CN105418733A - 一种穿膜多肽与抗肿瘤药偶联物的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明所述的细胞穿膜肽，由13个氨基酸组成，序列为RGGRVRRRWRGGR。本发明通过固相合成的方法得到所需多肽，并与抗肿瘤药物通过化学合成的方法得到偶联物。本发明还提供了偶联物在制备治疗脑瘤药物中的应用。

Description

一种穿膜多肽与抗肿瘤药偶联物的制备及应用

技术领域

本发明涉及肿瘤相关的药物领域，具体而言，本发明涉及一种多肽与抗肿瘤药偶联形成一种新药物，该多肽本身不具有生理活性，但是具有透过血脑屏障的作用，本发明还涉及该多肽的制备方法及其应用。

背景技术

脑瘤及脑转移瘤的发病率逐年上升。在对其治疗方面，血脑屏障被认为是阻止化疗药物进入脑组织进而影响疗效的主要原因。血脑屏障是机体参与固有免疫的内部屏障之一，由介于血循环与脑实质间的软脑膜、脉络丛的脑毛细血管壁和包于壁外的胶质膜所组成，能阻挡病原生物和其他大分子物质由血循环进入脑组织和脑室。基本上100％的大分子药物，包括多肽、重组蛋白、单克隆抗体、基于RNA干扰技术的药物、基因治疗相关药物等都无法穿越血脑屏障，且大于98％的小分子药物也无法穿过血脑屏障。目前，放射性治疗与化学疗法只能延长患者生命4个月，因此本发明致力于研究使现有药物更好的透过血脑屏障。

多肽由于其具有极性末端和非极性末端，因此在体内有较高的利用度，由于本身是内源性物质所以毒性小，但是多肽直接作为药物受到较大的限制，例如其稳定性差，不能口服。近年来，多肽作为药物辅助功能的应用逐渐成为了新药研制的热点之一。细胞穿膜肽是20世纪中期开始认识到的一类具特殊功能的多肽分子，英文学术名称一般写为cell2-penetrating-peptides(CPPs)。它们通常由5～30个氨基酸组成，典型的一般由8～16个氨基酸构成，具有生物膜穿透功能，还可携带其它分子甚至超分子颗粒进入细胞中。正是因为这种特殊的功能，它们被看作生物活性分子有效的细胞内转运工具，具有广泛的应用前景。

近些年来多肽和药物通过共价方式形成组合物的例子很多，例如：多肽Penetratin和阿霉素共价耦合用于治疗乳腺癌；多肽TAT和药物P53共价耦合用于治疗眼癌转移；多肽YTA4与甲氨蝶呤共价耦合治疗乳腺癌。

发明内容

以下是本发明的详细描述：

(1)本发明所述的穿膜肽

本发明所述的细胞穿膜肽，由13个氨基酸组成，而且是亲水性和疏水性交替组合的，氨基酸序列为：SEQIDNO：1。

(2)本发明所述的穿膜肽的制备方法

本发明所需多肽是采用固相的方法制备的，固相合成是以固相载体树脂为载体，从C端即羧基端向N端即氨基端逐渐添加氨基酸的过程。

本发明中优选树脂：Fmoc-wang树脂、2-cl-trt树脂，树脂取代度0.24～0.4。

本发明所使用的保护氨基酸为：Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Trp-OH，反应过程中保护氨基酸3～5倍过量。

本发明所使用的脱保护试剂为：哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，比例为10:90～30:70。

本发明所使用的偶联试剂为：①苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑(HOBT)，②2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基苯并三唑(HOBT)，③N,N'-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(HOBT)。

本发明中，若使用第①或者第②种偶联试剂，那么反应中过程中应添加缚酸剂：DIEA/NMP。

本发明中所使用的切割试剂为：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1,2-乙二硫醇，比例为：82.5:5:5:5:2.5。

本发明中所使用MS-IT-TOF确定分子量，使用HPLC纯化粗肽。

(3)本发明所述多肽与抗肿瘤药物阿霉素的连接方法

首先阿霉素与酸酐反应，在阿霉素分子上构建羧基；再将多肽片段的末端氨基与上述分子上的羧基反应，生成偶联物；最后分离纯化偶联物。

(4)本发明所述多肽与抗肿瘤药物紫杉醇的连接方法

首先紫杉醇与酸酐反应，在紫杉醇分子上构建羧基；再将多肽片段的末端氨基与上述分子上的羧基反应，生成偶联物；最后分离纯化偶联物。

附图说明

附图1：靶向肽的液相纯度谱图

附图2：靶向肽的液相纯度谱图

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1:多肽的固相合成

使用Fmoc策略的固相多肽合成方法(使用的氨基酸购自上海吉尔公司)，使用CEM公司生产的Liberitity型仪器进行本发明的穿膜多肽的合成。操作方法按照生产商的仪器说明书进行。

合成所用试剂选择：

(1)载体树脂：Fmoc-Arg(pbf)-wang-rink，替代度：0.33。

(2)所选用的保护氨基酸：Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Trp-OH，反应中所用保护氨基酸5倍过量。

(3)本发明所使用的脱保护试剂为：哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，比例为20:80。

(4)本发明所使用的偶联试剂为：N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)/1-羟基苯并三唑(HOBT)。

(5)本发明中所使用的切割试剂为：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1,2-乙二硫醇，比例为：82.5:5:5:5:2.5。

将制得的多肽使用HPLCC18半制备柱(购自Phenomenex公司)进行纯化，检测条件为：检测波长：214nm，流动相A：乙腈(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：水(含0.1％三氟乙酸)，洗脱条件：30分钟内由35％A～50％A，利用MS-IT-TOF确定所得纯品分子量，用HPLC确定样品纯度(液相纯度谱图见附图1)，纯度大于95％经脱盐及冷冻干燥得到多肽冻干粉。

实施例2：脑靶向肽与抗肿瘤药物阿霉素的偶联物

化合物II的合成

50m反应瓶中加入1.0g(1.72mmol)阿霉素，0.52g(5.20mmol)丁二酸酐，30mlTHF，滴加0.66g(5.12mmol)N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，27℃搅拌6h，蒸干溶剂得蜡状物，加水搅拌，有黄色固体析出，抽滤，水洗两次，干燥，得黄色固体1.15g。

化合物I的合成

50m反应瓶中加入0.22g(0.32mmol)化合物II，0.10g(0.31mmol)O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，5mlDMF，氮气保护，滴加0.08g(0.62mmol)N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，27℃搅拌1h后，加入0.10g多肽，27℃搅拌3h后，终止反应。使用MS-IT-TOF确定分子量，使用HPLC纯化粗产物。

实施例3：脑靶向肽与抗肿瘤药物紫杉醇的偶联物

化合物III的合成

50m反应瓶中加入1.50g(1.72mmol)紫杉醇，0.52g(5.20mmol)丁二酸酐，30mlTHF，滴加0.66g(5.12mmol)N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，27℃搅拌6h，蒸干溶剂得蜡状物，加水搅拌，有黄色固体析出，抽滤，水洗两次，干燥，得黄色固体1.15g。

化合物IV的合成

50m反应瓶中加入0.22g(0.32mmol)化合物III，0.10g(0.31mmol)O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，5mlDMF，氮气保护，滴加0.08g(0.62mmol)N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，27℃搅拌1h后，加入0.10g多肽，27℃搅拌3h后，终止反应。使用MS-IT-TOF确定分子量，使用HPLC纯化粗产物。

实施例4：偶联物透过血脑屏障的体内评价

将上述偶联物I和对照阿霉素，偶联物IV和对照紫杉醇，用生理盐水配置成10mg/ml溶液，将大鼠(购自中科院上海实验动物中心，SD大鼠)用乙醚麻醉，经股静脉注射(200μL/只，6只/组)，分别于注射后30分钟取脑脊液，并断颈处死大鼠。脑脊液经液质联用测定透过血脑屏障的情况。

实验结果表明：偶联物I实验组可在脑脊液中检测到阿霉素，而对照组并没有检测到阿霉素的存在；偶联物IV实验组可在脑脊液中检测到紫杉醇，而对照组并没有检测到紫杉醇的存在。

实施例5：偶联物透过血脑屏障的体外评价

本实施例中，采用的细胞为：Hela，SK-BR-3，NIH3T3(购自中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)，将细胞种在24孔板中，浓度为2×10⁵孔，培养过夜，偶联物I和偶联物IV用PBS溶解，与细胞孵育使其终浓度为10umol/l。

本实施例中，使用免疫荧光染色，①用4％的甲醛在4°下固定细胞10分钟。②用3％冷Triton-X100缓冲液在4°渗透细胞20分钟。③2％的BSA封闭缓冲液在室温下封闭细胞30分钟。④羊抗人-FLAGmAb在室温下孵育细胞1小时。⑤2mg/mlStreptavidin-Alexa499在室温下孵育细胞1小时。以上每步均用PBS冲洗至少两遍。⑥0.3％Triton-X100缓冲液洗20分钟。最后置细胞与显微镜及共聚显微镜下观察。

实验结果表明：细胞内均有染色，即表明偶联物I和偶联物IV均可通过细胞膜。

实施例6：偶联物抗肿瘤作用研究

本实施例中，采用的细胞为：FCY20201MCF-7，FCY202111590BS524(T47D)，TC-hxbz-286M453，利用MTT法评价偶联物的抑瘤效果。

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔。5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，4小时以后加入5个浓度梯度的药物，原则上，每孔100ul,设5个复孔，继续孵育48小时，倒置显微镜下观察。每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。小心吸去孔内培养液，每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡5min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

本实施例计算结果采用公式：

增殖抑制率＝1-(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)，其中每组的A值为减去凋零孔之后的结果。

实验结果显示：偶联物I和偶联物IV具有较好的抑瘤效果，根据增殖抑制率公式可以计算出偶联物I和偶联物IV在100ug/ml的抑瘤率分别为99.98％，99.92％。在10ug/ml的抑瘤率分别为99.92％，98.15％。在1ug/ml的抑瘤率分别为86.63％，79.21％。在1ug/ml的抑瘤率分别为20.88％，6.4％。

表1：偶联物I吸光度值

100ug/ml	10ug/ml	1ug/ml	0.1ug/ml	0.01ug/ml
					0.0034	0.0122	0.1569	0.9142	1.1196
0.0039	0.0156	0.1657	0.9211	1.1231
					0.0042	0.0165	0.1672	0.9607	1.198
0.0049	0.0149	0.1697	0.9982	1.1482
					0.0051	0.0198	0.1553	0.9537	1.1356

表2：偶联物IV吸光度值

100ug/ml	10ug/ml	1ug/ml	0.1 ug/ml	0.01 ug/ml
					0.0035	0.0235	0.2356	1.2025	1.2305
0.0058	0.0244	0.2655	1.2121	1.2032
					0.0055	0.0309	0.2601	1.9203	1.1905
0.0054	0.0257	0.2548	1.1601	1.1965
					0.0047	0.0261	0.2544	1.1877	1.1984

Claims (5)

1.一种细胞穿膜肽，其特征在于，所述靶向肽是由13个氨基酸组成，其氨基酸序列是序列表中SEQIDNO：1。

2.一种偶联物，为权利要求1所述的脑靶向肽与抗肿瘤药物通过化学键偶联形成。

3.一种如权利要求2所述的偶联物的制备方法，具体步骤如下：

A.使用Fmoc策略的固相多肽合成方法合成靶向肽；

B.将抗肿瘤药物与酸酐反应，在药物分子上构建羧基；

C.将多肽片段的末端氨基与抗肿瘤药物分子上的羧基反应，构建酰胺键；

D.偶联物的分离纯化。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤B中所述抗肿瘤药物选自阿霉素和紫杉醇。

5.根据权利要求2所述的偶联物，其特征在于偶联物在制备治疗脑瘤药物中的应用。