CN103025165B - 自大分子共轭物的控释 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含通过速率受控的β-消除来释放药物或前药的接头的大分子载体和药物的共轭物以及制备和使用该共轭物的方法。

Description

自大分子共轭物的控释
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年5月5日提交的美国临时专利申请序列号61/331,738的权益，其全部内容通过引用结合在此。
技术领域
本发明涉及大分子载体和药物之间的大分子共轭物，这些共轭物包含通过受控的β-消除反应来释放药物的接头。
发明背景
药物分子与大分子载体共价结合以增强药学特性，诸如半衰期、稳定性、溶解性、耐受性和安全性。在一种方法中，药物部分通过永久性接头而偶联到大分子，但是这种方法受至少两个因素限制：1)接头必须在不抑制生物活性的位点附接到该药物部分上，并且2)永久性共轭物通常不能穿过细胞膜，因此，该方法仅对于细胞外药物靶标可行。
在一种第二方法中，共价结合的药物-大分子共轭物采用了在医药中有用的药物或生长因子的控释。例如，已经描述了针对共价偶联到聚乙二醇(PEG)的药物的控释的组合物和方法。该方法不要求细胞外药物靶标，并且连接位点优选地是抑制药物活性使其在从载体中释放之前受到一定掩蔽的连接位点。典型地，对于含醇或酚的药物，该药物通过经常可利用一种血清酯酶水解的酯键或碳酸酯键而附接到该载体上。例子有PEG-喜树碱、PEG-SN38、PEG-依立替康和PEG-多烯紫杉醇。已经进行了调整来适应含胺药物，由此利用可裂解的酯将PEG部分连接到一种自我牺牲型(self-immolating)氨基甲酸酯上。这种技术已应用于肽和蛋白质以及柔红霉素、两性霉素、Ara-C和其他小分子。然而，在这些情况下的药物释放速率是不可预测的且难以调节的，因为酯酶活性在各物种和个体之间变化并且某些区室是缺乏酯酶的(例如，局部区、眼内区、间质区)。
在本文中，说明了一种允许通过速率受控的β-消除机理释放药物的药物共轭物体系。
魏兹曼研究所(WeizmannInstitute)开发出了一种体系，其中将一种蛋白质或聚合物载体附接到接头(例如芴甲氧羰基(Fmoc)或其2-磺基衍生物(Fms))上。这些在美国专利7,585,837中进行了说明。这些接头通过非酶促β-消除机理而释放药物；然而，对释放速率的可调控制仍然是这个体系的一个问题。
PCT公布WO2009/158668说明了与大分子共轭的可释放的药物共轭物，其中β-消除的速率是由独立于该大分子自身的触发基所控制。这解决了现有技术中遗留的未解决的问题。‘668PCT公布提供了最直接地可适用于碱性含胺药物的接头，因为这些接头经由氨基甲酸酯键或硫代氨基甲酸酯键而附接到药物上。因此，存在着一种对于新的可裂解接头的未满足的需求，这些接头对于允许含醇、含酚、含硫醇、含苯硫酚及某些含氮的药物与大分子载体的共轭并且允许这些药物随后在生理条件下以受控速率释放。值得注意的是，超过50％的分子量为1200以下的FDA批准药物具有伯或仲脂肪族羟基、酚或硫醇的基团，并且约8％包含磺酰胺、吡咯或吲哚氮(参见DrugBank)。本发明通过提供经由N-氧甲基、N-(杂环氨基)甲基和N-硫代甲基氨基甲酸酯而连接的药物-大分子共轭物而满足了这一需要，这些共轭物通过β-消除而以受控的速率可裂解，以提供游离药物。此外，本文所述的接头在不依赖于生理酶的活性或存在的情况下释放游离药物分子。
虽然简单的N-烷氧基甲基、N-酰氧基甲基和N-硫代甲基氨基甲酸酯此前已作为前药而报道[参见例如Majumdar和Sloan描述的N-酰氧基甲基氨基甲酸酯，Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通迅](2007)17：1447-1450]或作为纺织品的改性剂[参见例如美国专利4,539,008、4,200,564；和3,758,554]，但这样的化合物不具有通过速率受控的β-消除来释放游离药物分子的能力。
发明概述
本发明提供了药物与大分子载体的共轭物，该共轭物包含允许随后在生理条件下以受控速率释放药物的可裂解的接头、连同可裂解的接头、包含可裂解的接头的接头-药物分子、包含可裂解的接头的大分子载体，连同上述各项的制备方法和用途。
总体上，本发明涉及一种下式的化合物
其中m是0或1；
其中R1和R2中的至少一者或二者独立地是CN、NO2；
任选取代的芳基；
任选取代的杂芳基；
任选取代的烯基；
任选取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3是H或任选取代的烷基；
各自任选取代的芳基或芳烷基；
各自任选取代的杂芳基或杂芳烷基；或
OR9或N(R9)2，其中每个R9独立地是H或任选取代的烷基，或者两个R9基团与它们附接到其上的氮一起形成一个杂环；
SR4，其中
R4是任选取代的烷基；
各自任选取代的芳基或芳烷基；或
各自任选取代的杂芳基或杂芳烷基；
其中R1和R2可以连接形成一个3-8元环；并且
其中R1和R2中的一个且仅一个可以是H或烷基、芳烷基或杂芳烷基，每一个均被任选地取代；
每一个R5独立地是H或烷基、烯基烷基、炔基烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，每一个均被任选地取代；
Z是通过O、S或非碱性N偶联的一种药物或前药的一个残基，或是允许这样的偶联的一种离核体；并且
B为烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，每一个均被任选地取代；并且
其中R1、R2、R5或B中的一个偶联至一个大分子上或包含一个允许与大分子连接的官能团。
因此，在一个方面，本发明涉及包含具有式(I)的可裂解的接头的药物与大分子载体的共轭物
其中R1、R2、R5、m和B如上所定义，其中D是通过O、S或非碱性N偶联的一种药物或前药，并且其中R1、R2、R5或B中的一个共轭至一个大分子上。
在一个第二方面，本发明提供了具有式(II)的是具有式(I)的化合物的前体的可裂解接头试剂化合物，
其中R1、R2、R5、m和B如上所定义；并且L是允许通过O、S或非碱性N偶联到一种药物或前药上的一种离核体。在式(II)中，R1、R2、R5或B基团中的至少一个包括允许连接到大分子上的一个官能团，而不是共轭至一个大分子上。
在一个第三方面，本发明提供具有式(III)的接头-药物化合物，
其中R1、R2、R5、m和B基团如上所定义；D是通过O、S或非碱性N连接的一种药物或前药的残基；并且其中R1、R2、R5或B基团中的至少一个包含一个允许与如上所述的大分子连接的官能团。
在一个第四方面，本发明提供了具有式(IV)的包含可裂解的接头的大分子载体，
其中R1、R2、R5、m和B基团如上所定义；L是允许通过O、S或非碱性N连接到一种药物或前药上的一种离核体；并且其中在式(I)中，R1、R2、R5或B中的至少一个进一步连接到一个大分子上。具体来说，R1、R2、R5或B中的至少一个包含用于介导到一个大分子上的偶联的一个官能团。
在一个第五方面，本发明提供了一种药物-大分子共轭物，其中该药物是通过一个接头而连接到该大分子上的，该药物分子通过O、S或非碱性N而附接到到该接头上，并且其中该药物在生理条件下通过β-消除反应从该共轭物释放。
在其他方面，本发明提供了用于制备式(I)、(II)、(III)和(IV)的化合物的方法及其用途。
附图简要说明
图1示出了本发明的分子之间的关系。式(II)的可裂解接头试剂分子通过O、S或非碱性N与药物反应产生了式(III)的接头-药物化合物。类似地，式(IV)的大分子-接头-试剂共轭物通过O、S或非碱性N与药物反应产生了式(I)的大分子-接头-药物共轭物。式(II)的接头试剂分子与大分子进行共轭提供了式(IV)的大分子-接头试剂共轭物。类似地,式(III)的接头-药物化合物与大分子进行共轭提供了式(I)的大分子-接头-药物共轭物。
图2.图A示出了β-消除触发的药物从本发明化合物释放的通用的方案。通过β-消除的裂解提供了一种不稳定的氨基甲酸，该氨基甲酸通过CO2的损失而分解以提供一种不稳定的半缩醛胺，该半缩醛胺进一步分解产生B-NH2、H2CO和游离药物ZH。游离ZH的释放速率取决于β-消除速率，β-消除速率进而主要取决于活化基团R1和R2。图B示出了本发明的化合物经由E1-消除的分解。使用孤电子对的氨基甲酸酯氮的C-Z结合的裂解提供了游离ZH和一种不稳定的亚氨鎓离子，该亚氨鎓离子水解以提供氨基甲酸酯和甲醛。游离ZH的释放速率取决于氨基甲酸酯N孤电子对的活性，该活性进而取决于B基团。总体上，与E1-消除相比，吸电子的和共轭的B基团将更有利于β-消除。
图3示出了在0.1MHEPES缓冲液、15mMNaCl、pH值为7.40和37℃下从S(N(9-芴甲氧羰基-N-苯基)氨甲基)N-(2，4-二硝基苯基)-半胱氨酸(实例11C)(菱形；T1/2＝100小时)和S-N-(乙氧羰基-N-苯基)氨甲基)N(2，4-二硝基苯基)-半胱氨酸(正方形；T1/2＝850小时)中释放N-(2，4-二硝基苯基)的动力学。
图4示出了在0.1MHEPES缓冲液、15mMNaCl、pH值为7.40和37℃下从O-(N-(9-芴甲氧羰基-N-苯基)氨甲基)-丝氨酸(实例11B)(菱形；T1/2＝400小时)和O-(N-乙氧羰基-N-苯基)氨甲基)-丝氨酸(正方形；T1/2＝8000小时)中释放N-(6-(2，4-二硝基苯基)氨基己酰基)-丝氨酸的动力学。
图5示出了如说明书中所述的用于将醇转化成中间体和式(II)的化合物的通用的方法。
图6示出了一种用于制备式(II)的化合物的方法，其中R1是芳基磺酰基，R2是H，R5是H和3-(5-己烯酰酰氨基)苯基，B是苯基，并且L是Cl。
图7示出了一种用于制备式(III)的化合物的方法，其中D是通过N连接的(DH是5-氟尿嘧啶)。该图还示出了一种用于制备式(II)的化合物的方法，其中L是I。
图8示出了实例44的4臂PEG-SN-38共轭物(实例42，其中R’＝4-N，N-二乙基甲酰氨基，并且R＝苯磺酰基或甲磺酰基)的浓度作为在鼠血清中的时间的函数的结果。图注：实线，R＝苯磺酰基；点短划线，R＝吗啉代磺酰基；短划线，R＝甲磺酰基。
图9示出了在实例50中描述的4臂PEG-SN38共轭物药代动力学实验的结果。图A示出了在对大鼠静脉给药后不同的四臂PEG-SN38共轭物的浓度。如在工作实例中所述，对鼠静脉给予多种共轭物，其中R1和R2中的一个为H而另一个为苯磺酰基(正方形)、甲磺酰基(菱形)或吗啉代磺酰基(三角形)，或者R1和R2二者都是H作为对照(圆形)，并且对血浆样品的剩余共轭物进行了分析。图B示出了数据的重绘图以确定在体内SN38从共轭物的裂解速率。在不同时间的可释放的共轭物(即，R1和R2中的一个为H而另一个为苯磺酰基(正方形)、甲磺酰基(菱形)或吗啉代磺酰基(三角形))与不可释放的、“稳定的”共轭物(圆形；即，R1和R2二者都是H作为对照)之比的对数图生成了直线，其斜率等于从共轭物释放的SN38的速率。观察到，在体内释放的SN38速率与针对体外共轭物所确定的那些速率是相同的，具有如下的半衰期(调节剂，体外T1/2，体内T1/2)：苯磺酰基，9.3小时，10.4小时；甲磺酰基，44小时，54小时；吗啉代磺酰基，123小时，137小时。
图10示出了作为与触发基相关联的哈米特(Hammett)常数的函数的药物的体内和体外释放速率的对比。
发明详细说明
本发明代表了优于标准共轭物惯例的改进，并具有优于诸如在以上引用的PCT公开WO2009/158668中描述的那些的聚乙二醇化的可释放的药物组合物的额外的优点。优点包括在从大分子载体中释放出来前将药物或前药保持处于非活性形式；多个药物结合位点，使得药物剂量可以增加，从而允许递送更少的有效药物；以及提供防止降解酶或其他灭活条件的保护。
本发明的组合物的另一个优点是，它们提供了药物到淋巴系统的有效递送。由于本发明化合物的分子量显著高于药物的分子量，因此在皮下给予化合物时，它们能够维持药物在淋巴系统中。分子量为40,000或更大的化合物被有效地保持在淋巴系统中。另外，因为淋巴结缺乏在血浆中存在的可以从酯化键释放药物的酯酶，因此淋巴的有利的pH值(这与血浆的值是相同的)允许从该共轭物释放活性药物。因此，就如(例如)关于淋巴瘤会出现的情况那样，当希望递送到淋巴时，本发明的化合物有效地将药物释放到淋巴中。
本发明提供了药物与大分子载体的共轭物，该共轭物包含允许随后在生理条件下以受控速率释放药物的可裂解的接头、和可裂解的接头试剂、包含可裂解的接头的接头-药物化合物、包含可裂解的接头试剂的大分子载体、以及上述各项的制备方法和用途。
本发明的化合物具有式(V)，它包含药物共轭物及其前体，并且进一步可以用来解释本发明。
在式(V)中：
R1和/或R2基团激活相邻的C-H，用于在生理条件下的β-消除。如本文中所使用，术语“在生理条件下的β-消除”是指一种化学转化，其中本发明的分子被按照以下示例性方案转化成一个烯烃部分(moiety)和一种氨基甲酸：
该方案是在生物系统中的那些典型的条件下发生，例如pH值在6和8之间，并且温度在25℃和40℃之间，速率使得反应的半衰期是在1和10,000小时之间、或在1和5,000小时之间、或在1和1,000小时之间、或在1和100小时之间、或在1和10小时之间。产物氨基甲酸通常是非常不稳定的，并进一步分解以释放CO2、B-NH2、H2C＝O和Z-H。用于该分解的一种可能的途径如图2A中所示，并且如下进一步详细地示出：
(1)HO-(C＝O)-N(B)-CH2-Z-＞CO2+B-NH-CH2-Z(不稳定的甲醛缩醛胺)
(2)B-NH-CH2-Z-＞B-N＝CH+ZH(亚胺形成)
(3)B-N＝CH+H2O-＞B-NH-CH2-OH(向亚胺加入水以形成半缩醛胺)
(4)B-NH2+O＝CH2(半缩醛胺分解以形成甲醛+胺)。
本领域的技术人员将认识到，上面所示的β-消除和后续的分解反应(1)-(4)的各种中间体可能是短暂的，并且因此可能无法在生理或其他化学反应条件下检测出。
活化R1和/或R2基团的性质如上所述，并基本上控制了消除反应的速率。R1和/或R2基团因而通过确定相邻C-H的酸度来作为一个或多个触发基团起作用。合适的R1和/或R2触发基团的选择提供了一种控制从本发明的化合物释放药物的速率的手段。R1和/或R2基团激活相邻的C-H键的程度可以通过所得的C-H键的酸度来表示；这种酸度可以进而表示为C-H键的pKa值，其中较低的pKa表示更酸性的、更易离子化的C-H键。各种基团的合适pKa值的清单是本领域中常见的，例如见于Bordwell，F.G.，“Equilibriumaciditiesindimethylsulfoxidesolution(二甲亚砜溶液中的平衡酸度)，”AccountsofChemicalResearch[化学研究述评]21(12)：456-463(2002)中(通过引用结合在此)。适当地活化基团的例子包括但不限于任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的烯烃、任选取代的炔、砜、亚砜、腈、酮、酯、酰胺和硝基的基团。当R1和/或R2基团连接以形成一个3-8元环时，该环可以形成更大的环状结构的一部分(被任选地取代)，例如
及其取代的形式。
R1和/或R2基团上的取代基可任选地被添加，以提供对相邻的C-H的酸度以及从而β-消除反应的速率的进一步的控制。总体上，吸电子的取代基会增加β-消除反应的速率，而供电子的取代基会降低β-消除反应的速率。不同取代基的电子效应在本领域中是众所周知的，并且可以被表示为例如线性自由能(哈米特)关系。对于芳族体系，例如取代的芳基、杂芳基、芳基酮、杂芳基酮、芳基砜、杂芳基砜、芳基亚砜和杂芳基亚砜基团，取代基的电子效应由哈米特σ参数描述，其中正σ值表示吸电子(相对于相邻的C-H的速率加速)，并且负σ值表示供电子(相对于该C-H的速率减缓)。表1提供了对于不同的取代基的哈米特σ常数的列表。
通过举例的方式，其中芳基环R1被“供电子的基团”取代，该取代基将导致相邻的苄型的C-H键的酸度减小。合适的供电子的取代基的例子包括但不限于烷基、烷氧基、烷硫基、甲硅烷氨基、烷氨基和二烷氨基。用一个或多个“吸电子的基团”取代芳基环导致相邻的苄型的C-H键的酸度增加。合适的吸电子的取代基的例子包括但不限于卤素、二氟甲基、三氟甲基、硝基、苯基、烯基、氰基、C(＝O)-R，其中R是H、烷基、烷氧基、或氨基、或SOR或SO2R，其中R是烷基、芳基或杂芳基。非氢的供电子或吸电子的取代基可以是存在于它们结合到其上的环上的多个位置。尽管，为了方便起见，在大多数例子中仅示出了在一个单环上非氢取代基单个取代基的发生，但也可以存在多个取代基，并且是在本发明的范围之内。这些取代基可以是相同的或不同的。
以上是过于简化的情况，因为在某些情况下，取代基是吸电子还是供电子取决于它在芳香环中的位置。这反映在下面的线性自由能(哈米特)关系的表中，其中正的σ值表示吸电子的效应，并且负的σ值表示供电子的效应。如表中所示，例如，OMe存在于苯环的间位时是吸电子的，但在对(或邻)位时是供电子的。
芳族取代基的选择的哈米特σ常数
其余的取代基R5和B对β-消除的速率有较小的效应，但B的性质特别影响竞争性E1消除反应的速率。B基团的性质影响N-亚甲基-氨基甲酸酯针对经由E1型消除反应而分解的稳定性，如图2B所示。例如通过延长的共轭和/或吸电子的能力来降低氨基甲酸酯N孤电子对的反应性的B基团降低了E1-消除途径的竞争性的分解速率。
大分子可以通过额外的“连接物”偶联至式V。额外的连接物是双官能团有机化合物。许多这样的连接物是例如从皮尔斯化学公司(PierceChemicalCo)，罗克福德(Rockford)，伊利诺斯州可商购的。不同双官能团连接物在本领域中是众所周知的，包括二羧酸或酸酐、二胺或异双官能团连接物。异双官能团连接物的例子包括例如具有琥珀酰亚胺基酯(“NHS”)和炔或环炔(例如，DBCO-NHS)、马来酰亚胺和NHS、或类似的分子的异双官能团连接物。该连接物的选择当然将取决于在大分子的取代基上的官能团的性质、药物以及取决于与式(I)-(V)对应的中间体。
术语“烷基”包括1-8个碳原子的直链的、支链的或环状的饱和烃基，或者在一些实施方案中是1-6或1-4个碳原子。
术语“烷氧基”包括与氧键合的烷基基团，包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丙氧基、环丁氧基和类似物。
术语“烯基”包括带有碳-碳双键的非芳族不饱和烃。术语“烯基(C2)”的意思是指单-、二-、三-或四-取代的任何几何构型的碳-碳双键。
术语“炔基”包括带有碳-碳三键的非芳族不饱和烃。“炔基(C2)”的意思是指单-或二-取代的碳-碳三键。
术语“芳基”包括6-18个碳原子优选为6-10个碳原子的芳族烃基，包括诸如苯基、萘基和蒽基的基团。术语“杂芳基”包括芳族环，该芳族环含有3-15个碳原子，含有至少一个N、O或S原子；优选为3-7个碳原子，含有至少一个N、O或S原子；包括基团诸如吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、喹啉基、吲哚基、茚基和类似物。
在某些情况下，烯基、炔基、芳基或杂芳基部分可以通过烷基键被偶联至该分子的其余部分上。在那些情况下，取代基将被称为烯基烷基、炔基烷基、芳烷基或杂芳烷基，这表明在烯基、炔基、芳基或杂芳基部分和烯基、炔基、芳基或杂芳基偶联的分子之间存在亚烷基部分。
术语“卤素”包括溴、氟、氯和碘。
术语“杂环”是指含有3-7个碳原子和至少一个N、O或S原子的4-8元芳族或非芳族环。例子包括哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、吡咯烷、和四氢呋喃基、以及上述为术语“杂芳基”提供的示例性基团。
“马来酰亚胺基”是指式
术语“非碱性N”是指在作为游离药物分子DH中的NH基团的一部分的氮，其中NH的特征在于具有小于或等于约20的pKa。在本发明的某些实施方案中，非碱性N是诸如吡咯、吲哚、嘧啶、或嘌呤、伯或仲磺酰胺(R-SO2NHR’)、伯或仲酰胺(R-CONHR’)、或酰亚胺(R-CO-NH-CO-R’)的杂芳环体系中的一员。
“离核体”是一种离去基团，该离去基团带有与其一起的电子对，该离去基团通过该电子对而键合。示例性离核体为卤素、OH、烷氧基、芳基磺酸酯、烷基磺酸酯或R2S+，其中每个R独立地是烷基、芳基或杂芳基。
术语“大分子”的意思是指具有在5,000和1,000,000道尔顿之间、优选在10,000和500,000道尔顿之间、并且更优选在10,000和250,000道尔顿之间的分子量的一种分子或分子的残基。大分子的例子包括但不限于：蛋白质，包括抗体、抗体片段和酶；多肽，包括诸如聚(赖氨酸)和聚(缬氨酸)的聚(氨基酸)和混合序列的多肽；合成的聚合物，包括聚(乙二醇)(PEG)、聚(氧化乙烯)(PEO)、聚(乙烯亚胺)(PEI)以及它们的共聚合物；以及多糖，诸如葡聚糖的。大分子将包括无论是本身还是在化学转化后适于共轭的至少一种官能团，例如如上所述的胺、羧酸、醇、硫醇、炔、叠氮化物或马来酰亚胺的基团。在本发明的某些实施方案中，大分子是聚乙二醇。聚乙二醇可以是直链或支链的，其一端以适于共轭的官能团封端，而另一端或其他端以封端基团(例如，甲基)封端，或者可以包括多个臂，每个臂以适于共轭的官能团封端。在本发明的优选实施方案中，聚乙二醇是一种具有在20,000和200,000道尔顿之间、优选在20,000和100,000道尔顿之间、最优选为约40,000道尔顿的平均分子量的直链的、支链的或多个臂的聚合物。这样的聚乙二醇的例子在本领域中是已知的，并且是例如从NOF公司(日本东京)可商购获得的。
术语“蛋白质”和“肽”可互换使用而与链长无关，并且这些术语进一步包括假肽，假肽包括除酰胺键以外的键合，诸如CH2NH2键以及模拟肽的键。
术语“核酸”和“寡核苷酸”也可以互换使用而与链长无关。核酸或寡核苷酸可以是单链或双链，或者可以是DNA、RNA、或其带有改变的键合的变形，例如磷酸二酯、氨基磷酸酯和类似物。对于在本发明中用作药物的蛋白质和核酸二者，这些术语还包括在蛋白质的情况下带有非天然的侧链的蛋白质、以及在核酸以及主链变体(backbonevariants)(诸如肽核酸)的情况下带有非天然的假肽键和碱基的核酸。
药物背景中的术语“小分子”是在本领域中得到充分理解的术语，并且意思是指包括除蛋白质和核酸以外的化合物，该化合物在性质上或合成或分离，并且总体上不类似于蛋白质或核酸。典型地，它们具有小于1,000的分子量，虽然没有确认的具体的截断值(cutoff)。然而，该术语在药理学和医学领域得到了充分的理解。
各种各样的药物可被包括作为D的实施方案。这些药物中的每一个均将通过非碱性氮、氧或硫被偶联至本发明的化合物的甲基氨基甲酸酯部分。因此，合适的药物将是具有允许偶联至接头的羟基、硫醇或非碱性胺的那些药物。合适的药物的例子包括人用或兽用的药物，包括但不限于：抗糖尿病药物；生长促进剂；抗菌剂，包括氨基糖苷类、青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类和肽类、甲氧苄啶、吡咯米酸和磺胺二甲嘧啶；镇痛和抗炎药、抗过敏和止喘的药物、抗高胆固醇的药物，β-肾上腺素能受体阻断剂和抗高血压药物、抗肿瘤药物和抗病毒药物。
这类药物的进一步的例子包括诸如紫杉醇和类似物的醇，埃博霉素和类似物，喜树碱和类似物，诸如伊立替康(irinotecan)，以及核苷，诸如5-氟尿嘧啶和卡培他滨的。在另一实施方案中，该药物是含有丝氨酸残基的肽。在另一个实施方案中，该药物是包含芳基基团的小分子；这类药物的例子包括SN-38、依替福林(etilefrine)、普瑞特罗(prenalterol)和雌二醇。在另一实施方案中，该药物是包含酪氨酸残基的肽。如果是通过S偶联，则该药物可以是含有硫醇的小分子。这类药物的例子包括青霉胺、卡托普利和依那普利。该药物可以是包含硫代芳基或硫杂芳基团的小分子；这类药物的例子包括6-巯基嘌呤。如果是通过非碱性N偶联，则该药物可以是小分子或含有伯或仲酰胺(例如焦谷氨酸酯残基或其他酰胺)或磺酰胺的肽或诸如吲哚(例如，色氨酸)或嘌呤的杂芳基。例子包括促甲状腺素释放激素、蛙皮素、促黄体生成激素释放激素、卵泡刺激激素释放激素、奥曲肽、5-氟尿嘧啶和别嘌呤醇。
基于核酸的药物的例子包括来自动物并且特别是来自哺乳动物的任何基因的正义链和反义链。这样的基因可以是已以治疗多种疾病为目的提供的反义DNA或RNA的或小干扰RNA的受试者(subject)的那些基因，例如蛋白激酶C-α、BCL-2、ICAM-1、肿瘤坏死因子α和类似物的基因。
在具体实施方案中，该药物是SN-38(7-乙基-10-羟基喜树碱)。
术语“前体”是指与式(I)类似的化合物，但其中不是大分子而是有关的取代基R1、R2、R5或B配有能够提供偶联的一个官能团或接头和/或其中D是由一种离核体取代的。因此，这个类别的化合物具有式(II)、(III)和(IV)。
虽然典型地，药物的活性形式是从本发明的共轭物直接释放的，但在某些情况下，有可能是以其前药的形式释放活性药物。
为了避免误解，本文所述的“药物共轭物”包括药物和前药二者的共轭物。
如上所述，在式(V)中，Z是通过O、S或N偶联的药物或前药的残基，或包含允许通过O、S或非碱性N连接到药物上的一种离核体。当Z是允许通过O、S或非碱性N连接到药物上的一种离核体时，Z可以是卤素、OH、烷氧基、芳基磺酸酯、烷基磺酸酯或R2S+，其中，每一个R独立地是烷基、芳基或杂芳基。在一个特定实施方案中，Z是卤素或R2S+。在另一个实施方案中，Z是氯或甲氧基。同样，在式(II)和式(IV)中的L可以是卤素、OH、烷氧基、芳基磺酸酯、烷基磺酸酯或R2S+，其中，每一个R独立地是烷基、芳基或杂芳基，并且在特定实施方案中，L是氯或甲氧基。
示例性取代基
因为基团R1、R2、R5和B是由定义这些基团的本发明的所有化合物所共用的，所以在下面提出的替代方式中展示的这些基团的各种实施方案对它们所有都是共用的。在任一基团可以本身被任选取代时，在任何的环体系上的取代可以是烷基、烯基、炔基或一个附加环，每一个均被任选地取代。包括上述的在内的任一基团上的任选取代基包括卤素、硝基、氰基、OR、SR、NR2、OCOR、NRCOR、COOR、CONR2、SOR、SO2R、SONR2、SO2NR2，其中每一个R独立地是烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基、或两个R基团与其所附接的原子一起形成一个环。
本发明的化合物含有通过R1、R2、R5和B(式(V)、(I)和(IV))中的一个与大分子的一个键合，或者R1、R2、R5和B中的一个包含允许连接到大分子上(式(V)、(II)和(III))的官能团。允许连接到大分子上的合适的官能团包括氨基、叠氮基、羟基、羧酸基、炔基、硫醇、马来酰亚胺基、呋喃基、环戊二烯基、1，3-二烯基或1，3-二羰基的基团或其受保护的变体。含有反应性官能团的取代基包括被反应性化学部分取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂烷基或杂芳烷基。因此，R1、R2、R5和B基团中的至少一个包含大分子或包含一个或多个氨基、叠氮基、羟基、羧酸基、炔基、硫醇、马来酰亚胺基、呋喃基、环戊二烯基、1，3-二烯基、或1，3-二羰基的基团、或其受保护的变体。在一些实施方案中，R1被偶联至一个大分子上或包含允许连接到大分子上的一个官能团。在一些实施方案中，R5被偶联至一个大分子上，或包含允许连接到大分子上的一个官能团。
如上所述，在本发明的化合物中，R1和R2一起施加对药物的释放速率的最大控制，但R5和m也具有一些影响。在某些情况下，R1和R2中的一个是氢或者是烷基、芳烷基或杂芳烷基，并且另一个包括如上提出的其余实施方案之一。在其他情况下，R1和R2均不为氢或烷基、芳烷基或杂芳烷基。
例如，R1可以是H并且R2可以是任选取代的苯基，或者R1和R2二者都可以是任选取代的苯基。在苯基环上的取代可以是在1-5处的位置，但优选为3或更小。如果R1和R2二者是任选取代的苯基，它们就不需要被相同地取代，或者可以被相同地取代。合适的取代基包括烷氧基、卤素、硝基、氰基和类似物，例如如上述表1中所给出。
在其他实施方案中，R1和R2中的一者或二者是R6S-、R6S(O)-或R6S(O)2-，其中R6是烷基、取代的烷基、二烷基氨基、烷基芳氨基、二芳基氨基、N-连接的杂环、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。R1和R2的其余成员则可以是例如H或上文提出的任一替代实施方案。在具体实施方案中，R1和R2中的一个是R6S(O)2-，其中R6是甲基、吗啉基、未取代的苯基、或用一个或多个卤素、甲基、甲氧基或三氟甲基的基团取代的苯基，并且R1和R2中的另一个是H。在进一步的实施方案中，R1和R2中的一个是苯磺酰基、4-(三氟甲基)苯磺酰基、4-氯苯磺酰基、4-甲基苯磺酰基、4-甲氧基苯磺酰基、2，4，6-三甲基磺酰基、吗啉代磺酰基或甲磺酰基，并且R1和R2中的另一个是H。
在其他的情况中，R1和R2中的一者或二者可以是氰基，并且另一个任选地选自H和如上文提出的允许的取代基，特别是在一个或多个位置任选地用例如卤素、CN、NO2、甲氧基和类似物取代的苯基，并且任选地进一步包含允许连接到大分子的官能团。在进一步的实施方案中，R1和R2中的一个是氰基，并且另一个是H。
在另一组的情况中，R1和R2中的一者或二者是任选取代的苯甲酰基，并且另一个是氢或任何其他合适的选择，如任选取代的苯基。在进一步的实施方案中，R1和R2中的一个是氨基羰基，例如N，N-二烷基氨基羰基或吗啉代羰基，而另一个是H。
在另外的实施方案中，R1和R2中的一个是上文所述的具体实施方案中的任何一个，进一步包含大分子或允许连接到大分子上的一个官能团，并且R1和R2中的另一个是H。
当R1和R2连接形成环状结构时，这包括多个基团，在这些基团中R1-CH-R2部分形成一个子结构，诸如
以及其任选地由如上所述的吸电子和/或供电子的基团取代的形式，其中G是一个键(例如，9-芴基)，C＝O、SO、SO2、CA2或CA2CA2，其中每一个A独立地是H或Cl。
在进一步的实施方案中，R1和R2与它们附接到其上的CH一起形成未取代的芴基或进一步包含一个大分子或允许连接到大分子上的官能团的芴基。在某些实施方案中，R1和R2与它们附接到其上的CH一起形成芴基或用烷基叠氮化物特别是(叠氮基-N-甲基(CH2)3-6烷基-酰氨基)甲基取代的芴基。
每一个R5独立地是H，或是烷基、烯基烷基、炔基烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，每一个均任选地被取代。在某些实施方案中，每一个R5为H。在其他实施方案中，R5中的一个是H，而另一个是被取代的烷基或取代的苯基。在还其他实施方案中，R5中的一个是H，另一个包含叠氮烷基。在其他实施方案中，R5中的一个是H，而另一个是叠氮基-(CH2)3-6烷基、单烷基氨基-(CH2)3-6烷基、N3(CH2)3-6N(Me)CO(CH2)3-6或-(CH2)3-6-CO2H，或其受保护的变体。在另外的实施方案中，R5中的一个是上述的具体实施方案中的任何一个，进一步包含大分子或允许连接到大分子上的一个官能基团，而另一个R5是H。
B基团可以是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，每一个均任选地被取代。在本发明的优选实施方案中，B是任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基。在本发明的某些实施方案中，B是芳基或杂芳基，每一个被具有正的哈米特σ常数(表1)的至少一个基团取代。在本发明的一个具体实施方案中，B是苯基或以烷氧羰基、甲酰氨基、亚磺酰氨基、CN、NO2或Br取代的苯基。在进一步的实施方案中，B是未取代的苯基。在更进一步的实施方案中，B是未取代的苯基或以二乙基氨基羰基、吗啉代羰基或吗啉代磺酰基取代的苯基。在更进一步的实施方案中，B是苯基、炔丙基、4-溴苯基、4-乙氧基羰基苯基、丙基、4-(N，N-二乙基甲酰氨基)苯基、4-吗啉代羰基苯基或4-吗啉代磺酰基苯基。在更进一步的实施方案中，B是苯基、4-(N，N-二乙基甲酰氨基)苯基、4-吗啉代羰基苯基或4-吗啉代磺酰基苯基。在另外的实施方案中，B是上述具体实施方案中的任何一个，进一步包含一个大分子或允许连接到一个大分子上的官能团。
在某些实施方案中，m为0。
在其他实施方案中，本发明考虑了式(X)的化合物：
其中
x是0、1、2或3；
每一个R10独立地是甲基、三氟甲基、甲氧基或卤素；
B’是苯基，任选以烷氧基羰基、甲酰氨基、亚磺酰氨基、CN、NO2或卤素取代；
Z’是通过O、S或非碱性N偶联的一种药物或前药的残基，或者是允许这种偶联的一种离核体；
间隔基是包含烷基、杂烷基、芳基或芳烷基基团(每一个任选被取代的)的接头；并且
MM是一个大分子或允许连接到大分子上的一个官能团。
在其他实施方案中，本发明考虑了式(XX)的化合物：
其中R1、R2、R5、m和B如在以上面对式(V)所定义。在式(XX)的进一步的实施方案中，m为0。在式(XX)的又另一个实施方案中，m为0；R1是苯磺酰基、取代的苯磺酰基、甲磺酰基、(R9)2N-SO2，其中R9为如对式(V)所定义或是CN；R2是H；一个R5是N3(CH2)5而另一个R5是H；并且B是苯基或取代的苯基。在其他实施方案中，m为0；R1是苯磺酰基、取代的苯磺酰基、甲磺酰基、(R9)2N-SO2或CN；R2是H；一个R5是任选取代的烷基而另一个R5为H；并且B是苯基或取代的苯基，并且其中R1、R5和B中的一个进一步包含与大分子的连接。在式(XX)的又另一个实施方案中，该大分子是直链的、支链的或多臂的聚乙二醇。在式(XX)的又另一个实施方案中，m为0，R1是苯磺酰基、取代的苯磺酰基、甲磺酰基、(R9)2N-SO2或CN；R2是H；一个R5是进一步连接到聚乙二醇上的被取代的烷基，而另一个R5是H；并且B是取代的苯基。
制备
在另一个方面，本发明提供了用于制备式(V)的化合物的方法。本领域的技术人员将认识到式(I)、(II)、(III)、(IV)和(X)的化合物是式(V)的化合物的亚组。
制备式(II)的化合物
用于制备式(II)的接头化合物的方法类似于在本领域中已知的用于制备N-羟甲基、N-烷氧甲基和N-卤代甲基-酰胺的方法或用于制备简单的N-卤代甲基、N-烷氧甲基或N-硫代甲基氨基甲酸酯的方法(Majumdar和Sloan，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters[生物有机与药物化学通迅](2007)17：1447-1450，通过引用结合在此)，并且在图5中示出。
式(II)的化合物是由醇R1R2C-(C＝C)mC(R5)2OH(图5和在下面的式(A))和类似物(其中m＝1)制备的。这样的醇的合成被描述于例如在以WO2009/158668A1公布的PCT专利申请PCT/US2009/048943(通过引用结合在此)。例子在图6中和在下面提供的工作实例中给出。
醇R1R2C-(C＝C)mC(R5)2OH(其中m是0(式(A))可以通过使R1R2CH2与一种强碱(例如丁基锂、NaH、二异丙基氨基锂、双(三甲基甲硅烷基氨基)锂或类似物)反应形成的负离子R1R2CH-与一种分子加成反应来制备，以生成式(A)的化合物
可替代地，式(A)的化合物(其中m是0，并且一个R5是H)可以由两步法来制备。在第一步骤中R1R2CH2与强碱反应形成的碳负离子R1R2CH与酯R5-C(＝O)OR*(其中R*是低级烷基)的加成反应生成了一种中间体酮R1R2CH-CR5＝O，它可在第二步骤中与一种合适还原剂(例如NaBH4或NaBH3CN)反应以提供式(A)的化合物(其中R5是H)。
例如，当R1R2CH2是芴时，它与强碱反应以例如形成芴基碳负离子，然后使其与R5 2-CO反应，反应如下：
醇R1R2C-(C＝C)mC(R5)2OH(其中m是1，并且两个R5都是H)可以通过向一种不饱和化合物，诸如3-(二甲基氨基)丙烯酸甲酯添加由R1R2CH2通过使用一种强碱(例如NaH、丁基锂、双(三甲基甲硅烷基氨基锂)或类似物)的锂化所得到的碳负离子来制备，以提供一种中间体酯，该中间体酯可经由一个步骤或通过多个步骤还原成相应的不饱和醇：
例如如在Org.Lett.[有机通讯](2005)7：4153-5中所述，上面所示的不饱和醛在钯催化剂的存在下与一种取代或未取代的芳基硼酸(芳基-B(OH)2)的反应提供了以下一种化合物，其中m为1，一个R5是取代的芳基，并且一个R5是H。
可替代地，上面所示的不饱和醛根据Soderquist的方法与烷基硼烷的反应提供了以下一种化合物，其中一个R5是H，并且另一个是-CH2CH＝CH2或-CH2CCH。参见C.H.等，J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志](2005)127：8044。
然后通过本领域中已知的方法将醇R1R2C-(C＝C)mC(R5)2OH转化成氨基甲酸酯R1R2C-(C＝C)mC(R5)2OC(O)NHB，例如，通过：1)将醇活化成一种氯甲酸酯(用光气和光气等效物，例如三光气和吡啶)，并在一种弱碱(诸如吡啶或碳酸氢钠)的存在下使氯甲酸酯与B-NH2反应；或2)使一种醇与异氰酸酯反应(图5)。然后使氨基甲酸酯R1R2C-(C＝C)mC(R5)2OC(O)NHB在一种离核体供体L*的存在下与多聚甲醛反应，以得到一种式(II)的化合物。在一个特定实施方案中，L*为一种氯化物供体(诸如Me3SiCl或HCl)，从而得到一种式(II)的化合物，其中L是Cl。
在另一个实施方案中，式(II)的接头化合物(其中L是Cl)是通过使氯甲酸酯与六氢化三嗪衍生物(B-N-CH2)3反应来制备(图5)。反应可在不掺溶剂的情况下或在一种惰性溶剂(诸如四氢呋喃、二氯甲烷、乙酸乙酯、或二噁烷)的存在下，在0℃和100℃之间，典型地是在溶剂沸点或在接近溶剂沸点的温度下进行。
大分子与式(II)或(III)的化合物的偶联
式(II)和(III)的R1、R2、R5或B基团提供了一种附接到大分子上的手段。用于共轭到大分子上的方法在本领域中总体上是已知的。
在允许连接到大分子上的在R1、R2、R5或B基团上的官能团是处于受保护的形式的情况下，首先使式(II)或(III)的接头-药物的化合物经受去除保护基的条件。因此，当保护基是酸可裂解时，诸如对于叔丁基酯醚或硫醚或对于tBOC氨基甲酸酯，式(II)或(III)的接头-药物先用三氟乙酸处理足够的时间以去除保护基。当保护基可通过还原除去时，诸如烯丙醚或酯或烯丙氧羰基(Alloc)氨基甲酸酯，式(II)或(III)的接头-药物首先在一种钯(0)催化剂(例如四(三苯基膦))的存在下用一种温和的还原剂(诸如苯基硅烷)进行处理。当保护基是一种甲硅烷基保护基时，可以用弱酸或用氟离子进行处理来实现除去，以显现游离羟基团。然后，使用本领域中已知的方法进行共轭。
在一个示例性的方法中，在氨基基团和羧酸基团之间形成一个酰胺键；因此，包含氨基基团的接头能够共轭至包含羧酸基的大分子上，或包含羧酸基团的接头能够共轭至包含氨基的大分子上。共轭还可以通过在一种缩合剂的存在下使接头和大分子反应进行，该缩合剂是例如诸如二环己基碳二亚胺(DCC)或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)的碳二亚胺、一种脲鎓试剂(诸如O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU))、或一种磷鎓试剂(诸如苯并三唑-1-三(三甲氨基)-六氟磷酸磷鎓(BOP))。可替代地，羧酸基可以在之前的步骤被活化以用于共轭，例如通过使用亚硫酰氯或草酰氯转化成酰氯，或使用碳二亚胺和五氟苯酚转化成诸如五氟苯基酯的活性酯，或使用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺转化成N-羟基琥珀酰亚胺酯，并且得到的活化的羧酸酯然后可以在第二步骤中与该胺反应。该胺和羧酸基团最初能以受保护的形式存在，并在共轭步骤前去除保护，如稳定性和/或与另外的化学转化的相容性的所要求的。胺基团可作为氨基甲酸酯而被保护，优选为叔丁氧基羰基(tBOC)、烯丙氧羰基(Alloc)或在中性至酸性条件下可除去的其他的氨基甲酸酯基团。羧酸可以作为在中性至酸性条件下可除去的酯被保护，如叔丁基(tBu)、三苯甲基(Ph3C)、烯丙基(All)或甲氧基甲基(MOM)。
在一个第二示例性方法中，在硫醇和马来酰亚胺基团之间形成了一个硫醚键；因此，含有硫醇的接头能够共轭至含有马来酰亚胺基团的大分子上，或含有马来酰亚胺基的接头能够共轭至含有硫醇的大分子上。硫醇最初能以受保护的形式存在，并在共轭步骤前去除保护，如稳定性和/或与另外的化学转化的相容性的所要求的。合适的保护基包括可以在中性至酸性条件下除去的那些，例如叔丁基硫醚(tBu)或三苯甲基硫醚。
在一个第三示例性方法中，在炔和叠氮基团之间形成了一个1，2，3-三唑键；因此，含有炔基的接头能够共轭至含有叠氮基团的大分子上，或含有叠氮基团的接头能够共轭至含有炔基的大分子上。共轭反应可以在金属催化下(典型地使用铜或钌)进行，或可以在不存在催化剂时使用一种活化的炔烃(诸如环辛炔)进行。还可以使用其他环加成反应，例如在1，3-二烯(例如，环戊二烯)与二烯亲合体(例如，马来酰亚胺)之间的狄尔斯-阿尔德反应。
在一个第四示例性方法中，在氨基和1，3-二羰基之间形成了一个烯胺(enamino)-酮键；因此，含有氨基的接头能够共轭至含有1，3-二羰基基团的大分子上，或含有1，3-二羰基基团的接头能够共轭至含有胺基的大分子上。在一个实施方案中，包含1，3-二羰基的接头与一种抗体(诸如包含适当的反应性赖氨酸ε-氨基的m38C2)反应(Doppalapudi等，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters[生物有机与医药化学快报](2007)17：501-506，通过引用结合在此)。
因此，R1、R2、R5或B基团可独立包括任选地受保护的胺、任选地受保护的羧酸、任选地受保护的硫醇、马来酰亚胺基、炔烃基或叠氮化合物的基团，以允许与大分子共轭。一旦共轭，这些基团可独立地任选地被通过羧酸酰胺、硫醚或1，2，3-三唑基团连接的大分子取代。
式(II)或式(IV)的化合物与药物/前药的键合
式(III)或(I)的化合物分别通过在一种弱碱的存在的无水条件下通过式(II)或(IV)的化合物(其中L是一个合适的离去基团(诸如甲苯磺酸酯、烷基磺酸酯、卤素或R6R7S+))与含有OH、SH或非碱性NH基团的药物DH进行反应来制备，：
合适的碱包括叔胺，例如三乙胺和N，N二异丙基乙胺、吡啶或4-(二甲氨基)吡啶。该反应混合物可以任选地包含NaI或四丁基碘化铵，以加速反应。合适的溶剂包括任何惰性、无水溶剂，包括四氢呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮和氯仿。在一些情况下，例如，当该药物包含酚或非碱性NH时，可以有利的是通过与一种强碱(例如NaH、双(三甲基甲硅烷基氨基)锂、二异丙基氨基锂或类似物)反应预形成该药物的盐。
在本发明的一个实施方案中，其中该药物是一种肽，该肽的末端的氨基酸可以是连接到本发明的接头上的焦谷氨酰基残基。这样的肽可通过肽的化学合成来制备，其中最后的偶联步骤使用接头-焦谷氨酸残基。这样的接头-焦谷氨酸残基能够通过以本发明的化合物(II)或(IV)进行的合适的焦谷氨酸(例如焦谷氨酸烯丙基酯)的盐的烷基化反应来制备。
在例如在一种还原剂(诸如硅烷)的存在下使用一种钯催化剂除去酯保护基后，接头-焦谷氨酸酯残基能够用于使用标准方法的肽的合成中。
给药和用途
设计为在可控的速率下释放药物的本发明的共轭物以总体上与的药物类似的方式施用给受试者。受试者可以是模型体系，诸如鼠、大鼠或兔，或可以是病人，或可以是兽科受试者，诸如伴侣动物、牲畜以及鸟类受试者。本发明的共轭物通常是通过注射给予，通常通过静脉内注射，但其他给药机制也在本发明的的范围内，例如口服给药、栓剂给药、经皮或经粘膜给药，等。剂量水平将取决于药物的性质、待治疗的病况、受试者的性质和主治专家的判断。对于具体的药物或方案选择合适的释放速率也取决于这些因素。因此，本发明的化合物的使用和给予是在医师的技能内。另外，如上文所述，本发明的共轭物在治疗淋巴系统疾病(其中优选皮下注射)中是特别有用和有利的。
除非另有说明，本文中引用的所有参考文件的全部内容通过引用合并在此。下面的实例旨在说明而非限制本发明。
实例1
通过β-消除裂解的基团
对具有一系列官能团作为潜在pKa调节剂(取代的芳香族化合物、酮、腈、砜)的模型接头支架进行了设计、制备并经由氨基甲酸酯键连接至Ne-2，4-二硝基苯基-L-赖氨酸(Ne-DNP-Lys)以评估释放速率。将DNP-Lys选为释放部分，因为它是水溶性的并且是允许HPLC-UV分析的强发色团。此实验证实氨基甲酸酯裂解速率可通过选择触发基团的具体取代基进行控制。
如以案卷号67057-20003.00提交的共同待决的申请中所述方法制备模型DNP-赖氨酸衍生物。
在pH7.4或pH8.3和37℃下，通过HPLC分析确定从这些化合物释放Nε-2，4-二硝基苯基-L-赖氨酸的速率。在350nm下使用UV/vis监测器通过HPLC(C18；直链甲醇/水+0.5％HOAc梯度)进行释放反应的动力学分析。对Lys(DNP)(“P”)和起始材料(“S”)峰下的面积进行积分以按照R＝P/(S+P)确定反应程度(“R”)。由通过对ln(1-R)-时间图线进行线性回归分析所获得的直线斜率计算反应速率。DNP-Lys氨基甲酸酯在pH7.4和/或8.3下的β-消除性裂解的t1/2值在表2中示出。
表2：37℃下N e -2，4-二硝基苯基-L-赖氨酸释放的动力学数据。
如表2所示，在pH7.4下，氨基甲酸酯的消除Nε-2，4-二硝基苯基-L-赖氨酸的释放的半衰期从2至＞1650小时变化。裂解由β-消除反应产生并且通过不同的半衰期和观察得以证实，该观察如下：在5天后于37℃和pH7.4下，O-苄基-N-(Nε-2，4-二硝基苯基-L-赖氨酸)-氨基甲酸酯(它不能发生O-烷基断裂)未显示出Nε-2，4-二硝基苯基-L-赖氨酸的可观测到的释放(小于估计的0.25％裂解的检测极限)(t1/2＞3年)。
O-苄基-N-(Ne-2，4-DNP-Lys)氨基甲酸酯于1周后在37℃下50％的人血清中没有发生可检出的水解。这证实氨基甲酸酯对血清水解酶的稳定性。总体上，与C-H相比，a)在β位的吸电子基团提高速率；b)在α位的烷基的提高速率；以及c)在α位的芳基部分降低速率。
针对取代的(苯磺酰基)乙基接头观察到良好的线性自由能关系，从而允许使用哈米特σ参数对基于SAR的此系列中的其他取代的接头的释放速率进行估计。因此，可对取代基进行选择以提供更慢(例如，4-OMe，σp＝-0.27；4-OH，σp＝-0.37；4-Me2N，σp＝-0.83)或中等释放速率(例如，4-F，σp＝+0.06；4-Cl，σp＝+0.23；3-Br，σm＝+0.39；4-CF3，σp＝+0.54)
实例2
氯甲酸酯和N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯通用制备
将吡啶(0.33当量)逐滴添加到在冰上冷却的剧烈搅拌的醇R1R2C-(C＝C)mC(R5)2OH(1当量)和三光气(0.33当量)于无水四氢呋喃(2mL/mmol)的溶液中。1小时后，允许混合物升温至环境温度并保持过夜。然后将混合物过滤并在旋转蒸发仪上真空浓缩。所得粗氯甲酸酯R1R2C-(C＝C)mC(R5)2OC(O)Cl即进行使用无需进一步纯化。
为制备N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯，将粗氯甲酸酯溶解于无水四氢呋喃(2mL/mmol)中并用吡啶(2当量)和N-基琥珀酰亚胺(4当量)在环境温度下处理30分钟。将混合物用乙酸乙酯稀释，相继用0.1NHC、水和盐水洗涤，然后经MgSO4干燥，过滤并蒸发。将粗碳酸盐R1R2C-(C＝C)mC(R5)2OC(O)Su通过硅胶色谱法(乙酸乙酯/己烷)纯化。
实例3
氨基甲酸酯的通用制备
将实例2的氯甲酸酯(1当量)在丙酮(2mL/mmol)中的溶液逐滴添加到剧烈搅拌的胺BNH2(1当量)和NaHCO3(2当量)在水(2mL/mmol)中的混合物中。30分钟后，将沉淀为固体的氨基甲酸酯通过真空过滤收集，用水洗涤并干燥；将分离成油状物的氨基甲酸酯用乙酸乙酯萃取。将萃取物经MgSO4干燥，过滤并蒸发以得到粗氨基甲酸酯。在任一种情况下，将粗氨基甲酸酯R1R2C-(C＝C)mC(R5)2OC(O)NHB通过柱色谱法(SiO2)或通过结晶进一步纯化。
可替代地，将三乙胺(1当量)添加到胺BNH2(1当量)和氯甲酸酯(1当量)在惰性无水溶剂(例如二氯甲烷、四氢呋喃或乙酸乙酯)的混合物中。在环境温度下搅拌1小时后，将混合物蒸发至干燥，并将残余物溶解于乙酸乙酯并相继用1NHCl、水、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，然后经MgSO4干燥，过滤并蒸发以得到粗氨基甲酸酯，该粗氨基甲酸酯按照上述进行纯化。
可替代地，将醇R1R2C-(C＝C)mC(R5)2OH转化成氨基甲酸酯而不分离中间体氯甲酸酯。吡啶(0.33当量)逐滴添加到在冰上冷却的剧烈搅拌的醇(1当量)和三光气(0.33当量)于无水四氢呋喃(2mL/mmol)的溶液中。1小时后，允许混合物升温至环境温度并保持过夜。将混合物在冰上冷却，并添加胺BNH2(2当量)。允许混合物升温至环境温度并保持过夜。然后将混合物蒸发至干燥，并将残余物溶解于乙酸乙酯中并相继用1NHCl、水、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，然后经MgSO4干燥，过滤并蒸发以得到粗氨基甲酸酯，该粗氨基甲酸酯按照上述进行纯化。
实例4
氨基甲酸酯的N-氯甲基化
在密封的螺口小瓶中，将实例3的氨基甲酸酯(1当量)和多聚甲醛(3当量甲醛)在1∶1四氢呋喃/三甲基氯硅烷(1mL/mmol)中的混合物在55℃下加热直至获得澄清溶液。将混合物在旋转蒸发仪上真空浓缩，并将残余物溶解于乙酸乙酯，过滤并再次浓缩以得到粗N-氯甲基氨基甲酸酯R1R2C-(C＝C)mC(R5)2OC(O)NBCH2Cl。
实例5
N-甲氧基甲基氨基甲酸酯
允许实例4的N-氯甲基氨基甲酸酯在甲醇中的溶液在环境温度下静置1小时，然后浓缩至干燥以得到N-甲氧基甲基氨基甲酸酯R1R2C-(C＝C)mC(R5)2OC(O)NBCH2OMe。
实例6
N-烷氧基甲基氨基甲酸酯、N-苯氧甲基氨基甲酸酯、N-硫代甲基氨基甲酸酯和N- 硫代苯基甲基氨基甲酸酯
将衍生自药物DH的醇、酚、硫醇或苯硫酚(1当量)和实例4的N-氯甲基氨基甲酸酯(1当量)在惰性无水溶剂(例如四氢呋喃、二氯甲烷或乙酸乙酯)中的溶液用三乙胺(1当量)逐滴处理。1小时后，将混合物蒸发至干燥。将粗产物通过硅胶色谱法纯化。
实例7
O-(9-芴基甲基)-N-炔丙基氨基甲酸酯
将9-芴甲氧基羰基氯化物(2.6g)在20mL丙酮中的溶液缓慢添加到炔丙胺盐酸盐(0.91g)和NaHCO3(2.5g)在20mL水中的搅拌混合物中。1小时后，将固体沉淀物通过真空过滤收集，用水洗涤并风干。从乙酸乙酯/己烷结晶得到产物。
实例8
O-(9-芴基甲基)N-(4-溴苯基)氨基甲酸酯
将三乙胺(0.7mL)添加到4-溴苯胺(0.85g)和9-芴甲氧基羰基氯化物(1.3g)在25mL二氯甲烷的搅拌混合物中。将混合物在环境温度下搅拌1小时，然后用1NHCl、水、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤。将有机溶液经MgSO4干燥，过滤并蒸发。
实例9
O-(9-芴基甲基)N-(4-(乙氧羰基)苯基)氨基甲酸酯
将三乙胺(0.7mL)添加到4-氨基苯甲酸乙酯(0.85g)和9-芴甲氧基羰基氯化物(1.3g)在25mL二氯甲烷的搅拌混合物中。将混合物在环境温度下搅拌1小时，然后用1NHCl、水、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤。将有机溶液经MgSO4干燥，过滤并蒸发。
实例10
O-(9-芴基甲基)N-苯基N-甲氧基甲基氨基甲酸酯
通过将O-(9-芴基甲基)N-苯基N-氯甲基氨基甲酸酯(实例14)溶解于甲醇中来制备。1H-NMR(d6-DMSO)δ7.86(2H，d，J＝7Hz)，7.42-7.22(m，9H)，7.14(m，2H)，4.83(2H，brs)，4.47(2H，d，J＝6Hz)，4.18(1H，m)，3.11(3H，brs)。
实例11
含有羟基和硫醇的部分与接头的共轭
该实例证实含羟基的分子易于共轭至接头部分上。
A.N-(6-(2，4-二硝基苯氨基)己酰基-L-丝氨酸烯丙酯。
步骤1.N-(叔丁氧基羰基)-L-丝氨酸烯丙酯：向烯丙基溴(2.3mL，26.6mmol)和三辛基甲基氯化铵(4.00g，9.90mmol)在CH2Cl2(35mL)的搅拌溶液中添加N-(叔丁氧基羰基)-L-丝氨酸(1.03g，5.02mmol)和NaHCO3(0.43g，5.12mmol)在水(16mL)中的溶液将双相反应混合物在室温下剧烈搅拌48小时。将其用水(50mL)稀释并用CH2Cl2(3x50mL)萃取。将合并的有机萃取物经MgSO4干燥，过滤并减压浓缩，以得到无色油状物(5.95g)。使用ThomsonInstruments单步80g硅胶筒以60％己烷/40％乙酸乙酯洗脱来进行纯化生产了呈无色油状物的LR2-1(1.01g，82％)。1HNMR(DMSO-d6)δ1.37(9H，s)，3.63(2H，m)，4.00(2H，m)，4.53(2H，m)，4.89(1H，t，J＝6.2Hz)，5.18(1H，dd，J＝1.4Hz，J＝10.6Hz)，5.30(1H，dd，J＝1.6Hz，J＝17.1Hz)，5.84(1H，m)，6.98(1H，d，J＝8.2Hz)。
步骤2.将N-(叔丁氧基羰基)-L-丝氨酸烯丙酯(0.175g，0.731mmol)在4M氯化氢/二噁烷(2mL)中的溶液在环境温度下搅拌40分钟。将反应混合物在旋转蒸发仪上浓缩并将粗HCl盐溶于无水四氢呋喃(3mL)中。向此溶液中添加N-琥珀酰亚氨基6-(2，4-二硝基苯胺基)己酸酯(0.288g，0.791mmol)和三乙胺(102mL，0.731mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟并将溶剂蒸发。将残余物在乙酸乙酯和水之间分配并分离各相。将有机相用饱和NaHCO3和饱和NaCl洗涤。将其经MgSO4干燥，过滤并减压浓缩，以得到呈黄色油状物的粗产物(0.293g)。使用ThomsonInstruments单步12g硅胶筒，以50％己烷/50％乙酸乙酯洗脱随后乙酸乙酯洗脱来进行纯化得到了呈黄色油状物的产物(0.222g，72％)。1HNMR(DMSO-d6)δ1.32(2H，m)，1.52-1.64(4H，m)，2.15(2H，t，J＝7.0Hz)，3.44(2H，m)，3.59(1H，m)，3.66(1H，m)，4.33(1H，m)，4.55(2H，m)，5.02(1H，t，J＝5.5Hz)，5.17(1H，m)，5.28(1H，m)，5.83(1H，m)，7.21(1H，d，J＝9.5Hz)，8.12(1H，d，J＝7.9Hz)，8.23(1H，dd，J＝2.5Hz，J＝9.4Hz)，8.85(2H，m)。
B.O-(N-((9-芴基甲氧基)羰基)-N-苯基)氨甲基)N-(6-(2，4-二硝基苯氨基)己酰 基)-丝氨酸.
步骤1.将N-(6-(2，4-二硝基苯氨基)己酰基-L-丝氨酸烯丙酯(0.050g，0.118mmol)、O-(9-芴基甲基)N-苯基N-氯甲基氨基甲酸酯(0.043g，0.118mmol)和三乙胺(16.1mL，0.116mmol)在无水CH2Cl2(2mL)中的溶液加热回流1小时。将O-(9-芴基甲基)N-苯基N-氯甲基氨基甲酸酯(0.043g，0.118mmol)和三乙胺(16.1mL，0.116mmol)的其他等分试样加入并保持回流1小时。将溶液冷却至室温，用CH2Cl2稀释，用饱和NaCl溶液洗涤，经MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。使用ThomsonInstruments单步12g硅胶筒，以50％己烷/50％乙酸乙酯随后30％己烷/70％乙酸乙酯洗脱来对粗料(0.145g)进行纯化，以得到呈黄色油状物的中间体烯丙酯(0.030g，33％)。1HNMR(DMSO-d6)δ1.31(2H，m)，1.52-1.63(4H，m)，2.15(2H，t，J＝7.3Hz)，3.41(2H，m)，3.43-3.70(2H，br.m)，4.15(1H，br，m)，4.43-4.54(5H，br.m)，4.87(2H，br.m)，5.14(1H，m)，5.25(1H，m)，5.79(1H，m)，7.12-7.38(12，m)，7.82(2H，d，J＝7.4Hz)，8.21(1H，dd，J＝2.5Hz)，J＝9.5Hz)，8.25(1H，d，J＝8.0Hz)，8.84(2H，m)。
步骤2.将四(三苯基膦)钯(0)(0.002g，1.7μmol)添加到得自步骤1的烯丙酯(0.030g，40μmol)和苯基硅烷(9.8mL，80μmol)在无水四氢呋喃(0.5mL)中的搅拌溶液中。将反应混合物在环境温度下搅拌30分钟，然后浓缩。添加硅胶和CH2Cl2，并将混合物再次浓缩并加载到短硅胶柱上。将柱用30％己烷/70％乙酸乙酯随后乙酸乙酯洗脱并最终用含有0.5％乙酸的乙酸乙酯洗脱，以得到呈黄色油状物的羧酸(0.024g，86％)。1HNMR(DMSO-d6)δ1.31(2H，m)，1.51-1.62(4H，m)，2.14(2H，t，J＝7.3Hz)，3.40(2H，m)，3.45-3.80(2H，br.m)，4.14(1H，br.m)，4.41(3H，br.m)，4.87(2H，br.m)，7.16-7.30(12H，m)，7.82(2H，d，J＝7.6Hz)，8.08(1H，d，J＝8.1Hz)，8.20(1H，dd，J＝2.7Hz，J＝9.6Hz)，8.83(2H，m)。在1MHEPES缓冲液、15mMNaCl中在pH7.40和37℃下，N-(6-(2，4-二硝基苯基)氨基己酰基)-丝氨酸从O-(N-(9-芴基甲氧羰基-N-苯基)氨甲基)-丝氨酸释放的动力学在图4中示出。
C.S-(N-(9-芴甲氧羰基-N-苯氨基)甲基)N-(2，4-二硝基苯基)-半胱氨酸
将N-(DNP)-半胱氨酸烯丙酯(82mg)和O-(9-芴基甲基)N-苯基N-氯甲基氨基甲酸酯(91mg)在二氯甲烷(1mL)中的溶液用三乙胺(35μL)处理1小时，然后通过使用1∶1乙酸乙酯/己烷的硅胶过滤并浓缩至干燥。将产物通过硅胶色谱法纯化。
将烯丙酯、苯基硅烷(75μL)和四(三苯基膦)钯(15mg)在THF(2.5mL)中的溶液在环境温度下搅拌10分钟，然后蒸发至干燥。将残留物溶解于二氯甲烷并加载至5mL硅胶柱上，将其相继以1∶4乙酸乙酯/己烷、乙酸乙酯和0.5％乙酸/乙酸乙酯洗脱。将含有产物的部分合并并蒸发。1H-NMR(d6-DMSO)：d13.7(1H，brs)，9.01(1H，d，J＝7Hz)，8.85(1H，d，J＝3Hz)，8.25(1H，dd，J＝3，9Hz)，7.82(1H，d，J＝7)，7.40-7.25(m，7H)，7.25-7.15(m，3H)，7.11(m，2H)，4.96(m，1H)，4.81(s，2H)，4.30(m，2H)，4.08(m，1H)，3.18(m，2H)。在0.1MHEPES缓冲液、15mMNaCl中在pH7.40和37℃下，N-(2，4-二硝基苯基)-半胱氨酸从S-(N-(9-芴甲氧羰基-N-苯基)氨甲基)N-(2，4-二硝基苯基)-半胱氨酸释放的动力学在图3中示出。
实例12
O-((9-(2-(N-(6-叠氮基己酰基)N-甲基)氨甲基)芴基)甲基)N-苯基N-氯甲基氨 基甲酸酯
将芴-2-羰基氯化物(由芴-2-羧酸和草酰氯制备)在THF中的溶液添加到甲胺水溶液(2摩尔当量)中以制备N-甲基芴-2-甲酰胺。使用醚中的LiAlH4还原酰胺提供了2-((甲氨基)甲基)芴。通过与二碳酸二叔丁酯进行反应得到2-((N-tBOC-N-甲氨基)甲基)芴来保护胺。
将2-((N-tBOC-N-甲氨基)甲基)芴在无水四氢呋喃(THF)中的溶液冷却至-78℃，然后用双(三甲基甲硅烷基)氨基锂在THF(1.2摩尔当量)中的溶液进行处理。1小时后，添加甲酸乙酯并允许混合物升温至环境温度。将混合物用乙酸乙酯稀释并相继用0.1NHCl、水、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，然后经MgSO4干燥，过滤并蒸发，以提供2-((N-tBOC-N-甲氨基)甲基)-芴-9-羧醛。将此化合物溶解于甲醇并用NaBH4处理，以提供9-(2-((N-tBOC-N-甲氨基)甲基)芴甲醇。
将9-(2-((N-tBOC-N-甲氨基)甲基)芴基甲醇溶解于THF并用根据实例2的通用工序用三光气和吡啶进行处理以提供氯甲酸酯。根据实例3的方法使氯甲酸酯与苯胺反应以提供O-(9-(2-((N-tBOC-N-甲氨基)甲基)芴基甲基)N-苯基氨基甲酸甲酯。
将氨基甲酸酯溶解于三氟乙酸以除去tBOC保护基。蒸发至干燥后，将所得胺溶解于THF中并用N-(6-叠氮基己酰基)琥珀酰亚胺和三乙胺(2当量)进行处理以提供O-(9-(2-((N-(6-叠氮基己酰基)-N-甲氨基)甲基)芴基甲基)N-苯基氨基甲酸酯。
使O-(9-(2-((N-(6-叠氮基己酰基)-N-甲氨基)甲基)芴基甲基)N-苯基氨基甲酸酯与多聚甲醛在1∶1THF/三甲基氯硅烷中反应提供了产物N-氯甲基氨基甲酸酯。
实例13
含有SN-38的接头-药物化合物
该实例证实药物分子与本发明的化合物特别是通过药物分子中的酚基进行键合的。
将实例12的N-氯甲基氨基甲酸酯(1当量)、SN-38(1当量)和碘化钠(10当量)在无水丙酮中的溶液用三乙胺(1当量)进行处理。将产物通过硅胶色谱法纯化。
实例14
与PEG的共轭
将40-kDaPEG-炔(2.5μmol；通过40-kDaPEG-胺与5-己炔酸的N-基琥珀酰亚胺酯反应而制备)和叠氮化物-接头(50μmol；例如，实例12的分子)在THF(3mL)和水(1.6mL)中的混合物用0.1MCuSO4(50μL)、50mM三[(1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)在DMSO(50μL)和0.1M抗坏血酸钠(200μL)中的新鲜制备的混合物进行处理。12小时后，在环境温度下，将混合物在旋转蒸发仪上蒸发以除去THF，用水稀释至2mL并且在SephadexG25柱上进行凝胶过滤。然后将含有大分子的流过物(flow-through)冻干，并且将残余物溶解于2mLTHF中，并通过添加5mL甲基叔丁基醚来使产物沉淀。如果需要的话，重复凝胶过滤和后续步骤。
实例15
制备R 5 叠氮基烷基-接头的通用方案
R-CH2-触发基与叠氮基链烷酸酯N3(CH2)nCO2R’(n＝3-6)在强碱例如NaH、双(三甲基甲硅烷基)氨基锂(LiHMDS)或二异丙氨基锂(LDA)的存在下进行克莱森缩合得到酮，该酮通过与温和还原剂(例如硼氢化钠)在甲醇中反应而被还原成醇。然后将所得醇经由氯甲酸酯转化成氨基甲酸酯，然后如上所述转化成N-氯甲基氨基甲酸酯。
实例16
制备R 5 BOC-保护的胺接头的通用方案
R-CH2-触发基与((N-叔丁氧基羰基N-烷基)氨基)链烷酸酯(n＝3-6)在强碱例如NaH、双(三甲基甲硅烷基)氨基锂(LiHMDS)或二异丙氨基锂(LDA)的存在下进行克莱森缩合得到酮，该酮通过与温和还原剂(例如硼氢化钠)在甲醇中反应而被还原成醇。然后如实例3中所述，用胺B-NH2将所得醇转化成氨基甲酸酯。如实例4中所述，将氨基甲酸酯转化成N-氯甲基氨基甲酸酯。
当与包含醇、硫醇、酚或苯硫酚基团的药物分子偶联后，通过用三氟乙酸乙酸处理将BOC基团从氨基甲酸酯中除去。使用缩合剂例如碳二亚胺(如EDCI)使所得胺与包含羧酸的大分子偶联。
实例17
制备R 5 酰氨基-叠氮基烷基-接头的替代方案
通过用三氟乙酸处理来将BOC基团从实例19的中间体BOC-保护的氨基甲酸酯中除去，并且所得胺与叠氮基链烷酸酯N-基琥珀酰亚胺酯(n＝3-6)进行反应得到叠氮基酰胺。将其转化成N-氯甲基氨基甲酸酯，如实例4中所述。
实例18
磺酰基触发的R 5 胺接头的制备
使用THF中过量的NaH将(2-苯磺酰基)乙酸乙酯去质子化并用N-(6-溴己基)乙基氨基甲酸酯烷基化。使用醚中的氢化铝锂还原产物以提供甲氨基醇，将甲氨基醇以BOC氨基甲酸酯的形式进行N-保护。根据前述工序将该醇转化成氯甲酸酯，然后转化成氨基甲酸酯并转化成N-氯甲基氨基甲酸酯。
实例19
磺酰基触发的R 5 酰氨基-叠氮化物接头的制备
通过用三氟乙酸处理将BOC基团从中间体实例18的BOC-保护的氨基甲酸酯中除去，并且所得胺与叠氮基链烷酸N-基琥珀酰亚胺酯(n＝3-6)进行反应提供了叠氮基酰胺。将其转化成N-氯甲基氨基甲酸酯，如实例4中所述。
实例20
磺酰基活化的 R 5酸接头的合成
在用戊二酸酐将苯基甲基砜酰化时，在四氢呋喃中用NaH将其去质子化，以提供一种酮酸。将所得酸以叔丁酯的形式进行保护，并将酮用NaBH4还原。将所得醇经由氯甲酸酯转化成氨基甲酸酯，然后如上所述转化成N-氯甲基氨基甲酸酯。
实例21
含有磺酰基活化的酸接头的接头-药物化合物的制备以及与PEG的共轭
使实例20的接头与药物DH在1当量三乙胺的存在下进行反应。将所得保护的接头-药物化合物用三氟乙酸处理，并使用EDCI将所得游离羧酸共轭至氨基-聚乙二醇。通过添加甲基叔丁基醚(MTBE)使共轭物从乙腈沉淀，然后通过尺寸排阻色谱法纯化。
实例22
连接的肽的合成
该实例证实使用本发明的化合物可容易地实现肽合成。使用针对固相肽合成的标准方法用丝氨酸、色氨酸、酪氨酸或半胱氨酸进行肽合成，丝氨酸、色氨酸、酪氨酸或半胱氨酸呈适当受保护的形式，使得这些残基的侧链可选择性地解离(deblock)而不使其他残基脱保护。使部分脱保护的肽与过量的式(II)化合物在弱碱的存在下进行反应。洗涤树脂后，将产物肽解离并从树脂中分开以提供式(III)化合物，其中D为肽。
作为一个实例，采用本领域中已知的方法(例如)如美国专利4,769,445中描述的方法(通过引用结合在此)，利用Rink树脂在固体载体上合成CCK8(Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2)。将商业Fmoc-Phe-Rink酰胺-MBHA树脂在DMF中预先溶胀30分钟，然后在室温下在哌啶/DMF(按体积计1∶4，50ml)中悬浮并摇晃30分钟以除去Fmoc基团。将产物通过过滤分离并用DCM、DCM中的5％N，N-二异丙基乙胺(DIEA)和DCM洗涤(每次3×50ml)以得到Phe-Rink酰胺-MBHA-树脂的游离碱。将Fmoc-Asp(OtBu)-OH(1.23g，3mmol)、DCC(0.62g，3mmol)和HOBt(0.69g，4.5mmol)于0°在下搅拌下溶解于50ml的按体积4∶1的DCM/DMF中持续1小时。将Phe-Rink酰胺-MBHA树脂(1毫当量)悬浮于过滤的反应混合物(除去DCU沉淀)中并在室温下摇晃2至15小时。将Fmoc-Asp-(OtBu)-Phe-Rink酰胺-MBHA树脂产物通过过滤收集并用DCM洗涤。将Fmoc-Asp-(OtBu)-Phe-Rink酰胺-MBHA树脂在室温下在哌啶/DMF(按体积计1∶4，50ml)中悬浮并摇晃3分钟，然后第二次摇晃7分钟，以除去Fmoc基团。将产物通过过滤分离并用DMF和DCM洗涤(每次3×50ml)，得到Asp-(OtBu)-Phe-Rink酰胺-MBHA树脂的游离碱。Fmoc-Met-OH(1.12g，3mmol)、DCC(0.62g，3mmol)和HOBt(0.69g，4.5mmol)于0°在搅拌下溶解于50ml按体积计4∶1的DCM/DMF中持续1小时。将Asp-(OtBu)-Phe-Rink酰胺-MBHA树脂(1毫当量)悬浮于过滤的反应混合物(除去DCU沉淀)中并在室温下摇晃2至15小时。将Fmoc-Met-Asp-(OtBu)-Phe-Rink酰胺-MBHA树脂产物通过过滤收集并用DCM和DMF洗涤。将Fmoc-Met-Asp-(OtBu)-Phe-Rink酰胺-MBHA树脂脱保护并相继与Fmoc-Trp-OH(1.28g，3mmol)、Fmoc-Gly-OH(0.89g，3mmol)、Fmoc-Met-OH(1.12g，3mmol)、Fmoc-Tyr-OH(1.37g，3mmol)和Boc-Asp(OtBu)-OH(1.23g，3mmol)偶联以提供Boc-Asp(OtBu)-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp(OtBu)-Phe-Rink酰胺-MBHA树脂。将Boc-Asp(OtBu)-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp(OtBu)-Phe-Rink酰胺-MBHA树脂用DCM(3×50ml)洗涤，在O-(9-芴基甲基)N-苯基N-氯甲基氨基甲酸酯(10当量)和三乙胺(1当量)于DCM的混合物中悬浮并摇晃。将树脂通过过滤分离并用DCM洗涤(每次3×50ml)。使所得Boc-Asp(OtBu)-Tyr(OX)-Met-Gly-Trp-Met-Asp(OtBu)-Phe-Rink酰胺-MBHA树脂从树脂中分离并通过用8％酚、5％苯甲硫醚、5％水和3％3，6-二氧杂-1，8-辛二硫醇在三氟乙酸(10mL/g树脂)中的混合物摇晃4小时进行解离。将树脂通过过滤除去，并且通过添加10体积的醚来使肽沉淀。将粗肽进一步通过反相HPLC纯化。
在另一个实例中，使用上述方法通过固相合成制备含有半胱氨酸的肽，结合了S-(烯丙氧羰基氨甲基)-半胱氨酸[Cys(allocam)]或S-(N-[2，3，5，6-四氟-4-(N’-哌啶子基)苯基]-N-烯丙氧羰基-氨基)半胱氨酸[Cys(fnam)]残基。在从树脂中裂解之前，将半胱氨酸残基用DCM中的(Ph3P)4Pd和苯基硅烷进行选择性的解离，然后如上所述与式(II)的化合物进行反应。最后将肽解离，从树脂中除去并如上所述进行纯化。
实例23
5-氟尿嘧啶的接头-药物化合物
作为制备本发明化合物的一个实例(其中D为通过杂环N偶联的药物残基)，式(III)的接头-药物化合物可根据类似于Taylor和Sloane，“1-AlkylcarbonyloxymethylProdrugsof5-Fluorouracil(5-FU)：Synthesis，PhysicochemicalProperties，andTopicalDeliveryof5-FU(5-氟尿嘧啶的1-烷基羰基氧基前药(5-FU)：5-FU的合成、物理化学特性和局部递送)”，J.PharmaceuticalSci.[药物科学](1998)87：15-20以及Roberts和Sloane，“Synthesisof3-Alkylcarbonyl-oxymethylDerivativesof5-Fluorouracil(5-氟尿嘧啶的3-烷基羰基氧甲基衍生物的合成)”，J.HeterocyclicChem.[杂环化学]39：905-910(均通过引用结合在此)中所用的方法由5-氟尿嘧啶和式(II)的化合物制备。因此，将其中L为Cl的式(II)的化合物(1mmol)和NaI(1.3mmol)在无水乙腈(1mL)中的悬浮液在黑暗中搅拌24小时，然后过滤得到其中L为I的式(II)的化合物的溶液。允许滤液与1-(烯丙氧羰基-氧甲基)-5-氟尿嘧啶[Liu，Fullwood，andRimmer，“SynthesisofAllyloxycarbonylmethyl-5-fluorouracilandcopolymerizationswithN-vinylpyrrolidinone((烯丙氧羰基甲基)5-氟尿嘧啶的合成以及与N-乙烯基吡咯烷酮的共聚反应”，J.MaterialsChem[材料化学].(2000)10：1771-1777](0.8mmol)和1，8-双(二甲氨基)萘的混合物在环境温度下进行反应。6小时后，将混合物用醚稀释，搅拌1小时并过滤。将滤液浓缩以提供受保护的粗产物，将其用四(三苯基膦)钯(0)和苯基硅烷在无水THF中的混合物处理1小时，以除去烯丙氧羰基甲基保护基。将混合物蒸发，并将残基通过硅胶色谱法纯化，以提供式(III)的接头-药物化合物。
实例24
6-叠氮基己醛的制备
(1)6-叠氮基-1-己醇：将6-氯-1-己醇(25g，183mmol)和叠氮化钠(32.5g，500mmol)在200mL水中的混合物在回流下加热20小时，然后冷却至环境温度并用乙酸乙酯萃取3x。将合并的萃取物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩，以得到呈浅黄色油状物的产物(28.3g)。
(2)6-叠氮基己醛：将固体三氯异氰尿酸(TCCA；4.3g)分小部分添加到剧烈搅拌的6-叠氮基-1-己醇(7.15g)和碳酸氢钠(5.0g)在二氯甲烷(100mL)和水(10mL)中的混合物中。在添加后将混合物搅拌另外30分钟，然后通过硅藻土垫过滤。将有机相分离并相继用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，然后经MgSO4干燥，干燥并浓缩，以提供产物(5.8g)，该产物即被使用无需进一步纯化。
实例25
叠氮醇的制备
将正丁基锂(3.1mL，5.0mmol)在己烷中的1.6M溶液逐滴添加到R-CH3(5.0mmol)在冷却至-78℃的无水四氢呋喃(THF)(15mL)的搅拌溶液中。添加后，将冷却浴除去并允许混合物经大约30分钟缓慢升温至0℃。然后将混合物冷却回-78℃，并添加6-叠氮基己醛(5.5mmol)。搅拌15分钟后，将冷却浴除去并允许混合物升温。在混合物变澄清时，添加5mL饱和NH4Cl水溶液并允许混合物继续升温至环境温度。将混合物用乙酸乙酯稀释并相继用水和盐水洗涤，然后经MgSO4干燥，过滤并蒸发以提供呈油状物的粗产物。使用己烷中的乙酸乙酯梯度在硅胶上进行色谱法提供了纯化的产物。
根据此方法制备的化合物包括：
1-(4-(三氟甲基)苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇(R-CH3＝4-(三氟甲基)苯基甲基砜)；
1-(4-氯苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇(R-CH3＝4-氯苯基甲基砜)；
1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇(R-CH3＝苯基甲基砜)；
1-(4-甲基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇(R-CH3＝4-甲基苯基甲基砜)；
1-(4-甲氧基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇(R-CH3＝4-甲氧基苯基甲基砜)；
1-(2，4，6-三甲基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇(R-CH3＝2，4，6-三甲基苯基甲基砜)；
1-(吗啉代磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇(R-CH3＝4-(甲磺酰)-吗啉；
1-(甲磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇(R-CH3＝二甲基砜)；
1-氰基-7-叠氮基-2-庚醇(R-CH3＝乙腈)；
1-(吗啉代羰基)-7-叠氮基-2-庚醇(R-CH3＝4-乙酰基吗啉)；和
1-(9-芴基)-7-叠氮基-2-庚醇(“R-CH3”＝芴)。
实例26
叠氮基-接头氯甲酸酯的制备
将吡啶(160μL)逐滴添加到实例25的叠氮醇(1.0mmol)和三光气(500mg)在15mL无水THF的搅拌溶液中。将此所得悬浮液搅拌10分钟，然后过滤并浓缩，得到呈油状物的粗氯甲酸酯。
根据此方法制备的化合物包括：
1-(4-(三氟甲基)苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-(4-氯苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-(4-甲基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-(4-甲氧基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-(2，4，6-三甲基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-(吗啉代磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-(甲磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-氰基-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；
1-(吗啉代羰基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯；和
1-(9-芴基)-7-叠氮基-2-庚基氯甲酸酯。
在制备缺少触发基官能团的模型体系的途径中，如上所述以6-叠氮基己醇开始制备了6-叠氮基己基氯甲酸酯。
实例27
叠氮基-接头-HSE碳酸酯的制备
将实例26的氯甲酸酯在15mL无水THF中的溶液相继用N-基琥珀酰亚胺(350mg)和吡啶(250μL)处理10分钟。然后将混合物浓缩，并将残基再溶解于乙酸乙酯中。在用0.1NHCl、水、饱和NaHCO3、水、和盐水洗涤后，将溶液经MgSO4干燥，过滤并蒸发。在一些情况下，HSE碳酸酯自发结晶，并从乙酸乙酯/己烷中重结晶。在其他情况下，将粗HSE碳酸酯首先在硅胶上使用己烷在乙酸乙酯中的梯度进行层析，然后进行结晶。所有化合物均为晶体，除了得自1-(甲磺酰基)-7-叠氮基-2-庚醇的化合物之外。
根据此方法制备的化合物包括：
O-[1-(4-(三氟甲基)苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯；
O-[1-(4-氯苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯；
O-[1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯；
O-[1-(4-甲基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯；
O-[1-(4-甲氧基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯；
O-[1-(2，4，6-三甲基苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯；
O-[1-(吗啉代磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯；
O-[1-(甲磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯；
O-[1-氰基-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯；
O-[1-(吗啉代羰基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯；
O-[1-(9-芴基)-7-叠氮基-2-庚基]-O’-琥珀酰亚胺基碳酸酯；
还根据此方法从6-叠氮基己基氯甲酸酯开始制备了O-[6-叠氮基己基]-O’-琥珀酰亚胺碳酸酯。
实例28
4-(N，N-二乙基甲酰氨基)苯胺的制备
(1)N，N-二乙基4-硝基苯甲酰胺：将二乙胺(5.6mL)添加到4-硝基苯甲酰氯(5.0g)在100mLDCM的冰冷却溶液中。1小时后，将混合物相继用水、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，然后经MgSO4干燥，过滤并蒸发以提供无色液体，该液体在静置时结晶。通过乙酸乙酯/己烷重结晶得到呈浅黄色晶体的产物(4.6g)。
(2)4-(N，N-二乙基甲酰氨基)苯胺：将N，N-二乙基4-硝基苯甲酰胺(4.44g)和10％钯碳(0.2g)在100mL甲醇中的混合物用甲酸铵(4.0g)在环境温度下处理2小时。将混合物通过硅藻土过滤并浓缩。将残余物再溶解于DCM中，相继用0.5MNa2CO3、水、和盐水洗涤，然后经MgSO4干燥，过滤并蒸发以给出结晶物质。通过乙酸乙酯/己烷重结晶提供了产物苯胺。
还根据同一工序通过用吗啉代替二乙胺制备了4-(吗啉代羰基)苯胺。
实例29
叠氮基氨基甲酸酯的制备
将根据实例26的工序由2.5mmol叠氮醇制备的粗氯甲酸酯溶解于20mLTHF中，并添加苯胺(2.5mmol)和三乙胺(0.7mL，5.0mmol)。1小时后，将混合物用乙酸乙酯稀释，相继用1NHCl、水、饱和NaHCO3和盐水洗涤，然后经MgSO4干燥，过滤并蒸发。将残余物使用乙酸乙酯/己烷在硅胶上进行层析以提供产物氨基甲酸酯。
根据此方法制备的化合物包括：
O-[1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基甲酰氨基)苯基氨基甲酸酯；
O-[1-(吗啉代磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基甲酰氨基)苯基氨基甲酸酯；
O-[1-(甲磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基甲酰氨基)苯基氨基甲酸酯；
O-[1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(吗啉代甲酰氨基)苯基氨基甲酸酯；和
O-[1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(吗啉代磺酰基)苯基氨基甲酸酯。
实例30
N-氯甲基氨基甲酸酯的制备
将实例29的叠氮基氨基甲酸酯(1.0mmol)、多聚甲醛(45mg)、三甲基氯硅烷(1mL)和THF(1mL)在20mL密封小瓶中的混合物在55℃浴中加热17小时。冷却至环境温度后，将小瓶打开并将混合物在旋转蒸发仪上浓缩成粘稠的油状物，将其在乙酸乙酯中吸收(takeup)并再次浓缩。将残留物溶解于2∶1乙酸乙酯/己烷中，过滤并浓缩，以给出N-氯甲基氨基甲酸酯，该N-氯甲基氨基甲酸酯即被使用无需进一步纯化。
根据此方法制备的化合物包括：
O-[1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基甲酰氨基)苯基]-N-氯甲基氨基甲酸酯；
O-[1-(吗啉代磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基甲酰氨基)苯基]-N-氯甲基氨基甲酸酯；
O-[1-(甲磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基甲酰氨基)苯基]-N-氯甲基氨基甲酸酯；和
O-[1-(吗啉代羰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基甲酰氨基)苯基]-N-氯甲基氨基甲酸酯，
在制备缺少触发基团的对照化合物的途径中，还制备了O-[6-叠氮基己基]-N-[4-(二乙基甲酰氨基)苯基]-N-氯甲基氨基甲酸酯。
实例31
N-烷氧基甲基氨基甲酸酯的制备
将实例30的N-氯甲基氨基甲酸酯(0.4mmol)溶解于5mL无水醇中。1小时后，将混合物蒸发至干燥，并将残余物在硅胶(乙酸乙酯/己烷)上进行层析以提供产物。
根据此方法制备的化合物包括：
O-[1-(苯磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基甲酰氨基)苯基]-N-甲氧基甲基氨基甲酸酯；
O-[1-(吗啉代磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基甲酰氨基)苯基]-N-甲氧基甲基氨基甲酸酯；和
O-[1-(甲磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基甲酰氨基)苯基]-N-甲氧基甲基氨基甲酸酯。
在制备缺少触发基团的对照化合物的途径中，还制备了O-[6-叠氮基己基]-N-[4-(二乙基甲酰氨基)苯基]-N-甲氧基甲基氨基甲酸酯。
实例32
叠氮基-接头-SN38的制备
工序1(碱＝DBU)。将SN-38(7-乙基-10-羟基-喜树碱)(40mg，0.1mmol)在5mLTHF中的悬浮液用16.5μL1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)进行处理。30分钟后形成金黄色的澄清溶液。添加实例30的N-氯甲基氨基甲酸酯(0.11mmol)在1mLTHF中的溶液，导致形成黏性沉淀物。30分钟后，HPLC分析显示SN-38到叠氮化物-接头-SN38加合物的约40％的转化率。添加额外的DBU(20μL)和N-氯甲基氨基甲酸酯(0.04mmol)。15分钟后，将混合物通过添加10％的柠檬酸水溶液淬灭并用二氯甲烷(DCM)萃取。将萃取物相继用10％柠檬酸、水、和盐水洗涤，然后经MgSO4干燥，过滤并蒸发。将残留物溶解于DCM中，过滤并蒸发以得到产物。
工序2(碱＝LiHMDS)。将SN-38(42mg)在5mL4∶1THF/DMF中的悬浮液在-78℃浴中冷却，并用双(三甲基甲硅烷基)氨基锂在THF(150μL)中的1.0M溶液逐滴处理。混合物在添加碱时变为深绿色，然后形成深的金黄色。添加结束后，允许混合物升温至环境温度，并添加实例30的N-氯甲基氨基甲酸酯(0.2μmol)在1mLTHF中的溶液。10分钟后，通过添加10％柠檬酸水溶液淬灭反应，并用二氯甲烷(DCM)萃取。将萃取物相继用10％柠檬酸、水、和盐水洗涤，然后经MgSO4干燥，过滤并蒸发，得到黄色油状物质。用水研磨以除去过量的DMF，得到呈黄色固体的粗产物。将残留物溶解于DCM中，并使用己烷中丙酮的梯度在硅胶上进行层析，得到纯化的产物。
根据此工序制备的产物包括：
R＝苯磺酰基，R’＝4-(N，N-二乙基甲酰氨基)；
R＝吗啉代磺酰基，R’＝4-(N，N-二乙基甲酰氨基)；和
R＝甲磺酰基，R’＝4-(N，N-二乙基甲酰氨基)。
实例33
4-臂PEG-[DBCO] 4 的制备
将具有季戊四醇核(NOFAmerica，PTE400PA)(500mg，12.5μmol)的带氨基丙基端基的40-kDa4-臂聚乙二醇、三乙胺(20μL)和6-氮杂-5，9-二氧代-9-(1，2-二脱氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀-5(6H)-基)(6-aza-5，9-dioxo-9-(1，2-didehydrodibenzo[b，f]azocin-5(6H)-yl))壬酸琥珀酰亚胺酯(“DBCO-NHS”，ClickChemistryTools，Macon，GA)(36mg，75μmol)在5mLTHF中的溶液在环境温度下搅拌24小时。通过将反应混合物添加到50mL甲基叔丁基醚(MTBE)中使产物沉淀。将沉淀物通过真空过滤收集并真空干燥以提供510mg产物。
实例34
可释放的4-臂PEG-SN38共轭物的制备
将4-臂PEG-[DBCO]4(100mg，2.0μmolDBCO)和实例32的叠氮化物-接头-SN38(10μmol)在1.5mLTHF中的溶液在环境温度下保持21小时。将混合物浓缩，再溶解于甲醇中，并针对甲醇进行渗析(10kDa截断膜)以除去游离的叠氮化物。在旋转蒸发仪上过滤之后，将产物溶解于2mLTHF中并通过添加10mLMTBE进行沉淀。将沉淀物通过真空过滤收集并真空干燥以提供产物共轭物。使用水+0.1％TFA中20-100％乙腈的梯度进行的HPLC分析(300AC4Jupiter柱(Phenomenex)，保持40℃的恒温)证实不存在非共轭的SN-38或游离的叠氮化物。通过在361nm下使用ε＝22,500M-1cm-1测量水溶液的UV吸光度来确定SN-38含量。
根据此工序制备的可释放的共轭物包括：R＝苯磺酰基；R＝甲磺酰基；和R＝吗啉代磺酰基，每种均具有R’＝4-(N，N-二乙基甲酰氨基)。作为对照，缺少触发基团的共轭物根据同一工序制备。
实例35
SN-38从PEG-SN38共轭物的释放
将实例34的4-臂SN-38共轭物(其中R’＝4-N，N-二乙基甲酰氨基，并且R＝苯磺酰基或甲磺酰基基)的样品溶解于缓冲液中并保持在37℃。将20μL的等分试样定期注射到HPLC(300AC4Jupiter柱(Phenomenex)，保持40℃的恒温)上并用水+0.1％TFA中20％-100％乙腈的梯度利用荧光检测(激发380nm；发射515nm)进行分析。在这些条件下，将游离SN-38在5分钟时洗脱并将共轭物在7分钟时洗脱。测量峰面积并将其用于通过指数拟合来计算反应速率。
在pH8.5和37℃下和在0.1MN-二甘氨酸中，其中R’＝4-N，N-二乙基甲酰氨基并且R＝苯磺酰基的共轭物，以T1/2＝1.6小时释放SN-38，而在相同条件下，其中R’＝4-N，N-二乙基甲酰氨基并且R＝甲磺酰的共轭物，以T1/2＝9h释放SN-38。
实例36
4-臂PEG-SN38共轭物在小鼠体内的药代动力学
通过将实例34的4-臂PEG-SN38共轭物溶解于pH5.0的10mM乙酸钠中来制备给药溶液，从而得到最终浓度为1mM的SN-38，该浓度通过在361nm(ε＝22,500M-1cm-1)下的UV吸光度确定。将给药溶液使用0.2μm注射器式滤器灭菌过滤并冷冻。
样品由静脉内注射给四只CD-1小鼠，每种化合物2μL/g体重。使用以下方案从眼窝窦收集血样：小鼠1∶1、16和72小时；小鼠2∶2和24小时；小鼠3∶4和32小时；小鼠4∶8和48小时。将样品在-80℃下速冻直至分析。将三分之一体积的Nε-(2，4-二硝基苯基)-L-赖氨酸的0.25mg/mL溶液添加到每种血清样品中作为最终浓度为0.0625mg/mL的内标物。将一半体积的200mM三乙胺·HCl缓冲液(pH10.75)添加到每种血清样品中并在37℃下放置16小时。在水解后，用三体积的甲醇使血清蛋白沉淀。根据稀释于小鼠血清中并用同一工序水解的其中R＝CH3SO2并且R’＝4-(N，N-二乙基甲酰氨基)的共轭物的母液绘制标准曲线。在具有JupiterC45μ柱的ShimadzuHPLC上使用含0.1％三氟乙酸的H2O中的乙腈的20％-100％梯度分析样品和标准物的全部游离SN38。用设定为380nm/515nm激发/发射的荧光检测器检测SN38。根据标准曲线用荧光峰面积计算SN38浓度。使用PK溶液药代动力学软件根据数据计算药代动力学参数。。结果在图8中示出。
实例37
通过N-氯甲基氨基甲酸酯连接至肽硫醇
将实例30的N-氯甲基氨基甲酸酯(0.1μmol)添加到含硫醇的肽(0.1μmol)在1.0mL三氟乙酸(TFA)的溶液中。2小时后，将产物通过添加5mL乙醚进行沉淀并离心收集。将沉淀物用醚洗涤3x并干燥。将其溶解于pH5的乙酸盐缓冲液中，并加载到1-gBondElutC18筒上。将筒用含有0.1％TFA的水中的甲醇的不连续梯度进行洗涤，以洗脱纯化的产物。
实例38
通过N-烷氧基甲基氨基甲酸酯连接至肽硫醇
将实例31的N-烷氧甲基氨基甲酸酯(0.1μmol)添加到含硫醇的肽(0.1μmol)在1.0mL三氟乙酸(TFA)的溶液中。2小时后，将产物通过添加5mL乙醚进行沉淀并离心收集。将沉淀物用醚洗涤3x并干燥。将其溶解于pH5的乙酸盐缓冲液中，并加载到1-gBondElutC18筒上。将筒用含有0.1％TFA的水中的甲醇的不连续梯度进行洗涤，以洗脱纯化的产物。
实例39
叠氮化物-接头谷胱甘肽的制备
将O-[1-(甲磺酰基)-7-叠氮基-2-庚基]-N-[4-(二乙基甲酰氨基)苯基]-N-甲氧基甲基氨基甲酸酯(50mg)添加到还原的谷胱甘肽(50mg)在1.0mL三氟乙酸(TFA)的溶液中。2小时后，将产物通过添加5mL乙醚进行沉淀、收集并干燥。将沉淀物溶解于pH5的5mL10mM乙酸钠缓冲液中，并加载到1-gBondElutC18筒上。将筒用10mL水/0.1％TFA洗涤以除去过量谷胱甘肽，然后用10mL1∶1甲醇/水/0.1％TFA洗涤以洗脱产物。将含有产物的洗脱物在旋转蒸发仪上蒸发至干燥。
实例40
硫醇连接肽的共轭
将实例37或38的硫醇连接的肽叠氮化物的溶液(1.5当量)和DBCO活化的聚乙二醇(PEG-DBCO)(1当量)在含水缓冲液中的溶液通过UV光谱法监测。在形成三唑时，DBCO在301nm下的特征性吸光度丢失。然后针对pH5.0的10mM乙酸钠对反应混合物进行渗析(10kDa截断膜)，以除去过量的叠氮化物。
实例41
PEG-共轭的谷胱甘肽
将40-kDa直链mPEG-DBCO(100mg，2.5μmol)在2.5mLpH5.0的10mM乙酸钠缓冲液中的溶液与S-[N-(4-二乙基-甲酰氨基)苯基N-(6-叠氮基-1-(苯磺酰基)甲基)己基氧基-羰基)氨甲基]谷胱甘肽(甲醇中65mg/mL；60μL)的溶液混合并在环境温度下保持16小时，然后通过用水平衡的PD-10柱(GEHealthSciences)。将含有大分子的柱流过物收集并蒸发。
实例42
4-臂PEG-SN38共轭物在大鼠体内的药代动力学(实验2)
将实例42的4-臂PEG-SN38共轭物溶解于pH5.0的10mM乙酸钠制备给药溶液，从而得到最终浓度为1mM的SN-38，该浓度通过在361nm(ε＝22,500M-1cm-1)下的UV吸光度测量。将给药溶液使用0.2μm注射器式滤器灭菌过滤并冷冻。
将样品静脉以100μL/100g体重注射给插套管的雄性斯普拉-道来大鼠。使用每种化合物一只单一大鼠完成时程。在0、1、2、4、8、12、24、48、72和120小时收集血样。将血清分离并冷冻。将大鼠血清样品在冰上解冻。将Nε-(2，4，-二硝基苯基)-L-赖氨酸的0.25mg/mL溶液的60μL等分试样添加到180μL的每种解冻的血清样品中。将2.5μL2M乙酸添加到这些样品的100μL等分试样中，然后添加至300μL甲醇，以使血清蛋白沉淀。将样品在冰上留置1小时并以14,000rpm离心。向分开的每种样品的100μL等分试样，添加50μL200mMEt3N并将这些等分试样置于37℃的培养箱中过夜(约16小时)，以自PEG水解SN38。在大鼠血清(Sigma-Aldrich)中稀释至40μM并随后根据上述相同工序处理的其中R＝苯磺酰的共轭物的母液制出标准曲线。在具有JupiterC4400A5u柱的ShimadzuHPLC上使用含0.1％TFA的H2O中的乙腈的0-100％梯度经10分钟分析样品和标准物的SN38共轭物以及全部游离SN38。用设定为380nm/515nm激发/发射的荧光检测器检测SN38。通过使用Excel(Microsoft)拟合成标准曲线来确定样品浓度。使用PK溶液软件(SummitPK)来计算PK参数。实验结果在图9中示出。
实例43
释放动力学
药物从本发明共轭物的释放速率可通过本领域中已知的方法(包括色谱法例如HPLC)进行确定。如果例如将荧光标记物用作药物的模型系统，则由释放荧光化合物引起的荧光与由共轭物发出的荧光相比和容易确定。
可通过测定共轭物的药代动力学(与具有相同规模的不可释放的共轭物的药代动力学相比)来测量药物从本发明共轭物的体内释放。对于小分子药物，释放的药物实际上立即从任何模型系统的血浆中清除，使得可忽略对血浆中游离药物浓度的测量，并且仅需测量共轭物本身的浓度就可计算释放速率(当比较系统的完整共轭物的清除率时)。相比小鼠，此类数据优选地在大鼠中获得，因为它们对本发明的高分子量共轭物表现出更有利的清除率。
更具体地讲，例如，通过静脉给药将共轭物给予诸如大鼠的模型受试者，并且定期采集血样并分离血浆。测定血浆中共轭物随时间变化的水平。这可通过色谱分离(例如脱蛋白质后联合UV、荧光或质谱检测的HPLC分析)来完成，或在适当的情况下通过直接测定例如ELISA、生物活性或荧光来完成。如上所述，附着到一区室模型的大分子共轭物(本发明的共轭物)可通过下面的两种机理之一从血浆中消失：药物从共轭物中释放，和完整共轭物的清除(例如通过肾滤)。因此从血浆中可释放的共轭物的损失率为通过药物释放或通过共轭物清除的损失率的总和。相比之下，不可释放的共轭物的损失率正好为从血浆中共轭物的清除率，因为未释放药物。因此，本发明共轭物的药物释放率可计算为可释放共轭物与相应的不可释放的共轭物的损失率的差值。这可通过直接取损失率差值进行，或这可根据ln(R/N)-时间的图线斜率进行计算，其中R为可释放共轭物的浓度，并且N为不可释放的共轭物的浓度，如图9a和图9b所示。如图a所示，原始数据仅示出各种共轭物和稳定共轭物随时间的浓度的对数(ln)。图b示出通过上述计算获得的各种可释放共轭物的释放速率的差值。稳定共轭物当然表现出零释放率，但是示出了来自样品共轭物中释放的触发基的各种实施方案的药物释放速率。
图10示出速率常数按照相同模式随触发基在体外和体内的性质的变化。

Claims (19)

1.一种下式的化合物
其中m是0或1；
其中R1和R2中的至少一者或二者独立地是CN；NO2；
任选取代的碳原子的芳基；
任选取代的杂芳基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3是H或任选取代的烷基；
各自任选取代的芳基或芳烷基；
各自任选取代的杂芳基或杂芳烷基；或
OR9或NR9 2，其中每个R9独立地是H或任选取代的烷基，或两个R9基团与它们附接到其上的氮一起形成一个杂环；
SR4，其中
R4是任选取代的烷基；
各自任选取代的芳基或芳烷基；或
各自任选取代的杂芳基或杂芳烷基；
其中R1和R2可以连接形成一个3-8元环；并且
其中R1和R2中的一个且仅一个可以是H或烷基、芳烷基或杂芳烷基，每一个均被任选地取代；
每个R5独立地是H或烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，每一个均被任选地取代；
Z是通过O、S或非碱性N偶联的一种药物或前药的一个残基，或是介导所述偶联的一种离核体；
B为烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，每一个均被任选地取代；并且
其中R1、R2、R5或B之一偶联至一个大分子上，或R1、R2或R5包含用于介导所述偶联的一个官能团；
其中每个所述的任选取代基独立地是卤素、硝基、氰基、OR、SR、NR2、OCOR、NRCOR、COOR、CONR2、SOR、SO2R、SONR2、SO2NR2，其中每个R独立地是烷基、芳基或杂芳基，或者两个R基团与其相连的原子结合在一起形成环；
所述芳基有6-18个碳原子；所述杂芳基有3-15个碳原子且含有O、N或S中的至少一个；所述烷基有1-8个碳原子。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R1和R2之一是CN。
3.如权利要求1所述的化合物，其中R1和R2中的至少一个包含苯基或亚苯基。
4.如权利要求1所述的化合物，其中R1和R2之一是SO2R3，并且另一个是H、烷基或苯基；所述烷基有1-8个碳原子。
5.如权利要求1所述的化合物，其中m是0。
6.如权利要求1所述的化合物，该化合物为具有下式的一种药物共轭物
其中R1、R2、R5、m和B如权利要求1所定义，
D是通过O、S或N偶联的一种药物或前药的残基；并且
R1、R2、R5或B之一偶联至一个大分子上。
7.如权利要求6所述的药物共轭物，其中该大分子是聚乙二醇(PEG)。
8.如权利要求6所述的药物共轭物，其中该药物是一种肽、核酸或小分子。
9.如权利要求1所述的化合物，该化合物具有下式
其中R1、R2、R5、m和B如权利要求1所定义；
L是介导一种通过O、S或非碱性N偶联的药物或前药的偶联的一种离核体；并且
R1、R2、R5或B中的至少一个包含用于介导到一个大分子上的偶联的一个官能团。
10.如权利要求1所述的化合物，该化合物具有下式
其中R1、R2、R5、m和B如权利要求1所定义；
其中D是通过O、S或非碱性N偶联的一种药物或前药的残基；并且
R1、R2、R5或B中的至少一个包含用于介导到一个大分子上的偶联的一个官能团。
11.如权利要求1所述的化合物，该化合物具有下式
其中R1、R2、R5、m和B如权利要求1所定义；
L是介导一种药物或前药通过O、S或非碱性N偶联的一种离核体；并且
R1、R2、R5或B之一偶联至一个大分子上。
12.一种制备如权利要求6所述的式(I)化合物的方法，该方法包括使下式的化合物
其中R1、R2、R5、m和B如权利要求1所定义；
L是介导一种药物或前药通过O、S或非碱性N偶联的一种离核体；并且
其中R1、R2、R5或B之一偶联至一个大分子上；
与一种药物或前药在所述前药借以偶联至所述式(IV)化合物的条件下进行反应。
13.一种制备如权利要求10所述的式(III)化合物的方法，该方法包括使下式的化合物
其中R1、R2、R5、m和B如权利要求1所定义；
L是介导一种药物或前药通过O、S或非碱性N偶联的一种离核体；并且
R1、R2、R5或B中的至少一个包含用于介导到一个大分子上的偶联的一个官能团；
与一种药物或前药在所述药物或前药借以偶联至所述式(Ⅱ)化合物的条件下进行反应。
14.一种制备如权利要求6所述的式(I)化合物的方法，该方法包括使下式的化合物
其中R1、R2、R5、m和B如权利要求1所定义；
并且D是通过O、S或非碱性N偶联的一种药物或前药的残基；并且
其中R1、R2、R5和B中的至少一个包含将式(III)偶联至一个大分子上的一个官能团；
与一种大分子在所述大分子借以偶联至式(III)化合物的条件下进行反应。
15.一种制备如权利要求11所述的式(IV)化合物的方法，该方法包括使下式的化合物
其中m、R1、R2、R5、m和B如权利要求1所定义；
L是介导一种药物或前药通过O、S或非碱性N偶联的一种离核体；并且
其中R1、R2、R5和B之一包含将式(Ⅱ)偶联至一个大分子上的一个官能团；
与一种大分子在所述大分子借以偶联至式(II)化合物的条件下进行反应。
16.如权利要求1所述的化合物，其中Z是一种SN-38分子的残基。
17.一种式(XX)的化合物
其中R1、R2、R5、m和B如权利要求1所定义。
18.如权利要求17所述的化合物，其中m是0。
19.如权利要求17所述的化合物，其中m是0；R1是苯磺酰基、取代的苯磺酰基、甲磺酰基、SO2NR9 2,其中每个R9独立地是烷基、芳基或杂芳基，或者两个R9基团与其相连的原子结合在一起形成环，或者R1是CN；R2是H；一个R5是任选取代的烷基，而另一个R5是H；并且B是苯基或取代的苯基，并且其中R1、R5和B之一还包含与大分子连接的官能团或大分子；
其中每个所述的任选取代基独立地是卤素、硝基、氰基、OR、SR、NR2、OCOR、NRCOR、COOR、CONR2、SOR、SO2R、SONR2、SO2NR2，其中每个R独立地是烷基、芳基或杂芳基，或者两个R基团与其相连的原子结合在一起形成环；
所述芳基有6-18个碳原子；所述杂芳基有3-15个碳原子且含有O、N或S中的至少一个；所述烷基有1-8个碳原子。
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