JP2022518924A - 二重リガンド薬物コンジュゲート及びその使用 - Google Patents

二重リガンド薬物コンジュゲート及びその使用 Download PDF

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Abstract

ペイロードと2つのターゲティング分子とを含むコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。また、このコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物にも関する。加えて、必要としている対象にペイロードを送達する方法、及び疾患を治療する方法に関し、これらの方法は、両方とも、治療有効量のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は医薬組成物を対象に投与することを含む。【選択図】なし

Description

本願は、生物医化学の分野に関する。より詳細には、本願は、二重リガンド薬物コンジュゲート、二重リガンド薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、二重リガンド薬物コンジュゲートを用いることによりペイロードをそれを必要としている対象に送達する方法、及び二重リガンド薬物コンジュゲートで疾患を治療する方法に関する。
一般に、罹患細胞と正常細胞とは、病理学的特徴及び生理学的特徴の双方に大きな違いがあり、そうした違いの一つは、罹患細胞がその表面に特異的な又は過剰発現した材料(抗原、化学的シグナル及び受容体など)を有するのに対し、正常細胞にはそうした材料が存在しないか、又は低発現であることにある。これを踏まえて、疾患の治療用に抗体-薬物コンジュゲート(ADC)及びポリペプチド-薬物コンジュゲート(PDC)が開発されている。現在、幾つかのADC及びPDCベースの薬物が上市されており、又は臨床研究に入っている;しかしながら、その設計原理に起因して、ADC及びPDCベースの薬物は臨床適用が極めて限られている。
ADCの複雑さ及び比較的大きい分子量に起因して、その開発は、好適な標的の欠如、生産の難しさ及び薬物安定性の低さを含め、多くの困難に直面する。現在、ADCは主に腫瘍治療の分野で使用されている。一部の例では、癌細胞表面抗原に対するターゲティング抗体の親和性は10-9~10-12(Kd、モル/リットル)に達し得る。従って、標的細胞に対して高い特異性を有するとき、ADCはまた、標的細胞と同じターゲティング受容体を含む正常細胞に対しても高い特異性を有する。更に、生体内でADCの代謝には長い時間がかかることもあり(1~3週間)、その間にもADCは正常細胞を殺傷し続けるため、毒性作用及び副作用の大幅な増加につながり得る。従って、ADCは、腫瘍細胞と正常細胞との間で細胞表面抗原の量が非常に大きく異なることを特徴とする疾患への適用性が高い。しかしながら、そのような厳しい要件を満たし得る疾患は、当該技術分野においてほとんど知られていない。
PDCは臨床又は前臨床研究で種々の疾患の治療に用いられてきたが、その場合に、化学療法薬が単純にポリペプチドに結び付けられるか、又は化学療法薬が埋め込まれたナノ粒子若しくはポリマー材料にポリペプチドが付加されるため、その分子量が大きいこと及び電荷を帯びていることに起因してほとんどのポリペプチドは細胞に侵入できないことになる。従って、現在、ほとんどのPDCは細胞外治療にのみ好適であり、PDCの適用範囲及び有効性は著しく限られている。
薬物コンジュゲート化合物はまた、リガンド-薬物コンジュゲート(LDC)であってもよく、ここでリガンドはペプチド又は小分子であり得る。しかしながら、バイオアベイラビリティ、安定性、有効性、毒性等の点で、LDCの適用には様々な問題がある。例えば、大きい分子量、親油性又は他の特性に起因して、多くのリガンドが細胞に侵入できず、その治療上の適用を制限している。加えて、リガンドは通常、従来の化学療法薬(ドキソルビシン及びパクリタキセルなど)とコンジュゲートしたとき有効性が低く、極めて有効性の高い薬物分子(MMAE及びDM1など)とコンジュゲートすると、リガンドは高い毒性を生じることもあり、そのため腫瘍の治療に治療上有効な量に達する前に動物を被毒させ、更には殺傷することさえある。
従って、当該技術分野では、罹患細胞の表面上に広く存在する高発現の受容体に作用し、ターゲティング範囲及び治療域を広げ、薬物有効性を増強し、及び薬物副作用を回避することができる改良されたLDCを入手することもまた差し迫って必要とされている。
一態様において、本願は、ペイロードと2つのターゲティング分子とを含むコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩を開示し、ここで2つのターゲティング分子は、それぞれ、相乗作用分子部分及び前立腺特異的膜抗原リガンド部分である。
別の態様において、本願は、ペイロードと2つのターゲティング分子とを含むコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩を開示し、ここで2つのターゲティング分子は、それぞれ、相乗作用分子部分及び式(I)によって表されるリガンド部分である:
Figure 2022518924000001
別の態様において、本願は、ペイロードと2つのターゲティング分子とを含むコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩を開示し、ここで2つのターゲティング分子は、それぞれ、相乗作用分子部分及びP10であり、ペイロードはカンプトテシン又はその任意の誘導体である。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる前立腺特異的膜抗原リガンドは以下の構造を有する:
Figure 2022518924000002
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる前立腺特異的膜抗原リガンドは以下の構造を有する:
Figure 2022518924000003
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる前立腺特異的膜抗原リガンドは以下の構造を有する:
Figure 2022518924000004
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる前立腺特異的膜抗原リガンドは以下の構造を有する:
Figure 2022518924000005
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる2つのターゲティング分子は異なる。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる相乗作用分子は細胞相互作用分子である。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる2つのターゲティング分子は、異なる細胞分子と相互作用する細胞相互作用分子である。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる相乗作用分子は、エンドサイトーシスの媒介能を有するエンドサイトーシス分子である。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる相乗作用分子は、FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)、GNRHR、Her2、Trop2、Her3、NECTIN4、LRP1、GLUT1、EGFR1、AXL、CA9、CD44、クローディン18.2、APN、DLL3、CEACAM5、FZD10、TFRC、MET、IGFR1、SSTR2、CCKBR、LFA1、ICAM、GPR87、GM-CSF、GM-CSFR、TIM3、TLRファミリー、CD40、CD40L、OX40、OX40L、GITRL、GITR、4-BBL、4-1BB、CD70、CD27、ICOSL、ICOS、HHLA2、CD28、CD86/80、CD28、MHCII抗原、TCR、CTLA-4、CD155、CD122、CD113、IGIT、PD-L1、PD1、ガレクチン-9、TIM-3、HVEM、BTLA、CD160、VISTA、B7-H4、B7-H3、ホスファチジルセリン、HHLA2、LAG3、ガレクチン-3、LILRB4、シグレック15、NKG2A、NKG2D、SLAMF7、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、FGFR1、FGFR2、FGFR4、NeuGcGM3及びCXCR4からなる群から選択される分子に結合する。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は前立腺特異的膜抗原リガンド部分と相乗作用分子部分とを含み、ここで相乗作用分子部分は、FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)、SSTR2及びGNRHRからなる群から選択される分子に結合する。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、式(I)によって表されるリガンド部分と相乗作用分子部分とを含み、ここで相乗作用分子部分は、FOLR1、TRPV6、SSTR2及びGNRHRからなる群から選択される分子に結合する。
更に一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩はP10と相乗作用分子部分とを含み、ここで相乗作用分子は、FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)及びGNRHRからなる群から選択される分子に結合する。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる相乗作用分子は葉酸塩又はその類似体である。一部の実施形態において、葉酸塩の類似体は、5-メチルテトラヒドロ葉酸、5-ホルミルテトラヒドロ葉酸、メトトレキサート、及び5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸からなる群から選択される。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、1、2、3、4個又はそれ以上のペイロードを含む。一部の実施形態において、ペイロードは、小分子化合物、ヌクレオチド、ペプチド及びタンパク質からなる群から選択される。一部の実施形態において、ペイロードは小分子化合物である。一部の実施形態において、小分子化合物は、カンプトテシン及びその任意の誘導体、アウリスタチン及びその任意の誘導体、メイタンシン及びその任意の誘導体、放射性核種錯体、シクロオキシゲナーゼ-2阻害薬、パクリタキセル及びその任意の誘導体、エポチロン及びその任意の誘導体、ブレオマイシン及びその任意の誘導体、ダクチノマイシン及びその任意の誘導体、プリカマイシン及びその任意の誘導体、及びマイトマイシンCからなる群から選択される。一部の実施形態において、小分子化合物は、カンプトテシン又はその任意の誘導体、アウリスタチン又はその任意の誘導体、メイタンシン又はその任意の誘導体、放射性核種錯体又はシクロオキシゲナーゼ-2阻害薬である。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれるペイロードは少なくとも1つのターゲティング分子にリンカーを介して連結される。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれるリンカーは、ペプチドリンカー、ジスルフィドリンカー、pH依存性リンカー又は上述のリンカーの組み合わせである。
一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、ある種の生理環境下でプロテアーゼ切断又は還元によって切断可能である。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、システイン、リジン、リジン-リジン、バリン-シトルリン、フェニルアラニン-リジン、バリン-リジン、システイン-リジン、システイン-グルタミン酸、アスパラギン酸-アスパラギン酸、及びアスパラギン酸-アスパラギン酸-リジンからなる群から選択され、任意選択で、上述のアミノ酸中のカルボン酸はアミド化されている。
一部の実施形態において、ジスルフィドリンカーは、DMDS、MDS、DSDM、及びNDMDSからなる群から選択される。
一部の実施形態において、pH依存性リンカーはシスアコニット酸無水物である。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のリンカーは、以下の構造:
Figure 2022518924000006

Figure 2022518924000007

Figure 2022518924000008

を有し、
又はリンカーは上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカーである。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる2つのターゲティング分子は互いにスペーサーを介して連結される。一部の実施形態において、本願に記載されるスペーサーは、配列番号1~14、Arg-Arg、Ala-Ser-Asn、Ala-Ala-Ala、Ser-Ser-Arg、Pro-Arg及びPro-Leu-Glyからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCB-20Bである:
Figure 2022518924000009
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCB-20BKである:
Figure 2022518924000010
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCB-60Sである:
Figure 2022518924000011
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCB-60SKである:
Figure 2022518924000012
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCB-20Cである:
Figure 2022518924000013
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCB-1020である:
Figure 2022518924000014
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCB-1320である:
Figure 2022518924000015
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCB-1820である:
Figure 2022518924000016
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCR19428である:
Figure 2022518924000017
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有する20R-SM09である:
Figure 2022518924000018
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCB-20Rである:
Figure 2022518924000019

(式中、Mは放射性核種である)。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCB-18Gである:
Figure 2022518924000020
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCR19426である:
Figure 2022518924000021
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCB-10Sである:
Figure 2022518924000022
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCR19425である:
Figure 2022518924000023
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の構造式を有するCB-50Sである:
Figure 2022518924000024
別の態様において、本願は、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を開示する。
一部の実施形態において、本組成物は、静脈内に、皮下に、経口的に、筋肉内に又は脳室内に投与される。
別の態様において、本願は、ペイロードをそれを必要としている対象に送達する方法であって、治療有効量の本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は本願の医薬組成物を対象に投与することを含む方法を開示する。
別の態様において、本願は、対象の疾患を治療する方法であって、治療有効量の本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は本願の医薬組成物を対象に投与することを含む方法を開示する。
一部の実施形態において、本願の対象の疾患を治療する方法は、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は医薬組成物と組み合わせて1つ以上の療法剤を投与することを更に含む。
更に別の態様において、本願は、対象の疾患を治療するための薬物の調製における本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は本願の医薬組成物の使用を開示する。
更に別の態様において、本願は、対象の疾患を治療するための本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は本願の医薬組成物を開示する。
一部の実施形態において、疾患は、癌、免疫疾患、心血管疾患、代謝疾患、及び神経学的疾患からなる群から選択される。
一部の実施形態において、癌は、前立腺癌、乳癌、肺癌、腎癌、白血病、卵巣癌、胃癌、子宮癌、子宮内膜癌、肝癌、結腸癌、甲状腺癌、膵癌、結腸直腸癌、食道癌、皮膚癌、リンパ腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。
一部の実施形態において、免疫疾患は自己免疫疾患である。一部の実施形態において、自己免疫疾患は、結合組織病、全身性硬化症、関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデスからなる群から選択される。
一部の実施形態において、心血管疾患は、アンギナ、心筋梗塞、脳卒中、心臓発作、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、不整脈、及び先天性心疾患からなる群から選択される。
一部の実施形態において、代謝疾患は、糖尿病、痛風、肥満、低血糖症、高血糖症、及び脂質異常症からなる群から選択される。
一部の実施形態において、神経学的疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、頭部傷害、多発性硬化症、眩暈、昏睡、及び癲癇からなる群から選択される。
コンジュゲート化合物CB-20Bの化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物CB-20BKの化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物CB-60Sの化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物CB-60SKの化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物CB-20Cの化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物CB-1020の化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物CB-1320の化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物CB-1820の化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物CR19428の化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物20R-SM09及びCB-20Rの化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物CB-18Gの化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物CR19426の化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物CB-10Sの化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物CR19425の化学構造式を示す。 コンジュゲート化合物CB-50Sの化学構造式を示す。 図2Aは、時間の経過に伴う異なる細胞別(上から下に:LNCaP細胞、SKOV3細胞、DU145細胞及びNCI-H460細胞)のCy5-pep-20BK結合及びエンドサイトーシスの曲線を示す。図2Bは、時間の経過に伴う異なる細胞別(上から下に:LNCaP細胞、SKOV3細胞、DU145細胞及びNCI-H460細胞)のCy5-pep-20AK結合及びエンドサイトーシスの曲線を示す。 図3は、時間の経過に伴う異なる細胞別のCy5-FA結合及びエンドサイトーシスの蛍光像を示し、ここで丸で囲んで示した蛍光は細胞核の蛍光であり、斑点状のパターンで分布する蛍光はCy5-FAの蛍光である。 図4Aは、示されるとおりの腫瘍細胞の増幅に対するコンジュゲート化合物CB-20BKの阻害活性を示す。 図4Bは、示されるとおりの腫瘍細胞の増幅に対するコンジュゲート化合物CB-20Bの阻害活性を示す。 図4Cは、示されるとおりの腫瘍細胞の増幅に対するコンジュゲート化合物CB-10Sの阻害活性を示す。 図4Dは、示されるとおりの腫瘍細胞の増幅に対するコンジュゲート化合物CB-60Sの阻害活性を示す。 図4Eは、示されるとおりの腫瘍細胞の増幅に対するコンジュゲート化合物CB-60SKの阻害活性を示す。 図4Fは、示されるとおりの腫瘍細胞の増幅に対するコンジュゲート化合物CB-18Gの阻害活性を示す。 図4Gは、示されるとおりの腫瘍細胞の増幅に対するコンジュゲート化合物CB-50Sの阻害活性を示す。 マウスにおけるコンジュゲート化合物CB-20BKの腫瘍抑制効果を示す。 マウスにおけるコンジュゲート化合物CB-20BKの腫瘍抑制効果を示す。 マウスにおけるコンジュゲート化合物CB-20BKの腫瘍抑制効果を示す。 マウスにおけるコンジュゲート化合物CB-20Bの腫瘍抑制効果を示す。 マウスにおけるコンジュゲート化合物CB-20Bの腫瘍抑制効果を示す。 マウスにおけるコンジュゲート化合物CB-18Gの腫瘍抑制効果を示す。 マウスにおけるコンジュゲート化合物CB-18Gの腫瘍抑制効果を示す。 マウスにおけるコンジュゲート化合物CB-18Gの腫瘍抑制効果を示す。 注射用CBP-1018がLU2505肺癌モデル及びLU1206肺癌モデルの腫瘍容積に及ぼす効果を示す。
本願には様々な態様及び実施形態が開示されることになるが、当業者が本願の主題の趣旨及び範囲から逸脱することなくそれらの態様及び実施形態に様々な等価な変更及び改良を加え得ることは明らかである。本願に開示される様々な態様及び実施形態はあくまでも例示を目的とし、限定することを意図するものではなく、真の範囲は添付の特許請求の範囲によって示される。本願に引用される全ての刊行物、特許又は特許出願は、全体として参照により援用される。特に定義されない限り、本明細書で使用されるとおりの科学技術用語は、本願が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ある(a)」、「ある(an)」、及び「その(the)」には、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象が含まれる。用語「ある(a)」(又は「ある(an)」)、「1つ以上」及び「少なくとも1つ」は、本明細書では同義的に用いられ得る。また、用語「~を含む/を含んでいる」、「~を包含する/包含している」、及び「~を有する/を有している」は同義的に用いられ得ることも注記される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、用語「類似体」には構造的類似体及び機能的類似体が含まれる。構造的類似体は、1つ以上の異なる原子又は1つ以上の異なる官能基を含み得る類似の化学構造を有する化合物のクラスを指す。機能的類似体は、同じ又は類似の化学的、生物学的又は薬理学的効果を有する化合物のクラスを指す。例えば、葉酸塩の類似体としては、5-メチルテトラヒドロ葉酸、5-ホルミルテトラヒドロ葉酸、メトトレキサート、及び5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸が挙げられる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、用語「誘導体」は、1つ以上の原子又は原子団が他の原子又は原子団に置換されている親化合物分子から誘導された比較的複雑な化合物を指す。例えば、カンプトテシン誘導体としては、イリノテカン、SN-38、Dxd、トポテカン、GI-147211C、トポテカン、9-アミノカンプトテシン、7-ヒドロキシメチルカンプトテシン、7-アミノメチルカンプトテシン、10-ヒドロキシカンプトテシン、(20S)-カンプトテシン、9-ニトロカンプトテシン、ギマテカン、カレニテシン、シラテカン、ルルトテカン、エキサテカン、ジフロモテカン、ベロテカン、ルルトテカン及びS39625が挙げられる。
一態様において、本願は、ペイロードと2つのターゲティング分子とを含むコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩を開示し、ここで2つのターゲティング分子は、それぞれ、相乗作用分子部分及び前立腺特異的膜抗原リガンド部分である。
別の態様において、本願は、ペイロードと2つのターゲティング分子とを含むコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩を開示し、ここで2つのターゲティング分子は、それぞれ、相乗作用分子部分及び式(I)によって表されるリガンド部分である:
Figure 2022518924000025
別の態様において、本願は、ペイロードと2つのターゲティング分子とを含むコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩を開示し、ここで2つのターゲティング分子は、それぞれ、相乗作用分子部分及びP10であり、ペイロードはカンプトテシン又はその任意の誘導体である。
用語「ペイロード」は、本明細書で使用されるとき、標的細胞又は組織に送達されることになる分子又は材料を指す。限定なしに、ペイロードは、対象の疾患の診断、治療、又は予防における使用が意図される任意の分子又は材料であってよい。一部の実施形態において、ペイロードは約5kDa以下の分子量を有する。一部の実施形態において、ペイロードは約1.5kDa以下の分子量を有する。一部の実施形態において、ペイロードは、適切な医薬品承認及び登録機関(FDA、EMEA、又はNMPAなど)によって使用が安全且つ有効と見なされている薬物又は診断試薬である。
一部の実施形態において、本願のペイロードは、小分子化合物、ヌクレオチド(DNA、プラスミドDNA、RNA、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びアプタマーなど)、ペプチド、又はタンパク質(例えば、酵素)である。一部の実施形態において、ペイロードは小分子化合物である。
一部の実施形態において、本願のペイロードとしては、抗癌薬、放射性物質、ビタミン、抗AIDS薬、抗生物質、免疫抑制薬、抗ウイルス薬、酵素阻害薬、神経毒、オピオイド、細胞-細胞外マトリックス相互作用調節薬、血管拡張薬、降圧薬、催眠薬、抗ヒスタミン薬、抗痙攣薬、筋弛緩薬、抗パーキンソン病物質、抗痙攣薬及び筋収縮抑制薬、駆虫薬及び/又は抗原虫薬、鎮痛薬、解熱薬、ステロイド系又は非ステロイド系抗炎症薬、抗血管新生因子、抗分泌因子、抗凝固薬及び/又は抗血栓剤、局所麻酔薬、プロスタグランジン、抗鬱薬、抗精神病薬、鎮吐薬、又は造影剤が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、本願のペイロードは、本願のコンジュゲート化合物とコンジュゲートされる前は遊離アミノ基又はカルボキシル基を有し、ペイロードは、上述のアミノ基又はカルボキシル基とコンジュゲート化合物の対応する部分(例えば、リンカー)との間のアシル化反応を通じてコンジュゲート化合物とコンジュゲートされる。一部の実施形態において、上述の遊離アミノ基又はカルボキシル基が(例えば、本願のコンジュゲート化合物とのコンジュゲーションにより)修飾されると、ペイロードの活性が大幅に(例えば、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%又は99%)低下し得る。
「小分子化合物」は、本明細書で使用されるとき、約2kDa以下の分子量を有する化合物を指す。一部の実施形態において、小分子化合物は約1.5kDa以下の分子量を有する。一部の好ましい実施形態において、小分子化合物は、約1kDa、800Da、700Da、600Da、又は500Da以下の分子量を有する。一部の実施形態において、本願の小分子化合物は、カンプトテシン及びその任意の誘導体(例えば、SN38又はDxd)、アウリスタチン及びその任意の誘導体(例えば、MMAE及びMMAF)、メイタンシン及びその任意の誘導体、シクロオキシゲナーゼ-2阻害薬(例えば、セレコキシブ)、放射性核種錯体、パクリタキセル及びその任意の誘導体、エポチロン及びその任意の誘導体、ブレオマイシン及びその任意の誘導体、ダクチノマイシン及びその任意の誘導体、プリカマイシン及びその任意の誘導体、及びマイトマイシンCからなる群から選択される。一部の実施形態において、小分子化合物は、カンプトテシン又はその任意の誘導体、アウリスタチン又はその任意の誘導体、放射性核種錯体又はシクロオキシゲナーゼ-2阻害薬である。一部の実施形態において、本願に記載される小分子化合物は、癌を軽減又は治療するための薬物である。一部の実施形態において、本願に記載される小分子化合物は、自己免疫疾患を軽減又は治療するための薬物である。
用語「カンプトテシン」は、本明細書で使用されるとき、主にカンレンボク(Camptotheca acuminata)(ヌマミズキ科(Nyssaceae))に由来する、強力な抗腫瘍活性を示す細胞毒性アルカロイドを指す。本願のカンプトテシン及びその誘導体には、既に存在する又は後に作り出されることになるカンプトテシン及びその誘導体が含まれる。本願のカンプトテシン及びその誘導体としては、カンプトテシン、イリノテカン、SN-38、Dxd、トポテカン、GI-147211C、トポテカン、9-アミノカンプトテシン、7-ヒドロキシメチルカンプトテシン、7-アミノメチルカンプトテシン、10-ヒドロキシカンプトテシン、(20S)-カンプトテシン、9-ニトロカンプトテシン、ギマテカン、カレニテシン、シラテカン、ルルトテカン、エキサテカン、ジフロモテカン、ベロテカン、ルルトテカン及びS39625が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アウリスタチン及びその任意の誘導体/アウリスタチン又はその任意の誘導体」は、本明細書で使用されるとき、天然の抗腫瘍産物であるアプリシアトキシン10、及びその一連の誘導体を指し、ここでかかる化合物は微視的自己集合を妨げて分裂期にある細胞を停止させ、それが細胞にとって強力な致死性を持つ。本願のアウリスタチン及びその任意の誘導体には、既に存在する又は後に作り出されることになるアウリスタチン及びその任意の誘導体が含まれる。本願のアウリスタチン及びその誘導体としては、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、モノメチルアウリスタチンD(MMAD)、AFP及びAFHPAが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「シクロオキシゲナーゼ-2阻害薬」は、本明細書で使用されるとき、特異的シクロオキシゲナーゼ-2阻害薬のクラスである。シクロオキシゲナーゼ-2は種々の機構を通じて悪性腫瘍の発育及び浸潤に関与する。シクロオキシゲナーゼ-2阻害薬は、腫瘍細胞の遊走及び接着並びに血管内浸潤を阻害し、それによって悪性腫瘍の発生及び発育を阻害することができる。本願のシクロオキシゲナーゼ-2阻害薬には、既に存在する又は後に作り出されることになるシクロオキシゲナーゼ-2阻害薬が含まれる。シクロオキシゲナーゼ-2阻害薬としては、セレコキシブ、ロフェコキシブ、パレコキシブ、バルデコキシブ及びエトリコキシブが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「放射性核種錯体」は、本明細書で使用されるとき、放射性核種を含有する特別なクラスの錯体を指し、ここで錯体中のキレート剤が放射性核種とキレート化して、標的物質に一層安定に結合する連結部を提供することができる。用語「放射性核種」は、本明細書で使用されるとき、放射線(α線、β線、又はγ線など)を自発的に放出することのできる元素を指す。本願の放射性核種には、既に存在する又は後に作り出されることになるあらゆる治療用及び診断用放射性核種が含まれる。本願の放射性核種としては、67Cu、64Cu、90Y、109Pd、111Ag、149Pm、153Sm、165Ho、166Ho、177Lu、186Re、188Re、99mTc、67Ga、68Ga、111In、90Y、177Lu、186Re、188Re、197Au、198Au、199Au、105Rh、161Tb、149Pm、44Sc、47Sc、70As、71As、72As、73As、74As、76As、77As、212Pb、212Bi、213Bi、225Ac、117mSn、67Ga、201Tl、123I、131I、160Gd、148Nd、89Sr及び211Atが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、キレート剤は大環状キレート剤である。本願のキレート剤としては、H2dedpa、H4octapa、H2azapa、DTPA、CHX-A”-DTPA、DTPA-ビス無水物、マレイミド-DTPA、DTPA(tBu)4、DiamSar CB-TE2A、サイクラム、DO2A、DOTA、OTA-GA(tBu)、マレイミド-DOTA-GA、p-NCS-Bz-DOTA-GA、NH2-DOTA-GA、DOTA-GA無水物、DOTA-トリス(tBu)エステル、プロパルギル-DOTA-トリス(tBu)エステル、DO3AM-酢酸、DO3AM-N-(2-アミノエチル)エタンアミド、DO3AtBu-N-(2-アミノエチル)エタンアミド、DOTA-ジ(tBu)エステル、DOTA-トリス(tBu)エステルNHSエステル、DOTA-NHSエステル、プロパルギル-DOTA-トリス(tBu)エステル、DOTADOTA-GA無水物、DOTA-GA(tBu)、p-NCS-Bz-DOTA-GA、NH2-DOTA-GA、マレイミド-DOTA-GA、AGuIX、Gado-H、サイクレン、DO2AtBu、DO3AtBu、DO3AEt、DO3AM、DOTAEt、DOTPrEt、cis-グリオキサール-サイクレン、モノ-N-ベンジル-サイクレン、trans-N-ジベンジル-サイクレン、トリBOC-サイクレン、モノ-N-ベンジル-TACN、ジBOC-TACN、架橋サイクラム(CB-サイクラム)、(13)aneN4、TACN、TACN・3HCl、TACD、モノ-N-ベンジル-TACD、ジBOC-TACD、1,7-ジオキサ-4,10-ジアザシクロドデカン、C-メチル-エステル-サイクラム、C-カルボン酸-サイクラム、trans-N-ジメチル-サイクラム、TETRAM、TETAEt、TETAMEt2、TETAMMe2、TETAM、CPTA、CB-サイクラム誘導体、CB-TE2A、メチルアミノ-(13)aneN4、ビス-(13)aneN4、オキソ-(13)aneN4、モノ-N-ベンジル-(13)aneN4、トリBOC-(13)aneN4、TRITRAM、TRI3AEt、TRI3AtBu、TRITAM、TRITA、モノ-N-ベンジル-サイクラム、ホルムアルデヒド-サイクラム、cis-グリオキサール-サイクラム、ジオキソサイクラム、オキソサイクラム、trans-N-ジベンジル-サイクラム、トリBOC-サイクラム、DOTP、DOTMA、TETA、DOTAM、DiAmSar、CB-サイクラム、CB-TE2A、NOTA、NOTAM、NH-NODA-GA、ヨード-NODA-GA、NCS-MP-NODA、NH2-MPAA-NODA、NODA-GA(tBu)、NODA-GA-NHSエステル、マレイミド-NODA-GA、NOTA-NHSエステル、マレイミド-NOTA、プロパルギル-NOTA(tBu)、p-NCS-ベンジル-NODA-GA、NOTA(tBu)、NCS-MP-NODA、NH-MPAA-NODA、NH-NODA-GA、ヨード-NODA-GA及びTACNが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は1つのペイロードを含む。一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は2つ以上のペイロードを含む。例えば、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又はそれ以上のペイロードを含む。複数のペイロードを含有するコンジュゲート化合物において、ペイロードの各々は互いに同一であっても、又は異なってもよい。一部の実施形態において、ペイロードのうちの少なくとも2つが互いに異なる。
用語「ターゲティング分子」は、本明細書で使用されるとき、本願のコンジュゲート化合物を標的部位、標的組織、標的器官、標的細胞、又は標的細胞内領域へと標的化させる能力を有する任意の分子又は部分を指す。一部の実施形態において、ターゲティング分子は、本願のコンジュゲート化合物が、非標的部位、非標的組織、非標的器官、非標的細胞又は非標的細胞内領域と比較して標的部位、標的組織、標的器官、標的細胞又は標的細胞内領域により多く分布する、例えば、少なくとも10%多く、20%多く、50%多く、80%多く、100%多く、150%多く、200%多く、300%多く、400%多く、500%多く等分布することを可能にする。一部の実施形態において、ターゲティング分子は、ターゲティング分子を含有するコンジュゲート化合物が、ターゲティング分子を含有しないコンジュゲート化合物と比較して、標的部位、標的組織、標的器官、標的細胞又は標的細胞内領域により多く、例えば、少なくとも10%多く、20%多く、50%多く分布する、80%多く、100%多く、150%多く、200%多く、300%多く、400%多く、500%多く等分布することを可能にする。一部の実施形態において、ターゲティング分子は、かかるターゲティング分子を含有するコンジュゲート化合物が標的分子に特異的に結合するように惹起又は促進し、標的細胞によるコンジュゲート化合物のエンドサイトーシスを惹起又は促進し、及びコンジュゲート化合物が標的細胞周辺で高濃度化する及び/又は標的細胞に侵入するように惹起又は促進することができる。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は少なくとも2つのターゲティング分子を含む。一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物に含まれる2つ以上のターゲティング分子は同一であるか、又は異なる。一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物に含まれる2つ以上のターゲティング分子のうちの少なくとも2つのターゲティング分子は異なる。一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物に含まれる2つ以上のターゲティング分子は、全てが互いに異なる。一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物に含まれる2つ以上のターゲティング分子のうちの少なくとも2つのターゲティング分子は、異なる細胞表面タンパク質又はマーカーに特異的に結合することができる。一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物に含まれる2つ以上のターゲティング分子は、異なる細胞表面タンパク質又はマーカーに特異的に結合することができる。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は少なくとも2つのターゲティング分子を含み、そのうちの少なくとも1つは相乗作用分子である。
用語「相乗作用分子」は、本明細書で使用されるとき、本願のコンジュゲート化合物に含まれる他のターゲティング分子と相乗的に働いて、より良好にコンジュゲート化合物が標的分子に特異的に結合するように惹起又は促進する、標的細胞によるコンジュゲート化合物のエンドサイトーシスを惹起又は促進する、コンジュゲート化合物が標的細胞周辺で高濃度化する及び/又は標的細胞に侵入するように惹起又は促進する、及び/又はコンジュゲート化合物の標的細胞への特異的結合及び維持を別様に生じさせる能力を有する任意の分子又は部分を指す。一部の実施形態において、相乗作用分子は、本願のコンジュゲート化合物が非標的部位、非標的組織、非標的器官、非標的細胞又は非標的細胞内領域と比較して標的部位、標的組織、標的器官、標的細胞又は標的細胞内領域により多く分布する、例えば、少なくとも10%多く、20%多く、50%多く、80%多く、100%多く、150%多く、200%多く、300%多く、400%多く、500%多く等分布することを可能にする。一部の実施形態において、相乗作用分子は、相乗作用分子を含有するコンジュゲート化合物が、相乗作用分子を含有しないコンジュゲート化合物と比較して、標的部位、標的組織、標的器官、標的細胞又は標的細胞内領域により多く、例えば、少なくとも10%多く、20%多く、50%多く、80%多く、100%多く、150%多く、200%多く、300%多く、400%多く、500%多く等分布することを可能にする。一部の実施形態において、相乗作用分子は、相乗作用分子を含有するコンジュゲート化合物が、相乗作用分子を含有しないコンジュゲート化合物と比較して、標的細胞に対してより高い活性、例えば、少なくとも10%高い、20%高い、50%高い、80%高い、100%高い、150%高い、200%高い、300%高い、400%高い、500%高い等の活性を有することを可能にする。
一部の実施形態において、本願の相乗作用分子は細胞相互作用分子である。
用語「細胞相互作用分子」は、本明細書で使用されるとき、標的細胞の細胞表面材料と相互作用して、かかる細胞相互作用分子を含有するコンジュゲート化合物が細胞に特異的に結合するように惹起又は促進する、標的細胞によるコンジュゲート化合物のエンドサイトーシスを惹起又は促進する、及び/又はコンジュゲート化合物が標的細胞周辺で高濃度化する及び/又は標的細胞に侵入するように惹起又は促進する能力を有する分子を指す。
細胞相互作用分子は化学的小分子又は大型生体分子であってもよい。一部の実施形態において、細胞相互作用分子は小分子化合物又はポリペプチドである。一部の実施形態において、細胞相互作用分子は、2~50、2~40、2~30、2~25、2~22、2~20、2~18、2~15、2~12、2~10、2~8、4~50、5~50、5~40、5~30、5~25、5~22、5~20、5~18、5~15、5~12、5~10、6、7、8、又は9アミノ酸を含む小分子化合物、又はポリペプチドである。
一部の実施形態において、ターゲティング分子は、細胞表面受容体又は他の分子に結合する能力を有するリガンドである。一部の実施形態において、ターゲティング分子のうちの少なくとも1つは、細胞表面受容体又は他の分子に結合する能力を有するリガンドである。
本願のリガンドには、選択の標的への特異的結合親和性を有するものであり得る種々の化学的分子又は生体分子が含まれてもよく、ここで選択の標的とは、例えば、細胞表面受容体、細胞表面抗原、細胞、組織、器官等であり得る。一部の実施形態において、リガンドは、標的細胞の表面上に発現するタンパク質又はマーカーに特異的に結合することができる。一部の実施形態において、本願のリガンドは、細胞表面タンパク質又はマーカーに10-6~10-11M(K値)の親和性で結合する。一部の実施形態において、本願のリガンドは、細胞表面タンパク質又はマーカーに少なくとも10-7、少なくとも10-8及び少なくとも10-9M(K値)の親和性で結合する。一部の実施形態において、本願のリガンドは、細胞表面タンパク質又はマーカーに10-6M未満、10-7M未満及び10-8M未満(K値)の親和性で結合する。一部の実施形態において、本願のリガンドは細胞表面タンパク質又はマーカーに一定の親和性で結合し、ここで一定の親和性とは、標的細胞表面タンパク質又はマーカーに対するリガンドの親和性が非標的細胞表面タンパク質又はマーカーに対するよりも少なくとも2、3、4、5、6、8、10、20、50、100倍又はそれ以上高いことを指す。一部の実施形態において、標的細胞(例えば癌細胞)における本願の細胞表面タンパク質又はマーカーの発現は、正常細胞における発現と比べて有意に高い。用語「有意に」は、本明細書で使用されるとき、統計的に有意な差、又は当業者が認識し得る有意な差を指す。
一部の実施形態において、標的細胞(例えば癌細胞)における本願の細胞表面タンパク質又はマーカーの発現レベルは、正常細胞と比べて2~1,000,000倍高い;例えば、標的細胞(例えば癌細胞)における発現レベルは、正常細胞と比べて2~10、2~100、2~1,000、2~10,000、2~100,000又は2~1,000,000(これは上記の数値範囲内にある任意の値に等しくてもよく、及びこの範囲の端点の値は含まれる)倍高い。一部の実施形態において、標的細胞(例えば癌細胞)における細胞表面受容体の発現レベルは正常細胞と比べて少なくとも10倍高い、又は100倍高い、又は1,000倍高い、又は10,000倍高い、又は100,000倍高い。一部の実施形態において、標的細胞(例えば癌細胞)上の細胞表面タンパク質又はマーカーレベルと比較して、正常細胞上の細胞表面受容体レベルは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は99%低下する。一部の実施形態において、本願に記載される細胞表面タンパク質又はマーカーは、正常細胞には検出不能である。
一部の実施形態において、本願の細胞表面タンパク質又はマーカーは細胞表面受容体である。
一部の実施形態において、本願の細胞表面受容体は、トランスフェリン受容体(TFR)、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)、葉酸受容体(FR)、成長ホルモン抑制ホルモン受容体、尿酸キナーゼ受容体、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)、インテグリン受容体(LFA-1)、SST-14受容体(SSTR2)、GNRH受容体(GNRHR)、TRPV6及びインテグリンα受容体からなる群から選択される。
一部の実施形態において、本願の細胞表面タンパク質又はマーカーは細胞表面抗原である。
一部の実施形態において、本願の細胞表面抗原は、前立腺特異的膜抗原、MUC1ムチン、急性リンパ芽球共通抗原、Thy-1細胞表面抗原、メランAタンパク質、扁平上皮癌抗原、ガレクチン3及びヒト白血球抗原からなる群から選択される。
一部の実施形態において、本願の細胞相互作用分子は、FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)、GNRHR、Her2、Trop2、Her3、NECTIN4、LRP1、GLUT1、EGFR1、AXL、CA9、CD44、クローディン18.2、APN、DLL3、CEACAM5、FZD10、TFRC、MET、IGFR1、SSTR2、CCKBR、LFA1、ICAM、GPR87、GM-CSF、GM-CSFR、TIM3、TLRファミリー、CD40、CD40L、OX40、OX40L、GITRL、GITR、4-BBL、4-1BB、CD70、CD27、ICOSL、ICOS、HHLA2、CD28、CD86/80、CD28、MHCII抗原、TCR、CTLA-4、CD155、CD122、CD113、IGIT、PD-L1、PD1、ガレクチン-9、TIM-3、HVEM、BTLA、CD160、VISTA、B7-H4、B7-H3、ホスファチジルセリン、HHLA2、LAG3、ガレクチン-3、LILRB4、シグレック15、NKG2A、NKG2D、SLAMF7、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、FGFR1、FGFR2、FGFR4、NeuGcGM3及びCXCR4からなる群から選択される分子に結合することができる。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は前立腺特異的膜抗原リガンド部分と相乗作用分子部分とを含み、ここで相乗作用分子部分は、FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)、SSTR2及びGNRHRからなる群から選択される分子に結合する。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、式(I)によって表されるリガンド部分と相乗作用分子部分とを含み、ここで相乗作用分子部分は、FOLR1、TRPV6、SSTR2及びGNRHRからなる群から選択される分子に結合する。
更に一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩はP10と相乗作用分子部分とを含み、ここで相乗作用分子は、FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)及びGNRHRからなる群から選択される分子に結合する。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩における相乗作用分子のうちの1つは、エンドサイトーシスの媒介能を有するエンドサイトーシス分子部分である。用語「エンドサイトーシス」は、本明細書で使用されるとき、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩が標的細胞と相互作用して、次には標的細胞による自らのエンドサイトーシス、インターナリゼーション又は取込みを媒介する能力を有することを意味する。用語「エンドサイトーシス分子」は、本明細書で使用されるとき、標的細胞と相互作用して、次には標的細胞による本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のエンドサイトーシス、インターナリゼーション、又は取込みを媒介する能力を有する分子を指す。
一部の実施形態において、エンドサイトーシス分子は、葉酸塩及びその類似体、エンドサイトーシスの媒介能を有するペプチド、及び細胞透過性ペプチドからなる群から選択される。
一部の実施形態において、本願のエンドサイトーシス分子は葉酸塩又はその類似体である。
葉酸塩は、その小さい分子量、非免疫原性、及び良好な安定性ゆえに他の基との化学結合の形成に有益である。葉酸塩は、細胞表面上に発現する葉酸受容体と高親和性で会合することにより葉酸塩の細胞取込みを媒介し得る。葉酸受容体はほとんどの正常細胞で極めて低発現であるものの、数多くの癌細胞において、低葉酸塩条件下で急速に分裂する細胞の高い葉酸塩要求に応えて高度に発現する(Kelemen LE,Int J Cancer,2006;119:243-50;Kane MA,et al.,J Clin Invest.1988;81:1398-406;Matsue H,et al.,Proc Natl Acad Sci USA.1992;89:6006-9;Zhao R,et al.,Annu Rev Nutr.2011;31:177-201を参照のこと)。葉酸塩は細胞表面上の葉酸受容体への特異的結合能を有し、また標的細胞へのコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のエンドサイトーシスの媒介能も有する。
一部の実施形態において、葉酸塩の類似体は、5-メチルテトラヒドロ葉酸、5-ホルミルテトラヒドロ葉酸、メトトレキサート、及び5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸からなる群から選択される。
一部の実施形態において、エンドサイトーシス分子は、エンドサイトーシスの媒介能を有するペプチドである。
一部の実施形態において、エンドサイトーシスの媒介能を有するペプチドは、配列番号16、配列番号17、配列番号18及びArg-Gly-Asp(RGDと呼ばれる)からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び配列番号16~18のいずれかと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のアミノ酸配列相同性を有する相同ペプチドを含み、ここで相同ペプチドは、それぞれ配列番号16~18に示されるとおりのペプチドの機能的同等物である。
一部の実施形態において、本願に記載されるとおりのエンドサイトーシスの媒介能を有するペプチドは、配列番号16~20及びRGDの配列と比較して1つのアミノ酸部位にのみアミノ酸の保存的置換を有する。一部の実施形態において、本願に記載されるとおりのエンドサイトーシスの媒介能を有するペプチドは、配列番号16~20の配列と比較して2、3、4、5、6、7、8、9、又は10のアミノ酸部位にアミノ酸の保存的置換を有する。
その生物学的活性に影響を及ぼさないという前提の下に、本願に記載されるとおりのエンドサイトーシスの媒介能を有するペプチドはまた、例えば、β-フルオロアラニン、1-メチル-ヒスチジン、γ-メチレン-グルタミン酸、α-メチル-ロイシン、4,5-デヒドロ-リジン、ヒドロキシプロリン、3-フルオロ-フェニルアラニン、3-アミノ-チロシン、4-メチル-トリプトファンなどを含めた、天然に存在しないアミノ酸も含有し得る。
相同性パーセンテージは、当該技術分野における様々な周知の方法によって決定することができる。例えば、配列比較は、以下の公開されているツール:BLASTpソフトウェア(国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information:NCBI)のウェブサイト:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiで利用可能;また、Altschul S.F.et al.,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990);Stephen F.et al,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1997)も参照のこと)、ClustalW2(欧州バイオインフォマティクス研究所(European Bioinformatics Institute)のウェブサイト:http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/で利用可能;また、Higgins D.G.et al.,Methods in Enzymology,266:383-402(1996);Larkin M.A.et al.,Bioinformatics(Oxford,England),23(21):2947-8(2007)も参照のこと)、及びTcoffee(スウェーデンバイオインフォマティクス研究所(Sweden Bioinformatics Institute)のウェブサイトで利用可能;また、Poirot O.et al.,Nucleic Acids Res.,31(13):3503-6(2003);Notredame C.et al.,J.Mol.Boil.,302(1):205-17(2000)も参照のこと)によって実現することができる。ソフトウェアを用いて配列アラインメントを実施する場合、そのソフトウェアで利用可能なデフォルトパラメータを使用してもよく、又は他の場合にはアラインメント目的に合わせてパラメータをカスタマイズしてもよい。これらは全て、当業者の知識の範囲内にある。
用語「機能的同等物」は、本明細書で使用されるとき、その誘導体ペプチドの由来である元のペプチド配列と実質的に類似した生物学的活性を保持している誘導体ペプチドを指す。機能的同等物は天然の誘導体であってもよく、又は合成的に調製される。例示的な機能的同等物は、1アミノ酸以上の置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列を含み、但し、ペプチドの生物学的活性は維持されているものとする。置換に用いられるアミノ酸は、望ましくは、置換されることになるアミノ酸と類似の化学物理学的特性を有する。望ましい類似の化学物理学的特性には、電荷、バルク性、疎水性、親水性などの点での類似性が含まれる。
一部の実施形態において、機能的同等物はアミノ酸残基の保存的置換を含む。アミノ酸残基の保存的置換とは、類似の特性を備えたアミノ酸間の置換、例えば、極性アミノ酸間の置換(グルタミンとアスパラギンとの間の置換など)、疎水性アミノ酸間の置換(ロイシン、イソロイシン、メチオニン及びバリンの間での置換など)、同一の電荷を有するアミノ酸間の置換(アルギニン、リジン及びヒスチジンの間での置換、又はグルタミン酸とアスパラギン酸との間の置換など)等を指す。
一部の実施形態において、エンドサイトーシス分子は細胞透過性ペプチドである。細胞透過性ペプチド(CPP)は、タンパク質形質導入ドメイン(PTD)としても知られ、受容体非依存的に細胞の内部に到達する能力を有する短鎖ペプチド(概して40アミノ酸未満)である。細胞透過性ペプチドは、ペイロードとコンジュゲートされるとペイロードの膜貫通輸送の媒介能を有し、タンパク質形質導入活性を有する。一部の実施形態において、本願に記載される細胞透過性ペプチドは、腫瘍ホーミングペプチド、ミトコンドリア透過性ペプチド、活性化可能細胞透過性ペプチド、及び抗細菌性ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態において、細胞透過性ペプチドは、配列番号19(RRRRRRRRR、R9と呼ばれる)及び配列番号20(GRKKRRQRRRPPQ、これはTatペプチド、即ちHIVトランス転写活性化タンパク質の細胞透過性ペプチドである)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩における1つのターゲティング分子は前立腺特異的膜抗原リガンド部分である。
用語「前立腺特異的膜抗原」は、本明細書で使用されるとき、前立腺上皮細胞の膜に存在するII型膜貫通糖タンパク質であって、細胞内領域の19アミノ酸、膜貫通領域の24アミノ酸及び細胞外領域の707アミノ酸を含む750アミノ酸からなるものを指す。前立腺特異的膜抗原は正常な前立腺上皮細胞に発現するが、前立腺癌細胞には、はるかに高いレベルで発現する。臨床検出に用いられる従来の前立腺特異的抗原と比較して、前立腺特異的膜抗原は感度及び特異性がより高い前立腺癌腫瘍マーカーであり、特にこれはホルモン不応性前立腺癌及び前立腺癌転移性病変の両方で高発現であり、前立腺癌を他の種類の悪性腫瘍と区別する際に高い感度及び特異性を有する。更に、種々の非前立腺固形腫瘍(肺癌、膀胱癌、胃癌、膵癌、腎癌及び結腸直腸癌など)でもまた、前立腺特異的膜抗原は腫瘍血管内皮細胞に高度且つ特異的に発現する。
用語「前立腺特異的膜抗原リガンド」は、本明細書で使用されるとき、前立腺特異的膜抗原を特異的に認識して結合する能力を有する抗体、アプタマー及び小分子を指す。本願の前立腺特異的膜抗原リガンドには、既に存在する又は後に作り出されることになる前立腺特異的膜抗原リガンドが含まれるとともに、前述のリガンドの断片が、前立腺特異的膜抗原に結合する能力をそれらの断片がなおも保持している限りにおいて含まれる。抗体リガンドは最も一般的な前立腺特異的膜抗原リガンドであり、モノクローナル抗体J591、J533、J415及びE99が挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Liu H,Rajasekaran AK,Moy P et al.「前立腺特異的膜抗原の構成的及び抗体誘導性インターナリゼーション(Constitutive and antibody-induced internalization of prostate-specific memberane antigen)」 [J].Cancer Res,1998,58(18):4055-4060を参照のこと)。アプタマーは、指数関数的濃縮リガンド系による技術的スクリーニングを通じて得られる一本鎖DNA又はRNAであり、高い親和性及び高い特異性で前立腺特異的膜抗原に結合することができる。かかる前立腺特異的膜抗原リガンドとしては、xPSM-A10アプタマー及びその誘導体並びにxPSM-A9アプタマー及びその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Lupoid SE et al.,「前立腺特異的膜抗原を介してヒト前立腺癌細胞に結合するヌクレアーゼ安定化RNA分子の同定及び特徴付け(Identification and Characterization of nuclease-stabilized RNA molecules that bind human prostate cancer cells via the prostate-specific membrane antigen)」,Cncer Res,2002,62(14):4029-4033を参照のこと)。抗体リガンド及びアプタマーリガンドと比較して、前立腺特異的膜抗原小分子リガンドは、低分子量、高透過性、低免疫原性、及び合成の容易さが利点であり、グルタミン尿素小分子リガンド及びホスホロアミデート小分子リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、本願の前立腺特異的膜抗原小分子リガンドは、2-[[メチルヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[エチルヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[プロピルヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[ブチルヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[シクロヘキシルヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[フェニルヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[2-(テトラヒドロフラニル)ヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[(2-テトラヒドロピラニル)ヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[((4-ピリジル)メチル)ヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[((2-ピリジル)メチル)ヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[(フェニルメチル)ヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[((2-フェニルエチル)メチル)ヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[((3-フェニルプロピル)メチル)ヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[((3-フェニルブチル)メチル)ヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[((2-フェニルブチル)メチル)ヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[(4-フェニルブチル)ヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;及び2-[[(アミノメチル)ヒドロキシホスフィニル]メチル]グルタル酸;2-[[メチルヒドロキシホスフィニル]オキシ]グルタル酸;2-[[エチルヒドロキシホスフィニル]オキシ]グルタル酸;2-[[プロピルヒドロキシホスフィニル]オキシ]グルタル酸;2-[[ブチルヒドロキシホスフィニル]オキシ]グルタル酸;2-[[フェニルヒドロキシホスフィニル]オキシ]グルタル酸;2-[[((4-ピリジル)メチル)ヒドロキシホスフィニル]オキシ]グルタル酸;2-[[((2-ピリジル)メチル)ヒドロキシホスフィニル]オキシ]グルタル酸;2-[[(フェニルメチル)ヒドロキシホスフィニル]オキシ]グルタル酸;及び2[[((2-フェニルエチル)メチル)ヒドロキシホスフィニル]オキシ]グルタル酸;2-[[(n-ヒドロキシル)カルバモイル]メチル]グルタル酸;2-[[(n-ヒドロキシル-n-メチル)カルバモイル]メチル]グルタル酸;2-[[(n-ブチル-n-ヒドロキシル)カルバモイル]メチル]グルタル酸;2-[[(n-ベンジル-n-ヒドロキシル)カルバモイル]メチル]グルタル酸;2-[[(n-ヒドロキシル-n-フェニル)カルバモイル]メチル]グルタル酸;2-[[(n-ヒドロキシル-n-2-フェニルエチル)カルバモイル]メチル]グルタル酸;2-[[(n-エチル-n-ヒドロキシル)カルバモイル]メチル]グルタル酸;2-[[(n-ヒドロキシル-n-プロピル)カルバモイル]メチル]グルタル酸;2-[[(n-ヒドロキシル-n-3-フェニルプロピル)カルバモイル]メチル]グルタル酸;2-[[(n-ヒドロキシル-n-4-ピリジル)カルバモイル]メチル]グルタル酸;2-[[(n-ヒドロキシル)アミド]メチル]グルタル酸;2-[[n-ヒドロキシル(メチル)アミド]メチル]グルタル酸;2-[[n-ヒドロキシル(ベンジル)アミド]メチル]グルタル酸;2-[[n-ヒドロキシル(フェニル)アミド]メチル]グルタル酸;2-[[n-ヒドロキシル(2-フェニルエチル)アミド]メチル]グルタル酸;2-[[n-ヒドロキシル(エチル)アミド]メチル]グルタル酸;2-[[n-ヒドロキシル(プロピル)アミド]メチル]グルタル酸;2-[[n-ヒドロキシル(3-フェニルプロピル)アミド]メチル]グルタル酸;及び2-[[n-ヒドロキシル(4-ピリジル)アミド]メチル]グルタル酸;2-[(チオニル)メチル]グルタル酸;2-[(メチルチオニル)メチル]グルタル酸;2-[(エチルチオニル)メチル]グルタル酸;2-[(プロピルチオニル)メチル]グルタル酸;2-[(ブチルチオニル)メチル]グルタル酸;2-[(フェニルチオニル]メチル]グルタル酸;2-[[(2-フェニルエチル)チオニル]メチル]グルタル酸;2-[[(3-フェニルプロピル)チオニル]メチル]グルタル酸;2-[[(4-ピリジル)チオニル]メチル]グルタル酸;2-[(ベンジルチオニル)メチル]グルタル酸;2-[(スルホニル)メチル]グルタル酸;2-[(メチルスルホニル)メチル]グルタル酸;2-[(エチルスルホニル)メチル]グルタル酸;2-[(プロピルスルホニル)メチル]グルタル酸;2-[(ブチルスルホニル)メチル]グルタル酸;2-[(フェニルスルホニル]メチル]グルタル酸;2-[[(2-フェニルエチル)スルホニル]メチル]グルタル酸;2-[[(3-フェニルプロピル)スルホニル]メチル]グルタル酸;2-[[(4-ピリジル)スルホニル]メチル]グルタル酸;2-[(ベンジルスルホニル)メチル]グルタル酸;2-[(スルホキシミニル)メチル]グルタル酸;2-[(メチルスルホキシミニル)メチル]グルタル酸;2-[(エチルスルホキシミニル)メチル]グルタル酸;2-[(プロピルスルホキシミニル)メチル]グルタル酸;2-[(ブチルスルホキシミニル)メチル]グルタル酸;2-[(フェニルスルホキシミニル]メチル]グルタル酸;2-[[(2-フェニルエチル)スルホキシミニル]メチル]グルタル酸;2-[[(3-フェニルプロピル)スルホキシミニル]メチル]グルタル酸;2-[[(4-ピリジル)スルホキシミニル]メチル]グルタル酸;及び2-[(ベンジルスルホキシミニル)メチル]グルタル酸;n-[メチルヒドロキシホスフィニル]グルタミン酸;n-[エチルヒドロキシホスフィニル]グルタミン酸;n-[プロピルヒドロキシホスフィニル]グルタミン酸;n-[ブチルヒドロキシホスフィニル]グルタミン酸;n-[フェニルヒドロキシホスフィニル]グルタミン酸;n-[(フェニルメチル)ヒドロキシホスフィニル]グルタミン酸;n-[((2-フェニルエチル)メチル)ヒドロキシホスフィニル]グルタミン酸;及びN-メチル-N-[フェニルヒドロキシホスフィニル]グルタミン酸からなる群から選択することができる。本願の前立腺特異的膜抗原リガンドにはまた、国際公開第2010/108125号パンフレット及び同第2006/093991号パンフレット(上述の2つの特許出願は全体として本明細書に援用される)に開示される全ての前立腺特異的膜抗原小分子リガンドも含まれる。
一部の実施形態において、本願の前立腺特異的膜抗原小分子リガンドはグルタル酸誘導体である。一部の実施形態において、本願の前立腺特異的膜抗原小分子リガンドはグルタル酸のアミノカルボニル誘導体である。
一部の実施形態において、本願の前立腺特異的膜抗原小分子リガンドは以下の構造を有する:
Figure 2022518924000026
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる前立腺特異的膜抗原リガンドは以下の構造を有する:
Figure 2022518924000027
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる前立腺特異的膜抗原リガンドは以下の構造を有する:
Figure 2022518924000028
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる前立腺特異的膜抗原リガンドは以下の構造を有する:
Figure 2022518924000029
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩に含まれる前立腺特異的膜抗原リガンドは以下の構造を有する:
Figure 2022518924000030
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩における1つのターゲティング分子は、式(I)によって表されるリガンド部分:
Figure 2022518924000031

又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも90%のアミノ酸配列相同性を有するか、又はそれとの3、2又は1個以下のアミノ酸置換(例えば、保存的置換)を有するリガンド部分である。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩における1つのターゲティング分子は、P10、又はそれと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%又は少なくとも93%のアミノ酸配列相同性を有するか、又はそれとの3、2又は1個以下のアミノ酸置換(例えば、保存的置換)を有するリガンド部分である。
用語「P10」は、本明細書で使用されるとき、アミノ酸配列Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Argを有するペプチドを指す。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、(1)葉酸塩リガンド及び前立腺特異的膜抗原リガンド;(2)TRPV6リガンド及び前立腺特異的膜抗原リガンド;(3)GNRHRリガンド及び前立腺特異的膜抗原リガンド;(4)SSTR2リガンド及び前立腺特異的膜抗原リガンド;(5)葉酸塩リガンド及びSSTR2リガンド;又は(6)TRPV6リガンド及び葉酸塩リガンドからなる群から選択されるターゲティング分子を有する。
一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩における2つのターゲティング分子は、それぞれ、相乗作用分子部分及び前立腺特異的膜抗原リガンド部分である。一部の実施形態において、相乗作用分子はエンドサイトーシスの媒介能を有する。一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩における2つのターゲティング分子は、それぞれ、葉酸塩又はその類似体及び前立腺特異的膜抗原リガンド部分である。理論によって制限されることは望まないが、先行技術のリガンドの組み合わせよりも安定性が良好な特異的葉酸塩又はその類似体及び前立腺特異的膜抗原リガンド部分が選択される。
一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩における2つのターゲティング分子は、それぞれ、相乗作用分子部分及び式(I)によって表されるリガンド部分である。一部の実施形態において、相乗作用分子はエンドサイトーシスの媒介能を有する。一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩における2つのターゲティング分子は、それぞれ、葉酸塩又はその類似体及び式(I)によって表されるリガンド部分である。
一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩の2つのターゲティング分子は、それぞれ、相乗作用分子部分及びP10である。一部の実施形態において、相乗作用分子はエンドサイトーシスの媒介能を有する。一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩の2つのターゲティング分子は、それぞれ、葉酸塩又はその類似体及びP10である。
一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物は、2つのターゲティング分子とコンジュゲートした単一のペイロードのみを含む。一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物は、2つのターゲティング分子とコンジュゲートした複数のペイロードを含む。
用語「コンジュゲートした」は、本明細書で使用されるとき、2つの化学基間に直接共有結合を形成しているか、又は2つの化学基をリンカーを介して間接的に連結しているかのいずれかの、2つの化学基の共有結合による連結を指す。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は1つ又は複数のペイロード(例えば、1つのペイロード)と2つのターゲティング分子とを含み、ここでペイロードはターゲティング分子のうちの少なくとも1つに直接、共有結合的に連結されている。一部の実施形態において、ペイロードは2つのターゲティング分子に直接、共有結合的に連結されている。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は1つ又は複数のペイロード(例えば、1つのペイロード)と2つのターゲティング分子とを含み、ここでペイロードはターゲティング分子のうちの少なくとも1つにリンカーを介して共有結合的に連結されている。一部の実施形態において、ペイロードは2つのターゲティング分子にリンカーを介して共有結合的に連結されている。
用語「リンカー」は、本明細書で使用されるとき、ペイロードをターゲティング分子に共有結合的に連結する分子又は部分を指す。リンカーは、ペイロードを少なくとも1つのターゲティング分子に連結するための官能基を含む。一部の実施形態において、この官能基は、一方がペイロードに連結し、他方がターゲティング分子に連結する2つの反応性部分を含み得る。一部の実施形態において、官能基は互いに異なる。一部の実施形態において、官能基は、チオール反応性部分とアミン反応性部分とを含む基を含む。一部の実施形態において、官能基は互いに同一である。一部の実施形態において、官能基はマレイミド基である。一部の実施形態において、リンカーはアミノ酸を含む。一部の実施形態において、リンカーに含まれるアミノ酸中のカルボン酸はアミド化されている。一部の実施形態において、リンカーは、(例えば、2~10、2~8、3~8、4~8、4~7、4~6、又は5個の繰り返し単位を含む)短鎖ポリエチレングリコールを含む。
一部の実施形態において、本願のリンカーは、少なくとも1つの(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の)ペイロード及び少なくとも1つのターゲティング分子への結合能を有する多価リンカーである。多価リンカーに結合するペイロードは同一であっても、又は異なってもよく、多価リンカーに結合するターゲティング分子は同一であっても、又は異なってもよい。
一態様において、リンカーは、ペイロードが血液循環の間に意図せず放出されることを回避して標的細胞又は組織に送達されるペイロードの有効量を増加させ及び毒性を回避するのに十分に安定しているものとする。別の態様において、リンカーは、標的細胞の周囲又はその中にペイロードを放出して効率的に標的細胞を殺傷し又は標的細胞の機能を遮断する能力を有するものとする。一部の実施形態において、リンカーは少なくとも1つの切断可能な官能基を含む。好ましくは、切断可能な官能基は標的細胞外で十分に安定しているが、標的細胞の中に入ると、切断されて1つ又は複数のペイロードを放出する。一部の実施形態において、切断可能な官能基は、血中又は血清中と比べて標的細胞において少なくとも10、20、30、50、100倍又はそれ以上効率的に切断される。
切断可能リンカーは、加水分解、酵素反応、若しくは還元反応によるか、又はpH変化によって切断されてもよい。一部の実施形態において、リンカーはある種の生理環境下で(例えば、適切なpH環境下で)切断可能である。一部の実施形態において、リンカーはpH約6.5以下の酸性環境で、又は酵素などの試薬により切断可能である。一部の実施形態において、リンカーは切断作用因子、例えば、pH、酸化還元電位又は分解性分子の存在の影響を受け易い。
一部の実施形態において、リンカーは切断不能である。切断不能リンカーは、本明細書で使用されるとき、細胞内代謝の間にも基本的にインタクトなまま留まるリンカーを指す。
一部の実施形態において、リンカーは、ペプチド結合によって連結された直鎖又は分枝鎖アミノ酸からなるペプチドリンカーである。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、標的細胞の周辺に又は標的細胞に高度に又は特異的に発現するプロテアーゼ、例えば、リソソーム又はエンドソーム内のカテプシンBによって切断可能である。ペプチドリンカーは、本明細書で使用されるとき、様々な長さであり得る。典型的には、本願のペプチドリンカーは1~50アミノ酸長である。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、1~45、1~40、1~35、1~30、1~25、1~20、1~15、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1~2又は1アミノ酸長である。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、2~45、2~40、2~35、2~30、2~25、2~20、2~15、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3又は2アミノ酸長である。本願に記載されるとおりのペプチドリンカーのアミノ酸の数は、その範囲の端点の値を含め、上記の数値範囲内にある任意の整数値に等しくてもよい。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、1、2、3、4又は5アミノ酸長であることが好ましい。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、システイン、リジン、リジン-リジン、バリン-シトルリン、フェニルアラニン-リジン、バリン-リジン、システイン-リジン、システイン-グルタミン酸、アスパラギン酸-アスパラギン酸、及びアスパラギン酸-アスパラギン酸-リジンであり、任意選択で、上述のアミノ酸中のカルボン酸はアミド化されている。
一部の実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合を含むジスルフィドリンカーである。ジスルフィド結合は、細胞内還元環境では切断されるが、循環系では安定なままであってもよい。本願のジスルフィドリンカーは、DSDM、DMDS、MDS、又はNDMDSであってもよい。これらのジスルフィドリンカーの構造を以下の表1に示す。
Figure 2022518924000032
一部の実施形態において、リンカーはpH依存性リンカーである。本願に記載されるとおりのpH依存性リンカーは、ある種のpH環境下で切断可能である。一部の実施形態において、pH依存性リンカーはアルカリ性条件下では安定しているが、酸性条件下、例えば6.5以下のpH値下では切断可能であってもよい。一部の実施形態において、pH依存性リンカーはシスアコニット酸無水物である。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のリンカーは、
Figure 2022518924000033

又は上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカー(例えば、1~3アミノ酸を含むペプチドリンカーを介してターゲティング分子に結合する)である。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のリンカーは、以下の構造:
Figure 2022518924000034

又は上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカー(例えば、1~3アミノ酸を含むペプチドリンカーを介してターゲティング分子に結合する)を有する。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のリンカーは、以下の構造:
Figure 2022518924000035

又は上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカー(例えば、1~3アミノ酸を含むペプチドリンカーを介してターゲティング分子に結合する)を有する。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のリンカーは、以下の構造:
Figure 2022518924000036

又は上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカー(例えば、1~3アミノ酸を含むペプチドリンカーを介してターゲティング分子に結合する)を有する。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のリンカーは、以下の構造:
Figure 2022518924000037

又は上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカー(例えば、1~3アミノ酸を含むペプチドリンカーを介してターゲティング分子に結合する)を有する。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のリンカーは、以下の構造:
Figure 2022518924000038

又は上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカー(例えば、1~3アミノ酸を含むペプチドリンカーを介してターゲティング分子に結合する)を有する。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のリンカーは、以下の構造:
Figure 2022518924000039

又は上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカー(例えば、1~3アミノ酸を含むペプチドリンカーを介してターゲティング分子に結合する)を有する。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のリンカーは、以下の構造:
Figure 2022518924000040

又は上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカー(例えば、1~3アミノ酸を含むペプチドリンカーを介してターゲティング分子に結合する)を有する。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のリンカーは、以下の構造:
Figure 2022518924000041

又は上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカー(例えば、1~3アミノ酸を含むペプチドリンカーを介してターゲティング分子に結合する)を有する。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のリンカーは、以下の構造:
Figure 2022518924000042

又は上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカー(例えば、1~3アミノ酸を含むペプチドリンカーを介してターゲティング分子に結合する)を有する。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のリンカーは、以下の構造:
Figure 2022518924000043

又は上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカー(例えば、1~3アミノ酸を含むペプチドリンカーを介してターゲティング分子に結合する)を有する。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩のリンカーは、以下の構造:
Figure 2022518924000044

又は上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカー(例えば、1~3アミノ酸を含むペプチドリンカーを介してターゲティング分子に結合する)を有する。
一部の実施形態において、本願のリンカーは、上記に記載されるとおりのリンカーのいずれか1つ又はそれらの組み合わせを含み得る。
一部の実施形態において、ペイロードは第1のターゲティング分子と直接又は間接的にコンジュゲートされ、第1のターゲティング分子は第2のターゲティング分子と直接又は間接的にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、ペイロードは第1及び第2のターゲティング分子の各々と直接コンジュゲートされる。一部の実施形態において、ペイロードは第1及び第2のターゲティング分子の各々と間接的にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、ペイロードは第1のターゲティング分子と間接的に、例えばリンカーを介してコンジュゲートされ、第1のターゲティング分子は第2のターゲティング分子と直接又は間接的にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、ペイロードは第1のターゲティング分子と第1のリンカーを介してコンジュゲートされ、ペイロードは第2のターゲティング分子と第2のリンカーを介してコンジュゲートされる。一部の実施形態において、リンカーは、少なくとも1つの(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の)ペイロード及び2つのターゲティング分子に結合する多価リンカーである。
一部の実施形態において、2つのターゲティング分子は互いにスペーサーを介して連結される。一部の実施形態において、スペーサーは、標的細胞に特異的に発現する又は標的細胞に発現することになるプロテアーゼによって切断可能である。かかるプロテアーゼとしては、例えば、以下の表2に掲載されるとおりのプロテアーゼが挙げられる。一部の実施形態において、スペーサーは、以下の表2に掲載されるとおりのアミノ酸配列のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む。
Figure 2022518924000045
用語「切断可能」又は「切断された」は、本明細書で使用されるとき、それによってペイロードとターゲティング分子との間のリンカー、又はターゲティング分子間のスペーサーが壊れて遊離ペイロード又はターゲティング分子が放出される本願に提供されるコンジュゲート化合物上での代謝過程又は反応過程を指す。リンカー及びスペーサーは、プロテアーゼによって切断されるか、又はある種の生理環境下、例えばpH環境下で切断されるかのいずれかである。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物は、以下のとおり示される式I、II、III、又はIVの構造を有し、式中、n、m、p及びqは、独立に、0又は1(これは独立に、リンカー及びスペーサーが存在すること又は存在しないことを表す)である。以下の式中の「分子」は、「ターゲティング分子」の略である。
Figure 2022518924000046
一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、本願に提供されるとおりの少なくとも1つの(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の)ペイロードと、本願に提供されるとおりの2つのターゲティング分子と、任意選択で本願に提供されるとおりのリンカー又はスペーサーとを含む。一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、本願に提供されるとおりの1つのペイロードと、本願に提供されるとおりの細胞表面タンパク質又はマーカーに特異的に結合する1つのリガンドと、本願に提供されるとおりの1つの相乗作用分子と、本願に提供されるとおりのリンカー又はスペーサーとを含む。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物は、以下のとおり示される式V、VI、VII、又はVIIIの構造を有し、式中、n、m、p、q及びsは、独立に、0又は1(これは独立に、リンカー、多価リンカー及びスペーサーが存在すること又は存在しないことを表す)である。
Figure 2022518924000047
一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩はペイロードと2つのターゲティング分子とを含み、ここで2つのターゲティング分子は、それぞれ、相乗作用分子部分及び前立腺特異的膜抗原リガンド部分、例えば、CB-20B、CB-20BK、CB-60S、CB-60SK、CB-20C、CB-1020、CB-1320、CB-1820、CR19428、20R-SM09及びCB-20Rである。
一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は1つ以上のペイロードと2つのターゲティング分子とを含み、ここで2つのターゲティング分子は、それぞれ、相乗作用分子部分及び式(I)によって表されるリガンド部分、例えば、CB-18G、CB-1820及びCR19426である。
一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は1つのペイロードと2つのターゲティング分子とを含み、ここで2つのターゲティング分子は、それぞれ、相乗作用分子部分及びP10であり、ペイロードはカンプトテシン又はCB-10S、CR19425及びCB-50Sなどのその任意の誘導体である。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、以下の化合物:CB-20B、CB-20BK、CB-60S、CB-60SK、CB-20C、CB-1020、CB-1320、CB-1820、CR19428、20R-SM09、CB-20R、CB-18G、CR19426、CB-10S、CR19425及びCB-50S(各コンジュゲート化合物の具体的な構造は図1に示す)からなる群から選択される。一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物は、リンカー-薬物部分をリガンド部分に共有結合で連結することにより形成される。本願のリンカー-薬物部分はペイロードとリンカーとを含み、本願のリガンド部分は2つのターゲティング分子と任意選択のスペーサー又はリンカーとを含み、ここではこれらの2つの部分が反応して共有結合を形成することにより本願のコンジュゲート化合物を形成し、共有結合は、リンカー-薬物部分のリンカーとリガンド部分のリガンド分子との間に形成されてもよく、又はリンカー-薬物部分のリンカーとリガンド部分のスペーサー又はリンカーとの間に形成されてもよい。
本願のコンジュゲート化合物、CB-20Bは、リンカー-薬物部分LT1002をリガンド部分20B-SM09に共有結合で連結することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CB-20BKは、リンカー-薬物部分LT1002をリガンド部分20BK-SM09に共有結合で連結することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CB-60Sは、リンカー-薬物部分LT2000Cをリガンド部分60S-SM09に共有結合で連結することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CB-60SKは、リンカー-薬物部分LT2000Cをリガンド部分60SK-SM09に共有結合で連結することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CB-20Cは、リンカー-薬物部分LD1001をリガンド部分20BK-SM09に共有結合で連結することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CB-1020は、リンカー-薬物部分LT1002をリガンド部分1020BK-SM09に共有結合で連結することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CB-1320は、リンカー-薬物部分LT1002をリガンド部分1320BK-SM09に共有結合で連結することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CB-1820は、リンカー-薬物部分LT1002をリガンド部分1820BK-SM09に共有結合で連結することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CR19428は、リンカー-薬物部分CR19423をリガンド部分20BK-SM09に共有結合で連結することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CB-20Rは、20R-SM09を放射性核種イオンMと錯体化することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CB-18Gは、リンカー-薬物部分LT1002をリガンド部分18G-SM09に共有結合で連結することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CR19426は、リンカー-薬物部分CR19423をリガンド部分18G-SM09に共有結合で連結することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CB-10Sは、リンカー-薬物部分LT1000をリガンド部分CBSM09に共有結合で連結することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CR19425は、リンカー-薬物部分CR19423をリガンド部分CBSM09に共有結合で連結することにより形成される。本願のコンジュゲート化合物、CB-50Sは、リンカー-薬物部分LT1000N3をリガンド部分50S-SM09に共有結合で連結することにより形成される。各構造を以下の表3に示す。
Figure 2022518924000048
Figure 2022518924000049
Figure 2022518924000050
Figure 2022518924000051
Figure 2022518924000052
Figure 2022518924000053
Figure 2022518924000054
一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は血液循環及び細胞外部(細胞間質中)に入る。リンカーは細胞外環境で極めて安定しており、薬物分子が遊離することはできないため、薬物分子の毒性は遮断されている。本コンジュゲートは、細胞毒性のない、又は低毒性の薬物であり、正常細胞に毒性作用を及ぼすことにはならない。
一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は複数の受容体又は抗原及び罹患細胞に同時に高発現する他の作用分子に結合し、それらの相乗効果により、標的細胞に対するコンジュゲート化合物の親和性が大幅に増加し、正常細胞に結合する可能性が低下する。従って、MMAE/Dxd/SN38/放射性核種錯体などの極めて有効性の高い毒素薬物を運ぶことができるため、薬物の有効性が高まり、治療域が広がり、薬物副作用が回避され得る。
一部の実施形態において、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は標的化された細胞の内部に入り、次にリンカーが細胞の内部環境の変化(特異的酵素消化、pH変化、ジスルフィド結合の還元等による)を通じて切断されると薬物分子が放出され(薬物分子の修飾基を取り除くことに等しい)、それが腫瘍細胞に治療効果を及ぼす。
一部の実施形態において、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩を使用して、標的組織環境内にある標的細胞にペイロードを特異的に送達することができる。概して、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩の2つのターゲティング分子には3つの利点がある。第一に、2つのターゲティング分子が複数の様式で(多くの場合に相乗的に)作用することができるため、副作用が低減されつつ治療効果が向上する。第二に、2つのターゲティング分子が結合することにより、標的受容体又は標的細胞に対するコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩の親和性及びアビディティが増加し、それによってその特異性が高まり、オフターゲット毒性が回避される。最後に、適切に設計されたとき、2つのターゲティング分子の組み合わせが、薬物コンジュゲートに求められる多機能特性を果たす。
本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、限定はされないが、(1)細胞表面受容体への結合能を有するリガンドとエンドサイトーシスの媒介能を有するエンドサイトーシス分子との組み合わせにより、コンジュゲート化合物が標的細胞に特異的に侵入することが可能となる;(2)本コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は薬物化合物の親和性及びターゲティング特異性を増強し、そのためMMAEなどの極めて有効性の高い化学療法剤が患者に送達され、かかる薬剤の治療域が広がり、副作用が回避される;(3)リンカーによってペイロードが標的細胞外で(例えば、血液循環系、細胞間質等において)放出されるのを防ぐことができ、そのため血液循環中にあるコンジュゲート化合物の安定性が確保され、薬物の毒性が低減される;標的細胞への侵入後、リンカーが切断されてペイロードが放出され、薬物の効果が発揮される一方、多剤耐性(MDR)を回避することができる;及び(4)本願のコンジュゲート化合物の形態で幅広い薬物を送達し得るため、従って関連性のある薬物の適用範囲が拡大することを含め、予期せぬ技術的効果を実現する。従って、本願のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、LDCベースの薬物のターゲティング範囲及び治療域を広げるのみならず、一部の薬物の毒性及び副作用も低減する。
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」は、本明細書で使用されるとき、単一のアミノ酸又はアミノ酸の重合体であり得る。本願に記載されるとおりのポリペプチド、タンパク質又はペプチドは、天然に存在するアミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸、又はその類似体及び模倣体を含み得る。ポリペプチド、タンパク質又はペプチドは、当該技術分野において周知の任意の方法、例えば、限定はされないが、天然材料からの単離及び精製、組換え発現、化学合成等により入手することができる。
別の態様において、本願は、本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を開示する。
用語「薬学的に許容可能」は、本明細書で使用されるとき、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応等がなくヒト及び他の動物の細胞との接触に好適で、穏当なリスク対効果比に見合ったものであることを意味する。
用語「薬学的に許容可能な塩」は、本明細書で使用されるとき、本願のコンジュゲート化合物の比較的非毒性の無機酸及び有機酸付加塩及び塩基付加塩を指す。代表的な酸付加塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル化物、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフタレン酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、スルファミン酸塩、マロン酸塩、サリチル酸塩、プロピオン酸塩、メチレン-ビス-b-ヒドロキシナフトエ酸塩、ゲンチジン酸塩、イセチオン酸塩、ジ-p-トルオイル酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩、キナ酸塩ラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。塩基付加塩としては、薬学的に許容可能な金属塩及びアミン塩が挙げられる。好適な金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、バリウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、及びアルミニウム塩が挙げられる。一部の実施形態では、ナトリウム塩及びカリウム塩が好ましい。好適な無機塩基付加塩は、例えば、水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、及び水酸化亜鉛を含めた金属塩基から調製される。好適なアミン塩基付加塩は、安定した塩を形成するのに十分な塩基性を有するアミン類から調製され、好ましくは、その低毒性及び医学的使用の許容可能性が理由で医薬品化学に高頻度に使用される以下のアミン類:アンモニア、エチレンジアミン、N-メチル-グルカミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、N-ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウム、トリエチルアミン、ジベンジルアミン、エフェナミン、デヒドロアビエチルアミン、N-エチルピペリジン、ベンジルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、塩基性アミノ酸、例えば、リジン及びアルギニン、ジシクロヘキシルアミンなどが挙げられる。
用語「薬学的に許容可能な担体」は、本明細書で使用されるとき、コンジュゲート化合物の構造及び特性を妨げることのない、本願に提供されるコンジュゲート化合物を対象に送達するための薬学的に許容可能な溶媒、懸濁液又は任意の他の薬理学的に不活性な媒体を指す。かかる担体により、コンジュゲート化合物を対象による経口摂取用に、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液及びトローチとして製剤化することが可能になる。かかる担体により、コンジュゲート化合物を局所投与用に注射液、注入液又は調製液として製剤化することが可能になる。
本願に提供される医薬組成物に用いられる薬学的に許容可能な担体としては、例えば、薬学的に許容可能な液体、ゲル、又は固体担体、水性媒体(塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液、又はデキストロース及び乳酸加リンガー注射液など)、非水性媒体(植物由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、又はピーナッツ油など)、抗微生物剤、等張剤(塩化ナトリウム又はデキストロースなど)、緩衝液(リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液など)、抗酸化剤(重硫酸ナトリウムなど)、麻酔薬(塩酸プロカインなど)、懸濁液/分散液(カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はポリビニルピロリドンなど)、キレート剤(EDTA(エチレンジアミン四酢酸)又はEGTA(エチレングリコール四酢酸)など)、乳化剤(ポリソルベート80(Tween-80)など)、希釈剤、アジュバント、賦形剤又は非毒性補助物質、当該技術分野において周知の他の成分、又はこれらの様々な組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。好適な成分としては、例えば、充填剤、結合剤、緩衝剤、保存剤、滑沢剤、香味剤、増粘剤、着色剤、又は乳化剤を挙げることができる。
一部の実施形態において、医薬組成物は注射製剤である。注射製剤には、滅菌水溶液又は分散液、懸濁液又はエマルションが含まれる。いずれの場合にも、注射製剤は無菌で、且つ注射し易いように流動体でなければならない。それは製造及び保管条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、及びこれらの好適な混合物及び/又は植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。注射製剤は、適切な流動性を維持していなければならない。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、界面活性剤の使用などによって維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。
一部の実施形態において、医薬組成物は経口製剤である。経口製剤としては、カプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、ロゼンジ(風味付けされた基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカントを用いるもの)、散剤、顆粒、又は水性若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液として、又は水中油型若しくは油中水型液体エマルションとして、又はエリキシル剤若しくはシロップ剤として、又はトローチとして(ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアなど、不活性基剤を用いるもの)及び/又は洗口液としてのものが挙げられるが、これらに限定されない。
経口投与用の固形剤形では(例えば、カプセル、錠剤、丸薬、糖衣剤、散薬、顆粒など)、コンジュゲート化合物が、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウムなどの1つ以上の薬学的に許容可能な担体、及び/又は以下のいずれか:(1)デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び/又はケイ酸などの充填剤又は増量剤;(2)カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び/又はアカシアなどの結合剤;(3)グリセロールなどの保湿剤;(4)寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウムなどの崩壊剤;(5)パラフィンなどの溶解抑制剤;(6)第4級アンモニウム化合物などの吸収促進剤;(7)アセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤;(8)カオリン及びベントナイト粘土などの吸収剤;(9)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物などの滑沢剤;及び(10)着色剤と混合される。
経口投与用の液体剤形では、コンジュゲート化合物が、以下のいずれか:薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤と混合される。コンジュゲート化合物に加えて、液体剤形は、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤など、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、イソプロパノール、1,3-ブチレングリコール、油(詳細には、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル類など、及びこれらの混合物を含有し得る。不活性希釈剤の他、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤及び懸濁液、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤及び保存剤などの補助剤も含むことができる。
一部の実施形態において、医薬組成物は、口腔スプレー製剤又は鼻腔内スプレー製剤である。スプレー製剤としては、水性エアロゾル、非水性懸濁液、リピドソーム(lipidosome)製剤又は固形顆粒製剤が挙げられるが、これらに限定されない。水性エアロゾルは、薬剤の水溶液又は懸濁液を従来の薬学的に許容可能な担体及び安定剤と混合することにより調製される。担体及び安定剤は具体的な化合物の要件に応じて異なるが、一般には、非イオン性界面活性剤(Tween又はポリエチレングリコール)、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、緩衝溶液、塩、糖又は糖アルコールが挙げられる。エアロゾルは、概して等張液から調製され、噴霧器によって送達することができる。
一部の実施形態において、医薬組成物は、1つ以上の他の薬物と混合して使用することができる。一部の実施形態において、医薬組成物は少なくとも1つの他の薬物を含む。一部の実施形態において、他の薬物は、抗新生物薬、心血管薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬、消化器系薬、神経系薬、呼吸器系薬、免疫系薬、皮膚科学薬、代謝薬などである。
一部の実施形態において、医薬組成物は、それを必要としている対象に対し、限定なしに、経口、注射(静脈内、筋肉内、皮下、皮内、心臓内、髄腔内、胸膜内及び腹腔内注射など)、粘膜(鼻腔及び口腔内投与など)、舌下、直腸、経皮、眼内、及び肺内投与を含め、適切な経路によって投与することことができる。一部の実施形態において、医薬組成物は、静脈内に、皮下に、経口的に、筋肉内に又は脳室内に投与することができる。
高い毒性及び高い親水性など、一部のペイロードの特性に起因して、ペイロードをそれを必要としている対象により特異的に且つより効率的に送達することが望ましい。例えば、癌治療では、化学療法剤を正常細胞への毒性がないよう癌細胞に特異的に送達することが望ましい。従って、別の態様において、本願は、ペイロードをそれを必要としている対象に送達する方法であって、治療有効量の本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は本願に提供される医薬組成物を対象に投与することを含む方法を開示する。本願に記載されるペイロードは、研究者、獣医師、医師又は他の臨床家が疾患を予防、阻害、改善又は治療しようとしている組織、系、動物、個体又はヒトに生物学的又は医学的応答を引き出す任意の医薬品であってよい。
用語「対象」は、本明細書で使用されるとき、ヒト及び非ヒト動物を指す。非ヒト動物には、全ての脊椎動物、例えば哺乳類及び非哺乳類が含まれる。対象はまた、ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽及びウマなどの家畜動物、又はイヌ及びネコなどの家庭動物であってもよい。対象は雄(例えば男性)又は雌(例えば女性)であってよく、高齢者であってもよく、及び成人、青年、小児、又は乳児であってもよい。ヒト対象は、コーカサス人、アフリカ人、アジア人、セム人、又は他の人種的背景を持つヒト又はかかる人種的背景の混血であってもよい。
用語「治療有効量」は、本明細書で使用されるとき、対象の疾患又は障害の1つ以上の症状を何らかの程度軽減し、疾患又は障害に関連する又はその原因となる1つ以上の生理学的又は生化学的パラメータを部分的に或いは完全に正常に戻し、及び/又は疾患又は障害が発生する可能性を低減するコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は医薬組成物の量を指す。かかる量は、概して、本願に提供される本明細書の範囲に従い当業者によって決定及び説明され得る幾つもの要因に応じて異なる。それらの要因としては、詳細な対象並びにその年齢、体重、身長、全般的な健康状態、及び病歴、使用される詳細な化合物、製剤の担体及び選択された投与経路、並びに治療下の病態の性質及び重症度が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、コンジュゲート化合物、又はその薬学的に許容可能な塩、又は医薬組成物の量は、対象の疾患又は障害を阻害するのに十分であるか、又は対象における疾患又は障害の発生を予防的に阻害又は防止するのに十分である。治療有効量は対象毎に異なり得るが、概して0.01~100mg/kg、例えば、0.01~90mg/kg、0.01~80mg/kg、0.01~70mg/kg、0.01~60mg/kg、0.01~50mg/kg、0.01~40mg/kg、0.01~30mg/kg、0.01~20mg/kg、0.01~10mg/kg、0.01~5mg/kg、0.01~4mg/kg、0.01~3mg/kg、0.01~2mg/kg、0.01~1mg/kg、及び0.01~0.1mg/kgの範囲である。本願に記載されるとおりの治療有効量は、この範囲の端点の値を含め、上記の数値範囲内にある任意の値に等しくてもよい。
別の態様において、本願は、ペイロードをそれを必要としている対象に送達する方法であって、治療有効量の本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は本願に提供される医薬組成物を対象に投与することを含む方法を開示する。
別の態様において、本願は、対象の疾患を治療する方法であって、治療有効量の本願に提供されるコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は本願に提供される医薬組成物を対象に投与することを含む方法を開示する。
一部の実施形態において、疾患は、限定はされないが、前立腺癌、乳癌、肺癌、腎癌、白血病、卵巣癌、胃癌、子宮癌、子宮内膜癌、肝癌、甲状腺癌、膵癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、皮膚癌、リンパ腫、及び多発性骨髄腫を含めた癌である。
一部の実施形態において、癌の癌細胞は、本願で言及される細胞表面受容体又は抗原の発現を有する。一部の実施形態において、癌の癌細胞は、本願で言及される細胞表面受容体又は抗原が高発現である(例えば、Depmapのデータによる(https://depmap.org/portal/を参照)、対応する遺伝子発現は少なくとも0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は10より高い)。一部の実施形態において、癌の癌細胞は、FOLR1及びFOLH1、TRPV6及びFOLH1、GNRHR及びFOLH1、SSTR2及びFOLH1、FOLR1及びSSTR2、又はTRPV6及びFOLR1が高発現である。一部の実施形態において、疾患は免疫疾患、例えば、限定はされないが、結合組織病、全身性硬化症、関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデスを含めた自己免疫疾患である。
一部の実施形態において、疾患は、限定はされないが、アンギナ、心筋梗塞、脳卒中、心臓発作、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、不整脈、及び先天性心疾患を含めた心血管疾患である。
一部の実施形態において、疾患は、限定はされないが、糖尿病、痛風、肥満、低血糖症、高血糖症、及び脂質異常症を含めた代謝疾患である。
一部の実施形態において、疾患は、限定はされないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、頭部傷害、多発性硬化症、眩暈、昏睡、及び癲癇を含めた神経学的疾患である。
一部の実施形態において、本願に提供される方法は、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は医薬組成物と組み合わせて1つ以上の療法剤を投与することを更に含む。一部の実施形態において、療法剤は抗癌治療標的を標的化し、癌に対する免疫応答を誘導若しくはブーストし、又は化学療法剤である。
具体的な例を用いて本願が更に詳細に記載されることになる。以下の例は、あくまでも例示を目的として提供され、いかなる形であれ本発明を限定することは意図されない。当業者は、本質的に同じ結果が生じるように変更又は修正することのできる種々の重大でないパラメータを容易に認識するであろう。
以下の例は、本願を更に説明することを意図している。この記載により、本願の利点及び特徴が明らかになるであろう。しかしながら、これらの説明は単に例に過ぎず、本願の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
実施例1:コンジュゲート化合物の調製
コンジュゲート化合物CB-20BK、CB-18G、CB-20B、CB-10S、CB-20C、FA-MMAE、CB-20AK、CB-1020、CB-1320及びCB-1820の合成
1.置換度0.45mmol/gの10gのRink amide-am樹脂(以下、「Rink樹脂」と称する、供給元Sunresin New Materials Co.Ltd.、カタログ番号183599-10-2)を秤量し、固相反応カラムにロードした;DCMを加え、窒素ガスを溶媒中にバブリングして樹脂を30分間膨潤させた;溶媒を汲み取った;及び樹脂上のFmoc保護基をDBLKによって除去し、次に樹脂をDMFで5回洗浄した。4.79g(9mmol)のFmoc-Lys(Dde)-OH及び1.47g(10.8mmol)のHOBtを秤量し、DMFに溶解させた。氷水浴中0℃の上述の溶液に1.67ml(10.8mmol)のDICを加えて混合することにより、5分間活性化させた。この溶液を上述の反応カラムに加え、3時間反応させて、次に溶媒を汲み取った;及び反応カラム中の樹脂を3回洗浄した。次にFmoc保護基をDBLKによって除去した。
2.上述の操作を繰り返し、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH及び中間体108を構造に従い順次コンジュゲートした。
Figure 2022518924000055
3.Dde保護基を2%ヒドラジン水和物/DMFで2回、1回につき10分間除去し、次に樹脂をDMFで5回洗浄した。Fmoc-Glu-OtBu及びプテロイン酸を順次コンジュゲートした。最後に、樹脂をメタノールで2回凝縮させて、溶媒を汲み取ることにより、17.4gの保護基付きペプチド樹脂を得た。
4.前のステップで得られた17.4gのペプチド樹脂を250ml一つ口フラスコに加えた;139mlの溶解緩衝液(TFA:HO:TIS=95:3:2(容積比))を予め調製し、2.1gのDTTを秤量して溶解緩衝液に加えた。この溶解緩衝液を上述のフラスコに加え、混合物を室温で2.5時間反応させ、ろ過した;30mlのTFAによる樹脂の洗浄を継続した;上述のろ液を合わせ、この混合物を834mlの無水エーテルに加えると黄色の固体が沈殿し、及び遠心して固体を得て、これを無水エーテルで洗浄し、真空中で乾燥させて、6.4gの粗製生成物を黄色の固体として93.4%の収率及び82.3%のHPLC純度で得た。この生成物を分取HPLCにより分離した(条件:C18カラム、移動相A:水中0.1%トリフルオロ酢酸、B:アセトニトリル、溶出グラジエント:(15-25)%B、溶出時間:60分;画分は収集した);及び適合と判定された生成物を含有する画分を凍結乾燥して、4.73gの20BK-SM09を98.8%の純度で得た。
5.4.09g(3.11mmol)のMc-Val-Cit-PAB-MMAE(LT1002)を秤量して1000ml一つ口フラスコに加え、500mlのリン酸緩衝液及び100mlのアセトニトリルを加えた;この溶液を撹拌し、pH=7.2に維持した後、澄明な溶液を得た;及び4.73g(3.11mmol)の中間体20BK-SM09を加え、この混合物を室温で2時間反応させて、この間、HPLCによって反応をモニタした。反応が完了した後、混合物をろ過し、ろ液を分取HPLCにより分離した(条件:C18カラム、移動相A:炭酸水素アンモニウム溶液(pH=7.2)、B:アセトニトリル、溶出グラジエント:(25-35)%B、溶出時間:60分;画分は収集した);適合と判定された生成物を含有する画分を凍結乾燥して、6.96gのCB-20BK生成物を98.8%の純度及び78.8%の収率で得た。
同じように、上述の方法にある同様のステップを通じてコンジュゲート化合物CB-18G、CB-20B、CB-10S、CB-20C、FA-MMAE(以下のとおり示される構造を有する)、CB-20AK(以下のとおり示される構造を有する)、CB-1020、CB-1320及びCB-1820を得ることができる。
Figure 2022518924000056
コンジュゲート化合物CB-50S、CB-60S及びCB-60SKの合成
1.置換度1.1mmol/gの10gのWang樹脂(供給元Sunresin New Materials Co.Ltd.、カタログ番号1365700-43-1)を秤量し、固相反応カラムにロードした;DMFを加え、窒素ガスを溶媒中にバブリングして樹脂を30分間膨潤させた;14.3g(22mmol)のFmoc-Arg(pbf)-OH、3.56g(26.4mmol)のHOBt、及び0.27g(2.2mmol)のDMAPを秤量し、DMFに溶解させた;氷水浴中0℃で4.1ml(26.4mmol)のDICを加えて混合することにより、5分間活性化させた;この溶液を反応カラムに加えて3時間反応させて、次に溶媒を汲み取った;及び樹脂を3回洗浄した。
2.10.4mlの酢酸酸化物及び8.9mlのピリジンを50mlのDMFに溶解させて混合し、樹脂を上記のステップで洗浄した後に加えた;この混合物を室温で5時間ブロッキングし、DMFで3回洗浄した;及び樹脂をメタノールで凝縮させて、次に溶媒を汲み取るとFmoc-Arg(pbf)-Wang樹脂が得られ、これは置換度が0.53mmol/gと決定された。
3.3.8g(2mmol)のFmoc-Arg(pbf)-Wang樹脂(Sub(置換度)=0.53mmol/g)を秤量し、反応カラムにロードした;樹脂をDMFで3回洗浄し、次にDMFを加えることにより30分間膨潤させた。次にFmoc保護基をDBLKによって除去し、樹脂をDMFで6回洗浄した。2.0g(6mmol)のFmoc-Pro-OH及び0.97g(7.2mmol)のHOBtを秤量し、DMFに溶解させた;氷水浴中0℃で1.1ml(7.2mmol)のDICを加えて混合することにより、5分間活性化させた;この混合物を反応カラムに加え、2時間反応させた;次にFmoc保護基をDBLKによって除去した。
4.上述の操作を繰り返し、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-プロパルギル-Gly-OH、Fmoc-Glu-OtBu及びプテロイン酸を構造に従い順次コンジュゲートした。樹脂をメタノールで2回凝縮させて、溶媒を汲み取ることにより、8.4gのペプチド樹脂を得た。
5.前のステップで得られた8.4gのペプチド樹脂を250ml一つ口フラスコに加えた;67mlの溶解緩衝液(TFA:HO:TIS=95:3:2(容積比))を予め調製し、0.92gのDTTを秤量して溶解緩衝液に加えた。この溶解緩衝液をフラスコに加え、混合物を室温で2.5時間反応させた;樹脂をろ過し、20mlのTFAで洗浄した;ろ液を合わせ、この混合物を402mlの無水エーテルに加えると黄色の固体が沈殿し、及び遠心して固体を得て、これを無水エーテルで洗浄し、真空中で乾燥させて、4.06gの粗製生成物を黄色の固体として97.3%の収率及び84.6%のHPLC純度で得た。この生成物を分取HPLCにより分離した(条件:C18カラム、移動相A:水中0.1%トリフルオロ酢酸、B:アセトニトリル、溶出グラジエント:(20-29)%B、溶出時間:60分;画分は収集した);及び適合と判定された生成物を含有する画分を凍結乾燥して、2.86gの50S-SM09を97.6%の純度で得た。
6.1.29g(1.37mmol)のLT1000N3を秤量して500ml一つ口フラスコに加え、270mlの混合溶媒(CAN:HO=1:4)及び393mg(2.74mmol)のCuBrを加えて撹拌した。2.86g(1.37mmol)の中間体50S-SM09を加え、この混合物を室温で2~3時間反応させて、この間、HPLCによって反応をモニタした。反応が完了した後、混合物をろ過し、ろ液を分取HPLCにより分離した(条件:C18カラム、移動相A:水中0.1%トリフルオロ酢酸、B:アセトニトリル、溶出グラジエント:(22-40)%B、溶出時間:60分;画分は収集した);及び適合と判定された生成物を含有する画分を凍結乾燥して、3.17gのCB-50Sを98.6%の純度及び76.4%の収率で得た。
同じように、上述の方法にある同様のステップを通じてコンジュゲート化合物CB-60S及びCB-60SKを得ることができる。
CB-20Rの合成
1.置換度0.45mmol/gの5gのRink樹脂を秤量し、固相反応カラムにロードした;DCMを加え、窒素ガスを溶媒中にバブリングして樹脂を30分間膨潤させた;溶媒を汲み取った;樹脂上のFmoc保護基をDBLKによって除去した;及び次に樹脂をDMFで5回洗浄した。2.4g(4.5mmol)のFmoc-Lys(Dde)-OH及び0.74g(5.4mmol)のHOBtを秤量し、DMFに溶解させた;氷水浴中0℃で0.84ml(5.4mmol)のDICを加えて混合することにより、5分間活性化させた;この混合物を反応カラムに加え、3時間反応させた;及び溶媒を汲み取り、樹脂を3回洗浄した。次にFmoc保護基をDBLKによって除去した。
2.上述の操作を繰り返し、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH及び中間体108を構造に従い順次コンジュゲートした。
3.Dde保護基を2%ヒドラジン水和物/DMFで2回、1回につき10分間除去し、次に樹脂をDMFで5回洗浄した。DOTA-トリス(tBu)エステルをコンジュゲートした。次にDde保護基を2%ヒドラジン水和物/DMFで2回、1回につき10分間除去し、次に樹脂をDMFで5回洗浄した。Fmoc-Glu-OtBu及びプテロイン酸を順次コンジュゲートし、最後に樹脂をメタノールで2回凝縮させて、溶媒を汲み取ることにより、9.2gの保護基付きペプチド樹脂を得た。
4.前のステップで得られた9.2gのペプチド樹脂を250ml一つ口フラスコに加えた;74mlの溶解緩衝液(TFA:HO:TIS=95:3:2(容積比))を予め調製し、1.05gのDTTを秤量して溶解緩衝液に加えた。この溶解緩衝液をフラスコに加え、混合物を室温で2.5時間反応させた;樹脂をろ過し、20mlのTFAで洗浄した;ろ液を合わせ、この混合物を560mlの無水エーテルに加えると黄色の固体が沈殿し、及び遠心して固体を得て、これを無水エーテルで洗浄し、真空中で乾燥させて、3.8gの粗製生成物を黄色の固体として87.4%の収率及び81.2%のHPLC純度で得た。この生成物を分取HPLCにより分離した(条件:C18カラム、移動相A:水中0.1%トリフルオロ酢酸、B:アセトニトリル、溶出グラジエント:(15-25)%B、溶出時間:60分;画分は収集した);及び合成生成物を含有する画分を凍結乾燥して、2.9gの20R-SM09を97.8%の純度で得た。
5.20R-SM09を放射性核種イオンMと錯体化してCB-20Rを得た。具体的には、放射性標識177Lu(約50MBq)を100μlの0.5M酢酸ナトリウム緩衝液(pH=5)と混合した。10%DMSOに溶解させた40μlの1mM CB-20R水溶液、2μlの飽和アスコルビン酸酸性溶液及び177Luを含有する100μlの溶液を混合し、この混合物を95℃に10分間加熱した。放射性HPLC(5分以内;水中0%-100%ACN;C18カラム)により標識を検出した。
化合物CR19425の合成
Figure 2022518924000057

1.N保護下、反応フラスコに441.4mgのCR19420(上記の反応ステップに示されるとおりの構造を有する)及び8.0mLのDMFを加え、撹拌し、溶解させて、氷浴で冷却した;次に459.2mgのHATU及び380μLのDIPEAを加えて30分間撹拌した;及び次に500.0mgのCR19419(上記の反応ステップに示されるとおりの構造を有する)及び190μLのDIPEAを加え、反応が完了するまでこの混合物を室温で反応させた。反応が完了した後、反応液を酢酸水溶液に注入した;固体を沈殿させてろ過し、ろ過ケーキを酢酸水溶液及び水で洗浄し、真空中で乾燥させて、835.7mgのCR19421(上記の反応ステップに示されるとおりの構造を有する)を褐色の粉末として90.0%のHPLC純度及び90.6%の収率で得た。
2.N保護下、反応フラスコに835.7mgのCR19421及び16mLの10%ピペリジンDMF溶液を加え、室温で30分間反応させた。反応が完了した後、反応液をTFA/MTBEに注入した;固体を沈殿させてろ過し、ろ過ケーキをMTBEで洗浄し、真空中で乾燥させて、599.7mgのCR19422(上記の反応ステップに示されるとおりの構造を有する)をフィールドグレーの粉末として84.7%のHPLC純度及び83.0%の収率で得た。
3.N保護下、反応フラスコに599.7mgのCR19422、586.7mgのCR19424(上記の反応ステップに示されるとおりの構造を有する)及び15mLのDMFを加え、撹拌し、溶解させて、氷浴で冷却した;次に495.7mgのHATU及び410μLのDIPEAを加え、室温で反応させた。反応が完了した後、反応液を分取精製に供し、純粋生成物溶液からアセトニトリルを減圧除去した;残渣をジクロロメタンとメタノールとの混合溶媒で抽出し、濃縮し、乾燥させて、674.9mgのCR19423(上記の反応ステップに示されるとおりの構造を有する)を黄色の粉末として88.4%のHPLC純度及び63.1%の収率で得た。
4.N保護下、反応フラスコに14.8mgのCR19423、3.0mLのPBS緩衝液(pH=6.6)及び3.0mLのアセトニトリルを加え、撹拌し、溶解させた;次に32.9mgのCBSM09を加え、この混合物をNaHPOでpH6.6~6.8に調整し、30分間反応させた。反応が完了した後、反応液を分取精製に供し、純粋生成物を凍結乾燥して、21.8mgのCR19425を黄色の粉末として95.6%のHPLC純度及び48.8%の収率で得た。
化合物CR19426の合成
Figure 2022518924000058

1.N保護下、反応フラスコに25.2mgのCR19423、3.0mLのPBS緩衝液(pH=6.6)及び3.0mLのアセトニトリルを加え、撹拌し、溶解させた;次に55.5mgの18G-SM09を加え、この混合物をNaHPOでpH6.6~6.8に調整し、30分間反応させた。反応が完了した後、反応液を分取精製に供し、純粋生成物を凍結乾燥して、44.6mgのCR19426を黄色の粉末として95.4%のHPLC純度及び55.2%の収率で得た。
化合物CR19428の合成
Figure 2022518924000059

1.N保護下、反応フラスコに486mgのCR19423、3.0mLのPBS緩衝液(pH=6.6)及び3.0mLのアセトニトリルを加え、撹拌し、溶解させた;次に712mgの20BK-SM09を加え、この混合物をNaHPOでpH6.6~6.8に調整し、30分間反応させた。反応が完了した後、反応液を分取精製に供し、純粋生成物を凍結乾燥して、508mgのCR19428を黄色の粉末として96.7%のHPLC純度及び42.3%の収率で得た。
実施例2:標的タンパク質に対するコンジュゲート化合物の親和性の決定
1.タンパク質FOLR1に対するCB-20BKの結合親和性の決定
実験器具、材料及び試薬:
BIAcore T200(GE)
CM5チップ(GE、カタログ番号29104988)
緩衝液:HBS-EP+緩衝液10×(GE、カタログ番号BR100669)、使用前に脱イオン水で10倍希釈した。
アミノカップリングキット(GE、カタログ番号BR100050)
再生試薬:10mM Glycine 2.0(GE、カタログ番号BR100355)
10mM Glycine 3.0(GE、カタログ番号BR100357)
実験ステップ
BIAcore T200(GE)の取扱説明書に従い実験を行い、分析物CB-20BK、CB-20AK、葉酸塩(FA)及びFA-MMAEのFOLR1に対する親和性を決定した。この実験では、CM5チップをリガンドFOLR1(R&D System、カタログ番号5646-FR)とコンジュゲートした。実験結果は表4に示すとおりである。
Figure 2022518924000060
表4は、CB-20BKがFOLR1に良好な親和性で特異的に結合することを示している。FOLR1に対するCB-20BKの結合親和性は、FOLR1に対するFA又はFA-MMAEの結合親和性と比べてやや弱い。CB-20AKはCB-20BKの葉酸塩部分を含まず、この実験ではFOLR1への特異的結合は検出されなかった。
2.タンパク質FOLH1に対するCB-20BKの結合親和性の決定
実験器具、材料及び試薬:
Gator(商標)(Probe Life)
SAプローブ(Probe Life、カタログ番号1906018)
緩衝液:Q緩衝液(Probe Life)、10mM、pH=7.4
実験ステップ
(1)分析物ビオチン-CB-20BKの合成ステップ
1)置換度0.45mmol/gの5.1gのRink樹脂を秤量し、固相反応カラムにロードした;DCMを加え、窒素ガスをバブリングして樹脂を30分間膨潤させた;溶媒を汲み取った;Fmoc保護基をDBLKによって除去した;及び次に樹脂をDMFで5回洗浄した。2.45gのFmoc-Lys(Dde)-OH及び0.75gのHOBtを秤量し、DMFに溶解させた;氷水浴中0℃で0.83mlのDICを加えて5分間活性化させた;この混合物を反応カラムに加え、3時間反応させた;及び溶媒を汲み取り、樹脂を3回洗浄した。次にFmoc保護基をDBLKによって除去した。
2)上述の操作を繰り返し、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH及び中間体108を構造に従い順次コンジュゲートした。
3)Dde保護基を2%ヒドラジン水和物/DMFで2回、1回につき10分間除去し、次に樹脂をDMFで5回洗浄した。Fmoc-Lys(ビオチン)-OH、Fmoc-Glu-OtBu及びプテロイン酸を順次コンジュゲートし、プテロイン酸をコンジュゲートした後、樹脂をDMFで2回洗浄した;及び最後に、樹脂をメタノールで凝縮させ、溶媒を汲み取ることにより、9.7gの保護基付きペプチド樹脂を得た。
4)前のステップで得られた9.7gのペプチド樹脂を250ml一つ口フラスコに加えた;77.6mlの溶解緩衝液(TFA:H2O:TIS=95:3:2(容積比))を予め調製し、1.1gのDTTを秤量して溶解緩衝液に加えた。この溶解緩衝液をフラスコに加え、混合物を室温で2.5時間反応させた;樹脂をろ過し、20mlのTFAで洗浄した;ろ液を合わせ、この混合物を466mlのメチルtert-ブチルエーテルに加えると黄色の固体が沈殿し、及び遠心して固体を得て、これをメチルtert-ブチルエーテルで洗浄し、真空中で乾燥させて、4.6gの黄色の固体を83.2%のHPLC純度で得た。この生成物を分取HPLCにより分離し、凍結乾燥して、2.1gのビオチン-20BK-SM09を95%以上の純度で得た。
5)500mgのMc-Val-Cit-PAB-MMAE(LT1002)を秤量して250ml一つ口フラスコに加え、65mlのリン酸緩衝液及び20mlのアセトニトリルを加えた;この溶液を撹拌し、pH=7.2に維持した後、澄明な溶液を得た;及び785mgの中間体ビオチン-20BK-SM09を加え、この混合物を室温で2時間反応させて、この間、HPLCによって反応をモニタした。反応が完了した後、混合物をろ過し、分取HPLCにより分離し、凍結乾燥して、723mgのビオチン-CB-20BKを96.8%の純度及び59.4%の収率で得た。
(2)Gator(商標)(Probe Life)の取扱説明書に従い実験を行い、FOLH1に対するビオチン-CB-20BKの結合親和性を決定した。この実験では、SAプローブがリガンドビオチン-CB-20BKに結合し、分析物がFOLH1(Sino Biologicals、カタログ番号15877-H07H)である。実験結果は表5に示すとおりである。
Figure 2022518924000061
表5は、CB-20BKがFOLH1に良好な親和性で結合することを示している。
3.FOLH1はCB-20BK-FOLR1複合体に結合する
実験材料及び試薬:
BIAcore T200(GE)
CM5チップ(GE、カタログ番号29104988)
緩衝液:HBS-EP+緩衝液10×(GE、カタログ番号BR100669)、使用前に脱イオン水で10倍希釈した。
アミノカップリングキット(GE、カタログ番号BR100050)
再生試薬:10mM Glycine 2.0(GE、カタログ番号BR100355)
10mM Glycine 3.0(GE、カタログ番号BR100357)
実験ステップ
CM5チップをリガンド:FOLR1(R&D System、カタログ番号5646-FR)とコンジュゲートした。
分析物:CB-20BK、FA-MMAE及びFOLH1(Sino Biologicals、カタログ番号15877-H07H)
BIAcore T200(GE)の操作説明書に従いFOLR1をCM5チップにコンジュゲートした;初めにCB-20BK又はFA-MMAEをロードし、次にFOLH1をロードした;及びCB-20BK-FOLR1複合体へのFOLH1の結合を検出した。実験結果は表6に示すとおりである。
Figure 2022518924000062
表6は、高濃度のFOLH1溶液に関して、CB-20BK-FOLR1複合体に結合したFOLH1の量がFA-MMAE-FOLR1複合体に結合した量と比べて有意に高く、それが継続的な上昇傾向を示すことを示している。FA-MMAE-FOLR1複合体に対するFOLH1の結合は高濃度で飽和する傾向がある。この実験から、CB-20BKがFOLR1及びFOLH1の両方の受容体に良好な親和性で結合できることが判明した。
実施例3:標的細胞へのリガンドコンジュゲートの結合及びエンドサイトーシスに関する研究
1.コンジュゲート化合物CB-20BKの細胞結合及びエンドサイトーシス実験
標識サンプルCy5-pep-20BK、Cy5-FA及びCy5-pep-20AKの合成
(1)置換度0.45mmol/gの2gのRink樹脂を秤量し、固相反応カラムにロードした;DCMを加え、窒素ガスを溶媒中にバブリングして樹脂を30分間膨潤させた;溶媒を汲み取った;Fmoc保護基をDBLKによって除去した;及び次に樹脂をDMFで5回洗浄した。0.96g(1.8mmol)のFmoc-Lys(Dde)-OH及び0.3g(2.2mmol)のHOBtを秤量し、DMFに溶解させた;氷水浴中0℃で0.33ml(2.2mmol)のDICを加えて混合することにより、5分間活性化させた;この混合物を反応カラムに加え、3時間反応させた;及び溶媒を汲み取り、樹脂を3回洗浄した。次にFmoc保護基をDBLKによって除去した。
(2)上述の操作を繰り返し、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH及び中間体108を構造に従い順次コンジュゲートした:
(3)Dde保護基を2%ヒドラジン水和物/DMFで2回、1回につき10分間除去し、次に樹脂をDMFで5回洗浄した。Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Glu-OtBu及びプテロイン酸を順次コンジュゲートした。
(4)Dde保護基を2%ヒドラジン水和物/DMFで2回、1回につき10分間除去し、次に樹脂をDMFで5回洗浄した;樹脂をCy5-COOHとコンジュゲートし、次にDMFで2回洗浄した;及び最後に、樹脂をメタノールで2回凝縮させて、溶媒を汲み取ることにより、3.6gの保護基付きペプチド樹脂を得た。
(5)前のステップで得られた3.6gのペプチド樹脂を50ml一つ口フラスコに加えた;29mlの溶解緩衝液(TFA:HO:TIS=95:3:2(容積比))を予め調製し、0.4gのDTTを秤量して溶解緩衝液に加えた。この溶解緩衝液をフラスコに加え、混合物を室温で2.5時間反応させた;樹脂をろ過し、8mlのTFAで洗浄した;ろ液を合わせ、この混合物を173mlの無水エーテルに加えると黄色の固体が沈殿し、及び遠心して固体を得て、これを無水エーテルで洗浄し、真空中で乾燥させて、1.9gの粗製生成物を青色の固体として89.6%の収率及び76.3%のHPLC純度で得た。この生成物を分取HPLCにより分離した(条件:C18カラム、移動相A:水中0.1%トリフルオロ酢酸、B:アセトニトリル、溶出グラジエント:(20-28)%B、溶出時間:50分;画分は収集した);及び適合と判定された生成物を含有する画分を凍結乾燥して、736mgのCy5-pep-20BKを93.4%の純度で得た。
同じように、上述の方法にある同様のステップを通じて化合物Cy5-FA及びCy5-pep-20AKを得ることができる。
Figure 2022518924000063
フローサイトメトリー法によりサンプルCy5-pep-20AK/Cy5-pep-20BKの細胞結合及びエンドサイトーシスを検出する実験
サンプル情報:Cy5-pep-20AK及びCy5-pep-20BK
細胞株:LNCaPヒト前立腺癌細胞、Du145ヒト前立腺癌細胞、SKOV3ヒト卵巣癌細胞及びNCI-H460ヒト肺癌細胞
主な試薬:IMDM培地、ウシ胎仔血清、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、L-グルタミン及びPBS
実験操作:
(1)細胞培養:細胞をトリプシン消化し、回収してカウントし、次にこの細胞を完全培地が入った幾つかの培養フラスコに加えた;培養フラスコを37℃、5%COのインキュベーターに置いて細胞を培養させて、最後に約5×10細胞を遠心管に回収した。
(2)サンプルインキュベーション:Cy5-pep-20AK/Cy5-pep-20BKサンプルをPBSで8nmol/Lに希釈した;細胞懸濁液を1000rpmで5分間遠心した;上清を除去し、残渣をPBSで1回洗浄した;細胞を均一に懸濁し、実験スキームに従い別々の遠心管に等分した;PBSを遠心によって除去した;200μlのサンプル作業溶液を各管に加え、37℃でそれぞれ15、30、60、及び90分間インキュベートし、PBSのみを加えた1本の管をブランク対照として使用した;操作は全て、遮光下で実施した。
(3)洗浄及びローディング:作業溶液を1000rpmで5分間遠心することによって除去し、細胞をPBSで3回洗浄し、適量のPBSを加えて細胞を1×10細胞/mlに懸濁した;Beckman CytoFLEXフローサイトメーターの電源を予め入れておくことにより、起動時のクリーニングプロセスを完了させた;及び細胞サンプルを順次ロードし、APCチャネルで10,000生細胞の蛍光を読み取った;操作は全て、遮光下で実施した。
(4)データ解析:各細胞サンプルのAPC蛍光の絶対MFI(平均蛍光強度)及び関連するブランク対照に対する相対MFIを取得し、相対MFIに基づきデータの折れ線グラフを作成した。
結果及び分析
Figure 2022518924000064
細胞の蛍光強度をそれぞれ15分、30分、60分、及び90分間インキュベートした時点で検出し、結果をプロットして図2A及び図2Bに示した。これらの図から、サンプルCy5-pep-20BK細胞の結合及びエンドサイトーシスを見ることができる。FOLR1が比較的低発現のDU145細胞株及びFOLH1が比較的低発現のNCI-H460細胞株と比較して、FOLR1が比較的高発現のLNCaP細胞株及びFOLH1が比較的高発現のSKOV3細胞株は、結合してエンドサイトーシスを受けたCB-20BKの蛍光強度が有意に高い。Cy5-pep-20AKはFOLH1リガンドを含むのみで、FOLR1リガンド、FAを含まないため、Cy5-pep-20AKは、FOLH1が高発現のLNCaP細胞では高いレベルの結合及びエンドサイトーシスを示し、FOLH1の発現が中程度のSKOV3細胞では中程度のレベルの結合及びエンドサイトーシスを示す;これらの2つの細胞株では、Cy5-pep-20AKの結合及びエンドサイトーシスレベルはCy5-pep-CB-20BKと比べて有意に低かった。細胞へのリガンドコンジュゲートの結合及びインターナリゼーションの程度は細胞関連受容体の発現レベルと正の相関がある。
2.細胞への単一リガンドコンジュゲートCy5-FAの結合及びエンドサイトーシス実験
サンプル情報:Cy5-FA
細胞株:Hela子宮頸癌細胞、SKOV3ヒト卵巣癌細胞及びA549ヒト肺癌細胞
主な試薬:IMDM培地、ウシ胎仔血清、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、L-グルタミン、PBS、及びDAPIを含有する抗蛍光消光封入剤
実験操作:
(1)カバーガラス上で成長する細胞:カバーガラスを24ウェルプレートに置いた;細胞をトリプシン消化し、回収してカウントし、次に細胞を完全細胞培養培地で約2×10細胞/mlに希釈した;500μlの希釈した細胞溶液を24ウェルプレートの各ウェルに加えた;及びプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて48時間培養した。
(2)サンプルインキュベーション:Cy5-FAサンプルをIMDM培地に73nmol/Lとなるように希釈した;24ウェルプレート内の培養培地を廃棄した;200μlのサンプル作業溶液を各ウェルの細胞カバーガラスに加え、37℃でそれぞれ15、30、及び60分間インキュベートし、及びIMDM培地のみを加えた1つのウェルをブランク対照として使用した;操作は全て、遮光下で実施した。
(3)洗浄及びマウント:24ウェルプレート内の作業溶液を廃棄し、プレートを37℃に予め温めておいたPBSで3回洗浄した;細胞カバーガラスを取り出し、5μlのDAPI含有抗蛍光消光封入剤をスライド上に滴下して加え、次に細胞カバーガラスで覆ってマウントを完了した;操作は全て、遮光下で実施した。
(4)サンプルの画像解釈:Leica蛍光顕微鏡DM2500の電源を入れ、蛍光励起装置を15分間予熱した;同じ位置で、対応する蛍光チャネルにより細胞核及びCy5フルオレセインの写真を撮り、ソフトウェアで画像融合を完了した。
図3から、15分及び30分の時点での細胞へのサンプルCy5-FAの結合及びエンドサイトーシスを見ることができ、FOLR1が高発現の細胞株Hela及びSKOV-3の蛍光強度は、FOLR1が比較的低発現の細胞株A549と比べて有意に高い。細胞へのリガンドコンジュゲートの結合及びインターナリゼーションの程度は細胞関連受容体の発現レベルと正の相関がある。
実施例4:コンジュゲート化合物における細胞拡大の阻害実験
1.CB-20BKにおける腫瘍細胞拡大の阻害実験
サンプル情報:CB-20BK
細胞株:KBヒト口腔類表皮癌細胞、T-47Dヒト乳癌細胞、NCI-H460ヒト肺癌細胞、CALU-3ヒト肺腺癌細胞、HuH-7ヒト肝癌細胞及びLNCaPヒト前立腺癌細胞
主な試薬:IMDM培地、ウシ胎仔血清、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、L-グルタミン及びCCK8
実験操作:
1)細胞プレーティング
細胞を予め調製し、トリプシン消化し、回収し、カウントした;完全細胞培養培地で、KB細胞を2.5×10細胞/mlに希釈し、T-47D細胞を1.3×10細胞/mlに希釈し、NCI-H460細胞を3.5×10細胞/mlに希釈し、CALU-3細胞を4.0×10細胞/mlに希釈し、HuH-7細胞を3.0×10細胞/mlに希釈し、及びLNCaP細胞を8.0×10細胞/mlに希釈した;100μlの希釈した細胞溶液を96ウェルプレートの各ウェルに加えた;及び各プレートに陰性対照及びブランク対照ウェルをセットした。細胞を加えた96ウェルプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて一晩培養した。
2)サンプルの希釈及び添加
サンプルを培養培地で所望の濃度に希釈した(表8を参照のこと)。一晩培養した96ウェルプレートの各ウェルに、50μlの希釈したサンプルを3レプリケートウェルとして加えた;陰性対照及びブランク対照をセットした;及びこれらのプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて72時間培養した。
Figure 2022518924000065
3)発色及びプレート読取り
各ウェルに、CCK-8からの15μl(ウェル内の液体容積の10%)の発色溶液を加えた;プレートを37℃で適切な時間にわたってインキュベートした(OD値を1.0~2.0の範囲に保つようにする);96ウェルプレートのカバーを取り外し、プレートをマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Spectra MAX Plus)で450nmで読み取った。
4)データ処理
データはSoftMax Proを使用して編集し、4パラメータフィッティング曲線をプロットした。
5)実験結果及び分析
4パラメータフィッティング曲線グラフによれば(図4A、ここではC値がIC50に対応する)、CB-20BKは、KB、T-47D、NCI-H460、CALU-3、HuH-7、及びLNCaP腫瘍細胞株の成長及び拡大に阻害効果を及ぼす。細胞におけるコンジュゲート化合物の対応する受容体の発現レベルが異なるため、阻害レベルが異なる。受容体が比較的高発現の細胞株T-47D、KB、LNCaP、HuH-7及びCALU-3のIC50は、受容体が比較的低発現の細胞株NCI-H460と比べて有意に低い。CB-20BKは、腫瘍成長阻害効果と細胞関連受容体の発現レベルとの間に相関を示す。
2.腫瘍細胞株LNCaP(ヒト前立腺癌細胞)及び22RV1(ヒト前立腺癌細胞)の拡大を阻害するコンジュゲート化合物CB-20BK及び関連化合物の実験
リガンドコンジュゲート中のペイロードの細胞増殖阻害毒性に対する感受性は細胞によって異なるため、時に定量分析が干渉を受けることもある。異なるリガンドの受容体の発現レベルが既知の一連の細胞株を選択し、リガンドコンジュゲート及び単一ペイロードの細胞増殖の阻害効果に対する応答に関して試験した。同じ細胞株におけるリガンドコンジュゲートのIC50に対する単一ペイロードのIC50の比を取ることにより、かかる干渉を取り除いた。
関連サンプル:MMAE、CB-20BK、CB-20AK及びFA-MMAE
実験操作:LNCaP及び22RV1細胞を予め調製し、カウントし、96ウェル細胞培養プレートにそれぞれ4×10細胞/ml及び2.0×10細胞/mlの細胞密度でプレーティングした(100μl/ウェル);各プレートに陰性対照及びブランク対照ウェルをセットした。一晩の接着細胞培養後、希釈した供試サンプルを50μl/ウェルで加えた。プレートを37℃、5%COのインキュベーターに置き、68~72時間培養した。各ウェルに、CCK8からの15μl(ウェル内の液体容積の10%)の発色溶液を加えた;及びプレートを37℃で45~70分間インキュベートし、各プレートをマイクロプレートリーダーで450nmで読み取った。SoftMax Proを使用してデータを編集し、4Pフィッティング曲線をプロットした。計算されたデータを表9に示す。
Figure 2022518924000066
上記の表から、LNCaPと22RV1との間でFOLR1発現レベルに大きい差がなく、LNCaPのFOLH1発現レベルは22RV1のFOLH1発現レベルと比べて有意に高いことが分かる。CB-20BK(FOLH1リガンド及びFOLR1リガンドを有する)及びCB-20AK(FOLH1リガンドのみを有する)は、LNCaP及び22RV1の両方の腫瘍細胞株の拡大に阻害効果を及ぼす。受容体FOLH1の発現レベルが異なる細胞に対するCB-20BK及びCB-20AKの阻害効果は異なる。受容体FOLH1が比較的高発現の細胞株LNCaPのIC50比は、この受容体が比較的低発現の細胞株22RV1のIC50比よりも2~4倍高い。FA-MMAEもまた、LNCaP及び22RV1腫瘍細胞株の拡大に阻害効果を及ぼす。LNCaP及び22RV1のFOLR1発現レベルは極めて低いため、LNCaP細胞(FOLR1遺伝子発現レベルが0.3219である、データの出典はDepmapによる)の発現は22RV1(FOLR1遺伝子発現レベルが0.0704である、データの出典はDepmapによる)と比べてやや高く、LNCaPと22RV1との間でFA-MMAEのIC50比は1.5倍異なるに過ぎない。上記のデータは、細胞増殖に対する阻害効果が細胞発現受容体FOLH1及びFOLR1の発現レベルと正の相関があることを示している。
3.腫瘍細胞株PANC-1(ヒト膵癌細胞)及びCFPAC-1(ヒト膵癌細胞)の拡大を阻害するコンジュゲート化合物CB-20BK及び関連化合物の実験
関連サンプル:MMAE及びCB-20BK
実験操作:PANC-1及びCFPAC-1細胞を予め調製し、カウントし、96ウェル細胞培養プレートに4×10細胞/mlの細胞密度でプレーティングした(100μl/ウェル);各プレートに陰性対照及びブランク対照ウェルをセットした。一晩の接着細胞培養後、希釈した供試サンプルを50μl/ウェルで加えた。プレートを37℃、5%COのインキュベーターに置き、68~72時間培養した。各ウェルに、CCK8からの15μl(ウェル内の液体容積の10%)の発色溶液を加えた;及びプレートを37℃で45~70分間インキュベートし、各プレートをマイクロプレートリーダーで450nmで読み取った。SoftMax Proを使用してデータを編集し、4Pフィッティング曲線をプロットした。計算されたデータを以下の表に示す:
Figure 2022518924000067
表10から、CFPAC-1のFOLH1発現レベルが極めて低く、CFPAC-1のFOLR1発現レベルがPANC1細胞株と比べて有意に高いことが分かる。CB-20BKはPANC-1及びCFPAC-1腫瘍細胞株の拡大に阻害効果を及ぼす。受容体FOLR1の発現レベルが異なる細胞に対する阻害効果は異なる。受容体FOLR1が比較的高発現の細胞株CFPAC-1のIC50比は、受容体FOLR1が比較的低発現のPANC-1のIC50比よりも有意に高く、細胞増殖に対する阻害効果は、細胞関連受容体FOLR1の発現レベルと正の相関がある。
実験2及び3から、CB-20BKにおけるこれらの2つのリガンド及び細胞表面上に発現するその受容体(FOLR1及びFOLH1)が化合物による腫瘍細胞増殖の阻害において重要な役割を果たすことが分かる。
4.CB-20Bにおける腫瘍細胞拡大の阻害実験
サンプル情報:CB-20B
細胞株:A549ヒト肺癌細胞、HuH-7ヒト肝癌細胞、KBヒト口腔類表皮癌細胞、LNCaPヒト前立腺癌細胞、DU145ヒト前立腺癌細胞及びT-47Dヒト乳癌細胞
主な試薬:IMDM培地、ウシ胎仔血清、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、L-グルタミン及びCCK8
実験操作:
1)細胞プレーティング
細胞を予め調製し、トリプシン消化し、回収し、カウントした;96ウェルプレートに、完全細胞培養培地で希釈してA549細胞、HuH-7細胞、KB細胞及びDU145細胞を2×10細胞/mlの密度でプレーティングし、T-47D細胞を1×10細胞/mlの密度でプレーティングし、及びLNCaP細胞を6×10細胞/mlの密度でプレーティングした;100μlの希釈した細胞溶液を各ウェルに加えた;及び各プレートに陰性対照及びブランク対照ウェルをセットした。細胞を加えた96ウェルプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて一晩培養した。
2)サンプルの希釈及び添加
サンプルを培養培地で所望の濃度に希釈した(表11を参照のこと)。一晩培養した96ウェルプレートの各ウェルに、50μlの希釈したサンプルを3レプリケートウェルとして加えた;陰性対照及びブランク対照をセットした;及びこれらのプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて72時間培養した。
Figure 2022518924000068
3)発色及びプレート読取り
各ウェルに、CCK-8からの15μl(ウェル内の液体容積の10%)の発色溶液を加えた;プレートを37℃で適切な時間にわたってインキュベートした(OD値を1.0~2.0の範囲に保つようにする);96ウェルプレートのカバーを取り外し、プレートをマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Spectra MAX Plus)で450nmで読み取った。
4)データ処理
データはSoftMax Proを使用して編集し、4パラメータフィッティング曲線をプロットした。
5)実験結果及び分析
4パラメータフィッティング曲線グラフによれば(図4B、ここではC値がIC50に対応する)、CB-20Bは、A549、HuH-7、KB、LNcap、DU145及びT-47D腫瘍細胞株の成長及び拡大に阻害効果を及ぼす。細胞におけるコンジュゲート化合物の対応する受容体の発現レベルが異なるため、阻害レベルが異なる。受容体が比較的高発現の細胞株T-47D、LNcap、KB、HuH-7及びDU145のIC50は、受容体が比較的低発現の細胞株A549と比べて有意に低い。CB-20Bは、腫瘍成長阻害効果と細胞関連受容体の発現レベルとの間の相関を示す。
5.CB-10Sにおける腫瘍細胞拡大の阻害実験
サンプル情報:CB-10S
細胞株:KBヒト口腔類表皮癌細胞、NCI-H460ヒト肺癌細胞、RT4ヒト膀胱癌細胞、T-47Dヒト乳癌細胞及びLNcapヒト前立腺癌細胞
主な試薬:IMDM培地、ウシ胎仔血清、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、L-グルタミン及びCCK8
実験操作:
1)細胞プレーティング
細胞を予め調製し、トリプシン消化し、回収し、カウントした;完全細胞培養培地で、KB細胞を3.5×10細胞/mlに希釈し、LNCaP細胞を8.0×10細胞/mlに希釈し、T-47D細胞を1.2×10細胞/mlに希釈し、NCI-H460細胞を2.5×10細胞/mlに希釈し、及びRT4細胞を1.2×10細胞/mlに希釈した;96ウェルプレートの各ウェルに、100μlの希釈した細胞溶液を加えた;及び各プレートに陰性対照及びブランク対照ウェルをセットした。細胞を加えた96ウェルプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて一晩培養した。
2)サンプルの希釈及び添加
サンプルを培養培地で所望の濃度に希釈した(表12を参照のこと)。一晩培養した96ウェルプレートの各ウェルに、50μlの希釈したサンプルを3レプリケートウェルとして加えた;陰性対照及びブランク対照をセットした;及びこれらのプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて72時間培養した。
Figure 2022518924000069
3)発色及びプレート読取り
各ウェルに、CCK-8からの15μl(ウェル内の液体容積の10%)の発色溶液を加えた;プレートを37℃で適切な時間にわたってインキュベートした(OD値を1.0~2.0の範囲に保つようにする);96ウェルプレートのカバーを取り外し、プレートをマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Spectra MAX Plus)で450nmで読み取った。
4)データ処理
データはSoftMax Proを使用して編集し、4パラメータフィッティング曲線をプロットした。
5)実験結果及び分析
4パラメータフィッティング曲線グラフによれば(図4C、ここではC値がIC50に対応する)、CB-10Sは、KB、LNCaP、T-47D、RT4及びNCI-H460腫瘍細胞株の成長及び拡大に阻害効果を及ぼす。細胞におけるコンジュゲート化合物の対応する受容体の発現レベルが異なるため、阻害レベルが異なる。受容体が比較的高発現の細胞株KB、LNcap、T-47D及びRT4のIC50は、受容体が比較的低発現の細胞株NCI-H460と比べて有意に低い。CB-10Sは、腫瘍成長阻害効果と細胞関連受容体の発現レベルとの間の相関を示す。
6.CB-60Sにおける腫瘍細胞拡大の阻害実験
サンプル情報:CB-60S
細胞株:KBヒト口腔類表皮癌細胞、T-47Dヒト乳癌細胞、NCI-H460ヒト肺癌細胞、CALU-3ヒト肺腺癌細胞、HuH-7ヒト肝癌細胞及びLNCaPヒト前立腺癌細胞
主な試薬:IMDM培地、ウシ胎仔血清、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、L-グルタミン及びCCK8
実験操作:
1)細胞プレーティング
細胞を予め調製し、トリプシン消化し、回収し、カウントした;完全細胞培養培地で、KB細胞を2.0×10細胞/mlに希釈し、T-47D細胞を1.5×10細胞/mlに希釈し、NCI-H460細胞を2.0×10細胞/mlに希釈し、CALU-3細胞を3.0×10細胞/mlに希釈し、HuH-7細胞を4.0×10細胞/mlに希釈し、及びLNCaP細胞を8.0×10細胞/mlに希釈した;100μlの希釈した細胞溶液を96ウェルプレートの各ウェルに加えた;及び各プレートに陰性対照及びブランク対照ウェルをセットした。細胞を加えた96ウェルプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて一晩培養した。
2)サンプルの希釈及び添加
サンプルを培養培地で所望の濃度に希釈した(表13を参照のこと)。一晩培養した96ウェルプレートの各ウェルに、50μlの希釈したサンプルを3レプリケートウェルとして加えた;陰性対照及びブランク対照をセットした;及びこれらのプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて72時間培養した。
Figure 2022518924000070
3)発色及びプレート読取り
各ウェルに、CCK-8からの15μl(ウェル内の液体容積の10%)の発色溶液を加えた;プレートを37℃で適切な時間にわたってインキュベートした(OD値を1.0~2.0の範囲に保つようにする);96ウェルプレートのカバーを取り外し、プレートをマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Spectra MAX Plus)で450nmで読み取った。
4)データ処理
データはSoftMax Proを使用して編集し、4パラメータフィッティング曲線をプロットした。
5)実験結果及び分析
4パラメータフィッティング曲線グラフによれば(図4D、ここではC値がIC50に対応する)、CB-60Sは、KB、T-47D、NCI-H460、CALU-3、HuH-7、及びLNCaP腫瘍細胞株の成長及び拡大に阻害効果を及ぼす。細胞におけるコンジュゲート化合物の対応する受容体の発現レベルが異なるため、阻害レベルが異なる。受容体が比較的高発現の細胞株LNCaP及びHuH-7のIC50は、受容体が比較的低発現の細胞株NCI-H460、KB、T-47D及びCALU-3と比べて有意に低い。CB-60Sは、腫瘍成長阻害効果と細胞関連受容体の発現レベルとの間の相関を示す。
7.CB-60SKにおける腫瘍細胞拡大の阻害実験
サンプル情報:CB-60SK
細胞株:KBヒト口腔類表皮癌細胞、T-47Dヒト乳癌細胞、NCI-H460ヒト肺癌細胞、CALU-3ヒト肺腺癌細胞、HuH-7ヒト肝癌細胞及びLNCaPヒト前立腺癌細胞
主な試薬:IMDM培地、ウシ胎仔血清、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、L-グルタミン及びCCK8
実験操作:
1)細胞プレーティング
細胞を予め調製し、トリプシン消化し、回収し、カウントした;完全細胞培養培地で、KB細胞を2.5×10細胞/mlに希釈し、T-47D細胞を1.3×10細胞/mlに希釈し、NCI-H460細胞を3.5×10細胞/mlに希釈し、CALU-3細胞を4.0×10細胞/mlに希釈し、HuH-7細胞を3.0×10細胞/mlに希釈し、及びLNCaP細胞を8.0×10細胞/mlに希釈した;100μlの希釈した細胞溶液を各ウェルに加えた;及び各プレートに陰性対照及びブランク対照ウェルをセットした。細胞を加えた96ウェルプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて一晩培養した。
2)サンプルの希釈及び添加
サンプルを培養培地で所望の濃度に希釈した(表14を参照のこと)。一晩培養した96ウェルプレートの各ウェルに、50μlの希釈したサンプルを3レプリケートウェルとして加えた;陰性対照及びブランク対照をセットした;及びこれらのプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて72時間培養した。
Figure 2022518924000071
3)発色及びプレート読取り
各ウェルに、CCK-8からの15μl(ウェル内の液体容積の10%)の発色溶液を加えた;プレートを37℃で適切な時間にわたってインキュベートした(OD値を1.0~2.0の範囲に保つようにする);96ウェルプレートのカバーを取り外し、プレートをマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Spectra MAX Plus)で450nmで読み取った。
4)データ処理
データはSoftMax Proを使用して編集し、4パラメータフィッティング曲線をプロットした。
5)実験結果及び分析
4パラメータフィッティング曲線グラフによれば(図4E、ここではC値がIC50に対応する)、CB-60SKは、KB、T-47D、NCI-H460、CALU-3、HuH-7、及びLNCaP腫瘍細胞株の成長及び拡大に阻害効果を及ぼす。細胞におけるコンジュゲート化合物の対応する受容体の発現レベルが異なるため、阻害レベルが異なる。受容体が比較的高発現の細胞株LNCaP及びHuH-7のIC50は、受容体が比較的低発現の細胞株T-47D、NCI-H460、CALU-3及びKBと比べて有意に低い。CB-60SKは、腫瘍成長阻害効果と細胞関連受容体の発現レベルとの間の相関を示す。
8.CB-18Gにおける腫瘍細胞拡大の阻害実験
サンプル情報:CB-18G
細胞株:A549ヒト肺癌細胞、Helaヒト子宮頸癌細胞、SCLC-21H小細胞肺癌細胞、U-2 OSヒト骨肉腫細胞、T-47Dヒト乳癌細胞及びNCI-H460ヒト肺癌細胞
主な試薬:IMDM培地、ウシ胎仔血清、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、L-グルタミン及びCCK8
実験操作:
1)細胞プレーティング
細胞を予め調製し、トリプシン消化し、回収し、カウントした;96ウェルプレートに、完全細胞培養培地で希釈してA549細胞、Hela細胞、SCLC-21H細胞及びU-2 OS細胞を2×10細胞/mlの密度でプレーティングし、T-47D細胞及びNCI-H460細胞を3×10細胞/mlの密度でプレーティングした;96ウェルプレートの各ウェルに、100μlの希釈した細胞溶液を加えた;及び各プレートに陰性対照及びブランク対照ウェルをセットした。細胞を加えた96ウェルプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて一晩培養した。
2)サンプルの希釈及び添加
サンプルを培養培地で所望の濃度に希釈した(表15を参照のこと)。一晩培養した96ウェルプレートの各ウェルに、50μlの希釈したサンプルを3レプリケートウェルとして加えた;陰性対照及びブランク対照をセットした;及びこれらのプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて72時間培養した。
Figure 2022518924000072
3)発色及びプレート読取り
各ウェルに、CCK-8からの15μl(ウェル内の液体容積の10%)の発色溶液を加えた;プレートを37℃で適切な時間にわたってインキュベートした(OD値を1.0~2.0の範囲に保つようにする);96ウェルプレートのカバーを取り外し、プレートをマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Spectra MAX Plus)で450nmで読み取った。
4)データ処理
データはSoftMax Proを使用して編集し、4パラメータフィッティング曲線をプロットした。
5)実験結果及び分析
4パラメータフィッティング曲線グラフによれば(図4F、ここではC値がIC50に対応する)、CB-18Gは、A549、Hela、SCLC-21H、U-2 OS、T-47D及びNCI-H460腫瘍細胞株の成長及び拡大に阻害効果を及ぼす。細胞におけるコンジュゲート化合物の対応する受容体の発現レベルが異なるため、阻害レベルが異なる。受容体が比較的高発現の細胞株HelaのIC50は、受容体が比較的低発現の細胞株NCI-H460と比べて有意に低い。CB-18Gは、腫瘍成長阻害効果と細胞関連受容体の発現レベルとの間の相関を示す。
9.CB-50Sにおける腫瘍細胞拡大の阻害実験
サンプル情報:CB-50S
細胞株:KBヒト口腔類表皮癌細胞、NCI-H460ヒト肺癌細胞、RT4ヒト膀胱癌細胞、T-47Dヒト乳癌細胞及びLNCaPヒト前立腺癌細胞
主な試薬:IMDM培地、ウシ胎仔血清、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、L-グルタミン及びCCK8
実験操作:
1)細胞プレーティング
細胞を予め調製し、トリプシン消化し、回収し、カウントした;完全細胞培養培地で、KB細胞を3.5×10細胞/mlに希釈し、LNCaP細胞を8.0×10細胞/mlに希釈し、T-47D細胞を1.2×10細胞/mlに希釈し、NCI-H460細胞を2.5×10細胞/mlに希釈し、及びRT4細胞を1.2×10細胞/mlに希釈した;96ウェルプレートの各ウェルに、100μlの希釈した細胞溶液を加えた;及び各プレートに陰性対照及びブランク対照ウェルをセットした。細胞を加えた96ウェルプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて一晩培養した。
2)サンプルの希釈及び添加
サンプルを培養培地で所望の濃度に希釈した(表16を参照のこと)。一晩培養した96ウェルプレートの各ウェルに、50μlの希釈したサンプルを3レプリケートウェルとして加えた;陰性対照及びブランク対照をセットした;及びこれらのプレートを37℃、5%COのインキュベーターに置いて72時間培養した。
Figure 2022518924000073
3)発色及びプレート読取り
各ウェルに、CCK-8からの15μl(ウェル内の液体容積の10%)の発色溶液を加えた;プレートを37℃で適切な時間にわたってインキュベートした(OD値を1.0~2.0の範囲に保つようにする);96ウェルプレートのカバーを取り外し、プレートをマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Spectra MAX Plus)で450nmで読み取った。
4)データ処理
データはSoftMax Proを使用して編集し、4パラメータフィッティング曲線をプロットした。
5)実験結果及び分析
4パラメータフィッティング曲線グラフによれば(図4G、ここではC値がIC50に対応する)、CB-50Sは、KB、LNCaP、T-47D、RT4及びNCI-H460腫瘍細胞株の成長及び拡大に阻害効果を及ぼす。細胞におけるコンジュゲート化合物の対応する受容体の発現レベルが異なるため、阻害レベルが異なる。受容体が比較的高発現の細胞株KB、LNcap、T-47D及びRT4のIC50は、受容体が比較的低発現の細胞株NCI-H460と比べて有意に低い。CB-50Sは、腫瘍成長阻害効果と細胞関連受容体の発現レベルとの間の相関を示す。
10.コンジュゲート化合物CB-1020における腫瘍細胞拡大の阻害実験
実験目的:CB-1020及び関連化合物が腫瘍細胞株LNCaP(ヒト前立腺癌細胞)、SK-BR-3(ヒト乳癌細胞)、NCI-H226(ヒト肺癌細胞)、CFPAC-1(膵癌細胞)及びPANC-1(膵癌細胞)に及ぼす阻害効果を試験すること。
関連サンプル:MMAE及びCB-1020
実験操作:LNCaP、SK-BR-3、NCI-H226、CFPAC-1及びPANC-1細胞を予め調製し、カウントした;培養培地(IMDM+10%FBS+1×L-グルタミン+1×P/S)で、細胞LNCaP、SK-BR-3及びCFPAC-1を4×10細胞/mlに希釈し、NCI-H226を2.0×10細胞/mlに希釈し、PANC-1を3.0×10細胞/mlに希釈した;希釈した細胞溶液を96ウェルプレートに100μl/ウェルでプレーティングした;及び各プレートに陰性対照及びブランク対照ウェルをセットした。一晩の接着細胞培養後、希釈した供試サンプルを50μl/ウェルで加えた。プレートを37℃、5%COのインキュベーターに置き、68~72時間培養した。各ウェルに、CCK8からの15μl(ウェル内の液体容積の10%)の発色溶液を加えた;及びプレートを37℃で45~70分間インキュベートし、各プレートをマイクロプレートリーダーで450nmで読み取った。SoftMax Proを使用してデータを編集し、4Pフィッティング曲線をプロットした。データを以下の表に示す:
Figure 2022518924000074
上記の表から、LNCaP及びSK-BR-3の両方がTRPV6及びFOLRH1を発現し、ここでLNCapはこれらの2つの受容体の発現レベルが比較的高いことが分かる。NCI-H226、CFPAC-1及びPANC-1はこれらの2つの受容体の発現レベルが低い又は弱い。CB-1020は、LNCaP、SK-BR-3、NCI-H226、CFPAC-1及びPANC-1腫瘍細胞株の成長及び拡大に阻害効果を及ぼす。2つの受容体が比較的高発現の細胞株LNCaPのCB-1020のIC50比は、受容体が中程度の発現の細胞株SK-BR-3のIC50比よりも高い;SK-BR-3のIC50比は、受容体が比較的低発現のCFPAC-1及び2つの受容体の発現が弱い細胞株NCI-H226及びPANC-1のIC50比よりも高い。細胞増殖に対する阻害効果は、細胞における2つの受容体の発現レベルと正の相関がある。
11.コンジュゲート化合物CB-1320における腫瘍細胞拡大の阻害実験
実験目的:CB-1320及び関連化合物が腫瘍細胞株LNCaP(ヒト前立腺癌細胞)、SK-BR-3(ヒト乳癌細胞)、MDA-MB-468(ヒト乳癌細胞)及びCFPAC-1(膵癌細胞)に及ぼす阻害効果を試験すること。
関連サンプル:MMAE及びCB-1320
実験操作:LNCaP、SK-BR-3、MDA-MB-468及びCFPAC-1細胞を予め調製し、カウントした;培養培地(IMDM+10%FBS+1×L-グルタミン+1×P/S)で、細胞LNCaP、SK-BR-3、MDA-MB-468及びCFPAC-1を4×10細胞/mlに希釈した;希釈した細胞溶液を96ウェルプレートに100μl/ウェルでプレーティングした;及び各プレートに陰性対照及びブランク対照ウェルをセットした。一晩の接着細胞培養後、希釈した供試サンプルを50μl/ウェルで加えた。プレートを37℃、5%COのインキュベーターに置き、68~72時間培養した。各ウェルに、CCK8からの15μl(ウェル内の液体容積の10%)の発色溶液を加えた;及びプレートを37℃で45~70分間インキュベートし、各プレートをマイクロプレートリーダーで450nmで読み取った。SoftMax Proを使用してデータを編集し、4Pフィッティング曲線をプロットした。具体的なデータを以下の表に示す:
Figure 2022518924000075
上記の表から、4つの細胞株のGNRHR発現レベルはほぼ等しく、LNCaPのFOLH1発現レベルは他の細胞株と比べて有意に高いことが分かる。CB-1320は4つの腫瘍細胞株の拡大に阻害効果を及ぼす。受容体FOLH1の発現レベルが異なる細胞に対するCB-1320の阻害効果は異なる。受容体FOLH1が比較的高発現の細胞株LNCapのIC50比は、受容体が比較的低発現の他の細胞株のIC50比よりも有意に高い。
12.コンジュゲート化合物CB-1820における腫瘍細胞拡大の阻害実験
実験目的:CB-1820及び関連化合物が腫瘍細胞株LNCaP(ヒト前立腺癌細胞)、MDA-MB-468(ヒト乳癌細胞)、CFPAC-1(膵癌細胞)及びPANC-1(膵癌細胞)に及ぼす阻害効果を試験すること。
関連サンプル:MMAE及びCB-1820
実験操作:LNCaP、MDA-MB-468、CFPAC-1及びPANC-1細胞を予め調製し、カウントした;培養培地(IMDM+10%FBS+1×L-グルタミン+1×P/S)で、細胞LNCaP、MDA-MB-468及びCFPAC-1を4×10細胞/mlに希釈し、及びPANC-1を3.0×10細胞/mlに希釈した;希釈した細胞溶液を96ウェルプレートに100μl/ウェルでプレーティングした;及び各プレートに陰性対照及びブランク対照ウェルをセットした。一晩の接着細胞培養後、希釈した供試サンプルを50μl/ウェルで加えた。プレートを37℃、5%COのインキュベーターに置き、68~72時間培養した。各ウェルに、CCK8からの15μl(ウェル内の液体容積の10%)の発色溶液を加えた;及びプレートを37℃で45~70分間インキュベートし、各プレートをマイクロプレートリーダーで450nmで読み取った。SoftMax Proを使用してデータを編集し、4Pフィッティング曲線をプロットした。具体的な値を以下の表に示す:
Figure 2022518924000076
上記の表から、LNCap、MDA-MB-468、CFPAC-1及びPANC-1のSSTR2発現レベルがほぼ等しく、LNCaPのFOLH1発現レベルは他の細胞株のFOLH1発現レベルと比べて有意に高いことが分かる。CB-1820は4つの腫瘍細胞株の拡大に阻害効果を及ぼす。受容体FOLH1の発現レベルが異なる細胞に対するCB-1820の阻害効果は異なる。受容体が比較的高発現の細胞株LNCaPのIC50比は、受容体が比較的低発現の他の細胞株のIC50比よりも有意に高く、細胞増殖に対する阻害効果は、細胞関連受容体FOLH1の発現レベルと正の相関がある。
13.コンジュゲート化合物CR19425、CR19426及びCR19428における腫瘍細胞拡大の阻害実験
実験目的:CR19428、CR19425、CR19426及び関連化合物が腫瘍細胞株NCI-H226(ヒト肺癌細胞)、CFPAC-1(ヒト膵癌細胞)及びMDA-MB-468(ヒト乳癌細胞)に及ぼす阻害効果を試験すること。
関連サンプル:SN-38、Dxd0017、CR19428、CR19425及びCR19426
実験操作:NCI-H226、CFPAC-1及びMDA-MB-468細胞を予め調製し、カウントした;96ウェルプレートにMDA-MB-468及びCFPAC-1細胞を2×10細胞/mlの密度でプレーティングし(100μl/ウェル)、及びNCI-H226細胞を1×10細胞/mlの密度でプレーティングした(100μl/ウェル);及び各プレートに陰性対照及びブランク対照ウェルをセットした。一晩の接着細胞培養後、希釈した供試サンプルを50μl/ウェルで加えた。プレートを37℃、5%COのインキュベーターに置き、68~72時間培養した。各ウェルに、CCK8からの15μl(ウェル内の液体容積の10%)の発色溶液を加えた;及びプレートを37℃で45~70分間インキュベートし、各プレートをマイクロプレートリーダーで450nmで読み取った。SoftMax Proを使用してデータを編集し、4Pフィッティング曲線をプロットした。具体的なデータを以下の表に示す:
Figure 2022518924000077
実施例5:CDXモデルにおけるコンジュゲート化合物の薬力学的研究
1.CDXモデルにおけるCB-20BKの薬力学的研究1
1)サンプル調製:
CB-20BK凍結乾燥粉末を秤量し、PBSで溶解してサンプル母液として調製し、この母液を後の使用のため注射用生理食塩水で作業濃度のサンプル溶液となるように希釈した。
2)CDXモデル構築
主な細胞株:KBヒト口腔類表皮癌細胞、MIA paca-2ヒト膵癌細胞、HCC1954ヒト乳癌細胞、CALU-3ヒト肺腺癌細胞及びDU145ヒト前立腺癌細胞
モデル構築:細胞を更生させ、培養し、回収し、カウントし、BALB/cヌードマウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍が成長して80~160mmに拡大したところで群分け及び投与を実施し、又はスケールアップのため迅速拡大した腫瘍塊をマウスに移植及び注射した。
3)群分け、投与及び観察
群分け:腫瘍が平均約80~160mmに成長したところで群分けを実施し、モデル対照群及び種々の用量の投与群をセットした。
投与:マウスには、尾静脈注射によって投与した。
実験観察及び測定:腫瘍接種後、腫瘍成長及び治療が動物の正常行動に及ぼす効果を、具体的には、実験動物の活動、摂食及び飲水状態、体重の増減(体重は週2回測定)、及びその他、眼、毛髪等の異常状態を含め、従来どおりモニタした。
マウスの体重並びに腫瘍塊の長径(a)及び短径(b)を週2回測定した。腫瘍容積(TV)の計算式は、TV=1/2×a×bである。
4)実験結果及び分析
マウスの腫瘍容積の変化によれば(図5A~図5E)、CB-20BKは、マウスにおけるKB、MIA aca-2、HCC1954、CALU-3及びDU145細胞株のCDX腫瘍モデルにおいて良好な阻害効果を有することが分かる。
2.CDXモデルにおけるCB-20BKの薬力学的研究2
実験目的:ヒト化LNCaP、DU145及びNCI-H460細胞株の皮下異種移植モデル(CDX)におけるコンジュゲート化合物CB-20BKの薬力学的研究を実施すること
主なCDXモデル:LNCaP、DU145及びNCI-H460
実験スキーム:
細胞又は腫瘍組織塊を調製し、BALB/cヌードマウスの右前腹部に皮下接種した。腫瘍容積が80~160mmに拡大したところで無作為化群分けを実施し、モデル対照群及び投与群をセットした。マウスには群分けの初日から投与し、ここで投与用量は、最新の体重測定値に基づき調整した。マウスには、尾静脈注射によって10μl/gの投与容積で投与した。群分け及び投与後、腫瘍成長及び治療が動物の正常行動に及ぼす効果を、具体的には、実験動物の活動、摂食及び飲水状態、体重の増減状態、及びその他、眼、毛髪等の異常状態を含め、モニタした。群分け及び投与後、マウスの体重を週2回測定して体重変化率を計算した;同時に、腫瘍の長径及び短径をノギスで測定し、腫瘍容積、相対腫瘍増殖率、腫瘍容積阻害率及び他の指標を計算した。腫瘍容積の式はTV=0.5a×b(式中、aは腫瘍の長径であり、bは腫瘍の短径である)である。
Figure 2022518924000078
上記の表から、試験サンプルCB-20BKは尾静脈からの投与レジメンで程度が異なる腫瘍成長阻害効果を示すことが分かる。ヒト化LNCaP、DU145及びNCI-H460細胞株のCDXモデルについては、試験サンプルは陰性対照群と比較して一定の抗腫瘍成長効果を有する。FOLR1及びFOLH1の二重発現を有するLNCaPモデルでは、試験サンプルは3mg/kgの用量で1日目、8日目及び15日目(D1、D8及びD15)に投与されており、95.68%のTGI値を有して優れた抗腫瘍成長効果を示し、これはFOLR1及びFOLH1が比較的低発現のDU145及びNCI-H460モデルと比べて有意に良好である。腫瘍成長阻害効果は細胞関連受容体の発現レベルと一定の相関がある。
3.HuPrime(登録商標)異種移植PDXモデルにおけるコンジュゲート化合物CB-20BKの腫瘍成長阻害実験1
実験目的:PDXモデルにおけるコンジュゲート化合物CB-20BKの薬力学的研究
主なモデル:LU1206、LU1380及びLU0367
実験スキーム:腫瘍組織塊を調製し、BALB/cヌードマウスの右前腹部に皮下接種した。腫瘍容積が80~160mmに拡大したところで無作為化群分けを実施し、モデル対照群及び投与群をセットした。マウスには群分けの初日から投与し、ここで投与用量は、最新の体重測定値に基づき調整した。マウスには、尾静脈注射によって10μl/gの投与容積及び3mg/kgの投与量で投与した。群分け及び投与後、腫瘍成長及び治療が動物の正常行動に及ぼす効果を、具体的には、実験動物の活動、摂食及び飲水状態、体重の増減状態、及びその他、眼、毛髪等の異常状態を含め、モニタした。群分け及び投与後、マウスの体重を週2回測定して体重変化率を計算した;同時に、腫瘍の長径及び短径をノギスで測定し、腫瘍容積、相対腫瘍増殖率、腫瘍容積阻害率及び他の指標を計算した。腫瘍容積の式はTV=0.5a×b(式中、aは腫瘍の長径であり、bは腫瘍の短径である)である。
Figure 2022518924000079
表22のデータから、試験サンプルCB-20BK(3mg/kg)がLU1206、LU1380及びLU0367ヒト化肺癌PDXモデルに対して一定の抗腫瘍効果を示すことが分かる。FOLR1及びFOLH1の二重発現を有するLU1206モデルのTGI値は90.89%であり、単一発現のLU1380及びLU0367モデルのTGI値は、それぞれ30.02%及び71.34%である。腫瘍成長阻害実験では、腫瘍成長阻害効果は細胞関連受容体の発現レベルと一定の相関がある。
4.HuPrime(登録商標)異種移植PDXモデルにおけるコンジュゲート化合物CB-20BKの腫瘍成長阻害実験2
実験目的:PDXモデルにおけるコンジュゲート化合物CB-20BKの薬力学的研究
主なモデル:BR1283及びBR0438
実験スキーム:腫瘍組織塊を調製し、BALB/cヌードマウスの右前腹部に皮下接種した。腫瘍容積が80~160mmに拡大したところで無作為化群分けを実施し、モデル対照群及び投与群をセットした。マウスには群分けの初日から投与し、ここで投与用量は、最新の体重測定値に基づき調整した。マウスには、尾静脈注射によって10μl/gの投与容積及び3mg/kgの投与量で投与した。群分け及び投与後、腫瘍成長及び治療が動物の正常行動に及ぼす効果を、具体的には、実験動物の活動、摂食及び飲水状態、体重の増減状態、及びその他、眼、毛髪等の異常状態を含め、モニタした。群分け及び投与後、マウスの体重を週2回測定して体重変化率を計算した;同時に、腫瘍の長径及び短径をノギスで測定し、腫瘍容積、相対腫瘍増殖率、腫瘍容積阻害率及び他の指標を計算した。腫瘍容積の式はTV=0.5a×b(式中、aは腫瘍の長径であり、bは腫瘍の短径である)である。
Figure 2022518924000080
上記の表から、FOLR1及びFOLH1の二重発現を有するBR1283及びBR0438モデルにおける3mg/kgの用量の試験サンプルCB-20BKのTGI値が、それぞれ96.49%及び70.74%であり、優れた抗腫瘍成長効果を示すことが分かる。更に、CB-20BKのTGIは、FOLR1及びFOLH1の発現がより高いBR1283において高くなっている。
5.CDXモデルにおけるCB-20Bの薬力学的研究
1)サンプル調製:
CB-20B凍結乾燥粉末を秤量し、PBSで溶解してサンプル母液として調製し、この母液を後の使用のため注射用生理食塩水で作業濃度のサンプル溶液となるように希釈した。
2)CDXモデル構築
主な細胞株:KBヒト口腔類表皮癌細胞、PC-9ヒト肺癌細胞及びDU145ヒト前立腺癌細胞
モデル構築:細胞を更生させ、培養し、回収し、カウントして、BALB/cヌードマウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍が成長して80~160mmに拡大したところで群分け及び投与を実施し、又はスケールアップのため迅速拡大した腫瘍塊をマウスに移植及び注射した。
3)群分け、投与及び観察
群分け:腫瘍が平均約80~160mmに成長したところで群分けを実施し、モデル対照群及び種々の用量の投与群をセットした。
投与:マウスには、尾静脈注射によって投与した。
実験観察及び測定:腫瘍接種後、腫瘍成長及び治療が動物の正常行動に及ぼす効果を、具体的には、実験動物の活動、摂食及び飲水状態、体重の増減(体重は週2回測定)、及びその他、眼、毛髪等の異常状態を含め、従来どおりモニタした。
マウスの体重並びに腫瘍塊の長径(a)及び短径(b)を週2回測定した。腫瘍容積(TV)の計算式は、TV=1/2×a×bである。
4)実験結果及び分析
マウスの腫瘍容積の変化によれば(図6A~図6C)、マウスにおけるKB、PC-9及びDU145細胞株のCDX腫瘍モデルにおいてCB-20Bは良好な阻害効果を有することが分かる。
6.CDXモデルにおけるCB-18Gの薬力学的研究
1)サンプル調製:
CB-18G凍結乾燥粉末を秤量し、PBSで溶解してサンプル母液として調製し、この母液を後の使用のため注射用生理食塩水で作業濃度のサンプル溶液となるように希釈した。
2)CDXモデル構築
主な細胞株:KBヒト口腔類表皮癌細胞、PC-9ヒト肺癌細胞、SPC-A1ヒト肺腺癌細胞、CALU-3ヒト肺腺癌細胞及びDU145ヒト前立腺癌細胞
モデル構築:細胞を更生させ、培養し、回収してカウントし、細胞溶液をBALB/cヌードマウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍が成長して80~160mmに拡大したところで群分け及び投与を実施し、又はスケールアップのため迅速拡大した腫瘍塊をマウスに移植及び注射した。
3)群分け、投与及び観察
群分け:腫瘍が平均約80~160mmに成長したところで群分けを実施し、モデル対照群及び種々の用量の投与群をセットした。
投与:マウスには、尾静脈注射によって投与した。
実験観察及び測定:腫瘍接種後、腫瘍成長及び治療が動物の正常行動に及ぼす効果を、具体的には、実験動物の活動、摂食及び飲水状態、体重の増減(体重は週2回測定)、及びその他、眼、毛髪等の異常状態を含め、従来どおりモニタした。
マウスの体重並びに腫瘍塊の長径(a)及び短径(b)を週2回測定した。腫瘍容積(TV)の計算式は、TV=1/2×a×bである。
4)実験結果及び分析
マウスの腫瘍容積の変化によれば(図7A~図7E)、マウスにおけるKB、PC-9、SPC-A1、CALU-3及びDU145細胞株のCDX腫瘍モデルにおいてCB-18Gは良好な阻害効果を有することが分かる。
7.ヒト化HPAF-II、NCI-H226及びSCLC-21H細胞株の皮下異種移植モデル(CDX)におけるコンジュゲート化合物CB-1020、CB-1320及びCB-1820の腫瘍成長阻害実験
実験目的:CDXモデルにおけるリガンドコンジュゲートCB-1020、CB-1320及びCB-1820の薬力学的研究
主なCDXモデル:HPAF-II(ヒト膵癌細胞)、NCI-H226(ヒト肺癌細胞)及びSCLC-21H(小細胞肺癌細胞)
実験スキーム:
細胞又は腫瘍組織塊を調製し、BALB/cヌードマウスの右前腹部に皮下接種した。腫瘍容積が80~160mmに拡大したところで無作為化群分けを実施し、モデル対照群及び投与群をセットした。マウスには群分けの初日から投与し、ここで投与用量は、最新の体重測定値に基づき調整した。マウスには、尾静脈注射によって10μl/gの投与容積で投与した。群分け及び投与後、腫瘍成長及び治療が動物の正常行動に及ぼす効果を、具体的には、実験動物の活動、摂食及び飲水状態、体重の増減状態、及びその他、眼、毛髪等の異常状態を含め、モニタした。群分け及び投与後、マウスの体重を週2回測定して体重変化率を計算した;同時に、腫瘍の長径及び短径をノギスで測定し、腫瘍容積、相対腫瘍増殖率、腫瘍容積阻害率及び他の指標を計算した。腫瘍容積の式はTV=0.5a×b(式中、aは腫瘍の長径であり、bは腫瘍の短径である)である。
Figure 2022518924000081
CB-1020は、ヒト化HPAF-II細胞株の皮下異種移植モデルにおいて明らかな抗腫瘍成長効果を有する;CB-1320は、NCI-H226及びSCLC-21H細胞株の皮下異種移植モデルにおいて明らかな抗腫瘍成長効果を有する;及びCB-1820は、SCLC-21H細胞株の皮下異種移植モデルにおいて明らかな抗腫瘍成長効果を有する。
8.ヒト化CALU-3、SCLC-21H及びSPC-A1細胞株の皮下異種移植モデル(CDX)におけるコンジュゲート化合物CR19428の腫瘍成長阻害実験
実験スキーム:腫瘍組織塊を調製し、BALB/cヌードマウスの右前腹部に皮下接種した。腫瘍容積が80~160mmに拡大したところで無作為化群分けを実施し、モデル対照群及び投与群をセットした。マウスには群分けの初日から投与し、ここで投与用量は、最新の体重測定値に基づき調整した。マウスには、尾静脈注射によって10μl/gの投与容積で週2回、3週連続で投与した。群分け及び投与後、腫瘍成長及び治療が動物の正常行動に及ぼす効果を、具体的には、実験動物の活動、摂食及び飲水状態、体重の増減状態、及びその他、眼、毛髪等の異常状態を含め、モニタした。群分け及び投与後、マウスの体重を週2回測定して体重変化率を計算した;同時に、腫瘍の長径及び短径をノギスで測定し、腫瘍容積、相対腫瘍増殖率、腫瘍容積阻害率及び他の指標を計算した。腫瘍容積の式はTV=0.5a×b(式中、aは腫瘍の長径であり、bは腫瘍の短径である)である。
Figure 2022518924000082
CR-19428は、リガンドFOLR1及びFOLH1とペイロードDxdとの薬物コンジュゲートである。上記の表から、この薬物コンジュゲートがヒト化CALU-3、SCLC-21H及びSPC-A1細胞株の皮下異種移植モデルにおいて明らかな抗腫瘍成長効果を有することが分かる。
9.肺癌LU2505モデル(PDXモデル)におけるコンジュゲート化合物CBP-1018の有効性に関する試験
この実験には、急速に成長する腫瘍モデルである第3世代の肺癌PDXモデルLU2505(アジア人女性患者由来)を使用した。BALB/cヌードマウスが皮下に腫瘍を担持し、腫瘍容積が約150mmに達したところで、低用量、中用量及び高用量試験サンプル群、小分子MMAE対照群、ターゲティングポリペプチド20BK-SM09対照群、及びブランク対照群(合計6群、及び各群8匹のマウス)に群分けした;群分け後1日目、8日目及び15日目にマウスに投与した;及び観察は最終回の投与後14日間継続した。試験サンプルCBP-1018の活性物質はCB-20BKであり、これは、CB-20BKを補助材料と混合し、次にそれを凍結乾燥することによって得られる。
Figure 2022518924000083
表26及び図8Aに示されるとおり:
いずれの群の動物も異常な臨床症状を示さず、投与後の死亡もない;及び各群の動物の体重はゆっくりと増加する。
ブランク対照群、20BK-SM09群、及び低用量CBP-1018群の動物は、22日目、22日目、及び26日目(D26)に平均腫瘍容積が2000mmを超えたため安楽死させた。従って、表26の体重、腫瘍容積、及び腫瘍成長阻害率のデータは、D22に得られたデータである。
注射用CBP-1018の有効性には明らかな用量相関があり、注射用CBP-1018は低用量群では無効で、中用量群及び高用量群では有効であった。高用量群の腫瘍は19日目(D19)に完治し、29日目(D29)にも腫瘍成長の徴候は見られなかった。
ポリペプチド20BK-SM09群は明らかな腫瘍成長阻害効果を示さなかったことから、単一のターゲティングポリペプチドは明白な抗腫瘍効果を生じるには十分でないことが示唆される。
MMAE群は明白な腫瘍成長阻害効果を示した。0.375mg/kgのMMAE及び1.5mg/kgのCBP-1018に等モルMMAEが含まれる。比較から、1.5mg/kgのCBP-1018の腫瘍成長阻害効果がMMAE群と比べて有意に良好であることが分かり、リガンドターゲティングの利点が示唆される(腫瘍成長阻害率:82.60%対48.97%)。
10.肺癌LU1206モデル(PDXモデル)におけるコンジュゲート化合物CBP-1018の有効性に関する試験
この実験には、急速に成長する腫瘍モデルである第5世代の肺癌PDXモデルLU1206(アジア人女性患者由来)を使用した。BALB/cヌードマウスが皮下に腫瘍を担持し、腫瘍容積が約150mmに達したところで、低用量、中用量及び高用量試験サンプル群、小分子MMAE対照群、ターゲティングポリペプチド20BK-SM09対照群、及びブランク対照群(合計6群、及び各群8匹のマウス)に群分けした;群分け後1日目、8日目及び15日目にマウスに投与した;及び観察は最終回の投与後14日間継続した。
Figure 2022518924000084
表27及び図8Bに示されるとおり:
いずれの群の動物も異常な臨床症状を示さず、投与後の死亡もなく、動物は全て29日目に安楽死させた。各群の動物の体重は基本的には変化しないままであったとともに、投与初日と比べてやや増えている。
注射用CBP-1018の有効性には明らかな用量相関があり、注射用CBP-1018は低用量群では無効で(8.08%の腫瘍成長阻害率)、中用量群及び高用量群では有効であり、それぞれ75.21%及び97.42%の腫瘍成長阻害率であった。低用量群と中用量群との間の有効性の違いは比較的大きい。
ポリペプチド20BK-SM09群は明らかな腫瘍成長阻害効果を示さなかったことから、単一のターゲティングポリペプチドは、このモデルで明白な抗腫瘍効果を生じるには十分でないことが示唆される。
MMAE群は明白な腫瘍成長阻害効果を示した。0.375mg/kgのMMAE及び1.5mg/kgのCBP-1018に等モルのMMAEが含まれる。比較から、1.5mg/kgのCBP-1018の腫瘍成長阻害効果がMMAE群と比べて有意に良好であることが分かり、リガンドターゲティングの利点が示唆される(腫瘍容積阻害率:75.21%対36.03%;腫瘍重量阻害率:78.38%対54.53%)。
11.腫瘍担持マウス(PDXモデルLU2505)の組織分布
HuPrime(登録商標)肺癌LU2505モデルの腫瘍塊を接種した12匹の雌腫瘍担持マウス及び12匹の健常雄BALB/cヌードマウスに1.5mg/140μCi/kgの[H]CBP-1018(MMAEに同位体標識)を単回尾静脈注射によって与えた。それぞれ0.5時間、2時間、6時間及び24時間の時点で3匹の雄マウス及び3匹の雌マウスを誘導箱に入れ、適量の二酸化炭素を吸入させることにより麻酔した;及び血液を心穿刺により採取し、次に直ちに安楽死を行いサンプルを採取した。
Figure 2022518924000085
上記の表から、雄と雌との間で動物組織分布に差が示されないことが分かる;投与後、薬物は主に腎臓、全血(主に血漿に分布する)、肝臓及び肺に分布する;全ての組織において、0.5時間で最も高い濃度が見られ、次に薬物は急速に排出され、ここで最も遅い排出は肝臓及び腫瘍に見られる;及び腫瘍のこの遅い排出は、有効性の点でのCBP-1018の利点を説明するものであり得る。
12.ラットにおける排泄実験
半分が雄で半分が雌の6匹の正常SDラットに、単回尾静脈注射によって0.75mg/70μCi/kgの[H]CBP-1018を与えた。指示される時間間隔で、尿、糞便、ケージフラッシュ/洗浄液及び完全体ラットの死体などのサンプルを投与前及び投与後0~168時間に採取し、BDCラットの胆汁、尿、糞便及びケージフラッシュ/洗浄液などのサンプルを投与前及び投与後0~72時間に採取した。上述のサンプルは低温の冷蔵庫(-10℃~-30℃)に凍結保存した。
各サンプルに、適量のシンチレーション液を加え、均一に混合し、次に液体シンチレーションカウンターを用いて放射能量を測定した。胆汁、尿、糞便、ケージフラッシュ/洗浄液及び死体などのサンプルで測定された放射能量を用いて投与用量に対する割合を計算した。血漿サンプル中の放射能量を用いてサンプル1グラム当たりの全放射能を計算した。WinNonLinソフトウェア(バージョン7.0、Pharsight)を使用してノンコンパートメントモデルに従い全血漿放射能の主な薬物動態パラメータを計算した。
Figure 2022518924000086
上記の表から、CBP-1018は主に尿中に排泄され、これが全投与用量の約57%を占め、糞便中に排泄された量は25%未満を占めることが分かる。腎臓を経て主に尿中に排泄されるという結果は、ヌードマウスの組織分布で腎臓に大きく分布するという知見と整合する。
13.血漿安定性
1μg/mL、10μg/mL及び100μg/mLの濃度のCBP-1008(その活性物質は、国際公開第2017025047 A1号パンフレットに記載されるLDC10Bであり、CBP-1008は、LDC10Bを補助材料と混合し、それを凍結乾燥することにより得られる;国際公開第2017025047A1号パンフレットは全体として参照により援用される)及びCBP-1018を種々の種の血漿と共に37℃で2時間インキュベートして、これらの2つの化合物の安定性を観察した。結果は(表30にある)、CBP-1018が様々な種の血漿中で安定しており、2時間インキュベートした後のその残留率が0時間における濃度の90%を上回ることを示している。しかしながら、CBP-1008はラットの血漿中においてのみ安定しており(87.92%~91.82%残留率)、他の種の血漿中では不安定で、0.751%~24.52%の残留率に過ぎない。
これらの実験結果は、CBP-1018の血漿安定性がCBP-1008よりも良好であることを示唆している。
Figure 2022518924000087
14.PKにおける半減期
血漿安定性の比較と一致して、CBP-1018の薬物動態学的半減期(約1時間)はラット及びカニクイザルにおいてCBP-1008(約20分)よりも有意に長く、CBP-1018の安定性がCBP-1008より高いことが示唆される。
Figure 2022518924000088

Claims (46)

  1. ペイロードと2つのターゲティング分子とを含み、前記2つのターゲティング分子が、それぞれ、相乗作用分子部分及び前立腺特異的膜抗原リガンド部分である、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  2. 前記前立腺特異的膜抗原リガンドが、以下の構造:
    Figure 2022518924000089

    を有する、請求項1に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  3. 前記前立腺特異的膜抗原リガンドが、以下の構造:
    Figure 2022518924000090

    を有する、請求項1に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  4. 前記前立腺特異的膜抗原リガンドが、以下の構造:
    Figure 2022518924000091

    を有する、請求項1に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  5. 前記前立腺特異的膜抗原リガンドが、以下の構造:
    Figure 2022518924000092

    を有する、請求項1に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  6. ペイロードと2つのターゲティング分子とを含み、前記2つのターゲティング分子が、それぞれ、相乗作用分子部分及び式(I)によって表されるリガンド部分:
    Figure 2022518924000093

    である、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  7. ペイロードと2つのターゲティング分子とを含み、前記2つのターゲティング分子が、それぞれ、相乗作用分子部分及びP10であり、前記ペイロードがカンプトテシン又はその任意の誘導体である、コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  8. 前記2つのターゲティング分子が異なる、請求項1~7のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  9. 前記相乗作用分子が細胞相互作用分子である、請求項1~8のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  10. 前記2つのターゲティング分子が、異なる細胞分子と相互作用する細胞相互作用分子である、請求項1~9のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  11. 前記相乗作用分子が、エンドサイトーシスの媒介能を有するエンドサイトーシス分子である、請求項1~10のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  12. 前記相乗作用分子が、FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)、GNRHR、Her2、Trop2、Her3、NECTIN4、LRP1、GLUT1、EGFR1、AXL、CA9、CD44、クローディン18.2、APN、DLL3、CEACAM5、FZD10、TFRC、MET、IGFR1、SSTR2、CCKBR、LFA1、ICAM、GPR87、GM-CSF、GM-CSFR、TIM3、TLRファミリー、CD40、CD40L、OX40、OX40L、GITRL、GITR、4-BBL、4-1BB、CD70、CD27、ICOSL、ICOS、HHLA2、CD28、CD86/80、CD28、MHCII抗原、TCR、CTLA-4、CD155、CD122、CD113、IGIT、PD-L1、PD1、ガレクチン-9、TIM-3、HVEM、BTLA、CD160、VISTA、B7-H4、B7-H3、ホスファチジルセリン、HHLA2、LAG3、ガレクチン-3、LILRB4、シグレック15、NKG2A、NKG2D、SLAMF7、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、FGFR1、FGFR2、FGFR4、NeuGcGM3及びCXCR4からなる群から選択される分子に結合する、請求項1~11のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  13. 前記相乗作用分子が、FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)、SSTR2及びGNRHRからなる群から選択される分子に結合する、請求項1~12のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  14. 前記相乗作用分子が、FOLR1、TRPV6、SSTR2及びGNRHRからなる群から選択される分子に結合する、請求項1に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  15. 前記相乗作用分子が、FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)及びGNRHRからなる群から選択される分子に結合する、請求項6に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  16. 前記相乗作用分子が葉酸塩又はその類似体である、請求項1~15のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  17. 前記葉酸塩の類似体が、5-メチルテトラヒドロ葉酸、5-ホルミルテトラヒドロ葉酸、メトトレキサート、及び5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸からなる群から選択される、請求項16に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  18. 1、2、3、4個又はそれ以上のペイロードを含む、請求項1又は6に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  19. 前記ペイロードが、小分子化合物、ヌクレオチド、ペプチド、及びタンパク質からなる群から選択される、請求項1又は6に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  20. 前記ペイロードが小分子化合物である、請求項19に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  21. 前記小分子化合物が、カンプトテシン及びその任意の誘導体、アウリスタチン及びその任意の誘導体、メイタンシン及びその任意の誘導体、放射性核種錯体、シクロオキシゲナーゼ-2阻害薬、パクリタキセル及びその任意の誘導体、エポチロン及びその任意の誘導体、ブレオマイシン及びその任意の誘導体、ダクチノマイシン及びその任意の誘導体、プリカマイシン及びその任意の誘導体、及びマイトマイシンCからなる群から選択される、請求項20に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  22. 前記小分子化合物が、カンプトテシン又はその任意の誘導体、アウリスタチン又はその任意の誘導体、放射性核種錯体又はシクロオキシゲナーゼ-2阻害薬である、請求項21に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  23. 前記ペイロードが前記ターゲティング分子のうちの少なくとも1つにリンカーを介して連結される、請求項1~22のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  24. 前記リンカーが、ペプチドリンカー、ジスルフィドリンカー、pH依存性リンカー又は上述のリンカーの組み合わせである、請求項23に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  25. 前記ペプチドリンカーが、ある種の生理環境下でプロテアーゼ切断又は還元によって切断可能である、請求項24に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  26. 前記ペプチドリンカーが、システイン、リジン、リジン-リジン、バリン-シトルリン、フェニルアラニン-リジン、バリン-リジン、システイン-リジン、システイン-グルタミン酸、アスパラギン酸-アスパラギン酸、及びアスパラギン酸-アスパラギン酸-リジンからなる群から選択され、任意選択で、上述のアミノ酸中のカルボン酸がアミド化されている、請求項24又は25に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  27. 前記ジスルフィドリンカーが、DMDS、MDS、DSDM及びNDMDSからなる群から選択される、請求項24に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  28. 前記pH依存性リンカーがシスアコニット酸無水物である、請求項24に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  29. 前記リンカーが、以下の構造:
    Figure 2022518924000094

    Figure 2022518924000095

    Figure 2022518924000096

    Figure 2022518924000097

    を有するか、
    又は前記リンカーが上述の構造の組み合わせ及びペプチドリンカーである、請求項23に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  30. 前記2つのターゲティング分子が互いにスペーサーを介して連結される、請求項1~29のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  31. 前記スペーサーが、配列番号1~14、Arg-Arg、Ala-Ser-Asn、Ala-Ala-Ala、Ser-Ser-Arg、Pro-Arg及びPro-Leu-Glyからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項30に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  32. 前記コンジュゲート化合物が、以下の化合物:
    Figure 2022518924000098

    Figure 2022518924000099

    Figure 2022518924000100

    Figure 2022518924000101

    Figure 2022518924000102

    Figure 2022518924000103

    Figure 2022518924000104

    Figure 2022518924000105

    Figure 2022518924000106

    Figure 2022518924000107

    (式中、Mは放射性核種である)からなる群から選択される、請求項1に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  33. 前記コンジュゲート化合物が、
    Figure 2022518924000108

    Figure 2022518924000109

    Figure 2022518924000110

    である、請求項6に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  34. 前記コンジュゲート化合物が、
    Figure 2022518924000111

    Figure 2022518924000112

    Figure 2022518924000113

    である、請求項7に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
  35. 請求項1~34のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  36. 前記組成物が、静脈内に、皮下に、経口的に、筋肉内に又は脳室内に投与される、請求項35に記載の医薬組成物。
  37. ペイロードをそれを必要としている対象に送達する方法であって、治療有効量の請求項1~34のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は請求項35又は36に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
  38. 対象の疾患を治療する方法であって、治療有効量の請求項1~34のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は請求項35又は36に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
  39. 前記疾患が、癌、免疫疾患、心血管疾患、代謝疾患、及び神経学的疾患からなる群から選択される、請求項38に記載の方法。
  40. 前記癌が、前立腺癌、乳癌、肺癌、腎癌、白血病、卵巣癌、胃癌、子宮癌、子宮内膜癌、肝癌、結腸癌、甲状腺癌、膵癌、結腸直腸癌、食道癌、精巣癌、皮膚癌、リンパ腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
  41. 前記免疫疾患が自己免疫疾患である、請求項39に記載の方法。
  42. 前記自己免疫疾患が、結合組織病、全身性硬化症、関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデスからなる群から選択される、請求項41に記載の方法。
  43. 前記心血管疾患が、アンギナ、心筋梗塞、脳卒中、心臓発作、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、不整脈、及び先天性心疾患からなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
  44. 前記代謝疾患が、糖尿病、痛風、肥満、低血糖症、高血糖症、及び脂質異常症からなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
  45. 前記神経学的疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、頭部傷害、多発性硬化症、眩暈、昏睡、及び癲癇からなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
  46. 前記コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩、又は前記医薬組成物と組み合わせて1つ以上の療法剤を投与することを更に含む、請求項38~45のいずれか一項に記載の方法。
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