KR20210119413A - 이중-리간드 약물 접합체 및 그의 용도 - Google Patents

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웨이 탄
지안 다이
쫑보 왕
시아오동 리우
신리 후
쉐위안 시에
준 샤오
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Abstract

페이로드 및 두 개의 표적화 분자를 포함하는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 또한, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 제약 조성물에 관한 것이다. 추가로, 페이로드를 필요한 개체에게 전달하기 위한 방법, 및 질환을 치료하기 위한 방법에 관한 것이고, 이러한 두 가지 방법 모두는 치료 유효량의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 제약 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

이중-리간드 약물 접합체 및 그의 용도
본 출원은 생의학 화학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 출원은 이중-리간드 약물 접합체, 이중-리간드 약물 접합체를 포함하는 제약 조성물, 이중-리간드 약물 접합체를 사용하여 페이로드의 전달을 필요로 하는 대상체에게 페이로드를 전달하기 위한 방법, 및 이중-리간드 약물 접합체로 질환을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 이환 세포 및 정상 세포의 병리학적 특징과 생리학적 특징 둘 모두는 유의하게 상이하며, 그 차이 중 하나는 이환 세포의 표면은 특정하거나 과다발현된 물질(예컨대, 항원, 화학적 신호, 수용체)을 갖지만, 정상 세포에서는 이들 물질이 존재하지 않거나 저-발현된다는 데 있다. 이를 기초로 하여, 항체-약물 접합체(ADC) 및 폴리펩티드-약물 접합체(PDC)가 질환의 치료를 위해 개발된다. 현재, 일부 ADC- 및 PDC-기반 약물이 시판되었거나 임상 연구에 들어갔지만; 이들 약물의 설계 원리로 인해 임상 적용에서 ADC- 및 PDC-기반 약물에 많은 제약이 있다.
ADC 개발은 ADC의 복잡성 및 비교적 큰 분자량으로 인해, 적합한 표적의 결여, 제조 상의 난관 및 불량한 약물 안정성을 포함하여 수많은 어려움에 직면해 있다. 현재, ADC는 주로 종양 치료 분야에 사용된다. 일부 경우에, 암 세포 표면 항원에 대한 표적화 항체의 친화도는 10-9-10-12(Kd, 몰/리터)에 이를 수 있다. 따라서, ADC는, 표적 세포에 대한 높은 특이성을 가질 때, 표적 세포와 동일한 표적화 수용체를 갖는 정상 세포에 대해서도 높은 특이성을 갖는다. 더욱이, ADC가 생체내에서 대사되는 데에는 오랜 시간(1주 내지 3주)이 걸릴 수 있으며, 그 동안에 ADC는 계속해서 정상 세포를 사멸시켜 유의하게 증가된 독성 및 부작용을 초래한다. 따라서, ADC는 종양 세포와 정상 세포 사이에 세포 표면 항원의 양의 차이가 매우 큰 것이 특징인 질환에 더 적절하다. 그러나, 당분야에 공지된 극소수의 질환이 이러한 엄격한 요건을 충족시킬 수 있다.
PDC는 임상 또는 전임상 연구에서 다양한 질환을 치료하는 데 사용되어 왔지만, 이러한 경우에는 화학요법제가 단순히 폴리펩티드에 연결되거나, 폴리펩티드가 화학요법 약물이 포함된 나노입자 또는 폴리머 물질에 첨가되는데, 이로 인해 대부분의 폴리펩티드가 이들의 큰 분자량 및 전하 보유로 인해 세포에 들어갈 수 없을 것이다. 따라서, 대부분의 PDC는 현재 세포외 치료에만 적합하며, PDC의 적용 범위 및 효능이 극히 제한적이다.
약물 접합체 화합물은 또한 리간드-약물 접합체(LDC)일 수 있으며, 여기서 리간드는 펩티드 또는 소분자일 수 있다. 그러나, LDC의 적용에는 생체이용률, 안정성, 효능, 독성 등의 측면에서 다양한 문제들이 있다. 예를 들어, 큰 분자량, 친유성 또는 다른 특성들로 인해, 다수 리간드들은 세포에 들어갈 수 없고, 이는 이들의 치료적 적용을 제한한다. 또한, 리간드가 통상적인 화학요법제(예컨대, 독소루비신 및 파클리탁셀)와 접합되는 경우에 효능은 일반적으로 낮고, 이들이 고도로 효과적인 약물 분자(예컨대, MMAE 및 DM1)와 접합되는 경우에는 리간드가 높은 독성을 일으켜, 심지어 종양 치료를 위한 치료 유효량이 달성되기 전에 동물을 중독시키고 심지어 사망을 초래할 수 있다.
따라서, 이환 세포의 표면 상에 광범위하게 존재하는 고도-발현된 수용체에 대하여 작용하고, 표적화 범위 및 치료 범위를 넓히고, 약물 효능을 향상시키고, 약물 부작용을 피할 수 있는, 개선된 LDC를 얻는 것이 또한 당분야에 시급히 필요하다.
일 양태에서, 본 출원은 페이로드 및 두 개의 표적화 분자를 포함하며, 여기서 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 전립선-특이적 막 항원 리간드 모이어티인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 개시한다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 페이로드 및 두 개의 표적화 분자를 포함하며, 여기서 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 하기 화학식 I으로 표현되는 리간드 모이어티인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 개시한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
또 다른 양태에서, 본 출원은 페이로드 및 두 개의 표적화 분자를 포함하며, 여기서 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 P10이고, 페이로드는 캄프토테신 또는 그의 임의의 유도체인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 개시한다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 전립선-특이적 막 항원 리간드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00002
.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 전립선-특이적 막 항원 리간드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00003
.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 전립선-특이적 막 항원 리간드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00004
.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 전립선-특이적 막 항원 리간드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00005
.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 두 개의 표적화 분자는 상이하다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 상승작용적 분자는 세포-상호작용 분자이다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 두 개의 표적화 분자는 상이한 세포 분자와 상호작용하는 세포-상호작용 분자이다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 상승작용적 분자는 세포내이입을 매개할 수 있는 세포내이입 분자이다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 상승작용적 분자는 FOLR1, TRPV6, FOLH1 (PMSA), GNRHR, Her2, Trop2, Her3, NECTIN4, LRP1, GLUT1, EGFR1, AXL, CA9, CD44, 클라우딘18.2, APN, DLL3, CEACAM5, FZD10, TFRC, MET, IGFR1, SSTR2, CCKBR, LFA1, ICAM, GPR87, GM-CSF, GM-CSFR, TIM3, TLR 패밀리, CD40, CD40L, OX40, OX40L, GITRL, GITR, 4-BBL, 4-1BB, CD70, CD27, ICOSL, ICOS, HHLA2, CD28, CD86/80, CD28, MHCII 항원, TCR, CTLA-4, CD155, CD122, CD113, IGIT, PD-L1, PD1, 갈렉틴-9, TIM-3, HVEM, BTLA, CD160, VISTA, B7-H4, B7-H3, 포스파티딜세린, HHLA2, LAG3, 갈렉틴-3, LILRB4, SIGLEC15, NKG2A, NKG2D, SLAMF7, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, FGFR1, FGFR2, FGFR4, NeuGcGM3 및 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 결합한다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 전립선-특이적 막 항원 리간드 모이어티 및 상승작용적 분자 모이어티를 포함하고, 여기서 상승작용적 분자 모이어티는 FOLR1, TRPV6, FOLH1(PMSA), SSTR2 및 GNRHR로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 결합한다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 화학식 I으로 표현된 리간드 모이어티 및 상승작용적 분자 모이어티를 포함하고, 여기서 상승작용적 분자 모이어티는 FOLR1, TRPV6, SSTR2 및 GNRHR로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 결합한다.
또 다른 일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 P10 및 상승작용적 분자 모이어티를 포함하고, 여기서 상승작용적 분자는 FOLR1, TRPV6, FOLH1(PMSA) 및 GNRHR로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 결합한다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 상승작용적 분자는 폴레이트 또는 그의 유사체이다. 일부 구현예에서, 폴레이트의 유사체는 5-메틸테트라히드로폴레이트, 5-포르밀테트라히드로폴레이트, 메토트렉세이트, 및 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 페이로드를 포함한다. 일부 구현예에서, 페이로드는 소분자 화합물, 뉴클레오티드, 펩티드, 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 페이로드는 소분자 화합물이다. 일부 구현예에서, 소분자 화합물은 캄프토테신 및 그의 임의의 유도체, 아우리스타틴 및 그의 임의의 유도체, 메이탄신 및 그의 임의의 유도체, 방사성핵종 착물, 시클로옥시게나제-2 억제제, 파클리탁셀 및 그의 임의의 유도체, 에포틸론 및 그의 임의의 유도체, 블레오마이신 및 그의 임의의 유도체, 닥티노마이신 및 그의 임의의 유도체, 플리카마이신 및 그의 임의의 유도체, 및 미토마이신 C로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 소분자 화합물은 캄프토테신 또는 그의 임의의 유도체, 아우리스타틴 또는 그의 임의의 유도체, 메이탄신 또는 그의 임의의 유도체, 방사성핵종 착물 또는 시클로옥시게나제-2 억제제이다.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 페이로드는 적어도 하나의 표적화 분자에 링커를 통해 연결된다.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 링커는 펩티드 링커, 디술피드 링커, pH-의존성 링커 또는 상기 언급된 링커들의 조합이다.
일부 구현예에서, 펩티드 링커는 특정 생리학적 환경 하에 프로테아제 절단 또는 환원에 의해 절단 가능하다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 시스테인, 리신, 리신-리신, 발린-시트룰린, 페닐알라닌-리신, 발린-리신, 시스테인-리신, 시스테인-글루탐산, 아스파르트산-아스파르트산, 및 아스파르트산-아스파르트산-리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 선택적으로, 상기 언급된 아미노산에서 카르복실산은 아미드화된다.
일부 구현예에서, 디술피드 링커는 DMDS, MDS, DSDM 및 NDMDS로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, pH-의존성 링커는 시스-아코니트산 무수물이다.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 링커는 하기 구조를 갖거나, 링커는 하기 언급되는 구조와 펩티드 링커의 조합이다:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 두 개의 표적화 분자는 스페이서를 통해 서로 연결된다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 스페이서는 SEQ ID NO: 1-14, Arg-Arg, Ala-Ser-Asn, Ala-Ala-Ala, Ser-Ser-Arg, Pro-Arg 및 Pro-Leu-Gly로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CB-20B이다:
Figure pct00009
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CB-20BK이다:
Figure pct00010
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CB-60S이다:
Figure pct00011
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CB-60SK이다:
Figure pct00012
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CB-20C이다:
Figure pct00013
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CB-1020이다:
Figure pct00014
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CB-1320이다:
Figure pct00015
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CB-1820이다:
Figure pct00016
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CR19428이다:
Figure pct00017
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 20R-SM09이다:
Figure pct00018
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CB-20R이다:
Figure pct00019
(상기 식에서, M은 방사성핵종임).
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CB-18G이다:
Figure pct00020
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CR19426이다:
Figure pct00021
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CB-10S이다:
Figure pct00022
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CR19425이다:
Figure pct00023
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일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 하기 구조식을 갖는 CB-50S이다:
Figure pct00024
.
또 다른 양태에서, 본 출원은 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 제약 조성물을 개시한다.
일부 구현예에서, 조성물은 정맥내로, 피하로, 경구로, 근육내로 또는 뇌실내로 투여된다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 페이로드의 전달을 필요로 하는 대상체에게 페이로드를 전달하기 위한 방법으로서, 본 출원의 치료 유효량의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 본 출원의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 개시한다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 대상체에서 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 본 출원의 치료 유효량의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 본 출원의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 개시한다.
일부 구현예에서, 본 출원의 대상체에서 질환을 치료하기 위한 방법은 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 제약 조성물과 조합하여 하나 이상의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 출원은 대상체에서 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에서 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 본 출원의 제약 조성물의 용도를 개시한다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 출원은 대상체에서 질환을 치료하기 위한 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 본 출원의 제약 조성물을 개시한다.
일부 구현예에서, 질환은 암, 면역 질환, 심혈관 질환, 대사 질환, 및 신경계 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 암은 전립선암, 유방암, 폐암, 신암, 백혈병, 난소암, 위암, 자궁암, 자궁내막 암종, 간암, 결장암, 갑상선암, 췌장암, 결장직장암, 식도암, 피부암, 림프종, 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역 질환은 자가면역 질환이다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환은 결합 조직 질환, 전신 경화증, 류마티스 관절염, 및 전신 홍반성 루푸스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 심혈관 질환은 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 심장 발작, 고혈압 심장 질환, 류마티스성 심장 질환, 심근병증, 부정맥, 및 선천성 심장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 대사 질환은 당뇨병, 통풍, 비만, 저혈당증, 고혈당증, 및 이상지혈증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 신경계 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 두부 손상, 다발성 경화증, 현기증, 혼수, 및 간질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 1a 내지 도 1o은 접합체 화합물 CB-20B, CB-20BK, CB-60S, CB-60SK, CB-20C, CB-1020, CB-1320, CB-1820, CR19428, 20R-SM09, CB-20R, CB-18G, CR19426, CB-10S, CR19425 및 CB-50S의 화학적 구조식을 나타낸 것이다.
도 2a는 시간 경과에 따른 상이한 세포(위에서 아래로: LNCaP 세포, SKOV3 세포, DU145 세포 및 NCI-H460 세포)에 의한 Cy5-pep-20BK 결합 및 세포내이입의 곡선을 나타낸 것이다. 도 2b는 시간 경과에 따른 상이한 세포(위에서 아래로: LNCaP 세포, SKOV3 세포, DU145 세포 및 NCI-H460 세포)에 의한 Cy5-pep-20AK 결합 및 세포내이입의 곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 시간 경과에 따른 상이한 세포에 의한 Cy5-FA 결합 및 세포내이입의 형광 이미지를 나타낸 것이고, 여기서 완전한 원으로 나타낸 형광은 세포 핵의 형광이고, 반점 패턴으로 분포된 형광은 Cy5-FA의 형광이다.
도 4a는 나타낸 바와 같은 종양 세포의 증폭에 대한 접합체 화합물 CB-20BK의 억제 활성을 나타낸 것이다. 도 4b는 나타낸 바와 같은 종양 세포의 증폭에 대한 접합체 화합물 CB-20B의 억제 활성을 나타낸 것이다. 도 4c는 나타낸 바와 같은 종양 세포의 증폭에 대한 접합체 화합물 CB-10S의 억제 활성을 나타낸 것이다. 도 4d는 나타낸 바와 같은 종양 세포의 증폭에 대한 접합체 화합물 CB-60S의 억제 활성을 나타낸 것이다. 도 4e는 나타낸 바와 같은 종양 세포의 증폭에 대한 접합체 화합물 CB-60SK의 억제 활성을 나타낸 것이다. 도 4f는 나타낸 바와 같은 종양 세포의 증폭에 대한 접합체 화합물 CB-18G의 억제 활성을 나타낸 것이다. 도 4g는 나타낸 바와 같은 종양 세포의 증폭에 대한 접합체 화합물 CB-50S의 억제 활성을 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5e는 마우스에서 접합체 화합물 CB-20BK의 종양 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6c는 마우스에서 접합체 화합물 CB-20B의 종양 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 도 7e는 마우스에서 접합체 화합물 CB-18G의 종양 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8b는 LU2505 폐암 모델 및 LU1206 폐암 모델의 종양 부피에 대한 주사용 CBP-1018의 효과를 나타낸 것이다.
다양한 양태 및 구현예가 본 출원에서 개시될 것이지만, 당업자라면 본 출원의 대상 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 양태 및 구현예에 대한 다양한 등가의 변화 및 변형을 이룰 수 있다는 것이 명백하다. 본 출원에 개시된 다양한 양태 및 구현예는 단지 설명하기 위한 것이며 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 진정한 범주는 첨부된 청구범위에 의해 나타내어진다. 본 출원에 인용된 모든 공개, 특허 또는 특허 출원은 그 전문이 참조로 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 과학 용어는 본 출원이 속하는 기술분야의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 용어 "어느 하나의"(또는 "어느 한"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 또한, 용어 "포함하다/포함하는", 및 "갖다/갖는"도 상호교환 가능하게 사용될 수 있다는 것이 주목되어야 한다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 용어 "유사체"는 구조적 유사체 및 기능적 유사체를 포함한다. 구조적 유사체는 하나 이상의 상이한 원자 또는 하나 이상의 상이한 작용기를 포함할 수 있는 유사한 화학적 구조를 갖는 부류의 화합물을 지칭한다. 기능적 유사체는 동일하거나 유사한 화학적, 생물학적 또는 약리학적 효과를 갖는 부류의 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 폴레이트의 유사체는 5-메틸테트라히드로폴레이트, 5-포르밀테트라히드로폴레이트, 메토트렉세이트, 및 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트를 포함한다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 용어 "유도체"는 하나 이상의 원자 또는 원자 기가 다른 원자 또는 원자 기로 치환된 모 화합물 분자로부터 유래된 비교적 복잡한 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 캄프토테신 유도체는 이리노테칸, SN-38, Dxd, 토포테칸, GI-147211C, 토포테칸, 9-아미노캄프토테신, 7-히드록시메틸 캄프토테신, 7-아미노메틸 캄프토테신, 10-히드록시캄프토테신, (20S)-캄프토테신, 9-니트로캄프토테신, 지마테칸, 카레니테신, 실라테칸, 루토테칸, 엑사테칸, 디플로모테칸, 벨로테칸, 루토테칸 및 S39625를 포함한다.
일 양태에서, 본 출원은 페이로드 및 두 개의 표적화 분자를 포함하며, 여기서 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 전립선-특이적 막 항원 리간드 모이어티인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 개시한다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 페이로드 및 두 개의 표적화 분자를 포함하며, 여기서 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 하기 화학식 I으로 표현되는 리간드 모이어티인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 개시한다:
[화학식 I]
Figure pct00025
.
또 다른 양태에서, 본 출원은 페이로드 및 두 개의 표적화 분자를 포함하며, 여기서 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 P10이고, 페이로드는 캄프토테신 또는 그의 임의의 유도체인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 개시한다.
본원에 사용된 용어 "페이로드"는 표적 세포 또는 조직으로 전달될 분자 또는 물질을 지칭한다. 제한 없이, 페이로드는 대상체에서의 질환의 진단, 치료 또는 예방에 사용하도록 의도된 임의의 분자 또는 물질일 수 있다. 일부 구현예에서, 페이로드는 약 5 kDa 이하의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 페이로드는 약 1.5 kDa 이하의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 페이로드는 적절한 약물 승인 및 등록 기관(예컨대, FDA, EMEA, 또는 NMPA)에 의해 사용이 안전하고 효과적인 것으로 간주된 약물 또는 진단 시약이다.
일부 구현예에서, 본 출원의 페이로드는 소분자 화합물, 뉴클레오티드(예컨대, DNA, 플라스미드 DNA, RNA, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 압타머), 펩티드, 또는 단백질(예를 들어, 효소)이다. 일부 구현예에서, 페이로드는 소분자 화합물이다.
일부 구현예에서, 본 출원의 페이로드는 다음을 포함하나, 이로 제한되지 않는다: 항암 약물, 방사성 물질, 비타민, 항-AIDS 약물, 항생제, 면역억제제, 항바이러스제, 효소 억제제, 신경독소, 오피오이드, 세포외 기질 상호작용 조절제, 혈관확장제, 항고혈압제, 최면제, 항히스타민, 항경련제, 근육이완제, 항-파킨슨 물질, 항경련제 및 근수축 억제용 약물, 구충제 및/또는 항원충제, 진통제, 해열제, 스테로이드성 또는 비스테로이드성 항염증 약물, 항혈관신생 인자, 항분비성 인자, 항응고제 및/또는 항혈전제, 국소 마취제, 프로스타글란딘, 항우울제, 항정신병제, 구토방지제, 또는 조영제.
일부 구현예에서, 본 출원의 페이로드는 본 출원의 접합체 화합물과 접합되기 전 유리 아미노 또는 카르복실 기를 갖고, 페이로드는 상기 언급된 아미노 또는 카르복실 기와 접합체 화합물의 상응하는 부분(예를 들어, 링커) 사이의 아실화 반응을 통해 접합체 화합물과 접합된다. 일부 구현예에서, 상기 언급된 유리 아미노 또는 카르복실 기에 대한 변형(예를 들어, 본 출원의 접합체 화합물과 접합함으로써)은 페이로드의 활성을 유의하게 감소시킬 수 있다(예를 들어, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%까지).
본원에 사용된 "소분자 화합물"은 약 2 kDa 이하의 분자량을 갖는 화합물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 소분자 화합물은 약 1.5 kDa 이하의 분자량을 갖는다. 일부 바람직한 구현예에서, 소분자 화합물은 약 1 kDa, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 또는 500 Da 이하의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 출원의 소분자 화합물은 캄프토테신 및 그의 임의의 유도체(예를 들어, SN38 또는 Dxd), 아우리스타틴 및 그의 임의의 유도체(예를 들어, MMAE 및 MMAF), 메이탄신 및 그의 임의의 유도체, 시클로옥시게나제-2 억제제(예를 들어, 셀레콕시브), 방사성핵종 착물, 파클리탁셀 및 그의 임의의 유도체, 에포틸론 및 그의 임의의 유도체, 블레오마이신 및 그의 임의의 유도체, 닥티노마이신 및 그의 임의의 유도체, 플리카마이신 및 그의 임의의 유도체, 및 미토마이신 C로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 소분자 화합물은 캄프토테신 또는 그의 임의의 유도체, 아우리스타틴 또는 그의 임의의 유도체, 방사성핵종 착물 또는 시클로옥시게나제-2 억제제이다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 소분자 화합물은 암을 완화시키거나 치료하기 위한 약물이다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 소분자 화합물은 자가면역 질환을 완화시키거나 치료하기 위한 약물이다.
본원에 사용된 용어 "캄프토테신"은 캄프토테카 아쿠미나타(Camptotheca acuminata)(니사나무과)로부터 주로 유래되고 강력한 항-종양 활성을 나타내는 세포독성 알카로이드를 지칭한다. 본 출원의 캄프토테신 및 그의 유도체는 이미 존재하거나 추후 생산될 캄프토테신 및 그의 유도체를 포함한다. 본 출원의 캄프토테신 및 그의 유도체는 다음을 포함하나, 이로 제한되지 않는다: 캄프토테신, 이리노테칸, SN-38, Dxd, 토포테칸, GI-147211C, 토포테칸, 9-아미노캄프토테신, 7-히드록시메틸 캄프토테신, 7-아미노메틸 캄프토테신, 10-히드록시캄프토테신, (20S)-캄프토테신, 9-니트로캄프토테신, 지마테칸, 카레니테신, 실라테칸, 루토테칸, 엑사테칸, 디플로모테칸, 벨로테칸, 루토테칸 및 S39625.
본원에 사용된 용어 "아우리스타틴 및 그의 임의의 유도체/아우리스타틴 또는 그의 임의의 유도체"는 천연 항-종양 산물, 아플리시아톡신 10, 및 일련의 그의 유도체를 지칭하고, 여기서 이러한 화합물은 세포에 강한 치사율을 갖는 분열기에 세포를 정지시키기 위해 미시적 자기-조립을 방해한다. 본 출원의 아우리스타틴 및 그의 임의의 유도체는 이미 존재하거나 추후 생산될 아우리스타틴 및 그의 임의의 유도체를 포함한다. 본 출원의 아우리스타틴 및 그의 유도체는 아우리스타틴, 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF), 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD), AFP 및 AFHPA를 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "시클로옥시게나제-2 억제제"는 특정 시클로옥시게나제-2 억제제의 부류이다. 시클로옥시게나제-2는 다양한 기전을 통해 악성 종양의 발달 및 침윤에 관여한다. 시클로옥시게나제-2 억제제는 종양 세포 이동 및 접착 및 혈관내 침윤을 억제함으로써 악성 종양의 발생 및 발달을 억제할 수 있다. 본 출원의 시클로옥시게나제-2 억제제는 이미 존재하거나 추후 생산될 시클로옥시게나제-2 억제제를 포함한다. 시클로옥시게나제-2 억제제는 셀레콕시브, 로페콕시브, 파레콕시브, 발데콕시브 및 에토리콕시브를 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "방사성핵종 착물"은 방사성핵종을 함유하는 특정 부류의 착물을 지칭하며, 여기서 착물 중의 킬레이팅제는 방사성핵종과 킬레이션되고, 표적 물질에 보다 안정하게 결합하는 연결부를 제공할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "방사성핵종"은 자발적으로 방사선(예컨대, 알파선, 베타선, 또는 감마선)을 방출할 수 있는 원소를 지칭한다. 본 출원의 방사성핵종은 이미 존재하거나 추후 생산될 치료 및 진단을 위한 모든 방사성핵종을 포함한다. 본 출원의 방사성핵종은 67Cu, 64Cu, 90Y, 109Pd, 111Ag, 149Pm, 153Sm, 165Ho, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 99mTc, 67Ga, 68Ga, 111In, 90Y, 177Lu, 186Re, 188Re, 197Au, 198Au, 199Au, 105Rh, 161Tb, 149Pm, 44Sc, 47Sc, 70As, 71As, 72As, 73As, 74As, 76As, 77As, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac, 117mSn, 67Ga, 201Tl, 123I, 131I, 160Gd, 148Nd, 89Sr 및 211At를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 킬레이팅제는 거대고리 킬레이팅제이다. 본 출원의 킬레이팅제는 H2dedpa, H4octapa, H2azapa, DTPA, CHX-A''-DTPA, DTPA-비스 무수물, 말레이미드-DTPA, DTPA(tBu)4, DiamSar CB-TE2A, 시클람, DO2A, DOTA, OTA-GA(tBu)4, 말레이미드-DOTA-GA, p-NCS-Bz-DOTA-GA, NH2-DOTA-GA, DOTA-GA 무수물, DOTA-트리스(tBu) 에스테르, 프로파르길-DOTA-트리스(tBu) 에스테르, DO3AM-아세트산, DO3AM-N-(2-아미노에틸)에탄아미드, DO3AtBu-N-(2-아미노에틸)에탄아미드, DOTA-디(tBu)에스테르, DOTA-트리스(tBu)에스테르 NHS 에스테르, DOTA-NHS 에스테르, 프로파르길-DOTA-트리스(tBu) 에스테르, DOTADOTA-GA 무수물, DOTA-GA(tBu)4, p-NCS-Bz-DOTA-GA, NH2-DOTA-GA, 말레이미드-DOTA-GA, AGuIX, Gado-H, 시클렌, DO2AtBu, DO3AtBu, DO3AEt, DO3AM, DOTAEt, DOTPrEt, 시스-글리옥살-시클렌, 모노-N-벤질-시클렌, 트랜스-N-디베닐-시클렌, TriBOC-시클렌, 모노-N-벤질-TACN, DiBOC-TACN, 가교-시클람(CB-시클람), (13)aneN4, TACN, TACN·3HCl, TACD, 모노-N-벤질-TACD, DiBOC-TACD, 1,7-디옥사-4,10-디아자시클로도데칸, C-메틸-에스테르-시클람, C-카르복실산-시클람, 트랜스-N-디메틸-시클람, TETRAM, TETAEt, TETAMEt2, TETAMMe2, TETAM, CPTA, CB-시클람 유도체, CB-TE2A, 메틸아미노-(13)aneN4, 비스-(13)aneN4, 옥소-(13)aneN4, 모노-N-벤질-(13)aneN4, TriBOC-(13)aneN4, TRITRAM, TRI3AEt, TRI3AtBu, TRITAM, TRITA, 모노-N-벤질-시클람, 포름알데하이드-시클람, 시스-글리옥살-시클람, 디옥소시클람, 옥소시클람, 트랜스-N-디벤질-시클람, TriBOC-시클람, DOTP, DOTMA, TETA, DOTAM, DiAmSar, CB-시클람, CB-TE2A, NOTA, NOTAM, NH2-NODA-GA, 아오오도-NODA-GA, NCS-MP-NODA, NH2-MPAA-NODA, NODA-GA(tBu)3, NODA-GA-NHS 에스테르, 말레이미드-NODA-GA, NOTA-NHS 에스테르, 말레이미드-NOTA, 프로파르길-NOTA(tBu)2, p-NCS-벤질-NODA-GA, NOTA(tBu)2, NCS-MP-NODA, NH2-MPAA-NODA, NH2-NODA-GA, 아이오도-NODA-GA 및 TACN을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 하나의 페이로드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 둘 이상의 페이로드를 포함한다. 예를 들어, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 초과의 페이로드를 포함한다. 다중 페이로드를 함유하는 접합체 화합물에서, 각각의 페이로드는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 페이로드 중 적어도 2개는 서로 상이하다.
본원에 사용된 용어 "표적화 분자"는 표적 부위, 표적 조직, 표적 기관, 표적 세포, 또는 표적 세포내 영역에 본 출원의 접합체 화합물을 표적화할 수 있는 임의의 분자 또는 모이어티를 지칭한다. 일부 구현예에서, 표적화 분자는 본 출원의 접합체 화합물이 비-표적 부위, 비-표적 조직, 비-표적 기관, 비-표적 세포 또는 비-표적 세포내 영역과 비교하여 표적 부위, 표적 기관, 표적 세포, 표적 세포내 영역에 더 많이, 예를 들어, 적어도 10% 초과, 20% 초과, 50% 초과, 80% 초과, 100% 초과, 150% 초과, 200% 초과, 300% 초과, 400% 초과, 500% 초과 등 더 많이 분포될 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 표적화 분자는 표적화 분자를 함유하는 접합체 화합물이, 표적화 분자를 함유하지 않는 접합체 화합물과 비교하여, 표적 부위, 표적 조직, 표적 기관, 표적 세포 또는 표적 세포내 영역에 더 많이, 예를 들어, 적어도 10% 초과, 20% 초과, 50% 초과, 80% 초과, 100% 초과, 150% 초과, 200% 초과, 300% 초과, 400% 초과, 500% 초과 등 더 많이 분포될 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 표적화 분자는 표적 분자에 특이적으로 결합하도록 이러한 표적화 분자를 함유하는 접합체 화합물을 촉발시키거나 촉진하고, 표적 세포에 의해 접합체 화합물의 세포내이입을 촉발시키거나 촉진하고, 표적 세포 주위에 풍부하도록 및/또는 표적 세포에 들어가도록 접합체 화합물을 촉발시키거나 촉진할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 적어도 두 개의 표적화 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물에 포함되는 둘 이상의 표적화 분자는 동일하거나 상이하다. 일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물에 포함되는 둘 이상의 표적화 분자의 적어도 두 개의 표적화 분자는 상이하다. 일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물에 포함되는 둘 이상의 표적화 분자는 모두 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물에 포함되는 둘 이상의 표적화 분자의 적어도 두 개의 표적화 분자는 상이한 세포 표면 단백질 또는 마커에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물에 포함되는 둘 이상의 표적화 분자는 상이한 세포 표면 단백질 또는 마커에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 적어도 두 개의 표적화 분자를 포함하고, 이 중 적어도 하나는 상승작용적 분자이다.
본원에 사용된 용어 "상승작용적 분자"는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 접합체 화합물을 더 잘 촉발시키거나 촉진시키고, 표적 세포에 의해 접합체 화합물의 세포내이입을 촉발시키거나 촉진시키고, 표적 세포에서 풍부해지도록 및/또는 표적 세포에 들어가도록 및/또는 접합체 화합물이 상이한 방식으로 표적 세포에 특이적으로 결합하고 유지되도록 접합체 화합물을 촉발시키거나 촉진시키기 위해 본 출원의 접합체 화합물에 포함되는 다른 표적화 분자와 상승작용적으로 작용할 수 있는 임의의 분자 또는 모이어티를 지칭한다. 일부 구현예에서, 상승작용적 분자는 본 출원의 접합체 화합물이 비-표적 부위, 비-표적 조직, 비-표적 기관, 비-표적 세포 또는 비-표적 세포내 영역과 비교하여 표적 부위, 표적 기관, 표적 세포, 표적 세포내 영역에 더 많이, 예를 들어, 적어도 10% 초과, 20% 초과, 50% 초과, 80% 초과, 100% 초과, 150% 초과, 200% 초과, 300% 초과, 400% 초과, 500% 초과 등으로 더 많이 분포될 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 상승작용적 분자는 상승작용적 분자를 함유하는 접합체 화합물이, 상승작용적 분자를 함유하지 않는 접합체 화합물과 비교하여, 표적 부위, 표적 조직, 표적 기관, 표적 세포 또는 표적 세포내 영역에 더 많이, 예를 들어, 적어도 10% 초과, 20% 초과, 50% 초과, 80% 초과, 100% 초과, 150% 초과, 200% 초과, 300% 초과, 400% 초과, 500% 초과 더 많이 분포될 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 상승작용적 분자는 상승작용적 분자를 함유하는 접합체 화합물이, 상승작용적 분자를 함유하지 않는 접합체 화합물과 비교하여 표적 세포에 더 높은 활성, 예를 들어, 적어도 10% 더 높은, 20% 더 높은, 50% 더 높은, 80% 더 높은, 100% 더 높은, 150% 더 높은, 200% 더 높은, 300% 더 높은, 400% 더 높은, 500% 등 더 높은 활성을 갖게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 출원의 상승작용적 분자는 세포-상호작용 분자이다.
본원에 사용된 용어 "세포-상호작용 분자"는 세포에 특이적으로 결합하도록 이러한 세포-상호작용 분자를 함유하는 접합체 화합물을 촉발시키거나 촉진시키고, 표적 세포에 의해 접합체 화합물의 세포내이입을 촉발시키거나 촉진시키고/촉진시키거나, 표적 세포 주위에 풍부해지도록 및/또는 표적 세포에 들어가도록 접합체 화합물을 촉발시키거나 촉진시키기 위해 표적 세포의 세포 표면 물질과 상호작용할 수 있는 분자를 지칭한다.
세포-상호작용 분자는 작은 화학 분자 또는 큰 생체분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포-상호작용 분자는 소분자 화합물 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 세포-상호작용 분자는 소분자 화합물, 또는 2개 내지 50개, 2개 내지 40개, 2개 내지 30개, 2개 내지 25개, 2개 내지 22개, 2개 내지 20개, 2개 내지 18개, 2개 내지 15개, 2개 내지 12개, 2개 내지 10개, 2개 내지 8개, 4개 내지 50개, 5개 내지 50개, 5개 내지 40개, 5개 내지 30개, 5개 내지 25개, 5개 내지 22개, 5개 내지 20개, 5개 내지 18개, 5개 내지 15개, 5개 내지 12개, 5개 내지 10개, 6개, 7개, 8개, 또는 9개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 표적화 분자는 세포 표면 수용체 또는 다른 분자에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 표적화 분자 중 적어도 하나는 세포 표면 수용체 또는 다른 분자에 결합할 수 있는 리간드이다.
본 출원의 리간드는 선택된 표적에 특이적 결합 친화도를 가질 수 있는 다양한 화학적 또는 생물학적 분자를 포함할 수 있고, 여기서 선택된 표적은, 예를 들어, 세포 표면 수용체, 세포 표면 항원, 세포, 조직, 기관 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는 표적 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질 또는 마커에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 출원의 리간드는 10-6-10-11 M(Kd 값)의 친화도로 세포 표면 단백질 또는 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 출원의 리간드는 적어도 10-7, 적어도 10-8 및 적어도 10-9 M(Kd 값)의 친화도로 세포 표면 단백질 또는 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 출원의 리간드는 적어도 10-6 M 미만, 적어도 10-7 M 미만 및 적어도 10-8 M 미만(Kd 값)의 친화도로 세포 표면 단백질 또는 마커에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 출원의 리간드는 특정 친화도로 세포 표면 단백질 또는 마커에 결합하고, 여기서 특정 친화도는 비-표적 세포 표면 단백질 또는 마커보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 8배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 그 초과인 표적 세포 표면 단백질 또는 마커에 대한 리간드의 친화도를 지칭한다. 일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어, 암 세포)에서 본 출원의 세포 표면 단백질 또는 마커의 발현은 정상 세포에서보다 유의하게 더 높다. 본원에 사용된 용어 "유의하게"는 통계적으로 유의한 차이, 또는 당업자에 의해 인식될 수 있는 유의한 차이를 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 출원의 세포 표면 단백질 또는 마커의 발현 수준은 정상 세포에서보다 표적 세포(예를 들어, 암 세포)에서 2배 내지 1,000,000배 더 높으며; 예를 들어, 정상 세포에서보다 표적 세포(예를 들어, 암 세포)에서 2배 내지 10배, 2배 내지 100배, 2배 내지 1,000배, 2배 내지 10,000배, 2배 내지 100,000배, 또는 2배 내지 1,000,000배(이러한 범위의 종점을 포함한, 상기 수치 범위 내의 임의의 값일 수 있음) 더 높다. 일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어, 암 세포)에서 세포 표면 수용체의 발현 수준은 정상 세포에서보다 적어도 10배 더 높거나, 100배 더 높거나, 1,000배 더 높거나, 10,000배 더 높거나, 100,000배 더 높다. 일부 구현예에서, 정상 세포 상의 세포 표면 수용체의 수준은 표적 세포(예를 들어, 암 세포) 상의 세포 표면 단백질 또는 마커의 수준과 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 감소된다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 세포 표면 단백질 또는 마커는 정상 세포 상에서 검출불가능하다.
일부 구현예에서, 본 출원의 세포 표면 단백질 또는 마커는 세포 표면 수용체이다.
일부 구현예에서, 본 출원의 세포 표면 수용체는 트랜스페린 수용체(TFR), 저밀도 지단백질 수용체(LDLR), 폴레이트 수용체(FR), 성장 호르몬-억제 호르몬 수용체, 요산 키나제 수용체, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), 인테그린 수용체(LFA-1), SST-14 수용체(SSTR2), GNRH 수용체(GNRHR), TRPV6 및 인테그린 α 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 출원의 세포 표면 단백질 또는 마커는 세포 표면 항원이다.
일부 구현예에서, 본 출원의 세포 표면 항원은 전립선-특이적 막 항원, MUC1 뮤신, 급성 림프모구성 공통 항원, Thy-1 세포 표면 항원, 멜란-A 단백질, 편평 세포 암종 항원, 갈렉틴 3 및 인간 백혈구 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 출원의 세포-상호작용 분자는 FOLR1, TRPV6, FOLH1(PMSA), GNRHR, Her2, Trop2, Her3, NECTIN4, LRP1, GLUT1, EGFR1, AXL, CA9, CD44, 클라우딘18.2, APN, DLL3, CEACAM5, FZD10, TFRC, MET, IGFR1, SSTR2, CCKBR, LFA1, ICAM, GPR87, GM-CSF, GM-CSFR, TIM3, TLR 패밀리, CD40, CD40L, OX40, OX40L, GITRL, GITR, 4-BBL, 4-1BB, CD70, CD27, ICOSL, ICOS, HHLA2, CD28, CD86/80, CD28, MHCII 항원, TCR, CTLA-4, CD155, CD122, CD113, IGIT, PD-L1, PD1, 갈렉틴-9, TIM-3, HVEM, BTLA, CD160, VISTA, B7-H4, B7-H3, 포스파티딜세린, HHLA2, LAG3, 갈렉틴-3, LILRB4, SIGLEC15, NKG2A, NKG2D, SLAMF7, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, FGFR1, FGFR2, FGFR4, NeuGcGM3 및 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 전립선-특이적 막 항원 리간드 모이어티 및 상승작용적 분자 모이어티를 포함하고, 여기서 상승작용적 분자 모이어티는 FOLR1, TRPV6, FOLH1(PMSA), SSTR2 및 GNRHR로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 화학식 I으로 표현된 리간드 모이어티 및 상승작용적 분자 모이어티를 포함하고, 여기서 상승작용적 분자 모이어티는 FOLR1, TRPV6, SSTR2 및 GNRHR로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 결합한다.
또 다른 일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 P10 및 상승작용적 분자 모이어티를 포함하고, 여기서 상승작용적 분자는 FOLR1, TRPV6, FOLH1(PMSA) 및 GNRHR로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에서 상승작용적 분자 중 하나는 세포내이입을 매개할 수 있는 세포내이입 분자 모이어티이다. 본원에 사용된 용어 "세포내이입 분자"는 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염이 표적 세포와 상호작용한 후에 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 표적 세포로의 세포내이입, 내재화 또는 흡수를 매개할 수 있다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "세포내이입 분자"는 표적 세포와 상호작용한 후에 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 표적 세포로의 세포내이입, 내재화 또는 흡수를 매개할 수 있는 분자를 지칭한다.
일부 구현예에서, 세포내이입 분자는 폴레이트 및 그의 유사체, 세포내이입을 매개할 수 있는 펩티드 및 세포-침투 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 출원의 세포내이입 분자는 폴레이트 또는 그의 유사체이다.
폴레이트는 그의 작은 분자량, 비면역원성 및 우수한 안정성으로 인해 다른 기와 화학 결합을 형성하는 데 있어서 유리하다. 폴레이트는 세포 표면 상에 발현된 폴레이트 수용체와 고친화도로 회합되어 폴레이트의 세포 흡수를 매개할 수 있다. 폴레이트 수용체는 대부분의 정상 세포에서 매우 낮은 수준으로 발현되지만, 수많은 암세포에서는 낮은 폴레이트 조건 하에 급속하게 분열하는 세포의 높은 폴레이트 요구량을 충족시키기 위해 높은 수준으로 발현된다(문헌[Kelemen LE, Int J Cancer, 2006; 119:243-50; Kane MA, et al., J Clin Invest. 1988; 81: 1398-406; Matsue H, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1992; 89: 6006-9; Zhao R, et al., Annu Rev Nutr . 2011; 31: 177-201] 참조). 폴레이트는 세포 표면 상의 폴레이트 수용체에 특이적으로 결합할 수 있으며, 또한 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 표적 세포로의 세포내이입을 매개할 수 있다.
일부 구현예에서, 폴레이트의 유사체는 5-메틸테트라히드로폴레이트, 5-포르밀테트라히드로폴레이트, 메토트렉세이트, 및 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 세포내이입 분자는 세포내이입을 매개할 수 있는 펩티드이다.
일부 구현예에서, 세포내이입을 매개할 수 있는 펩티드는 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 및 Arg-Gly-Asp(RGD라 명명됨) 및 SEQ ID NO: 16 내지 18 중 임의의 것에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 아미노산 서열 상동성을 갖는 상동 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상동 펩티드는 각각 SEQ ID NO: 16 내지 18에 나타낸 바와 같은 펩티드의 기능적 등가물이다.
일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 바와 같은 세포내이입을 매개할 수 있는 펩티드는 SEQ ID NO: 16 내지 20 및 RGD의 서열과 비교하여 단지 1개의 아미노산 부위에서 아미노산의 보존적 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 바와 같은 세포내이입을 매개할 수 있는 펩티드는 SEQ ID NO: 16 내지 20의 서열과 비교하여 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 부위에서 아미노산의 보존적 치환을 갖는다.
본 출원에 기재된 바와 같은 세포내이입을 매개할 수 있는 펩티드는 또한, 그의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 전제-조건에서, 예를 들어, β-루오로-알라닌, 1-메틸-히스티딘, γ-틸렌-글루탐산, α-틸-류신, 4,5-데히드로-리신, 히드록시프롤린, 3-플루오로-페닐알라닌, 3-아미노-티로신, 4-메틸-트립토판 등을 포함한 비-자연 발생 아미노산을 함유할 수 있다.
상동성의 백분율은 당분야에 널리 공지된 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열의 비교는 하기 공개적으로 이용 가능한 툴에 의해 달성될 수 있다: BLASTp 소프트웨어(국립 생물 정보 센터 (NCBI)의 웹사이트 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi로부터 이용 가능함, 또한 문헌[Altschul S.F. et al., J. Mol . Biol ., 215:403-410 (1990); Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)] 참조), ClustalW2(유럽 생물정보학 연구소의 웹사이트: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/로부터 이용 가능함, 또한 문헌[Higgins D.G. et al., Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. et al., Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007)] 참조), 및 Tcoffee(스웨덴 생물정보학 연구소의 웹사이트로부터 이용 가능함, 또한 문헌[Poirot O. et al., Nucleic Acids Res., 31(13): 3503-6 (2003); Notredame C. et al., J. Mol . Boil., 302(1): 205-17 (2000)] 참조). 서열의 정렬이 소프트웨어를 사용하여 수행되는 경우에, 소프트웨어에서 이용 가능한 디폴트 매개변수가 사용될 수 있거나, 달리 매개변수는 정렬 목적에 적합하게 사용자 정의될 수 있다. 이들은 모두 당업자의 지식 범주 내에 있다.
본원에 사용된 용어 "기능적 등가물"은 유도체 펩티드가 유래된 원래 펩티드 서열의 것과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 보유하는 유도체 펩티드를 지칭한다. 기능적 등가물은 천연 유도체일 수 있거나 또는 합성적으로 제조된다. 예시적인 기능적 등가물은 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 단 펩티드의 생물학적 활성은 보존된다. 치환을 위해 사용되는 아미노산은 바람직하게는 치환될 아미노산의 것과 유사한 화학-물리적 특성을 갖는다. 바람직한 유사한 화학-물리적 특성은 전하, 벌크성, 소수성, 친수성 등에서의 유사성을 포함한다.
일부 구현예에서, 기능적 등가물은 아미노산 잔기의 보존적 치환을 포함한다. 아미노산 잔기의 보존적 치환은 유사한 특성을 갖는 아미노산 사이의 치환, 예를 들어, 극성 아미노산 사이의 치환(예컨대, 글루타민과 아스파라긴 사이의 치환), 소수성 아미노산 사이의 치환(예컨대, 류신, 이소류신, 메티오닌 및 발린 중에서의 치환), 동일한 전하를 갖는 아미노산 사이의 치환(예컨대, 아르기닌, 리신 및 히스티딘 중에서의 치환, 또는 글루탐산과 아스파르트산 사이의 치환) 등을 지칭한다.
일부 구현예에서, 세포내이입 분자는 세포-침투 펩티드이다. 단백질 전달 도메인(PTD)이라고도 공지된, 세포-침투 펩티드(CPP)는 수용체-비의존성 방식으로 세포의 내부에 접근하는 능력을 갖는 짧은 펩티드(일반적으로 40개 미만의 아미노산)이다. 세포-침투 펩티드는, 페이로드와 접합 시, 페이로드의 막관통 수송을 매개할 수 있으며, 단백질 전달 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 바와 같은 세포-침투 펩티드는 종양-지향성 펩티드, 미토콘드리아 침투 펩티드, 활성화 가능한 세포-침투 펩티드, 및 항박테리아 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포-침투 펩티드는 SEQ ID NO: 19(RRRRRRRRR, R9라 명명됨) 및 SEQ ID NO: 20(Tat 펩티드인 GRKKRRQRRRPPQ, 즉, 전사 단백질의 HIV 전사활성인자의 세포-침투 펩티드)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에서 하나의 표적화 분자는 전립선-특이적 막 항원 리간드 모이어티이다.
본원에 사용된 용어 "전립선-특이적 막 항원"은 전립선 상피 세포의 막에 존재하고, 세포내 영역에 19개의 아미노산, 막관통 영역에서 24개 아미노산 및 세포외 영역에서 707개 아미노산을 포함하여 750개 아미노산으로 이루어지는 II형 막관통 당단백질을 지칭한다. 전립선-특이적 막 항원은 정상 전립선 상피 세포에서 발현되지만, 전립선 암 세포에서 훨씬 더 높은 수준으로 발현된다. 임상 검출에 사용되는 전형적인 전립선-특이적 항원과 비교하여, 전립선-특이적 막 항원은 보다 민감하고, 특이적 전립선 암 종양 마커이며, 특히, 호르몬-불응성 전립선 암과 전립선 암 전이성 병변 둘 모두에서 고도로 발현되며, 전립선 암을 다른 유형의 악성 종양과 구별하는 데 높은 민감도 및 특이성을 갖는다. 더욱이, 다양한 비전립선 고형 종양(예컨대, 폐암, 방광암, 위암, 췌장암, 신장암 및 결장직장암)에서, 전립선-특이적 막 항원은 또한 종양 혈관 내피 세포에서 고도로 그리고 특이적으로 발현된다.
본원에 사용된 용어 "전립선-특이적 막 항원 리간드"는 전립선-특이적 막 항원을 특이적으로 인식하고 이에 결합할 수 있는 항체, 압타머 및 소분자를 지칭한다. 본 출원의 전립선-특이적 막 항원 리간드는 이미 존재하거나 추후 생산될 전립선-특이적 막 항원 리간드, 뿐만 아니라 상기 언급된 리간드의 단편(이들 단편이 전립선-특이적 막 항원에 결합하는 능력을 여전히 보유하는 한)을 포함한다. 항체 리간드는 단클론성 항체 J591, J533, J415 및 E99를 포함하나, 이로 제한되지 않는 가장 일반적인 전립선-특이적 막 항원 리간드이다(예를 들어, 문헌[Liu H, Rajasekaran AK, Moy P et al. Constitutive and antibody-induced internalization of prostate-specific memberane antigen [J]. Cancer Res, 1998, 58 (18): 4055-4060] 참조). 압타머는 기하급수적 풍부 리간드 시스템에 의해 기술적 스크리닝을 통해 얻어지는 단일-가닥 DNA 또는 RNA이고, 고친화도 및 고특이성으로 전립선-특이적 막 항원에 결합할 수 있다. 이러한 전립선-특이적 막 항원 리간드는 xPSM-A10 압타머 및 그의 유도체 및 xPSM-A9 압타머 및 그의 유도체를 포함하나, 이로 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌[Lupoid SE et al., Identification and Characterization of nuclease-stabilized RNA molecules that bind human prostate cancer cells via the prostate-specific membrane antigen, Cncer Res, 2002, 62(14):4029-4033] 참조). 항체 리간드 및 압타머 리간드와 비교하여, 전립선-특이적 막 항원 소분자 리간드는 저분자량, 높은 투과성, 저면역원성, 및 합성 용이성의 이점들을 갖고, 글루타민 우레아 소분자 리간드 및 포스포르아미데이트 소분자 리간드를 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 출원의 전립선-특이적 막 항원 소분자 리간드는 2-[[메틸히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[에틸히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[프로필히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[부틸히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[시클로헥실히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[페닐히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[2-(테트라히드로푸라닐)히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[(2-테트라히드로피라닐)히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[((4-피리딜)메틸)히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[((2-피리딜)메틸)히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[(페닐메틸)히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[((2-페닐에틸)메틸)히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[((3-페닐프로필)메틸)히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[((3-페닐부틸)메틸)히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[((2-페닐부틸)메틸)히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[(4-페닐부틸)히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 및 2-[[(아미노메틸)히드록시포스피닐]메틸]글루타르산; 2-[[메틸 히드록시포스피닐]옥시]글루타르산; 2-[[에틸 히드록시포스피닐]옥시]글루타르산; 2-[[프로필 히드록시포스피닐]옥시]글루타르산; 2-[[부틸 히드록시포스피닐]옥시]글루타르산; 2-[[페닐 히드록시포스피닐]옥시]글루타르산; 2-[[((4-피리딜)메틸)히드록시포스피닐]옥시]글루타르산; 2-[[((2-피리딜)메틸)히드록시포스피닐]옥시]글루타르산; 2-[[(페닐메틸)히드록시포스피닐]옥시]글루타르산; 및 2[[((2-페닐에틸)메틸)히드록시포스피닐]옥시]글루타르산; 2-[[(n-히드록실)카르바모일]메틸]글루타르산; 2-[[(n-히드록실-n-메틸)카르바모일]메틸]글루타르산; 2-[[(n-부틸-n-히드록실)카르바모일]메틸]글루타르산; 2-[[(n-벤질-n-히드록실)카르바모일]메틸]글루타르산; 2-[[(n-히드록실-n-페닐)카르바모일]메틸]글루타르산; 2-[[(n-히드록실-n-2-페닐에틸)카르바모일]메틸]글루타르산; 2-[[(n-에틸-n-히드록실)카르바모일]메틸]글루타르산; 2-[[(n-히드록실-n-프로필)카르바모일]메틸]글루타르산; 2-[[(n-히드록실-n-3-페닐프로필)카르바모일]메틸]글루타르산; 2-[[(n-히드록실-n-4-피리딜)카르바모일]메틸]글루타르산; 2-[[(n-히드록실)아미드]메틸]글루타르산; 2-[[n-히드록실(메틸)아미드]메틸]글루타르산; 2-[[n-히드록실(벤질)아미드]메틸]글루타르산; 2-[[n-히드록실(페닐)아미드]메틸]글루타르산; 2-[[n-히드록실(2-페닐에틸)아미드]메틸]글루타르산; 2-[[n-히드록실(에틸)아미드]메틸]글루타르산; 2-[[n-히드록실(프로필)아미드]메틸]글루타르산; 2-[[n-히드록실(3-페닐프로필)아미드]메틸]글루타르산; 및 2-[[n-히드록실(4-피리딜)아미드]메틸]글루타르산; 2-[(티오닐)메틸]글루타르산; 2-[(메틸티오닐)메틸]글루타르산; 2-[(에틸티오닐)메틸]글루타르산; 2-[(프로필티오닐)메틸]글루타르산; 2-[(부틸티오닐)메틸]글루타르산; 2-[(페닐티오닐]메틸]글루타르산; 2-[[(2-페닐에틸)티오닐]메틸]글루타르산; 2-[[(3-페닐프로필)티오닐]메틸]글루타르산; 2-[[(4-피리딜)티오닐]메틸]글루타르산; 2-[(벤질티오닐)메틸]글루타르산; 2-[(술포닐)메틸]글루타르산; 2-[(메틸술포닐)메틸]글루타르산; 2-[(에틸술포닐)메틸]글루타르산; 2-[(프로필술포닐)메틸]글루타르산; 2-[(부틸술포닐)메틸]글루타르산; 2-[(페닐술포닐]메틸]글루타르산; 2-[[(2-페닐에틸)술포닐]메틸]글루타르산; 2-[[(3-페닐프로필)술포닐]메틸]글루타르산; 2-[[(4-피리딜)술포닐]메틸]글루타르산; 2-[(벤질술포닐)메틸]글루타르산; 2-[(술폭시미닐)메틸]글루타르산; 2-[(메틸술폭시미닐)메틸]글루타르산; 2-[(에틸술폭시미닐)메틸]글루타르산; 2-[(프로필술폭시미닐)메틸]글루타르산; 2-[(부틸술폭시미닐)메틸]글루타르산; 2-[(페닐술폭시미닐]메틸]글루타르산; 2-[[(2-페닐에틸)술폭시미닐]메틸]글루타르산; 2-[[(3-페닐프로필)술폭시미닐]메틸]글루타르산; 2-[[(4-피리딜)술폭시미닐]메틸]글루타르산; 및 2-[(벤질술폭시미닐)메틸]글루타르산; n-[메틸 히드록시포스피닐]글루탐산; n-[에틸 히드록시포스피닐]글루탐산; n-[프로필 히드록시포스피닐]글루탐산; n-[부틸 히드록시포스피닐]글루탐산; n-[페닐 히드록시포스피닐]글루탐산; n-[(페닐메틸)히드록시포스피닐]글루탐산; n-[((2-페닐에틸)메틸)히드록시포스피닐]글루탐산; 및 N-메틸-N-[페닐히드록시포스피닐]글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 출원의 전립선-특이적 막 항원 리간드는 또한 PCT 출원 제WO 2010/108125호 및 제WO 2006/093991호에 개시된 모든 전립선-특이적 막 항원 소분자 리간드를 포함하고, 상기 언급된 두 특허 출원은 그 전문이 본원에 포함된다.
일부 구현예에서, 본 출원의 전립선-특이적 막 항원 소분자 리간드는 글루타르산 유도체이다. 일부 구현예에서, 본 출원의 전립선-특이적 막 항원 소분자 리간드는 글루타르산의 아미노카르보닐 유도체이다.
일부 구현예에서, 본 출원의 전립선-특이적 막 항원 소분자 리간드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00026
.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 전립선-특이적 막 항원 리간드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00027
.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 전립선-특이적 막 항원 리간드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00028
.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 전립선-특이적 막 항원 리간드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00029
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일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 포함되는 전립선-특이적 막 항원 리간드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00030
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에서 하나의 표적화 분자는 하기 화학식 I으로 표현되는 리간드 모이어티 또는 이에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85% 또는 적어도 90% 아미노산 서열 상동성을 갖거나 이와 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 치환)을 갖는 리간드 모이어티이다:
[화학식 I]
Figure pct00031
.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에서 하나의 표적화 분자는 P10 또는 이에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 또는 적어도 93% 아미노산 서열 상동성을 갖거나 이와 최대 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 치환)을 갖는 리간드 모이어티이다.
본원에 사용된 용어 "P10"은 아미노산 서열 Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg를 갖는 펩티드를 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 (1) 폴레이트 리간드 및 전립선-특이적 막 항원 리간드; (2) TRPV6 리간드 및 전립선-특이적 막 항원 리간드; (3) GNRHR 리간드 및 전립선-특이적 막 항원 리간드; (4) SSTR2 리간드 및 전립선-특이적 막 항원 리간드; (5) 폴레이트 리간드 및 SSTR2 리간드; 또는 (6) TRPV6 리간드 및 폴레이트 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 분자를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에서 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 전립선-특이적 막 항원 리간드 모이어티이다. 일부 구현예에서, 상승작용적 분자는 세포내이입을 매개할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에서 두 개의 표적화 분자는 각각 폴레이트 또는 그의 유사체 및 전립선-특이적 막 항원 리간드 모이어티이다. 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 종래 기술의 리간드 조합보다 우수한 안정성을 갖는 특이적 폴레이트 또는 그의 유사체 및 전립선-특이적 막 항원 리간드 모이어티가 선택된다.
일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에서 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 화학식 I으로 표현되는 리간드 모이어티이다. 일부 구현예에서, 상승작용적 분자는 세포내이입을 매개할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에서 두 개의 표적화 분자는 각각 폴레이트 또는 그의 유사체 및 화학식 I으로 표현되는 리간드 모이어티이다.
일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에서 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 P10이다. 일부 구현예에서, 상승작용적 분자는 세포내이입을 매개할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에서 두 개의 표적화 분자는 각각 폴레이트 또는 그의 유사체 및 P10이다.
일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물은 단지 두 개의 표적화 분자와 접합된 단일 페이로드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물은 두 개의 표적화 분자와 접합된 다중 페이로드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "접합된"은 2개의 화학적 기의 공유 결합을 통해, 직접적으로 2개의 화학적 기 사이에 공유 결합을 형성하거나, 간접적으로 링커를 통해 2개의 화학적 기를 연결하는 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 페이로드(들)(예를 들어, 1개의 페이로드) 및 두 개의 표적화 분자를 포함하고, 여기서 페이로드는 직접적으로 표적화 분자 중 적어도 1개에 공유 연결된다. 일부 구현예에서, 페이로드는 직접적으로 두 개의 표적화 분자에 공유 연결된다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 페이로드(들)(예를 들어, 1개의 페이로드) 및 2개의 표적화 분자를 포함하고, 여기서 페이로드는 링커를 통해 표적화 분자 중 적어도 1개에 공유 연결된다. 일부 구현예에서, 페이로드는 링커를 통해 두 개의 표적화 분자에 공유 연결된다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 페이로드를 표적화 분자에 공유 연결하는 분자 또는 모이어티를 지칭한다. 링커는 페이로드를 적어도 하나의 표적화 분자에 연결하기 위한 작용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 작용기는 2개의 반응성 모이어티를 포함할 수 있으며, 그 중 하나는 페이로드에의 연결을 위한 것이고, 다른 하나는 표적화 분자에의 연결을 위한 것이다. 일부 구현예에서, 작용기는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 작용기는 티올-반응 모이어티 및 아민-반응 모이어티를 함유하는 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 작용기는 서로 동일하다. 일부 구현예에서, 작용기는 말레이미드 기이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산을 함유한다. 일부 구현예에서, 링커에 함유된 아미노산에서 카르복실산은 아미드화된다. 일부 구현예에서, 링커는 단쇄 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, 2개 내지 10개, 2개 내지 8개, 3개 내지 8개, 4개 내지 8개, 4개 내지 7개, 4개 내지 6개, 또는 5개의 반복 단위 포함)을 함유한다.
일부 구현예에서, 본 출원의 링커는 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과)의 페이로드 및 적어도 하나의 표적화 분자에 결합할 수 있는 다가 링커이다. 다가 링커에 결합된 페이로드는 동일하거나 상이할 수 있고, 다가 링커에 결합된 표적화 분자는 동일하거나 상이할 수 있다.
일 양태에서, 링커는 표적 세포 또는 조직으로 전달되는 페이로드의 유효량을 증가시키고 독성을 방지하기 위해 혈액 순환 동안에는 페이로드의 의도하지 않은 방출을 방지하기에 충분히 안정할 것이다. 또 다른 양태에서, 링커는 표적 세포를 효율적으로 사멸시키거나 또는 표적 세포의 기능을 차단하기 위해 표적 세포 주위에 또는 그 안에 페이로드를 방출할 수 있을 것이다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 1개의 절단 가능한 작용기를 포함한다. 바람직하게는, 절단 가능한 작용기는 표적 세포 외부에서는 충분히 안정하지만, 표적 세포에 들어가면 절단되어 페이로드(들)를 방출한다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 작용기는 혈액 또는 혈청에서보다 표적 세포에서 적어도 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 또는 그 보다 더 효율적으로 절단된다.
절단 가능한 링커는 가수분해, 효소적 반응 또는 환원 반응에 의해, 또는 pH 변화에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 특정 생리학적 환경 하에(예를 들어, 적절한 pH 환경 하에) 절단 가능하다. 일부 구현예에서, 링커는 약 6.5 이하의 pH를 갖는 산성 환경에서, 또는 효소와 같은 작용제에 의해 절단 가능하다. 일부 구현예에서, 링커는 절단 작용제, 예를 들어 pH, 산화환원 전위 또는 분해성 분자의 존재에 민감하다.
일부 구현예에서, 링커는 절단 불가능하다. 본원에 사용된 바와 같은 절단 불가능한 링커는 세포내 대사 동안 기본적으로 무손상으로 남아 있는 링커를 지칭한다.
일부 구현예에서, 링커는 펩티드 결합에 의해 연결된 직쇄 또는 분지쇄 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커이다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 표적 세포 주위에서 또는 그 안에서 고도로 또는 특이적으로 발현되는 프로테아제, 예를 들어 리소솜 또는 엔도솜 내 카텝신 B에 의해 절단 가능하다. 본원에 사용된 바와 같은 펩티드 링커는 다양한 길이를 가질 수 있다. 전형적으로, 본 출원의 펩티드 링커는 1개 내지 50개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 1개 내지 45개, 1개 내지 40개, 1개 내지 35개, 1개 내지 30개, 1개 내지 25개, 1개 내지 20개, 1개 내지 15개, 1개 내지 10개, 1개 내지 9개, 1개 내지 8개, 1개 내지 7개, 1개 내지 6개, 1개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 1개 내지 2개 또는 1개 아미노산의 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 2개 내지 45개, 2개 내지 40개, 2개 내지 35개, 2개 내지 30개, 2개 내지 25개, 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 2개 내지 9개, 2개 내지 8개, 2개 내지 7개, 2개 내지 6개, 2개 내지 5개, 2개 내지 4개, 2개 내지 3개, 또는 2개 아미노산의 길이이다. 본 출원에 기재된 바와 같은 펩티드 링커의 아미노산 수는 이러한 범위의 종점을 포함한, 상기 수치 범위 내의 임의의 정수 값일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 2개, 3개, 4개 또는 5개 아미노산 길이인 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 시스테인, 리신, 리신-리신, 발린-시트룰린, 페닐알라닌-리신, 발린-리신, 시스테인-리신, 시스테인-글루탐산, 아스파르트산-아스파르트산, 및 아스파르트산-아스파르트산-리신이고, 선택적으로, 상기 언급된 아미노산에서 카르복실산은 아미드화된다.
일부 구현예에서, 링커는 디술피드 결합을 함유하는 디술피드 링커이다. 디술피드 결합은 세포내 환원성 환경 하에 절단될 수 있고, 반면 순환계에서는 안정한 상태를 유지한다. 본 출원의 디술피드 링커는 DSDM, DMDS, MDS, 또는 NDMDS일 수 있다. 이들 디술피드 링커의 구조는 하기 표 1에 제시되어 있다.
[표 1]
Figure pct00032
일부 구현예에서, 링커는 pH-의존성 링커이다. 본 출원에 기재된 바와 같은 PH-의존성 링커는 특정 pH 환경 하에 절단 가능하다. 일부 구현예에서, pH-의존성 링커는 알칼리성 조건 하에 안정할 수 있고, 반면 산성 조건, 예를 들어 6.5 이하의 pH 값 하에서는 절단 가능하다. 일부 구현예에서, pH-의존성 링커는 시스-아코니트산 무수물이다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 링커는 하기 구조 또는 하기 언급되는 구조의 조합 및 펩티드 링커(예를 들어, 1개 내지 3개의 아미노산을 함유하는 펩티드 링커를 통해 표적화 분자에 결합하는)이다:
Figure pct00033
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일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 링커는 하기 구조 또는 하기 언급되는 구조와 펩티드 링커의 조합(예를 들어, 1개 내지 3개의 아미노산을 함유하는 펩티드 링커를 통해 표적화 분자에 결합하는)을 갖는다:
Figure pct00034
.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 링커는 하기 구조 또는 하기 언급되는 구조와 펩티드 링커의 조합(예를 들어, 1개 내지 3개의 아미노산을 함유하는 펩티드 링커를 통해 표적화 분자에 결합하는)을 갖는다:
Figure pct00035
.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 링커는 하기 구조 또는 하기 언급되는 구조와 펩티드 링커의 조합(예를 들어, 1개 내지 3개의 아미노산을 함유하는 펩티드 링커를 통해 표적화 분자에 결합하는)을 갖는다:
Figure pct00036
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일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 링커는 하기 구조 또는 하기 언급되는 구조와 펩티드 링커의 조합(예를 들어, 1개 내지 3개의 아미노산을 함유하는 펩티드 링커를 통해 표적화 분자에 결합하는)을 갖는다:
Figure pct00037
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일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 링커는 하기 구조 또는 하기 언급되는 구조와 펩티드 링커의 조합(예를 들어, 1개 내지 3개의 아미노산을 함유하는 펩티드 링커를 통해 표적화 분자에 결합하는)을 갖는다:
Figure pct00038
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일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 링커는 하기 구조 또는 하기 언급되는 구조와 펩티드 링커의 조합(예를 들어, 1개 내지 3개의 아미노산을 함유하는 펩티드 링커를 통해 표적화 분자에 결합하는)을 갖는다:
Figure pct00039
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일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 링커는 하기 구조 또는 하기 언급되는 구조와 펩티드 링커의 조합(예를 들어, 1개 내지 3개의 아미노산을 함유하는 펩티드 링커를 통해 표적화 분자에 결합하는)을 갖는다:
Figure pct00040
.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 링커는 하기 구조 또는 하기 언급되는 구조와 펩티드 링커의 조합(예를 들어, 1개 내지 3개의 아미노산을 함유하는 펩티드 링커를 통해 표적화 분자에 결합하는)을 갖는다:
Figure pct00041
.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 링커는 하기 구조 또는 하기 언급되는 구조와 펩티드 링커의 조합(예를 들어, 1개 내지 3개의 아미노산을 함유하는 펩티드 링커를 통해 표적화 분자에 결합하는)을 갖는다:
Figure pct00042
.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 링커는 하기 구조 또는 하기 언급되는 구조와 펩티드 링커의 조합(예를 들어, 1개 내지 3개의 아미노산을 함유하는 펩티드 링커를 통해 표적화 분자에 결합하는)을 갖는다:
Figure pct00043
.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 링커는 하기 구조 또는 하기 언급되는 구조와 펩티드 링커의 조합(예를 들어, 1개 내지 3개의 아미노산을 함유하는 펩티드 링커를 통해 표적화 분자에 결합하는)을 갖는다:
Figure pct00044
.
일부 구현예에서, 본 출원의 링커는 상기 기재된 바와 같은 링커 중 어느 하나 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 페이로드는 직접적으로 또는 간접적으로 제1 표적화 분자와 접합되고, 제1 표적화 분자는 직접적으로 또는 간접적으로 제2 표적화 분자와 접합된다. 일부 구현예에서, 페이로드는 직접적으로 각각의 제1 및 제2 표적화 분자와 접합된다. 일부 구현예에서, 페이로드는 간접적으로 각각의 제1 및 제2 표적화 분자와 접합된다. 일부 구현예에서, 페이로드는 간접적으로, 예를 들어, 링커를 통해 제1 표적화 분자와 접합되고, 제1 표적화 분자는 직접적으로 또는 간접적으로 제2 표적화 분자와 접합된다. 일부 구현예에서, 페이로드는 제1 링커를 통해 제1 표적화 분자와 접합되고, 페이로드는 제2 링커를 통해 제2 표적화 분자와 접합된다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과)의 페이로드 및 두 개의 표적화 분자에 결합하는 다가 링커이다.
일부 구현예에서, 두 개의 표적화 분자는 스페이서를 통해 서로 연결된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 표적 세포에서 특이적으로 발현되거나 표적 세포에서 발현될 프로테아제에 의해 절단 가능하다. 이러한 프로테아제는, 예를 들어, 하기 표 2에 열거된 바와 같은 프로테아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 하기 표 2에 열거된 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
[표 2]
Figure pct00045
본원에 사용된 용어 "절단 가능한" 또는 "절단된"은 본 출원에 제공된 접합체 화합물 상에서의 대사 과정 또는 반응 과정을 지칭하고, 이에 의해 페이로드와 표적화 분자 사이의 링커, 또는 표적화 분자 사이의 스페이서가 파괴되어 유리 페이로드 또는 표적화 분자를 방출한다. 링커 및 스페이서는 프로테아제에 의해 절단되거나 또는 특정 생리학적 환경, 예를 들어, pH 환경 하에 절단된다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물은 하기와 같이 나타낸 화학식 I, II, III, 또는 IV의 구조를 갖고, 여기서 n, m, p 및 q는 독립적으로 0 또는 1이고, 이는 링커 및 스페이서가 독립적으로 존재하거나 부재인 것을 나타낸다. 하기 화학식에서 "분자"는 "표적화 분자"에 대한 약칭이다.
[화학식 I]
Figure pct00046
[화학식 II]
Figure pct00047
[화학식 III]
Figure pct00048
[화학식 IV]
Figure pct00049
일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과)의 본 출원에 제공된 바와 같은 페이로드, 본 출원에 제공된 바와 같은 두 개의 표적화 분자 및 선택적으로 본 출원에 제공된 바와 같은 링커 또는 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 본 출원에 제공된 바와 같은 하나의 페이로드, 본 출원에 제공된 바와 같은 세포 표면 단백질 또는 마커에 특이적으로 결합하는 하나의 리간드, 본 출원에 제공된 바와 같은 하나의 상승작용적 분자, 및 본 출원에 제공된 바와 같은 링커 또는 스페이서를 포함한다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물은 하기와 같이 나타낸 화학식 V, VI, VII, 또는 VIII의 구조를 갖고, 여기서 n, m, p, q 및 s는 독립적으로 0 또는 1이고, 이는 링커, 다가 링커 및 스페이서가 독립적으로 존재하거나 부재인 것을 나타낸다.
[화학식 V]
Figure pct00050
[화학식 VI]
Figure pct00051
[화학식 VII]
Figure pct00052
[화학식 VIII]
Figure pct00053
일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 페이로드 및 두 개의 표적화 분자를 포함하고, 여기서 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 전립선-특이적 막 항원 리간드 모이어티, 예를 들어, CB-20B, CB-20BK, CB-60S, CB-60SK, CB-20C, CB-1020, CB-1320, CB-1820, CR19428, 20R-SM09 및 CB-20R이다.
일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 페이로드 및 두 개의 표적화 분자를 포함하고, 여기서 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 화학식 I으로 표현되는 리간드 모이어티, 예를 들어, CB-18G, CB-1820 및 CR19426이다.
일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 하나의 페이로드 및 두 개의 표적화 분자를 포함하고, 여기서 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 P10이고, 페이로드는 캄프토테신 또는 그의 임의의 유도체, 예컨대, CB-10S, CR19425 및 CB-50S이다.
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 다음 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다: CB-20B, CB-20BK, CB-60S, CB-60SK, CB-20C, CB-1020, CB-1320, CB-1820, CR19428, 20R-SM09, CB-20R, CB-18G, CR19426, CB-10S, CR19425 및 CB-50S(각 접합체 화합물의 특정 구조는 도 1a 내지 도 1o에 나타나 있음). 일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물은 공유 결합을 통해 리간드 모이어티에 링커-약물 모이어티를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 링커-약물 모이어티는 페이로드 및 링커를 포함하고, 본 출원의 리간드 모이어티는 두 개의 표적화 분자 및 선택적 스페이서 또는 링커를 포함하고, 여기서 두 개의 모이어티는 반응하고 공유 결합을 형성시킴으로써 본 출원의 접합체 화합물을 형성하고, 공유 결합은 링커-약물 모이어티의 링커와 리간드 모이어티의 리간드 분자 사이에 형성될 수 있거나, 링커-약물 모이어티의 링커와 리간드 모이어티의 스페이서 또는 링커 사이에 형성될 수 있다.
본 출원의 접합체 화합물인 CB-20B는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 20B-SM09에 링커-약물 모이어티 LT1002를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CB-20BK는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 20BK-SM09에 링커-약물 모이어티 LT1002를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CB-60S는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 60S-SM09에 링커-약물 모이어티 LT2000C를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CB-60SK는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 60SK-SM09에 링커-약물 모이어티 LT2000C를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CB-20C는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 20BK-SM09에 링커-약물 모이어티 LD1001를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CB-1020는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 1020BK-SM09에 링커-약물 모이어티 LT1002를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CB-1320는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 1320BK-SM09에 링커-약물 모이어티 LT1002를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CB-1820는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 1820BK-SM09에 링커-약물 모이어티 LT1002를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CR19428는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 20BK-SM09에 링커-약물 모이어티 CR19423를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CB-20R은 20R-SM09을 방사성핵종 이온 M과 착물화시킴으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CB-18G는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 18G-SM09에 링커-약물 모이어티 LT1002를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CR19426는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 18G-SM09에 링커-약물 모이어티 CR19423를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CB-10S는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 CBSM09에 링커-약물 모이어티 LT1000를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CR19425는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 CBSM09에 링커-약물 모이어티 CR19423를 연결함으로써 형성된다. 본 출원의 접합체 화합물인 CB-50S는 공유 결합을 통해 리간드 모이어티 50S-SM09에 링커-약물 모이어티 LT1000N3를 연결함으로써 형성된다. 각 구조는 하기 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 혈액 순환 및 (세포간 물질에서) 세포 외부에 들어간다. 링커는 세포외 환경에서 매우 안정하고 약물 분자는 방출될 수 없기 때문에, 약물 분자의 독성이 차단된다. 접합체는 세포독성이 없거나 독성이 낮은 약물이고, 정상 세포에 독성 효과를 갖지 않을 것이다.
일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 다중 수용체 또는 항원 및 이환 세포에서 동시에 고도 발현되는 다른 작용 분자에 결합하고, 이의 상승작용적 효과는 표적 세포에 대한 접합체 화합물의 친화도를 크게 증가시켜 정상 세포에 결합할 가능성을 감소시킨다. 따라서, MMAE/Dxd/SN38/방사성핵종 착물과 같은 매우 효과적인 독소 약물이 약물의 효능을 향상시키고, 치료 범위를 확대하고, 부작용을 방지하기 위해 함유될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 표적화된 세포의 내부에 들어가고, 이후 링커는 세포의 내부 환경의 변화를 통해(특정 효소 분해, pH 변화, 디술피드 결합 감소 등에 의해) 절단되어 종양 세포에 치료 효과를 갖는 약물 분자를 방출할 수 있다(약물 분자의 변형 기를 제거하는 것과 동등함).
일부 구현예에서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 표적 조직 환경 내 표적 세포에 페이로드를 특이적으로 전달하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 두 개의 표적화 분자는 세 가지 이점을 갖는다. 첫째로, 두 개의 표적화 분자는 부작용을 감소시킴과 동시에, 개선된 치료 효과를 유발하면서, 다중 방식으로(종종 상승작용적으로) 작용할 수 있다. 둘째로, 두 개의 표적화 분자의 결합은 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 표적 수용체 또는 표적 세포에 대한 친화도 및 결합력을 증가시키고, 따라서 그의 특이성을 증진시키며 표적외 독성을 방지한다. 마지막으로, 적절하게 설계 시, 두 개의 표적화 분자의 조합은 약물 접합체를 필요로 하는 다중-기능 요건을 충족시킬 수 있다.
본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 다음을 포함하나 이로 제한되지 않는 예기치 않은 기술적 효과를 달성한다: (1) 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드 및 세포내이입 분자의 조합은 접합체 화합물이 특이적으로 표적 세포에 들어가도록 함; (2) 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 고도로 효과적인 화학요법제 예컨대 MMAE를 환자에게 전달하고, 이러한 작용제의 치료 범위를 확장시키며, 부작용을 방지하도록, 약물 화합물의 친화도 및 표적화 특이성을 증진시킴; (3) 링커는 표적 세포 외부에서의(예를 들어, 혈액 순환계, 세포간 물질 등에서의) 페이로드의 방출을 방지할 수 있으며, 이는 혈액 순환 동안 접합체 화합물의 안정성을 보장하고, 약물의 독성을 감소시키며; 표적 세포에 들어간 후, 링커는 절단되어 페이로드를 방출함으로써 약물의 효과를 발휘하고, 한편으로 다중 약물 내성(MDR)을 방지하는 것이 가능함; 및 (4) 매우 다양한 약물이 본 출원의 접합체 화합물 형태로 전달될 수 있고, 따라서 관련 약물의 적용 범주를 넓힘. 따라서, 본 출원의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 표적화 범위를 넓히고 LDC-기반 약물의 치료 범위를 넓힐 뿐만 아니라, 일부 약물의 독성 및 부작용을 감소시킨다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 단일 아미노산 또는 아미노산의 폴리머일 수 있다. 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드는 자연-발생 아미노산, 및 비-자연-발생 아미노산, 또는 아미노산의 유사체 및 모방체를 함유할 수 있다. 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드는 당분야에 널리 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 비제한적으로 천연 물질로부터의 단리 및 정제, 재조합 발현, 화학적 합성 등에 의해 수득될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 제약 조성물을 개시한다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은, 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 다른 동물의 세포와 접촉 상태로 사용하기에 적합하며, 합리적인 이익/위험 비에 부합하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본 출원의 접합체 화합물의 상대적으로 비-독성의, 무기 및 유기산 부가염 및 염기 부가염을 지칭한다. 대표적인 산 부가염은 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 술페이트, 비술페이트, 포스페이트, 니트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 발레레이트, 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 보레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락티오비오네이트, 술파메이트, 말로네이트, 살리실레이트, 프로피오네이트, 메틸렌-비스-b-히드록시나프토에이트, 겐티세이트, 이세티오네이트, 디-p-톨루오일타르트레이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 시클로헥실술파메이트 및 퀴나테스라우릴술포네이트 염 등을 포함한다. 염기 부가염은 약제학적으로 허용되는 금속 및 아민 염을 포함한다. 적합한 금속 염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 바륨, 아연, 마그네슘 및 알루미늄 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 나트륨 및 칼륨 염이 바람직하다. 적합한 무기 염기 부가염은, 예를 들어, 수소화나트륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화알루미늄, 수산화리튬, 수산화마그네슘 및 수산화아연을 포함하는 금속 염기로부터 제조된다. 적합한 아민 염기 부가염은, 안정한 염을 형성하기에 충분한 염기도를 가지며, 바람직하게는 그의 낮은 독성 및 의학적 용도를 위한 허용가능성 때문에 의약 화학에 빈번하게 사용되는 하기 아민을 포함하는 아민으로부터 제조된다: 암모니아, 에틸렌디아민, N-메틸-글루카민, 리신, 아르기닌, 오르니틴, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 디에탄올아민, 프로카인, N-벤질페네틸아민, 디에틸아민, 피페라진, 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 테트라메틸암모늄 히드록시드, 트리에틸아민, 디벤질아민, 에페나민, 데히드로아비에틸아민, N-에틸피페리딘, 벤질아민, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 에틸아민, 염기성 아미노산, 예를 들어 리신 및 아르기닌, 및 디시클로헥실아민 등.
본원에 사용된 용어 "그의 약제학적으로 허용되는 담체"는 접합체 화합물의 구조 및 특성에 간섭하지 않으면서, 본 출원에 제공된 접합체 화합물을 대상체에게 전달하기 위한 약제학적으로 허용되는 용매, 현탁액 또는 임의의 다른 약리학적 불활성 비히클을 지칭한다. 이러한 담체는 접합체 화합물이, 예를 들어, 대상체에 의한 경구 섭취를 위한 정제, 환제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 및 파스틸로서 제형화되도록 할 수 있다. 이러한 담체는 접합체 화합물이 국부 투여를 위한 주사액, 주입물 또는 제제로서 제형화되도록 할 수 있다.
본 출원에 제공된 제약 조성물에서 사용하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 비히클(예컨대, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 등장성 덱스트로스 주사액, 멸균수 주사액, 또는 덱스트로스 및 락테이트화 링거 주사액), 비수성 비히클(예컨대, 식물성 기원의 고정 오일, 목화씨 오일, 옥수수 오일, 참깨 오일 또는 땅콩 오일), 항미생물제, 등장화제(예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로스), 완충제(예컨대, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 항산화제(예컨대, 중황산나트륨), 마취제(예컨대, 프로카인히드로클로라이드), 현탁액/분산액(예컨대, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 또는 폴리비닐피롤리돈), 킬레이트화제(예컨대, EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산) 또는 EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산)), 유화제(예컨대, 폴리소르베이트 80(트윈-80)), 희석제, 애주번트, 부형제 또는 비-독성 보조 물질, 당분야에 공지된 다른 성분, 또는 그의 다양한 조합물을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 적합한 성분은, 예를 들어, 충전제, 결합제, 완충제, 보존제, 윤활제, 향미제, 증점제, 착색제 또는 유화제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제약 조성물은 주사 제제이다. 주사 제제는 멸균수 용액 또는 분산액, 현탁액 또는 에멀션을 포함한다. 모든 경우에, 주사 제제는 멸균성이고, 용이한 주사를 위한 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하며, 미생물, 예컨대, 세균 및 진균의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 주사 제제는 적절한 유동성을 유지하여야 한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대, 레시틴의 사용, 계면활성제의 사용 등에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 제약 조성물은 경구 제제이다. 경구 제제는 캡슐, 카쉐, 환제, 정제, 로젠지(향미 베이스, 통상적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 사용함), 분말, 과립을 포함하거나, 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀션으로서, 또는 엘릭시르 또는 시럽으로서, 또는 파스틸(불활성 베이스, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아를 사용함)로서 및/또는 구강 세정제 등으로서 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
경구 투여를 위한 고체 투여 형태(예를 들어, 캡슐, 정제, 환제, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 접합체 화합물은 1종 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 예컨대 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘 및/또는 하기 중 임의의 것과 혼합된다: (1) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및/또는 규산; (2) 결합제, 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스 및/또는 아카시아; (3) 함습제, 예컨대 글리세롤; (4) 붕해제, 예컨대 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염 및 탄산나트륨; (5) 용해 지연제, 예컨대 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예컨대 4급 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 예컨대 아세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예컨대 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 술페이트, 및 그의 혼합물; 및 (10) 착색제.
경구 투여를 위한 액체 투여 형태에서, 접합체 화합물은 다음 중 어느 것과 혼합된다: 약제학적으로 허용되는 에멀션, 마이크로에멀션, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르. 접합체 화합물 이외에도, 액체 투여 형태는 당분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 이소프로판올, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 올리브, 피마자 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 그의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에도, 경구 조성물은 또한 애주번트, 예컨대, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 향미제, 착색제, 퍼퓸제 및 보존제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제약 조성물은 구강 스프레이 제제 또는 비강 스프레이 제제이다. 스프레이 제제는 수성 에어로졸, 비수성 현탁액, 리피도솜 제제 또는 고체 과립 제제 등을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 수성 에어로졸은 작용제의 수성 용액 또는 현탁액과 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체 및 안정화제를 혼합함으로써 제조된다. 담체 및 안정화제는 특정한 화합물의 요건에 따라 변화하지만, 일반적으로 이들은 비이온성 계면활성제(트윈 또는 폴리에틸렌 글리콜), 올레산, 레시틴, 아미노산 예컨대 글리신, 완충제 용액, 염, 당 또는 당 알콜을 포함한다. 에어로졸은 일반적으로 등장성 용액으로부터 제조되며, 분무기에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 제약 조성물은 1종 이상의 다른 약물과 혼합함으로써 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제약 조성물은 적어도 1종의 다른 약물을 포함한다. 일부 구현예에서, 다른 약물은 항신생물 약물, 심혈관 약물, 항염증 약물, 항바이러스 약물, 소화기계 약물, 신경계 약물, 호흡기계 약물, 면역계 약물, 피부과 약물, 대사 약물 등이다.
일부 구현예에서, 제약 조성물은 경구, 주사(예컨대, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 심장내, 척수강내, 흉막내 및 복강내 주사), 점막(예컨대, 비강 및 구강내 투여), 설하, 직장, 경피, 안내, 및 폐 투여를 비제한적으로 포함한, 적절한 경로에 의해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 제약 조성물은 정맥내로, 피하로, 경구로, 근육내로 또는 뇌실내로 투여될 수 있다.
일부 페이로드의 특성, 예컨대, 높은 독성, 및 높은 친수성으로 인해, 페이로드를 보다 특이적으로 및 보다 효율적으로 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 암 치료에서, 화학요법제를, 정상 세포에 대한 독성 없이, 특이적으로 암 세포에 전달하는 것이 바람직하다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 출원은 페이로드의 전달을 필요로 하는 대상체에게 페이로드를 전달하기 위한 방법으로서, 본 출원에 제공된 치료 유효량의 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 본 출원에 제공된 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 개시한다. 본 출원에 기재된 페이로드는 질환을 예방, 억제, 호전 또는 치료하는 데 있어서 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 추구되고 있는 조직, 계, 동물, 개체 또는 인간에서의 생물학적 또는 의약적 반응을 도출하는 임의의 제약 작용제일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "개체"는 인간 및 비-인간 동물을 지칭한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물을 포함한다. 대상체는 또한 축산 동물 예컨대, 소, 돼지, 양, 가금류 및 말, 또는 가축 예컨대 개 및 고양이일 수 있다. 대상체는 수컷(예를 들어, 남성) 또는 암컷(예를 들어, 여성)일 수 있으며, 노인일 수 있으며, 성인, 청소년, 소아 또는 유아일 수 있다. 인간 대상체는 백인, 아프리카인, 아시아인, 셈족, 또는 다른 인종 배경, 또는 이러한 인종 배경의 혼혈의 인간일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량"은 대상체에서 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상을 어느 정도까지 완화하고/완화하거나; 질환 또는 장애와 연관되거나 또는 그의 원인이 되는 1개 이상의 생리학적 또는 생화학적 매개변수를 부분적으로 또는 완전히 정상으로 회복시키고/회복시키거나; 질환 또는 장애의 개시 가능성을 감소시키는 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 제약 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 양은 일반적으로 본 출원에 제공된 명세서의 범주에 따라 통상의 기술자에 의해 결정되고 설명될 수 있는 수많은 인자들에 따라 달라진다. 이들 인자들은, 제한 없이, 특정한 대상체 및 그의 연령, 체중, 신장, 일반적인 신체 조건, 및 병력, 사용되는 특정한 화합물, 선택된 제제의 담체 및 투여 경로, 및 치료되는 병태의 성질 및 중증도를 포함한다.
일부 구현예에서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 제약 조성물의 양은 대상체에서 질환 또는 장애를 억제하거나, 질환 또는 장애의 개시를 예방적으로 억제하거나 또는 예방하기에 충분하다. 치료 유효량이 상이한 대상체에서 달라질 수 있지만, 이는 일반적으로 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예를 들어, 0.01 mg/kg 내지 90 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 80 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 70 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 60 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 50 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 40 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 30 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 20 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 5 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 4 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 3 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 2 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 1 mg/kg, 및 0.01 mg/kg 내지 0.1 mg/kg의 범위이다. 본 출원에 기재된 바와 같은 치료 유효량은 이러한 범위의 종점을 포함한, 상기 수치 범위 내의 임의의 값일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 페이로드의 전달을 필요로 하는 대상체에게 페이로드를 전달하기 위한 방법으로서, 치료 유효량의 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 본 출원에 제공된 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 개시한다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 대상체에서 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 치료 유효량의 본 출원에 제공된 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 본 출원에 제공된 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 개시한다.
일부 구현예에서, 질환은 전립선암, 유방암, 폐암, 신암, 백혈병, 난소암, 위암, 자궁암, 자궁내막 암종, 간암, 갑상선암, 췌장암, 결장암, 결장직장암, 식도암, 피부암, 림프종, 및 다발성 골수종을 포함하나, 이로 제한되지 않는 암이다.
일부 구현예에서, 암의 암 세포는 본 출원에서 언급된 세포 표면 수용체 또는 항원의 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 암의 암 세포는 본 출원에서 언급된 세포 표면 수용체 또는 항원의 높은 발현(예를 들어, Depmap로부터의 데이터에 따라(참조: https://depmap.org/portal/), 상응하는 유전자 발현은 적어도 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 초과임)을 갖는다. 일부 구현예에서, 암의 암 세포는 FOLR1 및 FOLH1, TRPV6 및 FOLH1, GNRHR 및 FOLH1, SSTR2 및 FOLH1, FOLR1 및 SSTR2, 또는 TRPV6 및 FOLR1의 높은 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 질환은 면역 질환, 예를 들어, 결합 조직 질환, 전신 경화증, 류마티스 관절염, 및 전신 홍반성 루푸스를 포함하나, 이로 제한되지 않는, 자가면역 질환이다.
일부 구현예에서, 질환은 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 심장 발작, 고혈압 심장 질환, 류마티스성 심장 질환, 심근병증, 부정맥, 및 선천성 심장 질환을 포함하나 이로 제한되지 않는, 심혈관 질환이다.
일부 구현예에서, 질환은 당뇨병, 통풍, 비만, 저혈당증, 고혈당증, 및 이상지혈증을 포함하나 이로 제한되지 않는, 대사 질환이다.
일부 구현예에서, 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 두부 손상, 다발성 경화증, 현기증, 혼수, 및 간질을 포함하나 이로 제한되지 않는, 신경계 질환이다.
일부 구현예에서, 본 출원에 제공된 방법은 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 제약 조성물과 조합하여 하나 이상의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 항암 치료 표적을 표적화하거나, 암에 대한 면역 반응을 유도 또는 부스팅하거나, 화학요법제이다.
본 출원은 구체적 실시예로서 더욱 상세히 기재될 것이다. 하기 실시예는 단지 설명하기 위한 목적으로 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 당업자라면 본질적으로 동일한 결과를 산출하도록 변화 또는 변형될 수 있는 다양한 비임계적 매개변수를 용이하게 인식할 것이다.
실시예
하기 실시예는 본 출원을 추가로 설명하려고 의도된 것이다. 본 출원의 이점 및 특징은 설명으로 명백해질 것이다. 그러나, 이들 설명은 단지 예시적이며, 본 출원의 범주에 대한 제한으로서 구성되어서는 안된다.
실시예 1: 접합체 화합물의 제조
접합체 화합물 CB- 20BK , CB-18G, CB-20B, CB-10S, CB-20C, FA- MMAE , CB-20AK, CB-1020, CB-1320 및 CB-1820의 합성
1. 0.45 mmol/g의 치환도를 갖는 10 g의 링크 아미드-am 수지(이하에서 "링크 수지(Rink Resin)"라 지칭됨, Sunresin New Materials Co. Ltd., Cat#: 183599-10-2)를 칭량하고, 고체 상 반응 칼럼에 로딩하고; DCM을 첨가하고, 질소 가스를 용매를 통해 버블링시켜 수지를 30분 동안 팽윤시키고; 용매를 펌핑하고; 수지 상의 Fmoc 보호기를 DBLK에 의해 제거한 후, 수지를 DMF로 5회 세척하였다. 4.79 g(9 mmol)의 Fmoc-Lys(Dde)-OH 및 1.47 g(10.8 mmol)의 HOBt를 칭량하고, DMF에 용해시켰다. 빙수조에 0℃에서 상기 언급된 용액에 1.67 ml(10.8 mmol)의 DIC를 첨가하고, 혼합하여, 5분 동안 활성화시켰다. 용액을 상기 언급된 반응 칼럼에 첨가하고, 3시간 동안 반응시키고, 이후 용매를 펌핑하고; 반응 칼럼에서 수지를 3회 세척하였다. 그 후에, Fmoc 보호기를 DBLK에 의해 제거하였다.
2. 상기 언급된 작업을 반복하고, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH 및 중간체 108을 구조에 따라 연속 접합시켰다.
Figure pct00060
(중간체 108)
3. Dde 보호기를 2% 히드라진 수화물/DMF로 각 회에 10분 동안 2회 제거하고, 이후 수지를 DMF로 5회 세척하였다. Fmoc-Glu-OtBu 및 프테로산을 연속 접합시켰다. 마지막으로, 수지를 메탄올로 2회 응축시키고, 용매를 펌핑하여, 17.4 g의 보호된 펩티드 수지를 수득하였다.
4. 이전 단계에서 수득된 17.4 g의 펩티드 수지를 250 ml 1구 플라스크에 첨가하고; 139 ml의 세포용해 완충제(TFA : H2O : TIS = 95 : 3 : 2(부피비))를 미리 제조하고, 2.1 g의 DTT를 칭량하고, 세포용해 완충액에 첨가하였다. 세포용해 완충제를 상기 언급된 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 반응시키고, 여과하고; 수지를 계속 30 ml의 TFA로 세척하고; 상기 언급된 여과액을 합하였고, 혼합물을 834 ml의 무수 에테르에 첨가하자, 황색 고형물이 침전되었으며, 이를 원심분리하여 고형물을 수득하였고, 이를 무수 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜, 93.4%의 수율 및 82.3%의 HPLC 순도를 갖는 6.4 g의 조생성물을 황색 고형물로서 수득하였다. 생성물을 분취용-HPLC(조건: C18 칼럼, 이동상 A: 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산, B: 아세토니트릴, 용리 구배: (15 내지 25)%B, 용리 시간: 60분; 분획을 수집함)에 의해 분리하고; 적격 생성물을 함유하는 분획을 동결건조시켜, 98.8%의 순도를 갖는 4.73 g의 20BK-SM09를 수득하였다.
5. 4.09 g(3.11 mmol)의 Mc-Val-Cit-PAB-MMAE (LT1002)를 칭량하고, 1000 ml 1구 플라스크에 첨가하고, 500 ml의 포스페이트 완충제 및 100 ml의 아세토니트릴을 첨가하고; 투명한 용액이 얻어질 때까지, 용액을 교반하고, pH = 7.2에서 유지시키고; 4.73 g(3.11 mmol)의 중간체 20BK-SM09를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 반응시키고, 그 동안 반응을 HPLC에 의해 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 분취용 HPLC(조건: C18 칼럼, 이동상 A: 암모늄 바이카르보네이트 용액(pH = 7.2), B: 아세토니트릴, 용리 구배: (25 내지 35)%B, 용리 시간: 60분; 분획을 수집함)에 의해 분리하고; 적격 생성물을 함유하는 분획을 동결건조시켜, 98.8%의 순도 및 78.8%의 수율을 갖는 6.96 g의 CB-20BK 생성물을 수득하였다.
동일한 방식으로, 접합체 화합물 CB-18G, CB-20B, CB-10S, CB-20C, FA-MMAE(하기와 같이 나타낸 구조를 가짐), CB-20AK(하기와 같이 나타낸 구조를 가짐), CB-1020, CB-1320 및 CB-1820이 상기 언급된 방법으로 유사한 단계를 통해 수득될 수 있다.
Figure pct00061
(FA-MMAE)
Figure pct00062
(CB-20AK)
접합체 화합물 CB-50S, CB-60S 및 CB-60SK의 합성
1. 1.1 mmol/g의 치환도를 갖는 10 g의 왕 수지(Wang Resin)(Sunresin New Materials Co. Ltd., Cat#: 1365700-43-1)를 칭량하고, 고체 상 반응 칼럼에 로딩하고; DMF를 첨가하고, 질소 가스를 용매를 통해 버블링시켜 수지를 30분 동안 팽윤시키고; 14.3 g(22 mmol)의 Fmoc-Arg(pbf)-OH, 3.56 g(26.4 mmol)의 HOBt, 및 0.27 g(2.2 mmol)의 DMAP를 칭량하고, DMF에 용해시키고; 빙수조에 0℃에서 4.1 ml(26.4 mmol)의 DIC를 첨가하고, 혼합하여, 5분 동안 활성화시키고; 용액을 반응 칼럼에 첨가하고, 3시간 동안 반응시킨 후, 용매를 펌핑하고; 수지를 3회 세척하였다.
2. 10.4 ml의 아세틱 옥사이드 및 8.9 ml의 피리딘을 50 ml의 DMF에 용해시키고, 혼합하고, 상기 단계에서 세척한 후 수지를 첨가하고; 혼합물을 실온에서 5시간 동안 블로킹하고, DMF로 3회 세척하고; 수지를 메탄올로 응축시킨 후, 용매를 펌핑하여, 0.53 mmol/g인 것으로 결정된 치환도를 갖는 Fmoc-Arg(pbf)-왕 수지를 수득하였다.
3. 3.8 g(2 mmol)의 Fmoc-Arg(pbf)-왕 수지(Sub = 0.53 mmol/g)를 칭량하고, 반응 칼럼에 로딩하고; 수지를 DMF로 3회 세척한 후, DMF를 첨가함으로써 30분 동안 팽윤시켰다. 그 후에, Fmoc 보호기를 DBLK에 의해 제거하고, 수지를 DMF로 6회 세척하였다. 2.0 g(6 mmol)의 Fmoc-Pro-OH 및 0.97 g(7.2 mmol)의 HOBt를 칭량하고, DMF에 용해시키고; 빙수조에 0℃에서 1.1 ml(7.2 mmol)의 DIC를 첨가하고, 혼합하여, 5분 동안 활성화시키고; 혼합물을 반응 칼럼에 첨가하고, 2시간 동안 반응시키고; 이후 Fmoc 보호기를 DBLK에 의해 제거하였다.
4. 상기 언급된 작업을 반복하고, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-프로파르길-Gly-OH, Fmoc-Glu-OtBu 및 프테로산을 구조에 따라 연속 접합시켰다. 수지를 메탄올로 2회 응축시키고, 용매를 펌핑하여, 8.4 g의 펩티드 수지를 수득하였다.
5. 이전 단계에서 수득된 8.4 g의 펩티드 수지를 250 ml 1구 플라스크에 첨가하고; 67 ml의 세포용해 완충제(TFA : H2O : TIS = 95 : 3 : 2(부피비))를 미리 제조하고, 0.92 g의 DTT를 칭량하고, 세포용해 완충액에 첨가하였다. 세포용해 완충제를 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 반응시키고; 수지를 여과하고, 20 ml의 TFA로 세척하고; 여과액을 합하고, 혼합물을 402 ml의 무수 에테르에 첨가하자, 황색 고형물이 침전되었으며, 이를 원심분리하여 고형물을 수득하였고, 이를 무수 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜, 97.3%의 수율 및 84.6%의 HPLC 순도를 갖는 4.06 g의 조생성물을 황색 고형물로서 수득하였다. 생성물을 분취용-HPLC(조건: C18 칼럼, 이동상 A: 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산, B: 아세토니트릴, 용리 구배: (20 내지 29)%B, 용리 시간: 60분; 분획을 수집함)에 의해 분리하고; 적격 생성물을 함유하는 분획을 동결건조시켜, 97.6%의 순도를 갖는 2.86 g의 50S-SM09를 수득하였다.
6. 1.29 g(1.37 mmol)의 LT1000N3를 칭량하고, 500 ml 1구 플라스크에 첨가하고, 270 ml의 혼합된 용매(CAN : H2O = 1 : 4) 및 393 mg(2.74 mmol)의 CuBr을 첨가하고, 교반하였다. 2.86 g(1.37 mmol)의 중간체 50S-SM09를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 내지 3시간 동안 반응시키고, 그 동안 반응을 HPLC에 의해 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 분취용-HPLC(조건: C18 칼럼, 이동상 A: 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산, B: 아세토니트릴, 용리 구배: (22 내지 40)%B, 용리 시간: 60분; 분획을 수집함)에 의해 분리하고; 적격 생성물을 함유하는 분획을 동결건조시켜, 98.6%의 순도 및 76.4%의 수율을 갖는 3.17 g의 CB-50S를 수득하였다.
동일한 방식으로, 접합체 화합물 CB-60S 및 CB-60SK가 상기 언급된 방법으로 유사한 단계를 통해 수득될 수 있다.
CB-20R의 합성
1. 0.45 mmol/g의 치환도를 갖는 5 g의 링크 수지를 칭량하고, 고체 상 반응 칼럼에 로딩하고; DCM을 첨가하고, 질소 가스를 용매를 통해 버블링시켜 수지를 30분 동안 팽윤시키고; 용매를 펌핑하고; 수지 상의 Fmoc 보호기를 DBLK에 의해 제거한 후, 수지를 DMF로 5회 세척하였다. 2.4 g(4.5 mmol)의 Fmoc-Lys(Dde)-OH 및 0.74 g(5.4 mmol)의 HOBt를 칭량하고, DMF에 용해시키고; 빙수조에 0℃에서 0.84 ml(5.4 mmol)의 DIC를 첨가하고, 혼합하여, 5분 동안 활성화시키고; 혼합물을 반응 칼럼에 첨가하고, 3시간 동안 반응시키고; 용매를 펌핑하고, 수지를 3회 세척하였다. 그 후에, Fmoc 보호기를 DBLK에 의해 제거하였다.
2. 상기 언급된 작업을 반복하고, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH 및 중간체 108을 구조에 따라 연속 접합시켰다.
3. Dde 보호기를 2% 히드라진 수화물/DMF로 각 회에 10분 동안 2회 제거하고, 이후 수지를 DMF로 5회 세척하였다. DOTA-트리스(tBu) 에스테르를 접합시켰다. 그 후에, Dde 보호기를 2% 히드라진 수화물/DMF로 각 회에 10분 동안 2회 제거하고, 이후 수지를 DMF로 5회 세척하였다. Fmoc-Glu-OtBu 및 프테로산을 연속 접합시키고, 마지막으로, 수지를 메탄올로 2회 응축시키고, 용매를 펌핑하여, 9.2 g의 보호된 펩티드 수지를 수득하였다.
4. 이전 단계에서 수득된 9.2 g의 펩티드 수지를 250 ml 1구 플라스크에 첨가하고; 74 ml의 세포용해 완충제(TFA : H2O : TIS = 95 : 3 : 2(부피비))를 미리 제조하고, 1.05 g의 DTT를 칭량하고, 세포용해 완충액에 첨가하였다. 세포용해 완충제를 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 반응시키고; 수지를 여과하고, 20 ml의 TFA로 세척하고; 여과액을 합하고, 혼합물을 560 ml의 무수 에테르에 첨가하자, 황색 고형물이 침전되었으며, 이를 원심분리하여 고형물을 수득하였고, 이를 무수 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜, 87.4%의 수율 및 81.2%의 HPLC 순도를 갖는 3.8 g의 조생성물을 황색 고형물로서 수득하였다. 생성물을 분취용-HPLC(조건: C18 칼럼, 이동상 A: 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산, B: 아세토니트릴, 용리 구배: (15 내지 25)%B, 용리 시간: 60분; 분획을 수집함)에 의해 분리하고; 합성 생성물을 함유하는 분획을 동결건조시켜, 97.8%의 순도를 갖는 2.9 g의 20R-SM09를 수득하였다.
5. 20R-SM09를 방사성핵종 이온 M과 착물화시켜 CB-20R을 수득하였다. 구체적으로, 방사성 표지 177Lu(약 50 MBq)를 100 μl의 0.5 M 소듐 아세테이트 완충제(pH = 5)와 혼합하였다. 10% DMSO에 용해된 1 mM CB-20R의 40 μl의 수용액, 2 μl의 포화 아스코르브산 용액 및 177Lu를 함유하는 100 μl의 용액을 혼합하고, 혼합물을 25℃까지 10분 동안 가열하였다. 표지를 방사성-HPLC(5분 이내; 물 중 0%-100% ACN; C18 칼럼)에 의해 검출하였다.
화합물 CR19425의 합성
Figure pct00063
1. N2 보호 하에서 반응 플라스크에 441.4 mg의 CR19420(상기 반응 단계에 나타낸 바와 같은 구조를 가짐) 및 8.0 mL의 DMF를 첨가하고, 교반하고, 용해시키고, 얼음조에 냉각시킨 후; 459.2 mg의 HATU 및 380 μL의 DIPEA를 첨가하고, 반시간 동안 교반하고; 이후, 500.0 mg의 CR19419(상기 반응 단계에 나타낸 바와 같은 구조를 가짐) 및 190 μL의 DIPEA를 첨가하고, 반응이 완료될 때까지 실온에서 혼합물을 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 아세트산 수용액에 붓고; 고형물을 침전시키고, 여과하고, 여과 케이크를 아세트산 수용액 및 물로 세척하고, 진공에서 건조시켜, 90.0%의 HPLC 순도 및 90.6%의 수율을 갖는 835.7 mg의 CR19421(상기 반응 단계에 나타낸 바와 같은 구조를 가짐)를 갈색 분말로서 수득하였다.
2. N2 보호 하에 반응 플라스크에 835.7 mg의 CR19421 및 16 mL의 10% 피페리딘 DMF 용액을 첨가하고, 실온에서 반시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 TFA/MTBE에 붓고; 고형물을 침전시키고, 여과하고, 여과 케이크를 MTBE로 세척하고, 진공에서 건조시켜, 84.7%의 HPLC 순도 및 83.0%의 수율을 갖는 599.7 mg의 CR19422(상기 반응 단계에 나타낸 바와 같은 구조를 가짐)를 암회색 분말로서 수득하였다.
3. N2 보호 하에서 반응 플라스크에 599.7 mg의 CR19422, 586.7 mg의 CR19424(상기 반응 단계에 나타낸 바와 같은 구조를 가짐) 및 15 mL의 DMF를 첨가하고, 교반하고, 용해시키고, 얼음조에 냉각시킨 후; 495.7 mg의 HATU 및 410 μL의 DIPEA를 첨가하고, 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 분취용 정제로 처리하고, 아세토니트릴을 감압 하에 순수한 생성물 용액으로부터 제거하고; 잔류물을 디클로로메탄과 메탄올의 혼합된 용액으로 추출하고, 농축시키고, 건조시켜, 88.4%의 HPLC 순도 및 63.1%의 수율을 갖는 674.9 mg의 CR19423(상기 반응 단계에 나타낸 바와 같은 구조를 가짐)를 황색 분말로서 수득하였다.
4. N2 보호 하에서 반응 플라스크에 14.8 mg의 CR19423, 3.0 mL의 PBS 완충제(pH = 6.6) 및 3.0 mL의 아세토니트릴을 첨가하고, 교반하고, 용해시킨 후; 32.9 mg의 CBSM09를 첨가하고, 혼합물을 Na2HPO4에 의해 pH 6.6 내지 pH 6.8까지 조절하고, 반시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 분취용 정제로 처리하고, 순수한 생성물을 동결건조시켜, 95.6%의 HPLC 순도 및 48.8%의 수율을 갖는 21.8 mg의 CR19425를 황색 분말로서 수득하였다.
화합물 CR19426의 합성
Figure pct00064
1. N2 보호 하에서 반응 플라스크에 25.2 mg의 CR19423, 3.0 mL의 PBS 완충제(pH = 6.6) 및 3.0 mL의 아세토니트릴을 첨가하고, 교반하고, 용해시킨 후; 55.5 mg의 18G-SM09를 첨가하고, 혼합물을 Na2HPO4에 의해 pH 6.6 내지 pH 6.8까지 조절하고, 반시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 분취용 정제로 처리하고, 순수한 생성물을 동결건조시켜, 95.4%의 HPLC 순도 및 55.2%의 수율을 갖는 44.6 mg의 CR19426를 황색 분말로서 수득하였다.
화합물 CR19428의 합성
Figure pct00065
1. N2 보호 하에서 반응 플라스크에 486 mg의 CR19423, 3.0 mL의 PBS 완충제(pH = 6.6) 및 3.0 mL의 아세토니트릴을 첨가하고, 교반하고, 용해시킨 후; 712 mg의 20BK-SM09를 첨가하고, 혼합물을 Na2HPO4에 의해 pH 6.6 내지 pH 6.8까지 조절하고, 반시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 분취용 정제로 처리하고, 순수한 생성물을 동결건조시켜, 96.7%의 HPLC 순도 및 42.3%의 수율을 갖는 508 mg의 CR19428를 황색 분말로서 수득하였다.
실시예 2: 표적 단백질에 대한 접합체 화합물의 친화도 결정
1. 단백질 FOLR1에 대한 CB-20BK의 결합 친화도 결정
실험 기기, 재료 및 시약:
BIAcore T200(GE)
CM5 칩(GE, Cat#: 29104988)
완충제: HBS-EP+ 완충제 10X(GE, Cat#: BR100669), 사용 전 탈이온수로 10배 희석.
아미노 커플링 키트(GE, Cat#: BR100050)
재생 시약: 10 mM 글리신 2.0(GE, Cat#: BR100355)
10 mM 글리신 3.0(GE, Cat#: BR100357)
실험 단계
BIAcore T200(GE) 사용 설명서에 따라 실험을 수행하여 FOLR1에 대한 분석물 CB-20BK, CB-20AK, 폴레이트(FA) 및 FA-MMAE의 친화도를 결정하였다. 실험에서, CM5 칩을 리간드 FOLR1(R&D System, Cat#: 5646-FR)과 접합시켰다. 실험 결과는 표 4에 나타낸 바와 같다.
[표 4]
Figure pct00066
"N/D"는 특이적 결합이 검출되지 않았다는 것을 의미한다.
표 4는 CB-20BK가 우수한 친화도로 FOLR1에 특이적으로 결합한다는 것을 보여준다. FOLR1에 대한 CB-20BK의 결합 친화도는 FOLR1에 대한 FA 또는 FA-MMAE의 결합 친화도보다 약간 약했다. CB-20AK는 CB-20BK의 폴레이트 모이어티를 포함하지 않고, 실험에서 FOLR1에 특이적으로 결합하는 것으로 검출되지 않았다.
2. 단백질 FOLH1에 대한 CB-20BK의 결합 친화도 결정
실험 기기, 재료 및 시약:
GatorTM(Probe Life)
SA 프로브(Probe Life, Cat#: 1906018)
완충제: Q 완충제(Probe Life), 10 mM, pH = 7.4
실험 단계
(1) 분석물 비오틴-CB-20BK의 합성 단계
1) 0.45 mmol/g의 치환도를 갖는 5.1 g의 링크 수지를 칭량하고, 고체 상 반응 칼럼에 로딩하고; DCM을 첨가하고, 질소 가스를 버블링시켜 수지를 30분 동안 팽윤시키고; 용매를 펌핑하고; Fmoc 보호기를 DBLK에 의해 제거한 후; 수지를 DMF로 5회 세척하였다. 2.45 g의 Fmoc-Lys(Dde)-OH 및 0.75 g의 HOBt를 칭량하고, DMF에 용해시키고; 빙수조에 0℃에서 0.83 ml의 DIC를 첨가하여, 5분 동안 활성화시키고; 혼합물을 반응 칼럼에 첨가하고, 3시간 동안 반응시키고; 용매를 펌핑하고, 수지를 3회 세척하였다. 그 후에, Fmoc 보호기를 DBLK에 의해 제거하였다.
2) 상기 언급된 작업을 반복하고, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH 및 중간체 108을 구조에 따라 연속 접합시켰다.
3) Dde 보호기를 2% 히드라진 수화물/DMF로 각 회에 10분 동안 2회 제거하고, 이후 수지를 DMF로 5회 세척하였다. Fmoc-Lys(비오틴)-OH, Fmoc-Glu-OtBu 및 프테로산을 연속 접합시키고, 프테로산을 접합시킨 후, 수지를 DMF로 2회 세척하고; 마지막으로, 수지를 메탄올로 2회 응축시키고, 용매를 펌핑하여, 9.7 g의 보호된 펩티드 수지를 수득하였다.
4) 이전 단계에서 수득된 9.7 g의 펩티드 수지를 250 ml 1구 플라스크에 첨가하고; 77.6 ml의 세포용해 완충제(TFA : H2O : TIS = 95 : 3 : 2(부피비))를 미리 제조하고, 1.1 g의 DTT를 칭량하고, 세포용해 완충액에 첨가하였다. 세포용해 완충제를 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 반응시키고; 수지를 여과하고, 20 ml의 TFA로 세척하고; 여과액을 합하고, 혼합물을 466 ml의 메틸 3차-부틸 에테르에 첨가하자, 황색 고형물이 침전되었으며, 이를 원심분리하여 고형물을 수득하였고, 이를 메틸 3차-부틸 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜, 83.2%의 HPLC 순도를 갖는 4.6 g의 황색 고형물을 수득하였다. 생성물을 분취용-HPLC에 의해 분리하고, 동결건조시켜, 95% 이상의 순도를 갖는 2.1 g의 비오틴-20BK-SM09를 수득하였다.
5) 500 mg의 Mc-Val-Cit-PAB-MMAE(LT1002)를 칭량하고, 250 ml 1구 플라스크에 첨가하고, 65 ml의 포스페이트 완충제 및 20 ml의 아세토니트릴을 첨가하고; 투명한 용액이 얻어질 때까지, 용액을 교반하고, pH = 7.2에서 유지시키고; 785 mg의 중간체 비오틴-20BK-SM09를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 반응시키고, 그 동안 반응을 HPLC에 의해 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 여과하고, 분취용-HPLC에 의해 분리하고, 동결건조시켜, 96.8%의 순도 및 59.4%의 수율을 갖는 723 mg의 비오틴-CB-20BK를 수득하였다.
(2) GatorTM(Probe Life) 사용 설명서에 따라 실험을 수행하여 FOLH1에 대한 비오틴-CB-20BK의 결합 친화도를 결정하였다. 실험에서, SA 프로브는 리간드 비오틴-CB-20BK에 결합하고, 분석물은 FOLH1(Sino Biologicals, Cat#: 15877-H07H)이었다. 실험 결과는 표 5에 나타낸 바와 같다.
[표 5]
Figure pct00067
표 5는 CB-20BK가 우수한 친화도로 FOLH1에 결합한다는 것을 보여준다.
3. CB- 20BK - FOLR1 착물에 결합하는 FOLH1
실험 재료 및 시약:
BIAcore T200(GE)
CM5 칩(GE, Cat#: 29104988)
완충제: HBS-EP+ 완충제 10X(GE, Cat#: BR100669), 사용 전 탈이온수로 10배 희석.
아미노 커플링 키트(GE, Cat#: BR100050)
재생 시약: 10 mM 글리신 2.0(GE, Cat#: BR100355)
10 mM 글리신 3.0(GE, Cat#: BR100357)
실험 단계
CM5 칩을 리간드: FOLR1(R&D System, Cat#: 5646-FR)과 접합시켰다.
분석물: CB-20BK, FA-MMAE 및 FOLH1(Sino Biologicals, Cat#: 15877-H07H)
BIAcore T200(GE) 작업 메뉴얼에 따라, FOLR1을 CM5 칩에 접합시키고; CB-20BK 또는 FA-MMAE를 먼저 로딩한 후, FOLH1을 로딩하고; CB-20BK-FOLR1 착물에 대한 FOLH1의 결합을 검출하였다. 실험 결과는 표 6에 나타낸 바와 같다.
[표 6]
Figure pct00068
표 6은 고농도의 FOLH1 용액과 관련하여, CB-20BK-FOLR1 착물에 결합된 FOLH1의 양이 FA-MMAE-FOLR1 착물에 결합된 양보다 유의하게 더 높고, 이는 지속적인 상승 경향을 나타낸다는 것을 보여준다. FA-MMAE-FOLR1 착물에 대한 FOLH1의 결합은 고농도에서 포화되는 경향이 있다. 이 실험은 CB-20BK가 우수한 친화도로 FOLR1과 FOLH1 수용체 둘 모두에 결합할 수 있다는 것을 입증하였다.
실시예 3: 표적 세포에 대한 리간드 접합체의 결합 및 세포내이입에 대한 연구
1. 접합체 화합물 CB- 20BK의 세포 결합 및 세포내이입 실험
표지된 샘플 Cy5 -pep- 20BK , Cy5 -FA 및 Cy5 -pep- 20AK의 합성
(1) 0.45 mmol/g의 치환도를 갖는 2 g의 링크 수지를 칭량하고, 고체 상 반응 칼럼에 로딩하고; DCM을 첨가하고, 질소 가스를 용매를 통해 버블링시켜 수지를 30분 동안 팽윤시키고; 용매를 펌핑하고; Fmoc 보호기를 DBLK에 의해 제거한 후; 수지를 DMF로 5회 세척하였다. 0.96 g(1.8 mmol)의 Fmoc-Lys(Dde)-OH 및 0.3 g(2.2 mmol)의 HOBt를 칭량하고, DMF에 용해시키고; 빙수조에 0℃에서 0.33 ml(2.2 mmol)의 DIC를 첨가하고, 혼합하여, 5분 동안 활성화시키고; 혼합물을 반응 칼럼에 첨가하고, 3시간 동안 반응시키고; 용매를 펌핑하고, 수지를 3회 세척하였다. 이후, Fmoc 보호기를 DBLK에 의해 제거하였다.
(2) 상기 언급된 작업을 반복하고, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH 및 중간체 108을 구조에 따라 연속 접합시켰다.
(3) Dde 보호기를 2% 히드라진 수화물/DMF로 각 회에 10분 동안 2회 제거하고, 이후 수지를 DMF로 5회 세척하였다. Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Glu-OtBu 및 프테로산을 연속 접합시켰다.
(4) Dde 보호기를 2% 히드라진 수화물/DMF로 각 회에 10분 동안 2회 제거하고, 이후 수지를 DMF로 5회 세척하고; 수지를 Cy5-COOH와 접합시킨 후, DMF로 2회 세척하고; 마지막으로, 수지를 메탄올로 2회 응축시키고, 용매를 펌핑하여, 3.6 g의 보호된 펩티드 수지를 수득하였다.
(5) 이전 단계에서 수득된 3.6 g의 펩티드 수지를 50 ml 1구 플라스크에 첨가하고; 29 ml의 세포용해 완충제(TFA : H2O : TIS = 95 : 3 : 2(부피비))를 미리 제조하고, 0.4 g의 DTT를 칭량하고, 세포용해 완충액에 첨가하였다. 세포용해 완충제를 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 반응시키고; 수지를 여과하고, 8 ml의 TFA로 세척하고; 여과액을 합하고, 혼합물을 173 ml의 무수 에테르에 첨가하자, 황색 고형물이 침전되었으며, 이를 원심분리하여 고형물을 수득하였고, 이를 무수 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜, 89.6%의 수율 및 76.3%의 HPLC 순도를 갖는 1.9 g의 조생성물을 청색 고형물로서 수득하였다. 생성물을 분취용-HPLC(조건: C18 칼럼, 이동상 A: 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산, B: 아세토니트릴, 용리 구배: (20 내지 28)%B, 용리 시간: 50분; 분획을 수집함)에 의해 분리하고; 적격 생성물을 함유하는 분획을 동결건조시켜, 93.4%의 순도를 갖는 736 mg의 Cy5-pep-20BK를 수득하였다.
동일한 방식으로, 화합물 Cy5-FA 및 Cy5-pep-20AK가 상기 언급된 방법으로 유사한 단계를 통해 수득될 수 있다.
Figure pct00069
Figure pct00070
유세포 분석법에 의해 샘플 Cy5 -pep- 20AK / Cy5 -pep- 20BK의 세포 결합 및 세포내이입을 결출하는 실험
샘플 정보: Cy5-pep-20AK 및 Cy5-pep-20BK
세포주: LNCaP 인간 전립선 암 세포, Du145 인간 전립선 암 세포, SKOV3 인간 난소암 세포 및 NCI-H460 인간 폐암 세포
주요 시약: IMDM 배지, 소 태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신 용액, L-글루타민 및 PBS
실험 작업:
(1) 세포 배양: 세포를 트립신으로 분해하고, 수집하고, 계수한 후, 세포를 완전 배지를 함유하는 여러 배양 플라스크에 첨가하고; 배양 플라스크를 세포 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣고, 마지막으로, 약 5 Х 106개 세포를 원심분리 튜브에 수집하였다.
(2) 샘플 인큐베이션: Cy5-pep-20AK/Cy5-pep-20BK 샘플을 PBS로 8 nmol/L까지 희석하고; 세포 현탁액을 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고; 상청액을 제거하고, 잔류물을 PBS로 1회 세척하고; 세포를 균일하게 현탁시키고, 실험 계획에 따라 상이한 원심분리 튜브에 동등하게 분할하고; PBS를 원심분리에 의해 제거하고; 200 μl의 샘플 작업 용액을 각 튜브에 첨가하고, 37℃에서 각각 15분, 30분, 60분, 및 90분 동안 인큐베이션하고, PBS만 첨가된 1개의 튜브를 블랭크 대조로서 사용하고; 모든 작업을 광 노출을 피하여 수행하였다.
(3) 세척 및 로딩: 작업 용액을 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 제거하고, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 적절한 양의 PBS를 1 Х 106개 세포/ml까지 세포가 현탁되도록 첨가하고; Beckman CytoFLEX 유세포 분석기를 스타트업 세정 과정을 완료하기 미리 작동시키고; 세포 샘플을 연속하여 로딩하고, 10,000개의 생세포의 형광을 APC 채널에서 판독하고; 모든 작업을 광 노출을 피하여 수행하였다.
(4) 데이터 분석: 각 세포 샘플의 APC 형광의 절대 MFI(평균 형광 강도) 및 상대 블랭크 대조의 상대 MFI를 얻고, 데이터 선 그래프를 상대 MFI에 따라 완성하였다.
결과 및 분석
[표 7]
Figure pct00071
Depmap로부터의 데이터에 따르면, 0 또는 음수인 데이터는 "-"로 표시되고, 0.001 내지 0.499인 데이터는 "+/-"로 표시되고, 0.500 내지 1.499인 데이터는 "+"로 표시되고, 1.500 내지 2.499인 데이터는 "2+"로 표시되는 등이다.
세포의 형광 강도를 각각 인큐베이션 15분, 30분, 60분, 및 90분에 검출하고, 결과를 플롯팅하였고, 이는 도 2a 및 도 2b에 나타나 있다. 도면으로부터 샘플 Cy5-pep-20BK 세포의 결합 및 세포내이입을 알 수 있다. FOLR1의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 DU145 세포주 및 FOLH1의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 NCI-H460 세포주와 비교하여, FOLR1의 상대적으로 높은 발현을 갖는 LNCaP 세포주 및 FOLH1의 상대적으로 높은 발현을 갖는 SKOV3 세포주는 결합되고 세포내이입된 CB-20BK의 유의하게 더 높은 형광 강도를 가졌다. Cy5-pep-20AK는 오로지 FOLH1 리간드만을 포함하고 FOLR1 리간드, FA를 포함하지 않기 때문에, Cy5-pep-20AK는 FOLH1의 높은 발현을 갖는 LNCaP 세포에서 높은 수준의 결합 및 세포내이입을 나타내고, FOLH1 중간 수준의 발현을 갖는 SKOV3 세포에서 중간 수준의 결합 및 세포내이입 수준을 나타내고; 두 세포주에서, Cy5-pep-20AK의 결합 및 세포내이입은 Cy5-pep-CB-20BK보다 유의하게 더 낮았다. 세포에 대한 리간드 접합체의 결합 및 내재화의 정도는 세포-관련 수용체의 발현 수준과 양의 상관관계에 있었다.
2. 세포에 대한 단일-리간드 접합체 Cy5 -FA의 결합 및 세포내이입 실험
샘플 정보: Cy5-FA
세포주: 헬라 자궁경부암 세포, SKOV3 인간 난소암 세포 및 A549 인간 폐암 세포
주요 시약: IMDM 배지, 소 태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신 용액, L-글루타민, PBS, 및 DAPI를 함유하는 항형광 켄칭 마운팅 배지
실험 작업:
(1) 커버슬립 상에서의 세포 성장: 커버슬립을 24-웰 플레이트에 배치하고; 세포를 트립신으로 분해하고, 수집하고, 계수한 후, 세포를 완전 세포 배양 배지로 약 2 Х 105개 세포/ml까지 희석하고; 500 μl의 희석된 세포 용액을 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고; 플레이트를 48시간 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
(2) 샘플 인큐베이션: Cy5-FA 샘플을 IMDM 배지에 73 nmol/L까지 희석하고; 24-웰 플레이트에서 배양 배지를 버리고; 200 μl의 샘플 작업 용액을 각 웰의 세포 커버슬립에 첨가하고, 37℃에서 각각 30분 및 60분 동안 인큐베이션하고, IMDM 배지만 첨가된 1개의 웰을 블랭크 대조로서 사용하고; 모든 작업을 광 노출을 피하여 수행하였다.
(3) 세척 및 마운팅: 24-웰 플레이트에서 작업 용액을 버리고, 플레이트를 37℃에서 예열된 PBS로 3회 세척하고; 세포 커버슬립을 꺼내고, 5 μl의 DAPI를 함유하는 항형광 켄칭 마운팅 배지를 슬라이드 상에 적가한 다음, 세포 커버슬립으로 커버링하여 마운팅을 완료하고; 모든 작업을 광 노출을 피하여 수행하였다.
(4) 샘플에 대한 이미지 해석: Leica 형광 현미경 DM2500을 작동시켜 15분 동안 형광 여기기를 예열하고; 동일한 위치에서, 세포 핵 및 Cy5 플루오레세인을 상응하는 형광 채널에서 촬영하고, 이미지 융합을 소프트웨어에서 완료하였다.
도 3으로부터 15분 및 30분의 세포에 대한 샘플 Cy5-FA의 결합 및 세포내이입을 알 수 있으며, FOLR1의 높은 발현을 갖는 SKOV-3 및 세포주 헬라에서의 형광 강도는 FOLR1의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 세포주 A549에서보다 유의하게 더 높았다. 세포에 대한 리간드 접합체의 결합 및 내재화의 정도는 세포-관련 수용체의 발현 수준과 양의 상관관계에 있었다.
실시예 4: 접합체 화합물에서 세포 확장을 억제하는 실험
1. CB-20BK에서 종양 세포 확장을 억제하는 실험
샘플 정보: CB-20BK
세포주: KB 인간 구강 표피 암종 세포, T-47D 인간 유방암 세포, NCI-H460 인간 폐암 세포, CALU-3 인간 폐 선암 세포, HuH-7 인간 간암 세포 및 LNCaP 인간 전립선 암 세포
주요 시약: IMDM 배지, 소 태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신 용액, L-글루타민 및 CCK8
실험 작업:
1) 세포 플레이팅
세포를 미리 준비하고, 트립신으로 분해하고, 수집하고, 계수하고; 완전 세포 배양 배지로 KB 세포를 2.5 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, T-47D 세포를 1.3 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, NCI-H460 세포를 3.5 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, CALU-3 세포를 4.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, HuH-7 세포를 3.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, LNCaP 세포를 8.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고; 희석된 세포 용액 중 100 μl를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조 웰을 각 플레이트에 대하여 설정하였다. 세포가 첨가된 96-웰 플레이트를 밤새 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
2) 샘플 희석 및 첨가
샘플을 배양 배지로 요망되는 농도까지 희석하였다(표 8 참조). 밤새 배양된 96-웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 희석된 샘플을 3중 웰로 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조를 설정하고; 플레이트를 72시간 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
[표 8]
Figure pct00072
3) 발색 및 판독 플레이트
각 웰에 15 μl(웰에서 액체 부피의 10%)의 CCK-8로부터의 발색 용액을 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 (1.0 내지 2.0 범위의 OD 값이 유지되게 하기에) 적절한 시간 동안 인큐베이션하고; 96-웰 플레이트의 커버를 제거하고, 플레이트를 마이크로플레이터 리더(Molecular Devices Spectra MAX Plus)로 450 nm에서 판독하였다.
4) 데이터 처리
데이터를 SoftMax Pro를 사용하여 편집하고, 4-매개변수 핏팅 곡선을 플롯팅하였다.
5) 실험 결과 및 분석
4-매개변수 핏팅 곡선 그래프에 따르면(도 4a, 여기서 C 값은 IC50에 해당), CB-20BK는 KB, T-47D, NCI-H460, CALU-3, HuH-7, 및 LNCaP 종양 세포주의 성장 및 확장에 대한 억제 효과를 가졌다. 세포에서 접합체 화합물의 해당 수용체의 발현 수준은 상이하기 때문에, 억제 수준이 상이하다. 수용체의 상대적으로 높은 발현을 갖는 세포주 T-47D, KB, LNCaP, HuH-7 및 CALU-3에 대한 IC50은 수용체의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 세포주 NCI-H460보다 유의하게 더 낮았다. CB-20BK은 종양 성장 억제 효과와 세포-관련 수용체의 발현 수준 사이에 상관관계를 나타냈다.
2. 종양 세포주 LNCaP (인간 전립선 암 세포 ) 및 22RV1(인간 전립선 암 세포)의 확장을 억제하는 접합체 화합물 CB-20BK 및 관련 화합물의 실험
상이한 세포는 리간드 접합체에서 페이로드의 세포 증식 억제 독성에 상이한 민감도를 갖기 때문에, 정량 분석이 종종 간섭받을 수 있다. 상이한 리간드 수용체의 알려진 발현 수준을 갖는 일련의 세포주를 선택하고, 리간드 접합체 및 단일 페이로드의 세포 증식 억제 효과에 대한 반응을 시험하였다. 이러한 간섭을 없애기 위해 동일한 세포주에서 리간드 접합체에 대한 단일 페이로드의 IC50 비율을 취했다.
관련 샘플: MMAE, CB-20BK, CB-20AK 및 FA-MMAE
실험 작업: LNCaP 및 22RV1 세포를 미리 준비하고, 계수하고, 각각 4 Х 104개 세포/ml 및 2.0 Х 104개 세포/ml의 세포 밀도로(100 μl/웰) 96-웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅하고; 음성 대조 및 블랭크 대조 웰을 각 플레이트에 대하여 설정하였다. 밤새 접착 세포 배양 후, 시험하고자 하는 희석된 샘플을 50 μl/웰로 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣고, 68시간 내지 72시간 동안 배양하였다. 각 웰에 15 μl(웰에서 액체 부피의 10%)의 CCK8로부터의 발색 용액을 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 45분 내지 70분 동안 인큐베이션하고, 각 플레이트를 마이크로플레이트 리더로 450 nm에서 판독하였다. 데이터를 SoftMax Pro를 사용하여 편집하고, 4-P 핏팅 곡선을 플롯팅하였다. 계산된 데이터는 표 9에 나타나 있다.
[표 9]
Figure pct00073
상기 표로부터, LNCaP와 22RV1 사이의 FOLR1의 발현 수준에서 큰 차이가 없고, LNCaP에서의 FOLH1의 발현 수준은 22RV1에서의 FOLH1의 발현 수준보다 유의하게 더 높다는 것을 알 수 있다. CB-20BK(FOLH1 리간드 및 FOLR1 리간드가 있는) 및 CB-20AK(FOLH1 리간드만 있는)는 LNCaP와 22RV1 종양 세포주 둘 모두의 확장에 대하여 억제 효과를 가졌다. 수용체 FOLH1의 상이한 발현 수준을 갖는 세포에 대한 CB-20BK 및 CB-20AK의 억제 효과는 상이했다. 수용체 FOLH1의 상대적으로 높은 발현을 갖는 세포주 LNCaP에서 IC50 비율은 수용체의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 세포주 22RV1에서 IC50 비율보다 2배 내지 4배 더 높았다. FA-MMAE는 또한 LNCaP 및 22RV1 종양 세포주의 확장에 대한 억제 효과를 가졌다. LNCaP 및 22RV1에서 FOLR1의 발현 수준은 매우 낮기 때문에, LNCaP 세포에서의 발현(FOLR1 유전자 발현 수준은 Depmap로부터의 데이터를 참조하여 0.3219임)은 22RV1(FOLR1 유전자 발현 수준은 Depmap로부터의 데이터를 참조하여 0.0704임)보다 약간 더 높고, LNCaP와 22RV1 사이의 FA-MMAE의 IC50 비율은 단지 1.5 배 상이했다. 상기 데이터는 세포 증식에 대한 억제 효과가 세포 발현 수용체 FOLH1 및 FOLR1의 발현 수준과 양의 상관관계가 있다는 것을 지시한다.
3. 종양 세포주 PANC -1(인간 췌장암 세포) 및 CFPAC -1(인간 췌장암 세포)의 확장을 억제하는 접합체 화합물 CB-20BK 및 관련 화합물의 실험
관련 샘플: MMAE 및 CB-20BK
실험 작업: PANC-1 및 CFPAC-1 세포를 미리 준비하고, 계수하고, 4 Х 104개 세포/ml의 세포 밀도(100 μl/웰)로 96-웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅하고; 음성 대조 및 블랭크 대조 웰을 각 플레이트에 대하여 설정하였다. 밤새 접착 세포 배양 후, 시험하고자 하는 희석된 샘플을 50 μl/웰로 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣고, 68시간 내지 72시간 동안 배양하였다. 각 웰에 15 μl(웰에서 액체 부피의 10%)의 CCK8로부터의 발색 용액을 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 45분 내지 70분 동안 인큐베이션하고, 각 플레이트를 마이크로플레이트 리더로 450 nm에서 판독하였다. 데이터를 SoftMax Pro를 사용하여 편집하고, 4-P 핏팅 곡선을 플롯팅하였다. 계산된 데이터는 하기 표에 나타나 있다:
[표 10]
Figure pct00074
표 10으로부터, CFPAC-1에서 FOLH1의 발현 수준은 매우 낮고, CFPAC-1에서 FOLR1의 발현 수준은 PANC1 세포주에서보다 유의하게 더 높다는 것을 알 수 있다. CB-20BK은 PANC-1 및 CFPAC-1 종양 세포주의 확장에 대한 억제 효과를 가졌다. 수용체 FOLR1의 상이한 발현 수준을 갖는 세포에 대한 억제 효과는 상이했다. 수용체 FOLR1의 상대적으로 높은 발현을 갖는 세포주 CFPAC-1에서 IC50 비율은 수용체 FOLR1의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 PANC-1에서 IC50 비율보다 유의하게 더 높고, 세포 증식에 대한 억제 효과는 세포-관련 수용체 FOLR1의 발현 수준과 양의 상관관계에 있었다.
실험 2 및 실험 3은 세포 표면에서 발현된 CB-20BK에서 두 개의 리간드 및 그의 수용체(FOLR1 및 FOLH1)가 종양 세포 증식을 억제하는 화합물에서 중요한 역할을 한다는 것을 입증해 준다.
4. CB-20B에서 종양 세포 확장을 억제하는 실험
샘플 정보: CB-20B
세포주: A549 인간 폐암 세포, HuH-7 인간 간암 세포, KB 인간 구강 표피 암종 세포, LNCaP 인간 전립선 암 세포, DU145 인간 전립선 암 세포 및 T-47D 인간 유방암 세포
주요 시약: IMDM 배지, 소 태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신 용액, L-글루타민 및 CCK8
실험 작업:
1) 세포 플레이팅
세포를 미리 준비하고, 트립신으로 분해하고, 수집하고, 계수하고; 완전 세포 배양 배지로 희석된, A549 세포, HuH-7 세포, KB 세포 및 DU145 세포를 2 Х 104개 세포/ml의 밀도로 플레이팅하고, T-47D 세포를 1 Х 105개 세포/ml의 밀도로 플레이팅하고, LNCaP 세포를 6 Х 104개 세포/ml의 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하고; 희석된 세포 용액 중 100 μl를 각 웰에 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조 웰을 각 플레이트에 대하여 설정하였다. 세포가 첨가된 96-웰 플레이트를 밤새 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
2) 샘플 희석 및 첨가
샘플을 배양 배지로 요망되는 농도까지 희석하였다(표 11 참조). 밤새 배양된 96-웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 희석된 샘플을 3중 웰로 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조를 설정하고; 플레이트를 72시간 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
[표 11]
Figure pct00075
3) 발색 및 판독 플레이트
각 웰에 15 μl(웰에서 액체 부피의 10%)의 CCK-8로부터의 발색 용액을 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 (1.0 내지 2.0 범위의 OD 값이 유지되게 하기에) 적절한 시간 동안 인큐베이션하고; 96-웰 플레이트의 커버를 제거하고, 플레이트를 마이크로플레이터 리더(Molecular Devices Spectra MAX Plus)로 450 nm에서 판독하였다.
4) 데이터 처리
데이터를 SoftMax Pro를 사용하여 편집하고, 4-매개변수 핏팅 곡선을 플롯팅하였다.
5) 실험 결과 및 분석
4-매개변수 핏팅 곡선 그래프에 따르면(도 4b, 여기서 C 값은 IC50에 해당), CB-20B는 A549, HuH-7, KB, LNcap, DU145 및 T-47D 종양 세포주의 성장 및 확장에 대한 억제 효과를 가졌다. 세포에서 접합체 화합물의 해당 수용체의 발현 수준은 상이하기 때문에, 억제 수준이 상이하다. 수용체의 상대적으로 높은 발현을 갖는 세포주 T-47D, LNcap, KB, HuH-7 및 DU145에 대한 IC50은 수용체의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 세포주 A549보다 유의하게 더 낮았다. CB-20B는 종양 성장 억제 효과와 세포-관련 수용체의 발현 수준 사이에 상관관계를 나타냈다.
5. CB-10S에서 종양 세포 확장을 억제하는 실험
샘플 정보: CB-10S
세포주: KB 인간 구강 표피 암종 세포, NCI-H460 인간 폐암 세포, RT4 인간 방광암 세포, T-47D 인간 유방암 세포 및 LNCaP 인간 전립선 암 세포
주요 시약: IMDM 배지, 소 태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신 용액, L-글루타민 및 CCK8
실험 작업:
1) 세포 플레이팅
세포를 미리 준비하고, 트립신으로 분해하고, 수집하고, 계수하고; 완전 세포 배양 배지로 KB 세포를 3.5 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, LNCaP 세포를 2.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, T-47D 세포를 1.2 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, NCI-H460 세포를 2.5 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, RT4 세포를 1.2 Х 104개 세포/ml까지 희석하고; 96-웰 플레이트의 각 웰에 희석된 세포 용액 중 100 μl를 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조 웰을 각 플레이트에 대하여 설정하였다. 세포가 첨가된 96-웰 플레이트를 밤새 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
2) 샘플 희석 및 첨가
샘플을 배양 배지로 요망되는 농도까지 희석하였다(표 12 참조). 밤새 배양된 96-웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 희석된 샘플을 3중 웰로 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조를 설정하고; 플레이트를 72시간 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
[표 12]
Figure pct00076
3) 발색 및 판독 플레이트
각 웰에 15 μl(웰에서 액체 부피의 10%)의 CCK-8로부터의 발색 용액을 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 (1.0 내지 2.0 범위의 OD 값이 유지되게 하기에) 적절한 시간 동안 인큐베이션하고; 96-웰 플레이트의 커버를 제거하고, 플레이트를 마이크로플레이터 리더(Molecular Devices Spectra MAX Plus)로 450 nm에서 판독하였다.
4) 데이터 처리
데이터를 SoftMax Pro를 사용하여 편집하고, 4-매개변수 핏팅 곡선을 플롯팅하였다.
5) 실험 결과 및 분석
4-매개변수 핏팅 곡선 그래프에 따르면(도 4c, 여기서 C 값은 IC50에 해당), CB-10S는 KB, LNCaP, T-47D, RT4 및 NCI-H460 종양 세포주의 성장 및 확장에 대한 억제 효과를 가졌다. 세포에서 접합체 화합물의 해당 수용체의 발현 수준은 상이하기 때문에, 억제 수준이 상이하다. 수용체의 상대적으로 높은 발현을 갖는 세포주 KB, LNcap, T-47D 및 RT4에 대한 IC50은 수용체의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 세포주 NCI-H460보다 유의하게 더 낮았다. CB-10S는 종양 성장 억제 효과와 세포-관련 수용체의 발현 수준 사이에 상관관계를 나타냈다.
6. CB-60S에서 종양 세포 확장을 억제하는 실험
샘플 정보: CB-60S
세포주: KB 인간 구강 표피 암종 세포, T-47D 인간 유방암 세포, NCI-H460 인간 폐암 세포, CALU-3 인간 폐 선암 세포, HuH-7 인간 간암 세포 및 LNCaP 인간 전립선 암 세포
주요 시약: IMDM 배지, 소 태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신 용액, L-글루타민 및 CCK8
실험 작업:
1) 세포 플레이팅
세포를 미리 준비하고, 트립신으로 분해하고, 수집하고, 계수하고; 완전 세포 배양 배지로 KB 세포를 2.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, T-47D 세포를 1.5 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, NCI-H460 세포를 2.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, CALU-3 세포를 3.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, HuH-7 세포를 4.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, LNCaP 세포를 8.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고; 희석된 세포 용액 중 100 μl를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조 웰을 각 플레이트에 대하여 설정하였다. 세포가 첨가된 96-웰 플레이트를 밤새 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
2) 샘플 희석 및 첨가
샘플을 배양 배지로 요망되는 농도까지 희석하였다(표 13 참조). 밤새 배양된 96-웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 희석된 샘플을 3중 웰로 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조를 설정하고; 플레이트를 72시간 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
[표 13]
Figure pct00077
3) 발색 및 판독 플레이트
각 웰에 15 μl(웰에서 액체 부피의 10%)의 CCK-8로부터의 발색 용액을 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 (1.0 내지 2.0 범위의 OD 값이 유지되게 하기에) 적절한 시간 동안 인큐베이션하고; 96-웰 플레이트의 커버를 제거하고, 플레이트를 마이크로플레이터 리더(Molecular Devices Spectra MAX Plus)로 450 nm에서 판독하였다.
4) 데이터 처리
데이터를 SoftMax Pro를 사용하여 편집하고, 4-매개변수 핏팅 곡선을 플롯팅하였다.
5) 실험 결과 및 분석
4-매개변수 핏팅 곡선 그래프에 따르면(도 4d, 여기서 C 값은 IC50에 해당), CB-60S는 KB, T-47D, NCI-H460, CALU-3, HuH-7, 및 LNCaP 종양 세포주의 성장 및 확장에 대한 억제 효과를 가졌다. 세포에서 접합체 화합물의 해당 수용체의 발현 수준은 상이하기 때문에, 억제 수준이 상이하다. 수용체의 상대적으로 높은 발현을 갖는 세포주 LNCaP 및 HuH-7에 대한 IC50은 수용체의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 세포주 NCI-H460, KB, T-47D 및 CALU-3보다 유의하게 더 낮았다. CB-60S는 종양 성장 억제 효과와 세포-관련 수용체의 발현 수준 사이에 상관관계를 나타냈다.
7. CB-60SK에서 종양 세포 확장을 억제하는 실험
샘플 정보: CB-60SK
세포주: KB 인간 구강 표피 암종 세포, T-47D 인간 유방암 세포, NCI-H460 인간 폐암 세포, CALU-3 인간 폐 선암 세포, HuH-7 인간 간암 세포 및 LNCaP 인간 전립선 암 세포
주요 시약: IMDM 배지, 소 태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신 용액, L-글루타민 및 CCK8
실험 작업:
1) 세포 플레이팅
세포를 미리 준비하고, 트립신으로 분해하고, 수집하고, 계수하고; 완전 세포 배양 배지로 KB 세포를 2.5 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, T-47D 세포를 1.3 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, NCI-H460 세포를 3.5 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, CALU-3 세포를 4.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, HuH-7 세포를 3.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, LNCaP 세포를 8.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고; 희석된 세포 용액 중 100 μl를 각 웰에 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조 웰을 각 플레이트에 대하여 설정하였다. 세포가 첨가된 96-웰 플레이트를 밤새 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
2) 샘플 희석 및 첨가
샘플을 배양 배지로 요망되는 농도까지 희석하였다(표 14 참조). 밤새 배양된 96-웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 희석된 샘플을 3중 웰로 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조를 설정하고; 플레이트를 72시간 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
[표 14]
Figure pct00078
3) 발색 및 판독 플레이트
각 웰에 15 μl(웰에서 액체 부피의 10%)의 CCK-8로부터의 발색 용액을 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 (1.0 내지 2.0 범위의 OD 값이 유지되게 하기에) 적절한 시간 동안 인큐베이션하고; 96-웰 플레이트의 커버를 제거하고, 플레이트를 마이크로플레이터 리더(Molecular Devices Spectra MAX Plus)로 450 nm에서 판독하였다.
4) 데이터 처리
데이터를 SoftMax Pro를 사용하여 편집하고, 4-매개변수 핏팅 곡선을 플롯팅하였다.
5) 실험 결과 및 분석
4-매개변수 핏팅 곡선 그래프에 따르면(도 4e, 여기서 C 값은 IC50에 해당), CB-60SK는 KB, T-47D, NCI-H460, CALU-3, HuH-7, 및 LNCaP 종양 세포주의 성장 및 확장에 대한 억제 효과를 가졌다. 세포에서 접합체 화합물의 해당 수용체의 발현 수준은 상이하기 때문에, 억제 수준이 상이하다. 수용체의 상대적으로 높은 발현을 갖는 세포주 LNCaP 및 HuH-7에 대한 IC50은 수용체의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 세포주 T-47D, NCI-H460, CALU-3 및 KB보다 유의하게 더 낮았다. CB-60SK는 종양 성장 억제 효과와 세포-관련 수용체의 발현 수준 사이에 상관관계를 나타냈다.
8. CB-18G에서 종양 세포 확장을 억제하는 실험
샘플 정보: CB-18G
세포주: A549 인간 폐암 세포, 헬라 인간 자궁경부암 세포, SCLC-21H 소세포 폐암 세포, U-2 OS 인간 골육종 세포, T-47D 인간 유방암 세포 및 NCI-H460 인간 폐암 세포
주요 시약: IMDM 배지, 소 태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신 용액, L-글루타민 및 CCK8
실험 작업:
1) 세포 플레이팅
세포를 미리 준비하고, 트립신으로 분해하고, 수집하고, 계수하고; 완전 세포 배양 배지로 희석된, A549 세포, 헬라 세포, SCLC-21H 세포 및 U-2 OS 세포를 2 Х 104개 세포/ml의 밀도로 플레이팅하고, T-47D 세포 및 NCI-H460 세포를 3 Х 104개 세포/ml의 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하고; 희석된 세포 용액 중 100 μl를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조 웰을 각 플레이트에 대하여 설정하였다. 세포가 첨가된 96-웰 플레이트를 밤새 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
2) 샘플 희석 및 첨가
샘플을 배양 배지로 요망되는 농도까지 희석하였다(표 15 참조). 밤새 배양된 96-웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 희석된 샘플을 3중 웰로 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조를 설정하고; 플레이트를 72시간 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
[표 15]
Figure pct00079
3) 발색 및 판독 플레이트
각 웰에 15 μl(웰에서 액체 부피의 10%)의 CCK-8로부터의 발색 용액을 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 (1.0 내지 2.0 범위의 OD 값이 유지되게 하기에) 적절한 시간 동안 인큐베이션하고; 96-웰 플레이트의 커버를 제거하고, 플레이트를 마이크로플레이터 리더(Molecular Devices Spectra MAX Plus)로 450 nm에서 판독하였다.
4) 데이터 처리
데이터를 SoftMax Pro를 사용하여 편집하고, 4-매개변수 핏팅 곡선을 플롯팅하였다.
5) 실험 결과 및 분석
4-매개변수 핏팅 곡선 그래프에 따르면(도 4f, 여기서 C 값은 IC50에 해당), CB-18G는 A549, 헬라, SCLC-21H, U-2 OS, T-47D 및 NCI-H460 종양 세포주의 성장 및 확장에 대한 억제 효과를 가졌다. 세포에서 접합체 화합물의 해당 수용체의 발현 수준은 상이하기 때문에, 억제 수준이 상이하다. 수용체의 상대적으로 높은 발현을 갖는 세포주 헬라에 대한 IC50은 수용체의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 세포주 NCI-H460보다 유의하게 더 낮았다. CB-18G는 종양 성장 억제 효과와 세포-관련 수용체의 발현 수준 사이에 상관관계를 나타냈다.
9. CB-50S에서 종양 세포 확장을 억제하는 실험
샘플 정보: CB-50S
세포주: KB 인간 구강 표피 암종 세포, NCI-H460 인간 폐암 세포, RT4 인간 방광암 세포, T-47D 인간 유방암 세포 및 LNCaP 인간 전립선 암 세포
주요 시약: IMDM 배지, 소 태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신 용액, L-글루타민 및 CCK8
실험 작업:
1) 세포 플레이팅
세포를 미리 준비하고, 트립신으로 분해하고, 수집하고, 계수하고; 완전 세포 배양 배지로 KB 세포를 3.5 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, LNCaP 세포를 2.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, T-47D 세포를 1.2 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, NCI-H460 세포를 2.5 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, RT4 세포를 1.2 Х 105개 세포/ml까지 희석하고; 96-웰 플레이트의 각 웰에 희석된 세포 용액 중 100 μl를 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조 웰을 각 플레이트에 대하여 설정하였다. 세포가 첨가된 96-웰 플레이트를 밤새 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
2) 샘플 희석 및 첨가
샘플을 배양 배지로 요망되는 농도까지 희석하였다(표 16 참조). 밤새 배양된 96-웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 희석된 샘플을 3중 웰로 첨가하고; 음성 대조 및 블랭크 대조를 설정하고; 플레이트를 72시간 배양을 위해 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
[표 16]
Figure pct00080
3) 발색 및 판독 플레이트
각 웰에 15 μl(웰에서 액체 부피의 10%)의 CCK-8로부터의 발색 용액을 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 (1.0 내지 2.0 범위의 OD 값이 유지되게 하기에) 적절한 시간 동안 인큐베이션하고; 96-웰 플레이트의 커버를 제거하고, 플레이트를 마이크로플레이터 리더(Molecular Devices Spectra MAX Plus)로 450 nm에서 판독하였다.
4) 데이터 처리
데이터를 SoftMax Pro를 사용하여 편집하고, 4-매개변수 핏팅 곡선을 플롯팅하였다.
5) 실험 결과 및 분석
4-매개변수 핏팅 곡선 그래프에 따르면(도 4g, 여기서 C 값은 IC50에 해당), CB-50S는 KB, LNCaP, T-47D, RT4 및 NCI-H460 종양 세포주의 성장 및 확장에 대한 억제 효과를 가졌다. 세포에서 접합체 화합물의 해당 수용체의 발현 수준은 상이하기 때문에, 억제 수준이 상이하다. 수용체의 상대적으로 높은 발현을 갖는 세포주 KB, LNcap, T-47D 및 RT4에 대한 IC50은 수용체의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 세포주 NCI-H460보다 유의하게 더 낮았다. CB-50S는 종양 성장 억제 효과와 세포-관련 수용체의 발현 수준 사이에 상관관계를 나타냈다.
10. 접합체 화합물 CB-1020에서 종양 세포 확장을 억제하는 실험
실험 목적: 종양 세포주 LNCaP(인간 전립선 암 세포), SK-BR-3(인간 유방암 세포), NCI-H226(인간 폐암 세포), CFPAC-1(췌장암 세포) 및 PANC-1(췌장암 세포)의 발현에 대한 CB-1020 및 관련 화합물의 억제 효과 시험.
관련 샘플: MMAE 및 CB-1020
실험 작업: LNCaP, SK-BR-3, NCI-H226, CFPAC-1 및 PANC-1 세포를 미리 준비하고, 계수하고; 배양 배지(IMDM + 10% FBS + 1X L-글루타민 + 1X P/S)로 세포 LNCaP, SK-BR-3 및 CFPAC-1을 4 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, NCI-H226을 2.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, PANC-1을 3.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고; 희석된 세포 용액을 96-웰 플레이트에 100 μl/웰로 플레이팅하고; 음성 대조 및 블랭크 대조 웰을 각 플레이트에 대하여 설정하였다. 밤새 접착 세포 배양 후, 시험하고자 하는 희석된 샘플을 50 μl/웰로 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣고, 68시간 내지 72시간 동안 배양하였다. 각 웰에 15 μl(웰에서 액체 부피의 10%)의 CCK8로부터의 발색 용액을 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 45분 내지 70분 동안 인큐베이션하고, 각 플레이트를 마이크로플레이트 리더로 450 nm에서 판독하였다. 데이터를 SoftMax Pro를 사용하여 편집하고, 4-P 핏팅 곡선을 플롯팅하였다. 데이터는 하기 표에 나타나 있다:
[표 17]
Figure pct00081
상기 표로부터, LNCaP와 SK-BR-3 둘 모두는 TRPV6 및 FOLRH1을 발현한다(여기서, LNCap는 두 수용체의 상대적으로 더 높은 발현 수준을 가짐)는 것을 알 수 있다. NCI-H226, CFPAC-1 및 PANC-1은 낮거나 약한 수준으로 두 수용체를 발현하였다. CB-1020은 LNCaP, SK-BR-3, NCI-H226, CFPAC-1 및 PANC-1 종양 세포주의 성장 및 확장에 대하여 억제 효과를 가졌다. 두 수용체의 상대적으로 높은 발현을 갖는 세포주 LNCaP에 대한 CB-1020의 IC50 비율은 수용체의 중간 발현을 갖는 세포주 SK-BR-3에 대한 IC50 비율보다 더 높고; SK-BR-3에 대한 IC50 비율은 수용체의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 CFPAC-1 및 두 수용체의 약한 발현을 갖는 세포주 NCI-H226 및 PANC-1보다 더 높았다. 세포 증식에 대한 억제 효과는 세포에서 두 수용체의 발현 수준과 양의 상관관계에 있었다.
11. 접합체 화합물 CB-1320에서 종양 세포 확장을 억제하는 실험
실험 목적: 종양 세포주 LNCaP(인간 전립선 암 세포), SK-BR-3(인간 유방암 세포), MDA-MB-468(인간 유방암 세포) 및 CFPAC-1(췌장암 세포)의 확장에 대한 CB-1320 및 관련 화합물의 억제 효과 시험.
관련 샘플: MMAE 및 CB-1320
실험 작업: LNCaP, SK-BR-3, MDA-MB-468 및 CFPAC-1 세포를 미리 준비하고, 계수하고; 배양 배지(IMDM + 10% FBS + 1X L-글루타민 + 1X P/S)로 세포 LNCaP, SK-BR-3, MDA-MB-468 및 CFPAC-1을 4 Х 104개 세포/ml까지 희석하고; 희석된 세포 용액을 96-웰 플레이트에 100 μl/웰로 플레이팅하고; 음성 대조 및 블랭크 대조 웰을 각 플레이트에 대하여 설정하였다. 밤새 접착 세포 배양 후, 시험하고자 하는 희석된 샘플을 50 μl/웰로 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣고, 68시간 내지 72시간 동안 배양하였다. 각 웰에 15 μl(웰에서 액체 부피의 10%)의 CCK8로부터의 발색 용액을 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 45분 내지 70분 동안 인큐베이션하고, 각 플레이트를 마이크로플레이트 리더로 450 nm에서 판독하였다. 데이터를 SoftMax Pro를 사용하여 편집하고, 4-P 핏팅 곡선을 플롯팅하였다. 구체적인 데이터는 하기 표에 나타나 있다:
[표 18]
Figure pct00082
상기 표로부터, 4개 세포주에서 GNRHR의 발현 수준은 거의 동등하고, LNCaP에서 FOLH1의 발현 수준은 다른 세포주보다 유의하게 더 높다는 것을 알 수 있다. CB-1320은 4개 종양 세포주의 확장에 대한 억제 효과를 가졌다. 수용체 FOLH1의 상이한 발현 수준을 갖는 세포에 대한 CB-1320의 억제 효과는 상이했다. 수용체 FOLH1의 상대적으로 높은 발현을 갖는 세포주 LNCap에서 IC50 비율은 수용체의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 다른 세포주에서 IC50 비율보다 유의하게 더 높았다.
12. 접합체 화합물 CB-1820에서 종양 세포 확장을 억제하는 실험
실험 목적: 종양 세포주 LNCaP(인간 전립선 암 세포), MDA-MB-468(인간 유방암 세포), CFPAC-1(췌장암 세포) 및 PANC-1(췌장암 세포)의 확장에 대한 CB-1820 및 관련 화합물의 억제 효과 시험.
관련 샘플: MMAE 및 CB-1820
실험 작업: LNCaP, MDA-MB-468, CFPAC-1 및 PANC-1 세포를 미리 준비하고, 계수하고; 배양 배지(IMDM + 10% FBS + 1X L-글루타민 + 1X P/S)로 세포 LNCaP, MDA-MB-468 및 CFPAC-1을 4 Х 104개 세포/ml까지 희석하고, PANC-1을 3.0 Х 104개 세포/ml까지 희석하고; 희석된 세포 용액을 96-웰 플레이트에 100 μl/웰로 플레이팅하고; 음성 대조 및 블랭크 대조 웰을 각 플레이트에 대하여 설정하였다. 밤새 접착 세포 배양 후, 시험하고자 하는 희석된 샘플을 50 μl/웰로 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣고, 68시간 내지 72시간 동안 배양하였다. 각 웰에 15 μl(웰에서 액체 부피의 10%)의 CCK8로부터의 발색 용액을 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 45분 내지 70분 동안 인큐베이션하고, 각 플레이트를 마이크로플레이트 리더로 450 nm에서 판독하였다. 데이터를 SoftMax Pro를 사용하여 편집하고, 4-P 핏팅 곡선을 플롯팅하였다. 특정 값은 하기 표에 나타나 있다:
[표 19]
Figure pct00083
상기 표로부터, LNCap, MDA-MB-468, CFPAC-1 및 PANC-1에서 SSTR2의 발현 수준은 거의 동등하고, LNCaP에서 FOLH1의 발현 수준은 다른 세포주에서 FOLH1의 발현 수준보다 유의하게 더 높다는 것을 알 수 있다. CB-1820은 4개 종양 세포주의 확장에 대한 억제 효과를 가졌다. 수용체 FOLH1의 상이한 발현 수준을 갖는 세포에 대한 CB-1820의 억제 효과는 상이했다. 수용체의 상대적으로 높은 발현을 갖는 세포주 LNCaP에서 IC50 비율은 수용체의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 다른 세포주에서 IC50 비율보다 유의하게 더 높고, 세포 증식에 대한 억제 효과는 세포-관련 수용체 FOLH1의 발현 수준과 양의 상관관계에 있었다.
13. 접합체 화합물 CR19425, CR19426 및 CR19428에서 종양 세포 확장을 억제하는 실험
실험 목적: 종양 세포주 NCI-H226(인간 폐암 세포), CFPAC-1(인간 췌장암 세포) 및 MDA-MB-468(인간 유방암 세포)의 확장에 대한 CR19428, CR19425, CR19426 및 관련 화합물의 억제 효과 시험.
관련 샘플: SN-38, Dxd0017, CR19428, CR19425 및 CR19426
실험 작업: NCI-H226, CFPAC-1 및 MDA-MB-468 세포를 미리 준비하고, 계수하고; 96-웰 플레이트에 MDA-MB-468 및 CFPAC-1 세포를 2 Х 104개 세포/ml의 밀도로(100 μl/웰) 플레이팅하고, NCI-H226 세포를 1 Х 104개 세포/ml의 밀도(100 μl/웰)로 플레이팅하고; 음성 대조 및 블랭크 대조 웰을 각 플레이트에 대하여 설정하였다. 밤새 접착 세포 배양 후, 시험하고자 하는 희석된 샘플을 50 μl/웰로 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 넣고, 68시간 내지 72시간 동안 배양하였다. 각 웰에 15 μl(웰에서 액체 부피의 10%)의 CCK8로부터의 발색 용액을 첨가하고; 플레이트를 37℃에서 45분 내지 70분 동안 인큐베이션하고, 각 플레이트를 마이크로플레이트 리더로 450 nm에서 판독하였다. 데이터를 SoftMax Pro를 사용하여 편집하고, 4-P 핏팅 곡선을 플롯팅하였다. 구체적인 데이터는 하기 표에 나타나 있다:
[표 20]
Figure pct00084
실시예 5: CDX 모델에서 접합체 화합물의 약력학적 연구
1. CDX 모델에서 CB-20BK의 약력학적 연구 1
1) 샘플 제조:
CB-20BK 동결건조 분말을 칭량하고, PBS로 용해시키고, 샘플 모액에 제조하고, 모액을 주사용 생리 식염수로 추후 사용을 위한 작업 농도를 갖는 샘플 용액에 희석하였다.
2) CDX 모델 구축
주요 세포주: KB 인간 구강 표피 암종 세포, MIA paca-2 인간 췌장암 세포, HCC1954 인간 유방암 세포, CALU-3 인간 폐 선암 세포 및 DU145 인간 전립선 암 세포.
모델 구축: 세포를 소생시키고, 배양하고, 수집하고, 계수하고, BALB/c-누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 성장하고 80 mm3 내지 160 mm3까지 확장될 때, 그룹화 및 투여를 수행하거나, 스케일 업을 위해 확장된 종양 덩어리를 신속히 옮기고 마우스에 주사하였다.
3) 그룹화, 투여 및 관찰
그룹화: 종양이 평균적으로 약 80 mm3 내지 160 mm3까지 성장할 때, 그룹화를 수행하고, 모델 대조군 및 상이한 용량의 투여군을 설정하였다.
투여: 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다.
실험 관찰 및 측정: 종양 접종 후, 종양 성장, 및, 특히, 실험 동물의 활동성, 식이 섭취 및 음용 상태, 체중 증가 또는 감소(주 2회 체중 측정), 및 기타 눈, 모발 등에서의 비정상 상태 포함하여, 동물의 정상 거동에 대한 치료의 효과를 통상적으로 모니터링하였다.
마우스 체중 및 종양의 장경(a) 및 단경(b)을 주 2회 측정하였다. 종양 부피(TV)의 계산식은 다음과 같다: TV = 1/2 Х a Х b2.
4) 실험 결과 및 분석
마우스의 종양 부피 변화에 따라(도 5a 내지 도 5e), CB-20BK가 마우스에서 KB, MIA aca-2, HCC1954, CALU-3 및 DU145 세포주의 CDX 종양 모델에서 우수한 억제 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
2. CDX 모델에서 CB-20BK의 약력학적 연구 2
실험 목적: 인간화 LNCaP, DU145 및 NCI-H460 세포주의 피하 이종이식 모델(CDX)에서 접합체 화합물 CB-20BK의 약력학적 연구 수행
주요 CDX 모델: LNCaP, DU145 및 NCI-H460
실험 계획:
세포 또는 종양 조직 덩어리를 준비하고, BALB/c-누드 마우스의 전방 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양 부피가 80 mm3 내지 160 mm3까지 확장될 때, 무작위화 그룹화를 수행하고, 모델 대조군 및 투여군을 설정하였다. 그룹화 첫 날부터 마우스에 투여하였고, 투여 용량을 최근 체중 측정에 따라 조절하였다. 10 μl/g의 투여 부피에서 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 투여하였다. 그룹화 및 투여 후, 종양 성장, 및, 특히, 실험 동물의 활동성, 식이 섭취 및 음용 상태, 체중 증가 또는 감소, 및 기타 눈, 모발 등에서의 비정상 상태 포함하여, 동물의 정상 거동에 대한 치료의 효과를 통상적으로 모니터링하였다. 그룹화 및 투여 후, 마우스의 체중을 주 2회 측정하여 체중 변화율을 계산하고; 이와 동시에, 종양의 장경 및 단경을 버니어 캘리퍼로 측정하고, 종양 부피, 상대 종양 증식률, 종양 부피 억제율 및 기타 지표를 계산하였다. 종양 부피의 식은 TV = 0.5 a Х b2이고, 여기서 a는 종양의 장경이고, b는 종양의 단경이다.
[표 21]
Figure pct00085
상기 표로부터, 시험 샘플 CB-20BK는 꼬리 정맥을 통한 투여 방식에 따라 상이한 정도의 종양 성장 억제 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다. 인간화 LNCaP, DU145 및 NCI-H460 세포주의 CDX 모델의 경우, 시험 샘플은 음성 대조군에 비해 특정 항-종양 억제 효과를 가졌다. FOLR1 및 FOLH1의 이중 발현을 갖는 LNCaP 모델에서, 시험 샘플을 3 mg/kg의 용량으로 1일, 8일 및 15일(D1, D8 및 D15)에 투여하였는데, 95.68%의 TGI 값을 갖고, FOLR1 및 FOLH1의 상대적으로 낮은 발현을 갖는 DU145 및 NCI-H460 모델보다 유의하게 더 우수한 탁월한 항종양 성장 효과를 나타냈다. 종양 성장 억제 효과는 세포-관련 수용체의 발현 수준과 특정 상관관계를 가졌다.
3. HuPrime ® 이종이식 PDX 모델에서 접합체 화합물 CB- 20BK의 종양 성장 억제 실험 1
실험 목적: PDX 모델에서 접합체 화합물 CB-20BK의 약력학적 연구
주요 모델: LU1206, LU1380 및 LU0367
실험 계획: 종양 조직 덩어리를 준비하고, BALB/c-누드 마우스의 전방 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양 부피가 80 mm3 내지 160 mm3까지 확장될 때, 무작위화 그룹화를 수행하고, 모델 대조군 및 투여군을 설정하였다. 그룹화 첫 날부터 마우스에 투여하였고, 투여 용량을 최근 체중 측정에 따라 조절하였다. 10 μl/g의 투여 부피 및 3 mg/kg의 투여량으로 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 투여하였다. 그룹화 및 투여 후, 종양 성장, 및, 특히, 실험 동물의 활동성, 식이 섭취 및 음용 상태, 체중 증가 또는 감소, 및 기타 눈, 모발 등에서의 비정상 상태 포함하여, 동물의 정상 거동에 대한 치료의 효과를 통상적으로 모니터링하였다. 그룹화 및 투여 후, 마우스의 체중을 주 2회 측정하여 체중 변화율을 계산하고; 이와 동시에, 종양의 장경 및 단경을 버니어 캘리퍼로 측정하고, 종양 부피, 상대 종양 증식률, 종양 부피 억제율 및 기타 지표를 계산하였다. 종양 부피의 식은 TV = 0.5 a Х b2이고, 여기서 a는 종양의 장경이고, b는 종양의 단경이다.
[표 22]
Figure pct00086
표 22로부터, 시험 샘플 CB-20BK(3 mg/kg)은 LU1206, LU1380 및 LU0367 인간화 폐암 PDX 모델에 대한 특정 항-종양 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다. FOLR1 및 FOLH1의 이중 발현을 갖는 LU1206 모델에서 TGI 값은 90.89%이고, 단일 발현을 갖는 LU1380 및 LU0367 모델에서 TGI 값은 각각 30.02% 및 71.34%였다. 종양 성장 억제 실험에서, 종양 성장 억제 효과는 세포-관련 수용체의 발현 수준과 특정 상관관계를 가졌다.
4. HuPrime ® 이종이식 PDX 모델에서 접합체 화합물 CB- 20BK의 종양 성장 억제 실험 2
실험 목적: PDX 모델에서 접합체 화합물 CB-20BK의 약력학적 연구
주요 모델: BR1283 및 BR0438
실험 계획: 종양 조직 덩어리를 준비하고, BALB/c-누드 마우스의 전방 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양 부피가 80 mm3내지 160 mm3까지 확장될 때, 무작위화 그룹화를 수행하고, 모델 대조군 및 투여군을 설정하였다. 그룹화 첫 날부터 마우스에 투여하였고, 투여 용량을 최근 체중 측정에 따라 조절하였다. 10 μl/g의 투여 부피 및 3 mg/kg의 투여량으로 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 투여하였다. 그룹화 및 투여 후, 종양 성장, 및, 특히, 실험 동물의 활동성, 식이 섭취 및 음용 상태, 체중 증가 또는 감소, 및 기타 눈, 모발 등에서의 비정상 상태 포함하여, 동물의 정상 거동에 대한 치료의 효과를 통상적으로 모니터링하였다. 그룹화 및 투여 후, 마우스의 체중을 주 2회 측정하여 체중 변화율을 계산하고; 이와 동시에, 종양의 장경 및 단경을 버니어 캘리퍼로 측정하고, 종양 부피, 상대 종양 증식률, 종양 부피 억제율 및 기타 지표를 계산하였다. 종양 부피의 식은 TV = 0.5 a Х b2이고, 여기서 a는 종양의 장경이고, b는 종양의 단경이다.
[표 23]
Figure pct00087
상기 표로부터, FOLR1 및 FOLH1의 이중 발현을 갖는 BR1283 및 BR0438 모델에서 3 mg/kg 용량의 시험 샘플 CB-20BK의 TGI 값은 각각 96.49% 및 70.74%로, 탁월한 항종양 성장 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다. 더욱이, CB-20BK의 TGI는 FOLR1 및 FOLH1의 더 높은 발현을 갖는 BR1283에서 더 높았다.
5. CDX 모델에서 CB-20B의 약력학적 연구
1) 샘플 제조:
CB-20B 동결건조 분말을 칭량하고, PBS로 용해시키고, 샘플 모액에 제조하고, 모액을 주사용 생리 식염수로 추후 사용을 위한 작업 농도를 갖는 샘플 용액에 희석하였다.
2) CDX 모델 구축
주요 세포주: KB 인간 구강 표피 암종 세포, PC-9 인간 폐암 세포 및 DU145 인간 전립선 암 세포.
모델 구축: 세포를 소생시키고, 배양하고, 수집하고, 계수하고, BALB/c-누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 성장하고 80 mm3 내지 160 mm3까지 확장될 때, 그룹화 및 투여를 수행하거나, 스케일 업을 위해 확장된 종양 덩어리를 신속히 옮기고 마우스에 주사하였다.
3) 그룹화, 투여 및 관찰
그룹화: 종양이 평균적으로 약 80 mm3 내지 160 mm3까지 성장할 때, 그룹화를 수행하고, 모델 대조군 및 상이한 용량의 투여군을 설정하였다.
투여: 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다.
실험 관찰 및 측정: 종양 접종 후, 종양 성장, 및, 특히, 실험 동물의 활동성, 식이 섭취 및 음용 상태, 체중 증가 또는 감소(주 2회 체중 측정), 및 기타 눈, 모발 등에서의 비정상 상태 포함하여, 동물의 정상 거동에 대한 치료의 효과를 통상적으로 모니터링하였다.
마우스 체중 및 종양의 장경(a) 및 단경(b)을 주 2회 측정하였다. 종양 부피(TV)의 계산식은 다음과 같다: TV = 1/2 Х a Х b2.
4) 실험 결과 및 분석
마우스의 종양 부피 변화에 따르면(도 6a 내지 도 6c), CB-20B는 마우스에서 KB, PC-9 및 DU145 세포주의 CDX 종양 모델에서 우수한 억제 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
6. CDX 모델에서 CB-18G의 약력학적 연구
1) 샘플 제조:
CB-18G 동결건조 분말을 칭량하고, PBS로 용해시키고, 샘플 모액에 제조하고, 모액을 주사용 생리 식염수로 추후 사용을 위한 작업 농도를 갖는 샘플 용액에 희석하였다.
2) CDX 모델 구축
주요 세포주: KB 인간 구강 표피 암종 세포, PC-9 인간 폐암 세포, SPC-A1 인간 폐 선암 세포, CALU-3 인간 폐 선암 세포 및 DU145 인간 전립선 암 세포
모델 구축: 세포를 소생시키고, 배양하고, 수집하고, 계수하고, 세포 용액을 BALB/c-누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 성장하고 80 mm3 내지 160 mm3까지 확장될 때, 그룹화 및 투여를 수행하거나, 스케일 업을 위해 확장된 종양 덩어리를 신속히 옮기고 마우스에 주사하였다.
3) 그룹화, 투여 및 관찰
그룹화: 종양이 평균적으로 약 80 mm3 내지 160 mm3까지 성장할 때, 그룹화를 수행하고, 모델 대조군 및 상이한 용량의 투여군을 설정하였다.
투여: 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다.
실험 관찰 및 측정: 종양 접종 후, 종양 성장, 및, 특히, 실험 동물의 활동성, 식이 섭취 및 음용 상태, 체중 증가 또는 감소(주 2회 체중 측정), 및 기타 눈, 모발 등에서의 비정상 상태 포함하여, 동물의 정상 거동에 대한 치료의 효과를 통상적으로 모니터링하였다.
마우스 체중 및 종양의 장경(a) 및 단경(b)을 주 2회 측정하였다. 종양 부피(TV)의 계산식은 다음과 같다: TV = 1/2 Х a Х b2.
4) 실험 결과 및 분석
마우스의 종양 부피 변화에 따르면(도 7a 내지 도 7e), CB-18G는 마우스에서 KB, PC-9, SPC-A1, CALU-3 및 DU145 세포주의 CDX 종양 모델에서 우수한 억제 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
7. 인간화 HPAF -II, NCI-H226 및 SCLC -21H 세포주의 피하 이종이식 모델(CDX)에서 접합체 화합물 CB-1020, CB-1320 및 CB-1820의 종양 성장 억제 실험
실험 목적: CDX 모델에서 리간드 접합체 CB-1020, CB-1320 및 CB-1820의 약력학적 연구
주요 CDX 모델: HPAF-II(인간 췌장암 세포), NCI-H226(인간 폐암 세포) 및 SCLC-21H(소세포 폐암 세포)
실험 계획:
세포 또는 종양 조직 덩어리를 준비하고, BALB/c-누드 마우스의 전방 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양 부피가 80 mm3 내지 160 mm3까지 확장될 때, 무작위화 그룹화를 수행하고, 모델 대조군 및 투여군을 설정하였다. 그룹화 첫 날부터 마우스에 투여하였고, 투여 용량을 최근 체중 측정에 따라 조절하였다. 10 μl/g의 투여 부피에서 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 투여하였다. 그룹화 및 투여 후, 종양 성장, 및, 특히, 실험 동물의 활동성, 식이 섭취 및 음용 상태, 체중 증가 또는 감소, 및 기타 눈, 모발 등에서의 비정상 상태 포함하여, 동물의 정상 거동에 대한 치료의 효과를 통상적으로 모니터링하였다. 그룹화 및 투여 후, 마우스의 체중을 주 2회 측정하여 체중 변화율을 계산하고; 이와 동시에, 종양의 장경 및 단경을 버니어 캘리퍼로 측정하고, 종양 부피, 상대 종양 증식률, 종양 부피 억제율 및 기타 지표를 계산하였다. 종양 부피의 식은 TV = 0.5 a Х b2이고, 여기서 a는 종양의 장경이고, b는 종양의 단경이다.
[표 24]
Figure pct00088
CB-1020은 인간화 HPAF-II 세포주의 피하 이종이식 모델에서 분명한 항종양 성장 효과를 갖고; CB-1320은 NCI-H226 및 SCLC-21H 세포주의 피하 이종이식 모델에서 분명한 항종양 성장 효과를 갖고; CB-1820은 SCLC-21H 세포주의 피하 이종이식 모델에서 분명한 항종양 성장 효과를 가졌다.
8. 인간화 CALU -3, SCLC -21H 및 SPC-A1 세포주의 피하 이종이식 모델(CDX)에서 접합체 화합물 CR19428의 종양 성장 억제 실험
실험 계획: 종양 조직 덩어리를 준비하고, BALB/c-누드 마우스의 전방 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양 부피가 80 mm3 내지 160 mm3까지 확장될 때, 무작위화 그룹화를 수행하고, 모델 대조군 및 투여군을 설정하였다. 그룹화 첫 날부터 마우스에 투여하였고, 투여 용량을 최근 체중 측정에 따라 조절하였다. 10 μl/g의 투여 부피로 연속 3주 동안 주 2회 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 투여하였다. 그룹화 및 투여 후, 종양 성장, 및, 특히, 실험 동물의 활동성, 식이 섭취 및 음용 상태, 체중 증가 또는 감소, 및 기타 눈, 모발 등에서의 비정상 상태 포함하여, 동물의 정상 거동에 대한 치료의 효과를 통상적으로 모니터링하였다. 그룹화 및 투여 후, 마우스의 체중을 주 2회 측정하여 체중 변화율을 계산하고; 이와 동시에, 종양의 장경 및 단경을 버니어 캘리퍼로 측정하고, 종양 부피, 상대 종양 증식률, 종양 부피 억제율 및 기타 지표를 계산하였다. 종양 부피의 식은 TV = 0.5 a Х b2이고, 여기서 a는 종양의 장경이고, b는 종양의 단경이다.
[표 25]
Figure pct00089
CR-19428은 리간드 FOLR1 및 FOLH1과 페이로드 Dxd의 약물 접합체다. 상기 표로부터, 약물 접합체는 인간화 CALU-3, SCLC-21H 및 SPC-A1 세포주의 피하 이종이식 모델에서 분명한 항종양 성장 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
9. 폐암 LU2505 모델( PDX 모델)에서 접합체 화합물 CBP -1018의 효과에 대한 연구
급성장 종양 모델인 3세대 폐암 PDX 모델 LU2505(아시아인 여성 환자로부터의)를 본 실험에 사용하였다. BALB/c 누드 마우스는 피하로 종양을 받았고, 종양 부피가 약 150 mm3에 이를 때, 저용량, 중간 용량 및 고용량 시험 샘플 군, 소분자 MMAE 대조군, 표적화 폴리펩티드 20BK-SM09 대조군, 및 블랭크 대조군(총 6개 그룹, 및 그룹 당 8마리 마우스)으로 그룹화하고; 그룹화 후 1일, 8일 및 15일에 마우스에 투여하고; 마지막 투여 후 14일 동안 계속 관찰하였다. 시험 샘플 CBP-1018의 활성 물질은 CB-20BK였고, 이는 CB-20BK를 보조 물질과 혼합한 후 이를 동결건조시킴으로써 수득되었다.
[표 26]
Figure pct00090
주: 1) 동물 복지의 요건으로 인해, 그룹내 동물은 그룹내 평균 종양 부피가 2000 mm3에 이를 때 안락사되어야 하므로, 각 그룹에 대한 실행 시간은 상이하다. 2) 중량, 종양 부피, 및 종양 성장 억제율의 데이터는 22일(D22)에 얻어진 데이터이다.
표 26 및 도 8a에 나타나 있는 바와 같이:
모든 그룹의 동물은 투여 후 비정상적인 임상 증상 및 사망을 나타내지 않고; 각 그룹내 동물의 체중은 서서히 증가한다.
블랭크 대조군, 20BK-SM09 군, 및 저용량 CBP-1018 군에서 동물은 평균 종양 부피가 2000 mm3를 초과했기 때문에 22일, 22일, 및 26일(D26)에 안락사되었다. 따라서, 표 26에서 중량, 종양 부피, 및 종양 성장 억제율의 데이터는 D22에 얻어진 데이터이다.
주사용 CBP-1018의 효과는 분명한 용량 상관관계를 갖는데, 여기서 주사용 CBP-1018은 저용량 군에서 효과적이지 않고, 중간 용량 군과 고용량 군에서 효과적이었다. 19일(D19)에 고용량 군에서 종양은 완치되었고, 29일(D29)에 종양 성장의 징후가 보이지 않았다.
폴리펩티드 20BK-SM09 군은 분명한 종양 성장 억제 효과를 나타내지 않았는데, 이는 단일 표적화 폴리펩티드가 명백한 항종양 효과를 야기하기에 충분하지 않다는 것을 시사한다.
MMAE 군은 명백한 종양 성장 억제 효과를 나타냈다. 등몰의 MMAE는 0.375 mg/kg으로 MMAE에, 그리고 1.5 mg/kg으로 CBP-1018에 함유되었다. 비교로부터, 1.5 mg/kg에서 CBP-1018의 종양 성장 억제 효과는 MMAE 군보다 유의하게 더 우수하다는 것을 알 수 있는데, 이는 리간드 표적화의 이점(종양 성장 억제율: 82.60% vs 48.97%)을 시사하는 것이다.
10. 폐암 LU1206 모델( PDX 모델)에서 접합체 화합물 CBP -1018의 효과에 대한 연구
급성장 종양 모델인 5세대 폐암 PDX 모델 LU1206(아시아인 여성 환자로부터의)을 본 실험에 사용하였다. BALB/c 누드 마우스는 피하로 종양을 받았고, 종양 부피가 약 150 mm3에 이를 때, 저용량, 중간 용량 및 고용량 시험 샘플 군, 소분자 MMAE 대조군, 표적화 폴리펩티드 20BK-SM09 대조군, 및 블랭크 대조군(총 6개 그룹, 및 그룹 당 8마리 마우스)으로 그룹화하고; 그룹화 후 1일, 8일 및 15일에 마우스에 투여하고; 마지막 투여 후 14일 동안 계속 관찰하였다.
[표 27]
Figure pct00091
표 27 및 도 8b에 나타나 있는 바와 같이:
모든 그룹내 동물은 투여 후 비정상적인 임상 증상 및 사망을 나타내지 않았고, 모든 동물들은 29일에 안락사되었다. 각 그룹내 동물의 체중은 기본적으로 변화 없이 유지되었고, 투여 첫 날보다 약간 더 높았다.
주사용 CBP-1018의 효과는 분명한 용량 상관관계를 갖는데, 여기서 주사용 CBP-1018은 저용량 군(8.08%의 종양 성장 억제율을 갖는)에서 효과적이지 않고, 중간 용량 군과 고용량 군에서 각각 75.21% 및 97.42%의 종양 성장 억제율로 효과적이었다. 저용량 군과 중간 용량 군 사이의 효과 차이는 상대적으로 컸다.
폴리펩티드 20BK-SM09 군은 분명한 종양 성장 억제 효과를 나타내지 않았는데, 이는 단일 표적화 폴리펩티드가 이러한 모델에서 명백한 항종양 효과를 야기하기에 충분하지 않다는 것을 시사한다.
MMAE 군은 명백한 종양 성장 억제 효과를 나타냈다. 등몰의 MMAE는 0.375 mg/kg으로 MMAE에, 그리고 1.5 mg/kg으로 CBP-1018에 함유되었다. 비교로부터, 1.5 mg/kg에서 CBP-1018의 종양 성장 억제 효과는 MMAE 군보다 유의하게 더 우수하다는 것을 알 수 있는데, 이는 리간드 표적화의 이점(종양 부피 억제율: 75.21% vs 36.03%; 종양 중량 억제율: 78.38% vs 54.53%)을 시사하는 것이다.
11. 종양-보유 마우스(PDX 모델 LU2505)의 조직 분포
HuPrime® 폐암 LU2505 모델의 종양 덩어리가 접종된 12마리의 암컷 종양-보유 마우스 및 12마리의 건강한 수컷 BALB/c 누드 마우스에 단일 꼬리 정맥 주사를 통해 1.5 mg/140 μCi/kg의 [3H]CBP-1018(MMAE 상의 동위원소 표지)를 제공하였다. 각각 0.5시간, 2시간, 6시간 및 24시간에, 3마리의 수컷 마우스 및 3마리의 암컷 마우스를 유도 상자에 넣고, 적절한 양의 이산화탄소를 흡입함으로써 마취시키고; 혈액을 심장 천자에 의해 수집한 후, 안락사를 수행한 즉시 샘플을 수집하였다.
[표 28]
Figure pct00092
상기 표로부터, 동물 조직에서의 분포는 수컷과 암컷 사이에 차이를 나타내지 않고; 투여 후, 약물이 주로 신장, 전혈(주로 혈장에 분포), 간 및 폐에 분포되고; 모든 조직에서, 최고 농도가 0.5시간에 나타나고, 이후 약물이 신속이 제거되고, 이때 간 및 종양에서 가장 느린 제거가 보인다는 것을 알 수 있으며; 종양에서의 느린 제거는 효과의 측면에서 CBP-1018의 이점을 설명할 수 있다.
12. 랫트에서의 배설 실험
6마리의 정상 SD 랫트(반은 수컷이고 반은 암컷임)에 단일 꼬리 정맥 주사를 통해 0.75 mg/70 μCi/kg의 [3H]CBP-1018을 제공하였다. 지정된 시간 간격으로, 통합 랫트의 소변, 대변, 케이지 플러싱/세정액 및 사체와 같은 샘플을 투여 전 및 투여 0시간 내지 168시간 후에 수집하고, BDC 랫트의 담즙, 소변, 대변 및 케이지 플러싱/세정액과 같은 샘플을 투여 전 및 투여 0시간 내지 72시간 후에 수집하였다. 상기 언급된 샘플을 저온 냉장고(-10℃내지 -30℃에서 저온보존하였다.
각 샘플에 적절한 양의 신틸레이션 유체를 첨가하고, 균일하게 혼합한 후, 방사능량을 액체 신틸레이션 계수기를 사용하여 측정하였다. 담즙, 소변, 대변, 케이지 플러싱/세정액 및 사체와 같은 샘플에서 측정된 방사능량을 이용하여 주어진 용량에서의 백분율을 계산하였다. 혈장 샘플에서의 방사능량을 이용하여 각 샘플 그램 중 총 방사능을 계산하였다. 총 혈장 방사능의 주요 약동학적 매개변수를 비-구획 모델에 따라 WinNonLin 소프트웨어(버전 7.0, Pharsight)를 이용하여 계산하였다.
[표 29]
Figure pct00093
상기 표로부터, CBP-1018은 주로 소변으로 배설되는데, 이는 총 주어진 용량의 약 57%를 차지하며, 대변으로 배설된 양은 25% 미만을 차지한다는 것을 알 수 있다. 신장을 통해 주로 소변으로 배설된다는 결과는 누드 마우스의 조직 분포에 있어 신장에서의 큰 분포라는 결과와 일치한다.
13. 혈장 안정성
1 μg/mL, 10 μg/mL 및 100 μg/mL의 농도에서 CBP-1008(이의 활성 물질은 제WO 2017025047 A1호에 기재된 LDC10B이고, CBP-1008는 LDC10B를 보조 물질과 혼합하고 이를 동결건조시킴으로써 수득된 것이고; 제WO 2017025047A1호는 그 전문이 참조로 포함됨) 및 CBP-1018를 37℃에서 2시간 동안 상이한 종의 혈장과 인큐베이션하여 두 화합물의 안정성을 관찰하였다. 결과는(표 30에서) CBP-1018이 다양한 종의 혈장에서 안정하고, 인큐베이션 2시간 후 이의 나머지 백분율이 0시간의 농도에 비해 90% 초과라는 것을 보여준다. 그러나, CBP-1008은 랫트의 혈장에서만 안정하고(나머지 87.92% 내지 91.82%), 다른 종의 혈장에서는 단지 나머지 0.751% 내지 24.52%로 불안정했다.
실험 결과는 CBP-1018의 혈장 안정성이 CBP-1008보다 우수하다는 것을 시사한다.
[표 30]
Figure pct00094
주:
1) 표의 데이터는 0시간과 비교한 2시간 동안의 혈장 인큐베이션 후 혈장 중 화합물 농도의 백분율이다.
2) 표의 데이터는 두 실험으로부터 얻어진 것이기 때문에, 소수점 이하 유효 자리수는 불일치한다. 추적성 및 신뢰성을 위해, 보고서의 데이터는 균일화 없이 직접적으로 참조된다.
14. PK에서의 반감기
혈장 안정성의 비교와 일관되게, CBP-1018의 약동학적 반감기(약 1시간)는 랫트 및 시노몰구스 원숭이에서 CBP-1008의 반감기(약 20분)보다 유의하게 더 긴데, 이는 CBP-1018이 CBP-1008보다 더 안정하다는 것을 시사한다.
[표 31]
Figure pct00095
SEQUENCE LISTING <110> COHERENT BIOPHARMA (SUZHOU) CO., LTD. <120> BI-LIGAND DRUG CONJUGATE AND USE THEREOF <130> 066138-8002WO02 <160> 20 <170> PatentIn version 3 .5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for Matripase <400> 1 Lys Ser Arg Ala Glu Asp Glu 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for MMP-2 <400> 2 Pro Leu Gly Leu Ala Gly 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for prostate-specific antigen <400> 3 Ser Ser Leu Tyr 1 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for TMPRSS2 <400> 4 Leu Leu Arg Ser Leu Ile Gly 1 5 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for activated protein C <400> 5 Leu Val Lys Arg 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for factor Ixa <400> 6 Leu Val Val Arg 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for factor VIIa <400> 7 Gln Leu Thr Arg 1 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for factor Xa <400> 8 Leu Glu Gly Arg 1 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for calpain-a <400> 9 Pro Leu Phe Ala Glu Pro 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for calpain-2 <400> 10 Gly Leu Gly Ser Glu Pro 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for enteropeptidase <400> 11 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for MMP-8 <400> 12 Gly Pro Ser Gly 1 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for proprotein convertase 5 <400> 13 Arg Ser Lys Arg 1 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition site for calpain-3 <400> 14 Val Gly Val Phe 1 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P10 <400> 15 Cys Lys Glu Phe Leu His Pro Ser Lys Val Asp Leu Pro Arg 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <400> 16 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Cys 1 5 10 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <400> 17 Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) ..(6) <223> Xaa=D-Lys <400> 18 Glu His Trp Ser Tyr Xaa Leu Arg Pro Gly Cys 1 5 10 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R9 <400> 19 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat peptide <400> 20 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10

Claims (46)

  1. 페이로드 및 두 개의 표적화 분자를 포함하는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 전립선-특이적 막 항원 리간드 모이어티인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  2. 제1항에 있어서, 전립선-특이적 막 항원 리간드는 하기 구조를 갖는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00096
    .
  3. 제1항에 있어서, 전립선-특이적 막 항원 리간드는 하기 구조를 갖는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00097
    .
  4. 제1항에 있어서, 전립선-특이적 막 항원 리간드는 하기 구조를 갖는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00098
    .
  5. 제1항에 있어서, 전립선-특이적 막 항원 리간드는 하기 구조를 갖는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00099
    .
  6. 페이로드 및 두 개의 표적화 분자를 포함하는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 하기 화학식 I으로 표현되는 리간드 모이어티인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
    [화학식 I]
    Figure pct00100
    .
  7. 페이로드 및 두 개의 표적화 분자를 포함하는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 두 개의 표적화 분자는 각각 상승작용적 분자 모이어티 및 P10이고, 페이로드는 캄프토테신 또는 그의 임의의 유도체인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 두 개의 표적화 분자는 상이한, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상승작용적 분자는 세포-상호작용 분자인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 두 개의 표적화 분자는 상이한 세포 분자와 상호작용하는 세포-상호작용 분자인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상승작용적 분자는 세포내이입을 매개할 수 있는 세포내이입 분자인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상승작용적 분자는 FOLR1, TRPV6, FOLH1(PMSA), GNRHR, Her2, Trop2, Her3, NECTIN4, LRP1, GLUT1, EGFR1, AXL, CA9, CD44, 클라우딘18.2, APN, DLL3, CEACAM5, FZD10, TFRC, MET, IGFR1, SSTR2, CCKBR, LFA1, ICAM, GPR87, GM-CSF, GM-CSFR, TIM3, TLR 패밀리, CD40, CD40L, OX40, OX40L, GITRL, GITR, 4-BBL, 4-1BB, CD70, CD27, ICOSL, ICOS, HHLA2, CD28, CD86/80, CD28, MHCII 항원, TCR, CTLA-4, CD155, CD122, CD113, IGIT, PD-L1, PD1, 갈렉틴-9, TIM-3, HVEM, BTLA, CD160, VISTA, B7-H4, B7-H3, 포스파티딜세린, HHLA2, LAG3, 갈렉틴-3, LILRB4, SIGLEC15, NKG2A, NKG2D, SLAMF7, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, FGFR1, FGFR2, FGFR4, NeuGcGM3 및 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 결합하는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상승작용적 분자는 FOLR1, TRPV6, FOLH1(PMSA), SSTR2 및 GNRHR로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자에 결합하는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  14. 제1항에 있어서, 상승작용적 분자는 FOLR1, TRPV6, SSTR2 및 GNRHR로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 결합하는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  15. 제6항에 있어서, 상승작용적 분자는 FOLR1, TRPV6, FOLH1(PMSA) 및 GNRHR로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 결합하는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상승작용적 분자는 폴레이트 또는 그의 유사체인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  17. 제16항에 있어서, 폴레이트의 유사체는 5-메틸테트라히드로폴레이트, 5-포르밀테트라히드로폴레이트, 메토트렉세이트, 및 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  18. 제1항 또는 제6항에 있어서, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 페이로드를 포함하는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  19. 제1항 또는 제6항에 있어서, 페이로드는 소분자 화합물, 뉴클레오티드, 펩티드, 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  20. 제19항에 있어서, 페이로드는 소분자 화합물인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  21. 제20항에 있어서, 소분자 화합물은 캄프토테신 및 그의 임의의 유도체, 아우리스타틴 및 그의 임의의 유도체, 메이탄신 및 그의 임의의 유도체, 방사성핵종 착물, 시클로옥시게나제-2 억제제, 파클리탁셀 및 그의 임의의 유도체, 에포틸론 및 그의 임의의 유도체, 블레오마이신 및 그의 임의의 유도체, 닥티노마이신 및 그의 임의의 유도체, 플리카마이신 및 그의 임의의 유도체, 및 미토마이신 C로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  22. 제21항에 있어서, 소분자 화합물은 캄프토테신 또는 그의 임의의 유도체, 아우리스타틴 또는 그의 임의의 유도체, 방사성핵종 착물 또는 시클로옥시게나제-2 억제제인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드는 링커를 통해 표적화 분자 중 적어도 하나에 연결되는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  24. 제23항에 있어서, 링커는 펩티드 링커, 디술피드 링커, pH-의존성 링커 또는 상기 언급된 링커들의 조합인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  25. 제24항에 있어서, 펩티드 링커는 특정 생리학적 환경 하에 프로테아제 절단 또는 환원에 의해 절단 가능한, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 펩티드 링커는 시스테인, 리신, 리신-리신, 발린-시트룰린, 페닐알라닌-리신, 발린-리신, 시스테인-리신, 시스테인-글루탐산, 아스파르트산-아스파르트산, 및 아스파르트산-아스파르트산-리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 선택적으로, 상기 언급된 아미노산에서 카르복실산은 아미드화되는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  27. 제24항에 있어서, 디술피드 링커는 DMDS, MDS, DSDM 및 NDMDS로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  28. 제24항에 있어서, pH-의존성 링커는 시스-아코니트산 무수물인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  29. 제23항에 있어서, 링커는 하기 구조를 갖거나, 링커는 하기 언급되는 구조와 펩티드 링커의 조합인, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00101

    Figure pct00102

    Figure pct00103

    Figure pct00104
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 두 개의 표적화 분자는 스페이서를 통해 서로 연결되는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  31. 제30항에 있어서, 스페이서는 SEQ ID NO: 1-14, Arg-Arg, Ala-Ser-Asn, Ala-Ala-Ala, Ser-Ser-Arg, Pro-Arg 및 Pro-Leu-Gly로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  32. 제1항에 있어서, 접합체 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00105

    Figure pct00106

    Figure pct00107

    Figure pct00108

    Figure pct00109

    Figure pct00110

    Figure pct00111

    Figure pct00112

    Figure pct00113

    Figure pct00114

    (상기 식에서, M은 방사성핵종임).
  33. 제6항에 있어서, 접합체 화합물은 하기와 같은, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00115

    Figure pct00116

    Figure pct00117
  34. 제7항에 있어서, 접합체 화합물은 하기와 같은, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00118

    Figure pct00119

    Figure pct00120
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 제약 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 조성물은 정맥내로, 피하로, 경구로, 근육내로 또는 뇌실내로 투여되는, 제약 조성물.
  37. 페이로드의 전달을 필요로 하는 대상체에게 페이로드를 전달하기 위한 방법으로서, 치료 유효량의 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 제35항 또는 제36항에 따른 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 대상체에서 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 치료 유효량의 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 제35항 또는 제36항에 따른 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 질환은 암, 면역 질환, 심혈관 질환, 대사 질환, 및 신경계 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 암은 전립선암, 유방암, 폐암, 신암, 백혈병, 난소암, 위암, 자궁암, 자궁내막 암종, 간암, 결장암, 갑상선암, 췌장암, 결장직장암, 식도암, 고환암, 피부암, 림프종, 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  41. 제39항에 있어서, 면역 질환은 자가면역 질환인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 자가면역 질환은 결합 조직 질환, 전신 경화증, 류마티스 관절염, 및 전신 홍반성 루푸스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  43. 제39항에 있어서, 심혈관 질환은 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 심장 발작, 고혈압 심장 질환, 류마티스성 심장 질환, 심근병증, 부정맥, 및 선천성 심장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  44. 제39항에 있어서, 대사 질환은 당뇨병, 통풍, 비만, 저혈당증, 고혈당증, 및 이상지혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  45. 제39항에 있어서, 신경계 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 두부 손상, 다발성 경화증, 현기증, 혼수, 및 간질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 제약 조성물과 조합하여 하나 이상의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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