CN116536365A - 一种利用血清阳离子蛋白递送核酸的方法 - Google Patents

一种利用血清阳离子蛋白递送核酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用血清阳离子蛋白递送核酸的方法。该方法是将核酸与血清中的阳离子蛋白混合形成纳米颗粒，纳米颗粒与细胞混合孵育从而实现向细胞中递送核酸。发明人基于血清富含的阳离子蛋白可以主动的吸附环境中的带负电的核酸并形成纳米颗粒，并将其中的核酸递送入靶细胞中，开发了一种利用血清阳离子蛋白包裹核酸进行转染，并使核酸在细胞内发挥相应的生物功能的方法。该方法不仅能够避免常用的病毒载体和非病毒载体在进行基因转染过程中可能产生的副作用，而且还能够提高基因转染的效率。

Description

一种利用血清阳离子蛋白递送核酸的方法
技术领域
本发明属于生物领域，涉及一种利用血清阳离子蛋白递送核酸的方法。
背景技术
基因转染是将具有生物功能的核酸(包括RNA和DNA)转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内发挥相应的生物功能。核酸分子在组织或细胞中易被核酸酶降解，且核酸分子自身带有负电荷，不能通过渗透的方式自由的通过带负电荷的细胞膜进入细胞中。目前研究和临床应用中进行基因转染的方式主要分为病毒载体和非病毒载体两类。对于病毒类载体，囿于病毒类载体负载量低、特异性不强、安全性差等缺点，病毒类载体在研究和临床应用过程中存在难以避免的缺陷。对于非病毒载体，目前常用的非病毒载体主要包括阳离子聚合物和阳离子脂质体，它们比较容易透过细胞膜，将其包裹的核酸递送入细胞内。然而，这些非病毒载体不仅基因转染效率低，而且对于机体依然属于外源性物质，反复给药后容易积聚于体内，有可能会引发毒性反应。因此，无论时研究还是临床，迫切需要开发新的核酸递送方法。
血浆中含有丰富的阳离子蛋白，我们通过大量的实验表明，血浆中的阳离子蛋白可以主动的吸附环境中的带负电的核酸并形成纳米颗粒。这些包裹核酸的纳米颗粒可以自由的通过带负电荷的细胞膜，将其中的核酸递送入细胞中。本发明开发了一种利用血浆阳离子蛋白包裹核酸进行基因转染，并使核酸在细胞内发挥相应的生物功能的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种纳米颗粒。
本发明的另一目的是提供该纳米颗粒的应用。
本发明的又一目的是提供一种利用血清阳离子蛋白递送核酸的方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种纳米颗粒，所述的纳米颗粒是利用血清中的阳离子蛋白主动吸附环境中带负电的核酸形成纳米颗粒得到的。
作为本发明的一种优选，将核酸与含血清的溶液混合，血清中的阳离子蛋白主动吸附其中带负电的核酸形成纳米颗粒；所述的血清为去除囊泡以及细胞碎片的血清，或FBS。
作为本发明的进一步优选，所述的血清的溶液溶剂为DMEM、RPMI1640等细胞基础培养基。
作为本发明的一种优选，所述的血清浓度为10％。
作为本发明的一种优选，血清中的阳离子蛋白主动吸附其中带负电的核酸形成纳米颗粒的温度为20-28℃，时间为5-10min。
作为本发明的一种优选，所述的核酸为RNA、DNA，优选小RNA。小RNA是指长度小于200nt的RNA分子，多为非编码RNA(ncRNA)，真核生物中此类RNA经常可与Ago等蛋白结合以进行RNA干扰，抑制其他基因mRNA的表现。小RNA的种类包括微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi作用RNA(piRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小卡哈氏体RNA(scaRNA)、tsRNA(衍生自tRNA的小RNA)和srRNA(衍生自rRNA的小RNA)等。许多小RNA与数种癌症等疾病有关。
本发明所述的纳米颗粒在递送核酸中的应用，所述的应用不以疾病治疗为目的；优选在递送小RNA中的应用。
一种非疾病治疗为目的的递送核酸的方法，将核酸与血清中的阳离子蛋白混合形成纳米颗粒，纳米颗粒与细胞混合孵育从而实现向细胞中递送核酸；或者向含有细胞的培养基中加入核酸并孵育，细胞培养基中含有血清，核酸与血清中的阳离子蛋白混合形成纳米颗粒，纳米颗粒与细胞混合孵育从而实现向细胞中递送核酸。
作为本发明的一种优选，所述的方法是将核酸与含血清的溶液混合，优选与含10％血清的溶液混合，血清中的阳离子蛋白主动吸附核酸，形成纳米颗粒，将纳米颗粒与细胞混合孵育从而实现向细胞中递送核酸；或者将核酸与含血浆阳离子蛋白的溶液混合，血浆阳离子蛋白主动吸附核酸形成纳米颗粒，将纳米颗粒与细胞混合孵育从而实现向细胞中递送核酸。
作为本发明的一种优选，核酸在含10％血清的溶液中的终浓度为小于等于50pmol/mL，优选50pmol/mL；如果条件限制，可以下调核酸的浓度，大于0pmol/mL即可。核酸在含10％血清的溶液中的终浓度为50pmol/mL时，约80％的核酸能够和阳离子蛋白结合形成纳米颗粒如果需要更大的核酸剂量，随着核酸浓度的提高，该比例会逐渐下降，浓度为100pmol/mL时，受限于血清中阳离子蛋白的载量，能够生成的纳米粒子的核酸比例为50％。
作为本发明的一种优选，对于贴壁细胞，建议的核酸孵育浓度为40pmol/mL以上，收集的纳米颗粒可用DMEM或RPMI1640稀释；加入培养皿使液体覆盖培养皿的底面即可；对于悬浮细胞，每106个细胞建议添加0.5mL纳米颗粒溶液，浓度为40pmol/mL。
作为本发明的一种优选，所述的血清为去除囊泡以及细胞碎片的血清，或FBS，所述的含10％血清的溶液以DMEM或RPMI1640等细胞基础培养基为溶剂。
作为本发明的一种优选，所述的纳米颗粒与细胞混合孵育温度为37℃，时间为1-48h。
作为本发明的一种优选，所述的核酸为RNA、DNA，优选小RNA。小RNA定义如上。
本发明所述的纳米颗粒在制备核酸药物中的应用；所述的核酸为RNA、DNA，优选小RNA。
有益效果：
发明人基于血清富含的阳离子蛋白可以主动的吸附环境中的带负电的核酸并形成纳米颗粒，并将其中的核酸递送入靶细胞中，开发了一种利用血清阳离子蛋白包裹核酸进行转染，并使核酸在细胞内发挥相应的生物功能的方法及纳米颗粒。该方法和纳米颗粒不仅能够避免常用的病毒载体和非病毒载体在进行基因转染过程中可能产生的副作用，而且还能够提高基因转染的效率。
附图说明
图1.血清中的阳离子蛋白可以主动吸附环境中的带负电的核酸并形成纳米颗粒。(a-b)通过纳米粒子测定仪(NTA)，观察血清阳离子蛋白与RNA形成的纳米颗粒。比例尺为200nm。(c)电子显微镜观察血清阳离子蛋白与RNA形成的纳米颗粒。(d)通过100KD超滤管，回收不能通过滤器的上层纳米颗粒，利用定量PCR检测纳米颗粒中包含的RNA。(e-f)通过100KD超滤管，回收不能通过滤器的上层纳米颗粒孵育细胞,通过对激光共聚焦拍摄细胞荧光图片的量化分析和定量PCR仪检测不同时间点时细胞内的荧光(左)和细胞内RNA含量(右)。
图2.去使用离子交换层析柱(a)除血清中阳离子蛋白，通过纳米粒子测定仪(NTA)，检测血清与RNA形成的纳米颗粒(b)。并将无血清对照组、含血清对照组和去除血清中阳离子蛋白组分别孵育细胞,通过对激光共聚焦拍摄细胞荧光图片的量化分析和定量PCR仪检测不同时间点时细胞内的荧光(c)和细胞内RNA含量(d)。图3.血清中的阳离子蛋白主动吸附环境中的带负电的RNA形成的纳米颗粒可以送入细胞内并被递送进线粒体。细胞内荧光分布和荧光水平量化分析(a-b)显示血浆和RNA混合后在37℃和4℃条件下在0、10、30和60分钟在细胞内逐渐增加的过程。Serum,37℃:10％血清与RNA混合，在37℃下与细胞孵育；-Serum,37℃:RNA不与血清混合，直接在37℃下与更换为无血清的DMEM培养基的细胞孵育；Serum,4℃:10％血清与RNA混合，在4℃下与细胞孵育；+Serum,ATP-：10％血清与RNA混合，在细胞被抑制了ATP的条件下与细胞孵育。定量PCR(c)显示细胞内RNA水平随着时间的推移，RNA在细胞内逐渐增加的现象。RNA在细胞亚细胞器内的具体定位我们用线粒体(mito)、溶酶体(lyso)、内质网(ER)分别与RNA共染后发现RNA最终去向是线粒体(d)。定量PCR也显示了RNA进入细胞后在全细胞(whole cell)和线粒体(mitochondria)中随着时间的推移有明显的积累(e)。
图4.血清中的阳离子蛋白与环境中的带负电的核酸并形成纳米颗粒，并进入细胞内，调控细胞内基因的表达。(a-b)激光共聚焦显微镜(a)和定量PCR(b)观察发现人工合成的带荧光标记的miR-21mimic加入含有10％血清的溶液中后形成的纳米颗粒可以进入细胞，纳米颗粒中的miR-21mimic可以递送入线粒体内。(c)递送入线粒体的miR-21或si-CYB可以促进调控线粒体内的靶基因CYB的表达。(d-e)递送入线粒体的miR-21或si-CYB通过调控线粒体内的靶基因CYB的表达，可以上调或下调细胞内产生的ATP(d),下调或上调线粒体产生的活性氧ROS(e)。
具体实施方式
实施例1血清中的阳离子蛋白可以主动吸附环境中的带负电的核酸并形成纳米颗粒
1)收集健康志愿者血清，先将血清于4℃、120000g离心70分钟，再用细胞培养基DMEM将血清稀释至10％(血清和DMEM培养基的体积比为1:9)，将10％血清DMEM装入100kD超滤管，25℃、4000g离心20分钟去除血清中的囊泡、细胞碎片以及原有的纳米颗粒。
2)将人工合成的RNA片段(序列：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA)加入上一步制备的含有10％血清的溶液中，混匀后25℃孵育5分钟。随后利用纳米粒子测定仪(NTA)对溶液中纳米粒子的直径进行测定，利用电子显微镜观察溶液中的纳米颗粒。其中，不加血清(培养基+RNA)、不加RNA(培养基/血清)的溶液作为对照。
3)将人工合成的RNA片段(序列：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA)加入含有1％，3％，10％血清的溶液中，混匀后RNA片段浓度为50pmol/mL，25℃孵育5分钟。随后通过100KD超滤管，分别回收不能通过超滤管的上层在纳米颗粒中的RNA和下层游离的RNA，利用定量PCR检测纳米颗粒中包裹的RNA和游离的RNA片段含量。
4)选取10％血清和人工合成的荧光标记的RNA按照3)的方法处理，收集上下层分别和接种在玻璃底培养皿密度为60％的HeLa细胞共孵育，在20，40，60分钟分别检测两组细胞内的荧光强度。
5)选取10％血清和人工合成的RNA片段(序列：UCGUCCUCCCCUUCUUCACCG)按照(3)的方法处理，收集上下层分别和接种在12孔板，密度为60％的HeLa细胞共孵育0，20，40，60分钟，分别测定两组细胞内的RNA含量。
结果：通过纳米粒子测定仪(NTA)，我们发现当将人工合成的RNA片段加入含有10％血清的溶液中时(血清+RNA)，溶液中会出现直径在110nm左右的纳米颗粒(图1a-b)。而只加RNA(培养基+RNA)或10％的血清以及单纯的培养基中无纳米颗粒(图1a-b)。电子显微镜扫描结果(图1c)也与纳米粒子测定仪(NTA)结果一致。通过100KD超滤管，将不同浓度的血清和RNA混合后分别回收不能通过超滤管的上层纳米颗粒中的RNA和下层的游离RNA，利用定量PCR分别检测，发现10％血清和RNA混合后，80％的RNA进入里纳米颗粒中。3％和1％的血清和RNA混合后，进入纳米颗粒中的RNA百分比分别为50％和20％。(图1d)。选取10％血清和RNA进行细胞实验，进一步的通过读取HeLa细胞内荧光强度和收集细胞提取RNA进行定量PCR，我们发现纳米颗粒中的RNA能够进入细胞，而游离的RNA不能(图1e)。实施例2血浆中的阳离子蛋白主动吸附环境中的带负电的核酸并形成纳米颗粒，并将核酸递送入细胞内
1)收集健康志愿者血清，先将血清于4℃、120000g离心70分钟，再用细胞培养基DMEM将血清稀释至10％(血清和培养基的体积比为1:9)，将10％血清的DMEM装入100kD超滤管，25℃、4000g离心20分钟去除血清中的囊泡以及细胞碎片。
2)将去除囊泡以及细胞碎片的10％血清的DMEM通过阳离子离子交换层析柱(工作原理见图2a)以去除血清中的阳离子蛋白。
3)将去除阳离子蛋白的10％血清的DMEM与人工合成的RNA片段(序列：
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA)混合，25℃孵育5分钟，利用纳米粒子测定仪(NTA)对溶液中纳米粒子的直径进行测定。
4)选取10％血清的DMEM和人工合成的荧光标记的RNA按照(2)的方法处理，和无血清组、未处理组分别和接种在12孔板，密度为60％的HeLa细胞在37℃共孵育2h，检测三组细胞内的荧光强度。
5)选取10％血清的DMEM和人工合成的RNA片段(序列：UCGUCCUCCCCUUCUUCACCG)按照(2)的方法处理，和无血清组、未处理组分别和接种在12孔板，密度为60％的HeLa细胞在37℃共孵育2h，测定三组细胞内的RNA含量。
结果：通过纳米粒子测定仪(NTA)，我们发现当将人工合成的RNA片段加入含有10％血清的DMEM中时(RNA+血清)，溶液中会出现直径在110nm左右的纳米颗粒，而去除了血清中的正电荷蛋白，再与RNA混合后，无纳米颗粒(图2b)。通过荧光和定量PCR的测定(图2c-d)，我们发现血清去除了正电荷蛋白后再和RNA混合，因为不能形成纳米颗粒，所以RNA便不能进入细胞了。
实施例3血浆中的阳离子蛋白与环境中的带负电的核酸形成纳米颗粒，可以使RNA进入细胞内，并递送进线粒体。
1)将HeLa细胞在96孔板里用200uL的10％血清DMEM中培养至70％密度；
2)37℃含血清组：在孔里加入10pmol人工合成的带荧光标记的RNA片段(序列：
UCGUCCUCCCCUUCUUCACCG)在37℃中孵育第0、10、30、60分钟的时候使用Operetta高内涵细胞筛选系统进行拍照；
3)4℃含血清组：将200uL 10％血清DMEM更换为预冷的200uL 10％血清DMEM和10pmol人工合成的带荧光标记的RNA片段的混合物在4℃孵育0、10、30、60分钟的时候使用Operetta高内涵细胞筛选系统进行拍照；
4)37℃不含血清组：将孔里200uL 10％血清DMEM弃掉，PBS洗3遍，更换为不含血清的DMEM。在孔里加入10pmol人工合成的带荧光标记的RNA片段，在37℃中孵育第0、10、30、60分钟的时候使用Operetta高内涵细胞筛选系统进行拍照；
5)去除ATP含血清组：在孔里加入ATP抑制剂oligomycin工作浓度5uM，1h后，在孔里加入10pmol人工合成的带荧光标记的RNA片段在37℃中孵育第0、10、30、60分钟的时候使用Operetta高内涵细胞筛选系统进行拍照；
6)将得到的照片用软件分析细胞内的荧光强度量化关系；
7)在12孔板中培养HeLa细胞至80％密度，按照2-5的处理条件，在0、10、30和60分钟后分别收获细胞，提取细胞的RNA，对RNA片段(序列：
UCGUCCUCCCCUUCUUCACCG)进行定量PCR测定；
8)将HeLa细胞在玻璃底培养皿中培养至60％密度，培养基为1mL 10％DMEM。加入人工合成的带荧光标记的RNA片段(序列：UCGUCCUCCCCUUCUUCACCG)6h，用激光共聚焦显微镜进行拍照。拍照前分别用Mitotracker(线粒体示踪)
/Lysotracker(溶酶体示踪)/ERtracker(内质网示踪)活染40分钟，而后弃掉培液，用PBS缓冲液洗涤细胞三次；
9)将HeLa细胞在10cm底培养皿中加入10mL 10％血清DMEM培养至90％密度，将人工合成的RNA fragment加入HeLa的10％血清DMEM培养基，RNA孵育的0、1、6h后收获细胞，1/10用来提取细胞RNA，9/10用线粒体提取试剂盒提取线粒体后，提取线粒体内RNA。分别用定量PCR测定6个组内的人工合成的RNA fragment含量。
结果：血浆中的阳离子蛋白与环境中的带负电的核酸形成纳米颗粒，可以使RNA进入细胞内，但是这个过程是温度和ATP依赖的(3a-b)。通过该过程进入细胞的RNA和线粒体是共定位的，说明RNA最终去向为线粒体(3d)。细胞和线粒体在1h和6h内均有检测到RNA水平的上升，也证实了这个现象(3e)。实施例4血浆中的阳离子蛋白与环境中的带负电的核酸形成纳米颗粒，并进入细胞内，调控细胞内基因的表达。
1)将HEK293T细胞在玻璃底培养皿中用10％血清DMEM培养至60％密度；
2)将人工合成的带荧光标记的miR-21mimic(序列：
5’UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA3’,5’AACAUCAGUCUGAUAAGCUAUU3’)加入含有10％血清的DMEM培养基中25℃孵育5分钟；
3)将步骤1)中的HEK293T培养基更换为步骤2)中的混合溶液。6个小时后利用激光共聚焦显微镜进行拍照。(拍照前Mitotracker活染线粒体45分钟，
Hoechst活染细胞核10分钟，而后弃掉培液，用PBS缓冲液洗涤细胞三次)；4)将HEK293T细胞在10cm底培养皿中用10％血清DMEM培养至90％密度；
5)将人工合成的miR-21mimic加入含有10％血清的DMEM中，25℃孵育5分钟。
随后步骤4)中的弃掉HEK293T培养基，将孵育后的混合溶液加入HEK293T细胞中。12个小时后弃掉培液，用PBS缓冲液洗涤细胞三次。收集细胞，用线粒体提取试剂盒提取线粒体后，提取线粒体内RNA。分别用定量PCR测定加或不加RNA的线粒体内miR-21含量；
6)将HEK293T细胞在6孔板中用10％血清DMEM培养至40％密度；
7)将人工合成的miR-21mimic，阴性对照NC-RNA(序列：
5’UUGUACUACACAAAAGUACUG3’，5’CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3’)，线粒体内细胞色素b(CYB)的小干扰RNA(siCYB，序列：5’CCACUAAGCCAAUCACUUUTT3’,5’AAAGUGAUUGGCUUAGUGGTT3’)和突变了miR-21种子序列的mutant-21(序列：5’UUCGAAUACAGACUGAUGUUGA3’,5’AACAUCAGUCUGUAUUCGAAUU3’)分别加入HEK293T的培养基中持续孵育48小时；
8)收获细胞，提取蛋白，然后通过Western blot测定miR-21靶基因CYB蛋白含量；将HEK293T细胞在12孔板中用10％血清DMEM培养至40％密度
9)重复7步骤，然后用ATP试剂盒测定细胞内ATP含量；
10)重复7步骤，然后加入mito Sox Red按照1:1000比例用HBSS稀释，用来标记线粒体内的ROS，然后用流式细胞仪测定细胞内的ROS含量。
上述所有实验中，RNA工作浓度均为50pmol/mL。
结果：通过激光共聚焦显微镜观察发现人工合成的带荧光标记的miR-21mimic加入含有10％血清的溶液中后形成的纳米颗粒可以进入细胞，并将miR-21mimic递送入线粒体内(图4a),定量PCR也证实了上述发现(图4b)。提取细胞蛋白，进行western blotting检测发现，miR-21被递送入线粒体后，可以上调其在线粒体内的靶基因CYB的表达水平,突变了种子序列的miR-21没有效果，si-CYB也可以下调其线粒体内靶基因CYB的表达水平(图4c)。CYB作为线粒体呼吸链的核心蛋白，CYB表达上升后，会明显上调线粒体产生的ATP，抑制线粒产生的活性氧ROS。检测结果表明，当我们用血清阳离子蛋白将miR-21或si-CYB导入细胞线粒体内，CYB表达上升或下降的同时，(图4c)细胞内的ATP产生也会随之上升或下降(图4d),线粒体产生的活性氧ROS会随之下降或上升(图4e)。

Claims (10)

1.一种纳米颗粒，其特征在于所述的纳米颗粒是利用血清中的阳离子蛋白主动吸附带负电的核酸形成纳米颗粒得到的。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，将核酸与含血清的溶液混合，血清中的阳离子蛋白主动吸附其中带负电的核酸形成纳米颗粒；所述的血清为去除囊泡以及细胞碎片的血清，或FBS。
3.根据权利要求2所述的纳米颗粒，其特征在于所述的血清的溶液溶剂为细胞基础培养基，优选DMEM或RPMI1640。
4.根据权利要求2所述的纳米颗粒，其特征在于所述的核酸为RNA、DNA，优选小RNA。
5.权利要求1～4中任一项所述的纳米颗粒在递送核酸中的应用，所述的应用不以疾病治疗为目的。
6.一种非疾病治疗为目的的向细胞递送核酸的方法，其特征在于将核酸与血清中的阳离子蛋白混合形成纳米颗粒，纳米颗粒与细胞混合孵育从而实现向细胞中递送核酸；或者向含有细胞的培养基中加入核酸并孵育，细胞培养基中含有血清，核酸与血清中的阳离子蛋白混合形成纳米颗粒，纳米颗粒与细胞混合孵育从而实现向细胞中递送核酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于将核酸与含血清的溶液混合，血清中的阳离子蛋白主动吸附核酸形成纳米颗粒，再将将纳米颗粒与细胞混合孵育从而实现向细胞中递送核酸；或者将核酸与含血浆阳离子蛋白的溶液混合，血浆阳离子蛋白主动吸附核酸形成纳米颗粒，将纳米颗粒与细胞混合孵育从而实现向细胞中递送核酸；其中，所述的核酸为RNA、DNA，优选小RNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的血清为去除囊泡以及细胞碎片的血清，或FBS，所述的含血清的溶液以DMEM为溶剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的孵育温度为37℃，时间为1～48h。
10.权利要求1～4中任一项所述的纳米颗粒在制备核酸药物中的应用；所述的核酸为RNA、DNA，优选小RNA。
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