CN108070592A - 用于生产小干扰rna的小干扰rna表达系统及其应用 - Google Patents

用于生产小干扰rna的小干扰rna表达系统及其应用 Download PDF

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任雨田
张鸿智
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Abstract

制备小干扰RNA(siRNA)表达系统文库，以生产通过诱导靶基因RNA表达产物降解来沉默靶基因的siRNA的方法，包括：(i)从细胞群中分离一种或多种靶基因的RNA；(ii)从分离的RNA产生RNA片段；(iii)将RNA片段转化为dsDNA片段；和(iv)将dsDNA片段克隆到载体中以形成克隆的载体，每个载体包含一个或多个启动子和能够接受至少一个dsDNA片段插入的至少一个限制性酶位点，使得可以产生siRNA。也提供了从siRNA表达系统产生siRNA的方法以及通过使用从siRNA表达系统产生的siRNA识别用于治疗的功能性靶基因和识别RNAi治疗剂的方法。

Description

用于生产小干扰RNA的小干扰RNA表达系统及其应用
序列表
随专利申请电子提交的、具有816字节的大小和2016年11月15日创建日 期的、名为“序列表”的序列表文件以引用的方式整体纳入本发明。
技术领域
本发明涉及制备小干扰RNA(siRNA，小干扰核糖核酸)表达系统文库， 以生产通过诱导靶基因RNA表达产物降解来沉默靶基因的siRNA的方法，所述 靶基因RNA表达产物来自分离自细胞群，特别优选，但非排除地所述细胞群来 自受试者，特别是患有疾病如癌症、感染性或遗传性疾病的人的细胞群的RNA。 本发明进一步提供了特别优选，但非排除地通过使用发酵罐生产siRNA特别是 从siRNA表达系统生产siRNA的方法。更进一步提供了通过使用产自siRNA表 达系统的siRNA来识别用于治疗细胞群疾病的功能性靶基因和识别RNAi治疗 剂的方法，以及使用识别的RNAi治疗剂治疗受试者的方法。更进一步提供了发 酵罐和从细胞群分离的RNA整合生产siRNA表达系统文库，从所述文库生产 siRNA，测定所述细胞群中靶基因沉默和生产一种或多种在所述RNAi筛选中识 别siRNA种类的方法。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是存在于许多真核细胞中的进化上保守的生物过程。在 RNAi过程中，短双链(ds)RNA分子，如siRNAs下调基因表达，即它们例如 通过从基因表达的切割以诱导信使RNA(mRNA)的降解来发挥转录后基因沉 默效果。通常，siRNA与RNA诱导的沉默复合物(RISC)相互作用，同时双链 siRNA被切割，其中的引导链，即与反义链互补的一条链与RISC保持相连。与 RISC结合的引导链随后通过碱基配对将复合物与RNA连接以降解，如切割 RNA，从而导致基因沉默。mRNA的降解导致编码基因不翻译，因此没有蛋白 质从编码基因合成。siRNA已经成为评估基因功能和识别RNAi治疗剂的非常有 前途的研究工具。然而，已知的方法有若干缺点，例如关于siRNA的稳定性或 者由于siRNA的非特异性作用，例如与非预期的RNA表达产物相互作用的脱靶。 此外，以常用的方法从表达系统生产的siRNA的产量有限，因此限制了常用的 siRNA文库的应用。
Huang等已经描述了新型siRNA设计和生产系统(Nat Biotechnol,2013,31 (4):350-6，Huang&Lieberman,Nat Protoc,2013,8(12):2325-36)。该系统利用 p19多肽的独特功能，其具有结合到并稳定通过内源性核糖核酸酶III在大肠杆 菌中产生的dsRNA种类的能力，产生特定所选基因序列内的一组siRNA。在大 肠杆菌中产生的那些siRNA也称为原核siRNA，pro-siRNA。
仍然需要可用于高通量筛选的siRNA文库，特别是那些能够靶向特定细胞 系和受试者的整个转录组的个性化文库，允许siRNA的高效生产并不需要对序 列的选择，并且适用于识别与疾病或RNAi治疗剂相关的功能性基因。特别地， 仍然强烈需要允许在可接受的时间段内从siRNA文库中大量生产特定siRNA的 方法。
发明内容
本发明在第一方面提供了一种制备小干扰RNA(siRNA)表达系统文库， 以生产通过诱导靶基因RNA表达产物如编码多肽的RNA表达产物(mRNA) 或非编码RNA表达产物降解来沉默靶基因的siRNA的方法，所述方法包括：
(i)从细胞群，如从受试者，特别是有疾病如癌症的人中分离一种或多种靶基 因的RNA，特别地RNA代表细胞群的转录组；
(ii)从分离的RNA产生RNA片段；
(iii)将RNA片段转化为dsDNA片段，具体地包括逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)；
(iv)将dsDNA片段克隆到载体中以形成克隆的载体，每个载体包含一个或多 个启动子和能够接受至少一个dsDNA片段插入的至少一个限制性酶位点，使得 可以产生siRNA。
载体特别进一步包含“siRNA结合多肽表达框架”，其包含启动子和编码 siRNA结合多肽如p19多肽的序列和编码siRNA产生酶，特别是像大肠杆菌 (E.coli)核糖核酸酶III的核糖核酸酶的序列。载体中的一个或多个启动子优 选包括至少一个T7启动子。载体中的至少一个限制性酶位点特别包括至少一个 SacI限制性酶位点。
产生的siRNA特别地具有约19碱基对(bp)至约23bp之间的长度，具体 是约21bp的长度。siRNA优选在其整个长度上与靶基因RNA表达产物或其部 分至少基本互补，即对所述靶基因特异性。
本发明制备小干扰RNA(siRNA)表达系统文库的方法特别进一步包括将 克隆的载体转化入能够支持siRNA产生的细菌细胞，特别是大肠杆菌(E.coli) 细胞的步骤(v)。具体地一个载体在一种细菌细胞中转化，即细菌细胞的每个群 随后代表一个或多个基因，特别是细菌细胞的每个群代表一个基因，即对一个基 因的特异。
本发明进一步提供了从siRNA表达系统，特别是上述的siRNA表达系统生 产siRNA的方法，该siRNA表达系统包含转化入细菌细胞中的克隆载体，即 siRNA表达系统是具有克隆载体的细菌细胞，特别是大肠杆菌细胞的形式。用于 生产siRNA的所述方法包括：
(i)提供如上所述的细菌细胞；
(ii)使所述细菌细胞经受产生siRNA的条件，特别地包括孵育细菌细胞；
(iii)可选地分离所述siRNA，特别地包括提取和纯化所述siRNA。
特别地，分离siRNA。可选地，包括离心以形成团块来收集细菌细胞并将其 储存在约-80℃直到siRNA分离。
步骤(ii)具体在发酵罐中进行。这样的实施方案特别适合大规模生产siRNA， 例如用于进一步筛选特异siRNA候选物。
在另一方面，本发明涉及适用于生产siRNA的发酵罐，特别是具有包括用 于搅拌的装置如一个或多个叶轮和用于向混合物供应空气的装置的搅拌单元，并 具有配置来引入siRNA表达系统和生长培养基的入口，用于自动供应酸和碱来 调节包含siRNA表达系统和生长培养基的混合物的pH值的装置，以及可以引入 生长培养基和siRNA表达系统的生物反应器容器的发酵罐。
本发明进一步提供的是通过使用如上所述产生的siRNA来诱导靶基因RNA 表达产物降解来沉默细胞群中的靶基因的方法，包括如上所述从分离自细胞群的 RNA提供siRNA并将所述siRNA引入所述细胞群。
本发明的方法特别优势在于：由于siRNA是通过从同一细胞群的RNA得到 的siRNA表达系统而产生的，所述siRNA引入同一细胞群以沉默靶基因。所述 方法可以包括确定靶基因的沉默效率的步骤，特别是通过例如以qRT-PCR方式 测定靶基因RNA表达产物的水平。靶基因可以与疾病相关。例如靶基因是致癌 基因，这意味着靶基因的过表达与疾病的病因、进展或维持有关。。
还提供了通过使用如上所述产生的siRNA识别用于治疗疾病的功能性靶基 因的方法，包括：
(i)如上所述从以分离自细胞群的RNA制备的siRNA表达系统提供siRNA， 该细胞群来自患病受试者；
(ii)将所述siRNA引入细胞群；
(iii)分析所述细胞群的表型。
步骤(iii)可包括将所述细胞群的表型与阴性对照相比较，即没有siRNA 或其中已经引入了非沉默siRNA的相同细胞和组织类型的细胞群和/或已引入已 知影响表型的siRNA，如已知沉默影响细胞群表型的特定基因的siRNA的相同 细胞和组织类型的细胞群的阳性对照相比较。
疾病可以是例如癌症，感染性疾病或遗传性疾病病。具体地，细胞群包含癌 细胞，和步骤(iii)包括测定靶细胞群的细胞存活，例如用市售检测方法如HCS ViabilityCellTiter-(CTG)Luminescent Cell Viability Assay或流式 细胞仪，并将细胞存活与阴性对照进行比较，其中与阴性对照相比，细胞存活率 低于60％，则表明被沉默的基因为对癌细胞生长必需的基因。
另一方面，本发明涉及通过使用如上所述产生的siRNA识别RNAi治疗剂 的方法，包括：
(i)如上所述从以细胞群分离的RNA制备的siRNA表达系统提供siRNA， 其中所述细胞群具有指示某种疾病的增加的基因表达或活性；
(ii)将所述siRNA引入细胞群；
(iii)测定沉默效率，包括通过qRT-PCR方式测定来自所述基因的RNA表 达产物的水平。
具体地，与阴性对照相比，RNA表达产物水平至少80％的降低表明所述 siRNA是潜在的RNAi治疗剂。
本发明还提供了从细胞群分离的RNA来整合生产siRNA用的siRNA表达 系统文库，从所述文库生产siRNA，如通过测定相比阴性对照和/或阳性对照的 表型或靶基因RNA的表达产物水平来测定所述细胞群中靶基因沉默，以及特别 是通过使用本发明的发酵罐来生产一种或多种导致预期表型和/或预期沉默效率 的siRNA种类的方法。因此，本发明还涉及生产导致靶基因的预期表型和/或预 期沉默效率的siRNA的方法，包括步骤：
A)制备小干扰RNA(siRNA)表达系统文库以生产siRNA，包含从有疾病， 如癌症的受试者细胞群中分离RNA；从所述分离的RNA产生RNA片段；将所 述RNA片段转化为dsDNA片段；将所述dsDNA片段克隆到载体中以形成克隆 载体，每个载体包含一个或多个启动子和能够接受至少一个dsDNA片段插入的 至少一个限制性酶位点，使得可以产生siRNA，并将载体转化入细菌细胞；
B)从步骤A)的siRNA表达系统生产siRNA，包括使细菌细胞经受产生 siRNA的条件并分离所述siRNA；具体地步骤B)包括将细菌细胞引入微孔板中， 具体使得一个孔接受一种细菌细胞群；使微孔板经受所述细菌细胞生长的条件， 并诱导siRNA产生；其中分离siRNA具体地包括如通过机械力引发细菌细胞裂 解；离心裂解物以获得含siRNA和残余物的上清液；提取和纯化所述上清液中 的siRNA，包括使上清液接触磁珠，以亲和纯化和洗脱siRNA，使洗脱物经受以 强阴离子交换磁珠的阴离子交换层析和/或固相可逆固定珠；
C)在细胞群中沉默靶基因包括将siRNA引入细胞群中，分析细胞群表型和 /或确定沉默效率，包括测定来自所述靶基因的RNA表达产物的水平；具体地步 骤C)包括将细胞群引入多孔板中，使得多孔板的每个孔接收由不同细菌细胞群 产生的siRNA，特别是每个孔接受对一个基因特异的siRNA，并例如通过HCS 或CTG方法分析细胞群表型如细胞存活，和/或确定沉默效率，包括确定来自所 述基因的RNA表达产物的水平；步骤C)可以进一步包括测序克隆的载体中的 siRNA或dsDNA片段以识别靶基因；
D)选择导致预期表型和/或具有预期沉默效率的siRNA并从根据步骤A) 的能够产生所述siRNA的细菌细胞生产siRNA，其包括使细菌细胞经受产生 siRNA的条件并分离所述siRNA用于进一步筛选，其中步骤D)具体包括将含 细菌细胞和生长培养基的混合物引入具有包括用于搅拌的装置和用于向混合物 供应空气的装置的搅拌单元，并具有配置来引入所述siRNA表达系统的入口以 及用于自动供应酸和碱来调节混合物pH值的装置的发酵罐；在约15℃至约40℃ 之间，如约30℃至约40℃之间的温度和约6.5至约7.5之间的pH下搅拌混合物； 诱导siRNA产生；将混合物中的细菌细胞保持在所述细菌细胞生长的条件下至 少约1小时；以及其中分离所述siRNA特别地包括如通过机械力引发所述细菌 细胞裂解；离心所述裂解物以获得含所述siRNA和残余物的上清液；提取和纯 化所述上清液中所述的siRNA，包括使上清液接触磁珠，以亲和纯化和洗脱所述 siRNA，使所述洗脱物经受以强阴离子交换磁珠的阴离子交换层析随后使以洗脱 物与固相可逆固定珠接触；
本发明的siRNA表达系统的文库代表了“个性化”功能诊断工具，尤其适用 于识别准确同种型并在细胞群中表达的疾病基因和RNAi治疗剂。因此，相应的 RNAi筛选可以较常规方法获得的效果高得多。本方法具有成本效益，并且易于 适应工业设置来生产各种个性化的文库，即细胞系和受试者特异性siRNA表达 系统。所述siRNA表达系统文库可以覆盖所有表达的基因，即任何物种的任何 细胞群的转录组可获得的siRNA为最小非靶向作用和最小化假阳性和假阴性率 即。即使是siRNA组也可具生产性，其允许检测和分析某些表型的基因的协同 效应。
所得到的siRNA表达系统文库可以类似常规siRNA文库使用。siRNA表达 系统库特别适用于全基因组功能缺失分析，即RNAi筛选以识别特定生物学途径 或疾病过程的基本功能基因。
此外，可以使用本发明的发酵罐大量生产被识别的候选siRNA，这意味着与 生产siRNA的常用方法相比本发明的生产量至少增加10倍。所述方法可以适应 工业设置以生产大量siRNA。siRNA可进一步以高纯度提供。随后可以将siRNA 用于各种下游应用，包括例如候选基因的验证，细胞系和动物模型中的基因功能 研究以及作为RNAi治疗剂。
为证明本发明方法的几个优点，发明人已经在HeLa癌细胞中制备了siRNA 表达系统文库，从所述文库中生产了siRNA，并用其识别涉及HeLa癌细胞中癌 细胞增殖的功能基因。候选基因包括先前通过常规RNAi筛选识别的D-3-磷酸甘 油酸脱氢酶(PHGDH)基因。这些结果证实了本发明的方法的高效率。因此， 本发明的方法代表了非常有前途和有利生产RNAi筛选商业产品的选择，特别是 特异针对各种细胞类型和疾病模型，如人的癌症，遗传疾病和病毒感染的siRNA 表达系统的文库的。
此外，本发明允许生产由患者本身的疾病细胞，如从癌症患者中分离的原代 癌细胞引导的个性化RNAi治疗剂。这允许特异性地识别患者特定癌症类型的基 本功能基因。对于癌症治疗，这些基因可以通过本发明的基因特异性药物，即生 产的siRNA或可选的其他类型的基因特异性药物来被靶向。针对这些靶基因的 siRNA可以大量快速生产，并随后制成用于通过本发明的方法治疗癌症的RNAi 治疗剂。
本领域技术人员会理解，本文所述的发明可以接受除那些特别描述的以外的 变化和修改。本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或 共同参考或指出的所有步骤和特征，以及步骤或特征的任何和所有组合。
通过考虑以下详细描述和附图，本发明的其它特征和方面将变得显而易见。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一个带颜色的附图。带颜色附图的本专利或专利 申请公开文本的副本将由官方根据要求提供，并支付必要的费用。
图1是产生siRNA表达系统文库的本发明方法，以及从中分离RNA的细胞 群的RNAi筛选如用于沉默靶基因的用途，识别用于治疗的功能靶基因和/或识 别RNAi治疗剂的实施方式的示意图。
图2A显示了具有SacI限制性酶位点和用于与dsDNA片段连接的TA克隆 位点的优选衔接子。
图2B是特别适用于产生siRNA表达系统文库的优选质粒设计示意图。质粒 1表达组氨酸标记的p19多肽。质粒2表达与大肠杆菌核糖核酸酶III融合的组 氨酸标记的p19多肽。质粒3表达组氨酸标记的p19多肽和大肠杆菌核糖核酸酶 III。“T7”是T7启动子。SacI表示SacI限制性酶位点。
图3A是Green琼脂糖凝胶染色的图像，显示了衔接子连接和PCR 富集后的dsDNA片段的大小。
图3B显示了有dsDNA片段的克隆质粒SacI酶切测试后的凝胶图像。
图3C是显示使用本发明siRNA表达系统文库产生的siRNAs的靶基因沉默 效率条形图，即12个克隆的克隆质粒(见表1)。高比例的siRNA(15个中的 11个)能够将相应的靶基因抑制至相对阴性对照样本中水平的<20％。图3A，B 和C因此涉及克隆效率和siRNA沉默效率。
图4是高通量siRNA生产和分离的本发明实施方式的示意图。
图5A是Gold聚丙烯酰胺凝胶染色的图像，其显示通过KingFisherTM FlexPurification System用Ni-NTA磁珠纯化的siRNA样品。
图5B是Gold聚丙烯酰胺凝胶染色的图像，其显示通过KingFisherTM FlexPurification System使用SAX磁珠以0.1至0.2M NaCl作为洗脱缓冲液分离 的siRNA样品。
图5C是Gold聚丙烯酰胺凝胶染色的图像，其显示通过KingFisherTM FlexPurification System使用AMPure磁珠进一步纯化和脱盐siRNA的影响。图 5A，B和C因此涉及用于产生siRNA的，有包括在多孔板中提取和纯化在内的 siRNA分离的方法的实施方案。
图6A显示了用siRNA以及与阳性对照siPLK和阴性对照siNC转染的HeLa 癌细胞代表性孔的成像结果。HeLa细胞以Hoechst 33342(Life Technologies)和 碘化丙啶(PI，Life Technologies)共染色10分钟随后置于HCS机器中收集 Hoechst，PI和EGFP通道的显微图像。在10x物镜条件下合并彩色图像。蓝点 表示HOECHST 33342染色的细胞核(活细胞)；绿点表示EGFP-Hela细胞；白点 表示PI染色的细胞核(死细胞)。从左到右是来自siNC，板1孔B3(P1-B3) siRNA和siPLK1代表性区域。
图6B显示了多孔板的图像，以及CellInsight CX7高内涵筛选(HCS)平台 数据收集和自动分析的实例。“所选对象计数”表示仅被HOECHST染色的细胞， 其表示活细胞的总计数。右侧的条形图显示了活细胞的相对百分比。siNC从孔 A1至孔A4四次重复转染作为阴性对照，用于每个筛板中的细胞存活测试标准 化。siPLK1从孔A9至孔A12四次重复转染作为每个筛板中阳性对照。
图6C显示了与图6B相同的96孔板使用CellTiter-Glo(CTG)的细胞存活 测定的示例性数据。siNC的数据是第一列，siPLK1的数据是第二列。图6A， B和C因此涉及siRNA筛选，即识别癌细胞存活必需的功能性靶基因。
图7A显示了来自96孔筛选板之一的HCS和CTG数据集之间的相关性。X 轴，CTG测试的相对siNC的活细胞数据。Y轴，HCS测试的相对siNC的活细 胞数据。红点是PHGDH siRNA的数据。从两种筛选方法获得的数据集相互关联 相对较好。显示了线性回归趋势线及其R2值。
图7B是显示在HCS和CTG测定中五种候选siRNA一致降低细胞存活至小 于60％(相对siNC对照)的结果的条形图。其靶基因在表2中给出。也显示了 siPLK1数据。图7A因此涉及和使用高内涵筛选(HCS)和CellTiter-Glo(CTG) 测试的siRNA筛选数据之间的比较。
图8A是本发明的优选实施方式的发酵罐示意图。
图8B是显示常规方法(摇瓶)与使用发酵罐的本发明方法的产量比较的条 形图。图8A和B因此涉及特别适用于大规模生产siRNA的本发明发酵罐。
图9是可用于工业生产siRNA的本发明siRNA生产方法的实施方式的示意 图。
图10是用于生产siRNA表达系统文库，用于生产siRNA，用于RNAi筛选 以及用于大规模生产有有利RNAi的siRNA候选物的整合方法的示意图。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的技术人员 普遍理解的相同的含义。除非本文中另有说明，标准方法可以如所述用于本发明 的方法中，例如Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(第3版), Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA(2001)；Davis 等,BasicMethods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York, USA(1995)；Current Protocols in Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等,John Wileyand Sons,Inc.)和R.Ian Freshney,Culture of Animal Cells：A Manual of BasicTechnique,出版：Wiley-Liss,第5版(2005),Animal Cell Culture Methods (Methods inCell Biology,第57卷,Jennie P.Mather和David Barnes编, AcademicPress,第1版,1998)中，其通过引用的方式整体纳入本文。
如本文所用“包括”是指包括以下元素，但不排除其他。“基本由...组成”是指 材料由各种元素以及通常和不可避免的杂质，例如通常由各制备过程或获得材料 的方法导致的副产物和组分如痕量其他组分或溶剂来组成。“由……组成”是指材 料仅由各元素组成，即形成。如本文所用，“a”，“an”和“the”形式旨在包括单数 和复数形式，除非上下文另有明确指出。除了在工作实施例中，或另外指出的地 方，本文中使用的所有数字应被理解为在所有情况下由术语“约”修饰。当与数字 相关使用时，术语“约”可以是指例如±2％。
本发明提供了制备小干扰RNA(siRNA)表达系统文库，以生产通过诱导 靶基因RNA表达产物降解来沉默靶基因的siRNA的方法，所述方法包括：
(i)从细胞群中分离一种或多种靶基因的RNA；
(ii)从所述分离的RNA产生RNA片段；
(iii)将所述RNA片段转化为dsDNA片段；
(iv)将所述dsDNA片段克隆到载体中以形成克隆的载体，每个载体包含一 个或多个启动子和能够接受至少一个dsDNA片段插入的至少一个限制性酶位 点，使得可以产生siRNA，特别是使得可以表达siRNA前体。
“siRNA表达系统文库”的表述包括克隆载体形式的siRNA表达系统，如克 隆质粒或以克隆载体已经被转化入其中的细菌细胞形式，其可用于生产沉默靶基 因的siRNA，特别是siRNA表达系统文库包括克隆载体已经被转化入其中的细 菌细胞。所述文库包括多种siRNA表达系统群，每个群对一个或多个基因或基 因片段特异，特别地每个群对一个基因特异。“群”是指相同类型的siRNA表达 系统，即有表达相同siRNA的相同克隆载体。最优选地，每个siRNA表达系统 群可以产生对不同于与其他群基因或基因片段的一个基因或基因片段特异的多 个siRNA。
“siRNA表达系统”同样包括克隆载体或克隆载体已经被转化入其中的细菌细 胞，其可用于生产siRNA，特别是其能够表达可被加工成siRNA的siRNA前体， 该siRNA前体是有约100个或更多个碱基对长度的dsRNA，其包括发夹dsRNA。 随后所述siRNA前体可以被加工，特别是切割成siRNA，特别是通过存在于细 菌细胞中的siRNA产生酶，例如编码于克隆载体中的siRNA产生酶，如通过引 用方式纳入本发明的US2015/0337306A1中公开的核糖核酸酶III，特别是大肠 杆菌核糖核酸酶III(例如NCBI gene ID：947033)或来自其他任何细菌种类的 核糖核酸酶III。siRNA产生酶是具有可以将(长)dsRNA以形成siRNA的方 式切割的核糖核酸酶活性的酶，即多肽。
siRNA表达系统群在沉默基因方面特别不同。即，每个表达系统群可用于产 生优选至少在其整个长度上与一个或多个基因RNA表达产物的至少一部分至少 基本互补的能沉默该基因的，特别是在其整个长度上与一个基因RNA表达产物 至少基本互补的能沉默该基因的siRNA。文库可以是例如在提供有生长培养基的 每个孔中具有表达系统群的多孔板的形式。多孔板的每个孔特别包含不同的 siRNA表达系统群，特别是以有克隆载体的细菌细胞的形式。所述文库可以包含 至少100个，优选至少500个，特别是多于900个不同siRNA表达系统群。特 别地，siRNA表达系统文库包含的表达系统群每个能产生其整个长度上与来自不 同靶基因的RNA表达产物至少基本互补的siRNA，即每个群对靶基因特异。
小干扰RNA是小双链RNA(dsRNA)也称为沉默RNA。siRNA在RNA干 扰(RNAi)途径中运行，其中其以与至少部分基因RNA表达产物序列至少部分 互补的至少部分siRNA序列，通过降解基因RNA表达产物来干扰基因表达，导 致在RNA表达产物编码多肽，即其为mRNA的情况下不翻译成所述基因的多肽 表达产物，或者在RNA表达产物为非编码的情况下另外抑制靶基因表达。
在本文中使用的“基因沉默”，“沉默”或“RNAi”表述是指引起RNAi的试剂， 在本发明中siRNA，导致RNA表达产物的特异性降解，从而在RNA表达产物 为mRNA表达产物的情况下抑制多肽表达产物的表达，或者在RNA表达产物为 非编码的情况下另外抑制基因表达。基因的沉默特别是指与不存在siRNA或用 非沉默siRNA的细胞中水平相比，统计学显著的细胞中基因RNA表达产物水平 降低，进一步优选细胞中基因RNA表达产物水平降低至少约20％，再进一步优 选至少约50％，更优选至少约60％，例如至少80％或更多。如本文所用的术语 “统计学显著”是指通常为对照的至少三次单独对照测定的平均值之上或之下的 至少两个标准偏差和/或按Student's t检验或其他领域中接受的统计学显著性检 测所测定的统计学显著的结果。
本文中使用术语“基因”是指核酸序列，即能够表达mRNA的DNA序列，其 表达产物通常为多肽，特别的其可被转录成mRNA并进一步转化为多肽。术语“靶 基因”包括可以通过siRNA沉默的所有基因，即其RNA表达产物可以被siRNA 降解，如切割。
术语“表达”是指涉及从DNA生产RNA和多肽的过程，包括转录，转录物 加工，翻译和蛋白折叠，修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA，以 及通过从基因转录的mRNA翻译所得的多肽以及非编码RNA。
与术语“蛋白质”互换使用的“多肽”是指通过相邻氨基酸残基的氨基和羧基 之间的肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。氨基酸残基可以被修饰 (例如，磷酸化，糖化，糖基化等)。
DNA和RNA序列是指核酸序列，即分别来自脱氧核糖核酸和核糖核酸单元 的序列。来自细胞群的分离的RNA通常是单链的。本文所用的dsDNA或dsRNA 分别是指双链DNA和RNA。双链DNA或RNA分别包含两条DNA和RNA链， 通常称为有义链和反义链，特别是其至少基本上互补。这并不排除环状结构的存 在。即，dsRNA包括的RNA包含可以自身反复形成具有环部分的双链结构的单 链RNA，例如，发夹RNA。
术语“互补”是指在两条链之间形成，即在正义和反义链之间形成的碱基对 A：T，G：C和A：U。本文所用的“基本上互补”特别是指核苷酸序列在所述序 列的整个长度上与另一核苷酸序列或其部分具有至少80％互补，例如，至少约 90％互补，至少约95％互补，至少约98％互补，至少约99％互补或100％互补。 即即使小于100％的碱基互补，核苷酸序列也是基本上互补的，例如序列可能在 某些碱基处不匹配。“部分互补”是指少于显著互补，即序列的部分与另一序列一 部分互补。对于siRNA，“与RNA互补”或“与RNA至少基本上互补”的表述总是 指siRNA的一条链，即与RNA表达产物相互作用的siRNA的引导链。
步骤(i)中从靶基因分离的RNA包括mRNA，也称为多肽编码RNA，以 及非编码RNA，其不编码多肽而是以其他方式调节靶基因表达。mRNA被称为 信使RNA，即指定基因多肽表达产物的氨基酸序列的RNA。因此，靶基因的“RNA 表达产物”是所述基因的表达产物的mRNA，或者以其他方式调节靶基因表达非 编码RNA。所述mRNA或非编码RNA包含siRNA一条链(引导链)可以与之 相互作用由此引起RNAi的核苷酸序列。术语“总RNA”特别包括mRNA，包括 核糖体RNA(rRNA)在内的非编码RNA。步骤(i)中使用的RNA优选代表细 胞群的转录组，即从细胞群特有基因组转录的RNA分子，特别是所有转录基因 的mRNA。
细胞群可以来自任何受试者。受试者可以是人或动物，特别是哺乳动物如人。 所述细胞群可以具有某些表型。特别地，细胞群来自具有某些疾病如癌症的受试 者。本发明特别的实施方式中，所述细胞群包含并进一步优选由癌细胞例如来自 人的癌细胞所形成。
可以产生的siRNA具有约19碱基对(bp)至约23bp长度，具体是约19bp 至约22bp的长度，优选所述siRNA长约21bp。所述siRNA优选在其整个长度 与编码多肽或者非编码的RNA表达产物至少基本上互补，其中一个siRNA特别 地在其整个长度上与来自一个靶基因的RNA表达产物至少基本上互补。在一些 实施方式中，所述siRNA可以是平末端的。在可选的实施方式中，所述siRNA 可在每条链上包含具有约0，1，2，3，4或5个核苷酸长度的3'和/或5'突出端。 突出长度在两条链之间独立。所述siRNA分子还可以包含3'羟基和5'磷酸基团。
所述方法的步骤(i)特别包括从细胞群中提取总RNA并除去rRNA。其可 以包括以有机溶剂或通过本领域技术人员已知的二氧化硅上固相萃取提取总 RNA。所述rRNA的去除可以例如通过mRNA选择，通过尾杂交或者通过与例 如市售试剂盒杂交去除rRNA来进行。来自所述细胞群的一个或多个靶基因的分 离的RNA特别包含并且更优选为mRNA。
步骤(ii)可以包括本领域技术人员已知的用于RNA片段化的方法，如酶， 金属离子，热和/或超声。
步骤(ii)中产生的所述RNA片段可以具有适合克隆入载体的数百个核苷 酸长度，优选其具有约100个核苷酸至约700个核苷酸，特别是至少约200个核 苷酸至约700个核苷酸的长度。
步骤(iii)特别包括逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
其优选包括将来自步骤(ii)的所述RNA片段逆转录翻译成第一链cDNA。 在该过程中，随机六核苷酸的混合物被特别地用作随机引物以沿着所述模板 RNA的多个位点引导DNA合成。也称为II逆转录酶的重组 M-MuLV逆转录酶优选用作关键酶以产生可以直接用于第二链合成的所述第一 链cDNA。步骤(iii)随后进一步包括从第一链cDNA产生双链cDNA的第二链 合成步骤。在此过程中，优选优化第二链合成酶混合物，以用优选存在于先前逆 转录系统中的随机引物将短第一链cDNA转化为双链cDNA。本文生成的所述DNA片段可随后转化为平末端dsDNA片段以用于进一步的步骤。
本文中使用的术语“载体”是指设计用于递送至宿主细胞，特别是细菌细胞的 核酸构建体。载体可以是病毒的或非病毒的。优选载体是质粒。质粒是双链并通 常为环状的DNA序列。载体是表达载体，即具有在宿主细胞，特别是细菌细胞 中掺入和表达核酸片段的能力的载体。
质粒可以包括但不限于通过引用并入本发明的US2015/0337306A1中公开 的质粒载体，并包括pBR322，pBR325，pACYC177，pACYC184，pUC8，pUC9， pUC18，pUC19，pLG339，pR290，pKC37，pKCl10，SV40，pBluescript II SK+/- 或KS+/-，pQE，pIH821，pGEX，pET系列。质粒可以是，例如pGEX质粒。
本文中将术语“克隆载体”或“克隆质粒”用于将dsDNA片段克隆到载体(如 质粒)中后获得的载体(如质粒)。
特别地，将一个或多个dsDNA片段克隆到一个载体中。本发明的实施方式 中，在步骤(iv)中将一个dsDNA片段克隆到一个载体中，即一个载体对一个 基因(或基因片段)特异，并且可以从靶向所述一个基因的所述载体产生siRNA。 这允许制备具有siRNA表达系统群的siRNA表达系统文库，每个群能够产生优 选在其整个长度上与不同于其他群基因的一个基因的RNA表达产物至少基本上 互补的siRNA。在可选实施方式中，将两个或更多个dsDNA片段克隆到一个载 体中，即将多个基因片段连接到一个载体中，其能产生优选在其整个长度上与两 个或更多个基因的RNA表达产物至少基本上互补的siRNA。
特别地，步骤(iv)中将所述dsDNA片段克隆进载体包括将有义序列，反 义序列和可选的形成环的序列，特别是在两个相对的启动子之间形成环的所述序 列连入载体，也称为“siRNA产生框架”，特别是作为克隆载体中siRNA前体表 达框架。
优选地，载体还包含“siRNA结合多肽表达框架”，其包含启动子和编码 siRNA结合多肽特别是p19多肽，以及可选的siRNA产生酶，特别是核糖核酸 酶如大肠杆菌(E.coli)核糖核酸酶III的序列。本领域技术人员会理解，本发明 的方法也可以使用编码来自任何其它细菌种类的siRNA产生酶，如核糖核酸酶 III的序列。在本发明的优选实施方式中，载体为进一步包含siRNA结合多肽表 达框架的质粒，siRNA结合多肽表达框架包含启动子，编码siRNA结合多肽的 序列和编码siRNA产生酶的序列，其中所述siRNA结合多肽是p19多肽而所述 siRNA产生酶是大肠杆菌核糖核酸酶III。
siRNA结合多肽，例如p19多肽，特别是但不限于，例如tombusvirus p19 (NCBIGene ID：1493957)的p19多肽能够结合siRNA，并特别地包括通过引 用方式纳入本发明的US2015/0337306A1中公开的那些。所述siRNA结合多肽 特别是如US2015/0337306A1中所公开的p19多肽，即选自如tombusvirus p19 多肽的p19多肽。进一步优选的是，所述siRNA结合多肽具有适于纯化siRNA 结合多肽和与siRNA结合多肽结合的siRNA的纯化标记。所述纯化标记可以与 如对纯化标记有亲和力的基质或树脂如Ni-NTA树脂上的另一部分结合。特别的 纯化标记包括如通过引用纳入本发明的US2015/0337306A1中公开的组氨酸标 记(“His标记”)。所述siRNA结合多肽特别是组氨酸标记的p19多肽。
载体特别能够表达siRNA结合多肽，特别是p19多肽，如组氨酸标记的p19 多肽，和siRNA产生酶，如核糖核酸酶III，或者与siRNA产生酶如大肠杆菌核 糖核酸酶III融合的siRNA结合多肽，特别是p19如组氨酸标记的p19。siRNA 产生酶如大肠杆菌核糖核酸酶III这样表达会增强siRNA生产。
载体中的一个或多个启动子优选包括T7启动子，即本领域技术人员已知的 T7启动子序列。特别地，载体包含两个或更多个启动子，特别是两个或更多个 T7启动子。克隆载体中的“siRNA产生框架”优选包含两个相对的启动子，更优 选的T7启动子，其间有至少一个dsDNA片段。
载体还可以包含启动子控制操纵基因，例如，如作为基于诱导物的存在与否 控制siRNA产生，例如siRNA前体表达的lac操纵子一部分的lac操纵基因。在 本发明的这样的实施方式中，所述siRNA前体的表达可以通过添加所述诱导物 来引发和/或增强。合适的诱导物是以引用纳入本发明的US2015/0337306A1中描 述的那些。优选的诱导物是异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。所述lac 操纵基因和所述lac操纵子的序列是本领域技术人员已知的。在本发明的优选实 施方式中，一个或多个启动子是T7启动子，并且所述载体进一步包含如作为lac 操纵子一部分的lac操纵基因。
载体因此具体地含有至少一种siRNA结合多肽，如p19多肽表达框架和 siRNA产生框架(图2B，质粒1)。所述siRNA产生框架由通过插入的dsDNA 片段侧翼的两个相对的启动子(例如T7启动子，参见图1)形成。此外，载体 可以通过将siRNA产生酶如大肠杆菌核糖核酸酶III与siRNA结合多肽如p19 多肽融合(图2B，质粒2)，或通过在相同转录物上表达单独的siRNA产生酶如 大肠杆菌核糖核酸酶III(图2B，质粒3)具有siRNA产生酶例如大肠杆菌核糖 核酸酶III过表达的能力。siRNA产生酶如大肠杆菌核糖核酸酶III的过表达可以 进一步增强siRNA产生。siRNA产生酶“过表达”，例如，是指siRNA产生酶表 达超过野生型大肠杆菌中表达至少约30％。
载体中至少一个限制性酶位点特别包括至少一个SacI限制性酶位点。
步骤(iv)可以特别包括：
a)将所述DNA片段与包含匹配载体中至少一个限制性酶位点的至少一个 限制性酶位点的衔接子连接；
b)以匹配衔接子的引物扩增所述dsDNA片段，特别地通过PCR方式进行；
c)通过能够识别衔接子上的限制性酶位点的限制性酶酶切所述dsDNA片 段，特别是通过SacI限制性酶；
d)将所述酶切的dsDNA连接到载体中。
衔接子的限制性酶位点特别是SacI限制性酶位点，和衔接子包含作为互补 链的SEQ.ID.NO：1和SEQ.ID.NO：2，特别是按图2A所示由作为互补链的 SEQ.ID.NO：1和SEQ.ID.NO：2形成。能够识别衔接子上的限制性酶位点的 限制性酶特别是SacI限制性酶。
在本发明的优选实施方式中，步骤a)包括加入衔接子和连接酶，特别地其 包括加入连接酶和具有基于TA克隆，即基于不同DNA片段的腺嘌呤和胸腺嘧 啶杂交和连接酶存在下连接在一起能力的SacI限制性酶位点的衔接子。
本发明的制备小干扰RNA(siRNA)表达系统文库的方法，优选进一步包 括将所述克隆载体转化入能够支持所述siRNA产生的细菌细胞的步骤(v)。
适合的细菌细胞是通过引用方式纳入本发明的US2015/0337306A1中公开 的那些。适用于本发明的细菌细胞的非限制性实例包括大肠杆菌细胞，包括大肠 杆菌BL21，大肠杆菌Tuner，大肠杆菌Rosetta，大肠杆菌JM101和任何前述的 衍生物。用于蛋白质表达的细菌细胞市售可得，例如。EXPRESS TM感受态大 肠杆菌(系列号C2523；NewEnglandBiosciences；Ipswich，MA)。本领域技术人 员会理解，本发明的方法还可以使用大肠杆菌以外的细菌种类。
优选地，细菌细胞选自大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌细胞有siRNA产生酶 如大肠杆菌核糖核酸酶III表达和siRNA结合多肽，特别是p19多肽表达，特别 是有显著超过野生型大肠杆菌细胞中表达的siRNA产生酶表达，其优选是指， 与野生型大肠杆菌细胞相比，siRNA产生酶如大肠杆菌核糖核酸酶III表达增加 至少20％，进一步优选至少30％，即特别是具有siRNA产生酶如大肠杆菌核糖 核酸酶III过表达。在本发明特别的实施方式中，所述细菌细胞选自大肠杆菌细 胞，转化入细菌细胞的载体包括siRNA结合多肽表达框架，其包含启动子，编 码siRNA结合多肽的序列和编码siRNA产生酶的序列，其中所述siRNA结合多肽优选为组氨酸标记的p19多肽，而所述siRNA产生酶优选为大肠杆菌核糖核 酸酶III。
特别地，将一种载体转化到一种细菌细胞中，即所述细菌细胞的每个群随后 代表一个或多个基因，特别是代表一个基因，即每个细菌细胞群可以用于制备 siRNA，siRNA优选在其整个长度上与不同于其他细菌细胞群靶基因的一个或多 个基因即靶基因的RNA表达产物，特别是与不同于其他细菌细胞群靶基因的一 个靶基因的RNA表达产物至少基本上互补。
图1显示了本发明方法的实施方式，其产生的siRNA表达系统文库可用于siRNA生产，和已从中分离RNA的细胞群的，如用来沉默靶基因的RNAi筛选， 识别治疗用功能性靶基因和/或识别RNAi治疗剂，其中从细胞群(“感兴趣的细 胞”)分离RNA，产生RNA片段，并将所述片段转化成dsDNA片段，将其克隆 入包含p19多肽形式(“p19”)的siRNA结合多肽的载体。
本发明还提供了从细菌细胞形式的siRNA表达系统，即包含转化入所述细 菌细胞的克隆载体的细菌细胞生产siRNA的方法。所述siRNA表达系统，特别 是如上所述的，即如上所述提供的siRNA表达系统。尽管优选大肠杆菌细胞， 所述细菌细胞可以来自任何种类。
特别地，所述细菌细胞选自大肠杆菌细胞，而所述载体包含siRNA结合多 肽表达框架，其包括启动子，编码siRNA结合多肽的序列和编码siRNA产生酶 的序列，其中所述siRNA结合多肽是组氨酸标记的p19多肽而所述siRNA产生 酶是大肠杆菌核糖核酸酶III。
所述生产siRNA的方法包括：
(i)提供细菌细胞形式的siRNA表达系统，特别是如上所述制备的细菌细胞 形式的siRNA表达系统，即制备包括如上所述的步骤：从所述细胞群体分离一 个或多个靶基因的RNA；从分离的RNA产生RNA片段；将RNA片段转化为 dsDNA片段；并将所述dsDNA片段克隆进载体中以形成克隆载体，每个载体包 含一个或多个启动子和能够接受至少一个dsDNA片段插入的至少一个限制性酶 位点，使得可以产生siRNA，特别是允许siRNA前体的表达；
(ii)使所述细菌细胞经受产生siRNA的条件，特别是包括孵育所述细菌细 胞；
(iii)可选地分离所述siRNA，特别是包括提取和纯化所述siRNA。
本文中所用术语“分离”是指如从所述细菌细胞其他成分和所用材料和用于 产生siRNA条件导致存在的其他DNA或RNA序列或多肽中分离所述siRNA。 特别地，分离siRNA包括提取和纯化所述siRNA。
“产生siRNA的条件”是指施加诸如添加引发物或适于引发和/或增强所述 siRNA的产生，特别是siRNA前体的表达及其加工成siRNA的某些温度或pH 的条件。
在本发明的优选实施方式中，分离所述siRNA。在本发明的可选的实施方案 中，收集所述细菌细胞包括进行离心以形成团块并将其储存在约-80℃直到 siRNA分离。
在本发明特别的实施方式中，步骤(ii)在多孔板，例如，96孔板或更多孔 板中进行，使得在每个孔中接收单一的siRNA表达系统群，即单一细菌细胞群， 即使得每个孔代表特定的靶基因。这种实施方式允许有利高通量产生siRNA和 随后的RNAi筛选。步骤(ii)可以包括步骤：
-将所述细菌细胞特别引入微孔板，特别使得一个孔接受一个细菌细胞群；
-可选用薄膜特别是透气膜密封微孔板；
-如通过振荡上至约21小时，特别通过将可选密封的微孔板置于孵育振荡器 中，例如在约15℃至约40℃，如在约30℃至约40℃，特别是在约37℃下，使微 孔板经受所述细菌细胞生长的条件；
-当细菌细胞处于指数生长期时，优选通过加入诱导物，尤其IPTG，诱导产 生siRNA。
图4显示用于高通量siRNA生产和分离的本发明方法的实施方式，包括通 过将单一细菌群(“单细菌菌落”)接种到每个孔中来将细菌细胞引入微孔板(这 里为96孔板)中，所述细菌细胞经受细菌细胞生长的条件(“培养”)，并且通过 IPTG诱导的方式产生所述siRNA。随后分离所述siRNA，包括在珠磨式研磨器 上裂解细胞，随后使用KingFisherTMFlex Purification System(Thermo Fisher Scientific)自动siRNA提取和使用KingFisherTM Flex Purification System以阴离 子交换和/或固相可逆固定磁珠纯化。
在优选实施方式中，步骤(ii)在发酵罐中进行。这种实施方式特别适用于 大规模生产siRNA，例如特异性siRNA候选物，即用于进一步筛选的siRNA群 体。
在优选实施方式中步骤(ii)包括：
a)将包含所述细菌细胞和生长培养基的混合物引入具有包括用于搅拌的装 置如一个或多个叶轮(3)和用于向混合物供应空气的装置(4，5)的搅拌单元 (2)，并具有配置来引入混合物的入口(6)以及用于自动供应酸和碱来调节混 合物pH值的装置(7，8)的发酵罐(1)；
b)在约15℃至约40℃之间，如约30℃至约40℃之间的温度和约6.5至约 7.5之间的pH下搅拌混所述合物；
c)诱导siRNA的产生；
d)将所述混合物中的所述细菌细胞保持在所述细菌细胞生长的条件下至少 约1小时。
发酵罐特别包括向其中引入生长培养基(20)和细菌细胞(21)的生物反应 器容器(19)。
所述搅拌单元(2)特别包括用于搅拌的装置，例如一个或多个叶轮(3)和 向所述混合物供应空气的装置(4，5)，包括管(5)，过滤器(18)和微型喷头 (4)，特别是布置在所述管的底部并突出到包含所述细菌细胞和所述生长培养基 的所述混合物中的自清洁喷头。用于自动供应酸和碱来调节所述混合物pH值的 装置(7，8)特别包括连接到蠕动泵(未示出)的入口和管。
优选地，步骤a)包括用接种物接种发酵罐，所述接种物包括所述细菌细胞 和所述生长培养基。特别地，用10％(v/v)的所述接种物接种所述发酵罐。所 述接种物的生产优选是通过将所述细菌细胞与所述生长培养基混合并在约 250rpm的振荡条件下在约15℃至约40℃，如在约30℃至约40℃之间的温度，更 优选约37℃下孵育培养物至少约8小时，优选至少约10小时特别是过夜。
本领域技术人员已知的“生长培养基”是指包含促进细菌生长的一种或多种 物质的液体，如组成本领域技术人员已知Terrific Broth培养基。
所述发酵罐可进一步包括下面的一种或多种特别是全部部件：
-用于消泡剂供应的入口(9)；
-具有过滤器的废气出口(10)；
-压力指示单元，例如特别是置于所述发酵罐上表面的压力表(11)；
-超压阀(12)，其特别地连接到所述发酵罐上表面的压力指示单元；
-取样口(14)，其可以包括过滤器(13)，并且特别地置于所述发酵罐上表 面(与用于酸和碱供应来调节混合物pH的所述入口和/或配置用于引入所述细菌 细胞和生长培养基的所述入口相对)；
-溶氧传感器(15)；
-具有集成温度传感器的pH传感器(16)；
-控制面板(17)，其特别用于命令和控制所有所需的参数，包括但不限于所 述混合物的pH和所述溶氧饱和度。所述控制面板可以连接到溶氧传感器(15) 和/或具有集成温度传感器的pH传感器(16)。来自溶氧传感器(15)和/或具有 集成温度传感器的pH传感器(16)的信号被所述控制面板集合，从中例如用于 酸和碱供应的泵会根据从所述面板接收的指令进行运作。对于其他参数，可以在 所述控制面板上输入值，并用于操作，例如输入在3Hz下搅拌以移动所述装置 来在该值下搅拌。
步骤b)优选以约3Hz至约5Hz，更优选以约3Hz的频率，特别是在约37℃ 的温度和约7的pH下进行。
步骤b)中溶氧饱和度优选约30％饱和度值，并由所述空气供应装置提供连 续的空气流。
特别地，通过调节所述搅拌频率和空气流量，将溶氧控制在30％的饱和度 值。以用于自动供应酸和碱来调节所述混合物pH值的所述装置(7，8)，特别 是蠕动泵自动控制的管，通过自动加入碱，特别是NaOH或酸，特别是HCl，将 pH保持在6.5和7.5之间，特别是在约7。
优选地，在步骤b)期间通过如每1小时测量约600nm的光密度测定所述细 菌细胞的生长。
步骤b)可以进行至少约8小时，例如至少约10小时和特别地过夜
步骤c)优选通过加入能够诱导siRNA产生,特别是随后被加工成所述 siRNA的siRNA前体表达的诱导物来进行。所述诱导物优选为IPTG(异丙基β-D- 硫代半乳糖苷)。优选在指数生长期，特别是在指数生长期的中段，加入诱导剂。 “指数生长期中段”为本领域技术人员已知的，并且是指，例如，在Terrific Broth 培养基中600nm处的光密度为约10。
在本发明特别的实施方案中，在步骤b)中搅拌混合物以约3Hz至约5Hz 的频率，在约37℃的温度和约7的pH值以及约30％的溶氧饱和度下进行，其 中通过调节所述搅拌频率和气流来控制所述溶氧饱和度，以蠕动泵自动控制的 管，来自动加入碱，特别是NaOH或酸，特别是HCl，将pH保持在约7，并且 其中通过在指数生长期中段加入异丙基β-D-硫代半乳糖苷来诱导所述siRNA的 表达。
步骤d)优选进行至少约2小时，特别是约3小时。
在步骤(ii)中使用发酵罐的本发明生产siRNA的方法可重复地允许以特别 高的产量，例如在2天内每升所述细菌细胞培养物约2mg来生产siRNA。
优选地，在步骤(iii)中分离所述siRNA，包括步骤：
a)可选地在离心混合物后，引发所述细菌细胞裂解；
b)在步骤a)之后离心裂解物，获得含有所述siRNA和残余物的上清液；
c)提取和纯化步骤b)所述的上清液中的siRNA，包括将所述上清液与磁 珠特别是磁性镍珠接触，更优选如柱形式的磁性Ni-NTA珠，如市售系统如 KingFisherTM FlexPurification System(Thermo Fisher Scientific)，以亲和纯化， 特别是组氨酸标记的多肽，如组氨酸标记的p19多肽或组氨酸标记的p19多肽结 合的siRNA以及siRNA洗脱。
所述细胞的裂解可以通过本领域技术人员已知的方法来引发。细胞裂解可 以，例如，通过机械力，酶切，超声处理，均化器中的均质化或冷冻和研磨中的 一种或多种引发。
步骤a)中所述的细胞的裂解引发优选通过机械力，特别通过向细胞加入例 如包括磷酸盐缓冲液，NaCl，咪唑和triton X-100，有溶菌酶的裂解缓冲液和珠， 如在市售珠磨式研磨器中，以通过机械力破坏细胞并释放细胞内容物。
优选在步骤c)后所述洗脱物经受作为步骤d)的阴离子交换层析，特别是 以高效液相层析(HPLC)的形式，以从先前纯化步骤中去除非特异性结合的多 肽或其他污染物，特别地阴离子交换层析以弱阴离子交换磁珠或强阴离子交换 (SAX)磁珠，最优选以强阴离子交换(SAX)磁珠，特别是用包含NaCl的洗 脱缓冲液进行以去除大于所述siRNA大小的RNA。洗脱缓冲液的非限制性实例 包括基本上由约0.1至约0.2M NaCl组成的洗脱缓冲液。所述阴离子交换层析可 以在市售系统，如使用SAX磁珠的KingFisherTM Flex PurificationSystem(Thermo Fisher Scientific)中进行。
优选地，洗脱物可选地在步骤d)或之后，例如在如KingFisherTM FlexPurification System(Thermo Fisher Scientific)的市售系统中，与如AMPure珠(Beckman Coulter)的固体可逆固定化珠接触，以除去盐和其他杂质，作为步骤 e)。
图9是本发明所述的siRNA生产的示意图，并且显示了用于工业生产siRNA 的实施方式，其包含所述接种物制备和用接种物接种所述发酵罐，搅拌所述混合 物并诱导所述siRNA的产生，以及将所述细菌细胞保持在所述混合物中(“发酵 罐培养”)，将所述混合物离心以获得细菌细胞团块，通过机械力(“高压细胞裂 解”)裂解细胞，离心所述裂解物，并使所述上清液经历Ni-NTA珠以提取和纯 化来得到siRNA洗脱物，并使洗脱物经历SAX HPLC以获得纯化的siRNA。
另一方面，本发明涉及适用于生产siRNA的上述发酵罐，特别是具有包括 用于搅拌的装置如一个或多个叶轮(3)和用于向所述混合物供应空气的装置(4， 5)的搅拌单元(2)，并具有配置来引入所述siRNA表达系统和/或生长培养基的 入口(6)，用于自动供应酸和碱来调节所述发酵罐中混合物pH值的装置(7，8)， 以及向其中引入特别是生长培养基(20)和所述siRNA表达系统(21)的生物 反应器容器(19)的发酵罐(1)。
所述发酵罐特别包括向其中引入生长培养基(20)和细菌细胞(21)的生物 反应器容器(19)。搅拌单元(2)特别包括用于搅拌的装置，例如一个或多个叶 轮(3)和向所述混合物供应空气的装置(4，5)，包括管(5)，过滤器(18)和 微型喷头(4)，特别是布置在管的底部并突出到引入所述发酵罐的所述混合物中 的自清洁喷头。用于自动供应酸和碱来调节混合物pH值的装置(7，8)特别包 括连接到蠕动泵(未示出)的入口和管。
所述发酵罐可进一步包括下面的一种或多种特别是全部部件：
-用于消泡剂供应的入口(9)；
-具有过滤器的废气出口(10)；
-压力指示单元，例如特别是置于所述发酵罐上表面的压力表(11)；
-超压阀(12)，其特别地连接到所述发酵罐上表面的所述压力指示单元；
-取样口(14)，其可以包括过滤器(13)，并且特别地置于所述发酵罐上表 面，与用于酸和碱供应来调节所述混合物pH的入口和/或配置用于引入所述 siRNA表达系统和生长培养基的入口相对；
-溶氧传感器(15)；
-具有集成温度传感器的pH传感器(16)；
-控制面板(17)，其特别用于命令和控制所有所需的参数，包括但不限于所 述混合物的所述pH和所述溶氧饱和度。控制面板可以连接到溶氧传感器(15) 和/或具有集成温度传感器的pH传感器(16)。来自所述溶氧传感器(15)和/ 或具有集成温度传感器的pH传感器(16)的信号被所述控制面板集合，从中例 如用于酸和碱供应的泵会根据从面板接收的指令进行运作。对于其他参数，可以 在所述控制面板上输入值，并用于操作，例如输入在3Hz下搅拌以移动所述装 置来在该值下搅拌。
本发明还提供了在细胞群中沉默靶基因的方法，也成为“RNAi筛选”，通过 使用如上述生产的siRNA诱导靶基因RNA表达产物降解，包括从细胞群分离的 RNA如上所述提供siRNA并将所述siRNA引入所述细胞群。
本发明的方法对siRNA表达系统生产的siRNA特别有利，所述siRNA表达 系统从向其中引入siRNA的相同类型细胞群分离的RNA如mRNA和非编码 RNA获得。
方法特别地进一步包括将所述细胞群引入多孔板，例如但不限于96孔板或 更多孔板，密度为例如，但不限于此限于每孔约5,000个细胞，并向孔中加入 siRNA。特别地，多孔板的每个孔接收不同siRNA表达系统群产生的siRNA，特 别是多种siRNA，特别地每个孔接收对于一个基因特异的siRNA，特别是多种 siRNA。加入的siRNA的浓度可以是例如约2nM。
所述siRNA可以通过本领域技术人员已知的用于转染的方法，例如显微注 射，电穿孔和脂质体介导的转染来引入所述细胞群，特别是通过向所述细胞群加 入转染试剂，例如阳离子脂质体制剂如如2000 (Invitrogen)。
细胞群优选孵育至少约12小时，特别是24小时，即保持所述细胞在有利于 转染的条件下，如在约37℃的温度下一定的时间。
方法还可以包括选择所述siRNA被引入的细胞的步骤。
此外，方法可以包括，特别是如以qRT-PCR方式通过测定所述基因的RNA 表达产物的水平来测定靶基因的沉默效率的步骤。
所述靶基因可能与疾病相关。这意味着所述靶基因的过表达与疾病的起因， 进展或维持有关，例如所述靶基因是致癌基因。
沉默靶基因是指通过降解如切割其RNA表达产物，至少统计学显著抑制所 述靶基因的表达，特别是其是指与没有siRNA或使用非沉默siRNA如来自 GenePharma的siNC的阴性对照相比，qRT-PCR可检测的所述RNA表达产物降 低至少约20％，进一步优选至少约50％，特别是大于60％，例如大于约80％。
进一步提供通过使用如上所述生产的siRNA识别用于治疗疾病的功能性靶 基因的方法，包括：
(i)如上所述从以分离自细胞群的所述RNA制备的siRNA表达系统提供 siRNA，该细胞群来自患病受试者；
(ii)将siRNA引入所述细胞群；
(iii)分析所述细胞群的表型。
本发明的方法特别有优势是由于步骤(i)中已从siRNA表达系统生产的 siRNA是从步骤(ii)向其中引入所述siRNA的相同类型细胞群所分离的RNA 如mRNA和非编码RNA获得。
步骤(ii)特别地进一步包括将细胞群引入多孔板，例如但不限于96孔板或 更多孔板，密度为例如，但不限于此限于每孔约5,000个细胞，并向孔中加入 siRNA。特别地，所述多孔板的每个孔接收不同siRNA表达系统群产生的siRNA， 特别是多种siRNA，特别地每个孔接收对于一个基因特异的siRNA，特别是多种 siRNA。加入的所述siRNA的浓度可以是例如约2nM。
所述siRNA可以通过本领域技术人员已知的用于转染的方法，例如显微注 射，电穿孔和脂质体介导的转染来引入所述细胞群，特别是通过向细胞群加入转 染试剂，例如阳离子脂质体制剂如如2000 (Invitrogen)。
步骤(ii)优选进一步孵育所述细胞群至少约12小时，特别是24小时，即 所述保持细胞群在有利于转染的条件下，如在约37℃的温度下一定的时间。该 方法还可以包括选择其中引入所述siRNA的细胞的步骤。
方法还可以包括选择所述siRNA被引入的细胞的步骤。
步骤(iii)可以包括将所述细胞群表型与阴性对照，即没有siRNA或向其 中引入了非沉默siRNA如GenePharma的siNC的相同细胞和组织类型细胞群， 和/或向其中引入了已知影响表型的siRNA，如已知沉默影响细胞群表型的特定 基因的siRNA的相同细胞和组织类型细胞群阳性对照相比较。
步骤(iii)可以包括例如与阴性对照相比测量所述细胞群中靶基因的表达水 平。
可选地步骤(iii)可以包括基于编码siRNA的DNA序列筛选靶基因，表型 分析和/或通过qRT-PCR测定靶基因的RNA表达产物的结果已发现其表型改变。
疾病可以是例如癌症，病毒性疾病或遗传疾病，特别是癌症。所述细胞群包 括并且特别是由来自人的癌细胞形成。所述癌细胞可以例如来自宫颈癌。
用该方法识别的疾病治疗靶基因可以用本发明的siRNA和/或其他类型的靶 基因特异性药物例如，小分子，抗体，基因编辑技术(锌指核酸酶，TALEN， CRISPR)和通过其他方法(例如化学合成)制备的siRNA来治疗。在这些情况 下，本发明的识别治疗用功能性靶基因的方法用做识别疾病治疗靶基因的诊断工 具的目的。
所述细胞群包含并且特别是由癌细胞形成的细胞群，和步骤(iii)随后优选 包括测定所述细胞群的细胞存活，例如用市售检测方法如HCS Viability CellTiter-(CTG)Luminescent Cell Viability Assay或流式细胞仪，并将细胞 存活与阴性对照进行比较，其中与用对基因非特异的siRNA的阴性对照相比， 细胞生长降低到小于约90％，特别是小于约60％表明对所述癌细胞生长必需的 基因沉默。
所述细胞群优选包含癌细胞，和步骤(iii)包括测定所述细胞群的细胞存活， 其中与阴性对照相比，细胞生长降低到小于60％表明对癌细胞生长必需的基因 沉默。
另一方面，本发明涉及通过使用如上所述产生的siRNA识别RNAi治疗剂 的方法，包括：
(i)如上所述从以分离自细胞群的RNA制备的siRNA表达系统提供siRNA， 其中所述细胞群具有指示某种疾病的增加的靶基因表达或活性；
(ii)将所述siRNA引入所述细胞群；
(iii)测定沉默效率，包括特别是通过qRT-PCR的方式测定靶基因的所述 RNA表达产物的水平。
本发明的方法特别有利是由于步骤(i)中已从siRNA表达系统生产的siRNA 是从步骤(ii)向其中引入siRNA的相同类型细胞群所分离的RNA如mRNA和 非编码RNA获得。
“增加的表达”或“增加的活性”可能是由于靶基因中的突变引起的。增加的活 性或增加的表达特别是指靶基因表达或活性显著增加的，特别至少10％并进一 步优选至少30％的增加，其可以用本领域技术人员已知的方法测定包括蛋白印 迹等。
步骤(ii)特别地进一步包括将所述细胞群引入多孔板，例如但不限于96 孔板或更多孔板，密度为例如，但不限于此限于每孔约5,000个细胞，并向孔中 加入siRNA。特别地，多孔板的每个孔接收不同siRNA表达系统群产生的siRNA， 特别是多种siRNA，特别地每个孔接收对于一个基因特异的siRNA，特别是多种 siRNA。加入的所述siRNA的浓度可以是例如约2nM。
siRNA可以通过本领域技术人员已知的用于转染的方法，例如显微注射，电 穿孔和脂质体介导的转染来引入所述细胞群，特别是通过向细胞群加入转染试 剂，例如阳离子脂质体制剂如如2000(Invitrogen)。
步骤(ii)优选进一步孵育所述细胞群至少约12小时，特别是24小时，即 保持所述细胞群在有利于转染的条件下，如在约37℃的温度下一定的时间。该 方法还可以包括选择其中引入siRNA的细胞的步骤。
方法还可以包括选择siRNA被引入的细胞的步骤。
特别地，相比阴性对照，靶基因RNA表达产物至少约50％，优选至少约 60％，特别至少约80％的降低表明所述siRNA是对所述靶基因的潜在RNAi治 疗剂。
作为RNAi治疗剂的所述siRNA可用于治疗如动物或人的受试者。即本发 明进一步提供了治疗患有疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量 的根据上述方法识别为RNAi治疗剂的siRNA。作为非限制性实例，疾病可以是 例如癌症，病毒性疾病或遗传性疾病。所述受试者特别是人或动物。siRNA可以 以药物形式施用，包括其可以是进一步包含至少一种药学上可耐受的赋形剂如药 学上可耐受的载体，填充剂，溶剂，稀释剂等的液体，半固体或固体形式。特别 地，所述siRNA可以包装入适合体内递送的输送载体，例如在基于脂和基于聚 合物的纳米颗粒中。所述siRNA可以通过口服或肠胃外途径施用于受试者。
本发明沉默细胞群中的靶基因，识别用于治疗疾病的功能性靶基因和识别 RNAi治疗剂的方法可以利用任何方法来分析所述细胞群的表型并确定沉默效 率，其中确定细胞生长和细胞存活仅表示一个实例，其特别适用于细胞群体为癌 细胞群的情况。可以应用适用于任何疾病或生物过程的指示和参数。
本领域技术人员会理解，本发明的特定优点通过组合本发明的方法获得，其 中技术人员会理解本发明包括说明书中单独地或共同地提及或指出的步骤和特 征的所有组合，以及每个方法步骤或特征的任何和所有组合。
方法优选地实施方式用于从细胞群分离的RNA整合生产siRNA表达系统文 库，从所述文库生产siRNA，如通过测定相比阴性对照和/或阳性对照的表型或 所述靶基因RNA表达产物水平来测定所述细胞群中靶基因沉默，以及特别是通 过使用本发明的发酵罐来生产一种或多种导致预期表型和/或预期沉默效率的 siRNA种类。因此，本发明还涉及生产导致靶基因的预期表型和/或预期沉默效 率的siRNA的方法，包括步骤：
A)制备小干扰RNA(siRNA)表达系统文库，包含从有疾病，如癌症的受 试者细胞群中分离RNA；从所述分离的RNA产生RNA片段；将所述RNA片 段转化为dsDNA片段；将所述dsDNA片段克隆到载体中，每个载体包含一个 或多个启动子和能够接受至少一个dsDNA片段插入的至少一个限制性酶位点， 使得可以产生siRNA，并将载体转化入细菌细胞；
B)从步骤A)所述的siRNA表达系统生产siRNA，包括使所述细菌细胞经 受产生siRNA的条件并分离所述siRNA；特别地步骤B)包括将所述细菌细胞 引入微孔板中，特别使得一个孔接受一种细菌细胞群；使微孔板经受所述细菌细 胞生长的条件，并诱导siRNA产生；其中分离siRNA特别地包括如通过机械力 引发细菌细胞裂解；离心所述裂解物以获得含所述siRNA和残余物的上清液； 提取和纯化所述上清液中的siRNA，包括使所述上清液接触磁珠，以亲和纯化和 洗脱siRNA，使所述洗脱物经历用强阴离子交换磁珠的阴离子交换层析和/或固 相可逆固定珠；
C)在所述细胞群中沉默靶基因包括将所述siRNA引入所述细胞群中，分 析所述细胞群表型和/或确定所述沉默效率，包括测定来自所述靶基因的RNA表 达产物水平；特别地步骤C)包括将所述细胞群引入多孔板中，使得所述多孔板 的每个孔接收由不同细菌细胞群产生的siRNA，特别是每个孔接受对一个基因特 异的siRNA，并例如通过HCS或CTG方法分析所述细胞群的表型如细胞存活， 和/或确定所述沉默效率，包括确定来自所述基因的RNA表达产物水平；步骤C) 可以进一步包括测序克隆的载体中的siRNA或dsDNA片段以识别靶基因；
D)选择导致预期表型和/或具有预期沉默效率的siRNA并从根据步骤A) 制备的能够产生所述siRNA的细菌细胞生产siRNA，其包括使所述细菌细胞经 受产生所述siRNA的条件并分离所述siRNA用于进一步筛选，其中步骤D)特 别包括将含所述细菌细胞和生长培养基的所述混合物引入具有包括用于搅拌的 装置(3)和用于向所述混合物供应空气的装置(4，5)的搅拌单元(2)，并具 有配置来引入所述siRNA表达系统的入口(6)以及用于自动供应酸和碱来调节 所述混合物pH值的装置(7，8)的发酵罐(1)；在约15℃至约40℃之间，如约30℃至约40℃之间的温度和约6.5至约7.5之间的pH下搅拌混合物；诱导所述 siRNA产生；将所述混合物中的细菌细胞保持在所述细菌细胞生长的条件下至少 约1小时；以及其中分离所述siRNA特别地包括如通过机械力引发细菌细胞裂 解；离心所述裂解物以获得含siRNA和残余物的上清液；提取和纯化所述上清 液中的所述siRNA，包括使上清液接触磁珠，以亲和纯化和洗脱siRNA，使所述 洗脱物经历用强阴离子交换磁珠的阴离子交换层析随后使洗脱物与固相可逆固 定珠接触；
图10显示了这样整合方法的实施方式，包括如上所述的从患者获得如癌细 胞的细胞群，从分离自所述细胞群的RNA制备siRNA表达系统，从所述表达系 统制备siRNA，在相同类型细胞群中以所述siRNA沉默靶基因，包括识别用于 治疗疾病的功能性靶基因，测序以识别靶基因和使用发酵罐生产siRNA。
实施例
实施例1A
根据本发明从HeLa癌细胞制备siRNA表达系统全转录组文库
图1中概述了所述siRNA文库制备和RNAi筛选方法的总体策略。总RNA 来自某靶细胞系，随后转化为siRNA产生质粒中的dsDNA文库。
首先提取来自HeLa-d1EGFP(具有EGFP转基因的HeLa细胞)的总RNA， 随后去除核糖体RNA。RNA被片段化为～200个核苷酸至～700个核苷酸的较 小片段，随后转化为dsDNA片段。随后将所述dsDNA片段通过TA克隆方法连 接到特别设计的含有与质粒上的限制性位点相匹配的SacI限制性位点的衔接子 (图2A)上。随后通过PCR扩增所述dsDNA片段(使用与衔接子匹配的引物)， SacI酶切并最终与载体连接。图3A显示了SacI衔接子连接和PCR后的所述DNA 片段。在这种情况下，所述dsDNA片段的大小范围为～200个核苷酸至～700 个核苷酸，其适合于克隆入所述质粒。将DNA片段与所述质粒连接后，对从几 个独立克隆中提取的质粒进行酶切测试(图3B)。可以获得高连接效率(在这种 情况下为100％)，所述dsDNA插入的大小范围与连接前的dsDNA片段的大小 范围相似。
已选择十二个克隆，即十二个克隆质粒群，来测序所述质粒以识别插入的 dsDNA片段(表1)。结果显示，十二个克隆覆盖了十四个独特基因的多个范围。 有趣的是，克隆中的三个，C1、C2和C7含有两个不同的基因片段(表1和图 3C中称为“基因1”和“基因2”)，表明多个dsDNA片段可以在插入所述质粒之前 连接在一起，这是因为DNA片段包含在两端包含相同的限制性位点。因此一个 siRNA质粒可能潜在地产生靶向多于一个基因的siRNA。
表1. 12个siRNA文库克隆的测序结果
实施例1B
从所述siRNA表达系统产生的所述siRNA的沉默效率
为了测试使用所述siRNA文库生产方法产生的siRNA的沉默效率，从十二个 个体克隆中提取siRNA。纯化的siRNA(根据Huang和Lieberman，Nat Protoc， 2013,8(12)：2325-36)被转染到HeLa-d1EGFP细胞中，并进行qRT-PCR以测 试RNA沉默效率。在15个测试的11个中，结果(图3C)显示了所述靶基因超 过80％的敲除。这些结果表明，高比例的siRNA文库克隆(>70％)可以产生 靶向其相应靶基因，即切割相应的RNA的高效siRNA。此外，对于C2和C7， 所述siRNA可以抑制两个靶基因，这证明一个siRNA文库质粒，如果其含有多 个dsDNA片段即多个基因片段，可以产生同时抑制多个基因的siRNA。
总之，这些数据表明本发明方法所述的siRNA文库生产方法已经成功地创 建了对细胞转录组“个性化”的细胞系特异siRNA文库，并且可以产生通过切割 RNA靶向相应基因的高效siRNA。
实施例1C
根据本发明从siRNA表达系统的文库生产siRNA
为了覆盖所述靶细胞的整个转录组，待生产的siRNA的数目在数千个范围 内。已经创建了高通量细菌培养和siRNA分离方法，用于生产含有数千个独立 siRNA表达系统的siRNA文库(图4)。
首先将所述siRNA文库质粒转化成能够支持siRNA生产的大肠杆菌细胞。 在37℃下，在具有抗生物素选择的培养基上过夜孵育后，将各克隆接种到预先 加入1ml培养基的96深孔板孔中。每个孔中含有一个独特的克隆于载体中特异 序列的dsDNA片段。因此，每个96孔板可以产生96种独立的siRNA。以相同 的方式制备多个板以达到数千siRNAs的数量。随后后将该板用透气膜密封并置 于孵育振荡器中，剧烈摇动培养上至21小时。当细菌处于指数生长阶段时，通 过添加IPTG诱导siRNA生成。在分离所述siRNA之前，将少量的所述细菌细 胞保存在甘油溶液中并储存在-80℃。细菌甘油储备物用于对所述DNA插入进行 测序以及之后所述siRNA的分离。
所述细菌培养步骤后，在裂解缓冲液中以珠磨式研磨器裂解所述细胞，其通 过机械力破坏细胞并随后释放所述细胞的内容物。将所述96孔板高速离心，然 后将所述上清液转移到另一个96孔板中，以用磁珠纯化siRNA。KingFisherTM Flex Purification System(Thermo Fisher Scientific)用于高通量和自动化的siRNA 纯化。
第一轮纯化包括结合磁性镍珠，多次洗涤和洗脱步骤。图5A显示了通过KingFisherTM Flex Purification System在96孔板中使用磁性Ni-NTA珠提取的几 种独立siRNA样品。进一步的纯化步骤是使用强阴离子交换(SAX)磁珠的阴 离子交换纯化，以除去大于siRNA大小(～21bp)的RNA。对于所述阴离子交 换纯化，图5B显示在洗脱步骤中使用～0.15M NaCl的溶液回收主要在约21bp 的siRNA。最后步骤是使用AMPure珠(BeckmanCoulter)形式的固相可逆固定 珠来从siRNA去除盐和其他杂质。然后将纯化的siRNA置于无核酸酶水溶液中， 准备用于下游的应用。图5C显示了在使用KingFisherTM FlexPurification System 的96孔形式中AMPure珠纯化后一些这样的独立siRNA。
所述细菌培养和分离过程已经在96孔板中重复进行以产生数千种siRNA。 使用上述方法所纯化的siRNA显示出约21bp的主要条带(图5C)，证明了通过 本发明所述的siRNA表达系统文库制备siRNA的方法获得了高效率和高纯度。 实施例1D
使用本发明的siRNA表达系统文库产生的siRNA识别癌细胞中的功能基因
使用上述方法，已提供了允许生产得自HeLa-d1EGFP细胞分离的RNA的 960个独立siRNA的siRNA文库。为证明siRNA文库的实用性，本例已经进行 了用于识别HeLa-d1EGFP细胞中癌细胞存活所需的功能基因的siRNA筛选。从 这种类型的RNAi筛选识别的所述基因可能潜在地成为癌症的治疗靶标。
HeLa-d1EGFP细胞以5000个细胞每孔的密度被置于在96孔板中。所述细 胞贴附到板上后，使用2000(Invitrogen)将10μl来自siRNA表 达系统文库的一个孔的siRNA转染到一个细胞孔中。转染24小时后，测定每个 孔中与细胞存活正相关的活细胞数目。使用针对PLK1的siRNA(siPLK1 GenePharma，序列：SEQ.ID No：3)，其为已知癌细胞分裂必需的基因，作为阳 性对照(其会使细胞存活显著降低)。使用订自GenePharma公司的阴性对照 siRNA(siNC；NC siRNA，B01001，GenePharma)作为所述筛选的阴性对照。
使用两种不同的活细胞读数方法进行两轮siRNA筛选。第一种是使用CellInsight CX7高内涵筛选(HCS)平台(Thermo Fisher Scientific)。对于HCS 方法，将细胞与Hechst 33342(Life Technologies)和碘化丙啶(PI，Life Technologies)共染色10分钟，随后置于HSC机器中以收集Hoechst，PI和EGFP 通道的显微图像。来自用siRNA转染的细胞的一个筛选孔，以及阳性对照 (siPLK1)和阴性对照(siNC)孔的代表性数据显示在图6A中。在这种情况下， 与阴性对照相比，P1-B3孔显示出明显减少的活细胞数。
HCS软件的参数已经设计为以自动分析图像并计算每个孔中活细胞的总数。 与用阳性对照siPLK1处理的孔显示类似活细胞计数的孔被选作潜在候选物。来 自一个96孔板的分析结果表明，来自孔C4的siRNA导致活细胞数量显著降低 (图6B)。最后，在候选的pro-siRNA中选择了可以严重影响癌细胞存活的C4。
对第二轮筛选，通过CellTiter-(CTG)Luminescent Cell Viability Assay(Promega)监测细胞存活。通过酶标仪(BioTek)读取与活细胞数量正相关的 所述发光信号。将siRNA转染的样品的数据标准化至siNC转染的阴性对照样品 以用于HCS和CTG筛选数据集。使用CTG测试的96孔筛选板代表性数据集显 示在图6C中。将CTG测试结果与HCS方法得到的结果相比较，两个数据集基 本相互一致(图7A)。
从11个96孔筛选板中选出5种siRNA候选物，在HCS和CTG测试中， 与阴性对照相比，其将细胞存活持续降低至小于60％(图6B，6C和图7B)。这 些已经被回收的siRNA克隆的甘油储备物，其克隆质粒被提取并测序以识别靶 基因。测序结果表明，这5个克隆质粒含有5个不同的基因或基因组序列(表2)。 有趣的是，候选物之一，磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)被先前的RNAi筛选识 别为人乳腺癌必需代谢基因(Possemato等人，Nature，2011年8月18日，486 日(7360)：346-50)。本发明的方法能够识别与其他RNAi筛选相同的候选物的 事实证明本发明的方法能够识别特定生物学途径中的真正参与者。
本发明的方法也可应用于其他癌症类型及其他疾病的功能基因组研究。
表2影响癌细胞存活的候选物siRNA
实施例2
从siRNA表达系统文库大量生产siRNA的方法
一旦潜在的功能靶基因已被识别，其需要在体外和体内实验中进行功能验 证。在动物体内的实验和治疗应用需要大量的siRNA。因此，本例已经开发和优 化了大规模生产siRNA的方法。
所述大规模siRNA生产方法已经基于被发酵罐系统开发(用于siRNA生产 的发酵罐的示意图在图8A中显示)。通过用siRNA表达质粒转化大肠杆菌T7 表达菌株开始所述生产。对于接种物制备，重组菌株已经在37℃下含有100毫 升优化生长培养基的1升挡板瓶中，以250rpm旋转的轨道摇动孵育器上生长过 夜。用10％(v/v)接种物接种所述发酵罐。所述发酵罐中的搅拌最初设定在频 率(3Hz)。温度控制在37℃，同时通过以蠕动泵自动控制的加料管自动加入 NaOH或HCl以保持pH值为7.0。溶氧(DO)通过在需要时增加搅拌频率(3-5 Hz)和空气流量控制在30％饱和度。通过安装于搅拌单元底部的自清洁微型喷 头施加连续空气流。每1小时从所述发酵罐无菌抽取样品，以测量600nm处的 光密度(OD)来监测细菌生长。当所述培养物处于指数期中段时，在所述发酵 罐中进行IPTG诱导，并且允许所述培养物进一步生长另外3小时。随后收获所 述培养物，将细菌团块保存在-80℃直到分离siRNA。
所述优化的大规模siRNA分离方法以使用基于高压方法的细胞裂解开始， 以实现从发酵罐获得的大细菌培养物团块的有效加工。之后是高度严格的结合和 洗涤步骤，以从镍NTA亲和珠去除非特异性结合的蛋白和其他污染物。最后， 在最佳摇动条件下洗脱siRNA以确保其从Ni-NTA珠上完全洗脱。为了获得没有 污染较长RNA的纯siRNA，也开发了使用阴离子交换柱(使用弱阴离子交换剂 或强阴离子交换剂)的优化HPLC纯化。
通过本发明的优化的大规模生产和纯化方法，可以非常快(2天内)和可重 复地以大约2毫升每升规模生产siRNA。图8B显示了与常规实验室生产方法(摇 瓶法)相比，基于发酵罐的siRNA生产结果。通过与摇瓶方法相比，以本发明 的方法使用优化的大规模生产方法在所述发酵罐中实现了几乎10倍的siRNA产 量改进。
总之，本发明已提供了用于大规模生产和分离高纯度pro-siRNA的最优方法。 这发展通过有助于所识别靶基因的体内功能验证和使siRNA能够大量生产来进 一步增加了制备siRNA表达系统文库和从其中生产siRNA，RNAi筛选，识别功 能性靶基因的新方法的价值，这种方法可以很容易地适应工业设定。图9给出了 在工业发酵设备中siRNA大规模生产应用和提取及纯化设置的示意图。
参考标记列表
1 发酵罐
2 搅拌单元
3 用于搅拌的装置，如一个或多个叶轮。
4 用于向混合物供应空气的装置，例如，微型喷头
5 用于向混合物供应空气的装置，例如，管
6 适于引入siRNA表达系统和生长培养基的入口
7 用于调节混合物pH值的自动酸供应装置
8 用于调节混合物pH值的自动碱供应装置
9 消泡剂供应
10 带过滤器的废气出口
11 压力指示单元，如压力表
12 超压阀
13 过滤器
14 取样口
15 溶氧传感器
16 带有集成温度传感器的pH传感器
17 控制面板
18 过滤器
19 生物反应器
20 生长培养基
21 siRNA表达系统
序列表
<110> 香港城市大学
<120> 用于生产小干扰RNA的小干扰RNA表达系统及其应用
<130> I48430LLO
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cgtcagagga agtaacgagc tcaat 25
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cccgcagtct ccttcattgc tcgagtt 27
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aagggcggct ttgccaagtg c 21

Claims (22)

1.一种制备小干扰RNA(siRNA)表达系统文库以生产通过诱导靶基因RNA表达产物降解来沉默靶基因的siRNA的方法，所述方法包括：
(i)从细胞群中分离一种或多种靶基因的RNA；
(ii)从分离的RNA产生RNA片段；
(iii)将RNA片段转化为dsDNA片段；
(iv)将dsDNA片段克隆到载体中以形成克隆载体，每个载体包含一个或多个启动子和能够接受至少一个dsDNA片段插入的至少一个限制性酶位点，使得可以产生siRNA。
2.权利要求1的方法，其中，所述RNA代表细胞群的转录组，以及其中细胞群来自人并包含癌细胞。
3.权利要求1的方法，其中，步骤(ii)中产生的所述RNA片段具有约100个核苷酸至约700个核苷酸的长度。
4.权利要求1的方法，其中，所述载体是进一步包含siRNA结合多肽表达框架的质粒，所述siRNA结合多肽表达框架包括启动子、编码siRNA结合多肽的序列和编码siRNA产生酶的序列，其中所述siRNA结合多肽是p19多肽而所述siRNA产生酶是大肠杆菌核糖核酸酶III。
5.权利要求1的方法，其中，所述一个或多个启动子是T7启动子。
6.权利要求1的方法，其中，产生的siRNA具有约19个碱基对至约22个碱基对之间的长度，以及其中siRNA表达系统文库包括表达系统群，每个表达系统能够表达在其整个长度上与不同靶基因RNA表达产物至少基本互补的siRNA。
7.权利要求1的方法，其中，步骤(iv)包括：
a)将DNA片段与衔接子连接，所述衔接子包含匹配所述载体中的至少一个限制性酶位点的至少一个限制性酶位点；
b)以匹配所述衔接子的引物扩增所述dsDNA片段；
c)通过能够识别所述衔接子上的限制性酶位点的限制性酶酶切所述dsDNA片段；
d)将酶切的dsDNA连接到所述载体中。
8.权利要求7的方法，其中，所述衔接子的限制性酶位点是SacI限制性酶位点，和所述衔接子包含SEQ.ID.NO：1和作为互补链的SEQ.ID.NO：2，以及步骤a)包括加入所述衔接子和连接酶。
9.权利要求1的方法，进一步包括将克隆的载体转化入细菌细胞的步骤(v)。
10.权利要求9的方法，其中，所述细菌细胞选自大肠杆菌细胞，和其中所述载体包含siRNA结合多肽表达框架，所述siRNA结合多肽表达框架包括启动子、编码siRNA结合多肽的序列和编码siRNA产生酶的序列，其中所述siRNA结合多肽是组氨酸标记的p19多肽而所述siRNA产生酶是大肠杆菌核糖核酸酶III，以及其中一个克隆的载体包含一个或多个dsDNA片段并被转化到一细菌细胞中。
11.一种从siRNA表达系统产生siRNA的方法，包括：
(i)提供细菌细胞形式的siRNA表达系统；
(ii)使细菌细胞经受产生siRNA的条件；
(iii)可选地分离所述siRNA。
12.权利要求11的方法，其中，所述siRNA由权利要求9的siRNA表达系统产生，包括：
(i)提供根据权利要求9的细菌细胞；
(ii)使所述细菌细胞经受产生siRNA的条件；
(iii)可选地分离所述siRNA。
13.权利要求11的方法，其中，步骤(ii)包括：
a)将包含所述细菌细胞和生长培养基的混合物引入发酵罐中，所述发酵罐具有包括用于搅拌的装置和用于向所述混合物供应空气的装置的搅拌单元，并具有配置来引入所述混合物的入口以及用于自动供应酸和碱来调节所述混合物的pH值的装置；
b)在约15℃至约40℃之间的温度和约6.5至约7.5之间的pH下搅拌所述混合物；
c)诱导所述siRNA的产生；
d)将所述混合物中的所述细菌细胞保持在所述细菌细胞生长的条件下至少约1小时。
14.权利要求13的方法，其中，在步骤b)中将所述混合物以大约3Hz至大约5Hz的频率、在约37℃的温度和约7的pH和约30％的溶氧饱和度下搅拌，其中通过调节搅拌频率和空气流量来控制溶氧饱和度，并通过由蠕动泵自动控制的管自动加入碱或酸来将pH保持在约7，以及其中在指数生长期中段通过加入异丙基β-D-硫代半乳糖苷来诱导siRNA的产生。
15.权利要求11的方法，其中，所述方法包括分离siRNA，和步骤(iii)包括：
a)引发所述细菌细胞的裂解；
b)在步骤a)之后离心裂解物，以获得含有siRNA和残余物的上清液；
c)提取和纯化步骤b)上清液中的siRNA，包括使所述上清液与磁珠接触进行亲和纯化和洗脱siRNA。
16.权利要求15的方法，其中，步骤a)中的所述细菌细胞裂解由包括向所述细菌细胞中加入裂解缓冲液和珠的机械力引发，以及步骤c)包括使上清液与磁性Ni-NTA珠接触。
17.权利要求15的方法，进一步包括在步骤c)后使洗脱物经历用含NaCl的洗脱缓冲液用强阴离子交换磁珠的阴离子交换层析的步骤d)，以及其中所述方法进一步包括在步骤d)后将洗脱物与固相可逆固定珠接触的步骤e)。
18.一种通过使用根据权利要求12产生的siRNA来识别用于治疗疾病的功能性靶基因的方法，包括：
(i)从以细胞群分离的RNA制备的siRNA表达系统根据权利要求12提供siRNA，该细胞群来自患有疾病的受试者；
(ii)将所述siRNA引入细胞群；
(iii)分析所述细胞群的表型。
19.权利要求18的方法，其中，疾病选自由癌、病毒性疾病和遗传疾病组成的组。
20.权利要求18的方法，其中，所述细胞群包含癌细胞，和步骤(iii)包括测定所述细胞群的细胞存活，其中与阴性对照相比，细胞生长降低到小于约60％表明对癌细胞的生长必需的靶基因沉默，以及其中通过高内涵筛选和/或CellTiterGlo测试来测定所述细胞群的细胞存活。
21.一种通过使用根据权利要求12产生的siRNA来识别RNAi治疗剂的方法，包括：
(i)从以细胞群分离的RNA制备的siRNA表达系统根据权利要求12提供siRNA，其中该细胞群具有指示某种疾病的增加的靶基因表达或活性；
(ii)将所述siRNA引入细胞群；
(iii)测定沉默效率，包括测定来自所述靶基因的RNA表达产物的水平。
22.权利要求21的方法，其中，与阴性对照相比，所述RNA表达产物的水平的至少80％的降低表明所述siRNA是对所述靶基因潜在的RNAi治疗剂。
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