TWI738168B - 以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法，其包括將一Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子與一Cas9蛋白質-嚮導RNA複合物結合，以獲得一轉染複合物；以及將該轉染複合物施予一細胞，以使該轉染複合物進入該細胞並調控至少一基因表現；其中該Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子包含一Cas9胜肽拓印之甲殼素聚合物與複數個磁性奈米粒子，並可與Cas9蛋白質結合。
Description
本發明係關於一種以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法，係使一Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子將Cas9蛋白質-嚮導RNA複合物運送到細胞內，並調控基因表現。
於生物醫學的相關研究中，常會透過使細胞大量表現特定基因，或是抑制特定基因的表現，以研究該基因的功能以及對生物體的影響。目前用於調控細胞基因表現的方法包含以特定化學物質促進或是抑制基因表現，此方法的專一性低，且對細胞的影響範圍大，不適合用於研究單一基因的作用；又，亦可利用載體將表現特定基因的質體DNA轉染到細胞中，或是以載體將抑制特定基因表現的小干擾RNA(siRNA)轉染到細胞中，以促進或是抑制特定基因的表現，但是目前使用的載體例如脂質類載體(如Lipofectamine 2000)或是病毒載體(腺病毒載體、慢病毒載體或是反轉錄病毒載體等等)，對細胞皆具有一定的毒性，且病毒載體亦可能會引起生物體免疫反應，甚至引起其他副作用，因此在使用上仍須要非常小心。
分子拓印技術係於一高分子物質上拓印一目標分子的形狀，以令高分子物質可專一辨識並吸附目標分子；現今的分子拓印高分子可製備成奈米大小的顆粒以作為載體使用，例如以藥物拓印之高分子顆粒作為藥物載體，將藥物輸送到細胞中進行疾病治療。然而，目前仍然未將分子拓印技術應用於調控基因表現的技術領域。
今，發明人有鑑於現有細胞轉染與調控細胞基因表現之技術仍有不足之處，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明係關於一種以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法，係將一Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子與一Cas9蛋白質-嚮導RNA複合物結合，以獲得一轉染複合物；以及將該轉染複合物施予一細胞，以使該轉染複合物進入該細胞並調控至少一基因；其中該Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子包含一Cas9胜肽拓印之甲殼素聚合物與複數個磁性奈米粒子，並可與一Cas9蛋白質結合。
於本發明之一實施例中，Cas9蛋白質-嚮導RNA複合物包含一Cas9蛋白質與一嚮導RNA。
於本發明之一實施例中，Cas9蛋白質係為一Cas9融合蛋白質。
於本發明之一實施例中，Cas9融合蛋白質為一不具有內切酶(endonuclease)活性的突變型Cas9融合蛋白質。
於本發明之一實施例中，Cas9融合蛋白質係具有轉錄活化功能。
於本發明之一實施例中，該嚮導RNA係包含一轉活化crRNA(trans activating crRNA)與一crRNA，其中crRNA選自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9與SEQ ID NO:10所構成之群組。
於本發明之一實施例中，crRNA係選自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7與SEQ ID NO:9所構成之群組。
於本發明之一實施例中，crRNA係由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7與SEQ ID NO:9所組成。
於本發明之一實施例中，crRNA係選自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8與SEQ ID NO:9所構成之群組。
於本發明之一實施例中，crRNA係由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8與SEQ ID NO:9所組成。
藉此，本發明以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法，可以有效將Cas9蛋白質-嚮導RNA複合物運送到細胞中，並將Cas9蛋白質-嚮導RNA複合物運送到細胞內特定的DNA位置，以調控基因表現。
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
本發明係關於一種以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法，係將一Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子與一Cas9蛋白質-嚮導RNA複合物結合，以獲得一轉染複合物；將該轉染複合物施予一細胞，以使該轉染複合物進入該細胞並調控至少一基因；其中該Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子係包含一Cas9胜肽拓印之甲殼素聚合物與複數個磁性奈米粒子，並可與一Cas9蛋白質結合。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
一、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之製造
(一)、磁性奈米粒子溶液製備
配置一鐵離子溶液，鐵離子溶液中含有0.126 M之硫酸鐵(FeSO4
‧7H2
O)以及0.252 M之氯化鐵(FeCl3
‧6H2
O)；取30 mL之鐵離子溶液以隔水加熱的方式加熱到沸騰，再加入10 mL的7 N氫氧化鈉(NaOH)溶液，以獲得一鐵離子/氫氧化鈉溶液；於加入氫氧化鈉溶液十秒後將鐵離子/氫氧化鈉溶液放置於一強力磁鐵上，此時鐵離子/氫氧化鈉溶液會產生分層並產生一上清液與一沉澱層，將上層之上清液移除；加入10~100 mL之純水，並與沉澱層攪拌一分鐘以清洗產生的磁性奈米粒子，再將溶液放置於強力磁鐵，利用磁力吸附住磁性奈米粒子以移除上清液；重複上述的清洗步驟至少一次，即至少以純水清洗磁性奈米粒子兩次，並移除上清液；最後加入10~100 mL之純水，並將溶液以超音波震盪10秒鐘以獲得磁性奈米粒子溶液，並保存於4℃。
(二)、Cas9胜肽溶液製備
將Cas9胜肽溶解於去離子水中，並配置成濃度為1 μg/mL之Cas9胜肽溶液；本實施例中所用的Cas9胜肽分別為胜肽Q與胜肽R，胜肽Q之序列請參見序列表之SEQ ID NO:1，以及胜肽R之序列請參見序列表之SEQ ID NO:2。
(三)、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之製備
使用分子量為370 K之甲殼素，將其溶解於0.1~2 wt%醋酸溶液中，以配置成0.001 ~1 wt%甲殼素微酸溶液；取100~500 μL之甲殼素微酸溶液、200~500 μL磁性奈米粒子溶液與100~500 μL、濃度為0.1~2 μg/mL的Cas9胜肽溶液(胜肽Q溶液或胜肽R溶液)充分混合均勻，冰浴，且持續攪拌10分鐘，並將作用溫度維持於0~4℃之間，以使甲殼素包覆於磁性奈米粒子外，此過程亦稱為相變化；同時準備一組只包含甲殼素微酸溶液與磁性奈米粒子溶液作用的組別，以製備一無拓印Cas9胜肽甲殼素複合奈米粒子，以作為對照組；將作用完成後的混合液放在強力磁鐵盤上靜置2小時，以使溶液分層並產生一澄清液層與甲殼素複合奈米粒子層；移除澄清液，再加入1 mL純水並震盪5分鐘，再將混合液放置於強力磁鐵盤上靜置1小時，並移除澄清液，以完成一次的清洗步驟；重複一次上述之清洗步驟，並於移除澄清液以獲得Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子(magnetic peptide imprinted polymers，MIP)或是無拓印胜肽之甲殼素複合奈米粒子(Magnetic non-imprinted chitosan，簡稱MNIP)，又使用胜肽Q拓印獲得之MIP稱為MQIP，使用胜肽R拓印獲得之MIP稱為MRIP；接著利用動態光散射粒徑分析儀(Dynamic light scattering analyzer)測量MQIP、MRIP與MNIP之粒徑，MQIP之平均粒徑約為40~120 nm，MRIP之平均粒徑為90~130 nm，且MNIP平均粒徑為72 ± 10 nm。
此外，MNIP對於胜肽Q的吸附量為35.8 ±1.2 μg/mg、對胜肽R的再吸附量為23.9 ±0.8 μg/mg；MQIP對於胜肽Q的再吸附量為39.2 ±2.2 μg/mg，且拓印效率(α)為1.10；MRIP對胜肽R的再吸附量為29.4 ±1.6 μg/mg，且拓印效率(α)為1.23；拓印效率之計算公式如下：
MQIP拓印效率(α)=MQIP胜肽Q再吸附量/MNIP胜肽Q再吸附量；
MRIP拓印效率(α)=MRIP胜肽R再吸附量/MNIP胜肽R再吸附量。
當α>1時，表示Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子表面確實有成功拓印出可吸附Cas9胜肽的孔洞，因此能吸附更多的Cas9胜肽。此外，本實施例使用的MQIP之比表面積為559.9 m2
/g，MQIP之比表面積為205.9 m2
/g，且二者皆具備超順磁性。
(四)、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子(MIP)之細胞毒性測試
將上述製備的MNIP、MQIP或MRIP，以濃度1~1000 μg/mL的濃度與HEK293細胞(human embryonic kidney 293 cells)共同培養12~48小時，由於甲殼素帶有正電性，因此MNIP、MQIP或MRIP會藉由胞飲作用(pinocytosis)進入細胞中；於培養後以顯微鏡觀察細胞型態，並以MTT存活試驗檢測細胞的存活率；MTT存活試驗的定量結果請參見第一圖(A)，於添加MQIP的MTT試驗結果中，於添加濃度介於1~100 μg/mL時，細胞的存活率介於82~100%之間且沒有明顯的改變；於添加MRIP與MNIP的MTT試驗結果中，在甲殼素複合奈米粒子使用濃度為1~100 μg/mL時，細胞的存活率介於82~100%之間，但是當使用濃度高於100 μg/mL時，可能是因為甲殼素複合奈米粒子的添加量過多，造成ELISA測定的誤差，因此細胞存活率會有突然升高的現象，因此另外以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino- 2-phenylindole)染劑(DAPI染劑)進行細胞核染色，並定量細胞發螢光的區域以作為細胞存活的指標；DAPI染色的定量結果請參見第一圖(B)，與無添加甲殼素複合奈米粒子的細胞相比，不論是以MNIP、MQIP或是MRIP處理的細胞，於使用濃度1000 μg/mL時，DAPI染色後發螢光的面積並沒有明顯改變，表示在使用濃度1000 μg/mL時，MNIP、MQIP與MRIP對細胞都不會產生明顯的毒性。
三、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之功效測試
(一)、Cas9融合蛋白之表現
以下實施例中所使用的Cas9蛋白質，為將不具有內切酶(endonuclease)活性的突變型Cas9基因(dCas9)，與具有活化轉錄(transcription)活性的蛋白質基因，以分子生物技術融合後以獲得一質體DNA，再將該質體DNA轉染到細胞中，令細胞表現出Cas9融合蛋白質(fusion protein)。本實施例使用的Cas9融合蛋白質分別為將Cas9與Suntag融合的Cas9-Suntag融合蛋白、將Cas9與P300融合之Cas9-P300融合蛋白，以及將Cas9與VP64-p65-Rta(VPR)融合之Cas9-VPR融合蛋白(之後分別簡稱為Cas9-Suntag、Cas9-P300與Cas9-VPR)。
(二)、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之Cas9蛋白質吸附力
將HEK293細胞培養於10公分細胞培養盤中，培養隔夜後轉染表現Cas9-Suntag、Cas9-P300或是Cas9-VPR之質體DNA，並於轉染後24小時萃取細胞蛋白質；蛋白質萃取皆於低溫操作，萃取步驟簡述如下：將培養盤中的培養液移除，並以1 X PBS溶液(Phosphate buffered saline)清洗細胞至少一次，再將1 X PBS溶液吸乾；於培養盤中加入蛋白質萃取溶液(lysis buffer)以及蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)，並於4℃作用至少20分鐘；以刮勺收集細胞液，並將細胞液以超音波震盪器震盪10~120秒；將細胞液以轉速1000 rpm離心10分鐘，收集上清液並分裝，以獲得蛋白質萃取液。
將含有20-2000 μg蛋白質之蛋白質萃取液與1-10 mg之MNIP、MQIP或MRIP混合，並於冰上作用10-60 分鐘，再利用強力磁鐵將MNIP、MQIP或是MRIP與蛋白質萃取液分離後，移除蛋白質萃取液；將所獲得的MNIP、MQIP或MRIP進行免疫螢光染色，以觀察MNIP、MQIP或MRIP上吸附Cas9融合蛋白質的情形；接著，再以0.1~10 mL清水清洗與蛋白質萃取液作用完畢的MNIP、MQIP或MRIP，使MNIP、MQIP或MRIP所吸附的蛋白質與甲殼素複合奈米粒子分離，收集清洗液，並以酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析清洗液中的Cas9融合蛋白質濃度。
請參見第二圖，為MNIP、MQIP或MRIP吸附實驗的ELISA分析結果，結果顯示三種甲殼素複合奈米粒子對於Cas9-Sungtag的吸附量最多，其吸附量可以是Cas9-VPR或Cas9-P300吸附量的4~5倍；請再參見第三圖，為MQIP吸附三種Cas9融合蛋白質的免疫螢光染色結果，結果顯示MQIP可以有效吸附Cas9-Suntag、Cas9-P300以及Cas9-VRP三種融合蛋白質。
(三)、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之功效測試
因甲殼素複合奈米粒子帶有正電，能藉由胞飲作用進入細胞內，因此可作為細胞轉染(transfection)工具；此外，Cas9蛋白質於作用時需要與嚮導RNA(guide RNA，簡稱gRNA)形成複合體(後簡稱Cas9-RNPs)，再利用gRNA的序列將Cas9帶到細胞核中與gRNA可配對的核酸序列處；本試驗中，除了測試結合有Cas9融合蛋白的甲殼素複合奈米粒子細胞轉染效率之外，亦以軟體預測可將Cas9融合蛋白(Cas9-Suntag，Cas9-VPR與Cas9-P300)藉由gRNA分別帶到Oct4基因、SOX-2基因、KLF4基因或是C-myc基因位置的gRNA序列，並以Oct4基因、SOX-2基因、KLF4基因與C-myc基因表現量高低做為評估gRNA序列功效高低的依據。
gRNA是由一trans activating CRISPR RNA(tracrRNA)以及一具有特定序列的CRISPR RNA(crRNA)所組成，crRNA的序列會決定Cas9在細胞中作用的核酸序列；本實施例係分別針對Oct4基因、SOX-2基因、KLF4基因與C-myc基因設計具專一性的crRNA；其中針對Oct4基因設計的crRNA為SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:4，針對SOX-2基因設計的crRNA為SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:6，針對KLF4基因設計的crRNA為SEQ ID NO:7與SEQ ID NO:8，以及針對C-myc基因設計的crRNA為SEQ ID NO:9以及SEQ ID NO:10；又後續將SEQ ID NO:3稱為「O1C序列」，SEQ ID NO:4稱為「O1A序列」，SEQ ID NO:5稱為「S2G序列」，SEQ ID NO:6稱為「S2A序列」，SEQ ID NO:7稱為「K4C序列」，SEQ ID NO:8稱為「K4G序列」，SEQ ID NO:9稱為「C1G序列」，以及將SEQ ID NO:10稱為「C1C序列」；此外，本試驗所使用的tracrRNA為購自Horizon Discovery公司的產品(Edit-R tracrRNA)。
(1)、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染效率測試
首先，將Cas9-Suntag與gRNA結合，此實施例使用的gRNA帶有針對Oct4基因設計的「O1C序列」的crRNA，接著使用MQIP吸附Cas9-Suntag後，再將獲得的蛋白質萃取液原液(1X 萃取液)、稀釋5倍的萃取液(0.2X 萃取液)與HEK293細胞共同培養12-48小時，之後再進行免疫螢光染色以並偵測細胞內Cas9融合蛋白(Cas9-Suntag)以及目標蛋白質Oct4之表現，並以核酸染劑DAPI的染色情形作為細胞存活的指標；本實驗中係以洗去MQIP後剩下的蛋白質溶液作為對照組。請參見第四圖，對照組的細胞存活情形不佳，推測是因為洗去MQIP後的蛋白質溶液會造成細胞培養液滲透壓的劇烈改變，進而導致細胞死亡，此外對照組中存活的細胞內亦沒有偵測到Cas9或是Oct4的表現，表示在沒有MQIP的存在下，Cas9-Suntag並無法進入到細胞中；1X 萃取液組的細胞生長情形良好，且細胞內亦可觀察到Cas9與Oct4的表現；0.2X 萃取液組的細胞生長情形亦佳，且也可以在細胞內觀察到Cas9與Oct4的表現，但Cas9與Oct4的表現強度比1X萃取液組相比明顯較低。
(2)、gRNA與Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染效率測試
本實施例中係使用Cas9-Suntag，Cas9-VPR與Cas9-P300三種融合蛋白，與不同gRNA的結合後，再觀察對於Oct4基因表現的變化，若Cas9融合蛋白能活化Oct4基因，則Oct4蛋白質的表現也會增加，本實施例使用gRNA為包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的gRNA。
此實驗中，先將crRNA與tracrRNA以等比例混和靜置30分鐘以獲得gRNA；接著將gRNA與含有純化後Cas9融合蛋白的溶液混合，再靜置30分鐘以獲得Cas9-RNPs；再將Cas9-RNPs與Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子混合，進行30分鐘的吸附作用，以獲得MQIP-Cas9-RNPs，再利用磁鐵收集MQIP-Cas9- RNPs；若使用的crRNA為O1A序列，則將該MQIP-Cas9- RNPs稱為MQIP-Cas9- RNPs(O1A)，以此類推；將獲得的MQIP-Cas9-RNPs以500 μg/培養孔的使用量，加入培養於24孔盤的HEK293細胞中，作用48小時，再將細胞進行Cas9與Oct4蛋白質的免疫螢光染色，以觀察Oct4蛋白質的表現。請參見第五圖，為使用MQIP-Cas9- RNPs(O1A)轉染細胞後的免疫螢光染色分析圖，根據第五圖，轉染MQIP-Cas9-Suntag-RNPs(O1A)、MQIP-Cas9-VPR-RNPs(O1A)與MQIP-Cas9- P300-RNPs(O1A)的細胞中，皆可以觀察到Oct4蛋白質的表現。進一步將免疫螢光染色之照片以Image J軟體進行螢光發光面積之定量，以比較三種Cas9融合蛋白質對於Oct4表現量之影響；請參見第六圖(A)之Cas9融合蛋白質表現定量圖，其中Cas9-P300的表現量最高，為Cas9-Suntag與Cas9-VPR之1.5~2倍；再請參見第六圖(B)之Oct4蛋白質表現定量圖，表現Cas9-Suntag組別中，HEK293細胞內的Oct4蛋白質表現量最高。
請參見第七圖，為使用MQIP-Cas9- RNPs(O1C)轉染細胞後的免疫螢光染色分析圖，根據第七圖，轉染MQIP-Cas9-Suntag-RNPs(O1C)、MQIP-Cas9-VPR-RNPs(O1C)與MQIP-Cas9-P300-RNPs(O1C)的細胞中皆可以觀察到Oct4蛋白質表現。進一步定量免疫螢光染色照片的螢光發光面積，請參見第八圖(A)之Cas9融合蛋白質表現定量圖，Cas9-P300的表現量最高，為Cas9-Suntag與Cas9-VPR表現量的1.5~2倍；再請參見第八圖(B)，表現Cas9-P300細胞內的Oct4蛋白質表現量亦為最高。
請再參見第九圖，進一步使用即時定量PCR，偵測細胞中Oct4的RNA表現量；第九圖結果顯示，以MQIP-Cas9-RNPs(O1A)或是MQIP-Cas9-RNPs(O1C)轉染的細胞，Oct4 RNA的表現量皆有上升，其中，轉染MQIP-Cas9(VPR)-RNPs(O1C)以及轉染MQIP-Cas9(Suntag)-RNPs(O1C)的二組別，其Oct4 RNA的表現量為各組中最高。
又，根據先前研究，Oct4蛋白質為轉錄因子(transcription factor)，會調控細胞內的多種基因表現，且對於未分化胚胎幹細胞的自我更新與維持幹細胞特性相當重要，故進一步以即時定量PCR偵測細胞中Oct4蛋白質下游基因的表現情形；請參見十圖，將MQIP-Cas9-RNPs(O1A)或MQIP-Cas9-RNPs(O1C)轉染HEK293細胞後，細胞內的β-catenin表現量皆有明顯上升的情形；請再參見第十一圖，將MQIP-Cas9-RNPs(O1A)或是MQIP-Cas9-RNPs(O1C)轉染HEK293細胞後，細胞內的STAT3表現量亦會上升，但是cMyc基因的表現量則無顯著改變；請再參見第十二圖，轉染MQIP-Cas9-RNPs(O1A)或是MQIP-Cas9-RNPs(O1C)後，HEK293細胞的HRAS、KRAS與ERK2的表現量也會上升，又以轉染MQIP-Cas9(P300)- RNPs(O1C)之細胞具有較佳的HRAS、KRAS與ERK2表現。
進一步的，本案測試攜帶SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9與SEQ ID NO:10的MOIP-Cas9-RNPs，轉染到細胞之後，細胞內各基因表現的情形。
於此實施例中，係使用Cas9-VPR融合蛋白質，並依照上述的步驟製備帶有不同gRNA的MQIP-Cas9-RNPs，再將帶有不同gRNA的MQIP-Cas9-RNPs以相同的添加量混合，以獲得一混合MQIP-Cas9-RNPs；本測試中，將帶有不同crRNA序列的MQIP-Cas9-RNPs以不同的組合轉染到細胞，並觀察細胞內各基因的表現情形；此實施例中，HEK293細胞先培養於DMED培養液中，再加入MQIP-Cas9-RNPs轉染24~72小時，轉染後每24~72小時更換一次培養液，轉染後使用的培養液為體積比1:1之Essential 8TM
mdelium (E8)/DMEM混合培養液，以刺激細胞轉化成誘導性多功能幹細胞(induced pluripotent stem cell，ipsc)；當細胞繼代培養8次之後，再將細胞以E8培養液繼續培養，並於培養1~3日後觀察細胞內各蛋白質的表現。
請參見第十三圖，為細胞內Oct4蛋白質的螢光染色定量結果，縱軸的IOD/細胞數代表「單位細胞的積分光強度」；當細胞內同時轉染MQIP-Cas9-RNPs(O1C)、MQIP-Cas9-RNPs(S2A)、MQIP-Cas9-RNPs(K4C)與MQIP-Cas9-RNPs(C1G)時，細胞內的Oct4蛋白質表現量為各組中最高；請再參見的十四圖之SOX-2蛋白質的螢光染色定量結果，同時轉染MQIP-Cas9-RNPs(O1C)、MQIP-Cas9-RNPs(S2A)、MQIP-Cas9-RNPs(K4C)與MQIP-Cas9-RNPs(C1G)時，細胞內的SOX-2蛋白質表現量亦為各組中最高；第十五圖為KLF4蛋白質的表現情形，當細胞內同時轉染MQIP-Cas9-RNPs(O1A)、MQIP-Cas9-RNPs(S2G)、MQIP-Cas9-RNPs(K4G)與MQIP-Cas9-RNPs(C1C)時，細胞內的KLF4蛋白質表現量為各組中最高；第十六圖為C-myc蛋白質的表現情形，當細胞內同時轉染MQIP-Cas9-RNPs(O1A)、MQIP-Cas9-RNPs(S2G)、MQIP-Cas9-RNPs(K4G)與MQIP-Cas9-RNPs(C1G)時，細胞內的C-myc蛋白質表現量為各組中最高。
此外，亦使用即時定量PCR的方式，觀察同時轉染MQIP-Cas9-RNPs、MQIP-Cas9-RNPs、MQIP-Cas9-RNPs與MQIP-Cas9-RNPs的細胞中，Oct4、SOX-2、KLF4以及C-myc的RNA表現量；請見第十七圖，轉染MQIP-Cas9-RNPs(O1C)、MQIP-Cas9-RNPs(S2A)、MQIP-Cas9-RNPs(K4C)與MQIP-Cas9-RNPs(C1G)的細胞，其Oct4與SOX-2的RNA表現量確實高於轉染未拓印Cas9胜肽的奈米複合粒子(NIPs)；又，轉染MQIP-Cas9-RNPs(O1C)、MQIP-Cas9-RNPs(S2A)、MQIP-Cas9-RNPs(K4G)與MQIP-Cas9-RNPs(C1G)的細胞內，KLF4的表現量高於轉染未拓印Cas9胜肽的奈米複合粒子(NIPs)；以及轉染MQIP-Cas9-RNPs(O1A)、MQIP-Cas9-RNPs(S2G)、MQIP-Cas9-RNPs(K4G)與MQIP-Cas9-RNPs(C1G)細胞，C-myc的RNA表現量確實高於轉染未拓印Cas9胜肽的奈米複合粒子(NIPs)。
根據以上實施例，本案將Cas9融合蛋白與適當的gRNA結合後，再以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子，吸附Cas9融合蛋白質-gRNA複合物，以形成MIP-Cas9-RNPs，再將MIP-Cas9-RNPs轉染到細胞內，以調控的基因處表現；根據本案實際試驗的結果，在搭配適當的crRNA下，本案之MIP-Cas9-RNPs確實可以提高目標基因的表現，甚至可進一步調控目標基因的下游基因表現，表示以本案揭露的Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子，確實可以做為轉染細胞(tranfection)的載體以及應用於調控細胞內基因表現。
此外，本案之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子具有極低的細胞毒性，作為載體使用並不會對細胞產生明顯傷害；又本案之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子內包含了磁性奈米粒子，因此相當容易純化因此於使用上兼具了安全性與方便性。
綜上所述，本發明之以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便
惟，上述所揭之說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
無
第一圖：MIP之細胞毒性與細胞存活率分析圖。
第二圖：MIP吸附Cas9融和蛋白質之酵素免疫分析圖。
第三圖：MQIP吸附Cas9融合蛋白質之免疫螢光染色分析圖。
第四圖：MQIP運送Cas9融合蛋白質至細胞之免疫螢光染色分析圖。
第五圖：細胞表現Cas9融合蛋白質之免疫螢光染色分析圖(一)。
第六圖：Cas9融合蛋白質與Oct4蛋白質之表現定量分析圖(一)。
第七圖：細胞表現Cas9融合蛋白質之免疫螢光染色分析圖(二)。
第八圖：Cas9融合蛋白質與Oct4蛋白質之表現定量分析圖(二)。
第九圖：Oct4基因之RNA表現量分析圖。
第十圖：MQIP-Cas9-RNPs調控基因表現分析圖(一)。
第十一圖：MQIP-Cas9-RNPs調控基因表現分析圖(二)。
第十二圖：MQIP-Cas9-RNPs調控基因表現分析圖(三)。
第十三圖：MQIP-Cas9-RNPs調控Oct4蛋白質表現分析圖。
第十四圖：MQIP-Cas9-RNPs調控SOX-2蛋白質表現分析圖。
第十五圖：MQIP-Cas9-RNPs調控KLF4蛋白質表現分析圖。
第十六圖：MQIP-Cas9-RNPs調控C-myc表現分析圖。
第十七圖：MQIP-Cas9-RNPs調控基因表現分析圖(四)。
無
Claims (7)
- 一種以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法，包含：將一Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子與一Cas9蛋白質-嚮導RNA複合物結合，以獲得一轉染複合物；以及將該轉染複合物施予一細胞，以使該轉染複合物進入該細胞並活化至少一基因；其中該Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子係包含一Cas9胜肽拓印之甲殼素聚合物與複數個磁性奈米粒子，並可與一Cas9蛋白質結合，其中該以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子係使用一Cas9胜肽拓印一甲殼素材料所獲得，其中該Cas9胜肽係為SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，其中該Cas9蛋白質-嚮導RNA複合物包含一Cas9蛋白質與一嚮導RNA，且其中該至少一基因係具有與該嚮導RNA具有可匹配的核酸序列。
- 如請求項1之以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法，其中該Cas9蛋白質係為一Cas9融合蛋白質。
- 如請求項2之以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法，其中該Cas9融合蛋白質為一不具有內切酶(endonuclease)活性的突變型Cas9融合蛋白質。
- 如請求項2之以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法，其中該Cas9融合蛋白質係具有轉錄活化功能。
- 如請求項1之以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法，其中該嚮導RNA係包含一轉活化crRNA(trans activating crRNA)與一crRNA，且其中該crRNA選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9與SEQ ID NO：10所構成之群組。
- 如請求項5之以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法，其中該crRNA係選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：9所構成之群組。
- 如請求項6之以Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子轉染細胞與調控基因表現的方法，其中該crRNA係由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：9所組成。
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-
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