JP6657464B2 - 血清半減期を延長するための、調節可能リンカーを介した薬学的活性剤とトランスサイレチンリガンドのコンジュゲーション - Google Patents

血清半減期を延長するための、調節可能リンカーを介した薬学的活性剤とトランスサイレチンリガンドのコンジュゲーション Download PDF

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Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０１４年８月１４日に出願された米国仮出願第62/037,592号の利益を主張するものであり、この仮出願は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦支援の研究または開発に関する申告
本明細書に開示される発明は、National Institute of Healthからの助成金1R15GM110677-01に基づき、政府支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
配列表
本出願は、EFS-Webを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１５年７月２０日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、UOPDP001US01_SL.txtという名称で、サイズは１，５８８である。配列表は、WIPO Handbook on Industrial Property Information and Documentation, Standard ST.25の段落３９に従って提出されている。
背景
発明の分野
本明細書で提供される教示は、活性剤のための送達システムであって、対象の血清中のトランスサイレチン（ＴＴＲ）に選択的なリガンド；および、リガンドを活性剤に共有結合的に作動可能に（operatively）結合させて、血清中の活性剤の半減期を延長するよう構成されたリンカー、を有する前記送達システムに関する。
関連技術の説明
多くの一見有用な薬物は、それらの劣等な薬物動態（ＰＫ）プロファイルのために、その潜在能力を実現していない。これは潜在的に有用な多くの薬物、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ウイルス様粒子、小分子、オリゴ糖、造影剤、またはそれらの組み合わせなどからなるものに当てはまる。例えば、長さが約５０アミノ酸未満のペプチドは、多くの生化学的および生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。多数のＦＤＡ承認薬物は、特に癌、糖尿病などの様々な疾患に使用されるペプチドである。さらにペプチドは、診断薬および標的リガンドの両方として大きな可能性を有する。小分子薬物より高い効力、選択性、および安全性のために、ペプチドは薬物候補として魅力的であり、したがって、臨床試験に入る新しいペプチドの数は増加し続けている。残念なことに、多くのペプチドの劣等な薬物動態プロファイルは、それらの継続的開発における主要な課題である。この問題は特に、多くのペプチドがその大きな潜在的治療能力に到達する力を制限している。
対象の血清中でのペプチドの半減期は、重大な懸念事項である。その理由は、それ以外では有用な多くペプチドが、おそらく２〜３０分の非常に短いin vivo半減期を有するからである。これは通常、（ｉ）血清プロテアーゼによる酵素分解、および／または（ｉｉ）約３０キロダルトンという、比較的高い糸球体濾過によって除去されるペプチドおよびタンパク質の分子量カットオフによる、高速腎クリアランスに起因する。当業者は、ペプチドの短いin vivo半減期が、例えば所望の結果を達成するために必要な用量のサイズおよび頻度を増加させ、そのためにその臨床潜在能力を制限していることを認識している。
図１は、半減期の問題および、この問題に対処するために当分野で使用されている、ＰＥＧ化によりペプチドの流体力学的サイズを増加させることによる、最先端の対応策を示す。図１の右側のパネルは、血清プロテアーゼおよび腎臓濾過によるペプチドの不活性化を示し、一方左のパネルは、ペプチドと巨大分子の共有コンジュゲーションを示す。図１に示すＰＥＧ化は、ペプチド１１０の、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー１１５への共有コンジュゲーション１０５である。この対応策は、ペギネサチド（peginesatide）(Affymax, Cupertino, CAのOMONTYS）を含む少数のＰＥＧ化ペプチドが市場に到達した程度まで使用されている。ペギネサチドは、ＰＥＧポリマーに共有結合して血清中でのその半減期を延長する、約５ｋＤａのペプチドの一例である。これは約４５ｋＤａの分子量を有し、透析の成人患者の慢性腎疾患に関連する貧血を処置するために使用されている。共有結合ＰＥＧ化によりペプチドの流体力学的サイズを増加させることによって、ペプチドのin vivo半減期は、例えば、腎臓による濾過１２０を減少させることにより、延長される。さらに、ＰＥＧ部分の立体的かさ高さは、ペプチド１１０のin vivo半減期を、プロテアーゼによる分解１２５に対して保護することにより延長させる。残念ながらＰＥＧ化は、いくつかの問題を当分野にもたらしている：（ｉ）大きなＰＥＧ部分の立体障害１３０はしばしば、標的細胞１４０上のその細胞外受容体１３５への、ペプチド１１０の結合親和性に害を及ぼし、これはペプチド１１０の治療薬力学的（ＰＤ）特性を、ペプチドのその受容体への結合親和性を損なうような様式で、損なう；（ｉｉ）ＰＥＧ化と相関する腎尿細管空胞形成が、動物モデルにおいて報告されている；（ｉｉｉ）動物およびヒトはＰＥＧに対する抗体を産生し得て、望ましくない免疫応答を生じる；および（ｉｖ）製造プロセスおよび冷蔵保存は、ＰＥＧ化されたペプチドの製造、貯蔵および輸送の費用を増加させる。
血清タンパク質もペプチドにコンジュゲートされ、かかる血清タンパク質は、腎臓を通って濾過されるには大きすぎるものとして選択された。一例は、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）への共有結合ペプチドコンジュゲーションである。ヒト血清アルブミンは６７ｋＤａの分子量を有し、ＨＳＡの約２０日という長い血清半減期と、ペプチドの治療効果とを合わせ持つ。１つの問題は、ＨＳＡの血清半減期が、いくつかのペプチド療法では長すぎることであり、組換えトランスサイレチン（ＴＴＲ）などの他の血清タンパク質が研究されている。トランスサイレチンは、５５ｋＤａの分子量と約２日の半減期を有する。ＴＴＲのペプチドへの共有コンジュゲーションは、その血清半減期を延長することに成功している。しかし残念なことに、ｒＨＳＡおよびＴＴＲコンジュゲーションの両方は、ＰＥＧ化アプローチの多くの制限を共有し、これには、使用のためのペプチドの製造、貯蔵および輸送のコストの増加に加えて、ペプチドの結合親和性および効力の低下が含まれる。
ＡＧ１０（化合物ＶＩＩｃ）は、強力で選択的な小分子ＴＴＲリガンドである。図２Ａ〜２Ｂは、いくつかの態様における、ＡＧ１０（化合物ＶＩＩｃ）に結合したｈＴＴＲの構造と、リンカー結合の可能性のある部位をortho（オルト）およびmeta（メタ）とラベル付けしたＡＧ１０の構造を示す。また図３Ａ〜３Ｃは、いくつかの態様における、ペプチドのin vitroおよびin vivo半減期を増強するリンカー修飾ＡＧ１０類似体を示す。これらの類似体を、半減期延長のためのＴＴＲリガンド、またはＴＬＨＥと呼ぶ。当業者は我々が、ＴＬＨＥの多数のペプチドへの結合が、その標的親和性を損なうことなくペプチドのin vitroおよびin vivo半減期を増強し、これが優れたin vivo有効性に翻訳されることを成功して実証したことを、理解するであろう。
したがって、少なくとも上記の理由から、当業者は、次のような送達システムが得られたことを理解する：（ｉ）他の点では非常に有用である活性剤の半減期を改善する；（ｉｉ）活性剤の結合親和性および効力に影響を及ぼす、立体障害の問題を回避する；（ｉｉｉ）ＰＥＧ化により引き起こされる腎尿細管の空胞化を回避する；（ｉｖ）免疫応答の問題を生じる抗体の生成を回避する；および（ｖ）ＰＥＧ化、Ｆｃおよびアルブミンがコンジュゲートしたペプチドおよび活性剤の製造、貯蔵および輸送のコストを大幅に増加させる、製造プロセスおよび冷蔵保存を回避する。
本明細書で提供される教示は、活性剤のための送達システムであって、対象の血清中の、例えばトランスサイレチンなどの血漿タンパク質に対して選択的なリガンド；および、リガンドを活性剤に作動可能に共有結合させて、血清中の活性剤の半減期を延長するよう構成されたリンカー、を有する前記送達システムに関する。
本教示は、活性剤のための送達システムを含み、該システムは以下を含む：（ｉ）対象にとって内因性で約３０ｋＤａ〜約８０ｋＤａの範囲の分子量の血漿タンパク質に対する高い選択性、（ｉｉ）該血漿タンパク質に対する少なくとも１０−６Ｍの高い結合親和性Ｋｄ、および（ｉｉｉ）約２００Ｄａ〜約２０００Ｄａの範囲の分子量、を有するリガンド；ならびに、長さが約１０Å〜約５０Åまたは８原子〜５０原子の範囲のリンカー。前記活性剤は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ウイルス様粒子、小分子、造影剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される構造を有することができる。
いくつかの態様において、血漿タンパク質は、血清アルブミン、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質、α−１グロブリン、α−２グロブリン、βグロブリン、およびγグロブリン、またはそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。いくつかの態様において、血漿タンパク質はＨＳＡである。また、いくつかの態様において、血漿タンパク質はＴＴＲである。
教示はまた、活性剤のための送達システムであって、対象の血清中のトランスサイレチンに対して選択的である、特に関心のあるリガンド；および、リガンドを活性剤に作動可能に共有結合させるように構成されたリンカー、を含む、前記送達システムを含む。いくつかの態様において、リンカーの長さは、１０Å〜５０Å、または１０原子〜２２原子の範囲である。リガンドは、次の化合物（Ｉ）：
式中、Ｘａ、ＸｂおよびＸｃは独立して、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳから選択され；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
環は４〜１２員環であり、ある態様において、４〜１２員環は芳香環またはヘテロ芳香環であり；
各Ｙは独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステルおよびシアノから選択され；
ｃは、０〜５の範囲の整数であり；および、
Ｂ環は、下記（ｈ１〜ｈ３０）から選択される複素環であり：
この式中、Ｒ１１〜Ｒ１６は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；Ｒ１７は、ヒドロキシル、アルキル、アミノ、およびアルキルアミノから選択され；およびＲ１１〜Ｒ１６の少なくとも１つは、Ｘｃとの連結基である；
または、その薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アミド、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、リガンドは、次の化合物（ＩＩ）：
式中、
ｎは、０〜８の範囲の整数であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステルおよびシアノから選択され；
Ｘａは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳであり；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
Ａは５〜１２員環であり、ある態様において、５〜１２員環は芳香環またはヘテロ芳香環であり；
各Ｙは独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステルおよびシアノから選択され；および、
ｃは、０〜５の整数である；
または、その薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アミド、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＩＩＩ）：
式中、
ｎは、０〜７の範囲の整数であり；
Ｚは炭素であるか、および／または５個のＺのうちの３個までのＺは窒素であってもよく；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
Ｘａは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳであり；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
各Ｙは独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステルおよびシアノから選択され；および
ｃは、０〜５の整数である；
または、その薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アミド、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、化合物（ＩＩＩ）のリガンドは、ｎは３であり；およびＸはＯである、の構造である。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＩＶ）：
式中、
ｎは、１〜４の範囲の整数であり；
Ｒ１は、１〜４個の炭素原子を有する短鎖アルキルであり；
Ｒ２は、水素であり；
Ｒ３は、１〜４個の炭素原子を有する短鎖アルキルであり；
Ｘａは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳであり；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
各Ｙは独立して、水素、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシル、複素環式基、アルコキシカルボニルスルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステルおよび置換アルコキシカルボニルから選択され；および
ｃは、２である；
または、その薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、化合物（ＩＶ）のリガンドは、Ｒ１はメチルであり、Ｒ３はメチルであり；ＸａはＯであり；およびＹはフルオロまたはカルボキシルである、の構造である。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（Ｖ）：
式中、
ｎは、１〜８の整数であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロ、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
Ｘａは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳであり；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
Ｒａは、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＲ７Ｒ８、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＯＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ９）ＣＯＯＨ、ＣＦ３、水素、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、カルボキシル、複素環式基、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステル、アルコキシカルボニル、または置換アルコキシカルボニルであり；
Ｒｂは、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＲ７Ｒ８、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＯＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ９）ＣＯＯＨ、ＣＦ３、水素、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、カルボキシル、複素環式基、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステル、アルコキシカルボニル、または置換アルコキシカルボニルであり；
Ｒ６は、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ７およびＲ８は、各々独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールであり；および、
Ｒ９は、天然に存在するα−アミノカルボン酸の側鎖である；
または、その薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アミド、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、化合物（Ｖ）のリガンドは、Ｒｂがブロモ、クロロ、およびフルオロから選択される構造である。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＶＩ）：
式中、
ｎは、３であり；
Ｒ１は、１〜４個の炭素原子を有する短鎖アルキルであり；
Ｒ２は、水素であり；
Ｒ３は、１〜４個の炭素原子を有する短鎖アルキルであり；
Ｘａは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳであり；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
Ｒａは、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＲ７Ｒ８、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＯＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ９）ＣＯＯＨ、水素、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、複素環式基、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステル、または置換アルコキシカルボニルであり；
Ｒｂは、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＲ７Ｒ８、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＯＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ９）ＣＯＯＨ、ハロゲンまたは複素環式基であり；
Ｒ６は、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ７およびＲ８は、各々独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールであり；および
Ｒ９は、天然に存在するα−アミノカルボン酸の側鎖である；
または、その薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＶＩＩｃ）：
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＶＩＩａ）：
式中、
Ｒａは、ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨ（ＯＨ）、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＨＲ６であり；
Ｒ６は、１〜３個の炭素原子の直鎖または分枝アルキルである；
または、その薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＶＩＩｂ）：
式中、
Ｒａは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨ（ＯＨ）、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＨＲ６であり；
Ｒ６は、１〜３個の炭素原子の直鎖または分枝アルキルである；
または、その薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、リガンドは、以下からなる群：
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物またはプロドラッグ、から選択される。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＶＩＩＩｃ）：
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物またはプロドラッグ、の構造を有し；および、
リンカーは、Ｃ１４のカルボキシル基に対してオルト位のＣ１５のリガンドに結合する。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＶＩＩＩｃ）：
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物またはプロドラッグ、の構造を有し；および、
リンカーは、Ｃ１４のカルボキシ炭素に対してメタ位のＣ１６のリガンドに結合する。
本教示は、活性剤のin vivo半減期を延長する方法を含み、該方法は、上記教示の任意の送達システムを活性剤に共有結合させることを含む。
本教示は、活性剤を対象に投与する方法を含み、該方法は、上記教示の任意の送達システムを活性剤に共有結合させて、コンジュゲート活性剤を生成すること；および、コンジュゲート活性剤を対象に投与すること、を含む。
本教示は、対象における活性剤の免疫原性を低下させる方法を含み、該方法は、（ｉ）対象にとって内因性で約３０ｋＤａ〜約８０ｋＤａの範囲の分子量の血漿タンパク質に対する高い選択性；（ｉｉ）該血漿タンパク質に対する少なくとも１０−６Ｍの高い結合親和性Ｋｄ；および（ｉｉｉ）約２００Ｄａ〜約２０００Ｄａの範囲の分子量、を有するリガンド；ならびに、長さが約１０Å〜約５０Åまたは８原子〜５０原子の範囲のリンカー；を有する送達システムを得ることを含む。方法はまた、送達システムを活性剤に共有結合させて、コンジュゲート活性剤を生成すること；および、コンジュゲート活性剤を対象に投与すること；を含み、ここで血漿タンパク質は、投与後の対象において、活性剤を抗体の生成から遮蔽する。
いくつかの態様において、送達システムは、上記教示の任意の送達システムであることができる。いくつかの態様において、血漿タンパク質は、血清アルブミン、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質、α−１グロブリン、α−２グロブリン、βグロブリン、およびγグロブリン、またはそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。いくつかの態様において、血漿タンパク質はＨＳＡである。いくつかの態様において、血漿タンパク質はＴＴＲである。
さらに、活性剤は、本明細書で教示の送達システムから利益を得ることができる、当業者に知られた任意の活性剤であり得ることを、理解すべきである。いくつかの態様において、活性剤は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ウイルス様粒子、小分子、オリゴ糖、造影剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される構造を含む。
図１は、半減期の問題および、この問題に対処するために当分野で使用されている、ＰＥＧ化によりペプチドの流体力学的サイズを増加させることによる、最先端の対応策を示す。
図２Ａおよび２Ｂは、いくつかの態様における、ＡＧ１０（化合物ＶＩＩｃ）に結合したｈＴＴＲの構造、およびリンカー結合の可能性のある部位をオルトおよびメタとラベル付けしたＡＧ１０の構造を示す。
図３Ａ〜３Ｃは、いくつかの態様における、ペプチドのin vitroおよびin vivo半減期を増強するリンカー修飾ＡＧ１０類似体を示す。
図４は、いくつかの態様における、コンジュゲート活性剤と血漿タンパク質との間の可逆的関係を示す。
図５Ａおよび５Ｂは、いくつかの態様における、（ｉ）ＡＧ１０とｈＴＴＲとのインキュベーションが、ヒト肝臓ミクロソームによる代謝に対する安定性を増強し、および（ｉｉ）ＡＧ１０の、ラットへの増加用量の静脈内投与（５、２０、および５０ｍｇ／ｋｇ）が、５分後にラット血漿中のＡＧ１０濃度の増加をもたらすことを示す。
図６Ａ〜６Ｄは、いくつかの態様における、化合物ＶＩＩＩｃの化学構造および、設計された半減期延長用のｈＴＴＲリガンド（ＴＬＨＥ）：ＴＬＨＥ１、ＴＬＨＥ２およびＴＬＨＥ３を示す。
図７は、いくつかの態様における、ＴＬＨＥ１のＴＴＲへの結合親和性を示す図である。
図８は、いくつかの態様における、試験化合物の存在下での、共有結合プローブによるヒト血清中のｈＴＴＲの修飾によって引き起こされる、蛍光の変化を示す図である。
図９は、いくつかの態様における、ＴＬＨＥをペプチドにコンジュゲートさせるための、一般的な合成スキームを示す図である。
図１０Ａ〜１０Ｄは、いくつかの態様における、４つのＴＬＨＥ１ペプチドコンジュゲートの構造を示す図である。
図１１Ａ〜１１Ｆは、いくつかの態様における、ＴＬＨＥ１−小分子コンジュゲートおよび５つのＴＬＨＥ１−蛍光色素コンジュゲートの構造を示す図である。 図１１Ａ〜１１Ｆは、いくつかの態様における、ＴＬＨＥ１−小分子コンジュゲートおよび５つのＴＬＨＥ１−蛍光色素コンジュゲートの構造を示す図である。
図１２は、いくつかの態様において、「スキーム１」１２００を、ＡＧ１０−ＧｎＲＨペプチドコンジュゲート（Ｃｏｎｊ３）の組み立てのためのモジュラーアプローチである、コンジュゲート活性剤を生成するための方法として、示す図である。
図１３は、いくつかの態様における、抗癌剤ＳＭ−３８をＴＬＨＥ１（すなわち、Ｃｏｎｊ５）にコンジュゲートするための合成スキームを示す。
図１４は、ＴＴＲへの結合の、in vitroでのＣｏｎｊ１の安定性に対する保護効果を示す図である。いくつかの態様において、ｈＴＴＲは、Ｃｏｎｊ１を緩衝液中のトリプシン加水分解に対して保護する。
図１５Ａおよび１５Ｂは、いくつかの態様における、ＴＴＲへの結合の、ヒト血清中のタンパク質分解加水分解（ｈＴＴＲ濃度約５μＭ）に対する、（Ａ）Ｃｏｎｊ２および（Ｂ）Ｃｏｎｊ３の安定性の保護効果を示す図である。
図１６は、いくつかの態様における、ｒＴＴＲへの結合の、ラットにおけるＣｏｎｊ３の半減期の延長に対する効果を示す図である。
図１７は、いくつかの態様において、Ｃｏｎｊ４がラットにおいて延長された半減期を示したことを示す。
図１８は、いくつかの態様において、血清テストステロンレベルの上昇を測定することにより、Ｃｏｎｊ４がラットにおいて延長された優れた有効性を示したことを示す。
図１９は、いくつかの態様における、ＴＴＲに共有結合することができるＡＧ１０類似体の化学合成を示す図である。
詳細な説明
活性剤のための送達システム、およびシステムを作製および使用する方法が提供される。送達システムは、（ｉ）対象の血清中の内因性血漿タンパク質に対して選択的であるリガンド；および（ｉｉ）リガンドを活性剤に作動可能に共有結合させて、血清中の活性剤の半減期を延長するように構成されたリンカー、を有する。
用語「半減期」は、その活性、例えばその薬理学的、生理学的または放射線学的活性の、半分を失うことを指すために使用することができる。用語「半減期」は、用語「生物学的半減期」または「終末相半減期」と互換的に使用することができる。いくつかの態様において、物質の半減期は、物質、例えば代謝産物、薬物、シグナル伝達分子、放射性核種、または他の物質が、その薬理学的、生理学的または放射線学的活性の半分を失うのにかかる時間である。いくつかの態様において、半減期という用語は、身体から物質を排除する排泄機能に加えて、腎臓および肝臓の機能による身体の清浄化を指すために使用することができる。いくつかの態様において、用語「半減期」は、物質の血漿濃度が、その定常状態で半分になるのにかかる時間（血漿半減期）を指すために使用することができる。いくつかの態様において、活性剤の活性の半減期は、本明細書に提供される送達システムを用いて対象に投与される場合、約３０分〜約３０日の範囲であることができる。例えば、いくつかの態様において、活性剤の活性の半減期は、本明細書で教示される、トランスサイレチンに対して高度に選択的なリガンドを有する送達システムを用いて対象に投与される場合、約３０分〜約２日の範囲であることができる。同様に、いくつかの態様において、活性剤の活性の半減期は、本明細書で教示される、ヒト血清アルブミンに対して高度に選択的なリガンドを有する送達システムを用いて対象に投与される場合、約３０分〜約２日の範囲であることができる。このように、いくつかの態様において、活性剤の活性の半減期は、本明細書に教示される送達システムを用いて対象に投与される場合、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１０日、約１２日、約１６日、約２０日、約３０日、または１時間の増分値でのその中の任意の量であることができる。当業者は、本明細書で教示の送達システムを用いて対象に投与される活性剤の活性の半減期が、約３０分〜約２日、約１時間〜約３６時間、約２時間〜約２０時間、約２時間〜約１０時間、約３時間〜約３０時間、約３時間〜約１５時間、約４時間〜約４０時間、約４時間〜約２０時間、約５時間〜約５０時間、約５時間〜約２５時間、または１時間の増分値でのその中の任意の範囲または任意の量であり得ることを、理解するであろう。
用語「医薬剤」または「医薬活性剤」は互換的に使用することができ、状態および疾患の診断、治癒、処置、管理または予防にin vivoで使用するための、任意の診断および治療物質を指す。いくつかの態様において、用語「医薬剤」または「医薬活性剤」は、用語「薬物」と互換的に使用することができる。いくつかの態様において、用語「医薬剤」または「医薬活性剤」は、用語「造影剤」と互換的に使用することができる。また、いくつかの態様において、用語「医薬剤」または「医薬活性剤」は、用語「診断剤」と互換的に使用することができる。
用語「活性剤」は、医薬剤および医薬活性剤を含み、診断用、治療用またはその他でのin vitroまたはin silicoでの、状態および疾患の診断、治癒、処置、管理または予防における剤の活性を評価するための、任意の物質を指すためにも使用することができる。多くの態様において、活性剤の分子量は、対象からの薬剤の除去を確実にするために、約４０，０００ダルトン以下でなければならない。いくつかの態様において、活性剤の分子量は、約２００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、約８，０００ダルトン〜約３０，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトン、またはその中の任意の範囲である。いくつかの態様において、本明細書で教示の方法はさらに、有効量の追加の活性剤または治療的処置の投与を含むことができ、例えば、有効量の抗増殖剤および／または有効量の放射線療法の投与などである。いくつかの態様において、用語「薬剤」、「生物活性剤」、「活性剤」および「療法」は、互換的であることができる。例えば、放射線の投与は、いくつかの態様においては、第２の薬剤の投与と見なすことができる。生物活性剤は、治療効果、予防効果、治療効果と予防効果の両方、または対象における他の生物学的に活性な効果に寄与することができる、任意の部分であり得る。生物活性剤はまた、診断特性を有することもできる。送達システムの設計の一般概念。
一般に、本明細書で教示の送達システム、および送達システムによって送達されるコンジュゲート活性剤は、当業者に知られている任意の合成技術を用いて作製することができる。例えば、活性剤、血漿タンパク質のためのリガンド、およびリガンドを活性剤に結合させるためのリンカーを選択することができる。本明細書で教示されるように、選択されたリガンドはＴＴＲに特異的であることができ、リンカーは、ＴＴＲリガンドを活性剤に結合させるように構成することができる。図３Ａ〜３Ｃは、いくつかの態様による、本明細書で教示される送達システムの単純化された構成を示す。図３Ａに示すように、リンカーは活性剤Ｙに結合している。図３Ｂにおいて、本明細書では化合物（ＶＩＩＩｃ）と称するＴＴＲリガンドをリンカーに結合させて、図３Ｃのコンジュゲート活性剤を生成する。当業者は、Ｙ基が任意の活性剤、例えばペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、ウイルス様粒子、造影剤、または小分子薬剤であり得ることを理解するであろう。また当業者は、リンカーが、所望の長さおよび機能性の任意の化学的部分であることができ、活性剤を血漿タンパク質に対して所望の位置に配置することを、理解するであろう。
図４は、いくつかの態様による、コンジュゲート活性剤と血漿タンパク質との間の可逆的関係を示す。図４は、ＴＴＲと可逆的な関係にある、本明細書で教示された送達システム４１０を示し、送達システム４１０はコンジュゲート活性剤４１１、４１２、４１３を有し、ここでＴＴＲリガンド４１１はリンカー４１２に結合し、リンカー４１２は活性剤としてのペプチド４１３に結合している。血漿タンパク質ＴＴＲ４１５と送達システム４１０との間の会合（association）は、例えば、腎臓による濾過４２０を低減することによって、ペプチド４１３のin vivo半減期を延長する。さらに、ＴＴＲ４１５の立体的かさ高さは、ペプチド４１３のin vivo半減期を、血清プロテアーゼ４２５による分解から保護することにより延長する。理想的には、送達システム４１０は、標的細胞４４０上における、ペプチド４１３のその細胞外受容体４３５への結合親和性を保存するであろう。
リンカーは、任意の好都合な化学修飾ケミストリーを使用して連結されてもよく、リンカーケミストリーを選択するプロセスは、任意の好都合な選択方法の使用を含むことができ、例えば限定はされないが、ＴＴＲのＸ線結晶構造のモデリング（例えば、ＴＴＲとリガンドの共結晶構造）、および容易に化学的に修飾され得るタンパク質との接触に関与しない１または２以上の適切な位置（例えば、溶媒露出位置）を選択すること、などである。さらなる方法は、目的の修飾が、動員部分（recruitment moiety）のＴＴＲへの結合という有害な効果を有するかどうかを、in vitro結合アッセイを使用して決定することを含む。
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」、「結合」および「連結基」は、２つの基を連結し、５０原子以下の長さの主鎖を有する化学結合部分を指す。いくつかの態様において、リンカーまたは結合は、２つの基を連結する共有結合、または、長さが１〜５０原子、長さが２〜２０原子、長さが３〜３０原子、長さが４〜４０原子、長さが１０〜５０原子、長さが１０〜３０原子、長さが１２〜２６原子、長さが１４〜３０原子、もしくはその中の任意の範囲で１原子の単位での長さの鎖を有する化学部分、であってよい。例えば、リンカーまたはリンカーの一部は、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、または５０個の炭素原子の長さを有することができ、ここでリンカーは、直鎖状、分枝状、環状または単一の原子であってよい。いくつかの態様において、リンカーは、長さが、１０Å、１１Å、１２Å、１３Å、１４Å、１５Å、１６Å、１７Å、１８Å、１９Å、２０Å、２２Å、２３Å、２４Å、２５Å、２６Å、２７Å、２８Å、２９Å、３０Å、３２Å、３４Å、３６Å、３８Å、４０Å、４５Å、５０Å、または１Åの増分値でのその中の任意の量であってよい。いくつかの態様において、リンカー主鎖の１、２、３、４、５または６個以上の炭素原子は、硫黄、窒素または酸素ヘテロ原子で任意に置換されていてもよい。主鎖原子間の結合は、飽和または不飽和であってもよく、通常、１、２、３個以下の不飽和結合がリンカー主鎖に存在する。リンカーは、１または２個以上の置換基、例えばアルキル、アリールまたはアルケニル基を含んでよい。リンカーは、限定されないが、オリゴ（エチレングリコール）；エーテル、チオエーテル、３級アミン、直鎖または分枝鎖であってもよいアルキル、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、１−メチルエチル（イソプロピル）、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルエチル（ｔ−ブチル）などを含んでよい。リンカー主鎖は、環状基、例えばアリール、複素環またはシクロアルキル基を含んでよく、ここで環状基の２または３個以上の原子、例えば２、３または４個の原子は主鎖に含まれる。リンカーは、切断可能であっても切断不可能であってもよい。
連結部分は、任意の好都合な官能基（カルボン酸、アミン、アルコール、カルバメート、エステル、アミド、エーテル、チオエーテル、マレイミドなど）および連結ケミストリーを用いて、ＴＴＲリガンドおよびＹにコンジュゲートされてもよい。例えば、G.T. Hermanson(“Bioconjugate Techniques”,Academic Press, Second Edition, 2008）に記載のコンジュゲーションケミストリーは、本ヘテロ二官能性化合物を調製する際の使用に容易に適合させることができ、これはその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「〜と組み合わせて」とは、例えば、第１の化合物を、第２の化合物の投与の全経過中に投与する場合の使用を指す；ここで、第１の化合物は、第２の化合物の投与と重複する期間投与され、例えば、第１の化合物の投与は第２の化合物の投与前に開始され、第１の化合物の投与は第２の化合物の投与の終了前に終了する；第２の化合物の投与は第１の化合物の投与前に開始され、第２の化合物の投与は第１の化合物の投与の終了前に終了する；第１の化合物の投与は第２の化合物の投与の開始前に開始され、第２の化合物の投与は第１の化合物の投与の終了前に終了する；第２の化合物の投与は第１の化合物の投与の開始前に開始され、第１の化合物の投与は第２の化合物の投与の終了前に終了する。したがって、「組み合わせて」とは、２または３種以上の化合物の投与を含むレジメンをも指すことができる。本明細書で使用される「〜と組み合わせて」はまた、同一または異なる製剤で、同一または異なる経路で、および同一または異なる剤形で投与され得る、２または３種以上の化合物の投与も指す。
本明細書で使用される、本発明の化合物の「薬学的に許容し得る誘導体」としては、その塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒和物、水和物またはプロドラッグが含まれる。かかる誘導体は、当業者によって、かかる誘導体化のための知られている方法を用いて容易に調製され得る。生成された化合物は、動物またはヒトに、実質的な毒性作用なしに投与することができ、これらは薬学的に活性であるか、またはプロドラッグである。
化合物の「薬学的に許容し得る塩」は、薬学的に許容され得て、親化合物の所望の薬理活性を有する塩を意味する。かかる塩としては、以下が挙げられる：（１）酸付加塩であって、以下のような無機酸と形成されるもの：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など；または、以下のような有機酸と形成されるもの：酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス−（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸など；または、（２）親化合物中に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンまたはアルミニウムイオンで置き換えられた場合に；あるいはこれが、有機塩基、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどと配位した場合に、形成される塩。
薬学的に許容し得る塩としてはまた、以下が挙げられるが限定はされない：アミン塩、例えば限定されないが、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、アンモニア、ジエタノールアミンおよび他のヒドロキシアルキルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、１−パラ−クロロベンジル−２−ピロリジン−１’−イルメチル−ベンゾイミダゾール、ジエチルアミンおよび他のアルキルアミン、ピペラジンおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなど；アルカリ金属塩、例えば限定されないが、リチウム、カリウムおよびナトリウムなど；アルカリ土類金属塩、例えば限定されないが、バリウム、カルシウムおよびマグネシウムなど；遷移金属塩、例えば限定されないが、亜鉛；他の金属塩、例えば限定されないが、リン酸水素ナトリウムおよびリン酸二ナトリウムなど；およびまた以下が挙げられる：限定されないが、鉱酸の塩、例えば限定されないが、塩酸塩および硫酸塩；有機酸の塩、例えば限定されないが、酢酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、酪酸塩、吉草酸塩およびフマル酸塩。その他の薬学的に許容し得る塩としては、以下が挙げられる：酸塩類、例えば酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニル−プロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩；アンモニウム塩、アルカリ金属塩を含む塩基塩、例えばナトリウムおよびカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムおよびマグネシウム塩、有機塩基との塩、例えばジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、およびアミノ酸との塩、例えばアルギニン、リシンなど。また、塩基性窒素含有基は、以下の剤と四級化することができる：低級アルキルハロゲン化物、例えばメチル、エチル、プロピルおよびブチルの塩化物、臭化物およびヨウ化物など；ジアルキルスルフェート、例えばジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミルスルフェート、長鎖ハライド、例えばデシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルの塩化物、臭化物およびヨウ化物、アラルキルハライド、例えば臭化ベンジルおよびフェネチルなど。これにより、水または油に溶解性または分散性の生成物が得られる。
薬学的に許容し得るエステルとしては、限定されないが、酸性基のアルキル、アルケニル、アルキニルおよびシクロアルキルエステルが挙げられ、酸性基としては限定されないが、カルボン酸、リン酸、ホスフィン酸、スルホン酸、スルフィン酸およびボロン酸を含む。
薬学的に許容し得るエノールエーテルとしては、限定されないが、式Ｃ＝Ｃ（ＯＲ）（式中、Ｒは水素、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはシクロアルキルである）の誘導体が含まれる。薬学的に許容し得るエノールエステルとしては、限定されないが、式Ｃ＝Ｃ（ＯＣ（Ｏ）Ｒ）（式中、Ｒは水素、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはシクロアルキルである）の誘導体が含まれる。薬学的に許容し得る溶媒和物および水和物は、化合物と、１または２以上の溶媒または水分子、または１から約１００、または１から約１０、または１から約２、３もしくは４の溶媒または水分子との、複合体である。
本発明の化合物の「薬学的に許容し得る溶媒和物または水和物」は、薬学的に許容され、親化合物の所望の薬理活性を有する、溶媒和物または水和物複合体を意味し、限定されないが、本発明の化合物と、１または２以上の溶媒または水分子、または１〜約１００、または１〜約１０、または１〜約２、３もしくは４の溶媒または水分子との、複合体である。
本明細書で使用する「有機基」および「有機ラジカル」という用語は、任意の炭素含有基を意味し、これは、脂肪族基、環式基、芳香族基、それらの官能化誘導体および／またはそれらの様々な組み合わせとして分類される、炭化水素基を含む。用語「脂肪族基」は、飽和または不飽和の直鎖状または分枝状の炭化水素基を意味し、例えば、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基を包含する。用語「アルキル基」は、置換または非置換の飽和直鎖状または分枝状炭化水素基または鎖（例えば、Ｃ１〜Ｃ８）を意味し、これは、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘプチル、イソプロピル、ｎ−オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、２−エチルヘキシルなどを含む。好適な置換基には、カルボキシ、保護カルボキシ、アミノ、保護アミノ、ハロ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、一置換アミノ、保護一置換アミノ、二置換アミノ、Ｃ１〜Ｃ７アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７アシル、Ｃ１〜Ｃ７アシルオキシなどが挙げられる。用語「置換アルキル」は、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、アミノ、保護アミノ、シアノ、ハロ、トリフルオロメチル、一置換アミノ、二置換アミノ、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、カルボキシ、保護カルボキシ、またはカルボキシ、アミノ、および／またはヒドロキシ塩によって１〜３回置換された、上記定義のアルキル基を意味する。ヘテロアリール環の置換基と共に使用される場合、用語「置換（シクロアルキル）アルキル」および「置換シクロアルキル」は、以下に定義のように、「置換アルキル」基について列挙したものと同じ基で置換される。用語「アルケニル基」は、ビニル基などの１または２以上の炭素−炭素二重結合を有する、不飽和の直鎖状または分枝状炭化水素基を意味する。用語「アルキニル基」は、１または２以上の炭素−炭素三重結合を有する、不飽和の直鎖状または分枝状炭化水素基を意味する。用語「環状基」は、脂環式基、芳香族基または複素環式基として分類される閉環炭化水素基を意味する。用語「脂環式基」とは、脂肪族基に似た特性を有する、環状炭化水素基を意味する。用語「芳香族基」または「アリール基」は、単環式または多環式の芳香族炭化水素基を意味し、１または２個以上のヘテロ原子を含んでよく、これらは以下でさらに定義される。用語「複素環式基」は、環内の１または２個以上の原子が炭素以外の元素（例えば、窒素、酸素、硫黄など）である、閉環炭化水素を意味し、これらは以下でさらに定義される。
「有機基」は官能化されていてもよく、または、保護されていても保護されていなくてもよいカルボキシル、アミノ、ヒドロキシルなどの有機基に付随する追加の官能性を含んでもよい。例えば、「アルキル基」という語句は、メチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチルなどの純粋な開鎖飽和炭化水素アルキル置換基だけでなく、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルスルホニル、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシルなどの当該分野で知られているさらなる置換基を有するアルキル置換基も含むことが意図される。したがって「アルキル基」には、エーテル、エステル、ハロアルキル、ニトロアルキル、カルボキシアルキル、ヒドロキシアルキル、スルホアルキルなどが含まれる。
用語「ハロ」および「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード基を指す。同一または異なる１または２以上のハロゲンが存在し得る。特に重要なハロゲンとしては、フルオロ、クロロおよびブロモ基が挙げられる。
用語「ハロアルキル」は、１または２個以上のハロゲン原子で置換された、上記定義のアルキル基を指す。ハロゲン原子は同一であっても異なっていてもよい。用語「ジハロアルキル」は、同一であっても異なっていてもよい２個のハロ基で置換された、上記のようなアルキル基を指す。用語「トリハロアルキル」は、同一であっても異なっていても３個のハロ基で置換された、上記のようなアルキル基を指す。用語「ペルハロアルキル」は、アルキル基中の各水素原子がハロゲン原子で置換されている、上記定義のハロアルキル基を指す。用語「ペルフルオロアルキル」は、アルキル基中の各水素原子がフルオロ基で置換されている、上記定義のハロアルキル基を指す。
用語「シクロアルキル」は、完全飽和または部分不飽和の単環式、二環式または三環式の飽和環を意味する。かかる基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、アダマンチル、シクロオクチル、シス−またはトランスデカリン、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、シクロヘキサ−１−エニル、シクロペンタ−１−エニル、１，４−シクロオクタジエニルなどが挙げられる。
用語「（シクロアルキル）アルキル」は、上記のシクロアルキル環の１つで置換された、上記定義のアルキル基を意味する。かかる基の例としては、（シクロヘキシル）メチル、３−（シクロプロピル）−ｎ−プロピル、５−（シクロペンチル）ヘキシル、６−（アダマンチル）ヘキシルなどが挙げられる。
用語「置換フェニル」は、以下からなる群から選択される１または２以上の部分で、いくつかの例においては１、２または３つの部分で置換された、フェニル基を特定する：ハロゲン、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７アシル、Ｃ１〜Ｃ７アシルオキシ、カルボキシ、オキシカルボキシ、保護カルボキシ、カルボキシメチル、保護カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、保護ヒドロキシメチル、アミノ、保護アミノ、（一置換）アミノ、保護（一置換）アミノ、（二置換）アミノ、カルボキサミド、保護カルボキサミド、Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）カルボキサミド、保護Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）カルボキサミド、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）カルボキサミド、トリフルオロメチル、Ｎ−（（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルホニル）アミノ、Ｎ−（フェニルスルホニル）アミノまたはフェニル；置換または非置換の、例えばビフェニルまたはナフチル基が生じる。
用語「置換フェニル」の例としては、以下が挙げられる：モノまたはジ（ハロ）フェニル基、例えば２、３または４−クロロフェニル、２，６−ジクロロフェニル、２，５−ジクロロフェニル、３，４−ジクロロフェニル、２、３または４−ブロモフェニル、３，４−ジブロモフェニル、３−クロロ−４−フルオロフェニル、２、３または４−フルオロフェニルなど；モノまたはジ（ヒドロキシ）フェニル基、例えば２、３または４−ヒドロキシフェニル、２，４−ジヒドロキシフェニル、それらの保護ヒドロキシ誘導体など；ニトロフェニル基、例えば２、３または４−ニトロフェニルなど；シアノフェニル基、例えば、２、３または４−シアノフェニルなど；モノまたはジ（アルキル）フェニル基、例えば２、３または４−メチルフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２、３または４−（イソプロピル）フェニル、２、３または４−エチルフェニル、２、３または４−（ｎ−プロピル）フェニルなど；モノまたはジ（アルコキシ）フェニル基、例えば２，６−ジメトキシフェニル、２、３または４−（イソプロポキシ）フェニル、２、３または４−（ｔ−ブトキシ）フェニル、３−エトキシ−４−メトキシフェニルなど；２、３または４−トリフルオロメチルフェニル；モノまたはジカルボキシフェニルまたは（保護カルボキシ）フェニル基、例えば２、３または４−カルボキシフェニルまたは２，４−ジ（保護カルボキシ）フェニルなど；モノまたはジ（ヒドロキシメチル）フェニルまたは（保護ヒドロキシメチル）フェニル、例えば２、３または４−（保護ヒドロキシメチル）フェニルまたは３，４−ジ（ヒドロキシメチル）フェニル；モノまたはジ（アミノメチル）フェニルまたは（保護アミノメチル）フェニル、例えば２、３または４−（アミノメチル）フェニルまたは２，４−（保護アミノメチル）フェニル；またはモノまたはジ（Ｎ−（メチルスルホニルアミノ））フェニル、例えば２、３または４−（Ｎ−（メチルスルホニルアミノ））フェニルなど。また、用語「置換フェニル」は、置換基が異なる二置換フェニル基を表し、例えば、３−メチル−４−ヒドロキシフェニル、３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル、２−メトキシ−４−ブロモフェニル、４−エチル−２−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシ−４−ニトロフェニル、２−ヒドロキシ−４−クロロフェニルなどである。
用語「（置換フェニル）アルキル」は、上記のアルキル基の１つに結合した、上記置換フェニル基の１つを意味する。例としては、２−フェニル−１−クロロエチル、２−（４’−メトキシフェニル）エチル、４−（２’，６’−ジヒドロキシフェニル）ｎ−ヘキシル、２−（５’−シアノ−３’−メトキシフェニル）ｎ−ペンチル、３−（２’，６’−ジメチルフェニル）ｎ−プロピル、４−クロロ−３−アミノベンジル、６−（４’−メトキシフェニル）−３−カルボキシ（ｎ−ヘキシル）、５−（４’−アミノメチルフェニル）−３−（アミノメチル）ｎ−ペンチル、５−フェニル−３−オキソ−ｎ−ペンタ−１−イル、（４−ヒドロキシナフタ−２−イル）メチルなどが挙げられる。
上記のように、用語「芳香族」または「アリール」は、６員炭素環を指す。また上記のように、用語「ヘテロアリール」は、任意に置換された５員または６員環であって、酸素、硫黄および／または窒素原子などの１〜４個のヘテロ原子、特に窒素を、単独でまたは硫黄もしくは酸素環原子と共に有するものを意味する。
さらに、上記の任意に置換された５員または６員環は、任意に芳香族５員または６員環系に縮合させることができる。例えば、該環は、ピリジンまたはトリアゾール系などの芳香族５員または６員環系に、好ましくはベンゼン環に、任意に縮合させることができる。
以下の環系は、用語「ヘテロアリール」で表される複素環（これらは置換されていてもいなくてもよい）ラジカルの例である：チエニル、フリル、ピロリル、ピロリジニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、テトラゾリル、チアトリアゾリル、オキサトリアゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、オキサジニル、トリアジニル、チアジアジニルテトラゾロ、１，５−［ｂ］ピリダジニルおよびプリニル、ならびにベンゾ縮合誘導体、例えばベンゾオキサゾリル、ベンズチアゾリル、ベンゾイミダゾリルおよびインドリル。
上記任意に置換されたヘテロアリール環の置換基は、１〜３個の、ハロ、トリハロメチル、アミノ、保護アミノ、アミノ塩、一置換アミノ、二置換アミノ、カルボキシ、保護カルボキシ、カルボン酸塩、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ヒドロキシ基の塩、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換（シクロアルキル）アルキル、フェニル、置換フェニル、フェニルアルキル、および（置換フェニル）アルキルである。ヘテロアリール基の置換基は、前記と同様であるか、またはトリハロメチルの場合、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、トリブロモメチル、またはトリヨードメチルであることができる。ヘテロアリール環に対する上記置換基と共に使用される場合、「低級アルコキシ」は、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基を意味し、同様に「低級アルキルチオ」はＣ１〜Ｃ４アルキルチオ基を意味する。
用語「（一置換）アミノ」とは、フェニル、置換フェニル、アルキル、置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アシル、Ｃ２〜Ｃ７アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７アルキニル、Ｃ７〜Ｃ１６アルキルアリール、Ｃ７〜Ｃ１６置換アルキルアリール、およびヘテロアリール基からなる群から選択される１つの置換基を有する、アミノ基を指す。（一置換）アミノはさらに、「保護（一置換）アミノ」という用語に包含されるような、アミノ保護基を有することができる。用語「二置換アミノ」は、フェニル、置換フェニル、アルキル、置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アシル、Ｃ２〜Ｃ７アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７アルキニル、Ｃ７〜Ｃ１６アルキルアリール、Ｃ７〜Ｃ１６置換アルキルアリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される２つの置換基を有する、アミノ基を指す。２つの置換基は、同一でも異なっていてもよい。
用語「ヘテロアリール（アルキル）」は、上で定義したヘテロアリール基によって任意の位置で置換された、上で定義したアルキル基を意味する。
「任意の」または「任意に」とは、その後に記載される事象、状況、特徴または要素が生じることもあるが、必ずしもその必要はないことを意味し、その記載は、事象または状況が生じる例および生じない例を含む。例えば、「アルキル基で任意に一置換または二置換されたヘテロシクロ基」とは、アルキルが存在していてもよいが、存在する必要はなく、ヘテロシクロ基がアルキル基で一置換または二置換されている状況、およびヘテロシクロ基がアルキル基で置換されていない状況を含む。
同じ分子式を有するが、それらの原子の結合の性質または順序または空間におけるそれらの原子の配置が異なる化合物は、「異性体」と呼ばれる。空間におけるそれらの原子の配置が異なる異性体は、「立体異性体」と呼ばれる。互いの鏡像ではない立体異性体は「ジアステレオマー」と呼ばれ、互いに重ね合わせることができない鏡像である立体異性体は「エナンチオマー」と呼ばれる。化合物が不斉中心を有する場合、例えば４つの異なる基に結合する場合、エナンチオマーの対が可能である。エナンチオマーは、その不斉中心の絶対配置により特徴付けることができ、CahnおよびPrelogのＲ−およびＳ−シーケンシング規則により、または分子が偏光面に関して回転する様式により記載され、右旋性または左旋性として（すなわち、それぞれ（＋）または（−）異性体として）示される。キラル化合物は、個々のエナンチオマーまたはその混合物のいずれかとして存在することができる。等量のエナンチオマーを含む混合物は、「ラセミ混合物」と呼ばれる。
本発明の化合物は、１または２以上の不斉中心を有することができる；かかる化合物はしたがって、個々の（Ｒ）または（Ｓ）立体異性体として、またはそれらの混合物として製造することができる。他に示されない限り、明細書および特許請求の範囲における特定の化合物の説明または命名は、個々のエナンチオマーおよびそれらの混合物、ラセミ混合物の両方を含むことが意図される。立体化学の決定および立体異性体の分離のための方法は、当分野で知られている（例えば、“Advanced Organic Chemistry”, 4th edition J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992の第４章の考察を参照）。
他に記載されていない限り、本態様の方法および技術は、当技術分野で周知の従来の方法に従って、および本明細書を通して引用され論じられている様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているようにして、一般に実施される。例えば、Loudon, Organic Chemistry, Fourth Edition, New York: Oxford University Press, 2002, pp. 360-361, 1084-1085；Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001を参照。
開示された化合物を合成するのに有用な一般に知られている化学合成スキームおよび条件を提供する、多くの一般的な参考文献が利用可能である（例えば、Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001；またはVogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Fourth Edition, New York: Longman, 1978を参照）。
本明細書に記載の化合物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、分取薄層クロマトグラフィー、フラッシュカラムクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー手段を含む、当技術分野で知られている任意の手段によって精製することができる。通常相および逆相ならびにイオン性樹脂を含む、任意の適切な固定相を使用することができる。例えば、Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2nd Edition, ed. L. R. Snyder and J. J. Kirkland, John Wiley and Sons, 1979；およびThin Layer Chromatography, ed E. Stahl, Springer-Verlag, New York, 1969を参照。
本開示の化合物の調製のためのいずれかのプロセスの間に、関係する分子のいずれかの感受性または反応性基を保護することが、必要および／または望ましい場合がある。これは、例えばT. W. Greene and P. G. M. Wuts, [Protective Groups in Organic Synthesis], Fourth edition, Wiley, New York 2006等の標準的な研究に記載されている従来の保護基により、達成することができる。保護基は、当技術分野で知られている方法を使用して、都合のよい後続の段階で除去することができる。
本明細書に記載の化合物は、１または２以上のキラル中心および／または二重結合を含むことができ、したがって、立体異性体として、例えば二重結合異性体（すなわち、幾何異性体）、エナンチオマーまたはジアステレオマーなどとして存在することができる。したがって、立体異性的に純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋な、エナンチオマー的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な形態）およびエナンチオマー混合物および立体異性体混合物を含む、化合物のすべての可能なエナンチオマーおよび立体異性体が、本明細書の化合物の記載に含まれる。エナンチオマー混合物および立体異性体混合物は、当業者に周知の分離技術またはキラル合成技術を用いて、それらの成分のエナンチオマーまたは立体異性体に分割することができる。化合物はまた、エノール形態、ケト形態およびそれらの混合物を含む、いくつかの互変異性形態で存在することもできる。したがって、本明細書に記載される化学構造は、例示される化合物の全ての可能な互変異性形態を包含する。記載の化合物はまた、１または２以上の原子が、自然界で通常見出される原子質量と異なる原子質量を有する、同位体標識化合物も含む。本明細書に開示の化合物に組み込むことができる同位体の例としては、限定されないが、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、１８Ｏ、１７Ｏなどが含まれる。化合物は、水和形態を含む、不溶媒和形態および溶媒和形態で存在することができる。一般に、化合物は水和化または溶媒和化することができる。ある化合物は、複数の結晶形態または非晶質形態で存在することができる。一般に、すべての物理的形態は、本明細書で企図される用途について同等であり、本開示の範囲内にあることが意図される。
本明細書で提供される送達システムの構造
活性剤の送達システムは、（ｉ）対象にとって内因性で約３０ｋＤａ〜約８０ｋＤａの範囲の分子量の血漿タンパク質に対する高い選択性；（ｉｉ）該血漿タンパク質に対する少なくとも１０−６Ｍの高い結合親和性Ｋｄ；および（ｉｉｉ）約２００Ｄａ〜約２０００Ｄａの範囲の分子量、を有するリガンド；ならびに、長さが約１０Å〜約５０Åまたは８原子〜５０原子の範囲のリンカー；を含むように構成することができる。用語「活性剤」は、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ウイルス様粒子、小分子、造影剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される構造を指すために使用することができる。用語「血漿タンパク質」は、血清アルブミン、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質、α−１グロブリン、α−２グロブリン、βグロブリン、およびγグロブリン、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される血清タンパク質を指すために使用することができる。いくつかの態様において、血漿タンパク質はＨＳＡである。いくつかの態様において、血漿タンパク質はＴＴＲである。
一般に、送達システムは、対象の血清中のトランスサイレチンに対して選択的な特定の関心のあるリガンド；および、リガンドを活性剤に作動可能に共有結合させるよう構成されたリンカー、を含むシステムに、一般に関する。いくつかの態様において、リンカーの長さは、１４Å〜３０Å、または１０原子〜２２原子の範囲である。リガンドは、以下の化合物（Ｉ）：
式中、
Ｘａ、ＸｂおよびＸｃは独立して、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳから選択され；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
環は４〜１２員環であり、ある態様において、４〜１２員環は芳香環またはヘテロ芳香環であり；
各Ｙは独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステルおよびシアノから選択され；
ｃは、０〜５の範囲の整数であり；および、
Ｂ環は、下記（ｈ１〜ｈ３０）から選択される複素環であり：
この式中、Ｒ１１〜Ｒ１６は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；Ｒ１７は、ヒドロキシル、アルキル、アミノ、およびアルキルアミノから選択され；およびＲ１１〜Ｒ１６の少なくとも１つは、Ｘｃとの連結基である；
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アミド、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有することができる。
いくつかの態様において、リガンドは、以下の化合物（ＩＩ）：
式中、
ｎは、０〜８の範囲の整数であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステルおよびシアノから選択され；
Ｘａは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳであり；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
Ａは５〜１２員環であり、ある態様において、５〜１２員環は芳香環またはヘテロ芳香環であり；
各Ｙは独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステルおよびシアノから選択され；および、
ｃは、０〜５の整数である；
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アミド、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有することができる。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＩＩＩ）：
式中、
ｎは、０〜７の範囲の整数であり；
Ｚは炭素であるか、および／または５個のＺのうちの３個までのＺは窒素であってもよく；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
Ｘａは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳであり；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
各Ｙは独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステルおよびシアノから選択され；および
ｃは、０〜５の整数である；
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アミド、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、化合物（ＩＩＩ）のリガンドは、ｎが３であり；およびＸがＯである、の構造である。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＩＶ）：
式中、
ｎは、１〜４の範囲の整数であり；
Ｒ１は、１〜４個の炭素原子を有する短鎖アルキルであり；
Ｒ２は、水素であり；
Ｒ３は、１〜４個の炭素原子を有する短鎖アルキルであり；
Ｘａは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳであり；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
各Ｙは独立して、水素、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシル、複素環式基、アルコキシカルボニルスルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステルおよび置換アルコキシカルボニルから選択され；および
ｃは、２である；
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、化合物（ＩＶ）のリガンドは、Ｒ１はメチルであり、Ｒ３はメチルであり；ＸａはＯであり；およびＹはフルオロまたはカルボキシルである、の構造である。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（Ｖ）：
式中、
ｎは、１〜８の整数であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロ、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
Ｘａは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳであり；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
Ｒａは、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＲ７Ｒ８、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＯＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ９）ＣＯＯＨ、ＣＦ３、水素、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、カルボキシル、複素環式基、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステル、アルコキシカルボニル、または置換アルコキシカルボニルであり；
Ｒｂは、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＲ７Ｒ８、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＯＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ９）ＣＯＯＨ、ＣＦ３、水素、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、カルボキシル、複素環式基、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステル、アルコキシカルボニル、または置換アルコキシカルボニルであり；
Ｒ６は、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ７およびＲ８は、各々独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールであり；および、
Ｒ９は、天然に存在するα−アミノカルボン酸の側鎖である；
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アミド、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、化合物（Ｖ）のリガンドは、Ｒｂがブロモ、クロロ、およびフルオロから選択される構造である。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＶＩ）：
式中、
ｎは、３であり；
Ｒ１は、１〜４個の炭素原子を有する短鎖アルキルであり；
Ｒ２は、水素であり；
Ｒ３は、１〜４個の炭素原子を有する短鎖アルキルであり；
Ｘａは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳであり；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
Ｒａは、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＲ７Ｒ８、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＯＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ９）ＣＯＯＨ、水素、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、複素環式基、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステル、または置換アルコキシカルボニルであり；
Ｒｂは、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＲ７Ｒ８、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＯＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ９）ＣＯＯＨ、ハロゲンまたは複素環式基であり；
Ｒ６は、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ７およびＲ８は、各々独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールであり；および
Ｒ９は、天然に存在するα−アミノカルボン酸の側鎖である；
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＶＩＩｃ）：
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＶＩＩａ）：
式中、
Ｒａは、ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨ（ＯＨ）、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＨＲ６であり；
Ｒ６は、１〜３個の炭素原子の直鎖または分枝アルキルである；
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＶＩＩｂ）：
式中、
Ｒａは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨ（ＯＨ）、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＨＲ６であり；
Ｒ６は、１〜３個の炭素原子の直鎖または分枝アルキルである；
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有する。
いくつかの態様において、リガンドは、以下からなる群：
および、その薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物またはプロドラッグから選択される。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＶＩＩＩｃ）：
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有し；および、
リンカーは、Ｃ１４のカルボキシル基に対してオルト位のＣ１５のリガンドに結合する。
いくつかの態様において、リガンドは、化合物（ＶＩＩＩｃ）：
またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、の構造を有し；および、
リンカーは、Ｃ１４のカルボキシ炭素に対してメタ位のＣ１６のリガンドに結合する。
使用および投与の方法
本明細書で提供される送達システムは、対象における疾患の処置において、または疾患の１または２以上の症状の改善において、治療的および／または予防的効果を提供することができる。用語「対象」および「患者」は互換的に使用され、哺乳類などの動物を指し、これには、限定されないが例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよびマウスなどの非霊長類；および、例えばサルまたはヒトなどの霊長類を含む。
活性剤のin vivo半減期を延長する方法が提供され、該方法は、上で教示された送達システムのいずれかを、活性剤に共有結合させることを含む。
活性剤を対象に投与する方法が提供され、該方法は、上で教示された送達システムのいずれかを活性剤に共有結合させて、コンジュゲート活性剤を生成すること；および、コンジュゲート活性剤を対象に投与すること、を含む。
対象における活性剤の免疫原性を低下させる方法が提供され、該方法は、（ｉ）対象にとって内因性で約３０ｋＤａ〜約８０ｋＤａの範囲の分子量の血漿タンパク質に対する高い選択性、（ｉｉ）該血漿タンパク質に対する少なくとも１０−６Ｍの高い結合親和性Ｋｄ、および（ｉｉｉ）約２００Ｄａ〜約２０００Ｄａの範囲の分子量、を有するリガンド；ならびに、長さが約１０Å〜約５０Åまたは１０原子〜５０原子の範囲のリンカー；を有する、送達システムを得ることを含む。該方法はまた、送達システムを活性剤に共有結合させて、コンジュゲート活性剤を生成すること；および、コンジュゲート活性剤を対象に投与すること；を含み、ここで、血漿タンパク質は、投与後の対象において、活性剤を抗体生成から遮蔽する。
いくつかの態様において、送達システムは、上で教示された送達システムのいずれかであることができる。いくつかの態様において、血漿タンパク質は、血清アルブミン、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質、α−１グロブリン、α−２グロブリン、βグロブリン、およびγグロブリン、またはそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。いくつかの態様において、血漿タンパク質はＨＳＡである。いくつかの態様において、血漿タンパク質はＴＴＲである。
さらに、活性剤は、本明細書に教示される送達システムから利益を得ることができる、当業者に知られている任意の活性剤であり得ることが、理解されるべきである。いくつかの態様において、活性剤は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ウイルス様粒子、小分子、オリゴ糖、造影剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される構造を含む。
製剤
本明細書に開示される送達システムは、これを適切な薬学的に許容し得る担体、希釈剤、賦形剤、および／またはアジュバントと組み合わせることによって、医薬組成物に製剤化することができる。製剤は、当業者に知られている任意の経路によって投与することができ、これには、限定されないが、経口、非経口、経皮、髄腔内、眼、局所、肺、経鼻、直腸またはデポー投与が含まれる。
送達システムは、例えば、適切な医薬調製物に製剤化することができ、例えば、経口投与のための液剤、懸濁剤、錠剤、分散性錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤またはエリキシル剤など、または非経口投与のための滅菌液剤または懸濁剤、ならびに経皮パッチ製剤および乾燥粉末吸入器などである。一般に上記の化合物は、当該分野で周知の技術および手順を用いて、医薬組成物に製剤化することができる（例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition 1985, 126を参照）。いくつかの態様において、化合物は、対象への経口投与のための適切な医薬製剤に製剤化される。
いくつかの態様において、送達システムは、適切な薬学的担体と混合される。さらに送達システムの任意の成分は、上記のように、製剤化の前に対応する塩、エステル、エノールエーテルまたはエステル、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒和物、水和物またはプロドラッグとして、誘導体化することができる。送達システムと共に投与されるコンジュゲート活性剤の濃度は、処置される疾患または障害の１または２以上の症状を処置、予防、または改善する有効量で送達される。
生物活性剤としては、限定されないが、小分子、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質が挙げられる。生物活性剤としては、限定されないが、抗増殖剤、抗腫瘍薬、抗有糸分裂剤、抗炎症剤、抗血小板、抗凝固剤、抗フィブリン、抗トロンビン、抗生物質、抗アレルギー剤、抗酸化剤、ならびにそれらの任意のプロドラッグ、コドラッグ、代謝産物、類似体、ホモログ、同族体、誘導体、塩および組み合わせを挙げることができる。当業者は、生物活性剤のグループ、サブグループ、および個々の生物活性剤のいくつかは、本発明のいくつかの態様において使用できない可能性があることを認識すべきであることが、理解される。
抗増殖剤としては、例えば、アクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＩＶ、アクチノマイシンＩ１、アクチノマイシンＸ１、アクチノマイシンＣ１、およびダクチノマイシン（Cosmegen.RTM., Merck & Co., Inc.）が挙げられる。抗腫瘍薬または抗有糸分裂剤としては、例えば、パクリタキセル（TAXOL, Bristol-Myers Squibb Co.）、ドセタキセル（TAXOTERE, Aventis S.A.）、メトトレキセート、イリノテカン、ＳＮ−３８、アザチオプリン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、フルオロウラシル、ドキソルビシン塩酸塩（ADRIAMYCIN, Pfizer, Inc.）、およびマイトマイシン（MUTAMYCIN, Bristol-Myers Squibb Co.）、ならびにそれらの任意のプロドラッグ、コドラッグ、代謝産物、類似体、ホモログ、同族体、誘導体、塩および組み合わせが挙げられる。抗血小板、抗凝固剤、抗フィブリン、および抗トロンビンとしては、例えば、ヘパリンナトリウム、低分子量ヘパリン、ヘパリノイド、ヒルジン、アルガトロバン、フォルスコリン、バピプロスト、プロスタサイクリンおよびプロスタサイクリン類似体、デキストラン、Ｄ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ａｒｇ−クロロメチルケトン（合成抗トロンビン）、ジピリダモール、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ血小板膜受容体アンタゴニスト抗体、組換えヒルジン、およびトロンビン阻害剤（ANGIOMAX, Biogen, Inc.）、ならびにそれらの任意のプロドラッグ、コドラッグ、代謝産物、類似体、ホモログ、同族体、誘導体、塩および組み合わせが挙げられる。細胞増殖抑制剤または抗増殖剤としては、例えば、アンギオペプチン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、例えばカプトリル（CAPOTEN and CAPOZIDE, Bristol-Myers Squibb Co.）、シラザプリルまたはリシノプリル（PRINVIL and PRINZIDE, Merck & Co., Inc.）；ニフェジピンなどのカルシウムチャネル遮断薬；コルヒチン；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）アンタゴニスト、魚油（オメガ３−脂肪酸）；ヒスタミンアンタゴニスト；ロバスタチン（MEVACOR, Merck & Co., Inc.）；モノクローナル抗体、例えば限定されないが、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体に特異的な抗体；ニトロプルシド；ホスホジエステラーゼ阻害剤；プロスタグランジン阻害剤；スラミン；セロトニン遮断薬；ステロイド；チオプロテアーゼ阻害剤；ＰＤＧＦアンタゴニスト、例えば限定されないが、トリアゾロピリミジン；および一酸化窒素、ならびにそれらの任意のプロドラッグ、コドラッグ、代謝産物、類似体、ホモログ、同族体、誘導体、塩および組み合わせが挙げられる。抗アレルギー剤としては、限定されないが、ペミロラストカリウム（ALAMAST, Santen, Inc.）ならびにそれらの任意のプロドラッグ、コドラッグ、代謝産物、類似体、ホモログ、同族体、誘導体、塩および組み合わせが挙げられる。
抗体療法は、本明細書に教示の方法と組み合わせて投与される場合に有用となり得る、さらなる生物活性剤を提供する。例えばAVASTATINは、ＶＥＧＦに対するヒトモノクローナル抗体であり、結腸直腸癌において有益な結果をもたらし、イリノテカン、５−フルオロウラシル、およびロイコボリンの標準的なSaltzレジメンと組み合わせて使用すると、生存時間を３０％以上増加させる。当業者は、いくつかのモノクローナル抗体が有用であることを理解するであろう；以下にさらなる例を提供する。
表
生物活性剤は、本明細書に教示の組成物および方法を用いて、単独で、または他の生物活性剤と組み合わせて与えることができることが、理解されるべきである。例えば化学療法薬は、併用化学療法レジメンとして組み合わせて投与される場合、時には最も効果的である。併用化学療法の根拠は、異なる作用機序で作用する薬物を使用することであり、それにより耐性癌細胞が発症する可能性が低減される。異なる効果を有する薬物が組み合わされる場合、各薬物はその最適な用量で、時には耐え難い副作用を伴わずに、時にはこれを軽減して、用いることができる。
活性剤は、例えば、薬学的に許容し得る担体中、送達システムにコンジュゲートされて、処置される患者への望ましくない副作用なしに、治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で、含めることができる。治療的に有効な濃度は、記載されたin vitroおよびin vivo系で化合物を試験し、次いでヒトのための投与量についてそれから外挿することによって、経験的に決定される。
送達システムの目的、例えば活性薬剤の半減期の延長と整合して、投与される活性剤の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化および排泄の速度、化合物の物理化学的特性、投薬スケジュール、投与量、ならびに当業者に知られている他の因子に依存する。
本明細書で提供される送達システムは、当業者に知られている任意の投与様式を用いて、対象に投与することができる。例えば、いくつかの態様において、局所投与が使用され、いくつかの態様において、全身投与が使用される。いくつかの態様において、全身投与と局所投与の組み合わせが使用される。当業者は、選択された治療プログラム、投与される薬剤、対象の状態および所望の効果が、使用される投与スケジュールおよびプログラムに影響し得ることを、理解するであろう。
当業者は、投与される薬剤の量が、例えば、疾患の種類、対象の年齢、性別、および体重、ならびに投与方法などの因子によって、変化し得ることを理解する。例えば、局所投与と全身投与では、実質的に異なる量を有効とすることができる。投与レジメンはまた、治療応答を最適化するように調節されてもよい。いくつかの態様において、単一のボーラスを投与してもよく；いくつかの分割用量を経時的に投与してもよい；用量は比例的に減少または増加してもよく；またはそれらの任意の組合せであり、これは、治療状況および当業者に知られている因子の緊急性によって指示される。投与量の値は、緩和すべき症状の重症度によって変化し得ることに留意されたい。投与レジメンは、個々の必要性および、組成物の投与を実施するまたは監督する人の専門的判断にしたがって、経時的に調整することができ、本明細書に記載の投与量範囲は単なる例示であり、医療従事者が選択できる用量範囲を限定するものではない。
用語「投与」または「投与する」は、組成物を、in vivoまたはex vivoのいずれかで対象の細胞または組織に取り込んで、疾患の症状を診断、予防、処置、または改善するための方法を指す。一例において、化合物は対象に、in vivoで非経口的に投与することができる。別の例において、化合物は対象に、組成物の有用性および有効性を決定するためのアッセイを含むがこれに限定されない目的のために、化合物を対象からの細胞組織とex vivoで混ぜ合わせることによって、投与することができる。化合物が１または２種以上の活性剤と組み合わせて対象に取り込まれる場合、用語「投与」または「投与する」は、化合物と、例えば上記の任意の薬剤などの他の薬剤との、順次のまたは同時の取り込みを含むことができる。本発明の医薬組成物は、意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、限定されないが、静脈内、皮内、筋肉内、および皮下注射などの非経口投与；経口；吸入；鼻腔内；経皮；経粘膜；および直腸投与が挙げられる。
本発明の化合物の「有効量」は、治療有効量または予防有効量を記述するために使用することができる。有効量はまた、疾患の症状を緩和する量であることができる。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指し、また、研究者、獣医師、医師または他の臨床家によって求められて所望の効果をもたらす処置計画の一部であってもよい、任意の生物学的または医学的応答を、組織、系または対象において誘発する、活性化合物、プロドラッグまたは医薬品の量を指してもよい。いくつかの態様において、治療有効量を、障害の１または２以上の症状の改善、障害の進行の予防、または障害の退行をもたらすのに十分な量で、投与する必要があり得る。いくつかの態様において、例えば、治療有効量は、組成物の所望の作用の、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％の、測定可能な応答を提供する薬剤の量を指すことができる。用語「処置する」は、本明細書で教示される１または２以上の治療剤または予防剤を投与することを指す。
「予防有効量」は、血管新生、腫瘍増殖または腫瘍浸潤の予防、阻害または逆転などの、所望の予防結果を達成するために必要な投薬および時間に有効である量を指す。典型的には、予防的用量は、対象に対し、疾患の発症の前に、または疾患の発症の初期段階において、疾患もしくは疾患の症状の発症を予防または阻害するために、使用する。予防有効量は、治療有効量よりも少ないか、より多いか、または等しくてもよい。
投与は、局所的または全身的であることができる。いくつかの態様において、投与は経口であることができる。他の態様において、投与は皮下注射であることができる。他の態様において、投与は、滅菌等張水性緩衝液を用いた、静脈内注射であることができる。別の態様において、投与は、可溶化剤およびリグノカインなどの局所麻酔剤を含むことができ、注射部位における不快感を緩和する。他の態様において、投与は、例えば投与の容易さおよび均一性を得るために、非経口であってもよい。
化合物は、投薬単位で投与することができる。用語「投薬単位」は、単一投薬量として対象に投与することができる、化合物の個別の所定量を指す。所望の治療効果を生じさせるために所定量の活性化合物を選択して、薬学的に許容し得る担体と共に、投与することができる。各単位投薬量における所定の量は、限定されないが、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、および、（ｂ）かかる投薬単位を作製し投与する技術分野に固有の制限、を含む因子に依存し得る。
「薬学的に許容し得る担体」は、組成物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルである。担体が薬学的に許容し得るとされるのは、州または連邦の規制機関またはU.S. Pharmacopeial Conventionのリスト、または対象への使用について一般に認知された源による、承認の後である。
医薬担体には、任意のおよび全ての生理学的に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬担体の例としては、限定されないが、水などの滅菌液体、リン脂質および糖脂質などの油および脂質が含まれる。これらの滅菌液体には、限定されないが、石油、動物、植物または合成由来のものが含まれ、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などである。水は、静脈内投与のための好ましい担体であることができる。生理食塩水、デキストロース水溶液およびグリセロール溶液も、特に注射液用の、液体担体であることができる。
好適な医薬賦形剤としては、限定されないが、デンプン、糖類、不活性ポリマー、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、少量の湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはそれらの組み合わせを含有してもよい。組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態を取ることができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。Martin、E.W. Remington's Pharmaceutical Sciencesを参照のこと。補充活性化合物もまた、組成物中に組み込むことができる。
いくつかの態様において、担体は、非経口投与に適している。他の態様において、担体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下または経口投与に適している。他の態様において、薬学的に許容し得る担体は、薬学的に許容し得る塩を含んでよい。
非経口投与のための医薬製剤は、リポソームを含んでよい。リポソームおよびエマルジョンは、疎水性薬物に特に有用な、送達ビヒクルまたは担体である。治療試薬の生物学的安定性に依存して、タンパク質安定化のためのさらなる戦略を用いてもよい。さらに、例えば標的特異的抗体でコーティングされたリポソームなどの、標的薬物送達システムで、薬物を投与してもよい。リポソームは、例えば、標的タンパク質に結合するように設計して、標的タンパク質を発現する細胞によって選択的に取り込まれるようにすることができる。
治療組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で滅菌されて安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の秩序構造物（ordered structure）として、製剤化することができる。いくつかの態様において、担体は、溶媒または分散媒であることができ、限定はされないが例えば、水；エタノール；ポリオール、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど；およびそれらの組み合わせである。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液中に必要な粒度を維持すること、界面活性剤を使用することなど、様々な方法で維持することができる。
いくつかの態様において等張剤を使用することができ、例えば、糖類；ポリアルコール類であって、限定なく、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、およびそれらの組み合わせを含むもの；および塩化ナトリウムである。持続吸収特性は、例えばモノステアリン酸塩、ゼラチン、および投与放出ポリマーなどの吸収を遅延させる薬剤を含むことにより、組成物に導入することができる。担体は、活性化合物を急速な放出から保護するために使用することができ、かかる担体には、限定されないが、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムにおける、制御放出製剤が含まれる。生分解性および生体適合性ポリマーを使用することができ、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）などである。かかる製剤は、一般に、当業者に知られている方法を用いて調製することができる。
化合物は、例えば、注射用の油性懸濁剤などの懸濁剤として投与してもよい。親油性溶媒またはビヒクルとしては、限定されないが、ゴマ油などの脂肪油；オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル；およびリポソームが挙げられる。注射に使用することができる懸濁剤はまた、懸濁剤の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどを含有してもよい。任意に懸濁剤は、化合物の溶解度を増加させ、高濃度の溶液の調製を可能にする、安定剤または薬剤を含有してもよい。
一態様において、滅菌の注射可能な溶液の調製を、有効量の活性化合物を溶媒中に、上記の所望の追加成分の任意の１つまたは任意の組み合わせと共に組み込み、濾過し、次いで溶液を滅菌することによって、行うことができる。別の態様において、分散液は、活性化合物を、分散媒および上記の所望の追加成分の任意の１つまたは任意の組み合わせを含有する、滅菌ビヒクルに組み込むことによって、調製することができる。滅菌粉末は、滅菌の注射用溶液中での使用のために、真空乾燥、凍結乾燥、またはそれらの組み合わせによって調製されて、活性成分および任意の所望の追加成分から構成され得る粉末を生じる。さらに、追加の成分は、別々に調製された滅菌の濾過溶液からのものであってもよい。別の態様において、抽出物は、抽出物の溶解性を高める１または２以上のさらなる追加の化合物と組み合わせて、調製されてもよい。
いくつかの態様において、治療上有効な投与量は、約０．１ｎｇ／ｍｌから約５０〜１００μｇ／ｍｌの有効成分の血清濃度を生成すべきである。別の態様において、医薬組成物は、１日当たり体重１キログラムあたり、約０．００１ｍｇ〜約２０００ｍｇの化合物の投与量を提供すべきである。医薬投薬単位形態は、投薬単位形態当たり、活性成分または必須成分の組合せとして、約０．０１ｍｇ、０．１ｍｇまたは１ｍｇから、約５００ｍｇ、１０００ｍｇまたは２０００ｍｇまで、および一態様において、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇを提供するように、調製される。
いくつかの態様において、組成物の治療有効量または予防有効量の濃度範囲は、約０．００１ｎＭ〜約０．１０Ｍ；約０．００１ｎＭ〜約０．５Ｍ；約０．０１ｎＭ〜約１５０ｎＭ；約０．０１ｎＭ〜約５００μＭ；約０．０１ｎＭ〜約１０００ｎＭ、０．００１μＭ〜約０．１０Ｍ、約０．００１μＭ〜約０．５Ｍ；約０．０１μＭ〜約１５０μＭ；約０．０１μＭ〜約５００μＭ；約０．０１μＭ〜約１０００ｎＭ、またはその中の任意の範囲である。いくつかの態様において、組成物は、以下の範囲の量で投与されてよい：約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇの範囲；約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇ；約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ；約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ；約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ；約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ；約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約１２０ｍｇ／ｋｇ；約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、またはその中の任意の範囲；ここではヒト対象は、平均約７０ｋｇと想定される。
いくつかの態様において、化合物は、適切な噴射剤を含んでよいエアロゾルスプレーまたは噴霧器による吸入によって、投与することができ、該噴霧剤としては例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはそれらの組み合わせである。一例では、加圧エアロゾル用の投薬単位は、計量バルブを介して送達されてもよい。別の態様において、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは例えば吸入器で使用されてもよく、これは、化合物とデンプンまたはラクトースなどの適切な粉末基剤との、粉末化混合物を含有するように製剤化することができる。
本明細書における教示は、１または２以上の薬剤の投与のための、持続放出製剤を包含する。いくつかの態様において、持続放出製剤は、かかる薬剤の、対象への投与の投薬量および／または頻度を低減することができる。
組成物は、医薬製剤として注射により投与することができる。いくつかの態様において、製剤は、抽出物を水性注射用賦形剤と組み合わせて含むことができる。適切な水性注射用賦形剤の例は当業者に周知であり、それらおよび製剤を製剤化する方法は、Alfonso AR: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton Pa., 1985などの標準的文献にも見出すことができる。好適な水性注射用賦形剤としては、水、食塩水溶液、デキストロース水溶液などが挙げられ、任意に、酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物のための溶解促進剤を、例えばマンニトールまたは他の糖の溶液、グリシンまたは他のアミノ酸の溶液などを含有する。
典型的には、本明細書に教示の組成物は、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内への注射によって、投与することができる。局所投与は、いくつかの態様において、例えば固形腫瘍などの処置すべき組織の領域への、薬剤の直接注入を含むことができる。いくつかの態様において静脈内投与が使用され、これは、数分〜１時間以上、例えば約１５分などの期間にわたる、連続的静脈内注入であることができる。投与される量は、製剤の種類、単位投薬量のサイズ、賦形剤の種類、および当業者に周知の他の因子に依存して、広く変わり得る。製剤は、例えば、約０．０００１％〜約１０％（ｗ／ｗ）、約０．０１％〜約１％、約０．１％〜約０．８％、またはその中の任意の範囲を含むことができ、残部は１または２種以上の賦形剤を含む。
いくつかの態様において、組成物は、処置される疾患状態のための少なくとも１つの他の治療剤、特に例えば化学療法剤などの癌を処置することができる別の薬剤と共に、投与することができる。必要とされる薬剤の量は低減または大幅に低減することができ、必要とされる１または２以上の薬剤の量は、対象から重要な応答が観察される程度まで、低減される。重要な応答としては、限定されないが、吐き気の低下または消失、耐性の目に見える増加、処置に対するより速い応答、処置に対するより選択的な応答、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
方法はさらに、有効量の抗増殖剤、有効量の放射線療法、外科療法、またはそれらの組み合わせの投与を、含むことができる。この教示はまた、癌を処置する方法にも関する。いくつかの態様において、方法は、癌の処置を必要とする対象に薬剤を投与することを含み、この薬剤の用量は、対象において実質的に高用量の薬剤を投与する場合に生じるであろう免疫抑制を、低減または排除するように選択される；方法は、放射線療法を薬剤と組み合わせて投与することを含み、免疫抑制の低減または排除は、対象において、実質的により高い薬剤の用量と組み合わせて投与された場合に観察される放射線療法の有効性と比較して、放射線療法の有効性を高める。いくつかの態様において、薬剤は、１または２以上の化学療法剤を本明細書で提供される薬剤と組み合わせて含む。これらの態様において、薬剤は、ダカルバジン、パクリタキセル、ドキソルビシン、またはそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。
いくつかの態様において、有効量は、例えば、平均体重のヒトに対して、約１ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日、約１０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、約５０ｍｇ／日〜約２５０ｍｇ／日、またはその中の任意の範囲であることができる。固形腫瘍を処置するためには、同様の量が治療的に有効であろう。当業者は、過度の実験をすることなく、その技術および本開示を考慮し、所与の疾患に対する本発明の組成物の治療有効量を決定することができるであろう。
いくつかの態様において、Ｇ−ＣＳＦが、本明細書に教示された組成物と組み合わせて、当業者により有効であることが知られている任意の量、時間、および投与方法を用いて、投与される。Ｇ−ＣＳＦはNEUPOGENであることができ、例えば、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ、またはその中の任意の範囲で、投与される。
いくつかの態様において、放射線療法は、例えば、約２０Ｇｙ〜約１００Ｇｙの範囲の、単一局所化高線量で投与することができる。いくつかの態様において、放射線療法は、約２０Ｇｙ〜約１００Ｇｙの範囲の総用量で、１週間の時間枠内に約２用量〜約５用量を含む、投薬の改変低分画投与レジメンを使用して、投与することができる。いくつかの態様において、放射線療法は、約２０Ｇｙ〜約１００Ｇｙの範囲の総用量で、約２日〜約３日の範囲の時間枠内に２用量〜３用量を含む投薬の改変低分画レジメンを使用して、投与することができる。放射線療法はまた、約４５Ｇｙ〜約６０Ｇｙの範囲の総用量で、３日の時間枠内に毎日約１５Ｇｙ〜約２０Ｇｙの範囲の単回用量を投与することを含む投薬の改変低分画レジメンを使用して、投与することもできる。
本明細書に教示される組成物および療法は、組み合わせて投与することができる。例えば組み合わせは、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、２週間、３週間、４週間、６週間、３カ月、６カ月、１年、それらの任意の組み合わせの間、または当業者が必要と考える任意の期間、投与することができる。薬剤は、対象に、同時に、順番に、または周期的に、投与することができる。周期的療法は、第１の薬剤を所定の時間投与すること、第２の薬剤または治療を第２の所定の時間投与すること、および、例えばこの処置の有効性を高めるためなどの任意の所望の目的のために、このサイクルを繰り返すことを含む。薬剤はまた、同時に投与することもできる。用語「同時に」とは、薬剤を正確に同時に投与することには限定されず、薬剤を順番に時間間隔で投与し、薬剤が一緒に作用して追加の利益をもたらすことができることを意味する。各薬剤は、１または２種以上の薬剤を投与する任意の適切な手段を用いて、別々に、または任意の適切な形態で一緒に、投与することができる。
製造物品
本発明は、仕上げられ、包装され、ラベル付けされた医薬製品を包含する、製造物品を提供する。製造物品は、適切な器または容器、例えばガラスバイアルまたは密封された他の容器中の、適切な単位剤形を含む。非経口投与に適した剤形の場合、有効成分、例えば本明細書に教示された抽出物を含む１または２以上の薬剤は、滅菌された無微粒子溶液としての投与に適している。換言すれば、本発明は非経口溶液および凍結乾燥粉末の両方を包含し、それぞれは滅菌され、後者は注射前に再構成するのに適している。代替的に、単位剤形は、経口、経皮、局所または粘膜送達に適した固体であってもよい。
いくつかの態様において、単位剤形は、静脈内、筋肉内、局所または皮下送達に適している。したがって本発明は、好ましくは滅菌され、各送達経路に適した溶剤を包含する。送達される薬剤の濃度および量は、本明細書に記載されるように、含有される。
任意の医薬品と同様に、包装材料および容器は、貯蔵および輸送中の製品の安定性を保護するように設計されている。さらに、製造物品は、例えば、医師、技術者または患者などの使用者に対して、問題の疾患の予防的、治療的、または改善的な処置として、組成物を如何にして適切に投与するかについて、アドバイスすることができる使用説明書または他の情報資料を含むことができる。いくつかの態様において、指示書は、実際の用量およびモニタリング手順を含むがこれに限定されない投薬レジメンを、指示または示唆することができる。
他の態様において、指示書は、組成物の投与が、例えばアナフィラキシーなどのアレルギー反応を含むがこれに限定されない有害反応をもたらしうることを示す、情報資料を含むことができる。情報資料は、アレルギー反応が軽度の掻痒性発疹のみを示すか、または重症であり、紅斑、脈管炎、アナフィラキシー、スティーブン・ジョンソン症候群などを含み得ることを、示すことができる。情報資料は、アナフィラキシーが致死的であり、任意の外来タンパク質が体内に導入された場合に起こる可能性があることを、示すべきである。情報資料は、これらのアレルギー反応が蕁麻疹または発疹として現れ、致死的全身反応に発展し得ること、および、例えば１０分以内などの曝露直後に起こり得ることを示すべきである。情報資料はさらに、アレルギー反応が対象に、感覚異常、低血圧、喉頭浮腫、精神状態変化、顔面または咽頭の血管浮腫、気道閉塞、気管支痙攣、蕁麻疹およびかゆみ、血清病、関節炎、アレルギー性腎炎、糸球体腎炎、一時的な関節炎、好酸球増加症、またはそれらの組み合わせを引き起こし得ることを示すことができる。
いくつかの態様において、製造物品は、１または２以上の包装材料、例えば、ボックス、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、注入器、静脈内（ＩＶ）バッグ、エンベロープなど；および包装材料内に、本明細書に教示の抽出物を含む薬剤の少なくとも１つの単位剤形を含むことができる。他の態様において、製造物品はまた、組成物を、当該疾患の診断、予防、治療、または緩和処置として使用するための、指示書を含んでもよい。
他の態様において、製造物品は、以下を含むことができる：１または２以上の包装材料、例えば、ボックス、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、注入器、静脈内（ＩＶ）バッグ、エンベロープなど；および、包装材料内に、本明細書に教示の抽出物を含む薬剤の少なくとも１つの単位剤形を含む、第１の組成物と共に、第２の薬剤、例えばグリコサミノグリカン、リン脂質、ポリ（アルキレングリコール）、本明細書に教示の任意の他の生物活性剤、または任意のプロドラッグ、コドラッグ、代謝産物、類似体、ホモログ、同族体、誘導体、塩およびその組み合わせ、を含む第２の組成物。他の態様において、製造物品はまた、組成物を、当該疾患の診断、予防、治療、または緩和処置として使用するための、指示書を含んでもよい。
以下の例は、当業者に、本発明をどのように製造し使用するかについての完全な開示および説明を提供するために提示されており、これは、本発明者らが本発明と考えるものの範囲を限定することを意図せず、また以下の実験が、実施されたすべての実験または唯一の実験であることを示すことも意図しない。
例１．ＴＴＲへの結合が、ＡＧ１０（ＶＩＩｃ）のin vitroおよびin vivo半減期を延長する
図５Ａおよび５Ｂは、いくつかの態様において、（ｉ）ＡＧ１０のｈＴＴＲとのインキュベーションが、ヒト肝臓ミクロソームによる代謝に対する安定性を増強し、および（ｉｉ）ＡＧ１０の、ラットへの増加用量の静脈内投与（５、２０、および５０ｍｇ／ｋｇ）が、５分後にラット血漿中のＡＧ１０濃度の増加をもたらすことを示す。
Ａ．in vitro実験：我々は、ｈＴＴＲの存在下で、ＡＧ１０のin vitroミクロソーム半減期が有意に増強されることを見出した。図５Ａに示すように、２時間後に残ったＡＧ１０の％は以下の通りであった：ＴＴＲでプレインキュベートしたＡＧ１０は９６％であった；ＡＧ１０単独は７９％であり、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でプレインキュベートしたＡＧ１０は７７％であった。
Ｂ．in vivo実験：ＡＧ１０の、ラットへの増加用量の静脈内投与（５、２０、および５０ｍｇ／ｋｇ）は、ＡＧ１０の血漿濃度の上昇をもたらした（５分での濃度はそれぞれ、４７±６μＭ、２００±３０μＭ、および６２０±８０μＭ）。図５Ｂに示すように、１０μＭを超える濃度においてＡＧ１０はｒＴＴＲ結合部位を飽和させ、残りの遊離ＡＧ１０が組織への分布に利用可能である。これは、ＡＧ１０総血漿濃度の、初期の急速な低下によって説明される（初期半減期＝５〜２０分）。ＡＧ１０の濃度が約１０μＭ（血清ｒＴＴＲ濃度と類似）に達すると、ＡＧ１０の排除が大幅に低減した。終末排除段階（二相性プロファイルの第２相）はより浅い傾きを有し、したがってより長い排除半減期を有する（終末相半減期＝５５０分）。ＡＧ１０の二相性薬物動態プロファイルは、ＡＧ１０のＴＴＲに対する高い選択性（〜１：１結合）に関する知識と共に、標的媒介性の薬物動態（ＴＭＤＤ）の特徴である。これらの実験は、ＡＧ１０の延長されたin vivo半減期が、主にラット血漿におけるｒＴＴＲへのその結合に起因することを示している。図５Ｂに示すように、ＡＧ１０の、ラットへの増加用量の静脈内投与（５、２０、および５０ｍｇ／ｋｇ）は、５分後にラット血漿中のＡＧ１０の濃度を増加させた。興味深いことに、２４時間後のＡＧ１０の濃度は、すべての用量について同様であった（約５μＭ）。これらの２つの実験は、ＡＧ１０の延長された半減期が、ラット血漿におけるｒＴＴＲへのその結合に起因することを示す（ラットにおけるＴＴＲの血漿濃度は、ヒトに類似している（約５μＭ））。
例２．（ＡＧ１０）−（リンカー）（「半減期延長用ＴＴＲリガンド「ＴＬＨＥ」とも呼ばれる）の開発
ＡＧ１０（ＶＩＩｃ）のフッ素原子は、ＴＴＲと大きく相互作用しない。したがって我々は、ＡＧ１０からフッ素原子を除去して、化合物ＶＩＩＩｃを得た。化合物ＶＩＩＩｃは、非常に良好な、緩衝液中のｈＴＴＲに対する結合親和性（Ｋｄ＝２２ｎＭ）およびヒト血清中のｈＴＴＲに対する選択性（ｈＴＴＲ結合９５±０．２％）を示した。ＡＧ１０−ｈＴＴＲの結晶構造に基づき（図２Ａ）、この目的のために潜在的に利用され得る、フェニル環上の２つの位置（すなわち、カルボキシル基に対してオルトおよびメタ位、図２Ｂ）が存在する。これらの２つの位置は、ｈＴＴＲ Ｔ４ポケット内のいかなる重要な相互作用にも関与していない。重要なことに、２つの位置は溶媒の方を向いているので、リンカーが付着すると、これは、Ｔ４ポケットの周辺の残基との大きな立体的な衝突なしに、Ｔ４結合ポケットの外側に突き出る。本発明者らはリンカー修飾ＡＧ１０類似体を開発し、これを、半減期延長用ＴＴＲリガンド、ＴＬＨＥと呼ぶ（図３）。
例３．血清中の（ＡＧ１０）−（リンカー）−（活性剤）コンジュゲートのＴＴＲへの最大結合親和性および選択性を保持する、最適なリンカー長を決定する。
リンカーの長さもまた、非常に重要である。リンカーが短すぎる場合、ペプチドは、コンジュゲートのＡＧ１０部分の、ｈＴＴＲへの結合を、立体的に阻害するであろう。我々のin silicoモデリング研究は、約２０Åのリンカー長（ＡＧ１０のフェニル環炭素から、結合ポケットの最も外側の残基までの距離）が、Ｔ４結合部位をクリアし、コンジュゲートのｈＴＴＲへの結合に影響を及ぼすことなく、リンカーの末端を所望のペプチドで修飾することを可能とするのに十分であることを示す。我々はまた、モデリングによって予測される２０Åの長さよりも、短い（１０〜１８Å）および長い（２２Åおよび３０Å）リンカーも合成した。
図６Ａ〜６Ｄは、いくつかの態様における、化合物ＶＩＩＩｃの化学構造および、設計された半減期延長用ｈＴＴＲリガンド（ＴＬＨＥ）：ＴＬＨＥ１、ＴＬＨＥ２およびＴＬＨＥ３を示す。図６Ａは、化合物ＶＩＩＩｃを示す。図６Ｂは、メタ位に結合した、アルキンで官能化された短いリンカーを示す（ＴＬＨＥ１）。ＴＬＨＥ１上のリンカーの末端は、「クリック」反応によってアジド修飾ペプチドに結合されるアルキン基で官能化することができる。図６Ｃは、ＶＩＩＩｃのオルト位に結合した、アルキンで官能化された短いリンカーを示す（ＴＬＨＥ２）。図６Ｄは、約２０Åのリンカー長さを示し、これは、ｈＴＴＲ Ｔ４結合部位からクリアされて、潜在的にペプチドで官能化するのに十分のはずである（ＴＬＨＥ３）。
図７は、いくつかの態様における、ＴＬＨＥ１のＴＴＲへの結合親和性を示す図である。ＴＬＨＥ１のｈＴＴＲに対する熱量滴定（ＩＴＣ）（Ｋｄ＝３２±６ｎＭ）。ｈＴＴＲ（２μＭ）のＴＬＨＥ１（２５μＭ）を用いた滴定からの、生データ（上）および統合された熱（下）。当業者は、ＴＬＨＥ１が図７で非常に良好な結合親和性を示すことを理解するであろう。
図８は、いくつかの態様における、試験化合物の存在下での、共有結合プローブによる、ヒト血清中のｈＴＴＲの修飾によって引き起こされる蛍光の変化を示す図である。我々は、この選択性アッセイを用いて、我々のリガンドのヒト血清中のＴＴＲに対する選択性を試験した。共有結合プローブによる、ヒト血清（ｈＴＴＲ濃度約５μＭ）中のｈＴＴＲの修飾による蛍光変化を、共有結合プローブ単独（ＤＭＳＯ）または共有結合プローブとｈＴＴＲリガンド（１０μＭ）の存在下で、６時間モニターした。共有結合プローブの結合および蛍光が低いほど、リガンドのｈＴＴＲに対する結合選択性が高くなる。各バーは、３回反復の平均（±ＳＤ）を示す。当業者は、ＴＬＨＥ１が、図８において非常に良好な選択性を示すことを、理解するであろう。
例４．ＡＧ１０−アルキンリンカーの化学合成
我々は、ＡＧ１０−アルキンリンカーの一般的な合成経路を設計した。第１ステップは、アルキンリンカーを（アルコールをｐ−ＴｓＣｌで活性化した後）、メチル−３，５−ジヒドロキシベンゾエートの等価フェノール性ヒドロキシル基の１つに結合させることであった（リンカーのビルディングブロックを、メタ位で生成する）。オルト位については、メチル−２，５−ジヒドロキシベンゾエートを使用した。５−ＯＨ基の、ＭＯＭエーテルを用いたさらなる保護が、リンカーを２位（オルト位）に結合させる前に必要であった。合成の以下のステップは、我々がＡＧ１０合成について最近報告したものと同様である。アルキンリンカーを使用して、コンジュゲートリンカー全体の長さを制御した。我々の合成戦略の利点は、いくつかの合成ステップにおいて様々なＡＧ１０−アルキンリンカーの安価な生成を可能にすることである。このアプローチに従うことにより、化合物ＴＬＨＥ１（ＶＩＩＩｃのメタ位にコンジュゲートしたＣ５アルキンリンカー；ｎ＝３）およびＴＬＨＥ２（ＶＩＩＩｃのオルト位にコンジュゲートしたＣ５アルキンリンカー）を首尾よく合成した。すべての合成化合物はクロマトグラフィーで精製し、ＴＬＨＥ１およびＴＬＨＥ２の化学構造を、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲおよび質量分析によって確認し、純度（＞９５％）をＨＰＬＣで確認した。
例５．ＴＬＨＥ−（活性剤）コンジュゲートの合成
我々は、銅触媒アジド−アルキン付加環化「クリックケミストリー」を用いる、ＴＬＨＥ−（活性剤）コンジュゲートの組み立てのためのモジュラーアプローチを使用した。
図９は、いくつかの態様における、ＴＬＨＥをペプチドにコンジュゲートするための一般的な合成スキームを示す図である。最初に、短いアジドリンカーＶＩＩＩｄを、アミド結合を介して目的のペプチドまたは活性薬剤に結合させて、活性剤−リンカーを得る。この活性剤−リンカーは、クリック反応によりＴＬＨＥ１と結合し、約２０Å（＜３５０Ｄａ）のリンカーを与える。この組み立てられたリンカーは、リンカーをＴＴＲ Ｔ４ポケットからクリアするのに十分でなければならない。
図１０Ａ〜１０Ｄは、いくつかの態様における、４つのＴＬＨＥ１−ペプチドコンジュゲートの構造を示す図である。我々は、ＴＬＨＥ１を４つの異なるペプチドにコンジュゲートさせて、４つのＴＬＨＥ１−ペプチドコンジュゲートを得た：Ｃｏｎｊ１をＲＧＫ−ＭＣＡに（図１０Ａ）、Ｃｏｎｊ２をニューロテンシン（ＮＴ）に（図１０Ｂ）、Ｃｏｎｊ３をＧｎＲＨに（図１０Ｃ）、およびＣｏｎｊ４をＤ６−ＧｎＲＨに（図１０Ｄ）。４つのコンジュゲート全ては、緩衝液中のｈＴＴＲへの良好な結合親和性（Ｋｄは２００〜４００ｎＭの範囲、ＳＰＲによって決定）およびヒト血清中のｈＴＴＲに対する選択性（ヒト血清中のｈＴＴＲに対し、約４６〜５７％の結合）を示した。
図１１Ａ〜１１Ｆは、いくつかの態様における、ＴＬＨＥ１−小分子コンジュゲートおよび５つのＴＬＨＥ１−蛍光色素コンジュゲートの構造を示す。我々はまた、ＴＬＨＥ１をＣｏｎｊ５に、および抗癌剤ＳＮ−３８にコンジュゲートし、ならびに診断目的で使用できる可能性のある５種類の蛍光色素にコンジュゲートした：Ｃｏｎｊ６をフルオレセインに、Ｃｏｎｊ７をフルオレセインに、Ｃｏｎｊ８を二酢酸フルオレセインに、Ｃｏｎｊ９をＣｙ３Ｂに、Ｃｏｎｊ１０をＩＲｄｙｅに。
図１２は、いくつかの態様において、「スキーム１」１２００を、ＡＧ１０−ＧｎＲＨペプチドコンジュゲート（Ｃｏｎｊ３）の組み立てのためのモジュラーアプローチである、コンジュゲート活性剤の生成方法として示す図である。我々は、ＶＩＩＩｃ １２５５を、ＴＴＲリガンドとして使用した。最初に、ＣＯＯＨ−ＰＥＧ４−アジドリンカー１２０２を、ＧｎＲＨ１２０４のＮ末端にアミド結合を介して結合させて、ＧｎＲＨ−ＰＥＧ４−アジド１２０６を得た。同じリンカー１２０２を、［Ｄ−ｌｙｓ６］−ＧｎＲＨ ５０７のリシンのε−アミノに結合して、［Ｄ−ｌｙｓ６］−ＧｎＲＨ−ＰＥＧ４−アジド１２０９を得た。これら２つのＧｎＲＨ−リンカー中間体１２０６、１２０９を、我々が合成したすべてのＴＬＨＥに結合させた。ＴＴＲ結合ポケットは比較的疎水性であり、したがって我々は、様々な長さ（例えば、ｎ＝１、３、５、７、および９個の炭素原子）のアルキル鎖１２１１を使用する；ここで、ＰＥＧ４にコンジュゲートした５個の炭素は、約２０Åの長さのリンカーをもたらすであろう。リンカー１２６６の長さは、リンカー１２６６をＴＴＲのＴ４ポケットから除去するための調整として、使用することができる。これらの短いアルキル鎖１２１１の末端には、我々の「クリックケミストリー」を用いてＧｎＲＨリンカー１２０２のアジド基にコンジュゲートされる、末端アルキンが存在する。これらのコンジュゲートは、スキーム１に示すリンカー５６６などの短いアルキル／ＰＥＧ−リンカー（＜４００ダルトン）を用いて合成され、これは、図１２に示すように、ＶＩＩＩｃ１２５５のオルト位およびメタ位に、およびＧｎＲＨのＮ末端または［Ｄ−ｌｙｓ６］−ＧｎＲＨのリシンのε−アミノに結合される。
例６．ＴＬＨＥ１−ペプチドコンジュゲート（Ｃｏｎｊ１、Ｃｏｎｊ２、Ｃｏｎｊ３、およびＣｏｎｊ４）の化学合成：
我々は、４つのＴＬＨＥ１ペプチドコンジュゲートの合成を首尾よく達成した（図１０）。Ｃｏｎｊ１は、蛍光発生トリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＭＣＡにコンジュゲートしたＴＬＨＥ１である。Ｃｏｎｊ１の安定性は、in vitroでのトリプシンアッセイにおいてｈＴＴＲの存在下で評価する。Ｃｏｎｊ２は、ニューロテンシン（ＮＴ）のＮ末端にコンジュゲートしたＴＬＨＥ１である。Ｃｏｎｊ２の安定性は、ヒト血清プロテアーゼアッセイにおいて評価する。Ｃｏｎｊ３は、天然のＧｎＲＨのＮ末端にコンジュゲートしたＴＬＨＥ１である。Ｃｏｎｊ３の安定性は、ヒト血清プロテアーゼアッセイにおいて評価し、その薬物動態特性は、ラットin vivoで評価する。Ｃｏｎｊ４は、ＧｎＲＨアゴニストであるＧｎＲＨ−ＡのＬｙｓ６のε−アミノ基にコンジュゲートしたＴＬＨＥ１である。Ｃｏｎｊ４の薬物動態学的特性および効力は、ラットin vivoで評価する。クリックケミストリーを用いて、ＴＬＨＥ１をペプチド−ＰＥＧ４−アジドリンカーに直接結合させた（スキーム１）。
例７．ＴＬＨＥ１−小分子薬物コンジュゲート（Ｃｏｎｊ５）の化学合成：
図１３は、いくつかの態様における、抗癌剤ＳＭ−３８をＴＬＨＥ１（すなわち、Ｃｏｎｊ５）にコンジュゲートして作製するための、合成スキームを示す。図１３に示すように、リンカー修飾ＳＮ−３８をＴＬＨＥ１に結合させた。
例８．ＴＬＨＥ１−造影剤コンジュゲート（Ｃｏｎｊ６〜Ｃｏｎｊ１０）の化学合成：
コンジュゲートＣｏｎｊ６、Ｃｏｎｊ７、Ｃｏｎｊ８、Ｃｏｎｊ９、およびＣｏｎｊ１０（図１１）は、クリックケミストリーを用いて合成した。リンカー修飾蛍光色素は、スキーム１に記載されているものと同様に、ＴＬＨＥ１に結合された（図１２）。
例９．ＴＬＨＥ１の化学的安定性および細胞傷害性の評価。
ＴＬＨＥ１は、血清および模擬胃酸中で少なくとも４８時間安定であり（分解＜３％）、非常に低い細胞傷害性を有する（１００μＭでの細胞生存率＝９６±４％）。したがってＴＬＨＥ１は、ペプチドへのコンジュゲーションの非常に良い候補である。
例１０．ｈＴＴＲはＣｏｎｊ１を緩衝液中でのタンパク質分解から保護する
トリプシンを使用して、ＴＬＨＥ１−ペプチドコンジュゲート（Ｃｏｎｊ１）を緩衝液中におけるタンパク質分解から保護するｈＴＴＲの能力を試験した。図１４は、ＴＴＲへの結合の、in vitroでのＣｏｎｊ１の安定性に対する保護効果を示す図である。いくつかの態様において、ｈＴＴＲは、Ｃｏｎｊ１を、緩衝液中でのトリプシン加水分解から保護する。ｈＴＴＲの存在下で、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＭＣＡのタンパク質分解に対する保護はなかったが、ｈＴＴＲが存在する場合、Ｃｏｎｊ１のタンパク質分解に対する顕著な保護があった（Ｃｏｎｊ１＝３１０±５ＡＦＵ；Ｃｏｎｊ１＋ｈＴＴＲ＝１６０±１５ＡＦＵ）。ｈＴＴＲの保護効果は、反応混合物をＡＧ１０でインキュベートすると消失した（Ｃｏｎｊ１＋ｈＴＴＲ＋ＡＧ１０＝２９０±２０ＡＦＵ）。これは、保護効果が主に、Ｃｏｎｊ１のｈＴＴＲへの結合によるものであることを示している。
ｈＴＴＲ（１０μＭ）またはＡＧ１０（２０μＭ）の存在下および不在下での、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＭＣＡおよびＣｏｎｊ１（１０μＭ）の緩衝液中のトリプシンによるタンパク質分解。混合物を、３７℃で３０分間インキュベートし、７−アミノ−４−メチルクマリン（７−ＡＭＣ）のタンパク質分解放出を、７−ＡＭＣ蛍光（λｅｘ３４５ｎｍおよびλｅｍ４４０ｎｍ）を測定することにより評価した。ＡＦＵは任意の蛍光単位である。各バーは、４回反復の平均（±ＳＤ）を示す。
例１１．ｈＴＴＲはＣｏｎｊ２およびＣｏｎｊ３を血清プロテアーゼに対して保護する
ｈＴＴＲの、ペプチドを血清中のタンパク質加水分解から保護する能力を試験するために、２つのペプチド、ニューロテンシン（ＮＴ；１３アミノ酸神経ペプチド）およびゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ；１０アミノ酸ペプチドホルモン）を使用した。ＴＬＨＥ１を、短いリンカー（約２３０Ｄａ）を介してＮＴのＮ末端にコンジュゲートしてＣｏｎｊ２を得、ＧｎＲＨのＮ末端にコンジュゲートしてＣｏｎｊ３を得た（図１０）。対照として、ＴＬＨＥ１を有さない、リンカー修飾ＮＴおよびＧｎＲＨ（ＮＴ−リンカーおよびＧｎＲＨ−リンカー）を合成した。
図１５Ａおよび１５Ｂは、いくつかの態様における、ヒト血清中のタンパク質分解加水分解（ｈＴＴＲ濃度約５μＭ）に対する、ＴＴＲへの結合の（Ａ）Ｃｏｎｊ２および（Ｂ）Ｃｏｎｊ３の安定性に対する効果を示す図である。試験化合物（５μＭ）を、血清および、ＡＧ１０（１０μＭ）でプレインキュベートした血清に添加した。血清中に残存する化合物の量を、異なる時点で定量した。各点は３回の反復の平均（±ＳＤ）を示す。
Ｃｏｎｊ２およびＣｏｎｊ３の安定性を、ヒト血清中（ｈＴＴＲ濃度約５μＭ）およびＡＧ１０でプレインキュベートした血清試料で評価した。ＮＴおよびＧｎＲＨは、血清中で最も低い安定性を有する（それぞれ４時間および２時間後に、検出可能な量のＮＴおよびＧｎＲＨはない；図１５Ａおよび１５Ｂ）。短いリンカーをＮＴ（ＮＴ−リンカー）およびＧｎＲＨ（ＧｎＲＨ−リンカー）に結合することにより、安定性が強化された（４時間後にＮＴ−リンカーの３８±２％が、２時間後にＧｎＲＨ−リンカーの８５±４％が残っている）。対照的に、Ｃｏｎｊ２（４８時間後に２２±１％が残っている）およびＣｏｎｊ３（４８時間後に５８±４％が残っている）は、血清プロテアーゼに対して最も保護されている。通常の血清と、ＡＧ１０でインキュベートした血清との間に、ＮＴ−リンカーおよびＧｎＲＨ−リンカーの安定性に差異はなかった。一方、通常の血清中のＣｏｎｊ２およびＣｏｎｊ３の安定性は、ＡＧ１０でプレインキュベートした血清試料のＣｏｎｊ２およびＣｏｎｊ３の安定性よりも高かった（２４時間および４８時間後にそれぞれ、Ｃｏｎｊ２およびＣｏｎｊ３の検出可能な量は残らなかった）。我々のデータは、コンジュゲート保護の大部分が、ｈＴＴＲの＞５０％に結合する結果であることを示す（図８）。
例１２．ＴＴＲは、ラットにおいてＣｏｎｊ３の循環半減期を延長する
図１６は、いくつかの態様における、ｒＴＴＲへ結合の、ラットにおけるＣｏｎｊ３の半減期の延長に対する効果を示す図である。等量のＧｎＲＨとＣｏｎｊ３を、２群の雄ラット（各群についてＮ＝４）に、時間０（単一ｉ．ｖ．ボーラス；各化合物３．３μｍｏｌ／ｋｇ）で投与した；一方の群はビヒクルで前処理し（未処理）、他方の群はＡＧ１０で前処理した（ＡＧ１０処理群；１７．１μｍｏｌ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）。血漿中の試験化合物の濃度を有効なＨＰＬＣ法を用いて決定し、投与後の時間の関数としてプロットした。濃度は、平均（±ＳＥＭ）で表す。
等量のＧｎＲＨ、ＧｎＲＨ−リンカー、およびＣｏｎｊ３を、単一のｉ．ｖ．ボーラスとして雄ラットの群に投与し、試験化合物の血漿濃度を異なる時点で測定した。対照として別のラットのセットに、同じ試験化合物（ＧｎＲＨ、ＧｎＲＨ−リンカーおよびＣｏｎｊ３）を、ただしＡＧ１０の存在下で同時投与した。薬物動態学的評価は、測定可能な量のＧｎＲＨが投与後１５分で存在しないことを示し、これは、報告された短いin vivo半減期と整合する。ＧｎＲＨ−リンカーの半減期は、ＡＧ１０処理ラットおよび未処理ラットにおいて同様であった（半減期＝それぞれ４．２分および３．５分）。対照的に、Ｃｏｎｊ３は、初期の急速分配相（半減期＝１２分）と、続いてより長い終末相半減期（４６±３分）を示した。Ｃｏｎｊ３の終末相半減期は、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ−リンカーのそれよりも少なくとも１３倍長い。Ｃｏｎｊ３の二相性プロファイルは、我々がＡＧ１０について観察したものに類似しており、ＴＭＤＤを示す。Ｃｏｎｊ３の半減期は、ＡＧ１０の存在下で約３倍減少した（半減期＝１６±１分）。
例１３．ｒＴＴＲは、ラットにおけるＣｏｎｊ４の循環半減期を延長する
図１７は、いくつかの態様において、Ｃｏｎｊ４が、ラットにおいて延長された半減期を示したことを示す。等量のＧｎＲＨ−ＡおよびＣｏｎｊ４を、２群の雄ラット（各群についてＮ＝３）に、時間０（単一ｉ．ｖ．ボーラス；各化合物３．３μｍｏｌ／ｋｇ）で投与した；一方の群はビヒクルで前処理し（未処理）、他方の群はＡＧ１０で前処理した（ＡＧ１０処理群；１７．１μｍｏｌ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）。血漿中の試験化合物の濃度を有効なＨＰＬＣ法を用いて決定し、投与後の時間の関数としてプロットした。濃度は、平均（±ＳＥＭ）で表す。
我々は、Ｃｏｎｊ４（図１０）を使用してin vivoの有効性を実施し、有効性がin vivoでの延長された半減期と相関するかどうかを決定した。Ｃｏｎｊ４は、ＴＬＨＥ１を、ＧｎＲＨ類似体［Ｄ−Ｌｙｓ６］−ＧｎＲＨ（ＧｎＲＨ−Ａ）中のＬｙｓ６のε−アミノ基にコンジュゲートした生成物である。ＧｎＲＨ−Ａ、ＧｎＲＨ−Ａ−リンカーおよびＣｏｎｊ４の薬物動態学的特性を、ラットにおいて、ＡＧ１０の不在下および存在下で評価した（図１７）。ＧｎＲＨ−Ａの半減期は５５±１１分であり、投与の２時間後に血漿中に検出可能なレベルは存在しなかった。類似するＧｎＲＨ−Ａの半減期が、ＡＧ１０処理ラットで観察された（半減期＝４９±４分）。ＧｎＲＨ−Ａ−リンカーのＰＫプロファイルおよび半減期（半減期＝５８±７分）は、ＧｎＲＨ−Ａのそれに匹敵し、ＡＧ１０処理したラットおよび未処置処理のラットの両方において、２時間後に検出可能なレベルのＧｎＲＨ−Ａ−リンカーは存在しなかった。これと比較して、Ｃｏｎｊ４は、初期の急速分配相（半減期＝１４分）を示し、続いて、ＧｎＲＨ−Ａの半減期よりも＞３倍長い非常に長い終末相半減期（１８０±１２分）を示した。２時間後に検出可能な血漿ＧｎＲＨ−Ａレベルは存在しなかったが、Ｃｏｎｊ４は、循環中に少なくとも１２時間存在した（図１９Ａ）。ＡＧ１０処理ラットにおけるＣｏｎｊ４の半減期（半減期＝１０２±７分）は、ＡＧ１０未処理ラットの半減期よりも有意に低かった。これらのデータは、ＴＴＲの動員が実際にin vivoでのペプチドの半減期を増強することができるという、我々の新規アプローチを強く支持し確認した。
例１４：Ｃｏｎｊ４はそのＧｎＲＨ−Ｒ有効性を、長期間にわたりラットにおいて維持する
図１８は、Ｃｏｎｊ４が、いくつかの態様において、血清テストステロンレベルの上昇を測定することにより、ラットにおいて延長された優れた有効性を示したことを示す。Ｃｏｎｊ４（単回ｉ．ｖ．ボーラス；２２５ｎｇ／ｋｇ、１２０ｐｍｏｌ／ｋｇ）を性腺無傷の雄ラット（Ｎ＝４）に投与すると、テストステロンの放出が刺激され、等用量のＧｎＲＨ−Ａ（単回ｉ．ｖ．ボーラス；１５０ｎｇ／ｋｇ、１２０ｐｍｏｌ／ｋｇ）の、ラットの第２群（Ｎ＝４）への投与と比較して、循環中により高いレベルのテストステロンを維持する。対照として、ラットの第３群（Ｎ＝３）にビヒクルのみを投与した。血清中のテストステロンレベルをＥＬＩＳＡを用いて測定し、濃度を平均（±ＳＥＭ）で表した。
ＧｎＲＨアゴニストは、下垂体のＧｎＲＨ−Ｒと相互作用する。外因性ＧｎＲＨアゴニストの急性投与は、雄ラットのテストステロンレベルの迅速な上昇を引き起こすことが知られている。したがって、Ｃｏｎｊ４の、テストステロンの循環レベルに対するin vivo有効性を、雄ラットにおいて評価した。Ｃｏｎｊ４、ＧｎＲＨ−Ａまたはビヒクルを３群のラットに投与し、テストステロンの血清濃度を様々な時点で測定した。ビヒクル処理ラットでは、テストステロンの正常な日周期リズムが観察された（ラットにおける正常な血清テストステロンの範囲は０．７〜５ｎｇ／ｍｌである）。
等用量のＧｎＲＨ−ＡまたはＣｏｎｊ４の投与は、注射後１時間以内にテストステロンレベルの有意な増加をもたらした（それぞれ図１８の３５．８±１．７ｎｇ／ｍｌおよび３５．６±３．２ｎｇ／ｍｌ）。両方の化合物についての１時間での類似する有効性は、ＧｎＲＨ−Ａ（Ｋｄ＝１．８ｎＭ）およびＣｏｎｊ４（Ｋｄ＝４．９ｎＭ）に対する、同様のin vitroＧｎＲＨ−Ｒ結合親和性と整合する。両処理群のテストステロンレベルは１時間後に減少し始めたが、ＧｎＲＨ−Ａ処理ラットにおける減少は、Ｃｏｎｊ４処理ラットのそれよりも有意に速かった。６時間において、テストステロンレベルは、ＧｎＲＨ−Ａ（１３．２±１．３ｎｇ／ｍｌ）およびＣｏｎｊ４（２５．６±２．８ｎｇ／ｍｌ）処理ラットの間で、有意差があった。ＧｎＲＨ−Ａについて、循環テストステロンレベルは、投与後８時間以内にビヒクル処理レベル（３．６±０．６ｎｇ／ｍｌ）に戻った。対照的に、８時間でのＣｏｎｊ４処理ラットのテストステロンレベル（１８．９±１．０ｎｇ／ｍｌ）は、ＧｎＲＨ−Ａまたはビヒクル処理ラットのものと比較して有意に高かった。重要なことに、Ｃｏｎｊ４処理ラットのテストステロンレベルは投与の１２時間後でも（１２．７±２．３ｎｇ／ｍｌ）、ビヒクル処理ラット（０．８±０．３ｎｇ／ｍｌ）と比較して、依然として高かった（基底レベルの約１６倍の増加）。Ｃｏｎｊ４処理ラットの循環テストステロンレベルは、２４時間以内に前処理範囲に戻った。この有効性データは、我々の薬物動態学的データと良好に相関し（図１８）、Ｃｏｎｊ４の増強された有効性は、主にｒＴＴＲへの結合に起因する、循環半減期の延長の結果であることを強く示している。
例１５．血清中のＴＴＲと不可逆的な共有結合付加物を形成可能なＡＧ１０−二官能性コンジュゲート：
適切な位置にカルボン酸部分を有するＴＴＲリガンド（例えば、ＡＧ１０）はＴＴＲに結合し、カルボン酸部分を介してＴＴＲ Ｔ４ポケット内のリシン１５（Ｋ１５）と静電相互作用を形成する。Choi S., et al. Nat Chem Biol. 6:133-9 (2010)；およびPenchala S., et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 11:9992-7 (2013)を参照；これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの小分子のいくつかは、カルボン酸を、アミド結合を介してＫ１５を共有結合的に修飾することができる反応性部分（Ｘ）に変換することにより、不可逆的なＴＴＲリガンドに変換され得ることが示されている。これらのＴＴＲリガンドは、経口経路または非経口経路によって投与されるとＴＴＲに結合し、血清中のＴＴＲとの共有結合付加物を形成する。二官能性分子のＡＧ１０部分のカルボン酸部分を、Ｋ１５を介してＴＴＲに共有結合可能な反応性基（Ｘ）に変換することによって、同じ原理を二官能性ＴＴＲ治療剤に適用することができる。血清中に二官能性分子−ＴＴＲコンジュゲートが形成されると、二官能性分子−ＴＴＲコンジュゲートは、タンパク質担体（ＴＴＲ）と類似の薬物動態学的特性（すなわち、最大in vivo血清半減期２４時間および薬物濃度１０μＭ）を有するであろう。治療剤（Ｙ）（例えば、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、ウイルス様粒子、造影剤、および他の小分子薬物）は、適切なリンカーを介してＴＴＲの表面を超えて引き続き延長されるので、共有結合コンジュゲートはそれでもいくらかの活性を有するであろう。しかしながら、ＴＴＲの立体的かさ高さ（５６ＫＤａ）のために、これらの共有結合コンジュゲートの活性は、それらの非共有結合（可逆的）対応物の活性よりも低いことが予想される。
化合物（ＩＸ）の次の構造は、ＴＴＲに共有結合し得るリガンドの種類の、一例である：
式中、
Ｒｂは、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＲ７Ｒ８、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＯＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ９）ＣＯＯＨ、ＣＦ３、水素、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、カルボキシル、複素環式基、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステル、アルコキシカルボニル、または置換アルコキシカルボニルの、いずれか１つまたは任意の組み合わせであることができ；
Ｘは、反応性置換基、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＮＨＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＯＮＨＳＯ２Ａｒ、カルボン酸エステル、カルボン酸チオエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、Ｎ−ヒドロキシマレイミド基、２−ヒドロキシプロピレン、１−、３−または４−アゼチジン基、およびａ−ハロメチルカルボニル（ａ−ハロアセチル）基（ここで、ハロ基は好ましくはブロモまたはクロロである）；マイケル付加反応においてＫ１５アミン窒素と反応する置換基などのマイケルアクセプター基、例えば−Ｃ（Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ２（アクリロイル）基、−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ＝ＣＨ２（ビニルスルホニル）基、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ２（アクリルアミド）基および−ＮＨＳ（Ｏ）２ＣＨ＝ＣＨ２（ビニルスルホンアミド）基を含む、のいずれか１つまたは任意の組み合わせであることができ；
Ｘａは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳであり；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、複素環式基、ハロゲン、ニトロ、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、およびシアノから選択され；
ｎは、０〜８の範囲の整数であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３基の各々は独立して、グリシジル基、アジリジニルメチル基またはチイラニルメチル基中に存在するエポキシド、アジリジンまたはエピスルフィド基；ならびにスルホンアミド、ビニルスルホンアミド、スルホニルフルオリド、アルコキシカルボニルまたは置換アルコキシカルボニルの、いずれか１つまたは任意の組み合わせとして選択されることができ；
Ｙは、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、ウイルス様粒子、造影剤、または小分子薬物の、いずれか１つまたは任意の組み合わせであることができ；および、
リンカー連結は、２つの基を連結し、かつ長さが３０原子以下の主鎖を有する、任意の部分であることができる。
図１９は、いくつかの態様による、ＴＴＲのＫ１５と共有結合を形成することができる、ＡＧ１０類似体（ＩＸａ）の化学合成を示す。
例１６．ＴＴＲへの結合により活性剤の免疫原性を低下させる
任意の起源の治療用ペプチドの反復投薬は、免疫応答を誘発し得ることが理解されるべきである。この免疫原性はまた、免疫細胞による迅速なクリアランスに起因して分子のin vivo半減期を低下させることにより、ペプチドを含む治療剤の有効性を低減することが示されている。治療用ペプチドの免疫原性に対処するためのいくつかの戦略が提案されており、これにはＰＥＧ化、ヒト化、エキソンシャッフリングなどを含む。別のアプローチは、ペプチドの、ＨＳＡなどの血清タンパク質への共有結合化学コンジュゲーションである。ペプチドのこのかさ高さの増加は、抗原エピトープのマスキングをもたらし、それによって免疫応答を低下させる。例えば、ＨＩＶ融合阻害剤ペプチドをＨＳＡにコンジュゲートさせると、その血清半減期が増加し、免疫原性も低下することが示されている。
したがって、本明細書で教示の（ＴＴＲリガンド）−（活性剤）コンジュゲートは、ＴＴＲのかさ高さを動員することによって、対象における免疫原性を低下させるために投与されることができ、これは、活性剤の対照を単独で（すなわち、ＴＴＲリガンドへのコンジュゲーション無しで）投与し、結果を、本明細書に教示の（ＴＴＲリガンド）−（活性剤）コンジュゲートの投与と比較することによって、証明することができる。
例１７．活性剤の半減期延長に使用される他のアプローチに対する、本明細書教示のアプローチのいくつかの利点。
効力を維持することに加えて、本明細書で教示のアプローチは、従来の遺伝子融合およびＰＥＧ化アプローチよりも多くの利点を提供し、例えば以下である：
（ｉ）我々のアプローチは、ペプチドのＴＬＨＥ１への単純な化学コンジュゲーションを含み、生成物は均質であり、ＨＰＬＣなどの過酷な条件を用いて、容易に特徴づけおよび精製（純度＞９８％）することができる。合成のモジュラー的性質は、結合部位の柔軟性と、非天然アミノ酸または非ペプチド性官能基のペプチド主鎖への取り込みを提供する；
（ｉｉ）融合パートナーの三次元構造が維持されることが必要なＨＳＡペプチド融合とは異なり、ＴＬＨＥ１へのコンジュゲーションは、冷蔵不要の安定した生成物をもたらす。これは、ペプチドコンジュゲートの生産および貯蔵のコストを低減する；
（ｉｉｉ）我々のコンジュゲートのサイズがさらに小さいため（ＨＳＡコンジュゲートのサイズの３％未満）、固形腫瘍に効率的に浸透することが予想される；
（ｉｖ）その非ペプチド性および小さいサイズにより、ＴＬＨＥ１が免疫原性応答を引き起こす可能性は低い；および、
（ｖ）ＴＬＨＥ系は、ペプチドへの長期間の暴露が望ましくない特定の用途には、好ましいであろう。
例１７．一般的実験
方法
材料：ヒトｈＴＴＲ（ヒト血漿から精製）は、Sigma（#P1742）から購入した。ヒト血清は、Sigma（#H4522）から購入した［血清中のｈＴＴＲ濃度は、比濁分析器を用いて測定した（２８ｍｇ／ｄＬまたは５μＭ）］。ＨＳＡは、Sigmaから入手した（#A3782；ヒト血清からのアルブミン、≧９９％）。サイロキシン（Ｔ４）は、Fisher Scientificから購入した。ＰＫ試験ラット血漿のＨＰＬＣ分析は、ダイオードアレイ検出器に接続したAgilentの１１００シリーズＨＰＬＣシステムで実施した；これは２００〜４００ｎｍのＵＶ範囲内で作動して、Agilent Chemstationソフトウェアを用いて定量化される。移動相は、溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むメタノール−水（５：９５、ｖ／ｖ）からなる）と、溶媒Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むメタノール−水（９５：５、ｖ／ｖ）からなる）から構成される。保護アミノ酸およびペプチドカップリング試薬は、Chem-Impex Internationalから購入した。２−クロロトリチル樹脂は、Advanced Chem Tech（#SC5055、１．６ｍｍｏｌ／ｇ）から購入し、RinkアミドＭＢＨＡ樹脂は、Novobiochem（#855003、０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）から購入した。
動物：成体の頸静脈カニューレ挿入雄Sprague-Dawley（ＳＤ）ラットは、Charles River Laboratories（Hollister、CA）から購入した。すべての動物は、温度制御室（２２．２℃）で、１２時間明／１２時間暗（午前６時に点灯）の光周期で維持した。ラットチャウ（Lab diet TM#5001）および水道水を自由に与えた。カテーテル維持溶液を含む動物用品は、SAI infusion technologiesから購入した。滅菌ＩＶ流体はPatterson Veterinaryから得た。すべての動物プロトコルは、University of PacificのAnimal Care Committeeによって承認され、Guide for the Care and Use of Laboratory Animals（EotcjEdotopm.2011）に準拠した。
ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）におけるＡＧ１０の代謝研究：ＡＧ１０についてのミクロソームインキュベーションを、ｈＴＴＲまたはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の不在下および存在下で行った。インキュベーション混合物は、総容量５００μＬのリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）中の、ヒト肝ミクロソーム（１ｍｇ／ｍＬ）、ＡＧ１０（５μＭ）、ｈＴＴＲまたはＨＳＡ（５μＭ）、ＭｇＣｌ２（４ｍＭ）、およびＮＡＤＰＨ（１．６ｍＭ）からなる。インキュベーション混合物を、３７℃で約１０〜１５分間プレインキュベートし、次いでＮＡＤＰＨ（または陰性対照のための緩衝液）の添加により、反応を開始した。０時間および２時間で８０μＬアリコートを採取し、等容量のメタノールに加えた。試料を１６，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を、ＨＰＬＣで分析するまで−２０℃で保存した。
ラットにおけるＡＧ１０の用量増大：成体の雄Wistarラット、体重１６０〜２００ｇを、研究に使用した。増大する単一ｉ．ｖ．用量、５、２０および５０ｍｇ／ｋｇのＡＧ１０（水中のナトリウム塩溶液）を、ラットの３つの群（１群あたり３匹）に投与した。血液試料を０．０８、２、４、８および２４時間の間隔で収集した。血漿試料は、１５，０００ＲＰＭで５分間遠心分離して調製した。得られた血漿を、２×溶媒Ｂ（９５：５、メタノール−水、０．１％ＴＦＡ）を用いて沈殿させた。試料を１５，０００ＲＰＭで５分間遠心分離し、上清を、ＨＰＬＣで分析するまで−２０℃で保存した。
血清中のＣｏｎｊ２およびＣｏｎｊ３の安定性：血清中のＣｏｎｊ２およびＣｏｎｊ３（５μＭ）の安定性を、ＡＧ１０（１０μＭ）の存在下および不在下で行った。Ｃｏｎｊ２およびＣｏｎ３を、０．５ｍＬのヒト血清中３７℃でインキュベートし、試料（５０μＬ）を０、２、４、８および２４時間の間隔でアッセイした。試料の処理を、２００μＬの溶媒Ｂ（水中９５％メタノールおよび０．１％ＴＦＡ）を添加し、続いて１６，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を、上記の有効なＨＰＬＣ法を用いて分析することにより行った。
Ｃｏｎｊ１のためのトリプシン切断実験：９６ウェル透明底プレートにおいて、ＰＢＳ（８７．５μＬ）中の試験化合物（１０μＭのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＭＣＡまたはＣｏｎｊ１）（２０μＭのＡＧ１０ありまたはなし）の溶液を、トリプシン（TrypLE（商標）Express、Gibco（登録商標）、１２．５μＬ、１Ｘ）と共に、ｈＴＴＲ（１０μＭ）の存在下および不在下でインキュベートした。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。７−アミノ−４−メチルクマリン（７−ＡＭＣ）の放出を、マイクロプレート分光光度計リーダー（Molecular Devices SpectraMax M5）を用いて蛍光（λｅｘ３４５ｎｍおよびλｅｍ＝４４０ｎｍ）を測定することにより、評価した。７−ＡＭＣの蛍光シグナルを、緩衝液および基質を含むがトリプシンを含まないブランクについて測定した。実験は、４回繰り返して行った。
ラットにおけるＣｏｎｊ３およびＣｏｎｊ４の薬物動態プロファイルの評価：頸静脈カニューレ挿入したSprague-Dawley雄ラット（２００〜２２０ｇ、４９〜５２日齢）を、この研究に使用した。エクステンションカテーテルを留置頸静脈カニューレに取り付け、遠隔サンプリングを容易にした。動物を無作為に２つの群（Ｎ＝３または４）：対照群および処理群に分けた。処理群を、ＡＧ１０（５．０ｍｇ／ｋｇ体重；１７．１μｍｏｌ／ｋｇ；２００μＬの滅菌水中）で静脈内で前処理し、続いて全試験化合物のモル当量の単回組み合わせ静脈内投与（単回ｉ．ｖ．投与として；各化合物３．３μｍｏｌ／ｋｇ）を行った：Ｃｏｎｊ３試験［ＧｎＲＨ（３．８７ｍｇ／ｋｇ）、ＧｎＲＨ−リンカー（４．６８ｍｇ／ｋｇ）、Ｃｏｎｊ３（８．８３ｍｇ／ｋｇ）］、Ｃｏｎｊ４試験［ＧｎＲＨ−Ａ（４．１ｍｇ／ｋｇ）、ＧｎＲＨ−Ａ−リンカー（４．８５ｍｇ／ｋｇ）、Ｃｏｎｊ４（６．０ｍｇ／ｋｇ）］（生理食塩水中、３８％ＰＥＧ−４００、５％ＤＭＳＯにおいて）。同時に、対照群をビヒクル（滅菌水）で前処理し、続いて、上記の全試験化合物のモル当量の単回組み合わせ静脈内投与を行った。血漿を各ラットから収集し、２Ｘ溶媒Ｂ（９５：５、メタノール−水、０．１％ＴＦＡ）を用いて沈殿させた。試料を、１５，０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。
ラットにおけるＣｏｎｊ４の有効性の評価：頸静脈カニューレ挿入Sprague-Dawley雄ラット（３００〜３２５ｇ、６８〜７３日齢）をこの研究に使用した。第１群（Ｎ＝４）は、ビヒクルのみで処理した対照群であり（生理食塩水中、２００μＬの３０％ＰＥＧ；ｉ．ｖ．）；第２群（Ｎ＝４）はＧｎＲＨ−Ａで処理し（１５０ｎｇ／ｋｇ、１２０ｐｍｏｌ／ｋｇ）；第３群（Ｎ＝４）は等用量のＣｏｎｊ４で処理した（２２５ｎｇ／ｋｇ、１２０ｐｍｏｌ／ｋｇ；ｉ．ｖ．）。ＧｎＲＨ−ＡおよびＣｏｎｊ４試料も、対照と同じビヒクルで調製した（すなわち、生理食塩水中、２００μＬの３０％ＰＥＧ−４００）。血清試料を各ラットについて収集し、テストステロンについてアッセイするまで、−２０℃で保存した。血清テストステロンレベルは、確立されたラットＥＬＩＳＡアッセイ（ALPCO Diagnostics、New Hampshire、cat#55-TESMS-E01）を用いて測定した。テストステロンＥＬＩＳＡアッセイは、ラット血清中のテストステロンの定量的測定のための、競合的イムノアッセイである。アッセイは、キット製造業者のプロトコルに従って行った。テストステロンの既知の濃度を用いて、標準曲線を作成した。キットの感度は０．０６６ｎｇ／ｍｌであった。テストステロンレベルを、平均（±ＳＥＭ）として表した。動物群間の有意差は、各特定の時点での、post hocダネット多重比較試験での一元配置分散分析によって決定した（GraphPad Prism）。
化学合成
３−（３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）プロポキシ）安息香酸（ＶＩＩＩｃ）：ＶＩＩＩｃを、３−ヒドロキシ安息香酸から出発して、ＶＩＩｃについて記載したのと同様のアプローチを用いて合成した。ＶＩＩＩｃは白色固体である；1H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 7.58-7.56 (m, 1H), 7.50-7.49 (m, 1H), 7.34-7.49 (t, 1H, J = 7.8 Hz), 7.13-7.10 (m, 1H), 3.93 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.58 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 2.12 (s, 6H), 1.95-1.90 (m, 2H); HRMS m/z: calcd for C15H18N2O3 + H+ 275.1396; found 275.1390 (M + H+)。
スキーム２．ＴＬＨＥ１の合成。ａ）Ｋ２ＣＯ３、ＫＩ、ＭｅＣＮ、還流、２４ｈ；ｂ）１，３−ジブロモプロパン、Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ、ｒｔ、１６ｈ；ｃ）ｉ．アセチルアセトン、ＤＢＵ、ベンゼン、ｒｔ、３日間；ｉｉ．ヒドラジン水和物、エタノール、９０℃、４ｈ；ｄ）ＬｉＯＨ、ＴＨＦ、水、ｒｔ、１４ｈ。
メチル３−ヒドロキシ−５−（ペンタ−４−イン−１−イルオキシ）ベンゾエート（ＩＸｃ）の調製：無水ＭｅＣＮ（３０ｍｌ）中のメチル３，５−ジヒドロキシベンゾエート（ＩＸｂ）（０．７７ｇ、４．５８ｍｍｏｌ、１当量）および４−ペンチニルｐ−トシレート（０．９８ｇ、４．１２ｍｍｏｌ、０．９当量）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１．２６７ｇ、９．１６ｍｍｏｌ、２当量）およびＫＩ（０．１５３ｇ、０．９２ｍｍｏｌ、０．２当量）を加えた。懸濁液を加熱して１６時間還流させ、濾過し、固体をＭｅＣＮでリンスした。濾液を減圧下で濃縮した。水を残渣に加え、水相をＥｔＯＡｃで抽出し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濃縮および精製フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１〜１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により、化合物ＩＸｃ（０．６８４ｇ、収率７１％）を得た；1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 7.16-7.14 (m, 2H), 6.62 (t, 1H, J = 2.4 Hz), 4.08 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.89 (s, 3H), 2.42-2.38 (m, 2H), 2.02-1.96 (m, 3H); (ESI+) m/z: calcd for C13H14O4 + H+ 235.0970; found 235.0961 (M + H+)。
メチル３−ヒドロキシ−５−（ペンタ−４−イン−１−イルオキシ）ベンゾエート（ＩＸｄ）の合成：ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＩＸｃ（３６０ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ、１当量）および１，３−ジブロモプロパン（０．７８ｍｌ、７．７ｍｍｏｌ、５当量）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２５６ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍｌ）で希釈し、ブライン（３×５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１〜１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により濃縮および精製して、化合物ＩＸｄ（４６８ｍｇ、収率８６％）を得た；1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 7.19-7.17 (m, 2H), 6.64 (t, 1H, J = 2.4 Hz), 4.12 (t, 2H, J = 5.8 Hz), 4.08 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.89 (s, 3H), 3.59 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 2.42-2.38 (m, 2H), 2.33-2.29 (m, 2H), 2.02-1.96 (m, 3H); (ESI+) m/z: calcd for C16H19BrO4 + H+ 355.0545; found 355.0529 (M + H+)。
メチル３−（３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）プロポキシ）−５−（ペンタ−４−イン−１−イルオキシ）ベンゾエート（ＩＸｅ）：ベンゼン（３ｍｌ）中のＩＸｃ（４５０ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を、ベンゼン（７ｍｌ）中のアセチルアセトン（０．２６ｍｌ、２．５４ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＢＵ（０．３８ｍｌ、２．５４ｍｍｏｌ、２当量）の溶液に滴下した。反応混合物を室温で３日間撹拌した。混合物を濾過し、シリカゲルのパッドに通した。溶媒を除去し、残渣をエタノール（５ｍｌ）に溶解した。ヒドラジン水和物（０．１７ｍｌ、３．１８ｍｍｏｌ、２．５当量）を加え、反応物を還流下で４時間加熱した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１〜２０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により濃縮および精製して、化合物ＩＸｅ（１５０ｍｇ、収率３２％）を２ステップで得た；1H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 7.13-7.08 (m, 2H), 6.67 (t, 1H, J = 2.34 Hz), 4.07 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.90 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.86 (s, 3H), 2.56 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 2.38-2.34 (m, 2H), 2.23 (t, 1H, J = 2.6 Hz), 2.11 (s, 6H), 1.97-1.88 (m, 4H); HRMS (DART) m/z: calcd for C21H26N2O4 + H+ 371.1971; found 371.1968 (M + H+)。
３−（３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）プロポキシ）−５−（ペンタ−４−イン−１−イルオキシ）安息香酸（ＴＬＨＥ１）：ＴＨＦ（３ｍｌ）および水（３ｍｌ）の混合物中のＩＸｅ（８５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１当量）の懸濁液に、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（１９ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。反応混合物を室温で１４時間撹拌した後、０℃に冷却し、１ＮのＨＣｌ水溶液でｐＨ２〜３に注意深く酸性化した。混合物をＥｔＯＡｃ（３×２０ｍｌ）で抽出し、合わせた有機抽出物を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１０〜５０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により濃縮および精製して、ＴＬＨＥ１（５９ｍｇ、収率７３％）を白色固体として得た；1H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 7.14-7.10 (m, 2H), 6.66 (t, 1H, J = 2.4 Hz), 4.07 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.90 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.57 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 2.38-2.35 (m, 2H), 2.24 (t, 1H, J = 2.4 Hz), 2.12 (s, 6H), 1.97-1.88 (m, 4H); HRMS (DART) m/z: calcd for C20H24N2O4 + H+ 357.1814; found 357.1818 (M + H+)。
スキーム３．ＴＬＨＥ２の合成。ａ）Ｋ２ＣＯ３、ＫＩ、ＭｅＣＮ、還流、２４ｈ；ｂ）６ＮのＨＣｌ／ＴＨＦ、５０℃、２ｈ；ｃ）１，３−ジブロモプロパン、Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ、ｒｔ、１６ｈ；ｄ）ｉ．アセチルアセトン、ＤＢＵ、ベンゼン、ｒｔ、３日間；ｉｉ．ヒドラジン水和物、エタノール、９０℃、４ｈ；ｅ）ＬｉＯＨ、ＴＨＦ、水、ｒｔ、１４ｈ。
５−（３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）プロポキシ）−２−（ペンタ−４−イン−１−イルオキシ）安息香酸（ＴＬＨＥ２）：ＴＬＨＥ２を、ＩＸｆから出発して、上記のＴＬＨＥ１について記載したのと同様のアプローチを用いて合成した。ＴＬＨＥ２は、白色固体である；1H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 7.29-7.28 (m, 1H), 7.04-7.02 (m, 2H), 4.10 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.85 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.55 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 2.40-2.37 (m, 2H), 2.21 (t, 1H, J = 2.7 Hz), 2.11 (s, 6H), 1.98-1.93 (m, 2H), 1.90-1.84 (m, 2H); HRMS (DART) m/z: calcd for C20H24N2O4 + H+ 357.1814; found 357.1817 (M + H+)。
ＴＬＨＥ３の合成：３−（３−（１−（２−（２−（２−（２−カルボキシエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロポキシ）−５−（３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）プロポキシ）安息香酸（ＴＬＨＥ３）：クリック（ＣｕＡＡＣ）反応を、ＴＬＨＥ１（４９ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）を、Ｈ２Ｏ／ＴＨＦ（２：１）（５ｍｌ）の混合物中のアジドリンカー３−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）プロパン酸（ＶＩＩＩｄ、６８ｍｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４（２２ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）、およびアスコルビン酸ナトリウム（５４ｍｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）と反応させることにより、実施した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。粗生成物を分取ＨＰＬＣにより精製して、ＴＬＨＥ３を得た（５３ｍｇ、収率６４％）；1H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 7.81 (1H, s), 7.10 (2H, d, J = 2.4 Hz), 6.66 (1H, t, J = 2.4 Hz), 4.51 (2H, t, J = 4.8 Hz), 4.01 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.90 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.84 (2H, t, J = 4.8 Hz), 3.68 (2H, t, J = 6.6 Hz), 3.55-3.52 (8H, m), 2.88 (2H, t, J = 7.8 Hz), 2.56 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.49 (2H, t, J = 6.6 Hz), 2.15-2.10 (m, 8H), 1.93-1.88 (2H, m); HRMS (DART) m/z: calcd for C29H41N5O9 + H+ 604.2982; found 604.2969 (M + H+)。
スキーム４．蛍光発生ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＭＣＡおよびＣｏｎｊ１の合成。試薬および条件：ａ）２−クロロトリチルクロリドポリスチレン樹脂、ＤＩＰＥＡ、ＤＣＭ、１６ｈ；ｂ）Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳ；ｃ）リンカーＶＩＩＩｄカップリング；ｄ）ＤＣＭ中の１％ＴＦＡ、１０分４Ｘ；ｅ）ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、ｒｔ、１６ｈ；ｆ）ＴＬＨＥ１、ＣｕＩ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、ｒｔ、２０ｈ；ｇ）９５％ＴＦＡ／水、２ｈ。
蛍光生成化合物Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＭＣＡおよびＣｏｎｊ１の合成：Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＭＣＡおよびＣｏｎｊ１の合成は、固相合成（スキーム４）を用いた標準Ｆｍｏｃ／Ｂｏｃプロトコルを用いて行った。合成は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中で約３０分間膨潤させた、２−クロロトリチル樹脂（樹脂負荷、１．６ｍｍｏｌ／ｇ）上で行った。樹脂負荷ステップのために、樹脂（３１２．５ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（３ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１１７１．５ｍｌ、２．５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．８２７ｍｌ、５ｍｍｏｌ）と反応させた。反応混合物を室温で一晩振とうした。Ｌｙｓアミノ酸を樹脂に負荷した後、樹脂の未反応部位を、ＤＣＭ（５ｍｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．４ｍｌ）溶液中のＨＰＬＣ等級ＭｅＯＨ（０．６ｍｌ）で、３０分間エンドキャップした。次いで、樹脂を洗浄して、残留したすべてのＭｅＯＨおよびＤＩＰＥＡを除去した。ＬｙｓのＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中２×３ｍｌの２０％ピペリジンを用いて、３０分間脱保護した。負荷した樹脂を、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ；１５３．２ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートメタンアミニウム（ＨＡＴＵ；４３０．５ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．３７５ｍｌ、２．２６ｍｍｏｌ）で前活性化したＤＭＦ（３ｍｌ）中の、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（３３６．６ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）と反応させた。樹脂に結合したジペプチドをＦｍｏｃ脱保護し、次に、ＨＯＢｔ（１５３．２ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（４３０．５ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．３７５ｍｌ、２．２６ｍｍｏｌ）で前活性化したＤＭＦ（３ｍｌ）中の、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（７３５ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）と、室温で２時間反応させた。カップリングおよび脱保護反応を、カイザー試験を行ってモニタリングした（すなわち、Ｆｍｏｃ基の脱保護は、紫色の発色によって示される陽性カイザー試験をもたらし、一方カップリングの完了は、黄色で示されるネガティブ試験をもたらした）。樹脂結合トリペプチドをＦｍｏｃ脱保護した後、ＨＯＢｔ（１５３．２ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（４３０．５ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．３７５ｍｌ、２．２６ｍｍｏｌ）で前活性化したＤＭＦ（３ｍｌ）中のアジドリンカーＶＩＩＩｄ（３４３ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）で、Ｎ末端をアセチル化した。保護されたトリペプチド−リンカーを、ＤＣＭ（４ｍｌ）中の１％ＴＦＡで１０分間処理し、溶液をピリジン（１ｍｌ）を含む氷冷したフラスコに排出することによって、支持樹脂から切断した。脱保護ステップを４回繰り返した。合わせた溶液を乾燥させ、残渣をヘキサンで洗浄して、ＩＸｇを得た（３６０ｍｇ；２−クロロトリチル樹脂に関して収率７６．５％）[IXg : ESI-MS: calculated for C41H68N10O13S [M+H] + 941.5; [M+Na]+ 963.5. Found: 941.7, 963.7]。ＩＸｇ（１８０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を７−ＡＭＣ（３４ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（１．５ｍｌ）中のＬｙｓ ＣＯＯＨ基をＨＡＴＵ（８７ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．２ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）を用いて活性化することによって、コンジュゲートした。反応物を室温で一晩撹拌した。ＤＭＦを減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムでＤＣＭ中２〜１０％ＭｅＯＨを用いて精製して、ＩＸｈを得た（９７ｍｇ、収率４６％）。[IXg : ESI-MS: calculated for C51H75N11O14S [M+H]+ 1098.5; [M+Na]+ 1120.5. Found: 1098.7, 1120.7]。ＩＸｈ（６１ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）を、ＴＬＨＥ１（２０ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（２７ｍｇ）、ＤＩＰＥＡ（０．０７６ｍｌ、０．４６ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（２ｍｌ）と反応させた。混合物を室温で一晩撹拌した（３８ｍｇ、収率３９％）。[IXi: ESI-MS calculated for C71H99N13O18S [M-H]- 1452.7. Found: 1452.8]。ＩＸｈおよびＩＸｉの脱保護を、９５％ＴＦＡを用いて室温で２時間実施して、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＭＣＡおよびＣｏｎｊ１をそれぞれ得た（スキーム４）。
Arg-Gly-Lys-MCA: yield = 21 mg, HPLC (0-100% solv. B [Solv. A: 95% Water 5% Methanol 0.1% TFA; Solv. B: 95% Methanol 5% Water 0.1% TFA], tR (column) (C18) = 29.9 min; tR (C4) = 21.4 min; ESI-MS: Exact mass calcd for C33H51N11O9 [M+H]+ 746.4; [M+Na]+ 768.4. Found: 746.5, 768.7]. Conj1: yield = 8 mg, 20%; HPLC (0-100% solv. B [Solv. A: 95% Water 5% Methanol 0.1% TFA; Solv. B: 95% Methanol 5% Water 0.1% TFA], tR (column) (C18) = 32.8 min; tR (C4) = 26.5 min; ESI-MS: Exact mass calcd for C53H75N13O13 [M+H]+ 1102.6. Found: 1102.7]
スキーム５．ニューロテンシン（ＮＴ）、ＮＴ−リンカー、およびＣｏｎｊ２の合成。試薬および条件：ａ）Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂；ｂ）Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳ（すべてＬ−アミノ酸）;ｃ）リンカーＶＩＩＩｄ、ＨＡＴＵ、ＨＯＢｔ。ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、２４ｈ；ｄ）ＴＦＡ、フェノール、Ｈ２ＯおよびＴＩＳ（８８：５：５：２の比）３ｈ；ｅ）ＴＬＨＥ１、ＣｕＩ。アスコルビン酸ナトリウム、ＤＭＦ／ピペリジン（４：１）、１６ｈ。
ニューロテンシン（ＮＴ）の合成：ＮＴペプチドを、固相合成を用いた標準Ｆｍｏｃ／ｔＢｕプロトコルを用いて合成した。分取ＨＰＬＣによる精製によりＮＴを得た。NT: purified yield = 92 mg, 58%; (97% purity by HPLC): tR (column) (C18) = 21.8 min; tR (C4) = 16.3 min; ESI-MS: Exact mass calcd for C78H122N21O20 [M+H]+ 1672.9; [M+2H]2+ 837.0; [M+3H]3+ 558.3. Found: 1673.2, 837.5, 558.8。
ＮＴ−リンカーの合成：使用したＮＴペプチドは、ＮＴについて上記したのと同様の方法で、ただし、Ｎ末端においてピログルタミン酸の代わりにグルタミン酸を使用して、合成した。アジドＰＥＧ−リンカー（ＶＩＩＩｄ、１４１ｍｇ、０．５７１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３ｍｌ）中のＨＡＴＵ（１４１ｍｇ、０．５７１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（７７ｍｇ、０．５７１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１２６μＬ、０．７６ｍｍｏｌ）で活性化させ、次にＮＴ−コンジュゲート樹脂（０．１９ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を２０時間振とうした。次いで、生成物を樹脂から切断し、側鎖基の脱保護を、ＴＦＡ、フェノール、脱イオン水およびＴＩＳ（８８：５：５：２の比）を含む切断カクテルで処理することにより実施した。分取ＨＰＬＣによる精製により、ＮＴ−リンカーを得た。NT−Linker: purified yield = 170 mg, 47%; (99% purity by HPLC): tR (column) (C18) = 23.2 min; tR (C4) = 17.7 min; ESI-MS: Exact mass calcd for C87H139N24O25 [M+H]+ 1920.0; [M+2H]2+ 960.5; [M+3H]3+ 640.7. Found: 1920.2, 961.0, 641.0。
Ｃｏｎｊ２の合成：クリック（ＣｕＡＡＣ）反応を、ＮＴ−リンカー（１７．３ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ／ピペリジン（４：１）（０．５ｍｌ）中のＴＬＨＥ１（１０ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（８ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）、およびアスコルビン酸ナトリウム（８．４ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）と反応させることにより実施した。混合物を室温で１６時間振とうした。生成物（Ｃｏｎｊ２）を分取ＨＰＬＣで精製した。Conj2: purified yield = 4.5 mg, 22%; (99% purity by HPLC): tR (column) (C18) = 26 min; tR (C4) = 18.4 min; ESI-MS: Exact mass calcd for C107H163N26O29 [M+H]+ 2276.2; [M+2H]2+ 1139.1; [M+3H]3+ 759.7. Found: 1139.7, 760.1。
スキーム６．ＧｎＲＨ−リンカーおよびＣｏｎｊ３の合成。試薬および条件：ａ）Ｒｉｎｋアミド樹脂、ＤＩＰＥＡ、ＤＣＭ、１６ｈ；ｂ）Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳ（すべてＬ−アミノ酸）。ｃ）リンカーＶＩＩＩｄ、ＨＡＴＵ、ＨＯＢｔ。ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、２４ｈ；ｄ）ＴＬＨＥ１、ＣｕＩ。アスコルビン酸ナトリウム、ＤＭＦ／ピペリジン（４：１）、１６ｈ；ｅ）ＴＦＡ、フェノール、Ｈ２Ｏ、およびＴＩＳ（８８：５：５：２の比）３ｈ。
ＧｎＲＨの合成：ＧｎＲＨを、固相合成を用いた標準Ｆｍｏｃ／ｔＢｕプロトコルを用いて合成した。合成は、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（Novobiochem #855003、０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）上で行った。ＧｎＲＨデカペプチド合成が完了したら、それを樹脂から切断し、側鎖基の脱保護を、ＴＦＡ、フェノール、脱イオン水およびＴＩＳ（８８：５：５：２の比）を含有する切断カクテルで処理ことにより実施した。切断後、得られたペプチドを冷エーテル上に集めることによって沈殿させ、エーテルで再度洗浄した。次いで、沈殿物を遠心分離により分離し、水に溶解し、凍結乾燥させた。分取ＨＰＬＣで精製して、ＧｎＲＨを得た。GnRH: (98% purity by HPLC): tR (column) (C18) = 28.3 min; tR (C4) = 20.2 min; ESI-MS: Exact mass calcd for C55H75N17O13 [M+H]+ 1182.6; [M+2H]2+ 591.8. Found: 1182.9, 592.2。
ＧｎＲＨ−リンカーの合成：使用したＧｎＲＨペプチドは、ＧｎＲＨについて上に記載したのと同様の方法で、ただし、Ｎ末端でピログルタミン酸の代わりにグルタミン酸を使用して、合成した。アジドＰＥＧ−リンカー（２、１３０ｍｇ、０．５２６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中のＨＡＴＵ（１３０ｍｇ、０．５２６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（７１ｍｇ、０．５２６ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１１６μＬ、０．７０ｍｍｏｌ）で活性化させ、その後ＧｎＲＨコンジュゲート樹脂（０．１７５ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を２０時間振とうした。次いで、生成物を樹脂から切断し、側鎖基の脱保護を、ＴＦＡ、フェノール、脱イオン水およびＴＩＳ（８８：５：５：２の比）を含む切断カクテルで処理することにより実施した。切断後、得られたペプチドを冷エーテル上に集めることによって沈殿させ、エーテルで再度洗浄した。次いで、沈殿物を遠心分離により分離し、水に溶解し、凍結乾燥させた。分取ＨＰＬＣによる精製により、ＧｎＲＨ−リンカーを得た。GnRH−Linker: purified yield = 77 mg, 31%; (97% purity by HPLC): tR (column) (C18) = 33.8 min; tR (C4) = 26.2 min; ESI-MS: Exact mass calcd for C64H92N20O18 [M+H]+ 1429.6; [M+2H]2+ 715.3. Found: 1429.5, 715.6。
Ｃｏｎｊ３の合成。クリック（ＣｕＡＡＣ）反応を、樹脂結合ＧｎＲＮ−リンカー（０．０４４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ／ピペリジン（４：１）（０．５ｍｌ）中のＴＬＨＥ１（４７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（４２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、およびアスコルビン酸ナトリウム（４３．６ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）と反応させることにより、実施した。混合物を室温で１６時間振とうした。次に生成物を樹脂から切断し、側鎖基の脱保護を、ＴＦＡ、フェノール、脱イオン水およびＴＩＳ（８８：５：５：２の比）を含む切断カクテルで処理することにより実施した。切断後、得られたペプチドを冷エーテル上に集めることによって沈殿させ、エーテルで再度洗浄した。次いで、沈殿物を遠心分離により分離し、水に溶解し、凍結乾燥させた。分取ＨＰＬＣによる精製により、Ｃｏｎｊ３を得た。Conj3: purified yield = 19.6 mg, 25%; (95.3% purity by HPLC): tR (column) (C18) = 35.5 min; tR (C4) = 29.3 min; ESI-MS: Exact mass calcd for C84H116N22O22 [M+H]+ 1785.9; [M+2H]2+ 893.4. Found: 1786.0, 893.7。
スキーム７．ＧｎＲＨ−Ａ、ＧｎＲＨ−Ａ−リンカーおよびＣｏｎｊ４の合成。試薬および条件：ａ）Ｒｉｎｋアミド樹脂、ＤＩＰＥＡ、ＤＣＭ、１６ｈ；ｂ）Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳ（Ｄ−Ｌｙｓを除き、全てＬ−アミノ酸）。ｃ）ＴＦＡ、フェノール、Ｈ２ＯおよびＴＩＳ（８８：５：５：２の比）３ｈ；ｄ）リンカーＶＩＩＩｄ ＮＨＳ、トリエチルアミン、ＤＭＦ、２４ｈ；ｅ）ＧｎＲＨ−Ａ−リンカー、ＴＬＨＥ１、ＣｕＩ、アスコルビン酸ナトリウム、ＤＭＦ／ピペリジン（４：１）、１６ｈ。
ＧｎＲＨ−Ａの合成：ＧｎＲＨペプチドを、固相合成を用いた標準的なＦｍｏｃ／ｔＢｕプロトコルを用いて合成した。合成は、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（Novobiochem #855003、０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）上で行った。樹脂負荷ステップのために、樹脂（２５０ｍｇ、０．１７５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（２６０ｍｇ、０．８７５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（０．１３７ｍｌ、０．８７５ｍｍｏｌ）と反応させた。反応混合物を、室温で５時間振とうした。ペプチドの構築を、Ｆｍｏｃ保護（Ｌ）−アミノ酸モノマー（Ｄ−Ｌｙｓ６を除く）をｒｉｎｋアミド樹脂に、ＤＭＦ中でＤＩＣおよびＨＯＢＴを用いて２時間振とうしながら、カップリングさせることによって行った。ＧｎＲＨデカペプチド合成が完了したら、これを樹脂から切断し、側鎖基の脱保護を、ＴＦＡ、フェノール、脱イオン水およびＴＩＳ（８８：５：５：２の比）を含有する切断カクテルで処理することにより実施した。切断後、得られたペプチドを冷エーテル上に集めることによって沈殿させ、エーテルで再度洗浄した。次に、沈殿物を遠心分離により分離し、水に溶解し、凍結乾燥して、（Ｄ−Ｌｙｓ６）−ＧｎＲＨ（ＧｎＲＨ−Ａ）を得た。[D-Lys6]-GnRH (GnRH-A): purified yield = 133.7 mg, 61%; (97.9% purity by HPLC): tR (column) (C18) = 28.9 min; tR (C4) = 19.5 min; ESI-MS: Exact mass calcd for C59H84N18O13 [M+H]+ 1253.7; [M+2H]2+ 627.3. Found: 1253.9, 627.7。
ＧｎＲＨ−Ａ−リンカーの合成：アジドＰＥＧ−リンカー（ＶＩＩＩｄ、１１９ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＮＨＳ（７０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、およびＤＣＣ（ジクロロメタン中、６００μｌの１Ｍ溶液）で２０時間活性化させた。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーによる精製により、（２−ＮＨＳ）が得られ、これを直接使用した。リンカーを、ＤＭＦ（３ｍｌ）中のＶＩＩＩｄ−ＮＨＳ（１６５ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）およびトリメチルアミン（３７μＬ、０．２６ｍｍｏｌ）との反応により、ＧｎＲＨ−Ａ（３００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）中のリシンのε−アミノ基にコンジュゲートさせた。分取ＨＰＬＣによる精製により、ＧｎＲＨ−Ａ−リンカーを得た。GnRH-A−Linker: purified yield = 126 mg, 37%; (97.2% purity by HPLC): tR (column) (C18) = 33.9 min; tR (C4) = 26.5 min; ESI-MS: Exact mass calcd for C68H99N21O17 [M+H]+ 1482.7; [M+2H]2+ 741.8. Found: 1482.5, 742.1。
Ｃｏｎｊ４の合成：クリック（ＣｕＡＡＣ）反応を、ＧｎＲＨ−Ａ−リンカー（６０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ／ピペリジン（４：１）（０．５ｍｌ）中のＴＬＨＥ１（４３ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（３８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、およびアスコルビン酸ナトリウム（３９．６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）と反応させることにより、実施した。混合物を室温で１６時間振とうした。生成物（Ｃｏｎｊ４）を分取ＨＰＬＣで精製し、ＧｎＲＨ−Ａ−リンカーについて上記したように分析した。Conj4: purified yield = 24 mg, 34%; (98.1% purity by HPLC): tR (column) (C18) = 35.2 min; tR (C4) = 29.4 min; ESI-MS: Exact mass calcd for C88H125N23O21 [M+H]+ 1840.9; [M+2H]2+ 920.9. Found: 1839.3, 920.6。
ＴＬＨＥ１−小分子薬物コンジュゲート（Ｃｏｎｊ５）の合成：リンカー修飾ＳＮ−３８を、図１３に記載のように、ＴＬＨＥ１に結合させた。３ｍＬの無水ＤＣＭ中のＳＮ３８（Ｍｗｔ：３９２、４９．３６ｍｇ、.１２５９ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（１６５ｕＬ、１．３当量）および無水ピリジン（２５０ｕＬ、２４当量）を加えた。懸濁液を室温で一晩撹拌した。次いで溶液を濾過し、０．５ＮのＨＣｌ（３×１０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（１×１０ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、真空下で蒸発させてＶＩＩＩｅを得た（５１．７２ｍｇ、収率８３％）。ＭＳにより、［Ｍ＋Ｈ］＋：４９２を確認した。２ｍＬの無水ＤＣＭ中のＶＩＩＩｅ（Ｍｗｔ：４９２、４８．５ｍｇ、０．０９８５７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＥＧ−リンカー（３２．６６ｍｇ、１．３４当量）、ＥＤＣ（２９．５ｍｇ、１．５６当量）、ＤＭＡＰ（３．７ｍｇ、０．３１当量）を加え、３時間撹拌した。反応混合物を１％ＮａＨＣＯ３（２×１０ｍＬ）、水（１×１０ｍＬ）、および０．１ＮのＨＣｌ（２×１０ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、ＮａＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて、ＶＩＩＩｆを得た（Ｍｗｔ：７２１、３６ｍｇ、収率５０．６％）。ＭＳにより、［Ｍ＋Ｈ］＋：７２２．１を確認した。２ｍＬの無水ＴＨＦ中のＶＩＩＩｆ（Ｍｗｔ：７２１、１０ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）およびＴＬＨＥ１（Ｍｗｔ：３５６、５ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ２Ｏ（０．５ｍＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（０．８ｍｇ、０．３当量）および硫酸銅（０．３５ｍｇ、０．１当量）を加えた。溶液を真空下で十分に蒸発させ、分取ＨＰＬＣにより精製して、ＶＩＩＩｇを得た（１３ｍｇ、収率８６．６％）。ＭＳにより、［Ｍ＋Ｈ］＋：１０７８．５を確認した。ＶＩＩＩｇ（Ｍｗｔ：１０７８，１０ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）に、ＤＣＭ中の２０％ＴＦＡを加え、３時間撹拌した。次いで溶液を真空下で蒸発させて、Ｃｏｎｊ５を得た（８．５ｍｇ、収率９３．７％）。MS (ESI+) m/z: found for C51H59N7O13 [M + H]+: 978.4。
ＴＬＨＥ１−造影剤コンジュゲート（Ｃｏｎｊ６〜Ｃｏｎｊ１０）の化学合成：Ｃｏｎｊ６、Ｃｏｎｊ７、Ｃｏｎｊ８、Ｃｏｎｊ９、およびＣｏｎｊ１０（図１１）を、クリックケミストリーを用いて合成した。リンカー修飾された蛍光色素を、スキーム１に記載されているものと同様に、ＴＬＨＥ１に結合した（図１２）。溶液を真空下で蒸発させ、得られた混合物をＨＰＬＣで精製し、濃縮して最終生成物を得た。生成物をＥＳＩ質量分析によって確認した。Conj6: MS (ESI+) m/z: found for C44H43N7O9S [M + H]+: [M + H]+(846.2). Conj7: MS (ESI+) m/z: found for C50H53N7O11 [M + H]+: [M + H]+(928.3). Conj8: MS (ESI+) m/z: found for C48H47N7O11S [M + H]+: [M + H]+(930.3). Conj9: MS (ESI+) m/z: found for C54H63N8O9S [M + H]+: [M + H]+(999.4). Conj10: MS (ESI+) m/z: found for C69H85N8O18S4 [M + H]+: [M + H]+(1441.5)。

Claims (19)

  1. 送達システムにコンジュゲートしてコンジュゲート薬物を形成する薬物を含む、増強された活性剤であって、
    前記送達システムは、
    対象の血清中のトランスサイレチンに対して選択的であるリガンド；および、
    該リガンドを共有結合的に薬物に作動的に結合するように構成されたリンカーであって、コンジュゲート薬物として対象におけるトランスサイレチンからの薬物の放出を引き起こすように選択され、長さが１４Å〜２０Åの範囲である、前記リンカー；
    を含み、
    ここで、前記送達システムは、
    式中、
    ｎは、１〜８であり；
    Ｒ１およびＲ３は独立して、１〜４個の炭素原子を有する短鎖アルキルから選択され；
    Ｒ２は、水素、１〜４個の炭素原子を有する短鎖アルキル、およびアリールからなる群から選択され;
    Ｘａは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）、Ｏ、Ｎ−Ｒ５またはＳであり；式中Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、１〜４個の炭素原子を有するアルキル、置換アルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、アルコキシカルボニル、およびアミノから選択され；
    Ｒａは、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＲ７Ｒ８、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＯＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ９）ＣＯＯＨ、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシル、複素環式基、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、チオエステル、アルコキシカルボニル、または置換アルコキシカルボニルであり；
    Ｒｂは、Ｒａに対してオルトまたはメタに位置する、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮＲ７Ｒ８、テトラゾリル、ＣＯＮＨＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＯＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ９）ＣＯＯＨ、ＣＦ３、水素、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、カルボキシル、複素環式基、スルホンアミド、スルホニルフルオリド、エステル、チオエステル、エーテル、チオエーテル、トリアゾリル、アルコキシカルボニル、または置換アルコキシカルボニルを含むリンカーであり；
    Ｒ６は、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクリルであり；
    Ｒ７およびＲ８は、各々独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールであり；および、
    Ｒ９は、天然に存在するα−アミノカルボン酸の側鎖である；
    または、その薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アミド、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物もしくは溶媒和物、を含む構造を有する、
    前記増強された活性剤。
  2. 請求項１に記載の増強された活性剤であって、ここでリガンドは、化合物（ＶＩＩＩｃ）：
    またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物もしくは溶媒和物、の構造を有し；および、
    リンカーは、Ｃ１４のカルボキシル基に対してオルト位のＣ１５のリガンドに結合する、
    前記増強された活性剤。
  3. 請求項１に記載の増強された活性剤であって、ここでリガンドは、化合物（ＶＩＩＩｃ）：
    またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、アミド、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、水和物もしくは溶媒和物、の構造を有し；および、
    リンカーは、Ｃ１４のカルボキシ炭素に対してメタ位のＣ１６のリガンドに結合する、
    前記増強された活性剤。
  4. 薬物は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ウイルス様粒子、小分子、オリゴ糖、造影剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される構造を有する、請求項１に記載の増強された活性剤。
  5. 薬物は、送達システムにコンジュゲートした場合、血清において延長された半減期を有する、請求項１に記載の増強された活性剤。
  6. 薬物は、送達システムにコンジュゲートした場合、血清において低減された免疫原性を有する、請求項１に記載の増強された活性剤。
  7. 薬物は、送達システムにコンジュゲートした場合、血清において延長された半減期を有する、請求項２に記載の増強された活性剤。
  8. 薬物は、送達システムにコンジュゲートした場合、血清において低減された免疫原性を有する、請求項２に記載の増強された活性剤。
  9. 薬物は、送達システムにコンジュゲートした場合、血清において延長された半減期を有する、請求項３に記載の増強された活性剤。
  10. 薬物は、送達システムにコンジュゲートした場合、血清において低減された免疫原性を有する、請求項３に記載の増強された活性剤。
  11. リンカーＲｂは、（ｉ）エーテル結合を介してリガンドに結合し、および（ｉｉ）アミド結合を介して活性剤に結合する、請求項１に記載の増強された活性剤。
  12. リンカーＲｂは、（ｉ）エーテル結合を介してリガンドに結合し、および（ｉｉ）エステル結合を介して活性剤に結合する、請求項１に記載の増強された活性剤。
  13. リンカーＲｂは、（ｉ）エーテル結合を介してリガンドに結合し、および（ｉｉ）アミド結合またはエステル結合を介して活性剤に結合し；
    Ｒａはカルボキシ基であり；
    Ｒ１はメチル基であり；
    Ｒ２は水素であり；
    Ｒ３はメチル基であり；および
    活性剤はタンパク質またはペプチドである、
    請求項１に記載の増強された活性剤。
  14. 有効量の請求項１に記載の増強された活性剤を含む、固形腫瘍を処置するための医薬組成物であって、
    ここで、薬物は固形腫瘍の処置に有効である、
    前記医薬組成物。
  15. 固形腫瘍は結腸直腸癌である、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 固形腫瘍は乳癌である、請求項１４に記載の医薬組成物。
  17. 有効量の請求項１に記載の増強された活性剤を含む、液性腫瘍を処置するための医薬組成物であって、
    ここで、薬物は液性腫瘍の処置に有効である、
    前記医薬組成物。
  18. 液性腫瘍は白血病である、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 液性腫瘍はリンパ腫である、請求項１７に記載の医薬組成物。
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