BRPI0807578A2 - macrociclo peptidomimético, composto, kit e métodos para sintetizar um macrociclo peptidomimético - Google Patents

macrociclo peptidomimético, composto, kit e métodos para sintetizar um macrociclo peptidomimético Download PDF

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BRPI0807578A2
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Aileron Therapeutics, Inc.
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Abstract

SISTEMAS DE TRIAZÓIS MACROCÍCLICOS. Patente de invenção refere-se a macrociclos peptidomiméticos inusitados e métodos para sua preparação e uso, bem como análogos de aminoácidos e ligantes formadores de macrociclos, e kits úteis na sua produção.

Description

. Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SISTEMAS DE TRIAZÓIS MACROCÍCLICOS".
À REFERÊNCIA CRUZADA Este pedido de patente reivindica o benefício do pedido de pa- tente provisório nº US 60/903.073, depositado em 23 de fevereiro de 2007, que é aqui incorporado como referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Os petídeos estão se tornando crescentemente importantes em aplicações farmacêuticas. Os peptídeos não-modificados sofrem frequente- mente de estabilidade metabólica deficiente, penetrabilidade de células defi- ciente, e ligação promíscua devido à flexibilidade conformacional. Para me- lhorar estas propriedades, os pesquisadores geraram peptídeos cíclicos e peptidomiméticos por uma série de métodos, incluindo formação de ligações dissulfeto, formação de ligações amida, e formação de ligações carbono- carbono (Jackson et al. J. Am. Chem. Soc. 113:9391-9392 (1991); Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119:455-460 (1997); Tailor, Biopolymers 66:49-75 (2002); Brunel et al, Chem. Commun. (20):2552-2554 (2005); Hiroshige et ] al., J. Am. Chem. Soc. 117:11590-11591 (1995); Blackwell et al, Angew. a Chem. Int. Ed. 37:3281-3284 (1998); Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000)). As limitações destes métodos incluem estabilidade metabólica deficiente (ligações dissulfeto e amida), penetrabilidade de célu- las deficiente (ligações dissulfeto e amida), e o uso de metais potencialmen- te tóxicos (para formação de ligações carbono-carbono). Assim sendo, há uma necessidade significativa de se obter métodos aperfeiçoados para pro- —duzir peptídeos ou peptidomiméticos que possuem maior rigidez conforma- cional, estabilidade metabólica e penetrabilidade de células. A presente in- venção dedica-se a estas e outras necessidades nessas técnicas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Esta invenção fornece macrociclos peptidomiméticos da Fórmula | emque:
- o o n. —Rº - Dr TAL-IBL [CL El Ri Ra YÚ (Fórmula 1) cada A, C, D, e E é independentemente um aminoácido natural ou não- natural; Ro. é um aminoácido natural ou não-natural, análogo de aminoá-
PN cido, * O ,ENHLZCO), ENH-L3-SO2], ou -NH-La]; R1 e R2 são independentemente —H, alquila, alguenila, alquinila, y arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, não-substituídos ou substituídos com halo; R3 é hidrogênio, alquila, alqguenila, alquinila, arilalquila, heteroal- quila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquilalquila, cicloarila, ou heteroci- —clo-arila, opcionalmente substituídos com Rs; L é um ligante formador de macrociclos da fórmula : Rn. rá
DX 7 / ; L1, L2 e La são independentemente alquileno, alquenileno, alqui- nileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, he- terocicloarileno, ou [-R1-K-R4-Jh, sendo cada um opcionalmente substituído comRs; cada R, é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno; cada Ké O, S, SO, SO,, CO, CO, ou CONR;s; cada R; é independentemente halogênio, alquila, -OR6s, -N(Re)2a, -SRe, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6, um grupamento fluorescentee, um radioisótopo ou um agente terapêutico; cada Rs; é independentemente —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, um grupamento fluorescente,
um radioisótopo ou um agente terapêutico;
.- R7 é —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, hete- roalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, cicloarila, ou heterocicloarila, opcionalmente substituídos com Rs, ou parte de uma estrutura cíclica com umresíduoD;
Rg é -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, ciclo-alquila, he- teroalquila, cicloalquil-alquila, heterociclo-alquila, ciclo-arila, ou heterociclo- arila, opcionalmente substituídos com Rs, ou parte de uma estrutura cíclica com um resíduo E;
v é um número inteiro entre 1-1.000; w é um número inteiro entre 1-1.000; : x é um número inteiro entre 0-10; y é um número inteiro entre 0-10; 2 é um número inteiro entre 0-10; e n é um número inteiro entre 1-5. Op Em algumas modalidades, L é NE. ou . o Se —n PASO = . Em outras modalidades, L é O ou - PI
Sy . Em outras modalidades, pelo menos um entre R, e R é al- quila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquita, heteroal- quila, ou heterocicloalquila, não-substituídos ou substituídos com halo-. Em modalidades afins, R, e R> são independentemente alquila, alquenila, alqui- nila, aril-alquila, ciclo-alquila, ciclo-alquil-alquila, heteroalquila, ou heteroci- clo-alquila, não-substituídos ou substituídos com halo-. Por exemplo, pelo menos um entre R, e R> pode ser alquila, não-substituída ou substituída com halo.
Em algumas modalidades, R; e também R> são independentemente alquila, não-substituída ou substituída com halo-. Em outras modalidades, pelo menos um entre R, e R, é metila.
Em ainda outras modalidades, R, e também R2 são metila.
Em algumas modalidades, pelo menos um entre D e E é um a- —minoácido natural ou não-natura! substituído com um lipídeo ou hidrocarbo-
f neto de alto peso molecular. Em outras modalidades, pelo menos um entre - D e E está anexado a um ligante formador de macrociclo adicional. Em ainda outras modalidades, uma estrutura secundária do macrociclo peptidomiméti- co é mais estável do que uma estrutura secundária correspondente de um polipeptideo não-macrocíclico correspondente. Em algumas modalidades, o macrociclo peptidomimético compreende uma hélice a. A hélice a pode compreender, por exemplo, entre 1 volta e 5 voltas. Em outras modalidades, a hélice a é mais estável do que uma hélice a de um polipeptídeo não- macrocíclico correspondente. O ligante formador de macrociclo pode abarcar entrei voltae5 voltas da hélice a, tal como aproximadamente 1, 2, 3, 4o0u 5 voltas da hélice a. O comprimento do ligante formador de macrociclo pode ã ser, por exemplo, cerca de 5 À e cerca de 9 À por volta da hélice a. Em al- gumas modalidades, o ligante formador de macrociclo abarca aproximada- mente 1 volta da hélice a. Nessas modalidades, o comprimento do ligante formador de macrociclo pode ser aproximadamente igual ao comprimento de cerca de 6 ligações carbono-carbono a cerca de 14 ligações carbono- carbono, ou pode ser igual ao comprimento de cerca de 8 ligações carbono- . carbono a cerca de 12 ligações carbono-carbono. Em modalidades afins, o : macrociclo pode compreender um anel de cerca de 18 átomos a 26 átomos. Em outras modalidades, o ligante formador de macrociclo abarca aproximadamente 2 voltas da hélice a. Em algumas modalidades, o compri- mento do ligante formador de macrociclo pode ser aproximadamente igual ao comprimento de entre cerca de 8 ligações carbono-carbono e cerca de 16 ligações carbono-carbono, ou pode ser aproximadamente igual ao compri- —mento de cerca de 10 ligações carbono-carbono a cerca de 13 ligações car- bono-carbono. Em modalidades afins, o macrociclo pode compreender um anel de cerca de 29 átomos a cerca de 37 átomos.
Em algumas modalidades, um aminoácido útil na síntese do ma- crociclo peptidomimético da invenção é um composto da Fórmula lla ou Ilb:
À '
Y X o, R IN A Ro
MA RR COR: DR. COR Rio Rio Illa Ilb em que R1 e R2 são independentemente alquila, alquenila, alquinila, ari- . lalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, não-substituída ou substituída com halo; 5 cada Q e T é selecionado independentemente no grupo que consiste em alquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroari- leno e [-R4-K-Ry-]h,cada um deles sendo não-substituído ou substituído com Rs; e Ké O, S, SO, SO2, CO, CO, ou CONR;3; R3 é hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, aril-alquila, heteroal- f quila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquilalquila, cicloarila, ou heteroci- cloarila, opcionalmente substituídos com Rs; Ra é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloal- quileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno; cada R; é independentemente halogênio, alquila, -ORÊ., -N(Re)», -SRe, -SORç, -SO2R6, -CO2Rs, um grupamento fluorescente, um radioisótopo ou um agente terapêutico; cada Rg; é independentemente —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, um grupamento fluorescente, um radioi- —sótopoou um agente terapêutico; R7 e Rg são independentemente —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquita, ou heterocicloalquila; Rio e R11 são independentemente -H ou qualquer grupo protetor apropriado para a síntese de peptídeos;
s g e h são independentemente um número inteiro entre 0 e 5, on- de g+h é maior do que 1; e ã n é um número inteiro entre 1 e 5. Em algumas modalidades, o composto é um composto da Fór- mulallaeR,; é alquila, não-substituida ou substituída com halo. Em outras modalidades, o composto é um composto da Fórmula llb e R, é alquila, não- substituída ou substituída com halo-. Em ainda outras modalidades, o com- posto é um composto da Fórmula lla e R, é alquila não-substituída. Por e- xemplo, R, pode ser metila. Em ainda outras modalidades, o composto é um — composto da Fórmula llb e R2 é alquila não-substituída. Por exemplo, Ro po- de ser metila. Em algumas modalidades dos compostos da invenção, pelo - menos um entre Rg e Rio é um grupo protetor apropriado para a síntese de peptídeos. Em outro aspecto, a presente invenção fornece ainda Kits que compreendem os compostos da invenção ou outros análogos de aminoáci- dos úteis na preparação dos macrociclos peptidomiméticos da invenção jun- to com reagentes de macrociclização como aqui descritos. Em algumas modalidades, a invenção fornece um Kit que com- " preende: . . g -- —- . a) pelo menos um composto selecionado no grupo que consiste em compostos das Fórmulas lla e Ilb: À % Y % Do, R Dor R
RR coa, A COR, Rio Rio Ila Ilb em que R, e R2 são independentemente —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, não- substituída ou substituída com halo-;
:| cada Q e T é independentemente selecionado no grupo que consiste em alquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroari- à leno e [-R4-K-Ra-Jh, cada um deles sendo não-substituído ou substituído com Rs; Ké O, S, SO, SO, CO, CO>, ou CONR;; R3 é hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, heteroal- quila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquilalquila, cicloarila, ou heteroci- Cloarila, opcionalmente substituída com Rs; Ra é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloal- quileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno; cada R; é independentemente halogênio, alquila, -ORs, -N(Re)», -SRs, " -SOR6, -SO2R6, -CO2R6s, um grupamento fluorescente, um radioisótopo ou um agente terapêutico; cada Rs é independentemente —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, um grupamento fluorescente, um radioi- sótopo ou um agente terapêutico; R; e Rg são independentemente —H, alquila, alqguenila, alquinila, í arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, ou heterocicloalquila; Rio e R11 são independentemente —H ou qualquer grupo protetor Ê 20 apropriado para a síntese de peptídeos; g e h são independentemente um número inteiro entre 0 e 5; n é um número inteiro entre 1e 5; e b) um reagente de macrociclização.
Em algumas modalidades, o kit compreende um composto da Fórmula llae R, é alquila, não-substituída ou substituída com halo-. Em modalidades afins, R, é alquila não-substituída.
Por exemplo, R, pode ser metila.
Em outras modalidades, o kit compreende um composto da Fórmula Ilb e R2 é alquila, não-substituída ou substituída com halo-. Em modalidades afins, R2 é alquila não-substituída.
Por exemplo, R> pode ser metila.
Em algumas modalidades, um kit compreende pelo menos um composto da Fórmula lla e pelo menos um composto da Fórmula Ilb.
Um Kit da invenção pode compreender também um composto da Fórmula lla ou
' Fórmula !lb no qual pelo menos um entre Rg e Rio é um grupo protetor apro- . priado para a síntese de peptídeos. Em modalidades específicas do Kit da invenção, o reagente de macrociclização é um reagente de Cu. Em ainda : outras modalidades do kit da invenção, o reagente de macrociclização é um reagentede Ru. A presente invenção fornece também um método para sintetizar um macrociclo peptidomimético, sendo que o método compreende as etapas de colocar um precursor zo peptidomimético da Fórmula Ill ou Fórmula IV: a ma, : Ri La rá R2
PA Re (Fórmula Ill) o a o A í Ri 1 2 R2 E ra & | de E - Re (Fórmula |V) em contato com um reagente de macrociclização; emquev,w,x,y,2, A, B, C, D, E, R1, Ra, R7, Rg, L1 e Lo são como definidos acima; R12 é -H quando o reagente de macrociclização é um reagente de Cu e R12 é -H ou alquila quando o reagente de macrociclização é um reagente de Ru; e ainda onde a dita etapa de colocar em contato resulta em uma liga- ção covalente sendo formada entre o alquino e o grupamento azida na Fór- mulalllou Fórmula IV, Por exemplo, R12 pode ser metila quando o reagente de macrociclização é um reagente de Ru.
Em algumas modalidades do método da invenção, pelo menos um entre R; e R> é alquila, alguenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, ciclo- alquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, não-substituída ou substitu- ídacomhalo-. Em modalidades afins, R, e Ro são independentemente alqui-
' la, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, - ou heterocicloalquila, não-substituída ou substituída com halo-. Por exemplo, pelo menos um entre R, e R2 pode ser alquila, não-substituída ou substituída com halo-. Em outro exemplo, R; e também —R>2sãoindependentemente alquila, não-substituída ou substituída com halo . Em algumas modalidades, pelo menos um entre R, e R2 é metila. Em ou- tras modalidades, R, e R2 são metila. O reagente de macrociclização pode ser um reagente de Cu. Alternativamente, o reagente de macrociclização pode ser um reagente de Ru.
Em algumas modalidades, o precursor peptidomimético é purifi- cado antes da etapa de colocar em contato. Em outras modalidades, o ma- í crociclo peptidomimético é purificado depois da etapa de colocar em contato. Em ainda outras modalidades, o macrociclo peptidomimético é redobrado depois da etapa de colocar em contato. O método pode ser realizado em solução, ou, alternativamente, o método pode ser realizado sobre um supor- te sólido.
Está previsto também nesta invenção realizar o método da in- É venção na presença de uma macromolécula-alvo que se liga ao precursor - peptidomimético ou macrociclo peptidomimético sob condições que favore- cema ditaligação. Em algumas modalidades, o método é realizado na pre- sença de uma macromolécula-alvo que se liga preferencialmente ao precur- sor peptidomimético ou macrociclo peptidomimético sob condições que favo- recem a dita ligação. O método pode ser aplicado também para sintetizar uma biblioteca de macrociclos peptidomiméticos.
O macrociclo peptidomimético resultante de um método da in- venção pode compreender uma hélice a em solução aquosa. Por exemplo, o macrociclo peptidomimético pode apresentar maior estrutura helicóide a em solução aquosa em comparação com um polipeptídeo não-macrocíclico cor- respondente. Em algumas modalidades, o macrociclo peptidomimético apre- senta maior estabilidade térmica em comparação com um polipeptídeo não- macrocíclico correspondente. Em outras modalidades, o macrociclo pepti- domimético apresenta maior atividade biológica em comparação com um
" polipeptídeo não-macrocíclico correspondente. Em ainda outras modalida- des, o macrociclo peptidomimético apresenta maior resistência contra de- ' gradação proteolítica em comparação com um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente. Em ainda outras modalidades, o macrociclo peptidomiméti- co apresenta maior capacidade de penetrar em células vivas, em compara- ção com um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente.
Em algumas modalidades, o grupamento alquino do precursor peptidomimético da Fórmula Ill ou Fórmula IV é uma cadeia lateral de um aminoácido selecionada no grupo que consiste em L-propargilglicina, D- —propargilglicina, ácido (S)-2-amino-2-metil-4-pentinóico, ácido (R)-2-amino-2- R metil-4-pentinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil-5-hexinóico, ácido (R)-2-amino- - 2-metil-S-hexinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil-6-heptinóico, ácido (R)-2- amino-2-metil-6-heptinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil-7-octinóico, ácido (R)- 2-amino-2-metil-7-octinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil-8-noninóico, ácido (R)-2-amino-2-metil-8-noninóico e o grupamento azida do precursor pepti- domimético da Fórmula Il! ou Fórmula IV é uma cadeia lateral de um amino- ácido selecionado no grupo que consiste em e-azido-L-lisina, e-azido-D- É lisina, e-azido-alfa-metil-L-lisina, S-azido-alfa-metil-D-lisina, 5-azido-alfa-metil- E L-ornitina, e 3-azido-alfa-metil-D-ornitina.
Em algumas modalidades, x+y+z é 3, e A, B e C são indepen- dentemente aminoácidos naturais ou não-naturais. Em outras modalidades, x+y+zé 6, e A, Be C são independentemente aminoácidos naturais ou não- naturais.
Em algumas modalidades, o reagente de macrociclização é um reagente de Cue a etapa de colocar em contato é realizada em um solvente selecionado no grupo que consiste em solvente prótico, solvente aquoso, solvente orgânico, e misturas deles. Por exemplo, o solvente pode ser esco- lhido no grupo que consiste em H2O, THF/H2O, tBuOH/H2O, DMF, DIPEA, CH3CN, CH2Cb, CICH2CH2CI ou uma mistura deles. Em outras modalidades, — oreagente de macrociclização é um reagente de Ru e a etapa de colocar em contato é realizada em um solvente orgânico. Por exemplo, o solvente pode ser DMF, THF, CH;CN, CH3Cl; ou CICH;CH,2CI. O solvente pode ser um sol-
- vente que favorece a formação de hélices. ' Em algumas modalidades, o macrociclo peptidomimético resul- tante da realização do etndo da invenção tem a Fórmula (1): o Nº — Do IAL-IBL-ICL EL R; Ra Y (Fórmula |) onde v, w, x, y, 2, A, B, C, D, E, Ra, Ro, R7, Rg, e L são como de- finidos acima.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA ! Todas publicações, patentes, e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados como referência até o mes- mo grau como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado como refe- rência.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO - Definições : PN Como aqui utilizado, o termo "macrociclo" refere-se a uma molé- “15. cula que tem uma estrutura química que inclui um anel ou ciclo formado por pelo menos 9 átomos ligados de forma covalente.
Como aqui utilizado, o termo "macrociclo peptidomimético" refe- re-se a um composto que compreende uma pluralidade de resíduos de ami- noácidos unidos por uma pluralidade de ligações peptídicas e pelo menos umliganteformador de macrociclo que forma um macrociclo entre o carbono a de um resíduo de aminoácido de ocorrência natural ou de um resíduo de aminoácido de ocorrência não-natural ou de um resíduo de análogo de ami- noácido e o carbono a de outro resíduo de aminoácido de ocorrência natural ou de um resíduo de aminoácido de ocorrência não-natural ou de um resi- duo de análogo de aminoácido. Os macrociclos peptidomiméticos incluem opcionalmente uma ou mais ligações não-peptídicas entre um ou mais resí- duos de aminoácidos e/ou resíduos de análogos de aminoácidos, e incluem
| opcionalmente um ou mais resíduos de aminoácidos de ocorrência não- ' natural, ou resíduos de análogos de aminoácidos além daqueles que formam o macrociclo.
Como aqui utilizado, o termo "estabilidade" refere-se à manuten- ção de uma estrutura secundária definida em solução por um macrociclo peptidomimético da invenção, medida por dicroísmo circular, RMN ou outra medida biofísica, ou resistência à degradação proteolítica in vitro ou in vivo.
Os exemplos não-limitativos de estruturas secundárias contempladas nesta invenção são hélices a, voltas 8, folhas fº pregueadas.
Como aqui utilizado, o termo "estabilidade helicóide" refere-se à : manutenção de uma estrutura helicóide a por um macrociclo peptidomiméti- - co da invenção, medida por dicroísmo circular.
Por exemplo, em algumas modalidades, os macrociclos peptidomiméticos da invenção apresentam pe- lo menos um aumento de 1,25, 1,5, 1,75 ou 2 vezes em helicidade a, deter- minada por dicroísmo circular, em comparação com um polipeptídeo não- macrocíclico correspondente.
O termo "a-aminoácido" ou simplesmente "aminoácido" refere-se ã a uma molécula que contém um grupo amino e também um grupo carboxila ' ligados a a um carbono que é designado carbono a.
Os aminoácidos apro- —priados incluem, sem limitações, os isômeros D e L dos aminoácidos de o- corrência natural, bem como aminoácidos de ocorrência não-natural prepa- rados por síntese orgânica ou outras rotas metabólicas.
A menos que o con- texto indique especificamente e forma diferente, o termo aminoácido, como aqui utilizado, pretende incluir análogos de aminoácidos.
O termo "aminoácido de ocorrência natural" refere-se a qualquer um dos vinte aminoácidos encontrados comumente em peptídeos sintetiza- dos na natureza, e conhecidos pelas abeviaturas de uma letra A, R N, C, D, Q, E, G, HI, LKM,F,P,S,T, W, YeV.
O termo "análogo de aminoácido" refere-se a uma molécula que é estruturalmente similar a um aminoácido e que pode ser substituído por um aminoácido na formação de um macrociclo peptidomimético.
Os análo- gos de aminoácidos incluem, sem limitações, os compostos que são estrutu-
" ralmente idênticos a um aminoácido, como aqui definido, exceto pela inclu- . são de um ou mais grupos metileno adicionais entre o grupo amino e carbo- xila (por exemplo, a-amino-B-carbóxi-ácidos), ou pela substituição o grupo amino ou carboxila por um grupo similarmente reativo (por exemplo, substi- tuiçãoda amina primária por uma amina secundária ou terciária, ou substitu- ição do grupo carboxila por um éster).
Um resíduo de aminoácido "não-essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir de uma sequência do tipo selvagem de um poli- peptídeo (por exemplo, um domínio BH3 ou o domínio ligante p53 MDM2) sem abolir ou alterar substancialmente sua atividade biológica ou bioquímica . essencial (por exemplo, ligação ou ativação de receptor). Um resíduo de a- - minoácido "essencial" é um resíduo que, quando alterado a partir da se- quência do tipo selvagem do polipeptídeo, resulta em abolir ou abolir subs- tancialmente a atividade biológica ou biogímica essencial do polipeptídeo.
Uma "substituição conservativa de aminoácido" é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduo de aminoácidos que têm i cadeias laterais similares foram identificadas nessas técnicas. Estas famílias E incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, K, R, H), cadeias laterais ácidas (por exemplo, D, E), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, G, N, Q, S, T, Y, C), cadeias laterais apolares (por e- xemplo, A, V, L, 1, P, F, M, W), cadeias laterais beta-ramificadas (por exem- plo, T, V, 1) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, Y, F, W, H). Assim sendo, um resíduo de aminoácido não-essencial previsto em um polipepti- deoBH3,por exemplo, é de preferência substituído por outro resíduo de a- minoácido da mesma família de cadeia lateral.
O termo "membro", como aqui utilizado,em conjunto com macro- ciclos ou ligantes formadores de macrociclos, refere-se aos átomos que for- mam ou podem formar o macrociclo, e exclui átomos de substituintes ou ca- deias laterais. Por analogia, ciclodecano, 1,2-diflúor-decano e 1,3-dimetil- ciclodecano são todos considerados macrociclos com dez membros, pois os substituintes hidrogênio ou flúor ou as cadeias laterais metila não participam
: da formação do macrociclo.
.- O símbolo FÊ . quando utilizado como parte de uma estrutura molecular refere-se a uma ligação simples ou uma ligação dupla trans ou cis. O termo "cadeia lateral de aminoácido" refere-se a um grupa- —mento anexado ao carbono a em um aminoácido. Por exemplo, a cadeia lateral de aminoácido para alanina é metila, a cadeia lateral de aminoácido para fenilalanina é fenil-metila, a cadeia lateral de aminoácido para cisteina é tiometila, a cadeia lateral de aminoácido para aspartato é carbóxi-metila, a cadeia lateral de aminoácido para tirosina é 4-hidróxi-fenil-metila, etc. Outras cadeias laterais de aminoácidos de ocorrência não-natural também estão . incluídas, por exemplo, aquelas que ocorrem na natureza (por exemplo, um 7 metabólito de aminoácido) ou aquelas que são fabricadas sinteticamente (por exemplo, um aminoácido a,a-dissubstituído). O termo "polipeptídeo" engloba dois aminoácidos de ocorrência — natural ou não-natural unidos por uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação amida). Os polipeptídeos, como aqui descritos, incluem proteínas de comprimento inteiro (por exemplo, proteínas completamente processadas), Ê bem como sequências de aminoácidos mais curtas (por exemplo, fragmen- z tos de proteinas de ocorrência natural ou fragmentos de polipeptídeos sinté- ticos).
O termo "reagente de macrociclização", como aqui utilizado, re- fere-se a qualquer reagente que pode ser usado para preparar um macroci- clo peptidomimético da invenção, mediando a reação entre uma azida e um alquino. Tais reagentes incluem, sem limitações, reagentes de Cu, tais como osreagentes que produzem uma espécie Cu(l) reativa, tal como CuBr, Cul ou CuOTf, bem como sais de Cu(ll) tais como Cu(CO2CHa)2, CuSO,, e CuCl que podem ser convertidos in situ em um reagente Cu(l) reativo pela adição de um agente redutor, tal como ácido ascórbico ou ascorbato de sódio. Os reagentes de macrociclização incluem adicionalmente, por exemplo, reagen- tes de Ru conhecidos nessas técnicas tais como Cp*RuCI(PPha), [Cp*RuCl]s ou outros reagentes de Ru que podem produzir uma espécie Ru(ll) reativa.
" O termo "halo" ou "halogênio" refere-se a flúor, cloro, bromo ou . iodo ou um seu radical.
O termo "alquila" refere-se a uma cadeia hidrocarbônica que é uma cadeia linear ou cadeia ramificada, que contém o número indicado de — átomos de carbono.
Por exemplo, C1-C19 indica que o grupo tem entre 1 e 10 (inclusive) átomos de carbono nele.
Na ausência de qualquer designação numérica, “alquila" é uma cadeia (linear ou ramificada) que tem 1 a 20 (in- clusive) átomos de carbono nela.
O termo "alquileno" refere-se a uma alquila bivalente (isto é, -R-). O termo "alquenila" refere-se a uma cadeia hidrocarbônica que é » uma cadeia linear ou cadeia ramificada que tem uma ou mais ligações du- - plas carbono-carbono.
O grupamento alquenila contém o número indicado de átomos de carbono.
Por exemplo, C2-C19 indica que o grupo tem entre 2 e 10 (inclusive) átomos de carbono nele.
O termo "alquenila inferior" refere-se a uma cadeia alquenila de C>-Cg.
Na ausência de qualquer designação nu- mérica, "alquenila" é uma cadeia (linear ou ramificada) que tem 2 a 20 (in- clusive) átomos de carbono nela.
Ê O termo "alquinila" refere-se a uma cadeia hidrocarbônica que é : uma cadeia linear ou cadeia ramificada que tem uma ou mais ligações triplas —carbono-carbono.
O grupamento alquinila contém o número indicado de á- tomos de carbono.
Por exemplo, C2-C109 indica que o grupo tem entre 2 e 10 (inclusive) átomos de carbono nele.
O termo "alquinila inferior" refere-se a uma cadeia alquinila de C2-Cg.
Na ausência de qualquer designação numéri- ca, "alquinila" é uma cadeia (linear ou ramificada) que tem 2 a 20 (inclusive) átomos de carbono nela.
O termo "arila" refere-se a um sistema anelar aromático monoci- clico com 6 carbonos ou bicíclico com 10 carbonos, onde O, 1, 2, 3, ou 4 á- tomos de cada anel são substituídos com um substituinte.
Os exemplos de grupos arila incluem fenila, naftila e similares.
O termo "arilalquila" ou o ter- mo "aralquila" refere-se a alquila substituída com uma arila.
O termo "arilal- cóxi" refere-se a um alcóxi substituído com arila. "Arilalquila" refere-se a um grupo arila, como definido acima, on-
' de um dos átomos de hidrogênio do grupo arila foi substituído por um grupo : alquila de C;-Cs, como definido. Os exemplos representativos de um grupo arilalquila incluem, porém sem limitações, 2-metilfenila, 3-metilfenila, 4-metil- fenila, 2-etilfenila, 3-etilfenila, 4-etilfenila, 2-propilfenila, 3-propilfenila, 4- propilfenila, 2-butilfenila, 3-butilfenila, 4-butifenila, 2-pentilfenila, 3- pentilfenila, 4-pentilfenila, 2-isopropilfenila, 3-isopropilfenila, 4-isopropilfenila, 2-isobutilfenila, 3-isobutilfenila, 4-isobutiffenila, 2-sec-butilfenila, 3-sec- butilfenila, 4-sec-butilfenila, 2-t-butilfenila, 3-t-butilfenila e 4-t-butilfenila. "Arilamido" refere-se a um grupo arila, como definido acima, on- de um dos átomos de hidrogênio do grupo arila foi substituído por um ou . mais grupos -C(O)NH2. Os exemplos representativos de um grupo aril-amido e incluem 2-C(O)NH2-fenila, 3-C(O)NH>z-fenila, 4-C(O)NHz-fenila, 2-C(O)NH7- piridila, 3-C(O)NH;-piridila, e 4-C(O)NH,-piridila.
"Alquil-heterociclo" refere-se a um grupo alquila de Cy-C5, como definido acima, onde um dos átomos de hidrogênio do grupo alquila de C1-Cs foi substituído por um heterociclo. Os exemplos representativos de um grupo alquil-heterociclo incluem, porém sem limitações, -CH2CHa-morfolina, - É CH2CH7-piperidina, -CH2CHCHy-morfolina, e -CHCH2CHa-imidazol. E -— — -- "Alquilamido" refere-se a um grupo alquila de .C1-Cs, como defi- —nido acima, onde um dos átomos de hidrogênio do grupo alquila de C1-Cs foi substituído por um grupo -C(O)NH>2. Os exemplos representativos de um grupo alquilamido incluem, porém sem limitações, -CH2-C(O)NH2, -CH2CH7- C(O)INH2, -CHICHICHC(O)NH,, -CHCHXCHCHC(O)NH2, -CHCHxCHa CHICHC(O)NH2, —-CHICH(C(O)NH2)CH3, — -CHCH(C(O)NH.)JCH-CH3, - — CH(C(O)NH)JCH;CH;3 e -C(CH3),. CH2C(O)NH,>.
"Alcanol" refere-se a um grupo alquila de C1-Cs, como definido acima, onde um dos átomos de hidrogênio do grupo alquila de C1-Cs foi substituído por um grupo hidroxila. Os exemplos representativos de um gru- po alcanol incluem, porém sem limitações, -CHOH, -CH;CH;OH, - CHCHCHOH, -CHCH;CHXCHOH, -CHCHCHr —“CHCHOH, - CHCH(OH)CH3, -CHCH(OH)CH2CH3, -CH(OH)CH; e -C(CH3).CH2OH. "Alquilcarbóxi" refere-se a um grupo alquila de C1-Cs, como defi-
' nido acima, onde um dos átomos de hidrogênio do grupo alquila de C1-Cs foi : substituído por um grupo --COOH.
Os exemplos representativos de um gru- po —alquilcarbóxi incluem, porém sem limitações, -CH;COOH, -CHCH;COOoH, -CH2CH;CHCOOH, -CHCH2CHCHCOOH, -CHCH(COOH)CH3, -CHXCHxCHCHXCHCOOH, -CHCH(COOH)CH2.CHs, -CH(COOH)CH2CH;3 e -C(CH3),.CH.COOH.
O termo "cicloalquila", como aqui empregado, inclui grupos hi- drocarbônicos cíclicos saturados e parcialmente insaturados que têm 3 a 12 carbonos, de preferência 3 a 8 carbonos, e mais preferivelmente, 3 a 6 car- —bonos, onde o grupo cicloalquila é além disso opcionalmente substituído. e Alguns grupos cicloalquila incluem, sem limitações, ciclopropila, ciclobutila, - ciclopentila, ciclopentenila, ciclo-hexila, ciclo-hexenila, ciclo-heptila, e ciclo- octila.
O termo "heteroarila" refere-se a um sistema anelar aromático —monocíclico com 5-8 membros, bicíclico com 8-12 membros, ou tricíclico com 11-14 membros, tendo 1-3 heteroátomos caso monocíclico, 1-6 hete- roátomos caso bicíclico, ou 1-9 heteroátomos caso tricíclico, sendo os ditos í heteroátomos selecionados entre O, N, ou S (por exemplo, átomos de car- : bono 1-3, 1-6, ou 1-9 heteroátomos de O, N, ou S caso monocíclico, bicícli- co, outricíclico, respectivamente), onde O, 1, 2, 3, ou 4 átomos de cada anel são substituídos com um substituinte.
Os exemplos de grupos heteroarila incluem piridila, furila ou furanila, imidazolila, benzimidazolila, pirimidinila, tiofenila ou tienila, quinolinila, indolila, tiazolila, e similares.
O termo "heteroaril-alquila" ou o termo "heteroaralquila" refere-se a uma alquila substituída com uma heteroarila.
O termo "heteroaril-alcóxi" refere-se a um alcóxi substituído com heteroarila.
O termo "heteroarilalquila" ou o termo "heteroaralquila" refere-se a uma alquila substituída com uma heteroarila.
O termo "heteroarilalcóxi” refere-se a um alcóxi substituído com heteroarila.
O termo "heterociclila" refere-se a um sistema anelar não- aromático monocíclico com 5-8 membros, bicíclico com 8-12 membros, ou tricíclico com 11-14 membros, tendo 1-3 heteroátomos caso monocíclico, 1-6
" heteroátomos caso bicíclico, ou 1-9 heteroátomos caso tricíclico, sendo os : ditos heteroátomos selecionados entre O, N, ou S (por exemplo, átomos de carbono e 1-3, 1-6, ou 1-9 heteroátomos de O, N, ou S$ caso monociíclico, bicíclico, ou tricíclico, respectivamente), onde O, 1, 2 ou 3 átomos de cada —anelsão substituídos com um substituinte.
Os exemplos de grupos heteroci- clila incluem piperazinila, pirrolidinila, dioxanila, morfolinila, tetra- hidrofuranila, e similares.
O termo "substituintes" refere-se a um grupo "substituído"de um grupo alquila, cicloalquila, arila, heterociclila, ou heteroarila em qualquer á- —tomos desse grupo.
Os substituintes apropriados incluem, sem limitações, os - grupos halo, hidróxi, mercapto, oxo, nitro, haloalquila, alquila, alcarila, arila, - aralquila, alcóxi, tioalcóxi, arilóxi, amino, alcoxicarbonila, amido, carbóxi, al- canossulfonila, alquilcarbonila, e ciano.
Em algumas modalidades, os compostos desta invenção contêm um ou mais centros assimétricos, e assim sendo, ocorrem como racematos e misturas racêmicas, enantiômeros individuais, diastereoisômeros individu- ais e misturas diastereoisoméricas.
Todas estas formas isoméricas destes Ê compostos estão incluídas na presente invenção, a menos que expressa- E mente indicado. de forma diferente.
Em algumas modalidades, os compostos desta invenção são representados também em múltiplas formas tautoméri- cas, e em tais casos, a invenção inclui todas formas tautoméricas dos com- postos aqui descritos (por exemplo, caso a alquilação de um sistema anelar resulte em alquilação em múltiplos sítios, a invenção inclui todos esses pro- dutos da reação). Todas essas formas isoméricas desses compostos estão incluídas na presente invenção, a menos que expressamente indicado de forma diferente.
Todas formas cristalinas dos compostos aqui descritos es- tão incluídas na presente invenção, a menos que expressamente indicado de forma diferente.
Como aqui utilizados, os termos "aumento" e "decréscimo" signi- ficam, respectivamente, causar um aumento ou decréscimo estatisticamente significante (isto é, p < 0,1) de pelo menos 5%. Como aqui utilizada, a citação de uma faixa numérica para uma
" variável pretende inferior que a invenção pode ser praticada com a variável : igual a qualquer um dos valores dentro daquela faixa. Assim sendo, para uma variável que é inerentemente distinta, a variável é igual a qualquer valor de número inteiro dentro da faixa numérica, incluindo os limites da faixa. Si- milarmente, para uma variável que é inerentemente contínua, a variável é igual a qualquer valor real dentro da faixa numérica, incluindo os limites da faixa. Como um exemplo, e sem limitações, uma variável é descrita como tendo valores entre O e 2 toma os valores 0, 1 ou 2 caso a variável seja ine- rentemente distinta, e toma os valores 0,0, 0,1, 0,01, 0,001, ou quaisquer outros valores reais 2 O e < 2 caso a variável seja inerentemente contínua. - Como aqui utilizada, a menos que especificamente indicado de - forma diferente, a palavra "ou" é utilizada no sentido inclusivo de "e/ou" e não no sentido excludente de "um ou outro". Os detalhes de uma ou mais modalidades específicas da inven- ção estão enunciados nos desenhos e na descrição abaixo. Outras caracte- rísticas, objetos, e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da des- crição e dos desenhos, e a partir das reivindicações. i Macrociclos Peptidomiméticos da Invenção B A presente invenção fornece um macrociclo peptidomimético da Fórmula(l): o o R; Rg DZ ' IAL-IBL CIT N . Ri R2 Ú (Fórmula 1) em que: cada A, C, D, e E é independentemente um aminoácido natural ou não- natural; Y B é um aminoácido natural ou não-natural, análogo de aminoá-
ANS cido, P o, [FNH-L3-CO-], -NH-L3-SO>-], ou [-NH-L3-]; R, e R2 são independentemente —H, alquila, alguenila, alquinila,
í arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, . não-substituídos ou substituídos com halo; R3 é hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, heteroal- quila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquilalquila, cicloarila, ou heteroci- cloarila, opcionalmente substituídos com Rs; L é um ligante formador de macrociclos da fórmula
EEE isáe =! ; L1, Ly e La são independentemente alquileno, alquenileno, alqui- E nileno, heteroalquileno, ciclo-alquileno, heterociclo-alquileno, ciclo-arileno, g 10 — heterociclo-arileno, ou [-R4-K-R4-]h, sendo cada um opcionalmente substituí- do com Rs; cada R, é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno; cada Ké O, S, SO, SO, CO, CO, ou CONRs; cada R; é independentemente halogênio, alquila, -OR6, -N(Rg), ' -SRe, -SOR6, -SO2R6g, -CO2RÊ, um grupamento fluorescentee, um radioisóto- : po ou um agente terapêutico; . R PN cada Rs; é independentemente —H, alquila, alquenila, alquinila, aril-alquila, ciclo-alquil-alquila, heterociclo-alquila, um grupamento fluores- cente, um radioisótopo ou um agente terapêutico; R7 é —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, hete- roalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, cicloarila, ou heterocicloarila, opcionalmente substituídos com R5, ou parte de uma estrutura cíclica com um resíduo D; Rg é -H, alquila, alguenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, hete- roalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, cicloarila, ou heterocicloarila, opcionalmente substituídos com Rs, ou parte de uma estrutura cíclica com um resíduo E; v é um número inteiro entre 1-1.000; w é um número inteiro entre 1-1.000;
" x é um número inteiro entre 0-10; e y é um número inteiro entre 0-10; z é um número inteiro entre 0-10; e n é um número inteiro entre 1-5. Em algumas modalidades da invenção, x+y+z é pelo menos 3. Em outras modalidades da invenção, x+y+z é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 92 ou 10. Cada ocorrência de A, B, C, D ou E em um macrociclo ou precursor de ma- crociclo da invenção é selecionado independentemente.
Por exemplo, uma sequência representada pela fórmula [A], quando x é 3, engloba modalida- desnas quais os aminoácidos não são idênticos, por exemplo, Gin-Asp-Ala, . bem como modalidades nas quais os aminoácidos são idênticos, por exem- - plo, GIn-GIn—Gln.
Isto se aplica para qualquer valor de x, y, ou z nas faixas indicadas.
Em algumas modalidades, o macrociclo peptidomimético da in- venção compreende uma estrutura secundária que é uma hélice a, e Rg é H, permitindo a ligação hidrogênio intra-helicóide.
Em outras modalidades, o comprimento do ligante formador de Ô macrociclo, L, medido a partir de um primeiro Ca até um segundo Ca é sele- E cionado para estabilizar uma estrutura peptídica secundária, tal como uma hélice a formada por resíduos do macrociclo peptidomimético incluindo, po- rém não necessariamente limitados àquelas entre o primeiro Ca e o segundo Ca.
Em algumas modalidades, o macrociclo peptidomimético com- preende pelo menos um modelo de hélice a.
Por exemplo, A, B e/ou C no composto da Fórmula | incluem uma ou mais hélices a.
Como regra geral, as hélices a incluem entre 3 e 4 resíduos de aminoácidos por volta.
Em algu- mas modalidades, a hélice a do macrociclo peptidomimético inclui 1 a 5 vol- tas e, portanto, 3 a 20 resíduos de aminoácidos.
Em modalidades especiífi- cas, a hélice a inclui 1 volta, 2 voltas, 3 voltas, 4 voltas, ou 5 voltas.
Em al- —gumas modalidades, o ligante formador de macrociclo estabiliza um modelo de hélice a incluído dentro do macrociclo peptidomimético.
Assim sendo, em algumas modalidades, o comprimento do ligante formador de macrociclo, L,
á a partir de um primeiro Ca até um segundo Ca é selecionado para aumentar . a estabilidade de uma hélice a.
Em algumas modalidades, o ligante formador de macrociclo abarca entre 1 volta e 5 voltas da hélice a.
Em algumas moda- lidades, o ligante formador de macrociclo abarca aproximadamente 1 volta, 2 voltas, 3 voltas, 4 voltas, ou 5 voltas da hélice a.
Em algumas modalidades, o comprimento do ligante formador de macrociclo é aproximadamente 5 À a 9 À por volta da hélice a, ou aproximadamente 6 À a 8 À por volta da hélice a.
Quando o ligante formador de macrociclo abarca aproximadamente 1 vol- ta de uma hélice a, o comprimento é igual a aproximadamente 5 ligações —carbono-carbono a 13 ligações carbono-carbono, aproximadamente 7 liga- . ções carbono-carbono a ligações carbono-carbono, ou aproximadamente 9 - ligações carbono-carbono.
Quando o ligante formador de macrociclo abarca aproximadamente 2 voltas de uma hélice a, o comprimento é igual a aproxi- madamente 8 ligações carbono-carbono a 16 ligações carbono-carbono, a- —proximadamente 10 ligações carbono-carbono a ligações 14 carbono- e carbono, ou aproximadamente 12 ligações carbono-carbono.
Quando o |li- gante formador de macrociclo abarca aproximadamente 3 voltas de uma hé- ' lice a, o comprimento é igual a aproximadamente 14 ligações carbono- BR carbono a ligações 22 carbono-carbono, aproximadamente 16 ligações car- —bono-carbono a 20 ligações carbono-carbono, ou aproximadamente 18 liga- ções carbono-carbono.
Quando o ligante formador de macrociclo abarca a- proximadamente 4 voltas de uma hélice a, o comprimento é igual a aproxi- madamente 20 ligações carbono-carbono a 28 ligações carbono-carbono, aproximadamente 22 ligações carbono-carbono a 26 ligações carbono- carbono, ou aproximadamente 24 ligações carbono-carbono.
Quando o |i- gante formador de macrociclo abarca aproximadamente 5 voltas de uma hé- lice a, o comprimento é igual a aproximadamente 26 ligações carbono- carbono a 34 ligações carbono-carbono, aproximadamente 28 ligações car- bono-carbono a 32 ligações carbono-carbono, ou aproximadamente 30 liga- ções carbono-carbono.
Quando o ligante formador de macrociclo abarca a- proximadamente 1 volta de uma hélice a, a ligação contém aproximadamen- te 4 átomos a 12 átomos, aproximadamente 6 átomos a 10 átomos, ou apro-
7 ximadamente 8 átomos. Quando o ligante formador de macrociclo abarca aproximadamente 2 voltas da hélice a, a ligação contém aproximadamente 7 átomos a 15 átomos, aproximadamente 9 átomos a 13 átomos, ou aproxi- madamente 11 átomos. Quando o ligante formador de macrociclo abarca — aproximadamente 3 voltas da hélice a, a ligação contém aproximadamente 13 átomos a 21 átomos, aproximadamente 15 átomos a 19 átomos, ou apro- ximadamente 17 átomos. Quando o ligante formador de macrociclo abarca aproximadamente 4 voltas da hélice a, a ligação contém aproximadamente 19 átomos a 27 átomos, aproximadamente 21 átomos a 25 átomos, ou apro- ximadamente 23 átomos. Quando o ligante formador de macrociclo abarca . aproximadamente 5 voltas da hélice a, a ligação contém aproximadamente - 25 átomos a 33 átomos, aproximadamente 27 átomos a 31 átomos, ou apro- ximadamente 29 átomos. Quando o ligante formador de macrociclo abarca aproximadamente 1 volta da hélice a, o macrociclo resultante forma um anel que contém aproximadamente 17 membros a 25 membros, aproximadamen- te 19 membros a 23 membros, ou aproximadamente 21 membros. Quando o ligante formador de macrociclo abarca aproximadamente 2 voltas da hélice f a, o macrociclo resultante forma um anel que contém aproximadamente 29 B membros a 37 membros, aproximadamente 31 membros a 35 membros, ou aproximadamente 33 membros. Quando o ligante formador de macrociclo abarca aproximadamente 3 voltas da hélice a, o macrociclo resultante forma um anel que contém aproximadamente 44 membros a 52 membros, aproxi- madamente 46 membros a 50 membros, ou aproximadamente 48 membros.
Quando o ligante formador de macrociclo abarca aproximadamente 4 voltas dahélicea,o macrociclo resultante forma um anel que contém aproximada- mente 59 membros a 67 membros, aproximadamente 61 membros a 65 membros, ou aproximadamente 63 membros. Quando o ligante formador de macrociclo abarca aproximadamente 5 voltas da hélice a, o macrociclo resul- tante forma um anel que contém aproximadamente 74 membros a 82 mem- bros, aproximadamente 76 membros a 80 membros, ou aproximadamente 78 membros. As modalidades explificativas do ligante formador de macrociclo
, L estão ilustradas abaixo:
A . tao Neo > as AGA As nt ae es AD 7 go DD paes tu, A AO paes > A rraLhA Ag CA À Sae a Sea AIN fera çQ n=N Roo Do ENE , Ce N=N e x A & = . E o ane RE A nas nro Ce ear aço E Snanedãa e ad fgucor a ineo. OO “mm. SO mo Ko - i PASO Fo A e O Tr Ss ; - « e = >
À Peso er DT Ag NEN NãN n=N NEN 2 % Hd Del Ag ao ME aa Aeagro CR “Sã, N=N NEN = e >< AE AVI, acer FR Á o EA Ss Ee ss o o A nes nã DA n. Fada N=N NNW fe “= a o Pro "W O A NEN " Em outras modalidades, D e/ou E são ainda modificados para facilitar a absorção celular. Em algumas modalidades, lipidar ou "PEGuila- ção" um macrociclo peptidomimético facilita a absorção celular, aumenta a —biodisponibilidade, aumenta a circulação sanguínea, altera a farmacocinéti- ca, diminui a imunogenicidade e/ou diminui a frquência necessária de admi- nistração. Em uma modalidade, um macrociclo peptidomimético apresenta melhores propriedades biológicas tais como estabilidade estrutural, afinidade aumentada por um alvo, maior resistência à degradação proteolítica e/ou penetrabilidade celular aumentada quando comparado com um polipeptídeo
, não-macrocíclico correspondente.
Em outra modalidade, um macrociclo pep- . tidomimético compreende uma ou mais hélices a em soluções aquosas e/ou apresenta um maior grau de helicidade a em comparação com um polipepti- deo não-macrocíclico correspondente.
Em algumas modalidades, um ligante formador de macrociclo aumenta a permeabilidade celular do macrociclo peptidomimético.
Sem desejar ficar ligado a qualquer teoria, conjectura-se que o ligante formador de macrociclo pode aumentar o caráter hidrofóbico global do macrociclo peptidomimético em relação a um polipeptídeo não-
macrocíclico correspondente.
Qualquer proteína ou polipeptídeo com uma sequência de ami- . noácidos primária conhecida que contém uma estrutura secundária que su- - postamente confere atividade biológica é o tema da presente invenção.
Por exemplo, a sequência do polipeptídeo pode ser analisada e os análogos de aminoácidos que contêm azida e que contêm alquino da invenção podem ser susbtituídos nas posições apropriadas.
As posições apropriadas são de- terminadas averiguando qual superfície (ou superfícies) molecular(es) da estrutura secundária é (são) necessária(s) para a atividade biológica e, por- E tanto, através das quais outra(s) superfície(s) os ligantes formadores de ma- . crociclos da invenção podem formar um macrociclo sem bloquear esterica- mente a(s) superfície(s) necessárias para a atividade biológica.
Tais deter- minações são feitas usando métodos tais como cristalografia a raios X de complexos entre a estrutura secundária e um parceiro de ligação natural pa- ra visualizar resíduos (e superfícies) críiticos para a atividade; por mutagê- nese sequencial de resíduos na estrutura secundária para identificar funcio- —nalmente resíduos (e superfícies) críticos para a atividade; ou por outros mé- todos.
Por tais determinações, os aminoácidos apropriados são substituídos pelos análogos de aminoácidos e ligante formador de macrociclos da inven- ção.
Por exemplo, para uma estrutura secundária helicóide a, uma superfície da hélice (por exemplo, uma superfície molecular que se estende longitudi- —nalmente ao longo do eixo da hélice e radialmente 45-135' ao redor do eixo da hélice) pode ser necessária para fazer contato com outra biomolécula in vivo ou in vitro para a atividade biológica.
Nesse caso, um ligante formador
7 de macrociclo é desenhado para ligar dois carbonos a da hélice, e ao mes- E mo tempo, estendendo-se longitudinalmente ao longo da superfície da hélice na parte da superfície não diretamente necessária para a atividade.
Em algumas modalidades da invenção, a sequência peptídica é —derivadadafamília BCL-2 de proteínas.
A família BCL-2 é definida pela pre- sença de até quatro domínios de homologia (BH) de BCL-2 conservados designados BH1, BH2, BH3, e BH4, todos os quais incluem segmentos heli- cóides a (Chittenden et a/., EMBO 14:5589 (1995); Wang et al., Genes Dev. 10:2859 (1996)). As proteínas antiapoptóticas, tais como BCL-2 e BCL-X,, apresentam conservação de sequência em todos domínios BH.
As proteínas - pró-apoptóticas são divididas em membros da família "multidomínio" (por - exemplo, BAK, BAX), que possuem homologia nos domínios BH1, BH2, e BH3, e membros da família "apenas domínio BH3" (por exemplo, BID, BAD, BIM, BIK, NOXA, PUMA), que contêm homologia de sequência exclusiva- —menteno segmento helicóide a anfipático BH3. Os membros da família BCL- 2 têm a capacidade de formar homodímeros e heterodímeros, sugerindo que a ligação competitiva e a relação entre os níveis de proteínas pró- h apoptóticas e antiapoptóticas dita a suscetibilidade a estímulos de morte.
As , proteínas antiapoptóticas funcionam para proteger células contra excesso — pró-apoptótico, isto é, morte celular programada excessiva.
As medidas de "segurança" adicional incluem regular a transcrição de proteínas pró- apotóticas e mantê-las como confôrmeros inativos, requerendo ativação pro- teolítica, desfosforilação, ou mudança conformacional induzida por ligantes para ativar funções pró-morte.
Em certos tipos de células, os sinais de morte — recebidos na membrana plasmática disparam apoptose por intermédio da via mitocondrial.
As mitocôndrias podem servir como "gatekeeper" da morte ce- lular sequestrando o citocromo c, um componente crítico de um complexo citosólico que ativa caspase 9, levando a episódios proteolíticos fatais a ju- sante.
As proteínas multidomínios tais como BCL-2/BCL-X, e BAK/BAX de- —sempenham papéis duelísticos de guardiãs e executoras na membrana mi- tocondrial, sendo suas atividades reguladas ainda mais por membros ape- nas BH3 a montante da família BCL-2. Por exemplo, BID é um membro da
, família do domínio apenas BH3 de proteínas pró-apoptóticas, e transmite : sinais de morte recebidos na membrana plasmática para proteínas efetoras pró-apoptóticas na membrana mitocondrial.
BID tem a capacidade de intera- gir com proteínas pró-apoptóticas e também antiapoptóticas, e depois da ativação por caspase 8, dispara a liberação do citocromo c e apoptose mito- condrial.
Estudos de deleção e mutagênese determinaram que o segmento BH3 helicóide a anfipático de membros da família pró-apoptótica podem fun- cionar como um domínio de morte, e assim sendo, podem representar um modelo estrutural crítico para interagir com proteínas apoptóticas multidomí- o.
Estudos estruturais demonstraram que a hélice BH3 pode interagir com . proteínas antiapoptóticas inserindo em um sulco hidrofóbico formado pela - interface dos domínios BH1, 2 e 3. BID ativado pode ser ligado e sequestra- do por proteínas antiapoptótica (por exemplo, BCL-2 e BCL-X,) e pode dis- parar a ativação das proteína pró-apoptóticas BAX e BAK, levando à libera- çãodocitocromo c e um programa de apoptose mitocondrial.
BAD é também um membro da família pró-apoptótica apenas do domínio BH3, cuja expres- são dispara a ativação de BAX/BAK.
Em contraste com BID, entretanto, BAD : apresenta ligação preferencial a membros da família antiapoptótica, BCL-2 e : BCL-X,. Embora o domínio BAD BH3 apresente alta ligação por afinidade ao peptídeo BCL-2, BAD BH3 é incapaz de ativar a liberação do citocromo c a partir de mitocôndrias in vitro, sugerindo que BAD não é um ativador direto de BAX/BAK.
As mitocôndrias que superexpressam BCL-2 são resistentes à liberação do citocromo c induzida por BID, mas o cotratamento com BAD pode restaurar a sensibilidade de BID.
A indução da apoptose mitocondrial por BAD parece resultar de: (1) deslocamento de ativadores de BAX/BAK tais como BID e proteínas semelhantes a BID, a partir da bolsa de ligação de BCL-2/BCL-XL, ou (2) ocupação seletiva da bolsa de ligação de BCL-2/BCL- XL por BAD para impedir o sequestro de proteínas semelhantes a BID por proteínas antiapoptóticas.
Assim sendo, duas classes de proteínas apenas de domínio BH3 emergiram, proteínas semelhantes a BID que ativam dire- tamente a apoptose mitocondrial, e proteinas semelhantes a BAD que têm a capacidade de sensibilizar mitocôndrias para pró-apoptóticas semelhantes a
: ocupando as bolsas de ligação de proteínas antiapoptóticas multidomínio. . Vários domomínio helicóides a de proteínas-membros da família BCL-2 sus- cetíveis à metodologia aqui descrita foram descritas (Walensky et al. (2004), Science 305:1466; e Walensky et a/.,, publicação de patente nº US 2005/0250680, cujos teores inteiros são aqui incorporados como referência). Em outras modalidades, a sequência peptídica é derivada da propteína p53 supressora de tumores que se liga à proteina oncogene MDM?. O sítio de ligação de MDM?2 fica localizado dentro de uma região do supressor de tumor p53 que forma uma hélice a. Na patente nº US
7.083.983, cujo teor inteiro é aqui incorporado como referência, Lane et al. . descrevem que a região de p53 responsável pela ligação a MDM2 é repre- - sentada aproximadamente pelos aminoácidos 13-31 (PLSQETFSDLWKLL- PENNV) da proteína P53 humana madura. Outras sequências modificadas descritas por Lane também estão contempladas na presente invenção. Além disso, ainteração de p53 e MDM? foi discutida por Shair et a/. (1997), Chem. & Biol. 4:791, cujo teor inteiro é aqui incorporado como referência, e muta- ções no gene de p53 foram identificadas em virtualmente metade de todos É casos relatados de câncer. Como tensões são impostas sobre uma célula, : acredita-se que p53 orquestre uma resposta que leva à detenção do cicloce- lulare reparo do DNA, ou morte celular programada. Da mesma forma que as mutações no gene de p53 que alteram a função da proteina p53 direta- mente, p53 pode ser alterada por mudanças em MDM?2. A proteina MDM2 demonstrou ligar-se a p53 e romper a ativação transcricional associando-se com o domínio de transativação de p53. Por exemplo, um peptídeo com 11 aminoácidos derivado do domínio de transativação de p53 forma uma hélice a anfipática de 2,5 voltas que se insere dentro da fenda de MDM2. Assim sendo, em algumas modalidades, as estruturas inusitadas da hélice a gera- das pelo método da presente invenção são arquitetadas para gerar estrutu- ras que se ligam firmemente ao aceptor da hélice e rompem as interações proteina nativa-proteína. Estas estruturas são então triadas usando técnicas de alto volume de produção para identificar peptídeos de moléculas peque- nas ideais. As estruturas inusitadas que rompem a interação de MDM2 são
" úteis para muitas aplicações, incluindo, porém sem limitações, controle de . sarcomas de tecidos mois (que superexpressa MDM2 na presença de p53 do tipo selvagem). Estes cânceres são então, em algumas modalidades, mantidos em cheque com moléculas pequenas que interceptam MDM2, im- — pedindo desta forma a supressão de p53. Adicionalmente, em algumas mo- dalidades, os rompedores de moléculas pequenas de interações MDM2-p53 são usados como terapia adjuvante para ajudar a controlar e modular o grau da resposta de apoptose dependente de p53 em quimioterapia convencional.
Uma lista exemplificative não-limitativa de sequências peptídicas apropriadas para uso na presente invenção é fornecida abaixo:
- Tabela 1 a RES OCR Nome (neg rito = resíduos críticos) : x = resíduo Xx-link i : |
. negrito = resíduos críticos X = resíduo x-link i Tabela 1 lista sequências humanas que assestam o sítio de ligação de BH3 e estão implicadas em cânceres, distúrbios autoimunes, doenças metabóli- cas e outras condições de doenças humanas.
Tabela 2 | riem feat os oa Sequência reticulada : negrito = resíduos críticos, X = resíduo x-link BH3 | É -
' Sequência Sequência reticulada . negrito = resíduos críticos X = resíduo x-link IPeptídeos : é : BH3 i 2 & BOK-BH3 IRLAEVCAVLLRLGDELEMIRP RLAEVXAVLXRLGDELEMIRP BAX-BH3 |PQDASTKKSECLKRIGDELDSNMEL |PQDASTKKXECLXRIGDELDSNMEL BAK-BH3 IPSSTMGQVGRQLAIIGDDINRR PSSTMGQVXRQLXIIGDDINRR BCL2L1-BH3 KQALREAGDEFELR QALXEAGDEFELR BCL2-BH3 |.SPPVWVHLALALRQAGDDFSRR |.SPPVVHLXLALXQAGDDFSRR : IBCL-XL-BH3 IEVIPMAAVKQALREAGDEFELRY — |EVIPMAAVXQALXEAGDEFELRY |BCL-W-BH3 IPADPLHOAMRAAGDEFETRF. |PADPLXOAMXAAGDEFETRF IMCL1-BH3 ATSRKLETLRRVGDGVORNHETA — JATSRKXETLXRVGDGVORNHETA IMTD-BH3 |LAEVCTVLLRLGDELEQIR |LAEVXTVLXRLGDELEQIR IMAP-1-BH3 ºMTVGELSRALGHENGSLDP IMTVGELXRALXHENGSLDP INIX-BH3 EGEKEVEALKKSADWVSDWS EGEKEXEALXKSADWVSDWS 41!CD(ERBB4)-BH3 |SMARDPORILVIOGDDRMKL MARDPXRILXIOGDDRMKL ' Tabela 2 lista sequências humanas que assestam o sítio de ligação de BH3 BR e estão implicadas em cânceres, distúrbios auto-imunes, doenças metabóli- cas e outras condições de doenças humanas.
Tabela 3 Sequência (negrito = resi-Sequência Reticulada (X = duos críticos resíduo x-link; Peptídeos sa | Ihp53 pepti-| deo muitocurto |.SQETFSDLWKLLPEN IXSQEXFSDLWKLLPEN lnp53 peptídeo curto |PPLSQETFSDLWKLLPENN |PPXSQEXFSDLWKLLPENN Ihp53-P27S —peptídeo- urto |PPLSQETFSDLWKLLSENN |PPXSQEXFSDLWKLLSENN |DPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENN- - |DPSVEPPXSQEXFSDLWKLLPENN- Ihp53 peptídeo Longo |VLSPLP IVLSPLP Ihp53-P27S peptídeo IDPSVEPPLSQETFSDLWKLLSENN- |DPSVEPPXSQEXFSDLWKLLSENN- ILongo LSPLP IVLSPLP hp53 peptí-| deo muitocurto LSQETFSDLWKLLPEN |LSQETFSDLWXLLPXN lhp53 peptídeo curto [PPLSQETFSDLWKLLPENN |PPLSQETFSDLWXLLPXNN
E Sequência (negrito = resi--Sequência Reticulada (X = F duos críticos resíduo x-link; ihp53-P27S — peptídeo urto |PPLSQETFSDLWKLLSENN |PPLSQETFSDLWXLLSXNN IDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENN- - |DPSVEPPLSQETFSDLWXLLPXNN- Ihp53 peptídeo Longo VLSPLP IVLSPLP Ihp53-P27S peptídeo IDPSVEPPLSQETFSDLWKLLSENN- |[DPSVEPPLSQETFSDLWXLLSXNN- Longo LSPLP LSPLP Tabela 3 lista sequências humanas que assestam o sítio de ligação de p53 de MDM2/X e estão implicadas em cânceres.
Tabela 4 ' Sequência Sequência reticulada - negrito = resíduos críticos)| (X = resíduo -link) Ligantes de peptídeo. ia í SO GPCR í Do langiotensia tt pRVWinPF prmrr | |Bombesina o TEGRLGNQOWAVGHLM IEQRLGNXWAVGHLX Bradiquinha — RPPGFSPARR RPPXFSPFRX ksa — snromoroRr [SHKDMXLGRX fee aRASALGLAR ARASHLXLARX IHormônio estimulante de a-melanócitos YSMEHFRWGKPV YSMXHFRWXKPV Tabela 4 lista sequências que assestam receptores acoplados à proteína G humana e estão implicadas em inúmeras condições doentias humanas (Tyndall et al. (2005), Chem.
Rev. 105:793-826). Métodos para Preparar os Macrociclos Peptidomiméticos da Invenção Os métodos para sintetizar os macrociclos peptidomiméticos da invenção estão aqui descritos.
Em algumas modalidades, a síntese destes —macrociclos peptidomiméticos envolve um processo em múltiplas etapas que efetua a síntese de um precursor peptidomimético que contém um grupa- mento azida e um grupamento alquino; em seguida, colocando em contato o precursor peptidomimético com um reagente de macrociclização para gerar um macrociclo peptidomimético ligado a triazol.
Os macrociclos ou precur- sors de macrociclos são sintetizados, por exemplo, por métodos em fase de solução ou fase sólida, e podem conter aminoácidos de ocorrência natural e
7 também ocorrência não-natural. Vide, por exemplo, Hunt, "The Non-Protein . Aminoácidos" em "Chemistry and Biochemistry of the Aminoacids", editado — por G.C. Barrett, Chapman and Hall, 1985. Em algumas modalidades, uma azida é ligada ao carbono a de umresíduoe um alquino é anexado ao carbono a de outro resíduo. Em al- gumas modalidades, os grupamentos azida são azido-análogos dos aminoá- cidos L-lisina, D-lisina, alfa-metil-L-lisina, alfa-metil-D-lisina, L-ornitina, D- ornitina, alfa-metil-L-ornitina ou alfa-metil-D-ornitina. Em outra modalidade, o grupamento alquino é L-propargilglicina. Em ainda outras modalidades, o — grupamento alquino é um aminoácido selecionado no grupo que consiste em , L-propargilglicina, D-propargilglicina, ácido (S)-2-amino-2-metil-4-pentinóico, - ácido — (R)-2-amino-2-metil-4-pentinóico, — ácido —(S)-2-amino-2-metil-5- hexinóico, ácido (R)-2-amino-2-metil-S-hexinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil- 6-heptinóico, ácido (R)-2-amino-2-metil-6-heptinóico, ácido (S)-2-amino-2- — metil-7-octinóico, ácido (R)-2-amino-2-metil-7-octinóico, ácido (S)-2-amino-2- metil-8-noninóico, e ácido (R)-2-amino-2-metil-8-noninóico. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para fi sintetizar um macrociclo peptidomimético, sendo que o método compreende E as etapas de colocar em contato um precursor peptidomimético da Fórmula 1louFórmulalv: o a re À, Ri La Pr R2
EA Ri2 (Fórmula Il!)
o | A py IALIBIy [C]z [El Ri Y 2 Ra e Re (Fórmula |V) Com um reagente de macrociclização; em que v, w, x, y, 7, A, B, C, D, E, Ra, R2, R7, Re, L1 e Lo são como definidos bs acima; R12 é -H quando o reagente de macrociclização é um reagente de Cu - e R12 é —-H ou alquila quando o reagente de macrociclização é um reagente deRu;eaindaondea dita etapa de colocar em contato resulta em uma liga- ção covalente ser formada entre o grupamento alquino e azida na Fórmula Ill ou Fórmula IV. Por exemplo, R12 pode ser metila quando o reagente de ma- crociclização é um reagente de Ru.
Em algumas modalidades do método da invenção, pelo menos “10 umenteR eR é alquila, alqguenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, ciclo- : alquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, não-substituída ou substitu- ida com halo-. Em modalidades afins, R, e R2 são independentemente alqui- la, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquitalquila, heteroalquila, ou heterociclo-alquila, não-substituída ou substituída com halo-. Por exemplo, pelo menos um entre R; e R» pode ser alquila, não-substituída ou substituída com halo-. Em outro exemplo, R; e também R2 são independentemente alquila, não-substituída ou substituída com halo- . Em algumas modalidades, pelo menos um entre R; e R> é metila. Em ou- tras modalidades, R, e R2 são metila. O reagente de macrociclização pode serum reagente de Cu ou um reagente de Ru.
Em algumas modalidades, o precursor peptidomimético é purifi- cado antes da etapa de colocar em contato. Em outras modalidades, o ma- crociclo peptidomimético é purificado depois da etapa de colocar em contato. Em ainda outras modalidades, o macrociclo peptidomimétic é redobrado de-
f pois da etapa de colocar em contato. O método pode ser realizado em solu- . ção, ou, alternativamente, o método pode ser realizado sobre um suporte sólido. Está previsto também nesta invenção realizar o método da in- venção na presença de uma macromolécula-alvo que se liga ao precursor peptidomimético ou macrociclo peptidomimético sob condições que favore- cem a dita ligação. Em algumas modalidades, o método é realizado na pre- sença de uma macromolécula-alvo que se liga preferencialmente ao precur- sor peptidomimético ou macrociclo peptidomimético sob condições que favo- recem a dita ligação. O método pode ser aplicado também para sintetizar ' uma biblioteca de macrociclos peptidomiméticos.
- O macrociclo peptidomimético resultante de um método da in- venção pode compreender uma hélice a em solução aquosa. Por exemplo, o macrociclo peptidomimético pode apresentar maior estrutura helicóide a em — solução aquosa em comparação com um polipeptídeo não-macrocíclico cor- respondente. Em algumas modalidades, o macrociclo peptidomimético apre- senta maior estabilidade térmica em comparação com um polipeptídeo não- á macrocíclico correspondente. Em outras modalidades, o macrociclo pepti- . domimético apresenta maior atividade -biológica em comparação com um —polipeptídeo não-macrocíclico correspondente. Em ainda outras modalida- des, o macrociclo peptidomimético apresenta maior resistência contra de- gradação proteolítica em comparação com um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente. Em ainda outras modalidades, o macrociclo peptidomiméti- co apresenta maior capacidade de penetrar em células vivas, em compara- —çãocom um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente.
Em algumas modalidades, o grupamento alquino do precursor peptidomimético da Fórmula Ill ou Fórmula IV é uma cadeia lateral de um aminoácido selecionada no grupo que consiste em L-propargilglicina, D- propargilglicina, ácido (S)-2-amino-2-metil-4-pentinóico, ácido (R)-2-amino-2- —metil-4-pentinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil-5-hexinóico, ácido (R)-2-amino- 2-metil-5-hexinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil-6-heptinóico, ácido (R)-2- amino-2-metil-6-heptinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil-7-octinóico, ácido (R)-
h 2-amino-2-metil-7-octinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil-8-noninóico, ácido . (R)-2-amino-2-metil-8-noninóico e o grupamento azida do precursor pepti- domimético da Fórmula Ill ou Fórmula IV é uma cadeia lateral de um amino- ácido selecionado no grupo que consiste em e-azido-L-lisina, e-azido-D- lisina, e-azido-alfa-metil-L-lisina, S-azido-alfa-metil-D-lisina, 5-azido-alpha- metil-L-ornitina, e d-azido-alfa-metil-D-ornitina.
Em algumas modalidades, x+y+z é 3, e A, B e C são indepen- dentemente aminoácidos naturais ou não-naturais. Em outras modalidades, x+y+zé6,e A, Be C são independentemente aminoácidos naturais ou não- naturais. . Em algumas modalidades, a etapa de colocar em contato é rea- . lizada em um solvente selecionado no grupo que consiste em solvente próti- co, solvente aquoso, solvente orgânico, e misturas deles. Por exemplo, o solvente pode ser escolhido no grupo que consiste em HO, THF/H2O, tBu- OH/HZO, DMF, DIPEA, CH3;CN, CH2Clz, CICHXCH2CI ou uma mistura deles. O solvente pode ser um solvente que favorece a formação de hélices. Em algumas modalidades, o macrociclo peptidomimético resul- f tante da realização do método da invenção tem a Fórmula (|): E erra - e R; Rg Pá [ALeBBL lot [DV El Ri Ra L (Fórmula |) em que v, w, x, y, 2, A, B, C, D, E, R1, R2, R7, Rg, e L são como definidos acima.
Grupos protetores, grupos de saída ou reagentes alternativos porém equivalentes são substituídos, e certas etapas de síntese são realiza- das em sequências ou ordens alternativas para produzir os compostos dese- jados. As transformações da química de síntese e as metologias de grupos protetores (proteção e desproteção) úteis para sintetizar os compostos aqui
" descritos incluem, por exemplo, aquelas descritas em Larock, "Comprehen- - sive Organic Transformations", VCH Publishers (1989); Greene e Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2º Edição, John Wiley & Sons (1991); Fieser e Fieser, "Fieser and Fiesers Reagents for Organic Synthe- sis", John Wiley & Sons (1994); e Paquette, editor, "Enciclopedia of Rea- gents for Organic Synthesis", John Wiley & Sons (1995), e suas edições subsequentes. Os macrociclos peptidomiméticos da invenção são fabricados, por exemplo, por métodos de síntese química, tais como descritos em Fields etal, Capítulo 3 em "Synthetic Peptides: A User's Guide", editor Grant, W. f H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, página 77. Assim sendo, por exem- : plo, os peptídeos são sintetizados usando as técnicas automatizadas de Merrifield de síntese em fase sólida com a amina protegida por química de tBoc ou Fmoc usando aminoácidos protegidos na cadeia lateral em, por e- xemplo, um sintetizador de peptídeos automatizado (por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA), Modelo 430A, 431, ou 433). Uma maneira para produzir os precursores peptidomiméticos e ' macrociclos peptidomiméticos aqui descritos usa síntese de peptídeos em : fase sólida (SPPS). O aminoácido do terminal C é afixado a uma resina de poliestireno reticulada por intermédio de uma ligação lábil a ácidos com uma molécula ligante. Esta resina é insolúvel nos solventes usados para a sínte- se, tornando relativamente simples rápido remover por lavagem reagentes em excesso e subprodutos. O terminal N é protegido com o grupo Fmoc, que é estável em ácido, mas removível por base. Os grupos funcionais da cadeia lateral são protegidos conforme necessário com grupos estáveis a bases, e lábeis a ácidos.
Precursores peptidomiméticos mais longos são produzidos, por exemplo, conjuntando peptídeos sintéticos individuais, usando ligação qui- mica nativa. Alternativamente, os peptídeos sintéticos mais longos são bios- sintetizados por técnicas bem conhecidas de DNA recombinante e expres- são de proteínas. Tais técnicas são fornecidas em manuais padronizados bem conhecidos com protocolos detalhados. Para construir um gene que f codifica um precursor peptidomimético desta invenção, a sequência de ami- : noácidos é traduzira inversamente para obter uma sequência de ácidos nu- cléicos que codifica a sequência de aminoácidos, de preferência com códons que são íotimos para o organismo no qual o gene vai ser expressado.
A se- guir, um gene sintético é produzido, tipicamente sintetizando oligonucleoti- deos que codificam o peptídeo e quaisquer elementos reguladores, caso necessário.
O gene sintético é inserido em um vetor de clonagem apropriado e transfectado em uma célula hospedeira.
O peptídeo é então expressado sob condições apropriadas para o sistema de expressão e hospedeiro sele- —cionado.
O peptídeo é purificado e caracterizado por métodos padronizados. . Os precursores peptidomiméticos são produzidos, por exemplo, : de uma maneira combinatorial em um alto volume de produção, usando, por exemplo, um sintetizador combinatório policanais de alto volume de produ- ção (por exemplo, o sintetizador de peptídeos multicanais Modelo Apex 396 da AAPPTEC, Inc., Louisville, KY). Os esquemas de síntese que se seguem são fornecidos unica- mente para ilustrar a presente invenção e não pretendem limitar o âmbito da É invenção, como aqui descrita.
Para simplificar os desenhos, os esquemas : ilustrativos representam análogos de azido-aminoácidos e-azido-a-metil--L- lisina e e-azido-a -metil-D-lisina, e análogos de alquino-aminoácidos L- propargilglicina, ácido (S)-2-amino-2-metil--4-pentinóico, e ácido (S)-2- amino-2-metil--6-heptinóico.
Assim sendo, nos esquemas de síntese que se seguem, cada Ri, Ra, R; e Rg é -H; cadal, é -(CH2)4-; e cada L2 é -(CH7)-. Entretanto, como assinalado na descrição detalhada inteira acima, podem ser empregados muitos outros análogos de aminoácidos nos quais R1, Ro, R7, Re, L1 e L2 podem ser selecioandos independentemente entre as várias estruturas aqui descritas.
Esquema de Síntese 1:
í O O N3 f o AFA >NAANa o : Non x No LR maio R NOR X=halogênio NONO ON Fmoen co GO OO Ret o S-AA-NI-BPB OQ, Q " o, x No A LS, E Ro Es £ RO UNOON X =halogênio in MANN TN Fmoc.
A, SoM R =H, CH3 . R-AA-Ni-BPB Pp x SS jo) N OX ny ——- NO<X R A R=H, CH; S-AA-Ni-BPB Eai o S : NeRESRs ' Ea r no, N A o N CNN -R SEISOS x = halogênio SL Ni VW Fmoes Ás, N TO o R =H, CH, p o H 2 O O O O Ron R-AA-Ni-BPB O Esquema de Síntese 1 descreve a preparação de vários com- postos da invenção.
Complexos de Ni(ll) de bases de Schiff derivados da (S)-2-[N-(N'-benzilprolil)-amino]-benzofenona (BPB) quiral auxiliar e aminoá- cidostais como glicina ou alanina são preparados como descrito em Belokon et al. (1998), Tetrahedron Asymm. 9:4249-4252. Os complexos resultants são subsequentemente reagidos com reagentes alquilantes que compreen- dem um grupo azida ou alquinila para produzir compostos enriquecidos em termos enantioméricos da invenção.
Caso desejado, os compostos resultan- tes podem ser protegidos para uso na síntese de peptídeos.
fi Esquema de Síntese 2: . mo ( No Ea HO o sa co Fm cos Na-Fmoc-C-a-metil N-a-Fmoc-C-a-metil AA AR AO E-azido-L-lisina e-azido-D-lisina 1AAh & [AAL (Se IAAIS * | ss on X R=H ou Me Nets e AE ao * Fmoce. AX Fmoc ASS SPPS N “co i N CoH Noroa âcido N-a-FmocS) y a jeaira: 2-amino 2-metil-4- propargilglicina pentinóico VEM < met = = R às N WS on R=H ou Me DE, Pa. Not Never, . Fmoc: nº Seo Fmoc. n com . —, âàcido Na-Fmoci(S)-2- D: & - Amnoetemõco ” amino-gmet-&-hepinico clvar do Suporte mm sólido Ah A AA SA MIRA IX MIRA IRA Aa in, & E A & E San R=H ou Me ss a R=H ou Me NÃ -N a W Nn Cu (1)
O [AA E SIAA XXC > [AAL IA 7 DIAaIS XX > [AAL bo R Rs IR R We =| nf R=H ou Me RS n R=H ou Me Nº oN no
N No método genérico para a síntese de macrociclos peptidomimé- ticos, ilustrado no Esquema de Síntese 2, o precursor peptidomimético con- tém um grupamento azida e um grupamento alquino e é sintetizado por sin- tese de peptídeos em fase de solução ou fase sólida (SPPS) usando o ami- noácido disponível comercialmente N-a-Fmoc-L-propargilglicina e as formas N-a-Fmoc-protegidas dos aminoácidos ácido (S)-2-amino-2-metil--4- pentinóico, ácido (S)-2-amino-6-heptinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil--6- heptinóico, N-metil-s-azido-L-lisina, e N-metil-e-azido-D-lisina. O precursor —peptidomimético é então desprotegido e clivado da resina em fase sólida por condições padronizadas (por exemplo, ácido forte, tal como TFA a 95%). O precursor peptidomimético é reagido como uma mistura bruta ou é purificado h antes da reação com um reagente de macrociclização, tal como Cu(l), em . soluções orgânicas ou aquosas (Rostovtsev et al. (2002), Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599; Tornoe et a/. (2002), J. Org. Chem. 67:3057-3064; Deiters * et al. (2003), J. Am. Chem. Soc. 125:11782-11783; Punna et al. (2005), An- gew Chem.lnt Ed. 44:2215-2220). Em uma modalidade, a reação formado- ra de triazol é realizada sob condições que favorecem a formação de hélice a. Em uma modalidade, a etapa de macrociclização é realizada em um sol- vente escolhido no grupo que consiste em HO, THF, CH3CN, DMF , DIPEA, tBuOH ou uma mistura deles. Em outra modalidade, a etapa de macrocicli- zação é realizada em DMF. Em algumas modalidades, a etapa de macroci- . clização é realizada em um solvente aquoso ou parcialmente aquoso tampo- - nado. Esquema de Síntese 3: AN: N; NES Ha, = á foss SOM Fosco rmseno nemeçema ELA O Cáxdotsa Cadena na PS Sinai “GIRAS f * SS MW ss Nº R=H ou Me F Ne F e Neem sm moe. moc< A E N “com Nº “com SsPPS N-a-Fmoc-L- âcido N-o-Fmoc4(S)-2- H n propargilglicina amino 2-metil-4-pentinóico tan e mea = Ss RS N R=H ou Me mo e CH Fmocr CO Fm com prscsdo trader as paleta ta | o no y o H RÃ O (AAh x. aço (AA SS iaaIs o ho SS n —ReHouMe NR ss R=H ou Me Ne -N Desproteger Pi ' n & clivar do N y y Ad Suporte sólido ú y Ad AO AA 7 CIAAKO CS x [Alo MAL E UIAAIK Xo CAals ba RS R=H ou Me : RS R=H ou Me
NEN NEN f No método genérico para a síntese. de macrociclos peptidomimé- '
: ticos, ilustrado no Esquema de Síntese 3, o precursor peptidomimético con- tém um grupamento azida e um grupamento alquino e é sintetizado por sin- tese de peptídeos em fase sólida (SPPS), usando o aminoácido disponível comercialmente N-a-Fmoc-L-propargilglicina e as formas N-a-Fmoc- protegidas dos aminoácidos ácido (S)-2-amino-2-metil--4-pentinóico, ácido (S)-2-amino-6-heptinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil--6-heptinóico, N-metil-s- azido-L-lisina, e N-metil-e-azido-D-lisina.
O precursor peptidomimético é rea- gido com um reagente de macrociclização, tal como um reagente de Cu(l) — sobre a resina como uma mistura bruta (Rostovtsev et a/. (2002), Angew. . Chem.
Int.
Ed. 41:2596-2599; Tornoe et al. (2002), J.
Org.
Chem. 67:3057- BR 3064; Deiters et al. (2003), J.
Am.
Chem.
Soc. 125:11782-11783; Punna et al. (2005), Angew.
Chem.
Int.
Ed. 44:2215-2220). O macrociclo peptidomi- mético que contém triazol resultante é então desprotegido e clivado da resi- naem fase sólida por condições padronizadas (por exemplo, ácido forte, tal como TFA a 95%). Em algumas modalidades, a etapa de macrociclização é realizada em um solvente escolhido no grupo que consiste em CH2Cl>, Cl- f CH2CH2CIl, DMF, THF, NMP, DIPEA, 2,6-lutidina, piridina, DMSO, HO ou ' uma mistura deles.
Em algumas modalidades, a etapa de macrociclização é realizada em um solvente aquoso ou parcialmente aquoso tamponado.
õ Esquema de Síntese 4: : Nó (> Hs ns Ffmoeny Co Free, coH
H H N-a-Fmoc-C-a-metil N-a-Fmoc-C-a-metil SS. RA O £-azido-L-lisina £-azido-D-lisina AA S [AALK (Se As SS ES ss o X R=H ou Me o Ne SE Fmocs, AR Fmoc., ARCH SPPS NÓ “com N “co N-a-Fmoc-L- 2 No FmocASH2- nº? Hu O dies il-4-pentir ponteira ami íta pentinóico aa 7 < q nau a P RS A R=H ou Me no Fmocx, SH Fmoc- uEHs | N “com N “coz Beido N-a-Fmoc(S)-2- âcido N-a-Fmoc(S)-2- Desproteger & amino-6-heptnóico amino-2-metil-6-heptnóico clivar do suporte - * sólido o o o o
H H H H tn, NAAS nal ta e Stan Ps (Alo NR ss NR SM = , R=H ou Me Ss rn R=H ou Me & 4 anão X NºN Ru (1) nt - H H H [SA A E met [Alo AA NI SAAE a, R Rs VIR R RR ' R=H ou Me RS " R=H ou Me
NÃ NAN y Nº No método genérico para a síntese de macrociclos peptidomimé- ticos, ilustrado no Esquema de Síntese 4, o precursor peptidomimético con- tém um grupamento azida e um grupamento alquino e é sintetizado por sin- tesede peptídeos em fase de solução ou fase sólida (SPPS), usando o ami- noácido disponível comercialmente N-a-Fmoc-L-propargilglicina e as formas N-a-Fmoc-protegidas dos aminoácidos ácido (S)-2-amino-2-metil--4- pentinóico, ácido (S)-2-amino-6-heptinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil--6- heptinóico acid, N-metil-s-azido-L-lisina, e N-metil-e-azido-D-lisina. O precur- — sor peptidomimético é então desprotegido e clivado da resina em fase sólida por condições padronizadas (por exemplo, ácido forte, tal como TFA a 95%). O precursor peptidomimético é reagido como uma mistura bruta ou é purifi- cado antes da reação com um reagente de macrociclização, tais como rea-
" gentes de Ru(l!), por exemplo, Cp*RuCI(PPh3)2 or [Cp*RuCl]a (Rasmussen et " al. (2007), Org. Lett. 9:5337-5339; Zhang et al. (2005), J. Am. Chem. Soc. 127:15998-15999). Em algumas modalidades, e etapa de macrociclização é realizada em um solvente escolhido no grupo que consiste em DMF, CH3;CN eTHF. Esquema de Síntese 5: Ni N. Free co mos co inner aE An VANNAA IA AAA Csnidotisima o pao eae! Aa SS SAAL O SIA DS % WA ss NR R=H ou Me : Ne Nes mw Free Com sa com SsPPS N-o-F' L ácido N-a-FmociS)-2- propargigicina Ea e neddetánds ta À 7 ane ea Po Ds - RS N R=H ou Me no e CH, Fmoea 'CoH moer Co E RT ar Seo Emas AMA le 0) : Ad LA AO tam Po Naa o San, (AI SRA o SRA ES Td RH DU Ma EE R=H ou Me nd Desproteger Ss Nº & clivar do No o Suporte sólido nu 2 H O
H H tao 7 SIA o StAaL AA IS RAI, A R Rs VR ReHoume R RS VT ReHoume
NA NO Nº Nº No método genérico para a síntese de macrociclos peptidomimé- ticos, ilustrado no Esquema de Síntese 5, o precursor peptidomimético con- tém um grupamento azida e um grupamento alquino e é sintetizado por sin- tese de peptídeos em fase de solução ou fase sólida (SPPS), usando o ami- noácido disponível comercialmente N-a-Fmoc-L-propargilglicina e as formas N-a-Fmoc-protegidas “dos aminoácidos ácido (S)-2-amino-2-metil--4- pentinóico, ácido (S)-2-amino-6-heptinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil--6-
o heptinóico, N-metil-s-azido-L-lisina, e N-metil-s-azido-D-lisina.
O precursor s . peptidomimético é reagido com um reagente de macrociclização, tais como um reagente de Ru(ll) sobre a resina como uma mistura bruta.
Por exemplo, 4 o reagente pode ser Cp*RuCI(PPh3a), ou [Cp*RuClls (Rasmussen et al. ; (2007), Org.
Lett 9:5337-5339; Zhang et al. (2005), J.
Am.
Chem.
Soc. 127:15998-15999). Em algumas modalidades, a etapa de macrociclização é realizada em um solvente escolhido no grupo que consiste em CH2Cl2, CI- CH2CH2CI, CH3;CN, DMF, e THF.
Vários macrociclos peptidomiméticos exemplificativos estão indi- cados na Tabela 5. Para estes macrociclos, um polipeptídeo não- . macrocíclico correspondente é o fragmento de sequência de polipeptídeo E: BID BH3, DIIRNIARHLAQVGDSMDRSI. "Nle" representa norleucina e subs- titui um resíduo de metionina.
Prevê-se que ligantes similares são usados para sintetizar macrociclos peptidomiméticos basados em sequências de —polipeptídeos descritas na Tabela 1 até Tabela 4.
. TABELA 5
N N AC-DIIRNIARHLAS Ç NVEeD” K >NEeDRSINH2 — MW=2464 N e CH; No AN
N AC-DIRNIARHIAS SveD” K SNIeDRSINH2 — MW=2464 Ee a N. AN
N V AC-DIIRNIARHLAS Vero” SÓ O NeDRSINH, MW = 2478 | CH3 Era CHa Nº N
N ACDIRNIARHLAS É SveD” SK O NGDRSINH, MW = 2478 SR j CH, N. eN
N : N K AC-DIIRNIARHLAS VEDT x NIEDRSINH2 — MW=2492 ea j em Nó ON N : NA a AC-DIIRNIARHLAS ven” XxX “NIeEDRSINH, — MW=2492 e f N.2N n u É acomar a A voo PA meorsu, MW = 2464 i den Fen : E Ss acomete eo Po mansa, — mca 1 OH Fº cHK
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NAN n 4 commit veo A menrsos, MW = 2478 Fen —" à - u O O MW = 2078 RR 7 CH, 4 : sy n H acormania Po ven A menrsim, NNW = 2452 - NE Fa > E) " acormaan A vao A nn MW = 2482 ir No p Tabela 5 ilustra macociclos peptidomiméticos exemplificativos da invenção. "Nle" representa norleucina. É Análogos de Aminoácidos A presente invenção contempla o uso de aminoácidos de ocor- rência não-natural e análogos de aminoácidos na síntese dos macrociclos peptidomiméticos aqui descritos. Qualquer aminoácido ou análogo de ami- —noácido suscetível aos métodos de síntese empregados para a síntese de macrociclos peptidomiméticos que contêm triazol estáveis pode ser usado na presente invenção. Por exemplo, L-propargilglicina está contemplada co- mo um aminoácido útil na presente invenção. Entretanto, outros aminoácidos que contêm alquino, contendo uma cadeia lateral de aminoácido diferente também são úteis na invenção. Por exemplo, L-propargilglicina contém uma unidade metileno no carbono a do aminoácido e o alquino da cadeia lateral do aminoácido. A invenção contempla também o uso de aminoácidos com múltiplas unidades metileno o carbono a e o alquino. Além disso, os azido-
í análogos de aminoácidos L-lisina, D-lisina, alfa-metil--L-lisina, e alfa-metil-D- A lisina estão contemplados como aminoácidos úteis na presente invenção. Entretanto, outros azido-âminoácidos que contêm uma cadeia lateral de a- minoácido diferente também são úteis na invenção. Por exemplo, o azido- análogo de L-lisina contém quatro unidades metileno entre o carbono a do aminoácido e o terminal azida da cadeia lateral do aminoácido. A invenção contempla também o uso de aminoácidos com menos ou mais do que quarto unidades metileno entre o carbono a e a azida terminal. A Tabela 6 indica alguns aminoácidos úteis na preparação de macrociclos peptidomiméticos dainvenção. ' TABELA 6 L ! - y À Free COM Presa cou N-a-Fmoc-L-propargil glicina Na-Fmoc-D-propargil glicina l: V' LH He: pres sa, Ps Aco, ácido N-a-Fmoc(S)-2-amino-2- ácido N-a-Fmoc4R)-2-amino-2- E meti-a-pentanóico meti-4-pentanéico
AF P Ú Ls Hs Press ou Fresco ácido N-a-Fmoc(S)-2-amino-2- cido N-a-Fmoc-(R)-2-amino-2- meti-s-hexinéico meti-S-hexinéico Ven. HG 2 Fmeesy co Pres cou ácido N-o-Fmoci(S)-2-amino-2- ácido N-o-Fmoc(R)-2-amino-2- metil-6-heptinóico metil-6-heptinóico Z (RR sHs es mora 'coH Fm 'CoH ácido N-a-Fmoc(S)-2-amino-2- ácido N-a-Fmoc-(R)-2-amino-2- metl-7-octinéico meti-7-octinéico A " " (— mesm com Free com ácido N-a-FmociS)-2-amino-2- ácido N-a-Fmoc-(R)-2-amino-2- meti-Bnoninóico meti-Bnoninéico
- N3 N3 - H H ( x A NÓ “CoH Fmoc N co,
H H Na-Fmoc-e-azido-L+lisina N-0-Fmoc-e-azido-DHisina N3 N3 CH; H3C, ( F e. ai moer», con Fmoc NO co,
H H " N-a-Fmoc-e-azido-a-metil-L- N-a-Fmoc-e-azido-a-metil-D- lisina lisina N3 N3 H H í Fi E XX moc>, CO Fmoc Nº co
H H N-a-Fmoc-b-azido-L-omitina Na-Fmoc-s-azido-D-ormitina - N3 N3 Nes a Fmoc, À Fmoc., À N “COH N 2 Nº “co Na-Fmoc-e-azido-o-metiL- (Hefmocraido a mei-D- omitina tina Tabela 6 indica aminoácidos exemplificativos úteis na preparação de ma- crociclos peptidomiméticos da invenção.
Em algumas modalidades, os aminoácidos e anaálogos de ami- noácidos têm a configuração D. Em outras modalidades, eles têm a configu- ração L. Em algumas modalidades, alguns dos aminoácidos e análogos de aminoácidos contidos no peptidomimético têm a configuração D, enquanto — que alguns dos aminoácidos e análogos de aminoácidos têm a configuração L. Em algumas modalidades, os análogos de aminoácidos são a,a-
' dissubstituídos, = tais como a-metil--L-propargilglicinan — a-metil--D- : propargilglicina, e-azido-alfa-metil--L-lisina, e e-azido-alfa-metil-D-lisina. Em algumas modalidades, os análogos de aminoácidos são N-alquilados, por exemplo, N-metil--L-propargilglicina, N-metil--D-propargilglicina, N-metil-e- azido-L-lisina, e N-metil-e-azido-D-lisina. Em algumas modalidades, o grupamento -NH do aminoácido é protegido usando um grupo protetor, incluindo sem limitações -Fmoc e -Boc. Em outras modalidades, o aminoácido não é protegido antes da síntese do macrociclo peptidomimético.
Em algumas modalidades, um aminoácido útil na síntese do ma- ' crociclo peptidomimético da invenção é um composto da Fórmula Ila ou Ilb: q V % AA COR" Rio Rio . la lb em que R, e R2 são independentemente alquila, alquenila, alquinila, ari- lalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, não-substituída ou substituída com halo; cada Q e T é selecionado independentemente no grupo que consiste em alquileno, cicloalquileno, heterocicioalquileno, arileno, heteroarileno e [-Ra4-K- Ra-lh,cada um deles sendo não-substituído ou substituído com Rs; Ké O, S, SO, SO>z, CO, CO, ou CONR;3; R3 é hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, heteroal- quila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquilalquila, cicloarila, ou heteroci- cloarila, opcionalmente substituídos com Rs; Ra é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, ciclo- alquileno, heterociclo-alquileno, arileno, ou heteroarileno;
À cada Rs; é independentemente halogênio, alquila, -ORÊ:, -N(Re)2, -SRe, : -SOR6, -SO2R6, -CO2R6s, um grupamento fluorescente, um radioisótopo ou um agente terapêutico; cada Rg é independentemente —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, um grupamento fluorescente, um radioi- sótopo ou um agente terapêutico; R;7 e Rg são independentemente —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquita, heteroalquilalquila, ou heterocicloalquila; R1o e R11 são independentemente -H ou qualquer grupo protetor apropriado para a síntese de peptídeos; ' g e h são independentemente um número inteiro entre O e 5, on- » de g+h é maior do que 1; e n é um número inteiro entre 1 e 5. Em algumas modalidades, o composto é um composto da Fór- mulallaeR;, é alquila, não-substituída ou substituída com halo-. Em outras modalidades, o composto é um composto da Fórmula |Ilb e R2 é alquila, não-substituída ou substituída com T halo-. Em ainda outras modalidades, o composto é um composto da Formu- la lla e R; é alquila não-substituída. Por exemplo, R, pode ser metila. Em ainda outras modalidades, o composto é um composto da Fórmula Ilb e Ro é alquila não-substituída. Por exemplo, R> pode ser metila.
Em algumas modalidades dos compostos da invenção, pelo me- nos um entre Rg e Rio é um grupo protegido apropriado para a síntese de peptídeos.
Kits : Em outro aspecto, a presente invenção fornece ainda kits que compreendem compostos da invenção ou outros análogos de aminoácidos úteis na preparação dos macrociclos peptidomiméticos da invenção junto com reagentes de macrociclização, como aqui descritos.
Em algumas modalidades, a invenção fornece um Kkit que com- preende: a) pelo menos um composto selecionado no grupo que consiste
- g e h são independentemente um número inteiro entre O e 5, on- p de g+h é maior do que 1; e n é um número inteiro entre 1 e 5; e b) um reagente de macrociclização.
Em algumas modalidades, o kit compreende um composto da Fórmula lla e R, é alquila, não-substituída ou substituída com halo-. Em modalidades afins, R; é alquila não-substituída. Por exemplo, R; pode ser metila. Em outras modalidades, o kit compreende um composto da Fórmula 1lb e R2 é alquila, não-substituída ou substituída com halo-. Em modalidades afins, Rz é alquila não-substituída. Por exemplo, R> pode ser metila. - Em algumas modalidades, um kit compreende pelo menos um . composto da Fórmula lla e pelo menos um composto da Fórmula Ilb. Um Kit da invenção pode compreender também um composto da Fórmula lla ou Fórmula lb onde pelo menos um entre Rg e Rio é um grupo protegido para a síntese de peptídeos. Em modalidades específicas do Kit da invenção, o re- agente de macrociclização é um reagente de Cu ou um reagente de Ru. Em algumas modalidades, o kit contém uma pluralidade de compostos da Fór- . mula lla e/ou Fórmula Ilb. Em algumas modalidades, o kit compreende um : ou mais recipientes que mantêm um ou mais análogos de aminoácidos como —aquidescritos. Em outras modalidades, o kit compreende um ou mais recipi- entes que mantêm um ou mais reagentes de macrociclização como aqui descritos. Em ainda outras modalidades, o kit compreende um ou mais reci- pientes que mantêm um ou mais análogos de aminoácidos como aqui des- critos, bem como um ou mais recipientes que mantêm um ou mais reagentes demacrociclização como aqui descritos.
Por exemplo, em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente que mantém pelo menos dois análogos de aminoácidos, como descritos acima, pelo menos um que tem uma cadeia lateral alquino e pelo menos um que tem um grupamento azida no terminal da cadeia lateral, sen- doo análogo de aminoácido opcionalmente protegido e apropriado para as sínteses aqui descritas. Em algumas modalidades, o análogo de aminoácido é selecionado no grupo que consistt em L-propargilglicina, D-
T propargilglicina, ácido (S)-2-amino-2-metil-4-pentinóico, ácido (R)-2-amino-2- S metil-4-pentinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil-5-hexinóico, ácido (R)-2-amino- 2-metil-S-hexinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil-6-heptinóico, ácido (R)-2- amino-2-metil-S-heptinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil-7-octinóico, ácido (R)- 2-amino-2-metil-7-octinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil-8-noninóico, ácido (R)-2-amino-2-metil-8-noninóico, e-azido-L-lisina, e-azido-D-lisina, e-azido- alfa-metil-L-lisina, 3-azido-alfa-metil-D-lisina, S-azido-alfa-metil-L-ornitina, e $-azido-alfa-metil-D-ornitina, e todas formas adequadamente protegidas para a síntese de peptídeos em fase líquida ou sólida. Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente que . mantém pelo menos um aminoácido de ocorrência não-natural, ou análogo . de aminoácido, ligado a um suporte sólido compatível com as sínteses aqui descritas para macrociclos peptidomiméticos. Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente que mantém um análogo de aminoácido da invenção que inclui um grupamento alquino terminal em combinação com um recipiente que mantém um análogo de aminoácido da invenção que in- clui um grupamento azida terminal em combinação com um reagente de ma- ! crociclização da invenção. B Ensaios As propriedades dos macrociclos peptidomiméticos da invenção são testadas, por exemplo, usando os métodos descritos abaixo. Em algu- mas modalidades, um macrociclo da invenção tem propriedades intensifica- das em relação a um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente. Um po- lipeptídeo não-macrocíclico correspondente é, por exemplo, um precursor de um macrociclo peptidomimético, tal como um composto da Fórmula Ill ou IV que é convertido no dito macrociclo. Alternativamente, um polipeptídeo não- macrocíclico correspondente é uma sequência de polipeptídeo, tal como uma sequência de polipeptídeo natural que tem substancial sobreposição de sequências com o macrociclo da invenção. Inúmeros exemplos de polipeptíi- —deos naturais correspondentes ao polipeptídeo macrocíclico são conhecidos nas Tabelas 1,2, 3e4.
Em geral, um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente po-
i de ser também um polipeptídeo natural marcado ou precursor peptidomimé- : tico marcado. Essa marcação, por exemplo, por marcação fluorescente ou radioativa, é usada caso necessário em alguns dos ensaios descritos abaixo. Em tais ensaios, o macrociclo e também o polipeptídeo não-macrocíclico correspondente são tipicamente marcados por métodos similares ou funcio- nalmente equivalentes. Ensaio para Determinar Helicidade a Em solução, a estrutura secundária dos polipeptídeos com do- mínios helicóides a atingirão um equilíbrio dinâmico entre estruturas helicoi- dais aleatórias e estruturas helicóides a, frequentemente expressado como é "helicidade percentual". Assim sendo, por exemplo, os domínios BH3 pró- B apoptóticos não-modificados são predominantemente espirais aleatórias em solução, com teor helicóide a usualmente abaixo de 25%. Os macrociclos peptidomiméticos com ligantes otimizados, por outro lado, possuem, por e- xemplo, uma helicidade alfa que é pelo menos duas vezes maior do que um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente. Em algumas modalidades, os macrociclos da invenção possuirão uma helicidade alfa maior do que 50%. Á Para testar a helicidade de macrociclos peptidomiméticos da invenção, tais V como macrociclos baseados em domínios BH3, os compostos são dissolvi- dosem uma solução aquosa(por exemplo, solução de fosfato de potássio 50 mM em pH 7, ou H2O destilada, até concentrações 25-50 UM). Os espectros de dicroísmo circular (CD) são obtidos em espectropolarímetro (por exemplo, Jasco J-710), usando parâmetros de medição padronizados (por exemplo, temperatura, 20 ºC; comprimento de onda, 190-260 nm; resolução da etapa, 0,5 nm; velocidade, 20 nm/s; acumulações, 10; resposta, 1 s; largura da banda, 1 nm; comprimento do trajeto, 0,1 cm). O Teor helicóide a de cada peptídeo é calculado dividindo a elipticidade média do resíduo (por exemplo,
[9]2220bs) pelo valor relatado para um modelo helicóide decapeptídeo (Yang et al. (1986), Métodos Enzymol. 130:208)). Ensaio para Determinar a Temperatura de Fusão (Tm). Um macrociclo peptidomimético da invenção, que comprende uma estrutura secundária, tal como uma hélice a, apresenta, por exemplo,
: uma temperatura de fusão mais alta do que um polipeptídeo não- : macrocíclico correspondente. Tipicamente, os macrociclos peptidomiméticos da invenção apresentam Tm > 60 ºC, representando uma estrutura altamen- te estável em soluções aquosas. Para testar o efeito da formação de macro- —ciclodobrea temperatura de fusão, os macrociclos peptidomiméticos ou po- lipeptídeos não-modificados são dissolvidos em H2O destilada (por exemplo, em uma concentração final 50 uM) e a Tm é determinada medindo a mudan- ça em elipticidade em uma faixa de temperatura (por exemplo, 4 a 95 ºC) em um espectropolarímetro (por exemplo, Jasco J-710), usando parâmetros pa- —dronizados (por exemplo, comprimento de onda 222 nm; resolução da etapa, . 0,5 nm; velocidade, 20 nm/s; acumulações, 10; resposta, 1 s; largura da . banda, 1 nm; taxa de aumento da temperatura: 1º C/min; comprimento do trajeto, 0,1 cm).
Ensaio de Resistência a Proteases A ligação amida da estrutura principal do peptídeo é suscetível à hidrólise por proteases, tornando desta forma os compostos peptídicos vul- neráveis à degradação rápida in vivo. A formação de hélice do peptídeo, en- Ú tretanto, tipicamente esconde a estrutura principal da amida, e portanto, po- ' de blindá-la contra clivagem proteolítica. Os macrociclos peptidomiméticos da presente invenção podem ser submetidos à proteólise in vitro por tripsina para avaliar qualquer mudança na taxa de degradação em comparação com um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente. Por exemplo, o macroci- clo peptidomimético e um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente são incubados com tripsina agarose e as reações são interrompidas rapidamente em vários pontos no tempo por centrifugação e subsequente injeção em H- PLC para quantificar o substrato residual por absorção de ultravioleta a 280 nm. Resumidamente, o macrociclo peptidomimético e o precursor peptido- mimético (5 meg) são incubados com tripsina agarose (Pierce) (S/E —125) por O, 10, 20, 90, e 180 minutos. As reações são interrompidas rapidamente por centrifugação em bancada em alta velocidade; o substrato remanescente no sobrenadante isolado é quantificado por detecção de picos baseada em HPLC a 280 nm. A reação proteolítica apresenta cinética de primeira ordem
! e a constante de taxa, k, é determinada a partir de uma plotagem de In[S] . versus tempo (k=-1Xslope). Ensaio de Estabilidade Ex Vivo Os macrociclos peptidomiméticos com ligantes otimizados pos- suem, por exemplo, uma meia-vida ex vivo que é pelo menos duas vezes maior do que aquela de um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente, e possuem uma meia-vida ex vivo de 12 horas ou mais.
Para estudos de esta- bilidade sérica ex vivo, uma série de ensaios pode ser usada.
Por exemplo, um macrociclo peptidomimético e um polipeptídeo não-macrocíclico corres- —pondente (em um exemplo específico, o polipeptídeo natural corresponden- . te) (2 mcg) são incubados com soro fresco de camundongo, rato e/ou huma- : no (2 mL) a 37 ºC por O, 1, 2, 4, 8, e 24 horas.
Para determinar o nível de compost intacto, o seguinte procedimento pode ser usado: As amostras são extraídas transferindo 100 uL de soros para tubos de centrifugação de 2 mL, eem seguida, adição de 10 ul de ácido fórmico a 50% e 500uL de acetoni- trila e centrifugação a 14.000 rpm por 10 min a 4 + 2 ºC.
Os sobrenadantes são então transferidos para tubos de 2 mL frescos e evaporados em Turbo- í vap sob N? < 68,95 kPa (10 psi), 37 ºC.
As amostras são reconstituídas em ! 100uL de acetonitrila:água 50:50 e submetidas à nálise por LC-MS/MS.
Ensaios de Ligação /n vitro Para avaliar a ligação e afinidade de macrociclos peptidomiméti- cos e precursores peptidomiméticos para proteínas aceptoras, em ensaio de polarização por fluorescência (FPA) é usado, por exemplo.
A técnica de FPA mede a orientação molecular e mobilidade usando luz polarizada e traçador fluorescente.
Quando excitados com luz polarizada, os traçadores fluores- centes (por exemplo, FITC) afixados a moléculas com pesos moleculares aparentes altos (por exemplo, peptídeos marcados com FITC ligados a uma proteína grande) emitem níveis mais altos de fluorescência polarizada devi- do a suas velocidades mais lentas de rotação em comparação com traçado- res fluorescentes afixados a moléculas menores (por exemplo, peptídeos marcados com FITC que estão livres em solução). Por exemplo, os macrociclos peptidomiméticos fluoresceinados
" (25 nM) são incubados com a protein aceptora (25-1.000 nM) em tampão de Y ligação (NaCl 140 MM, Tris-HCI 50 mM, pH 7,4) por 30 minutos à temperatu- ra ambiente.
A atividade de ligação é medida, por exemplo, por polarização de fluorescência em um espectrofotômetro de luminescência (por exemplo, —Perkin-Elmer LS50B). Os valores de Kd podem ser determinados por análise de regressão não-linear usando, por exemplo, o software Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Um macrociclo peptidomimético da invenção apresenta, em alguns casos, Kd similar ou mais baixa do que um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente.
As proteínas aceptoras para peptídeos BH3, tais como BCL-2, - BCL-X,, BAX ou MCL1, podem ser, por exemplo, usadas neste ensaio.
As : proteínas aceptoras para peptídeos p53, tais como MDM2 ou MDMX, tam- bém podem ser usadas neste ensaio.
Ensaios de Deslocamento /n vitro para Caracterizar Antagonistas de Intera- ções Peptideo-Proteina Para avaliar a ligação e afinidade «de compostos que antagoni- zam a interação entre um peptídeo (por exemplo, um peptídeo BH3 ou um fr peptídeo p53) e uma proteína aceptora, um ensaio de polarização por fluo- E rescência (FPA) que utiliza um macrociclo peptidomimético fluoresceinado derivado de uma sequência de precursor peptidomimético, é usado, por e- xemplo.
A técnica de FPA mede a orientação molecular e mobilidade usando luz polarizada e traçador fluorescente.
Quando excitados com luz polarizada, os traçadores fluorescentes (por exemplo, FITC) afixados a moléculas com pesos moleculares aparentes altos (por exemplo, peptídeos marcados com —FITC ligados a uma proteína grande) emitem níveis mais altos de fluores- cência polarizada devido a suas velocidades mais lentas de rotação em comparação com traçadores fluorescentes afixados a moléculas menores (por exemplo, peptídeos marcados com FITC que estão livres em solução). Um composto que antagoniza a interação entre o macrociclo peptidomiméti- co fluoresceinado e uma proteína aceptora será detectado em um experi- mento de FPA de ligação competitiva.
Por exemplo, compostos antagonistas putativos (1 nM a 1 mM) e
" um macrociclo peptidomimético fluoresceinado (25 nM) são incubados com a : proteína aceptora (50 nM) em tampão de ligação (NaCl 140 mM, Tris-HCI 50 MM, pH 7,4) por 30 minutos à temperatura ambiente. A atividade de ligação de antagonistas é medida, por exemplo, por polarização com fluorescência em um espectrofotômetro de luminescência (por exemplo, Perkin-Elmer LS50B). Os valores de Kd podem ser determinados por análise de regressão não-linear usando, por exemplo, o software Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).
Qualquer classe de molécula, tais como moléculas orgânicas pequenas, peptídeos, oligonucleotídeos ou proteínas podem ser examinadas : como antagonistas putativos neste ensaio. As proteínas aceptoras para pep- - tídeos BH3, tais como BCL2, BCL-XL, BAX ou MCL1, podem ser usadas neste ensaio. As proteínas aceptoras para peptídeos p53, tais como MDM2 ou MDMX, podem ser usadas enste ensaio.
Ensaios de Ligação em Células Intactas É possível medir a ligação de peptídeos ou macrociclos pepti- domiméticos aos seus acceptores naturais em células intactas por experi- : mentos de imunoprecipitação. Por exemplo, células intactas são incubadas - com compostos fluoresceinados (marcados com FITC) por 4 h na ausência de soro, eem seguida, substituição do soro e incubação adicional que dura 4-18 h. As células são então peletizadas e incubadas em tampão de lise (Tris SOMM [pH 7,6], NaCl 150 mM, 1% de CHAPS e coquetel de inbidores de proteases) por 10 minutos a 4 ºC. Os extratos são centrifugados a 14.000 rpm por 15 minutos e os sobrenadantes são coletados e incubados com 10 ul de anticorpo caprino anti-FITC por 2 h, girando a 4 ºC, e em seguida, mais 2 h de incubação a 4 ºC com proteína A/Sepharose G (50 uL de lama de pérolas a 50%. Depois de rápida centrifugação, os péletes são lavados em tampão de lise contendo cpncentração crescente de sais (por exemplo, 150, 300, 500 mM). As pérolas são então reequilibradas em NaCl 150 mM —antesda adição de tampão de amostras contendo SDS e fervura. Depois da centrifugação, os sobrenadantes passam opcionalmente por eletroforese usando gradiente de 4%-12% de géis de Bis-Tris, e em seguida, transferên-
" cia para dentro de membranas Immobilon-P.
Depois de bloquear, as man- : chas são opcionalmente incubadas com um anticorpo que detecta FITC e também com um ou mais anticorpos que detectam proteínas que se ligam ao macrociclo peptidomimético, incluindo BCL2, MCL1, BCL-XL, A1, BAX, BAK, MDM2ouMDMX.
Ensaios de Permeabilidade Celular Um macrociclo peptidomimético é, por exemplo, mais permeável a células em comparação com um polipeptídeo não-macrocíclico correspon- dente.
Em algumas modalidades, os macrociclos peptidomiméticos são mais permeáveis a células do que um polipeptídeo não-macrocíclico correspon- fr dente.
Os macrociclos peptidomiméticos com ligantes otimizados possuem, : por exemplo, permeabilidade cellular que é pelo menos duas vezes maior do que um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente, e frequentemente 20% ou mais do peptide aplicado serão observados como tendo penetrados na célula depois de 4 horas.
Para medir a permeabilidade celular de macro- ciclos peptidomiméticos e polipeptídeos não-macrocíclicos correspondentes, células intactas são incubadas com macrociclos peptidomiméticos ou poli- ' peptídeos não-macrocíclicos correspondentes fluoresceinados (10 UM) por 4 : h em meios isentos de soro a 37 ºC, lavados com meios e incubados com tripsina (0,25%) por 10 min a 37 ºC.
As células são lavadas novamente e recolcoadas em suspensão em PBS.
A fluorescência celular é analisada, por exemplo, usando um citômetro de fluxo FACSCalibur ou a leitora Cellomics' QuineticScan O HCS Reader.
Ensaios da Eficácia Celular A eficácia de certos macrociclos peptidomiméticos é determina- da, por exemplo, em ensaios de exterminação baseados em células, usando uma série de linhagens de células tumorigênicas e não-tumorigênicas e célu- las primárias derivadas de populações de células humanas ou do camun- dongo.
A viabilidade celular é monitorada, por exemplo, durante 24-96 h de incubação com macrociclos peptidomiméticos (0,5 a 50 uM) para identificar aqueles que exterminam em CEso <10 UM.
Vários ensaios-padrão que me- dem a viabilidade cellular estão disponíveis comercialmente e são usados bi opcionalmente para avaliar a eficácia dos macrociclos peptidomiméticos. i Além disso, ensaios que medem a ativação de Anexina V e caspases são opcionalmente usados para avaliar se os macrociclos peptidomiméticos ex- terminam células ativando a maquinaria apoptótica.
Ensaiode Estabilidade /n Vivo Para investigar a estabilidade in vivo dos macrociclos peptido- miméticos, os compostos são, por exemplo, administrados a camundongos e/ou ratos belas vias IV, IP, PO ou inalação em concentrações na faixa entre 0,1 e 50 mg/kg e espéciemes de sangue são retiradas em 0', 5', 15', 30, 1h, 4h, /8he24 horas após a injeção.
Os níveis de composto intact em 25 ul ] - — decada soro fresco são então medidos por LC-MS/MS como acima.
R Eficácia In vivo em Modelos Animais Para determinar a atividade antioncogênica de macrociclos pep- tidomiméticos da invenção in vivo, os compostos são, por exemplo, dados isoladamente (vias IP, IV, PO, por inalação ou nasal) ou em combinação com doses abaixo da ótima de quimioterapia relevante (por exemplo, ciclo- fosfamida, doxorrubicina, etoposida). Em um exemplo, 5 x 10º RS4;11 célu- h las (estabelecidas a partir da medula óssea de um paciente com leucemia : linfoblástica aguda) que expressam de forma estável luciferase recebem in- jeção pela veia da cauda em camundongos NOD-SCID 3 h depois que eles foram submetidos a irradiação do corpo total.
Caso deixada não-tratada, es- ta forma de leucemia é fatal em 3 semanas neste modelo.
A leucemia é fa- cilmente monitorada, por exemplo, injetando os camundongos com D- luciferina (60 mg/kg) e reproduzindo imagens dos animais anestesiados (por exemplo, Xenogen In Vivo Imaging System, Caliper Life Sciences, Hopquin- ton, MA). A bioluminescência de corpo total é quantificada por integração de fluxo fotônico (fótons/s) pelo Software de Imagens Vivas (Caliper Life Scien- ces, Hopkinton, MA). Os macrociclos peptidomiméticos isoladamente ou em combinação com doses abaixo da ótima de agentes quimioterápicos relevan- tes são, por exemplo, administrados a camundongos leucêmicos (10 dias depois da injeção/Dia 1 do experimento, em faixa de bioluminescência de 14-16) pela veia da cauda ou IP em doses na faixa entre 0,1mg/kg e 50 a mg/kg por 7 a 21 dias.
Opcionalmente, os camundongos passam por repro- : dução de imagens durante o tratamento inteiro a cada dois dias e a sobrevi- da foi monitorada diariamente durante a duração do experimento.
Os ca- mundongos expirados são opcionalmente submetidos a necropsia no final do experimento.
Outro modelo animal em implantação em camundongos NOD- SCID de DoHH2, uma linhagem de células derivada de linfoma folicular hu- mano, que expressam de forma estável luciferase.
Estes testes in vivo ge- ram opcionalmente dados farmacocinéticos, farmacodinâmicos e toxicológi- cos.
Ensaios Clínicos 1 Para determinar a adequabilidade dos macrociclos peptidomimé- : ticos da invenção para tratamento de humanos, são realizados ensaios clíni- cos.
Por exemplo, pacientes diagnosticados com câncer e em necessidade de tratamento são selecionados e separados em tratamento e um ou mais — grupos de controle, onde o grupo de tratamento recebe administração de um macrociclo peptidomimético da invenção, enquanto que os grupos de contro- le recebem placebo ou um fármaco anticâncer conhecido.
A segurança e do Ú tratamento e a eficácia dos macrociclos peptidomiméticos da invenção po- E dem ser assim avaliadas realizando comparações de grupos de pacientes com respeito a fatores tais como sobrevida e qualidade de vida.
Neste e- xemplo, o grupo de pacientes tratados com um macrociclo peptidomimético apresenta melhor sobrevida de longo prazo em comparação com um grupo de pacientes de controle tratado com placebo.
Composições Farmacêuticas e Vias de Administração Os macrociclos peptidomiméticos da invenção incluem também seus serivados ou pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis.
Um "deriva- do farmaceuticamente aceitável" significa qualquer sal, éster, sal de um és- ter, pró-fármaco, ou outro derivado farmaceuticamente aceitável de um com- posto desta invenção que, após administração a um recebedor, é capaz de — produzir (direta ou indiretamente) um composto desta invenção.
São deriva- dos farmaceuticamente aceitáveis particularmente favorecidos aqueles que aumentam a biodisponibilidade dos compostos da invenção quando adminis-
trados a um mamífero (por exemplo, aumentando a absorção no sangue de L um composto administrado por via oral) ou que aumenta a distribuição do composto ativo para um compartimento biológico (por exemplo, o cérebro ou sistema linfático) em relação à espécie originária. Alguns derivados farma- ceuticamente aceitáveis incluem um grupo químico que aumenta a solubili- dade aquosa ou o transporte ativo através da mucosa gastrointestinal.
Em algumas modalidades, os macrociclos peptidomiméticos da invenção são modificados juntando de forma covalente ou não-covalente grupos funcionais apropriados, para melhorar as propriedades biológicas seletivas. Tais modificações incluem aquelas que aumentam a penetração . biológica em um dado compartimento biológico (por exemplo, sangue, sis- BR tema linfático, sistema nevoso central), aumentam a disponibilidade oral, aumentam a solubilidade para permitir a administração por injeção, alteram o metabolismo, e alteram a teaxa de exceção.
Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta in- venção incluem aqueles derivados de ácidos e bases inorgânicas e orgâni- cas farmaceuticamente aceitáveis. Os exemplos de sais de ácidos apropria- " dos incluem acetato, adipato, benzoato, benzenessulfonato, butirato, citrato, BR digliconato, dodecilsulfato, formiato, fumarato, glicolato, hemissulfato, hepta- —noato, hexanoato, cloridrato, bromidrato, iodidrato, lactato, maleato, malona- to, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, palmoato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartarato, tosilato e undecanoato. Os sais derivados de bases apropriadas incluem sais de metais alcalinos (por exemplo, sódio), metais alcalino terrosos (por e- —xemplo, magnésio), amônio e sais de N-(alquila),*.
Para preparar composições farmacêuticas a partir dos compos- tos da presente invenção, os carreadores farmaceuticamente aceitáveis in- cluem carreadores sólidos ou líquidos. As preparações na forma sólida in- cluem pós, comprimidos, pílulas, cápsulas, hóstias, supositórios, e grânulos —dispersáveis. Um carreador sólido pode ser uma ou mais substâncias, que Ê atuam também como diluentes, sabores, aglutinantes, conservantes, agen- tes desintegradores de comprimidos, ou um material de encapsulação. Os
- detalhes sobre as técnicas para formulação e administração estão bem des- & critos na literatura científica e de patentes; vide, por exemplo, a última edição de "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co, Easton, PA.
Em pós, o carreador é um sólido finamente dividido, que está em mistura com o componente ativo finamente dividido. Em comprimidos, o componente ativo é misturado com o carreador com as propriedades ligan- tes necessárias em proporções apropriadas e compactado no formato e ta- manho desejados.
Os excipientes sólidos apropriados são cargas de carboidratos : ou proteínas incluem, porém sem limitações, açúcares, incluindo lactose, B sacarose, manitol, ou sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata, ou outras plantas; celulose tal como metilcelulose, hidroxipropilmetil-celulose, ou car- boximetil-celulose sódica; e gomas, incluindo goma-arábica e tragacanto; bem como proteínas tais como gelatina e colágeno. Caso desejado, agentes desintegradores ou de solubilização são adicionados, tais como poli(vinil- pirrolidona) reticulada, ágar, ácido algínico ou um seu sal, tal como alginato Ú de sódio. DB As preparações na forma líquida incluem soluções, suspensões, e emulsões, por exemplo, soluções em água ou água/propilenoglicol. Para injeção parenteral, as preparações líquidas as preparações líquidas podem ser formuladas em solução em solução aquosa de polietilenoglico!.
A preparação farmacêutica está de preferência na forma de do- sagem unitária. Nesta forma a preparação é subdividida em doses unitárias que contêm quantidades apropriadas do componente ativo. A forma de do- sagem unitária pode ser uma preparação embalada, a embalagem contendo quantidades distintas de preparação, tais como comprimidos, cápsulas, e pós embalados em frasocs ou ampolas. Além disso, a forma de dosagem unitária pode ser uma cápsula, comprimido, hóstia, pastilha em si, ou ela — pode sero número apropriado de qualquer deles na forma embalada. Quando as composições desta invenção compreendem uma combinação de macrociclo peptidomimético e um ou mais agentes terapêuti-
* cos ou profiláticos adicionais, o composto e o agente adicional devem estar & presentes em níveis de dosagem entre cerca de 1 e 100%, e mais preferi- velmnente entre cerca de 5 e 95% da dosagem normalmente administrada em um esquema de monoterapia.
Em algumas modalidades, os agentes a- dicionaissão administrados separadamente, como parte de um esquema e múltiplas doses, dos compostos desta invenção.
Alternativamente, esses agentes são parte de uma forma de dosagem única, misturados com os compostos desta invenção em uma única composição.
Métodos de Uso Em um aspecto, a presente invenção fornece macrociclos pepti- - domiméticos inusitados que são úteis em ensaios de ligação competitiva pa- ra identificar agentes que se ligam ao(s) ligante(s) natural(ais) das proteínas i ou peptídeos sobre os quais os macrociclos peptidomiméticos são modela- dos.
Por exemplo, no sistema de p53 MDM?2, os macrociclos peptidomiméti- cos estabilizados marcados baseados na p53 são usados em um ensaio de ligação de MDM?2 junto com moléculas pequenas que se ligam competitiva- mente a MDM2. Estudos de ligação competitive permitem a rápida avaliação - in vitro e determinação de candidatos a fármacos específicos para o sistema E P53/MDM2. Similarmente, no sistema antiapoptótico BH3/BCL-X,, os macro- ciclos peptidomiméticos marcados baseados em BH3 podem ser usados em um ensaio de ligação de BCL-X, junto com moléculas pequenas que se |i- gam competitivamente a BCL-X,. Estudos de ligação competitiva permitem a rápida avaliação in vitro e determinação de candidatos a fármacos especiífi- cos para o sistema BH3/BCL-X,. A invenção fornece ainda a geração de an- ticorpos contra os macrociclos peptidomiméticos.
Em algumas modalidades, estes anticorpos se ligam especificamente ao macrociclo peptidomimético e também ao precursor de p53 ou BH3 peptidomimético após o que os macro- ciclos peptidomiméticos são derivados.
Tais anticorpos, por exemplo, rom- pem os sistemas p53/MDM2 ou BH3/BCL-XL, respectivamente.
Em outros aspectos, a presente invenção fornece métodos profi- láticos e também terapêuticos para tratar um indivíduo em risco de (ou sus- cetível a) um distúrbio ou que tem um distúrbio associado à expressão de
; membro da família de BCL-2 aberrante (por exemplo, insuficiente ou exces- siva) ou atividade (por exemplo, anormalidades da via apoptótica extrínseca ou intrínseca). Acredita-se que alguns distúrbios do tipo BCL-2 são causa- dos, pelo menos em parte, por um nível anormal de um ou mais membros da família BCL-2 (por exemplo, superexpressão ou subexpressão), ou pela pre- sença de um ou mais mebros da família BCL-2, que apresentam atividade anormal. Assim sendo, a redução no nível e/ou atividade do membro da fa- mília BCL-2 ou a intensificação do nível e/ou atividade do membro da família BCL-2, é usada, por exemplo, para melhorar ou reduzir os sintomas adver- sosdo distúrbio.
. Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para . tratar ou prevenir doença hiperproliferativa interferindo com a interação ou ligação entre p53 e MDM2 em células tomorosas. Estes métodos compreen- dem administrar uma quantidade eficaz de um composto da invenção a um animal homeotermo, incluindo um humano, ou às células tumorosas que contêm p53 do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a administração dos compostos da presente invenção induz a detenção do crescimento celu- f lar ou apoptose. Em outras modalidades, a presente invenção é usada para : tratar doença e/ou células tumorosas que compreendem níveis elevados de MDM?2.0O termo "níveis elevados de MDM2", como aqui utiulizado, refere-se a níveis de MDM2 maiores do que aqueles encontrados em células que con- têm um número de cópias mais do que o normal (2) de mdm2 ou acima cer- ca de 10.000 moléculas de MDMZ2 por célula, medido por ELISA e ensaios similares (Picksley et a/. (1994), Oncogene 9, 2523 2529).
Como aqui utilizado, o termo "tratamento" é definido como a a- plicação ou administração de um agente terapêutico a um paciente, ou apli- cação ou administração de um agente terapêutico a uma célula ou linhagem de células isolada a partir de um paciente, que tem uma doença, um sintoma de doença ou uma predisposição para uma doença, com o propósito de cu- rar, cicatrizar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, melhorar, amenizar ou afetar a doença, os sintomas da doença ou a predisposição para a doença.
Em algumas modalidades, os macrociclos peptidomiméticos da invenção são usados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar cânceres e con- dições neoplásicas. Como aqui utilizados, os termos "câncer", "hiperprolife- rativa" e "neoplásica" referem-se a células que têm a capacidade de cresci- mento autônomo, isto é, um estado ou condição anormal caracterizada por crescimento celular rapidamente proliferante. Os estados doentios hiperproli- ferativos e neoplásicos podem ser classificados como patológicos, isto é, caracterizando ou constituindo um estado doentio, ou podem ser classifica- dos como não-patológicos, isto é, um desvio do normal, mas não associado com um estado doentio. O termo pretende incluir todos tipos de crescimen- tos cancerosos ou processos oncogênicos, tecidos metastáticos ou células, í tecidos ou órgãos transformados de forma maligna, independentemente do ' tipo ou estágio histopatológico de invasão. Um tumor metastático pode advir de uma multiplicidade de tipos de tumores primários, incluindo, porém sem limitações, aqueles de origem mamária, pulmonar, hepática, colônica e ova- riana. As células "patológicas hiperproliferativas" ocorrem em estados doen- tios caracterizados por rescimento de tumores malignos. Os exemplos de células não-patológicas hiperproliferativas incluem a proliferação de células ' associadas ao reparo de feridas. Os exemplos de distúrbios celulares prolife- ' rativos e/ou diferenciadores incluem câncer, por exemplo, carcinoma, sar- coma, ou distúrbios metastáticos. Em algumas modalidades, os macrociclos peptidomiméticos são agentes terapêuticos inusitados para controlar câncer de mama, câncer de ovário, câncer de cólon, câncer de pulmão, metástases de tais cânceres e similares.
Os exemplos de cênceres ou condições neoplásicas incluem, porém sem limitações, um fibrossarcoma, miossarcoma, lipossarcoma, con- drossarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endotelios- sarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, meso- telioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, câncer gás- trico, câncer esofágico, câncer retal, câncer pancreático, câncer ovariano, — câncer prostático, câncer uterino, câncer da cabeça e pescoço, câncer cutãà- neo, câncer cerebral, carcinoma de células escamosas, carcinoma de glân- dulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarci-
noma, carcinoma medular,carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, car- cinoma embrionário, tumor de Wilm, câncer cervical, câncer testicular, carci- noma pulmonar de células pequenas, carcinoma pulmonar de células não- pequenas, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblas- toma, neuroma de acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, ou sarcoma de Kaposi. Os exemplos de distúrbios proliferativos incluem distúrbios neo- —plásicos hematopoieticos. Como aqui utilizado, o termo "distúrbios neoplási- . cos hematopoieticos" inclui doenças que envolvem células hiperplási- - cas/neoplásicas de origem hematopoiética, por exemplo, advindas de linha- gens mielóde, linfóide ou eritróide, ou células precursoras delas. De prefe- rência, as doenças advêm de leucemias agudas deficientemente diferencia- das, por exemplo, leucemia eritroblástica e leucemia aguda megacarioblásti- ca. Os distúrbios mielóides exemplificativos adicionais incluem, porém sem limitações, leucemia promielóide aguda (APML), leucemia mielógena aguda fi (AML) e leucemia mielógena crônica (CML) (revisado em Vaickus (1991), .- Crit Rev. Oncol./Hemotol. 11:267-97); as malignidades linfóides incluem, po- rém sem limitações, leukemia linfoblástica aguda (ALL) que inclui ALL de linhagem B e ALL de linhagem T, leucemia linfocítica crônica (CLL), leuce- mia prolinfocítica (PLL), leucemia de células pilosas (HLL) e macroglobuli- nemia de Waldenstrom (WM). As formas adicionais de linfomas malignos incluem, porém sem limitações, linfoma não-Hodgkin e variantes dele, linfo- mas de célulasT periféricas, leucemia/linfoma de células T adultas (ATL), linfoma de células T cutâneas (CTCL), leucemia linfocítica granular grande (LGF), doença de Hodgkin e doença de Reed-Stemberg.
Os exemplos de distúrbios celulares proliferativoss e/ou de dife- renciação da mama incluem, porém sem limitações, doença mamária prolife- rative, incluindo, por exemplo, hiperplasia epitelial, adenose esclerosante, e papilomas de dutos pequenos; tumores, por exemplo, tumores estromais tais como fibroadenoma, tumor filodes, e sarcomas, e tumores epiteliais tais co-
mo papiloma de dutos grandes; carcinoma da mama, incluindo carcinoma in situ (não-invasivo) que inclui carcinoma ductal in situ (incluindo doença de Paget) e carcinoma lobular in situ, e carcinoma invasivo (infiltrante) incluindo, porém sem limitações, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasi- : 5 vo, carcinoma medular, carcinoma colóide (mucinoso), carcinoma tubular, e carcinoma papilar invasivo, e neoplasmas malignos miscelâneos. Os distúr- bios na mama masculina incluem, porém sem limitações, ginecomastia e carcinoma.
Os exemplos de distúrbios celulares proliferativos e/ou de dife- —renciação do pulmão incluem, porém sem limitações, carcinoma broncogêni- h co, incluindo síndromes paraneoplásicas, carcinoma bronquioalveolar, tumo- : res neuroendócrinos, tais como carcinóide brônquico, tomores miscelâneos, e tumores metastáticos; patologias da pleura, incluindo efusões pleurais in- flamatórias, efusões pleurais não-inflamatórias, pneumotórax, e tumores —pleurais, incluindo tumores fibrosos solitários (fibroma pleural) e mesotelioma maligno.
Os exemplos de distúrbios celulares proliferativos e/ou de dife- á renciação do cólon incluem, porém sem limitações, pólipos não-neoplásicos, , adenomas, síndromes familiais, carcinogênese colorretal, carcinoma colorre- tal, etumores carcinóides.
Os exemplos de distúrbios celulares proliferativos e/ou de dife- renciação do fígado incluem, porém sem limitações, hiperplasias nodulares, adenomas, e tumores malignos, incluindo carcinoma primário do fígado e tumores metastáticos.
Os exemplos de distúrbios celulares proliferativos e/ou de dife- renciação do ovário incluem, porém sem limitações, tumores ovarianos tais como epitélio celômico, tumores serosos, tumores mucinosos, tumores en- dometrióides, adenocarcinoma de células claras, cistadenofibroma, tumor de Brenner, tumores epiteliais superficiais; tumores de células germinativas tais como teratomas maduros (benignos), teratomas monodérmicos, teratomas malignos imaturos, disgerminoma, tumores do seio endodérmico, coriocarci- noma; tumores dos cordões sexuais-estoma tais como tumores de células da granulosa-teca, tecomafibromas, androblastomas, tumores de células hilares, e gonadoblastoma; e tumores metastáticos tais como tumores de Krukenberg.
Em outras modalidades, os macrociclos peptidomiméticos aqui — descritos são usados para tratar, prevenir ou diagnosticar condições caracte- rizadas por morte celular hiperativa ou morte celular devido a insulto fisioló- gico, etc. Alguns exemplos de condições caracterizadas por morte celular prematura ou indesejada são proliferações celular alternativamente indese- jada ou excessiva incluem, porém sem limitações, condições hipocelula- res/hipoplásicas, acelulares/aplásicas, ou hipercelulares/hiperplásicas. Al- . guns exemplos incluem distúrbios hematológicos, incluindo, porém sem limi- D tações, anemia de Fanconi, anemia aplásica, talaessemia, neutropenia con- gênita, mielodisplasia Em outras modalidades, os macrociclos peptidomiméticos da invenção, que atuam para diminuir apoptose, são usados para tratar distúr- bios associados a um nível indesejado de morte celular. Assim sendo, em algumas modalidades, os macrociclos peptidomiméticos antiapoptóticos da fi invenção são usados para tratar distúrbios tais como aqueles que levam à ' morte celular associada a infecção viral, por exemplo, infecção associada ao vírus da imunodeficiência humana (HIV). Várias doenças neurológicas são caracterizadas pela perda gradual de conjuntos específicos de neurônios, e os macrociclos peptidomiméticos antiapoptóticos da invenção são usados, em algumas modalidades, no tratamento destes distúrbios. Tais distúrbios incluem doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amio- trófica(ALS), retinite pigmentosa, atrofia muscular espinhal, e várias formas de degeneração cerebelar. A perda de células nestas doenças não induz uma resposta inflamatória, e a apoptose parece ser um mecanismo de morte celular. Além disso, inúmeras doenças hematológicas estão associadas a uma produção diminuída de células sanguíneas. Estes distúrbios incluem anemia associada a doença crônica, anemia aplásica, neutropenia crônica, e síndromes mielodisplásicas. Os distúrbios de produção células sanguíneas, tais como síndrome mielodisplásica e algumas formas de anemia aplásica,
estão associados à maior morte celular apoptótica dentro da medula óssea. Estes distúrbios poderiam resultar da ativação de genes promovem apopto- se, deficiências adquiridas em células do estroma ou fatores de sobrevivên- cia hematopoiéticos, ou os efeitos diretos de toxinas e mediadores de res- — postas imunes. Dois distúrbios comuns associados à morte celular são infar- tos do miocárdio e acidente vascular cerebral. Em ambos distúrbios, as célu- las dentro da área central da isquemia, que é produzida no caso de perda aguda de fluxo sanguíneo, parecem morrer rapidamente como resultado de necrose. Entretanto, for a da zona isquêmica central, as células morrem du- rante um período de tempo mais prolongado e morfologicamente parecem . morrer por apoptose. Em outras modalidades, os macrociclos peptidomimé- ticos antiapoptóticos da invenção são usados para tratar todas as doenças i associadas à morte celular indesejável.
Alguns exemplos de distúrbios imunológicos que são tratados com os macrociclos peptidomiméticos aqui descritos incluem, porém sem limitações, rejeição a transplantes de órgãos, artrite, lúpus, IBD, doença de Crohn, asma, esclerose múltipla, diabetes, etc. e Alguns exemplos de distúrbios neurológicos que são tratados com os macrociclos peptidomiméticos aqui descritos incluem, porém sem limitações, doença de Alzheimer, síndrome de Down, Amiloidose de Hemor- ragia Cerebral Hereditária do Tipo Holandês, Amiloidose Reativa, Nefropatia Amilóide Famiílial com Urticária e Surdez, Sindrome de Muckle-Wells, Mie- loma Idiopático; Mieloma Associado a Macroglobulinemia, Polineuropatia Amilóide Famiílial, —Cardiomiopatia Amilóide Famiílial, Amilóide Cardíaco Isolado, Amiloidose Senil Sistêmica, Diabetes de Início no Adulto, Insulinoma, Amilóide Atrial Iso- lado, Carcinoma Medular da Tireóide, Amiloidose Famiílial, Hemorragia Ce- rebral Hereditária Com Amiloidose, Polineuropatia Amiloidótica Famiílial, S- crapie, Doença de Creutzfeldt-Jacob, Síndrome de Gerstmann Straussler- —Scheinker, Encefalite Espongiforme Bovina, uma doeça mediada por príons, e Doença de Huntington.
Alguns exemplos de distúrbios endocrinológicos que são trata-
dos com os macrociclos peptidomiméticos aqui descritos incluem, porém sem limitações, diabetes, hipotireoidismo, hipopituitarismo, hipoparatireoi- dismo, hipogonadismo, etc.
Os exemplos de distúrbios cardiovasculares (por exemplo, dis- túrbios inflamatórios) que são tratados ou prevenidos com os macrociclos peptidomiméticos da invenção incluem, porém sem limitações, aterosclero- se, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, trombose, aneurisma, insuficiência cardíaca, doença cardiac isquêmica, angina do peito, morte cardíaca repentina, doença cardíaca hipertensiva; doença de vaso não- —coronário, tais como arteriolosclerose, doença de vasos pequenos, nefropa- - tia, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, xantomatose, asma, hipertensão, enfesima e doença pulmonar crônica; ou uma condição cardiovascular associada a procedimentos de intervenção ("traumatismo vascular procedimental"), tais como restenose após angioplastia, colocação de um desvio, sonda, enxertos de excisão sintéticos ou naturais, sonda de demora, válvula ou outros dispositivos implantáveis.
Os distúrbios cardiovas- culares preferidos incluem aterosclerose, infarto do miocárdio, aneurisma, e - acidente vascular cerebral.
E Exemplos A seção que se segue fornece exemplos ilustrativos da presente invenção.
Exemplo 1. Preparação de Aminoácidos Alfa, Alfa-Dissubstituídos Composto 1 ENAANNa O Composto 1 foi preparado por uma sequência de duas etapas de acordo com Yao et al. (2004) J.
Org.
Chem, 69:1720-1722. Adicionou-se azida de sódio (0,53 9, 8,2 mmol) a 1-iodo-4-cloro-butano (1 mL, 8,2 mmol) em dimetil-formamida (10 mL), e a reação foi agitada à temperatura ambien- te de um dia para o outro.
A reação foi então diluída com acetato de etila e água.
A camada orgânica foi lavada com água (3 vezes), secada com sulfato de magnésio e concentrada sob vácuo para dar 1-azido-4-cloro-butano com rendimento de 80%. A azida foi diluída com acetona (38 mL), e iodeto de sódio (1,98 g, 13,00 mmol) foi adicionado, e a reação foi aquecida no refluxo de um dia para o outro. Depois disso, a reação foi diluída com água e o pro- duto foi extraído com éter (três vezes). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com bicarbonato de sódio e salmoura. Os extratos orgânicos foram secados com sulfato de magnésio e contrados sob vácuo. O produto 1 foi purificado passando-o através de um leito de alumina neutra. O rendi- mento foi 89%. Composto 2 Ze.
GOES
Õ V S-Ala-Ni-BPB O Composto 2 foi preparado por uma sequência de três etapas de acordo com Belokon et al. (1998), Tetrahedron Asymm. 9:4249-4252. Uma solução de S-prolina (100 g, 0,869 mol) e KOH (172 g, 2,61 mol) em f isopropanol (600 mL) foi preparada sob agitação a 40 ºC. Tão logo a solução E ficou transparente, adicionou-se cloreto de benzila (156 mL, 1,34 mol) na mesma temperatura. Depois de completada a adição (3,5 h), a reação foi agitada de um dia para o outro a 40 ºC. A reação foi neutralizada com HCI concentrado (110 mL) atél pH 5, e depois adicionou-se clorofórmio (400 mL) à mistura da reação e a mistura foi deixada agitando de um dia para o outro. A mistura foi então filtrada e o precipitado foi lavado com CHCI. As soluções em CHCL3 foram combinadas e evaporadas, o resíduo foi tratado com ace- tonaeo precipitado do produto bruto foi filtrado e lavado adicionalmente com acetona. O produto benzil-prolina foi isolado com rendimento de 75%. Adicionou-se cloreto de tionila (18,34 mL, 0,25 mmol) uma solu- çãode benzil-prolina (41 g, 0,2 mol) em cloreto de metileno (200 mL) sob agi- tação a -20 ºC a -30 ºC durante um período de 10 min. A agitação foi conti- —nuadaa-10"ºC até a mistura reativa ficar quase transparente. Depois, uma solução de 2-amino-benzofenona (25 g, 0,125 mol) em cloreto de metileno
(100 mL) foi adicionada à mistura da reação a -30 ºC sob agitação.
A agita- ção foi continuada à temperatura ambiente por mais 10 h e uma solução de carbonato de sódio (40 g) em água (150 mL) foi adicionada à mistura da re- ação sob agitação a 0 ºC.
A camada orgânica foi separada, a camada aquo- — safoiextraída várias vezes com cloreto de metileno e as soluções orgânicas foram combinadas e evaporadas.
O produto (aduto de benzil-prolina/amino- benzofenona) foi cristalizado em etanol e foi isolado com rendimento de 85%. Uma solução de KOH (23,1 g, 0,35 mol) em metanol (75 ml) foi vertida para dentro de uma mistura sob agitação do aduto de benzil- f prolina/amino-benzofenona (19,5 g, 0,05 mol) e nitrato de níquel hexa- V hidratado (29,1 g, 0,1 mol), L-Ala (8,9 g, 0,1 mol) em metanol (175) sob ni- trogênio a 40-50 ºC.
A mistura reativa foi agitada a 55C-65 ºC por 2 h e de- pois neutralizada com ácido acético (20 mL). O volume da reção foi diluído com água (500 mL). Depois de 6 h, o sólido cristalino separado foi filtrado e lavado com água (2x) para dar o composto 2 puro (sólido vermelho, 22 g). M+H obs. 512.4, M+H calc.512.1. i Composto 3 Es Oo NY Ao composto 2 (5,122g, 10,0 mmols) adicionou-se dimetilforma- mida(45 mL), que foi desgaseificada por intermédio de um ciclo de conge- lamento-descongelamento.
A solução foi resfriada até 4 ºC com um banho de gelo e adicionou-se KOH em pó (6,361g, 100 mmols) em uma parcela.
O banho gelado foi removido e o composto 1 (3,375 g, 15 mmois) dissolvido em dimetilformamida (4,0 mL) foi adicionado por intermédio de uma seringa.
A reação foi agitada à temperatura ambiente por 40 min.
A reação foi então interrompida rapidamente adicionando-a lentamente a uma solução aquosa gelada de ácido acético a 5 % (200 mL). O produto bruto foi coletado por filtração e lavado três vezes com água gelada. O produto foi purificado por cromatografia rápida usando uma coluna de sílica Biotage e hexano/acetato de etila como eluente. O Composto 3 foi obtido como um sólido vermelho (51% de rendimento), M+H calc.609.2, M+H obs.609.37. A pureza foi deter- —minada como sendo 98% por UV 254 nm. Composto 4
ODE Adicionou-se iodeto de sódio (14,321 g, 95,54 mmols) a uma solução de 5-cloro-pentino (5 g, 47,8 mmolis) em acetona (80 mL). A reação foi aquecida no refluxo de um dia para o outro. Depois disso, a reação foi - 10 diluída com água e o produto foi extraído com éter (três vezes). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com bicarbonato de sódio e salmoura. É Os extratos orgânicos foram secados com sulfato de magnésio e concentra- dos sob vácuo. O produto 4 foi purificado passando-o através de um leito de alumina neutra. O rendimento foi de 92%. Composto5 =
O NM Adicionou-se dimetilformamida (23 mL) ao composto 2 (2,561 g, 5,0 mmols), que foi desgaseificada por intermédio de um ciclo de congela- mento-descongelamento. A solução foi resfriada até 4 ºC com um banho de gelo e adicionou-se KOH em pó (3,181 g, 50 mmols) em uma parcela. O ba- nho gelado foi removido e o composto 4 (1,94 g, 10 mmolis)) dissolvido em dimetil-formamida (2,0 mL) foi adicionado por intermédio de uma seringa. A reação foi agitada à temperatura ambiente por 40 min. A reação foi então interrompida rapidamente adicionando-alentamente a uma solução aquosa gelada de ácido acético a 5% (100 mL). O produto bruto foi coletado por fil- tração e lavado três vezes com água gelada. O produto foi purificado por cromatografia rápida usando uma coluna de sílica Biotage e hexano/acetato de etila como eluente.
O Composto 5 é um sólido vermelho, 1,4 g (rendimen- to 48%). M+H calc.578.19 , M+H obs.578.69. A pureza foi determinada como sendo 97% por UV 254 nm.
Composto 6 ro, FmocHN “MN; Uma solução do Composto 3 (1 g, 1,85 mmol) em MeOH (3 mL) foi adicionada a uma solução (12 mL) de de HCVMeOH 1/13 N a 70 ºC sob a forma de gotas.
O material de partida desapareceu dentro de 5-10 min.
À mistura reativa foi então concentrada sob vácuo e o solvente residual foi re- - movido em uma bomba de alto vácuo.
O resíduo bruto foi diluído com solu- " 10 ção aquosa a 10% de NazCO; (16 mL) resfriada até O ºC com um banho de gelo.
Fmoc-OSu (0,84 g, 2,5 mmol) dissolvido em dioxano (16 mL) foi adi- cionado e a reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente sob agi- tação de um dia para o outro.
Depois disso, a reação foi diluída com acetato de etila e HCl 1 N.
A camada orgânica foi lavada com HCl 1 N (3 vezes). À camada orgânica foi então secada com sulfato de magnésio e concentrada h sob vácuo.
O produto puro foi isolado depois de uma purificação por croma- E tografia rápida com uma coluna de sílica Biotage e acetato de etila/hexano e cloreto de metileno/metanol como eluentes, para dar um óleo viscoso com rendimento global de 36% para ambas etapas.
M+Na obs 431.89, M+H cale (409.18). A pureza foi determinada como sendo 98% UV 254 nm.
Composto 7 o po, FmocHNT ANDAR Adicionou-se uma solução do Composto 5 (1,4 9, 2,4 mmol) em MeOH (4 mL) a uma solução (18 m!) de HC/MeOH 1/13 N a 70 ºC sob a forma de gotas.
O material de partida desapareceu dentro de 5-10 min.
À mistura reativa foi então concentrada sob vácuo e o solvente residual foi re- movido em uma bomba de alto vácuo.
O resíduo bruto foi diluído com solu- ção aquosa a 10% de NazCO; (24 mL) resfriada até 0 ºC com um banho de gelo.
Fmoc-OSu (0,98 g, 2,9 mmol) dissolvido em dioxano (24 mL) foi adi-
cionado e a reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente sob agi- tação de um dia para o outro. Depois disso, a reação foi diluída com acetato de etila e HCl 1 N. A camada orgânica foi lavada com HCI 1 N (3 vezes). À camada orgânica foi então secada com sulfato de magnésio e concentrada — sob vácuo. O produto puro foi isolado (30% de rendimento para ambas eta- pas) depois de uma purificação por cromatografia rápida com uma coluna de sílica Biotage e acetato de etila/hexano e cloreto de metileno/metanol como eluentes. O produto foi obtido como um óleo viscoso, que solidifica depois de descansar. M+H calc. 378.16, M+Na obs 400.85.
Inúmeras modalidades da invenção foram descritas. Contud, - deve-se entender que várias modificações podem ser feitas sem fugir do ' espírito e âmbito da invenção. Consequentemente, outras modalidades es- tão dentro do âmbito das reivindicações que se seguem.

Claims (78)

  1. REIVINDICAÇÕES : 1. Macrociclo peptidomimético, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula (1): 7 o o Nº —s DI [AL-IBL-[CL El Ri Ra Ú (Fórmula |) em que: cadaA C,D,eEé independentemente um aminoácido natural ou não- natural; R B é um aminoácido natural ou não-natural, análogo de aminoá- Pã cido, O ,[-NH-L3-CO-], [-NH-L3-SO>2-], ou [-NH-L3-]; R, e R2 são independentemente —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroaiquila, ou heterocicloalquila, não-substituídos ou substituídos com halo;
    R3 é hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, heteroal- quila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquilalquila, cicloarila, ou heteroci- cloarila, opcionalmente substituídos com Rs;
    L é um ligante formador de macrociclos de fórmula Ned Au Cr.
    N==n ;
    L1, Lo e La são independentemente alquileno, alquenileno, alqui- nileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, he- terocicloarileno, ou [-R,4-K-R,-]h, sendo cada um opcionalmente substituído com Rs;
    cada R, é alquileno, alguenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterociclo-alquileno, arileno, ou heteroarileno; cada Ké O, S, SO, SO, CO, CO», ou CONR;; cada R; é independentemente halogênio, alquila, -ORg, -N(Rs)2a, -SRs,
    PE 2 -SORç, -SO2R6s, -CO2R6s, um grupamento fluorescentee, um radioisótopo ou í um agente terapêutico; cada R; é independentemente —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, Ê cicloalquilalquila, heterocicloalquila, um grupamento fluorescente, um radioi- sótopo ou um agente terapêutico; R7 é —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, hete- roalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, cicloarila, ou heterocicloarila, opcionalmente substituídos com Rs, ou parte de uma estrutura cíclica com um resíduo D; Ra é —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, hete- roalquila, cicloalquilalquila, heterocicioalquila, cicloarila, ou heterocicloarila, opcionalmente substituídos com R5, ou parte de uma estrutura cíclica com um resíduo E; v é um número inteiro entre 1-1.000; w é um número inteiro entre 1-1.000; x é um número inteiro entre 0-10; y é um número inteiro entre 0-10; z é um número inteiro entre 0-10; e n é um número inteiro entre 1-5; em que o macrociclo peptidomimético compreende uma hélice o ou folha B
  2. 2. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, ao A A caracterizado pelo fato de que L é N==N ou N==s p
  3. 3. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1,
    PTS SN caracterizado pelo fato de que L é Ê ou S :
  4. 4. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um entre R, e R> é alquila, al- quenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, cada grupo sendo opcionalmente substituído com halo.
  5. 5. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R, e R> são independentemente alquila, al-
    Im 3 quenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou í heterocicloalquila, cada grupo sendo opcionalmente substituído com halo.
  6. 6. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, Í caracterizado pelo fato de que pelo menos um entre R; e R,2 é alquila, opcio- —nalmente substituída com halo.
  7. 7. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R, e R7 são independentemente alquila, op- cionalmente substituídos com halo.
  8. 8. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um entre R; e R> é metila.
  9. 9. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R, e R2 são metila.
  10. 10. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um entre D e E é um aminoá- cido natural ou não-natural substituído com um lipídeo ou hidrocarboneto de alto peso molecular.
  11. 11. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um entre D e E é anexado a um ligante formador de macrociclo adicional.
  12. 12. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma estrutura secundária do macrociclo peptidomimético é mais estável do que uma estrutura secundária correspon- dente de um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente.
  13. 13. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o macrociclo peptidomimético compreende uma hélice a.
  14. 14. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a hélice a compreende entre 1 volta e 5 voltas.
  15. 15. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a hélice a. é mais estável do que uma hé- lice a de um polipeptídeo um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente.
    Nas 4
  16. 16. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação f 13, caracterizado pelo fato de que o ligante formador de macrociclo abarca entre 1 volta e 5 voltas da hélice a. Í
  17. 17. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o ligante formador de macrociclo abarca aproximadamente 1, 2, 3, 4 ou 5 voltas da hélice a.
  18. 18. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o comprimento do ligante formador de macrociclo é cerca de 5 À a cerca de 9 À por volta da hélice a.
  19. 19. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o ligante formador de macrociclo abarca aproximadamente 1 volta da hélice a.
  20. 20. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o comprimento do ligante formador de macrociclo é aproximadamente igual ao comprimento de entre cerca de 6 ligações carbono-carbono e cerca de 14 ligações carbono-carbono.
  21. 21. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o comprimento do ligante formador de macrociclo é aproximadamente igual ao comprimento de entre cerca de 8 ligações carbono-carbono e cerca de 12 ligações carbono-carbono.
  22. 22. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o macrociclo compreende um anel de cer- ca de 18 átomos a 26 átomos.
  23. 23. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que a hélice a compreende cerca de 2 voltas.
  24. 24. Macrociclo peptidomimético, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o comprimento do ligante formador de macrociclo é aproximadamente igual ao comprimento de entre cerca de 8 ligações carbono-carbono e cerca de 16 ligações carbono-carbono.
  25. 25. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o comprimento do ligante formador de macrociclo é aproximadamente igual ao comprimento de entre cerca de 10
  26. PER 5 ligações carbono-carbono e cerca de 13 ligações carbono-carbono. É 26. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o macrociclo compreende um anel de cer- Í ca de 29 átomos a cerca de 37 átomos.
  27. 27. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fór- mula Ila ou llb: À '
    V Tv “o, Ri A Ra
    A E coa, D COR Rio Rio lla Ilb em que R, e R2 são independentemente alquila, alquenila, alquinila, ari- lalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, não-substituída ou substituída com halo; cada Q e T é selecionado independentemente no grupo que consiste em alquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno e [-R4-K- Ra-ln,cada um deles sendo não-substituído ou substituído com Rs; Ké oO, S, SO, SO2, CO, CO,, ou CONR;; R3 é hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, heteroal- quila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquilalquila, cicloarila, ou heteroci- cloarila, opcionalmente substituídos com Rs; Ra é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloal- quileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno; cada R; é independentemente halogênio, alquila, -ORs, -N(R6)2, -SRe, -SOR6s, -SO2R6, -CO2R, um grupamento fluorescente, um radioisótopo ou um agente terapêutico; cada R; é independentemente —H, alquila, alguenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, um grupamento fluorescente, um radioi-
    Ns 6 sótopo ou um agente terapêutico; É R; e Rg são independentemente —H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, ou heterociclo-alquila; Ô R1o e R1, são independentemente -H ou qualquer grupo protetor apropriado para a síntese de peptídeos; g e h são independentemente um número inteiro entre 0 e 5, on- de g+h é maior do que 1; e n é um número inteiro entre 1 e 5.
  28. 28. Composto de acordo com a reivindicação 27, caracterizado —pelofatode que o composto é um composto da Fórmula lla e R,; é alquila, não-substituída ou substituída com halo-.
  29. 29. Composto de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o composto é um composto da Fórmula Ilb e R, é alquila, não-substituída ou substituída com halo.
  30. 30. Composto de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o composto é um composto da Fórmula lla e R, é alquila não-substituída.
  31. 31. Composto de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o composto é um composto da Fórmula lb e R> é alquila . 20 não-substituída.
  32. 32. Composto de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o composto é um composto da Fórmula lla e R, é metila.
  33. 33. Composto de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o composto é um composto da Fórmula llb e R> é metila.
  34. 34. Composto de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que pelo menos um entre Rg e R19 é um grupo protegido apro- priado para a síntese de peptídeos.
  35. 35. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: a) pelo menos um composto selecionado no grupo que consiste em compostos de Fórmulas lla e llb:
    DE 7
    Y Y i “o, R “a, Ra Re E ATA DD CORn Rio Rio Ila Ilb em que R, e R2 são independentemente alquila, alquenila, alquinila, ari- laiquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, não-substituída ousubstituídacom halo-; cada Q e T é selecionado independentemente no grupo que consiste em alquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno e [-R4-K- Ra-lh,cada um deles sendo não-substituído ou substituído com Rs5; Ké O, S, SO, SO, CO, CO>z, ou CONR;; R3 é hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, heteroal- quila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquilalquila, cicloarila, ou heteroci- cloarila, opcionalmente substituídos com Rs; Ra é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloal- quileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno; cada R; é independentemente halogênio, alquila, -OR6s, -N(R6)2, -SRse, -SORç, -SO2R6Ê, -CO2R6s, um grupamento fluorescente, um radioisótopo ou um agente terapêutico; cada R; é independentemente H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, ci- cloalquilalquila, heterocicloalquita, um grupamento fluorescente, um radioisó- topoouum agente terapêutico; R7 e Rg são independentemente —H, alquila, alquenila, alquinilta, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, ou heterocicloalquila; R10 e R11 são independentemente —H ou qualquer grupo protetor apropriado para a síntese de peptídeos; g e h são independentemente um número inteiro entre 0 e 5, on-
    na 8 de g+h é maior do que 1; e ' n é um número inteiro entre 1e 5; e b) um reagente de macrociclização.
    Í
  36. 36. Kit de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato dequeo Kit compreende um composto da Fórmula lIla e R, é alquila, não- substituída ou substituída com halo.
  37. 37. Kit de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o Kit compreende um composto da Fórmula Ilb e R, é alquila, não- substituída ou substituída com halo.
  38. 38. Kit de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o Kit compreende um composto da Fórmula lla é R, é alguila não- substituída.
  39. 39. Kit de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o Kkit compreende um composto da Fórmula Ilb e R> é alquila não- substituída.
  40. 40. Kit de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o kit compreende um composto da Fórmula lla e R, é metila.
  41. 41. Kit de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o kit compreende um composto da Fórmula llb e R> é metila.
  42. 42. Kit de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que pelo menos um entre Rg e Rio é um grupo protegido apropriado para a síntese de peptídeos.
  43. 43. Kit de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o kit compreende pelo menos um composto da Fórmula lla e pelo menos um composto da Fórmula lb.
  44. 44, Kit de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o reagente de macrociclização é um reagente de Cu.
  45. 45. Kit de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o reagente de macrociclização é um reagente de Ru.
  46. 46. Método para sintetizar um macrociclo peptidomimético com- preendendo uma hélice a ou folha B, caracterizado pelo fato de que o méto- do compreende as etapas de colocar um precursor peptidomimético de Fór-
    o 9 mula Il! ou Fórmula IV: . o | a na À Ri ha á R2
    PA Re (Fórmula ll) o a na, R1 ba 2 R2 to Re (Fórmula IV) em contato com um reagente de macrociclização; em que v, w, x, y, z, A, B, C, D, E, Ra, R2, R7, Rg, L1 e L2 são como definidos na reivindicação 1; R12 é H ou alquila; ainda em que R,, é H quando o reagente de macrociclização é um reagente de Cu e R12 é -H ou alquila quando o reagente de macrocicli- zação é um reagente de Ru; e a dita etapa de colocar em contato resulta em uma ligação covalente ser formada entre o grupamento alquino e azida na Fórmula Ill ou Fórmula IV.
  47. 47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que pelo menos um entre R, e R> é alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, cada grupo sendo opcionalmente substituído com halo.
  48. 48. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que R; e R2 são independentemente alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, cada grupo sendo opcionalmente substituído com halo.
  49. 49. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lofatode que pelo menos um entre R, e R> é alquila, opcionalmente substi- tuída com halo.
    Va 10
  50. 50. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- 1 lo fato de que R; e R2 são independentemente alquila, opcionalmente substi- tuída com halo. i
  51. 51. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lofatode que pelo menos um entre R, e R> é metila.
  52. 52. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que R; e R> são metila.
  53. 53. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o reagente de macrociclização é um reagente de Cu.
  54. 54. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o reagente de macrociclização é um reagente de Ru.
  55. 55. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o precursor peptidomimético é purificado antes da etapa de colocar em contato.
  56. 56. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o macrociclo peptidomimético é purificado depois da etapa de colocar em contato.
  57. 57. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o macrociclo peptidomimético é redobrado depois da etapa de colocarem contato.
  58. 58. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o método é realizado em solução.
  59. 59. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o método é realizado sobre um suporte sólido.
  60. 60. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o método é realizado na presença de uma macromolécula- alvo que se liga ao precursor peptidomimético ou macrociclo peptidomiméti- co sob condições que favorecem a dita ligação.
  61. 61. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o método é realizado na presença de uma macromolécula- alvo que se liga preferencialmente ao precursor peptidomimético ou macro- ciclo peptidomimético sob condições que favorecem a dita ligação.
    aa. 1
  62. 62. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- f lo fato de que o método é aplicado para sintetizar uma biblioteca de macro- ciclos peptidomiméticos. I
  63. 63. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lofatode que o macrociclo peptidomimético compreende uma hélice a em solução aquosa.
  64. 64. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o macrociclo peptidomimético apresenta maior estrutura heli- cóide a em solução aquosa, em comparação com um polipeptídeo não- —macrocíclico correspondente.
  65. 65. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o macrocicio peptidomimético apresenta maior estabilidade térmica em comparação com um polipeptídeo não-macrocíclico correspon- dente.
  66. 66. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o macrociclo peptidomimético apresenta maior atividade bioló- gica em comparação com um polipeptídeo não-macrocíclico correspondente.
  67. 67. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o macrociclo peptidomimético apresenta maior resistência à degradação proteolítica em comparação com um polipeptídeo não- macrocíclico correspondente.
  68. 68. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o macrociclo peptidomimético apresenta maior capacidade para penetrar em células vivas, em comparação com um polipeptídeo não- —macrocíclico correspondente.
  69. 69. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o grupamento alquino do precursor peptidomimético da Fór- mula Ill ou Fórmula IV é uma cadeia lateral de um aminoácido selecionado no grupo que consiste em L-propargilglicina, D-propargilglicina, ácido (S)-2- amino-2-metil-4-pentinóico, ácido (R)-2-amino-2-metil-4-pentinóico, ácido (S)-2-amino-2-metil-5-hexinóico, ácido (R)-2-amino-2-metil-5-hexinóico, áci- do (S)-2-amino-2-metil-6-heptinóico, ácido (R)-2-amino-2-metil-6-heptinóico,
    PDR e 12 ácido (S)-2-amino-2-metil-7-octinóico, ácido (R)-2-amino-2-metil-7-octinóico, ' ácido (S)-2-amino-2-metil-8-noninóico, e ácido (R)-2-amino-2-metil-8- noninóico, e o grupamento azida do precursor peptidomimético da Fórmula ' Ill ou Fórmula IV é uma cadeia lateral de um aminoácido selecionado no grupo que consiste em e-azido-L-lisina, e-azido-D-lisina, e-azido-alfa-metil-L- lisina, 3-azido-alfa-metil-D-lisina, 5-azido-alpha-metil-L-ornitina, e S-azido- alfa-metil-D-ornitina.
  70. 70. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que xty+z é 3,e A, Be C são independentemente aminoácidos naturais ou não-naturais.
  71. 71. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que x+y+z é 6,e A, Be C são independentemente aminoácidos naturais ou não-naturais.
  72. 72. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lofatode que o reagente de macrociclização é um reagente de Cu e a etapa de colocar em contato é realizada em um solvente selecionado no grupo que consiste em solvente prótico, solvente aquoso, solvente orgânico, e misturas deles.
  73. 73. Método de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pe- lo fato de que o solvente é HO, THF/H2O, tBuOH/H2O, DMF, DIPEA, CH3CN, CH2Ck ou CICHCH2CI.
  74. 74. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que o reagente de macrociclização é um reagente de Ru e a etapa de colocar em contato é realizada em um solvente orgânico.
  75. 75. Método de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pe- lo fato de que o solvente é DMF, THF, CH;CN, CH2Cb ou CICHXCH2CI.
  76. 76. Método de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pe- lo fato de que o solvente é um solvente que favorece a formação de hélice.
  77. 77. Método para sintetizar um macrociclo peptidomimético, ca- racterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de colocar um precursor peptidomimético de Fórmula Ill ou Fórmula IV:
    SS
    E 13 S o a me À, . Ri ha r R2 pa Re (Fórmula Ill) o a ae A, Ra ba 2 Ra to Re (Fórmula IV) em contato com um reagente de macrociclização baseado em rutênio; em que v, w, x, y, z, A, B, C, D, E, Ri, R2, R7, Rg, L1 e L2 são como definidos na reivindicação 1; R12 é H ou alquila; e a dita etapa de colocar em contato resulta em uma ligação cova- lente ser formada entre o grupamento alquina e azida na Fórmula Ill ou Fór- mula IV.
  78. 78. Método de acordo com a reivindicação 46 ou 77, caracteri- zado pelo fato de que o macrociclo peptidomimético compreende uma hélice a
    O
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