CN103555767B - 一种层层自组装的microRNA纳米载体的制备方法及其应用 - Google Patents
一种层层自组装的microRNA纳米载体的制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103555767B CN103555767B CN201310518253.3A CN201310518253A CN103555767B CN 103555767 B CN103555767 B CN 103555767B CN 201310518253 A CN201310518253 A CN 201310518253A CN 103555767 B CN103555767 B CN 103555767B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protamine
- nano diamond
- mirna
- nano
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 title claims abstract description 12
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims abstract description 63
- 239000002113 nanodiamond Substances 0.000 claims abstract description 51
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 39
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims abstract description 39
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 claims abstract description 36
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 32
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 25
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 16
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 claims description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 6
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 238000010301 surface-oxidation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 claims 3
- 229940064302 folacin Drugs 0.000 abstract description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 8
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 abstract description 8
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 abstract description 5
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108091029119 miR-34a stem-loop Proteins 0.000 description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 108090000123 Fos-related antigen 1 Proteins 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 102000003817 Fos-related antigen 1 Human genes 0.000 description 6
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 6
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 6
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091027559 Mir-96 microRNA Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 229920002334 Spandex Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- -1 after weighing Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 210000004691 chief cell of stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091074487 miR-34 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091092493 miR-34-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091059780 miR-34-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091086713 miR-96 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091070961 miR-96-3 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- ZODDGFAZWTZOSI-UHFFFAOYSA-N nitric acid;sulfuric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O.OS(O)(=O)=O ZODDGFAZWTZOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004759 spandex Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 229940046001 vitamin b complex Drugs 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
一种层层自组装的microRNA纳米载体的制备方法及其应用属于纳米材料生物学领域。本发明涉及一种基于静电吸引力的层层自组装技术，是以纳米金刚石作为基底材料，以生物安全性良好的鱼精蛋白硫酸盐和具有肿瘤靶向功能的小分子叶酸为自组装材料，构建出具有叶酸受体靶向功能的microRNA纳米载体。本发明制备的microRNA纳米载体具有自组装形成，microRNA保护能力较强，细胞靶向能力较强，基因沉默效率较高等特点。
Description
技术领域：
本发明属于纳米材料生物学领域。本发明涉及一种基于静电吸引力的层层自组装技术，是以纳米金刚石作为基底材料，以生物安全性良好的鱼精蛋白硫酸盐和具有肿瘤靶向功能的小分子叶酸为自组装材料，构建出具有叶酸受体靶向功能的microRNA纳米载体。本发明制备的microRNA纳米载体具有自组装形成，microRNA保护能力较强，细胞靶向能力较强，基因沉默效率较高等特点。
背景技术：
RNA干扰（RNAi）是一种存在于植物和哺乳动物细胞中的基因沉默的自然机制。microRNA就是人们近年来刚刚发现的一类内源的具有RNA干扰活性的小RNA。这样的小RNA被通称为小干扰RNA。将大小在21-25bp左右的外源双链RNA（doublestrandRNA，dsRNA）导入细胞即可被加工成为单链的小干扰RNA（microinterferingRNA，以下简称miRNA），与单链miRNA互补的mRNA即可被降解并抑制其翻译表达即导致基因沉默。RNAi具有较好的特异性，RNAi技术的应用将为人类疾病的基因治疗开辟一个革命性的领域，对生命科学的影响将不亚于PCR技术。目前有3种方法可以触发RNA干扰：在靶细胞中引入可转录产生干扰RNA的DNA质粒；引入干扰RNA前体分子；在靶细胞中引入合成的小分子干扰RNA(miRNA)。其中，第三种方法因合成miRNA的化学反应步骤比较简单、非特异性不良反应小而引起了广泛关注。
miRNA不稳定，易被酶降解，难以被细胞吞噬，高效的转染载体对于其应用的发挥至关重要。目前利用重组病毒作为miRNA体内传递载体虽然传递效率高，但是潜在的生物安全性问题限制了其应用。非病毒型miRNA载体通常包括阳离子脂质体和阳离子聚合物两大类，阳离子脂质体转染效率高，但是其生物相容性差、细胞毒性大。阳离子聚合物虽然对质粒转染效率较高，但是对于小分子量的miRNA，其转染能力较弱，而且肿瘤组织靶向性较差。因此选择合适的miRNA传递载体，制备安全、稳定、高效且具有肿瘤靶向性的载体/miRNA复合粒子具有重要意义。
miR-34a被发现在乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞中低表达，而提高miR-34a在MDA-MB-231细胞中的表达量能够抑制MDA-MB-231细胞中Fra-1基因的表达，从而抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力（Yang,S.,Li,Y.,Gao,J.,Zhang,T.,Li,S.,Luo,A.,...&Liu,Z.(2012).MicroRNA-34suppressesbreastcancerinvasionandmetastasisbydirectlytargetingFra-1.Oncogene.）。
纳米金刚石是一种碳纳米材料，生物相容性好，细胞毒性小，它与PEI等高分子相互作用，被用作基因载体。我们使用纳米金刚石与鱼精蛋白硫酸盐相互作用形成的纳米颗粒作为siRNA载体（专利公开号：103060379A），但是迄今为止，并未见使用该种颗粒吸附miRNA并具有癌细胞靶向效果的报道。
叶酸是维生素B复合体之一，它能够特异性的与叶酸受体结合，其平衡解离常数可以达到10-9mol/L，是单克隆抗体与肿瘤细胞表面受体的亲和力的100多倍。癌组织细胞表面存在着相对正常组织细胞高表达的叶酸受体，这种特性使得叶酸受体可以成为肿瘤靶向治疗的通路，使用叶酸做为给药系统的靶向分子可以使得药物富集在肿瘤组织细胞中。
发明内容：
本发明的目的是提供一种以纳米金刚石为基底材料，通过静电吸引力的层层自组装技术构建出具有靶向功能，能较好的保护miRNA的纳米载体。以纳米金刚石和鱼精蛋白硫酸盐相互作用形成的纳米颗粒作为miRNA传递载体，并在形成的miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石纳米颗粒的外层再吸附上鱼精蛋白硫酸盐，最后将具有靶向功能的小分子叶酸吸附于纳米材料的最外层。该载体具有快捷的制备过程，RNA保护效果较好，癌细胞靶向效果较好，基因沉默效果良好的特点。
本发明提供一种具有乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞靶向作用的miRNA输送载体，其活性成分为纳米金刚石与鱼精蛋白硫酸盐通过极性相互作用形成基本骨架，在鱼精蛋白硫酸盐的外层通过极性作用吸附上miRNA，然后依次在miRNA的外层吸附上鱼精蛋白硫酸盐和叶酸。
一种层层自组装的microRNA纳米载体的制备方法，其特征在于，
将纳米金刚石经过表面氧化处理，得到纳米金刚石溶液；在鱼精蛋白硫酸盐溶液过量的情况下，将纳米金刚石溶液和鱼精蛋白硫酸盐溶液混合，得到混合溶液；将得到的混合溶液离心后得到沉淀物，将得到的沉淀物溶解在去离子水中形成鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料。纳米金刚石通过极性相互作用吸附鱼精蛋白硫酸盐后，鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的动力学尺寸为114nm-115nm，表面zeta电位为33.5mV-34.1mV。
进一步的，所述的鱼精蛋白硫酸盐来源于鲑鱼。
将miRNA与鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料按照溶质质量比1:4混合得到miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石混合溶液，得到的混合溶液离心后得到沉淀物，将得到的沉淀物溶解在去离子水中形成miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料。miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的动力学尺寸为170nm-173.3nm，表面zeta电位为-20.1mV--21.2mV。
将得到的miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石混合溶液加入到浓度为2mg/ml的鱼精蛋白硫酸盐溶液中，使得鱼精蛋白硫酸盐过量，得到鱼精蛋白-miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石混合溶液，得到的混合溶液离心后得到沉淀物，将得到的沉淀物在去离子水中形成鱼精蛋白-miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料。鱼精蛋白-miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的动力学尺寸为200nm-201.5nm，表面zeta电位为18.5mV-19.2mV。
将叶酸溶解于pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液中得到浓度为10mg/ml的叶酸溶液，叶酸处于过量状态，将得到的鱼精蛋白-miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石混合溶液加入到该叶酸溶液中。得到的混合溶液离心后得到沉淀物，将得到的沉淀物溶解于水中，得到叶酸-鱼精蛋白-miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石层层自组装多功能纳米基因载体。该叶酸-鱼精蛋白-miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的动力学尺寸为209.5nm-210.3nm，表面zeta电位为-25.8mV--26.3mV。
一种层层自组装的microRNA纳米载体在生物学领域的应用。
从分子结构上分析，本发明提供的具有叶酸受体靶向作用的miRNA载体由鱼精蛋白硫酸盐和纳米金刚石通过极性相互作用形成基本骨架结构，负载的miRNA位于中间层，静电吸引鱼精蛋白硫酸盐，最后叶酸通过静电相互作用吸附在最外层。鱼精蛋白硫酸盐吸附于纳米金刚石表面。鱼精蛋白硫酸盐是一种水溶性的强阳离子蛋白质，能够与核酸的磷酸基团带的阴性电荷中和，产生强大的核酸亲和力。但是单独的鱼精蛋白硫酸盐因为分子量大，转染分子量较小的miRNA能力弱，而纳米金刚石是一种碳纳米材料，与其它碳纳米材料相比，如碳纳米管，其毒性小，生物相容性较好，其表面富集大量的羟基、羧基、羰基等，易与鱼精蛋白硫酸盐中的氨基酸通过氢键和电荷作用相互吸引，形成鱼精蛋白硫酸盐包裹纳米金刚石的纳米颗粒，其表面带有强正电荷，易吸附miRNA形成基因转染试剂。为了增加其靶向功能，再吸附上一层鱼精蛋白硫酸盐，使复合材料带正电荷，最后吸附带负电的叶酸，形成表面带有叶酸的层层自组装材料。叶酸做为靶向肿瘤的生理性配体，具有低成本、化学性质稳定，生物相容性良好、无免疫原性等优点，而且叶酸与其受体的结合具有特异性、选择性、饱和性、亲和力强和对多种肿瘤有效等特点。
本发明的miRNA输送载体能通过自组装方式形成纳米颗粒，具有合适的理化性质，较好的稳定性，制备方法简单，可重复性高，能够较好的保护miRNA免受降解，同时拥有MDA-MB-231细胞的特异性靶向能力，且能有效的保证miR-34a能在细胞内发挥抑制MDA-MB-231细胞迁移能力的作用，结合纳米材料特有的尺寸效应，是一种良好的miRNA基因载体。
本发明中，提供的miRNA输送载体是通过与MDA-MB-231细胞膜表面的叶酸受体结合而进入癌细胞的，这使得本发明提供的miRNA输送载体具有富集在叶酸受体高表达的癌细胞中的特征。
附图说明
图1为制备过程中复合材料的电镜结构，其中a：PS/NDsb：miR-34a/PSNDsc：PS/miR-34a/PSNDsd：FA/PS/miR-34a/PSNDs，标尺为5nm；
图2为制备过程中复合材料的粒径大小变化情况；
图3为制备过程中复合材料的zeta电位变化情况；
图4为FA/PS/miR-34a/PSNDs、单一的miRNA在DMEM培养基中孵育不同时间后，没有降解的miRNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图5为激光共聚焦显微镜下观察到的FA/PS/miR-34a/PSNDs负载的Cy3标记的miRNA进入MDA-MB-231细胞情况。使用DAPI对细胞核进行染色，激发波长为364，蓝光视野，Cy3激发波长为550，红光视野。A组为FA/PS/miR-34a/PSNDs转染MDA-MB-231；B组使用叶酸溶液封闭MDA-MB-231表面的叶酸受体后，转染FA/PS/miR-34a/PSNDs；
图6为转染FA/PS/miR-34a/PSNDs后，MDA-MB-231细胞迁移能力的变化情况；
图7为转染FA/PS/miR-34a/PSNDs后，MDA-MB-231细胞迁移能力的定量计算结果；
图8为转染FA/PS/miR-34a/PSNDs后，MDA-MB-231细胞中miR-34a的靶蛋白Fra-1的表达情况；
图9为转染FA/PS/miR-34a/PSNDs后，MDA-MB-231细胞中miR-34a的靶蛋白Fra-1的表达量的定量计算结果；
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
1、纳米金刚石的制备
将浓度为150mg/ml纳米金刚石（Nanodiamond，ND，以下简称ND）水凝胶（产品目录号：386-8567，Tokida，Ueda，Nagano）用去离子水稀释成ND浓度为1mg/ml的水溶液，取2ml用KQ-100DB超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司）在100W功率下超声2h，得到ND浓度为1mg/ml的水溶液。
2、纳米金刚石表面氧化
将质量分数为98%硝酸和质量分数为98%硫酸按质量比硝酸:硫酸=3:1混合，在140℃下，将1中得到的ND浓度为1mg/ml的水溶液置于上述硝酸和硫酸的混合液中反应12h，将反应产物离心，得到的沉淀用去离子水清洗并离心，重复3遍，得到的沉淀最后溶解于去离子水中并置于真空干燥箱中60℃干燥过夜，称量干燥后的产物，称量后将产物溶于去离子水中，制成ND浓度为1mg/ml的水溶液。
3、纳米金刚石-鱼精蛋白纳米复合载体的制备
取40mg鱼精蛋白硫酸盐（产品目录号：PS4020，SigmaAdrich公司），溶于4ml去离子水中，超声10分钟，加速溶解，制成10mg/ml的鱼精蛋白硫酸盐溶液。为了制备鱼精蛋白-纳米金刚石复合物（以下简称PSNDs），按溶质质量比纳米金刚石:鱼精蛋白硫酸盐=1:20，即2ml1mg/ml的ND溶液与4ml10mg/ml的鱼精蛋白硫酸盐溶液混合，漩涡混合器（ScientificIndustriesInc）涡旋2分钟，使鱼精蛋白硫酸盐与ND充分相互作用，将得到的混合溶液以13000rpm的离心速度离心15min，去除上清液，得到离心沉淀物，并再次用去离子水重悬，离心得到沉淀，重复3次。将最终得到的离心产物冻干、称量，称量后将产物溶于去离子水中，制成PSNDs浓度为0.6mg/ml的溶液。
4、叶酸-鱼精蛋白-miRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白载体的制备
将40μgmiRNA-34a（广州锐博生物技术公司）溶于500μl无RNase的水中，制成浓度为80μg/ml的工作液。将300μgPSNDs复合物溶于500μl无RNase的水中，制成浓度为600μg/ml的工作液。取200μlmiRNA-34a（16μg）工作液，按质量比例miRNA:PSNDs=1:4取对应量的PSNDs，将miRNA加入PSNDs中，加入的过程中使用涡旋振荡仪震荡混匀，室温孵育15min，制成miRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白复合物（以下简称miR-34a/PSNDs）。
将得到的miR-34a/PSNDs溶液加入到500μl浓度为2mg/ml的鱼精蛋白硫酸盐溶液中，加入的过程中使用涡旋振荡仪震荡混匀，将得到的混合溶液以13000rpm的离心速度离心15min，去除上清液，得到离心沉淀物，并再次用去离子水重悬，离心得到沉淀，重复3次。将最终得到的离心产物溶于去离子水中，制成鱼精蛋白-miR-34a-鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料（以下简称PS/miR-34a/PSNDs）的溶液。
将得到的PS/miR-34a/PSNDs的溶液逐渐缓慢的加入到500μl浓度为10mg/ml的叶酸溶液中，其中叶酸溶解于pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液中。加入的过程中使用涡旋振荡仪震荡混匀，将得到的混合溶液以13000rpm的离心速度离心15min，去除上清液，得到离心沉淀物，并再次用去离子水重悬，离心得到沉淀，重复3次。将最终得到的离心产物溶于去离子水中，制成叶酸-鱼精蛋白-miR-34a-鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料（以下简称FA/PS/miR-34a/PSNDs）的溶液。
5、NDs和FA/PS/miR-34a/PSNDs形貌的表征
采用高分辨透射电镜观察复合纳米材料的物理形态，取未经处理的ND和FA/PS/miR-34a/PSNDs复合材料混悬液少许，滴至微栅铜网上，过夜干燥后，放入透射电镜下观察材料的形态并拍照。
结果如图1所示，可以明显观察到具有晶格结构的纳米金刚石部分和周围不同层次的无定型态结构。并且，随着层层自组装的进行，表面的无定形态的厚度也有所增加。
6、PSNDs，miR-34a/PSNDs、PS/miR-34//PSNDs、FA/PS/miR-34a/PSNDs复合物粒径大小和表面zeta电位的检测
将上述步骤中得到的PSNDs，miR-34a/PSNDs，PS/miR-34a/PSNDs，FA/PS/miR-34a/PSNDs分别稀释成60μg/ml的浓度，通过ZetasizerNanoZS(Malvern,Worcestershire,U.K.）测试复合物的粒径和表面zeta电位。测试粒径的参数为25℃，173°散射角。表面电位的测定是基于纳米粒子在溶液中的电泳迁移率，在自动模式下测定。
结果如图2、图3所示，随着自组装过程的进行，载体电位发生了逆转，动力学尺寸逐渐增大。
7、FA/PS/miR-34a/PSNDs对miRNA保护效果
为检测FA/PS/miR-34a/PSNDs在生理环境下保护miRNA免受降解的效果，将FA/PS/miR-34a/PSNDs与含10%胎牛血清，1%谷氨酰胺的DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedia，产品目录号11995，lifetechnology公司）培养基于37℃，5%CO2(v/v)，70%湿度的培养箱（赛默飞世尔科技公司）中共孵育，以单独的miRNA为对照组，孵育时间设为0h、4h、8h、12h、16h、24h后，加入5μl2%SDS，与miRNA竞争性结合到FA/PS/miR-34a/PSNDs上，以使被保护的miRNA脱离下来从而检测被保护miRNA的总量。
取7.5μl加入了2%SDS的FA/PS/miR-34a/PSNDs和DMEM混合物，与2.5μl80%甘油混合，110V电压，于2%琼脂糖凝胶上进行电泳（含0.5mg/mlEB），10minhou观察，拍照。
结果如图4所示，表明FA/PS/miR-34a/PSNDs能够较好的在含10%血清的DMEM细胞培养基中保护microRNA不被降解。
8、细胞摄取FA/PS/miR-34a/PSNDs复合物能力检测
1）、细胞培养及接种
本发明使用乳腺癌细胞系MDA-MB-231做为细胞实验对象，MDA-MB-231细胞由中国科学院国家纳米中心提供，使用含10%胎牛血清，1%谷氨酰胺的DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedia，产品目录号11995，lifetechnology公司）培养基，于37℃，5%CO2(v/v)，70%湿度的培养箱（赛默飞世尔科技公司）中培养。将2×105个MDA-MB-231细胞接种于直径20mm，玻片厚度0.13-0.17mm的Confocal专用培养皿（产品目录号801001，无锡耐思生物科技有限公司）中，使用10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、无抗生素DMEM培养，过夜贴壁。
2）、FA/PS/miR-34a/PSNDs加入培养基及观察
按步骤4制备FA/PS/miR-34a/PSNDs，将得到的FA/PS/miR-34a/PSNDs与1ml无血清DMEM培养基于1.5ml无RNase道夫管中混匀，加入铺有MDA-MB-231细胞的Confocal培养皿中，miRNA的终浓度为100nM。设置叶酸受体封闭对照组，即加入FA/PS/miR-34a/PSNDs之前，将2mg/ml的叶酸溶液加入到细胞培养基中，37℃孵育30min，使得MDA-MB-231细胞表面的叶酸受体得到充分的封闭。封闭完成后，换成无血清的DMEM培养基，加入FA/PS/miR-34a/PSNDs，使得miRNA终浓度为100nM，置于37℃，5%CO2(v/v)，70%湿度的培养箱中培养，6h后将培养基换成10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、无抗生素DMEM完全培养基，于37℃，5%CO2(v/v)，70%湿度的条件培养24h后，去除旧培养基，PBS洗涤细胞3遍，每个培养皿加入1ml4%多聚甲醛固定液，固定20min，去除固定液，PBS洗涤3遍，每个培养皿加入1mlDAPI染色液（产品目录号C1005，碧云天生物技术研究所），染色10min，去除DAPI染色液，PBS洗涤3遍，每次2min。激光共聚焦显微镜（德国莱卡公司）观察miR-34a在MDA-MB-231细胞内的分布情况，并对比叶酸阻滞组，观察靶向效果。
结果如图5所示，表明使用本发明的载体能够将标记了Cy3的miR-34a输送至细胞内，并且具有基于叶酸受体摄取的特异靶向性。
9、FA/PS/miR-34a/PSNDs对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响
本发明使用的miR-34a据文献报道能够抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力，为评价本发明提供的运输载体能否使得miR-34a在MDA-MB-231细胞中发挥功能，使用Tranaswell法对MDA-MB-231细胞的迁移能力进行检测。
1）、细胞培养及接种
使用FA/PS/miR-34a/PSNDs转染MDA-MB-231细胞，设置对照组：A：叶酸溶液封闭组（Block-FA/PS/miR-34a/PSNDs）；B：无义miR组（FA/PS/N.C./PSNDs）；C：只加材料PSNDs组（control）。转染48h后，消化细胞，重悬在0.1%血清的DMEM培养基中，制成细胞悬液。
2）、Transwell法
（1）使用孔径大小为0.8μm的24孔板Transwell小室（Corning,USA），接种2×105个1）中的细胞到Transwell小室中，24孔板下室加入30%血清的DMEM培养基，37℃，5%CO2(v/v)，70%湿度的条件培养24h。
（2）取出Transwell小室，用棉签擦去上室中未迁移过去的细胞，浸入4%多聚甲醛中固定20min，取出小室晾干后使用结晶紫染色15min，之后使用去离子水清洗3次，晾干后倒置显微镜明场观察拍照。
（3）迁移率计算：使用倒置显微镜取10个不同的视野，对细胞进行计数，取平均值，按如下公式计算细胞的迁移率：
Relativerateofmigration(%)=migratingcellswithtreatment/migratingcellswithouttreatment×100
结果如图6、图7所示，表明FA/PS/miR-34a/PSNDs能够使得miR-34a在MDA-MB-231中行使抑制细胞迁移的功能。
10、FA/PS/miR-34a/PSNDs对miR-34a靶点Fra-1的抑制效率测定
本发明使用的miR-34a购自于广州锐博生物技术公司，能够特异性的抑制MDA-MB-231中的Fra-1基因。
1）、细胞培养及接种
（1）、将5×105个MDA-MB-231细胞接种于6孔板（GreinerBio-one公司），使用10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、无抗生素的DMEM培养基，过夜贴壁后细胞汇合度达到70%-80%；（2）将FA/PS/miR-34a/PSNDs加入到1ml无血清、1%谷氨酰胺、无抗生素的DMEM培养基中，充分混匀；
2）、转染FA/PS/miR-34a/PSNDs
去除6孔板中的旧培养基，加入含有FA/PS/miR-34a/PSNDs的培养基，设置对照组，分别为：A：为使用无义链（NoCodingmiRNA）miR制备的FA/PS/N.C/PSNDs进行转染，B：为叶酸溶液封闭叶酸受体后转染FA/PS/miR-34a/PSNDs，C：不封闭叶酸受体，转染FA/PS/miR-34a/PSNDs。37℃培养6h后换成10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、无抗生素的DMEM培养基，继续培养48h；
3）、细胞蛋白提取及定量
（1）配制细胞裂解液：使用细胞裂解液位RIPA裂解液（强）（产品目录号：P0013B，碧云天生物技术研究所）裂解细胞，使用前数分钟加入PMSF（产品目录号ST506，碧云天生物技术研究所），使得PMSF的终浓度为1mM；（2）、去除各个孔中的培养基，PBS洗涤3遍，每个孔中加入200μl配置好的RIPA裂解液（强）。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，冰上孵育5min；（3）、总蛋白定量：使用BCA蛋白定量试剂盒（产品目录号PA115，天根生化科技有限公司）进行蛋白定量，具体步骤如下：①、制备标准品：使用配置好的RIPA裂解液（强）按下表对BSA标准品进行稀释：②、配制BCA工作液：将试剂A充分混匀，然后按照试剂A和试剂B按体积比为50:1配制10ml工作液；③、吸取25μl按表1新鲜配制的标准品和提取的各实验组的总蛋白，加入96孔板（GreinerBio-one公司），每组5个复孔；④、每孔中加入200μlBCA工作液，并充分混匀；⑤、加盖，37℃孵育30min后冷却至室温；⑥、在多功能微孔板检测仪（美国珀金埃尔默公司）于562nm处检测吸光值；⑦、由标准品制出标准曲线，并根据标准曲线计算各实验组中的蛋白含量；
表1BSA标准浓度配制表
4、WesternBlot检测Fra-1表达量
使用5×蛋白变性剂对提取的蛋白进行变性，变性后取30μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭4h，使用封闭液按1:200倍稀释Fra-1一抗（Bioworld,USA），1：500倍稀释GAPHD一抗（CellsignalingInc.,USA），4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，使用羊源抗兔的IRDye800标记二抗（KPL,USA）孵育40min，TBST，TBS分别洗3次，使用Odysseyinfraredimagingsystem(LI-CORBiosciences,USA)进行观察。
结果如图8、图9所示，结果显示通过复合材料运载进入细胞的miR-34a能有效的进入MDA-MB-231细胞并发挥抑制Fra-1蛋白水平表达量的作用。
Claims (3)
1.一种层层自组装的microRNA纳米载体的制备方法，其特征在于，
将纳米金刚石经过表面氧化处理，得到纳米金刚石溶液；纳米金刚石溶液和鱼精蛋白硫酸盐溶液混合得到混合溶液；将得到的混合溶液离心后得到沉淀物，将得到的沉淀物溶解在去离子水中形成鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料，纳米金刚石通过极性相互作用吸附鱼精蛋白硫酸盐后得到鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料，鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的动力学尺寸为114nm-115nm，表面zeta电位为33.5mV-34.1mV；
将miRNA与鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料按照溶质质量比1：4混合得到miRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白复合物，动力学尺寸为170nm-173.3nm，表面zeta电位为-20.1mV--21.2mV；再次吸附上鱼精蛋白硫酸盐后，得到的鱼精蛋白-miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石的动力学尺寸为200nm-201.5nm，表面zeta电位为18.5mV-19.2mV；最外层吸附上叶酸后得到的叶酸-鱼精蛋白-miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石转染试剂的动力学尺寸为209.5nm-210.3nm，表面zeta电位为-25.8mV--26.3mV；叶酸吸附是将叶酸溶解于pH＝8.0的磷酸盐缓冲溶液中后，再加入鱼精蛋白-miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石。
2.根据权利要求1所述一种层层自组装的microRNA纳米载体的制备方法，其特征在于：所述的鱼精蛋白硫酸盐来源于鲑鱼。
3.根据权利要求1所述方法制备的叶酸-鱼精蛋白-miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石转染试剂的应用，其特征在于：
叶酸-鱼精蛋白-miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石转染试剂在靶向性结合乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞并抑制其细胞迁移中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310518253.3A CN103555767B (zh) | 2013-10-28 | 2013-10-28 | 一种层层自组装的microRNA纳米载体的制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310518253.3A CN103555767B (zh) | 2013-10-28 | 2013-10-28 | 一种层层自组装的microRNA纳米载体的制备方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103555767A CN103555767A (zh) | 2014-02-05 |
| CN103555767B true CN103555767B (zh) | 2016-07-13 |
Family
ID=50010113
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310518253.3A Expired - Fee Related CN103555767B (zh) | 2013-10-28 | 2013-10-28 | 一种层层自组装的microRNA纳米载体的制备方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103555767B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107865970B (zh) * | 2016-09-27 | 2021-04-02 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种以纳米金刚石为载体的多功能靶向给药体系的构建及其应用 |
| CN109486906A (zh) * | 2018-11-16 | 2019-03-19 | 中山大学附属第五医院 | 基于静电亲和纳米转运载体及细胞成像的胞内microRNA非酶扩增检测方法 |
| CN111000566B (zh) * | 2019-12-13 | 2021-05-11 | 江南大学 | 具有光热效应和抗菌功能的可穿戴柔性传感器 |
| CN114908123B (zh) * | 2021-02-08 | 2024-02-02 | 中国科学院生物物理研究所 | 介导非编码小rna进入细胞的方法 |
| CN113402722B (zh) * | 2021-05-28 | 2023-03-24 | 云南师范大学 | 一种鱼精蛋白复合材料及其制备方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102525882A (zh) * | 2012-02-28 | 2012-07-04 | 上海市肿瘤研究所 | 一种纳米复合温敏凝胶剂及其制备方法和应用 |
| CN102600474A (zh) * | 2012-02-17 | 2012-07-25 | 上海市肿瘤研究所 | 聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸-聚-l-赖氨酸嵌段聚合物在递送药物或基因中的应用 |
| WO2012107579A1 (en) * | 2011-02-10 | 2012-08-16 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Hydrophobic modified peptides and their use for liver specific targeting |
| CN103060379A (zh) * | 2012-12-25 | 2013-04-24 | 北京工业大学 | 一种鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的制备方法及其应用 |
-
2013
- 2013-10-28 CN CN201310518253.3A patent/CN103555767B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012107579A1 (en) * | 2011-02-10 | 2012-08-16 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Hydrophobic modified peptides and their use for liver specific targeting |
| CN102600474A (zh) * | 2012-02-17 | 2012-07-25 | 上海市肿瘤研究所 | 聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸-聚-l-赖氨酸嵌段聚合物在递送药物或基因中的应用 |
| CN102525882A (zh) * | 2012-02-28 | 2012-07-04 | 上海市肿瘤研究所 | 一种纳米复合温敏凝胶剂及其制备方法和应用 |
| CN103060379A (zh) * | 2012-12-25 | 2013-04-24 | 北京工业大学 | 一种鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的制备方法及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 肿瘤特异性标志及生物靶向纳米制剂的研究;牛瑞芳;《中国博士学位论文全文数据库》;20130515(第5期);摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103555767A (zh) | 2014-02-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xi et al. | Drug loading techniques for exosome-based drug delivery systems | |
| Wang et al. | Near-infrared light triggered photodynamic therapy in combination with gene therapy using upconversion nanoparticles for effective cancer cell killing | |
| CN103555767B (zh) | 一种层层自组装的microRNA纳米载体的制备方法及其应用 | |
| Ladeira et al. | Highly efficient siRNA delivery system into human and murine cells using single-wall carbon nanotubes | |
| Zhang et al. | Multifunctional fluorescent-magnetic polyethyleneimine functionalized Fe 3 O 4–mesoporous silica yolk–shell nanocapsules for siRNA delivery | |
| Zhang et al. | DNA tetrahedron delivery enhances doxorubicin-induced apoptosis of HT-29 colon cancer cells | |
| CN103060379B (zh) | 一种鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的制备方法及其应用 | |
| Rabiee et al. | Aptamer hybrid nanocomplexes as targeting components for antibiotic/gene delivery systems and diagnostics: a review | |
| CN106890343B (zh) | 一种靶向型多肽纳米基因载体复合物 | |
| Li et al. | A siRNA-induced peptide co-assembly system as a peptide-based siRNA nanocarrier for cancer therapy | |
| JP2021534237A (ja) | 吸入用細胞外小胞 | |
| Sun et al. | Targeting and regulating of an oncogene via nanovector delivery of MicroRNA using patient-derived xenografts | |
| CN108175759A (zh) | 一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用 | |
| Sancho-Albero et al. | Use of exosomes as vectors to carry advanced therapies | |
| Cen et al. | Improving magnetofection of magnetic polyethylenimine nanoparticles into MG-63 osteoblasts using a novel uniform magnetic field | |
| Zhang et al. | High transfection efficiency of quantum dot-antisense oligonucleotide nanoparticles in cancer cells through dual-receptor synergistic targeting | |
| CN105802998B (zh) | 一种层层包覆结构的磁性纳米球及其制备方法和应用 | |
| CN102935239B (zh) | 用于预防或治疗肺癌的制剂及其制备方法与应用 | |
| CN109651811A (zh) | 磁性sf/pei纳米颗粒及其用途 | |
| Yang et al. | Enhanced survivin siRNA delivery using cationic liposome incorporating fatty acid-modified polyethylenimine | |
| Vankayala et al. | A general strategy to achieve ultra-high gene transfection efficiency using lipid-nanoparticle composites | |
| Li et al. | Rod-shaped polypeptide nanoparticles for siRNA delivery | |
| Li et al. | siRNA design and delivery based on carbon nanotubes | |
| Yang et al. | Attaching biosynthesized bacterial magnetic particles to polyethylenimine enhances gene delivery into mammalian cells | |
| CN105169402A (zh) | 靶向免疫治疗胰腺癌的载药纳米微粒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20170527 Address after: 610000 Tianfu Life Science Park, No. 88 South Garden Road, Chengdu hi tech Zone, Sichuan, China Patentee after: Chengdu Dapu Medical Devices Co., Ltd. Address before: 100124 Chaoyang District, Beijing Ping Park, No. 100 Patentee before: Beijing University of Technology |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20170830 Address after: 100000, No. 100, Paradise Village, Chaoyang District, Beijing Patentee after: Sheng Wang Address before: 610000 Tianfu Life Science Park, No. 88 South Garden Road, Chengdu hi tech Zone, Sichuan, China Patentee before: Chengdu Dapu Medical Devices Co., Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20171117 Address after: 610000, 99, 1, 107, 1, No. 3, No. 1, West Street, Jinhui District, Chengdu, Sichuan Patentee after: Chengdu Yu Huanong Biological Technology Co. Ltd. Address before: 100000, No. 100, Paradise Village, Chaoyang District, Beijing Patentee before: Sheng Wang |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160713 Termination date: 20181028 |