CN109821028A - 一种多巴胺包埋磁性纳米粒子的dna释放载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体及其制备方法，所述多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体包括Fe3O4磁性纳米粒子、聚多巴胺以及阳离子聚合物，其中，所述聚多巴胺包覆于所述Fe3O4磁性纳米粒子的表面而形成多巴胺包覆的磁性纳米粒子，所述阳离子聚合物接枝于所述多巴胺包覆的磁性纳米粒子的表面，而形成所述多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。本发明通过将阳离子聚合物接枝于多巴胺包覆的磁性纳米粒子表面，显著降低了细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体及其制备方法。
背景技术
基因治疗是指将DNA等外源性核酸注入细胞(转染)，从而对疾病起到预防和治疗效果的方法。近年来，基因治疗作为一种很有前景的治疗手段，受到人们越来越多的关注。脱氧核糖核酸(DNA)分子量大且容易降解，带有负电荷，与细胞膜有排斥作用，且裸DNA在核酸酶的作用下会迅速水解。所以，有效基因载体的开发对基因治疗的发展有重大意义。
现有的基因载体主要有两种：病毒载体和非病毒载体。大多数病毒载体都具有高效的基因传递效率，在临床治疗中应用较多。然而病毒载体经常会引发不良的免疫反应，这制约了它的发展。因此，非病毒载体的开发与应用成为现阶段基因治疗的研究重点。非病毒载体包括阳离子脂质体、阳离子聚合物、树枝状高分子和纳米粒子等。但目前所使用的非病毒载体普遍细胞毒性大的问题。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体及其制备方法，旨在降低DNA载体的细胞毒性，提高转染率。
为实现上述目的，本发明提出一种多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体，包括Fe3O4磁性纳米粒子、聚多巴胺以及阳离子聚合物，其中，所述聚多巴胺包覆于所述Fe3O4磁性纳米粒子的表面而形成多巴胺包覆的磁性纳米粒子，所述阳离子聚合物接枝于所述多巴胺包覆的磁性纳米粒子的表面，而形成所述多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
优选地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、PLL和聚酰胺-胺型树枝状高分子中的任意一种。
优选地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺。
为实现上述目的，本发明还提出一种多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤S10、采用水热法制备Fe3O4磁性纳米粒子；
步骤S20、将所述Fe3O4磁性纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，然后加入多巴胺盐酸盐，搅拌反应46～50h后，分离出反应后的沉淀物，得Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子；
步骤S30、将所述Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，然后加入阳离子聚合物，搅拌反应至使所述阳离子聚合物接枝于所述Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子表面后，分离出反应后的固体产物，得Fe3O4/聚多巴胺/阳离子聚合物复合纳米粒子，即为多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
优选地，在步骤S20中：所述Fe3O4磁性纳米粒子与所述多巴胺盐酸盐的摩尔比为1：(1～2)。
优选地，步骤S20包括：
在超声作用下，将所述Fe3O4磁性纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，超声处理25～35min后，加入多巴胺盐酸盐并继续超声25～35min，得待反应液；
将所述待反应液在室温下搅拌反应46～50h后，采用磁分离收集沉淀物，经过洗涤、干燥处理，得Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子。
优选地，在步骤S30中：所述Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子与所述阳离子聚合物的摩尔比为1：(1～2)。
优选地，步骤30中的所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺，且步骤S30包括：
在超声作用下，将所述Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，超声处理25～35min后，加入聚乙烯亚胺并继续超声25～35min，得待反应溶液；
将所述待反应液在室温下搅拌反应46～50h后，采用磁分离收集沉淀物，经过洗涤、干燥处理，得Fe3O4/聚多巴胺/聚乙烯亚胺复合纳米粒子，即为多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
优选地，步骤S10包括：
将六水三氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠溶解于乙二醇中，在45～55℃、400～600rpm条件下搅拌至形成均匀的黄色溶液；
将所述黄色溶液在密封条件下加热至180～220℃反应10～14h后，冷却并收集固体产物，然后进行洗涤、干燥，得Fe3O4磁性纳米粒子。
优选地，将六水三氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠溶解于乙二醇中，在45～55℃、400～600rpm条件下搅拌至形成均匀的黄色溶液的步骤中：所述六水三氯化铁、丙烯酸钠、乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1：(1～1.5)：(1～1.5)：(1～2)。
本发明提供的技术方案中，以Fe3O4磁性纳米粒子、聚多巴胺和阳离子聚合物制得多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体，该DNA释放载体中，聚多巴胺包覆于Fe3O4磁性纳米粒子的表面而形成多巴胺包覆的磁性纳米粒子，然后阳离子聚合物接枝于该多巴胺包覆的磁性纳米粒子的表面，而形成所述多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体，通过将阳离子聚合物接枝于多巴胺包覆的磁性纳米粒子表面，显著降低了其用作DNA载体的细胞毒性，提高了使用安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的制备方法的一实施例的流程示意图；
图2～6为各实施例制备的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的电泳测试结果图；
图7～11为各实施例制备的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的细胞毒性检测结果图；
图12～16为各实施例制备的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的转染效果检测结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
现有非病毒载体包括阳离子脂质体、阳离子聚合物、树枝状高分子和纳米粒子等，目前所使用的非病毒载体普遍具有以下缺点：(1)阳离子脂质体稳定性差、毒性大，基因难以长时间稳定表达；(2)阳离子聚合物分子量大，不易被细胞内的酶代谢，从而在细胞内堆积，引起细胞毒性；(3)无机纳米粒子表面功能化步骤复杂，且尺寸分布不均、稳定性差、易团聚。针对上述提出的现有非病毒载体容易引起细胞毒性的问题，本发明提出一种多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体，包括Fe3O4磁性纳米粒子、聚多巴胺以及阳离子聚合物，其中，所述聚多巴胺包覆于所述Fe3O4磁性纳米粒子的表面而形成多巴胺包覆的磁性纳米粒子，所述阳离子聚合物接枝于所述多巴胺包覆的磁性纳米粒子的表面，而形成所述多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
本发明提供的技术方案中，以Fe3O4磁性纳米粒子、聚多巴胺和阳离子聚合物制得多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体，该DNA释放载体中，聚多巴胺包覆于Fe3O4磁性纳米粒子的表面而形成多巴胺包覆的磁性纳米粒子，然后阳离子聚合物接枝于该多巴胺包覆的磁性纳米粒子的表面，而形成所述多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体，通过将阳离子聚合物接枝于多巴胺包覆的磁性纳米粒子表面，显著降低了其用作DNA载体的细胞毒性，提高了使用安全性。
进一步地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺(简称PEI)、聚赖氨酸(简称PLL)和聚酰胺-胺型树枝状高分子(简称PAMAM)中的任意一种，更优选为所述阳离子聚合物为PEI，所制得的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的细胞毒性更低，例如，在具体制备时，可选用分子量为30000Da(也即30kDa)的PEI(以下简称PEI-30k)作为所述阳离子聚合物。
根据上述提出的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体，本发明还提供了该多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的制备方法，图1所示为本发明提供的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的制备方法的一实施例。请参阅图1，在本实施例中，所述多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的制备方法包括以下步骤：
步骤S10、采用水热法制备Fe3O4磁性纳米粒子；
制备所述Fe3O4磁性纳米粒子时，采用传统的水热合成法进行即可，在本实施例中提供了通过水热法制备Fe3O4磁性纳米粒子的一种具体实施方式，也即，在本实施例中，步骤S10包括：
步骤S11、将六水三氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠溶解于乙二醇中，在45～55℃、400～600rpm条件下搅拌至形成均匀的黄色溶液；
为加快所述六水三氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠在乙二醇中的溶解效率，本实施例中采用加热搅拌的方式加速溶解，其搅拌方式可以选用机械搅拌或磁力搅拌等常规搅拌方式进行，在本实施例中优选为机械搅拌。需要说明的是，采用水热法制备所述Fe3O4磁性纳米粒子时，可以通过改变体系中溶剂的比例，对Fe3O4磁性纳米粒子的平均尺寸进行调控，在本实施例中，优选为所述六水三氯化铁、丙烯酸钠、乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1：(1～1.5)：(1～1.5)：(1～2)，制得的Fe3O4磁性纳米粒子的平均尺寸为500nm左右，进而使得最终所制备的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的平均粒径尺寸为300nm左右。进一步地，所述六水三氯化铁、丙烯酸钠、乙酸钠和乙二醇的摩尔比更优选为1:1:1:1，制得的Fe3O4磁性纳米粒子的尺寸分布更均匀，进而使得制备的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的尺寸分布更均匀，改善了现有无机纳米离子用作DNA载体时存在的尺寸分布不均匀的问题。
步骤S12、将所述黄色溶液在密封条件下加热至180～220℃反应10～14h后，冷却并收集固体产物，然后进行洗涤、干燥，得Fe3O4磁性纳米粒子。
在本实施例中，步骤S12中的反应可以选用高压反应釜作为反应容器，以下以选用不锈钢高压釜作为反应容器说明步骤S12的具体操作方法：将配制的所述黄色溶液转入到不锈钢高压釜中，密封后加热至180～220℃，保温反应10～14℃后，生成的固体产物即为Fe3O4，然后将高压釜冷却至室温，收集固体产物，使用乙醇和去离子水对固体产物进行多次洗涤，再进行冷冻干燥至彻底去除水分，得Fe3O4磁性纳米粒子。在本发明的其他实施例中，还可以选用真空干燥、微波干燥等常规的干燥方式，而采用冷冻干燥具有干燥效率高、不容易对物质自身性质造成过多影响的特点，以下均以所述干燥方式为冷冻干燥为例进行说明，在具体实施时，以干燥至水分彻底挥发为准，例如，可以设置为在-50～-60℃下冷冻干燥10～14h。
步骤S20、将所述Fe3O4磁性纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，然后加入多巴胺盐酸盐，搅拌反应46～50h后，分离出反应后的沉淀物，得Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子；
在步骤S20的搅拌反应过程中，多巴胺盐酸盐(3-Hydroxytyraminehydrochloride，简称DA，分子式为C8H11NO2·HCl，分子量为189.64，CAS号为62-31-7)发生自聚合，而在所述Fe3O4磁性纳米粒子表面形成聚多巴胺(简称PDA)薄膜，也即，通过步骤S20制得的Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子(以下均简称Fe3O4/PDA复合纳米粒子)中，所述PDA包覆于所述Fe3O4磁性纳米粒子的表面。为使增大所述PDA在所述Fe3O4磁性纳米粒子表面的包覆面积，所述多巴胺盐酸盐的摩尔数应不少于所述Fe3O4磁性纳米粒子的摩尔数，在本实施例中：所述Fe3O4磁性纳米粒子与所述多巴胺盐酸盐的摩尔比为1：(1～2)，在此范围内，所述PDA既能将所述Fe3O4磁性纳米粒子的表面完全包覆，又不会导致过多浪费。
其搅拌反应时的搅拌方式可以采用机械搅拌或超声等常规方式，在本实施例中均以机械搅拌为例进行说明，步骤S20在具体实施时包括以下步骤：
步骤S21、在超声作用下，将所述Fe3O4磁性纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，超声处理25～35min后，加入多巴胺盐酸盐并继续超声25～35min，得待反应液；
借助于超声分散作用，有利于提高所述Fe3O4磁性纳米粒子和所述多巴胺盐酸盐在所述Tris-HCl缓冲液中的分散效率和分散均匀度，在具体操作时，可设置超声的频率为50～60KHz。其中，所选用的Tris-HCl缓冲液的pH值为8～9，更优选为所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8.5。
步骤S22、将所述待反应液在室温下搅拌反应46～50h后，采用磁分离收集沉淀物，经过洗涤、干燥处理，得Fe3O4/PDA复合纳米粒子。
在超声分散完成后，将所述待反应液转入三口烧瓶、锥形瓶或反应釜等反应容器中进行搅拌，并在室温下搅拌反应46～50h，待反应完成后，反应后的沉淀物中因含有所述Fe3O4磁性纳米粒子而带有磁性，此时采用将反应后的溶液置于磁场作用下的方式，即可利用磁分离收集其中的沉淀物，相比于过滤、离心等常规的固液分离方式，其分离效率更高、且操作更为简便。分离完成后，使用乙醇和去离子水进行多次洗涤后再冷冻干燥，得Fe3O4/PDA复合纳米粒子。
步骤S30、将所述Fe3O4/PDA复合纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，然后加入阳离子聚合物，搅拌反应至使所述阳离子聚合物接枝于所述Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子表面后，分离出反应后的固体产物，得Fe3O4/PDA/阳离子聚合物复合纳米粒子，即为多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
在步骤S30的搅拌反应过程中，所述阳离子聚合物接枝于所述Fe3O4/PDA复合纳米粒子表面，也即，通过步骤S30制得的Fe3O4/PDA/阳离子聚合物复合纳米粒子中，所述阳离子聚合物包覆于所述Fe3O4/PDA复合纳米粒子的表面。为使增大所述阳离子聚合物在所述Fe3O4/PDA复合纳米粒子表面的包覆面积，所述阳离子聚合物的摩尔数应不少于所述Fe3O4/PDA复合纳米粒子的摩尔数，在本实施例中：所述Fe3O4/PDA复合纳米粒子与所述阳离子聚合物的摩尔比为1：(1～2)，在此范围内，所述阳离子聚合物既能将所述Fe3O4磁性纳米粒子的表面完全包覆，又不会导致过多浪费。
在本实施例中所选用的阳离子聚合物为PEI(以PEI作为阳离子聚合物制备的Fe3O4/PDA/阳离子聚合物复合纳米粒子，以下均简称为Fe3O4/PDA/PEI复合纳米粒子)，对应地，步骤S30具体包括以下步骤：
步骤S31a、在超声作用下，将所述Fe3O4/PDA复合纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，超声处理25～35min后，加入PEI并继续超声25～35min，得待反应溶液；
同样地，借助于超声分散作用，有利于提高所述Fe3O4/PDA复合纳米粒子在所述Tris-HCl缓冲液中的分散效率和分散均匀度，在具体操作时的超声频率同样可以设置为50～60KHz。其中，所选用的Tris-HCl缓冲液的pH值为8～9，更优选为所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8.5。
步骤S32a、将所述待反应液在室温下搅拌反应46～50h后，采用磁分离收集沉淀物，经过洗涤、干燥处理，得Fe3O4/PDA/PEI复合纳米粒子，即为多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
在超声分散完成后，将所述待反应液转入三口烧瓶、锥形瓶或反应釜等反应容器中进行机械搅拌，并在室温下搅拌反应46～50h，待反应完成后，同样采用磁分离的方式收集其中的沉淀物，分离完成后，使用乙醇和去离子水进行多次洗涤后再冷冻干燥，得Fe3O4/PDA/PEI复合纳米粒子，即为所述多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
在本发明的其他实施例中，当选用的阳离子聚合物为PLL或PAMAM时，需要对步骤S30中的部分工艺进行调整，例如，选用PAMAM时(以PAMAM作为阳离子聚合物制备的Fe3O4/PDA/阳离子聚合物复合纳米粒子，以下均简称为Fe3O4/PDAPAMAM复合纳米粒子)，步骤S30可按照以下方式进行：
步骤S31b、在超声作用下，将所述Fe3O4/PDA复合纳米粒子分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，超声处理25～35min，得悬浮液；
步骤S32b、将PAMAM分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中形成混合液，然后将所述混合液加入到上述悬浮液中，得待反应溶液；
步骤S33b、在室温环境下，将所述待反应液在超声波作用下反应22～26h，然后采用磁分离收集反应后的沉淀物，经过洗涤、干燥处理，得Fe3O4/PDA/PAMAM复合纳米粒子，即为多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
其中，步骤S31b中的超声处理是为了提高所述Fe3O4/PDA复合纳米粒子在所述Tris-HCl缓冲液中的分散效率和均匀度，步骤S33b中的超声处理是为了通过超声搅拌作用促使所述PAMAM反应接枝于所述Fe3O4/PDA复合纳米粒子的表面，在本实施例中，其超声频率均可以设置为50～60KHz。
当选用PLL作为所述阳离子聚合物时，可以按照上述提供的步骤S31a至S32a或步骤S31b至步骤S33b相同或相类似的操作方法进行，使所述PLL接枝于所述Fe3O4/PDA复合纳米粒子的表面即可，在此不做赘述。
本发明提供的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的制备方法，采用水热法制备Fe3O4磁性纳米粒子，制得的磁性纳米粒子的粒径均匀，且方法简便、易于操作；通过多巴胺的自聚合，在所述Fe3O4磁性纳米粒子表面形成PDA薄膜，稳定性高、不易团聚，可长时间保存，改善了现有用于DNA载体的无机纳米粒子稳定性差、易团聚的问题；在多巴胺包埋所述Fe3O4磁性纳米粒子后，利用PDA表面的基团对所述Fe3O4磁性纳米粒子进行进一步的表面功能化修饰，对无机纳米粒子表面进行功能化修饰的实施方式简便易行，避免了现有用于DNA载体的无机纳米粒子表面功能化步骤复杂的问题；通过将所述高树枝状分子材料接枝于多巴胺包覆的磁性纳米粒子表面，显著降低了该DNA载体的细胞毒性，改善了现有用于DNA载体的阳离子聚合物、树枝状高分子材料的分子量较大而导致其细胞毒性大的问题，提高了使用安全性；此外，所制得的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体还具有无免疫源问题、安全性高以及生物相容性好的优点。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)将六水三氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠溶解于乙二醇中(六水三氯化铁、丙烯酸钠、乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1:1:1:1)，在50℃、500rpm条件下进行机械搅拌至形成均匀的黄色溶液；然后将黄色溶液转移到不锈钢高压釜中，密封后加热至200℃反应12h，再冷却至室温后收集高压釜中的固体产物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-50℃下冷冻干燥14h，得Fe3O4磁性纳米粒子；
(2)在超声作用(50Hz)下，将步骤(1)制得的Fe3O4磁性纳米粒子分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，超声处理30min后，加入多巴胺盐酸盐(Fe3O4磁性纳米粒子与多巴胺盐酸盐的摩尔比为1:1)后超声处理30min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应48h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-50℃下冷冻干燥14h，得Fe3O4/PDA复合纳米粒子；
(3)在超声作用(50Hz)下，将步骤(2)制得的Fe3O4/PDA复合纳米粒子分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，超声处理30min后，加入PEI-30k(Fe3O4/PDA复合纳米粒子与PEI的摩尔比为1:1)后超声处理30min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应48h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-50℃下冷冻干燥14h，得Fe3O4/PDA/PEI复合纳米粒子，即获得多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
实施例2
(1)将六水三氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠溶解于乙二醇中(六水三氯化铁、丙烯酸钠、乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1:1.5:1:1)，在45℃、600rpm条件下进行机械搅拌至形成均匀的黄色溶液；然后将黄色溶液转移到不锈钢高压釜中，密封后加热至180℃反应14h，再冷却至室温后收集高压釜中的固体产物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-55℃下冷冻干燥12h，得Fe3O4磁性纳米粒子；
(2)在超声作用(55Hz)下，将步骤(1)制得的Fe3O4磁性纳米粒子分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，超声处理25min后，加入多巴胺盐酸盐(Fe3O4磁性纳米粒子与多巴胺盐酸盐的摩尔比为1:1)后继续超声25min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应46h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-55℃下冷冻干燥12h，得Fe3O4/PDA复合纳米粒子；
(3)在超声作用(55Hz)下，将步骤(2)制得的Fe3O4/PDA复合纳米粒子分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，超声处理25min后，加入PEI-30k(Fe3O4/PDA复合纳米粒子与PEI的摩尔比为1:1)后继续超声35min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应50h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-55℃下冷冻干燥12h，得Fe3O4/PDA/PEI复合纳米粒子，即获得多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
实施例3
(1)将六水三氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠溶解于乙二醇中(六水三氯化铁、丙烯酸钠、乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1:1.5:1.5:1)，在55℃、400rpm条件下进行机械搅拌至形成均匀的黄色溶液；然后将黄色溶液转移到不锈钢高压釜中，密封后加热至190℃反应13h，再冷却至室温后收集高压釜中的固体产物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-60℃下冷冻干燥10h，得Fe3O4磁性纳米粒子；
(2)在超声作用(60Hz)下，将步骤(1)制得的Fe3O4磁性纳米粒子分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，超声处理25min后，加入多巴胺盐酸盐(Fe3O4磁性纳米粒子与多巴胺盐酸盐的摩尔比为1:1)后继续超声35min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应50h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-60℃下冷冻干燥10h，得Fe3O4/PDA复合纳米粒子；
(3)在超声作用(60Hz)下，将步骤(2)制得的Fe3O4/PDA复合纳米粒子分散于pH值为9.0的Tris-HCl缓冲液中，超声处理35min后，加入PEI-30k(Fe3O4/PDA复合纳米粒子与PEI的摩尔比为1:2)后继续超声25min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应46h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-60℃下冷冻干燥10h，得Fe3O4/PDA/PEI复合纳米粒子，即获得多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
实施例4
(1)将六水三氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠溶解于乙二醇中(六水三氯化铁、丙烯酸钠、乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5)，在50℃、450rpm条件下进行机械搅拌至形成均匀的黄色溶液；然后将黄色溶液转移到不锈钢高压釜中，密封后加热至210℃反应11h，再冷却至室温后收集高压釜中的固体产物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-55℃下冷冻干燥12h，得Fe3O4磁性纳米粒子；
(2)在超声作用(50Hz)下，将步骤(1)制得的Fe3O4磁性纳米粒子分散于pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液中，超声处理35min后，加入多巴胺盐酸盐(Fe3O4磁性纳米粒子与多巴胺盐酸盐的摩尔比为1:1.2)后超声处理30min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应49h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-55℃下冷冻干燥12h，得Fe3O4/PDA复合纳米粒子；
(3)在超声作用(50Hz)下，将步骤(2)制得的Fe3O4/PDA复合纳米粒子分散于pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液中，超声处理30min后，加入PLL(Fe3O4/PDA复合纳米粒子与PLL胺的摩尔比为1:1.2)后继续超声35min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应47h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-55℃下冷冻干燥12h，得Fe3O4/PDA/PLL复合纳米粒子，即获得多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
实施例5
(1)将六水三氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠溶解于乙二醇中(六水三氯化铁、丙烯酸钠、乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1:1.5:1.5:2)，在50℃、550rpm条件下进行机械搅拌至形成均匀的黄色溶液；然后将黄色溶液转移到不锈钢高压釜中，密封后加热至220℃反应10h，再冷却至室温后收集高压釜中的固体产物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-55℃下冷冻干燥12h，得Fe3O4磁性纳米粒子；
(2)在超声作用(60Hz)下，将步骤(1)制得的Fe3O4磁性纳米粒子分散于pH值为9.0的Tris-HCl缓冲液中，超声处理30min后，加入多巴胺盐酸盐(Fe3O4磁性纳米粒子与多巴胺盐酸盐的摩尔比为1:1.5)后超声处理25min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应47h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-55℃下冷冻干燥12h，得Fe3O4/PDA复合纳米粒子；
(3)在超声作用(60Hz)下，取步骤(2)制得的Fe3O4/PDA复合纳米粒子10mg分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液(40mL，50mmol/L)中，超声处理30min后形成悬浮液；然后将含有PAMAM 250mg的Tris-HCl缓冲液10mL加入到该悬浮液中，得待反应溶液；在室温下，将该待反应溶液在超声波作用(60Hz)下反应24h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-55℃下冷冻干燥12h，得Fe3O4/PDA/PAMAM复合纳米粒子，即获得多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
分别取上述实施例1至5制得的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体作为DNA释放载体样本，进行效果测试，测试方法及结果如下：
(1)载体对DNA的缩合能力
将DNA释放载体样品加入到适量的去离子水中溶解，制成一定浓度的样品溶液，采用琼脂糖凝胶电泳评价多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体对DNA缩合能力：
将适量样品溶液与0.3μg质粒DNA(如绿色荧光蛋白质粒，GFP plasmid DNA，简称pDNA)按不同的质量比混合，得DNA释放载体/pDNA复合物(DNA释放载体与pDNA的质量比分别为0.5:1、1:1、2:1、4:1、8:1和16:1)；反应40min后，加入上样缓冲液，加样于琼脂糖凝胶(1％w/v)，并将凝胶置于pH为7.4的Tris-硼酸(TBE)缓冲液中，进行琼脂糖凝胶电泳，设置电压为90V，时间为40min；同时设置裸DNA和PEI-30k对照。电泳结束后，用溴化乙锭(EB)染色凝胶，使DNA条带显示。染色后用凝胶成像仪观察并拍照，结果如图2至图6所示，其中，图2至图6依次为实施例1至实施例5制备的DNA释放载体的电泳测试结果图，且每张图中从左至右依次为DNA释放载体与pDNA的质量比分别为0:1、0.5:1、1:1、2:1、4:1、8:1和16:1时的测试结果。
图2至图6的结果表明，DNA可与实施例制备的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体发生凝聚而滞留在凝胶泳道中。
(2)细胞毒性检测
采用噻唑蓝(MTT)比色法对多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的安全性进行评价，同时设置同等浓度PEI-30k为对照组。将一系列浓度梯度的DNA释放载体样品和PEI-30k分别与人宫颈癌细胞(Hela)共同孵育24h后，加入MTT溶液(0.5mg/mL)继续培养4h，吸取培养液，加入二甲基亚砜，使用酶标仪测定570nm处的吸光度，并计算细胞的存活率，结果如图7至图11以及表1所示，其中，图7至图11依次为实施例1至实施例5制备的DNA释放载体的细胞毒性检测结果图，且图中PEI-30K表示对照组，Fe3O4@PDA@PEI-30K表示实施例1至3制备的DNA释放载体，Fe3O4@PDA@PLL和Fe3O4@PDA@PAMAM分别表示实施例4和5制备的DNA释放载体。
表1各实施例制备的DNA释放载体的细胞毒性检测结果
图7至11以及表1的结果表明，多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体无明显细胞毒性，且与PEI-30k相比，细胞毒性明显降低，说明本发明实施例制备的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体可作为一种安全的基因载体。
(3)转染效果检测
通过考察多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体在HEK-293T细胞内对增强绿色荧光蛋白(EGFP)的表达，评价该载体的转染能力：
将DNA释放载体样品与EGFP按质量比为7:1混合，孵育40min后，与HEK-293T细胞共同培养4h，再改用新鲜的含10％胎牛血清的培养液继续培养48h。培养完毕后使用荧光显微镜在蓝光激发下，放大40倍观察EGFP的表达情况，结果如图12至图16(图中的白色点状部分即为观测到的绿色荧光表达)和表2所示，其中，图12至图16依次为实施例1至实施例5制备的DNA释放载体的转染效果检测结果图。
表2各实施例制备的DNA释放载体的转染效果检测结果
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | |
| 转染率(％) | 24.06 | 13.41 | 23.77 | 13.10 | 13.40 |
图12至16以及表2的结果表明，绿色荧光蛋白可以在细胞内实现表达，说明本发明实施例制备的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体可以作为有效的基因载体。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体，其特征在于，包括Fe3O4磁性纳米粒子、聚多巴胺以及阳离子聚合物，其中，所述聚多巴胺包覆于所述Fe3O4磁性纳米粒子的表面而形成多巴胺包覆的磁性纳米粒子，所述阳离子聚合物接枝于所述多巴胺包覆的磁性纳米粒子的表面，而形成所述多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
2.如权利要求1所述的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体，其特征在于，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚酰胺-胺型树枝状高分子中的任意一种。
3.如权利要求2所述的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体，其特征在于，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺。
4.一种如权利要求1至3任意一项所述的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S10、采用水热法制备Fe3O4磁性纳米粒子；
步骤S20、将所述Fe3O4磁性纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，然后加入多巴胺盐酸盐，搅拌反应46～50h后，分离出反应后的沉淀物，得Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子；
步骤S30、将所述Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子和阳离子聚合物在Tris-HCl缓冲液中，搅拌反应至使所述阳离子聚合物接枝于所述Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子表面后，分离出反应后的固体产物，得Fe3O4/聚多巴胺/阳离子聚合物复合纳米粒子，即为多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
5.如权利要求4所述的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的制备方法，其特征在于，在步骤S20中：所述Fe3O4磁性纳米粒子与所述多巴胺盐酸盐的摩尔比为1：(1～2)。
6.如权利要求4所述的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的制备方法，其特征在于，步骤S20包括：
在超声作用下，将所述Fe3O4磁性纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，超声处理25～35min后，加入多巴胺盐酸盐并继续超声25～35min，得待反应液；
将所述待反应液在室温下搅拌反应46～50h后，采用磁分离收集沉淀物，经过洗涤、干燥处理，得Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子。
7.如权利要求4所述的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的制备方法，其特征在于，在步骤S30中：所述Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子与所述阳离子聚合物的摩尔比为1：(1～2)。
8.如权利要求4所述的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的制备方法，其特征在于，步骤S30中的所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺，且步骤S30包括：
在超声作用下，将所述Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，超声处理25～35min后，加入聚乙烯亚胺并继续超声25～35min，得待反应溶液；
将所述待反应液在室温下搅拌反应46～50h后，采用磁分离收集沉淀物，经过洗涤、干燥处理，得Fe3O4/聚多巴胺/聚乙烯亚胺复合纳米粒子，即为多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体。
9.如权利要求4所述的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的制备方法，其特征在于，步骤S10包括：
将六水三氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠溶解于乙二醇中，在45～55℃、400～600rpm条件下搅拌至形成均匀的黄色溶液；
将所述黄色溶液在密封条件下加热至180～220℃反应10～14h后，冷却并收集固体产物，然后进行洗涤、干燥，得Fe3O4磁性纳米粒子。
10.如权利要求9所述的多巴胺包埋磁性纳米粒子的DNA释放载体的制备方法，其特征在于，将六水三氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠溶解于乙二醇中，在45～55℃、400～600rpm条件下搅拌至形成均匀的黄色溶液的步骤中：
所述六水三氯化铁、丙烯酸钠、乙酸钠和乙二醇的摩尔比为1：(1～1.5)：(1～1.5)：(1～2)。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109797169A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-05-24 | 武汉轻工大学 | 一种基因载体及其制备方法 |
| CN112237906A (zh) * | 2019-07-19 | 2021-01-19 | 南京理工大学 | Php修饰的磁性纳米微球、制备方法及其在dna分离中的应用 |
| CN112353955A (zh) * | 2020-11-17 | 2021-02-12 | 南京信息职业技术学院 | 一种PSiNPs@Fe3O4复合材料及其制备方法与应用 |
| CN115068631A (zh) * | 2021-03-10 | 2022-09-20 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种CRISPR/Cas9递送体系及其制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108620048A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-10-09 | 天津大学 | 聚乙烯亚胺修饰的磁性微球制备方法及应用 |
| CN109182327A (zh) * | 2018-08-30 | 2019-01-11 | 尤崇革 | 磁性纳米粒子在核酸提取中的应用及其制备方法 |
-
2019
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108620048A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-10-09 | 天津大学 | 聚乙烯亚胺修饰的磁性微球制备方法及应用 |
| CN109182327A (zh) * | 2018-08-30 | 2019-01-11 | 尤崇革 | 磁性纳米粒子在核酸提取中的应用及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SHEN ET AL.: "Fe3O4 Nanoparticles in Targeted Drug/Gene Delivery Systems", 《MATERIALS》 * |
| 吴淑恒等: "精氨酸修饰的Fe3O4 磁性纳米粒子作为基因释放载体的研究", 《武汉轻工大学学报》 * |
| 王晶等: "信号响应性基因载体及其应用研究", 《中国生物医学工程学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109797169A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-05-24 | 武汉轻工大学 | 一种基因载体及其制备方法 |
| CN112237906A (zh) * | 2019-07-19 | 2021-01-19 | 南京理工大学 | Php修饰的磁性纳米微球、制备方法及其在dna分离中的应用 |
| CN112353955A (zh) * | 2020-11-17 | 2021-02-12 | 南京信息职业技术学院 | 一种PSiNPs@Fe3O4复合材料及其制备方法与应用 |
| CN115068631A (zh) * | 2021-03-10 | 2022-09-20 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种CRISPR/Cas9递送体系及其制备方法和应用 |
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