CN109879916A - 阳离子醚化单宁酸及其制备方法以及基因体外释放载体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种阳离子醚化单宁酸及其制备方法以及基因体外释放载体，所述阳离子醚化单宁酸为具有结构式(1)所示结构的化合物。本发明提供的阳离子醚化单宁酸具有确定的分子结构式，从而在制备过程中可以通过常规的分离纯化手段得到纯度较高的产物，该产物用作基因组载体材料时使用剂量可控，解决了现有基因载体材料在实际应用时剂量不可控的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种阳离子醚化单宁酸及其制备方法以及基因体外释放载体。
背景技术
基因治疗是将外源基因导入体内靶细胞从而达到预防或治疗目的的方法，其中基因载体是限制基因治疗发展的主要瓶颈之一，发展安全、高效的基因载体仍是突破基因治疗发展困境的主要研究热点。
现有基因载体主要包括病毒型和非病毒型两类，其中病毒型载体由于具有免疫原性、致癌性等缺点导致其应用和发展受到限制。因此，非病毒型基因载体的研究越来越受到重视，研究者对多种不同材料作为基因载体做了大量的工作和尝试，材料类型主要包括：阳离子脂质体、多聚阳离子有机高分子化合物、无机纳米粒子等材料，但这些材料普遍存在制备及表征过程复杂、毒性高、生物兼容性差等缺陷，仍然不能解决当前基因治疗发展对基因载体的要求。尤其是现有的多聚阳离子载体及无机纳米类载体，由于其制备过程复杂、分子量大，所制备的材料往往以不同分子量或粒径的混合物形式呈现，导致该类材料在实际应用到基因载体中时质量难以控制，故而很难准确地把握其使用剂量。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种阳离子醚化单宁酸及其制备方法，旨在解决现有基因载体材料在实际应用时使用剂量不可控的问题。
为实现上述目的，本发明提出一种阳离子醚化单宁酸，所述阳离子醚化单宁酸为具有以下结构式(1)所示结构的化合物：
为实现上述目的，本发明还提出一种如上所述的阳离子醚化单宁酸的制备方法，包括以下步骤：
步骤S10、将单宁酸溶解于氢氧化钠的水溶液中，得到单宁酸溶液；
步骤S20、向所述单宁酸溶液中加入吡啶和3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵，在45～55℃温度下搅拌反应20～30h，得产物溶液；
步骤S30、对所述产物溶液进行分离纯化，得到阳离子醚化单宁酸。
优选地，在步骤S10中：所述单宁酸与所述氢氧化钠的摩尔比为1：(1～1.2)。
优选地，在步骤S20中：所述单宁酸、吡啶和3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的摩尔比为1：(25～35)：(1～1.5)。
优选地，步骤S20具体包括：
将所述单宁酸溶液在水浴环境中加热至45～55℃后，在搅拌作用下向所述单宁酸溶液中先加入吡啶，然后加入3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的水溶液，添加完毕后搅拌反应20～30h，得产物溶液。
优选地，在步骤S20中：所述3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的水溶液中的3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的质量百分比为65～70％。
优选地，步骤S30包括：
步骤S31、将所述产物溶液冷却至室温后装入透析袋中，先采用流水进行透析，然后采用去离子水进行透析，直至透出液中不含有季铵盐为止，收集截留液；
步骤S32、对所述截留液进行低温真空浓缩后，将浓缩产物先进行预冷冻后再冷冻干燥，得到的干燥产物即为阳离子醚化单宁酸。
优选地，在步骤S31中：所述透析袋的截留分子量为400～600；和/或，
采用流水进行透析的透析时间为20～30h，采用去离子水进行透析的透析时间为10～15h，且在采用去离子水进行透析的过程中，每1.5～2.5h更新一次透出液。
优选地，在步骤S32中：所述预冷冻的冷冻温度为-25～-15℃、冷冻时间为20～28h。
本发明还提出一种基因体外释放载体，所述基因体外释放载体包括如上所述的阳离子醚化单宁酸。
本发明提供的技术方案中，所述阳离子醚化单宁酸具有确定的分子结构式，从而在制备过程中可以通过常规的分离纯化手段得到纯度较高的产物，该产物用作基因组载体材料时使用剂量可控，解决了现有基因载体材料在实际应用时剂量不可控的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的阳离子醚化单宁酸的制备方法的一实施例的流程示意图；
图2至图4为各实施例制备的阳离子醚化单宁酸的电泳测试结果图；
图5为各实施例制备的阳离子醚化单宁酸的DNA释放检测结果图；
图6至图8为各实施例制备的阳离子醚化单宁酸的转染效果检测结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
现有用作基因载体的多聚阳离子载体及无机纳米类材料，由于其制备过程复杂、分子量大，所制备的产物往往以不同分子量或粒径的混合物形式呈现，导致该类材料在实际应用到基因载体中时质量难以控制，故而很难准确地把握其使用剂量。为解决上述问题，本发明提出一种阳离子醚化单宁酸，所述阳离子醚化单宁酸为具有以下结构式(1)所示结构的化合物：
本发明提供的所述阳离子醚化单宁酸具有确定的分子结构式，其理化性质稳定，从而在制备过程中可以通过常规的分离纯化手段得到纯度较高的产物，该产物用作基因组载体材料时使用剂量可控，解决了现有基因载体材料在实际应用时剂量不可控的问题。
进一步地，本发明还提供了一种如上所述的阳离子醚化单宁酸的制备方法，以天然单宁酸和一种阳离子季铵盐作为反应原料，通过一步反应制得，图1所示为本发明提供的所述阳离子醚化单宁酸的制备方法的一实施例。请参阅图1，在本实施例中，所述阳离子醚化单宁酸的制备方法包括以下步骤：
步骤S10、将单宁酸溶解于氢氧化钠的水溶液中，得到单宁酸溶液；
单宁酸是一种天然多酚类物质，具有生物兼容性好、细胞毒性低等先天优势，本实施例中选用的所述单宁酸为具有以下结构式(2)所示结构的化合物，本实施例中采用在其分子末端通过亲和反应修饰季铵盐的方式，得到具有如结构式(1)所示结构的阳离子醚化单宁酸。
在对所述单宁酸进行修饰反应时，首先先将所述单宁酸溶解于碱性溶液中，然后再在催化剂作用下与阳离子季铵盐进行反应，本实施例中采用的碱性溶液为氢氧化钠的水溶液，且在将所述单宁酸溶液与所述氢氧化钠的水溶液中时，采用磁力搅拌的方式加速溶解，所述单宁酸与所述氢氧化钠的摩尔比为1：(1～1.2)。
步骤S20、向所述单宁酸溶液中加入吡啶和3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵，在45～55℃温度下搅拌反应20～30h，得产物溶液；
所述吡啶在反应过程中充当催化剂，所述3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵在反应过程中作为阳离子季铵盐对所述单宁酸的分子末端进行修饰，三者在反应时的添加比例为：所述单宁酸、吡啶和3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的摩尔比为1：(25～35)：(1～1.5)，所述3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的摩尔量不低于所述单宁酸的摩尔量，从而使得所述3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵能够在最大程度上对所述单宁酸的分子末端进行修饰，在本发明提供的一优选实施例中，所述3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的添加量更优选为其摩尔量稍多于所述单宁酸的摩尔量。
进一步地，所述吡啶和所述3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵在添加至所述单宁酸溶液中时，为使三者充分混合均匀，优选为先将所述单宁酸溶液进行预热后，再将所述吡啶在搅拌作用下加入到预热后的单宁酸溶液中，吡啶添加完毕后，再将所述3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵以溶液的形式继续加入到所述单宁酸溶液中。在本实施例中，步骤S20在具体实施时，可采用以下方式进行：将所述单宁酸溶液在水浴环境中加热至45～55℃后，在搅拌作用下向所述单宁酸溶液中先加入吡啶，然后加入3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的水溶液，添加完毕后直接在45～55℃的反应温度下搅拌反应20～30h，得产物溶液。其中，所述3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的水溶液中的3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的质量百分比为65～70％。
步骤S30、对所述产物溶液进行分离纯化，得到阳离子醚化单宁酸。
在反应完成生成目标产物后，可以采用柱层析、透析等有机合成领域的常规分离纯化手段对目标产物进行分离纯化。在本实施例中，对目标产物进行分离纯化的方法为先采用透析膜进行透析，然后再经过浓缩、冷冻和干燥处理的方式，其操作方式较为简单、且分离纯化得到的目标产物的纯度高，在具体实施时，包括以下步骤：
步骤S31、将所述产物溶液冷却至室温后装入透析袋中，先采用流水进行透析，然后采用去离子水进行透析，直至透出液中不含有季铵盐为止，收集截留液；
本实施例中采用的所述透析袋的截留分子量为400～600，使得含有目标产物在内的所述产物溶液中的小分子杂质和未参与反应的物质被透出而得以去除，其中，所述产物溶液的中残留的季铵盐的透出相较于其他杂质略为艰难，故而在透析过程中还通过对透出液及时采用溴酚蓝法检测所述透出液中是否含有季铵盐，其中，溴酚蓝法的具体操作步骤为：取适量透出液，依次加入5mL柠檬酸(10％)、5mL盐酸羟胺，摇匀，静置5min；用氨水调节pH至5～6，加入1mL 2,9-二甲基-1,10-邻二氮杂菲，加入6mL氯仿-异戊醇，震荡3min，分层后向有机相中加入5mL pH为10的缓冲溶液及0.25mL溴酚蓝溶液(溶剂为10％的乙醇水溶液，溴酚蓝的质量浓度为0.5％)，振荡3min，分层后有机相以试剂空白为参比，测定604nm处的吸光度。当检测结果为透出液中不含有季铵盐时，说明被截留在所述透析袋内的产物溶液中未反应完全的季铵盐已经被充分去除，进而确定透析处理最终所需的时间。在本实施例中，通过此种方式最终确定的透析时间为：采用流水进行透析的透析时间为20～30h，采用去离子水进行透析的透析时间为10～15h，且在采用去离子水进行透析的过程中，每1.5～2.5h更新一次透出液。
步骤S32、对所述截留液进行低温真空浓缩后，将浓缩产物先进行预冷冻后再冷冻干燥，得到的干燥产物即为阳离子醚化单宁酸。
经过透析处理后收集的截留液即为包含目标产物的分离纯化产物，先经过低温真空浓缩至刚好有固体物质析出时，对浓缩产物进行干燥处理去除其中的溶剂成分，即可得到目标产物。在本实施例中，采用冷冻干燥的方式对所述截留液进行干燥处理，以避免目标产物在加热干燥过程中可能存在稳定性不佳而出现分解或其他对结构产生影响的问题。进一步地，在本实施例中，在进行冷冻干燥之前，先对所述截留液进行预冷冻，在-25～-15℃温度下冷冻20～28h，使其形成固体状之后再放入冷冻干燥器中在-60～-50℃温度下进行冷冻干燥，得到的干燥产物即为阳离子醚化单宁酸的目标产物。
本发明提供的所述阳离子醚化单宁酸的制备方法，其制备反应过程在水溶液中进行，而未采用有机溶剂等污染较大、分离纯化困难以及后处理工艺难度大的反应溶剂体系，不仅在产物的分离纯化步骤上简化了工艺，还克服了现有非病毒型基因载体在制备过程中存在的生产成本高、对环境不友好等缺点。并且由于所制得的阳离子醚化单宁酸具有明确的分子结构式，其理化性质稳定，因此可以通过透析等常规分离纯化手段对目标产物进行分离纯化，不仅得到的产物纯度高，在用作基因载体材料时能够定量使用，解决了现有基因载体材料在实际应用时剂量不可控的问题，而且与现有多聚阳离子高分子类基因在同一材料相比，具有细胞毒性低、生物兼容性好、水溶性好的优点，还进一步减少了分离纯化过程中有机溶剂的使用，对环境更为友好。
本发明还提出一种基因体外释放载体，所述基因体外释放载体包括如上所述的阳离子醚化单宁酸，所述基因载体可以单独作为基因载体使用，也可以与其他载体材料共同制成基因载体，使用本发明上述提供的阳离子醚化单宁酸用作基因载体材料时，具有细胞毒性低、生物兼容性好、制备成本低、水溶性优良且使用剂量可控的优点，应用范围更为广泛。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)将单宁酸在磁力搅拌下溶解于氢氧化钠的水溶液中，使单宁酸与氢氧化钠的摩尔比为1:1.1，搅拌至单宁酸全部溶解、溶液清澈无不溶物，得到单宁酸溶液；
(2)将步骤(1)得到单宁酸溶液转移至圆底烧瓶中，并放置在50℃水浴中，在搅拌作用下向圆底烧瓶中先滴加吡啶，然后再加入3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的水溶液(3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的质量百分比为69％)，添加完毕后在50℃水浴中搅拌反应24h，得到生成有阳离子醚化单宁酸的产物溶液；其中，单宁酸、吡啶和3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的摩尔比为1:30:1.2；
(3)将步骤(2)得到的产物溶液冷却至室温后装入到截留分子量为500的透析袋中，先采用流水透析24h，然后再采用去离子水透析12h，透析结束后收集截留液进行低温真空浓缩，再将浓缩产物放入温度设置为-20℃的冰箱中预冷冻24h，最后再置于冷冻干燥器中冷冻干燥24h，得阳离子醚化单宁酸。
实施例2
(1)将单宁酸在磁力搅拌下溶解于氢氧化钠的水溶液中，使单宁酸与氢氧化钠的摩尔比为1:1，搅拌至单宁酸全部溶解、溶液清澈无不溶物，得到单宁酸溶液；
(2)将步骤(1)得到单宁酸溶液转移至圆底烧瓶中，并放置在45℃水浴中，在搅拌作用下向圆底烧瓶中先滴加吡啶，然后再加入3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的水溶液(3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的质量百分比为65％)，添加完毕后在45℃水浴中搅拌反应30h，得到生成有阳离子醚化单宁酸的产物溶液；其中，单宁酸、吡啶和3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的摩尔比为1:25:1；
(3)将步骤(2)得到的产物溶液冷却至室温后装入到截留分子量为400的透析袋中，先采用流水透析20h，然后再采用去离子水透析15h，透析结束后收集截留液进行低温真空浓缩，再将浓缩产物放入温度设置为-25℃的冰箱中预冷冻20h，最后再置于冷冻干燥器中冷冻干燥24h，得阳离子醚化单宁酸。
实施例3
(1)将单宁酸在磁力搅拌下溶解于氢氧化钠的水溶液中，使单宁酸与氢氧化钠的摩尔比为1:1.2，搅拌至单宁酸全部溶解、溶液清澈无不溶物，得到单宁酸溶液；
(2)将步骤(1)得到单宁酸溶液转移至圆底烧瓶中，并放置在55℃水浴中，在搅拌作用下向圆底烧瓶中先滴加吡啶，然后再加入3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的水溶液(3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的质量百分比为70％)，添加完毕后在55℃水浴中搅拌反应24h，得到生成有阳离子醚化单宁酸的产物溶液；其中，单宁酸、吡啶和3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的摩尔比为1:35:1.5；
(3)将步骤(2)得到的产物溶液冷却至室温后装入到截留分子量为600的透析袋中，先采用流水透析30h，然后再采用去离子水透析10h，透析结束后收集截留液进行低温真空浓缩，再将浓缩产物放入温度设置为-15℃的冰箱中预冷冻28h，最后再置于冷冻干燥器中冷冻干燥24h，得阳离子醚化单宁酸。
分别取上述实施例1至3制得的阳离子醚化单宁酸，溶解于去离子水中制成样品储液，测试其用作基因载体的性能，测试方法及结果如下：
(1)阳离子醚化单宁酸凝聚DNA的能力
在20mM、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中，分别取适量样品储液与质粒DNA(绿色荧光蛋白质粒，GFP plasmid DNA)按不同质量比混合反应30min，反应结束后加入上样缓冲液，取10μL加样于预制好的1％琼脂糖凝胶上样孔中，设置电压60～90V，电泳时间40～60min；电泳结束后用溴化乙锭染色凝胶，染色后凝胶通过凝胶成像仪观察并拍照，结果如图2至图4所示。其中，图2、图3和图4分别为实施例1、实施例2和实施例3制备的阳离子醚化单宁酸的电泳测试结果图，且图2至图4中，染色条带上方的1:1、2:1、3:1、4:1和5:1表示阳离子醚化单宁酸与DNA的质量比，DNA表示未添加阳离子醚化单宁酸的DNA空白样。
由图2至图4的结果可知，被阳离子醚化单宁酸凝聚的质粒DNA留在凝胶加样孔中，表明DNA被实施例所制备的阳离子醚化单宁酸成功凝聚。
(2)DNA释放检测
取样品储液和DNA(浓度标记为C0)按不同质量比反应30min后，离心(5000r/min)取上清液测定其中的DNA浓度(标记为C1)，得到阳离子醚化单宁酸-DNA复合物，然后将该复合物分散于pH为7.4的Tris-HCl缓冲液中，每隔2h离心取上清液，用超微量核酸检测仪测定其中DNA的量(浓度标记为C2)，按照下述公式计算DNA的释放率：
DNA释放率(％)＝C2/(C0-C1)×100％
DNA的释放率计算结果如图5所示。结果表明各实施例所制备的阳离子醚化单宁酸可以较好的释放DNA，且在12h时释放率基本达到稳定且维持在90％以上。
(3)阳离子醚化单宁酸安全性检测
采用噻唑蓝(MTT)比色法对阳离子醚化单宁酸的安全性进行评价：在96孔板中将细胞(人卵巢癌细胞A2780)培养至生长达到70～80％汇合度时，加入用完全培养基稀释的阳离子醚化单宁酸溶液100μL，浓度依次为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL和1.0mg/mL，在37℃、5％CO2条件下培养24h后，向每孔中加入10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h；然后吸去培养基，用DMSO溶解产生的formazan晶体，用多功能读板器测定其570nm处的吸光度值A1，空白孔的吸光度值A0，每个浓度平行测定三次，将空白孔的细胞存活率定为100％，按照下述公式计算阳离子醚化单宁酸不同浓度下的细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(A1/A0)×100％
细胞存活率的计算结果如表1所示。
表1各实施例制备的DNA释放载体的细胞毒性检测结果
表1的结果表明，本发明实施例制备的阳离子醚化单宁酸无显著细胞毒性，可作为一种安全的DNA基因释放载体。
(3)阳离子醚化单宁酸在细胞内的基因释放检测
通过考察阳离子醚化单宁酸转运绿色荧光蛋白质粒DNA的效率，评价阳离子醚化单宁酸在细胞内释放DNA的能力：
待24孔板中细胞(人卵巢癌细胞A2780)生长至70～80％细胞汇合度时，用DMEM培养基替换完全培养基，按照阳离子醚化单宁酸与DNA的质量比为5:1的比例配置醚化单宁酸/DNA凝聚物，反应30min后滴加入24孔板中，置于37℃、5％CO2的条件下培养4～6h；然后用含血清的完全培养基替换24孔板中的培养基，在相同条件下继续培养24h；再用荧光显微镜在蓝色激发光条件下观察绿色荧光蛋白的表达情况，结果如图6至图8(图6至图8中的白色点状部分即为观测到的绿色荧光表达)和表2所示，其中，图6至图8依次为实施例1、实施例2和实施例3制备的阳离子醚化单宁酸的转染效果检测结果图。
表2各实施例制备的DNA释放载体的转染效果检测结果
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 转染率(％) | 26.46 | 24.20 | 21.89 |
图6至图8以及表2的结果表明，大量的绿色荧光蛋白在细胞内实现表达，说明本发明实施例制备的阳离子醚化单宁酸可以在细胞内有效转运并释放DNA。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种阳离子醚化单宁酸，其特征在于，所述阳离子醚化单宁酸为具有以下结构式(1)所示结构的化合物：
2.一种如权利要求1所述的阳离子醚化单宁酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S10、将单宁酸溶解于氢氧化钠的水溶液中，得到单宁酸溶液；
步骤S20、向所述单宁酸溶液中加入吡啶和3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵，在45～55℃温度下搅拌反应20～30h，得产物溶液；
步骤S30、对所述产物溶液进行分离纯化，得到阳离子醚化单宁酸。
3.如权利要求2所述的阳离子醚化单宁酸的制备方法，其特征在于，在步骤S10中：所述单宁酸与所述氢氧化钠的摩尔比为1：(1～1.2)。
4.如权利要求2所述的阳离子醚化单宁酸的制备方法，其特征在于，在步骤S20中：所述单宁酸、吡啶和3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的摩尔比为1：(25～35)：(1～1.5)。
5.如权利要求2所述的阳离子醚化单宁酸的制备方法，其特征在于，步骤S20具体包括：
将所述单宁酸溶液在水浴环境中加热至45～55℃后，在搅拌作用下向所述单宁酸溶液中先加入吡啶，然后加入3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的水溶液，添加完毕后搅拌反应20～30h，得产物溶液。
6.如权利要求5所述的阳离子醚化单宁酸的制备方法，其特征在于，在步骤S20中：所述3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的水溶液中的3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵的质量百分比为65～70％。
7.如权利要求2所述的阳离子醚化单宁酸的制备方法，其特征在于，步骤S30包括：
步骤S31、将所述产物溶液冷却至室温后装入透析袋中，先采用流水进行透析，然后采用去离子水进行透析，直至透出液中不含有季铵盐为止，收集截留液；
步骤S32、对所述截留液进行低温真空浓缩后，将浓缩产物先进行预冷冻后再冷冻干燥，得到的干燥产物即为阳离子醚化单宁酸。
8.如权利要求7所述的阳离子醚化单宁酸的制备方法，其特征在于，在步骤S31中：所述透析袋的截留分子量为400～600；和/或，
采用流水进行透析的透析时间为20～30h，采用去离子水进行透析的透析时间为10～15h，且在采用去离子水进行透析的过程中，每1.5～2.5h更新一次透出液。
9.如权利要求7所述的阳离子醚化单宁酸的制备方法，其特征在于，在步骤S32中：所述预冷冻的冷冻温度为-25～-15℃、冷冻时间为20～28h。
10.一种基因体外释放载体，其特征在于，所述基因体外释放载体包括如权利要求1所述的阳离子醚化单宁酸。
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2019
- 2019-03-06 CN CN201910170509.3A patent/CN109879916A/zh active Pending
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