盐型缩合剂;在步骤S1中,所述第一溶剂包括:二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷及四氢呋喃中的一种或几种;在步骤S5中,所述脱帽液包括:二甲基甲酰胺溶液,以及溶解于二甲基甲酰胺溶液中的6%W/V的哌嗪和0.1M HOBT;在步骤S7中,所述切割液包括:以重量百分数计,95%的TFA、2%的TIS以及3%的H2O。
优选的,所述苯并三唑鎓盐型缩合剂包括O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐中的一种或几种。
优选的,每种氨基酸与所述树脂的投料摩尔量比例为(1:1)-(10:1);所述缩合剂与所述树脂的投料摩尔量比例为(1:1)-(10:1)。
优选的,所述步骤S8中,所述萃取包括:在经洗涤过的滤液中加入无水乙醚,放置1-4h;且所述无水乙醚与滤液的体积比为(5:1)-(60:1)。
另一方面,还提供一种上述细胞穿膜肽的应用方法,所述细胞穿膜肽用于在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子,并携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。
优选的,携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞的过程包括:所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA。
优选的,所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA的过程包括如下步骤:
S1、将质粒DNA与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液中;
S2、调整所述质粒DNA与所述细胞穿膜肽两者间的N/P比为0-80;
S3、培养过夜的细胞,用无血清的培养基洗涤,将含有所述质粒DNA和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中;
以及S4、4-6h后去掉培养基,添加含有10-15%FCS的培养基,静置1-4h。
本发明技术方案所带来的效果:
本发明的人源性细胞穿膜肽穿膜效果显著,穿膜效率高;且免疫原性低,安全低毒;制备方法操作简单且便于进行质量管控。
附图说明
图1a为本发明的细胞穿膜肽SPOCK2与质粒DNA结合后最优N/P比的实验结果图。
图1b为本发明的细胞穿膜肽TSPYL2与质粒DNA结合后最优N/P比的实验结果图。
图2a为本发明的细胞穿膜肽SPOCK2用于BHK21细胞转染结果示意图。
图2b为本发明的细胞穿膜肽TSPYL2用于BHK21细胞转染结果示意图。
图3a为本发明的细胞穿膜肽SPOCK2用于B16细胞转染结果示意图。
图3b为本发明的细胞穿膜肽TSPYL2用于B16细胞转染结果示意图。
图4a为本发明的细胞穿膜肽SPOCK2用于BHK21及B16转染得到的荧光值。
图4b为本发明的细胞穿膜肽TSPYL2用于BHK21及B16转染得到的荧光值。
图5a为本发明的细胞穿膜肽SPOCK2用于BHK21MTT结果示意图。
图5b为本发明的细胞穿膜肽TSPYL2用于BHK21MTT结果示意图。
图6a为本发明的细胞穿膜肽SPOCK2用于B16MTT结果示意图。
图6b为本发明的细胞穿膜肽TSPYL2用于B16MTT结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例一:
通过对人类蛋白质数据库进行检索,发明人发现人类的SPOCK2蛋白(SPARC/osteonectin,CWCV,and Kazal-like domains proteoglycan 2)的C端与细胞膜紧密结合,有多个多糖黏着位点,以及发现人类的类Y染色体编码睾丸特异蛋白基因2(Testis-specific proteinY encoded-like,TSPYL2)编码一类具有参与核小体装配,维持细胞活力状态功能的蛋白具有此功能,该蛋白需要与DNA结合发挥功能。
进一步分析发现,SPOCK2蛋白C端的一段长17个氨基酸的短肽(RRRRRKQARRPRRRRAR)富含精氨酸,具有很强的正电荷,推测这段短肽可能是一个新型的人源性穿膜肽,具有自主穿膜功能,由此提供了本实施例中的人源性细胞穿膜肽(简称SPOCK2),其包括如下所述的第一序列:RRRRRKQARRPRRRRAR,其氨基酸序列如序列表所示;其中,所述R选自精氨酸残基,所述K选自赖氨酸残基,所述Q选自谷氨酰胺残基,所述A选自丙氨酸残基,所述P选自脯氨酸残基。
同时,还发现TSPYL2蛋白的一段长19个氨基酸的短肽(RSSRRRRRRRRRKQRKVKR)富含精氨酸,具有很强的正电荷,推测这段短肽可能是一个新型的人源性穿膜肽,具有自主穿膜功能。由此提供了本实施例中的人源性细胞穿膜肽(简称TSPYL2),其包括如下所述的第二序列:RSSRRRRRRRRRKQRKVKR,其氨基酸序列如序列表所示;其中,所述R选自精氨酸残基,所述S选自丝氨酸残基,所述K选自赖氨酸残基,所述Q选自谷氨酰胺残基,所述V选自缬氨酸残基。
进一步的,上述细胞穿膜肽的制备方法包括如下步骤:
S1、称取树脂(如Fmoc-Wang树脂),倒入反应器中,加入第一溶剂(包括二氯甲烷(DCM)、二甲基甲酰胺(DMF)及四氢呋喃(THF)中的一种或几种)浸泡,直至所述树脂在第一溶剂中浸泡至所述树脂溶胀,再向反应器中加入适量脱保护溶液,通氮气鼓动0.5-2小时(优选为1.5h),抽干,再向反应器中加入适量DMF,通氮气鼓动,抽干;重复上述加脱保护液、通氮气鼓动、抽干以及加适量DMF、通氮气鼓动、抽干的操作1-10次(优选为5次);
S2、称取氨基酸以及缩合剂,需要说明的是,若制备的是SPOCK2,则称取的是精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、脯氨酸,若制备的是TSPYL2,则称取的是精氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸;
且每种氨基酸的摩尔量均为所述树脂摩尔量的1倍,所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的3倍;优选的,所述缩合剂包括苯并三唑鎓盐型缩合剂,且所述苯并三唑鎓盐型缩合剂包括O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)中的一种或几种;再将氨基酸、缩合剂溶于盛装于反应器内的第二溶剂(包括DMF、DCM、THF中的一种或几种)中,形成混合物;
S3、在所述混合物加入溶胀的树脂中形成反应体系,反应时间为1-4h(优选为3h),茚三酮法检测直至不显色时停止反应;
S4、抽干去除反应后所述反应体系中的溶液,加适量DMF对残留物洗涤1-5次(优选为3次),通氮气鼓动,抽干;
S5、在所述残留物中加入脱帽液,通氮气鼓动1-3h(优选为2h),抽干,直至茚三酮法检测呈阳性;优选的,所述脱帽液包括:DFM溶液,以及溶解于所述二甲基甲酰胺(DFM)溶液中的6%W/V的哌嗪和0.1M HOBT;
S6、抽干去除经由步骤S5后的反应体系中的溶液,加适量DMF洗涤1-10次,通氮气鼓动,抽干,由此获得含Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Gln-Ala-Arg-Arg-Pro-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg(SPOCK2)或Arg-Ser-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Gln-Arg-Lys-Val-Lys-Arg(TSPYL2)的多肽链;
S7、将干燥后的树脂装入合适的离心管中,在所述多肽链中加入切割液,在4-30℃(优选为18℃)下恒温机械搅拌1-4h(优选为3h),过滤得滤液,且用TFA洗涤所述滤液;所述切割液包括:以重量百分数计,95%的TFA、2%的TIS以及3%的H2O;
S8、过滤所述滤液,将滤液全部收集到烧瓶中;对经洗涤过的滤液进行萃取,高速离心得到细胞穿膜肽粗品;所述萃取包括:在经洗涤过的滤液中加入无水乙醚,放置1-4h(优选为3h);且所述无水乙醚与滤液的体积比为(5:1)-(60:1)(优选为30:1);
以及S9、运用HPLC/MS或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化,最终得到所需多肽。
此外,本实施例还提供一种上述细胞穿膜肽的应用方法,具体的,所述细胞穿膜肽用于在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子,并携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。本实施例中,所述标记物选自荧光素、生物素以及亲和基团中的一种或几种;所述载物分子选自糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子及纳米微球中的一种或几种。
其中,携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞的过程包括:所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA;本实施例中,所述质粒选自pEGFP或PdsRED。
具体的,所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA的过程包括如下步骤:
S1、将质粒DNA与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液中;
S2、调整所述质粒DNA与所述细胞穿膜肽两者间的N/P(即NH+3/PO-4)比为0-80;优选的,调整两者间N/P比分别为0、1、3、5、10、20、40、80;
将上述调整好N/P比的质粒DNA与所述细胞穿膜肽混合液进行琼脂糖电泳实验,确定最优N/P比,结果如图1a所示,对于SPOCK2而言,其N/P在10左右时,质粒DNA与细胞穿膜肽结合较好,因此,上述两者间N/P比可进一步优选为10;如图1b所示,对于TSPYL2而言,其N/P在5左右时,质粒DNA与细胞穿膜肽结合较好,因此,上述两者间N/P比可进一步优选为5;
S3、培养过夜的细胞,用无血清的培养基洗涤,将含有所述质粒DNA和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中;
以及S4、4-6h(优选为5h)后去掉培养基,添加含有10-15%FCS(即胎牛血清)的培养基,静置1-4h(优选为3h)。
实施例二:
本实施例与实施例一的不同之处仅在于,细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中,每种氨基酸的摩尔量均为所述树脂摩尔量的5倍,所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的10倍。
实施例三:
本实施例与实施例一的不同之处仅在于,细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中,每种氨基酸的摩尔量均为所述树脂摩尔量的1倍,所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的10倍。
实施例四:
本实施例与实施例一的不同之处仅在于,细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中,每种氨基酸的摩尔量均为所述树脂摩尔量的5倍,所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的1倍。
实施例五:
本实施例与实施例一的不同之处仅在于,细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中,每种氨基酸的摩尔量均为所述树脂摩尔量的10倍,所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的10倍。
实施例六:
本实施例与实施例一的不同之处仅在于,细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中,种氨基酸的摩尔量均为所述树脂摩尔量的7倍,所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的5倍。
如下分别示出了本发明的细胞穿膜肽SPOCK2、TSPYL2与质粒DNA结合后的穿膜效果实验过程,其具体包括如下步骤:
(1)实验组为本发明的细胞穿膜肽,将本发明的细胞穿膜肽SPOCK2和pEGFP(或PdsRED)按0、10、20、40、80的N/P比混合,或将细胞穿膜肽TSPYL2和pEGFP(或PdsRED)按0、5、10、20、40、80的N/P比混合;
室温或者37℃孵育半个小时或一个小时;对照组为穿膜肽Tat,对应的,其同样分别与pEGFP(或PdsRED)按0、10、20、40、80或0、5、10、20、40、80的N/P比混合,孵育时间以及温度条件与实验组相同;
(2)培养细胞(分别为BHK21和B16细胞系)过夜,用没有血清的培养基洗两次;实验组中,在细胞中加入质粒DNA和细胞穿膜肽SPOCK2/TSPYL2,形成实验组混合物,再取所述实验组混合物500μl加入到培养基中;
(3)6小时后去掉原培养基,添加含有10%胎牛血清的新鲜培养基;
(4)1-4小时后显微镜观察;如图2a-2b所示,在BHK21细胞系中,本发明的细胞穿膜肽SPOCK2/TSPYL2与质粒DNA在N/P比为10的条件下结合时,其已能将质粒DNA带入胞内,在N/P比为10时,其穿膜效率即可超过Tat的穿膜效率,且在N/P比为80时,其穿膜效率最高,远高于Tat的穿膜效率;
类似的,如图3a-3b所示,在B16细胞系中,本发明的细胞穿膜肽SPOCK2与质粒DNA在N/P比为10、TSPYL2与质粒DNA在N/P比为5的条件下结合时,其均已能将质粒DNA带入胞内;在N/P比为40时,细胞穿膜肽SPOCK2的穿膜效率最高;在N/P比为20时,细胞穿膜肽TSPYL2穿膜效率最高,且在上述两个N/P下,SPOCK2/TSPYL2的穿膜效率均远高于Tat的穿膜效率。
(5)BHK21或B16细胞系细胞经上述处理4h后经酶标仪检测,得到荧光定量结果,如图4a-4b所示,在BHK21及B16细胞系中,本发明的细胞穿膜肽SPOCK2/TSPYL2在各个浓度值上,其荧光强度均强于Tat的荧光强度,且均在20μM时,荧光强度最强。
如下示出了本发明的细胞穿膜肽SPOCK2/TSPYL2细胞毒性实验过程,其具体包括如下步骤:
(1)取对数生长期培养细胞BHK21和B16,以每孔1×104个细胞接种于96孔板,37℃下于5%二氧化碳培养箱中培养24小时,使细胞贴壁;
(2)达到对数生长期时换成无血清的培养液,继续培养1小时;
(3)配置不同浓度的细胞穿膜肽SPOCK2/TSPYL2,同时设置三个阴性对照孔及阳性对照孔(Tat),阳性对照孔(Tat)按照说明书操作进行实验;37℃下于5%二氧化碳培养箱培养1-24h;
(4)孵育时间结束后,每孔均加入PBS洗涤;
(5)贴壁细胞每孔加入20μl MTT(0.5%),继续孵育4-6h之后弃掉培养液,每孔加入150μl DMSO(二甲基亚砜),震荡10min;
(6)比色:选择490nm或570nm波长,在酶标仪免疫检测仪上测定光吸收值,处理数据得到细胞存活率;结果如图5a-5b所示,对于BHK21细胞系,本发明细胞穿膜肽SPOCK2/TSPYL2在0-16μmol/L的浓度范围内,细胞存活率与阳性对照组无明显差别;
如图6a-6b所示,对于B16细胞系,本发明细胞穿膜肽SPOCK2/TSPYL2在0-16μmol/L的浓度范围内,细胞存活率与阳性对照组无明显差别;上述实验结果证明本发明涉及的细胞穿膜肽安全低毒,其毒性与Tat无差别,且各浓度的毒性变化不大,无浓度依赖性。
综上所述,本发明的细胞穿膜肽SPOCK2/TSPYL2具有如下优点:分子量小,氨基酸残基个数少,穿膜效果显著,效率明显高于穿膜肽Tat;免疫原性低,安全低毒,毒性与Tat无差别;可由固相合成方法而得,所述合成方法既可以在实验室水平也可在工业水平进行,操作简单且便于质量管控。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种细胞穿膜肽,其特征在于:所述细胞穿膜肽包括第一序列RRRRRKQARRPRRRRAR,或包含第二序列RSSRRRRRRRRRKQRKVKR。
2.一种如权利要求1所述的细胞穿膜肽的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、提供树脂,且将所述树脂在第一溶剂中浸泡至所述树脂溶胀;
S2、将缩合剂、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、脯氨酸或缩合剂、精氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸溶于第二溶剂中,形成混合物;
S3、在所述混合物中加入溶胀的树脂已形成反应体系,反应时间为1-4h;
S4、去除反应后所述反应体系中的溶液,对残留物洗涤1-5次,气体鼓动,抽干;
S5、在所述残留物中加入脱帽液,气体鼓动,抽干;
S6、去除经由步骤S5后的反应体系中的溶液,洗涤1-10次,气体鼓动,抽干,由此获得合成的多肽链;
S7、在所述多肽链中加入切割液,在4-30℃下搅拌1-4h,过滤得滤液,且洗涤所述滤液;
S8、对经洗涤过的滤液进行萃取,离心得到细胞穿膜肽粗品;
以及S9、对所述细胞穿膜肽粗品进行鉴定和纯化。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述树脂包括Fmoc-Wang树脂。
4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,在步骤S2中,所述缩合剂包括苯并三唑鎓盐型缩合剂;在步骤S1中,所述第一溶剂包括:二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷及四氢呋喃中的一种或几种;在步骤S5中,所述脱帽液包括:二甲基甲酰胺溶液,以及溶解于二甲基甲酰胺溶液中的6%W/V的哌嗪和0.1M HOBT;在步骤S7中,所述切割液包括:以重量百分数计,95%的TFA、2%的TIS以及3%的H2O。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述苯并三唑鎓盐型缩合剂包括O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐中的一种或几种。
6.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,每种氨基酸与所述树脂的投料摩尔量比例为(1:1)-(10:1);所述缩合剂与所述树脂的投料摩尔量比例为(1:1)-(10:1)。
7.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤S8中,所述萃取包括:在经洗涤过的滤液中加入无水乙醚,放置1-4h;且所述无水乙醚与滤液的体积比为(5:1)-(60:1)。
8.一种如权利要求1所述的细胞穿膜肽的应用方法,其特征在于,所述细胞穿膜肽用于在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子,并携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。
9.如权利要求8所述的应用方法,其特征在于,携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞的过程包括:所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA。
10.如权利要求9任一项所述的应用方法,其特征在于,所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA的过程包括如下步骤:
S1、将质粒DNA与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液中;
S2、调整所述质粒DNA与所述细胞穿膜肽两者间的N/P比为0-80;
S3、培养过夜的细胞,用无血清的培养基洗涤,将含有所述质粒DNA和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中;
以及S4、4-6h后去掉培养基,添加含有10-15%FCS的培养基,静置1-4h。
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Denomination of invention: The invention relates to a cell membrane penetrating peptide and a preparation method and application thereof Effective date of registration: 20211119 Granted publication date: 20210129 Pledgee: Bank of Hankou Limited by Share Ltd. Sales Department Pledgor: TAIZE (WUHAN) BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2021420000127 |