CN114908123B - 介导非编码小rna进入细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种介导非编码小RNA进入细胞的方法，其中，将细胞与裸露的非编码小RNA在含有血清的细胞培养液中进行孵育。本发明的方法能够避免现有方法中转染试剂带来的副作用，且对细胞的饲养没有任何影响。
Description
技术领域
本发明涉及一种介导非编码小RNA进入细胞的方法，以及该导入方法在基础科研和商业方面的应用。
背景技术
RNA的转染是基础实验中亟待解决的重点和难点之一。一方面，在体注射或离体细胞孵育非编码RNA，很难使RNA被吸收并进入组织或细胞中。目前常用的方法是使用脂质体、囊泡或外泌体包裹非编码RNA转染细胞。RNA包括长链编码RNA(mRNA)、长链非编码RNA(LncRNA)与非编码小RNA(rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和microRNA等)。其中，mRNA是生物体DNA编码蛋白质的媒介，是基因转录表达所必需的RNA分子。而非编码小RNA，如rRNA和microRNA也可以通过影响mRNA的翻译过程，进而调控基因的表达。因此，将人工合成和/或生物体内纯化得到的RNA转染至细胞内，是探究RNA作用和开展RNA应用最直接的方式方法。但是，目前为止，实践中常用的是选择亲脂载体(如：脂质体)，或囊泡/外泌体载体等外源性大分子载体作为递送介质将RNA导入细胞，在此过程中不仅需要添加此类外源性递送载体，而且需要一定步骤的实验操作。本发明提供了另一种无需添加外源性载体就可以将RNA导入至细胞内的方法。
此外，在医学应用方面，某些生物类产品和药物富含非编码小RNA。并且，动植物的小RNA进入细胞后可直接参与调控一系列靶基因，进而调控细胞甚至器官的生物学功能。然而，如何能让生物制品和药物中的成分有效地进入细胞，一直是一个难题。本发明人通过研究发现，人或哺乳动物的血清可以介导细胞对小RNA的吸收和利用，为含有小RNA成分的物质被细胞或组织吸收进而发挥功能提供了简单有效的方法。
发明内容
本发明提供了一种介导非编码小RNA进入细胞的方法，具体为使用哺乳动物的血清即可使裸露的非编码小RNA高效地进入细胞，可达到甚至超过目前已知的通过脂质体转染小RNA进入细胞、囊泡/外泌体载体协助小RNA进入细胞等方法同样的效果，但是与现有方法相比，本方法更简单高效。
在现有技术中，小RNA的化学转染方法均需要添加特定的转染试剂，例如脂质体转染方法，一般需要添加lipo2000或lipo3000，将lipo2000或lipo3000与小RNA和无血清培养基混合制备转染复合物(因为血清会影响复合物的形成)，然后在无血清培养基中与细胞孵育转染(防止血清干扰转染)，转染之后转移至细胞培养基进行培养。而本发明人发现，血清能够帮助小RNA进入细胞，也就是说可以通过在细胞培养液中增加血清即可直接使小RNA进入细胞，而无需再额外添加其他任何的转染试剂，这避免了现有转染试剂的使用及其带来的副作用以及电转等其他导入方法的使用及其带来的副作用，且对细胞的饲养没有任何影响。并且，本方法的实施结果显示，小RNA可以穿过细胞膜并与线粒体、溶酶体等细胞器有明显的共定位，说明RNA不仅进入了细胞，而且呈现明确的亚细胞定位，并发挥一定的功能。实验结果显示，将外源RNA与含有血清的细胞培养液孵育细胞一定时间后，采用pull-down方法将进入到细胞内的外源RNA及其结合物纯化分离出来，进一步鉴定发现外源RNA的结合蛋白组分主要是线粒体蛋白，也有一些其它细胞器蛋白或胞浆蛋白，说明外源RNA已进入细胞并可能进入或锚定在某些细胞器中并发挥相应的功能。
在本发明的实施例中，验证了血清可介导多种非编码小RNA例如microRNA和microRNA前体进入细胞，但本发明所述的非编码小RNA并不限于以上两种，现有的任何其他非编码小RNA均适用于本发明，并可实现同样的技术效果。原因在于：实施例结果显示，血清对于不同二级结构以及不同核苷酸序列的多种microRNA和microRNA前体，均可介导其进入细胞，说明血清介导RNA进入细胞的过程不依赖于microRNA的长短、序列或其二级结构。因此，我们认为对于长度在20-200个核苷酸左右的小RNA，血清均可介导其进入细胞。这类RNA包括但不局限于rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、microRNA或microRNA前体等。
本发明提供了一种血清介导小RNA进入细胞的方法，该血清包括但不局限于商业化和根据现有技术制备的哺乳动物血清及血清的有效成分。其中包括但不局限于商业化的人、牛、马、驴、鸡、羊、羊驼血清等各种哺乳动物的血清，也包含各种根据现有技术制备的哺乳动物血清。其中，制备血清方法是现有常规技术方法，具体操作为：
(1)获得生命体征正常的动物动脉血液若干；
(2)将动脉血液存放在离心管中，将血液低速离心至血细胞和血清分离；
(3)吸取分离完全的上清，即血清，低温储存使用。
上述这一系列的不同种属的动物血清，都可以介导小RNA进入哺乳动物细胞，并不需要使用任何其他试剂。
在本发明中，细胞培养液中血清的含量可以为>0％的任意比例，例如，所述血清的体积分数可以为5％-60％，例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％。
本发明提供的介导非编码小RNA进入细胞的方法，能够避免现有方法中转染试剂带来的副作用，且对细胞的饲养没有任何影响。
本发明提供一种非编码小RNA导入细胞的方法，具体观察的小RNA包括但不局限于动植物的、天然的或合成的rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和microRNA；所指细胞包括所有的哺乳动物细胞，包括但不局限于商业化的细胞系或实验室分离得到的原代细胞。为了明确该结论，申请人集中观察的是microRNA和microRNA前体在多种类细胞系中，在有牛血清或人血清孵育时，microRNA和microRNA前体进入细胞的情况。其中，人源细胞系包括人表皮角质细胞系(HEK)、人肺表皮细胞系(BEAS-2B)、人胰岛β细胞系(1.1B4)以及工具细胞HEK293A和HELA细胞系。
上述这个重要发现引导着本发明人对血清帮助小RNA进入细胞的机制进行了深入研究。这样的科研思路和大量实验数据决定了本发明不是科学猜想或是科研臆断，而是一种真正可以产业化的科研成果，一种真正的发明创新。
本发明适用于，所有含有小RNA成分的物质均可通过本发明阐述的方法被细胞或组织吸收，进而发挥功能，以及所述方法在基础科研实验、临床药物开发和使用中的用途。其中上述临床药物包括但不局限于包含血清组分的涂抹和内服使用的药物。
在本发明的实施例中，使用了牛血清和人血清，但本发明的血清并不限于以上两种，现有技术中的任何其他常规血清均可用于本发明，并可实现同样的技术效果。
总之，本发明提供了以下技术方案：
1.一种介导非编码小RNA进入细胞的方法，其中，将细胞与裸露的非编码小RNA在含有血清的细胞培养液中进行孵育。
2.根据项目1所述的方法，其包括以下步骤：
1)将裸露的非编码小RNA加入含有血清的细胞培养液中；
2)将步骤1)获得的细胞培养液孵育细胞；
3.根据项目1或2所述的方法，其中，所述非编码小RNA包括但不限于rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、microRNA前体或microRNA。
4.根据项目1或2所述的方法，其中，所述血清为一种或多种动物血清，包括但不限于胎牛血清、牛血清、马血清、驴血清、鸡血清、羊血清、羊驼血清或人血清或其任意组合。
5.根据项目1或2所述的方法，其中，所述细胞为哺乳动物细胞，例如商业化的哺乳动物细胞或细胞系以及原代分离的哺乳动物细胞。
6.血清在介导非编码小RNA进入细胞中的用途。
7.血清在制备用于使非编码小RNA进入细胞的药物中的用途。
8.一种非编码小RNA的转染方法，其特征在于，将裸露的非编码小RNA加入到含有血清的细胞培养液中并孵育细胞，使得非编码小RNA转染到细胞中。
本发明的技术效果为：介导多种类型的非编码小RNA有效地进入细胞，既避免了现有转染试剂的使用及其带来的副作用以及电转等其他导入方法的使用及其带来的副作用，且对细胞的饲养没有任何影响。
附图说明
图1：人和牛血清均可介导miR-21a前体进入细胞，并呈现明显的细胞内亚细胞定位；
图2：牛血清可介导植物MIR214、MIR156和MIR168前体，以及动物MIR-29a前体进入细胞；
图3：牛血清可介导microRNA进入人表皮角质细胞、肺上皮细胞、胰岛β融合细胞、HEK293T、HELA等细胞；
图4：microRNA通过含牛血清的细胞培养液孵育进入细胞后，在细胞中的结合蛋白列表。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购试剂。
试剂和材料：microRNA和microRNA前体订购自广州市锐博生物科技有限公司(Ribobio Corp.)。细胞购自协和细胞库，细胞培养液和牛血清购自赛默飞世尔科技公司(Scientific Thermo Fisher Corp.)，人血清购自亚科因生物技术有限公司(AbbkineScientific Co.,Ltd)，马、羊、驴、兔子和豚鼠等血清购自上海羽朵生物科技有限公司(Shanghai feather flower biological science and Technology Co.)。如无特别说明，其他化学试剂均来自Sigma-Aldrich公司。
细胞培养方法：细胞使用90％基础培养液和10％血清作为完全培养液培养细胞，待细胞密度达到80-90％，加入一定浓度合成的带有荧光标签的microRNA或microRNA前体，孵育一定时间后，观察RNA进入细胞的情况。
在本发明中，“裸露的非编码小RNA”是指不与任何转染试剂复合或结合的非编码小RNA，其通常存在于常规缓冲液(例如：去离子水等)中，其中所述缓冲液中不包含任何转染试剂，且其中所述非编码小RNA不与任何转染试剂共存或形成复合物。其中，所述转染试剂包是指在现有技术中使用的作为递送介质将RNA导入细胞的外源性大分子载体，包括常规的脂质体转染试剂例如lipo2000、lipo3000等，磷酸钙，DEAE-葡聚糖，Entranster等。
实施例1、血清介导microRNA进入细胞
1.使用含有10％牛血清(购自赛默飞世尔科技公司)的高糖DMEM培养液(购自赛默飞世尔科技公司)，在37℃且含有5％ CO2的细胞培养箱(购自赛默飞世尔科技公司)中，培养HELA细胞(购自协和细胞库)，直至细胞密度至60-80％；
2.将人血清(购自亚科因生物技术有限公司)或牛血清添加入新鲜高糖DMEM培养液中(作为实验组)，或不将血清添加入高糖DMEM培养液中(作为对照组)，其中血清组分占总培养液体积的10％，并以上述新鲜培养液培养细胞；
3.同时在培养液中加入Cy3和Cy5荧光共标记的microRNA前体(购自广州市锐博生物科技有限公司)，浓度不低于10pmol/L；
4.孵育细胞(37℃，5％ CO2)6小时后，使用激光共聚焦显微镜，观察细胞内microRNA的含量和分布。
结果显示，对于细胞培养液中未添加血清的细胞，microRNA不能进入细胞。相反地，对于在细胞培养液中添加了血清的细胞，观察到了microRNA的荧光信号，并呈现明确的线粒体的亚细胞定位(如图1所示)。
实施例2：牛血清介导多种microRNA前体进入细胞
1.使用含有10％牛血清(购自赛默飞世尔科技公司)的高糖DMEM培养液(购自赛默飞世尔科技公司)，在37℃且含有5％ CO2的细胞培养箱(购自赛默飞世尔科技公司)中，培养HELA细胞(购自协和细胞库)，直至细胞密度至60-80％；
2.取新鲜培养液中添加牛血清，血清组分占总体积的10％，并以该新鲜培养液培养细胞；
3.加入荧光标记Cy3与Cy5的不同microRNA前体(例如，MIR214、MIR156和MIR168前体，以及MIR-29a前体，均购自广州市锐博生物科技有限公司)，每种浓度不低于10pmol/L；
4.孵育细胞(37℃，5％ CO2)6小时后，使用激光共聚焦显微镜，观察不同物种和类别的microRNA进入细胞的情况；其中，不同的microRNA包括植物MIR214、MIR156和MIR168前体，以及动物miR-29a前体；
结果显示，培养细胞时在细胞培养液中添加血清可介导植物MIR214、MIR156和MIR168前体，以及动物miR-29a前体进入细胞，并呈现明确的亚细胞定位(如图2所示)，结果说明血清可介导microRNA进入细胞，且对microRNA的种类没有选择性。
实施例3：牛血清介导microRNA进入多种类型的细胞
1.按照现有技术的常规方法(使用含有10％牛血清(购自赛默飞世尔科技公司)的高糖DMEM培养液(购自赛默飞世尔科技公司)，在37℃且含有5％ CO2的细胞培养箱(购自赛默飞世尔科技公司)中培养细胞)，培养不同类型的细胞，包括人上皮角化细胞、肺上皮细胞、胰岛β融合细胞、人肾母细胞瘤HEK293T、HELA等细胞(均购自协和细胞库)，直至细胞密度至60-80％；
2.将含有10％牛血清(作为实验组)与不含牛血清(作为对照组)的细胞培养液与荧光标记Cy3的miR-29a(购自广州市锐博生物科技有限公司)共孵育细胞；
3.孵育细胞(37℃，5％ CO2)6小时后，使用激光共聚焦显微镜观察microRNA进入细胞的情况。
结果显示，与不加血清的对照组相比，加入血清的培养液孵育细胞后，每种细胞内的microRNA信号都显著增加。该结果显示，血清可介导microRNA进入不同组织和种属来源的细胞(如图3所示)。
实施例4：microRNA在细胞内的结合蛋白
将生物素(biotin)标记的microRNA-168a(购自广州市锐博生物科技有限公司)与含有牛血清(购自赛默飞世尔科技公司)的细胞培养液(购自赛默飞世尔科技公司)共孵育细胞(37℃，5％ CO2)6小时；
使用链霉亲和素融合的磁珠(Streptavidin Magnetic Beads,Pierce,Lot:300959A)结合生物素，将microRNA和与之结合的蛋白亲和纯化出来。具体步骤如下：
(1)使用microRNA-biotin和含有10％牛血清(购自赛默飞世尔科技公司)的细胞培养液(购自赛默飞世尔科技公司)共孵育HELA细胞(购自协和细胞库)(37℃，5％ CO2；)6小时；
(2)使用室温PBS(购自上海碧云天生物技术有限公司)洗细胞3次；
(3)使用含有0.25％胰酶和0.05％EDTA的消化液(购自赛默飞世尔科技公司)消化细胞；
(4)吹打细胞成为单细胞并悬浮于PBS中，1500转/分钟离心5分钟；
(5)弃掉上清，使用RIPA(Radioimmunoprecipitation assay buffer)细胞裂解液(购自上海碧云天生物技术有限公司，P0013B)裂解细胞；
(6)12000转/分钟离心10分钟，弃掉离心沉淀，收取上清；
(7)加入1/10体积的链霉亲和素磁珠(Pierce,Lot:300959A)；
(8)4℃旋转混合1小时，使收取的上清(即细胞裂解液)与磁珠充分混合均匀；
(9)使用磁力架收集磁珠，弃掉上清，并加入RIPA细胞裂解液(购自上海碧云天生物技术有限公司，P0013B)吹打混匀洗涤磁珠，如此反复3次以上；
(10)最终得到清洗后的磁珠，加入pH2.0的溶解液(Chromotek,#8121301)，溶解富集到的蛋白；
(11)收集蛋白溶液，使用质谱进行蛋白质组分分析；
质谱结果显示，细胞内与microRNA结合的蛋白，打分前27名的蛋白中有17种为线粒体蛋白，说明microRNA的确已进入细胞并存在于特定的亚细胞定位，可能发挥了相应的功能。
经实验证实，包括实施例所述的牛血清在内的商业化哺乳动物的血清，包括但不局限于人、牛、马、鸡、羊驼、羊、豚鼠血清等，均可介导小RNA进入哺乳动物细胞。血清组分可帮助细胞或组织吸收小RNA，该专利可应用于基础科研，并向生物产品和药物的应用转化。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种促进非编码小RNA进入细胞的方法，其中，将细胞与裸露的非编码小RNA在含有血清的细胞培养液中进行孵育，从而所述血清促进非编码小RNA进入细胞中；
其中，所述非编码小RNA为microRNA前体或microRNA；所述细胞为哺乳动物细胞；并且所述方法用于非疾病治疗目的。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：
1）将裸露的非编码小RNA加入含有血清的细胞培养液中；
2）将步骤1）获得的细胞培养液孵育细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述血清包括牛血清、马血清、驴血清、鸡血清、羊血清、羊驼血清或人血清或其任意组合。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述血清为胎牛血清。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞为商业化的哺乳动物细胞或细胞系以及原代分离的哺乳动物细胞。
6.血清在介导非编码小RNA进入细胞中的用途；其中，所述非编码小RNA为microRNA前体或microRNA，并且所述细胞为哺乳动物细胞，其中所述用途用于非疾病治疗目的。
7.血清在制备用于使非编码小RNA进入细胞的药物中的用途；其中，所述非编码小RNA为microRNA前体或microRNA，并且所述细胞为哺乳动物细胞。
8.一种促进非编码小RNA转染的方法，其特征在于，将裸露的非编码小RNA加入到含有血清的细胞培养液中并孵育细胞，使得血清促进非编码小RNA转染到细胞中；其中，所述非编码小RNA为microRNA前体或microRNA；所述细胞为哺乳动物细胞；并且所述方法用于非疾病治疗目的。
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