TW202404643A - 化合物及用途 - Google Patents

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魏志剛
錢剛
蔣閃軍
保華 黃
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Abstract

一種能夠靶向結合細胞並降解異常或不需要的蛋白的偶聯體化合物及其用途，和可用於製備偶聯體化合物的連接子化合物。

Description

化合物及用途
本申請案關於生物醫藥化學領域。更具體地，本申請案關於一種能夠靶向結合細胞並降解靶蛋白的偶聯體化合物及其用途，和可用於製備偶聯體化合物的連接子化合物。
蛋白質水解靶向嵌合體（「PROTAC」，Proteolysis Targeting Chimeras）於2001年由Raymond Deshaies和Craig Crews提出並驗證，是利用泛素-蛋白酶體系統對標靶蛋白（「POI」，Protein of Interest）進行降解的一種新成藥技術。它是誘導蛋白降解技術的一種改進的、通用的平臺技術，這個技術平臺形成的嵌合體雙功能小分子，一端是結合靶蛋白的靶蛋白配體，另一端是結合E3連接酶的E3連接酶配體，兩個配體透過一段連接部分連接。在進入細胞後，嵌合體可以將靶蛋白和E3連接酶拉近並形成靶蛋白-PROTAC-E3連接酶三元複合物，與此同時，泛素基於泛素結合酶E2與E3連接酶靠近，並進一步依賴E3連接酶而貼到靶蛋白上（靶蛋白的泛素化）。貼上泛素的靶蛋白將被蛋白酶體識別並降解，從而靶蛋白的量被選擇性地降低。前述過程中，PROTAC中的靶蛋白配體無需長時間佔據結合位點，只需三元複合物短暫的形成便可瞬時完成靶蛋白的泛素化，並且PROTAC在細胞內可多次循環發揮作用。理論上催化量的PROTAC藥物就可以將任何過表現和突變的致病蛋白清除，從而治療疾病。
PROTAC技術具有很多優勢，包括1）PROTAC可克服腫瘤藥物抗藥性：化療、激酶抑制劑、免疫療法等癌症治療方法展現的抗藥性阻礙了臨床應用，增加了藥物開發的難度，而較低劑量的PROTAC就能降解整個標靶蛋白，並刪除靶蛋白的全部功能，因此PROTAC技術有望解決當前面臨的抗藥性問題；2）PROTAC有望降解不可成藥的靶點：目前只有20～25%的蛋白質靶點正在進行藥物發現的研究，大多數小分子藥物或大分子抗體需要結合酶或受體的活性位點來發揮作用，然而，人類細胞中80%的蛋白缺乏這樣的位點，對於PROTAC，其不需要這樣的位點而只需要提供結合活性，觸發標靶蛋白與E3酶靠近，從而介導靶蛋白的泛素化並引發靶蛋白降解。
2013年，Arvinas在2019年將第一款PROTAC藥物（ARV-110）推進至臨床研究階段。全球各藥企爭相利用PROTAC技術，開發靶向蛋白降解類藥物。截止到2021年底，已經有16款PROTAC藥物已經處於或即將進入臨床研究階段。然而，PROTAC也有侷限性。例如PROTAC成藥性差，PROTAC分子量一般在700～1200之間，這種相對大的尺寸通常會使得它們的透膜能力、物理化學性質（例如，低水溶性）和藥物動力學較差，這可能會使它們的體內應用複雜化。此外，PROTAC的靶向性差，儘管PROTAC對多種靶點的高效性已被證實，但迄今為止報導的大多數降解物顯示了其有限的組織選擇性，並且對不同類型的細胞選擇性較差。
本發明結合了配體藥物偶聯物和PROTAC技術的優勢，透過將PROTAC偶聯到具有靶向作用的配體上，在利用PROTAC藥物自身克服腫瘤藥物抗藥性、靶向傳統難以成藥的靶點以及毒性小的同時，提高了PROTAC的靶向性和成藥性。
本申請案的一個方面提供了一種偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽包含至少兩個特異性結合細胞表面蛋白的配體的靶向分子和與所述靶向分子連接的有效載荷，其中所述有效載荷為蛋白降解靶向嵌合體。
在一些實施方式中，靶向分子結合以下細胞表面蛋白：FOLR1、TRPV6、PSMA、LHRH、EGFR、Her2、Trop2、Her3、Claudin18.2、c-Met或其任意組合。在一些實施方式中，靶向分子結合以下細胞表面蛋白：FOLR1、TRPV6、PSMA、c-Met或其任意組合。
在一些實施方式中，靶向分子結合以下細胞表面蛋白組合：FOLR1和TRPV6；FOLR1和PSMA；TRPV6和PSMA；TRPV6和c-Met；FOLR1和c-Met；PSMA和c-Met；FOLR1、TRPV6和PSMA；FOLR1、TRPV6和c-Met；FOLR1、PSMA和c-Met；TRPV6、PSMA和c-Met；或FOLR1、PSMA、TRPV6和c-Met。在一些實施方式中，靶向分子包含兩種配體且分別結合FOLR1和TRPV6、FOLR1和PSMA、TRPV6和PSMA、FOLR1和c-Met、PSMA和c-Met或TRPV6和c-Met。
在一些實施方式中，結合FOLR1的配體包括葉酸或其類似物和蝶酸，較佳地，所述葉酸類似物選自5-甲基四氫葉酸、5-甲醯基四氫葉酸、10-甲醯四氫葉酸、甲胺蝶呤、5,10-甲醯四氫葉酸、5,10-亞甲基四氫葉酸、胺基碟呤和雷替曲塞。
在一些實施方式中，結合TRPV6的配體包括由SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列、由SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列、或與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，結合PSMA的配體包括多肽、抗體或小分子。在一些實施方式中，結合PSMA的配體選自以下結構： 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方式中，結合c-MET的配體包括由SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列：Cys a-X1-Cys c-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cys d-Trp-Cys b-Tyr-X4-X5-X6；其中X1為Asn、His或Tyr；X2為Gly、Ser、Thr或Asn；X3為Thr或Arg；X4為Ala、Asp、Glu、Gly或Ser；X5為Ser或Thr；X6為Asp或Glu；Cys a-d各自為半胱胺酸殘基；較佳地，殘基Cys a與Cys b以及Cys c與Cys d分別環化形成兩個獨立的二硫鍵。在一些實施方式中，c-MET配體的末端離胺酸的羧基可以被醯胺化。在一些實施方式中，c-MET配體的N末端可以被乙醯化。在一些實施方式中，結合c-MET的配體包括由SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列Ala-Gly-Ser-Cys a-Tyr-Cys c-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys d-Trp-Cys b-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys，其中Cys a-d各自為半胱胺酸殘基，較佳地，殘基Cys a與Cys b以及Cys c與Cys d分別環化形成兩個獨立的二硫鍵，較佳地，末端Ala的胺基被乙醯化。在一些實施方式中，結合c-MET的配體包括與SEQ ID NO: 4具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，並且其中Cys a-d各自為半胱胺酸殘基，較佳地，殘基Cys a與Cys b以及Cys c與Cys d分別環化形成兩個獨立的二硫鍵。
在一些實施方式中，靶向分子中的配體直接連接或者透過間隔區相互連接，較佳的，所述連接透過脫水縮合的方式進行。在一些實施方式中，所述間隔區包含選自下組的胺基酸或胺基酸組合：Lys、Cys、Lys-Cys、Cys-Cys、Lys-Cys-Lys、Arg-Arg、Ala-Ser-Asn、Ala-Ala-Ala、Ser-Ser-Arg、Pro-Arg、Asp-Asp-Lys-Cys、和Pro-Leu-Gly，任選的，所述胺基酸可以被醯胺化。在一些實施方式中，Lys被醯胺化，例如醯胺化成為2,6-二胺基己醯胺。在一些實施方式中，間隔區包含一個或多個相同或不同的選自下組的化合物透過脫水縮合形成： 、 、 和 ，其中n為0或1。
在一些實施例中，具有以下結構部分的靶向分子與有效載荷進行連接以形成偶聯體化合物， 、 、 或 ； 其中，Q為活性基團。在一些實施方式中，上述靶向分子透過活性基團Q與有效載荷進行連接，較佳地，所述活性基團Q為炔基或巰基。
在一些實施方式中，具有以下結構的靶向分子與有效載荷進行連接以形成偶聯體化合物： 、 、 、 或 。
在一些實施方式中，具有式（I）所示結構的蛋白降解靶向嵌合體與靶向分子進行連接以形成偶聯體化合物： (T P) n-L-T E3(I)， 其中， 所述T P為結合靶蛋白的靶蛋白配體部分，其中n為1、2或3； 所述L為連接T P和T E3的連接部分； 所述T E3為結合E3連接酶的E3連接酶配體部分。
在一些實施方式中，所述E3連接酶配體結合VHL（von Hippel-Lindau）蛋白、CRBN（cereblon）蛋白、MDM2蛋白或XIAP蛋白；較佳地，所述E3連接酶配體為VHL配體或CRBN配體。
在一些實施方式中，VHL配體為VHL-L或其類似物，其中VHL-L具有選自下組的結構： ，其中R是氫或甲基；和 。
在一些實施方式中，所述CRBN配體為來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺或其類似物。
在一些實施方式中，蛋白降解靶向嵌合體具有選自以下組的結構： (II)， (III)， (IV) 或 (V)， 其中， Ra、Rb和Rc各自獨立地為氫、烷基、NH 2、OH、或鹵素，較佳地，所述烷基為甲烷基，所述鹵素為氟； Rd為CH 2、C=O或C=S； p為0或1； 所述靶蛋白配體能結合特定的靶蛋白； 所述靶蛋白配體透過所述連接部分連接至E3連接酶基團。
在一些實施方式中，靶蛋白為核受體（例如，AR和ER）、激酶類蛋白（例如，RIPK2、BCR-ABL、EGFR、HER2、c-Met、TBK1、CDK2/4/6/9、ALK、Akt、CK2、ERK1/2、FLT3、PI3K、BTK和FAK）AKT、PAN-BET蛋白、BET蛋白（例如，BRD2、BRD3、BRD4和BRD6）、BLK、BRAF1、BCL-xl、ERRα、FKBP12、FRS2α、JAK1、JAK3、IKZF1、IRAK4、MDM2、MetAP2、PLK1、PSK-J3、RAS、TACC3、Tau、TrkB、MDM2或其任意組合物。在一些實施方式中，所述靶蛋白為AR蛋白、ER蛋白、RAS蛋白、BRD4蛋白、PLK1蛋白、FAK蛋白、MDM2蛋白或其任意組合物。
在一些實施方式中，所述靶蛋白配體部分具有選自以下的結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方式中，蛋白降解靶向嵌合體中的連接部分具有選自下組的結構： (L1)， (L2)，或 (L3) 其中， p 1為0～4的整數； p 2為0～6的整數； p 3、p 4、p 5和p 6各自獨立地為0或1； G 1為4～14元直鏈亞烷基，任選地，所述4～14元直鏈亞烷基中的2～5個碳原子可以被-O-、-NH-、-N(C 1-6烷基)-或-C≡C-取代； G 2為胺基酸殘基，其中較佳地，所述G2為Lys殘基； G 3選自下組： 、 、 和 ； G 4為5～9元直鏈亞烷基，任選地，所述5～9元直鏈亞烷基中的2～4個碳原子可以被-O-、-NH-、-N(C 1-6烷基)-或-C≡C-取代。
一些實施方式中，蛋白降解靶向嵌合體中的連接部分具有選自下組的結構 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方式中，蛋白降解靶向嵌合體具有如下所示的結構：
CR202CC
CR202CF
CR202CI
CR202CL
CR202CP
CR20274
CR202EE
CR202Z5
CR202ES
CR202Z7
CR202Z8
CR202Z9
CR202Z1
CR202Z2
CR202Z3
CR202Z4
CR202Y2
CR202Y4
在一些實施方式中，所述有效載荷與所述靶向分子直接連接、或所述有效載荷透過連接子與所述靶向分子連接。在一些實施方式中，所述有效載荷與所述靶向分子之間、所述有效載荷與所述連接子之間、或所述連接子與所述靶向分子之間的連接是透過化學反應完成的。在一些較佳的實施方式中，所述靶向分子與所述連接子之間的連接是透過鍵擊反應（click反應）完成的。
在一些實施方式中，所述連接子包含連接模組1和連接模組2。
在一些實施方式中，所述連接子包含連接模組2。
在一些實施方式中，所述連接子包含連接模組1和與連接模組1結合的如下基團：PEG鏈、 、 、 、 、C 1-C 8烷基鏈、-NH-、-O-、-C(O)-或其任意組合。在一些較佳的實施方式中，PEG鏈為PEG1（ ）、PEG2（ ）或PEG3（ ）。在一些較佳的實施方式中，所述連接子包含連接模組1和與連接模組1結合的如下基團： 。本技術領域中具有通常知識者可以理解，這些基團可以透過左側連接點與連接模組1中的連接部分鍵合並且透過右側連接點與有效載荷鍵合，或者透過右側連接點與連接模組1中的連接部分鍵合並且透過左側連接點與有效載荷鍵合。
在一些實施方式中，連接模組1與連接模組2透過鍵或者化學基團相連。在一些實施方式中，所述化學基團為PEG鏈、 、 、 、C 1-C 8烷基鏈、-NH-、-O-、-C(O)-、 、 或其任意組合。在一些較佳的實施方式中，PEG鏈為PEG1、PEG2或PEG3。在一些較佳實施方式中，所述化學基團為 、 、 、 、 、、 或 。本技術領域中具有通常知識者可以理解，這些化學基團可以透過左側連接點與連接模組1鍵合以及透過右側連接點與連接模組2鍵合，或者透過右側連接點與連接模組1鍵合以及透過左側連接點與連接模組2鍵合。
在一些實施方式中，所述連接模組1包括馬來醯亞胺基己醯基（ ）、馬來醯亞胺基（ ）或疊氮基團（ ）。
在一些實施方式中，所述連接模組2包括組織蛋白酶酶切基團、纖溶酶酶切基團、天門冬醯胺內切酶酶切基團、β-葡萄糖苷酸酶酶切基團、硫酸酯酶酶切基團、磷酸酯酶酶切基團、β-半乳糖苷酶酶切基團、穀胱甘肽酶酶切基團或酸不穩定基團。
在一些實施方式中，所述組織蛋白酶酶切基團為CB酶酶切基團。
在一些較佳的實施方式中，所述組織蛋白酶酶切基團包括胺基酸或胺基酸與自分解片段的組合。在一些較佳的實施方式中，所述胺基酸為Val-Cit、Gly-Gly-Phe-Gly、CycloBut-Cit、Phe-Cit、Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ala-Cit、Val-Cit-Pro或Val-Cit-Pro-Gly。
在一些較佳的實施方式中，所述纖溶酶酶切基團包括胺基酸或胺基酸與自分解片段的組合。在一些較佳的實施方式中，所述胺基酸為Val-Leu-Lys。
在一些較佳的實施方式中，所述天門冬醯胺內切酶基團包括胺基酸或胺基酸與自分解片段的組合。在一些較佳的實施方式中，所述胺基酸選自Gly-Asn-Asn或Ala-Ala-Asn。
在一些較佳的實施方式中，所述自分解片段為PAB及其衍生物、 或 。在一些較佳的實施方式中，所述PAB為 。在一些較佳的實施方式中，所述PAB衍生物為 、 、 或 。
在一些較佳的實施方式中，所述β-葡萄糖醛酸酶酶切基團為 或 。在一些較佳的實施方式中，所述硫酸酯酶酶切基團為 或 。在一些較佳的實施方式中，所述磷酸酯酶酶切基團為 或 。在一些較佳的實施方式中，所述β-半乳糖苷酶酶切基團為 或 。在一些較佳的實施方式中，所述穀胱甘肽酶酶切基團為 。在一些較佳的實施方式中，所述酸不穩定基團為 。
本技術領域中具有通常知識者可以理解，上述酶切基團的活性位點可任選地在合適的反應後與連接模組1連接、與化學基團連接、與靶向分子連接或與有效載荷連接。例如，在所述β-葡萄糖醛酸酶酶切基團在與連接模組1、化學基團、靶向分子或有效載荷進行有效連接後具有以下結構 或 ；所述硫酸酯酶酶切基團在與連接模組1、化學基團、靶向分子或有效載荷進行有效連接後具有以下結構 或 ；所述磷酸酯酶酶切基團在與連接模組1、化學基團、靶向分子或有效載荷進行有效連接後具有以下結構 ；所述β-半乳糖苷酶酶切基團在與連接模組1、化學基團、靶向分子或有效載荷進行有效連接後具有以下結構 或 ；所述穀胱甘肽酶酶切基團在與連接模組1、化學基團、靶向分子或有效載荷進行有效連接後具有以下結構 ；所述酸不穩定基團在與連接模組1、化學基團、靶向分子或有效載荷進行有效連接後具有以下結構 。
在一些較佳的實施方式中，當所述連接子包括連接模組2時，所述連接模組2是穀胱甘肽酶酶切基團。在一些較佳的實施方式中，所述穀胱甘肽酶酶切基團為 。
在一些實施方式中，偶聯體化合物具有以下結構： W 1-L 1-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L 2-W 2， 其中， L 1 為 、 、-S-S-或鍵； EG為-CH 2CH 2O-或-OCH 2CH 2-；n 1是0～6的整數； n 2是0～8的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； B每次出現時獨立地為-C(=O)-、 、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-CH(CH 3)-CH 2-O-、-CH 2CH 2O-、-NH-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～5的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L 2 為 、 、 、 、-NH-CH 2-O-或鍵； 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-、氧或 ； R 2為鍵、-OH-CH 2-或-NH-CH 2CH 2-NH-C(=O)-； R 3為氫或 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基、 、 、 或 ； R 4為氫或C 1-8烷基； R 5為氫、胺基、硝基、磷酸基、-OR a或 ；其中，R a為甲烷基、乙烷基、丙烷基或異丙烷基； W 1 為可以結合細胞表面蛋白的靶向分子，並且 W 2 為有效載荷。
在一些實施方式中，EG為-CH 2CH 2O-。在一些實施方式中，n 1是2。在一些實施方式中，n 1是0。在一些實施方式中，n 2是1。在一些實施方式中，n 2是4。在一些實施方式中，n 2是5。在一些實施方式中，n 5是0。在一些實施方式中，n 6是1。在一些實施方式中，n 6是3。在一些實施方式中，n 1是2、n 2是1、n 3和n 4是0並且L 2是鍵。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu、Leu、Lys、Ala、Gly、Phe、Gln、Pro或Asn形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-、       -Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Cit-、-Val-Leu-Lys-、-Val-Cit-Pro-Gly-、-Gly-Asn-Asn-和-Ala-Ala-Asn-。
在一些實施方式中，當n 4為1時，Q為-C(=O)-；當n 4為2時，Q分別為-O-和-C(=O)-；當n 4為3時，Q分別為-O-、-O-和鍵。在一些實施方式中，n 4為0。
在一些實施方式中，L 2為鍵、 、 、 、-NH-CH 2-O-、 、 、 、 、 、 或 。
在一些實施方式中，偶聯體化合物具有以下結構： W 1-L 1-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L 2-W 2其中， L 1為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是0～4的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； n 2是0～5的整數； B為-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-CH 2CH 2O-、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～3的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L 2為 、 或 ， 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-或 ； R 2為鍵； R 3為 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基或 ； R 4為氫； R 5為氫、-OCH 3或 W 1為可以結合細胞表面蛋白的靶向分子，並且W 2為有效載荷。
在一些實施方式中，L 2為 、 、 、 、 或 。
在一些實施方式中，L 1為 ，n 1、n 5和n 4均為0。
在一些實施方式中，L 1為 ，n 2是1或2。
在一些實施方式中，n 5為1時，n 2和n 4均為0。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-和-Val-Ala-。
在一些實施方式中，偶聯體化合物具有以下結構： W 1-L 1-(EG)n 1-(CH 2)n 2-(C=O)-(AA)n 3-L 2-W 2其中， L 1為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是0-4的整數； n 2是0-5的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是1～4的整數； L 2為 或鍵， 其中X為-NH-； R 2為鍵； R 4為氫； R 5為氫或-OCH 3； W 1為可以結合細胞表面蛋白的靶向分子，並且W 2為有效載荷。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是2、n 2是1且L 2是 。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是2、n 2是1且L 2是鍵。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是0、n 2是5且L 2是 。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是0、n 2是5且L 2是鍵。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-、-Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Val-Leu-Lys-和-Gly-Asn-Asn-。
在一些實施方式中，偶聯體化合物具有如下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 或 ，其中W 1為可以結合細胞表面蛋白的靶向分子，且W 2為有效載荷。
在一些實施方式中，偶聯體化合物具有以下結構：
CR202CE
CR202CH
CR202CK
CR202CN
CR202CR
CR202F0
CR202F2
CR20214
CR20282
CR20285
CR20287
CR20293
CR20295
CR20297
CR202EF
CR202W5
CR202W6   
CR202W7
CR202W8
CR202W9
CR202X0
CR202X1
CR202X2
CR202X3
CR202Y3
CR202Y5
CR202V4
CR202V5
CR202V6
CR202V7
CR202Z6
CR202V8
CR202V9
CR202AL
CR202W1
CR202GM
CR202GQ
CR202HJ
CR202FU
CR202JG
CR202LB
CR202HT
CR202HU
CR202HV
CR202FX
CR202HR
CR202GC
CR202MT
CR202EZ
本申請案的另一個方面提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含了本文所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，藥物組合物，用於靜脈、皮下、口服、肌內或心室內施用。
本申請案的另一個方面提供了一種用於治療對象中的疾病的方法，所述方法包括向所述對象施用治療有效量的本文所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者本文所述的藥物組合物。在一些實施方式中，所述疾病選自下組：癌症、免疫性疾病、心血管疾病、代謝疾病和神經疾病。在一些實施方式中，疾病的特徵在於在所述對象中表現靶蛋白或異常表現靶蛋白。在一些實施方式中，所述方法還包括將一種或多種治療劑與所述偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者所述藥物組合物聯合施用。
在一些實施方式中，癌症的特徵在於癌細胞高表現FOLR1、TRPV6、PSMA或c-MET。在一些實施方式中，癌症的特徵在於癌細胞高表現FOLR1和TRPV6、FOLR1和c-MET、c-MET和TRPV6、c-MET和PSMA、PSMA和TRPV6或FOLR1和PSMA。在一些實施方式中，癌症選自下組：人乳腺導管癌、人腦星形膠質母細胞瘤、膀胱移行細胞乳頭瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、白血病、卵巢癌、胃癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、肝癌、結腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、結直腸癌、食道癌、睪丸癌、皮膚癌、淋巴瘤和多發性骨髓瘤。在一些實施方式中，肺癌是非小細胞肺癌或小細胞肺癌。
在一些實施方式中，免疫性疾病是自身免疫性疾病。在一些實施方式中，自身免疫性疾病選自下組：結締組織病、系統性硬化症、類風濕性關節炎和系統性紅斑狼瘡。
在一些實施方式中，心血管疾病選自下組：心絞痛、心肌梗死、中風、心臟病發作、高血壓性心臟病、風濕性心臟病、心肌病、心臟心律失常和先天性心臟病。
在一些實施方式中，代謝疾病選自下組：糖尿病、痛風、肥胖症、低血糖症、高血糖症和血脂異常。
在一些實施方式中，神經疾病選自下組：阿茲海默症、帕金森氏症、亨丁頓舞蹈症、頭部損傷、多發性硬化症、眩暈、昏迷和癲癇。
本申請案的另一個方面提供了一種本文所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者本文所述的藥物組合物在用於製備治療對象中的疾病的藥物中的用途。
本申請案的另一個方面提供了一種化合物或其鹽，所述化合物具有以下結構： L a-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L b， 其中， L a為 、 或 ； EG為-CH 2CH 2O-或-OCH 2CH 2-；n 1是0～6的整數； n 2是0～8的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； B為-C(=O)-、 、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-CH(CH 3)-CH 2-O-、-CH 2CH 2O-、-NH-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～5的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L b為 、 、 、 、-OH或-NH-CH 2-OH； 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-、氧或 ； R 2為鍵、-O-CH 2-或-NH-CH 2CH 2-NH-C(=O)-； R 3為氫或 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基、 、 、 或 ； R 4為氫或C 1-8烷基； R 5為氫、胺基、硝基、磷酸基、-OR a或 ；其中，R a為甲烷基、乙烷基、丙烷基或異丙烷基； R 1為離去基團，較佳的R 1是鹵素（例如氯）、 或 。
在一些實施方式中，EG為-CH 2CH 2O-。在一些實施方式中，n 1是2。在一些實施方式中，n 1是0。在一些實施方式中，n 2是1。在一些實施方式中，n 2是4。在一些實施方式中，n 2是5。在一些實施方式中，n 5是0。在一些實施方式中，n 6是1。在一些實施方式中，n 6是3。在一些實施方式中，n 1是2、n 2是1、n 3-n 4是0並且L b是-OH。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu、Leu、Lys、Ala、Gly、Phe、Gln、Pro或Asn形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-、       -Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Cit-、-Val-Leu-Lys、-Val-Cit-Pro-Gly-、-Gly-Asn-Asn-和-Ala-Ala-Asn-。在一些實施方式中，當n 4為1時，Q為      -C(=O)-；當n 4為2時，Q分別為-O-和-C(=O)-；當n 4為3時，Q分別為-O-、-O-和鍵。在一些實施方式中，n 4為0。
在一些實施方式中，L b為 、 、 、-OH、-NH-CH 2-OH、 、 、 、 、 、 或 。
在一些實施方式中，所述化合物具有以下結構： L a-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L b其中， L a為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是2～4的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； n 2是0～5的整數； B為-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-CH 2CH 2O-、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～3的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L b為-OH、 、 或 ， 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-或 ； R 2為鍵； R 3為 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基或 ； R 4為氫； R 5為氫、-OCH 3或 ； R 1為離去基團，較佳的R 1是鹵素（例如氯）、 或 。
在一些實施方式中，L b為-OH、 、 、 、 、 或 。
在一些實施方式中，n 5為1時，n 2和n 4均為0。
在一些實施方式中，L a為 ，n 1、n 5和n 4均為0。
在一些實施方式中，L a為 ，n 2是1或2。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-和-Val-Ala-。
在一些實施方式中，所述化合物具有以下結構： L a-(EG)n 1-(CH 2)n 2-(C=O)-(AA)n 3-L b其中， L a為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是0～4的整數； n 2是0～5的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～3的整數； L b為 或-OH， 其中X為-NH-； R 2為鍵； R 4為氫； R 5為氫或-OCH 3； R 1為離去基團，較佳的R 1是鹵素（例如氯）、 或 。
在一些實施方式中，L a為 、n 1是2、n 2是1且L b是 。
在一些實施方式中，L a為 、n 1是2、n 2是1且L b是-OH。
在一些實施方式中，L a為 、n 1是0、n 2是5且L b是 。
在一些實施方式中，L a為 、n 1是0、n 2是5且L b是-OH。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-、-Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Val-Leu-Lys-和-Gly-Asn-Asn-。
在一些實施方式中，化合物具有選自以下組的結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，其中R 1為離去基團，較佳的R 1是鹵素（例如氯）、 或 。
本申請案的另一個方面提供了一種化合物 或其鹽。
本申請案的另一個方面提供了一種偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述偶聯體化合物具有以下結構： W a-L 1-(EG)n 1-(D)n 5- (CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L 2-W b， 其中， L 1為 、 、-S-S-或鍵； EG為-CH 2CH 2O-或-OCH 2CH 2-；n 1是0～6的整數； n 2是0～8的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； B每次出現時獨立地為-C(=O)-、 、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-CH(CH 3)-CH 2-O-、-CH 2CH 2O-、-NH-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～5的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L 2為 、 、 、 、-NH-CH 2-OH或鍵； 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-、氧或 ； R 2為鍵、-O-CH 2-或-NH-CH 2CH 2-NH-C(=O)-； R 3為氫或 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基、 、 、 或 ； R 4為氫或C 1-8烷基； R 5為氫、胺基、硝基、磷酸基、-OR a或 ；其中，R a為甲烷基、乙烷基、丙烷基或異丙烷基； W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
在一些實施方式中，EG為-CH 2CH 2O-。在一些實施方式中，n 1是2。在一些實施方式中，n 1是0。在一些實施方式中，n 2是1。在一些實施方式中，n 2是4。在一些實施方式中，n 2是5。在一些實施方式中，n 5是0。在一些實施方式中，n 6是1。在一些實施方式中，n 6是3。在一些實施方式中，n 1是2、n 2是1、n 3和n 4是0並且L 2是鍵。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu、Leu、Lys、Ala、Gly、Phe、Gln、Pro或Asn形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-、       -Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Cit-、-Val-Leu-Lys-、-Val-Cit-Pro-Gly-、-Gly-Asn-Asn-和Ala-Ala-Asn-。
在一些實施方式中，當n 4為1時，Q為-C(=O)-；當n 4為2時，Q分別為-O-和-C(=O)-；當n 4為3時，Q分別為-O-、-O-和鍵。在一些實施方式中，n 4為0。
在一些實施方式中，L 2為鍵、 、 、 、-NH-CH 2-O-、 、 、 、 、 、 或 。
在一些實施方式中，所述化合物具有以下結構： W a-L 1-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L 2-W b其中， L 1為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是2～4的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； n 2是0～5的整數； B為-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-CH 2CH 2O-、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～3的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L 2為 、 或 ， 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-或 ； R 2為鍵； R 3為 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基或 ； R 4為氫； R 5為氫、-OCH 3或 ； W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
在一些實施方式中，L 2為 、 、 、 、 或 。
在一些實施方式中，n 5為1時，n 2和n 4均為0。
在一些實施方式中，L 1為 ，n 1、n 5和n 4均為0。
在一些實施方式中，L 1為 ，n 2是1或2。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-和-Val-Ala-。
在一些實施方式中，所述化合物具有以下結構： W a- L 1-(EG)n 1-(CH 2)n 2-(C=O)-(AA)n 3-L 2-W b其中， L 1為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是0～4的整數； n 2是0～5的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是1～4的整數； L 2為 或鍵， 其中X為-NH-； R 2為鍵； R 4為氫； R 5為氫或-OCH 3； W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是2、n 2是1且L 2是 。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是2、n 2是1且L 2是鍵。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是0、n 2是5且L 2是 。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是0、n 2是5且L 2是鍵。
在一些實施方式中，偶聯體化合物具有選自以下組的結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，其中W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
本申請案的另一個方面揭露了一種偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述偶聯體化合物 ，其中W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
本申請案的另一個方面揭露了一種偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述偶聯體化合物 ，其中W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
本申請案的另一個方面提供了一種蛋白降解靶向嵌合體或其藥學上可接受的鹽，所述蛋白降解靶向嵌合體化合物具有以下結構： 或者 ， 其中， Ra和Rb各自獨立地為氫、烷基、NH 2、OH、或鹵素； A每次出現時獨立地為胺基酸殘基； a為0或1； b為0-5的整數； X為 或鍵； 靶蛋白配體為 或 。
在一些實施方式中，Ra為氫。在一些實施方式中，Rb為氫。在一些實施方式中，A為Lys形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，a為1。在在一些實施方式中，a為0。在一些實施方式中，b為1。在一些實施方式中，b為2。在一些實施方式中，b為3。在一些實施方式中，b為4。在一些實施方式中，b為5。
在一些實施方式中，蛋白降解靶向嵌合體具有選自以下組的結構：
   、
   、
   、
   、
   和
   。
以下描述只為說明本申請案的多種實施方式。因此，此處的具體實施方式不應理解為對申請專利範圍的限制。本技術領域中具有通常知識者基於本發明的宗旨和本文的描述，可很容易地得出多種等同方式和修改，應理解這樣的等同實施方式包含在本發明範圍內。在本申請案中引用的所有文獻，包含公開出版物、專利和專利申請都透過引用的方式全文併入本申請案。
除非上下文另外明確指出，否則本文所使用的單數形式「一」、「一個」、「一種」和「該」或「所述」包括複數引用。
本文所使用的諸如「包括」、「包含」、「含有」、「含有」和「具有」等術語是包括性的或開放式的，並且不排除額外的、未敘述的要素或方法步驟。術語「由……組成」是封閉式的。
本文一方面揭露了一種偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽包含至少兩個特異性結合細胞表面蛋白的配體的靶向分子和與所述靶向分子連接的有效載荷，其中所述有效載荷為蛋白降解靶向嵌合體。
在本申請案中使用的術語「靶向分子」指的是能夠靶向至靶部位、靶組織、靶器官、靶細胞或靶細胞內區域的任意分子或部分。在一些實施方式中，靶向分子使得，相比於非靶部位、非靶組織、非靶器官、非靶細胞或非靶細胞內區域，靶向分子使得連接於靶向分子的部分在靶部位、靶組織、靶器官、靶細胞或靶細胞內區域分配的更多，例如，多至少10%、20%、50%、80%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更高。在一些實施方式中，靶向分子使得，相比於不帶靶向分子，帶有靶向分子的偶聯體化合物或試劑在靶部位、靶組織、靶器官、靶細胞或靶細胞內區域分配的更多，例如，多至少10%、20%、50%、80%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更高。在一些實施方式中，靶向分子能夠觸發或促進含有此類靶向分子的偶聯體化合物與靶分子的特異性結合，觸發或促進靶細胞對偶聯體化合物的內吞作用，觸發或促進偶聯體化合物在靶細胞周圍富集和/或進入靶細胞。
本申請案使用的術語「配體」可以包括各種各樣的化學分子或多肽，其對所選定的靶點具有特異性的結合親和性，所選定的靶點可以是細胞表面蛋白（例如細胞表面受體或細胞表面抗原）、特定蛋白、細胞、組織、器官等。在一些實施方式中，配體可以與細胞表面受體特異性結合。在一些實施方式中，配體可以與細胞表面抗原特異性結合。在一些實施方式中，配體可以與特定蛋白特異性結合，所述特定蛋白可以是導致疾病的。在一些實施方式中，該特定蛋白的過表現會導致疾病或者該特定蛋白是導致疾病的突變蛋白。在一些實施方式中，本申請案的配體以10 -6～10 -11M（K d值）的親和性與靶點結合。在一些實施方式中，本申請案的配體以至少10 -6、至少10 -7、至少10 -8或至少10 -9M（K d值）的親和性與靶點結合。在一些實施方式中，本申請案的配體以一定的親和性與靶點結合，所述一定的親和性是指與同非靶點（例如，其它細胞表面受體、細胞表面抗原或特定蛋白等）的親和性相比，配體對靶點的親和性高至少兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍、五十倍、一百倍或更多倍。在一些實施方式中，本申請案的細胞表面受體、細胞表面抗原、特定蛋白在靶細胞（例如，癌細胞或生理功能異常細胞）表面或靶細胞內的表現顯著高於在正常細胞中的表現。在本申請案中使用的術語「顯著」指的是統計學上的顯著差異，或者可以由本技術領域中具有通常知識者認識到的顯著性差異。
在一些實施方式中，本申請案的細胞表面受體、細胞表面抗原或特定蛋白在靶細胞（例如，癌細胞或生理功能異常細胞）表面或靶細胞內的表現量是在正常細胞中的表現量的2倍至1,000,000倍，例如在靶細胞（例如，癌細胞或生理功能異常細胞）中的表現量比在正常細胞中的表現量高2倍至10倍、2倍至100倍、2倍至1,000倍、2倍至10,000倍、2倍至100,000倍或2倍至1,000,000倍（可以等於上述數值範圍內的任意值，包括該範圍的端點）。在一些實施方式中，細胞表面受體在靶細胞（例如，癌細胞或生理功能異常細胞）中的表現量比在正常細胞中的表現量高至少10倍、至少100倍、至少1,000倍、至少10,000倍或者至少100,000倍。在一些實施方式中，當與靶細胞（例如，癌細胞或生理功能異常細胞）表現的細胞表面受體、細胞表面抗原或特定蛋白的量比較時，正常細胞上的細胞表面受體、細胞表面抗原或特定蛋白的量降低至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。在一些實施方式中，本申請案所述的細胞表面受體、細胞表面抗原或特定蛋白在正常細胞中是不能檢測到的。
在一些實施方式中，細胞表面受體選自FOLR1、TRPV6或c-Met。在一些實施方式中，細胞表面抗原選自PSMA。
在一些實施方式中，特定蛋白選自核受體（例如，AR和ER）、激酶類蛋白（例如，RIPK2、BCR-ABL、EGFR、HER2、c-Met、TBK1、CDK2/4/6/9、ALK、Akt、CK2、ERK1/2、FLT3、PI3K、BTK和FAK）AKT、PAN-BET蛋白、BET蛋白（例如，BRD2、BRD3、BRD4和BRD6）、BLK、BRAF1、BCL-xl、ERRα、FKBP12、FRS2α、JAK1、JAK3、IKZF1、IRAK4、MDM2、MetAP2、PLK1、PSK-J3、RAS、TACC3、Tau、TrkB、MDM2或其任意組合物。在一些實施方式中，特定蛋白選自AR蛋白、ER蛋白、RAS蛋白、BRD4蛋白、PLK1蛋白、FAK蛋白、MDM2蛋白或其任意組合物。在一些實施方式中，蛋白降解靶向嵌合體中的靶蛋白配體部分靶向該特定蛋白。
葉酸受體1（FOLR1）是一種糖基磷脂醯肌醇（GPI）錨定的糖蛋白，它以奈莫耳的親和力結合葉酸，從而促進受體介導的內吞作用。快速生長的實體惡性腫瘤，包括卵巢癌和肺癌，都依賴於葉酸進行代謝和核酸合成。在一些實施方式中，本申請案所述的靶向分子包括靶向FOLR1的配體。
特異性結合FOLR1的配體或「FOLR1配體」是指能特異性識別並結合FOLR1的抗體、多肽、核酸適配體和小分子等。本申請案的FOLR1配體包括目前已經存在的或者之後產生的FOLR1配體。在一些實施方式中，FOLR1配體包括葉酸或其類似物和蝶酸。本文中所使用的術語「類似物」包括結構類似物與功能類似物。其中結構類似物是指具有相似化學結構的一類化合物，它們之間可以存在一個或多個不同的原子、或一個或多個不同的官能團。功能類似物是指具有相同或相似的化學作用、生物作用或藥理學作用的一類化合物。在一些實施方式中，葉酸類似物選自下組：5-甲基四氫葉酸、5-甲醯基四氫葉酸、10-甲醯四氫葉酸甲胺蝶呤、5,10-甲醯四氫葉酸、5,10-亞甲基四氫葉酸、胺基碟呤和雷替曲塞。
瞬時受體陽離子通道亞家族V成員6（transient receptor potential cation channel subfamily V member 6），即TRPV6，是一種高選擇性鈣離子跨膜轉運通道，介導鈣離子由細胞外向細胞內的主動轉運。TRPV6在人正常的腎臟、胃腸道、胰腺、乳腺、唾液腺等中有表現，但是主要表現於腸上皮細胞，其參與鈣離子向細胞內的轉運，因此當TRPV6通道的數量或功能發生改變時，可引起鈣離子調節的變化，進一步導致與其相關組織器官的結構或功能異常。和正常組織相比，TRPV6在乳腺癌、膽管癌、卵巢癌、肺鱗癌、前列腺癌等惡性腫瘤中表現明顯升高，其異常表現可能與腫瘤的形成與進展有關。
特異性結合TRPV6的配體或「TRPV6配體」是指能特異性識別並結合TRPV6的抗體、多肽、核酸適配體和小分子等。本申請案的TRPV6配體包括目前已經存在的或者之後產生的TRPV6配體。在一些實施方式中，TRPV6配體包括由SEQ ID NO: 1（KEFLHPSKVDLPR）所示的胺基酸序列、由SEQ ID NO: 2（EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR）所示的胺基酸序列、或與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
前列腺特異性膜抗原（PSMA），是指存在於前列腺上皮細胞膜的一種II型跨膜糖蛋白，由750個胺基酸組成，其具有19個胞內區胺基酸、24個跨膜區胺基酸和707個胞外區胺基酸。前列腺特異性膜抗原在正常前列腺上皮細胞中表現，但其在前列腺癌細胞中的表現量要高得多。相對於傳統用於臨床檢測的前列腺特異抗原，前列腺特異性膜抗原是一種更加敏感和特異的前列腺癌腫瘤標記物，尤其是在激素難治性前列腺癌及前列腺癌轉移灶中均為高表現，在區分前列腺癌和其他類型惡性腫瘤時具有高敏感度和特異性。同時，在多種非前列腺來源的實體瘤（如肺癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、腎癌和結直腸癌等）中，前列腺特異性膜抗原也高度特異地表現於腫瘤血管內皮細胞上。
特異性結合前列腺特異性膜抗原的配體或「前列腺特異性膜抗原配體」是指能特異性識別並結合前列腺特異性膜抗原的抗體、多肽、核酸適配體和小分子等。本申請案的前列腺特異性膜抗原配體包括目前已經存在的或者之後產生的前列腺特異性膜抗原配體，還包括前述配體的片段，只要這些片段還保留與前列腺特異性膜抗原結合的能力。抗體類配體是最常見的前列腺特異性膜抗原配體，其包括但不限於單株抗體J591、J533、J415和E99（例如，參見Liu H, Rajasekaran AK, Moy P等人 Constitutive and antibody-induced internalization of prostate-specific memberane antigen[J]. Cancer Res., 1998, 58 (18): 4055-4060）。核酸適配體是經過指數富集配體系統進行技術篩選得到的能與前列腺特異性膜抗原高親和性、高特異性結合的單鏈DNA或RNA，該類前列腺特異性膜抗原配體包括但不限於xPSM-A10核酸適配體及其衍生物和xPSM-A9核酸適配體及其衍生物（例如，參見Lupoid SE等人， Identification and Characterization of nuclease-stabilized RNA molecules that bind human prostate cancer cells via the prostate-specific membrane antigen, Cancer Res., 2002, 62(14):4029-4033）。相比於抗體類和核酸適配體類配體，前列腺特異性膜抗原小分子配體具有分子量小、高滲透性、低免疫原性、易於合成等優勢，其包括但不限於穀胺醯脲類小分子配體和胺基磷酸酯類小分子配體。
在本文中使用的在本申請案中使用的術語「多肽」、「蛋白」和「肽」可以是單個胺基酸或者胺基酸的聚合物。如本申請案所述的多肽、蛋白或肽可以含有天然存在的胺基酸，以及非天然存在的胺基酸，或者胺基酸的類似物和模擬物。可以透過本領域熟知的任何方法獲得多肽、蛋白或肽，例如但不限於從天然物質中分離和純化、重組表現、化學合成等。在一些實施方式中，多肽包括2～50、2～40、2～30、2～25、2～22、2～20、2～18、2～15、2～12、2～10、2～8、4～50、5～50、5～40、5～30、5～25、5～22、5～20、5～18、5～15、5～12、5～10、6、7、8或9個胺基酸。
在本文中使用的「小分子配體」指的是具有小於或等於約3kDa分子量的化合物。在一些實施方式中，小分子化合物具有小於或等於約2kDa的分子量。在一些實施方式中，小分子化合物具有小於或等於約1.5kDa的分子量。在一些較佳的實施方式中，小分子化合物具有小於或等於約1kDa、800Da、700Da、600Da或500Da的分子量。
在一些實施方式中，本申請案的前列腺特異性膜抗原小分子配體可以選自由以下組成的組：2-[[甲基羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[乙基羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[丙基羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[丁基羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[環己基羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[苯基羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[2-(四氫呋喃基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[(2-四氫吡喃基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((4-吡啶基)甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((2-吡啶基)甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[(苯基甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((2-苯基乙基)甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((3-苯基丙基)甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((3-苯基丁基)甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((2-苯基丁基)甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[(4-苯基丁基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；和2-[[(氨甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[甲基羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[乙基羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[丙基羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[丁基羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[苯基羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[((4-吡啶基)甲基)羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[((2-吡啶基)甲基)羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[(苯基甲基)羥基氧膦基]氧]戊二酸；和2[[((2-苯基乙基)甲基)羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[(N-羥基)胺基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基-N-甲基)胺基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-丁基-N-羥基)胺基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-苄基-N-羥基)胺基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基-N-苯基)胺基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基-N-2-苯基乙基)胺基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-乙基-N-羥基)胺基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基-N-丙基)胺基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基-N-3-苯基丙基)胺基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基-N-4-吡啶基)胺基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(甲基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(苄基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(苯基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(2-苯基乙基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(乙基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(丙基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(3-苯基丙基)醯胺]甲基]戊二酸；和2-[[N-羥基(4-吡啶基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[(亞硫醯基)甲基]戊二酸；2-[(甲基亞硫醯基)甲基]戊二酸；2-[(乙基亞硫醯基)甲基]戊二酸；2-[(丙基亞硫醯基)甲基]戊二酸；2-[(丁基亞硫醯基)甲基]戊二酸；2-[(苯基亞硫醯基]甲基]戊二酸；2-[[(2-苯基乙基)亞硫醯基]甲基]戊二酸；2-[[(3-苯基丙基)亞硫醯基]甲基]戊二酸；2-[[(4-吡啶基)亞硫醯基]甲基]戊二酸；2-[(苄基亞硫醯基)甲基]戊二酸；2-[(磺醯基)甲基]戊二酸；2-[(甲磺醯基)甲基]戊二酸；2-[(乙磺醯基)甲基]戊二酸；2-[(丙磺醯基)甲基]戊二酸；2-[(丁磺醯基)甲基]戊二酸；2-[(苯基磺醯基]甲基]戊二酸；2-[[(2-苯基乙基)磺醯基]甲基]戊二酸；2-[[(3-苯基丙基)磺醯基]甲基]戊二酸；2-[[(4-吡啶基)磺醯基]甲基]戊二酸；2-[(苄基磺醯基)甲基]戊二酸；2-[(亞碸亞胺基(sulfoximinyl))甲基]戊二酸；2-[(甲基亞碸亞胺基)甲基]戊二酸；2-[(乙基亞碸亞胺基)甲基]戊二酸；2-[(丙基亞碸亞胺基)甲基]戊二酸；2-[(丁基亞碸亞胺基)甲基]戊二酸；2-[(苯基亞碸亞胺基]甲基]戊二酸；2-[[(2-苯基乙基)亞碸亞胺基]甲基]戊二酸；2-[[(3-苯基丙基)亞碸亞胺基]甲基]戊二酸；2-[[(4-吡啶基)亞碸亞胺基]甲基]戊二酸；和2-[(苄基亞碸亞胺基)甲基]戊二酸；N-[甲基羥基氧膦基]麩胺酸；N-[乙基羥基氧膦基]麩胺酸；N-[丙基羥基氧膦基]麩胺酸；N-[丁基羥基氧膦基]麩胺酸；N-[苯基羥基氧膦基]麩胺酸；N-[(苯基甲基)羥基氧膦基]麩胺酸；N-[((2-苯基乙基)甲基)羥基氧膦基]麩胺酸；和N-甲基-N-[苯基羥基氧膦基]麩胺酸。本申請案的前列腺特異性膜抗原配體還包括PCT申請WO2010/108125和WO2006/093991中揭露的所有前列腺特異性膜抗原小分子配體，上述兩個專利申請以其全部內容併入本文。
在一些實施方式中，本申請案的前列腺特異性膜抗原配體是戊二酸衍生物。在一些實施方式中，本申請案的前列腺特異性膜抗原配體是戊二酸的胺羰基衍生物。
在一些實施方式中，本申請案的前列腺特異性膜抗原配體包括如下結構：
在一些實施方式中，偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的前列腺特異性膜抗原配體包括如下結構：
在一些實施方式中，偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的前列腺特異性膜抗原配體包括如下結構：
在一些實施方式中，偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的前列腺特異性膜抗原配體包括如下結構：
在一些實施方式中，偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的前列腺特異性膜抗原配體包括如下結構：
在一些實施方式中，偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的前列腺特異性膜抗原配體包括如下結構：
在一些實施方式中，偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的前列腺特異性膜抗原配體包括如下結構：
C-MET是一種由C-MET原癌基因編碼的蛋白產物，為肝細胞生長因子（HGF）的受體，具有酪胺酸激酶活性，與多種癌基因產物和調節蛋白相關，參與細胞訊息傳遞、細胞骨架重排的調控，是細胞增殖、分化和運動的重要因素。C-MET與多種癌的發生和轉移密切相關。研究表明，許多腫瘤病人在其腫瘤的發生和轉移過程中均有C-MET過度表現和基因擴增。由於C-MET在不同細胞、不同分化階段作用的基質不同，使其在特定的條件下表現出多種功能，例如促進肝細胞、內皮細胞和黑色素細胞的分裂、引起上皮細胞的分散和誘導細胞形態變化。在一些實施方式中，本申請案所述的靶向分子包括靶向C-MET的配體。
特異性結合C-MET的配體或「C-MET配體」是指能特異性識別並結合C-MET的抗體、多肽、核酸適配體和小分子等。本申請案的C-MET配體包括目前已經存在的或者之後產生的C-MET配體。在一些實施方式中，C-MET配體包括由SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列：Cys a-X1-Cys c-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cys d-Trp-Cys b-Tyr-X4-X5-X6；其中X1為Asn、His或Tyr；X2為Gly、Ser、Thr或Asn；X3為Thr或Arg；X4為Ala、Asp、Glu、Gly或Ser；X5為Ser或Thr；X6為Asp或Glu；Cys a-d各自為半胱胺酸殘基。在一些較佳的實施方式中，殘基Cys a與Cys b以及Cys c與Cys d分別環化形成兩個獨立的二硫鍵。在一些實施方式中，c-MET的配體包括由SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列Ala-Gly-Ser-Cys a-Tyr-Cys c-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys d-Trp-Cys b-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys，其中Cys a-d各自為半胱胺酸殘基。在一些較佳的實施方式中，殘基Cys a與Cys b以及Cys c與Cys d分別環化形成兩個獨立的二硫鍵。在一些較佳的實施方式中，末端離胺酸的羧基可以被醯胺化。本申請案的C-MET配體還包括PCT申請WO2008139207A3中揭露的所有C-MET配體，該文獻揭露的所有內容透過引用的方式併入本文。
文本使用的胺基酸的對應的中文名稱和簡寫如下表所示。本申請案中使用的術語「胺基酸」或具體的胺基酸中文名稱或胺基酸簡寫旨在包括其所有的立體異構體，例如L-構型和D-構型。例如文申請使用的「Arg」可以是L-Arg或D-Arg。例如，醯胺化的Lys可以是L-2,6-二胺基己醯胺或D-2,6-二胺基己醯胺。
中文名稱 符號與縮寫
丙胺酸 A 或 Ala
精胺酸 R 或 Arg
天門冬醯胺 N 或 Asn
天門冬胺酸 D 或 Asp
半胱胺酸 C 或 Cys
麩胺酸 E 或 Glu
麩醯胺酸 Q或 Gln
甘胺酸 G 或 Gly
組胺酸 H 或 His
白胺酸 L 或 Leu
異白胺酸 I 或 Ile
離胺酸 K 或 Lys
甲硫胺酸 M 或 Met
苯丙胺酸 F 或 Phe
脯胺酸 P 或 Pro
絲胺酸 S 或 Ser
蘇胺酸 T 或 Thr
色胺酸 W 或 Trp
酪胺酸 Y 或 Tyr
纈胺酸 V 或 Val
在一些實施方式中，靶向分子中的配體直接連接或者透過間隔區相互連接。在一些較佳的實施方式中，配體與配體之間或配體與間隔區之間的連接透過脫水縮合的方式進行。本文所使用的「脫水縮合」是指兩個基團發生反應，脫去一個分子的水並形成新的化學鍵的過程。例如一個胺基酸中的胺基（-NH 2）和另一個胺基酸中的羧基（-COOH）發生反應，脫去一個分子的水並形成新的肽鍵。
在一些實施方式中，間隔區包含選自下組的胺基酸或胺基酸組合：Lys、Cys、Lys-Cys、Cys-Cys、Lys-Cys-Lys、Arg-Arg、Ala-Ser-Asn、Ala-Ala-Ala、Ser-Ser-Arg、Pro-Arg、Asp-Asp-Lys-Cys和和Pro-Leu-Gly。任選的，間隔區的胺基酸可以被醯胺化。在一些較佳的實施方式中，離胺酸（Lys）被醯胺化，例如，醯胺化成為2,6-二胺基己醯胺。
在一些實施方式中，間隔區包含一個或多個相同或不同的選自下組的化合物透過脫水縮合形成： 、 、 和 ，其中n為0或1。在一些實施方式中，間隔區可以是 、 或 。
在一些實施例中，具有以下結構部分的靶向分子與有效載荷進行連接以形成偶聯體化合物， 、 、 或 。 其中，Q為活性基團； 在一些實施方式中，上述靶向分子透過活性基團Q與有效結構連接，其中活性基團Q為炔基或巰基。
在一些實施方式中，具有以下結構的靶向分子與有效載荷進行連接以形成偶聯體化合物： 、 、 、 或 。
在本申請案中使用的術語「有效載荷」指的是擬遞送至靶細胞或組織的分子或物質。在一些實施方式中，有效載荷可以是用於診斷、治療或預防對象中的疾病的分子或物質。非限制性地，有效載荷可以是旨在用於診斷、治療或預防對象中的疾病的蛋白降解靶向嵌合體。
在一些實施方式中，所述蛋白降解靶向嵌合體具有結合靶蛋白（特定蛋白）的靶蛋白配體部分，結合E3連接酶的E3連接酶配體部分，以及連接靶蛋白配體部分和E3連接酶配體部分的連接部分。本申請案的蛋白降解靶向嵌合體包括目前已經存在的或者之後產生的蛋白降解靶向嵌合體。本申請案的蛋白降解靶向嵌合體還包括PCT申請WO2021205391A1；美國申請US20190151457A1；和中國申請CN113563414、CN104736569A和CN108366992A中揭露的所有蛋白降解靶向嵌合體，這些文獻揭露的所有內容透過引用的方式併入本文。
在一些實施方式中，具有式（I）所示結構的蛋白降解靶向嵌合體與靶向分子進行連接以形成偶聯體化合物： (T P) n-L-T E3(I)， 其中， 所述T P為結合靶蛋白的靶蛋白配體部分，其中n為1、2或3； 所述L為連接T P和T E3的連接部分； 所述T E3為結合E3連接酶的E3連接酶配體部分。
在一些實施方式中，蛋白降解靶向嵌合體具有選自以下組的結構： (II)， (III)， (IV) 或 (V)， 其中， Ra、Rb和Rc各自獨立地為氫、烷基、NH 2、OH、或鹵素，較佳地，所述烷基為甲烷基，所述鹵素為氟； Rd為CH 2、C=O或C=S； p為0或1； 所述靶蛋白配體能結合特定的靶蛋白； 所述靶蛋白配體透過所述連接部分連接至E3連接酶基團。
在一些實施方式中，靶蛋白為本文所述的特定蛋白。在一些實施方式中，靶蛋白選自核受體（例如，AR和ER）、激酶類蛋白（例如，RIPK2、BCR-ABL、EGFR、HER2、c-Met、TBK1、CDK2/4/6/9、ALK、Akt、CK2、ERK1/2、FLT3、PI3K、BTK和FAK）AKT、PAN-BET蛋白、BET蛋白（例如，BRD2、BRD3、BRD4和BRD6）、BLK、BRAF1、BCL-xl、ERRα、FKBP12、FRS2α、JAK1、JAK3、IKZF1、IRAK4、MDM2、MetAP2、PLK1、PSK-J3、RAS、TACC3、Tau、TrkB、MDM2或其任意組合物。在一些較佳的實施方式中，靶蛋白選自AR蛋白、ER蛋白、RAS蛋白、BRD4蛋白、PLK1蛋白、FAK蛋白、MDM2蛋白或其任意組合物。在一些實施方式中，特定蛋白的蛋白降解靶向嵌合體中的靶蛋白。
在一些實施方式中，本文揭露的靶蛋白配體部分具有選自以下的結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方式中，蛋白降解靶向嵌合體中的連接部分具有選自下組的結構： (L1)， (L2)，或 (L3) 其中， p 1為0～4的整數； p 2為0～6的整數； p 3、p 4、p 5和p 6各自獨立地為0或1； G 1為4～14元直鏈亞烷基，任選地，所述4～14元直鏈亞烷基中的2～5個碳原子可以被-O-、-NH-、-N(C 1-6烷基)-或-C≡C-取代； G 2為胺基酸殘基，其中較佳地，所述G 2為Lys殘基； G 3選自下組： 、 、 和 ； G 4為5～9元直鏈亞烷基，任選地，所述5～9元直鏈亞烷基中的2～4個碳原子可以被-O-、-NH-、-N(C 1-6烷基)-或-C≡C-取代。
一些實施方式中，本文揭露的蛋白降解靶向嵌合體中的連接部分具有選自下組的結構 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方式中，本文揭露的蛋白降解靶向嵌合體具有如下所示的結構：
CR202CC
CR202CF
CR202CI
CR202CL
CR202CP
CR20274
CR202EE
CR202Z5
CR202ES
CR202Z7  
CR202Z8
CR202Z9
CR202Z1
CR202Z2
CR202Z3
CR202Z4
CR202Y2
CR202Y4
在一些實施方式中，偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽包含一個、兩個、三個、四個或更多個有效載荷。
在一些實施方式中，本申請案的有效載荷在連接至本申請案的靶向分子或連接子之前（即，形成偶聯體化合物之前）具有游離的胺基或者羧基，有效載荷透過上述胺基或者羧基與偶聯體化合物的相應部分（例如，連接子）的基團發生醯化反應從而偶聯至偶聯體化合物。
在一些實施方式中，有效載荷與所述靶向分子直接連接、或所述有效載荷透過連接子與所述靶向分子連接。在一些實施方式中，有效載荷與所述靶向分子之間、所述有效載荷與所述連接子之間、或所述連接子與所述靶向分子之間的連接是透過化學反應完成的。在一些較佳的實施方式中，所述靶向分子與所述連接子之間的連接是透過鍵擊反應（click反應）完成的。
本申請案所述的「鍵擊反應」（即「click反應」）為一類具有高效性和高選擇性的化學合成方法。鍵擊反應透過形成高效連接單元把幾個分子片段拼接起來，整個反應過程簡單、快捷且副產物少。一些鍵擊反應的實例包括但不限於硫醇與烯烴的加成反應、疊氮化物與炔烴的環化反應。
在本申請案中使用的術語「連接子」指的是將有效載荷與靶向分子共價連接的分子或部分。連接子包括用於將有效載荷與至少一個靶向分子連接的官能團。在一些實施方式中，官能團可以含有兩個反應性部分，一個用於與有效載荷連接，另一個用於與靶向分子連接。在一些實施方式中，官能團彼此之間是不同的。在一些實施方式中，官能團包含含有巰基反應性部分和胺反應性部分的基團。在一些實施方式中，官能團彼此之間是相同的。在一些實施方案中，連接子含有的胺基酸中的羧酸被醯胺化。在一些實施方案中，連接子含有短鏈的聚乙二醇（例如，包括2～10、2～8、3～8、4～8、4～7、4～6或5個重複單元）。在一些實施方案中，連接子含有疊氮基團。在一些實施方案中，連接子含有炔基基團。在一些實施方式中，連接子足夠穩定以避免在血液循環過程中意外釋放有效載荷，以增加有效載荷到靶細胞或組織的有效量並避免毒性。在一些實施方式中，連接子能夠在靶細胞周圍或內部釋放有效載荷以有效殺死靶細胞或阻斷靶細胞的功能。
在一些實施方式中，所述連接子包含連接模組1和連接模組2。
在一些實施方式中，所述連接子包含連接模組2。
在一些實施方式中，所述連接子包含連接模組1和與連接模組1結合的如下基團：PEG鏈、 、 、 、 、C 1-C 8烷基鏈、-NH-、-O-、-C(O)-或其任意組合。在一些較佳的實施方式中，PEG鏈為PEG1（ ）、PEG2（ ）或PEG3（ ）。在一些較佳的實施方式中，所述連接子包含連接模組1和與連接模組1結合的如下基團： 。本技術領域中具有通常知識者可以理解，這些基團可以透過左側連接點與連接模組1中的連接部分鍵合並且透過右側連接點與有效載荷鍵合，或者透過右側連接點與連接模組1中的連接部分鍵合並且透過左側連接點與有效載荷鍵合。
在一些實施方式中，連接模組1與連接模組2透過鍵或者化學基團相連。在一些實施方式中，所述化學基團為PEG鏈、 、 、 、C 1-C 8烷基鏈、-NH-、-O-、-C(O)-、 、 或其任意組合。在一些較佳的實施方式中，PEG鏈為PEG1、PEG2或PEG3。在一些較佳實施方式中，所述化學基團為 、 、 、 、 、、 或 。本技術領域中具有通常知識者可以理解，這些化學基團可以透過左側連接點與連接模組1鍵合以及透過右側連接點與連接模組2鍵合，或者透過右側連接點與連接模組1鍵合以及透過左側連接點與連接模組2鍵合。
在一些實施方式中，所述連接模組1包括馬來醯亞胺基己醯基（ ）、馬來醯亞胺基（ ）或疊氮基團（ ）。
在一些實施方式中，所述連接模組2包括CB酶酶切基團、纖溶酶酶切基團、天門冬醯胺內切酶酶切基團、β-葡萄糖苷酸酶酶切基團、硫酸酯酶酶切基團、磷酸酯酶酶切基團、β-半乳糖苷酶酶切基團、穀胱甘肽酶酶切基團或酸不穩定基團。
在一些較佳的實施方式中，所述CB酶酶切基團包括胺基酸或胺基酸與自分解片段的組合。在一些較佳的實施方式中，所述胺基酸為Val-Cit、Gly-Gly-Phe-Gly、CycloBut-Cit、Phe-Cit、Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ala-Cit、Val-Cit-Pro或Val-Cit-Pro-Gly。
在一些較佳的實施方式中，所述纖溶酶酶切基團包括胺基酸或胺基酸與自分解片段的組合。在一些較佳的實施方式中，所述胺基酸為Val-Leu-Lys。
在一些較佳的實施方式中，所述天門冬醯胺內切酶基團包括胺基酸或胺基酸與自分解片段的組合。在一些較佳的實施方式中，所述胺基酸選自Gly-Asn-Asn或Ala-Ala-Asn。
在一些較佳的實施方式中，所述自分解片段為PAB及其衍生物、 、或 。在一些較佳的實施方式中，所述PAB為 。在一些較佳的實施方式中，所述PAB衍生物為 、、 、 或 。
在一些較佳的實施方式中，所述β-葡萄糖醛酸酶酶切基團為 或 。在一些較佳的實施方式中，所述硫酸酯酶酶切基團為 或 。在一些較佳的實施方式中，所述磷酸酯酶酶切基團為 或 。在一些較佳的實施方式中，所述β-半乳糖苷酶酶切基團為 或 。在一些較佳的實施方式中，所述穀胱甘肽酶酶切基團為 。在一些較佳的實施方式中，所述酸不穩定基團為 。
本技術領域中具有通常知識者可以理解，上述酶切基團的活性位點可任選地在合適的反應後與連接模組1連接、與化學基團連接、與靶向分子連接或與有效載荷連接。例如，在所述β-葡萄糖醛酸酶酶切基團在與連接模組1、化學基團、靶向分子或有效載荷進行有效連接後具有以下結構 或 ；所述硫酸酯酶酶切基團在與連接模組1、化學基團、靶向分子或有效載荷進行有效連接後具有以下結構 或 ；所述磷酸酯酶酶切基團在與連接模組1、化學基團、靶向分子或有效載荷進行有效連接後具有以下結構 ；所述β-半乳糖苷酶酶切基團在與連接模組1、化學基團、靶向分子或有效載荷進行有效連接後具有以下結構 或 ；所述穀胱甘肽酶酶切基團在與連接模組1、化學基團、靶向分子或有效載荷進行有效連接後具有以下結構 ；所述酸不穩定基團在與連接模組1、化學基團、靶向分子或有效載荷進行有效連接後具有以下結構 。
在一些較佳的實施方式中，當所述連接子包括連接模組2時，所述連接模組2是穀胱甘肽酶酶切基團。在一些較佳的實施方式中，所述穀胱甘肽酶酶切基團為 。
CB酶是指組織蛋白酶B（Cathepsin B），其是一種常見於溶酶體中的半胱胺酸蛋白酶。纖溶酶（Plasmin）是指一種常見於血漿中的絲胺酸蛋白酶。天門冬醯胺內切酶（Lagumain），或稱人豆莢蛋白，是一種溶酶體中的肽酶，其可以靶向切割含有天門冬醯胺殘基（-Asn-）的肽段。
在一些實施方式中，偶聯體化合物具有以下結構： W 1-L 1-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L 2-W 2， 其中， L 1 為 、 、-S-S-或鍵； EG為-CH 2CH 2O-或-OCH 2CH 2-；n 1是0～6的整數； n 2是0～8的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； B每次出現時獨立地為-C(=O)-、 、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-、 -C(=O)-NH-、-CH(CH 3)-CH 2-O-、-CH 2CH 2O-、-NH-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～5的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L 2 為 、 、 、 、-NH-CH 2-O-或鍵； 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-、氧或 ； R 2為鍵、-O-CH 2-或-NH-CH 2CH 2-NH-C(=O)-； R 3為氫或 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基、 、 、 或 ； R 4為氫或C 1-8烷基； R 5為氫、胺基、硝基、磷酸基、-OR a或 ；其中，R a為甲烷基、乙烷基、丙烷基或異丙烷基； W 1 為可以結合細胞表面蛋白的靶向分子，且 W 2 為有效載荷。
在一些實施方式中，EG為-CH 2CH 2O-。在一些實施方式中，n 1是2。在一些實施方式中，n 1是0。在一些實施方式中，n 2是1。在一些實施方式中，n 2是4。在一些實施方式中，n 2是5。在一些實施方式中，n 5是0。在一些實施方式中，n 6是1。在一些實施方式中，n 6是3。在一些實施方式中，n 1是2、n 2是1、n 3和n 4是0並且L 2是鍵。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu、Leu、Lys、Ala、Gly、Phe、Gln、Pro或Asn形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、      -Ala-Cit-、-Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Cit-、-Val-Leu-Lys-、      -Val-Cit-Pro-Gly-、-Gly-Asn-Asn-和-Ala-Ala-Asn-。
在一些實施方式中，當n 4為1時，Q為-C(=O)-；當n 4為2時，Q分別為-O-和-C(=O)-；當n 4為3時，Q分別為-O-、-O-和鍵。在一些實施方式中，n 4為0。
在一些實施方式中，L 2為鍵、 、 、 、-NH-CH 2-O-、 、 、 、 、 、 或 。
在一些實施方式中，偶聯體化合物具有以下結構： W 1-L 1-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L 2-W 2其中， L 1為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是0～4的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； n 2是0～5的整數； B為-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-CH 2CH 2O-、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～3的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L 2為 、 或 ， 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-或 ； R 2為鍵； R 3為 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基或 ； R 4為氫； R 5為氫、-OCH 3或 ； W 1 為可以結合細胞表面蛋白的靶向分子，並且 W 2 為有效載荷。
在一些實施方式中，L 2為 、 、 、 、 或 。
在一些實施方式中，L 1為 ，n 1、n 5和n 4均為0。
在一些實施方式中，L 1為 ，n 2是1或2。
在一些實施方式中，n 5為1時，n 2和n 4均為0。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-和-Val-Ala-。
在一些實施方式中，偶聯體化合物具有以下結構： W 1-L 1-(EG)n 1-(CH 2)n 2-(C=O)-(AA)n 3-L 2-W 2其中， L 1為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是0～4的整數； n 2是0～5的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是1～4的整數； L 2為 或鍵， 其中X為-NH-； R 2為鍵； R 4為氫； R 5為氫或-OCH 3； W 1 為可以結合細胞表面蛋白的靶向分子，並且 W 2 為有效載荷。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是2、n 2是1且L 2是 。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是2、n 2是1且L 2是鍵。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是0、n 2是5且L 2是 。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是0、n 2是5且L 2是鍵。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-、-Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Val-Leu-Lys-和-Gly-Asn-Asn-。
在一些實施方式中，本文揭露的偶聯體化合物具有如下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 或 ， 其中W 1為可以結合細胞表面蛋白的靶向分子，且W 2為有效載荷。
在一些實施方式中，本文揭露了以下偶聯體化合物：
  
  
     
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
     
  
本申請案中使用的術語「偶聯體化合物」或「化合物」旨在包括所示結構的所有立體異構體（例如對映體和非對映體）、幾何異構體、互變異構體和同位素。
本申請案所述的偶聯體化合物或化合物可以是不對稱的（例如具有一個或多個立體中心）。除非另外指明，所有的立體異構體，例如對映體和非對映體，都旨在包含在內。可以以光學活化或外消旋的形式分離含有不對稱取代的碳原子的本申請案的偶聯體化合物或化合物。如何從不具有光學活性的初始原料製備光學活化形式的方法是本領域習知的，如透過拆分外消旋混合物或透過立體選擇性合成。在本申請案所述的偶聯體化合物或化合物中還可以存在烯烴、碳-碳雙鍵等多種幾何異構體，並且在本申請案中已經考慮了所有的這些穩定異構體。本申請案描述了偶聯體化合物或化合物的順式和反式幾何異構體並且其可以以異構體的混合物或單獨的異構體形式分離。
可以透過本領域習知的多種方法中的任一對化合物的外消旋混合物進行拆分。示例性的方法包括使用手性拆分酸的分級結晶，手性拆分酸是一種具有光學活性的成鹽有機酸。用於分級重結晶方法的適宜的拆分試劑是例如具有光學活性的酸（如，酒石酸、二乙醯酒石酸、二苯甲醯酒石酸、扁桃酸、蘋果酸、乳酸的D和L形式）或各種具有光學活性的樟腦磺酸。適於分級結晶方法的其他拆分試劑包括N-甲基苄胺、2-苯甘氨醇、去甲麻黃鹼、麻黃鹼、N-甲基麻黃鹼、環己基乙胺、1,2-二胺基環己烷等的立體異構純形式。
還可以透過在裝有光學活性拆分試劑（例如二硝基苯甲醯基苯基甘胺酸）的柱上透過洗脫進行外消旋混合物的拆分。可以由本技術領域中具有通常知識者確定適宜的洗脫溶劑組合物。
本申請案的偶聯體化合物或化合物還包括互變異構形式。互變異構形式是由同時伴有質子的遷移的單鍵與相鄰雙鍵的對換導致的。互變異構形式包括具有相同化學式和總電荷的異構質子化狀態的質子的互變異構體。質子互變異構體的示例包括酮-烯醇對、醯胺-亞胺酸對、內醯胺-內醯亞胺對、烯胺-亞胺對和環狀的形式，其中質子能夠佔據雜環系統的兩個或多個位置，例如1H-和3H-咪唑、1H-，2H-和4H-1,2,4-三唑、1H-和2H-異吲哚以及1H-和2H-吡唑。互變異構形式透過適宜的取代能夠平衡或空間鎖定成一種形式。
本申請案的偶聯體化合物或化合物還可以包括中間體或最終化合物中出現原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序數但不同質量數的那些原子。例如，氫的同位素包括氕、氘和氚。
在某些實施方案中，本申請案的偶聯體化合物或化合物可以透過有機合成獲得。可以使用任意習知的有機合成技術製備並且可以根據多種可能的合成途徑合成本申請案的偶聯體化合物或化合物，包括其鹽、酯、水合物或溶劑化物。
可以在適宜的溶劑中進行製備本申請案的偶聯體化合物或化合物的反應，有機合成領域的通常知識者能夠容易地對溶劑進行選擇。適宜的溶劑能夠在反應進行的溫度下（例如可以是從溶劑的冷凍溫度至溶劑的沸騰溫度的溫度範圍）基本上不與初始原料（反應物）、中間體或產物反應。可以在一種溶劑或一種以上溶劑的混合物中進行給定的反應。根據特定反應步驟，本技術領域中具有通常知識者能夠針對特定反應步驟選擇適宜的溶劑。
本申請案偶聯體化合物或化合物的製備可能關於各種化學基團的保護和去保護。本技術領域中具有通常知識者能夠容易地確定是否需要保護和去保護以及選擇適宜的保護基團。保護基團化學可以參見例如T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., Wiley & Sons, Inc., New York (1999)，其全部內容透過引用併入本申請案。
可以根據本領域習知的任意適宜方法對反應進行監測。例如，可以利用光譜法，如核磁共振光譜（例如 1H或 13C）、紅外光譜、分光光度法（例如UV-可見）、質譜，或者利用層析法，如高效液相層析（HPLC）、液相層析-質譜（LCMS）或薄層層析（TLC）對產物的形成進行監測。本技術領域中具有通常知識者可以利用多種方法對化合物進行純化，包括高效液相層析（HPLC）（例如參見「Preparative LC-MS Purification: Improved Compound Specific Method Optimization」 Karl F. Blom, Brian Glass, Richard Sparks, Andrew P. Combs J. Combi. Chem. 2004, 6(6), 874-883，其全部內容透過引用併入本申請案）和正相矽膠柱層析。
本申請案的一個方面揭露了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本申請案所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，本申請案所述的藥物組合物用於靜脈、皮下、口服、肌內或心室內施用。
在本申請案中使用的術語「藥學上可接受的」指的是在合理的醫學判斷範圍內，其適用於與人和其他動物的細胞接觸而沒有不適當的毒性、刺激性、過敏反應等，並且與合理的效益/風險比是相稱的。
在本申請案中使用的術語「藥學上可接受的鹽」指的是本申請案的偶聯體化合物的相對無毒性的、無機和有機酸加成鹽和鹼加成鹽。代表性的酸加成鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽、胺基磺酸鹽、丙二酸鹽、水楊酸鹽、丙酸鹽、亞甲基-雙- b-羥基萘甲酸鹽、龍膽酸鹽、羥乙基磺酸鹽、二對甲苯甲醯基酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、環己基胺基磺酸鹽和奎尼酸月桂基磺酸鹽等。鹼加成鹽包括藥學上可接受的金屬和胺鹽。適宜的金屬鹽包括鈉、鉀、鈣、鋇、鋅、鎂和鋁鹽。在一些實施方式中，鈉鹽和鉀鹽是較佳的。適宜的無機鹼加成鹽由金屬鹼製備，所述金屬鹼包括例如氫化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁、氫氧化鋰、氫氧化鎂和氫氧化鋅。適宜的胺鹼加成鹽由具有足夠鹼性的胺製備，以形成穩定的鹽，並且較佳包括以下常用於藥物化學的胺，因為其毒性較低並且是醫療用途可接受的：氨、乙二胺、N-甲基葡糖胺、離胺酸、精胺酸、鳥氨酸、膽鹼、N, N'-二苄基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、吡𠯤、三羥甲基胺基甲烷、四甲基氫氧化銨、三乙胺、二苄胺、二苯羥甲胺、脫氫樅胺、N-乙基呱啶、苄胺、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、鹼性胺基酸（例如，離胺酸和精胺酸）以及二環己胺等。
在本申請案中使用的術語「藥學上可接受的載體」指的是用於向對象遞送本申請案提供的偶聯體化合物的藥學上可接受的溶劑、混懸劑或任意其他藥學上惰性的載劑，其不干擾偶聯體化合物的結構和性質。某些這樣的載體能夠將偶聯體化合物配製成例如片劑、丸劑、膠囊劑、液體、凝膠劑、糖漿劑、漿劑、混懸劑和軟錠劑，供對象口服攝入。某些這樣的載體能夠將偶聯體化合物製成注射、輸注或局部施用的製劑。
用於本申請案提供的藥物組合物中的藥學上可接受的載體包括但不限於，例如藥學上可接受的液體、凝膠或固體載體、水性載劑（例如，氯化鈉注射液、林格氏注射液、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液或者右旋糖和乳酸林格氏注射液）、非水性載劑（例如，植物來源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油）、抗微生物劑、等滲劑（例如，氯化鈉或右旋糖）、緩衝劑（例如，磷酸或檸檬酸緩衝劑）、抗氧劑（例如，硫酸氫鈉）、麻醉劑（例如，鹽酸普魯卡因）、混懸劑/分散劑（例如，羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮）、螯合劑（例如，EDTA（乙二胺四乙酸）或EGTA（乙二醇四乙酸））、乳化劑（例如，聚山梨醇酯80（吐溫-80））、稀釋劑、佐劑、賦形劑、或無毒性輔助物質、本領域習知的其他成分或其各種組合。適宜的成分可以包括例如填充劑、黏合劑、緩衝劑、防腐劑、潤滑劑、調味劑、增稠劑、著色劑或乳化劑。
在一些實施方式中，藥物組合物是注射製劑。注射製劑包括無菌水溶液或分散劑、混懸劑或乳劑。在所有情況下，注射製劑應該是無菌的並且應該是流體以便於注射。注射製劑應在生產和儲存條件下保持穩定，並且必須防止細菌和真菌等微生物的污染。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）及其適宜的混合物和/或植物油的溶劑或分散介質。注射製劑應保持適當的流動性。例如，可以透過使用諸如卵磷脂的包衣、透過使用表面活性劑等保持適當的流動性。可以透過各種抗細菌劑和抗真菌劑實現阻止微生物的作用，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。
在一些實施方式中，藥物組合物是口服製劑。口服製劑包括但不限於膠囊、扁膠囊、丸劑、片劑、錠劑（使用調味基質，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠）、粉劑、顆粒劑、或在水性或非水性液體中的溶液劑或混懸劑、或者作為水包油或油包水液體乳劑、或者作為酏劑或糖漿、或者作為軟錠劑（使用惰性基質，如明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯膠）和/或作為漱口劑等。
在用於口服施用的固體劑型（例如，膠囊、片劑、丸劑、糖衣丸、散劑、顆粒劑等）中，將偶聯體化合物與一種或多種藥學上可接受的載體混合，如檸檬酸鈉或磷酸氫二鈣，和/或下述中的任意一種：（1）填充劑或增量劑，例如，澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或矽酸；（2）黏合劑，例如，羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；（3）保濕劑，例如，甘油；（4）崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、海藻酸、某些矽酸鹽和碳酸鈉；（5）溶液阻滯劑，例如，石蠟；（6）吸收促進劑，例如，季銨化合物；（7）潤濕劑，例如，乙醯基醇和單硬脂酸甘油酯；（8）吸收劑，例如，高嶺土和膨潤土；（9）潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物；以及（10）著色劑。
在用於口服施用的液體劑型中，將偶聯體化合物與下述中的任意一種混合：藥學上可接受的乳劑、微乳、溶液、混懸劑、糖漿劑和酏劑。除了偶聯體化合物以外，液體劑型可以含有本領域常用的惰性稀釋劑，例如，水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑，例如，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、異丙醇、1,3-丁二醇、油（特別是，棉籽油、花生油、玉米油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨醇脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀釋劑以外，口服組合物還可以包含佐劑，例如，潤濕劑、乳化劑和混懸劑、甜味劑、調味劑、著色劑、增香劑和防腐劑。
在一些實施方式中，藥物組合物是口腔噴霧製劑或鼻噴霧製劑。噴霧製劑包括但不限於水性氣霧劑、非水性混懸劑、脂質體製劑或固體顆粒製劑等。水性氣霧劑透過將藥劑的水溶液或混懸液與常規藥學上可接受的載體和穩定劑混合製備。載體和穩定劑根據具體化合物的要求而改變，但是在通常情況下，其包括非離子表面活性劑（吐溫或聚乙二醇）、油酸、卵磷脂、胺基酸，例如，甘胺酸、緩衝溶液、鹽、糖或糖醇。氣霧劑通常由等滲溶液製備，並且能夠透過噴霧遞送。
在一些實施方式中，藥物組合物可以透過與一種或多種其他藥物混合使用。在一些實施方式中，藥物組合物包含至少一種其他藥物。在一些實施方式中，其他藥物是抗腫瘤藥、心血管藥、抗炎藥、抗病毒藥、消化系統藥、神經系統藥、呼吸系統藥、免疫系統藥、皮膚病藥、代謝藥等。
在一些實施方式中，可以透過適宜的途徑向有需要的對象施用藥物組合物，包括但不限於口服、注射（例如，靜脈、肌內、皮下、皮內、心內、鞘內、胸膜內、腹膜內注射等）、黏膜（例如，鼻內、口內施用等）、舌下、直腸、經皮、眼內和肺部施用。在一些實施方式中，藥物組合物可以靜脈內、皮下、口服、肌內或心室內施用。
由於一些有效載荷的性質，例如高毒性、高親水性，因而希望將有效載荷更特異性地和更有效地向有需要的對象遞送。例如，在癌症治療中，希望將化療劑特異性地向癌細胞遞送，而不對正常細胞產生毒性。因而，本申請案的另一個方面揭露了向有需要的對象遞送有效載荷的方法，所述方法包括向對象施用治療有效量的本申請案提供的偶聯體化合物，或其藥學上可接受的鹽，或者本申請案提供的藥物組合物。本申請案所述的有效載荷可以是研究者、獸醫、醫生或其他醫師正在尋找的在組織、系統、動物個體或人中引發生物學或醫學反應以預防、抑制、改善或治療疾病的任何藥劑。
本申請案的一個方面揭露了一種用於治療對象中的疾病的方法，所述方法包括向所述對象施用治療有效量的本申請案所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者本申請案所述的藥物組合物。
在本申請案中使用的術語「治療有效量」指的是偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽或藥物組合物在一定程度上減輕對象中疾病或病症的一種或多種症狀的量；使與疾病或病症相關或導致疾病或病症的一個或多個生理或生化參數部分或完全恢復正常的量；和/或降低疾病或病症發病的可能性的量。這種量通常根據多種因素而改變，本領域的普通技術人員根據本申請案提供的說明書的範圍能夠對其進行確定和說明。這些包括但不限於：特定對象及其年齡、體重、身高、一般身體狀況和病史、所使用的特定化合物，以及其製劑的載體和所選擇的施用途徑；以及所治療病況的性質和嚴重程度。
在一些實施方式中，偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者藥物組合物的量足以在對象中抑制疾病或病症，或者預防性地抑制或阻止疾病或病症的發病。儘管治療有效量可以在不同對象中改變，但是其範圍通常為從0.01至100 mg/kg，例如0.01至90 mg/kg、0.01至80 mg/kg、0.01至70 mg/kg、0.01至60 mg/kg、0.01至50 mg/kg、0.01至40 mg/kg、0.01至30 mg/kg、0.01至20 mg/kg、0.01至10 mg/kg、0.01至5 mg/kg、0.01至4 mg/kg、0.01至3 mg/kg、0.01至2 mg/kg、0.01至1 mg/kg、0.01至0.1 mg/kg。本申請案所述的治療有效量可以等於上述數值範圍內的任意值，包括該範圍的端點。
本申請案的另一個方面揭露了一種用於治療對象中的疾病的方法，所述方法包括向所述對象施用治療有效量的本申請案所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者本申請案所述的藥物組合物。在一些實施方式中，所述方法還包括將一種或多種治療劑與所述偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者所述藥物組合物聯合施用。
本申請案的又一個方面揭露了本申請案所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者本申請案所述的藥物組合物在用於製備治療對象中的疾病的藥物中的用途。
在本申請案中使用的術語「對象」指的是人和非人動物。非人動物包括所有的脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物。對象也可以是家畜，例如，牛、豬、羊、家禽和馬，或家養動物，例如，狗和貓。對象可以是雄性（例如，男性）或雌性（例如，女性），可以是老年，成年、青少年、兒童或嬰兒。人可以是高加索人、非洲人、亞洲人、閃族人或其他種族背景人士，或者是這些種族背景的混合。
在一些實施方式中，本申請案所述疾病選自下組：癌症、免疫性疾病、代謝疾病和神經疾病。在一些實施方式中，所述疾病的特徵在於對象中的器官或組織中的細胞高表現或異常表現細胞表面受體、細胞表面抗原或特定蛋白。在一些實施方式中，細胞表面受體選自FOLR1、TRPV6和c-Met。在一些實施方式中，細胞表面抗原選自PSMA。在一些實施方式中，特定蛋白選自核受體（例如，AR和ER）、激酶類蛋白（例如，RIPK2、BCR-ABL、EGFR、HER2、c-Met、TBK1、CDK2/4/6/9、ALK、Akt、CK2、ERK1/2、FLT3、PI3K、BTK和FAK）AKT、PAN-BET蛋白、BET蛋白（例如，BRD2、BRD3、BRD4和BRD6）、BLK、BRAF1、BCL-xl、ERRα、FKBP12、FRS2α、JAK1、JAK3、IKZF1、IRAK4、MDM2、MetAP2、PLK1、PSK-J3、RAS、TACC3、Tau、TrkB、MDM2或其任意組合物。
在一些實施方式中，癌細胞或其他生理功能異常的細胞具有本申請案提及的細胞表面受體或抗原的表現。在一些實施方式中，癌細胞或其他生理功能異常具有本申請案提及的細胞表面受體或抗原的高表現（例如，根據Depmap數據（參見https://depmap.org/portal/），相應的基因表現至少為0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10以上）。在一些實施方式中，癌細胞或其他生理功能異常細胞具有高表現，FOLR1、TRPV6、PSMA、c-Met或其任意組合。
本申請案的另一個方面揭露了一種化合物或其鹽，所述化合物具有以下結構： L a-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L b， 其中， L a為 、 或 ； EG為-CH 2CH 2O-或-OCH 2CH 2-；n 1是0～6的整數； n 2是0～8的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； B為-C(=O)-、 、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-、-C(=O)-NH-、 -CH(CH 3)-CH 2-O-、-CH 2CH 2O-、-NH-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～5的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L b為 、 、 、 、-OH或-NH-CH 2-OH； 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-、氧或 ； R 2為鍵、-O-CH 2-或-NH-CH 2CH 2-NH-C(=O)-； R 3為氫或 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基、 、 、 或 ； R 4為氫或C 1-8烷基； R 5為氫、胺基、硝基、磷酸基、-OR a或 ；其中，R a為甲烷基、乙烷基、丙烷基或異丙烷基； R 1為離去基團，較佳的R 1是鹵素（例如氯）、 或 。
在一些實施方式中，EG為-CH 2CH 2O-。在一些實施方式中，n 1是2。在一些實施方式中，n 1是0。在一些實施方式中，n 2是1。在一些實施方式中，n 2是4。在一些實施方式中，n 2是5。在一些實施方式中，n 5是0。在一些實施方式中，n 6是1。在一些實施方式中，n 6是3。在一些實施方式中，n 1是2、n 2是1、n 3-n 4是0並且L b是-OH。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu、Leu、Lys、Ala、Gly、Phe、Gln、Pro或Asn形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-、-Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Cit-、-Val-Leu-Lys、-Val-Cit-Pro-Gly-、-Gly-Asn-Asn-和-Ala-Ala-Asn-。在一些實施方式中，當n 4為1時，Q為-C(=O)-；當n 4為2時，Q分別為-O-和-C(=O)-；當n 4為3時，Q分別為-O-、-O-和鍵。在一些實施方式中，n 4為0。
在一些實施方式中，L b為 、 、 、-OH、-NH-CH 2-OH、 、 、 、 、 、 或 。
在一些實施方式中，所述化合物具有以下結構： L a-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L b其中， L a為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是2～4的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； n 2是0～5的整數； B為-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-CH 2CH 2O-、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～3的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L b為-OH、 、 或 ， 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-或 ； R 2為鍵； R 3為 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基或 ； R 4為氫； R 5為氫、-OCH 3或 ； R 1為離去基團，較佳的R 1是鹵素（例如氯）、 或 。
在一些實施方式中，L b為-OH、 、 、 、 、 或 。
在一些實施方式中，n 5為1時，n 2和n 4均為0。
在一些實施方式中，L a為 ，n 1、n 5和n 4均為0。
在一些實施方式中，L a為 ，n 2是1或2。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-和-Val-Ala-。
在一些實施方式中，所述化合物具有以下結構： L a-(EG)n 1-(CH 2)n 2-(C=O)-(AA)n 3-L b其中， L a為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是0～4的整數； n 2是0～5的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～3的整數； L b為 或-OH， 其中X為-NH-； R 2為鍵； R 4為氫； R 5為氫或-OCH 3； R 1為離去基團，較佳的R 1是鹵素（例如氯）、 或 。
在一些實施方式中，L a為 、n 1是2、n 2是1且L b是 。
在一些實施方式中，L a為 、n 1是2、n 2是1且L b是-OH。
在一些實施方式中，L a為 、n 1是0、n 2是5且L b是 。
在一些實施方式中，L a為 、n 1是0、n 2是5且L b是-OH。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-、-Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Val-Leu-Lys-和-Gly-Asn-Asn-。
在一些實施方式中，本文揭露的化合物具有選自以下組的結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ， 其中R 1為離去基團，較佳的R 1是鹵素（例如氯）或 及其衍生物。
本申請案的另一個方面揭露了一種化合物 或其鹽。
在一些實施方式中，離去基團是鹵素，例如氟、氯、溴或碘。在一些較佳的實施方式中，離去基團是氯。在一些較佳的實施方式中，離去基團是對硝基苯酚。在一些較佳的實施方式中，離去基團是五氟苯酚。
本申請案的另一個方面揭露了一種偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述偶聯體化合物具有以下結構： W a-L 1-(EG)n 1-(D)n 5- (CH 2)n 2-(B) n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L 2-W b， 其中， L 1為 、 、-S-S-或鍵； EG為-CH 2CH 2O-或-OCH 2CH 2-；n 1是0～6的整數； n 2是0～8的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； B每次出現時獨立地為為-C(=O)-、 、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-、           -C(=O)-NH-、-CH(CH 3)-CH 2-O-、-CH 2CH 2O-、-NH-C(=O)-或-NH-；n 6為0-3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～5的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L 2為 、 、 、 、-NH-CH 2-OH或鍵； 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-、氧或 ； R 2為鍵、-O-CH 2-或-NH-CH 2CH 2-NH-C(=O)-； R 3為氫或 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基、 、 、 或 ； R 4為氫或C 1-8烷基； R 5為氫、胺基、硝基、磷酸基、-OR a或 ；其中，R a為甲烷基、乙烷基、丙烷基或異丙烷基； W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
在一些實施方式中，EG為-CH 2CH 2O-。在一些實施方式中，n 1是2。在一些實施方式中，n 1是0。在一些實施方式中，n 2是1。在一些實施方式中，n 2是4。在一些實施方式中，n 2是5。在一些實施方式中，n 5是0。在一些實施方式中，n 6是1。在一些實施方式中，n 6是3。在一些實施方式中，n 1是2、n 2是1、n 3和n 4是0並且L 2是鍵。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu、Leu、Lys、Ala、Gly、Phe、Gln、Pro或Asn形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、      -Ala-Cit-、-Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Cit-、-Val-Leu-Lys-、      -Val-Cit-Pro-Gly、-Gly-Asn-Asn-和-Ala-Ala-Asn-。
在一些實施方式中，當n 4為1時，Q為-C(=O)-；當n 4為2時，Q分別為-O-和-C(=O)-；當n 4為3時，Q分別為-O-、-O-和鍵。在一些實施方式中，n 4為0。
在一些實施方式中，L 2為鍵、 、 、 、-NH-CH 2-O-、 、 、 、 、 、 或 。
在一些實施方式中，所述化合物具有以下結構： W a-L 1-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L 2-W b其中， L 1為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是2～4的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； n 2是0～5的整數； B為-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-CH 2CH 2O-、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～3的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L 2為 、 或 ， 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-或 ； R 2為鍵； R 3為 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基或 ； R 4為氫； R 5為氫、-OCH 3或 ； W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
在一些實施方式中，L 2為 、 、 、 、 或 。
在一些實施方式中，n 5為1時，n 2和n 4均為0。
在一些實施方式中，L 1為 ，n 1、n 5和n 4均為0。
在一些實施方式中，L 1為 ，n 2是1或2。
在一些實施方式中，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-和-Val-Ala-。
在一些實施方式中，所述化合物具有以下結構： W a- L 1-(EG)n 1-(CH 2)n 2-(C=O)-(AA)n 3-L 2-W b其中， L 1為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是0～4的整數； n 2是0～5的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是1～4的整數； L 2為 或鍵， 其中X為-NH-； R 2為鍵； R 4為氫； R 5為氫或-OCH 3； W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是2、n 2是1且L 2是 。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是2、n 2是1且L 2是鍵。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是0、n 2是5且L 2是 。
在一些實施方式中，L 1為 、n 1是0、n 2是5且L 2是鍵。
在一些實施方式中，本文揭露了具有選自以下組的結構的偶聯體化合物： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ， 其中W a和W b各自獨立地有效載荷或為可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
本申請案的另一個方面提供了一種偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述偶聯體化合物 ，其中W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
本申請案的另一個方面提供了一種偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述偶聯體化合物 ，其中W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
本申請案的另一個方面提供了一種蛋白降解靶向嵌合體或其藥學上可接受的鹽，所述蛋白降解靶向嵌合體化合物具有以下結構： 或者 ， 其中， Ra和Rb各自獨立地為氫、烷基、NH 2、OH、或鹵素； A每次出現時獨立地為胺基酸殘基； a為0或1； b為0～5的整數； X為 或鍵； 靶蛋白配體為 或 。
在一些實施方式中，Ra為氫。在一些實施方式中，Rb為氫。在一些實施方式中，A為Lys形成的胺基酸殘基。在一些實施方式中，a為1。在在一些實施方式中，a為0。在一些實施方式中，b為1。在一些實施方式中，b為2。在一些實施方式中，b為3。在一些實施方式中，b為4。在一些實施方式中，b為5。
在一些實施方式中，蛋白降解靶向嵌合體具有選自以下組的結構：
   、
   、
   、
   、
   和
   。
以下將透過具體實施例更詳細地描述本申請案。提供以下實施例僅用於說明目的，並且不旨在以任何方式限制本發明。本技術領域中具有通常知識者將容易地意識到可以對多種非關鍵參數進行改變或修改以產生基本上相同的結果。 實施例
以下實施例旨在更好地說明本發明，且不應理解為限制本發明的範圍。所有下述的特定組合物、材料和方法，其整體或部分，都在本發明的範圍內。這些特定的組合物、材料和方法不是為了限制本發明，而只是為說明特定的實施方式在本發明的範圍內。本技術領域中具有通常知識者可不添加進步性及不偏離本發明範圍而開發出等同的組合物、材料和方法。應理解，在對本發明的方法作出的多種改動可以仍然包含在本發明範圍內。發明人意在將這樣的變動包含在本發明的範圍內。 實施例1     偶聯體化合物的製備
1.     蛋白降解靶向嵌合體的製備
1.1 CR202CC、 CR202CF、 CR202CI、 CR202CL和 CR202CP的製備
將 CR202EC（240.0 mg，0.44 mmol，合成路徑可參考文獻J. Med. Chem. 2020, 63, 17, 9977-9989，該文獻揭露的內容透過引用的方式併入本文）加入DMF（5 mL）中，0～5℃，加入HATU（175.0 mg，0.46 mmol），DIPEA（166.0 μL，0.50 mmol），攪拌半小時後，加入 CR202EB（342.0 mg，0.42 mmol，合成路徑可參考專利WO2015/184349A2說明書第[0227]段，該文獻揭露的內容透過引用的方式併入本文），保溫反應2小時，反應完全，反應液加水（25 mL）、乙酸乙酯（25 mL）萃取，用無水硫酸鈉乾燥有機相，柱層析純化，得淡黃色固體 CR202ED14.0 mg。將 CR202ED（14.0 mg，0.01 mmol）加入甲醇（200 μL）中，0～5℃，加入3M HCl/甲醇溶液（50 μL），20～25℃下反應1小時，反應完全，乾燥得到 CR202CC13.0 mg。
透過與以上方法類似的步驟可獲得到蛋白降解靶向嵌合體 CR202CF、 CR202CI、 CR202CL和 CR202CP。
1.2 CR20274的製備
UB-180961h 的合成
專利文獻WO2021205391A1揭露了化合物UB-180961h的製備方法，該文獻揭露的內容透過引用的方式併入本文。
將 UB-180961a（20 g，71.1 mmol）溶於乾燥的DMF（80 mL）並冷卻至0℃，再加入NaH（16.8 g，107 mmol）至反應液中。半小時後，將 UB-180961b（21.1 g，107 mmol）溶於乾燥的DMF（20 mL）並滴加至反應液中，室溫反應過夜。向反應液中加入冰水（100 mL）並用EtOAc（60 mL）萃取三次，有機相合併後透過柱層析（PE/EtOAc = 0～100%）分離得到無色油狀的 UB-180961c（25g，47%回收率）。將化合物 UB-180961c（15 g，285.4 mmol）溶於水（40 mL）後加入濃HC1（10 mL）並室溫反應過夜。反應液用DCM（50 mL）萃取3次，有機相用無水硫酸鈉乾燥後，濃縮得到無色油狀的 UB-180961d（7.6 g）。
將 UB-180961d（7.8 g，68 mmol）和 UB-180961e（7.6 g，68 mmol）溶於DCE（100 mL）後室溫反應1小時，再加入NaBH(OAc) 3（29.6 g，136 mmol）繼續室溫反應過夜，向反應液中加入TEA（5 mL，sat）以及Boc 2O（6 g，23.8 mmol）後室溫反應18小時，反應液用EtOAc（15 mL）萃取2次，有機相用無水Na 2SO 4乾燥後透過柱層析分離（PE/EtOAc = 0～100%）得到黃色油狀的 UB-180961f（4.6 g，57% 回收率）。將 UB-180961f（4.6 g，15 mmol）以及A1-I（3.7 g，10 mmol）、Pd(PPh 3) 2Cl 2（701 mg，1 mmol）、Cul（190 mg，lmmol）、TEA（4.2 ml，30 mmol）溶於乾燥的DMF（120 mL）後，在80℃條件下反應過夜。反應液用EtOAc（15 mL）萃取兩次，有機相用無水Na 2SO 4乾燥後透過柱層析分離（PE/EtOAc = 0～100%）得到黃色固狀的 UB-180961g（3.6 g，57% 回收率）。
將 UB-180961g（3.6 g，33.8 mmol）、TEA（10.3 g，10.2 mmol）以及DMAP（12.4 g，10.2 mmol）溶於乾燥的DMF（140 mL）後，在0℃條件下加入TsCl（14.6 g，7.7 mmol）。反應液升至30℃後反應15小時。反應液用DCM（50 mL）萃取兩次，有機相濃縮後透過柱層析分離（PE/EtOAc = 0～100%）得到白色固狀的 UB-180961h（3.6 g，86%回收率）。 CR20274b 的合成
將 UB-180961h（48.4g，1.0 eq）溶解於DMF（484 mL，10V）中，N 2置換，加入CsF（31.2g，3 eq），加入TMSN 3（疊氮三甲基矽烷，23.7g，3 eq），內溫升至80℃，攪拌4.5小時；將反應液滴入飽和NaHCO 3水溶液（4.8 L）中，析出固體，用EA（乙酸乙酯，968 mL）將固體溶解，再用飽和食鹽水（484 mL）洗滌，有機相乾燥後濃縮得粗品，柱層析純化（DCM:MeOH=45:1）得白色固體 CR20274b（31.1g，純度：95.6%，回收率：78.7%），LCMS: [M+H] += 579.1。
CR20274d 的合成
將 CR20274b（30.8g，1.0 eq）、 CR20274c（21.7g，1.0 eq）溶於叔丁醇（900 mL，30v），加入水（45 0mL，15v）、CuSO 4（8.49g，1.0 eq）、抗壞血酸鈉（21.1g，2.0 eq），氮氣置換三次，控制25～30℃，保溫反應3.1小時，反應液中加入DCM（900 mL）和飽和食鹽水（300 mL），分液，再用DCM（900 mL）萃取一次，收集有機相，乾燥，濃縮；柱層析純化（洗脫劑：DCM/MeOH=200/1～50/1），減壓濃縮得產物 CR20274d（41.5g，回收率：78.8%）。
CR20274 的合成
將 CR20274d溶於DCM（3 mL），加入0.5 mL HCl/dioxane（4 M），室溫反應1小時。反應液濃縮後用乙醚洗（5 mL）三次，過濾得到白色固狀的 CR20274（純度98.1%，MS:[M+H] +=884.6）
1.3 CR202EE的製備
CR202EM 的合成
將 CR206EP加入DMF（5 mL）中，0～5℃，加入HATU和DIPEA，攪拌半小時後，加入 CR202EK，保溫反應2小時，反應完全，反應液加水（25 mL）、乙酸乙酯（25 mL）萃取，用無水硫酸鈉乾燥有機相，濃縮，柱層析純化，得到 CR202EL。將 CR202EL加入甲醇（200 μL）中，0～5℃，加入3M HCl/甲醇溶液（50 μL），20～25℃下反應1小時，反應完全，濃縮得到 CR202EM。
CR202EN 合成
將 CR206GT加入DMF（5 mL）中，0～5℃，加入HATU和DIPEA，攪拌半小時後，加入 CR202EM，保溫反應2小時，反應完全，反應液加水（25 mL）、乙酸乙酯（25 mL）萃取，用無水硫酸鈉乾燥有機相，濃縮，柱層析純化，得到 CR202EN 。
CR202EE 合成
將 CR205EN（320.0 mg，0.23 mmol）加入20%呱啶/DMF溶液（3.0mL），室溫反應1小時，反應完全，加水（15 mL），二氯甲烷（15 mL）萃取，濃縮，柱層析純化，得 CR202EE181.0 mg。
1.4 CR202Z5、 CR202ES、 CR202Z7、 CR202Z8、 CR202Z9、 CR202Z1、 CR202Z2、 CR202Z3、 CR202Z4、 CR202Y2和 CR202Y4（來源：MCE，目錄號：HY-114312）的合成
CR202Z5的合成路徑可參考文獻（Communications Biology, (2018) 1:100）中ARCC-4的合成。 CR202ES的合成路徑可參考文獻（PNAS, 113 (26) 7124-7129）中ARV-771的合成。 CR202Z7的合成路徑可參考文獻（J. Med. Chem. 2019, 62, 3, 1420–1442）中ERD-308的合成。 CR202Z8的合成路徑可參考文獻（ChemMedChem, 2020, 15, 17-25）中GNE-987的合成。 CR202Z9的合成路徑可參考文獻（J. Med. Chem. 2019, 62, 2, 941–964）中ARD-69的合成。 CR202Z1的合成路徑可參考專利（CN 111892577 A）中ARV-110的合成。 CR202Z2的合成路徑可參考專利（US 2021/0139458 A1）中ARV-471的合成。 CR202Z3的合成路徑可參考文獻（Chemistry & Biology, 2015, 22, 755–763）中ARV-825的合成。 CR202Z4的合成路徑可參考文獻（ACS Med Chem Lett. 2019, 11, 1855-1862）中FC-11的合成。 CR202Y2的合成路徑可參考文獻（Cancer Res. 2019, 79, 251–262）中MD-224的合成路徑。 CR202Y4購買獲得（MCE，目錄號：HY-114312）。這些文獻揭露的全部內容透過引用的方式併入本文。
2.     靶向分子的製備
2.1 L-01、 L-02和 L-04的合成 （L-01）
利用Fmoc化學胺基樹脂固相合成靶向TRPV6和葉酸受體的靶向L-01。將樹脂裝載於固相反應柱中，加入DMF，氮氣鼓泡至溶劑中，使樹脂溶脹30分鐘。加入Fmoc-Arg-OH、DCC（二環己基碳二亞胺）和DMAP，在25℃下反應3小時，後用醋酸酐和吡啶封端1小時，再用DMF洗滌3次，用DBLK脫除樹脂上的Fmoc保護基團，再用DMF洗滌5次。稱取Fmoc-Pro-OH和HOBt，用DMF溶解，0℃冰水浴下向上述溶液中加入DIC，混合使其活化5分鐘。將該溶液加入上述反應柱中，反應3小時後，抽乾溶劑，洗滌反應柱中的樹脂3遍，隨後用DBLK脫除Fmoc保護基團。重複上述操作，按照結構依次偶聯Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu-OtBu以及蝶酸，以獲得肽樹脂。用裂解液裂解肽樹脂後，過濾，收集裂解液倒入MTBE中，析出固體，用MTBE洗滌，得到粗品，粗品經Pre-HPLC製備得到L-01。
透過與以上方法類似的步驟可獲得到 L-02 和 L-04 （L-02） （L-04）
2.2 L-03的合成 CR211D6的結構： 製備流程：
CR211D6合成參見（Nature Medicine, 2015, 21, 955–961）。該文獻揭露的全部內容透過引用的方式併入本文。
將 CR194PF（150.0 mg，145.9 μmol）加入DMF（3.0 mL）中，氮氣保護，避光，溶解，室溫（25.5℃）下攪拌，向反應液中依次加入HOSu（25.2 mg，219.0 μmol）、EDCI（42.0 mg，219.0 μmol），滴加DIPEA調節至pH=8，室溫反應1小時，補加EDCI（42.0 mg，219.0 μmol），繼續反應1小時，將反應液滴加入MTBE（30.0 mL）中，倒去清液，殘留物用MTBE洗滌（5.0 mL×2），20℃，真空乾燥得黃色油狀物，加DMF（1.0 mL）溶解所得的黃色油狀物（即獲得 CR194PF活化酯溶液），待用。
將 CR211D6（284.0 mg，102.13 μmol）加入DMF/水（2.0 mL/1.0 mL）中溶解，避光，氮氣保護，室溫（25.9℃）下攪拌，滴加DIPEA調節至pH=8，滴加 CR194PF活化酯溶液，室溫反應1小時，反應液反向製備液相純化，凍乾得 CR194PV（50.0 mg）。
將 CR194PV（56.2 mg，14.8 μmmol）加入TFA/DCM（1.4 mL/1.4 mL）中，避光，氮氣保護，室溫（22.7℃）下攪拌1小時，加入MTBE（10.0 mL）稀釋，氮氣吹乾，殘留物用MTBE（5.0 mL）洗滌，氮氣吹乾得 L-03。
2.3 L-05的合成 （L-05） 製備流程：
將 SM1（Fmoc-L-Pra-OH，20.00 g，60 mmol）溶於DMF（150 mL）。氮氣置換三次，反應液溫度降至-8℃，加入HATU（27.40 g，72 mmol，1.2 eq）和 SM2（7.56 g，72mmol），稱取DIEA（15.50 g，120 mmol）溶於DMF（10 mL）中，滴加到體系中，反應液在0℃攪拌1小時。HPLC中控監測原料SM1基本反應完全。將反應液加入到乙酸乙酯（250 mL）和水（800mL）中，萃取分層，水相再用適量EA萃取2次，合併有機相，用適量無水硫酸鈉乾燥1小時。過濾減壓濃縮，乾燥後，柱層析純化（DCM:MeOH=100:1），得到白色固體 CR202HY（26.51g,純度:98.51%,回收率:100%），[M+H] +=423.4。 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.81 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.64 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.45 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 6.94 (s, 1H), 5.76 (s, 1H), 4.49 (dd, J = 18.1, 11.0 Hz, 2H), 4.26 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.86 – 3.69 (m,2H), 3.66 – 3.44 (m, 6H), 2.66 (dd, J = 71.1, 60.5 Hz, 4H)。
氮氣保護下將 SM3（13.58 g，96 mmol，1.6 eq）加入到無水DCM (600 mL)中，反應液溫度降至0℃，緩慢滴加 CR202HY（25.80 g，60 mmol）的DCM（200mL）溶液，在10℃下反應30分鐘，用氨水乙腈取樣淬滅，HPLC中控至完全反應完畢；加入三乙胺（18.22 g，180mmol），測pH=8，最後在5℃下滴加溶於DCM（10 mL）中的 SM2（9.47 g，90 mmol）溶液，滴加完畢後，反應在10℃攪拌30分鐘，HPLC中控監測基本反應完全。將反應液加入到二氯甲烷（500 mL）和水（200 mL）中，萃取分層，水相再用150 mL二氯甲烷萃取2次，合併有機相，用適量無水硫酸鈉乾燥1小時。過濾減壓濃縮乾後柱層析純化（DCM:EA=1:1，加1%甲醇和0.5%醋酸），濃縮得到泡泡狀固體 CR202HZ（24.00 g，純度：95.82 %，回收率：63.3%），[M+H] +=633.14。
類似於由 CR202HY製備 CR202HZ的方法，製備獲得得到 CR202JA。
將 CR202JA（6.15 g，7.29mmol）溶於DMF（100 mL）中。氮氣置換三次，反應液溫度降至零下5℃，滴加DBU（2.10 g，13.68 mmol）。滴加完畢後，反應液在15℃下攪拌1～4小時，HPLC中控監測基本反應完全。加入 CR21532的DMSO溶液（3.63 g，7.29 mmol，用80ml DMSO提前溶清），再加入HATU（4.99 g，13.12 mmol），15℃反應30分鐘，HPLC中控監測至基本反應完全。停止反應，對所得粗產物進行純化（乙腈/0.1%TFA-H 2O），凍乾得到黃棕色固體 CR202JF（2.55 g，純度：83.16%，回收率：31.87%），[M+H] +=1100.9。
將 CR202JF（1.26 g，1.14mmol）溶於無水DMF（15mL）中，加入球狀分子篩，乾燥30分鐘，過濾，將濾液轉移至250 mL夾套瓶中，加入無水TEA（0.92 g，9.12 mmol，pH=8～9），氮氣置換三次，在25℃下，加入二（對硝基苯）碳酸酯（NPC，0.6859 g，2.3mmol），磁力攪拌8～10小時，停止反應。加入200 mL MTBE析出固體，離心得黃色固體 CR202JL（1.28 g，純度：60.86%，回收率：87.50%），[M+H] +=1265.52。
將 CR202JL（600.0 mg，0.474 mmol）溶於DMF（40 mL），加入 CR211D6（1039.5 mg，0.474 mmol），HOBT（115.5 mg，0.711 mmol），氮氣置換三次，加入DIEA（125.9 mg，0.948mmol），控制反應液溫度為25℃，磁力攪拌3～5小時，HPLC中控監測反應完全。停止反應，加入300 mL MTBE析出固體，攪拌10分鐘，離心得黃色固體 CR202JM（1.26 g，純度：60.41%，回收率：68.11%），[M4+H] +=978.09。
在100 mL夾套瓶中，加入40% TFA/DCM（40 mL），冷卻至零下10℃，氮氣保護下加入 CR202JM（1.26 g，0.317 mmol），緩慢升溫至18℃，攪拌2～3小時，HPLC中控監測反應完全。停止反應，將反應液加入冷的300 mL MTBE中析出固體，攪拌10分鐘，離心得粗品，製備純化，凍乾得到黃色固體 CR202JN（即 L-05，160.9 mg，純度：90.87%，回收率：26.67%），[M/3+H]+=1285.5。
3.     連接子的製備
連接子 CR20501的合成路徑可參考文獻 J. Med. Chem. 2018, 61, 989-1000。 CR19206的合成路徑可參考文獻 Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1860。這些文獻揭露的全部內容透過引用的方式併入本文。可以透過上述類似的方法合成本文中的其他連接子化合物。
本發明連接子中的多肽部分可參考靶向分子中的固相合成方法製備得到。
4.    偶聯體化合物的製備
4.1 CR202F0的製備
控溫0～10℃且在氮氣保護的條件下，將 CR202F4（13.5 mg，0.077 mmol）、HATU（29.3 mg，0.077 mmol）和DIPEA（10.0 mg，0.077 mmol）依次加入DCM（1.0 mL）中，磁力攪拌0.5小時，加入游離態 CR20274（45.5 mg，0.05 mmol），磁力攪拌溶解，氮氣保護，20～25℃反應4小時，HPLC中控至反應完全。反應液加入冰水（10.0 mL）和DCM（10.0 mL）萃取分層，有機相依次用飽和檸檬酸（10.0 mL）、飽和碳酸氫鈉（10.0 mL）和飽和食鹽水（10.0 mL）洗滌，無水硫酸鈉乾燥得到黃色固體56.0 mg（含 CR202F5）。粗品直接用於下一步反應。
將含 CR202F5的粗品（56.0 mg，0.0054 mmol）加入DCM（2.0 mL）中，磁力攪拌溶解，氮氣保護，控溫0～10℃，滴加TFA（0.5 mL），保溫反應1小時，HPLC中控至反應完全。反應液濃縮，加入DCM（10.0 mL）和飽和碳酸氫鈉（2.0 mL），萃取分層，水相再用DCM（5.0 mL×2）萃取，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥得到土灰色固體49.7 mg（含 CR202F6）。
控溫0～10℃且在氮氣保護的條件下，將 CR19424（29.9 mg，0.063 mmol）、HATU（24.1 mg，0.063 mmol）和DIPEA（8.2 mg，0.063 mmol）依次加入DMF（2.0 mL）中，磁力攪拌0.5小時，加入游離態 CR202F6（39.7 mg，0.042 mmol），磁力攪拌溶解，氮氣保護，20～25℃下反應1小時，HPLC中控至反應完全。反應液使用製備液相純化。凍乾得白色固體21.1 mg（含 CR202E9）。
控溫20～25℃、避光且在氮氣保護的情況下，將 CR202E9（17.0 mg，0.012 mmol）和 CR19208（27.8 mg，0.018 mmol）加入DMF（2.5 mL）中，磁力攪拌，滴加DIPEA調節至pH=8，保溫反應1小時，HPLC中控至反應完全，反應液使用製備液相純化。凍乾得白色固體15.1 mg（ CR202F0）。MS：[M+4H] 4+/4=730.58。
4.2 CR202F2的製備
控溫0～10℃，且在氮氣保護的條件下，將 CR194H8（167.9 mg，0.068 mmol）、HATU（25.8 mg，0.068 mmol）和DIPEA（13.2 mg，0.10 mmol）依次加入DMF（0.6 mL）中，磁力攪拌0.5小時，加入游離態 CR20274（30.0 mg，0.034 mmol），磁力攪拌溶解，氮氣保護，25℃下反應2小時，HPLC中控至反應完全。反應加入DMF（2 mL），避光，15～25℃下加入 CR19208（155.2 mg，0.10 mmol），攪拌溶解，滴加DIPEA至pH=8，反應1.5小時，HPLC中控至反應完全。反應液使用製備液相純化。凍乾得 CR202F2（25.5 mg）。MS：[M+4H] 4+/4=658.78
4.3 CR20293、 CR202CE、 CR202CH、 CR202CK、 CR202CN、 CR202CR、 CR20214、 CR20282、 CR20285、 CR20287、 CR20295和 CR20297的製備
採用與 CR19206的類似方法，製備得到 CR20502。
將 CR20274（151.3 mg，0.171 mmol）、 CR20502（277.3 mg，0.353 mmol）和HOBt（5.7 mg，0.042 mmol）依次加入DMF（3.0 mL）中，磁力攪拌溶解，氮氣保護，25℃下反應24小時，HPLC中控至反應完全。反應加入DMF（6 mL），避光，15～25℃下加入 CR19208（775.0 mg，0.509 mmol），攪拌溶解，滴加DIPEA至pH=8，反應2小時，取樣20 μL加乙腈/水（400 μL）稀釋，HPLC中控至反應完全。反應液使用製備液相純化。得到 CR20293（175.2 mg，純度：95.85%，回收率：33.7%）。
採用與製備CR20293類似的方法，製備其它偶聯體化合物CR202CE、CR202CH、CR202CK、CR202CN、CR202CR、CR20214、CR20282、CR20285、CR20287、CR20295和CR20297。
4.4 CR202EZ的合成
將 L-03 （ CR194PW ）粗品溶解於DMF/水（2.0 mL/0.7 mL）中，再加入 CR202X7（21.8 mg，14.8 μmol）溶解，避光，氮氣保護，室溫（25.9℃）下攪拌，滴加DIPEA調節至pH=8，加入溴化亞銅（2.1 mg，14.8 μmol），室溫反應1小時，反應液反向製備液相純化，凍乾得 CR202EZ（5.0 mg，回收率：6.7%）。[M+5H] 5+/5=1040.06。
4.5 CR202W5、 CR202W6和 CR202W9的合成
向25 mL單口夾套瓶R1中加入 CR202Z5（100.0 mg, 97.7 μmol）、DCM（2 mL）和4A分子篩（200.0 mg），降溫至0 °C，加入三乙胺（34.5 mg, 342.0 μmol），攪拌2小時。0 °C下滴加三光氣（14.5 mg，48.9 μmol）的DCM（0.1mL）溶液，保溫反應5分鐘。同時，向25mL單口夾套瓶R2中加入DMF（0.5 mL）、 CR202FG（54 mg，97.7 μmol）、DMAP（12 mg，97.7 μmol）和TEA（10mg，97.7 μmol），在R2中攪拌溶解，加入4A分子篩（0.1 g），降溫至0 °C。氮氣保護下，將R1中的混合物滴加至R2中，並保溫攪拌反應0.5小時，至反應完全。向R2加入水（1 mL）淬滅反應，反應液反向液相製備純化，得到 CR202GN（白色粉末，m=90mg，純度：91.4%，回收率：58.4%），LCMS：[M+2] 2+/2=800.9 。
將 CR202GN（75 mg，46.9 μmol）和 L-04 （ CR202W4 ）（106.5 mg，70.3 μmol）用DMF（4.5 mL）和水（1.5mL）在避光的條件下溶解，維持氮氣保護，加入DIPEA調節體系pH=8，加入CuBr（6.7 mg，46.9 μmol），HPLC中控至反應完全。反應液用反向液相製備純化，得到 CR202W5（白色粉末，70.0 mg，純度：100%，回收率：47.9%），LCMS：[M-3H] 3-/3=1037.0。
同理，採用類似的方法合成 CR202W6和 CR202W9。
4.6 CR202X1和 CR202W7的合成
將 CR202Z2（100.0 mg，138.0 μmol）和DMAP（20.0 mg，166.0 μmol）加入DMF（3.6 mL）中，氮氣保護，零下10℃下攪拌，依次加入三氟甲磺酸鈧（18.0 mg，41.4 μmol）、DIPEA（18.0 mg，138.0 μmol）和 CR202X6（129.0 mg，179.2 μmol），用DMF溶液（1.0 mL）溶解，保溫反應48小時，反應液用反向製備液相純化，得 CR202EQ（140.0 mg，回收率：78.2%）白色固體，[M+H] +=1300.5。
CR202X1合成參見 CR202W5的合成。
同理，採用類似的方法合成 CR202W7。
4.7 CR202W8的合成
將 CR202Z8（30 mg，27.4 μmol）和NPC（67 mg，220 μmol）用DMF（0.3 mL）溶解，磁力攪拌，保持氮氣保護。加入DIEA（7.1 mg，54.9 μmol），25 ℃下攪拌15小時。加入 CR202GF（45 mg，81.7 μmol）、DMAP（4 mg，32.7 μmol）和DIEA（7.1 mg，54.9 μmol），25 ℃下攪拌16小時，取樣中控至反應完全。製備純化得到白色固體 CR202ER（29 mg，純度：98.24%，回收率：63%）。LCMS: [M+2H] 2+/2 = 837.5
將 CR202ER（50 mg，29.9 μmol）和 CR202W4（54 mg，35.6 μmol）用DMF（2.5 mL）和水（0.8 mL）在避光條件下溶解，磁力攪拌，維持氮氣保護。加入DIEA（130 μL）調節至pH=8後，加入CuBr（4.3 mg，29.9 μmol），25℃下反應1小時，取樣中控至反應完全。反應液用製備液相純化。得 CR202W8（33 mg，回收率：41%）。LCMS: [M+3H] 3+/3 = 1063.1。
4.8 CR202V4的合成
將 CR202FT（6.73 g，15.81 mmol）溶於DMF（50 mL）中，磁力攪拌溶解。反應液溫度降至0℃，加入HATU（6.61 g，17.39 mmol），反應液在0℃下攪拌10分鐘。加入 CR19154（6.00 g，15.8 mmol），稱取DIEA（2.25 g，17.39 mmol）溶於DMF（10 mL）中，滴加到體系中，反應液在0℃下攪拌1小時。監測原料反應完全。將反應液加入到乙酸乙酯（180 mL）中，攪拌0.5小時。離心，用乙酸乙酯洗三次，離心，放至烘箱過夜（35℃）。得到 CR202FQ（11.93 g，純度：80%，回收率：76.7%）黃色固體。[M+H] +=787.47。
將 CR202FQ（6.5 g，8.26 mmol）溶於甲醇（70 mL）中，磁力攪拌溶解。加入20%呱啶DMF溶液（12.3 g，28.91 mmol），反應液在50℃下攪拌過夜。LCMS監測原料反應完全。將甲醇旋乾，用乙酸乙酯帶兩次（50 mL×2），旋至剩約15 mL，加入甲基叔丁基醚（200 mL），有白色固體析出，過濾，濾餅甲基叔丁基醚淋洗（20 mL×2），真空乾燥，得到 CR202FR（4.09 g，純度：91%，回收率：79.8%）乳白色固體。
將 CR194Z0（1.51 g，7.97 mmol）溶於DMF（30 mL）中，磁力攪拌溶解。反應液溫度降至0℃，加入HATU（3.03 g，7.97 mmol），反應液在0℃下攪拌10分鐘。加入 CR202FR（4.09 g，7.24 mmol），稱取DIEA（1.03 g，7.97 mmol）溶於DMF（10 mL）中，滴加到體系中，反應液在0℃下攪拌1小時。LCMS監測原料反應完全。將反應液加入到乙酸乙酯（150 mL）中，攪拌過夜。析出固體，將固體離心，用甲基叔丁基醚洗一次，烘乾得到 CR202FS（3.7 g，純度：79.6%，回收率：69.5%）淡黃色固體，[M+H] +=736.51。
將 CR202FS（1.7 g，2.3103 mmol）溶於DMF（20 mL）中，磁力攪拌溶解。加入NPC（1.4 g，4.6206 mmol）和DIEA（447.9 mg，3.4655 mmol），反應液在室溫攪拌1小時。用反向製備液相純化，得到 CR202X4（1.77 g，純度：99.28%，回收率：85.04%）白色固體。 1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.16 (s, 1H), 8.38-8.30 (m, 2H), 8.25 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.96 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 7.75 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 7.68 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 7.64-7.55 (m, 2H), 7.44 (d, J= 8.6 Hz, 2H), 6.06 (s, 0H), 5.27 (s, 2H), 4.51-4.37 (m, 3H), 4.24 (dd, J= 8.4, 6.9 Hz, 1H), 3.96 (s, 2H), 3.70-3.58 (m, 6H), 3.49-3.39 (m, 2H), 3.03 (ddd, J= 38.8, 13.1, 6.5 Hz, 2H), 2.29-2.19 (m, 2H), 1.98 (ddd, J= 20.3, 12.7, 6.0 Hz, 2H), 1.85-1.67 (m, 2H), 1.55 (ddd, J= 21.1, 11.2, 5.0 Hz, 2H), 1.41 (s, 10H), 0.87 (dd, J= 14.8, 6.8 Hz, 6H)，[M+H] +=901.46。
游離 CR20274：將CR20274鹽酸鹽（902.8 mg，0.94 mmol）加入DCM（50.0 mL）和甲醇（10.0 mL）中，磁力攪拌至固體完全溶解。在5～10℃下，滴加10%碳酸氫鈉水溶液（20 mL），攪拌30分鐘，反應液中加入DCM（50 mL）、甲醇（5 mL）和水（20 mL），萃取（乳化層較厚），水相加入DCM/甲醇混合溶液萃取2遍，每遍加入DCM（50 mL）和甲醇（5 mL）。合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，30℃真空濃縮乾。得到游離態 CR20274（910.4 mg，純度：92.04%，回收率：100.0%）固體，直接用於後續步驟，未純化。
將游離態 CR20274（60.0 mg，0.068 mmol）、 CR202X4（150.1 mg，0.170 mmol）和HOBt（1.8 mg，0.014 mmol）依次加入DMF（1.5 mL）中，磁力攪拌溶解，氮氣保護，25℃下反應24小時，補加DIPEA（12 μL，0.068 mmol），繼續反應20小時，用HPLC中控至反應完全，反應液直接製備純化，得 CR202AW（64.9 mg，純度：92.96%，回收率：43.6%）。[M+2H] +/2=823.8。
將 CR202AW（50.0 mg，0.03mmol）加入DCM（2.0 mL）中，氮氣保護，控制外溫15℃，滴加TFA（0.2 mL），保溫反應3小時，用HPLC中控至反應完全，控制外溫10℃，滴加飽和NaHCO 3調節至pH=7～8，濃縮除去DCM，有少量固體析出，加入乙腈（4 mL）溶解，反向製備液相純化，得 CR202X5（20.6 mg，純度：84.20%，回收率：42.9%）。
在25 mL夾套中，將 CR202X5（16.0 mg，10.1 μmol）和 CR202W4（18.3 mg，12.1 μmol）用DMF（1 mL）和水（0.3 mL）在避光條件下溶解，磁力攪拌，氮氣保護。加入DIEA（250 μL）調節pH=8後，加入CuBr（1.5 mg，1.0 eq.），25℃下反應2小時。反應液用製備液相純化。得 CR202V4（5.7 mg，純度：92.26%，回收率：13.9%），[M+3H] 3+/3=1035.98。
4.9 CR202V5、 CR202V6、 CR202Z6和 CR202V7的合成
將 CR202Z0（3.00 g，15.81 mmol）、HATU（6.01 g，15.81 mmol）、DIPEA（2.73 g，21.08 mmol）和 CR19154（4.00 g，10.54 mmol）依次加入DMF（40 ml）中，氮氣保護，控制溫度25℃下反應2小時，用HPLC中控至反應完全，反應液直接用反向製備液相純化，得 CR202FG（1.88 g，回收率：43.2%），[M+H] +=551.31。
將 CR202FG（1.48 g，2.68 mmol）和NPC（1.63 g，5.36 mmol）加入DMF（7.5 ml），滴入DIEA（519.7 mg，4.02 mmol），氮氣保護，磁攪攪拌反應2小時，HPLC中控至反應完全，反應液直接用反向製備液相純化，得 CR202X6（2.07g，純度：100.0%，回收率：100%）。 1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.17 (s, 1H), 8.40 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 8.34 (d, J= 9.1 Hz, 3H), 7.68 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 7.63-7.57 (m, 2H), 7.49 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 7.44 (d, J= 8.5 Hz, 3H), 6.04 (s, 1H), 5.27 (s, 2H), 4.42 (d, J= 5.3 Hz, 1H), 4.35 (dd, J= 8.8, 6.6 Hz, 1H), 3.99 (s, 2H), 3.73-3.58 (m, 8H), 3.43 (t, J= 4.9 Hz, 2H), 3.02 (d, J= 21.0 Hz, 2H), 2.03 (dd, J= 13.4, 6.7 Hz, 1H), 1.79-1.54 (m, 2H), 1.42 (dd, J= 21.6, 14.8 Hz, 2H), 0.91 (d, J= 6.7 Hz, 3H), 0.85 (d, J= 6.7 Hz, 3H)，[M+H] +=716.30。
CR20274游離：將CR20274鹽酸鹽（902.8 mg，0.94 mmol）加入DCM（50.0 mL）和甲醇（10.0 mL）中，磁力攪拌至固體完全溶解。5～10℃下，滴加10%碳酸氫鈉水溶液（20 mL），攪拌30分鐘，反應液中加入DCM（50 mL）、甲醇（5 mL）和水（20 mL），萃取（乳化層較厚），水相加入DCM/甲醇混合溶液萃取2遍，每遍加入DCM（50 mL）和甲醇（5 mL）。合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，30℃真空濃縮得到 CR20274固體（910.4 mg，回收率：100.0%，純度：92.04%），直接用於後續步驟，未純化。
將游離態 CR20274（200.0 mg，0.23 mmol）、 CR202X6（404.7 mg，0.57 mmol）和HOBt（6.1mg，0.045mmol）依次加入DMF（5.0 mL）中，磁力攪拌溶解，氮氣保護，25℃下反應24小時，HPLC中控至反應完全，反應液直接用反向製備液相純化，得到 CR202X7（134.0 mg，純度：98.32%，回收率：40.6%），[M+2H] 2+=730.99。
將 CR202X7（130.0 mg，0.089 mmol）和 CR202W4（161.8 mg，0.107 mmol）用DMF（7.8 mL）和水（2.6 mL）在避光條件下溶解，磁力攪拌，氮氣保護。加入DIEA（250 μL）調節pH=8後，加入CuBr（12.7 mg，0.089 mmol），25℃下反應2小時中控至反應完全。反應液用反向製備液相純化。得 CR202V5（76.6 mg，純度：95.70%，回收率：28.9%），MS：[M+4H] 4+/4=745.02。
同理，採用類似的方法合成CR202V6、CR202Z6和CR202V7。
4.10 CR202V8的合成
CR202AS的合成 樹脂溶脹：稱取2-CTC樹脂（50.00 g，32.5 mmol），加入無水DCM（500 mL），開啟機械攪拌（120轉/分鐘），氮氣保護，25℃下樹脂溶脹30分鐘。 胺基酸偶聯：加入Fmoc-Lys(boc)-OH（45.68 g，97.5 mmol）和DIEA（21.00 g，162.5 mmol），繼續反應3小時。 樹脂封端：反應液轉入固相合成反應釜中，抽乾反應液，用DMF反復洗滌樹脂三遍（500 mL×3），然後加入DMF（500 mL），氮氣鼓吹，最後加入甲醇（10.41 g，325 mmol）和DIEA（12.60 g，97.5 mmol），25℃下反應1小時。抽乾反應液，DMF洗滌樹脂5遍（500 mL×5）。 脫保護：加入20%呱啶溶液（500 mL），氮氣鼓吹，25℃下反應20分鐘，取出幾粒樹脂用乙醇洗滌三遍後加入茚三酮顯色劑，110℃下加熱2分鐘，樹脂顯紫色，反應結束。抽乾反應液，DMF洗滌樹脂5遍（500 mL×5）。 胺基酸偶聯：稱取Fmoc-Leu-OH（17.33 g，48.8 mmol）和HOBT（6.59 g，48.8 mmol），加入DMF（250 ml），磁力攪拌溶解後加入DIC（6.15 g，48.98 mmol），攪拌3分鐘後加入反應釜中，25℃下反應1小時。取樹脂檢測，加熱顯色呈白色，反應結束。抽乾反應液，DMF洗滌樹脂3遍（500 ml×3）。按照順序再依次將Fmoc-Val-OH和N 3-PEG 2-CH 2-COOH與樹脂進行偶聯。 樹脂收縮：DCM洗滌樹脂兩遍（500 mL×2)，MeOH收縮樹脂，乾燥後稱重得樹脂66.00 g。 裂解：將22.00 g樹脂加入240 mL配置好的裂解液（72 mL三氟乙醇用DCM稀釋至240 mL），開啟機械攪拌，氮氣保護，25℃下反應3小時。 後處理：抽濾除去樹脂，少量二氯甲烷洗滌樹脂一遍，將濾液直接濃縮乾，得到8.08 g油狀液體 CR202AS，保存在零下20℃環境下產物固化，HPLC：91.08%，回收率：118.0%，超重原因分析：產物中有三氟乙醇殘留。
CR202AY的合成
將 CR202AS（3.51 g，5.6 mmol）和HATU（2.97 g，7.8 mmol）依次加入DMF（33 mL）、EA（乙酸乙酯，18 mL）和水（3.5 mL）的混合溶劑中，磁力攪拌，氮氣保護，降溫至0℃，依次滴加對胺基苄醇溶液（1.03 g，8.4 mmol，用EA（7 mL）和DMF（1.8 mL）溶解）和DIEA溶液（1.3 mL，7.8 mmol，用EA（7 mL）溶解），0℃下反應1小時，HPLC中控至反應完全，反應液加入到純化水（200 mL）中，EA萃取（100 mL×3），合併有機相，依次用純化水（100 mL）和飽和食鹽水（100 mL）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，濃縮有機相，得黃色油狀液體 CR202AY（4.1466 g，HPLC：86.48%，回收率：96.5%）。
CR202CU 合成
將 CR202AY（2.0783 g，2.8 mmol）和二對硝基苯碳酸脂（1.5486 g，5.1 mmol）加入DCM（30 ml）中，磁力攪拌至溶解，加入DIEA（0.93 ml，5.7 mmol），氮氣保護，25℃下反應3小時。HPLC中控至反應完全，25℃下濃縮，反應液用製備液相純化，得 CR202Z1（1.3924 g，HPLC：95.00%，回收率：52.8%）白色固體。
CR202AZ合成
將 CR20274（150 mg，0.17 mmol）和 CR202CU（275.0 mg，0.31 mmol）加入DMF（3.0 ml）中，磁力攪拌至溶解。加入HOBT（4.6 mg，0.034 mmol）和DIEA（40 mg，0.26 mmol，1.5eq），氮氣保護，25℃下反應18小時。HPLC中控至反應完全，反應液用製備液相純化。得白色固體 CR202AZ（170.0 mg，HPLC：98.89%，回收率：60.9%），[M+2H] 2+/2=823.46。
CR202BA合成
將 CR202AZ（170.0 mg，0.10 mmol）加入DCM（4.0 mL）中，氮氣保護，控制外溫15℃，滴加TFA（0.4 mL），保溫反應2.5小時，HPLC中控至反應完全。控制外溫0℃，滴加飽和碳酸氫鈉溶液調節至pH=7～8。15℃下濃縮除去DCM，殘留物加乙腈（10 mL）溶解，反應液用製備液相純化。得 CR202BA（34.0 mg，HPLC：89.36%，回收率：21.4%）白色固體，[M+2H] 2+/2=773.3。
CR202V8合成
將 CR202BA（55.0 mg，0.036 mmol）和 CR202W4（64.7 mg，0.43 mmol）用DMF（4.0 mL）和水（1.3 mL）在避光條件想溶解，維持氮氣保護，磁力攪拌至溶解。加入DIEA調節至pH=8，加入CuBr（5.1 mg，0.036 mmol），25℃下反應2小時，取樣中控反應完全。反應液用製備液相純化。除鹽，得 CR202V8（22.5 mg，純度：95.03%，回收率：20.8%），[M+3H] 3+/3=1020.48。
4.11 CR202V9的合成
CR202AU合成 樹脂溶脹：稱取2-CTC樹脂（50.00 g，32.5 mmol），加入無水DCM（500 mL），開啟機械攪拌，氮氣保護，25℃樹脂溶脹30分鐘。 胺基酸偶聯：加入Fmoc-Asn(trt)-OH（58.18 g，97.5 mmol）和DIEA（21.00 g，162.5 mmol），繼續反應3小時。 樹脂封端：反應液轉入固相合成反應釜中，抽乾反應液，用DMF反復洗滌樹脂三遍（500 mL×3），然後加入DMF（500 mL），氮氣鼓吹，最後加入甲醇（10.41 g，325 mmol），DIEA（12.60 g，97.5 mmol），25℃下反應1小時。抽乾反應液，DMF洗滌樹脂5遍（500 mL×5）。 脫保護：加入20%呱啶溶液（500 mL），氮氣鼓吹，25℃下反應20分鐘，取出幾粒樹脂用乙醇洗滌三遍後加入茚三酮顯色劑，110℃下加熱2分鐘，樹脂顯紫色，反應結束。抽乾反應液，DMF洗滌樹脂5遍（500 mL×5）。 胺基酸偶聯：稱取Fmoc-Asn(trt)-OH（17.33 g，48.8 mmol）和HOBT（6.59 g，48.8 mmol），加入DMF（250 mL），磁力攪拌溶解後加入DIC（6.15 g，48.98 mmol），攪拌3分鐘後加入反應釜中，25℃下反應1小時。取樹脂檢測，加熱顯色呈白色，反應結束。抽乾反應液，DMF洗滌樹脂3遍（500 mL×3）。按照順序再依次將Fmoc-Gly-OH和N 3-PEG 2-CH 2-COOH與樹脂進行偶聯。 樹脂收縮：DCM洗滌樹脂兩遍（500 mL×2），MeOH收縮樹脂，乾燥後稱重得樹脂96.42 g。 裂解：32.14 g樹脂，在5℃下加入配置好的裂解液中（300 mL，DCM:TFA:Tis=4.9:4.9:0.2），開啟機械攪拌，氮氣保護，25℃下反應3小時。 後處理：抽濾除去樹脂，少量二氯甲烷洗滌樹脂一遍，將濾液直接濃縮除去DCM後加入600 mL預冷的MTBE中，析出白色固體，攪拌10分鐘，過濾，MTBE洗滌固體2遍（100 mL×2），乾燥得5.21 g白色固體CR202AU（HPLC：92.71%，回收率：101.6%），推測超重原因：產物中有TFA殘留。
CR202AV合成
將 CR202AU（2.50 g，5.3 mmol）和對胺基苄醇（0.54 g，4.4 mmol）加入DMF（12 mL）中，磁力攪拌至溶解澄清，加入HATU（2.51 g，6.6 mmol）和DIEA（2.20 ml，13.2 mmol），25℃下反應1.5小時。HPLC中控至反應完全，將反應液加入到預冷的MTBE（60 mL）中，析出白色固體，磁力攪拌10分鐘過濾，MTBE洗滌固體2遍（20 mL×2），乾燥得到 CR202AV（1.3194 g，純度：87.79%，回收率：51.9%）白色固體。
CR202CV合成
將 CR202AV（1.28 g，2.2 mmol）和二對硝基苯碳酸脂（1.21 g，4.0 mmol）加入DMF（10 mL）中磁力攪拌溶解，加入DIEA（0.73 mL，4.4 mmol），氮氣保護，25攝氏度下反應2小時。HPLC中控至反應完全，將反應液加入到MTBE（60 mL）中，析出白色固體，攪拌10分鐘，過濾，MTBE洗滌固體2遍（20 mL×2），30℃下真空乾燥，得到 CR202CV（1.19 g，HPLC：87.40%，回收率：84.8%）白色固體。
CR202BD合成
將 CR20274（51.2 mg，56.6 μmol）和 CR202CV（75.8 mg，101.8 μmol）加入DMF（1 ml）磁力攪拌溶解。加入HOBT（1.5 mg，11.3 μmol）和DIEA（15μL，84.8 μmol），N 2保護，25℃下反應18小時。HPLC中控至反應完全，反應液用製備液相純化，得 CR202BD（68.6 mg，純度：91.5%，回收率：81.7%）白色固體。
CR202V9合成
將 CR202BD（58.0 mg，39.0 μmol）和 CR202W4（70.8 mg，46.7 μmol）用DMF（3.6 mL）和水（1.2 mL）在避光條件下溶解，氮氣保護，磁力攪拌溶解。加入DIEA調節pH=8後，加入 CuBr（5.6 mg，39.0 μmol），25℃下反應2小時，取樣中控至反應完全。反應液製備液相純化。得 CR202V9（37.4 mg，純度：94.90%，回收率：31.6%），[M+4] 4+/4=751.89。
4.12 CR202AL的合成
CR202Z0活化酯合成：將 CR202Z0（3.00 g，15.9 mmol）加入DCM（30 mL）中，氮氣保護，控制外溫0℃，依次分批加入EDCI（4.57 g，23.8 mmol）和HOSu（2.74 g，23.8 mmol），添加完畢後，自然升至室溫，在室溫下反應2小時，反應液倒入冰水（100 mL）中，用DCM萃取（50 mL×2），合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，濃縮乾得4.6 g黃色油狀物。
CR202BQ合成：將 CR202BP（5.90 g，19.1 mmol）加入DMF（30 mL）中，磁力攪拌溶解，加入DBU（2.40 g，15.9 mmol），室溫下反應3小時，加入DIPEA（4.5 mL），將 CR202Z0活化酯（4.6 g）滴加入反應中，室溫下反應2小時，反應液倒入冰水（250 mL）中，用正庚烷萃取（100 mL×2），水相用6N鹽酸調節至pH=2，再用DCM萃取（100 mL×2），合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，得 CR202BR（2.30g，回收率：56.1%）黃色油狀物。 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.36 (s, 1H), 4.06 (s, 2H), 3.82-3.67 (m, 6H), 3.62 (dd, J= 12.1, 6.0 Hz, 2H), 3.52-3.41 (m, 2H), 2.67 (t, J= 6.0 Hz, 2H)，MS：[M+H] +=261.4。
將 CR202Q8（3.30 g，6.8 mmol）加入異丙醇（15 mL）和氯仿（55 mL）中，氮氣保護，控制外溫0℃，分批加入硼氫化鈉（389.1 mg，10.2 mmol），保溫反應3.5小時，TLC（正庚:EA=1:1，Rf=0.5）驗證反應完全。反應液倒入冰水（150 mL）中，滴加6N鹽酸（2 mL），用DCM萃取（100 mL×2），合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得4.6 g粗品，加入EA:正庚烷（7.5 mL:7.5mL）室溫打漿過夜，過濾，EA:正庚烷（1 mL:1 mL）淋洗，真空乾燥得 CR202Q9（3.60g，回收率：83.7%）類白色固體。 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.86 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 7.58 (dd, J= 8.5, 2.1 Hz, 1H), 7.40 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 5.43-5.30 (m, 3H), 5.23 (d, J= 6.8 Hz, 1H), 4.77 (s, 2H), 4.24 (d, J= 8.9 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.10 (d, J= 3.4 Hz, 6H)，MS：[M+H] +=475.2。
將 CR202Q9（2.85g，5.9 mmol）加入甲醇（100 mL）中，加入10% Pd/C（0.30 g，含水量：50%），氫氣置換3遍，室溫，常壓氫化4小時，TLC驗證反應完全，過濾，濃縮乾，加入EA:正庚烷（2mL:4mL）在室溫下打漿16小時，過濾，用EA:正庚烷（1:2，2 mL×2）淋洗，真空乾燥得 CR202R0（2.60 g，純度：91.63%，回收率：87.8%）類白色固體。 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 6.94 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 6.77 (d, J= 1.7 Hz, 1H), 6.70 (dd, J= 8.2, 1.7 Hz, 1H), 5.42-5.31 (m, 3H), 5.06 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 4.59 (s, 2H), 4.20 (d, J= 9.3 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 2.14-2.08 (m, 9H)，MS：[M+H] +=456.3。
將 CR202BR（1.82g，6.9 mmol）加入DMF（24 mL）中，氮氣保護，控制外溫0℃，依次加入DIPEA（1.38 g，10.6 mmol）、HATU（2.62g，6.9 mmol）和 CR202R0（2.40 g，5.3 mmol），添加完畢，自然升至室溫（16.0℃），在室溫下反應2.5小時，HPLC中控至反應完全，反應倒入冰水（200 mL）中，用EA萃取（100 mL×3），合併有機相，飽和食鹽水洗滌（100 mL×2），無水硫酸鈉乾燥，濃縮得5.4 g粗品，製備純化，得泡沫狀固體 CR202AH（2.18 g，純度：97.52%，回收率：54.8%）。 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.43 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.10 (d, J= 7.0 Hz, 1H), 6.97 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 5.45 (t, J= 9.5 Hz, 1H), 5.35 (dt, J= 14.0, 7.7 Hz, 2H), 5.09 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 4.68 (s, 2H), 4.23 (d, J= 9.7 Hz, 1H), 4.06 (s, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.71 (d, J= 5.1 Hz, 8H), 3.44 (t, J= 4.9 Hz, 2H), 2.76 (t, J= 5.6 Hz, 2H), 2.18-2.04 (m, 9H)，MS：[M+H] +=698.3。
將 CR202AH（1.10 g，1.58 mmol）加入DMF（10.0 mL）溶解，氮氣保護，依次加入二對硝基苯酚碳酸酯（960.0 mg，3.15 mmol）和DIPEA（306.0 mg，2.37 mmol），室溫下反應3小時，HPLC中控至反應完全。反應液製備純化，得白色固體 CR202AI（1.10 g，純度：99.85%，回收率：80.9%）。 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.56 (d, J= 1.9 Hz, 1H), 8.35-8.28 (m, 2H), 8.13 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.45-7.39 (m, 2H), 7.17 (dd, J= 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.01 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 5.47 (t, J= 9.5 Hz, 1H), 5.39-5.31 (m, 2H), 5.27 (s, 2H), 5.13 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 4.25 (d, J= 9.7 Hz, 1H), 4.10 (s, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.75-3.68 (m, 8H), 3.47-3.41 (m, 2H), 2.79 (t, J= 6.1 Hz, 2H), 2.14-2.08 (m, 9H)，MS：[M+H] +=863.3。
CR20274的游離：將CR20274鹽酸鹽（2.8 g，2.93 mmol，1.0 eq.）用DCM（100.0 mL）和甲醇（20.0 mL）溶解，冷卻至5～10℃。稱取NaHCO 3（2.0 g，23.8 mmol）溶於水（35 mL），然後滴加到CR20274的DCM/MeOH溶液中。5～10℃下攪拌3分鐘，分層。水相用DCM/MeOH（10/1, 50 mL ×2）萃取。合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾。濾液30℃真空濃縮乾燥。得到游離態 CR20274（2.5 g，純度：98.02%，回收率：97%）淡黃色固體，直接用於後續步驟。
將游離態 CR20274（150.0 mg，0.17 mmol）、 CR202AI（292.8 mg,0.34 mmol）、HOBt（4.6 mg，0.034mmo）和DIPEA（32.9 mg，0.25 mmol）依次加入DMF（4.0 mL）中，磁力攪拌溶解，氮氣保護，25℃下反應20小時，補加DIPEA（8 μL，0.045 mmol），繼續反應24小時，HPLC中控至反應完全，反應液用製備液相純化，得 CR202AJ（218.1 mg，純度：99.56%，回收率：54.5%）。
將 CR202AJ（210.0mg，130.0 μmol）加入THF（21 mL）中溶解，控制外溫0～5℃，滴加0.1 M LiOH水溶液（7.2 mL，718.0 μmol），保溫反應1小時，反應液滴加5% TFA水溶液，調節至pH=6～7，減壓濃縮除去THF，殘留液用製備液相純化。得 CR202AK（35.0 mg，純度：94.84%，回收率：17.8%）。
在25 mL夾套中，將 CR202AK（85.0 mg，57.8 μmol，1.0 eq.）和 CR202W4（104.9 mg，69.4 μmol，1.2 eq.）用DMF（6.4 mL）和水（2.5 mL）在避光條件下溶解，磁力攪拌，氮氣保護。加入DIEA調節至pH=8，加入CuBr（8.3 mg，57.8 μmol，1.0 eq.），25℃下反應2小時，取樣中控至反應完全。反應液用製備液相純化。純水除鹽，得 CR202AL（23.7 mg，純度：94.48%，回收率：13.9%），[M+4H] 4+/4=746.40。
4.13 CR202W1的合成
在100 mL三口瓶中，將磺醯氯（9.65 g，71.5 mmol，1.0 eq.）用無水THF（15 mL）稀釋，磁力攪拌，氮氣保護，降溫到零下70℃。將新戊醇（6.3 g，71.5 mmol）和吡啶（5.66 g，71.5 mmol）溶於無水THF（30 mL)，1小時緩慢滴加入三口瓶，滴加完畢自然升溫至室溫，攪拌2小時，過濾除去固體，得到 氯代亞硫酸新戊酯（Neopentyl sulfurochloridate）。
在250 mL三口瓶中，把 CR202BE（6 g，35.9 mmol）、TEA（7.27 g，71.8 mmol）和DMAP（4.4 g，36.0 mmol）溶於THF（120 mL），氮氣保護，冷卻至0℃。滴加含 Neopentyl sulfurochloridate的THF溶液（71.5 mmol）。0℃下攪拌1小時，加入1M HCl（150 mL）和乙酸乙酯（150 mL）淬滅。分層，有機相依次用飽和NaHCO 3（100 mL）和10% Na 2SO 4（100 mL）洗滌，用無水Na 2SO 4乾燥後過濾。濾液濃縮過矽膠柱（正庚烷/乙酸乙酯=10/1 ～ 5/1）得到 CR202BN（6.4 g，純度：98.49%，回收率：50%）淡黃色固體。H-NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.09 (s, 1H), 8.76 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 8.39 (dd, J= 8.4 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.96 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 4.36 (s, 2H), 0.97 (s, 9H)。
在100 mL夾套中，把 CR202BN（3 g，9.45 mmol）和溴丙炔（1.69 g，14.2 mmol）溶於THF（40 mL），氮氣保護。冷卻至-10℃，加入鋅粉（927 mg，14.2 mmol）。關閉冷凝，自然升溫至室溫（10～20℃），攪拌過夜，取樣中控至反應完全，加入飽和NH 4Cl（200 mL）淬滅，乙酸乙酯萃取（150 mL×2）。合併有機相依次用水（150 mL）和10% Na 2SO 4（150 mL）洗滌，無水Na 2SO 4乾燥後過濾。濾液濃縮，柱層析（正庚烷/乙酸乙酯 = 6/1 ～ 4/1）得到 CR202BG（5.0 g，純度：94.86%，回收率：64%）黃色的油。H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.09 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 7.71 (dd, J= 8.4 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.61 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 4.97 (t, J= 6.4 Hz, 1H), 4.22 (s, 2H), 2.73-2.60 (m, 2H), 2.13 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 1.02 (s, 9H)。
CR202BG（5 g，14.0 mmol）和 CR202BS（2.44 g，14.0 mmol）溶於DMF（50 mL）和水（ 15mL）中，氮氣保護。加入DIEA（2.3 mL）調pH=8。加入CuBr（2.0 g，13.9 mmol），25℃攪拌1小時，取樣中控至反應完全。反應液製備液相純化得無色的油 CR202BH（7.2 g，純度：86.69%，回收率：59%）。LCMS: [M+H]+ = 532.3。
將 CR202BH（7.2 g，9.48 mmol）、 CR194Z0（1.8 g，9.52 mmol）和DIEA（3.65 g，28.2 mmol）溶於DMF（50 mL）中，氮氣保護。加入HATU（3.6 g，9.47 mmol）。14℃攪拌2小時，取樣中控至反應完全。加水（150 mL）和乙酸乙酯萃取（100 mL×2）。合併有機相，依次用水（100 mL）和10% Na 2SO 4（100 mL）洗滌，無水Na 2SO 4乾燥後過濾。濾液濃縮柱層析純化（DCM/MeOH = 30/1 ～ 20/1）得到 CR202BJ（6.4 g，純度：94.11%，回收率：90%）黃色的油。[M+H] += 703.4 (4.43分鐘)。H-NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 8.09 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 7.80 - 7.78 (m, 2H), 7.64 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.61 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.00 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 4.46 (t, J= 5.6 Hz, 2H), 4.29 (s, 2H), 3.88 (s, 2H), 3.76 (t, J= 5.2 Hz, 2H), 3.62 - 3.59 (m, 6H), 3.51 - 3.39 (m, 9H), 3.26 (q, J= 6.0 Hz, 2H), 3.02 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 0.96 (s, 9H)。
將 CR202BJ（6.4 g，9.11 mmol）、NPC（5.5 g，18.1 mmol）和DIEA（1.77 g，13.7 mmol）溶於DMF（30 mL）中，氮氣保護。25℃下攪拌1.5小時，取樣中控反應完全。反應液用製備液相純化得 CR202Z4（6.0 g，純度：97.24%，回收率：72%）無色膠狀物。[M+H] += 868.3。H-NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 8.30 (d, J= 9.2 Hz, 2H), 8.25 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 7.94 (dd, J= 8.4 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.74 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.60 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 7.52 (d, J= 9.2 Hz, 2H), 6.17 (t, J= 6.4 Hz, 1H), 4.48 (t, J= 4.8 Hz, 2H), 4.31 (s, 2H), 3.87 (s, 2H), 3.76 (t, J= 4.8 Hz, 2H), 3.61 - 3.58 (m, 6H), 3.46 - 3.36 (m, 10H), 3.24 (q, J= 6.0 Hz, 2H), 0.95 (s, 9H)。
將 CR20274（100 mg，113 μmol.）、 CR202Z4（196 mg，226 μmol）、HOBT（3 mg，22.2 μmol）和DIEA（29.2 mg，226 μmol）溶於DMF（1.5 mL）中，氮氣保護。25℃下攪拌21小時，取樣中控至反應完全。反應液用製備液相純化得 CR202BK（82 mg，純度：95.21%，回收率：53%）。LCMS: [M/2+H] += 806.9 (RT=5.45 min)。
將 CR202BK（117 mg，101 μmol）溶於DMF（3 mL）中，加入5 M NH 4OAc水溶液（3 mL），氮氣保護。45℃下攪拌17小時，取樣中控至反應完全。反應液用製備液相純化得 CR202BL（78 mg，純度：99.54%，回收率：70%）。LCMS: [M-H] -= 1540.8。
將 CR202BL（70 mg，45.4 μmol）和 CR202W4（83 mg，54.8 μmol）用DMF（6 mL）和水（2 mL）在避光條件下溶解，磁力攪拌，氮氣保護。加入DIEA（250 μL）調PH=8後，加入CuBr（6.5 mg，45.4 μmol），25℃下反應1小時，補加 CR202W4（18 mg，11.9 μmol）、 DIEA（100 μL）和CuBr（3.2 mg，22.7 μmol），25℃下反應1小時，取樣中控至反應完全。反應液用製備液相純化。純水除鹽，得 CR202W1（33 mg，純度：94.46%，回收率：19%），LCMS: [M+4H] 4+/4 = 764.94。
4.14 CR202GM的合成
將 SM1（500 mg，3.53 mmol，1.0 eq.）溶於DCM（50.0 mL）中，氮氣保護，冷卻至0℃。加入 SM2（307 mg，3.53 mmol，1.0 eq.），0℃下攪拌30分鐘。加入TEA（714 mg，7.06 mmol，2.0 eq.）和 SM3（371 mg，3.53 mmol，1.0 eq.），5℃下攪拌1小時。HPLC中控至反應完全。加入NPC（2.15 g，7.07 mmol，2.0 eq.）和TEA（358 mg，3.54 mmol，1.0 eq.），25℃下攪拌3小時。反應液濃縮過矽膠柱（正庚烷/乙酸乙酯/乙酸=50/50/1），得到無色黏稠的油 CR202HD（1.2 g，純度：98.47%，回收率：74%）。LCMS: [M+H] += 463.4。 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ8.30 - 8.26 (m, 2H), 8.02 (s, 1H), 7.43 - 7.40 (m, 2H), 5.72 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.46 - 4.44 (m, 2H), 4.33 (t, J= 4.8 Hz, 2H), 3.79 - 3.77 (m, 2H), 3.67 (t, J= 4.8 Hz, 2H), 3.53 (t, J= 4.8 Hz, 2H), 3.35 (q, J= 4.8 Hz, 2H)。
將 CR202HD（402 mg，0.869 mmol，1.1 eq.）溶於DMF（3 mL）中，加入 CR19154（300 mg，0.791 mmol，1.0 eq.）和TEA（240 mg，2.37 mmol，3.0 eq.），25℃下攪拌17小時。HPLC中控至反應完全。反應液濃縮並用柱層析純化（DCM/MeOH/AcOH=100/10/1），得到白色發泡固體 CR202HE（560 mg，純度：100%，90%回收率）。LCMS: [M+H] += 703.4。 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 9.92 (s, 1H), 8.04 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.98 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.08 (s, 1H), 4.42 - 4.37 (m, 3H), 4.07 - 4.03 (m, 4H), 3.88 (dd, J = 8.4 Hz, 6.8 Hz, 1H), 3.56 - 3.54 (m, 2H), 3.48 - 3.46 (m, 4H), 3.01 - 2.93 (m, 4H), 2.01 - 1.92 (m, 1H), 1.74 - 1.30 (m, 4H), 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。
將 CR202HE（460 mg，1.21 mmol，1.0 eq.）溶於DMF（6 mL）中，加入NPC（405 mg，1.33 mmol，1.1 eq.）和DIEA（235 mg，1.82 mmol，1.5 eq.），25℃攪拌17小時。HPLC中控至反應完全。反應液直接用反向製備液相純化，得到白色固體 CR202HF（230 mg，純度：98.59%，回收率：37%）。LCMS: [M+H] += 868.3。 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 11.37 (s, 1H), 10.14 (s, 1H), 8.36 - 8.32 (m, 2H), 8.13 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.84 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.61 - 7.58 (m, 2H), 7.44 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.03 (s, 1H), 5.27 (s, 2H), 4.47 - 4.42 (m, 1H), 4.25 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 4.14 - 4.05 (m, 2H), 3.95 - 3.91 (m, 1H), 3.61 - 3.59 (m, 4H), 3.52 - 3.51 (m, 2H), 3.13 - 2.96 (m, 4H), 2.04 - 1.96 (m, 1H), 1.78 - 1.58 (m, 2H), 1.54 - 1.34 (m, 2H), 0.90 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。
將 CR202HF（200.0 mg，0.23 mmol）、 CR20274（游離態，220.0 mg，0.23 mmol）、HOBt（6.4 mg，0.05 mmol）、DIPEA（89.0 mg，0.69 mmol）依次加入DMF（4.0 mL）中，氮氣保護，室溫（26.0℃）下反應16小時，HPLC中控至反應完全，反應液用製備HPLC純化（流動相：為0.1%TFA/H 2O和0.1% TFA/ACN），凍乾得 CR202HG（130.0 mg，純度：97.81%，回收率：35.0 %）。LCMS: [M+H] +=1612.93。
在氮氣保護下將 CR202HG（120.0 mg，0.074 mmol）、 CR202W4（134.0 mg，0.088 mmol），加入DMF（6 mL）和水（2 mL）的混合溶劑中，避光攪拌至溶解，滴加DIPEA並調節至pH=8，加入CuBr（13.0 mg，0.074 mmol），室溫（25.0 ℃）反應2.5小時，HPLC中控至反應完全。反應液直接用製備HPLC純化（流動相為0.1%TFA/H 2O和0.1% TFA/ACN），用純水將經製備HPLC純化的產物脫鹽，凍乾得到 CR202GM（52.1 mg，純度：95.83%，回收率：22.4 %），LCMS：[M+4H] 4+=782.49。
4.15 CR202HJ的合成
向100 mL單口瓶中依次加入 CR202X6（1.00 g，1.39 mmol），Fmoc-乙二胺（0.39 g，1.39 mmol），DMF（10 mL）攪拌至溶解。加入DIEA（0.22 g，1.67 mmol）並在20.7 ℃下反應0.5小時，反應中取樣並中控至反應完全。反應液倒入預冷（0～10℃）的MTBE（80 mL）中，保溫攪拌5分鐘並離心，析出的固體用冷MTBE洗滌（8 mL×5），得到白色固體 CR202MH（1.12 g，純度：93.66%，回收率：93.8%）。
將 CR202MH（1.08 g，1.26 mmol）加入DMF（7 mL）中溶解，滴加DBU（0.19 g，1.26 mmol）的DMF（3 mL）溶液，22.2℃反應0.5小時，反應中取樣並中控至反應完全，反應液用製備HPLC純化（流動相:為0.1%TFA/H 2O和0.1% TFA/ACN），凍乾得 CR202MJ（913.7mg，純度：99.8%）。
將 CR202MJ（0.83 g，1.30 mmol）、NPC（0.79 g，2.60 mmol）加入DMF（8 mL）中完全溶解，加入DIEA（0.25 g，1.95 mmol）後室溫反應0.5小時，反應中取樣並中控至反應完全，反應液用製備HPLC純化，凍乾得 CR202BX（254.9 mg，純度：96.46%，回收率：24.5%）。LCMS：[M+1H] +=802.4。 1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.06 (s, 1H), 8.36 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 8.10 (s, 1H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.47 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.01 (s, 1H), 5.43 (s, 1H), 4.99 (s, 2H), 4.42 (dd, J = 13.4, 7.8 Hz, 1H), 4.38-4.32 (m, 1H), 3.99 (s, 2H), 3.70-3.61 (m, 6H), 3.45-3.42 (m, 3H), 3.17 (s, 4H), 3.01 (dd, J = 22.5, 9.5 Hz, 2H), 2.07-1.97 (m, 1H), 1.77-1.56 (m, 2H), 1.53-1.32 (m, 2H), 0.90 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.85 (d, J = 6.8 Hz, 3H).
將 CR202BX（190.0 mg，0.24 mmol）、 CR20274（游離態，251.4 mg，0.28 mmol）、HOBt（6.4 mg，0.05 mmol）和DIPEA（91.9 mg，0.71 mmol）依次加入DMF（3.8 mL）中，氮氣保護下室溫反應8小時，反應液用製備HPLC純化（流動相為0.1% TFA/H 2O和0.1% TFA/ACN），凍乾得 CR202HH（230.0 mg，純度：98.27%，回收率：59.7%）。LCMS：[M+H] +=1546.63。
氮氣保護下將 CR202HH（210.0 mg，0.14 mmol）、 CR202W4（240.0 mg，0.16 mmol）加入DMF（12 mL）和水（4 mL）的混合溶劑中，避光攪拌溶解，滴加DIPEA調節至pH=8，加入CuBr（18.9 mg，0.14 mmol），室溫（25.0 ℃）反應5小時，反應中取樣並中控至反應完全。反應液直接用製備HPLC純化（流動相為0.1% TFA/H 2O和0.1% TFA/ACN），用純水將經製備HPLC純化的產物脫鹽，凍乾得 CR202HJ（215.7 mg，純度：96.69%，回收率：47.3%），LCMS： [M+3H] 3+=1021.20。
4.16 CR202FU的合成
氮氣保護下將四氫鋁鋰（0.47g，12.24 mmol）加入到THF（3 mL）中並冷卻到0℃，滴加 CR202MA（1.50g，8.28 mmol）的THF（15 mL）溶液，0℃保溫反應2小時，反應中取樣並用TLC監測至反應完全。反應液倒入冰水（5 mL）中，滴加15%氫氧化鈉溶液（1 mL），室溫攪拌15分鐘，用乙酸乙酯萃取（15 mL×3）。合併有機相並用無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮濾液至乾燥，粗產物用柱層析純化（PE/EA=1:1），得 CR202MB（1.15g，純度：95.03%，回收率：86.15%），LCMS: [M+H] +=154.6。
氮氣保護下將 CR202MB（1.15 g，7.50 mmol）加入到DCM（12 mL）中，依次加入咪唑（1.53 g，22.52 mmol）和TBSCl（1.69 g，11.26 mmol），室溫反應2小時，反應中取樣並用TLC監測至反應完全。反應液倒入冰水（5 mL）中淬滅，加入DCM萃取（15 mL×3）。合併有機相並用無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮濾液至乾燥，粗產物用柱層析純化（DCM/MeOH=10:1），得 CR202MC（1.50 g，純度：99.15%，回收率：74.07%）。 1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 6.73 (s, 1H), 6.62 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.60 (s, 2H), 4.54 (s, 2H), 3.74 (s, 3H), 0.88 (s, 9H), 0.05 (s, 6H).
將 CR202MD（1.66 g，3.73 mmol）加入到DMF（15 mL）中，控溫25℃，加入HATU（1.99 g，5.22 mmol），攪拌15分鐘，加入 CR202MC（1.50 g，5.59 mmol）和DIEA（0.67 g，5.22 mmol），反應中取樣監測至反應完全。反應液倒入冰水（75 mL）中，加入DCM萃取（30 mL×3）。合併有機相並用無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮濾液至乾燥，粗品 CR202ME直接用於下一步反應。LCMS：[M+H] += 695.6。
將 CR202ME（2.78g，3.73 mmol）加入到THF（30 mL）中，加入TBAF（2.09 g，7.46 mmol），25 °C反應1小時，反應中取樣並用TLC監測至反應完全。濃縮反應液至乾燥，粗品 CR202MG直接用於下一步反應。
將 CR202MG粗品加入DMF（30 mL）中並完全溶解，加入二(對硝基苯)碳酸酯（NPC，2.26g，7.44 mmol），DIPEA（0.72 g，5.58 mmol），20～25°C反應1小時，反應中取樣監測至反應完全。反應液用製備HPLC純化，凍乾得白色固體 CR202BW（1.35 g，純度：98.5%，回收率：48.7%）。 LCMS: [M+H] += 746.6; 1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.17 (s, 1H), 8.46-8.48 (d, 1H), 8.31-8.33 (d, 1H), 8.05-8.07 (d, 1H), 7.57-7.59 (d, 1H), 7.46-7.49 (d, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.02-7.07 (d, 1H), 6.00 (bs，1H), 5.26 (s, 2H), 4.49-4.54 (m, 2H), 4.33-4.37 (dd, 2H), 3.97 (s, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.62-3.65 (m, 6H), 3.40-3.43(t, 2H), 2.97-3.00 (t, 2H),2.01-2.03(m, 1H), 1.59-1.61 (m, 2H), 1.42-1.45 (m, 2H), 0.88-0.90 (d, 3H) , 0.82-0.84 (d, 3H)。
氮氣保護下將 CR202BW（250.1 mg，0.34 mmol）、 CR20274（游離態，326.0 mg，0.37 mmol）、HOBt（9.0 mg，0.07 mmol）、DIPEA（140.0 mg，1.02 mmol）依次加入DMF（5.0 mL）中，室溫反應16小時，反應液用製備HPLC純化（流動相為0.1% TFA/H 2O和0.1% TFA/ACN），凍乾得 CR202HP（236.2 mg，純度：96.14%，回收率：47.3%）。LCMS：[M+H] +=1490.96.
氮氣保護下將 CR202HP（211.9 mg，0.15 mmol）和 CR202W4（268.0 mg，0.148 mmol）加入DMF（12 mL）和水（4 mL）的混合溶劑中，避光攪拌至完全溶解，滴加DIPEA調節至pH=8，加入CuBr（6.4 mg，0.05 mmol），室溫（23.7 ℃）反應5小時。反應液直接用製備HPLC純化（流動相為0.1% TFA/H 2O和0.1% TFA/ACN），用純水將經製備HPLC純化的產物脫鹽，凍乾得到 CR202FU（132.4 mg，純度：98.67%，回收率：28.5%），LCMS： [M+4H] 4+=751.89。
4.17 CR202GQ的合成
CR202DS合成參考Ligand-01的製備：LCMS：[M+H] +=600.4， 1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.29 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.10 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 4.49-4.40 (m, 1H), 4.35-4.23 (m, 2H), 3.94 (s, 2H), 3.78 (dd, J = 17.5, 6.0 Hz, 1H), 3.73-3.54 (m, 9H), 3.45-3.37 (m, 2H), 2.95 (s, 2H), 2.08-1.78 (m, 5H), 1.73-1.63 (m, 1H), 1.56-1.32 (m, 3H), 0.81 (dd, J = 19.2, 6.7 Hz, 6H)
氮氣保護下將 CR202DS（350.0 mg，0.58 mmol）加入DMF（4.0 mL）中攪拌至完全溶解並冷卻至5℃，加入HATU（220.5 mg，0.58 mmol）、DIPEA（224.9 mg，1.74 mmol），保溫反應0.5小時，加入 CR20274（游離態，541.8 mg，0.61 mmol），自然升至室溫（27.0 ℃）反應16小時，反應液用製備HPLC純化（流動相為0.1% TFA/H 2O和0.1% TFA/ACN），凍乾得 CR202GP（204.9 mg，純度：91.88%，回收率：23.8%）。LCMS：[M+H] +=1465.32。
氮氣保護下將 CR202GP（200.0 mg，0.14 mmol）和 CR202W4（249.5 mg，0.16 mmol）加入DMF（12 mL）和水（4 mL）的混合溶劑中，避光攪拌至完全溶解，自然至室溫（23.0 ℃），滴加DIPEA調節至pH=8，加入CuBr（20.0 mg，0.14 mmol），反應1.5小時。反應液直接用製備HPLC純化（流動相為0.1% TFA/H 2O和0.1% TFA/ACN），用純水將經製備HPLC純化的產物脫鹽，凍乾得到 CR202GQ（156.7 mg，純度：95.61%，回收率：36.6%），LCMS： [M+4H] 4+=745.93。
4.18 CR202LB的合成
將5-甲醯水楊酸（5.03 g，2.96 mmol）加入到氯化亞碸（75 mL）中，油浴（82℃）加熱反應過夜。之後將反應液冷卻至50℃，35℃真空濃縮至乾，加入乾燥的THF（30 mL×3）帶蒸三遍除掉殘餘的氯化亞碸，得到5-甲醯水楊醯氯（黃色固體）。
將疊氮-三聚乙二醇-胺（4.30 g，1.97 mmol）加入到THF（80 mL）中，降溫至2℃，加入DIPEA（10mL）。用乾燥的THF（20 mL）溶解5-甲醯水楊酸醯氯並控溫降溫至2～10℃，滴加入反應液中（pH=5～6），補加1 mL DIPEA（pH=8），升溫至20℃攪拌過夜。向反應液加入水（80 mL），並用DCM萃取（100 mL×3）。合併有機相並用無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮濾液得到油狀物粗品，粗品經矽膠柱層析純化（DCM:EtOAc=10:1至2:1）得到 CR202KV（0.8 g，純度：～90%（TLC），產率：15%）。LC-MS: [M+H] +:367.06。 1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.71 (s, 1H), 8.37 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 3.60 – 3.48 (m, 10H), 3.46 (dd, J = 7.3, 4.2 Hz, 4H), 3.38-3.26 (m, 2H)。
將 CR194KV（0.80 g，2.18 mmol）加入到DCM（40 mL）中攪拌溶解，冰鹽浴降溫至0℃，加入DIPEA（1.0 mL，5.45 mmol），CBr 4（2.79 g，8.73 mmol）並攪拌至完全溶解。滴加亞磷酸二苄酯（1.14 g，4.36 mmol），滴加完畢移去冰鹽浴，改用冰浴冷卻反應液至內溫5℃，逐滴加入5% NaH 4PO 4水溶液（30 mL），並用DCM（50mL×3）萃取。合併有機相並用無水硫酸鈉乾燥，過濾後在35℃下真空濃縮濾液得到橙色油狀物，經柱層析純化（DCM:EtOAc=10:1 -2:1）得到 CR202KW（1.3g，產率：60%）。[M+H] +:627.19， 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 9.96 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.85 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.30 (dt, J = 10.0, 5.1 Hz, 10H), 7.20 (s, 1H), 5.12 (d, J = 7.5 Hz, 4H), 3.63-3.51 (m, 14H), 3.30 (t, J = 5.0 Hz, 2H)。
將 CR202KW（1.30g，2.07 mmol）加入DCM/MeOH混合溶液（50 mL，V/V=1/1）中，溶清，冰鹽浴冷卻內溫0℃，分批加入NaBH 4（0.16g，4.14 mmol），0℃攪拌30分鐘，向反應液中加入水（50 mL）和DCM（50 mL），分出有機相，水相再用DCM萃取（50mL×2）。合併有機相並用無水硫酸鈉乾燥，過濾後在35℃下真空濃縮濾液得到 CR202KX粗產品（1.29g，純度:85.30%，回收率：99.2%）。粗產品不經純化直接進行下一步反應。LC-MS: [M+H] +:629.14， 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.78 (s, 1H), 7.37-7.26 (m, 13H), 5.10 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 4.66 (s, 2H), 3.57 (d, J = 11.9 Hz, 4H), 3.30 (t, J = 5.0 Hz, 2H)。
將 CR202KX（1.09 g，1.73 mmol）加入乙腈（20 mL）中溶清，冰浴冷卻，加入TEA（0.25 mL，1.73 mmol），之後將雙（五氟苯基）碳酸脂（1.06 g，2.6 mmol）的乙腈（2.5 mL）溶液逐滴加入反應液中，移去冰浴攪拌1.5小時。反應完畢後用冰浴冷卻反應液，加入飽和碳酸氫鈉水溶液（30 mL）和乙酸乙酯（70 mL）萃取，收集有機相。有機相分別用水（一次，40mL）和飽和氯化鈉溶液（30 mL）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾後在30℃下真空濃縮濾液得到油狀物。油狀物經柱層析純化（正庚烷：乙酸乙酯=10:1至1:1）得到 CR202KY（1.02 g，純度：96.53%，回收率：70.3%）。LC-MS： [M+H] +:839.12，H-NMR: 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.91 (s, 1H), 7.43-7.26 (m, 12H), 5.28 (s, 2H), 5.11 (d, J = 8.9 Hz, 4H), 3.66-3.47 (m, 14H), 3.30 (t, J = 5.0 Hz, 2H)。
將 CR20274（0.57 g，0.65 mmol）加入DMF（10 mL）中溶清，冰浴冷卻。依次加入HOBT（88.0mg，0.65 mmol）和DIPEA（140 μL，0.78 mmol）。將 CR202KY（0.66 g， 0.78 mmol）溶於DMF（2.5 mL），滴加入反應液中，滴加完畢，移去冰浴攪拌1小時。反應液製備純化凍乾得到 CR202KZ（0.79g，純度：93.01%，回收率：80.0%）。LC-MS:[M+2H] 2+:769.92。
將50% TFA的二氯甲烷溶液（14 mL，V/V=1/1）降溫至0℃，加入 CR202KZ（0.40 g，0.26 mmol）攪拌至完全溶解，之後升溫至24℃攪拌2小時。在27℃下真空濃縮反應液得到 CR202LA（0.36 g），按理論產率直接進行下一步反應。LC-MS:[M+2] 2+:680.25。
將 CR202LA（0.36 g，0.26 mmol）加入到DMF:H 2O（12 mL，V/V=1/1）混合溶劑中並降溫至4℃，逐滴加入DIPEA（1.7mL），調至pH=8，依次加入 CR202W4（0.39g，0.26 mmol）和CuBr（37.1mg，10.26 mmol），升溫至內溫24.2℃後攪拌1.5小時，反應中取樣用HPLC中控至反應完成。反應液用製備HPLC純化，凍乾得到 CR202LB（0.29 g，純度：98.34%，兩步回收率：38.8%）。
4.19 CR202HV的合成
在氮氣保護下將碳酸銫（53.18 g，179.48 mmol）加入到THF（290 mL）中，攪拌中加入硫代乙酸（13.66 g，179.48 mmol），25℃下反應30分鐘後加入(s)-(-)-2-氯丙酸甲酯（20.00 g，163.16 mmol），繼續反應1小時。將反應液過濾，濾液加入水（1.2 L）中，MTBE萃取兩遍（1 L×2）。合併有機相並用無水硫酸鈉乾燥，合併有機相無水硫酸鈉乾燥，過濾後濃縮濾液至乾燥得到 CR202KQ（24.34 g，純度：90.09%，回收率：92.00%），                [M+H] +=163.11。 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 4.16 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 3.66 (s, 4H), 2.28 (s, 3H), 1.43 (d, J = 7.3 Hz, 3H)。
氮氣保護下將LiAlH 4（9.36 g，246.64 mmol）加入THF（150 mL）中，攪拌溶解並降溫至0℃。同時將 CR202KQ（10.00 g，61.65 mmol）溶解於THF（50 mL）中，再將此溶液緩慢滴加至LiAlH 4溶液中，滴加結束將溫度升至室溫，反應1.5小時，用HPLC中控反應至完全。之後降溫至0℃，緩慢滴加2 M HCl溶液至反應液不再新產生氣泡，繼續攪拌15分鐘，過濾，濾餅用THF（100 mL）洗滌一遍，合併（THF）濾液後舍去。將濾餅用甲醇（300 mL）泡洗後過濾，此操作重複一遍，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾後濃縮得到 CR202KR（9.0104 g，純度：92.21%，回收率: 158.63%，備註：甲醇殘留較多，回收率超100%）。
將2,2'-二硫二吡啶（10.37 g，47.07 mmol）加入甲醇（40 mL）中，加入 CR202KR（8.6763 g，94.14 mmol），25℃反應2小時，用HPLC中控反應至完全。反應液濃縮得到粗產品並用柱層析純化（n-Heptane/EA=6/1）得到 CR202KS（2.5298 g，純度：94.35%，回收率：26.7%），LCMS：[M+H] +=201.97。 1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.43 (m, 1H), 7.81 (m, 2H), 7.22 (td, J = 5.3, 2.8 Hz, 1H), 5.08 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.46 (m, 2H), 3.05 (dd, J = 13.0, 6.5 Hz, 1H), 1.22 (t, J = 6.5 Hz, 3H)。
將 CR202KS（1.20 g，5.96 mmol）加入到DCM（12 mL）中，之後加入對硝基苯基氯甲酸酯（1.44 g，7.14 mmol），吡啶（0.49 g，6.26 mmol），25 °C反應1小時，用HPLC中控反應至完全。反應液濃縮得到粗產品並用柱層析純化（n-Heptane/EA=10/1）得到 CR202KT（2.01 g，純度：87.42%，回收率：92.2%），LCMS：[M+H] +=366.98， 1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.44 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 8.31 (m, 2H), 7.81 (m, 2H), 7.55 (m, 2H), 7.24 (ddd, J = 6.5, 4.8, 1.5 Hz, 1H), 4.34 (qd, J = 11.2, 6.0 Hz, 2H), 3.46 (dt, J = 13.1, 6.5 Hz, 1H), 1.33 (d, J = 7.0 Hz, 3H)。
將 CR202KT（314.0 mg，0.86 mmol）加入到DMF（5 mL）中，之後加入 CR20274（500.0 mg，0.57 mmol）、HOBT（76.4 mg，0.57 mmol）和DIPEA（146.0 mg，1.13 mmol），25 °C反應16 小時，中控反應至完全。用製備HPLC純化後凍乾得到 CR202KU（0.4567 g，純度：88.69%，回收率：72.69%）。
在氮氣保護下將 CR19208（205.5 mg，0.13 mmol）加入到50% DMF/H 2O溶液（8 mL，V/V=1/1）中，滴加0.1 M NaHCO 3溶液至反應液pH≈7。將 CR202KU（150.0 mg，0.13 mmol）溶解於THF（3 mL）後滴加入反應液中（可觀察到反應液變渾濁）。補加10 mL 50% DMF/H 2O溶液，10 mL DMF，5 mL 0.1 M NaHCO 3溶液（可觀察到反應液變澄清），之後在25 °C下反應0.5小時，用HPLC中控反應至完全。反應液用製備HPLC純化（流動相為0.1% TFA/H 2O和0.1% TFA/ACN），凍乾得到 CR202HV（99.5 mg，純度：98.73 %，回收率：29.26%）。LCMS：[M+3H] 3+=841.76。
4.20 CR202GC的合成
向25 mL單口瓶中加入 CR20274（313.9 mg，0.3551 mmol），之後在氮氣保護下加入THF（10.0 mL）並降溫至0℃。加入三光氣（42.2 mg，0.1420 mmol），此時出現白色固體，滴加DIEA至固體完全溶解，保溫0℃下反應40分鐘。另取一25 mL單口瓶，加入 CR202JC（191.6 mg，0.3551 mmol）和THF（2.0 mL），降溫至0℃後加入NaH（85.2 mg，2.1306 mmol），攪拌至不再有氣泡冒出。將 CR20274的反應液加入到 CR202JC的反應液。加入完畢後緩慢恢復到室溫反應30分鐘，用HPLC中控反應至完成。反應液用製備HPLC純化得到44.2mg白色固體 CR202JD（純度：80.42%，回收率：8.6%）。
稱取 CR202JD（40.0 mg，0.0276 mmol，1.0 eq.）， CR202W4（41.8 mg，0.0276 mmol，1.0 eq.），加入到50 mL夾套瓶中，並加入DMF/H 2O溶液（2.0 mL，V/V=3/1），避光條件下控溫至25℃。滴加DIEA到反應液中至pH=8，加入CuBr（4.5 mg，0.0276 mmol，1.0 eq.）。保溫25℃，攪拌10分鐘。取反應液20 μL，加ACN/MeOH/H 2O稀釋至300 μL，HPLC中控至反應完成。反應液在2～8℃下冷藏2小時，用製備HPLC純化得到 CR202GC白色固體（22.0 mg，純度：98.53%）。
4.21 CR202JG的合成
將 化合物 8（20.0 g，226 mmol，24.4 mL，1.40 eq.）和吡啶（12.8 g，162 mmol，13.1 mL，1.00 eq.）溶於DCM（200 mL）中，控溫零下78℃到零下60℃之間，將其緩慢滴加至磺醯氯（21.8 g，162 mmol，16.2 mL，1.00 eq.）的DCM（200 mL）溶液中，室溫反應10小時。反應液濃縮得到黃色油狀物，蒸餾得到無色油狀的 化合物 1a（10.5 g，粗品）。 1H NMR: (400 MHz, CDCl 3) δ: 4.18 (s, 2H), 1.06 (s, 9H)。
將 化合物 1a（5.00 g，40.9 mmol，1.00 eq.）、DMAP（5.00 g，40.9 mmol，1.00 eq.）和Et 3N（8.29 g，81.8 mmol，11.4 mL，2.00 eq.）溶於THF（70.0 mL）中，向上述溶液中滴加 化合物 1（9.55 g，51.1 mmol，1.25 eq.）的THF（35.0 mL）溶液，室溫反應12小時。加入10%檸檬酸（500 mL）淬滅反應，用乙酸乙酯萃取（200 mL * 2），合併有機相並用飽和食鹽水（200 mL）洗滌，然後用無水硫酸鈉乾燥，過濾。濃縮濾液得到黃色油狀物，柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯=10/1～5/1）得到無色油狀 化合物 2（9.00 g，32.7 mmol，純度：99.0%，回收率：79.9%）。 1H NMR: (CDCl 3, 400 MHz) δ 9.94 (s, 1H), 7.91 - 7.87 (m, 2H), 7.41 (dd, J = 10.8 Hz, 2.40 Hz, 2H), 4.04 (s, 2H), 0.90 (s, 9H)。
將 化合物 2（9.00 g，32.7 mmol，1.00 eq.）和3-溴丙炔（7.30 g，49.0 mmol，5.29 mL，純度：80%，1.50 eq.）溶於DMF（135 mL）中，零下10℃的條件下加入Zn（3.44 g，52.6 mmol，1.61 eq.），升至室溫反應12小時。加入氯化銨水溶液（400 mL）淬滅反應，用乙酸乙酯萃取（250 mL *3），合併有機相並用無水硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮濾液至乾燥，粗產物用柱層析純化（PE/EA=6/1）得到黃色油狀 化合物 3（10.0 g，粗品）。LCMS：[M+H] += 313.1； 1H NMR: (CDCl 3, 400 MHz) δ 7.46 (d, J = 8.80 Hz, 2H), 7.32 - 7.28 (m, 2H), 4.90 (t, J = 6.40 Hz, 1H), 4.09 (s, 2H), 2.65 - 2.62 (m, 2H), 2.09 (t, J = 2.80 Hz, 1H), 1.01 (s, 9H)。
將 化合物 3（6.87 g，19.5 mmol，1.00 eq.）和 化合物 3a（3.41 g，19.5 mmol，1.00 eq.）溶於乙腈（60 mL）和水（18.0 mL），室溫下加入DIEA（2.03 g，15.6 mmol，2.73 mL，0.80 eq.）和CuBr（2.81 g，19.6 mmol，596 μL，1.00 eq.），室溫反應0.5小時。反應液中加入醋酸酸化得到藍色溶液，用製備HPLC純化（0.05% TFA 體系）的得到 化合物 4（10.7 g，17.5 mmol，純度：98.6%，回收率：89.6%，TFA salt）。LCMS: [M+H] += 487.2； 1H NMR：(CDCl 3, 400 MHz) δ 8.01 (br s, 3H), 7.46 (br s, 2H), 7.25 (s, 2H), 4.49 - 4.46 (m, 2H), 4.10 (s, 2H), 3.85 - 3.55 (m, 10H), 3.11 (s, 3H), 1.01 (s, 9H)。
將 化合物 4（6.30 g，10.3 mmol，1.00 eq.，TFA salt）、 化合物 4a（1.62 g，8.58 mmol，0.83 eq.）和DIPEA（4.01 g，31.0 mmol，5.40 mL，3.00 eq.）溶於DMF（30.0 mL）中，室溫下加入HATU（3.93 g，10.3 mmol，1.00 eq.），室溫反應2小時。反應液用製備HPLC純化（0.01% TFA 體系）得到 化合物 5（3.30 g，4.95 mmol，純度：98.6%，回收率：47.8%）。LCMS：[M+H] += 658.4； 1H NMR：(CDCl 3, 400 MHz) δ 7.51 (s, 1H), 7.39 (d, J = 8.40 Hz, 2H), 7.21 - 7.20 (m, 2H), 7.04 (s, 1H), 5.00 (dd, J = 8.80 Hz, 3.20 Hz, 1H), 4.46 - 4.43 (m, 2H), 4.01 (s, 2H), 3.89 (s, 2H), 3.78 - 3.59 (m, 2H), 3.58 - 3.32 (m, 16H), 3.04 - 2.99 (m, 2H), 0.94 (s, 9H)。
將 化合物 5（3.50 g，5.32 mmol，1.00 eq.）和DIPEA（2.75 g，21.3 mmol，3.71 mL， 4.00 eq.）溶於THF（35.0 mL），室溫下加入對硝基苯基氯甲酸酯（2.25 g，11.2 mmol，2.10 eq.），室溫反應1小時後，加入N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺（1.71 g，10.6 mmol，1.67 mL，2.00 eq.），室溫反應2小時。反應液用製備HPLC純化（0.01% TFA 體系）得到 化合物 6（3.50 g, 4.00 mmol, 純度：96.4%,回收率75.1%）。LCMS：[M+H]+ = 844.4； 1H NMR：(CDCl 3, 400 MHz) δ 7.43 (s, 1H), 7.35 (d, J = 8.80 Hz, 2H), 7.24 - 7.22 (m, 2H), 7.09 (s, 1H), 5.92 - 5.89 (m, 1H), 5.77 (s, 1H), 5.18 (s, 1H), 4.48 - 4.46 (m, 2H), 4.06 (s, 2H), 3.98 (s, 2H), 3.80 - 3.66 (m, 2H), 3.65 - 3.55 (m, 14H), 3.53 (d, J = 8.40 Hz, 2H), 3.37 - 3.19 (m, 6H), 1.40 (s, 9H), 0.98 (s, 9H)。
將 化合物 6（3.50 g，4.00 mmol，1.00 eq.）溶於乙腈（44.0 mL）中，室溫下加入TsOH（2.41 g，13.9 mmol，3.50 eq.），室溫反應12小時。反應液濃縮得到黃色油狀 化合物 7（4.00 g，粗品），粗品直接用於下一步反應。
將 化合物 7（2.00 g，2.18 mmol，1.00 eq.，粗品）和DIEA（1.13 g，8.73 mmol，1.52 mL，4.00 eq.）溶於乙腈（20 mL）中，10℃下加入二(對硝基苯)碳酸酯（531 mg，1.75 mmol，0.80 eq），反應液在10℃下反應0.5小時。反應液用製備HPLC純化（0.01% TFA 體系）得到無色油狀 CR202DR（1.05 g，1.14 mmol，回收率：52.2%，純度：98.7%）。LCMS：[M+H] += 909.3； 1H NMR：(CDCl 3, 400 MHz) δ 8.23 (d, J = 8.80 Hz, 2H), 7.48(s, 1H), 7.38 (d, J = 8.40 Hz, 2H), 7.31 - 7.25 (m, 4H), 7.16 (s, 1H), 6.46 (s, 1H), 5.97 (s, 2H), 4.48 (t, J = 4.80 Hz, 2H), 4.10 (s, 2H), 4.01 (s, 2H), 3.82 - 3.67 (m, 2H), 3.58 - 3.26 (m, 22H), 1.01(s, 9H)。
將 CR202DR（350 mg，385 μmol）溶於DMF（7 mL）中並用冰浴降溫，之後在氮氣保護下加入 CR20274（340 mg，385 μmol）、HOBT（10 mg，77 μmol）和DIEA（100 mg，770 μmol），並在25℃下攪拌反應6小時。反應液倒入70 mL的MTBE中，瓶底析出油狀物，棄去上層清液。繼續向油狀物中加入50mL的MTBE並攪拌，油狀物部分固化，得到的半固體粗品 CR202JQ直接用於下步反應（純度：78.22%）。LCMS: [M+H] += 1654.2。
在氮氣保護下，向100 mL茄型燒瓶中加入上步所得的 CR202JQ並溶於DMF（7.5 mL）中，之後加入5 M NH 4OAc水溶液（7.5 mL），55℃下攪拌16小時，反應過程中取樣中控反應至完全。反應液用製備HPLC純化得到 CR202JR（219.3 mg，純度：85.83%，回收率：55.2%）。[M+H] += 1504.07。
在氮氣保護下，向25 mL茄型燒瓶中加入 CR202JR（151.0 mg，94.7 μmol）和 CR202W4（170.2 mg，94.7 μmol），並加入DMF（7.5 mL）和水（7.5 mL）在避光條件下攪拌至完全溶解。加入DIEA調節pH=8，之後加入CuBr（13.6 mg， 94.7 μmol），在25 ℃下反應2.5小時，反應過程中取樣中控反應至完全。反應液用製備HPLC純化得到 CR202JG（62.3 mg，純度：96.78%，回收率：21.2%）。LCMS: [M-2H] 2-= 1547.85。
4.22 CR202HT的合成
在氮氣保護下將TEA（2.54 g，25.08 mmol）加入DCM（20 mL）中，冷卻至0℃，滴加 CR202MQ（1.95 g，10.53 mmol），後用DCM（4 mL）淋洗注射器，保溫反應0.5 小時，用注射泵滴加 CR202MN/DCM（2.20 g/8 mL，10.03 mmol），1小時滴加完畢，保溫反應1小時，滴加 CR202MP/DCM（1.35 g/5 mL，11.24 mmol），10分鐘滴加完畢，0 ℃反應1小時。濃縮除去DCM，加入EA/正庚烷（V/V=1/4，60 mL）稀釋，純化水洗滌3遍（60 mL×3），有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後在35℃下真空濃縮濾液，經柱層析純化（正庚烷/EA=100/0～8/1），得淡黃色油狀物 CR202MK（1.59 g，純度：～80%，回收率：54.9%）。 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 9.93 (s, 1H), 7.84 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.15 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.02 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.70 (m, 12H), 3.42 (m, 2H), 1.23 (m, 2H), 1.13 (dd, J = 7.1, 3.4 Hz, 12H)。
將 CR202MK（112.8 mg，0.25 mmol）加入到甲醇（1.1 mL）中，外溫零下4.0℃下加入硼氫化鈉（10.0 mg，0.25 mmol），反應中取樣並用TLC檢測至反應完全，滴加純化水（2.0 mL）淬滅反應，加入EA（3.0 mL）萃取，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後在35℃下真空濃縮得淡黃色油狀物 CR202ML（181.5 mg）。 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.27 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.65 (s, 2H), 4.00 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.70 (m, 12H), 3.41 (m, 2H), 1.19 (m, 2H), 1.11 (dd, J = 6.9, 2.5 Hz, 12H)。
將 CR202ML（170.0 mg，0.373 mmol）加入到THF（3.0 mL）中，攪拌形成懸濁液，氮氣保護下加入DIPEA（120.5 mg，0.933 mmol）和氯甲酸對硝基苯酚酯（112.8 mg，0.559 mmol），室溫反應（26.2 ℃）6小時，補加DCM（1.2 mL）至反應液溶清，繼續反應44小時，用HPLC中控至反應基本完全。加入EA（5.0 mL）、純化水（5.0 mL）萃取分液，純化水（5 mL×2）洗滌兩遍，有機相用無水硫酸鈉乾燥後，過濾後真空濃縮，粗品用製備HPLC純化（流動相為乙腈和水），凍乾得油狀物 CR202KL（219.0 mg，純度98.23%，回收率：61.8%）。
氮氣保護下將 CR202KL（2170 mg，0.35 mmol）、 CR20274（370.8mg，0.42 mmol）和HOBt（10.1 mg，0.07 mmol）加入到DMF（4.0 mL）中，加入DIPEA（90.5 mg，0.70 mmol），室溫反應（24.9 ℃）7小時，取樣中控反應完全，反應液用製備HPLC純化（流動相為乙腈和水）。凍乾得 CR202KM（107.7 mg純度：95.0%，回收率：22.4%）。
將 CR202KM（107.0 mg，0.078mmol）溶於DMF（6.5 mL）中，加入純化水（3.5 mL），反應液渾濁，在避光的條件下加入 CR202W4（142.5 mg，0.095 mmol），氮氣置換3遍，外溫25℃下攪拌至溶清，滴加DIPEA（100 μL）調節至pH=8，加入溴化亞銅（11.2 mg，0.078 mmol），保溫反應2小時，取樣中控反應完畢，反應液用製備HPLC純化（流動相為15 nM醋酸鈉/水-乙腈體系，乙腈-水體系脫鹽），凍乾得 CR202HT（26.1 mg，純度：88.29%，16.0 mg，純度：73.74%）。LCMS:[M+3H] 3+=960.92。
4.23 CR202HU的合成
將鋅粉（9.03g, 0.138 mol）加入到500mL 單口瓶中，然後加入乾燥THF（150mL），滴加炔丙基溴（16.41g, 0.138 mol）。攪拌30分鐘。將 CR202BE（9.98g,0.060 mol）溶於乾燥THF（150 mL）中，在-10℃～-5℃下滴加入反應中，滴加完畢後，移去冰浴反應15分鐘，反應液成膠狀，取樣HPLC中控。將反應液冷至0℃，滴加入100mL 飽和氯化銨，然後補加100mL 水，將反應液轉移至分液漏斗中，加入乙酸乙酯 300mL萃取兩次，合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥， 過濾後在35℃下真空濃縮濾液得到棕色油狀物，經柱層析純化（正庚烷：乙酸乙酯=20:1～2:1） 得到 CR202BF（12.00g, 純度：91.14%, 產率：97.6%）。 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 10.53 (s, 1H), 8.13 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.62 (dd, J = 8.7, 2.0 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.86 (dd, J = 9.5, 6.2 Hz, 1H), 2.71 – 2.55 (m, 2H), 2.48 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 2.11 – 2.04 (m, 1H).
將碳酸銀（13.24 g，48.03 mmol）加入到250 mL單口瓶中，再加入乙腈（130 mL），保持冰鹽浴冷卻，加入HMTTA（2.09 g，9.09 mmol），攪拌7分鐘，加入 CR202BF（2.70 g, 12.98 mmol）和 CR202KC（6.94g，16.88 mmol），移去冰鹽浴，反應1小時，取樣HPLC中控，反應液過濾，除去碳酸銀，濾液加入乙酸乙酯（150 mL）和水（100 mL），分出有機相，水相再用乙酸乙酯（100mL）萃取，合併有機相，用飽和氯化鈉（100mL）洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾（矽藻土+矽膠+矽藻土三層過濾）後在28℃下真空濃縮濾液，經柱層析純化（正庚烷：乙酸乙酯=4:1～1:2）得到 CR202KD（10.00g，產率：120.9%（產物含有乙酸乙酯））。 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.83 (dd, J = 9.1, 2.1 Hz, 1H), 7.54 (td, J = 9.3, 2.2 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.51 (dd, J = 10.5, 7.9 Hz, 1H), 5.44 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.06 (ddd, J = 9.2, 8.5, 1.9 Hz, 2H), 4.88 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 4.30 – 4.19 (m, 1H), 4.18 – 3.98 (m, 2H), 2.71 – 2.54 (m, 2H), 2.16 (s, 3H), 2.13 – 2.07 (m,3H), 2.04 (s, 3H), 2.01 (s, 3H).
將 CR202KD（9.50 g，0.018 mol）溶於乙腈/H 2O（280 mL，乙腈:H 2O=3:1）中，冰鹽浴冷卻至3℃，加入N 3-(PEG) 2-NH 2（3.08 g, 0.018 mol），隨後加入CuBr（2.54 g，0.018 mol），3℃下反應20分鐘，取樣HPLC中控。向反應液中滴加5% TFA（60 mL），調節至pH=5，製備純化凍乾，得到 CR202KE（11.02g ，純度:93.38%, 產率115.7%（產物含反應試劑）。          LC-MS:[M+H] +：712.17。
將 CR202KE（10.00 g, 0.014 mol）加入到500 mL單口瓶中，加入乾燥的DMAc（100 mL），冰浴冷卻至內溫4℃，加入 CR202Z0（2.66g, 0.014 mol）和HATU（5.34g，0.014 mol），滴加入DIPEA（11 mL，0.063mol），冰浴反應25分鐘，取樣中控，反應結束，向反應液中滴加300 mL水，控溫＜20℃，用乙酸乙酯萃取（200 mL×2），合併有機相，用飽和食鹽水洗（50 mL×4），用無水硫酸鈉乾燥，過濾後在25℃下真空濃縮濾液得到粗品，經柱層析純化（正庚烷:乙酸乙酯=4:1；DCM:MeOH=100:1～30:1）得到 CR202KF（6.20g，純度：90.02%，產率：61.4%）。 1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.81 (s, 1H), 7.73 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.13 (s, 1H), 5.51 (dd, J = 10.3, 8.1 Hz, 1H), 5.44 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.14 – 5.00 (m, 3H), 4.61 – 4.50 (m, 2H), 4.22 (dd, J = 11.2, 7.0 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 11.6, 6.6 Hz, 1H), 3.94 (s, 2H), 3.84 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.70 – 3.61 (m, 6H), 3.58 (s, 4H), 3.51 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.48 – 3.41 (m, 2H), 3.41 – 3.35 (m, 2H), 3.16 (dd, J = 15.1, 3.2 Hz, 1H), 3.03 (dd, J = 15.0, 8.8 Hz, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 1.99 (s, 3H).
將 CR202KF（2.00g，2.27mmol）溶解於乾燥的DMAc（60mL）中，加入NPC（1.38g，4.53 mmol)，隨後滴加入DIPEA（1.2 mL，6.81 mmol)，攪拌17小時，滴加300mL的乙腈/0.1%TFA水=1/1試劑，控溫＜20℃，製備純化凍乾得到 CR202KG（1.65g，純度：98.3%，產率67.5%）。LC-MS:[M+H] +:1048.29。
將 CR202KG（0.82 g, 0.76 mmol）溶解於乾燥的DMAc（13 mL）中，冰浴冷卻至內溫10℃，加入 CR20274（0.74 g，0.84 mmol）和HOBT（0.1032 g，0.76 mmol），隨後加入DIPEA（0.16mL），移去冰浴攪拌3.5小時。反應液製備純化凍乾得到 CR202KH（1.0781 g，純度：98.23%，產率：78.7%）。LC-MS：[M+2] 2+:897.21。
將 CR202KH（0.50 g, 0.28 mmol）溶解於甲醇（50mL）中，降溫至10℃，滴加0.1 M LiOH（25 mL），控溫在10～15℃，反應25分鐘，取樣中控反應結束，滴加入5%AcOH調pH=5，純化凍乾得到 CR202KJ（0.24g，純度：98.84%，產率：45.3%）。LC-MS:[M+2] 2+：813.18。
將 CR202KJ（0.22 g, 0.135 mmol）和CR202W4（0.25 g, 0.162 mmol）溶解於DMF:H 2O=1:1（6.6 mL）中，控溫20℃，滴加DIPEA調pH=8.0。加入CuBr（20.1 mg，0.135 mmol），攪拌1.5小時，取樣HPLC中控至反應完全，將反應液溫度降至0℃，滴加2% TFA調pH=3，製備純化得到 CR202HU（0.11 g，純度：95.3%，產率：26.2%）。
4.24 CR202HR的合成
將 CR202JN（520.0mg，0.135mmol）溶於DMF/水（9/1，40 mL）中，加入 CR202HG（250.0mg，0.155mmol）和CuBr（48.4mg，0.337mmol），氮氣置換三次，pH=7，控制反應液溫度為25℃，磁力攪拌3～5小時，HPLC中控監測反應完全，停止反應，反應液製備純化，凍乾得到黃色固粉末 CR202HR（358.6 mg，純度97.78%，回收率:40.75%），[M/4+H] +=1367.50。
4.25 CR202MT的合成
採用與L-01的類似方法，製備得到黃色固體 CR202MS。
採用與 CR20282的類似方法，製備得到 CR20275。
將 CR20275（150.1 mg，0.10 mmol）和 CR202MS（81.2 mg，0.12 mmol）加入到50% ACN/H 2O（15 mL）中，再加入10 mmol/L Na 2HPO 4調節反應液pH至4～6，25 ℃反應1小時，HPLC中控至反應完全。反應液直接製備純化，得 CR202MT（90.0 mg，純度：93.46%，回收率：41.3%）。 實施例2     溶解性實驗研究
溶解度實驗通用操作：向偶聯體化合物（1.0 mg）和單獨的蛋白降解嵌合體分批加入PBS（pH=7.2～7.4），每次0.05 mL，渦旋2分鐘，直至固體溶解，溶解度計算公式：C=m/V，C：濃度，m：樣品重量，V：PBS總體積。 表1.     溶解度
化合物 CR202V5 CR202V6 CR202V7 CR202W4 CR20282 CR20293 CR20295 CR20297
濃度mg/mL 2.8 1.9 1.5 2.8 13.4 20.6 26.4 10.6
化合物 CR202Z6 CR202V4 CR202V8 CR202V9 CR202AL CR202W1 CR20274   
濃度mg/mL 2.7 8.0 7.5 15.8 5.7 8.1 ＜0.9   
實驗結論：從上表可以看出，偶聯體化合物的溶解度顯著高於單獨的蛋白降解嵌合體（即CR20274）。 實施例3     酶切實驗研究
1.     CR20282、CR20293、CR20295、CR20297的組織蛋白酶B酶切實驗研究
樣品資訊（酶切實驗）：CR20282、CR20293、CR20295、CR20297、組織蛋白酶B-human liver（來源：Sigma）、半胱胺酸（來源：Sigma）、醋酸鈉和EDTA（上海淩峰）。
實驗方案：將各偶聯體化合物用乙腈-水（1:1含0.1%TFA）溶解配製成1 mg/mL母液；取30 μL 1 mg/mL各化合物母液加至570 μL的50 mM NaOAc（含1 mM EDTA和10 mM半胱胺酸）溶液中，混勻；再加入7 μL組織蛋白酶B（濃度為0.05U/μl），輕柔混勻，將整個反應樣品置於37℃恆溫箱中孵育0、1、2、4和8小時；各時間點取樣進HPLC分析。
實驗結果與分析：由表2和3可知，組織蛋白酶B的酶切作用下，各藥物均具有較好的載藥釋放速率。 表2      酶切各偶聯體化合物的主成分剩餘率
時間 CR20282 CR20293 CR20295 CR20297
0小時 87% 100% 100% 100%
1小時 17% 76% 46% 55%
2小時 8% 46% 22% 27%
4小時 2% 27% 8% 10%
8小時 0% 7% 0% 0%
表3      酶切各偶聯體化合物的CR20274生成率
時間點 CR20282 CR20293 CR20295 CR20297
0小時 9% 0% 0% 0%
1小時 79 % 17% 15% 21%
2小時 86% 38% 16% 40%
4小時 89% 59% 18% 55%
8小時 86% 64% 24% 61%
2.     CR202V4、CR202V5、CR202V6、CR202V7和CR202Z6的組織蛋白酶B酶切速率研究
樣品資訊（酶切實驗）：CR202V4、CR202V5、CR202V6、CR202V7、CR202Z6、組織蛋白酶B-human liver（來源：Sigma)、半胱胺酸（來源：Sigma)、醋酸鈉和EDTA（來源：上海淩峰）。
實驗步驟： 1)               用0.1%TFA-乙腈水（1:1）將各偶聯體化合物配置成500 µg/mL母液； 2)               取60 μL的500 μg/mL化合物母液加入至536 µL的50 mM NaOAc（含1 mM EDTA+10 mM Cys），再加入4 μL 組織蛋白酶B（CB酶），輕微振盪混勻； 3)               將上述2)中酶切反應物置於37℃恆溫培養箱中孵育0小時、1小時、2小時、4小時和24小時，到點進樣，各時間點取樣進LC-MS分析。
實驗結果與分析：由表4和5可知，在CB酶的作用下，各藥物均具有較好的載藥釋放速率。 表4.     各化合物酶切主成分剩餘率
時間 CR202V4 CR202V5 CR202V6 CR202V7 CR202Z6
0小時 100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 100.00%
1小時 0.00% 2.37% 11.20% 30.64% 6.89%
2小時 0.00% 0% 2.66% 13.69% 0.58%
4小時 0.00% 0% 0% 3.70% 0.41%
24小時 0.00% 0% 0% 0% 0%
表 5. 各化合物酶切 CR20274 生成率
時間 CR202V4 CR202V5 CR202V6 CR202V7 CR202Z6
0小時 0% 0% 0% 0% 0%
1小時 100% 100% 6% 57% 100%
2小時 100% 100% 88% 89% 100%
4小時 100% 100% 100% 100% 100%
24小時 100% 100% 100% 100% 100%
3.     CR202V8和CR202W1酶切速率研究
透過纖溶酶和硫酸酯酶的酶切作用觀察偶聯體化合物CR202V8（含纖溶酶酶切基團）和CR202W1（含硫酸酯酶酶切基團）的化合物結構穩定性。
實驗步驟： 1)            用PBS（pH=7.4）將各化合物配置成500 μg/mL母液； 2)            取60 μL的500 μg/mL化合物母液加入至420 μL PBS（pH=7.4）中，再加入60 μL 0.2U/mL纖溶酶（或60 μL 0.5U/mL硫酸酯酶），輕微振盪混勻； 3)            將上述2)中酶切反應物置於37℃恆溫培養箱中孵育0小時、1小時、2小時、4小時和24小時，到點進樣，各時間點取樣進LC-MS分析。
實驗結果與分析：由表6和7可知，CR202V8和CR202W1均具有較快的載藥釋放速率。其中，相比於CR202W1，CR202V8的載藥釋放速率更快。 表6.     各化合物酶切主成分剩餘率
時間 CR202V8 CR202W1
0小時 8% 97%
1小時 1% 89%
2小時 1% 80%
4小時 0% 69%
24小時 0% 37%
表7.     各化合物酶切CR20274生成率
時間 CR202V8 CR202W1
0小時 22% 0%
1小時 100% 9%
2小時 100% 15%
4小時 100% 27%
24小時 100% 56%
4、  研究CR202AL的β-葡萄糖苷酶酶切速率
透過β-葡萄糖苷酶的酶切作用觀察偶聯體化合物CR202AL的化合物結構穩定性，並觀察是否有其他酶切片段，確定酶切位點。
實驗步驟： 1)            用PBS（pH=6.8）將CR202AL配置成500 μg/mL母液； 2)            取100 μL的500 μg/mL化合物母液加入至775 μL PBS（pH=6.8）中，再加入125 μL 100U/mL β-葡萄糖苷酶，輕微振盪混勻； 3)            將上述2)中酶切反應物置於25℃恆溫培養箱中孵育0小時、1小時、2小時、4小時、24小時，到點進樣，各時間點取樣進LC-MS分析。
實驗結果與分析：由表8和9可知，β-葡萄糖苷酶酶切作用下，CR202AL具有較好的載藥釋放速率。 表8.     CR202AL酶切主成分剩餘率
時間 CR202AL
0小時 100.00%
1小時 26.70%
2小時 9.75%
4小時 4.87%
24小時 0.00%
表9.     CR202AL酶切CR20274生成率
時間 CR202AL
0小時 5.16%
1小時 107.33%
2小時 146.03%
4小時 146.54%
24小時 100.80%
實施例4     血漿穩定性研究
1.     CR20282、CR20285、CR20293、CR20295和CR20297的血漿穩定性研究實
樣品資訊：CR20282、CR20285、CR20293、CR20295、CR20297、甲醇和小鼠血漿。
實驗方案：將各偶聯體化合物用乙腈-水（1:1）或乙腈-水（1:1含0.1%TFA）溶解配製成1 mg/mL母液；取10 μL 1 mg/mL母液加至90 μL血漿中，輕柔混勻，將血漿藥物樣置於37℃恆溫箱中孵育0、0.5、1、2、4、6和24小時；到反應時間點後取出樣品，加300 μL甲醇溶液（含10 ng/mL特菲那定）進行蛋白沉澱；離心（12 min、4℃、12000 rpm），取上清，保存於零下80℃的冰箱中，收集完所有時間點樣品，進行LC-MS分析。
實驗結果與分析：由表10和11可知，各偶聯體化合物在血漿中較穩定，在血漿中釋放的有效載荷較少且速度較慢。 表10.   各化合物血漿穩定性主成分剩餘率
時間 CR20282 CR20285 CR20293 CR20295 CR20297
0小時 86.91% 80.03% 83.13% 92.38% 85.14%
0.5小時 78.98% 73.49% 75.57% 85.39% 87.68%
1小時 80.58% 70.41% 75.83% 72.91% 77.46%
2小時 67.29% 68.31% 67.76% 71.15% 74.50%
4小時 54.93% 63.85% 69.79% 64.95% 79.71%
6小時 55.92% 60.08% 70.46% 41.82% 43.25%
24小時 15.25% 26.68% 45.43% 20.02% 22.96%
表11.   各化合物血漿穩定性CR20274生成率
時間 CR20282 CR20285 CR20293 CR20295 CR20297
0小時 0.01% 0.20% 0.00% 0.02% 0.05%
0.5小時 0.27% 0.56% 0.17% 0.09% 0.13%
1小時 0.36% 0.52% 0.32% 0.10% 0.15%
2小時 0.41% 0.80% 0.52% 0.19% 0.38%
4小時 0.50% 1.39% 0.67% 0.31% 0.47%
6小時 0.65% 1.51% 0.95% 0.19% 0.38%
24小時 0.84% 3.09% 3.38% 0.71% 1.34%
2.     CR202V4、CR202V5、CR202V6、CR202V7、CR202V8、CR202V9、CR202Z6、CR202W1、CR202AL和CR20282的血漿穩定性研究
樣品資訊：CR202V4、CR202V5、CR202V6、CR202V7、CR202V8、CR202V9、CR202Z6、CR202W1、CR202AL、CR20282、甲醇和小鼠血漿。
實驗步驟： 1)          用0.1%TFA-乙腈水（1:1）將各偶聯體化合物配置成1 mg/mL母液； 2)          取10 μL 1mg/mL化合物母液加入至90 μL新鮮血漿，輕微振盪混勻，置於37℃恆溫培養箱中孵育0小時、0.5小時、1小時、2小時、4小時、6小時和24小時； 3)          到反應時間點後取出樣品，加300 μL甲醇溶液（含10 ng/mL特菲那定）進行蛋白沉澱； 4)          離心（13分鐘、4℃、12000 rpm），取上清，保存於零下80℃的冰箱中，收集完所有時間點樣品，進行LC-MS分析。
實驗結果與分析：由表12和13可知，各偶聯體化合物在血漿中較穩定，在血漿中釋放的有效載荷較少且速度較慢。 表12.   各化合物血漿穩定性主成分剩餘率
時間 主成分 (CR202V4) 剩餘率 主成分 (CR202V5) 剩餘率 主成分 (CR202V6) 剩餘率 主成分 (CR202V7) 剩餘率 主成分 (CR202V8) 剩餘率 主成分 (CR202V9) 剩餘率 主成分 (CR202Z6) 剩餘率 主成分 (CR202W1) 剩餘率 主成分 (CR202AL) 剩餘率 主成分 (CR20282) 剩餘率
0h 84.13% 94.75% 91.24% 88.59% 78.37% 99.22% 105.34% 105.30% 76.04% 109.94%
0.5h 75.91% 100.98% 87.89% 80.93% 50.90% 99.85% 113.62% 89.44% 69.77% 95.98%
1h 74.31% 94.88% 87.91% 86.63% 59.93% 98.41% 111.67% 102.61% 78.07% 82.50%
2h 78.19% 94.66% 87.59% 75.50% 49.50% 89.57% 80.38% 105.09% 75.61% 83.10%
4h 61.27% 90.56% 82.48% 63.89% 41.21% 67.13% 88.43% 107.80% 74.87% 74.33%
6h 70.38% 80.42% 80.40% 66.20% 32.46% 66.29% 98.63% 84.83% 57.09% 66.72%
24h 1.36% -1.03% 0.00% -2.63% -2.40% 0.62% 4.82% -2.67% 1.20% -2.82%
表13.   各化合物CR20274釋放率
時間 CR202V4 中 CR20274 釋放率（實際釋放 / 理論釋放） CR202V5 中 CR20274 釋放率（實際釋放 / 理論釋放） CR202V6 中 CR20274 釋放率（實際釋放 / 理論釋放） CR202V7 中 CR20274 釋放率（實際釋放 / 理論釋放） CR202V8 中 CR20274 釋放率（實際釋放 / 理論釋放） CR202V9 中 CR20274 釋放率 （實際釋放 / 理論釋放） CR202Z6 中 CR20274 釋放率（實際釋放 / 理論釋放） CR202W1 中 CR20274 釋放率（實際釋放 / 理論釋放） CR202AL 中 CR20274 釋放率（實際釋放 / 理論釋放） CR20282 中 CR20274 釋放率（實際釋放 / 理論釋放）
0h -0.12% 0.02% 0.03% -0.02% 0.06% 0.11% 0.05% 0.68% 0.01% 0.00%
0.5h 0.04% 0.17% 0.07% 0.15% 1.94% 0.17% 0.22% 0.63% 0.47% 0.34%
1h 0.11% 0.25% 0.15% 0.24% 5.56% 0.22% 0.34% 0.83% 0.86% 0.48%
2h 0.17% 0.37% 0.26% 0.28% 7.07% 0.21% 0.25% 0.80% 0.96% 0.84%
4h 0.30% 0.94% 0.47% 0.37% 14.20% 0.25% 0.37% 0.96% 2.60% 1.17%
6h 0.42% 0.97% 0.52% 0.49% 14.58% 0.30% 0.48% 0.88% 3.69% 1.60%
24h 2.62% 3.92% 2.47% 3.25% 105.58% 1.46% 1.95% 2.82% 28.17% 8.18%
實施例5     偶聯體化合物CR20214對不同腫瘤細胞的擴增抑制實驗
細胞株資訊 表14
細胞名稱 中文名稱
A549 人非小細胞肺癌細胞
HCC1954 人乳腺導管癌細胞
HCT-116 人結腸癌細胞
SK-BR-3 人乳腺腺癌細胞
U87MG 人腦星形膠質母細胞瘤細胞
NCI-H460 人大細胞肺癌細胞
RT4 人膀胱移行細胞乳頭瘤細胞
KB 人口腔表皮樣癌細胞
SCLC-21H 人小細胞肺癌細胞
LNCaP 人前列腺癌細胞
Hela 人子宮頸癌細胞
293T 人胚腎細胞
293T-FOLR1 人胚腎細胞高表現FOLR1
293T-FOLR1/PSMA 人胚腎細胞高表現FOLR1和PSMA
主要試劑：1640無葉酸培養基、胎牛血清、青黴素-鏈黴素溶液、L-麩醯胺酸和CCK8。
實驗步驟 1)   細胞鋪盤 提前準備好細胞，胰蛋白酶（Trypsin）消化、收集計數，使用完全細胞培養基將細胞稀釋成2×10 4個細胞/mL，鋪96孔盤，每個孔加入100 μL稀釋的細胞懸液，每塊盤設置陰性及空白對照孔。將加好細胞的96孔盤置於37℃，5%CO 2培養箱培養過夜。 2)   稀釋加樣 將樣品用培養基進行梯度稀釋（初始濃度10 μM，5倍梯度稀釋），共設置9個濃度梯度，將孔盤中的培養基吸棄，按照每孔100 μL的藥物溶液加入到96孔盤中，3個複孔，並設立陰性對照和空白對照，置於37℃，5%CO 2培養箱培養72小時。 3)   顯色讀盤 取CCK-8顯色液，每孔加入10 μL（孔內液體體積的10%），37℃孵育適宜時間（儘量使OD值在1.0～2.5範圍內），96孔盤去掉培養盤蓋，置於微量盤分析儀（Molecular Devices SpectraMax iD5），450 nm讀數數值。 4)   數據處理 使用GraphPad Prism 8.0.2進行四參數擬合曲線，得到IC 50值。 5)   實驗結果與分析 實驗結果：見表15，由表15可知，CR20214對各種類型的腫瘤細胞有殺傷作用。 表15.   化合物IC 50(nM)
細胞名稱 CR20214
A549 1603
HCC1954 3968
HCT-116 1117
SK-BR-3 1489
U87MG 907.3
NCI-H460 1595
RT4 275.5
KB 422.2
SCLC-21H 1795
LNCaP 52.23
Hela 950.2
293T 2023
293T-FOLR1 692.7
293T-FOLR1/PSMA 845.2
實施例6     偶聯體化合物CR20282、CR20285、CR20287、CR20293、CR20295、CR20297和CR202F0對不同腫瘤細胞的擴增抑制實驗
細胞株資訊 表16
細胞名稱 中文名稱 FOLR1/PSMA 表現情況
LNCaP 人前列腺癌細胞 PSMA高表現
22RV1 人前列腺癌細胞 PSMA高表現
C4-2 人前列腺癌細胞 PSMA高表現
MDA-MB-231-FOLR1 人乳腺癌細胞穩轉FOLR1 FOLR1高表現
MDA-MB-231-PSMA 人乳腺癌細胞穩轉PSMA PSMA高表現
293T-PSMA 人胚腎細胞 PSMA高表現
主要試劑：1640無葉酸培養基、胎牛血清、青黴素-鏈黴素溶液、L-麩醯胺酸和CCK8。
實驗步驟 1)   細胞鋪盤 提前準備好細胞，胰蛋白酶（Trypsin）消化、收集計數，使用完全細胞培養基將細胞稀釋成2×10 4個細胞/ml，鋪96孔盤，每個孔加入100 μL稀釋的細胞懸液，每塊盤設置陰性及空白對照孔。將加好細胞的96孔盤置於37℃，5%CO 2培養箱培養過夜。 2)   稀釋加樣 將樣品用培養基進行梯度稀釋（初始濃度10 μM，5倍梯度稀釋），共設置9個濃度梯度，將孔盤中的培養基吸棄，按照每孔100 μL的藥物溶液加入到96孔盤中，3個複孔，並設立陰性對照和空白對照，置於37℃，5%CO 2培養箱培養72小時。 3)   顯色讀盤 取CCK-8顯色液，每孔加入10 μL（孔內液體體積的10%），37℃孵育適宜時間（儘量使OD值在1.0～2.5範圍內），96孔盤去掉培養盤蓋，置於微量盤分析儀（Molecular Devices SpectraMax iD5），450nm讀數數值。 4)   數據處理 使用GraphPad Prism 8.0.2進行四參數擬合曲線，得到IC 50值。 5)   實驗結果與分析 實驗結果：見表17，由表17可知，CR20282、CR20285、CR20293、CR20295和CR20297對表現FOLR1和PSMA的各腫瘤細胞具有很強的殺傷作用。 表17.   化合物IC 50(nM)
IC 50（nM） LNCap 22RV1 C4-2 MDA-MB-231-FOLR1 MDA-MB-231-PSMA 293T-PSMA
CR20282 73.95 98.49 212.4 206.9 374.3 85.64
CR20295 10.58 3.239 5.074 13.89 8.695 85.64
CR20293 37.91 16.43 77.98 94.15 70.63 3267
CR20297 178 71.89 128.8 258.2 313.9 5827
CR20285 44.59 17.53 40.67 49.2 85.81 6047
CR202F0 1483 367.7 1121 10808 5951 12661
CR20287 1259 449 882.5 1630 2040 3314
實施例7     化合物CR20274和偶聯體化合物CR20282對不同腫瘤細胞的擴增抑制實驗
細胞株資訊 表18
細胞名稱 中文名稱 FOLR1/PSMA 表現情況
HepG2 人肝癌細胞 FOLR1和PSMA無可見表現
PC-3 人前列腺癌細胞 FOLR1和PSMA無可見表現
A549 人非小細胞肺癌細胞 FOLR1和PSMA無可見表現
NCI-H460 人大細胞肺癌細胞 FOLR1和PSMA無可見表現
主要試劑：1640無葉酸培養基、胎牛血清、青黴素-鏈黴素溶液、L-麩醯胺酸和CCK8。
實驗步驟 1)   細胞鋪盤 提前準備好細胞，胰蛋白酶（Trypsin）消化、收集計數，使用完全細胞培養基將細胞稀釋成2×10 4個細胞/ml，鋪96孔盤，每個孔加入100 μL稀釋的細胞懸液，每塊盤設置陰性及空白對照孔。將加好細胞的96孔盤置於37℃，5%CO 2培養箱培養過夜。 2)   稀釋加樣 將樣品用培養基進行梯度稀釋（初始濃度10 μM，5倍梯度稀釋），共設置9個濃度梯度，將孔盤中的培養基吸棄，按照每孔100 μL的藥物溶液加入到96孔盤中，3個複孔，並設立陰性對照和空白對照，置於37℃，5%CO 2培養箱培養72小時。 3)   顯色讀盤 取CCK-8顯色液，每孔加入10 μL（孔內液體體積的10%），37℃孵育適宜時間（儘量使OD值在1.0～2.5範圍內），96孔盤去掉培養盤蓋，置於微量盤分析儀（Molecular Devices SpectraMax iD5），450nm讀數數值。 4)   數據處理 使用GraphPad Prism 8.0.2進行四參數擬合曲線，得到IC 50值。 5)   實驗結果與分析 實驗結果：見表19，由表19可知，CR20274對不表現PSMA和FOLR1的細胞株依然有較強的殺傷作用，而CR20282對不表現PSMA和FOLR1的細胞幾乎無殺傷作用，這表明細胞膜表面缺乏FOLR1和PSMA，雙配體PROTAC靶向遞送受到阻礙，表明雙配體PROTAC相比PROTAC裸藥具有更好的靶向性。 表19.   化合物IC 50(nM)
IC 50 （ nM ） HepG2 PC-3 A549 NCI-H460
CR20274 106.8 103.2 124.2 314.2
CR20282 / / / /
實施例8     偶聯體化合物CR202V4、CR202V5、CR202V6、CR202V7、CR202V9、CR202W1、CR202Z6、CR202AL、CR202GM、CR202GQ、CR202FU、CR202HJ、CR202JG、CR202HU、CR202HV和CR202V8對不同腫瘤細胞的擴增抑制實驗
細胞株資訊：22RV1（人前列腺癌細胞）、C4-2（人前列腺癌細胞）和MDA-MB-231（人乳腺癌細胞）
主要試劑：1640無葉酸培養基、胎牛血清、青黴素-鏈黴素溶液、L-麩醯胺酸、CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay試劑
實驗步驟： 1)    細胞鋪盤 提前準備好細胞，Trypsin消化、收集計數，使用完全細胞培養基將細胞稀釋成1.5×10 4個細胞/mL，鋪96孔盤，每個孔加入100 μL稀釋的細胞懸液，每塊盤設置陰性及空白對照孔。將加好細胞的96孔盤置於37℃，5％CO 2培養箱培養過夜。 2)    稀釋加樣 將樣品用培養基進行梯度稀釋（初始濃度10μM，3倍梯度稀釋），共設置9個濃度梯度，將孔盤中的培養基吸棄，按照每孔100 μL的藥物溶液加入到96孔盤中，3個複孔，並設立陰性對照和空白對照，置於37℃，5％CO 2培養箱培養72小時。 3)    CellTiter-Glo 發光法檢測細胞活性 將CellTiter-Glo緩衝液融化並放置至室溫，將CellTiter-Glo基質放置至室溫，在一瓶CellTiter-Glo基質中加入CellTiter-Glo緩衝液以溶解基質，從而配製CellTiter-Glo工作液，緩慢渦旋震盪使充分溶解。取出細胞培養盤放置30分鐘使其平衡至室溫，在每孔中加入50μL（等於每孔中細胞培養液一半體積）的CellTiter-Glo工作液。用鋁箔紙包裹細胞盤以避光。將培養盤在軌道搖床上振搖2分鐘以誘導細胞裂解。培養盤在室溫放置10分鐘以穩定發光信號。置於微量盤分析儀（Molecular Devices SpectraMax iD5）檢測發光信號。 4)    數據處理 使用GraphPad Prism 8.0.2進行四參數擬合曲線，得到IC50值。 5)    實驗結果與分析 實驗結果：見表20，由表20可知，偶聯體化合物CR202V4、CR202V5、CR202V6、CR202V7、CR202V9、CR202W1、CR202Z6、CR202AL、CR202GM、CR202GQ、CR202FU、CR202HJ、CR202JG、CR202HU、CR202HV和CR202V8對不同腫瘤細胞均有較好的腫瘤抑制作用。 表20：化合物IC50(nM)
化合物名稱 細胞株名稱
22RV1 C4-2 MDA-MB-231
CR202V4 221.8 84.7 233.7
CR202V5 779.3 143.8 412.2
CR202V6 3.0 4.6 2.7
CR202V7 103.3 37.1 128.1
CR202V9 118.0 44.0 324.5
CR202W1 111.5 43.2 120.2
CR202Z6 370.4 272.5 344.4
CR202AL 6.3 0.5 2.5
CR202GM 286.7 / 512.1
CR202GQ 3162 / 4475
CR202FU 468.7 / 791.9
CR202HJ 1215 / 3653
CR202JG 1098 / 3779
CR202HU 1.52 / 5.5
CR202HV 154.6 / 14.19
CR202V8 20.47 / 24.07
備註：「/」表示沒有檢測。 實施例9 偶聯體化合物CR202W5、CR202W8、CR202W9和CR202W6以及單獨的蛋白降解嵌合體 CR202Z5、CR202Z8、CR202Z9和CR202ES對不同腫瘤細胞的擴增抑制實驗
細胞株資訊：LNCaP（人前列腺癌細胞）、VCaP（人前列腺癌細胞）
主要試劑：1640無葉酸培養基、胎牛血清、青黴素-鏈黴素溶液、L-麩醯胺酸、CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay試劑
實驗步驟： 1)    細胞鋪盤 提前準備好細胞，Trypsin消化、收集計數，使用完全細胞培養基將細胞稀釋成1.5×10 4個細胞/mL，鋪96孔盤，每個孔加入100 μL稀釋的細胞懸液，每塊盤設置陰性及空白對照孔。將加好細胞的96孔盤置於37℃，5％CO 2培養箱培養過夜。 2)    稀釋加樣 將樣品用培養基進行梯度稀釋（初始濃度10μM，3倍梯度稀釋），共設置9個濃度梯度，將孔盤中的培養基吸棄，按照每孔100 μL的藥物溶液加入到96孔盤中，3個複孔，並設立陰性對照和空白對照，置於37℃，5％CO 2培養箱培養72小時。 3)    CellTiter-Glo 發光法檢測細胞活性 將CellTiter-Glo緩衝液融化並放置至室溫，將CellTiter-Glo基質放置至室溫，在一瓶CellTiter-Glo基質中加入CellTiter-Glo緩衝液以溶解基質，從而配製CellTiter-Glo工作液，緩慢渦旋震盪使充分溶解。取出細胞培養盤放置30分鐘使其平衡至室溫，在每孔中加入50μL（等於每孔中細胞培養液一半體積）的CellTiter-Glo工作液。用鋁箔紙包裹細胞盤以避光。將培養盤在軌道搖床上振搖2分鐘以誘導細胞裂解。培養盤在室溫放置10分鐘以穩定發光信號。置於微量盤分析儀（Molecular Devices SpectraMax iD5）檢測發光信號。 4)    數據處理 使用GraphPad Prism 8.0.2進行四參數擬合曲線，得到IC 50值。 5)    實驗結果與分析 實驗結果：見表21，由表21可知，和單獨的蛋白降解嵌合體CR202Z5、CR202Z8、CR202Z9和CR202ES相比，偶聯體化合物CR202W5、CR202W8、CR202W9和CR202W6對不同腫瘤細胞具有相當甚至更優的殺傷效果。 表21：化合物IC50(nM)
化合物名稱 細胞株名稱
LNCaP VCaP
CR202Z5 373.1 182.9
CR202W5 442.9       75.3
CR202Z8 1.5 1.5
CR202W8 5.3 2.7
CR202Z9 417.7 12.4
CR202W9 72 180
CR202ES 8.7 10.9
CR202W6 12.2 4.7
實施例10   化合物CR202CC、CR202CF和CR202CI對腫瘤細胞的擴增抑制實驗
細胞株資訊 表22
細胞名稱 中文名稱 FOLR1/PSMA 表現情況
LNCaP 人前列腺癌細胞 PSMA高表現
SK-OV-3 人卵巢癌細胞 FOLR1高表現
主要試劑：1640無葉酸培養基、胎牛血清、青黴素-鏈黴素溶液、L-麩醯胺酸和CCK8。
實驗步驟 1)   細胞鋪盤 提前準備好細胞，胰蛋白酶（Trypsin）消化、收集計數，使用完全細胞培養基將細胞稀釋成2×10 4個細胞/ml，鋪96孔盤，每個孔加入100 μL稀釋的細胞懸液，每塊盤設置陰性及空白對照孔。將加好細胞的96孔盤置於37℃，5%CO 2培養箱培養過夜。 2)   稀釋加樣 將樣品用培養基進行梯度稀釋（初始濃度10 μM，5倍梯度稀釋），共設置9個濃度梯度，將孔盤中的培養基吸棄，按照每孔100 μL的藥物溶液加入到96孔盤中，3個複孔，並設立陰性對照和空白對照，置於37℃，5%CO 2培養箱培養72小時。 3)   顯色讀盤 取CCK-8顯色液，每孔加入10 μL（孔內液體體積的10%），37℃孵育適宜時間（儘量使OD值在1.0～2.5範圍內），96孔盤去掉培養盤蓋，置於微量盤分析儀（Molecular Devices SpectraMax iD5），450nm讀數數值。 4)   數據處理 使用GraphPad Prism 8.0.2進行四參數擬合曲線，得到IC 50值。 5)   實驗結果與分析 實驗結果：見表23。由表23可知，CR202CC、CR202CF和CR202CI對表現FOLR1和PSMA的各腫瘤細胞具有很強的殺傷作用。 表23.   化合物IC 50(nM)
IC 50（nM） LNCap SK-OV-3
CR202CC 0.3 /
CR202CF / 31.5
CR202CI / 0.3
實施例11   CR20214、CR20295、CR202V6、CR202AL的靶蛋白降解活性實驗
細胞株資訊：MDA-MB-231（人乳腺癌細胞）、22RV1（人前列腺癌細胞）
主要試劑耗材：
名稱 廠家 貨號
PBS(1×) gibco C100105OOBT
RIPA Lysis and Extraction Buffer Thermo 89901
Protease Inhibitor Cooktail bimake B14001
4×Laemmli sample buffer BIO-RAD 161-0747
Precision Plus Protein™ BIO-RAD 161-0377
Tris-Glycine Transfer Buffer (pH8.3, 10×) 康為世紀 CW0044S
TBS（pH8.0, 10×） 康為世紀 CW0042
Nonfat Dry Milk CST #9999
GAPDH(D4C6R)Mouse mAb CST #97166
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody CST #7076
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody CST #7074
ExpressPlus™ PAGE Gels,10×8, 4～20%, 15 wells 金斯瑞 M42015C
MOPS Running Bffer Liquid(20×) 金斯瑞 M00680-500
Clc-PARPity Max™ Western ECL Substrate BIO-RAD 1705062
BCA蛋白質定量試劑盒 TIANGEN PA115
實驗步驟：
蛋白樣品的提取： 1)      取適量的RIPA裂解液，在使用前數分鐘加入Protease Inhibitor Cooktail（1:100）。 2)      對細胞去除培養基，用細胞刮刮下，離心細胞，預冷PBS洗兩遍。按照每大皿300μL裂解液的比例加入裂解液。將離心管置於冰上，用槍頭吹打5分鐘，使裂解液和細胞充分接觸。 3)      裂解30分鐘後，收集裂解液並轉移到離心管中，離心樣品15分鐘，12000×g使細胞碎片成小球。 4)      將上清液轉移到新的離心管中，即可進行後續的Western操作。
BCA法濃度測定： 1)      4×Laemmli sample buffer中每900 μL加入100 μL巰基乙醇，現配現用。 2)      稀釋樣品：按20 μg～40 μg蛋白量每孔，15～20 μL上樣量每孔，計算出所加裂解液體積、PBS體積和4×loading buffer體積，三者充分混勻。 3)      變性樣品：90～95℃加熱5分鐘。
ExpressPlus™ PAGE電泳： 每孔加入適量蛋白質樣品溶液，挑選孔中加入預染標記（marker）蛋白質溶液做為電泳標記，上樣後在恆壓140V條件下電泳直至溴酚蘭跑膠底部為止。
轉膜： 1)      先把硝酸纖維素膜用甲醇處理5～10秒，再用純水處理1～2分鐘，然後用轉膜緩衝液30分鐘平衡硝酸纖維素膜和厚濾紙各30分鐘； 2)      將膠和硝酸纖維素膜夾於兩層厚濾紙之間逐層鋪平，做成「三明治」，並將其轉移到濕轉轉膜儀上，恆流300 mA 2小時； 3)      轉膜結束後，用鑷子將膜取出，按自己便於記憶的位置做好標記。
封閉： 將經1×TBST洗滌的硝酸纖維素膜浸沒於用1×TBST緩衝液配製的5% Nonfat Dry Milk封閉液中，20～25度孵育2小時；1×TBST溶液洗膜2次，1×TBS溶液洗膜1次，每次5分鐘。
孵育一抗： 封閉完成後將配好一抗溶液和硝酸纖維素膜加入雜交袋中4℃過夜；1×TBST溶液洗膜2次，1×TBS溶液洗膜1次，每次5分鐘。
孵育二抗： 用稀釋後的二抗孵育硝酸纖維素膜1.5小時後棄去多餘的抗體溶液，1×TBST溶液洗膜2次，1×TBS溶液洗膜1次，每次5分鐘。
顯色曝光： 採用HRP標記的抗體耦聯增強化學發光試劑進行顯色，然後透過X射線膠片曝光，經過顯影、水洗和定影後確定抗原-抗體（一抗）-抗體（二抗）在硝酸纖維素膜上的位置。用凝膠成像系統掃描 X 射線膠片上出現的條帶，以GAPDH作為參照。
結果分析：由西方墨點法實驗結果可知（參見圖2～4），CR20214、CR20295、CR202V6和CR202AL能快速降解靶蛋白。其中，CR20214在100 nM濃度下，6小時幾乎能完全降解BRD4和PLK1（圖2）。CR20295在100 nM濃度下，6小時幾乎能夠完全降解BRD4靶蛋白（圖3A）；當CR20295在10 nM濃度下，24小時幾乎能完全降解BRD4（圖3B）。CR202V6和CR202AL在3 nM濃度下，6小時幾乎能完全降解BRD4靶蛋白（圖4A），顯示出優異的靶蛋白降解活性，24小時仍然有較強的降解活性（圖4B）。 實施例12   化合物對人肝癌HepG2細胞皮下移植腫瘤在BALB/c裸小鼠模型的藥效學評價
實驗目的：臨床前評價CR202系列化合物對無FOLR1和PSMA受體表現的皮下HepG2肝細胞癌移植腫瘤模型在BALB/c裸小鼠體內的藥效。
實驗方案：將0.1 mL（10×10 6個）HepG2細胞皮下接種於每隻小鼠的右背側，腫瘤平均體積達到100～150 mm 3時隨機分組，設置模型對照組和給藥組，在分組第一天開始給藥。在給藥開始前，稱量所有動物的體重，並用遊標卡尺測量腫瘤體積。腫瘤細胞接種後，常規監測包括了腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響，具體內容有實驗動物的活動性，攝食和飲水情況，體重增加或降低情況，眼睛、被毛及其它異常情況。開始給藥後，定期測量小鼠的體重和腫瘤的大小。腫瘤體積計算公式：腫瘤體積（mm 3）V= 1/2×(a×b 2)（其中a表示長徑，b表示短徑）。腫瘤生長抑制率，TGI(%)，計算公式為：TGI% =（1-T/C）×100%（T和C分別為治療組和對照組在某一特定時間點的平均腫瘤體積）實驗分組與設計如下表24所示： 表24.   HepG2動物模型實驗分組和給藥方案
組別 動物數 測試物 劑量（ mg/kg ） 給藥方式 給藥體積（ ml/kg ） 計劃給藥週期
1 6 對照 -- -- -- --
2 6 CR20274 4 iv 10 biw×3w
3 6 CR20282 12.5 iv 10 biw×3w
4 6 CR20282 12.5 iv 10 qw×3w
注：biw×3w是指每週施藥兩次，持續3週（下同）；qw×3w是指每週施藥1次，持續3週（下同）。
實驗結果分析：陰性對照組在分組後第36天平均瘤體積達到1726.90 mm 3。測試物 CR20274在4 mg/kg，biw×3給藥方案下未表現出一定的腫瘤生長抑制作用，在分組後第36天平均瘤體積達到1329.84 mm 3，TGI值為22.99%，與陰性對照組相比無顯著性差異（P=0.382）。測試物 CR20282在12.5 mg/kg，biw×3和12.5mg/kg，qw×3的兩種給藥方案下未表現出一定的腫瘤生長抑制作用，與陰性對照組相比無顯著性差異（P=0.701）。具體可參見圖5A～圖5B。
測試物CR20274和CR20282在設定給藥頻率方案下對人肝癌模型HepG2荷瘤小鼠的腫瘤生長均未產生良好的抗腫瘤效果。而小鼠人肝癌模型HepG2為不表現FOLR1和PSMA的模型，由此可得出雙配體PROTAC化合物在無相應靶點蛋白表現的動物模型中，無明顯的抗腫瘤效果。 實施例13   化合物對皮下異體移植人乳腺癌MDA-MB-231腫瘤模型的藥效學評價
實驗目的：臨床前評價測試物CR20274、CR20282和CR20285在皮下人乳腺癌模型MDA-MB-231在BALB/c裸小鼠體內的藥效學研究。
實驗方案：將MDA-MB-231瘤塊皮下接種於每隻小鼠的右側腋下，腫瘤平均體積達到200 mm 3時開始分組給藥。在給藥後，每天監測動物的健康狀況及死亡情況，例行檢查包括觀察腫瘤生長和藥物治療對動物日常行為表現的影響行為活動，攝食攝水量，體重變化，外觀體徵或其它不正常情況。考察腫瘤生長是否被抑制、延緩或治癒。定期檢測腫瘤體積。腫瘤體積的計算公式為：V=1/2×(a×b 2)，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。腫瘤生長抑制率，TGI(%)，計算公式為：TGI% =（1-T/C）×100%（T和C分別為治療組和對照組在某一特定時間點的平均腫瘤體積）。實驗分組和給藥方案見下表25所示： 表25.   MDA-MB-231動物模型實驗分組和給藥方案
組別 動物數 測試物 劑量 （ mg/kg ） 給藥方式 計劃給藥週期
1 6 對照 N/A N/A N/A
2 6 CR20274 4 iv biw×3
3 6 CR20282 12.5 iv qw×3
4 6 CR20282 12.5 iv biw×3
5 6 CR20282 6 iv biw×3
6 6 CR20285 12.5 iv qw×3
7 6 CR20285 6 iv biw×3
實驗結果分析：人乳腺癌模型MDA-MB-231在荷瘤小鼠腫瘤體積變化請參見圖6A，人乳腺癌模型MDA-MB-231荷瘤小鼠相較初始體重隨給藥時間的變化參見圖6B。可見， CR2028212.5 mg/kg biw×3對小鼠異體移植結人乳腺癌模型MDA-MB-231的腫瘤生長產生了顯著的抗腫瘤效果，且安全性較高。 CR2028212.5 mg/kg qw×3、 CR2028512.5 mg/kg qw×3、 CR202856mg/kg biw×3、 CR202823mg/kg biw×3和 CR202853mg/kg biw×3對小鼠異體移植結人乳腺癌模型MDA-MB-231的腫瘤也有一定的抗腫瘤效果。 CR202744 mg/kg biw×3對小鼠異體移植結人乳腺癌模型MDA-MB-231的腫瘤則沒有抗腫瘤效果。該結果表明，相比於蛋白降解靶向嵌合體，連接有靶向分子的偶聯體化合物能顯著提高的抗腫瘤作用。 實施例14   化合物對人前列腺癌22RV1細胞皮下移植腫瘤在BALB/c裸小鼠模型的藥效學評價
實驗目的：臨床前評價化合物對治療皮下22RV1細胞移植腫瘤模型（高表現PSMA）在BALB/c裸小鼠體內的藥效學研究。
實驗方案：將22RV1瘤塊皮下接種於每隻小鼠的右背側下，腫瘤平均體積達到150 mm 3時開始分組給藥。在給藥後，每天監測動物的健康狀況及死亡情況，例行檢查包括觀察腫瘤生長和藥物治療對動物日常行為表現的影響行為活動，攝食攝水量，體重變化，外觀體徵或其它不正常情況。考察腫瘤生長是否被抑制、延緩或治癒。定期檢測腫瘤體積。腫瘤體積的計算公式為：V = 1/2×(a×b 2)，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。實驗分組和給藥方案見下表26所示： 表26.   22RV1動物模型中的給藥途徑、劑量及方案
組別 動物數 測試物 劑量 （ mg/kg ） 給藥方式 給藥體積（ ml/kg ） 計劃給藥週期
1 6 對照 -- -- -- --
2 6 CR20274 4 iv 10 biw×3
3 6 CR20282 12.5 iv 10 biw×3
4 6 CR20293 12.5 iv 10 biw×3
5 6 CR20295 12.5 iv 10 biw×3
6 6 CR20297 12.5 iv 10 biw×3
實驗結果分析：人前列腺癌模型22RV1荷瘤小鼠相較初始體重隨給藥時間的變化情況請參見圖7A。本實驗中，BALB/c荷瘤裸小鼠對不同劑量的測試物耐受良好，體重呈增長趨勢，實驗期間無小鼠死亡。
人前列腺癌模型22RV1荷瘤小鼠腫瘤體積變化情況請參見圖7B。陰性對照組在分組後第31天平均瘤體積達到1861.79 mm 3。測試物 CR20274在4 mg/kg，biw×3給藥方案下未表現出一定的腫瘤生長抑制作用，在分組後第31天平均瘤體積達到1274.47 mm 3，TGI值為31.55%，與陰性對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。測試物 CR20282在12.5 mg/kg，biw×3給藥方案下表現出極顯著的腫瘤生長抑制作用，在分組後第31天平均瘤體積達到21.22 mm 3，TGI值為98.86%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。測試物 CR20293在12.5 mg/kg，biw×3給藥方案下表現出極顯著的腫瘤生長抑制作用，在分組後第31天平均瘤體積達到46.32 mm 3，TGI值為97.51%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。測試物 CR20295在12.5 mg/kg，biw×3給藥方案下表現出極顯著的腫瘤生長抑制作用。在分組後第31天平均瘤體積達到86.32 mm 3，TGI值為95.36%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。測試物 CR20297在12.5 mg/kg，biw×3給藥方案下表現出極顯著的腫瘤生長抑制作用，在分組後第31天腫瘤完全消退，TGI值為100.00%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。
可見，相比對照組和CR20274，測試物CR20282、CR20293、CR20295和CR20297對人前列腺癌模型22RV1荷瘤小鼠的腫瘤生長均產生顯著的抗腫瘤效果；且BALB/c荷瘤裸小鼠對上述測試物耐受良好，體重呈增長趨勢，實驗期間無小鼠死亡。 實施例15   化合物對人前列腺癌C4-2細胞皮下移植腫瘤在NCG小鼠模型的藥效學評價
實驗目的：臨床前評價化合物對治療皮下C4-2細胞移植腫瘤模型（高表現PSMA）在NCG小鼠體內的藥效影響。
實驗方案：將C4-2細胞皮下接種於每隻小鼠的右背側，腫瘤平均體積達到100～150 mm 3時分組給藥，給藥後，常規監測包括腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響，具體內容有實驗動物的活動性，攝食和飲水情況，體重增加或降低情況，眼睛、被毛及其它異常情況。試驗過程中觀察到的臨床症狀均記錄在原始數據中。開始給藥後，定期測量小鼠的體重和腫瘤的大小。腫瘤體積的計算公式為：V = 1/2×(a×b 2)，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。實驗分組和給藥方案見下表27所示： 表27.   C4-2動物模型中的給藥途徑、劑量及方案
組別 動物數 測試物 劑量 （ mg/kg ） 給藥方式 給藥體積（ ml/kg ） 計劃給藥週期
1 5 對照 -- -- -- --
2 5 CR20274 4 i.v 10 biw×3w
3 5 CR20282 12.5 i.v 10 biw×3w
4 5 CR20285 12.5 i.v 10 biw×3w
5 5 CR20293 12.5 i.v 10 biw×3w
6 5 CR20295 12.5 i.v 10 biw×3w
7 5 CR20297 12.5 i.v 10 biw×3w
實驗結果分析：小鼠人前列腺癌模型C4-2荷瘤小鼠相較初始體重隨給藥時間的變化情況請參見圖8A。本實驗中，BALB/c荷瘤裸小鼠對不同劑量的測試物耐受良好，體重呈增長趨勢，實驗期間基本無小鼠死亡。
小鼠人前列腺癌模型C4-2荷瘤小鼠相較初始體重隨給藥時間的變化情況請參見圖8B。陰性對照組在分組後第23天平均瘤體積達到1748.61 mm 3。測試物 CR20274在4 mg/kg，biw×3給藥方案下未表現出一定的腫瘤生長抑制作用，在分組後第23天平均瘤體積達到2198.07 mm 3，TGI值為-25.70%，與陰性對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。測試物 CR20282在12.5mg/kg，biw×3給藥方案下表現出一定的腫瘤生長抑制作用，在分組後第23天平均瘤體積達到557.12 mm 3，TGI值為68.14%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.01）。測試物 CR20293在12.5 mg/kg，biw×3給藥方案下表現出一定的腫瘤生長抑制作用，在分組後第23天平均瘤體積達到778.70 mm 3，TGI值為55.47%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.05）。測試物 CR20295在12.5 mg/kg，BIW×3給藥方案下表現出一定的腫瘤生長抑制作用。在分組後第23天平均瘤體積達到415.38 mm 3，TGI值為76.25%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。測試物 CR20297在12.5 mg/kg，biw×3給藥方案下表現出優異的腫瘤生長抑制作用，在分組後第23天平均瘤體積達到300.72 mm 3，TGI值為82.80%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。
綜上所述，相比對照組和CR20274，測試物CR20282、CR20293、CR20295和CR20297對小鼠人前列腺癌模型C4-2的腫瘤生長均表現出比較好的抗腫瘤效果和安全性。 實施例 16 ：化合物對 HT-29 細胞皮下移植腫瘤在 BALB/c 裸小鼠模型的藥效學評價
實驗目的：臨床前評價CR202系列化合物對治療皮下HT-29細胞移植腫瘤模型在BALB/c nude小鼠體內的藥效影響。
實驗方案：將: HT-29細胞皮下接種於每隻小鼠的右背側，腫瘤平均體積達到100～150 mm 3時分組給藥，給藥後，常規監測包括腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響，具體內容有實驗動物的活動性，攝食和飲水情況，體重增加或降低情況，眼睛、被毛及其它異常情況。試驗過程中觀察到的臨床症狀均記錄在原始數據中。開始給藥後，定期測量小鼠的體重和腫瘤的大小。腫瘤體積的計算公式為：V = 1/2×(a×b 2)，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。實驗分組和給藥方案見下表28所示： 表28.   HT-29動物模型中的給藥途徑、劑量及方案
組別 動物數 測試物 劑量 （ mg/kg ） 給藥方式 計劃給藥週期
1 6 對照 -- -- --
2 6 CR20274 2 i.v biw×3w
3 6 CR20274 4 i.v biw×3w
4 6 CR20282 6 i.v biw×3w
5 6 CR20282 12.5 i.v biw×3w
6 6 CR202EZ 10.4 i.v biw×3w
7 6 CR202EZ 21.6 i.v biw×3w
8 6 CR202HR 10.9 i.v biw×3w
9 6 CR202HR 22.7 i.v biw×3w
實驗結果與分析：本實驗中，CR20282，CR202EZ，CR202HR與等莫耳劑量的CR20274相比，在低劑量和高劑量下均表現良好的抑瘤率和安全性（參見圖9A～9B）。給藥組小鼠耐受性良好，體重呈增長趨勢，實驗期間無小鼠異常死亡。陰性對照組在分組後第25天平均瘤體積達到2079.64 mm 3，實施安樂死。
測試物CR20274在2 mg/kg，BIW×3給藥方案下表現出一定的腫瘤生長抑制作用。在分組後第25天平均瘤體積達到1575.84 mm 3，TGI值為24.23%，與陰性對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。
測試物CR20274在4 mg/kg，BIW×3給藥方案下表現出一定的腫瘤生長抑制作用。在分組後第25天平均瘤體積達到1316.64 mm 3，TGI值為36.69%，與陰性對照組相比差異不顯著（P＞0.01）。
測試物CR20282在6 mg/kg，BIW×3給藥方案下表現出一定的腫瘤生長抑制作用。在分組後第25天平均瘤體積達到971.53 mm 3，TGI值為53.28%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。
測試物CR20282在12.5 mg/kg，BIW×3給藥方案下表現出一定的腫瘤生長抑制作用。在分組後第25天平均瘤體積達到670.36 mm 3，TGI值為67.77%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。
測試物CR202EZ在10.4 mg/kg，BIW×3給藥方案下未表現出一定的腫瘤生長抑制作用。在分組後第25天平均瘤體積達到1082.77 mm 3，TGI值為47.93%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。
測試物CR202EZ在21.6 mg/kg，BIW×3給藥方案下表現出一定的腫瘤生長抑制作用。在分組後第25天平均瘤體積達到691.438mm 3，TGI值為66.75%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。
測試物CR202HR在10.9 mg/kg，BIW×3給藥方案下表現出優異的腫瘤生長抑制作用。在分組後第25天平均瘤體積達到946.05 mm 3，TGI值為54.51%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。
測試物CR202HR在22.7 mg/kg，BIW×3給藥方案下表現出優異的腫瘤生長抑制作用。在分組後第25天平均瘤體積達到614.73 mm 3，TGI值為70.44%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。
綜上所述，測試物CR20282、CR202EZ、CR202HR對小鼠皮下移植人結直腸癌模型HT-29的腫瘤生長均表現較好的抗腫瘤效果且呈明顯的劑量相關。 實施例 17 ：化合物在人前列腺癌 22Rv-1 細胞株皮下異種移植 BALB/c Nude 雄性小鼠模型中的藥效學評價
實驗目的：臨床前評價CR202系列化合物在人源前列腺癌22Rv-1細胞株皮下異種移植BALB/c Nude雄性小鼠模型中的抗腫瘤作用。
實驗方案：22Rv-1（CL-00458）細胞培養在含10%胎牛血清的PRMI1640培養液中。收集指數生長期的22Rv-1細胞，PBS重懸至適合濃度用於裸鼠皮下腫瘤接種。實驗小鼠於右側背部皮下接種1×107 22Rv-1細胞，細胞重懸在1:1的PBS與基質膠中（0.1 mL/隻）定期觀察腫瘤生長情況，待腫瘤生長至平均體積100～150 mm 3時根據腫瘤大小隨機分組給藥。給藥後，常規監測包括腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響，具體內容有實驗動物的活動性，攝食和飲水情況，體重增加或降低情況，眼睛、被毛及其它異常情況。試驗過程中觀察到的臨床症狀均記錄在原始數據中。開始給藥後，定期測量小鼠的體重和腫瘤的大小。腫瘤體積的計算公式為：V = 1/2×(a×b2)，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。實驗分組和給藥方案見下表29所示： 表29.   22Rv-1動物模型中的給藥途徑、劑量及方案
組別 動物數 測試物 劑量（ mg/kg ） 給藥方式 計劃給藥週期
1 6 對照 -- -- --
2 6 CR202LB 2.87 i.v biw×3w
3 6 CR202HT 2.88 i.v biw×3w
實驗結果與分析：本實驗中人源前列腺癌22Rv-1在荷瘤小鼠腫瘤體積變化請參見圖10A，人源前列腺癌22Rv-1荷瘤小鼠相較初始體重隨給藥時間的變化參見圖10B。由此可見，CR202LB和CR202HT均表現良好的抑瘤率和安全性。給藥組小鼠耐受性良好，體重呈增長趨勢，實驗期間無小鼠異常死亡。陰性對照組在分組後第29天平均瘤體積達到1651.17 mm3，實施安樂死。
測試物CR202LB在2.87 mg/kg，BIW×3給藥方案下表現出一定的腫瘤生長抑制作用。在分組後第29天平均瘤體積達到969.46 mm3，TGI值為41.29%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。
測試物CR202HT在2.88 mg/kg，BIW×3給藥方案下表現出一定的腫瘤生長抑制作用。在分組後第29天平均瘤體積達到690.37 mm3，TGI值為58.19%，與陰性對照組相比呈顯著性差異（P＜0.001）。
綜上所述，CR202LB和CR202HT化合物對小鼠皮下移植人源前列腺癌22Rv-1的腫瘤生長均表現較好的安全性和一定的抗腫瘤效果。
與上述實驗方法類似，檢測本申請案其他偶聯化合物的抑瘤作用。實驗結果顯示，本申請案其他偶聯化合物均具有一定的抑瘤作用，且偶聯化合物的抑瘤效果優於裸藥。
實施例 18 ：化合物在人結直腸癌 HT-29 細胞株皮下異種移植 BALB/c Nude 雄性小鼠模型中的單次 PK 評價
實驗目的：化合物CR20214和CR20274在人結直腸癌HT-29細胞株皮下異種移植BALB/c Nude雄性小鼠模型中的單次PK評價。
實驗方案：將HT-29細胞系接種於每隻小鼠（購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，體重20～25g，雄性，年齡45～60天）的右背側皮下，腫瘤平均體積達到約300 mm 3時分組。HT-29荷瘤小鼠以尾靜脈注射的方式，分別單次給予6.25 mg/kg的CR20214和2 mg/kg的CR20274。給藥後分別於0.833、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48和72小時取腫瘤，並將腫瘤研磨後取勻漿液進行液液萃取，取離心後上清液注入三重四級桿串聯質譜儀，定量測定CR20274在腫瘤中的含量，見表30所示。 表30.   CR20214和CR20274在腫瘤組織中的濃度（nmol/g）
時間（ h ） CR20214 在腫瘤中釋放 CR20274 的濃度（ C1 ） CR20274 在腫瘤中的濃度（ C2 ） C1/C2
0.0833 0.044 0.227 0.19
0.25 0.060 0.206 0.29
0.5 0.164 0.222 0.74
1 0.108 0.191 0.57
2 0.191 0.180 1.06
4 0.265 0.164 1.62
8 0.353 0.154 2.29
24 0.271 0.104 2.61
48 0.166 0.064 2.59
72 0.133 0.044 3.02
實驗結果與分析：在等莫耳劑量給藥條件下，在腫瘤組織中，CR20214比CR20274具有更高的濃度，顯示了CR20214具有更好的靶向能力。
無
圖1示出了示例性的本申請案的偶聯體化合物。
圖2顯示了化合物CR20214降解靶蛋白的西方墨點法（Western Blot）實驗結果。
圖3顯示了化合物CR20295降解靶蛋白的西方墨點法（Western Blot）實驗結果。
圖4顯示了化合物CR202V6、CR202AL降解靶蛋白的西方墨點法（Western Blot）實驗結果。
圖5顯示了施用對照、CR20274和本申請案偶聯體化合物後，人肝癌模型HepG2的荷瘤小鼠中腫瘤體積變化（圖5A）和人肝癌模型HepG2的荷瘤小鼠相較初始體重隨給藥時間的變化情況（圖5B）。
圖6顯示了施用對照、CR20274和本申請案偶聯體化合物後，人乳腺癌模型MDA-MB-231的荷瘤小鼠中腫瘤體積變化（圖6A）和人乳腺癌模型MDA-MB-231的荷瘤小鼠相較初始體重隨給藥時間的變化（圖6B）。
圖7顯示了施用對照、CR20274和本申請案偶聯體化合物後，人前列腺癌模型22RV1的荷瘤小鼠相較初始體重隨給藥時間的變化情況（圖7A）和人前列腺癌模型22RV1的荷瘤小鼠中腫瘤體積變化情況（圖7B）。
圖8顯示了施用對照、CR20274和本申請案偶聯體化合物後，人前列腺癌模型C4-2荷瘤小鼠相較初始體重隨給藥時間的變化情況（圖8A）和人前列腺癌模型C4-2的荷瘤小鼠中腫瘤體積變化情況（圖8B）。
圖9顯示施用對照、CR20274及本申請案偶聯體化合物後，人結腸癌模型HT-29荷瘤小鼠腫瘤體積變化情況（圖9A）和人結腸癌模型HT-29的荷瘤小鼠相較初始體重隨給藥時間的變化情況（圖9B）。
圖10顯示使用對照、CR20274及本申請案偶聯體化合物後，人前列腺癌模型22RV1荷瘤小鼠中腫瘤體積變化情況（圖10A）和人前列腺癌模型22RV1相較初始體重隨給藥時間的變化情況（圖10B）。
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Claims (72)

  1. 一種偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽包含至少兩個特異性結合細胞表面蛋白的配體的靶向分子和與所述靶向分子連接的有效載荷，其中所述有效載荷為蛋白降解靶向嵌合體。
  2. 根據請求項1所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述靶向分子結合以下細胞表面蛋白：FOLR1、TRPV6、PSMA、LHRH、EGFR、Her2、Trop2、Her3、Claudin18.2、c-Met或其任意組合。
  3. 根據請求項1或2所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述靶向分子結合以下細胞表面蛋白：FOLR1、TRPV6、PSMA、c-Met或其任意組合。
  4. 根據請求項1～3中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述靶向分子結合以下細胞表面蛋白組合：FOLR1和TRPV6；FOLR1和PSMA；TRPV6和PSMA；TRPV6和c-Met；FOLR1和c-Met；PSMA和c-Met；FOLR1、TRPV6和PSMA；FOLR1、TRPV6和c-Met；FOLR1、PSMA和c-Met；TRPV6、PSMA和c-Met；或FOLR1、PSMA、TRPV6和c-Met。
  5. 根據請求項1～4中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述靶向分子包含兩種配體且分別結合FOLR1和TRPV6、FOLR1和PSMA、TRPV6和PSMA、FOLR1和c-Met、PSMA和c-Met或TRPV6和c-Met。
  6. 根據請求項2～5中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述結合FOLR1的配體包括葉酸或其類似物和蝶酸，較佳地，所述葉酸類似物選自5-甲基四氫葉酸、5-甲醯基四氫葉酸、10-甲醯四氫葉酸甲胺蝶呤、5,10-甲醯四氫葉酸、5,10-亞甲基四氫葉酸、胺基碟呤和雷替曲塞。
  7. 根據請求項2～6中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述結合TRPV6的配體包括由SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列、由SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列、或與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
  8. 根據請求項2～7中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述結合PSMA的配體包括多肽、抗體或小分子。
  9. 根據請求項2～8中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述結合PSMA的配體選自以下結構： 、 、 、 、 、 和 。
  10. 根據請求項2～9中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述結合c-MET的配體包括由SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列：Cys a-X1-Cys c-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cys d-Trp-Cys b-Tyr-X4-X5-X6；其中X1為Asn、His或Tyr；X2為Gly、Ser、Thr或Asn；X3為Thr或Arg；X4為Ala、Asp、Glu、Gly或Ser；X5為Ser或Thr；X6為Asp或Glu；Cys a-d各自為半胱胺酸殘基；較佳地，殘基Cys a與Cys b以及Cys c與Cys d分別環化形成兩個獨立的二硫鍵。
  11. 根據請求項2～10中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述結合c-MET的配體包括由SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列Ala-Gly-Ser-Cys a-Tyr-Cys c-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys d-Trp-Cys b-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys，其中Cys a-d各自為半胱胺酸殘基，較佳地，殘基Cys a與Cys b以及Cys c與Cys d分別環化形成兩個獨立的二硫鍵，可選的，末端離胺酸的羧基可以被醯胺化；可選的，N末端的丙胺酸可以被乙醯化。
  12. 根據請求項2～11中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述結合c-MET的配體包括與SEQ ID NO: 4具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，並且其中Cys a-d各自為半胱胺酸殘基，較佳地，殘基Cys a與Cys b以及Cys c與Cys d分別環化形成兩個獨立的二硫鍵。
  13. 根據請求項1～12中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述配體直接連接或者透過間隔區相互連接，較佳的，所述連接透過脫水縮合的方式進行。
  14. 根據請求項13所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述間隔區包含選自下組的胺基酸或胺基酸組合：Lys、Cys、Lys-Cys、Cys-Cys、Lys-Cys-Lys、Arg-Arg、Ala-Ser-Asn、Ala-Ala-Ala、Ser-Ser-Arg、Pro-Arg、Asp-Asp-Lys-Cys、和Pro-Leu-Gly，任選的，所述胺基酸可以被醯胺化。
  15. 根據請求項14所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中Lys被醯胺化，例如醯胺化成為2,6-二胺基己醯胺。
  16. 根據請求項13所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述間隔區包含一個或多個相同或不同的選自下組的化合物透過脫水縮合形成： 、 、 和 ，其中n為0或1。
  17. 根據請求項1～16中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中具有以下結構的靶向分子與有效載荷進行連接以形成偶聯體化合物： 、 、 或 ； 其中，Q為活性基團，所述靶向分子透過其活性基團Q與有效載荷進行連接；較佳地，所述活性基團Q為炔基或巰基；較佳地，所述靶向分子具有以下結構： 、 、 、 或 。
  18. 根據請求項1～17中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中具有式（I）所示結構的蛋白降解靶向嵌合體與靶向分子進行連接以形成偶聯體化合物： (T P) n-L-T E3(I)， 其中， 所述T P為結合靶蛋白的靶蛋白配體部分，其中n為1、2或3； 所述L為連接T P和T E3的連接部分； 所述T E3為結合E3連接酶的E3連接酶配體部分。
  19. 根據請求項18所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述E3連接酶配體結合VHL（von Hippel-Lindau）蛋白、CRBN（cereblon）蛋白、MDM2蛋白或XIAP蛋白；較佳地，所述E3連接酶配體為VHL配體或CRBN配體。
  20. 根據請求項19所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述VHL配體為VHL-L或其類似物，所述CRBN配體為來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺或其類似物。
  21. 根據請求項18～20中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述蛋白降解靶向嵌合體具有選自以下組的結構： (II)， (III)， (IV) 或 (V)， 其中， Ra、Rb和Rc各自獨立地為氫、烷基、NH 2、OH、或鹵素，較佳地，所述烷基為甲烷基，所述鹵素為氟； Rd為CH 2、C=O或C=S； p為0或1； 所述靶蛋白配體能結合特定的靶蛋白； 所述靶蛋白配體透過所述連接部分連接至E3連接酶基團。
  22. 根據請求項18～21中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述靶蛋白為核受體（例如，AR和ER）、激酶類蛋白（例如，RIPK2、BCR-ABL、EGFR、HER2、c-Met、TBK1、CDK2/4/6/9、ALK、Akt、CK2、ERK1/2、FLT3、PI3K、BTK和FAK）AKT、PAN-BET蛋白、BET蛋白（例如，BRD2、BRD3、BRD4和BRD6）、BLK、BRAF1、BCL-xl、ERRα、FKBP12、FRS2α、JAK1、JAK3、IKZF1、IRAK4、MDM2、MetAP2、PLK1、PSK-J3、RAS、TACC3、Tau、TrkB、MDM2或其任意組合物。
  23. 根據請求項18～22中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述靶蛋白為AR蛋白、ER蛋白、RAS蛋白、BRD4蛋白、PLK1蛋白、FAK蛋白、MDM2蛋白或其任意組合物。
  24. 根據請求項18～23中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述靶蛋白配體部分具有選自以下的結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
  25. 根據請求項18～24中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述連接部分具有選自下組的結構： (L1)， (L2)，或 (L3) 其中， p 1為0～4的整數； p 2為0～6的整數； p 3、p 4、p 5和p 6各自獨立地為0或1； G 1為4～14元直鏈亞烷基，任選地，所述4～14元直鏈亞烷基中的2～5個碳原子可以被-O-、-NH-、-N(C 1-6烷基)-或-C≡C-取代； G 2為胺基酸殘基，其中較佳地，所述G 2為Lys殘基； G 3選自下組： 、 、 和 ； G 4為5～9元直鏈亞烷基，任選地，所述5～9元直鏈亞烷基中的2～4個碳原子可以被-O-、-NH-、-N(C 1-6烷基)-或-C≡C-取代。
  26. 根據請求項18～25中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述連接部分具有選自下組的結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
  27. 根據請求項18～26中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中蛋白降解靶向嵌合體具有如下所示的結構： CR202CC 、 CR202CF 、 CR202CI 、 CR202CL 、 CR202CP 、 CR20274 、 CR202EE 、 CR202Z5 、 CR202ES 、 CR202Z7 、 CR202Z8 、 CR202Z9 、 CR202Z1 、 CR202Z2 、 CR202Z3 、 CR202Z4 、 CR202Y2 或 CR202Y4 。
  28. 根據請求項1～27中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述有效載荷與所述靶向分子直接連接、或所述有效載荷透過連接子與所述靶向分子連接。
  29. 根據請求項1～28所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述有效載荷與所述靶向分子之間、所述有效載荷與所述連接子之間、或所述連接子與所述靶向分子之間的連接是透過化學反應完成的；較佳地，所述靶向分子與所述連接子之間的連接是透過鍵擊反應完成的。
  30. 根據請求項1～29中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述偶聯體化合物具有以下結構 W 1-L 1-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L 2-W 2， 其中， L 1為 或 、-S-S-或鍵； EG為-CH 2CH 2O-或-OCH 2CH 2-；n 1是0～6的整數； n 2是0～8的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； B每次出現時獨立地為-C(=O)-、 、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-、         -C(=O)-NH-；-CH(CH 3)-CH 2-O-、-CH 2CH 2O-、-NH-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～5的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L 2為 、 、 、 、-NH-CH 2-O-或鍵； 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-、氧或 ； R 2為鍵、-O-CH 2-或-NH-CH 2CH 2-NH-C(=O)-； R 3為氫或 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基、 、 、 或 ； R 4為氫或C 1-8烷基； R 5為氫、胺基、硝基、磷酸基、-OR a或 ；其中，R a為甲烷基、乙烷基、丙烷基或異丙烷基； W 1為可以結合細胞表面蛋白的靶向分子，並且W 2為有效載荷； 較佳地，所述L 2為鍵、 、 、 、-NH-CH 2-O-、 、 、 、 、 、 或 ； 較佳地，EG為-CH 2CH 2O-； 較佳地，n 1是2或0； 較佳地，n 2是1、4或5； 較佳地，n 5是0； 較佳地，n 6是1或3； 較佳地，n 1是2、n 2是1、n 3和n 4是0並且L 2是鍵； 較佳地，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu、Leu、Lys、Ala、Gly、Phe、Gln、Pro或Asn形成的胺基酸殘基； 較佳地，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-、-Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Cit-、-Val-Leu-Lys-、Val-Cit-Pro-Gly-、-Gly-Asn-Asn-和Ala-Ala-Asn-； 較佳地，當n 4為1時，Q為-C(=O)-； 較佳地，當n 4為2時，Q分別為-O-和-C(=O)-； 較佳地，當n 4為3時，Q分別為-O-、-O-和鍵；或 較佳地，n 4為0。
  31. 根據請求項1～30中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述偶聯體化合物具有以下結構 W 1-L 1-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L 2-W 2其中， L 1為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是0～4的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； n 2是0～5的整數； B為-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-CH 2CH 2O-、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～3的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L 2為 、 或 ， 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-或 ； R 2為鍵； R 3為 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基或 ； R 4為氫； R 5為氫、-OCH 3或 ； W 1為可以結合細胞表面蛋白的靶向分子，並且W 2為有效載荷； 較佳地，所述L 2為 、 、 、 、 或 ； 較佳地，L 1為 ，n 1、n 5和n 4均為0； 較佳地，L 1為 ，n 2是1或2； 較佳地，n 5為1時，n 2和n 4均為0； 較佳地，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala形成的胺基酸殘基；或 較佳地，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-和-Val-Ala-。
  32. 根據請求項1～31中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述偶聯體化合物具有以下結構 W 1-L 1-(EG)n 1-(CH 2)n 2-(C=O)-(AA)n 3-L 2-W 2其中， L 1為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是0～4的整數； n 2是0～5的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是1～4的整數； L 2為 或鍵， 其中X為-NH-；R 2為鍵；R 4為氫；R 5為氫或-OCH 3； W 1為可以結合細胞表面蛋白的靶向分子，並且W 2為有效載荷； 較佳地，L 1為 、n 1是2、n 2是1且L 2是 ； 較佳地，L 1為 、n 1是2、n 2是1且L 2是鍵； 較佳地，L 1為 、n 1是0、n 2是5且L 2是 ； 較佳地，L 1為 、n 1是0、n 2是5且L 2是鍵； 較佳地，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala胺基酸殘基；或 較佳地，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-、-Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Val-Leu-Lys-和-Gly-Asn-Asn-。
  33. 根據請求項28～32中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述連接子包含連接模組1和連接模組2，可選地，所述連接模組1與連接模組2透過鍵相連；可選地，所述連接模組1與連接模組2透過化學基團相連。
  34. 根據請求項28～32中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述連接子包含連接模組2；較佳的，所述連接模組2可被酶切或在酸中不穩定。
  35. 根據請求項28～32中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述連接子包含連接模組1以及與所述連接模組1結合的基團；可選的，所述與連接模組1結合的基團為PEG鏈、 、 、 、 、C 1-C 8烷基鏈、-NH-、-O-、-C(O)-或其任意組合； 較佳地，所述PEG鏈為PEG1（ ）、PEG2（ ）或PEG3（ ）； 可選的，所述與連接模組1結合的基團為 。
  36. 根據請求項33～35中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述連接模組1為馬來醯亞胺基己醯基（ ）、馬來醯亞胺基（ ）或疊氮基團（ ）。
  37. 根據請求項33～36中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述連接模組2在與靶向分子、連接模組1、化學基團或有效載荷連接前，具有包含以下基團的結構：CB酶酶切基團、纖溶酶酶切基團、天門冬醯胺內切酶酶切基團、β-葡萄糖苷酸酶酶切基團、硫酸酯酶酶切基團、磷酸酯酶酶切基團、β-半乳糖苷酶酶切基團、穀胱甘肽酶酶切基團或酸不穩定基團。
  38. 根據請求項33所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述化學基團為PEG鏈、 、 、 、C 1-C 8烷基鏈、-NH-、、-O-、-C(O)-、 、 或其任意組合； 較佳地，所述PEG鏈為PEG1、PEG2或PEG3； 較佳地，所述化學基團為 、 、 、 、 、、 或 。
  39. 根據請求項37所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中： 所述CB酶酶切基團包括胺基酸或胺基酸與自分解片段的組合，所述胺基酸為Val-Cit、Gly-Gly-Phe-Gly、CycloBut-Cit、Phe-Cit、Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ala-Cit、Val-Cit-Pro或Val-Cit-Pro-Gly； 所述纖溶酶酶切基團包括胺基酸或胺基酸與自分解片段的組合，所述胺基酸為Val-Leu-Lys； 所述天門冬醯胺內切酶基團包括胺基酸或胺基酸與自分解片段的組合，所述胺基酸選自Gly-Asn-Asn或Ala-Ala-Asn； 所述β-葡萄糖醛酸酶酶切基團為 或 ； 所述硫酸酯酶酶切基團為 或 ； 所述磷酸酯酶酶切基團為 或 ； 所述β-半乳糖苷酶酶切基團為 或 ； 所述穀胱甘肽酶酶切基團為 ； 所述酸不穩定基團為 ； 可選的，所述自分解片段為PAB及其衍生物、 或 ； 較佳地，所述PAB為 ； 較佳地，所述PAB衍生物為 、 、 或 。
  40. 根據請求項39所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，在與連接模組1、化學基團、靶向分子或有效載荷進行有效連接後連接模組2部分具有如下結構： 、 、 、 、 、 、 、 或 。
  41. 根據請求項1～40中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述偶聯體化合物具有如下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 或 ， 其中W 1為可以結合細胞表面蛋白的靶向分子，並且W 2為有效載荷。
  42. 根據請求項1～41所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述偶聯體化合物具有以下結構： CR202CE CR202CH CR202CK CR202CN CR202CR CR202F0 CR202F2 CR20214 CR20282 CR20285 CR20287 CR20293 CR20295 CR20297 CR202EF CR202W5 CR202W6    CR202W7 CR202W8 CR202W9 CR202X0 CR202X1 CR202X2 CR202X3 CR202Y3 CR202Y5 CR202V4 CR202V5 CR202V6 CR202V7 CR202Z6 CR202V8 CR202V9 CR202AL CR202W1 CR202GM CR202GQ CR202HJ CR202FU CR202JG CR202LB CR202HT CR202HU CR202HV CR202FX CR202HR CR202GC CR202MT CR202EZ
  43. 一種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據請求項1～42中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體。
  44. 根據請求項43所述的藥物組合物，其中，所述組合物用於靜脈、皮下、口服、肌內或心室內施用。
  45. 一種用於治療對象中的疾病的方法，所述方法包括向所述對象施用治療有效量的根據請求項1～42中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者根據請求項43或44所述的藥物組合物。
  46. 根據請求項45所述的方法，其中所述疾病選自下組：癌症、免疫性疾病、心血管疾病、代謝疾病和神經疾病。
  47. 根據請求項46所述的方法，其中所述癌症的特徵在於癌細胞高表現FOLR1、TRPV6、PSMA或c-MET。
  48. 根據請求項47所述的方法，其中所述癌症的特徵在於癌細胞高表現FOLR1和TRPV6、FOLR1和c-MET、c-MET和TRPV6、c-MET和PSMA、PSMA和TRPV6或FOLR1和PSMA。
  49. 根據請求項45～48中任一項所述的方法，其中所述疾病的特徵在於在所述對象中表現所述靶蛋白或異常表現所述靶蛋白。
  50. 根據請求項46所述的方法，其中所述癌症選自下組：人乳腺導管癌、人腦星形膠質母細胞瘤、膀胱移行細胞乳頭瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、白血病、卵巢癌、胃癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、肝癌、結腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、結直腸癌、食道癌、睪丸癌、皮膚癌、淋巴瘤和多發性骨髓瘤。
  51. 根據請求項46所述的方法，其中所述免疫性疾病是自身免疫性疾病，可選的，所述自身免疫性疾病選自下組：結締組織病、系統性硬化症、類風濕性關節炎和系統性紅斑狼瘡。
  52. 根據請求項46所述的方法，其中所述心血管疾病選自下組：心絞痛、心肌梗死、中風、心臟病發作、高血壓性心臟病、風濕性心臟病、心肌病、心臟心律失常和先天性心臟病。
  53. 根據請求項46所述的方法，其中所述代謝疾病選自下組：糖尿病、痛風、肥胖症、低血糖症、高血糖症和血脂異常。
  54. 根據請求項46所述的方法，其中所述神經疾病選自下組：阿茲海默症、帕金森氏症、亨丁頓舞蹈症、頭部損傷、多發性硬化症、眩暈、昏迷和癲癇。
  55. 根據請求項45～54中任一項所述的方法，其中所述方法還包括將一種或多種治療劑與所述偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者所述藥物組合物聯合施用。
  56. 根據請求項1～42中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者根據請求項43或44所述的藥物組合物在用於製備治療對象中的疾病的藥物中的用途。
  57. 一種化合物或其鹽，所述化合物具有以下結構： L a-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L b， 其中， L a為 、 或 ； EG為-CH 2CH 2O-或-OCH 2CH 2-；n 1是0～6的整數； n 2是0～8的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； B為-C(=O)-、 、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-、-C(=O)-NH-、                 -CH(CH 3)-CH 2-O-、-CH 2CH 2O-、-NH-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～5的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L b為 、 、 、 、-OH或-NH-CH 2-OH； 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-、氧或 ； R 2為鍵、-O-CH 2-或-NH-CH 2CH 2-NH-C(=O)-； R 3為氫或 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基、 、 、 或 ； R 4為氫或C 1-8烷基； R 5為氫、胺基、硝基、磷酸基、-OR a或 ；其中，R a為甲烷基、乙烷基、丙烷基或異丙烷基； R 1為離去基團，較佳的R 1是鹵素（例如氯）、 或 ； 較佳地，所述L b為 、 、 、-OH、        -NH-CH 2-OH、 、 、 、 、 、 或 ； 較佳地，EG為-CH 2CH 2O-； 較佳地，n 1是0或2； 較佳地，n 2是1、4或5； 較佳地，n 5是0； 較佳地，n 6是1或3； 較佳地，n 1是2、n 2是1、n 3和n 4是0並且L b是-OH； 較佳地，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu、Leu、Lys、Ala、Gly、Phe、Gln、Pro或Asn形成的胺基酸殘基； 較佳地，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-、-Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Cit-、-Val-Leu-Lys-、-Val-Cit-Pro-Gly-、-Gly-Asn-Asn-和-Ala-Ala-Asn-； 較佳地，當n 4為1時，Q為-C(=O)-； 較佳地，當n 4為2時，Q分別為-O-和-C(=O)-； 較佳地，當n 4為3時，Q分別為-O-、-O-和鍵；或 較佳地，n 4為0。
  58. 根據請求項57所述的化合物或其鹽，其中所述化合物具有以下結構： L a-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L b其中， L a為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是2～4的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； n 2是0～5的整數； B為-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-CH 2CH 2O-、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～3的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L b為-OH、 、 或 ， 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-或 ； R 2為鍵； R 3為 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基或 ； R 4為氫； R 5為氫、-OCH 3或 ； R 1為離去基團，較佳的R 1是鹵素（例如氯）、 或 。 較佳地，L b為-OH、 、 、 、 、 或 ； 較佳地，n 5為1時，n 2和n 4均為0； 較佳地，L a為 ，n 1、n 5和n 4均為0； 較佳地，L a為 ，n 2是1或2； 較佳地，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala形成的胺基酸殘基；或 較佳地，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-和-Val-Ala-。
  59. 根據請求項57或58所述的化合物或其鹽，其中所述化合物具有以下結構： L a-(EG)n 1-(CH 2)n 2-(C=O)-(AA)n 3-L b其中， L a為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是0～4的整數； n 2是0～5的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～3的整數； L b為 或-OH， 其中X為-NH-；R 2為鍵；R 4為氫；R 5為氫或-OCH 3； R 1為離去基團，較佳的R 1是鹵素（例如氯）、 或 ； 較佳地，L a為 、n 1是2、n 2是1且L b是 ； 較佳地，L a為 、n 1是2、n 2是1且L b是-OH； 較佳地，L a為 、n 1是0、n 2是5且L b是 ； 較佳地，L a為 、n 1是0、n 2是5且L b是-OH； 較佳地，所述AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala胺基酸殘基；或 較佳地，所述-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-、-Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Val-Leu-Lys-和-Gly-Asn-Asn-。
  60. 根據請求項57～59中任一項所述的化合物或其鹽，所述化合物具有選自以下組的結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，其中R 1為離去基團，較佳的R 1是鹵素（例如氯）、 或 。
  61. 一種化合物或其鹽，所述化合物是 。
  62. 一種偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述偶聯體化合物具有以下結構： W a-L 1-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L 2-W b， 其中， L 1為 、 、-S-S-或鍵； EG為-CH 2CH 2O-或-OCH 2CH 2-；n 1是0～6的整數； n 2是0～8的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； B每次出現時獨立地為-C(=O)-、 、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-、         -C(=O)-NH-、-CH(CH 3)-CH 2-O-、-CH 2CH 2O-、-NH-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～5的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L 2為 、 、 、 、-NH-CH 2-OH或鍵； 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-、氧或 ； R 2為鍵、-O-CH 2-或-NH-CH 2CH 2-NH-C(=O)-； R 3為氫或 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基、 、 、 或 ； R 4為氫或C 1-8烷基； R 5為氫、胺基、硝基、磷酸基、-OR a或 ；其中，R a為甲烷基、乙烷基、丙烷基或異丙烷基； W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子； 較佳地，所述L 2為鍵、 、 、 、-NH-CH 2-O-、 、 、 、 、 、 或 ， 較佳地，EG為-CH 2CH 2O-； 較佳地，n 1是0或2； 較佳地，n 2是1、4或5； 較佳地，n 5是0； 較佳地，n 6是1或3； 較佳地，n 1是2、n 2是1、n 3和n 4是0並且L 2是鍵； 較佳地，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu、Leu、Lys、Ala、Gly、Phe、Gln、Pro或Asn形成的胺基酸殘基； 較佳地，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-、-Phe-Cit-、-Val-Ala-、-Gly-Gly-Phe-Gly-、-Cit-、-Val-Leu-Lys-、-Val-Cit-Pro-Gly-、-Gly-Asn-Asn-和-Ala-Ala-Asn-； 較佳地，當n 4為1時，Q為-C(=O)-； 較佳地，當n 4為2時，Q分別為-O-和-C(=O)-； 較佳地，當n 4為3時，Q分別為-O-、-O-和鍵；或 較佳地，n 4為0。
  63. 根據請求項62所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述偶聯體化合物具有以下結構： W a-L 1-(EG)n 1-(D)n 5-(CH 2)n 2-(B)n 6-(AA)n 3-(CH 2CH 2-Q)n 4-L 2-W b其中， L 1為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是2～4的整數； D為-C(=O)-NH-S(=O) 2-NH-；n 5為0或1； n 2是0～5的整數； B為-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-CH 2CH 2O-、-NH-CH 2CH 2-C(=O)-或-NH-；n 6為0～3的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是0～3的整數； Q每次出現時獨立地為-C(=O)-、-O-或鍵，n 4是0～3的整數； L 2為 、 或 ， 其中X為鍵、-NH-、-C(=O)-或 ； R 2為鍵； R 3為 ，其中R b和R c各自獨立地為氫、硝基或 ； R 4為氫； R 5為氫、-OCH 3或 ； W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子； 較佳地，L 2為 、 、 、 、 或 ； 較佳地，n 5為1時，n 2和n 4均為0； 較佳地，L 1為 ，n 1、n 5和n 4均為0； 較佳地，L 1為 ，n 2是1或2； 較佳地，AA每次出現時獨立地為Val、Cit、Glu或Ala形成的胺基酸殘基；或 較佳地，-(AA)n 3-為選自下組的肽殘基：-Val-Cit-、-Glu-Val-Cit-、-Ala-Cit-和-Val-Ala-。
  64. 根據請求項61或62所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述偶聯體化合物具有以下結構： W a-L 1-(EG)n 1-(CH 2)n 2-(C=O)-(AA)n 3-L 2-W b其中， L 1為 或 ； EG為-CH 2CH 2O-；n 1是0～4的整數；較佳地 n 2是1～5的整數； AA每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n 3是1～4的整數； L 2為 或鍵， 其中X為-NH-；R 2為鍵；R 4為氫；R 5為氫或-OCH 3； W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子； 較佳地，L 1為 、n 1是2、n 2是1且L 2是 ; 較佳地，L 1為 、n 1是2、n 2是1且L 2是鍵; 較佳地，L 1為 、n 1是0、n 2是5且L 2是 ； 較佳地，L 1為 、n 1是0、n 2是5且L 2是鍵。
  65. 根據請求項52-64中任一項所述的偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述化合物具有選自以下組的結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，其中W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
  66. 一種偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述偶聯體化合物是 ，其中W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
  67. 一種偶聯體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述偶聯體化合物是 ，其中W a和W b各自獨立地為有效載荷或可以結合細胞表面蛋白的靶向分子。
  68. 一種蛋白降解靶向嵌合體或其藥學上可接受的鹽，所述蛋白降解靶向嵌合體化合物具有以下結構： 或者 ， 其中， Ra和Rb各自獨立地為氫、C 1-4烷基、NH 2、OH、或鹵素； A為胺基酸殘基；a為0或1； b為0～5的整數； X為 或鍵； 靶蛋白配體為 或 。
  69. 根據請求項68所述的蛋白降解靶向嵌合體或其藥學上可接受的鹽，其中Ra為氫。
  70. 根據請求項68所述的蛋白降解靶向嵌合體或其藥學上可接受的鹽，其中Rb為氫。
  71. 根據請求項68所述的蛋白降解靶向嵌合體或其藥學上可接受的鹽，其中A為Lys形成的胺基酸殘基。
  72. 根據請求項68所述的蛋白降解靶向嵌合體或其藥學上可接受的鹽，所述蛋白降解靶向嵌合體化合物具有選自以下組的結構：    、    、    、    、    和    。
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