CN103897043A - 一种穿膜多肽连接拉帕替尼的制备及应用 - Google Patents

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CN103897043A CN201210580890.9A CN201210580890A CN103897043A CN 103897043 A CN103897043 A CN 103897043A CN 201210580890 A CN201210580890 A CN 201210580890A CN 103897043 A CN103897043 A CN 103897043A
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郑学敏
袁静
龚珉
孔维苓
徐为人
汤立达
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Abstract

本发明所述的细胞穿膜肽，由24个氨基酸组成，而且是亲水性和疏水性交替组合的，含有大量的赖氨酸和精氨酸，本发明通过固相合成的方法得到所需多肽，并且通过化学合成的方法与拉帕替尼连接，本发明还提供连接物的通过血脑屏障的作用以及抑瘤作用。

Description

一种穿膜多肽连接拉帕替尼的制备及应用
技术领域
本发明涉及肿瘤相关的药物领域，具体而言，本发明涉及一种多肽与拉帕替尼连接形成一种新的药物，该多肽本身不具有生理活性，但是具有透过血脑屏障的作用，本发明还涉及该多肽的制备方法及其应用。
背景技术
由于血脑屏障的存在，脑瘤的治疗是肿瘤学研究的最大挑战。血脑屏障是机体参与固有免疫的内部屏障之一，由介于血循环与脑实质间的软脑膜、脉络丛的脑毛细血管壁和包于壁外的胶质膜所组成，能阻挡病原生物和其他大分子物质由血循环进入脑组织和脑室。脑瘤快速增殖、渗透影响周围的正常组织。目前，放射性治疗与化学疗法只能延长患者生命4个月，现在化学疗法等效果差的原因一部分是由于血脑屏，因此，本发明致力于研究使现有药物更好的透过血脑屏障。
拉帕替尼（lapatinib）是近年开发的针对EGFR和HER的双靶点抗肿瘤新药，是英国葛兰素史克(GlaxOSmithKline)公司开发的，于2007年3月13日经优先审批程序获得FDA批准在美国上市，后相继在澳大利亚、印度、韩国、印度尼西亚、新加坡、中国香港等国家和地区获批销售和使用。目前，拉帕替尼用于联合卡培他滨治疗HER2过度表达的，既往接受过包括蒽环类、紫杉醇、曲妥珠单抗(赫赛汀)治疗的晚期或转移性乳腺癌。在对拉帕替尼的I期临床研究中，研究者发现对晚期难治性实体瘤患者表现出较好疗效或可使疾病趋于稳定，同时证实药物毒性较小；在对拉帕替尼的II期试验的结果初步表明拉帕替尼对HER2阳性炎性乳腺癌的疗效突出；在对拉帕替尼的III期试验的结果显示，拉帕替尼可使中位肿瘤延迟，并且脑瘤转移的发生也减少，但是这部分的机理还没有明确的报道，本发明主要针对拉帕替尼透过血脑屏障之后可能会对脑瘤起到较好的抑制作用。
多肽由于其具有极性末端和非极性末端，因此在体内有较高的利用度，由于本身是内源性物质所以毒性小，但是多肽直接作为药物受到较大的限制，例如其稳定性差，不能口服。近年来，多肽作为药物辅助功能的应用逐渐成为了新药研制的热点之一。细胞穿膜肽（CPPS）通常由5~30个氨基酸组成，典型的一般由8~16个氨基酸。
近些年来多肽和药物通过共价方式形成组合物的例子很多，例如：多肽Penetratin和阿霉素共价耦合用于治疗乳腺癌；多肽TAT和药物P53共价耦合用于治疗眼癌转移；多肽YTA4与甲氨蝶呤共价耦合治疗乳腺癌。
发明内容
以下是本发明的详细描述：
（1）本发明所述的穿膜肽
本发明所述的细胞穿膜肽，由24个氨基酸组成，而且是亲水性和疏水性交替组合的，含有大量的赖氨酸和精氨酸，所述的穿膜肽序列为下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：
SEQ ID NO:1：X1X2WWK X3WWKX4 WWKSX5 WWRKR KRKX6
通式I
其中X1为：甘氨酸或丙氨酸；
其中X2为：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸；
其中X3为：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸；
其中X4为：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸；
其中X5为：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸；
其中X6为：甘氨酸或者丙氨酸。
所述具有通式I的序列：
SEQ ID NO:2:GLWWK GWWKV WWKSG WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:3:GLWWK AWWKG WWKSG WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:4:GLWWK GWWKA WWKSG WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:5:GLWWK GWWKV WWKSG WWRKR KRKA；
SEQ ID NO:6:ALWWK GWWKP WWKSG WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:7:ALWWK VWWKP WWKSV WWRKR KRKV。
优选地：X3=X4，所述穿膜肽序列具有通式II
X1X2WWK X3WWKX3 WWKSX4 WWRKR KRKX5
通式II
所述具有通式II的序列：
SEQ ID NO:8:GLWWK GWWKG WWKSG WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:9:GLWWK AWWKA WWKSG WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:10:GLWWK AWWKA WWKSG WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:11:GLWWK VWWKV WWKSG WWRKR KRKA；
SEQ ID NO:12:ALWWK PWWKP WWKSG WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:13:ALWWK PWWKP WWKSV WWRKR KRKV。
更优选地：X3=X4=X6，所述穿膜肽序列具有通式III
X1X2WWK X3WWKX3 WWKSX4 WWRKR KRKX3
通式III
所述具有通式III的序列：
SEQ ID NO:14：GLWWK AWWKA WWKSL WWRKR KRKA；
SEQ ID NO:15：ALWWK GWWKG WWKSL WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:16：ALWWK PWWKP WWKSL WWRKR KRKP；
SEQ ID NO:17：ALWWK VWWKV WWKSL WWRKR KRKV；
SEQ ID NO:18：GLWWK VWWKV WWKSL WWRKR KRKV。
（2）本发明所述的穿膜肽的制备方法
本发明所需多肽是采用固相的方法制备的，固相合成是以固相载体树脂为载体，从C端即羧基端向N端即氨基端逐渐添加氨基酸的过程。
本发明中优选树脂：Fmoc-wang树脂、2-cl-trt树脂，树脂取代度0.24~0.4。
本发明所使用的保护氨基酸为：Fmoc-Tyr（tBu）-OH，Fmoc-Ile-OH Fmoc-leu（tBu）-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Lys（Boc）-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Arg（pbf）-OH，Fmoc-Ser（tBu）-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Cys（Trt）-OH，Fmoc-Gln（Trt）-OH，Fmoc-Asn（trt）-OH，Fmoc-Trp（tBu）-OH，Fmoc-Asp-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，反应过程中保护氨基酸3~5倍过量。
本发明所使用的脱保护试剂为：哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，比例为10:90~30:70。
本发明所使用的偶联试剂为：①苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑(HOBT)。②2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基苯并三唑(HOBT)。③N,N'-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(HOBT)。
本发明中，若使用第①或者第②种偶联试剂，那么反应中过程中应添加缚酸剂：DIEA/NMP。
本发明中所使用的切割试剂为：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1,2-乙二硫醇，比例为：82.5:5:5:5:2.5。
本发明中所使用MS-IT-TOF确定分子量，使用HPLC纯化粗肽。
（3）本发明所需的多肽与拉帕替尼的连接方法
Figure BDA00002670280000051
1）化合物II的合成
50ml反应瓶中加入1.00g（1.72mmol）拉帕替尼，0.52g（5.20mmol）丁二酸酐，30mlTHF，滴加0.66g（5.12mmol）N,N-二异丙基乙胺（DIEA)，27℃搅拌6h，蒸干溶剂得蜡状物，加水搅拌，有黄色固体析出，抽滤，水洗两次，干燥，得黄色固体1.15g。
2）化合物I的合成
50ml反应瓶中加入0.22g（0.32mmol）化合物II，0.10g（0.31mmol）O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，5mlDMF，氮气保护，滴加0.08g（0.62mmol）N,N-二异丙基乙胺（DIEA），27℃搅拌1h后，加入0.10g多肽，27℃搅拌3h后，终止反应。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1:多肽的固相合成
使用Fmoc策略的固相多肽合成方法（使用的氨基酸购自上海吉尔公司），使用CEM公司生产的Liberitity型仪器进行本发明的穿膜多肽的合成。操作方法按照生产商的仪器说明书进行。
以SEQ ID NO:8:GLWWK GWWKG WWKSG WWRKR KRKG为例，合成所用试剂选择：
（1）载体树脂：fmoc-Gly-wang-rink，替代度：0.33；
（2）所选用的保护氨基酸：Fmoc-Gly-OH，Fmoc-leu（tBu）-OHFmoc-Lys（Boc）-OH，Fmoc-Ser（tBu）-OH，Fmoc-Arg（pbf）-OH，反应中所用保护氨基酸5倍过量；
（3）本发明所使用的脱保护试剂为：哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，比例为20:80；
（4）本发明所使用的偶联试剂为：N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）/1-羟基苯并三唑(HOBT)；
（5）本发明中所使用的切割试剂为：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1,2-乙二硫醇，比例为：82.5:5:5:5:2.5。
将制得的多肽使用HPLC C18半制备柱（购自Phenomenex公司）进行纯化，检测条件为：检测波长：214nm，流动相A：乙腈（含0.1%三氟乙酸），流动相B：水（含0.1%三氟乙酸），洗脱条件：30分钟内由35%A~50%A,利用MS-IT-TOF确定所得纯品分子量，用HPLC确定样品纯度，纯度大于95%经脱盐及冷冻干燥得到多肽冻干粉，制得SEQ ID NO:8。
实施例2：拉帕替尼与多肽连接物透过血脑屏障的体内评价
本实施例中，采用的穿膜多肽如下：
SEQ ID NO:2:GLWWK GWWKV WWKSG WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:8:GLWWK GWWKG WWKSG WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:14：GLWWK AWWKA WWKSL WWRKR KRKA。
本实施例中，将穿膜多肽SEQ ID NO:2与拉帕替尼连接成功后，标记为LP/SEQ IDNO:2;将穿膜多肽SEQ ID NO:8与拉帕替尼连接成功后，标记为LP/SEQ ID NO:8;将穿膜多肽SEQ ID NO:14与拉帕替尼连接成功后，标记为LP/SEQ ID NO:14。
将上述连接物（共计3种）及对照（拉帕替尼）用生理盐水配置成10mg/ml溶液，将大鼠（购自中科院上海实验动物中心，SD大鼠）用乙醚麻醉，经股静脉注射（200μL/只，6只/组），分别于注射后30分钟取脑脊液，并断颈处死大鼠。脑脊液经液质联用测定透过血脑屏障的情况。
实验结果表明：三组实验组可分别在脑脊液中检测到LP/SEQ ID NO:2，LP/SEQID NO:8和LP/SEQ ID NO:14，而对照组并没有检测到拉帕替尼的存在。
实施例3：拉帕替尼与多肽连接物透过血脑屏障的体外评价
本实施例中，仍然采用穿膜多肽如下：
SEQ ID NO:2:GLWWK GWWKV WWKSG WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:8:GLWWK GWWKG WWKSG WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:14：GLWWK AWWKA WWKSL WWRKR KRKA。
本实施例中，将穿膜多肽SEQ ID NO:2与拉帕替尼连接成功后，标记为LP/SEQ IDNO:2;将穿膜多肽SEQ ID NO:8与拉帕替尼连接成功后，标记为LP/SEQ ID NO:8;将穿膜多肽SEQ ID NO:14与拉帕替尼连接成功后，标记为LP/SEQ ID NO:14。
本实施例中，采用的细胞为：Hela，SK-BR-3，NIH3T3（购自中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所），将细胞种在24孔板中，浓度为2×105孔，培养过夜，LP/SEQ ID NO:2，LP/SEQ ID NO:8，LP/SEQ ID NO:14用PBS溶解，与细胞孵育使其终浓度为10umol/l。
本实施例中，使用免疫荧光染色，①用4%的甲醛在4°下固定细胞10分钟。②用3%冷Triton-X100缓冲液在4°渗透细胞20分钟。③2%的BSA封闭缓冲液在室温下封闭细胞30分钟。④羊抗人-FLAG mAb在室温下孵育细胞1小时。⑤2mg/mlStreptavidin-Alexa499在室温下孵育细胞1小时。以上每步均用PBS冲洗至少两遍。⑥0.3%Triton-X100缓冲液洗20分钟。最后置细胞与显微镜及共聚显微镜下观察。
实验结果表明：细胞内均有染色，即表明LP/SEQ ID NO:2、LP/SEQ ID NO:8、LP/SEQ ID NO:14均可通过细胞膜。
实施例4：拉帕替尼与多肽连接物抗肿瘤作用研究
本实施例中，采用穿膜多肽如下：
SEQ ID NO:15：ALWWK GWWKG WWKSL WWRKR KRKG；
SEQ ID NO:16：ALWWK PWWKP WWKSL WWRKR KRKP；
SEQ ID NO:17：ALWWK VWWKV WWKSL WWRKR KRKV。
本实施例中，将穿膜多肽SEQ ID NO:15与拉帕替尼连接成功后，标记为LP/SEQID NO:15;将穿膜多肽SEQ ID NO:16与拉帕替尼连接成功后，标记为LP/SEQ IDNO:16;将穿膜多肽SEQ ID NO:17与拉帕替尼连接成功后，标记为LP/SEQ ID NO:17。
本实施例中，采用的细胞为：FCY20201MCF-7，FCY202111590BS524(T47D)，TC-hxbz-286M453，利用MTT法评价拉帕替尼与多肽连接物的抑瘤效果。
收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔。5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），4小时以后加入5个浓度梯度的药物，原则上，每孔100ul，设5个复孔，继续孵育48小时，倒置显微镜下观察。每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。小心吸去孔内培养液，每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡5min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
本实施例计算结果采用公式：
增殖抑制率=1-(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)，其中每组的A值为减去凋零孔之后的结果。
实验结果显示：多肽SEQ ID15、SEQ ID16、SEQ ID17与拉帕替尼的连接物仍然具有较好的抑瘤效果，根据增殖抑制率公式可以计算出SEQ ID15、16、17在100ug/ml的抑瘤率分别为99.99%，99.3%，99.90%；在10ug/ml的抑瘤率分别为99.90%，98.16%，96.56%；在1ug/ml的抑瘤率分别为86.73%，79.11%，63.48%；在0.1ug/ml的抑瘤率分别为20.98%，0，6.2%。具体SEQ ID NO:15、16、17浓度在100ug/ml、10ug/ml、1ug/ml、0.1ug/ml、0.01ug/ml的吸光度值分别见表1、表2、表3。
表1：LP/SEQ ID NO:15吸光度值
100ug/ml 10ug/ml 1ug/ml 0.1ug/ml 0.01ug/ml
0.0034 0.0122 0.1569 0.9142 1.1196
0.0039 0.0156 0.1657 0.9211 1.1231
0.0042 0.0165 0.1672 0.9607 1.198
0.0049 0.0149 0.1697 0.9982 1.1482
0.0051 0.0198 0.1553 0.9537 1.1356
表2：LP/SEQ ID NO:16吸光度值
100ug/ml 10ug/ml 1ug/ml 0.1ug/ml 0.01ug/ml
0.0035 0.0235 0.2356 1.2025 1.2305
0.0058 0.0244 0.2655 1.2121 1.2032
0.0055 0.0309 0.2601 1.9203 1.1905
0.0054 0.0257 0.2548 1.1601 1.1965
0.0047 0.0261 0.2544 1.1877 1.1984
表3：LP/SEQ ID NO:17吸光度值
100ug/ml 10ug/ml 1ug/ml 0.1ug/ml 0.01ug/ml
0.0045 0.0412 0.4126 1.1023 1.254
0.0052 0.0425 0.4258 1.1156 1.2144
0.0055 0.0501 0.4786 1.1634 1.2301
0.0063 0.0499 0.4523 1.1241 1.1986
0.0049 0.0432 0.4361 1.1264 1.1997
Figure IDA00002670280500011
Figure IDA00002670280500021
Figure IDA00002670280500031
Figure IDA00002670280500041
Figure IDA00002670280500051
Figure IDA00002670280500061
Figure IDA00002670280500071

Claims (13)

1.一种细胞穿膜肽，由24个氨基酸组成，而且是亲水性和疏水性交替组合的，含有大量的赖氨酸和精氨酸，所述的穿膜肽序列为下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：
SEQ ID NO:1：X1X2WWK X3WWKX4 WWKSX5 WWRKR KRKX6
通式I
其中X1为：甘氨酸或丙氨酸；
其中X2为：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸；
其中X3为：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸；
其中X4为：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸；
其中X5为：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸；
其中X6为：甘氨酸或丙氨酸。
2.根据权利要求1所述，穿膜肽选自具有通式I的序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7。
3.根据权利要求1所述，通式I中优选地：X3=X4，得到通式II即X1X2WWK X3WWKX3 WWKSX4 WWRKR KRKX5。
4.根据权利要求3所述，穿膜肽选自具有通式II的序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13。
5.根据权利要求1所述，通式I中更优选地：X3=X4=X6，得到通式III，即X1X2WWK X3WWKX3 WWKSX4 WWRKR KRKX3。
6.根据权利要求5所述，穿膜肽选自具有通式III的序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18。
7.根据权利要求1-6任一项所述的穿膜多肽，其特征在于，所述多肽含有大量精氨酸和赖氨酸。
8.根据权利要求1-7任一项所述的穿膜多肽，其特征在于，其制备方法是采用Fmoc固相多肽合成法合成。
9.根据权利要求8所述的穿膜多肽，其特征在于，其制备方法优选全保护Fmoc固相合成法。
10.一种穿膜多肽与拉帕替尼通过化学键形成的连接物。
11.根据权利要求10所述的连接物，其特征在于用于连接穿膜多肽与拉帕替尼的物质优选丁二酸酐。
12.根据权利要求11所述的连接物，其特征在于连接物具有通过血脑屏障的作用。
13.根据权利要求10-12任一项所述的连接物，其特征在于连接物在制备治疗脑瘤药物中的应用。
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