CN116789733A - 偶联连接子 - Google Patents

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Abstract

在此提供一种偶联连接子，以及包含所述连接子的连接子‑载荷偶联物和ADC。

Description

偶联连接子
技术领域
本发明涉及药物偶联物领域，具体说来涉及抗体药物偶联物。
背景技术
抗体药物偶联物(ADC)是大分子药物，它们利用抗体与抗原(位于癌症细胞表面)的特异性结合将细胞毒素类物质(药物)带向细胞并杀死细胞。它们可被视为既是位点定向释放又是位点特异性释放的大分子前药。ADC实际上是一个三组分系统，包括通过可降解或不可降解(可剪切/不可剪切)连接子连接到抗体(通常是单克隆抗体mAb)的强效药物。
通常，ADC在与细胞上的抗原结合后被内吞，然后，在细胞内药物从抗体中释放并发挥效用。与小分子相比，到达靶细胞的ADC分子数量相对较少，内化率也较低。因此希望提高连接子被剪切从而释放药物的速度。
连接子对ADC而言至关重要，例如它对ADC的稳定性和药物释放机制有很大影响。可被酶切连接子，如Trastuzumab deruxtecan，中的连接子，通常包括一个短肽(例如2～4个氨基酸)，该短肽在ADC内吞后就会在溶酶体中裂解，从而释放药物发挥细胞杀伤作用。在已经很慢的ADC作用机制中，连接子的酶切(一种或多种酶)速度决定着药物的起效速度。目前大多数ADC采用可剪切连接子，因为它们能在靶细胞中迅速释放药物。举例来说，brentuximab vedotin/>trastuzumab deruxtecan/>loncastuximab tesirine-lpyl/>采用的都是肽剪切片段，分别为VC、GGFG和VA。这些肽主要由溶酶体中的组织蛋白酶(主要是组织蛋白酶B(cathepsin B))剪切。剪切速度因多种因素而异，包括相关酶的特性、区域特异性酶与底物相互作用等等。举例来说，的连接子含四肽GGFG，最后一个甘氨酸的酰胺键为可剪切键，由溶酶体蛋白酶(例如组织蛋白酶)剪切。GGFG的剪切速度不及VC快。
在适宜位置例如溶酶体中连接子能被快速剪切是ADC的理想特征之一。我们需要更好的连接子和连接子-载荷以制得性能更优的ADC产品，并且能够以更具操作性和更高产量的工艺来生产ADC。
发明内容
发明人设计了一系列连接子，适用于生产性能更优的连接子-载荷和ADC，例如可剪切性更高(例如，表现为剪切速度更高)、DAR分布改善、均质性提高、稳定性和/或治疗相关功效提高。基于所述连接子和包含连接子的连接子-载荷能够通过更具可操作性和更高产量的工艺来制造ADC，例如使ADC产品更纯净，其中残留的未与抗体结合的连接子-载荷含量更低和/或残留连接子-载荷更容易被去除。
在第一方面，本发明提供了式I的化合物：
其对映异构体、非对映异构体、外消旋体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐或酯；
其中，“*”表示手性中心，其是S-或R-或外消旋的；并且连接到手性碳原子的氢原子和连接到具有R2取代基的碳原子的氢原子从式中省略；
L1是-(CH2)a-，其中a是0至10的整数，或-(CH2CH2O)b-，其中b是1至36的整数；
L2是-(CH2)c-，其中c是1至10的整数，或-(CH2CH2O)d-，其中d是1至36的整数；
L3不存在，或是-(CH2)e-，其中e是1至10的整数，或-(CH2CH2O)f-，其中f是1至36的整数；
R1是-CF3、-NRaRb、-NRa(C＝O)Rb或-O(CH2)gCH3，其中g是0至3的整数，Ra是H或-C1-6烷基，Rb是H或-C1-6烷基；
R2是-H、-C1-6烷基或-O(CH2)hCH3，其中h是0至3的整数；
X是卤素、-OR3或-NR4R5；
R3是-H、-C1-6烷基或卤素；
R4和R5独立地是-H或-C1-6烷基；
n＝0或1；和
m＝0或1。
在另一方面，本发明提供了式II的偶联化合物：
其对映异构体、非对映异构体、外消旋体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐或酯；其中，“*”、L1、L2、L3、R1、R2、n和m如式I中所定义；并且，“DRUG”是共价偶联至连接子的药物部分。
在另一方面，本发明提供了式III的抗体-药物偶联物：
其对映异构体、非对映异构体、外消旋体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐或酯；其中，“*”、L1、L2、L3、R1、R2、n和m以及“DRUG”如式II中所定义；并且，p是1-8，例如1、2、3、4、5、6、7和8；Ab是指抗体。
在另一方面，本发明提供了一种生产连接子-载荷化合物的方法，其包括将药物与本发明的连接子化合物偶联。在一些实施方式中，药物是依喜替康(exatecan)。
在另一方面，本发明提供了一种生产抗体-药物-偶联物的方法，其包括：
(a)将药物与本发明的连接子化合物偶联以获得连接子-载荷化合物；其中，优
选地，药物是依喜替康(exatecan)；和
(b)将抗体与步骤(a)中获得的连接子-载荷化合物偶联。
附图说明
图1：本发明代表性实施例之一，连接子-载荷化合物(附图中亦标为“德鲁替康类似物”(Deruxtecan analog))1-7的合成方案。
图2：本发明代表性实施例之一，连接子-载荷化合物3-1的合成方案。
图3：本发明代表性实施例之一，连接子-载荷化合物1-1的合成方案。
图4：本发明代表性实施例之一，连接子-载荷化合物1-2的合成方案。
图5：本发明代表性实施例之一，连接子-载荷化合物1-3的合成方案。
图6：本发明代表性实施例之一，连接子-载荷化合物1-4的合成方案。
图7：本发明代表性实施例之一，连接子-载荷化合物1-8的合成方案。
图8：本发明代表性实施例之一，连接子-载荷化合物3-4的合成方案。
图9：(a)本发明连接子-载荷化合物与原有连接子-载荷化合物相比的修饰位点(划圈)和剪切位点(虚线)的示意图；(b)本发明连接子-载荷化合物经时剪切百分比(％)与原有连接子-载荷化合物的比较。
图10：(a)含本发明连接子-载荷部分的ADC与含原有连接子-载荷部分的ADC相比的修饰位点(划圈)和剪切位点(虚线)示意图；(b)ADC中本发明连接子-载荷部分经时剪切百分比(％)与ADC中原有连接子-载荷部分的比较。
图11：含不同连接子-载荷部分的ADC与不同细胞系上Her2抗原结合的亲和力。
图12及12(续)：含不同连接子-载荷部分的ADC对不同细胞系的细胞毒性。
具体实施方式
通过以下详细说明，本发明的其他目的、特征和优点将显而易见。然而，应当理解，详细描述和具体实施例在显示本发明优选实施方式的同时仅是示例性描述，因为本领域技术人员能够从这些详细描述领会本发明的构思和范围内的各种改变和调整。
术语与定义
本文中，“一个”、“一种”和“该/所述”引导的单数形式包括复数含义，除非另作说明。而且，术语“一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可以互换使用。
本文中，除非另作说明，不论数值或范围前是否有“约”都涵盖了相关领域技术人员可理解的合理的约略范围，例如指定值的±10％、±5％、±3％、±2％、±1％或±0.5％范围。
本文中，术语“基本上没有”就某种情形或某种物质的存在性而言不仅表示不存在(即“无”、“零”等)还表示无显著意义的存在或低于检查限因而无法测知的存在或存在量。这是本领域技术人员所熟知的。
本文中一种实施方式中的一项或多项特征可以与另一实施方式中的一项或多项特征组合，这并不背离本发明的构思和概念。
除非另做定义，本发明使用的所有技术和科学术语其意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。文中列举的公开文献和专利文献都通过援引纳入本文并适用于各种目的。引用的文献均可被看作表明本领域技术人员的技能水平，但这不能理解为承认它们先于本发明，因为本发明发明在先。
综述
多肽连接子的剪切速度因多种因素而异，包括相关酶的特性、区域特异性酶与底物相互作用等等。我们发现，改变四肽GGFG两侧的结构会改变连接子的酶结合性，表现为组织蛋白酶B(cathepsin B)的kcat/Km值升高。基于此我们设计了一系列连接子。采用这些连接子能够获得性能更优的连接子-载荷化合物和ADC。据后文实施例所示，包含本发明设计的连接子部分的本发明连接子-载荷化合物不论是作为独立化合物还是ADC的组成部分都表现出与包含类似的现有连接子部分的参照物相比有更高的组织蛋白酶B剪切速度。我们发现，本发明设计的连接子更容易被酶切，这有助于提高ADC的效力。我们还发现，与现有类似ADC相比，包含本发明连接子-载荷部分的ADC可表现出更高的稳定性(例如储存稳定性，如冻融稳定性)且/或相当甚至更好的治疗相关效力(例如结合亲和力和/或细胞毒性)。
同时，我们还发现，用包含本发明设计的连接子部分的本发明连接子-载荷化合物制造ADC能提供更纯净的产物，例如与高药物-抗体之比(DAR)的相比。/>的DAR为7.5。DAR越高，偶联反应需要的连接子-载荷越多。因此，去除残留的连接子-载荷会非常麻烦。本发明中，例如与Enhertu中的德鲁替康相比，本发明的连接子-载荷清除起来更容易、更彻底，因此能够制得更纯净的ADC产品。其原因可能是本发明连接子-载荷的亲水性更高。同时，偶联中采用大过量连接子-载荷来实现高DAR时会发生连接子-载荷与抗体重链非特异性结合，由此产生4药偶联的重链，但理想的数量是不超过3。本发明中，4药偶联重链的百分比可降低至/>工艺的1/3。因此，本发明的连接子和连接子-载荷能够提供均质性更高的ADC产品。
我们还发现，用本发明连接子-载荷制备的ADC更易纯化。一些情形中，与例如所用连接子-载荷生产的产品相比，UFDF(超滤&深层过滤)纯化后，偶联后ADC中残留的游离连接子-载荷显著减少。因此，本发明连接子和连接子-载荷能生产出纯度更高的ADC，并且能够用更具操作性和产能的工艺生产ADC。
具体实施方式示例
1.连接子
在本公开中，术语“连接子”，如从上下文中可以理解的，可以指本发明的单独的连接子化合物或纳入到本发明的连接子-载荷偶联物或抗体-药物偶联物中并因此作为其一部分的连接子部分。可以理解，连接子部分是指源自对应的连接子化合物(当通过偶联纳入到偶联物中时)的部分。
在一个方面，本发明提供具有式I的结构的连接子化合物：
其对映异构体、非对映异构体、外消旋体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐或酯；
其中，“*”表示手性中心，其是S-或R-或外消旋的；并且连接到手性碳原子的氢原子和连接到具有R2取代基的碳原子的氢原子从式中省略；
L1是-(CH2)a-，其中a是1至10，优选1至8，更优选2至6或4至5的整数，或者-(CH2CH2O)b-，其中b是1至36，优选2至30，更优选3至25或4至20的整数；
L2是-(CH2)c-，其中c是1至10，优选1至8或1至6，更优选1至2的整数，或者-(CH2CH2O)d-，其中d是1至36，优选2至30，更优选3至25或4至20的整数；
L3不存在，或是-(CH2)e-，其中e是1至10，优选1至8或1至6，更优选1至2的整数，或者-(CH2CH2O)f-，其中f是1至36，优选1至20，更优选1至2、3至25或4至20的整数；
R1是-CF3、-NRaRb、-NRa(C＝O)Rb或-O(CH2)gCH3，其中g是0至3的整数，优选1至2，Ra是H或-C1-6烷基，优选-H或-CH3；Rb是H或-C1-6烷基，优选是-H或-CH3；优选地，R1是-CF3、-N(CH3)2、-NH(C＝O)CH3或-O(CH2)2CH3；
R2是-H、-C1-6烷基或-O(CH2)hCH3，其中h是0至3的整数，优选地，R2是-H或-CH3；
X是卤素、-OR3或-NR4R5，优选-OR3；
R3是-H、-C1-6烷基或卤素，优选是-H、-CH3、叔丁基或Cl；
R4和R5独立地是-H或-C1-6烷基；
n＝0或1；和
m＝0或1；
连接子化合物的具体示例包括如下所示的化合物L-1-1、L-1-2、L-1-3、L-1-4、L-1-7、L-1-8、L-3-1和L-3-4，或其药学上可接受的盐或酯：
其中“*”表示手性中心，其为外消旋的。
所设计的连接子提供了独特的特征和化学性质。例如，在L-1-1、L-1-2、L-1-3、L-1-4、L-1-7和L-1-8中，将CF3基团引入胺残基的α位，从而在GGFG肽的N侧产生强偶极部分。该基团很可能减少组织蛋白酶B与GGFG相互作用的Km，从而加速肽水解的酶催化速率。显然，在连接子(例如，如L-3-1和L-3-4)的类似位置引入四胺或乙酰胺也导致催化速率增加。
我们进一步探索了四肽GGFG的N侧修饰。我们发现，在药物部分(例如，依喜替康或Dxd)的连接键附近引入额外的甲基/亚甲基(例如，如L-1-2、L-1-3、L-1-8)或乙二醇基(例如，L-1-7和L-1-8)不会减慢组织蛋白酶B剪切速率。
2.连接子-载荷
2.1.本发明的连接子-载荷偶联物
在本公开中，术语“连接子-载荷”(下文中也简称为“LP”)，如从上下文中可以理解的，可以指单独的本发明的连接子-载荷化合物或纳入并因此作为根据本发明的抗体-药物偶联物的一部分的连接子-载荷部分。连接子-载荷部分可以与其相应的通过偶联衍生自的连接子-载荷化合物共享相同的数字代码。
在本公开中，术语“连接子-载荷化合物”是指由连接子部分与药物部分共价偶联而成的偶联化合物，其中药物部分也被称为“载荷”。该连接子-载荷化合物可进一步与抗体偶联，从而提供一种包含本发明的连接子-载荷部分的ADC。
因此，在一个方面，本发明提供了一种具有式II结构的连接子-载荷偶联化合物：
其对映异构体、非对映异构体、外消旋体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐或酯；其中，“*”、L1、L2、L3、R1、R2、n和m如式I中所定义；并且，“DRUG”是共价偶联至连接子部分的药物部分。
在一些实施方式中，连接子-载荷偶联物可以是具有以下任意式的化合物，或其药学上可接受的盐或酯：
其中“*”表示手性中心，其为外消旋的。
可用于本发明的药物没有特别限制，只要其具有或可以被修饰为具有在与马来酰亚胺部分的相反末端与连接子化合物偶联的官能团即可。在一些实施方式中，用于偶联的官能团可以是-NHR，其中R是烷基或H。
如本文所用，术语“药物(DRUG)”，如从上下文中可以理解的，可以指形成共价偶联至连接子-载荷化合物或ADC中连接子部分的药物部分的药物，或者通过酶切从连接子-载荷或ADC释放的药物。
可用于本发明中的药物包括细胞毒性药物，尤其是用于癌症治疗的药物。此类药物包括但不限于DNA损伤剂、DNA结合剂、核酸合成抑制剂、转录抑制剂、抗代谢物、酶抑制剂如胸苷酸合成酶抑制剂和拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白抑制剂和毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的毒素。具体示例包括，例如，紫杉醇、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲基蝶呤(methopterin)、二氯甲氨蝶啶、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿拉伯糖苷胞嘧啶、美法仑、环氧长春碱(leurosine)、异长春碱(leurosidine)、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、丝裂霉素C、丝裂霉素A、洋红霉素(caminomycin)、氨基蝶呤、他利霉素(tallysomycin)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)和鬼臼毒素衍生物如依托泊苷(etoposide)或磷酸依托泊甙、长春花碱、长春新碱、长春地辛、紫杉烷包括紫杉醇、视黄酸紫杉醇酯(taxotere retinoic acid)、丁酸、N8乙酰亚精胺(N8-acetyl spermidine)、喜树碱、卡奇霉素、埃斯培拉霉素(esperamicin)、烯二炔类、多卡霉素A(duocarmycin A)、多卡菌素SA(duocarmycin SA)、卡奇菌素、喜树碱，哈米特林类(hemiasterlins)、美登素类(maytansinoids，包括DM1、DM2、DM3、DM4)、奥瑞他汀类包括单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，单甲基奥瑞他汀F(MMAF)和单甲基奥瑞他汀D(MMAD)、喜树碱、伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、依喜替康(exatecan)、依托泊苷及其衍生物。在一些实施方式中，药物是拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱、伊立替康、拓扑替康、依喜替康、依托泊苷及其衍生物，如羟基喜树碱(hodroxycamptothecin)和Dxd。在一些实施方式中，药物是Dxd。在一些其他实施方式中，药物是依喜替康。在一些实施方式中，当从连接子-载荷或ADC释放时，药物是Dxd。在一些其他实施方式中，当偶联至连接子以形成药物部分时，药物是依喜替康。
相应地，连接子-载荷偶联物可以是具有式IIa的结构的化合物，其对映异构体、非对映异构体、外消旋体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐或酯：
其中，“*”、L1、L2、L3、R1、R2、n和m如式II中所定义。
在一些具体实施例中，连接子-载荷偶联物可以是选自如下所示的组的化合物：1-1、1-2、1-3、1-4、1-7、1-8、3-1或3-4，或其药学上可接受的盐或酯：
/>
/>
其中“*”表示手性中心，其为外消旋的。
2.2.连接子-载荷偶联物的合成
作为本发明的一方面，本文提供了一种生产连接子-载荷偶联化合物的方法，其包括将药物与本发明的连接子化合物偶联。在一些实施方式中，药物是依喜替康。
药物与连接子化合物的偶联可以通过本领域已知的偶联反应(如酯化反应或酰胺化反应)或酯交换反应进行，这取决于连接子化合物末端的一个/种或多个/种官能团的类型和药物上的一个/种或多个/种官能团的类型。
3.抗体-药物偶联物
3.1.本发明的抗体-药物偶联物
在一个方面，本发明提供了一种抗体-药物偶联物，其包括通过本发明的连接子部分将抗体与一个或多个药物分子偶联，其可由式III表示：
其对映异构体、非对映异构体、外消旋体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐或酯；其中，“*”、L1、L2、L3、R1、R2、n和m以及“DRUG”如式II中所定义；并且，p是1至8，例如1、2、3、4、5、6、7和8；“Ab”是指抗体。
在一些具体示例中，抗体-药物偶联物可以是选自下组化合物的化合物：
/>
/>
其中“*”表示手性中心，其为外消旋的，
其中p是1至8，如1、2、3、4、5、6、7和8；在一些实施方式中，p是2、4或6；以及在一些实施方式中，p是4。
对于本发明可用的抗体基本没有限制。可以是各种特异性、构型和来源的抗体。一些实施方式中，抗体特异性结合肿瘤抗原(TA)，例如肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA)。肿瘤抗原的例子包括但不限于：CD20、CD38、CD123、ROR1、ROR2、BCMA、PSMA、SSTR2、SSTR5、CD19、FLT3、CD33、PSCA、ADAM 17、CEA、Her2、EGFR、EGFR-vIII、CD30、FOLR1、GD-2、CA-IX、Trop2、CD70、CD38、间皮素(mesothelin)、EphA2、CD22、CD79b、GPNMB、CD56、CD138、CD52、CD74、CD30、CD123、RON和ERBB2。TA特异性抗体的例子包括但不限于：曲妥珠单抗(Trastuzumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、马妥珠单抗(Matuzumab)、吉妥珠单抗(Gemtuzumab)、泊洛妥珠单抗(Polatuzumab)、伊妥珠单抗(Inotuzumab)等。在一些实施方式中，抗体(Ab)是曲妥珠单抗。
就本发明的ADC而言，“抗体”一词包括抗体片段，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段。并且，“抗体”一词延伸包括功能等同物，例如特异性识别并结合靶分子(如抗原，例如肿瘤抗原)的配体和结合蛋白，受体或靶细胞(如疾病相关细胞，例如癌细胞或肿瘤细胞)上的其他表面分子，只要这些等同分子具备或可经改性而具备能够与连接子的马来酰胺基团反应从而与之共价结合的官能团。一些实施方式中，所述官能团是硫醇基团，例如链间二硫键还原释放的那些硫醇基，抗体可由此通过硫-马来酰胺连接键与连接子部分偶联。
3.2.抗体-药物偶联物的制备
在一方面，本发明提供了一种生产抗体-药物偶联物的方法，其包括将抗体与本发明的连接子-载荷化合物偶联。
一些实施方式中，所述方法可以包括：
(a)将药物与本发明的连接子化合物偶联以获得连接子-载荷化合物；优选地，药物是依喜替康；和
(b)将抗体与步骤(a)中获得的连接子-载荷化合物偶联。
步骤(a)可以通过本领域已知的偶联反应(如酯化反应或酰胺化反应)或酯交换反应进行，这取决于连接子化合物末端的一个/种或多个/种官能团的类型和药物上的一个/种或多个/种官能团的类型。
步骤(b)可以通过迈克尔加成反应使马来酰亚胺部分与抗体中的游离硫醇基团反应来进行。例如，一个/种或多个/种游离硫醇基团可以来自一个/种或多个/种半胱氨酸残基，例如通过链间二硫键的还原而释放的那些硫醇基，使得抗体可以通过硫-马来酰胺连接键与连接子部分偶联。
4.应用
本发明之抗体-药物偶联物(ADC)可用药学上可接受的制剂配制成药物组合物。一些实施方式中，组合物可包含治疗有效量的抗体-药物偶联物。一些实施方式中，组合物可包含能够实现所需剂量的有效量的抗体-药物偶联物。
本发明的抗体-药物偶联物可用于在有需要的对象中治疗其疾病、紊乱或状况，所述治疗包括给与对象治疗有效量的抗体-药物偶联物。本申请还提供用于在有需要的对象中治疗其疾病、紊乱或状况的本发明抗体药物-偶联物。治疗的疾病包括但不限于癌症，包括实体瘤和血液癌。所述癌症的例子包括但不限于乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肺癌(例如NSCLC)、头颈部癌、结直肠癌、B细胞淋巴瘤(例如非霍金斯淋巴瘤(NHL))和白血病。
本文中，术语“对象”指人类或非人类动物对象。非人类动物可以是哺乳动物，例如灵长类动物。非人类哺乳动物对象的例子包括但不限于豢养动物、畜牧动物和动物园动物、竞技动物或宠物，例如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛和熊。优选地，对象是人。“有需要的对象”指需要就疾病、紊乱或状况进行诊断、预后、缓解、预防和/或治疗的对象。
实施例
以下实施例仅用于说明，不对本发明范围构成限制。
实施例1：连接子-载荷的合成(a)化合物1-7(在图1中也称为德鲁替康类似物1-7)的合成
合成过程示意性地描述在图1中。
步骤1：2-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙氧基)乙酸甲酯(a-1)
将2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙醇(6.51g，42.5mmol)加入无水叔丁醇(50.0mL)中。在搅拌情况下加入叔丁醇钾(3.18g，28.3mmol)，并在0℃下搅拌1小时，然后逐滴加入2-溴乙酸甲酯(5.00g，28.3mmol)的叔丁醇(50.00mL)溶液。将所得溶液升温至0-25℃并搅拌2小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝10:1，Rf＝0.2)显示反应完全。在0℃下加入水(100mL)使反应混合物淬灭，并用二氯甲烷50.0mL(50.0mL*3)萃取。合并的有机层用盐水(20.0mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过柱色谱法(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝50/1至2/1)纯化，得到无色油状的2-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙氧基)乙酸甲酯(3.00g，42.5％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 4.19(s,2H),3.79-3.84(m,2H),3.76(s,2H),3.62-3.67(m,2H),0.90(s,9H),0.07(s,6H)。
步骤2：2-(2-羟基乙氧基)乙酸苄酯(a-2)
向2-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙氧基)乙酸甲酯，a-1(800mg，4.03mmol)的四氢呋喃(10.0mL)和水(10.0mL)混合物中加入氢氧化锂一水合物(168mg，4.03mmol)。将混合物在25℃下搅拌2小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝5:1，Rf＝0.2)显示反应完全。将反应混合物减压浓缩以除去水和四氢呋喃，得到残留物。将残留物溶于N,N-二甲基甲酰胺(5.00mL)中，加入碳酸钾(556mg，4.03mmol)和苄基溴(1.38g，8.05mmol)，将混合物在25℃下搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝10:1，Rf＝0.5)表明中间体被完全消耗，根据TLC显示反应混乱。将反应混合物减压浓缩以除去N,N-二甲基甲酰胺，并通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝100/1至50/1)纯化，得到浅黄色液体的中间体(1.30g)。中间体是在1M HCl(5.00mL)中的脱TBS。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝2:1，Rf＝0.5)表明中间体被完全消耗，但TLC显示反应混乱。通过柱色谱法(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝50/1至2/1)纯化反应混合物，得到浅黄色液体的2-(2-羟基乙氧基)乙酸苄酯(600mg，产率88.6％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.28-7.41(m,5H),5.20(s,2H),4.22(s,2H),3.81(t,J＝5.1Hz,3H),3.64-3.68(m,2H),0.90(s,9H),0.07(s,6H)。
步骤3：1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9,12-三氧杂-4,7-二氮杂十四烷-14-酸苄酯(a-4)
向2-(2-羟基乙氧基)乙酸苄酯a-2(400mg，1.09mmol)和乙酸(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)甲酯a-3(342mg，1.63mmol)在四氢呋喃(4.00mL)中的混合物中加入4-甲基苯磺酸一水合物(10.4mg，54.2umol)，然后将混合物在25℃下搅拌1小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1:1，Rf＝0.2)显示反应完全。混合物用碳酸氢钠(10.0mL)稀释，并用乙酸乙酯(30.0mL)萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱法(100-200目硅胶)纯化，用(石油醚/乙酸乙酯＝50/1至1/1)洗脱，得到白色固体的1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9,12-三氧杂-4,7-二氮杂十四烷-14-酸苄酯(0.40g，产率71.0％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.77(d,J＝7.5Hz,2H),7.61(d,J＝7.5Hz,2H),7.30-7.44(m,9H),5.13-5.22(m,2H),4.81(d,J＝6.8Hz,2H),4.44(d,J＝6.8Hz,2H),4.15-4.18(m,2H),3.92(d,J＝5.5Hz,2H),3.73-3.76(m,2H),3.68(d,J＝2.5Hz,2H)。
步骤4：1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9,12-三氧杂-4,7-二氮杂十四烷-14-酸(a-5)
向1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9,12-三氧杂-4,7-二氮杂十四烷-14-酸苄酯a-4(0.40g，771umol)在乙醇(20.0mL)和乙酸乙酯(20.0mL)中的混合物中加入干燥的Pd/C(0.80g)，在氢气气氛(15psi)中在25℃搅拌3小时。TLC(DCM/MeOH＝10:1，Rf＝0.3)显示反应完成。将反应混合物通过硅藻土过滤，并将滤液减压浓缩，得到无色油状的1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9,12-三氧杂-4,7-二氮杂十四烷-14-酸(0.25g，产率75.6％)。粗产物直接用于下一步而无需纯化。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.64-8.74(m,1H),7.83-7.95(m,2H),7.73(d,J＝7.4Hz,1H),7.55-7.62(m,1H),7.26-7.49(m,4H),4.56(d,J＝6.5Hz,2H),4.26-4.35(m,2H),3.64(d,J＝4.4Hz,2H),3.49-3.60(m,4H)。
步骤5：(a-6，即，L-1-7)
向含有CTC-树脂(0.50g，14.1mmol)和1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9,12-三氧杂-4,7-二氮杂十四烷-14-酸，a-5(0.20g，520umol)的混合物中，加入N,N-二异丙基乙胺(0.25g，1.95mmol)、二氯甲烷(10.0mL)进行溶胀。将树脂混合2小时，然后加入甲醇(5.00mL)并混合30分钟。然后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺(10.0mL)洗涤3次。将树脂用N,N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶处理30分钟以进行Fmoc脱保护。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤5次。然后加入Fmoc-Phe-OH(0.58g，1.31mmol)并混合30秒，然后加入O-苯并三唑-N,N,N-四甲基-脲鎓(uronium)-六氟磷酸盐(HBTU)(0.54g，1.43mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.25g，1.95mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液，氮气鼓泡30分钟。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次。在25℃下重复上述步骤进行接下来的偶联：氨基酸Fmoc-Gly-OH(0.53g，1.50mmol)和2-((7-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-1,1,1-三氟庚烷-2-基)氨基)乙酸(0.20g，1.31mmol)。通过茚三酮试验检测反应。通过茚三酮显色反应监测偶联反应。用10.0mL甲醇洗涤并真空干燥后。向含有肽树脂的烧瓶中加入20.0mL裂解缓冲液(20％ HFIP/80％DCM)，搅拌2分钟2次。在真空中除去HFIP混合物，得到残留物。通过快速色谱法(10-50％H2O/CH3CN洗脱液，C-18柱色谱)纯化残留物。然后将所得产物冷冻干燥，得到白色固体化合物a-6(100mg，粗品，纯度90.0％)。LCMS(ESI,m/z):713.68[M+H]+:715(Xbrige C18,3.5um,2.1*30mm色谱柱,波长:UV 220nm&254nm；柱温:30℃)用水中的0.1％ TFA:乙腈中的0.1％TFA洗脱(10-80_2分钟)。HPLC(Gemini-NX C18 5um 110A 150*4.6mm色谱柱,波长:UV220nm&254nm；柱温:30℃)用水中的0.1％ TFA:乙腈中的0.1％ TFA洗脱(10-80_20分钟)。
步骤6：(化合物1-7)
将化合物a-6(59.7mg，79.2umol，)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.80mg，20.6umol，)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)。向混合物中加入依喜替康甲磺酸盐(10.0mg，18.8umol)和N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(9.50mg，75.24umol)，然后将混合物在40℃下搅拌2小时。TLC(DCM/MeOH＝10/1，Rf＝0.4)显示反应完成。真空除去痕量的N,N-二甲基甲酰胺，得到残留物。通过快速色谱法(10-50％水/乙腈洗脱液，C-18柱色谱)纯化残留物。然后将所得产物冷冻干燥，得到浅黄色固体的化合物1-7(8.00mg，产率37.4％，纯度95.7％)。LCMS(ESI,m/z):1131.1[M+H]+:1132.6(Xbrige C18,3.5um,2.1*30mm色谱柱,波长:UV 220nm&254nm；柱温:30℃)用水中的0.1％ TFA:乙腈中的0.1％TFA洗脱(10-80_2分钟)。HPLC(Gemini-NXC18 5um 110A 150*4.6mm色谱柱,波长:UV 220nm&254nm；柱温:30℃)用水中的0.1％ TFA:乙腈中的0.1％ TFA洗脱(35-65_20+3分钟)。
(b)化合物3-1(在图2中也称为德鲁替康类似物3-1)的合成
合成过程示意性地描述在图2中。
步骤1：1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸苄酯(b-3)
向乙酸(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)甲酯(500mg，1.36mmol)和3-羟基丙酸苄酯(366mg，2.04mmol)在四氢呋喃(5.00mL)中的混合物中加入4-甲基苯磺酸一水合物(12.9mg，67.8umol)，然后将混合物在25℃下搅拌3小时。LC-MS显示原料被完全消耗，并检测到一个具有所期望质量的主峰。混合物用饱和碳酸氢钠(50.0mL)稀释，并用乙酸乙酯(50.0mL)萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱法(100-200目硅胶)纯化，用(石油醚/乙酸乙酯＝50/1至1/1)洗脱，得到白色固体的1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸苄酯，b-3(400mg，产率60.3％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.90(d,J＝7.4Hz,2H),7.73(d,J＝7.0Hz,2H),7.24-7.64(m,9H),5.05-5.14(m,2H),4.48-4.62(m,4H),4.16-4.34(m,3H),3.54-3.72(m,4H)。
步骤2：1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸(a-3)
向1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸苄酯(400mg，818umol)的乙醇(10.0mL)和乙酸乙酯(10.0mL)的混合物中加入干燥的Pd/C(0.05g)，然后将反应混合物在25℃下在氢气氛(15psi)中搅拌5小时。TLC(DCM/MeOH＝10:1，Rf＝0.2)显示原料被消耗并形成了一个新的点。将反应混合物通过硅藻土过滤，并将滤液减压浓缩，得到白色固体的1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸,a-3(300mg，产率91.9％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.90(d,J＝7.4Hz,2H),7.73(d,J＝7.0Hz,2H),7.24-7.64(m,4H),5.05-5.14(m,2H),4.48-4.62(m,2H),4.16-4.34(m,3H),3.54-3.72(m,4H)。
步骤3：(S)-2-氨基-6-((叔丁氧羰基)氨基)己酸(b-6)
将(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酸(5.00g，10.67mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(10.0mL)和三乙胺(2.50mL)中的溶液在25℃下搅拌16小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.2)显示反应完成。将反应混合物逐滴加入搅拌中的异丙醚(100mL)的溶液中，过滤所得固体，并用异丙醚(50mL)洗涤固体。在真空中除去痕量的异丙醚，得到白色固体的(S)-2-氨基-6-((叔丁氧羰基)氨基)己酸，b-6(2.50g，产率95.1％)。粗产物无需进一步纯化即可用于下一步中。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm3.67(t,J＝6.1Hz,1H),3.03(t,J＝6.7Hz,2H),1.73-1.90(m,2H),1.23-1.56(m,12H)。
步骤4：(S)-6-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(二甲氨基)己酸(b-7)
在25℃下，向(S)-2-氨基-6-((叔丁氧羰基)氨基)己酸(2.00g，8.12mmol)的三氟乙醇(14.0mL)溶液中滴加甲醛(1.32g，16.2mmol，纯度37％)，在25℃下搅拌30分钟，然后在冰浴中在30分钟的时间段内滴加硼氢化钠(614mg，16.2mmol)，然后在25℃下再保持30分钟。LC-MS显示原料被完全消耗，并检测到一个具有所期望质量的主峰。真空除去痕量的三氟乙醇(14.0mL)，得到残留物，然后用1％乙酸(20.0mL)稀释。混合物通过快速色谱法纯化(洗脱液为10～50％ H2O(0.1％TFA/CH3CN，C-18柱色谱)。然后将所得产物冷冻干燥，得到白色固体的(S)-6-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(二甲氨基)己酸，b-7(1.20g，产率53.8％)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δppm 3.16(t,J＝7.0Hz,1H),3.02(t,J＝6.8Hz,2H),2.52(s,6H),1.66-1.73(m,2H),1.46(ddd,J＝11.0,7.0,4.0Hz,2H),1.38(s,9H),1.22-1.31(m,2H)。
步骤5：(S)-2-(二甲氨基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(b-9)
将(S)-6-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(二甲氨基)己酸b-7(0.60g，2.19mmol)在三氟乙酸(0.60mL)和二氯甲烷(6.00mL)中的溶液在25℃下搅拌2小时。LC-MS显示原料被完全消耗，并检测到一个具有所期望质量的主峰。将反应混合物减压浓缩以除去二氯甲烷和三氟乙酸，得到无色油状的脱-Boc产物。将无色油状物在0℃下溶于饱和碳酸氢钠(6.00mL)中，然后向反应混合物中加入2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸甲酯(407mg，2.62mmol)，并在0℃下搅拌1小时，然后在25℃下再保持3小时。LC-MS显示中间体被完全消耗，并检测到一个具有所期望质量的主峰。通过加入1M HCl(5.00mL)酸化反应混合物，并通过快速色谱法(洗脱液为10～50％ H2O(0.1％TFA)/CH3CN，C-18柱色谱)纯化。然后将所得产物冷冻干燥，得到白色固体的(S)-2-(二甲氨基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸，b-9(500mg，89.9％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 6.80(s,2H),3.79(dd,J＝8.5,4.4Hz,1H),3.49(t,J＝6.8Hz,2H),2.88(d,J＝13.4Hz,6H),1.89-2.00(m,2H),1.56-1.64(m,2H),1.30-1.40(m,2H)。
步骤6：(3S，12S)-12-苄基-3-(4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基)-2-甲基-4,7,10,13,16-五氧代-19-氧杂-2,5,8,11,14,17-六氮杂二十二烷-22-酸(b-10，即L-3-1)
向含有CTC-树脂(0.50g，14.1mmol)和1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸，a-3(0.20g，520umol)的混合物中，加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(0.25g，1.95mmol)、二氯甲烷(10.0mL)进行溶胀。将树脂混合2小时，然后加入甲醇(5.00mL)并混合30分钟。然后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺(10.0mL)洗涤3次。将树脂用N,N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶处理30分钟以进行Fmoc脱保护。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤5次。然后加入Fmoc-Phe-OH(0.58g，1.31mmol)并混合30秒，然后加入O-苯并三唑-N,N,N-四甲基-脲鎓(uronium)-六氟磷酸盐(HBTU)(0.54g，1.43mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(0.25g，1.95mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液，氮气鼓泡30分钟。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次。对接下来的氨基酸Fmoc-Gly-Gly-OH(0.53g，1.50mmol)和特殊氨基酸(S)-2-(二甲氨基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸，b-9(0.20g，1.31mmol)，在25℃下的偶联重复上述步骤。通过茚三酮试验检测反应。通过茚三酮显色反应监测偶联反应。用10.0mL甲醇洗涤并真空干燥后,向含有肽树脂的烧瓶中加入20.0mL裂解缓冲液(20％HFIP/80％ DCM)，搅拌2分钟2次。在真空中除去HFIP混合物，得到残留物。通过快速色谱法(C-18柱色谱，10-50％H2O/CH3CN洗脱液)纯化残留物。然后将所得产物冷冻干燥，得到白色固体的(3S,12S)-12-苄基-3-(4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基)-2-甲基-4,7,10,13,16-五氧代-19-氧杂-2,5,8,11,14,17-六氮杂二十二烷-22-酸b-10，(30.0mg，产率4.39％)。
步骤7：化合物3-1
向(3S,12S)-12-苄基-3-(4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基)-2-甲基-4,7,10,13,16-五氧代-19-氧杂-2,5,8,11,14,17-六氮杂二十二烷-22-酸，b-10(18.6mg，28.2umol)，和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.80mg，20.6umol，)在N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)中的溶液中加入依喜替康甲磺酸盐(10.0mg，18.8umol)和N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(9.50mg，75.24umol)，然后将混合物在25℃下搅拌3小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.3)显示反应完成。在真空中除去痕量的N,N-二甲基甲酰胺，得到残留物。通过快速色谱法(10-50％H2O/CH3CN洗脱液，C-18柱色谱)纯化残留物。然后将所得产物冷冻干燥，得到浅黄色固体的化合物3-1(7.20mg，产率35.4％)。LCMS(ESI,m/z):1077.1[M+H]+:1077.6(XbrigeC18,3.5um,2.1*30mm色谱柱,波长:UV 220nm&254nm；柱温:30℃)用水中的0.1％ TFA:乙腈中的0.1％ TFA洗脱(10-80_2分钟)。HPLC(Gemini-NX C18 5um 110A150*4.6mm色谱柱,波长:UV 220nm&254nm；柱温:30℃)用水中的0.1％ TFA:乙腈中的0.1％ TFA洗脱(25-55_20+3分钟)。
(c)其他化合物的合成
化合物1-1(在图3中也称为德鲁替康类似物1-1)的合成
步骤1：10-苄基-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,9,12,15-四氧代-18-(三氟甲基)-3-氧杂-5,8,11,14,17-五氮杂二十三烷-1-酸(c-1，即L-1-1)
肽合成：
使用标准Fmoc化学合成肽。
1)将DCM添加到含有CTC树脂(0.25mmol，0.44g，Sub＝0.57mmol/g)和5-苄基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9-三氧代-2,12-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-14-酸(0.10g，0.25mmol，1.0当量)的容器中，同时氮气鼓泡。
2)滴加DIEA(6.0当量)并混合2小时。
3)加入MeOH(0.8mL)并混合30分钟。
4)沥干(drain)并用DMF洗涤5次。
5)加入20％哌啶/DMF并反应30分钟。
6)沥干并用DMF洗涤3次。
7)加入Fmoc氨基酸溶液并混合30秒，然后加入活化缓冲液，N2鼓泡约1小时。
8)对接下来的氨基酸偶联重复步骤5至7。
注：
使用DMF中的20％哌啶进行Fmoc脱保护30分钟。通过茚三酮测试监测偶联反应，并用DMF洗涤树脂5次。
肽的剪切和纯化：
1)向肽树脂中加入剪切缓冲液(20％HFIP/DCM)，搅拌3分钟3次。
2)DCM在减压下浓缩。
3)将肽在高真空中干燥2小时。
4)通过制备型HPLC(A：H2O中0.075％TFA，B：ACN)纯化粗肽，得到化合物c-1(26.0mg，95.0％纯度，7.36％产率)。
步骤2：(德鲁替康类似物1-1)
向化合物c-1(21.0mg，31.3umol，1当量)和依喜替康甲磺酸盐(16.6mg，31.3umol)在DMF(0.5mL)中的溶液中加入HOAt(12.8mg，93.9umol，3当量)、DIC(15.8mg，125.2umol，4当量)和DIEA(12.14mg，93.9umol，3当量)，然后将反应混合物在25℃下搅拌16小时。LCMS显示化合物c-1被消耗，并检测到一个具有所期望质量的主峰。反应混合物通过制备型HPLC(自然条件，纯水)直接纯化，在制备型HPLC中检测到具有所期望质量的两个峰，分离并冻干，得到白色固体的德鲁替康类似物1-1(峰1:1.4mg，85.97％纯度，峰2:7.1mg，90.32％纯度，22.3％产率)。
化合物1-2(在图4中也称为德鲁替康类似物1-2)的合成
步骤1：(S)-1-(9H-芴-9-基)-10-甲基-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷-11-酸苄基酯(d-3)
向乙酸(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)甲酯(5g，13.57mmol)和(S)-2-羟基丙酸苄酯(d-2，4.89g，27.15mmol)在四氢呋喃(5.00mL)中的混合物中加入4-甲基苯磺酸水合物(129.09mg，678.64umol)，然后将混合物在25℃下搅拌5小时。LC-MS显示原料被完全消耗，并检测到一个具有所期望质量的主峰。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残留物。得到黄色油状化合物(S)-1-(9H-芴-9-基)-10-甲基-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷-11-酸苄基酯，d-3(4.10g，8.38mmol，61.77％产率)。
步骤2：(S)-1-(9H-芴-9-基)-10-甲基-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷-11-酸(d-4)
向(S)-1-(9H-芴-9-基)-10-甲基-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷-11-酸苄酯，d-3(2.00g，4.09umol)在四氢呋喃(20.0mL)中的溶液中加入干燥的Pd/C(200mg)，然后将反应混合物在25℃下在氢气氛(15psi)中搅拌4小时。TLC(DCM/MeOH＝10:1，Rf＝0.3)显示原料耗尽并形成了一个新的点。将反应混合物通过硅藻土过滤，并将滤液减压浓缩，得到白色固体的(S)-1-(9H-芴-9-基)-10-甲基-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷-11-酸，d-4(1.28g，3.21mmol，78.4％产率)。
步骤3：(2S,10S)-10-苄基-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-甲基-6,9,12,15-四氧代-18-(三氟甲基)-3-氧杂-5,8,11,14,17-五氮杂二十三烷-1-酸(d-5，即L-1-2)
向含有CTC-树脂(0.50g，0.50mmol)和(S)-1-(9H-芴-9-基)-10-甲基-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷-11-酸，d-4(0.50g，500umol)的混合物中，加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(2.00mmol)、二氯甲烷(10.0mL)进行溶胀。将树脂混合2小时，然后加入甲醇(5.00mL)并混合30分钟。然后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺(10.0mL)洗涤5次。将树脂用N,N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶处理30分钟以进行Fmoc脱保护。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次。然后加入Fmoc-Phe-OH(1.50mmol)并混合30秒，然后加入O-苯并三唑-N,N,N-四甲基-脲鎓(uronium)-六氟磷酸盐(HBTU)(1.50mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(3.00mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液，氮气鼓泡30分钟。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次。对接下来的氨基酸Fmoc-Gly-OH(1.50mmol)和特殊氨基酸2-((7-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-1,1,1-三氟庚烷-2-基)氨基)乙酸(0.20g，1.31mmol)在25℃下的偶联重复上述步骤。通过茚三酮试验检测反应。通过茚三酮显色反应监测偶联反应。用10.0mL甲醇洗涤并真空干燥后。向含有肽树脂的烧瓶中加入20.0mL裂解缓冲液(20％ HFIP/80％ DCM)，搅拌2分钟2次。在真空中除去HFIP混合物，得到残留物。通过快速色谱法(10-50％H2O/CH3CN洗脱液，C-18柱色谱)纯化残留物。然后将所得产物冷冻干燥，得到白色固体的(2S，10S)-10-苄基-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-甲基-6,9,12,15-四氧代-18-(三氟甲基)-3-氧杂-5,8,11,14,17-五氮杂二十三烷-1-酸，d-5，(55.0mg，产率9.98％)。
步骤4：(德鲁替康类似物1-2)
向(2S，10S)-10-苄基-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-甲基-6,9,12,15-四氧代-18-(三氟甲基)-3-氧代-5,8,11,14,17-五氮杂二十三烷-1-酸，d-5(20.0mg，29.2umol)，和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)(7.95mg，58.4umol)在N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)中的溶液中加入依喜替康甲磺酸盐(15.5mg，29.1umol)，N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(22.1mg，175umol，27.1uL)和N,N-二异丙乙胺(DIEA)(7.55mg，58.4umol，10.1uL)，然后将混合物在25℃下搅拌3小时。LC-MS显示原料被完全消耗，并检测到一个具有所期望质量的主峰。过滤反应混合物以除去未溶解的残留物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残留物。然后将所得产物冷冻干燥，得到浅黄色固体的德鲁替康类似物1-2(18.8mg，17.0umol，产率58.4％，纯度96.3％)。
化合物1-3(在图5中也称为德鲁替康类似物1-3)的合成
步骤1：1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸苄酯(e-3)
向化合物a-3(500mg，1.36mmol)和化合物e-2(366mg，2.04mmol)在THF(5.00mL)中的混合物中加入4-甲基苯磺酸一水合物(12.9mg，67.8umol)，然后将混合物在25℃下搅拌3小时。LC-MS显示化合物a-3被完全消耗，并检测到一个具有所期望质量的主峰。将混合物用NaHCO3(50.0mL)稀释并用EtOAc(50.0mL)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱法(100-200目硅胶)纯化，用(石油醚/乙酸乙酯＝50/1至1/1)洗脱，得到白色固体的化合物e-3(400mg，产率60.3％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.90(d,J＝7.4Hz,2H),7.73(d,J＝7.0Hz,2H),7.24-7.64(m,9H),5.05-5.14(m,2H),4.48-4.62(m,4H),4.16-4.34(m,3H),3.54-3.72(m,4H)。
步骤2：1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸(e-4)
向化合物e-3(400mg，818umol)在乙醇(10.0mL)和乙酸乙酯(10.0mL)中的混合物中加入干燥的Pd/C(0.05g)，然后将反应混合物在25℃下在氢气氛(15psi)中搅拌5小时。TLC(DCM/MeOH＝10:1，Rf＝0.2)显示化合物e-3耗尽并形成了一个新的点。将反应混合物通过硅藻土过滤，并将滤液减压浓缩，得到白色固体的化合物e-4(300mg，产率91.9％)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.90(d,J＝7.4Hz,2H),7.73(d,J＝7.0Hz,2H),7.24-7.64(m,4H),5.05-5.14(m,2H),4.48-4.62(m,2H),4.16-4.34(m,3H),3.54-3.72(m,4H)。
步骤3：(11S)-11-苄基-24-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-7,10,13,16-四氧代-19-(三氟甲基)-4-氧杂-6,9,12,15,18-五氮杂二十四烷-1-酸(e-5，即L-1-3)
向含有CTC-树脂(0.50g，14.1mmol)和化合物e-4(0.20g，520umol)的混合物中，加入DIEA(0.25g，1.95mmol)、DCM(10.0mL)进行溶胀。将树脂混合2小时，然后加入MeOH(5.00mL)并混合30分钟。然后，树脂用DMF(10.0mL)洗涤3次。将树脂用DMF中的20％哌啶处理30分钟以进行Fmoc脱保护。树脂用DMF洗涤5次。然后加入Fmoc-Phe-OH(0.58g，1.31mmol)并混合30秒，然后加入HBTU(0.54g，1.43mmol)和DIEA(0.25g，1.95mmol)的DMF溶液，氮气鼓泡30分钟。树脂用DMF洗涤3次。对接下来的氨基酸Fmoc-Gly-OH(0.53g，1.50mmol)和特殊氨基酸2-((7-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-1,1,1-三氟庚烷-2-基)氨基)乙酸(0.20g，1.31mmol)在25℃下的偶联重复上述步骤。通过茚三酮试验检测反应。通过茚三酮显色反应监测偶联反应。用10.0mLMeOH洗涤并真空干燥后。向含有肽树脂的烧瓶中加入20.0mL裂解缓冲液(20％HFIP/80％ DCM)，搅拌2分钟2次。在真空中除去HFIP混合物，得到残留物。通过快速色谱法(10-50％H2O/CH3CN洗脱液，C-18柱色谱)纯化残留物。然后将所得产物冷冻干燥，得到白色固体的化合物e-5(30.0mg，产率4.39％)。
步骤4：(德鲁替康类似物1-3)
向化合物e-5(27.2mg，37.6umol)在DMF(1.00mL)中的溶液中加入HATU(9.30mg，24.4umol)。将反应混合物在25℃下搅拌20分钟。向反应混合物中加入依喜替康甲磺酸盐(10.0mg，18.8umol)和DIEA(4.86mg，37.6umol)，并在40℃下保持2小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.4)显示反应完成。在真空中除去痕量的DMF，得到残留物。通过快速色谱法(10-50％H2O/CH3CN洗脱液，C-18柱色谱)纯化残留物。然后将所得产物冷冻干燥，得到浅黄色固体的德鲁替康类似物1-3(7.20mg，34.7％产率)。
化合物1-4(在图6中也称为德鲁替康类似物1-4)的合成
步骤1：(S)-1-(9H-芴-9-基)-11-甲基-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸甲酯(f-3)
向乙酸(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)甲酯(5g，13.5mmol)和(S)-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯(3.21g，27.1mmol)在四氢呋喃(50.0mL)中的混合物中加入4-甲基苯磺酸水合物(129mg，678umol)，然后将混合物在25℃下搅拌1小时。LC-MS显示原料被完全消耗，并检测到一个具有所期望质量的主峰。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残留物。得到黄色油状化合物(S)-1-(9H-芴-9-基)-11-甲基-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸甲酯，f-3(4.79g，11.2mmol，82.7％产率)。
步骤2：(S)-1-(9H-芴-9-基)-11-甲基-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸(f-4)
向(S)-1-(9H-芴-9-基)-11-甲基-3,6-二氧-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸甲酯，f-3(4.79g，11.2mmol)在四氢呋喃(20.0mL)和水(20.0mL)的溶液中的溶液中加入氢氧化锂一水合物(942mg，22.4mmol)，将混合物在25℃下搅拌2小时。LC-MS显示原料被完全消耗，并检测到一个具有所期望质量的主峰。加入乙酸酸化，然后加入铵碱化，然后加入(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)9H-芴-9-基甲基碳酸酯(8.21g，24.3mmol)和碳酸氢钠(2.04g，24.3mmol)。将混合物在25℃下搅拌2小时。LC-MS显示原料被完全消耗，并检测到一个具有所期望质量的主峰。TLC(二氯甲烷/甲醇＝10:1，Rf＝0.3)显示原料耗尽并形成了一个新的点。将反应混合物减压浓缩以除去水和四氢呋喃，得到残留物。粗产物通过柱色谱法纯化(SiO2，二氯甲烷/甲醇＝100/1至20/1)，得到浅黄色液体的浅黄色油状物(S)-1-(9H-芴-9-基)-11-甲基-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸，f-4(1.25g，3.03mmol，12.45％产率)。
步骤3：(11S)-11-苄基-24-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-甲基-7,10,13,16-四氧代-19-(三氟甲基)-4-氧杂-6,9,12,15,18-五氮杂二十四烷-1-酸(f-5，即L-1-4)
向含有CTC-树脂(1.5g，1.50mmol)和(S)-1-(9H-芴-9-基)-11-甲基-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-12-酸，f-4(0.60g，1.50mmol)的混合物中，加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(6.00mmol)、二氯甲烷(10.0mL)进行溶胀。将树脂混合2小时，然后加入甲醇(5.00mL)并混合30分钟。然后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺(10.0mL)洗涤5次。将树脂用N,N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶处理30分钟以进行Fmoc脱保护。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次。然后加入Fmoc-Phe-OH(4.50mmol)并混合30秒，然后加入O-苯并三唑-N,N,N-四甲基-脲鎓(uronium)-六氟磷酸盐(HBTU)(4.50mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(9.00mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液，氮气鼓泡30分钟。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次。对接下来的氨基酸Fmoc-Gly-OH(0.53g，4.50mmol)和特殊氨基酸2-((7-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-1,1,1-三氟庚烷-2-基)氨基)乙酸(0.20g，1.31mmol)在25℃下的偶联重复上述步骤。通过茚三酮试验检测反应。通过茚三酮显色反应监测偶联反应。用10.0mL甲醇洗涤并真空干燥后，向含有肽树脂的烧瓶中加入20.0mL裂解缓冲液(20％ HFIP/80％ DCM)，搅拌2分钟2次。在真空中除去HFIP混合物，得到残留物。通过快速色谱法(10-50％H2O/CH3CN洗脱液，C-18柱色谱)纯化残留物。然后将所得产物冷冻干燥，得到白色固体的(11S)-11-苄基-24-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-甲基-7,10,13,16-四氧代-19-(三氟甲基)-4-氧杂-6,9,12,15,18-五氮杂二十四烷-1-酸，f-5，(167mg，产率9.80％)。
步骤4：(德鲁替康类似物1-4)
向(11S)-11-苄基-24-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-甲基-7,10,13,16-四氧代-19-(三氟甲基)-4-氧杂-6,9,12,15,18-五氮杂二十四烷-1-酸，f-5(20.0mg，28.6umol)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)(7.79mg，57.2umol)在N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)中的混合物中加入依喜替康甲磺酸盐(15.2mg，28.6umol)，N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(21.6mg，171umol，26.5uL)和N,N-二异丙乙胺(DIEA)(7.40mg，57.2umol，9.97uL)，然后将混合物在25℃下搅拌3小时。LC-MS显示原料被完全消耗，并检测到一个具有所期望质量的主峰。过滤反应混合物以除去未溶解的残留物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残留物。然后将所得产物冷冻干燥，得到浅黄色固体的德鲁替康类似物1-4(6mg，5.20umol，产率18.1％，纯度96.2％)。
化合物1-8(在图7中也称为德鲁替康类似物1-8)的合成
步骤1：2-(2-(苄氧基)乙氧基)丙酸苄酯(g-2)
在0℃下，在N2中分批向搅拌中的DMF(100mL)中加入NaH(3.33g，83.2mmol，60％纯度)。在0℃下将(2S)-2-羟基丙酸苄酯(d-2，10.0g，55.5mmol)滴加到上述溶液中，并在25℃下搅拌0.5小时。然后，在0℃将2-溴乙氧基甲苯(14.3g，66.6mmol)加入到上述溶液中。将反应在25℃下搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝5:1，Rf＝0.2)显示反应完全。通过加入0℃的水(1000mL)使反应混合物淬灭，并用二氯甲烷(200mL x3)萃取。合并的有机层用盐水(200mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过柱色谱法(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝50/1至5/1)纯化，得到无色油状的2-(2-(苄氧基)乙氧基)丙酸苄酯，g-2(790mg，4.53％产率)。δppm 7.29-7.43(m,10H),5.10-5.30(m,2H),4.58(d,J＝2.01Hz,2H),4.14(q,J＝6.86Hz,1H),3.75-3.87(m,1H),3.60-3.73(m,3H),1.47(d,J＝7.03Hz,3H)。
步骤2：2-(2-羟基乙氧基)丙酸(g-3)
将100mL圆底烧瓶用Ar吹扫3次，并小心地加入干燥的Pd/C(160mg)。然后加入甲醇(～10.0mL)以完全渗透Pd/C，然后在Ar中缓慢加入(2S)-2-(2-(苄氧基)乙氧基)丙酸苄酯，g-2(790mg，2.51mmol)在MeOH(20.0mL)中的溶液。将所得混合物脱气并用H2吹扫3次，然后在25℃下在H2气氛下搅拌混合物4小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝5:1，Rf＝0.2)显示反应完全。过滤反应物并在减压下浓缩，得到浅黄色液体的产物2-(2-羟基乙氧基)丙酸，g-3(320mg，粗品)，粗品直接用于下一步，无需进行纯化。1H NMR(400MHz,DMSO):δppm 4.02(q,J＝6.78Hz,1H),3.66-3.70(m,2H),3.60-3.66(m,1H),3.49-3.56(m,1H),1.39(d,J＝7.03Hz,3H)。
步骤3：2-(2-羟基乙氧基)丙酸苄酯(g-4)
将(2S)-2-(2-羟基乙氧基)丙酸，g-3(320mg，2.39mmol)溶于MeOH(4mL)和H2O(0.8mL)并在该溶液中加入Cs2CO3(389mg，1.19mmol)。将混合物在25℃下搅拌0.5小时并浓缩。然后加入溴甲苯(449毫克，2.62毫摩尔)和DMF(2毫升)。将混合物在25℃下搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝3:1，Rf＝0.4)显示反应完全。用水(50.0mL)稀释混合物，并用DCM(30mL x 3)萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱法(100-200目硅胶)纯化，用(石油醚/乙酸乙酯＝20/1至5/1)洗脱，得到白色固体的2-(2-羟基乙氧基)丙酸苄酯，g-4(340mg，产率64％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.37(s,5H),5.15-5.26(m,2H),4.04-4.15(m,1H),3.71-3.76(m,2H),3.60-3.68(m,2H),1.46(d,J＝7.03Hz,3H)。
步骤4：1-(9H-芴-9-基)-13-甲基-3,6-二氧代-2,9,12-三氧杂-4,7-二氮杂十四烷-14-酸苄酯(g-6)
向乙酸[[2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)乙酰基]氨基]甲酯(a-3)(614mg，1.67mmol)在THF(8mL)中的溶液中加入TsOH.H2O(14.4mg，75.8umol)和2-(2-羟基乙氧基)丙酸苄酯，g-4(340mg，1.52mmol)。将混合物在25℃下搅拌6小时。减压浓缩该反应混合物，以去除溶剂。残留物用饱和NaHCO3(50.0mL)稀释，并用DCM(30mL x 3)萃取。合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残留物。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1:1，Rf＝0.4)显示反应完全。残留物通过硅胶柱色谱法(100-200目硅胶)纯化，用(石油醚/乙酸乙酯＝20/1至5/1)洗脱，得到白色固体的1-(9H-芴-9-基)-13-甲基-3,6-二氧代-2,9,12-三氧杂-4,7-二氮杂十四烷-14-酸苄酯，g-6(416mg，781umol，产率51.5％)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.77(d,J＝7.53Hz,2H),7.61(br d,J＝7.28Hz,2H),7.39-7.43(m,2H),7.28-7.38(m,7H),7.21(br s,1H),5.53(br s,1H),5.19(s,2H),4.93-5.03(m,1H),4.67(br s,1H),4.44(d,J＝7.03Hz,2H),4.22-4.27(m,1H),4.05(q,J＝7.03Hz,1H),3.92(br s,2H),3.76(br s,1H),3.71(br d,J＝9.03Hz,2H),3.55(br d,J＝8.53Hz,1H),1.44(d,J＝6.78Hz,3H)。
步骤5：1-(9H-芴-9-基)-13-甲基-3,6-二氧代-2,9,12-三氧杂-4,7-二氮杂十四烷-14-酸(g-7)
将100mL圆底烧瓶用Ar吹扫3次，并小心地加入干燥的Pd/C(60mg)。然后加入THF(5mL)以完全渗透Pd/C，然后在Ar下缓慢加入1-(9H-芴-9-基)-13-甲基-3,6-二氧代-2,9,12-三氧杂-4,7-二氮杂十四烷-14-酸苄酯，g-6(416mg，781umol)在THF(10mL)中的溶液。将所得混合物脱气并用H2吹扫3次，然后在H2(15psi)中在25℃下搅拌2小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1:1，Rf＝0.4)显示反应完全。过滤反应物并在减压下浓缩，得到白色胶状的产物1-(9H-芴-9-基)-13-甲基-3,6-二氧代-2,9,12-三氧杂-4,7-二氮杂十四烷-14-酸，g-7(320mg，92.6％产率)，粗产物用于下一步而不纯化。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.77(d,J＝7.53Hz,2H),7.60(br d,J＝7.28Hz,2H),7.38-7.44(m,2H),7.29-7.35(m,2H),5.48-5.65(m,1H),4.95(br s,1H),4.70(dd,J＝10.54,6.02Hz,1H),4.42-4.52(m,2H),4.23(t,J＝6.78Hz,1H),4.02(q,J＝6.86Hz,1H),3.94(br s,1H),3.83-3.92(m,1H),3.75-3.82(m,2H),3.73(br d,J＝6.78Hz,2H),3.58-3.67(m,1H),1.42-1.48(m,3H)。
步骤6：(13S)-13-苄基-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-甲基-9,12,15,18-四氧代-21-(三氟甲基)-3,6-二氧杂-8,11,14,17,20-五氮杂二十六烷-1-酸(g-8，即L-1-8)
肽合成：
使用标准Fmoc化学合成肽。
1)向含有CTC树脂(1.5mmol，1.5g，Sub＝1.01mmol/g)和1-(9H-芴-9-基)-13-甲基-3,6-二氧代-2,9,12-三氧杂-4,7-二氮杂十四烷-14-酸(0.6g，1.5mmol 1.0当量)的容器中加入DCM，同时N2鼓泡。
2)滴加DIEA(4.0当量)并混合2小时。
3)加入MeOH(0.5mL)并混合30分钟。
4)沥干并用DMF洗涤5次。
5)加入20％哌啶/DMF并反应30分钟。
6)沥干并用DMF洗涤3次。
7)加入Fmoc氨基酸溶液并混合30秒，然后加入活化缓冲液，N2鼓泡约0.5小时。
8)对接下来的氨基酸偶联重复步骤5至7。
注：
使用DMF中的20％哌啶进行Fmoc脱保护30分钟。通过茚三酮测试监测偶联反应，并用DMF洗涤树脂5次。
肽的剪切和纯化：
1)将树脂用MeOH洗涤3次，并通过真空干燥。
2)向肽树脂中加入剪切缓冲液(20％HFIP/DCM)，搅拌0.5小时3次。
3)DCM在减压下浓缩。
4)将肽在高真空中干燥2小时，得到化合物g-8(100mg，90％)。
步骤7：(德鲁替康类似物1-8)
向化合物g-8(20.0mg，27.5umol)在DMF(200uL)中的溶液中加入DIC(19.8mg，157umol)、HOAT(7.12mg，52.3umol)、(10S)-23-氨基-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四烷-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烷-5,9-二酮(13.9mg,26.1umol,MsOH)和DIEA(6.76mg,52.3umol)。将混合物在25℃下搅拌8小时。LC-MS显示化合物g-8被完全消耗，并检测到一个具有所期望m/z的主峰。在真空中除去痕量的N,N-二甲基甲酰胺，得到残留物。通过快速色谱法(10-50％H2O/CH3CN洗脱液，C-18柱色谱)纯化残留物。然后将所得产物冷冻干燥，得到浅黄色固体的化合物德鲁替康类似物1-8(12mg，10.5umol)。LCMS(ESI,m/z)：1145.4[M+H]+：1146.6(Xbrige C18,3.5um,2.1*30mm色谱柱，波长:UV220 nm&254nm；柱温:30℃)用水中的0.1％TFA:乙腈中的0.1％ TFA洗脱(10-80_2分钟)。HPLC(Gemini-NX C18 5um110A 150*4.6mm色谱柱,波长:UV 220nm&254nm；柱温:30℃)用水中的0.1％ TFA :乙腈中的0.1％ TFA洗脱(40-70_20+3分钟)。
化合物3-4(在图8中也称为德鲁替康类似物3-4)的合成
步骤1：(S)-2-乙酰氨基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(h-3)
向(2S)-2-乙酰氨基-6-氨基-己酸(2.00g，10.6mmol)在饱和NaHCO3(50mL)中的溶液中加入2,5-二氧代吡咯-1-羧酸甲酯(1.65g，10.6mmol)。将混合物在25℃下搅拌4小时。LC-MS显示化合物h-1被完全消耗，并检测到一个具有所期望m/z的主峰。通过加入0℃的H2SO4至PH＝3-4使反应混合物淬灭，然后用EA(100mL x 3)萃取。合并的有机层用盐水(50mLx 1)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过柱色谱法(硅胶，DCM/MeOH＝100/1至20/1)纯化，得到(S)-2-乙酰氨基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸，h-3(460mg，1.71mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 6.71(s,2H),6.30(br d,J＝7.28Hz,1H),4.48-4.59(m,1H),3.54(t,J＝6.78Hz,2H),2.08(s,3H),1.90-2.00(m,1H),1.75-1.84(m,1H),1.56-1.70(m,2H),1.31-1.45(m,2H)。
步骤2：(19S)-10-苄基-19-(4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基)-6,9,12,15,18,21-六氧代-3-氧杂-5,8,11,14,17,20-六氮杂二十二烷-1-酸(h-4，即L-3-4)
肽合成：
使用标准Fmoc化学合成肽。
1)向含有CTC树脂(0.5mmol，0.5g，Sub＝1.01mmol/g)和1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷-11-酸(0.2g，0.5mmol，1.0当量)的容器中加入DCM，同时N2鼓泡。
2)滴加DIEA(4.0当量)并混合2小时。
3)加入MeOH(0.5mL)并混合30分钟。
4)沥干并用DMF洗涤5次。
5)加入20％哌啶/DMF并反应30分钟。
6)沥干并用DMF洗涤3次。
7)加入Fmoc氨基酸溶液并混合30秒，然后加入活化缓冲液，N2鼓泡约0.5小时。
8)对接下来的氨基酸偶联重复步骤5至7。
注：
使用DMF中的20％哌啶进行Fmoc脱保护30分钟。通过茚三酮测试监测偶联反应，并用DMF洗涤树脂5次。
肽的剪切和纯化：
1)将树脂用MeOH洗涤3次，并通过真空干燥。
2)向肽树脂中加入剪切缓冲液(20％HFIP/DCM)，搅拌0.5小时3次。
3)DCM在减压下浓缩。
4)将肽在高真空中干燥2小时，得到化合物h-4(100mg，95％)。
步骤3：(德鲁替康类似物3-4)
向化合物h-4(20.0mg，29.7umol)在DMF(500μL)中的溶液中加入DIC(15.6mg，124umol)、依喜替康甲磺酸盐(13.2mg，24.7ummol)和HOBt(3.68mg，27.2umol)。将混合物在25℃下搅拌16小时。TLC(DCM/MeOH＝10/1，Rf＝0.4)显示反应完成。在真空中除去痕量的N,N-二甲基甲酰胺，得到残留物。通过快速色谱法(10-50％H2O/CH3CN洗脱液，C-18柱色谱)纯化残留物。然后将所得产物冷冻干燥，得到浅黄色固体的化合物德鲁替康类似物3-4(7mg，6.42umol)。LCMS(ESI,m/z)：1090.4[M+H]+：1091.4(Xbrige C18,3.5um,2.1*30mm色谱柱，波长:UV220 nm&254nm；柱温:30℃)用水中的0.1％TFA:乙腈中的0.1％ TFA洗脱(10-80_2min)。HPLC(Gemini-NX C18 5um 110A 150*4.6mm色谱柱,波长:UV 220nm&254nm；柱温:30℃)用水中的0.1％ TFA:乙腈中的0.1％ TFA洗脱(25-55_20+3分钟)。
(d)“原有连接子-载荷”的合成
在本公开的上下文中，术语“原有连接子-载荷”(在下文中也称为“原有-LP”或“nat-LP”)是指具有以下结构的化合物：
原有-LP与Enhertu中的德鲁替康具有相同的结构，均含有马来酰亚胺-GGFG连接子。在该实施例中，原有-LP以“德鲁替康”的名称从MedChemExpress购得。
实施例2：抗体-药物偶联物的合成
抗体-药物偶联物按照以下一般程序合成：首先用2～20当量的TCEP还原pH7 PBS溶液中的抗体，持续0.5至18小时；在通过柱或膜去除或不去除残留的TCEP的情况下，引入过量的连接子-载荷(15～18摩尔过量)；在4℃至室温(RT)的温度范围内，偶联反应在半小时到几个小时内完成，然后进行HPLC纯化以提供最终的ADC产物。
注：1：表示为Ab，后面是每个连接子-载荷部分的数字代码
2：摩尔比
3：以下也称为“Her-Dxd”或“Her-nat-LP”
实施例3：连接子-载荷的剪切
方法
反应缓冲液(40mM H3PO4/H3BO3/HAc，1mM EDTA，pH 4.5)，135mM半胱氨酸，DMA(N,N’-二甲基乙酰胺，2％，v/v)，样品(0.015μmol连接子-载荷化合物)和组织蛋白酶B(最终16U/μmol连接子-载荷化合物)被依次加入1.5mL EP管。由此形成的300μL裂解系统中半胱氨酸的最终浓度为10mM。将EP管置于37℃水浴中。
裂解约15分钟(min)、2小时(hr)、5小时和16小时后，将混合物充分涡旋搅拌，然后取样(25μL)。向采得的混合物样本中加入组织蛋白酶B抑制剂E64(与组织蛋白酶B相比为2.5当量)将蛋白酶B灭活，然后进行RP-HPLC和RP-MS分析。由裂解连接子-载荷的峰面积与非裂解加裂解连接子-载荷面积(如RP-HPLC和RP-MS测得)之和之比计算剪切百分比。
结果
表1汇总了约16小时间(过夜)的剪切情况(以百分比表示)，显示的是连接子-载荷之间组织蛋白酶B消化效率的比较。结果显示，参检的本发明连接子-载荷的剪切都比原有连接子-载荷快，至少相当(化合物3-1)。
表1
在图9中，分图(a)显示与原有连接子-载荷相比，化合物1-1中连接子部分的剪切位点和修饰；分图(b)显示剪切百分比，基于反相HPLC色谱(混合模式)检测的释出药物峰面积算得。与表1中的结果一致，本发明的连接子-载荷被剪切得更快。
实施例4：ADC中连接子-载荷部分的剪切
方法
反应条件与实施例3中连接子-载荷化合物本身裂解所述一样。具体而言，反应缓冲液(40mM H3PO4/H3BO3/HAc，1mM EDTA，pH 4.5)，135mM半胱氨酸，DMA(2％，v/v)，样品(0.015μmol ADC)和组织蛋白酶B(16U/μmol ADC)被依次加入1.5mL EP管。由此形成的300μL裂解系统中半胱氨酸的最终浓度为10mM。将EP管置于37℃水浴中。
裂解10min、5hr、24hr和48hr后，混合物充分涡旋搅拌，然后取样25μL。向采得的混合物样本中加入组织蛋白酶抑制剂E64(与组织蛋白酶B相比为2.5当量)将蛋白酶B灭活，然后进行反相LC-MS分析。基于质谱MS测得的DAR降低来计算裂解率。
结果
经时消化百分比汇总于表2，显示ADC中不同连接子-载荷部分组织蛋白酶B消化效率比较。显然，含连接子-载荷1-2、1-3、3-1和3-4的ADC在组织蛋白酶B存在下药物释放更快。值得注意的是，另一裂解实验中用混合模式柱来定量剪切释放的药物，结果显示含连接子-载荷部分1-1的ADC药物的释放略快于含原有连接子-载荷的ADC。
表2
在图10中，分图(a)显示与ADC中的原有连接子-载荷相比ADC中连接子-载荷部分的剪切位点和修饰，分图(b)显示ADC中连接子-载荷的经时剪切百分比(％)，该百分比基于药物释放峰面积来计算(同上)。48小时后，ADC-1-1(即含有连接子-载荷1-1的ADC)的裂解百分比为18.5％，ADC-原有LP则为15.5％。
实施例5：冻融稳定性
方法
取出-80℃冻存的Eppendorf管内的ADC样品(～10mg/mL，溶于20mM组氨酸、150mMNaCl，pH6.0)，室温解冻30分钟。然后将ADC样品-80℃冻存2天，接着室温解冻30分钟；如此冻/融过程再重复一次。然后，各样品取20μl进行SEC与MS测定DAR和药物分布。根据物质的峰面积测定各样品中各种物质(L0、L1、L2、H0、H1、H2、H4等，其中“L”指轻链，“H”指重链，数字指链上连接的药物分子数)的百分比(摩尔比)。
结果
两轮冻融(F/T)循环后，不需要的杂质生成物比如L2(轻链连有两个药物分子的ADC)和H4(重链连有四个药物分子的ADC)的改变和DAR改变汇总于表3。结果显示，两轮冻融循环后，含本发明连接子-载荷的ADC中L2仍然为零(0)，Her-Dxd(即德喜曲妥珠单抗)中L2则升至0.76％。Her-Dxd中的H4％也是最高的。含连接子-载荷1-8的ADC两轮冻融循环后的DAR下降最小。总体而言，冻融循环后8种ADC类似物中不需要的H4含量都低于Her-Dxd且都保持了稳定的DAR。
表3
注：“Her”＝“赫赛汀(Herceptin)”亦即“曲妥珠单抗”；“新鲜”指新合成后未经冻融循
环的ADC。
实施例6：ADC中H4的检测
方法
将ADC配制在20mM组氨酸缓冲液(含150mM NaCl，pH6.0)中。对所得ADC样品进行LC-MS分析测定药物在轻链和重链上的分布。理想的是只测到5种物质即L0、H0、L1、H1和H2。HPLC检测聚集百分比。
结果
表4显示ADC之间非特异性杂质H4％的比较。用原有连接子-载荷制得的德喜曲妥珠单抗即Her-Dxd对照在合成后的H4％(摩尔比)为3％，Her-1-8中该杂质含量显著降低，降至0.8％。如结果所示，用本发明连接子-载荷生产的ADC产品杂质降低。
表4
ADC名称 CADC(mg/ml) MS-DAR H4％ 聚集(％)
Her-Dxd(对照) NA 7.75 3.0 NA
Her-1-2 5.28 7.49 1.9 1.98％
Her-1-4 4.86 7.84 1.4 1.94％
Her-1-8 5.51 7.78 0.8 1.66％
Her-3-4 5.67 7.82 2.5 1.13％
实施例7：未偶联连接子-载荷的清除
如实施例2中所述进行偶联后，用旋转脱盐柱(40kDa)将ADC换液到20mM组氨酸缓冲液(含150mM NaCl，pH6.0)中。表5所示的是用不同连接子-载荷制得的ADC之间游离连接子-载荷(即未偶联的连接子-载荷)清除的比较。用UFDF清除游离连接子-载荷。Her-Dxd(即德喜曲妥珠单抗)偶联产物中残留游离连接子-载荷含量接近5％，但在用本发明连接子-载荷生产的产品中该含量在2％以下。
如结果所示，本发明连接子-载荷提高了纯化的操作性，例如更容易、更彻底地清除ADC偶联产物中的残留游离连接子-载荷。不局限于任何特定理论，据信，在连接子部分引入极性基团提高了连接子-载荷的水溶性，促进其清除，例如由UFDF清除。这对于ADC制造工艺来说有重要意义。
表5
实施例8：亲和力检测
方法
ADC与人类HER2的体外(in vitro)结合力是用FACS(荧光活细胞流式仪)技术来检测的。检测当日，表达HER-2(1×105细胞/孔)的肿瘤细胞与连续稀释的ADC于4℃共孵育1-2小时。按实施例2中所述制备的Her-Dxd作为参照ADC和阳性对照。将用来溶解ADC的缓冲液(20mM组氨酸缓冲液，含150mM NaCl，pH6.0)作为阴性对照。孵育后，用FACS染色缓冲液洗涤细胞，然后加入以FACS染色缓冲液稀释的二抗Alexa647-偶联山羊抗人IgG Fc(Jackson公司)。培养板在4℃避光培养20-60分钟。用流式细胞仪(BD FACS Canto II)测定荧光强度，用FlowJo进行数据分析。用GraphPad Prism计算EC50值。
结果
结果如图11所示。据N87细胞检测，本发明参检ADC的EC50为1nM左右，Her-Dxd则为0.9nM。据JIMT-1细胞检测，本发明参检ADC的EC50为0.4～0.7nM，Her-Dxd则为0.4nM。据MDA-MB-231细胞检测，本发明参检ADC(Her3-1除外)的EC50为0.5～0.7nM，Her-Dxd则为0.6nM。结果显示，具有本发明连接子及具有本发明连接子-载荷的本发明ADC其结合亲和力与德喜曲妥珠单抗至少相当，甚至可以更好。
实施例9：细胞毒性检测
方法
通过体外细胞毒性检测来测定抑制肿瘤细胞生长的能力。肿瘤细胞系NCI-N87、HCC1954、MDA-MB-231和JIMT-1(购自ATCC)按常规培养在RPMI1640培养基或DMEM培养基中。检测的前一日，将细胞按照适宜的细胞密度接种到96孔板上的培养基中。次日，向各孔加入用培养基连续稀释的ADC。将按实施例2中所述制备的Her-Dxd作为参照ADC和阳性对照。将用于溶解ADC的缓冲液用作阴性对照。培养板在培养箱中37℃、5％CO2保温。4-6天后，用CellTiter-Glo(Promega)测定细胞活力。用GraphPad Prism计算IC50值。
结果
结果如图12所示。本发明参检ADC和Her-Dxd都未测得对JIMT-1细胞和MDA-MB-231细胞有细胞毒性(IC50>1nM)，在N87细胞和HCC1954细胞中，全部本发明参检ADC的细胞毒性与原有ADC相当，IC50约0.1nM。结果显示，具有本发明连接子及具有本发明连接子-载荷的本发明ADC其细胞毒性至少与德喜曲妥珠单抗相当。

Claims (18)

1.一种式I的化合物：
其对映异构体、非对映异构体、外消旋体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐或酯；
其中，“*”表示手性中心，其是S-或R-或外消旋的；并且连接到手性碳原子的氢原子和连接到具有R2取代基的碳原子的氢原子从式中省略；
L1是-(CH2)a-，其中a是0至10的整数，或-(CH2CH2O)b-，其中b是1至36的整数；
L2是-(CH2)c-，其中c是1至10的整数，或-(CH2CH2O)d-，其中d是1至36的整数；
L3不存在，或是-(CH2)e-，其中e是1至10的整数，或-(CH2CH2O)f-，其中f是1至36的整数；
R1是-CF3、-NRaRb、-NRa(C＝O)Rb或-O(CH2)gCH3，其中g是0至3的整数，Ra是H或-C1-6烷基，Rb是H或-C1-6烷基；
R2是-H、-C1-6烷基或-O(CH2)hCH3，其中h是0至3的整数；
X是卤素、-OR3或-NR4R5；
R3是-H、-C1-6烷基或卤素；
R4和R5独立地是-H或-C1-6烷基；
n＝0或1；和
m＝0或1。
2.如权利要求1所述的化合物，其中L1是-(CH2)a-，其中a是2至6的整数；
L2是-(CH2)c-，其中c是1至6的整数；
L3不存在，或是-(CH2)e-，其中e是1至6的整数，或-(CH2CH2O)f-，其中f是1至20的整数；
R1是-CF3、-N(CH3)2、-NH(C＝O)CH3或-O(CH2)2CH3；
R2是-H或-C1-6烷基；和/或
R3是-H、-CH3、叔丁基或Cl。
3.如权利要求1所述的化合物，其中L1是-(CH2)a-，a是4至5的整数；
L2是-(CH2)c-，其中c是1至2的整数；
L3不存在，或是-(CH2)e-，其中e是1至2的整数，或-(CH2CH2O)f-，其中f是1至2的整数；
R1是-CF3、-N(CH3)2或-NH(C＝O)CH3；
R2是-H或-CH3；和/或
R3是-H、-CH3、叔丁基或Cl。
4.如权利要求1的化合物，其中所述化合物选自如下所示的组：L-1-1、L-1-2、L-1-3、L-1-4、L-1-7、L-1-8、L-3-1和L-3-4，或其药学上可接受的盐或酯：
其中“*”表示手性中心，其为外消旋的。
5.式II的偶联化合物：
其对映异构体、非对映异构体、外消旋体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐或酯；
其中，“*”表示手性中心，其是S-或R-或外消旋的；并且连接到手性碳原子的氢原子和连接到具有R2取代基的碳原子的氢原子从式中省略；
L1是-(CH2)a-，其中a是0至10的整数，或-(CH2CH2O)b-，其中b是1至36的整数；
L2是-(CH2)c-，其中c是1至10的整数，或-(CH2CH2O)d-，其中d是1至36的整数；
L3不存在，或是-(CH2)e-，其中e是1至10的整数，或-(CH2CH2O)f-，其中f是1至36的整数；
R1是-CF3、-NRaRb、-NRa(C＝O)Rb或-O(CH2)gCH3，其中g是0至3的整数，Ra是H或-C1-6烷基，Rb是H或-C1-6烷基；
R2是-H、-C1-6烷基或-O(CH2)hCH3，其中h是0至3的整数；
n＝0或1；
m＝0或1；和
“DRUG”是共价偶联至连接子部分的药物部分。
6.如权利要求5所述的偶联化合物，其中L1是-(CH2)a-，其中a是2至6的整数；
L2是-(CH2)c-，其中c是1至6的整数；
L3不存在，或是-(CH2)e-，其中e是1至6的整数，或-(CH2CH2O)f-，其中f是1至20的整数；
R1是-CF3、-N(CH3)2、-NH(C＝O)CH3或-O(CH2)2CH3；和/或
R2是-H或-C1-6烷基。
7.如权利要求5所述的偶联化合物，其中L1是-(CH2)a-，其中a是4至5的整数；
L2是-(CH2)c-，其中c是1至2的整数；
L3不存在，或是-(CH2)e-，其中e是1至2的整数，或-(CH2CH2O)f-，其中f是1至2的整数；
R1是-CF3、-N(CH3)2或-NH(C＝O)CH3；和/或
R2是-H或-CH3。
8.如权利要求5所述的偶联化合物，其具有式IIa的结构：
其对映异构体、非对映异构体、外消旋体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐或酯；其中，“*”、L1、L2、L3、R1、R2、n和m如权利要求5中所定义。
9.如权利要求5所述的偶联化合物，其具有选自下组的结构：
其中“*”表示手性中心，其为外消旋的。
10.式III的抗体-药物偶联物：
其对映异构体、非对映异构体、外消旋体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐或酯；
其中，“*”表示手性中心，其是S-或R-或外消旋的并且连接到手性碳原子的氢原子和连接到具有R2取代基的碳原子的氢原子从式中省略；
L1是-(CH2)a-，其中a是0至10的整数，或-(CH2CH2O)b-，其中b是1至36的整数；
L2是-(CH2)c-，其中c是1至10的整数，或-(CH2CH2O)d-，其中d是1至36的整数；
L3不存在，或是-(CH2)e-，其中e是1至10的整数，或-(CH2CH2O)f-，其中f是1至36的整数；
R1是-CF3、-NRaRb、-NRa(C＝O)Rb或-O(CH2)gCH3，其中g是0至3的整数，Ra是H或-C1-6烷基，Rb是H或-C1-6烷基；
R2是-H、-C1-6烷基或-O(CH2)hCH3，其中h是0至3的整数；
n＝0或1；
m＝0或1；
“DRUG”是共价偶联至连接子部分的药物部分；
p是1至8，以及
Ab是抗体。
11.如权利要求10所述的抗体-药物偶联物，其中L1是-(CH2)a-，其中a是2至6的整数；
L2是-(CH2)c-，其中c是1至6的整数；
L3不存在，或是-(CH2)e-，其中e是1至6的整数，或-(CH2CH2O)f-，其中f是1至20的整数；
R1是-CF3、-N(CH3)2、-NH(C＝O)CH3或-O(CH2)2CH3；
R2是-H或-C1-6烷基；和/或
p是2、4或6。
12.如权利要求10所述的抗体-药物偶联物，其中L1是-(CH2)a-，其中a是4至5的整数；
L2是-(CH2)c-，其中c是1至2的整数；
L3不存在，或是-(CH2)e-，其中e是1至2的整数，或-(CH2CH2O)f-，其中f是1至2的整数；
R1是-CF3、-N(CH3)2或-NH(C＝O)CH3；
R2是-H或-CH3；
“DRUG”是依喜替康；
p是4；和/或
Ab是曲妥珠单抗。
13.如权利要求10所述的抗体-药物偶联物，其具有选自下组的结构：
/>
其中“*”表示手性中心，其为外消旋的。
14.如权利要求13所述的抗体-药物偶联物，其中，p是2、4或6；和/或Ab是曲妥珠单抗。
15.一种生产连接子-载荷化合物的方法，其包括将药物与权利要求1所述的化合物偶联。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述药物是依喜替康。
17.一种生产抗体-药物-偶联物的方法，其包括：
(a)将药物与权利要求1所述的化合物偶联以获得连接子-载荷化合物；和
(b)将抗体与步骤(a)中获得的连接子-载荷化合物偶联。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述药物是依喜替康。
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