KR20210127718A - 섬모병증의 치료 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 섬모병증을 앓고 있는 대상체에서 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물로서, 여기서 폴리리보뉴클레오티드는 상기 섬모병증과 연관된 결함을 갖는 단백질의 기능적 버전을 코딩하고, 여기서 상기 대상체의 호흡기계에 대한 상기 제약 조성물의 투여는 대상체가 호흡기계의 염증을 나타낼 때 실시되는 것인 제약 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본 개시내용은 섬모발생에 대한 폴리리보뉴클레오티드의 효과를 분석하는 방법으로서, 여기서 상기 폴리리보뉴클레오티드는 섬모발생에 수반되고/거나 그에 요구되는 단백질을 코딩하는 것인 방법에 관한 것이다.

Description

섬모병증의 치료

본 발명은 섬모병증을 앓고 있는 대상체에서 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물로서, 여기서 폴리리보뉴클레오티드는 상기 섬모병증과 연관된 결함을 갖는 단백질의 기능적 버전을 코딩하고, 여기서 상기 대상체의 호흡기계에 대한 상기 제약 조성물의 투여는 대상체가 호흡기계의 염증을 나타낼 때 실시되는 것인 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 섬모발생에 대한 폴리리보뉴클레오티드의 효과를 분석하는 방법으로서, 여기서 상기 폴리리보뉴클레오티드는 섬모발생에 수반되고/거나 그에 요구되는 단백질을 코딩하는 것인 방법에 관한 것이다.

산소는 세포의 에너지 공급에 중요하기 때문에 많은 다세포 유기체에 필수적이다. 포유동물에서, 공기에 포함된 산소는 호흡에 수반되는 기관을 지칭하는 호흡기계를 통해 유기체에 유입될 수 있다. 이는, 예를 들어 코, 인후, 후두, 기관, 기관지 및 폐를 포함한다. 후자의 경우, 환경으로부터의 기체는 내부 혈액 순환계에 포함된 기체로 교환되며, 이는 산소를 폐로부터 유기체의 상이한 부분에 있는 세포로 수송한다. 그러나, 요구되는 산소 외에도 다른 성분, 예컨대 오염물질, 질환 유발 인자 및 병원체 예컨대 바이러스 및 박테리아를 포함하여 공기에 포함된 자극 인자가 호흡기계를 통해 유기체에 유입될 수 있다. 따라서, 방어 메커니즘 예컨대 기침 반사 및 재채기가 호흡기계로부터 자극 인자를 배출하기 위해 존재한다. 배출을 위해, 자극 인자는 호흡기계 내의 상피 세포에 의해 분비되는 점성 점액에 포매된 다음, 섬모 세포에 의해 상피 표면을 가로질러 수송된다.

섬모 세포는 다수의 운동성 섬모의 동기화된 박동에 의해 상피 표면을 가로질러 점액과 자극 인자를 수송할 수 있다. 섬모는 상피 표면으로부터 환경과 접촉하는 호흡기계의 공간으로 확장되는 막으로 둘러싸인 관형 구조이다. 세포 내에서, 섬모의 축사는 고정 구조를 통해 기저체에 고정된다. 축사는 9개의 외부 이중선 미세소관이 중앙의 단일항 미세소관 쌍 (즉, 호흡 섬모)을 둘러싸고 있는 미세소관의 중심 번들이다. 외부 이중선 미세소관과 중앙 미세소관 쌍은 방사형 스포크에 의해 연결된다. 9개의 외부 이중선 미세소관 각각은 A-세관과 B-세관으로 이루어지며, 이중선은 넥신-디네인 조절 복합체에 의해 원주 방향으로 상호 연결된다. 내부 디네인 아암과 외부 디네인 아암은 각각의 A-세관에 연결되어 있다. 이들 디네인 아암은 미세소관을 따라 걸을 수 있는 운동 단백질을 함유하여, 섬모가 구부러져 박동을 초래하게 한다 (예를 들어 문헌 [Lodish et al., 2000, Molecular Cell Biology, 4^th edition, New York: W. H. Freeman, Section 19.4] 참조). 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei) 모델을 사용한 섬모체 구조의 조사는 이들 구조적 성분 중 일부가 빠른 회전을 나타내는 반면, 방사형 스포크, 중앙 쌍 및 외부 디네인 아암의 골격 성분은 발달 동안 섬모체 구조의 원위 말단에 주로 혼입되는 것으로 나타났다 (Vincensini et al., Biol Cell, 2018, 110:1-15).

섬모 세포의 동기화된 박동은 상피 표면을 가로질러 체액의 수송에 중요하기 때문에, 섬모체 구조의 섭동은 심각한 장애를 유발할 수 있다. 감소된 진폭 및/또는 박동 주파수 및/또는 비동기성을 포함한 운동성 결함은, 예를 들어 디네인 아암의 감소 또는 손실, 잘못된 국소화를 포함한 미세소관 배열의 해체 및 축사당 미세소관의 총 수에서의 변화 및 그의 조합의 결과로서 발생할 수 있다. 공지된 바에 따르면, 이들 기능적 축사 요소에서의 변화는 근본적인 유전적 결함으로 인해 발생한다. 이는 대부분 상기 언급된 것들을 포함하여 축사 성분을 코딩하는 유전자의 서열에서의 변화 때문이다. 유전자는 폴리리보뉴클레오티드 예컨대 mRNA로 전사되어 단백질로 번역될 수 있기 때문에, 유전자의 DNA 서열은 양 및 기능성 관점에서 각각의 단백질의 합성에 영향을 미친다. 서열 변화에 의해 유발된 섬모 장애, 즉 섬모병증은 유전되어 배아 또는 신생아를 포함한 모든 발달 단계에서 섬모의 운동성 결함과 연관되기 때문에, 섬모병증은 유기체에 심각한 결과를 초래할 수 있다.

섬모 장애의 널리 공지된 예는 종종 폐 기능 저하와 연관된 진행성 장애인 원발성 섬모 이상운동증 (PCD)이다. 따라서, 빈도가 증가하면서 점액 청소율을 증강시키고 중증의 경우에는 심지어 폐 이식까지 하기 위해서는, 예를 들어 흉부 타박 및 체위 배출을 포함한 장기 치료가 요구된다. 추가로, PCD 환자는 폐 및/또는 귀에서의 재발성 감염, 종종 또한 불임, 수두증 및 신체 편측성, 즉 좌우 축, 결함, 뿐만 아니라 망막 및/또는 신경학적 문제로 인해 고통받는다. 그러나 대부분의 섬모병증의 심각성에도 불구하고, PCD와 같은 섬모병증을 치료하기 위한 표준화된 유효한 전략은 아직 없다. 현재의 요법은 예를 들어 낭포성 섬유증으로부터 외삽되며 대부분의 경우 치료할 특이적 섬모병증, 예컨대 예를 들어 PCD에 대해 검증조차 되지 않았다. 따라서, 섬모병증 예컨대 PCD을 앓고 있는 대상체를 효율적으로 치료할 수 있는 해결책이 필요하다.

본 출원은 청구범위에 나열된 바와 같은 실시양태를 제공함으로써 섬모병증, 예컨대 PCD를 앓고 있는 대상체에서 섬모 기능을 회복할 필요성을 다룬다.

특히, 본 발명은 섬모병증을 앓고 있는 대상체에서 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물로서, 여기서 폴리리보뉴클레오티드는 상기 섬모병증과 연관된 결함을 갖는 단백질의 기능적 버전을 코딩하고, 여기서 상기 상기 대상체의 호흡기계에 대한 제약 조성물의 투여는 대상체가 호흡기계의 염증을 나타낼 때 실시되는 것인 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 세포 (섬모의 단백질 복합체의 특정 단백질에서의 결함을 보이며, 그의 결함은 적당한 섬모 기능의 상실을 초래함)를, 상기 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드로 형질감염시킴으로써 적당한 섬모 기능을 회복시키는 것이 실제로 가능하다는 발견에 기초한다. 그러나, 섬모 세포는 이러한 효과를 달성하기 위해 분화 동안 초기 단계에서 형질감염되어야 한다는 것이 또한 밝혀졌다. 이것은 섬모를 운반하는 상피 세포, 즉 기저 세포의 전구체 세포가 상피 내에 더 깊숙이 위치하고 표면에 노출되지 않기 때문에 기도계를 통한 형질감염에 접근할 수 없기 때문에 실질적인 문제를 야기한다. 본 발명에 따르면, 폴리리보뉴클레오티드의 투여에 의한 상피 세포의 형질감염은 섬모병증을 앓고 있는 대상체가 호흡기계의 염증을 나타낼 때 실시된다. 호흡기계 염증 동안 기도 상피는 섬모 세포의 전구체 세포, 즉 아직 섬모발생을 시작하지 않은 기저 세포에 접근할 수 있게 하는 병변과 상처를 보여준다. 각각의 단백질의 기능적 버전을 발현하는 상기 기재된 바와 같은 폴리리보뉴클레오티드로 이들 세포를 형질감염시키면, 이들 세포를 기능적 섬모 또는 적어도 부분적으로 기능적 섬모를 형성하는 세포로 만들 수 있으며, 이는 각각의 증상의 실질적인 완화를 초래할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "섬모병증"은 섬모 세포의 결함과 연관되고/거나 이를 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 따라서, 섬모병증은 섬모 고정 구조, 섬모 구조가 세포 내에서 고정되는 기저체, 및/또는 섬모 기능을 포함한 섬모 구조의 장애를 포함한다. 섬모병증의 예는 PCD, 바르데-비들 증후군, 심슨-골라비-버멜 증후군 (유형 2), 레버 선천성 흑내장, 신장염, 두개외배엽 이형성증 [센센브레너(Sensenbrenner)]을 포함한다 (예를 들어 문헌 [Mitchison et al., 2017, Ultrastructural Pathology,41(6):415-427] 참조).

본원에 사용된 바와 같은 용어 "섬모병증"은 대상체의 DNA, 예를 들어, 염색체 또는 미토콘드리아 DNA에서의 유전적 결함에 의해 야기되는 섬모병증을 지칭한다. 그러한 유전적 결함은 돌연변이에 의해 유발될 수 있고 서열 일부의 손실, 부가 또는 교환을 포함할 수 있다. 그 예는 카피 수 변이, 존재/부재 변이, 결실 (전체 또는 부분), 삽입, 미스-센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 스플라이스 부위 변이, 또는 그의 조합이다. 이러한 DNA에서의 변화는 코딩된 단백질의 가용성에서의 변화, 예컨대 단백질의 손실 또는 그 양의 감소로 이어질 수 있거나, 또는 변경된 기능을 갖는 단백질을 초래할 수 있다.

바람직한 실시양태에서 용어 "섬모병증"은 운동성 섬모에서의 결함과 연계된 질환을 지칭한다. 그러한 섬모병증의 한 예는 원발성 섬모 이상운동증 (PCD)이다. PCD는 운동성 섬모의 기능 장애로 인한 희귀 질환이다. PCD는 유전적, 기능적, 초구조적 수준에서 이질적이다. PCD는 점액 수송 및 청소 장애와 연관된다. PCD를 앓고 있는 대상체는 재발성 비충혈, 부비동 감염, 중이염, 불임, 위치 이상 예컨대 전내장 역위증 및 내장 역위 - "모호한 위치"로서 지칭되기도 함-, 및/또는 수두증을 나타낸다. 분자 수준에서, PCD는 대부분의 경우 호흡기계 섬모의 구조, 기능 및 생물발생에서의 이상과 연관된다. 이러한 이상에 대한 예는 디네인 아암의 부재 또는 단축, 결함있는 중심 쌍 복합체, 방사형 스포크 또는 넥신 링크이다. 이러한 이상 및 이에 따른, PCD와 연관된 섬모 운동성 결함은 각각의 성분을 코딩하는 유전자에서의 돌연변이, 특히 표 1에 열거된 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발되며, 여기서 그룹 "A" 및 "B"는 각각 PCD 증례의 적어도 1% 및 1% 미만을 차지하는 것으로 추정되는 병원성 돌연변이를 갖는 유전자를 지칭한다 (문헌 [Zariwala et al., GeneReviews®, 2007, updated 2015, Primary Ciliary Dyskinesia, editors Adam et al., Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2018] 참조).

따라서, 본 발명에 따른 제약 조성물에 포함되는 폴리리보뉴클레오티드는 표 1에 열거된 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 폴리리보뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 제약 조성물에 포함되는 폴리리보뉴클레오티드는 DNAH5, DNAH11, CCDC39, DNAI1, CCDC40, CCDC103, SPAG1, ZMYND10, ARMC4, CCDC151, DNAI2, RSPH1, CCDC114, RSPH4A, DNAAF1 (LRRC50), DNAAF2 (KTU), 및 LRRC6으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 mRNA이다.

표 1

본 개시내용의 전술한 또는 다른 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드 또는 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 또는 5 내지 11 중 하나 이상 (예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 5 내지 11에 제시된 서열)과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92% 또는 적어도 95% 동일한 (예를 들어, 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한) 1차 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 본원에 제시된 임의의 그러한 수준 및/또는 유형으로부터 선택된 변형의 수준 및/또는 유형을 갖는 변형된 폴리리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드의 동일성 퍼센트는 서열식별번호: 1 또는 5 내지 11의 CCDC40 코딩 서열 부분에 대해서만 측정된다 (예를 들어, UTR, 다른 비-코딩 서열 및 GFP 또는 에피토프 태그는 동일성 퍼센트를 계산할 때 고려되지 않음). 전술한 것 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 그러한 폴리리보뉴클레오티드 (또는 변형된 폴리리보뉴클레오티드)는 기능적 CCDC40 단백질을 코딩한다.

본 개시내용의 전술한 또는 다른 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드 또는 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 서열식별번호: 2 또는 12 내지 14 중 하나 이상 (예를 들어, 서열식별번호: 2 또는 12 내지 14에 제시된 서열)과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 또는 적어도 95% 동일한 (예를 들어, 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한) 1차 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 본원에 제시된 임의의 그러한 수준 및/또는 유형으로부터 선택된 변형의 수준 및/또는 유형을 갖는 변형된 폴리리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드의 동일성 퍼센트는 서열식별번호: 2 또는 12 내지 14의 CCDC39 코딩 서열 부분에 대해서만 측정된다 (예를 들어, UTR, 다른 비-코딩 서열 및 GFP 태그 또는 에피토프 태그는 동일성 퍼센트를 계산할 때 고려되지 않음). 전술한 것 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 그러한 폴리리보뉴클레오티드 (또는 변형된 폴리리보뉴클레오티드)는 기능적 CCDC39 단백질을 코딩한다.

본 개시내용의 전술한 또는 다른 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드 또는 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 서열식별번호: 4 (예를 들어, 서열식별번호: 4에 제시된 서열)과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 또는 적어도 95% 동일한 (예를 들어, 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한) 1차 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 본원에 제시된 임의의 그러한 수준 및/또는 유형으로부터 선택된 변형의 수준 및/또는 유형을 갖는 변형된 폴리리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드의 동일성 퍼센트는 서열식별번호: 4의 MCIDAS 코딩 서열 부분에 대해서만 측정된다 (예를 들어, UTR, 다른 비-코딩 서열 및 GFP 또는 에피토프 태그는 동일성 퍼센트를 계산할 때 고려되지 않음). 전술한 것 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 그러한 폴리리보뉴클레오티드 (또는 변형된 폴리리보뉴클레오티드)는 기능적 MCIDAS 단백질을 코딩한다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용은 전술한 폴리리보뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 더욱이, 임의의 그러한 폴리리보뉴클레오티드 (또는 제약 조성물)는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서 사용될 수 있다.

섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 한 실시양태에서, 상기 섬모병증은 코일드-코일 도메인 함유 40 (CCDC40; 예를 들어 인간 mRNA 및 단백질 CCDC40 서열 각각에 대한 NCBI 참조 서열 NM_017950.4 및 NP_060420.2 참조) 단백질에서의 결함 또는 코일드-코일 도메인 함유 39 (CCDC39; 예를 들어 인간 mRNA 및 단백질 CCDC39 서열 각각에 대한 NCBI 참조 서열 NM_181426.2 및 NP_852091.1 참조) 단백질에서의 결함과 연관된다.

CCDC40 및 CCDC39는 방사형 스포크와 A-세관 사이에 위치한 복합체를 구축한다. CCDC40 또는 CCDC39 단백질의 결함 버전은 CCDC40 유전자 또는 CCDC39 유전자에서의 돌연변이 예컨대 삽입, 결실, 넌센스 및 스플라이스 부위 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. 특히, CCDC40 단백질을 코딩하는 DNA 서열에서 248번 위치의 결실 및 2824번과 2825번 위치 사이의 TGT 삽입은 상당히 빈번한 것으로 보인다. CCDC40 또는 CCDC39의 결함 버전은 축사의 구조에서의 결함 예컨대 부재 또는 편심 중심 쌍, 비정상적인 방사형 스포크 및 넥신 링크, 디네인 조절 복합체의 비정상적인 어셈블리, 및/또는 내부 디네인 아암의 저하를 유발한다. 따라서, 본 발명에 따른 제약 조성물에 포함된 폴리리보뉴클레오티드는 바람직하게는 CCDC40 및/또는 CCDC39의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 mRNA이다. 섬모발생에 수반되는 단백질 뿐만 아니라 섬모병증과 연관된 유전자 및 분자 경로에 대한 추가 정보는 예를 들어 라이터와 레루의 리뷰 기사에서 찾을 수 있다 (Reiter and Leroux, 2017, Nat Rev Mol Cell Biol, 18(9):533-547).

본 발명의 제약 조성물은 섬모병증을 앓고 있는 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본원에서 섬모병증을 앓고 있는 대상체는 또한 환자로서 지칭될 수 있다. 환자는 비정상적인 섬모 구조 및/또는 기능, 및/또는 호흡기에서의 점액 및 박테리아의 체류를 초래하는 생물발생 결함을 보일 수 있다. 주어진 대상체에 대한 섬모병증의 진단은 예를 들어 문헌 (Goutaki et al., 2016, Eur Respir J, 48(4):1081-1095)에서 고찰된 바와 같이, 임상 소견, 분자 분석 및/또는 상기 대상체의 생검에 대한 섬모 초미세 구조 분석에 기초할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "폴리리보뉴클레오티드"는 아데노신, 구아노신, 시티딘 및/또는 우리딘 잔기 (변형된 또는 비변형된 형태, 하기 참조)로 구축된 단일 가닥 서열을 지칭한다. 본원에서, 용어 "단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드"는 단백질을 코딩하는 코딩 영역, 즉 아미노산 서열로 번역될 수 있는 코딩 영역을 함유하는 폴리리보뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 용어 "단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드"는 바람직하게는 mRNA를 지칭하며, 여기서 mRNA는 세포 내로 들어온 경우 단백질의 발현에 적합하거나 또는 단백질로 번역되는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에서, 용어 "단백질"은 임의의 종류의 아미노산 서열, 즉 각각 펩티드 결합을 통해 연결되는 2개 이상의 아미노산의 쇄를 포괄한다. 이러한 맥락에서 사용된 용어 "단백질"은 임의의 관심 아미노산 서열을 지칭한다. 바람직하게는, 코딩된 아미노산 서열은 적어도 5개의 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 적어도 10개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 적어도 50개, 100개, 200개 또는 500개의 아미노산 길이이다. 따라서, 용어 "단백질"은 짧은 펩티드 뿐만 아니라 폴리펩티드를 포괄한다. 코딩된 단백질의 기능과 관련하여, 단백질의 결함 변이체가 섬모병증과 연관되는 것을 제외하고는 제한이 없다. 본원에서, 용어 "와 연관된"은 용어 "유발하는", "에 수반되는" 및/또는 "증강시키는" 것을 포괄하도록 의도된다.

본원에서, 용어 "결함을 갖는 단백질"은 "결함 단백질" 또는 "단백질의 결함 버전"을 지칭하고, 따라서 상기 단백질의 기능적 버전과 비교하여 변경된 기능을 갖는 단백질 버전을 지칭한다. 그러나, 상기 용어는 합성이 완전히 또는 부분적으로 결여되므로, 세포 내에서의 이용가능성이 완전히 또는 부분적으로 결여된 상기 단백질의 버전을 또한 포괄할 수 있다. 어떤 경우든, 단백질 버전의 결함으로 인해 단백질의 본연의 기능을 수행할 수 없는 단백질 버전이 생성된다.

본연의 기능을 수행하는 단백질의 버전은 본원에서 "기능적 단백질" 또는 "단백질의 기능적 버전"으로서 지칭되며, 각각의 결함 단백질과 동일한 DNA 서열에 의해 코딩되지만, DNA 서열에서의 변화를 유발하는 결함을 수반하지 않으므로, DNA 서열에서의 돌연변이를 수반하지 않는다.

따라서, 본 발명의 맥락에서, "기능적 단백질"은 바람직하게는 A-세관, B-세관, 또는 넥신-디네인 조절 복합체, 또는 방사형 스포크, 내부 디네인 아암, 및/또는 외부 디네인 아암의 빌딩 블록이다.

따라서, 용어 "폴리리보뉴클레오티드는 상기 섬모병증과 연관된 결함을 갖는 단백질의 기능적 버전을 코딩한다"는 바람직하게는, 섬모 축사, 축사 고정 구조 또는 기저체의 구조적 구성에 수반되는 기능적 단백질을 코딩하고 그의 본연의 기능을 수행하는 mRNA를 지칭한다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리리보뉴클레오티드는 바람직하게는, 기능적 단백질을 코딩하는 mRNA를 지칭하며, 그의 존재는 섬모병증을 앓고 있는 대상체의 세포에서, 이러한 세포의 DNA 서열에 의해 코딩된 바와 같이 상기 단백질의 결함과 연관되는 상기 섬모병증의 징후를 완화 또는 방지하거나 또는 연관된 증상을 완화시키는데 필요하거나 유익하다.

또한, 본 발명에 따라 이용되는 폴리리보뉴클레오티드는 또한 추가의 기능적 영역 및/또는 3' 또는 5' 비-코딩 영역을 포함할 수 있다. 3' 및/또는 5' 비-코딩 영역은 코딩된 단백질을 자연적으로 플랭킹하는 서열 또는 상기 폴리리보뉴클레오티드의 안정화 및/또는 조절에 기여하는 인공 서열일 수 있다. 적합한 서열은 일상적인 실험에 의해 확인되고 조사될 수 있다. 추가로, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 또한 추가의 기능적 영역을 가질 수 있고, 예를 들어 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 원하는 폴리리보뉴클레오티드의 활성을 공간적 및 시간적 제어하기 위해, 즉 예를 들어 특이적 세포 또는 세포 유형 및/또는 발달 단계 또는 특이적 시간대와 관련하여, 마이크로-RNA의 조절 요소 및 표적 서열과 조합될 수 있다.

본 발명에 따라 이용되는 폴리리보뉴클레오티드는 사용될 자연 서열로부터 유래된 부분적으로 또는 완전히 코돈 최적화된 서열을 포함할 수 있다. 코돈 최적화는 주어진 아미노산에 대해 일부 종에 의해 우선적으로 사용되는 코돈이 존재하는 일부 경우에서와 같이 각각의 폴리리보뉴클레오티드의 번역 효율을 증가시킴으로써 단백질 발현을 최대화하기 위해 적용되는 기술을 지칭한다. 추가로, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 작용 지속기간을 조정 및/또는 연장하기 위한 추가의 변형을 포함할 수 있다. 상기 폴리리보뉴클레오티드는 또한 m7GpppG 캡, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 및/또는 3' 말단에서의 폴리A 꼬리 및/또는 번역 촉진을 위한 부가의 서열을 함유할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서 본 발명에 따라 이용되는 폴리리보뉴클레오티드는 비변형된 및 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비변형된 뉴클레오티드"는 A, C, G 및 U 뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 A, C, G 및 U 뉴클레오티드의 임의의 자연적으로 발생하거나 또는 비-자연적으로 발생하는 이성질체 뿐만 아니라 예를 들어 화학적 변형 또는 치환된 잔기를 갖는 임의의 자연적으로 발생하거나 또는 자연적으로 발생하는 유사체, 대체물 또는 변형된 뉴클레오티드 또는 그의 이성질체를 지칭한다. 변형된 뉴클레오티드는 염기 변형 및/또는 당 변형을 가질 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 또한, 예를 들어, mRNA 분자의 5개 프라임 캡과 관련하여 포스페이트 기 변형을 가질 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드의 공유 변형에 의해 전사 후 합성되는 뉴클레오티드를 포함한다. 추가로, 비변형된 및 변형된 뉴클레오티드의 임의의 적합한 혼합물이 가능하다. 변형된 뉴클레오티드의 비-제한적인 수의 예는 문헌에서 찾을 수 있고 (예를 들어 문헌 [Cantara et al., Nucleic Acids Res, 2011, 39(Issue suppl_1):D195-D201; Helm and Alfonzo, Chem Biol, 2014, 21(2):174-185; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2012, 51(29):7110-31]), 일부 바람직한 변형된 뉴클레오티드는 각각의 뉴클레오시드 잔기에 기초하여 하기에서 예시적으로 언급된다:

1-메틸아데노신, 2-메틸티오-N6-히드록시노르발릴 카르바모일아데노신, 2-메틸아데노신, 2'-O-리보실포스페이트 아데노신, N6-메틸-N6-트레오닐카르바모일아데노신, N6-아세틸아데노신, N6-글리시닐카르바모일아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-메틸아데노신, N6-트레오닐카르바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, N6-히드록시노르발릴카르바모일아데노신, 1,2'-O-디메틸아데노신, N6,2'-O-디메틸아데노신, 2'-O-메틸아데노신, N6,N6,2'-O-트리메틸아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-메틸아데노신, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카르바모일아데노신, N6-2-메틸티오-N6-트레오닐 카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, 7-메틸아데노신, 2-메틸티오-아데노신, 2-메톡시-아데노신, 2'-아미노-2'-데옥시아데노신, 2'-아지도-2'-데옥시아데노신, 2'-플루오로-2'-데옥시아데노신, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데노신, 7-데아자-8-아자-아데노신, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린; 2-티오시티딘, 3-메틸시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 5-히드록시시티딘, 리시딘, N4-아세틸-2'-O-메틸시티딘, 5-포르밀-2'-O-메틸시티딘, 5,2'-O-디메틸시티딘, 2-O-메틸시티딘, N4,2'-O-디메틸시티딘, N4,N4,2'-O-트리메틸시티딘, 이소시티딘, 슈도시티딘, 슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2'-메틸-2'-데옥시시티딘, 2'-아미노-2'-데옥시시티딘, 2'-플루오로-2'-데옥시시티딘, 5-아이오도시티딘, 5-브로모시티딘, 2'-아지도-2'-데옥시시티딘, 2'-아미노-2'-데옥시시티딘, 2'-플루오르-2'-데옥시시티딘, 5-아자-시티딘, 3-메틸-시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘, 제불라린, 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린; 1-메틸구아노신, N2,7-디메틸구아노신, N2-메틸구아노신, 2'-O-리보실포스페이트 구아노신, 7-메틸구아노신, 히드록시와이부토신, 7-아미노메틸-7-데아자구아노신, 7-시아노-7-데아자구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, N2,7,2'-O-트리메틸구아노신, N2,2'-O-디메틸구아노신, 1,2'-O-디메틸구아노신, 2'-O-메틸구아노신, N2,N2,2'-O-트리메틸구아노신, N2,N2J-트리메틸구아노신, 이소구아노신, 4-데메틸와이오신, 에폭시큐오신, 과소변형된 히드록시와이부토신, 메틸화된 과소변형된 히드록시와이부토신, 이소와이오신, 퍼옥시와이부토신, 갈락토실-큐오신, 만노실-큐오신, 큐오신, 아르케오신, 와이부토신, 메틸와이오신, 와이오신, 7-아미노카르복시프로필데메틸와이오신, 7-아미노카르복시프로필와이오신, 7-아미노카르복시프로필와이오신메틸에스테르, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신, N1-메틸구아노신, 2'-아미노-3'-데옥시구아노신, 2'-아지도-2'-데옥시구아노신, 2'-플루오로-2'-데옥시구아노신, 2-티오우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘, 3-메틸우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-카르복시메틸우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘, 5-히드록시우리딘, 5-메틸우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 5-카르바모일메틸우리딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘 메틸 에스테르, 디히드로우리딘, 5-메틸디히드로우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘, 5-(카르복시히드록시메틸)-2'-O-메틸우리딘 메틸 에스테르, 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘, 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오우리딘, 3,2'-O-디메틸우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-카르바모일히드록시메틸우리딘, 5-카르바모일메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-카르바모일메틸-2-티오우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸우리딘, 5,2'-O-디메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 2'-O-메틸-2-티오우리딘, 2-티오-2'-O-메틸우리딘, 우리딘 5-옥시아세트산, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘, 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5-메톡시우리딘, 5-아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오우리딘, 슈도우리딘, 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘, 1-메틸슈도우리딘, 3-메틸슈도우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, 5-포르밀우리딘, 5-아미노메틸-2-제라닐우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 5-아이오도우리딘, 5-브로모우리딘, 2'-메틸-2'-데옥시우리딘, 2'-아미노-2'-데옥시우리딘, 2'-아지도-2'-데옥시우리딘, 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘, 이노신, 1-메틸이노신, 1,2'-O-디메틸이노신, 2'-O-메틸이노신, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-카르복시메틸-우리딘, 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 1,2'-O-디메틸아데노신, 1,2'-O-디메틸구아노신, 1,2'-O-디메틸이노신, 2,8-디메틸아데노신, 2-메틸티오메틸렌티오-N6-이소펜테닐-아데노신, 2-제라닐티오우리딘, 2-리시딘, 2-메틸티오 시클릭 N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐) 아데노신, 2-메틸티오-N6-히드록시노르발릴카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-셀레노우리딘, 2-티오-2'-O-메틸우리딘, 2'-O-메틸아데노신, 2'-O-메틸시티딘, 2'-O-메틸구아노신, 2'-O-메틸이노신, 2'-O-메틸슈도우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 2'-O-리보실아데노신포스페이트, 2'-O-리보실구아노신포스페이트, 3,2'-O-디메틸우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)-5,6-디히드로우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘, 5,2'-O-디메틸시티딘, 5,2'-O-디메틸우리딘, 5-(카르복시히드록시메틸)-2'-O-메틸우리딘 메틸 에스테르, 55-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸우리딘, 5-아미노메틸-2-제라닐티오우리딘, 5-아미노메틸-2-셀레노우리딘, 5-아미노메틸우리딘, 5-카르바모일메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-카르복시히드록시메틸우리딘, 5-카르복시메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-제라닐티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-시아노메틸우리딘, 5-포르밀-2'-O-메틸시티딘, 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-제라닐티오우리딘, 7-아미노카르복시프로필-데메틸와이오신, 7-메틸구아노신, 8-메틸아데노신, N2,2'-O-디메틸구아노신, N2,7,2'-O-트리메틸구아노신, N2,7-디메틸구아노신, N2,N2,2'-O-트리메틸구아노신, N2,N2,7-트리메틸구아노신, N2,N2,7-트리메틸구아노신, N4,2'-O-디메틸시티딘, N4,N4,2'-O-트리메틸시티딘, N4,N4-디메틸시티딘, N4-아세틸-2'-O-메틸시티딘, N6,2'-O-디메틸아데노신, N6,N6,2'-O-트리메틸아데노신, N6-포르밀아데노신, N6-히드록시메틸아데노신, 아그마티딘, 2-메틸티오 시클릭 N6-트레오닐카르바모일아데노신, 글루타밀-큐오신, 임의의 뉴클레오티드에 부가된 구아노신, 구아닐화된 5' 말단, 히드록시-N6-트레오닐카르바모일아데노신; 가장 바람직하게는 슈도-우리딘, N1-메틸-슈도-우리딘, 2'-플루오로-2'-데옥시시티딘, 5-아이오도시티딘, 5-메틸시티딘, 2-티오우리딘, 5-아이오도우리딘 및/또는 5-메틸-우리딘.

더욱이, 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 동위원소 예컨대 중수소를 함유하는 뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "동위원소"는 동일한 수의 양성자를 갖지만 상이한 수의 중성자를 가지므로 상이한 질량 수를 초래하는 원소를 지칭한다. 따라서, 예를 들어 수소의 동위원소는 중수소에 제한되지 않고 또한 삼중수소를 포함한다. 더욱이, 폴리리보뉴클레오티드는 또한 예를 들어 탄소, 산소, 질소 및 인을 포함한 다른 원소의 동위원소를 함유할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드가 중수소화되거나 또는 수소 또는 산소, 탄소, 질소 또는 인의 또 다른 동위원소를 함유하는 것이 또한 가능하다.

폴리리보뉴클레오티드 내의 변형된 뉴클레오티드 유형의 총 수는 0, 1, 2, 3 또는 4일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 하나의 뉴클레오티드 유형의 적어도 하나의 뉴클레오티드, 예를 들어, 적어도 하나의 U 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 2가지 뉴클레오티드 유형 중 적어도 하나의 뉴클레오티드, 예를 들어, 적어도 하나의 U 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 C 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 3가지 뉴클레오티드 유형 중 적어도 하나의 뉴클레오티드, 예를 들어, 적어도 하나의 G 뉴클레오티드, 적어도 하나의 U 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 C 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 4가지 모든 뉴클레오티드 유형 중 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 이들 모든 실시양태에서 뉴클레오티드 유형당 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형될 수 있으며, 뉴클레오티드 유형당 상기 변형된 뉴클레오티드의 백분율은 0%, 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 100%이다. 일부 실시양태에서, 정제될 mRNA 분자에 포함된 변형된 뉴클레오티드의 총 백분율은 0%, 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 100%이다.

따라서, 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어 U 뉴클레오티드의 0.5 내지 50%, 바람직하게는 5 내지 50% 및 C 뉴클레오티드의 5 내지 50%가 변형되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 변형된 U 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도우리딘이고 상기 변형된 C 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도시티딘이다.

일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 U 뉴클레오티드의 15 내지 25% 및 C 뉴클레오티드의 3 내지 15%, 바람직하게는 5 내지 15%가 변형되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 상기 변형된 U 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-메틸우리딘이고 상기 변형된 C 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도시티딘이다.

일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 U 뉴클레오티드의 30 내지 50% 및 C 뉴클레오티드의 10 내지 20%가 변형되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 상기 변형된 U 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도우리딘이고 상기 변형된 C 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도시티딘이다.

일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 U 뉴클레오티드의 30 내지 50% 및 C 뉴클레오티드의 5 내지 15%가 변형되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 상기 변형된 U 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도우리딘이고 상기 변형된 C 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도시티딘이다.

일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 U 뉴클레오티드의 0.5 내지 5% 및 C 뉴클레오티드의 25 내지 35%가 변형되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 상기 변형된 U 뉴클레오티드는 바람직하게는 2-티오우리딘이고 상기 변형된 C 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-메틸시티딘이다.

폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어 또한 U 뉴클레오티드의 50 내지 100%, 바람직하게는 100%가 변형되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 변형된 U 뉴클레오티드는 바람직하게는 N1-메틸-슈도-우리딘이다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명에 따르면, 섬모병증을 앓고 있는 환자에 대한 제약 조성물의 투여는 대상체가 호흡기계의 염증을 나타내는 경우에 실시된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "염증"은 감염, 외상 및 과민증을 포함한 상해에 대한 세포 반응을 지칭한다. "호흡기계의 염증"은 호흡기계, 특히 코, 인두, 후두, 기관, 기관지 및/또는 폐 (이에 제한되지 않음)에서의 염증 반응을 지칭한다. 호흡기계에서의 염증 반응은 예를 들어 자극 인자 예컨대 병원체, 독소, 오염물질 및/또는 알레르겐에 의해 유발될 수 있다. 염증 동안 특이적 세포 유형이 활성화되어, 예를 들어 다른 세포의 활성을 변형시키기 위해 시토카인 및 매개인자를 방출할 수 있다. 이들 프로세스는, 예를 들어 문헌 (Iwasaki et al., 2017, Nat Rev Immunol, 17(1):7-20)에 기재되어 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드가 투여될 섬모병증을 앓고 있는 대상체는 치료 전에, 대상체가 호흡기계의 염증을 앓고 있는지 여부를 결정하기 위해 검정을 받았으며, 여기서 대상체는 호흡기계의 염증이 있는 것으로 양성 결정되었다.

바람직하게는, 호흡기계의 염증은 급성 염증이다. 급성 염증은 몇 초, 몇 분, 몇 시간, 및 며칠에 걸쳐 발생할 수 있지만, 더 오랜 기간 동안 발생하지 않을 수도 있다. 따라서, 급성 염증은 최대 4주의 시간 범위, 바람직하게는 3주 미만의 시간대에 발생하는 염증이다. 이것은 국부적으로 증가된 혈류, 국부적으로 증가된 모세혈관 투과성, 및/또는 증가된 수의 호중구, 대식세포 및/또는 림프구를 기반으로 하는 일상적인 실험실 방법에 의해 결정될 수 있다. 원발성 섬모 이상운동증에서 기도 염증의 마커에 관한 더 많은 정보는, 예를 들어, 문헌 (Zihlif et al., 2006, Pediatr Pulmonol, 41(6):509-14)에서 찾을 수 있다.

일반적으로, 염증은 급성 또는 만성으로서 분류될 수 있다. 급성 염증은 유해한 자극에 대한 신체의 반응이며, 예를 들어 병에 걸린 조직으로의 과립구 이동 증가를 특징으로 한다. 염증의 전형적인 징후는 발열, 통증, 발적, 부기 및 기능 상실이다. 섬모병증 예컨대, PCD는 유전 장애이므로, 치료하지 않을 경우 기능 상실로 인한 영구적인 평생 자극으로 인해, 전형적으로 상기 증상을 나타내지 않는 영구적인 만성 염증 (기능 상실 이외)을 초래한다. 만성 염증과 연관된 질환에 대한 추가 예는 예를 들어: 건초열, 치주 질환, 아테롬성 경화증 및 골관절염이다. 그럼에도 불구하고, 그러한 질환을 앓고 있는 환자는 또한, 예를 들어 부가의 유해한 자극을 받는 것을 통해 급성 염증이 야기될 수 있고, 그 결과 염증의 고전적 징후와 같은 하나 이상의 고전적 증상은 발열, 통증, 발적, 부기 및 부가의 기능 상실이다.

따라서, 한 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드가 투여될 섬모병증을 앓고 있는 대상체는 치료 전에, 대상체가 호흡기계의 급성 염증을 앓고 있는지 여부를 결정하기 위한 검정을 받았으며, 여기서 대상체는 호흡기계의 급성 염증이 있는 것으로 양성 결정되었다.

대안적으로 또는 추가적으로, 호흡기계의 염증은 염증의 악화, 바람직하게는 염증의 급성 악화를 지칭한다. 악화는 질환의 악화 또는 증상의 증가를 지칭한다. 악화는 환자의 삶의 질을 저하시키고, 폐 기능의 감소를 가속화하며, 질환 관련 비용에 실질적으로 기여하기 때문에, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)의 맥락에서 가장 잘 조사된다.

임상 시험의 경우 호흡기계 악화는 하기와 같이 정의될 수 있다: "호흡기계 악화는 시험에서 박테리아 배양 결과와 상관없이 전신 항생제 치료를 시작하게 하는 호흡기 증상, 또는 항생제 처방 여부에 관계없이 스크리닝 및 랜덤화에서 예측된 평균 FEV1%에 비해 10 백분율 포인트 이상으로 예측된 1초 강제 호기 폐활량 (FEV1) %에서의 감소로서 정의된다. 악화의 발생은 환자 인터뷰, 신체 검사 및 폐활량 측정에 의해 평가할 수 있다. 각각의 시험 방문, 및 악화로 인한 시험 현장과의 임의의 추가 접촉 시, 참가자는 시험 현장과의 마지막 접촉 이후 증상 및 병용 약물에 관하여 인터뷰할 수 있다. 인터뷰는 증상 및 항생제에 대한 주간 환자 일기로 보완될 수 있다. 모든 방문에서 참가자의 전반적인 상태, 활력 징후, 귀, 심장 및 폐를 검토하는 신체 검사를 수행할 수 있다" (예를 들어 문헌 [Kobbernagel et al., 2016, BMC Pulmonary Medicine, 16:104] 참조).

따라서, 바람직한 실시양태에 따르면, 제약 조성물은 섬모병증을 앓고 있는 대상체에서 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 mRNA를 포함하고, 여기서 mRNA는 상기 섬모병증과 연관된 결함을 갖는 섬모 구조 단백질의 기능적 버전을 코딩하고, 여기서 상기 섬모병증을 앓고 있는 상기 대상체의 호흡기계에 대한 상기 제약 조성물의 투여는 섬모병증을 앓고 있는 대상체가 호흡기계의 급성 염증, 바람직하게는 급성 악화를 나타낼 때 실시된다.

따라서, 한 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드가 투여될 섬모병증을 앓고 있는 대상체는 치료 전에, 대상체가 호흡기계의 급성 염증, 바람직하게는 급성 악화를 앓고 있는지 여부를 결정하기 위해 검정을 받았으며, 여기서 대상체는 호흡기계의 만성 염증, 바람직하게는 급성 악화가 있는 것으로 양성 결정되었다.

섬모병증을 앓고 있는 대상체의 호흡기계의 염증의 존재 또는 부재는, 예를 들어, 혈액 샘플을 분석함으로써 또는 환자가 코감기 등을 앓고 있는지 여부를 결정함으로써 일상적인 절차에 의해 결정될 수 있다.

호흡기계에서 염증은 일반적으로 감염, 특히 바이러스성 또는 박테리아성 감염에 의해 유발된다. 따라서, 섬모병증 환자에서 염증의 존재 또는 부재는 바람직하게는, 감염, 바람직하게는 급성 감염의 존재 또는 부재를 결정함으로써 평가될 수 있다. 바람직하게는, 감염은 바이러스성 및/또는 박테리아성 감염이다.

급성 감염은 청진 소견, 화농성 기침, 침윤물, 객혈, 발열, 혈액 염증 파라미터에서의 증가 (c-반응성 단백질 (CRP) >200 mg/ml, 혈액 침강 <100 mm/h)를 특징으로 한다. 만성 감염은 침윤물의 이동, 항생제 내성, 지속적인 일반 증상 및 중간 정도로 증가된 혈액 염증 마커 (CRP 50-100 mg/ml, 혈액 침강 <50 mm/h)를 추가로 특징으로 한다 (Klinische Pneumonologie, 1. Aufl. 2014 Georg Thieme Verlag KG, ISBN 978-3-13-129751-8; Jaroszewski et al., 2012, Thorac Surg Clin, 22(3):301-24).

본 발명의 맥락에서, 용어 "호흡기계"는 호흡에 수반되는 기관, 예컨대 코, 인두, 후두, 기관, 기관지 및 폐를 포함한다. 특히, 호흡기계는 또한, 본원에서 대상체로서 지칭되기도 하는 인간을 포함한 일부 포유동물의 경우에 호흡기로서 지칭될 수 있다. 본원에서, 용어 "호흡기계" 및 "호흡기"는 상호교환적으로 사용된다. 호흡기는 상부 호흡기와 하부 호흡기로 나눌 수 있다. 상부 호흡기는 비강, 비갑개, 비전정 및 비도를 포함하는 코; 부비동; 인두, 및 성대 (코드) 위의 후두 부분을 포함한다. 하부 호흡기는 성대, 기관, 기관지 및 세기관지 아래의 후두 부분을 포함한다. 본원에서, 폐는 하부 호흡기에 포함되며, 호흡기 세기관지, 폐포관, 폐포낭 및 폐포를 포함한다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "제약 조성물"은 섬모병증을 치료하기 위해 대상체에 투여하기 위한 본 발명에 따른 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 포함하는 조성물을 지칭한다. 폴리리보뉴클레오티드는 바람직하게는 유효량, 즉 제약 조성물이 투여될 대상체에서 검출가능한 치료 반응을 유도하기에 충분한 양으로 포함된다. 본 발명의 제약 조성물은 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼 또는 에어로졸의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 제약 조성물은 스프레이 또는 액적, 예를 들어, 비강 스프레이 또는 비강 액적을 통해, 예를 들어, 흡입, 분무를 통해 호흡기계에 투여할 수 있게 하는 형태이다.

이는 스프레이, 액적, 네뷸라이저를 사용한 투여 또는 흡입에 의한 투여가 환자에 의해 용이하게 수행될 수 있고, 수송이 편안하므로, 어떠한 행동의 자유도 제한하지 않고 환자가 쉽게 이용할 수 있기 때문에 환자에게 유리하다.

바람직한 실시양태에서 제약 조성물은 DNAH5, DNAH11, CCDC39, DNAI1, CCDC40, CCDC103, SPAG1, ZMYND10, ARMC4, CCDC151, DNAI2, RSPH1, CCDC114, RSPH4A, DNAAF1 (LRRC50), DNAAF2 (KTU), 및 LRRC6으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 mRNA를 포함하고, 스프레이, 액적, 네뷸라이저를 사용함으로써 및/또는 흡입에 의해 상기 단백질의 결함으로 인한 PCD를 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 보다 바람직하게는 상기 단백질은 CCDC40 및/또는 CCDC39이다.

제약 조성물은 제약상 허용되는 담체, 즉 건전한 의학적 판단 범위 내에서 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 것으로 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화학적 화합물, 물질, 성분 및/또는 조성물을 포함할 수 있다. 따라서, 제약상 허용되는 담체는 투여량, 흡수, 용해도 또는 약동학적 고려 사항의 관점에서 취급을 용이하게 하기 위해 제약상 활성 물질과 함께 제형화된 불활성 물질이다. 적합한 제약상 허용되는 담체의 예는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 인산염 완충 식염수 용액, 완충제, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제 및 멸균 용액을 포함한다. 특히, 수성 담체는 식염수 및 완충 매질을 포함한, 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일, 및 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레이트이다. 제약상 허용되는 담체의 추가 예는 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액, 시트레이트, 인산염 및 다른 유기 산; 염 형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨 및 칼륨; 저분자량 (> 10개 아미노산 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민 또는 젤라틴; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 히스티딘, 글루타민, 리신, 아스파라긴, 아르기닌 또는 글리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 탄수화물; 모노사카라이드; 디사카라이드; 다른 당, 예를 들어, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 상표명 트윈(Tween)으로 시판되는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 프로필렌 글리콜, 플루로닉스(Pluronics) 또는 폴리에틸렌 글리콜; 메티오닌, 아스코르브산 및 토코페롤을 포함한 항산화제; 및/또는 보존제, 예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 제약상 허용되는 담체 및 그의 제형은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985, Mack Publishing Co]에 상세히 기재되어 있다. 더욱이, 보존제, 안정화제 및 다른 첨가제, 예컨대, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체, 나노시스템 또는 리포좀 등이 또한 존재할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 스프레이, 액적, 흡입기, 네뷸라이저 등의 사용과 같이 호흡기계에 투여하기 적합한 것으로 통상의 기술자에게 공지된 광범위한 부류의 투여 형태를 통해 환자에게 투여될 수 있다. 용량 및 작용 지속기간은 상기 폴리리보뉴클레오티드가 수행해야 하는 기능에 따라 달라지며 각각의 경우에 신중하게 조정되어야 한다. 작용 지속기간은, 예를 들어, 상기 폴리리보뉴클레오티드가 마찬가지로, 결핍성 유전자, 즉 변화된 DNA 서열로 인한 질환의 만성 요법에 사용되는 경우 가능한 한 길 것이다. 지속기간은 특이적 시간대로 조정될 수도 있다.

한 실시양태에서 제약 조성물은 1주에 적어도 1회 투여된다. 이는 상기 PCD의 치료의 효율적이고 지속적인 효과를 보장하는데 유리하다. 바람직하게는 제약 조성물은 적어도 2주 동안, 보다 바람직하게는 적어도 3주 동안, 보다 더 바람직하게는 적어도 4주 동안 매주 투여된다. 대안적으로, 제약 조성물은 적어도 1주 동안, 바람직하게는 적어도 2주 동안, 보다 바람직하게는 적어도 3주 동안, 보다 더 바람직하게는 적어도 4주 동안 주 2회 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이 4주 동안의 초기 치료 후 추가 치료가 필요한 경우, 치료는 매주 수행된다. 매주 투여에 대해 대안적으로, 투여는 더 긴 기간 동안, 예를 들어 적어도 2개월 동안, 바람직하게는 적어도 3개월 동안, 보다 바람직하게는 적어도 4개월 동안, 보다 더 바람직하게는 적어도 5개월 동안, 가장 바람직하게는 적어도 6개월 동안 월 1회 투여로 전환될 수 있다.

하나의 바람직한 실시양태에서 제약 조성물은 대상체가 적절한 용액, 바람직하게는 점액 용해제, 예컨대 고장성 식염수 또는 N-아세틸시스테인 (NAC) 용액을 흡입하거나, 또는 점액 및 잠재적으로 탈락된 기도 상피 세포를 제거하기 위해 적절한 용액, 바람직하게는 점액 용해제, 예컨대 고장성 식염수 또는 N-아세틸시스테인 (NAC)을 사용하여 비강 및/또는 부비동을 세척한 후 대상체의 호흡기계에 투여된다. 따라서, 제약 조성물은 대상체가 적절한 용액, 바람직하게는 점액 용해제, 예컨대 고장성 식염수 또는 N-아세틸시스테인 (NAC) 용액을 흡입하고, 기침을 하여 상피 세포에 위치한 점액을 토해낸 후 대상체의 호흡기계에 투여하는 것이 바람직하다. 이는 제약 조성물을 투여하기 전에 상피 세포를 노출시켜 폴리리보뉴클레오티드의 형질감염 효능을 증강시키는데 특히 유리하다.

따라서, 한 실시양태에서 폴리리보뉴클레오티드가 투여될 섬모병증을 앓고 있는 대상체는 치료 전에, 적절한 용액, 바람직하게는 점액 용해제, 예컨대 고장성 식염수 또는 N-아세틸시스테인 (NAC) 용액을 흡입시키거나, 또는 적절한 용액, 바람직하게는 점액 용해제, 예컨대 고장성 식염수 또는 N-아세틸시스테인 (NAC)으로 비강 및/또는 부비동을 세척시킨 대상체이다.

이러한 단계는 폴리리보뉴클레오티드를 투여하기 전에 대상체의 호흡기계로부터 점액을 물리적으로 제거하는 것을 목표로 한다.

또한, 이러한 대상체는 바람직하게는, 치료 전에, 대상체가 호흡기계의 염증, 바람직하게는 급성 염증 또는 염증의 악화를 앓고 있는지 여부를 결정하기 위해 검정을 거친 대상체이며, 여기서 대상체는 호흡기계의 염증, 바람직하게는 급성 염증 또는 염증의 악화가 있는 것으로 양성 결정되었다.

바람직한 실시양태에서, 상기 용액 중 NAC의 농도는 3% 내지 20%, 바람직하게는 5% 내지 15%, 보다 바람직하게는 8% 내지 12%, 가장 바람직하게는 10%이다. 백분율은 중량/중량을 기준으로 한다. 바람직하게는, NAC를 함유하는 용액은 또한 제약상 허용되는 농도의 나트륨 에데테이트 (에데테이트는 에틸렌디아민 테트라 아세테이트를 지칭함) 및/또는 나트륨 히드록시드를 함유한다. 바람직하게는, 용액을 수용액이다.

섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 점액 용해제, 예컨대 N-아세틸시스테인 (NAC) 및/또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 고장성 용액을 추가로 포함한다. 거담제로서 작용하는 NAC와 나트륨 클로라이드를 포함하는 고장성 용액은 둘 다 PCD를 앓고 있는 대상체에서 점성 점액의 체류를 저하시키는데 유리하다. 이것은 호흡기계 감염의 위험을 저하시키므로, 환자에 대한 부가의 스트레스를 저하시킬 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 상기 나타낸 바와 같은 농도의 NAC를 추가로 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 2% 내지 8%, 바람직하게는 3% 내지 7%, 보다 바람직하게는 4% 내지 7% 농도의 나트륨 클로라이드를 포함하는 고장성 용액을 추가로 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 3% 내지 20%, 바람직하게는 5% 내지 15%, 보다 바람직하게는 8% 내지 12%, 가장 바람직하게는 10% 농도의 NAC, 및/또는 2% 내지 8%, 바람직하게는 3% 내지 7%, 보다 바람직하게는 4% 내지 7% 농도의 나트륨 클로라이드를 포함하는 고장성 용액을 추가로 포함한다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 제약 조성물의 바람직한 실시양태에서, 상기 제약 조성물은 DNAH5, DNAH11, CCDC39, DNAI1, CCDC40, CCDC103, SPAG1, ZMYND10, ARMC4, CCDC151, DNAI2, RSPH1, CCDC114, RSPH4A, DNAAF1 (LRRC50), DNAAF2 (KTU), 및 LRRC6, 바람직하게는 CCDC40 및/또는 CCDC39로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 mRNA를 포함한다. 이러한 제약 조성물은 하기에서 "제1 제약 조성물"로서 지칭되기도 한다.

다섬모 분화 및 DNA 합성 연관 세포 주기 (MCIDAS) 단백질은 다중 운동성 섬모의 섬모발생을 포함하는 다섬모 세포 분화에 구체적으로 요구되는 전사 조절인자 단백질이다 (예를 들어 인간 mRNA 및 단백질 MCIDAS 서열 각각에 대한 NCBI 참조 서열 NM_001190787.1 및 NP_001177716.1; 또는 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 최적화된 폴리리보뉴클레오티드 서열 참조).

따라서, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제약 조성물은 다섬모 분화 및 DNA 합성 연관 세포 주기 (MCIDAS) 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 MCIDAS 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 제약 조성물과 함께 투여되는, 상기 기재된 바와 같은 제1 제약 조성물이다.

두 제약 조성물, 즉 MCIDAS 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드를 추가로 포함하는 상기 정의된 바와 같은 제1 제약 조성물 또는 MCIDAS 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 제약 조성물과 함께 투여되는 제1 제약 조성물은, 제약 조성물이 섬모발생 전 및/또는 섬모발생 동안 세포에 투여될 때, 본 발명에 따른 제약 조성물의 투여가 섬모 세포 구조 및 기능을 회복시키는데 특히 유효하기 때문에 유리하다. 추가로, 둘 다는 바람직하게는, 비강 스프레이 및/또는 네뷸라이저를 사용함으로써 및/또는 흡입에 의해, 바람직하게는 1주에 적어도 1회 및/또는 적어도 4주 동안 환자에게 투여된다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 2개 이상의 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 예를 들어 2개 이상의 상이한 단백질을 코딩하는 단일 폴리리보뉴클레오티드인 멀티시스트론성 폴리리보뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 2A 펩티드를 사용하여 그러한 멀티시스트론성 폴리리보뉴클레오티드를 설계하는 것은 문헌에 잘 설명되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌에서는 멀티시스트론성 mRNA를 생성하기 위한 2A 펩티드의 사용을 명확하게 보여주었다 (Liu et al., 2017, Scientific Reports, 7:2193). 이러한 2A 펩티드는 예를 들어 리보솜 스키핑 (2A 펩타이드의 기능적 특징)의 결과로서 서열 내의 제1 단백질 상으로 첨부되는 부가의 아미노산 (2A 펩타이드의 일부)을 제거하기 위한 푸린 절단 부위와 추가로 조합될 수 있다. 예를 들어, 2A 펩티드를 이용한 푸린 절단의 사용이, 예를 들어, 문헌 (Chng et al., 2015 MAbs, 7(2):403-412)에 기재되었다. 따라서, 2개 이상, 바람직하게는 2개의 치료 단백질 (예를 들어 CCDC40 및 MCIDAS)을 코딩하는 단일 폴리리보뉴클레오티드가 설계될 수 있으며, 여기서 2개의 치료 단백질의 코딩 영역은 2A 펩티드에 의해 분리된다 (상기 인용에 기재된 바와 같음).

따라서, 일부 실시양태에서, 제약 조성물이 2개 이상, 바람직하게는 2개의 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 상기 실시양태에 대해 기재된 바와 동일하게 적용된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 실시양태에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 DNAH5, DNAH11, CCDC39, DNAI1, CCDC40, CCDC103, SPAG1, ZMYND10, ARMC4, CCDC151, DNAI2, RSPH1, CCDC114, RSPH4A, DNAAF1 (LRRC50), DNAAF2 (KTU), 및 LRRC6, 바람직하게는 CCDC40 및/또는 CCDC39로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 서열, 및 MCIDAS 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 서열을 포함하는 멀티시스트론성 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 MCIDAS 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있고 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 최적화된 폴리리보뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드, 및 CCDC40 및/또는 CCDC39 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있고 서열식별번호: 1 (또는 서열식별번호: 5 내지 11) 및/또는 서열식별번호: 2 (또는 서열식별번호: 12 내지 14)에 제시된 바와 같은 최적화된 폴리리보뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 비강 스프레이, 및/또는 네뷸라이저를 사용함으로써, 및/또는 흡입에 의해, 바람직하게는 1주에 적어도 1회 및/또는 적어도 4주 동안 환자에게 투여된다.

MCIDAS에 대해 대안적으로 또는 추가적으로, 예를 들어 GemC1, FoxJ1 및/또는 E2f4VP16을 사용할 수 있다. GemC1은 섬모 상피에서 특이적으로 발현되며 섬모발생의 중심 조절인자이다. GemC1의 이소성 발현은 다섬모발생의 2가지 주요 전사 조절인자인 MCIDAS와 FoxJ1을 상향 조절함으로써 생체 외 기도 상피 세포에서 다섬모발생의 초기 단계를 유도하기에 충분하다고 보고되었다 (Arbi M et al., 2016, EMBO reports, 17(3):400-413). 더욱이, 동일한 연구에서 GemC1이 MCIDAS 및 FoxJ1 상류 조절 서열을 직접적으로 트랜스 활성화할 수 있다고 보고되었다. E2f4VP16은 HSV1 VP16으로부터의 일반 활성화 도메인을 함유하는 E2f4의 한 형태를 지칭하며, 다섬모발생과 연관된 핵심 유전자의 발현의 활성화에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다 (Kim S et al., Scientific Reports, 2018, 8:12369).

따라서, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제약 조성물은 상기 기재된 바와 같은 제1 제약 조성물이고, 하기 중 적어도 하나를 추가로 포함한다: MCIDAS 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드, GemC1 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드, FoxJ1 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드, 및/또는 E2f4VP16 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드.

제약 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 제1 제약 조성물은 하기 중 적어도 하나를 포함하는 제2 제약 조성물과 함께 투여될 수 있다: MCIDAS 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드, GemC1 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드, FoxJ1 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드, 및/또는 E2f4VP16 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드.

두 제약 조성물, 즉 MCIDAS, GemC1, FoxJ1, 및/또는 E2f4VP16 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드를 추가로 포함하는 상기 정의된 바와 같은 제1 제약 조성물 또는 MCIDAS, GemC1, FoxJ1, 및/또는 E2f4VP16 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 제약 조성물과 함께 투여되는 제1 제약 조성물은, 세포가 섬모발생을 개시하기 전 또는 세포가 섬모발생하는 동안에 제약 조성물이 세포에 투여될 때, 본 발명에 따른 제약 조성물의 투여가 섬모 세포 구조 및 기능을 회복시키는데 특히 유효하기 때문에 유리하다. 추가로, 둘 다는 바람직하게는, 비강 스프레이 및/또는 네뷸라이저를 사용함으로써 및/또는 흡입에 의해, 바람직하게는 1주에 적어도 1회 및/또는 적어도 4주 동안 환자에게 투여된다.

상기 언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 제약 조성물이 2개 이상, 바람직하게는 2개의 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 상기 실시양태에 대해 기재된 바와 동일하게 적용된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 실시양태에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 멀티시스트론성 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다.

제약 조성물은 폴리리보뉴클레오티드로 세포의 형질감염을 촉진시키는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 화합물의 예는 WO 2014/20723에 개시된 것들이다.

제약 조성물은 표적 세포 또는 표적 조직 내로 RNA를 전달 및/또는 도입하기 위한 하나 이상의 작용제(들) 또는 하나 이상의 시약(들)을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 이러한/이들 작용제(들) 또는 시약(들)은 RNA를 세포 또는 조직으로 전달 및/또는 도입하는 것을 지지하는 것으로 예상된다. 이러한/이들 작용제(들) 또는 시약(들)은 RNA와 함께 투여될 수 있다. 전달/도입될 RNA는 또한 이러한/이들 작용제(들) 또는 시약(들)과 커플링되거나 (예를 들어 그에 공유 결합되거나 또는 그와 복합체화됨) 또는 커플링 해제될 수 있다 (예를 들어 단지 혼합됨). 각각의 작용제 또는 시약은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어 문헌 [Tavernier, J Control Release 150(3) (2011), 238-47]), 예를 들어, 특히 지질 및 리포솜, 미셀, 중합체 및 덴드리머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 각각의 작용제 또는 시약의 특정한 예는 GL67, EDMPC, DOTAP (1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판), DODAP (1,2-디올레일-3-디메틸암모늄 프로판), DOTMA (1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판), XTC (2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란) 및 MC3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트), ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라히드로-3aH-시클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민)), NC98-5 (4,7,13-트리스(3-옥소-3-(운데실아미노)프로필)-N1,N16-디운데실-4,7,10,13-테트라아자헥사데칸-1,16-디아미드), C12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DSDMA", 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DODMA", 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DLinDMA", 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DLenDMA", N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 또는 "DODAC", N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 또는 "DDAB", N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시 에틸 암모늄 브로마이드 또는 "DMRIE", 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디에녹시)프로판 또는 "CLinDMA", 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸-1-(시스,시스-9',1-2'-옥타데카디에녹시)프로판 또는 "CpLinDMA", N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민 또는 "DMOBA", 1,2-N,N'-디올레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DOcarbDAP", 2,3-디리놀레오일옥시-N,N-디메틸프로필아민 또는 "DLinDAP", 1,2-N,N'-디리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DLincarbDAP", 1,2-디리놀레오일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DLinCDAP", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 또는 "DLin-K-DMA", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란 또는 "DLin-K-XTC2-DMA" 또는 그의 혼합물이다 (Heyes, J Controlled Release 107 (2005), 276-287; Morrissey, Nat. Biotechnol. 23(8) (2005), 1003-1007; WO2005/121348). 추가 예는 DC-Chol (N,N-디메틸-N-에틸카르복스아미도콜레스테롤), 1,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진이다 (Gao, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179 (1991), 280; Wolf, et al. BioTechniques 23 (1997), 139; 미국 특허 번호 5,744,335). 추가 예는 LIPOFECTIN (DOTMA:DOPE) [인비트로젠(Invitrogen; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)], LIPOFECTAMINE (DOSPA:DOPE) (인비트로젠), LIPOFECTAMINE2000. (인비트로젠), FUGENE, TRANSFECTAM (DOGS), 및 EFFECTENE이다. 추가 예는 변형된 및 비변형된 폴리아크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리락티드, 폴리락티드-폴리글리콜리드 공중합체, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 알기네이트, 콜라겐, 키토산, 시클로덱스트린, 폴리리신, 폴리아르기닌, 올리고/폴리아민 및 폴리에틸렌이민이다.

작용제 또는 시약은 올리고머, 중합체 또는 리피도이드일 수 있다. 이들은, 예를 들어 PCT/EP2014/063756에 기재된 바와 같은 특징적인 올리고(알킬렌 아민) 모이어티와 같은 올리고(알킬렌 아민) 모이어티를 포함할 수 있다. 특히, 작용제 또는 시약은 PCT/EP2014/063756에 기재된 바와 같은 올리고머, 중합체 또는 리피도이드일 수 있다. 이러한 특정한 작용제 또는 시약의 주요 특징 중 하나는 하기 화학식 (I)의 공통 구조적 실체를 함유한다는 것이다:

이러한 작용제 또는 시약은 하기로부터 선택된 올리고(알킬렌 아민)일 수 있다 (이를 포함하는 성분일 수 있음):

a) 측쇄로서 및/또는 말단 기로서 복수 개의 화학식 (II)의 기를 포함하는 올리고머 또는 중합체:

여기서 변수 a, b, p, m, n 및 R² 내지 R⁶은 복수 개의 이러한 기에서 화학식 (II)의 각각의 기에 대해 독립적으로 하기와 같이 정의되며:

a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,

p는 1 또는 2이고,

m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥ 2이고;

R² 내지 R⁵는 서로 독립적으로, 수소; 기 -CH₂-CH(OH)-R⁷, -CH(R⁷)-CH₂-OH, -CH₂-CH₂-(C=O)-O-R⁷, -CH₂-CH₂-(C=O)-NH-R⁷ 또는 -CH₂-R⁷로부터 선택되고, 여기서 R⁷은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐; 아미노 기에 대한 보호 기; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;

R⁶은 수소; 기 -CH₂-CH(OH)-R⁷, -CH(R⁷)-CH₂-OH, -CH₂-CH₂-(C=O)-O-R⁷, -CH₂-CH₂-(C=O)-NH-R⁷ 또는 -CH₂-R⁷로부터 선택되고, 여기서 R⁷은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐; 아미노 기에 대한 보호 기; -C(NH)-NH₂; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되고;

여기서 화학식 (II)에 표시된 질소 원자 중 하나 이상은 양성자화되어 화학식 (II)의 양이온성 기를 제공할 수 있고;

b) 반복 단위로서 복수 개의 화학식 (III)의 기를 포함하는 올리고머 또는 중합체:

여기서 변수 a, b, p, m, n 및 R² 내지 R⁵은 복수 개의 이러한 기에서 화학식 (III)의 각각의 기에 대해 독립적으로 하기와 같이 정의되며:

a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,

p는 1 또는 2이고,

m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥ 2이고;

R² 내지 R⁵는 서로 독립적으로, 수소; 기 -CH₂-CH(OH)-R⁷, -CH(R⁷)-CH₂-OH, -CH₂-CH₂-(C=O)-O-R⁷ 또는 -CH₂-CH₂-(C=O)-NH-R⁷ 또는 -CH₂-R⁷로부터 선택되고, 여기서 R⁷은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐; 아미노 기에 대한 보호 기; -C(NH)-NH₂; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;

여기서 화학식 (III)에 표시된 질소 원자 중 하나 이상은 양성자화되어 화학식 (III)의 양이온성 기를 제공할 수 있고;

c) 화학식 (IV)의 구조를 갖는 리피도이드:

여기서 변수 a, b, p, m, n 및 R¹ 내지 R⁶은 하기와 같이 정의되며:

a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,

p는 1 또는 2이고,

m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥ 2이고;

R¹ 내지 R⁶은 서로 독립적으로, 수소; 기 -CH₂-CH(OH)-R⁷, -CH(R⁷)-CH₂-OH, -CH₂-CH₂-(C=O)-O-R⁷, -CH₂-CH₂-(C=O)-NH-R⁷ 또는 -CH₂-R⁷로부터 선택되고, 여기서 R⁷은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐; 아미노 기에 대한 보호 기; -C(NH)-NH₂; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되며; 단, R¹ 내지 R⁶ 중 적어도 2개의 잔사는 기 -CH₂-CH(OH)-R⁷, -CH(R⁷)-CH₂-OH, -CH₂-CH₂-(C=O)-O-R⁷, -CH₂-CH₂-(C=O)-NH-R⁷ 또는 -CH₂-R⁷이고, 여기서 R⁷은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택되고;

여기서 화학식 (IV)에 표시된 질소 원자 중 하나 이상은 양성자화되어 화학식 (IV)의 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.

바람직하게는, 이러한 작용제 또는 시약은 a) 및 b)로부터 선택된 올리고(알킬렌 아민)일 수 있으며 (이를 포함하는 성분일 수 있음), 여기서

a) 측쇄로서 및/또는 말단 기로서 복수 개의 화학식 (IIa)의 기를 포함하는 올리고머 또는 중합체:

-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR₃-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶ (IIa)

여기서 a, b, m, n 및 R² 내지 R⁶은 상기 기재된 바와 같이 정의되고, 화학식 (IIa)에 표시된 질소 원자 중 하나 이상은 양성자화되어 양이온성 올리고머 또는 중합체 구조를 제공할 수 있으며;

b) 반복 단위로서 복수 개의 화학식 (IIIa)의 기를 포함하는 올리고머 또는 중합체:

-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n- (IIIa)

여기서 a, b, m, n 및 R² 내지 R⁵는 상기 기재된 바와 같이 정의되고, 화학식 (IIIa)에 표시된 질소 원자 중 하나 이상은 양성자화되어 양이온성 올리고머 또는 중합체 구조를 제공할 수 있다.

더욱이, 이러한 작용제 또는 시약은 화학식 (IVa)의 구조를 갖는 리피도이드로부터 선택된 올리고(알킬렌 아민)일 수 있다 (이를 포함하는 성분일 수 있음):

R¹-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶ (IVa)

여기서 a, b, m, n 및 R¹ 내지 R⁶은 상기 기재된 바와 같이 정의되고, 화학식 (IVa)에 표시된 질소 원자 중 하나 이상은 양성자화되어 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.

이러한 작용제 또는 시약에 관하여, 화학식 (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) 또는 (IVa)에서 n은 1일 수 있거나; 또는 m은 1일 수 있고 n은 1일 수 있다.

추가로, 이러한 작용제 또는 시약에 관하여, 화학식 (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) 또는 (IVa)에서 a는 1일 수 있고 b는 2일 수 있거나; 또는 a는 2일 수 있고 b는 1일 수 있다.

일부 실시양태에서, 올리고머, 중합체 또는 리피도이드는 양이온성 (예를 들어 양성자화된) 올리고머, 중합체 또는 리피도이드일 수 있다.

이용될 이러한 올리고머, 중합체 또는 리피도이드의 한 비제한적인 예는 100 mg N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (0.623 mmol)과 575.07 mg 1,2-에폭시도데칸 (3.12 mmol, (N-1) 당량, 여기서 N은 올리고(알킬렌 아민)당 2x 양의 1급 아민 플러스 1x 양의 2급 아민임)을 혼합함으로써 제조되고 일정한 진탕 하에 80℃에서 96시간 동안 혼합된 양이온성 지질이다. 이러한 올리고머, 중합체 또는 리피도이드는 리피도이드 "C12-(2-3-2)"로서 지칭되기도 한다.

이용될 작용제 또는 시약, 특히 중합체는 공중합체, 특히 통계적 공중합체일 수 있다. 이러한 공중합체는 교대 길이의 알킬렌 아민 반복 단위의 통계적/랜덤 배열을 함유하는 공중합체일 수 있다 (예를 들어, 비-교대 길이의 알킬렌 아민 반복 단위의 유사한 배열을 함유하는 덜 바람직한 중합체와 대조적임). 공중합체는 양이온성 (예를 들어, 양성자화된) 공중합체일 수 있다. 이용될 공중합체는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 EP 14 19 9439.2, WO 01/00708, EP-A1 1 198 489 및 CA-A1 2,377,207에 기재되어 있다.

특히, 공중합체는 하기 화학식 (a1) 및 (a2)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수 개의 반복 단위 (a):

하기 화학식 (b1) 내지 (b4)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수 개의 반복 단위 (b):

를 포함하는 통계적 공중합체일 수 있으며,

여기서 반복 단위 (a)의 합 대 반복 단위 (b)의 합의 몰 비는 0.7/1.0 내지 1.0/0.7의 범위 내에 있고,

여기서 공중합체에 함유된 반복 단위 (a) 및/또는 (b)의 질소 원자 중 하나 이상이 양성자화되어 양이온성 공중합체를 제공할 수 있다.

공중합체는 임의의 반복 단위 (a) 및 임의의 반복 단위 (b)가 공중합체 거대분자에 통계적으로 분포되는 통계적 공중합체일 수 있다. 이는 전형적으로 중합 반응 동안 반복 단위 (a)를 생성하는 단량체와 중합 반응 동안 반복 단위 (b)를 생성하는 단량체의 혼합물의 공중합으로부터 수득된다. 바람직하게는, 공중합체는 임의의 반복 단위 (a) 및 임의의 반복 단위 (b)가 중합체 거대분자에 랜덤하게 분포되는 랜덤 공중합체이다.

이러한 공중합체는 선형, 분지형 또는 수지상 공중합체일 수 있다. 숙련된 독자에 의해 이해되는 바와 같이, 2 원자가 (즉, 이웃 단위에 대한 개방 결합)를 갖는 화학식 (a1), (b1) 또는 (b3)의 반복 단위는 선형 방식으로 공중합체 구조의 전파를 초래한다. 따라서, 선형 공중합체는 화학식 (a1)의 반복 단위 및 화학식 (b1) 및 (b3)의 하나 이상의 유형의 반복 단위를 포함할 수 있지만, 화학식 (a2), (b2) 또는 (b4)의 반복 단위는 포함하지 않는다. 추가로 이해되는 바와 같이, 3 원자가를 갖는 화학식 (a2), (b2) 또는 (b4)의 반복 단위의 존재는 공중합체 구조에 분기점을 제공한다. 따라서, 분지형 공중합체는 화학식 (a2), (b2) 및 (b4)의 하나 이상의 유형의 반복 단위를 포함하고, 화학식 (a1), (b1) 및 (b3)의 하나 이상의 유형의 반복 단위를 추가로 포함할 수 있다.

이러한 공중합체는 상기 정의된 화학식 (a1) 및 (a2)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수 개의 반복 단위 (a), 및 상기 정의된 화학식 (b1) 내지 (b4)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수 개의 반복 단위 (b)를 포함할 수 있다. 상기 정의된 화학식 (a1) 및 (a2)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수 개의 반복 단위 (a), 및 상기 정의된 화학식 (b1) 및 (b2)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수 개의 반복 단위 (b)를 포함하는 공중합체가 바람직하다.

바람직하게는, 이러한 공중합체는 반복 단위 (a2), (b2) 및 (b4)로부터 선택된 하나 이상의 유형의 반복 단위를 포함하고, 임의로 화학식 (a1), (b1) 및 (b3)의 하나 이상의 유형의 반복 단위를 추가로 포함하는 분지형 공중합체이고, 특히 화학식 (a2)의 반복 단위 및 화학식 (b2) 및 (b4)의 하나 이상의 유형의 반복 단위를 포함하고, 임의로 화학식 (a1), (b1) 및 (b3)의 하나 이상의 유형의 반복 단위를 추가로 포함하는 공중합체이다. 상기와 일치하여, 보다 바람직한 공중합체는 따라서 화학식 (a2)의 반복 단위 및 화학식 (b2)의 반복 단위를 포함하고, 임의로 화학식 (a1) 및 (b1)의 하나 이상의 유형의 반복 단위를 추가로 포함하는 분지형 공중합체이다.

공중합체에서, 반복 단위 (a)와 반복 단위 (b)의 총 수는 전형적으로 20 이상, 바람직하게는 50 이상, 보다 바람직하게는 100 이상이다. 전형적으로, 반복 단위 (a)와 반복 단위 (b)의 총 수는 10,000 이하, 바람직하게는 5,000 이하, 보다 바람직하게는 1,000 이하이다.

더욱이, 반복 단위 (a) 및 (b)가 공중합체 내의 모든 반복 단위의 80 mol% 이상, 보다 바람직하게는 90 mol% 이상을 차지하는 공중합체가 바람직하다. (a1) 및 (a2)로부터 선택된 반복 단위 (a) 및 (b1) 및 (b2)로부터 선택된 반복 단위 (b)가 공중합체 내의 모든 반복 단위의 80 mol% 이상, 보다 바람직하게는 90 mol% 이상을 차지하는 공중합체가 추가로 바람직하다. 공중합체 내의 모든 반복 단위가 반복 단위 (a) 또는 (b)인 것, 특히 공중합체 내의 모든 반복 단위가 (a1) 및 (a2)로부터 선택된 반복 단위 (a) 또는 (b1) 및 (b2)로부터 선택된 반복 단위 (b)인 것이 가장 바람직하다.

선형 폴리(에틸렌 옥시드) 표준에 비해, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피를 통해 측정된 바와 같은 공중합체의 중량 평균 분자량은 일반적으로 1,000 내지 500,000 Da, 바람직하게는 2,500 내지 250,000 Da, 보다 바람직하게는 5,000 내지 50,000 Da 이하의 범위이다.

이러한 공중합체의 말단 기는 전형적으로 하기 화학식 (c1) 내지 (c3)의 기, 바람직하게는 하기 화학식 (c1) 및 (c2)의 기로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 유형의 기 (c)를 포함한다:

바람직하게는, 공중합체 내의 말단 기는 하기 화학식 (c1) 내지 (c3)의 기, 바람직하게는 화학식 (c1) 및 (c2)의 기로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 유형의 기 (c)로 이루어진다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 말단 기의 수는 공중합체의 구조에 의존한다. 선형 공중합체는 단지 2개을 말단을 갖는 반면, 분지형, 특히 수지상 공중합체에는 더 많은 수의 말단 기가 함유되어 있다. 추가로 이해되는 바와 같이, 공중합체에 함유된 말단 기 (c)의 질소 원자 중 하나 이상이 또한 양성자화되어 양이온성 공중합체를 제공할 수 있다.

공중합체에서, 반복 단위 (a)의 합 대 반복 단위 (b)의 합의 몰 비는 0.7/1.0 내지 1.0/0.7의 범위 내이고, 바람직하게는 0.8/1.0 내지 1.0/0.8의 범위 내이다. 이러한 몰 비는, 예를 들어 NMR을 통해 결정될 수 있다. 따라서, 상기 비율은 통상적으로 공중합체의 복수 개의 거대분자에 대해 결정되고, 전형적으로 복수 개의 거대분자에서 반복 단위 (a)의 합 대 반복 단위 (b)의 합의 전체 비율을 나타내는 것으로 이해될 것이다.

상기 나타낸 바와 같이, 공중합체의 질소 원자 중 하나 이상이 양성자화되어 공중합체를 양이온성 형태, 전형적으로 올리고양이온성 또는 다가양이온성 형태로 생성할 수 있다. 반복 단위 (a) 또는 (b) 또는 말단 기 (c)에서의 1급, 2급 또는 3급 아미노 기는 특히 생리학적 유체를 포함한 물 및 수용액에서 양성자 수용체로서 작용할 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 이러한 공중합체는 전형적으로 pH 7.5 미만의 수용액에서 전체 양전하를 갖는다. 본원에 지칭된 바와 같은 수용액은 용매가 50% (vol./vol.) 이상, 바람직하게는 80 또는 90% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 물을 포함하는 용액이다. 또한, 조성물이 예를 들어 혈액 및 폐 유체 포함하여, pH가 7.5 미만인 생리학적 유체와 접촉하는 경우, 이는 전형적으로 질소 원자가 양성자화된 반복 단위 (a) 및 (b)를 함유한다. 조성물에 사용된 공중합체의 pK_a 값은 자동화된 pK_a 적정기를 사용하여 산-염기 적정에 의해 결정될 수 있다. 이어서, 주어진 pH 값에서의 순전하는, 예를 들어 헨더슨-하셀바흐(Henderson-Hasselbach) 방정식으로부터 계산될 수 있다. 임의의 전하는 여러 기본 중심 전체에 걸쳐 공유될 수 있으며 반드시 단일 지점에 귀속될 수는 없다. 전형적으로, 생리학적 pH의 용액에서, 조성물에 사용되는 공중합체는 양성자화된 상태의 아미노 기를 갖는 반복 단위 및 비양성자화된 상태의 아미노 기를 갖는 반복 단위를 포함한다.

그러나, 숙련된 독자에 의해 이해되는 바와 같이, 공중합체 뿐만 아니라 조성물은 또한 양이온성 형태로 공중합체를 함유하는 건조 염 형태로서 제공될 수 있다.

추가로 이해되는 바와 같이, 공중합체 및 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 단일 가닥 RNA 예컨대 mRNA를 포함하는 조성물에서 양성자화된 아미노 기의 양전하에 대한 반대이온 (음이온)은 전형적으로 핵산에 함유된 음이온성 모이어티에 의해 제공된다. 양전하를 띤 기가 핵산에서의 음이온성 모이어티와 비교하여 과량으로 존재하는 경우, 양전하는 다른 음이온, 특히 생리학적 유체에서 전형적으로 만나는 음이온, 예컨대 Cl^- 또는 HCO₃ ^-에 의해 균형을 이룰 수 있다.

상기와 일치하여, 바람직한 공중합체는 랜덤 공중합체이며, 여기서

모든 반복 단위의 80 mol% 이상, 보다 바람직하게는 모든 반복 단위는 하기에 의해 형성되며:

하기 화학식 (a1) 및 (a2)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수 개의 반복 단위 (a):

하기 화학식 (b1) 및 (b2)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수 개의 반복 단위 (b):

여기서 반복 단위 (a)의 합 대 반복 단위 (b)의 합의 몰 비는 0.7/1.0 내지 1.0/0.7의 범위 내이고, 보다 바람직하게는 0.8/1.0 내지 1.0/0.8의 범위 내이고;

여기서 공중합체의 말단 기는 하기에 의해 형성되고:

화학식 (c1) 및 (c2)의 기로부터 독립적으로 선택된 기 (c):

여기서 공중합체에 함유된 반복 단위 (a) 및/또는 (b) 및/또는 말단 기 (c)의 질소 원자 중 하나 이상이 양성자화되어 양이온성 공중합체를 제공할 수 있다. 공중합체가, 단위 (a2) 및 (b2)를, 임의로 단위 (a1) 및/또는 (b1)과 함께 포함하는 분지형 공중합체인 것이 추가로 바람직하다.

공중합체는 폴리알킬렌이민, 예컨대 분지형 또는 선형 폴리에틸렌이민 (PEI)의 제조에 대해 공지된 것과 유사한 절차로 편리하게 제조될 수 있다. 공중합체의 생산에 사용되는 단량체는 그에 따라 조정되어야 함을 이해할 것이다. 본원에서, 단량체는 정량적 방식으로 편리하게 반응할 수 있고, 이에 따라 공중합체에서의 단위 (a) 및 (b)의 비율은 중합시킨 단량체 혼합물에서 그에 따라 단량체 비율을 조정함으로써 조정될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 폴리에틸렌이민은 예를 들어 아지리딘의 개환 중합을 통해 제조될 수 있지만, 공중합체는 아지리딘, 아제티딘 및 적용가능한 경우 피롤리딘, 또는 바람직한 실시양태에서 아지리딘 및 아제티딘을 포함하거나 이로 이루어진 단량체 혼합물의 개환 중합을 통해 제조될 수 있다. "적용가능한 경우"라는 표현은 피롤리딘에 의해 형성될 반복 단위 (b3) 및 (b4) 또는 말단 기 (c3)의 존재 또는 부재를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 비-치환된 시클릭 아민의 개환 중합은 통상적으로 분지형 공중합체를 생성한다. 선형 공중합체는, 예를 들어, 적합한 N-치환된 아지리딘, N-치환된 아제티딘 및 N-치환된 피롤리딘, 또는 N-치환된 아지리딘 및 N-치환된 아제티딘의 중합을 통해 제조될 수 있으며, 이어서 예를 들어, 문헌 [Katrien F. Weyts, Eric J. Goethals, New synthesis of linear polyethyleneimine, Polymer Bulletin, 1988, 19(1):13-19]에 공개된 절차와 유사하게, 예를 들어 그 결과로 생성된 폴리알킬렌이민 쇄에 부착된 N-치환기의 가수분해 절단이 수행될 수 있다. 덴드리머는, 예를 들어 문헌 [Yemul et al., Colloid and Polymer Science, 2008, 286(6-7):747-752, Synthesis and characterization of poly(ethylenimine) denrimers]에 기재된 방법에 따라 합성될 수 있다.

덴드리머 (또는 수지상 공중합체)의 제조를 위해, 폴리에틸렌이민 또는 폴리프로필렌아민 덴드리머의 생산에 대해 공지된 합성 전략이 유사하게 적용될 수 있다. 폴리프로필렌이민 덴드리머는 1급 아민에 대한 마이클 부가에 이은 불균일하게 촉매된 수소화의 순서를 반복적으로 사용하여 아크릴로니트릴 빌딩 블록으로부터 합성될 수 있다 (Newkome and Shreiner Poly(amidoamine), polypropylenimine, and related dendrimers and dendrons possessing different 1→2 branching motifs: An overview of the divergent procedures. Polymer 49 (2008) 1-173; De Brabander-Van Den Berg et al. Large-scale production of polypropylenimine dendrimers, Macromolecular Symposia (1994) 77 (1) 51-62). 폴리에틸렌이민 덴드리머는 1급 아민에 비닐 브로마이드 빌딩 블록을 마이클 부가한 다음 가브리엘 아민 합성 방법을 사용하여 알킬브로마이드를 아민으로 전환시키는 순서를 반복적으로 사용하여 생산될 수 있다 (Yemul & Imae, Synthesis and characterization of poly(ethyleneimine) dendrimers, Colloid Polym Sci (2008) 286:747-752). 따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 엄격하게 교대하는 덴드리머를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 예를 들어 프로필렌이민 및 에틸렌이민의 층을 생산할 수 있다. 유사하게, 화학식 (a2), (b2) 및 (b4)의 반복 단위, 바람직하게는 반복 단위 (a2) 및 (b2)의 랜덤 조성을 포함하거나 이로 이루어진 층을 갖는 덴드리머가 생성될 수 있다.

아지리딘 및 아제티딘, 또는 아지리딘, 아제티딘 및 피롤리딘의 개환 중합은 용액, 예를 들어 물에서 수행될 수 있다. 총 단량체 농도는 특별히 제한되지 않으며, 전형적인 농도는 10% wt/wt 내지 80% wt/wt, 바람직하게는 30% wt/wt 내지 60% wt/wt 범위이다. 전형적으로, 중합은 양성자에 의해 개시되어, 브뢴스테드 산, 특히 무기 산 예컨대 황산을 반응 시스템에 부가하는 것이 바람직하다. 단량체의 총 농도를 기준으로 소량, 예컨대 0.001 내지 0.01 당량의 산이 일반적으로 충분하다. 반응은 예를 들어 50 내지 150℃, 특히 90 내지 140℃의 온도 범위에서 편리한 속도로 진행된다. 이러한 범위에서, 고분자량 공중합체는 통상적으로 더 높은 온도 하에 있고, 저분자량 공중합체는 더 낮은 온도 하에 있다.

원칙적으로, 리피도이드는 특히 올리고머, 보다 특히 중합체와 비교 시, 바람직한 작용제 또는 시약으로 이용된다.

RNA를 표적 세포 또는 표적 조직으로 전달 및/또는 도입하기 위한 하나 이상의 작용제(들) 또는 하나 이상의 시약(들)의 추가 예는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 리포솜 형질감염 시약 (LTR) 및 자성 입자 (MP)이다.

RNA를 표적 세포 또는 표적 조직으로 전달 및/또는 도입하기 위한 한 가지 특정한 방식은 형질감염이다. 따라서, 이용될 RNA는 ((표적) 세포 또는 조직 내로) 형질감염되고, 형질감염을 통해 전달/투여되는 것으로 및/또는 형질감염을 위해 준비되는 것으로 구상될 수 있다. RNA를 형질감염시키는 수단 및 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Tavernier (상기 참조); Yamamoto (Eur J Pharm Biopharm. 71(3) (2009), 484-9) 및 Kormann (Nat Biotechnol. 29(2) (2011), 154-7)]에 기재되어 있다. 형질감염의 특정한 방식은 리포펙션,마그네토펙션 또는 마그네토리포펙션이다.

따라서, 이용될 RNA는 리포펙션을 위해 준비될 수 있고, 리포펙션에 의해 형질감염되도록 준비될 수 있고, 리포펙션을 통해 전달/도입될 수 있고/거나 리포펙션을 통해 투여될 수 있다.

따라서, 제약 조성물은 적어도 하나의 지질 또는 리포솜 형질감염 시약 또는 인핸서 (LTR; 리포좀 형질감염 시약)를 (추가로) 포함할 수 있다. 이용될 RNA는 LTR에 포함되고/거나, 그와 복합체화되고/거나 그에 의해 전달될 수 있다. 특히, 이용될 RNA는 RNA 및 LTR을 포함하는 (각각의) 리포펙션 복합체에 포함되고/거나 이러한 복합체에 의해 전달될 수 있다. 제약 조성물은 리포펙션 복합체를 (추가로) 포함할 수 있다.

LTR은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 오즈바이오사이언시스 (OzBiosciences; 프랑스 마르세유)에 의해 유통된다. 이용될 LTR은 RNA를 표적 세포 또는 표적 조직으로 전달 및/또는 도입하기 위한 상기 기재된 작용제 또는 시약으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 이러한 LTR은 지질 또는 리피도이드, 바람직하게는 양이온성 지질 또는 양이온성 리피도이드, 예를 들어 PCT/EP2014/063756에 개시된 바와 같은 리피도이드 (예를 들어 C12-(2-3-2)), EP2285772에 개시된 바와 같은 지질 [예를 들어 도그토르(Dogtor)] 및 EP1003711에 개시된 바와 같은 리포폴리아민 (예를 들어, 드림펙트(DreamFect)™ 및 드림펙트 골드(DreamFect Gold)™)일 수 있다. 특정한 LTR은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:

(i) C12-(2-3-2);

(ii) 드림펙트™, 바람직하게는 드림펙트 골드™ (DF™/DF-골드™; 오즈바이오사이언시스, 프랑스 마르세유);

(iii) 도그토르 (오즈바이오사이언시스, 프랑스 마르세유); 및

(iv) 리포펙타민, 예를 들어, 리포펙타민 2000 (인비트로젠; 미국 캘리포니아주).

원칙적으로 도그토르가 바람직하고, 드림펙트™이 보다 바람직하며 DF-골드™ 및 C12-(2-3-2)가 보다 더 바람직한 LTR이다.

도그토르와 같은 LTR은, 예를 들어, EP2285772에 기재되어 있다. DF™ 또는 DF-골드™와 같은 LTR은, 예를 들어, EP1003711에 기재되어 있다. 원칙적으로, PCT/EP2014/063756에 개시된 바와 같은 올리고머, 중합체 또는 리피도이드, EP2285772에 개시된 바와 같은 특정한 양이온성 지질 및 EP1003711에 개시된 바와 같은 특정한 리포폴리아민이 바람직한 LTR이다. C12-(2-3-2) 및 DF-골드™와 같은 LTR이 가장 바람직하다.

리포펙션 복합체의 비제한적인 예는 DF-골드™/RNA 리포플렉스 및 C12-(2-3-2)/RNA 리포플렉스이다.

C12-(2-3-2)는 화학식 (V)에 제시된 구조를 갖는 특히 바람직한 LTR이다 (문헌 [Jarzebinska et al., Angew Chem Int Ed Engl., 2016; 55(33):9591-5] 참조):

C12-(2-3-2)는 바람직하게는, 예를 들어 WO 2016/075154 A1, EP 3013964, 및 문헌 [Jarzebinska et al. (Angew Chem Int Ed Engl., 2016;55(33):9591-5)]에 기재된 바와 같이 제조된다. 양이온성 리피도이드는 N1-(2-아미노에틸)-N3-(2-((3,4-디메톡시벤질)아미노)에틸)프로판-1,3-디아민 (8.9 g, 1 당량, 28.67 mmol)을 1,2-에폭시도데칸 (42.27, 8 당량, 229.4 mmol)과 24시간 동안 80℃에서 일정한 진탕 하에 혼합한 후 정제하고 3,4-디메톡시벤질 보호기를 제거함으로써 제조될 수 있다.

C12-(2-3-2)의 상이한 이성질체, 예컨대 라세미체, S-이성질체 및/또는 R-이성질체가 사용될 수 있다. 바람직하게는, C12-(2-3-2)는 순수한 R-이성질체로서 사용되며 화학식 (VI)에 제시된 구조를 갖는다. C12-(2-3-2)의 순수한 R-이성질체를 수득하기 위하여, 합성을 위해 1,2-에폭시도데칸의 R-이성질체를 사용하여 C12-(2-3-2)에 대해 상기 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

따라서, 바람직한 실시양태에서 제약 조성물은 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고, 화학식 (V)에 제시된, 바람직하게는 화학식 (VI)에 제시된 바와 같은 구조를 갖는 리피도이드를 추가로 포함한다.

추가로 특히 바람직한 LTR은 촉매로서 붕산을 사용하는 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민과 N-도데실아크릴아미드의 반응을 통해 합성될 수 있는, 본원에서 "dL_P"로서 지칭되기도 하는 화학식 (VII)를 갖는 양이온성 리피도이드이다. 상기 반응을 위해, 혼합물을 마이크로파 조사 하에 100℃에서 교반할 수 있다.

따라서, 추가의 바람직한 실시양태에서 제약 조성물은 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 화학식 (VII)에 제시된 구조를 갖는 리피도이드를 추가로 포함한다.

더욱이, 제약 조성물은 하기에 기재된 바와 같은 제형에 포함된, 화학식 (V), (VI) 및/또는 (VII)을 갖는 양이온성 리피도이드, 바람직하게는 dL_P 및/또는 C12-(2-3-2), 보다 바람직하게는 dL_P 및/또는 C12-(2-3-2)의 R-이성질체를 포함한다. 특히, RNA를 표적 세포 또는 표적 조직으로 전달 및/또는 도입하기 위한 본원에 기재된 작용제 및 시약, 및 본원에 기재된 LTR은 하나 이상 (예를 들어, 2개, 3개 또는 4개)의 추가 지질(들) (예를 들어, 콜레스테롤, DPPC, DOPE 및/또는 PEG-지질 (예를 들어 DMPE-PEG, DMG-PEG2000))과 조합될 수 있다. 이들 추가 지질은 작용제/시약 및 LTR의 원하는 기능을 지원할 수 있고 (각각 세포 또는 조직 내로 RNA를 전달 및/또는 도입하는 것을 지원 및/또는 증가시키고 형질감염 효율을 개선시킬 수 있음), 각각의 "헬퍼 지질"로서 기능할 수 있다. 이러한 "헬퍼 지질"의 특정한 예는 콜레스테롤, DPPC, DOPE 및/또는 PEG-지질 (예를 들어 DMPE-PEG, DMG-PEG (예를 들어 DMG-PEG2000))이다. 추가 지질 (예를 들어 "헬퍼 지질")은 또한 본원에 개시된 복합체/입자의 일부(들)일 수 있다. 통상의 기술자는 본 발명에 따른 복합체/입자를 쉽게 제조할 수 있는 위치에 있다. 추가 지질 (예를 들어 "헬퍼 지질")의 예는 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 통상의 기술자는 적합한 추가 지질 (예를 들어 "헬퍼 지질") 및 작용제/시약/LTR 및 추가 지질 (예를 들어 "헬퍼 지질")의 비율을 쉽게 선택할 수 있는 위치에 있다. 이러한 비율은 작용제/시약/LTR : 추가 지질(들)의 1-4 : 1-5, 3-4 : 4-6, 약 4 : 약 5, 약 4 : 약 5.3의 몰 비일 수 있다 (보다 협소한 범위가 바람직함). 예를 들어, 작용제/시약/LTR은 각각 8 : 5.3 : 4.4 : 0.9, 또는 보다 특히, 각각 8 : 5.29 : 4.41 : 0.88의 몰 비로, 3가지 추가 지질, 예컨대 DPPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2000과 조합될 수 있다.

바람직하게는, dL_P 및/또는 C12-(2-3-2), 보다 바람직하게는 dL_P 및/또는 C12-(2-3-2)의 R-이성질체가 상기 기재된 바와 같이 생성되고, 지질 입자를 제형화하기 위한 몰 비 8 : 5.29 : 4.41 : 0.88 하에 헬퍼 지질 DPPC 및 콜레스테롤 및 PEG-지질 DMG-PEG2000와 함께 사용된다.

C12-(2-3-2)의 R-이성질체 (화학식 VI)가 몰 비 8 : 5.29 : 4.41 : 0.88 하에 지질 DPPC 및 콜레스테롤 및 PEG-지질 DMG-PEG2000과 함께 제형화되는 조성물은 또한 본원에서 "LF92"로서 지칭된다. dL_P (화학식 VII)가 몰 비 8 : 5.29 : 4.41 : 0.88 하에 지질 DPPC 및 콜레스테롤 및 PEG-지질 DMG-PEG2000과 함께 제형화되는 조성물은 또한 본원에서 "LF111"로서 지칭된다.

또한 예를 들어, WO 2016/075154 A1, EP 3013964, 및 문헌 [Zhang et al. (TERMIS, 2019, Tissue Engineering: Part A, Vol. 25, Numbers 1 and 2)]에 예시적으로 기재된 바와 같이, dL_P 및/또는 C12-(2-3-2)를 비-바이러스 벡터로서 사용하여, 리피도이드의 양성 아미노 기와 mRNA 분자의 음성 포스페이트 기 간의 정전기적 상호작용을 기반으로 하여 mRNA 분자와의 안정한 리포플렉스를 만들 수 있다 (Anderson, Human Gene Therapy 14, 2003, 191-202). 리포플렉스 구조를 안정화하고 누출을 감소시키기 위해, dL_P 및/또는 C12-(2-3-2), 보다 바람직하게는 dL_P 및/또는 C12-(2-3-2)의 R-이성질체에 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC) 및 콜레스테롤이라는 2가지 헬퍼 지질이 공급될 수 있다 (Anderson, Drug Delivery 11, 2004, 33-39; Liang, Journal of Colliod and Interface Science 278, 2004, 53-62). 마지막으로, 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DMG-PEG) 2 kD (DMG-PEG2000)를 지질 혼합물에 부가하여 PEG화된 리포솜을 제공한다. PEG화가 수 용해도를 증가시키고, 효소적 분해로부터 보호하며, 면역원성 및 항원성 반응을 제한함으로써 리포솜 제형의 물리 화학적 특징을 개선시킨다는 것은 이미 널리 공지되어 있다 (Milla, Current Drug Metabolism 13, 2012, 105-119). 전체 에탄올성 지질 혼합물에 대한 최종 N/P 비는 dL_P 및/또는 C12-(2-3-2)/DPPC/콜레스테롤/DMG-PEG2000 각각의 아미노 기 대 mRNA 분자의 하나의 포스페이트 기의 몰 비를 나타내는 8 : 5.29 : 4.41 : 0.88이어야 한다.

따라서, 바람직한 실시양태에서 제약 조성물은 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고; DPPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2000과 함께 제형화되는, dL_P 및/또는 C12-(2-3-2), 바람직하게는 dL_P 및/또는 C12-(2-3-2)의 R-이성질체를 추가로 포함한다.

더욱이, 특히 바람직한 실시양태에서 제약 조성물은 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고; dL_P 및/또는 C12-(2-3-2)/DPPC/콜레스테롤/DMG-PEG2000 각각의 아미노 기 대 mRNA 분자의 하나의 포스페이트 기의 몰 비에 대해 8 : 5.29 : 4.41 : 0.88의 전체 에탄올성 지질 혼합물에 대한 최종 N/P 비로 DPPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2000과 함께 제형화되는, dL_P 및/또는 C12-(2-3-2), 바람직하게는 dL_P 및/또는 C12-(2-3-2)의 R-이성질체를 추가로 포함한다.

상기 언급된 바와 같이 DPPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2000과 함께 제형화된 C12-(2-3-2)의 R-이성질체는 또한 LF92 제형으로서 지칭된다.

따라서, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 제약 조성물은 LF92 제형을 추가로 포함한다.

상기 언급된 바와 같이 DPPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2000과 함께 제형화된 dL_P는 또한 LF111 제형으로서 지칭된다.

따라서, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 제약 조성물은 LF111 제형을 추가로 포함한다.

섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 바람직한 실시양태에서, 상기 제약 조성물은 LF92 및/또는 LF111 제형을 추가로 포함한다. LF92 및/또는 LF111은 세포 형질감염에 사용되는 담체 제형을 지칭한다. 이것은 LF92 및/또는 LF111의 사용이 높은 형질감염 효율과 연관되어 있고, 따라서 섬모병증과 연관된 결함을 갖는 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드가 세포, 바람직하게는 미분화된 섬모 세포 또는 기저 세포에 효율적으로 유입될 수 있도록 보장하며, 따라서 PCD를 앓고 있는 대상체에서 섬모 세포 기능을 회복시키기 때문에 유리하다.

특히 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 LF92 및/또는 LF111 제형, 하기 중 적어도 하나를 포함한다: MCIDAS 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 mRNA, GemC1 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 mRNA, FoxJ1 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 mRNA, E2f4VP16 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 mRNA; 및 CCDC40 및/또는 CCDC39의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 mRNA. 바람직하게는, 이러한 조성물은 스프레이, 액적 및/또는 네뷸라이저를 사용함으로써, 및/또는 흡입에 의해, 바람직하게는 1주에 적어도 1회 및/또는 적어도 4주 동안 환자에게 투여된다.

따라서, 일부 실시양태에서, 제약 조성물이 2개 이상, 바람직하게는 2개 단백질의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 상기 실시양태에 대해 기재된 바와 동일하게 적용된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 실시양태에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 멀티시스트론성 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 또한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 섬모병증을 앓고 있는 대상체에서 섬모병증을 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리리보뉴클레오티드는 상기 섬모병증과 연관된 결함을 갖는 단백질의 기능적 버전을 코딩하고, 여기서 상기 제약 조성물은 상기 대상체의 호흡기계에 투여되고 대상체가 호흡기계의 염증을 보일 때 실시되는 것인 방법에 관한 것이다. 제약 조성물의 가능한 실시양태 및 바람직한 실시양태 및 그의 투여 방식 및 시간과 관련하여, 본 발명에 따른 제약 조성물과 연계해서 상기 본원에 제시된 바와 동일하게 적용된다.

본 발명은 또한 섬모병증과 연관된 결함을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드, 및 N-아세틸시스테인 (NAC), 나트륨 클로라이드를 포함하는 고장성 용액, 및/또는 LF92 및/또는 LF111 제형을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

제약 조성물 및 그의 성분과 관련하여, 섬모병증을 앓고 있는 대상체에서 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물과 연계해서 상기 기재된 바와 동일하게 적용된다. 더욱이, 이러한 제약 조성물의 다른 특징은 상기 기재된 바와 같을 수 있다.

따라서, 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 MCIDAS의 기능적 버전으로 번역될 수 있는 mRNA를 추가로 포함할 수 있다.

본 개시내용은 또한 서열식별번호: 1 또는 5 내지 11 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 인간 CCDC40을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 개시내용의 전술한 또는 다른 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드 또는 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 인간 CCDC40 (예를 들어, 기능적 인간 CCDC40)을 코딩하고, 서열식별번호: 1 또는 5 내지 11 중 하나 이상 (예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 5 내지 11에 제시된 서열)과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 또는 적어도 95% 동일한 (예를 들어, 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한) 1차 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 T7 프로모터의 일부, 에트리스(Ethris)의 최소 5' 비-번역된 영역 (UTR), CYBA 5' UTR, 코작 요소에 이어, 인간 CCDC40 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 코돈 최적화된 서열, CYBA 3' UTR, 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다 (예를 들어 서열식별번호: 1 참조).

특정 실시양태에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 T7 프로모터의 일부, 에트리스의 최소 5' 비-번역된 영역 (UTR), 코작 요소에 이어, 인간 CCDC40 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 코돈 최적화된 서열, 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다 (예를 들어 서열식별번호: 5 참조).

특정 실시양태에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 T7 프로모터의 일부, 에트리스의 최소 5' 비-번역된 영역 (UTR), 부가의 U 뉴클레오티드, TISU 요소에 이어, 인간 CCDC40 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 코돈 최적화된 서열, 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다 (예를 들어 서열식별번호: 6 참조).

특정 실시양태에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 T7 프로모터의 일부, 에트리스의 최소 5' 비-번역된 영역 (UTR), hAg 5' UTR, 코작 요소에 이어, 인간 CCDC40 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 코돈 최적화된 서열, 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다 (예를 들어 서열식별번호: 7 참조).

특정 실시양태에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 T7 프로모터의 일부, 에트리스의 최소 5' 비-번역된 영역 (UTR), 인간 CMV IE9 5' UTR, 코작 요소에 이어, 인간 CCDC40 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 코돈 최적화된 서열, 인간 성장 호르몬 3' UTR, 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다 (예를 들어 서열식별번호: 8 참조).

특정 실시양태에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 T7 프로모터의 일부, 에트리스의 최소 5' 비-번역된 영역 (UTR), 코작 요소, EGFP 코딩 서열, G4S 스페이서에 이어, 인간 CCDC40 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 코돈 최적화된 서열, 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다 (예를 들어 서열식별번호: 9 참조).

특정 실시양태에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 T7 프로모터의 일부, 에트리스의 최소 5' 비-번역된 영역 (UTR), 코작 요소에 이어, 인간 CCDC40 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 코돈 최적화된 서열, G4S 스페이서, EGFP 코딩 서열, 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다 (예를 들어 서열식별번호: 10 참조).

특정 실시양태에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 T7 프로모터의 일부, 에트리스의 최소 5' 비-번역된 영역 (UTR), CYBA 5' UTR, 코작 요소에 이어, HA 태그, G4S 스페이서, 인간 CCDC40 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 코돈 최적화된 서열, T2A 펩티드, tdTomato를 코딩하는 서열, CYBA 3' UTR, 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다 (예를 들어 서열식별번호: 11 참조).

일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 본원에 제시된 임의의 그러한 수준 및/또는 유형으로부터 선택된 변형의 수준 및/또는 유형을 갖는 변형된 폴리리보뉴클레오티드이다.

특정 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드의 동일성 퍼센트는 서열식별번호: 1 또는 5 내지 11의 CCDC40 코딩 서열 부분에 대해서만 측정된다 (예를 들어, UTR, 다른 비-코딩 서열 및 GFP 또는 에피토프 태그는 동일성 퍼센트를 계산할 때 고려되지 않으며, 폴리리보뉴클레오티드는 그러한 영역을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있음).

전술한 것 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 그러한 폴리리보뉴클레오티드 (또는 변형된 폴리리보뉴클레오티드)는 기능적 CCDC40 단백질을 코딩한다.

본 개시내용은 또한 서열식별번호: 2 또는 12 내지 14 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 인간 CCDC39를 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 개시내용의 전술한 또는 다른 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드 또는 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 인간 CCDC39를 코딩하고, 서열식별번호: 2 또는 12 내지 14 중 하나 이상 (예를 들어, 서열식별번호: 2 또는 12 내지 14에 제시된 서열)과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 또는 적어도 95% 동일한 (예를 들어, 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한) 1차 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 T7 프로모터의 일부, 에트리스의 최소 5' UTR, CYBA 5' UTR, 코작 요소에 이어, 인간 CCDC39 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 코돈 최적화된 서열, CYBA 3' UTR, 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다 (예를 들어 서열식별번호: 2 참조).

특정 실시양태에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 T7 프로모터의 일부, 에트리스의 최소 5' UTR, 코작 요소에 이어, 인간 CCDC39 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 코돈 최적화된 서열, 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다 (예를 들어 서열식별번호: 12 참조).

특정 실시양태에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 T7 프로모터의 일부, 에트리스의 최소 5' UTR, 부가의 U 뉴클레오티드, TISU 요소에 이어, 인간 CCDC39 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 코돈 최적화된 서열, 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다 (예를 들어 서열식별번호: 13 참조).

특정 실시양태에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 T7 프로모터의 일부, 에트리스의 최소 5' UTR, 5' UTR로서의 SP30 (즉 30개 뉴클레오티드의 랜덤 서열), 코작 요소에 이어, 인간 CCDC39 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 코돈 최적화된 서열, 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다 (예를 들어 서열식별번호: 14 참조).

일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 본원에 제시된 임의의 그러한 수준 및/또는 유형으로부터 선택된 변형의 수준 및/또는 유형을 갖는 변형된 폴리리보뉴클레오티드이다.

특정 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드의 동일성 퍼센트는 서열식별번호: 2 또는 12 내지 14의 CCDC39 코딩 서열 부분에 대해서만 측정된다 (예를 들어, UTR, 다른 비-코딩 서열 및 GFP 또는 에피토프 태그는 동일성 퍼센트를 계산할 때 고려되지 않으며, 폴리리보뉴클레오티드는 그러한 영역을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있음).

전술한 것 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 그러한 폴리리보뉴클레오티드 (또는 변형된 폴리리보뉴클레오티드)는 기능적 CCDC39 단백질을 코딩한다.

본 개시내용은 또한 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 인간 MCIDAS를 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 개시내용의 전술한 또는 다른 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드 또는 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 인간 MCIDAS를 코딩하고, 서열식별번호: 4 (예를 들어, 서열식별번호: 4에 제시된 서열)과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 또는 적어도 95% 동일한 (예를 들어, 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한) 1차 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 T7 프로모터의 일부, 에트리스의 최소 5' UTR, 코작 요소에 이어, 인간 MCIDAS 단백질의 기능적 버전을 코딩하는 코돈 최적화된 서열, PCR 기반 주형 생산을 위한 역방향 프라이머 결합 부위로서 또한 기능하는 임의적 3' UTR 뿐만 아니라 폴리(A) 꼬리를 함유한다. 일부 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 본원에 제시된 임의의 그러한 수준 및/또는 유형으로부터 선택된 변형의 수준 및/또는 유형을 갖는 변형된 폴리리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드의 동일성 퍼센트는 서열식별번호: 4의 MCIDAS 코딩 서열 부분에 대해서만 측정된다 (예를 들어, UTR, 다른 비-코딩 서열 및 GFP 또는 에피토프 태그는 동일성 퍼센트를 계산할 때 고려되지 않으며, 폴리리보뉴클레오티드는 그러한 영역을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있음). 전술한 것 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 그러한 폴리리보뉴클레오티드 (또는 변형된 폴리리보뉴클레오티드)는 기능적 MCIDAS 단백질을 코딩한다.

제2 서열과 비교한 제1 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 유사체 (예를 들어, 메틸시티딘)는 시티딘 등과 매칭된다. 특정 실시양태에서, 용어 "1차 서열"은 CUCUCUA와 동일한 1차 서열이 나열된 뉴클레오티드 중 임의의 것 또는 전부가 변형되었는지 여부에 관계없이 그러한 서열을 포함하도록, 변형의 여부 또는 수준과 상관 없이 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, C, U 및 A 중 어느 하나 이상의 유사체가 존재할 수 있고 동일한 1차 서열로 간주될 것임).

특정 실시양태에서, 동일성 퍼센트는, 예를 들어, CCDC40 또는 CCDC39에 대한 코딩 서열에 상응하는 주어진 열거된 서열의 부분을 참조해서만 결정된다. 다른 실시양태에서는, 동일성 퍼센트가 코딩 서열 및 하나 이상의 비-코딩 서열 둘 다를 참조하여 결정된다. 특정 실시양태에서, 동일성 퍼센트는 열거된 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정된다 (예를 들어, 본원의 서열 목록에 열거된 서열의 전체 길이를 참조함).

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 섬모발생에 대한 폴리리보뉴클레오티드의 효과를 분석하는 방법으로서, 여기서 상기 폴리리보뉴클레오티드는 섬모발생에 수반되고/거나 그에 요구되는 단백질을 코딩하는 것인 방법에 관한 것이다:

(a) 섬모병증을 가진 대상체의 코 브러시를 수득하며, 상기 코 브러시는 미분화된 기저 세포 및 분화된 섬모 세포를 포함하는 것인 단계,

(b) 단계 (a)로부터 수득된 세포를 미분화된 기저 세포 및 탈분화된 섬모 세포를 수득하기 위한 침지 세포 배양물로서 배양하는 단계,

(c) 단계 (b)로부터 수득된 미분화된 기저 세포 및 탈분화된 섬모 세포를 기액 계면 세포 배양물로서 배양하고 에어 리프트를 수행하는 단계,

(d) 단계 (c)로부터 수득된 세포를 섬모발생에 수반되고/거나 그에 요구되는 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계,

(e) 분화된 섬모 세포를 수득하기 위해 단계 (d)로부터 수득된 형질감염된 세포를 배양하는 단계, 및

(f) 락테이트 데히드로게나제 측정, 누크그린(NucGreen) 검정, 고속 비디오 현미경검사, 섬모 박동 주파수 측정, 점액섬모 청소 검정 및/또는 면역형광 염색을 사용하여 섬모발생에 대한 상기 폴리리보뉴클레오티드의 효과를 결정하는 단계.

환자의 호흡기 상피 세포를 수득하기 위해서는, 코 브러시가 유리한데, 이는 조작하기가 쉽고 시술이 빠르고 환자에게 고통이 없기 때문이다. 코 브러시로부터 수득된 세포는 미분화된 기저 세포와 분화된 섬모 세포를 포함하며, 이는 침지 세포 배양물로서 배양될 수 있다. 침지 세포 배양물로서 세포를 배양함으로써, 미분화된 기저 세포 및 탈분화된 섬모 세포를 수득할 수 있는데, 이는 침지 조건이 상피 세포의 탈분화를 유도하기 때문이다. 이어서, 이로써 수득된 탈분화된 섬모 세포 뿐만 아니라 코 브러시의 미분화된 기저 세포는 기액 계면 (ALI) 세포 배양물로서 배양되어야 한다.

단계 (c)의 기액 계면 세포 배양은 세포의 기저 표면이 액체 배양 배지와 접촉하는 반면, 정단 표면이 공기에 노출되는 것을 특징으로 하는 세포 배양을 지칭한다. 세포는 예를 들어 세포 배양 삽입물의 투과성 막 상에 시딩될 수 있으며, 초기에는 정점 구획과 기저 구획 둘 다에 배양 배지가 공급된다. 이것은 또한 "침지 세포 배양"으로서 지칭될 수 있다. 일단 전면생장에 도달하면, 세포는 배지가 기저 챔버에만 공급되는 "에어-리프트" 단계를 거친다. 이것은, 예를 들어 호흡기계에서 발견되는 조건을 모방하고 미분화된 섬모 세포에서의 섬모발생을 포함한 세포 분화를 유도한다. 따라서, 예를 들어 기저 세포 및 섬모 세포를 포함한 호흡기계의 상피를 모방하는 세포는 시험관내 추가 조사를 위해 수득될 수 있다.

이어서, 이와 같이 수득된 상피 모방 세포는 섬모발생에 수반되고/거나 그에 요구되는 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드로 형질감염될 수 있다. 따라서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 바이러스성 감염 또는 바이러스성 감염 이외의 수단에 의해 인공적으로 수행될 수 있는 세포 내로 도입되어 세포에서 외인성 폴리리보뉴클레오티드를 발현한다. 그 다음, 형질감염된 세포를 배양하여 기저 및 미분화된 섬모 세포로부터 분화된 섬모 세포를 수득한다. 따라서, 섬모발생에 대한 폴리리보뉴클레오티드 예컨대 mRNA의 효과는 예를 들어 대상체에서 발견될 수 있는 바와 같이 호흡기계의 상피를 모방하는 세포의 환경을 보존하면서 시험관내에서 결정될 수 있다.

섬모발생에 대한 폴리리보뉴클레오티드의 효과는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 락테이트 데히드로게나제 측정, 누크그린 검정, 고속 비디오 현미경검사, 섬모 박동 주파수 측정, 점액섬모 청소 검정 및/또는 면역형광 염색을 포함한다. 따라서, 락테이트 데히드로게나제 측정 (LDH)은 세포 주변 환경에서 방출되는 LDH의 양을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 각각의 검정은 비색 검정일 수 있으며, 여기서 방출된 LDH의 양은 예를 들어 아이오도니트로테트라졸륨 또는 테트라졸륨 염을 적색 포르마잔으로 전환시키는 효소 반응으로 측정된다. 따라서, 검정은 분광학으로 쉽게 판독될 수 있다.

대안적으로 또는 추가적으로, 누크그린 검정을 수행할 수 있다. 누크그린은 핵산과 결합할 때 영구적인 녹색 형광 핵산 얼룩이며 예를 들어 형질감염의 독성 관련 효과를 조사하는데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 형질감염된 폴리리보뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질의 면역형광 염색은 다른 단백질과의 공동-국재화를 포함한 세포성 국재화 및 그의 양을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 발현된 단백질의 양을 결정하기 위해, 웨스턴 블롯 기술을 사용하는 것이 또한 가능하다.

더욱이, 섬모 구조적 결함 또는 섬모 결여는 예를 들어 특수 현미경검사를 사용하여 검출될 수 있다. 스크리닝 시험은 비강 산화질소 생산 속도, 비강 세포의 고속 비디오 현미경검사에 의한 섬모 운동성, 또는 예를 들어 사카린 시험을 포함한 생체내 시험을 포함한다. 보다 구체적인 진단을 위해서는, 예를 들어 면역형광 및 투과 전자 현미경검사에 의한 섬모 검사가 요구된다.

대안적으로 또는 추가적으로, 섬모 박동 주파수 측정은 고속 비디오 현미경검사를 사용하여 박동 주파수, 박동 섬모 및 섬모 세포의 수, 및 박동 동시성을 조사하기 위해 적용될 수 있다. 섬모 기능에 의해 영향을 받는 점액 청소율을 결정하기 위해 수행될 수 있는 점액섬모 청소 검정에도 동일하게 적용된다.

상기 기재된 방법에 이용될 폴리리보뉴클레오티드와 관련하여, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 제약 조성물과 연계해서 상기 기재된 바와 동일하게 적용된다. 더욱이, 또한 이러한 폴리리보뉴클레오티드의 다른 특징은 상기 기재된 바와 같을 수 있다.

더욱이, 폴리리보뉴클레오티드는 마커를 코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 그 예는 각각의 검출 방법과 함께 첨부된 예에 기재된 바와 같은 tdTomato (예를 들어 서열식별번호: 3에 포함된 바와 같음), 녹색 형광 단백질 (GFP), 및 증강된 GFP (eGFP)를 포함한다. 이는 폴리리보뉴클레오티드로의 세포의 성공적인 형질감염을 검증하는데 특히 유리하다.

섬모발생에 대한 폴리리보뉴클레오티드의 효과를 분석하는 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 단계 (c)에서 에어 리프트가 수행된 후 0 내지 12일 이내, 바람직하게는 0 내지 11일 이내, 보다 바람직하게는 0 내지 6일 이내, 보다 더 바람직하게는 0 내지 4일 이내 및 가장 바람직하게는 0 내지 48시간 이내에 형질감염된다. 이것은 에어 리프트 단계가 기저 및 미분화된 섬모 세포의 섬모발생을 유도하기 때문에 유리하다.

섬모발생에 대한 폴리리보뉴클레오티드의 효과를 분석하는 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 화학식 (V), (VI), 및/또는 (VII)에 제시된 구조를 갖는 리피도이드를 사용하여 섬모발생에 수반되고/거나 그에 요구되는 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 mRNA로 형질감염된다.

섬모발생에 대한 폴리리보뉴클레오티드의 효과를 분석하는 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 배지 G를 사용하여 단계 (b) 내지 (e)에서 배양된다. 배지 G의 조성은 전형적으로 표 2에 제시된 바와 같다.

표 2

섬모발생에 대한 폴리리보뉴클레오티드의 효과를 분석하는 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 표 3에 제시된 배지 중 하나를 사용하여 단계 (b) 내지 (e)에서 배양된다. 표 3에 제시된 배지는 ALI 배양물을 성장시키는데 사용될 수 있는 상업적으로 입수가능한 배지 중 일부이다.

표 3

섬모발생에 대한 폴리리보뉴클레오티드의 효과를 분석하는 방법의 일부 실시양태에서, 코 브러시는 섬유모세포를 추가로 포함하고, 여기서 상기 섬유모세포의 성장은 단계 (b) 내지 (e)에서 억제된다. 이것은 섬유모세포가 기저 및 미분화된 섬모 세포와 비교해서 더 빠르게 성장하고 따라서 상기 기재된 바와 같이 섬모발생에 대한 폴리리보뉴클레오티드의 효과에 대한 조사를 방해할 수 있기 때문에 유리하다.

세포를 정지 상의 플라스크로 옮기기 전에, 1-2시간의 짧은 인큐베이션 시간으로 인해 섬유모세포를 나머지 세포로부터 분리할 수 있다. 그 시간 동안, 섬유모세포는 정착하여 세포 플라스크에 부착될 수 있다. 다른 모든 세포는 배지에 현탁 세포로서 남아 있으며 나중에 "정지 상 플라스크"로 쉽게 옮길 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 바람직하게는, 섬모발생에 긍정적인 영향을 미치고 기능상 섬모 세포 구조를 회복시키는데 사용될 수 있는 폴리리보뉴클레오티드의 확인을 초래하므로, 제2 측면에 따른 제약 조성물 및 본 발명의 제1 측면에 따른 섬모병증을 앓고 있는 대상체에서 섬모병증을 치료하는데 있어서의 그의 용도를 초래한다. 따라서, 폴리리보뉴클레오티드의 특징과 관련하여, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 제약 조성물과 연계해서 상기 기재된 바와 동일하게 적용된다. 더욱이, 이러한 폴리리보뉴클레오티드의 다른 특징도 상기 기재된 바와 같을 수 있다.

도 1: CCDC40 mRNA의 번역 효율. 2/1.4/0.3/0.2/0.05x10^6 HEK293 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 시딩 후 24시간에 리포펙타민2000을 사용하여 세포를 상이한 CCDC40 구축물 (ETH031T06-T10, 2.5 μg/9.5 cm²)로 형질감염시켰다. 세포 용해는 형질감염 후 6, 24, 48, 72 및 144시간에 수행되었다. 50 μg의 총 단백질 용해물을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다. CCDC40은 아틀라스 항체(Atlas Antibodies) (1:2000)로부터의 항-CCDC40 항체 (HPA022974)를 사용하여 검출되었다. GAPDH가 부하 대조군으로서 제공되었다. GFP는 형질감염 대조군으로서 제공되었다.

도 2: BEAS-2B, RPMI2650 및 HEK293 세포에서 CCDC40 mRNA 구축물의 번역 효율성: 2x10^6 HEK293, 7.5x10^5 BEAS-2B 및 5x10^5 RPMI 2650 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 시딩 후 24시간에 리포펙타민2000을 사용하여 세포를 상이한 CCDC40 구축물 (2.5 μg/9.5 cm²)로 형질감염시켰다. 세포 용해는 형질감염 후 6시간에 수행되었다. 단백질 용해물을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다 (HEK293: 50 μg, RPMI 2650: 20 μg, BEAS-2B: 총 용해물 30 μg). CCDC40은 아틀라스 항체 (1:2000)로부터의 항-CCDC40 항체 (HPA022974)를 사용하여 검출되었다.

도 3: LF92/CCDC40 형질감염 후 고속 비디오 현미경검사 (HSVM) 결과. 환자 유래 ALI 배양물을 격일로 3 μg LF92/CCDC40으로 형질감염시켰다. 형질감염 전 및 형질감염 후 24시간마다 비디오 (삽입물당 20개)를 촬영하고 SAVA (시손-아몬스 비디오 분석) 소프트웨어를 사용하여 CFB (섬모 박동 주파수)를 계산하였다. 총 16번의 형질감염 (1개월)이 수행되었다. 40x 배율을 이용하여 37℃에서 측정하였다. 섬모 박동 주파수 측정의 평균값이 계산된다 (전체 필드 분석, WFA).

도 4: Z-투영 및 폴라그래프로서 제시된 점액섬모 청소 (MCC). CCDC40 환자 ALI 배양물을 에어-리프트 시 18일에, 3 μg/삽입물의 농도 하에 CCDC40 mRNA/LF92로 형질감염시켰다. ALI 배양물은 실험 동안 배지 G에서 유지되었다. 형질감염 (TF)은 4주 동안 1주에 1회 수행되었다 (= 4x TF). 점액섬모 청소 (MCC)는 0.5 μm 형광 비드를 사용하여 20x 배율로 측정되었다. 상이한 영역의 30초 비디오를 촬영하고 마지막 TF 후 1주일에 니콘(Nikon)으로부터의 폴라그래프 소프트웨어로 분석하였다. 하나의 예시적인 사진이 제시된다.

도 5: tdTomato에 대한 Z-투영 (좌측 위) 및 폴라그래프 (우측 위) 및 건강한 대조군에 대한 폴라그래프 (우측 아래)로서 제시된 점액섬모 청소 (MCC). 상단 행: ALI 배양물에서 CCDC40 돌연변이가 있는 환자로부터의 세포를 에어-리프트 시 18일에, 3 μg/삽입물의 농도 하에 tdTomato mRNA/LF111로 형질감염시켰다. ALI 배양물은 실험 동안 배지 G에서 유지되었다. 형질감염 (TF)은 4주 동안 1주에 1회 수행되었다 (= 4x TF). 점액섬모 청소 (MCC)는 0.5 μm 형광 비드를 사용하여 30x 배율로 측정되었다. 상이한 영역의 20초 비디오를 촬영하고 마지막 TF 후 1주일에 니콘으로부터의 폴라그래프 소프트웨어로 분석하였다. 하나의 예시적인 비디오가 제시된다. 우측 아래: 건강한 WT ALI 배양물의 입자 추적. MCC는 0.5 μm 형광 비드를 사용하여 20x 배율로 측정되었다. 상이한 영역의 20초 비디오를 촬영하고 마지막 TF 후 1주일에 니콘으로부터의 폴라그래프 소프트웨어로 분석하였다. 하나의 예시적인 사진과 2개의 분석된 ROI가 제시된다.

도 6: ALI 배양물에서 CCDC40 돌연변이가 있는 환자로부터의 세포를 에어-리프트 시 18일에, 3 μg/삽입물의 용량 하에 tdTomato mRNA/LF111 또는 CCDC40 mRNA/LF92로 형질감염시켰다. ALI 배양물은 실험 동안 배지 G에서 유지되었다. 형질감염 (TF)은 4주 동안 1주에 1회 수행되었다 (= 4x TF). 대조군으로서, 건강한 코 브러시로부터의 WT ALI를 사용하였다. 극저온 포매를 위한 샘플은 마지막 TF 후 1주일에 준비되었다. CCDC40 mRNA 및 tdTomato mRNA 처리된 ALI 막을 20μm로 커팅하고 항-GAS8 (적색), 항-아세틸화 튜불린 (녹색) 및 DAPI (청색)로 염색하였다. 사진은 공초점 현미경으로 촬영하였다. 하나의 예시적인 영상이 제시된다. 스케일 바는 10 μm를 나타낸다.

도 7: ALI 배양물에서 CCDC40 돌연변이가 있는 환자로부터의 세포를 에어-리프트 시 18일에, 3 μg/삽입물의 용량 하에 tdTomato mRNA/LF111 또는 CCDC40 mRNA/LF92로 형질감염시켰다. ALI 배양물은 실험 동안 배지 G에서 유지되었다. 형질감염 (TF)은 4주 동안 1주에 1회 수행되었다 (= 4x TF). 대조군으로서, 건강한 대조군으로부터의 ALI를 사용하였다. 극저온 포매를 위한 샘플은 마지막 TF 후 1주일에 준비되었다. CCDC40 mRNA 및 tdTomato mRNA 처리된 ALI 막을 20 μm로 커팅하고 항-DNALI1 (적색), 항-아세틸화 튜불린 (녹색) 및 DAPI (청색)로 염색하였다. 사진은 공초점 현미경으로 촬영하였다. 하나의 예시적인 영상이 제시된다. 스케일 바는 10 μm를 나타낸다.

도 8: ALI 배양물에서 CCDC40 돌연변이가 있는 환자로부터의 세포를 에어-리프트 시 18일에, 3 μg/삽입물의 용량 하에 tdTomato mRNA/LF111 또는 CCDC40 mRNA/LF92로 형질감염시켰다. ALI 배양물은 실험 동안 배지 G에서 유지되었다. 형질감염 (TF)은 4주 동안 1주에 1회 수행되었다 (= 4x TF). 대조군으로서, 건강한 대조군으로부터의 ALI를 사용하였다. 극저온 포매를 위한 샘플은 마지막 TF 후 1주일에 준비되었다. CCDC40 mRNA 및 tdTomato mRNA 처리된 ALI 막을 20 μm로 커팅하고 항-CCDC39 (1:200, 적색), 항-아세틸화 튜불린 (1:10,000, 녹색) 및 DAPI (청색)로 염색하였다. 사진은 공초점 현미경으로 촬영하였다. 하나의 예시적인 영상이 표시된다. 배율 40x.

도 9: 형질감염 후 6시간 & 24시간에서, HEK-293 & BEAS-2B에서의 CCDC39 단백질 (110 kDa) 발현. 1.4x10^5 HEK-293 세포 및 3.5x10^5 BEAS-2B 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고 CCDC39-RNA (ETH047T02, 최소 5'UTR, 리포펙타민 메신저맥스(Lipofectamine MessengerMax); 비율 1:1.5)로 형질감염시켰다. 6시간 및 24시간 후, 세포를 M-PER 및 트리톤 X-100 완충제로 용해시켰다. 50 μg의 단백질 용해물을 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 대조군으로서, 비형질감염된 (UT) 세포 및 EGFP 형질감염된 세포의 용해물을 사용하였다. 고용량 = 0.5 μg/cm², 저용량 = 0.25 μg/cm².

도 10:

미처리된 ALI 배양물에서의 CCDC39 단백질 (110 kDa) 발현. 축사 추출 프로토콜을 사용하여 2개의 삽입물을 추출하였다. 30, 10 및 5 μL의 단백질 용해물을 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 활성 영역: 삽입물 39.9 = 71.25%, 삽입물 41.2 = 59.88%.

도 11:

프로테아솜 억제제로 처리한 후 16HBE14o-에서의 CCDC39 단백질 (110 kDa) 발현. 6.0x10^5 16HBE14o- 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고 CCDC39-RNA (리포펙타민 메신저맥스; 비율 1:1.5)로 형질감염시켰다. 6시간 후 세포를 M-PER 완충제로 용해시켰다. 20 μg의 단백질 용해물을 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 대조군으로서, 형질감염된 (UT) 세포 및 EGFP 형질감염된 세포의 용해물을 사용하였다. 고용량 = 0.5 μg/cm², 저용량 = 0.25 μg/cm². RNA: ETH047T02: 최소 5'UTR, ETH047T03: TISU, ETH047T04: CYBA, ETH047T05: SP30.

도 12: 프로테아솜 억제제로 처리한 후 16HBE14o-에서의 CCDC39 단백질 (110 kDa) 발현. 6.0x10^5 16HBE14o- 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고 CCDC39-RNA (ETH047T03, TISU 5'UTR, 리포펙타민 메신저맥스; 비율 1:1.5)로 형질감염시켰다. 24시간 후 세포를 M-PER 완충제로 용해시켰다. 20 μg의 단백질 용해물을 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 대조군으로서, 형질감염된 (UT) 세포 및 EGFP 형질감염된 세포의 용해물을 사용하였다. 고용량 = 0.5 μg/cm², 저용량 = 0.25 μg/cm².

본 발명의 다른 측면 및 이점은 제한이 아닌 예시의 목적으로 제공되는 하기 실시예에서 설명될 것이다. 본 출원에 인용된 각각의 간행물, 특허, 특허 출원 또는 다른 문서는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

실시예

방법 및 재료는 본 개시내용에서 사용하기 위해 본원에 기재되어 있고; 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.

I. 재료 및 방법

사용된 재료, 장치, 소프트웨어, 및 시험 시스템

재료가 표 4에 열거되어 있다.

표 4

장치가 표 5에 열거되어 있다.

표 5

소프트웨어가 표 6에 열거되어 있다.

표 6

시험 시스템이 표 7에 열거되어 있다.

표 7

I. 침지 세포 배양물

1. 배양하는 것

세포주는 37℃ 및 5% CO₂ 함량의 가습 대기 하에 세포 인큐베이터에서 배양하였다. 모든 시약 및 용액은 사용 전에 수조에서 37℃로 가열하였다.

전면생장 세포 (약 90%)를 먼저, 20 mL DPBS (Mg²⁺/Ca²⁺ 비포함)로 세척하여 죽은 세포를 제거하였다. 세포를 분리하기 위해 플라스크당 트립신/EDTA 용액 (0.05%) 2 mL를 부가하였다. 그 다음, 세포의 분리가 발생할 때까지 세포를 37℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 배지 8 mL를 사용하여 트립신을 중단시켰다. LHC-9 배지는 거의 무혈청이기 때문에, 트립신화를 불활성화하기 위해 분리된 BEAS-2B 세포에 적어도 동일한 용적의 트립신 억제제를 부가하였다. 세포 용액은 트립신 억제제를 다시 제거하기 위해 분당 1100 회전 (rpm)에서 5분 (min) 동안 원심분리시켜야 했다. 그런 다음 펠릿을 배지에 용해시켰다. 계대를 위해, 세포는 다음 사용에 따라 상이한 비율로 분할되었다.

HEK 293 (DSMZ 번호: ACC305)

이러한 확립된 세포주는 아데노바이러스 유형 5 (AD 5)에 의해 형질전환된 인간 1차 배아 신장으로부터 유래되었다. 이것은 둘벡코의 변형 이글 배지 (DMEM) - 10% 열 불활성화 (h.i.) 소 태아 혈청 (FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (P/S)을 포함하는 글루타맥스(GlutaMAX)™ 보충물에서 배양되었다. 이러한 세포주는 1주에 2회 분할되었다.

RPMI 2650 (DSMZ 번호: ACC207)

이러한 세포주는 비중격의 역형성 편평 세포 암종을 앓고 있는 52세 남성의 흉막 삼출액으로부터 유래되었다. 그것은 상피 모양의 섬모 형태와 세기관지 상피와의 유사성 때문에 선택되었다. 또한 둘벡코의 변형 이글 배지 (DMEM) - 10% 열 불활성화 (h.i.) 소 태아 혈청 (FBS) + 1% 페니실린/스트렙토마이신 (P/S) + 1x 비필수 아미노산 용액 (NEAA)을 포함하는 글루타맥스™ 보충물에서 배양되었다. 이러한 세포주는 1주에 1 내지 2회 분할되었다.

BEAS-2B (ATCC 번호: CRL 9609)

BEAS-2B 세포는 비-암성 개체의 부검으로부터 수득된 정상 기관지 상피로부터 유래되었다. 그런 다음 세포를 복제-결함 SV40/아데노바이러스 12 하이브리드로 감염시키고 클로닝하였다. 사용된 배양 배지는 첨가제 비포함한 변형된 LHC-9였다. 이들은 또한 전면생장에 따라 1주에 1 내지 2회 분할되었다.

BEAS-2B 세포에 사용된 플라스크는 LHC-9에 용해된 0.01 mg/mL 피브로넥틴, 0.03 mg/mL 콜라겐 및 0.01 mg/mL 소 혈청 알부민의 혼합물로 코팅되었다. 혼합물을 표면적 1 cm²당 0.2 mL의 비율로 부가하였다. 그 후, 37℃에서 적어도 6시간 동안 인큐베이션하는 것이 필요하였다. 세포를 부가하기 전에, 플라스크를 Mg²⁺/Ca²⁺를 포함하지 않은 둘벡코의 인산염 완충 식염수 (DPBS)로 3회 세척하였다.

2. 시험관내 전사

시험관내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해, 원형 플라스미드를 BstBI로 제한 소화하여 선형화하고, 클로로포름 에탄올 침전에 의해 추가로 정제하였다.

mRNA는 T7 RNA 폴리머라제, 무기 피로포스파타제 및 RNase 억제제를 함유하는 표준 시험관내 전사 믹스 (표시된 변형된 트리포스페이트 뉴클레오티드를 포함함)를 사용하여 생산되었다. ARCA 캡 유사체를 부가하여 공동-전사 캡핑을 달성하였다. 화학적으로 변형된 RNA의 시험관내 전사를 위해, 각각 7.5%의 시티딘-5'-트리포스페이트가 5-아이오도시티딘-5'-트리포스페이트로 대체되었고, 30% 우리딘-5'-트리포스페이트가 5-아이오도우리딘-5'-트리포스페이트 [제나 바이오사이언시스(Jena Biosciences)]로 대체되었다 (예를 들어 서열식별번호: 1 참조). 또 다른 화학적으로 변형된 RNA 생산 설정에서, 각각 3%의 시티딘-5'-트리포스페이트가 5-아이오도시티딘-5'-트리포스페이트로 대체되었고, 15% 우리딘-5'-트리포스페이트가 5-메틸-우리딘-5'-트리포스페이트 (제나 바이오사이언시스)로 대체되었다 (예를 들어 서열식별번호: 2 참조). 잔류 주형 DNA는 DNaseI를 사용하여 소화시켰다. 후속적으로 mRNA는 암모늄 아세테이트 침전에 의해 정제한 다음, 70% 에탄올을 사용한 세척 단계를 수행하였다.

캡핑되지 않은 잔류 mRNA의 탈인산화는 신속 탈인산화 키트를 사용하여 수행한 다음, 암모늄 아세테이트 침전을 통한 정제에 이어 70% 에탄올을 사용한 세척 단계 및 100 MWCO 컷 오프 필터를 사용한 한외여과를 수행하였다.

mRNA는 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 추가로 폴리아데닐화되었다. 다시 mRNA를 암모늄 아세테이트 침전에 의해 정제한 다음, 70% 에탄올을 사용한 세척 단계 및 100 MWCO 컷 오프 필터를 사용한 한외여과를 수행하였다. 폴리(A) 길이는 모세관 겔 전기영동에 의해 100개 내지 250개의 뉴클레오티드인 것으로 결정되었다.

특히, 이러한 실험에서 조사된 CCDC40 mRNA 구축물은 5' ARCA 캡 및 PPA를 포함하였고 하기와 같다: 에트리스의 최소 UTR을 포함함 (ETH031T06; T06; 서열식별번호: 5), TISU 5' UTR을 포함하지만 3' UTR은 포함하지 않음 (ETH031T07; T07; 서열식별번호: 6), hAg 5' UTR을 포함하지만 3' UTR은 포함하지 않음 (ETH031T08; T08; 서열식별번호: 7), CYBA 5' 및 3' UTR을 포함함 (ETH031T0; T09; 서열식별번호: 1), 및 인간 CMV IE9로부터의 5' UTR 및 인간 성장 호르몬으로부터의 3' UTR을 포함함 (ETH031T0; T10; 서열식별번호: 8).

3. 형질감염

적어도 90%의 전면생장을 제공하기 위해, 세포를 형질감염 24시간 전에 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포 계수는 판독 시점 및 세포 유형에 따라 상이하였다 (표 8를 비교함).

표 8

형질감염 대조군으로서 증강된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 코딩하는 mRNA 뿐만 아니라 상이한 CCDC40 mRNA 구축물을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 리포펙타민® 2000을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 형질감염 전에 배양 배지를 교환하여 세포에 대한 최적의 조건을 제공하였다. 리포플렉스 반응에는 mRNA/WFI 믹스 뿐만 아니라 리포펙타민® 2000/배지 믹스가 요구되었다. mRNA가 1 μg/μl의 스톡 농도를 나타내므로, 각각의 믹스 125 μL를 mRNA 대 리포펙타민® 2000 1:2의 용적 비율로 사용하였다. 상이한 mRNA 농도를 사용하고 이에 따라 믹스를 조정하였다 (예시적인 피펫팅 방식에 대해서는 표 9 참조).

표 9

믹스 둘 다를 제조한 후, mRNA/WFI 믹스를 리포펙타민®2000/배지 믹스에 부가하고 용액을 ≥5분 동안 인큐베이션한 후, 시딩된 세포에 적가하였다. 세포의 더 나은 생육력을 수득하기 위해, 형질감염 후 4시간에 부가의 배지 교환을 수행하였다.

4. CCDC40 웨스턴 블롯

a. 웨스턴 블롯을 위한 샘플링

세포 용해를 위해, 형질감염으로부터의 배양 배지를 제거하고 세포를 DPBS (Mg²⁺/Ca²⁺ 비포함)로 세척한 다음 코닝(Corning)® 세포 스크래퍼를 사용하여 긁어내었다. 세포를 100 μL의 용해 완충 용액으로 용해시킨 후 [10x 트리톤X-100 용해 완충제 (250 mM 트리스-HCl, 1% 트리톤X-100, pH: 7.8)를 WFI에서 1x로 조정하고 프로테아제 억제제 컴플리트로 보완하였다] 샘플을 -20℃에서 동결시켰다.

총 단백질 농도는 피어스(Pierce)™ BCA 단백질 검정 키트 (BCA 검정)를 사용하여 결정되었다. 검정은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었다. 간단히 언급하면, 1:50 BCA 작업 시약 (WR) 희석액을 준비하였다. 5 μL의 각각의 샘플을 96-웰 플레이트 (평평한 바닥, 투명)로 옮기고 웰당 200 μL WR을 부가하였다. 마지막 단계는 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하는 것이었다. 결과는 마겔란(Magellan)™ - 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 테칸 인피니트(Tecan Infinite)® 200 PRO 플레이트 판독기에서 측정되었다.

b. NET-젤라틴의 제조

표 10

c. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯

나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 수행하기 위해, 용해물을 5 μL 볼트(Bolt) LDS 샘플 완충제 (4x) 및 2 μL 볼트 샘플 환원제 (10x)와 혼합한 다음, 써모믹서(Thermomixer)® C에서 350 rpm 및 10분 동안 70℃로 가열하였다. 하나의 겔에서 샘플 간을 비교할 수 있도록, 동일한 양의 총 단백질을 부하하였다. 7 μL의 마커 (프리시젼 플러스 프로테인™ 이중 색상 표준)를 각각의 겔의 제1 포켓에 충전시켜, 나중에 정확한 단백질 크기 추정을 가능하게 할 수 있다. 그런 다음 겔 탱크를 1 A에서 30분 동안 전원 공급 장치 (파워 PAC 300)에 연결하였다. 후속적으로 카세트를 주걱으로 개봉한 다음, 겔을 블로팅 스테이션으로 이동시켰다.

전달 시스템 (트랜스-블롯(Trans-Blot)® 터보(Turbo)™ 전달 시스템, 30분, 25 V, 1 A) 및 적합한 막 (트랜스-블롯 전달 팩 미니 0.2 μm PVDF)을 제조업체의 지침에 따라 블로팅에 사용하였다. "샌드위치" 위로 롤러를 스크롤함으로써, 단백질 전달을 방해할 수 있는 어떠한 거품도 제거하였다. 유리 결합 부위를 차단하기 위해, 막을 NET-젤라틴에 넣고 플레이트 진탕기 상에서 60분 동안 진탕시켰다. 겔을 75 kD 밴드에서 커팅하여 CCDC40 및 글리세린알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제 (GAPDH)를 동시에 검출하였다. 항체를 NET-젤라틴 (6 mL 중 항-CCDC40 1:2000, 10 mL NET-젤라틴 중 GAPDH 1:10000)으로 희석하고, 막을 플레이트 진탕기 상에서 상응하는 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. GAPDH는 부하 대조군으로서 기능한다. 이용된 항체의 목록이 표 11에 제시된다. 그 다음 날, 막을 NET-젤라틴으로 10분 동안 3회 세척하여, 비-특이적으로 결합되거나 또는 잔류하는 항체를 제거하였다. 2차 항체 염소 항-토끼 IgG-HRP를 NET-젤라틴으로 1:10,000 희석하였다. 실온 (RT) 하에 플레이트 진탕기에서 60분 인큐베이션한 후, 막을 NET-젤라틴으로 10분 동안 다시 3회 세척하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다제 HRP 접합된 2차 항체는 분자 영상화제 [케미독(ChemiDoc)™ XRS 시스템]를 통해 검출할 수 있었다. 따라서 루미나타 크레센도 웨스턴 HRP 기질 5 mL를 겔 상에 부가하고 5분 동안 인큐베이션하였다. 아직 과다 노출되지 않은 마지막 사진과 비색 사진을 병합하여 이미지 랩(Image Lab)™ 소프트웨어로 예시하였다. 또한, 밴드 강도는 나중에 이미지 랩™으로 결정되었다.

표 11

II. ALI 배양물

1. 인간 호흡기 상피 세포 (hREC)의 샘플링

a. 코 브러싱

RPMI 배지를 실온으로 가열하고 브러시를 멸균 등장성 식염수 용액으로 습윤시켰다. 보호 팁이 있는 셀레타(Celletta)™ 브러시 세포 수집기가 적용되었다. 환자에게 코를 세정하도록 요청한 후, 환자는 머리를 받치도록 머리를 벽에 대고 의자에 앉아야 했다. 브러시는 회전 및 선형 움직임을 사용하여 하비도의 내측 및 상측을 빠르게 몇 번 문질렀다. 브러시를 꺼낼 때, 예열된 RPMI 배지 5 ml가 들어 있는 수집 튜브 (15 ml 코니클)에 즉시 브러시를 넣었다. 브러시로부터 세포를 분리하기 위해 튜브 내에서 브러시를 적어도 40회 동안 격렬하게 흔들었다.

b. 정지 배양

튜브를 실온에서 5분 동안 900 rpm으로 회전시켰다. 상청액을 버린 후, 펠릿을 UG 배지 [5 mL 멸균 100x 항생제/진균제 및 10 mL 멸균 울트로서(Ultroser) G를 포함하는 DMEM/햄 F-12 1:1]에서 분해하였다. 5 mL 배지는 T25에 사용되었고 25 mL는 T75 플라스크에 사용되었다.

세포를 세포 배양 플라스크로 옮기고, 세포를 5% CO₂의 가습 인큐베이터에서 37℃ 하에 밤새 인큐베이션하였다. 세포는 20 내지 24시간 후에 부착되어야 한다. UG 배지는 1주에 3회 (월요일, 수요일 및 금요일) 교체되었다.

2. ALI 배양물의 생성 및 형질감염

a. 트랜스웰 삽입물의 코팅 (0.33 cm ² )

ALI 배양물을 위해 하기 플레이트를 이용하였다: 투명한 폴리에스테르-막이 있는 코닝 트랜스웰 (0.4 μm 공극, 6.5 mm 직경의 삽입물, 24-웰 플레이트). 래트 꼬리 콜라겐을 아세트산에서 1:5로 희석시키고 250 μL를 각각의 삽입물의 정점 측에 부하하였다. 플레이트를 실온에서 밤새 인큐베이션한 후, 나머지 액체를 파스퇴르 피펫으로 흡인한 다음 플레이트를 적어도 5분 동안 열린 뚜껑으로 건조되도록 방치하였다 (멸균). 마지막으로, 삽입물을 DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 비포함)로 2회 세척한 다음 실온에서 밤새 건조시켰다 (멸균). 삽입물은 최대 1개월 동안 4℃ 하에 저장하였다.

b. 침지 배양 (정지 배양)으로서의 hREC의 세포 확장

세포에 2 내지 3일 (월요일, 수요일, 금요일)마다 예열된 UG 배지 15 mL를 공급하였다. 콜라겐 층의 손상과 세포의 박리를 방지하기 위해 새로운 배지를 콜라겐 층에 직접 부가하지 않도록 주의하였다. 세포가 80% 전면생장하거나 또는 콜라겐 층이 분리되기 시작하자마자 세포를 ALI 필터로 옮겼다 (침지 배양에서 대략 3주 후).

c. 배지 G의 제조

상이한 ALI 배지를 시험하였지만, 자기 제작 배지 G가 바람직하다.

이러한 배지는 1주 동안 제조되었지만, 4℃에서 저장할 필요가 있다. 배치는 예정된 실험 크기에 근거하여 분취액으로 동결시켰다. 표 2는 배지 G의 조성을 제시한다.

d. hREC (ALI 배양물)의 시딩 및 에어-리프트

1. UG 배지를 흡인하고, 세척 배지 [1x 멸균 항생제/항진균제 (AA)를 포함하는 DMEM/햄 F-12 1:1] 또는 DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 비포함)로 1회 세척한다.

2. 자기 제작 래트-꼬리 콜라겐으로 코팅된 플라스크의 경우:

a. 9 mL 콜라게나아제 (1x)를 부가하여 콜라겐 층을 용해하고, 37℃에서 45 내지 60분 동안 인큐베이션한다.

b. 세포를 15 mL 코니클 튜브로 옮기고 1000 rpm, 실온에서 5분 동안 원심분리시킨다.

c. 세척 완충제로 세포를 세척한다 (1000 rpm, 실온, 5분 동안)

d. 2 mL 트립신 EDTA (1x)를 부가하고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 세포를 분리하며, 37℃에서 세포를 인큐베이션하고, 세포 클러스터가 붕해될 때까지 (대략 5분) 코니클을 진탕시킨다.

깁코(gibco)로부터 구입한 콜라겐으로 코팅된 플라스크의 경우:

a. 세포가 분리될 때까지 (대략 5분) 세포 배양 플라스크에 3 ml 트립신 EDTA (1x)를 부가한다.

3. 0.5 mL FBS 및 5 mL 세척 배지를 부가하여 트립신을 중지시킨다.

4. 세포를 15 ml 팔콘으로 옮기고 세척 배지로 세포를 2회 세척한다 (1000 rpm, 실온, 5분 동안).

5. 적절한 양의 ALI 배지 (1-2 mL, 펠릿 크기에 따라 다름)에 펠릿을 재현탁시키고, 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수한다.

6. 250 μL의 세포 현탁액 (400,000개 세포/mL)을 기저외측 측에 500 μL ALI 배지가 있는 각각의 콜라겐 코팅된 트랜스웰에 부가한다.

7. 세포를 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃ 하에 밤새 인큐베이션한다.

제3일 내지 제5일: ALI-성장

8. 현미경으로 삽입물을 일관되게 검사한다.

9. 80 - 100% 전면생장까지 (3 내지 4일) 매일 ALI 배지를 세포에 공급한다.

ALI-분화

10. 80 - 100% 전면생장까지 세포를 에어리프트한다.

a. 정점 및 기저외측 측 둘 다로부터 ALI 배지를 흡인한다.

b. 기저외측 구획에 500 μL의 신선한 ALI 배지를 부가한다.

c. 세포를 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃ 하에 인큐베이션한다.

11. 1주에 1회 예열된 세척 배지 (정점)로 세포를 세척하고, 2 내지 3일마다 (또는 월요일 - 수요일 - 금요일) ALI 배지를 세포에 공급한다.

e. hREC의 형질감염

제형 (LF111-mRNA)을 2% 수크로스에서 3 μg/삽입물 (= 9 μg/cm²)의 최종 농도로 희석하였다. 점액을 제거하기 위해, 형질감염 전에, 삽입물을 정점 측에서 200 μL DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 비포함)로 세척하고 37℃ 하에 20분 동안 인큐베이션하거나 (에피텔릭스 ALI) 또는 정점 측에서 200 μL DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 비포함)로 세척하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다 (hREC, UKM). 그 후, 상피를 손상시키지 않고 부드럽게 흡인함으로써 정단 표면으로부터 DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 비포함)를 제거하였다. 점액 세척 직후, 세포를 WFI (100 μL)로 다시 세척하여 미량의 DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 비포함)를 제거하였다. 25 μL의 제형을 삽입물의 정점 측에 부가하여 세포성 흡수를 허용하였다. 인큐베이션 6시간 후에 담체의 제거를 수행하고, 세포를 200 μL DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 비포함)로 1회 세척하며, 배양물을 정점 측에 액체를 포함하지 않는 ALI로서 유지시켰다.

3. 판독 검정

다양한 판독 검정이 이용된다. LDH 측정 및 누크그린 검정을 사용하여 형질감염의 독성 관련 효과를 조사하였다. 섬모 박동 주파수 측정 (CBF)은 섬모 박동 주파수 및 섬모 면적의 백분율과 관련하여 섬모 박동 방식을 조사하기 위해 필요하였다. 섬모 박동이 방향 흐름을 유도하는 경우, 점액섬모 청소 (MCC) 검정을 사용하여 연구할 수 있다. CCDC40, 그의 이종이량체 파트너 CCDC39 및 섬모 마커 아세틸화 알파-튜불린에 대한 면역형광 (IF) 염색을 활용하여, 치료 후 CCDC40 단백질 또는 그의 파트너 CCDC39가 섬모에서 검출될 수 있는지 여부를 검출하였다. 또한, GAS8 및 DNALI1과 같은 디네인 조절 복합체 (DRC)의 단백질이 염색되었다. DRC는 CCDC40/CCDC39에 의해 고정되며 CCDC40/CCDC39가 섬모 축사에 올바르게 통합된 경우에만 존재한다.

a. LDH 측정

LDH 농도는 피어스™ 락테이트 데히드로게나제 세포독성 검정 키트를 사용하여 측정된다. 절차는 제조업체의 프로토콜에 기재된 바와 같이 수행된다. ALI 배양물은 37℃ 및 5% CO₂에서 30분 동안 100 μL DPBS (Mg²⁺/Ca²⁺ 포함)와 함께 정점 측에서 인큐베이션하였다. 50 μL의 LDH 반응 믹스와 50 μL의 인큐베이션 배지를, 96-웰 형식을 활용하여 혼합하고 50 μL 정지 용액을 부가하여 실온에서 30분 동안 빛으로부터 보호하여 인큐베이션하였다. 포르마잔의 흡광도는 마이크로플레이트 판독기 (트리스타2 다중모드 판독기 LB 942)를 사용하여 490 nm 및 680 nm에서 측정하였다. 배경 정규화를 위해 490 nm에서 680 nm 값을 공제한다. 각각의 삽입물에 대해 이중 측정을 수행하였다.

b. 섬모 박동 주파수 (CBF) 측정

hREC의 섬모 박동 주파수 (CBF) 분석은 고속 비디오 현미경검사 및 시손-아몬스 비디오 분석에 의해 수행되었다. 비디오 (125 fps, 640x480 픽셀 해상도)는 미니튜브 SC300 가열 시스템에 의해 36℃의 온도로 유지시킴으로써, 생리학적 조건 하에 ELWD 40x S 플랜 플루오르 대물렌즈가 장착된 도립 위상차 현미경에 부착된 메가플러스 카메라 모델 ES 310 터보를 사용하여 녹화하였다.

c. 점액섬모 청소 검정 (MCC, 형광 비드)

ALI 배지 및 DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 비포함)를 실온으로 예열하고 현미경 플레이트를 37℃로 가열하였다. ALI 삽입물을 새로운 플레이트로 옮기고, 예열된 ALI 배지 (Ca²⁺/Mg²⁺를 포함하지 않은 대체 DPBS)로 2회 정점으로 세척하였다. 삽입물 (SAVA 소프트웨어)의 전체적인 인상을 얻기 위해 삽입물당 20개의 비디오 (40x 배율, Ph2)를 녹화하기 전에 100 μL ALI 배지를 정점 구획에 부가하였다. 직경 0.5 μm의 적색 형광 입자를 DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 비포함)에서 1:1000으로 희석시키고, 적어도 1분 동안 와동시켰다. 10 μL의 입자 희석액을 100 μL의 ALI 배지에 부가하고 와동시키며, 110 μL을 정점 구획에 부가하였다. 비드를 취급하는 동안, 응집을 방지하기 위해 각각의 단계 전에 와동시키는 것이 중요하였다. 더욱이, 표백을 피하기 위해 희미한 빛으로 작업하는 것이 필요하였다.

NIS-요소 기본 연구 소프트웨어로 형광 입자의 유동을 기록하였다. 움직임은 488 nm 레이저로 입자를 여기시키면서 20x 배율 (Ph1)을 사용하여 20-30초에 걸쳐 기록되었다. 노출 시간은 초당 기록된 프레임 수 (fps)로 조정되어야 했다. 7.5 fps의 경우, 노출 시간은 100 ms로 설정되었고, 15 fps의 경우에는 50 ms로 설정되었다. 정확한 관찰 영역을 SAVA (20x 배율, Ph1)로 분석하여 섬모의 움직임과 세포 층의 3D 구조를 시각화하였다.

평가 및 데이터 분석을 위해, 니콘 NIS 요소 AR 소프트웨어, NIS PLUG-IN <ADVANCED 2D TRACKING> <AR> (상기 NIS 요소 AR 추적 모듈 참조)이 이용된다.

d. ALI 배양물의 IF

ALI 배양물의 포매

막 제조 전에, ALI 삽입물을 DPBS (Mg²⁺/Ca²⁺ 비포함, 200 μL, 1분, 실온)로 2회 세척하여 점액을 제거하였다. 하기 프로토콜에 따라 하기 막 제조를 수행한다 (하기 참조).

트랜스웰 필터 막은 3 mL DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺)가 있는 페트리 접시에 막을 옮기기 전에 메스 또는 주사기를 사용하여 커팅하였다. 막을 동일한 조각 (4 내지 6개)으로 커팅하고 샨돈 크라이오매트릭스(Shandon Cryomatrix)™ 동결 포매 배지로 크라이오몰드(cryomold)를 제조하였다 (중간 크기). 막 조각을 크라이오매트릭스에 넣고 크라이오매트릭스가 경화될 때까지 크라이오몰드를 드라이 아이스에서 인큐베이션하기 전에 서로 평행하게 배열하였다. 크라이오몰드는 저온 유지장치에서 커팅하기 전에 적어도 2시간 동안 -80℃에서 저장되었다.

ALI 막의 커팅

샨돈 크라이오매트릭스™에 포매된 ALI 막은 저온 유지장치 마이크롬(Microm) HM560을 사용하여 커팅되었다. 따라서, 저온 유지장치는 -20℃ (-21℃ 하의 테이블 및 -25℃ 하의 챔버)로 사전 냉각시켰다 (커팅 전 2-3시간). ALI 막 함유 크라이오몰드를 적어도 1시간 동안 -80℃에서 -20℃로 옮겼다. 막의 커팅은 막의 취급 조건에 따라 20 μm에서 수행되었다. 막 슬라이스를 슈퍼프로스트 울트라 플러스(Superfrost Ultra Plus) 슬라이드로 옮기고, 실온에서 적어도 1시간 동안 건조시킨 후, -80℃에서 밤새 저장하거나 -80℃에서 사용할 때까지 저장하였다.

염색 절차

적용된 항체에 대해서는, 표 12를 참조한다.

제1일:

1. 실온에서 5분 동안 1x DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺)로 세척한다

2. 고정: 실온에서 15분 동안 4% PFA/1x DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺)

3. 3x DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺)로 세척 (2x 신속, 1x 5분)

4. 투과성:

a. 5분 동안 0.5% 트리톤 X-100 또는

b. 10분 동안 0.2% 트리톤 X-100 (사용된 항체에 따라 다름)

5. 실온에서 3x DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺)로 세척 (2x 신속, 1x 5분)

6. 차단: 5% 정상 염소 혈청 + DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺) 중의 2% BSA 또는 DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺) 중의 5% 탈지유 → 실온에서 2시간

7. 제1 항체: 4℃에서 밤새 200 μl

제2일:

8. 45분 동안 DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺)로 세척한다 (3x 15분)

9. 제2 항체: 실온에서 1시간 동안 200 μl

10. 암실에서 실온 하에 10분 동안 DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺) 중의 훽스트33342 1:1000

11. DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺)으로 6x 5분 동안 세척한다

12. 다코 안티페이드(Dako antifade)를 커버 슬립에 장착한다

표 12

e. ALI 배양물 상에서의 에어 브러시

에어 브러시 모델은 분화하는 ALI 배양물을 생성하기 위해 이용되었다. 프로토콜은 문헌 [Crespin et al. 2011 (Approaches to Study Differentiation and Repair of Human Airway Epithelial Cells)] 이후로 확립되었다.

세포를 예열된 DPBS (Mg²⁺/Ca²⁺)로 정점 측에서 간단히 세척하였다. 에어 브러시에 연결된 압축기는 에어 브러시를 실행시키고 작은 바퀴를 돌려서 1 kg/cm²로 설정하였다. 에어 브러시는 일정한 값을 유지하기 위해 얼마 동안 실행해야 할 필요가 있다. 그런 다음 에어 브러시 상단의 작은 저장소를 DPBS (Mg²⁺/Ca²⁺)로 채우고 기본 배지가 없는 새로운 플레이트에 삽입물을 넣었다. 에어 브러시는 제1 압력 지점까지 누르고 압축기 상의 압력이 일정하게 유지될 때까지 기다리면서 시작되었다. 이어서, 에어 브러시를 삽입물의 상단에 수직으로 놓고 에어 브러시의 레버를 제1 압력 지점 [저장소로부터 DPBS (Mg²⁺/Ca²⁺)을 분산시킴] 너머로 아주 약간만 2초 동안 눌렀다. 다음으로, 삽입물의 정점 측을 예열된 DPBS (Mg²⁺/Ca²⁺)로 간단히 세척하고 삽입물을 ALI 분화에 적용가능한 신선한 배지에 넣었다. 현미경 관찰로 상처를 확인하였다. 너무 작거나 (삽입물 면적의 1/3 미만) 또는 상처에 있는 세포가 약간만 벗겨지면, 상기 절차를 반복하였다. 배양물을 37℃, 5% CO₂의 가습 대기에서 인큐베이션하고 ALI로서 배양하였다.

III. 태그부착된 CCDC40 mRNA

연구 중인 mRNA가 표 13에 제시된다.

표 13

a. 세포 배양

HEK-293 세포는 37℃, 5% CO₂에서 MEM 글루타맥스™, 10% FBS, 100 U/ml P/S (= 배양 배지)에서 배양된다.

시딩하기 전에, 세포를 DPBS로 세척하고 트립신을 사용하여 분리한다. 트립신 처리 후, 트립신은 FBS를 함유하는 배양 배지를 사용하여 불활성화된다. 따라서, 동일하거나 더 많은 용적의 배양 배지가 사용된다. 1100x g에서 5분 동안 원심분리하고 정상 성장 배지에 재현탁한 후, 카운테스 세포 계수 장치를 사용하여 세포를 계수한다.

b. 시험관내 전사

시험관내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해, 원형 플라스미드를 BstBI로 제한 소화시킴으로써 선형화하고 클로로포름 에탄올 침전에 의해 추가로 정제하였다.

mRNA는 T7 RNA 폴리머라제, 무기 피로포스파타제 및 RNase 억제제를 함유하는 표준 시험관내 전사 믹스를 사용하여 생산되었다. ARCA 캡 유사체를 부가하여 공동-전사 캡핑을 달성하였다. 화학적으로 변형된 RNA의 시험관내 전사를 위해, 각각 7.5%의 시티딘-5'-트리포스페이트가 5-아이오도시티딘-5'-트리포스페이트로 대체되었고 30% 우리딘-5'-트리포스페이트가 5-아이오도우리딘-5'-트리포스페이트로 대체되었다. 또 다른 SNIM®RNA 생산 설정에서, 각각 3%의 시티딘-5'-트리포스페이트가 5-아이오도시티딘-5'-트리포스페이트로 대체되었고 15% 우리딘-5'-트리포스페이트가 5-메틸-우리딘-5'-트리포스페이트로 대체되었다. 잔여 주형 DNA는 DNaseI를 사용하여 소화되었다. 후속적으로, mRNA는 암모늄 아세테이트 침전에 의해 정제된 다음 70% 에탄올을 사용한 세척 단계가 수행되었다.

캡핑되지 않은 잔류 mRNA의 탈인산화는 신속 탈인산화 키트를 사용하여 수행한 후 암모늄 아세테이트 침전을 통한 정제에 이어 70% 에탄올을 사용한 세척 단계 및 100 MWCO 컷 오프 필터를 사용한 한외여과를 수행하였다.

mRNA는 폴리(A) 폴리머라제를 사용함으로써 추가로 폴리아데닐화되었다. 다시 mRNA를 암모늄 아세테이트 침전에 의해 정제한 다음 70% 에탄올을 사용한 세척 단계 및 100 MWCO 컷 오프 필터를 사용한 한외여과를 수행하였다. 폴리(A) 길이는 모세관 겔 전기영동에 의해 100개 내지 250개의 뉴클레오티드인 것으로 결정되었다.

c. 시딩, 형질감염 및 판독

세포를 처리 24시간 전에 96-웰 블랙 마이크로플레이트 (웰당 25,000개 세포)에 시딩하였다. 시딩 후 24시간에 신선한 배지를 각각의 웰에 부가하였다 (100 μL). mRNA는 1:1.5 (w/v)의 RNA 대 리포펙타민 비율로 리포펙타민® 메신저맥스™를 사용하여 형질감염되었다. 250 ng/96-웰 (

758 ng/cm²) eGFP-CCDC40 (ETH031T28 또는 ETH031T30) 또는 HA-CCDC40-T2A-tdTomato (ETH031T26) mRNA가 이용되었다. 모든 RNA는 1 mg/mL의 스톡 농도를 갖고 있었다. 리포플렉스 형성을 위해, mRNA를 아쿠아 비데스트에 희석하였다. 리포펙타민® 메신저맥스™를 SFM (무혈청 배지)에 희석하고 피펫팅하여 혼합하였다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후, RNA 용액을 리포펙타민® 메신저맥스™ 용액에 부가하고, 혼합하며 실온에서 5분 더 인큐베이션하였다. 그 후, 웰에 리포플렉스 용액을 부가하기 전에 상기 믹스를 SFM에서 2배로 희석하였다. 표 14에서는, 하나의 RNA에 대한 예가 계산되었다.

표 14

형질감염 후 6시간 및 24시간에, 형질감염 효율을 형광 현미경검사에 의해 검사하고, 사진을 10x 배율로 촬영하였다.

IV. CCDC39

연구 중인 mRNA (ETH047T02; 서열식별번호: 12)는 hCCDC39를 코딩하였고 에트리스 최소 UTR을 포함하였다. 전체적으로, 15%의 우리딘-5'-트리포스페이트가 5-메틸-우리딘-5'-트리포스페이트로 대체되었고, 총 3%의 시티딘-5'-트리포스페이트가 5-아이오도-시티딘-5'-트리포스페이트로 대체되었다. 사용된 항체가 표 15에 제시된다.

표 15

1. 침지 세포 배양물에서의 CCDC39 형질감염 및 웨스턴 블롯

a. 세포 배양

BEAS-2B 세포는 코팅된 플라스크의 LHC-9 배지에서 배양되었다. 자세한 내용은 상기 I 1을 참조한다. 실험은 코팅되지 않은 플레이트에서 수행되었다.

HEK-293 세포를 열 불활성화 FBS 및 페니실린/스트렙토마이신 (P/S)이 보충된 MEM GlutaMax 배지에서 배양하였다.

시딩하기 전에, 세포를 DPBS로 세척하고 트립신을 사용하여 분리하였다. 트립신 처리 후, 트립신은 BEAS-2B에 대한 트립신 억제제를 사용하거나 또는 HEK-293에 대한 FBS를 함유하는 배양 배지를 사용하여 불활성화되었다. 따라서, 트립신 억제제/배양 배지의 동일하거나 더 큰 용적이 사용되었다. 1100x g에서 5분 동안 원심분리하고 정상 성장 배지에서 재현탁한 후, 카운테스 세포 계수 장치를 사용하여 세포를 계수하였다. 2 mL의 시딩 용적 및 6-웰 플레이트 형식을 고려하면, 5.0x10⁵개의 시딩된 BEAS-2B 세포 및 1.4x10⁶개의 시딩된 HEK-293 세포가 수득되었다.

b. 형질감염

세포는 처리 24시간 전에 각각의 밀도로 시딩되었다. 시딩 후 24시간에, 2 mL의 신선한 배지를 각각의 웰에 부가하였다. mRNA는 1:1.5 (w/v)의 RNA 대 리포펙타민 비율로 리포펙타민® 메신저맥스™를 사용하여 형질감염되었다. 모든 RNA는 1 mg/mL의 스톡 농도를 갖고 있었다. 리포플렉스 형성을 위해, mRNA를 아쿠아 비데스트에 희석하였다. 리포펙타민® 메신저맥스™를 SFM에 희석하고 피펫팅하여 혼합하였다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후, RNA 용액을 리포펙타민® 메신저맥스™ 용액에 부가하고, 혼합하며 실온에서 5분 더 인큐베이션하였다. 그 후, 웰에 리포플렉스 용액을 부가하였다. 표 16에서는, 형질감염에 대한 예가 하나의 6-웰 플레이트에 대해 계산되었다.

표 16

c. 세포 용해

최적의 세포 용해를 수득하기 위해, 2가지 상이한 용해 완충제, 즉 트리톤 X-100 완충제와 상업적으로 이용가능한 용해 완충제 M-PER™을 비교하였으며, 둘 다는 프로테아제 억제제 컴플리트, EDTA-무함유, 및 40 μL/mL DNase I 용액 (23:1:1으로 혼합됨)으로 보충되었다. 따라서, 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고 6시간 및 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 수거하였다. 따라서, 플레이트는 1 mL DPBS를 사용하여 1회 세척되었다. 플레이트로부터 세포를 제거하기 위해, 또 다른 1 mL의 DPBS를 부가하고 세포를 플레이트로부터 긁어내어 에펜도르프 튜브로 옮겼다. DPBS를 제거하기 위해, 세포를 4℃에서 2분 동안 6250x g에서 원심분리하였다. 세포 용해는 200 μL의 각각의 완충제를 부가함으로써 수행되었다. 완전한 용해를 보장하기 위해, 세포를 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 용해 후, 하기 변화를 수반한 제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 검정 키트를 사용하여 총 단백질 농도를 결정하기 위해 BCA 검정을 수행하였다:

● 200 μL 작업 시약을 5 μL 세포 용해물에 부가하였다

● 샘플 및 표준은 삼중으로 측정되었다

● 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하기 전에, 플레이트를 450 rpm에서 30초 동안 진탕시켰다.

d. 샘플 제조

샘플을 5 μL 볼트® LDS 샘플 완충제 및 2 μL 볼트® 샘플 환원제와 혼합한 다음 70℃에서 10분 동안 가열한 후 SDS-PAGE를 수행하였다. SDS-PAGE에 대해서는 30 μg의 총 단백질이 사용되었고, 볼트™ 4-12% SDS-PAGE 겔, 10 웰이 이용되었다.

e. SDS Page 및 블롯팅 방법

트랜스-블롯® 터보™ 전달 시스템을 사용하였다. SDS-PAGE는 200 V를 40분 동안 인가하여 수행하였다. 트랜스블롯® 터보™ 전달 시스템을 30분 동안 사용하여 전달을 수행하였다.

f. 항체 및 차단 방법

전달 후, 막을 실온에서 1시간 동안 차단하였다. NET-젤라틴을 차단 시약으로서 사용하였다. 아틀라스 항체로부터의 항체 HPA035364는 CCDC39의 검출에 사용되었고, 압캠(abcam)으로부터의 항체 ab8227은 액틴의 검출에 사용되었다. 항체를 부가하기 전에 막을 약 60 kDa에서 커팅하였다. 막을 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 실온에서 차단 용액으로 3회 세척 (각각 10분)한 후, 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 부가하였다 (1:20,000 희석됨). 막을 각각 10분 동안 실온에서 차단 용액으로 다시 3회 세척하였다.

g. 화학발광 신호 발생

신호는 화학발광 기질 키트 [신호 강도에 따라 루미나타 크레센도(Luminata Crescendo), 클래시코(Classico) 또는 포르테 웨스턴(Forte Western) HRP 기질] 및 케미독™ MP 시스템으로 시각화되었다.

2. 분화된 ALI 배양물에서의 내인성 CCDC39의 웨스턴 블롯

a. 세포 용해

250μL ALI 용해 완충제 (조성의 세부사항은 표 17을 참조함)를 삽입물마다 부가하고 얼음 위에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 전, 인큐베이션 동안 (5분마다) 및 인큐베이션 종료 시, ALI 용해 완충제를 앞뒤로 피펫팅하였다. 에펜도르프 튜브로 옮기고 150 μL ALI 용해 완충제로 각각의 삽입물을 세정한 후, 샘플을 완전히 와동시켰다. 이러한 단계에서, 샘플은 추가 프로세싱이 있을 때까지 임의로 -20℃ 하에 저장할 수 있었다.

표 17

b. 전체 세포 용해물로부터 축사 용해물의 분리

샘플을 용해 매트릭스 A 튜브에 부가하였다 (튜브는 이전에 70% EthOH로 세척되었고 석류석은 제거됨). 튜브를 단단히 잠그고, 튜브를 이동시키면서 액체 질소에서 20초 동안 동결시켰다. 튜브를 MP 패스트프렙-24 (HOM-1) 내로 신속하게 삽입하였다, 설정: 6.5 m/s, 3x 1분. 후속적으로, 튜브를 얼음 위에서 15분 동안 응축시킨 후 액체를 신선한 에펜도르프 튜브로 옮기고 1100 rpm, 4℃에서 20분 동안 회전시켰다. 상층액을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮기고 펠렛과 상층액을 추가 프로세싱이 있을 때까지 -20℃ 하에 저장하였다.

c. 축사 추출물 용해물의 제조: 섬모 축사 단백질의 고염 추출

각각의 펠릿을 50 μl MMRB + 0.1% 트리톤 X-100 (MMRB + 0.1% 트리톤X-100의 조성에 대한 자세한 내용은 표 18을 참조함)에 재현탁시키고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다 (가끔 부드러운 와동을 수반함). 4℃에서 14,000 rpm으로 10분간 회전시킨 후, 상층액을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮기고 추가 프로세싱이 있을 때까지 -20℃ 하에 저장하였다.

표 18

표 19

d. 웨스턴 블롯을 위한 용해물의 제조

샘플을 얼음 위에서 해동하고 30 μl의 샘플을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 12 μL LDS 샘플 완충제 및 5 μl 10x 환원제를 부가한 후, 샘플을 70℃, 350 rpm에서 10분 동안 가열하였다. 웰당 5, 10 및 30 μl를 볼트™ 4-12% SDS-PAGE 겔, 10 웰에 적용하였다.

e. SDS Page 및 블롯팅 방법: IV 1 e 참조

f. 항체 및 차단 방법: IV 1 f 참조

g. 화학발광 신호 발생: IV 1 g 참조

II. 결과

CCDC40 발현은 형질감염 후 6시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 144시간에 HEK293 세포에서 결정되었다. 특히, 2/1.4/0.3/0.2/0.05x10⁶개 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고, 리포펙타민® 2000을 사용하여 상이한 CCDC40 구축물 (2.5 μg/9.5cm²)로 시딩한 후 24시간에 세포를 형질감염시켰다. 이러한 실험에 사용된 CCDC40 mRNA 구축물은 T06 내지 T10 (서열식별번호: 1, 및 서열식별번호: 5 내지 서열식별번호: 8)이었다. 형질감염 후 6, 24, 48, 72 및 144시간에 세포 용해를 수행하고 50 μg의 총 단백질 용해물을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, HEK 세포에서 CCDC40 mRNA의 형질감염 후 6시간에 피크 번역 효율이 검출가능하였다.

그 다음 실험은, 이러한 경우에 2x10⁶개 HEK293 세포, 7.5x10⁵개 BEAS-2B 세포 및 5x10⁵개 RPMI 2650 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 단백질 용해물을 분석한 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같이 수행되었다 (HEK293: 50 μg, RPMI 2650: 20 μg, BEAS-2B: 30 μg의 총 용해물). CCDC40은 아틀라스 항체 (1:2000)로부터의 항-CCDC40 항체 (HPA022974)를 사용하여 검출되었다.

여기에서, T09 (CYBA; 서열식별번호: 1) 및 T10 (인간 성장 호르몬 서열식별번호: 8로부터의 인간 CMV IE9 및 3' UTR) UTR이 BEAS-2B, RPMI2650 및 HEK293 세포에서 형질감염 후 6시간에 가장 높은 번역 효율을 유도한다는 것을 관찰할 수 있었다 (도 2).

그런 다음 환자 유래 ALI 배양물에서 섬모 운동성의 회복을 조사하기 위해 2가지 실험을 수행하였다. 특히, 제1 실험에서는 미분화된 ALI 배양물 (데이터는 제시되지 않음)이 사용된 반면 (섬모 세포는 엑손 1 및 2가 결실되어 섬모가 매우 짧고 운동성이 적음), 제2 실험에서는 분화된 ALI 배양물이 사용되었다. 두 경우 모두에서, ALI 배양물을 총 16번의 형질감염을 위해 1개월 동안 격일로 3 μg LF92/CCDC40 (ETH031T09; 서열식별번호: 1)으로 형질감염시켰다. 판독으로서, 고속 비디오 현미경검사 (HSVM)를 24시간마다 수행하고 면역 형광 면역세포화학 (IF-ICC)을 수행하였다. 형질감염 전 및 형질감염 후 24시간마다, 비디오 (삽입물당 20개)를 촬영하고 SAVA 소프트웨어를 사용하여 CFB (섬모 박동 주파수)를 계산하였다. 총 16번의 형질감염 (1개월)이 수행되었다. 37℃에서 40x 배율을 사용하여 측정을 수행하였다. 섬모 박동 주파수 (CBF)의 평균값이 계산된다.

LF92/CCDC40의 반복된 형질감염은 환자 유래 완전히 분화된 ALI 배양물에서 내약성이 우수하였다. CCDC40 단백질은 IF-ICC에 의해 22일 후에 기도 상피 세포의 자연적으로 발생하는 세포하 영역, 즉 섬모에서 검출될 수 있었고 섬모 운동성은 LF92/CCDC40 형질감염 후 제18일까지 정상 섬모 박동 주파수의 ~50%까지 증가하였으며, 이는 분화된 ALI 배양물을 사용한 실험에 대한 도 3에서 볼 수 있는 바와 같다.

재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이, 배지 G를 사용하여 미분화된 ALI 배양물을 수득하였고, 에어-리프트 후 18일에 형질감염 (TF)을 시작하였다. CCDC40 mRNA/LF92를 사용한 CCDC40 환자 ALI 배양물의 형질감염 (TF)은 4주 동안 1주에 1회 수행되었다 (= 4x TF). 점액섬모 청소 (MCC)는 0.5 μm 형광 비드를 사용하여 20x 배율로 측정되었다. 상이한 영역의 30초 비디오는 마지막 TF 후 1주일에 니콘으로부터의 폴라그래프 소프트웨어로 촬영 및 분석된다.

중요하게도, 4회 매주 CCDC40 mRNA/LF92 형질감염 후 CCDC40 환자 ALI에서 섬모 박동의 회복이 검출될 수 있었다. 더욱이, 섬모 박동이 동기화되어, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이 지향성 입자 수송이 허용되었다. 비교를 위해, 입자 수송은 대조군, 즉 4배 tdTomato mRNA/LF111 형질감염 및 건강한 대조군의 경우 도 5에 제시되어 있다.

따라서, 섬모 세포의 분화기 동안 tdTomato 대조군과의 비교에 의해 나타난 바와 같이, LF92를 사용한 환자 ALI 배양물의 성공적인 CCDC40 mRNA/LF92 TF는 성공적인 섬모 성장, 성공적인 섬모 박동, 성공적인 지향성 입자 수송 및 성공적인 단백질 검출을 초래하였다 (CCDC40의 결합 파트너로서의 CCDC39 + DRC 복합체의 일부로서의 GAS8/DNALI1). 더욱이, tdTomato 대조군 삽입물은 상기 언급된 효과 중 어떠한 것도 나타내지 않았다.

도 6은 대조군 (tdTomato mRNA) 처리된 환자 ALI에 없는 건강한 대조군에서와 같이 CCDC40 mRNA로 반복하여 환자 ALI 처리한 후 축사 내의 GAS8 단백질의 성공적인 혼입을 명확하게 보여준다. 도 7은 대조군 (tdTomato mRNA) 처리된 환자 ALI에 없는 건강한 대조군에서와 같이 CCDC40 mRNA로 반복하여 환자 ALI 처리한 후 축사 내의 DNALI-1 단백질의 성공적인 혼입을 명확하게 보여준다. 도 8은 대조군 (tdTomato mRNA) 처리된 환자 ALI에 없는 건강한 대조군에서와 같이 CCDC40 mRNA로 반복하여 환자 ALI 처리한 후 축사 내의 CCDC39 단백질의 성공적인 혼입을 명확하게 보여준다.

요약하면, 섬모 운동성은 분화된 ALI 배양물을 사용할 때 유의미한 수준으로 회복될 수 없었지만, 분화된 ALI 배양물을 사용할 때 부분적으로 회복되었다.

CCDC39 실험과 관련하여, CCDC39 단백질은 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이 HEK-293 및 BEAS-2B 세포에서 형질감염 후 6시간 및 24시간에 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출될 수 있었다. 도 11에 제시된 바와 같이, CCDC39 (ETH047T03; 서열식별번호: 13) 발현은 프로테아솜 억제제를 사용하여 16HBE14o-에서 6시간 후에 검출될 수 있었다. ETH047T02 (서열식별번호: 12), ETH047T04 (서열식별번호: 2), 및 ETH047T05 (서열식별번호: 14)에 대해서도 동일한 실험을 또한 수행하여 유사한 결과를 수득하였다. 도 12에 제시된 바와 같이, CCDC39 (ETH047T03; 서열식별번호: 13) 발현은 또한 프로테아솜 억제제를 사용하여 16HBE14o-에서 24시간 후에 검출될 수 있었다.

본 출원에 기재된 예시적인 서열이 하기에 제공된다. 본 개시내용은 일부 실시양태에서, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 2에 제시된 UTR 서열, 또는 이러한 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드, 또는 전술한 것 중 임의의 것에 상응하거나 이에 의해 코딩되는 폴리리보뉴클레오티드 서열, 예컨대 mRNA를 제공한다. 전술한 것 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리리보뉴클레오티드는 변형된다 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 뉴클레오티드 유사체를 포함함).

SEQUENCE LISTING <110> ethris GmbH <120> TREATMENT OF CILIOPATHIES <130> AB3066 PCT S3 <150> EP 19 15 7210.6 <151> 2019-02-14 <160> 14 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 3546 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCDC40 sequence with CYBA 5’ and 3’ UTR (ETH031T09) - codon optimized sequence encoding a functional version of a human CCDC40 protein <400> 1 gggagaccgc gccuagcagu gucccagccg gguucguguc gccgccacca uggcugaacc 60 uggcggagcc gccggaagau cccacccuga agauggcucu gccagcgagg gcgagaaaga 120 gggcaacaac gagagccaca uggugucccc cccagagaag gacgacggcc agaaaggcga 180 agaggccgug ggcucuaccg agcacccuga ggaagugacc acacaggccg aggccgccau 240 ugaagagggc gagguggaaa cagagggcga agccgcugug gaaggcgaag aggaagccgu 300 gucuuacggc gacgccgaga gcgaggaaga guacuacuac accgagacaa gcagccccga 360 gggccagauc ucugccgccg auaccaccua ccccuacuuc agccccccuc aggaacugcc 420 uggggaagag gccuacgaua gcguguccgg cgaagcuggc cugcagggcu uucagcagga 480 agccacaggc ccucccgaga gccgggaaag aagagugaca agccccgagc cuagccacgg 540 cgugcuggga ccaucugagc agaugggcca agugaccucu ggcccugcug ugggcagacu 600 gacaggcagc acagaggaac cucagggcca ggugcugccu augggagugc agcaccgguu 660 cagacugagc cacggcagcg acaucgagag cagcgaccug gaagaguucg ucagccagga 720 acccgugauc ccuccuggcg ugccagaugc ccaucccagg gaaggcgauc ugcccguguu 780 ccaggaccag auccagcagc ccucuaccga agagggggcu auggccgaga gaguggaaag 840 cgagggcucc gacgaagaag ccgaggacga gggaucucag cugguggugc uggaccccga 900 ccacccucug auggugcggu uucaggccgc ccugaagaac uaccugaacc ggcagaucga 960 gaagcugaaa cuggaccugc aggaacuggu gguggccaca aagcagagca gagcccagag 1020 acaggaacug ggcgugaacc uguacgaggu gcagcagcau cuggugcauc ugcagaagcu 1080 gcuggaaaag agccacgacc ggcacgccau ggccagcucu gagcgcagac agaaagagga 1140 agaacugcag gccgccagag cccuguacac caagacaugc gccgcugcca acgaggaacg 1200 gaagaagcug gcugcccugc agaccgagau ggaaaaccug gcucugcacc uguucuacau 1260 gcagaauauc gaccaggaca ugcgggacga caucagagug augacccagg ucgugaagaa 1320 ggccgagaca gagagaaucc gggccgagau ugagaagaaa aagcaggacc uguacgugga 1380 ccagcugacc accagggccc agcagcugga agaggauauc gcccuguucg aggcccagua 1440 ccuggcccag gccgaagaua cccggauccu gagaaaggcc guguccgagg ccugcaccga 1500 gaucgaugcc aucagcgugg aaaagcggcg gaucaugcag cagugggcca gcagccucgu 1560 gggcaugaag cacagagaug aggcccaccg ggccgugcug gaagcucuga gaggcuguca 1620 gcaccaggcc aagagcaccg acggcgagau cgaggccuac aagaaaucca ucaugaagga 1680 agaggaaaag aacgagaaac uggccagcau ccugaacaga accgaaaccg aggccacccu 1740 gcugcagaaa cugaccaccc agugccugac caaacaggug gcccugcagu cccaguucaa 1800 caccuacaga cugacccugc aggacaccga ggacgcccug agucaggauc agcuggaaca 1860 gaugauucug accgaggaac ugcaggcuau ccggcaggcc auucaggggg agcuggaacu 1920 gcggagaaag accgacgccg ccaucagaga gaagcugcag gaacacauga ccagcaacaa 1980 gaccaccaag uacuucaacc agcugauucu gcgccugcag aaagaaaaga ccaacaugau 2040 gacacaccug agcaagauca acggcgacau ugcccagacc acccuggaca ucacccacac 2100 cagcagcaga cuggacgccc accagaaaac ccugguggaa cuggaccagg augugaagaa 2160 agugaacgag cugaucacca acagccagag cgagaucagc cggcggacca uccugaucga 2220 gagaaagcag ggccugauca acuuccugaa caaacagcug gaaagaaugg uguccgagcu 2280 gggcggcgag gaagugggac cucuggaacu ggaaaucaag cggcugagca agcugaucga 2340 cgagcacgac ggcaaggccg ugcaggcuca agugacaugg cugcggcugc agcaggaaau 2400 ggucaaagug acccaggaac aggaagaaca gcuggccucc cuggacgcca gcaagaaaga 2460 acugcacauc auggaacaga aaaagcugcg gguggaaagc aagaucgagc aggaaaaaaa 2520 agaacagaaa gaaaucgagc accacaugaa ggaccuggac aacgaccuga agaaacugaa 2580 uaugcugaug aacaagaacc gcugcuccag cgaagaacug gaacagaaca acagagugac 2640 cgagaacgag uucgugcgga gccugaaggc cagcgagcgg gaaaccauca agaugcagga 2700 caagcugaac cagcuguccg aggaaaaagc cacacugcug aaccagcugg uggaagccga 2760 gcaccagauc augcuguggg agaagaagau ccagcuggcc aaagaaaugc ggagcagcgu 2820 ggacagcgag aucggccaga ccgaaaucag agccaugaag ggcgagaucc accggaugaa 2880 agugcggcug ggacagcugc ugaaacagca ggaaaagaug auccgggcca uggaacuggc 2940 cguggccaga cgggaaaccg ugacaaccca ggcugagggc cagcggaaga uggacagaaa 3000 ggcccugacc cggaccgacu uccaccacaa gcagcuggaa cugaggcgga agauccggga 3060 cgugcggaag gccaccgaug agugcacaaa gacagugcug gaacuggaag agacacagcg 3120 gaacgugucc uccagccugc uggaaaaaca ggaaaagcug agcgugaucc aggccgacuu 3180 cgacacccug gaagcugacc ugacaagacu gggagcccug aaaagacaga accuguccga 3240 gaucguggca cugcagaccc ggcugaaaca ucugcaggcu gugaaagagg gacgcuacgu 3300 guuccuguuc agauccaagc agucucuggu gcuggaaaga cagcggcugg acaagcggcu 3360 ggcacugauu gccaccaucc uggauagagu gcgcgacgag uacccacagu uccaggaagc 3420 acugcacaag gugucccaga ugaucgccaa caagcuggaa uccccuggcc ccagcugacc 3480 ucgccccgga ccugcccucc cgccaggugc acccaccugc aauaaaugca gcgaagccgg 3540 gauucg 3546 <210> 2 <211> 3063 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCDC39 sequence with CYBA UTRs (ETH047T04) - codon optimized sequence encoding a functional version of a human CCDC39 protein <400> 2 gggagaccgc gccuagcagu gucccagccg gguucguguc gccgccacca ugagcagcga 60 guuucuggcc gaacugcacu gggaggacgg cuucgcuauu cccguggcca acgaggaaaa 120 caagcugcug gaagaucagc ugagcaagcu gaaggacgag agagccucuc ugcaggacga 180 gcugagagag uacgaggaac ggaucaacag caugaccagc cacuucaaga acgugaagca 240 agagcugagc aucacccaga gccugugcaa ggccagagag agagaaaccg agagcgagga 300 acacuucaag gcuaucgccc agcgcgagcu gggaagagug aaggaugaga uccagcggcu 360 ggaaaacgag auggccagca uccuggaaaa gaaguccgac aaagagaacg gcaucuucaa 420 ggccacacag aagcuggacg gccugaagug ccagaugaac ugggaucagc aggcccugga 480 agccuggcug gaagagucug cccacaagga uucugacgcc cugacacugc agaaguacgc 540 ccagcaggac gacaacaaga uccgggcucu gacccugcag cuggaaagac ugacccugga 600 augcaaccag aagcggaaga uccuggacaa cgagcugacc gagacaauca gcgcccagcu 660 ggaacuggau aaggccgcuc aggacuucag aaagauccac aacgagcggc aagaacugau 720 caagcagugg gagaacacca ucgagcagau gcagaaacgc gacggcgaca ucgacaacug 780 cgcccuggaa cucgcccgga ucaagcaaga gacacgcgag aaagagaacc uggucaaaga 840 gaagaucaag uuccucgagu ccgagaucgg caacaacacc gaguucgaga agcggaucag 900 cguggccgac agaaagcugc ugaagugcag aaccgccuac caggaccacg agacaagccg 960 gauucagcuc aagggcgagc uggauucucu gaaggccacc gugaacagaa ccagcagcga 1020 ucuggaagcc cugcggaaga acaucagcaa gaucaagaag gacauccacg aggaaaccgc 1080 caggcugcag aaaacaaaga accacaauga gaucauccag accaagcuga aagagaucac 1140 cgaaaagacc augagcgugg aagagaaggc cacaaaccug gaagauaugc ucaaagagga 1200 agagaaagac gucaaagagg uggacguuca acugaaccug auuaagggcg ugcuguucaa 1260 gaaggcccaa gagcugcaga ccgaaaccau gaaggaaaag gccguccugu cugagaucga 1320 gggcaccaga ucuagccuga agcaccugaa ccaucagcug cagaagcucg acuucgagac 1380 acugaagcag caagagauca uguacagcca ggauuuccac auccagcagg ucgagcggcg 1440 gaugucuaga cugaagggcg agaucaacuc cgaggaaaaa caggcccucg aggccaagau 1500 cguggaacug agaaagagcc ucgaagagaa gaagucuacc ugcggccugc uggaaaccca 1560 gauuaagaag cugcacaacg accuguacuu caucaagaaa gcccacagca agaacagcga 1620 cgagaagcag agccugauga ccaagaucaa ugagcugaac cuguucaucg aucggagcga 1680 aaaagagcug gacaaggcca agggcuucaa gcaggaccug augaucgagg acaaccugcu 1740 gaagcuggaa gugaagcgga ccagagagau gcugcacagc aaggccgagg aagugcuguc 1800 ucuggaaaag cggaagcagc agcuguacac cgccauggaa gagagaaccg aagagaucaa 1860 ggugcacaag accaugcugg cuucccagau 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caccagcacc ucuaccagcc aguccagcau 2760 uaaggugcug gaacucaagu uccccgccag cucuagccuc gugggaagcc cuucuagacc 2820 uagcagcgcc ucuagcagcu ccagcaacgu gaaguccaag aaaagcucca agugaccucg 2880 ccccggaccu gcccucccgc caggugcacc caccugcaau aaaugcagcg aagccgggau 2940 ucgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060 aaa 3063 <210> 3 <211> 1644 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized sequence encoding a functional version of a tdTomato protein <400> 3 gggagaccca agcuggcuag cguuuaaacu uaagcuuggu accgcgggcc cgggauccac 60 cggucgccac cauggugagc aagggcgagg aggucaucaa agaguucaug cgcuucaagg 120 ugcgcaugga gggcuccaug aacggccacg aguucgagau cgagggcgag ggcgagggcc 180 gccccuacga gggcacccag accgccaagc ugaaggugac caagggcggc ccccugcccu 240 ucgccuggga cauccugucc ccccaguuca uguacggcuc caaggcguac gugaagcacc 300 ccgccgacau ccccgauuac aagaagcugu ccuuccccga gggcuucaag ugggagcgcg 360 ugaugaacuu cgaggacggc ggucugguga ccgugaccca ggacuccucc cugcaggacg 420 gcacgcugau cuacaaggug aagaugcgcg gcaccaacuu cccccccgac ggccccguaa 480 ugcagaagaa gaccaugggc ugggaggccu ccaccgagcg ccuguacccc cgcgacggcg 540 ugcugaaggg cgagauccac caggcccuga agcugaagga cggcggccac uaccuggugg 600 aguucaagac caucuacaug gccaagaagc ccgugcaacu gcccggcuac uacuacgugg 660 acaccaagcu ggacaucacc ucccacaacg aggacuacac caucguggaa caguacgagc 720 gcuccgaggg ccgccaccac cuguuccugg ggcauggcac cggcagcacc ggcagcggca 780 gcuccggcac cgccuccucc gaggacaaca acauggccgu caucaaagag uucaugcgcu 840 ucaaggugcg cauggagggc uccaugaacg gccacgaguu cgagaucgag ggcgagggcg 900 agggccgccc cuacgagggc acccagaccg ccaagcugaa ggugaccaag ggcggccccc 960 ugcccuucgc cugggacauc cugucccccc aguucaugua cggcuccaag gcguacguga 1020 agcaccccgc cgacaucccc gauuacaaga agcuguccuu ccccgagggc uucaaguggg 1080 agcgcgugau gaacuucgag gacggcgguc uggugaccgu gacccaggac uccucccugc 1140 aggacggcac gcugaucuac aaggugaaga ugcgcggcac caacuucccc cccgacggcc 1200 ccguaaugca gaagaagacc augggcuggg aggccuccac cgagcgccug uacccccgcg 1260 acggcgugcu gaagggcgag auccaccagg cccugaagcu gaaggacggc ggccacuacc 1320 ugguggaguu caagaccauc uacauggcca agaagcccgu gcaacugccc ggcuacuacu 1380 acguggacac caagcuggac aucaccuccc acaacgagga cuacaccauc guggaacagu 1440 acgagcgcuc cgagggccgc caccaccugu uccuguacgg cauggacgag cuguacaagu 1500 aggcggccaa uucugcagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaagc ggcc 1644 <210> 4 <211> 1327 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCIDAS sequence with Ethris’ minimal 5’ UTR and optional 3’ UTR - codon optimized sequence encoding a functional version of a human MCIDAS protein <400> 4 gggagacgcc accaugcaag cuuguggcgg cggagcugcu ggaagaaggg ccuucgauag 60 caucugcccc aaccggaugc uugcccuucc ugguagagcc cugcugugca agccuggcaa 120 gcccgagaga aaguucgccc cuccaagaaa guucuucccc ggcuguacug gcggcagccc 180 ugugucugug uaugaggacc cuccugaugc cgagccuaca gcucugccug cucugaccac 240 aaucgaccug caggaucugg ccgauugcag cucucugcug ggaucugaug cuccuccugg 300 cggagaucug gcugccucuc agaaucacag ccaccagaca gaggccgacu ucaaccugca 360 agacuuccgg gacaccgugg acgaccugau cagcgauagc agcagcauga ugagccccac 420 ucuggccagc ggcgauuucc cauucagccc cugugacauc agcccuuucg gcccuugucu 480 gagcccucca cuggauccua gagcacugca gagcccaccu cugaggccuc cagauguucc 540 uccaccugag caguacugga aagagguggc cgaccagaac cagagagcac ugggcgacgc 600 ucugguggaa aacaaccagc ugcacgugac ccugacacag aagcaagaag agaucgccag 660 ccugaaagaa cggaaugugc agcugaaaga gcuggccucc aggacaagac accuggccag 720 ugugcuggac aagcugauga ucacccagag cagagauugc ggagccgccg cugaaccuuu 780 ucugcugaag gccaaggcca agagaagccu ggaagaacug gugucugccg ccggacagga 840 uugcgcugaa guggaugcca uccugcgcga gaucagcgag agaugugaug aggcccugca 900 gagcagggac cccaaaagac cuagacugcu gcccgagccu gccaacaccg auaccagacc 960 uggaaaucug cacggcgccu ucagaggccu gagaaccgau ugcucuagaa gcgcccugaa 1020 ccugagccac agcgaacucg aagaaggcgg cagcuucagc acccggauca gaagccacag 1080 caccaucaga acccuggccu uuccacaggg caacgccuuc acaaucagaa ccgccaacgg 1140 cggcuacaag uucagauggg ugccaagcug agcuagccac cgggcaauac gagcucaagc 1200 cagucucaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaa 1327 <210> 5 <211> 3446 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence with Ethris’ minimal 5’ UTR (ETH031T06) - codon optimized sequence encoding a functional version of a human CCDC40 protein <400> 5 gggagacgcc accauggcug aaccuggcgg agccgccgga agaucccacc cugaagaugg 60 cucugccagc gagggcgaga aagagggcaa caacgagagc cacauggugu cccccccaga 120 gaaggacgac ggccagaaag gcgaagaggc cgugggcucu accgagcacc cugaggaagu 180 gaccacacag gccgaggccg ccauugaaga gggcgaggug gaaacagagg gcgaagccgc 240 uguggaaggc gaagaggaag ccgugucuua cggcgacgcc gagagcgagg aagaguacua 300 cuacaccgag acaagcagcc ccgagggcca gaucucugcc gccgauacca ccuaccccua 360 cuucagcccc ccucaggaac ugccugggga agaggccuac gauagcgugu ccggcgaagc 420 uggccugcag 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ccagauccag cagcccucua ccgaagaggg ggcuauggcc gagagagugg aaagcgaggg 840 cuccgacgaa gaagccgagg acgagggauc ucagcuggug gugcuggacc ccgaccaccc 900 ucugauggug cgguuucagg ccgcccugaa gaacuaccug aaccggcaga ucgagaagcu 960 gaaacuggac cugcaggaac uggugguggc cacaaagcag agcagagccc agagacagga 1020 acugggcgug aaccuguacg aggugcagca gcaucuggug caucugcaga agcugcugga 1080 aaagagccac gaccggcacg ccauggccag cucugagcgc agacagaaag aggaagaacu 1140 gcaggccgcc agagcccugu acaccaagac augcgccgcu gccaacgagg aacggaagaa 1200 gcuggcugcc cugcagaccg agauggaaaa ccuggcucug caccuguucu acaugcagaa 1260 uaucgaccag gacaugcggg acgacaucag agugaugacc caggucguga agaaggccga 1320 gacagagaga auccgggccg agauugagaa gaaaaagcag gaccuguacg uggaccagcu 1380 gaccaccagg gcccagcagc uggaagagga uaucgcccug uucgaggccc aguaccuggc 1440 ccaggccgaa gauacccgga uccugagaaa ggccgugucc gaggccugca ccgagaucga 1500 ugccaucagc guggaaaagc ggcggaucau gcagcagugg gccagcagcc ucgugggcau 1560 gaagcacaga gaugaggccc accgggccgu gcuggaagcu cugagaggcu gucagcacca 1620 ggccaagagc accgacggcg agaucgaggc cuacaagaaa uccaucauga aggaagagga 1680 aaagaacgag aaacuggcca gcauccugaa cagaaccgaa accgaggcca cccugcugca 1740 gaaacugacc acccagugcc ugaccaaaca gguggcccug cagucccagu ucaacaccua 1800 cagacugacc cugcaggaca ccgaggacgc ccugagucag gaucagcugg aacagaugau 1860 ucugaccgag gaacugcagg cuauccggca ggccauucag ggggagcugg aacugcggag 1920 aaagaccgac gccgccauca gagagaagcu gcaggaacac augaccagca acaagaccac 1980 caaguacuuc aaccagcuga uucugcgccu gcagaaagaa aagaccaaca ugaugacaca 2040 ccugagcaag aucaacggcg acauugccca gaccacccug gacaucaccc acaccagcag 2100 cagacuggac gcccaccaga aaacccuggu ggaacuggac caggauguga agaaagugaa 2160 cgagcugauc accaacagcc agagcgagau cagccggcgg accauccuga ucgagagaaa 2220 gcagggccug aucaacuucc ugaacaaaca gcuggaaaga augguguccg agcugggcgg 2280 cgaggaagug ggaccucugg aacuggaaau caagcggcug agcaagcuga ucgacgagca 2340 cgacggcaag gccgugcagg cucaagugac auggcugcgg cugcagcagg aaauggucaa 2400 agugacccag gaacaggaag aacagcuggc cucccuggac gccagcaaga aagaacugca 2460 caucauggaa cagaaaaagc ugcgggugga aagcaagauc gagcaggaaa aaaaagaaca 2520 gaaagaaauc gagcaccaca ugaaggaccu ggacaacgac cugaagaaac ugaauaugcu 2580 gaugaacaag aaccgcugcu ccagcgaaga acuggaacag aacaacagag ugaccgagaa 2640 cgaguucgug cggagccuga aggccagcga gcgggaaacc aucaagaugc aggacaagcu 2700 gaaccagcug uccgaggaaa aagccacacu gcugaaccag cugguggaag ccgagcacca 2760 gaucaugcug ugggagaaga agauccagcu ggccaaagaa augcggagca gcguggacag 2820 cgagaucggc cagaccgaaa ucagagccau gaagggcgag auccaccgga ugaaagugcg 2880 gcugggacag cugcugaaac agcaggaaaa gaugauccgg gccauggaac uggccguggc 2940 cagacgggaa accgugacaa cccaggcuga gggccagcgg aagauggaca gaaaggcccu 3000 gacccggacc gacuuccacc acaagcagcu ggaacugagg cggaagaucc gggacgugcg 3060 gaaggccacc gaugagugca caaagacagu gcuggaacug gaagagacac agcggaacgu 3120 guccuccagc cugcuggaaa aacaggaaaa gcugagcgug auccaggccg acuucgacac 3180 ccuggaagcu gaccugacaa gacugggagc ccugaaaaga cagaaccugu ccgagaucgu 3240 ggcacugcag acccggcuga aacaucugca ggcugugaaa gagggacgcu acguguuccu 3300 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480 gauaccaccu accccuacuu cagccccccu caggaacugc cuggggaaga ggccuacgau 540 agcguguccg gcgaagcugg ccugcagggc uuucagcagg aagccacagg cccucccgag 600 agccgggaaa gaagagugac aagccccgag ccuagccacg gcgugcuggg accaucugag 660 cagaugggcc aagugaccuc uggcccugcu gugggcagac ugacaggcag cacagaggaa 720 ccucagggcc aggugcugcc uaugggagug cagcaccggu ucagacugag ccacggcagc 780 gacaucgaga gcagcgaccu ggaagaguuc gucagccagg aacccgugau cccuccuggc 840 gugccagaug cccaucccag ggaaggcgau cugcccgugu uccaggacca gauccagcag 900 cccucuaccg aagagggggc uauggccgag agaguggaaa gcgagggcuc cgacgaagaa 960 gccgaggacg agggaucuca gcugguggug cuggaccccg accacccucu gauggugcgg 1020 uuucaggccg cccugaagaa cuaccugaac cggcagaucg agaagcugaa acuggaccug 1080 caggaacugg ugguggccac aaagcagagc agagcccaga gacaggaacu gggcgugaac 1140 cuguacgagg ugcagcagca ucuggugcau cugcagaagc ugcuggaaaa gagccacgac 1200 cggcacgcca uggccagcuc ugagcgcaga cagaaagagg aagaacugca ggccgccaga 1260 gcccuguaca ccaagacaug cgccgcugcc aacgaggaac ggaagaagcu ggcugcccug 1320 cagaccgaga 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aagaccacca aguacuucaa 2040 ccagcugauu cugcgccugc agaaagaaaa gaccaacaug augacacacc ugagcaagau 2100 caacggcgac auugcccaga ccacccugga caucacccac accagcagca gacuggacgc 2160 ccaccagaaa acccuggugg aacuggacca ggaugugaag aaagugaacg agcugaucac 2220 caacagccag agcgagauca gccggcggac cauccugauc gagagaaagc agggccugau 2280 caacuuccug aacaaacagc uggaaagaau gguguccgag cugggcggcg aggaaguggg 2340 accucuggaa cuggaaauca agcggcugag caagcugauc gacgagcacg acggcaaggc 2400 cgugcaggcu caagugacau ggcugcggcu gcagcaggaa auggucaaag ugacccagga 2460 acaggaagaa cagcuggccu cccuggacgc cagcaagaaa gaacugcaca ucauggaaca 2520 gaaaaagcug cggguggaaa gcaagaucga gcaggaaaaa aaagaacaga aagaaaucga 2580 gcaccacaug aaggaccugg acaacgaccu gaagaaacug aauaugcuga ugaacaagaa 2640 ccgcugcucc agcgaagaac uggaacagaa caacagagug accgagaacg aguucgugcg 2700 gagccugaag gccagcgagc gggaaaccau caagaugcag gacaagcuga accagcuguc 2760 cgaggaaaaa gccacacugc ugaaccagcu gguggaagcc gagcaccaga ucaugcugug 2820 ggagaagaag auccagcugg ccaaagaaau gcggagcagc guggacagcg agaucggcca 2880 gaccgaaauc agagccauga agggcgagau ccaccggaug aaagugcggc ugggacagcu 2940 gcugaaacag caggaaaaga ugauccgggc cauggaacug gccguggcca gacgggaaac 3000 cgugacaacc caggcugagg gccagcggaa gauggacaga aaggcccuga cccggaccga 3060 cuuccaccac aagcagcugg aacugaggcg gaagauccgg gacgugcgga aggccaccga 3120 ugagugcaca aagacagugc uggaacugga agagacacag cggaacgugu ccuccagccu 3180 gcuggaaaaa caggaaaagc ugagcgugau ccaggccgac uucgacaccc uggaagcuga 3240 ccugacaaga cugggagccc ugaaaagaca gaaccugucc gagaucgugg cacugcagac 3300 ccggcugaaa caucugcagg cugugaaaga gggacgcuac guguuccugu ucagauccaa 3360 gcagucucug gugcuggaaa gacagcggcu ggacaagcgg cuggcacuga uugccaccau 3420 ccuggauaga gugcgcgacg aguacccaca guuccaggaa gcacugcaca agguguccca 3480 gaugaucgcc aacaagcugg aauccccugg ccccagcggc agcggcgagg gcagaggcag 3540 ccugcugacc ugcggcgacg uggaggagaa ccccggcccc auggugagca agggcgagga 3600 ggucaucaaa gaguucaugc gcuucaaggu gcgcauggag ggcuccauga acggccacga 3660 guucgagauc gagggcgagg gcgagggccg ccccuacgag ggcacccaga ccgccaagcu 3720 gaaggugacc aagggcggcc cccugcccuu cgccugggac auccuguccc cccaguucau 3780 guacggcucc aaggcguacg ugaagcaccc cgccgacauc cccgauuaca agaagcuguc 3840 cuuccccgag ggcuucaagu gggagcgcgu gaugaacuuc gaggacggcg gucuggugac 3900 cgugacccag gacuccuccc ugcaggacgg cacgcugauc uacaagguga agaugcgcgg 3960 caccaacuuc ccccccgacg gccccguaau gcagaagaag accaugggcu gggaggccuc 4020 caccgagcgc cuguaccccc gcgacggcgu gcugaagggc gagauccacc aggcccugaa 4080 gcugaaggac ggcggccacu accuggugga guucaagacc aucuacaugg ccaagaagcc 4140 cgugcaacug cccggcuacu acuacgugga caccaagcug gacaucaccu cccacaacga 4200 ggacuacacc aucguggaac aguacgagcg cuccgagggc cgccaccacc uguuccuggg 4260 gcauggcacc ggcagcaccg gcagcggcag cuccggcacc gccuccuccg aggacaacaa 4320 cauggccguc aucaaagagu ucaugcgcuu caaggugcgc auggagggcu ccaugaacgg 4380 ccacgaguuc gagaucgagg gcgagggcga gggccgcccc uacgagggca cccagaccgc 4440 caagcugaag gugaccaagg gcggcccccu gcccuucgcc ugggacaucc ugucccccca 4500 guucauguac ggcuccaagg cguacgugaa gcaccccgcc gacauccccg auuacaagaa 4560 gcuguccuuc cccgagggcu ucaaguggga gcgcgugaug aacuucgagg acggcggucu 4620 ggugaccgug acccaggacu ccucccugca ggacggcacg cugaucuaca aggugaagau 4680 gcgcggcacc aacuuccccc ccgacggccc cguaaugcag aagaagacca ugggcuggga 4740 ggccuccacc gagcgccugu acccccgcga cggcgugcug aagggcgaga uccaccaggc 4800 ccugaagcug aaggacggcg gccacuaccu gguggaguuc aagaccaucu acauggccaa 4860 gaagcccgug caacugcccg gcuacuacua cguggacacc aagcuggaca ucaccuccca 4920 caacgaggac uacaccaucg uggaacagua cgagcgcucc gagggccgcc accaccuguu 4980 ccuguacggc auggacgagc uguacaagug accucgcccc ggaccugccc ucccgccagg 5040 ugcacccacc ugcaauaaau gcagcgaagc cgggauucga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 5199 <210> 12 <211> 2963 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ETH047T02 (CCDC39 with Ethris’ minimal UTR) - codon optimized sequence encoding a functional version of a human CCDC39 protein <400> 12 gggagacgcc accaugagca gcgaguuucu ggccgaacug cacugggagg acggcuucgc 60 uauucccgug gccaacgagg aaaacaagcu gcuggaagau cagcugagca agcugaagga 120 cgagagagcc ucucugcagg acgagcugag agaguacgag gaacggauca acagcaugac 180 cagccacuuc aagaacguga agcaagagcu gagcaucacc cagagccugu gcaaggccag 240 agagagagaa accgagagcg aggaacacuu caaggcuauc gcccagcgcg agcugggaag 300 agugaaggau gagauccagc ggcuggaaaa cgagauggcc agcauccugg aaaagaaguc 360 cgacaaagag aacggcaucu ucaaggccac acagaagcug gacggccuga agugccagau 420 gaacugggau cagcaggccc uggaagccug gcuggaagag ucugcccaca aggauucuga 480 cgcccugaca cugcagaagu acgcccagca ggacgacaac aagauccggg cucugacccu 540 gcagcuggaa agacugaccc uggaaugcaa ccagaagcgg aagauccugg acaacgagcu 600 gaccgagaca aucagcgccc agcuggaacu ggauaaggcc gcucaggacu ucagaaagau 660 ccacaacgag cggcaagaac ugaucaagca gugggagaac accaucgagc agaugcagaa 720 acgcgacggc gacaucgaca acugcgcccu ggaacucgcc cggaucaagc aagagacacg 780 cgagaaagag aaccugguca aagagaagau caaguuccuc gaguccgaga ucggcaacaa 840 caccgaguuc gagaagcgga ucagcguggc cgacagaaag cugcugaagu gcagaaccgc 900 cuaccaggac cacgagacaa gccggauuca gcucaagggc gagcuggauu cucugaaggc 960 caccgugaac agaaccagca gcgaucugga agcccugcgg aagaacauca gcaagaucaa 1020 gaaggacauc cacgaggaaa ccgccaggcu gcagaaaaca aagaaccaca augagaucau 1080 ccagaccaag cugaaagaga ucaccgaaaa gaccaugagc guggaagaga aggccacaaa 1140 ccuggaagau augcucaaag aggaagagaa agacgucaaa gagguggacg uucaacugaa 1200 ccugauuaag ggcgugcugu ucaagaaggc ccaagagcug cagaccgaaa ccaugaagga 1260 aaaggccguc cugucugaga ucgagggcac cagaucuagc cugaagcacc ugaaccauca 1320 gcugcagaag cucgacuucg agacacugaa gcagcaagag aucauguaca gccaggauuu 1380 ccacauccag caggucgagc ggcggauguc uagacugaag ggcgagauca acuccgagga 1440 aaaacaggcc cucgaggcca agaucgugga acugagaaag agccucgaag agaagaaguc 1500 uaccugcggc cugcuggaaa cccagauuaa gaagcugcac aacgaccugu acuucaucaa 1560 gaaagcccac agcaagaaca gcgacgagaa gcagagccug augaccaaga ucaaugagcu 1620 gaaccuguuc aucgaucgga gcgaaaaaga gcuggacaag gccaagggcu ucaagcagga 1680 ccugaugauc gaggacaacc ugcugaagcu ggaagugaag cggaccagag agaugcugca 1740 cagcaaggcc gaggaagugc ugucucugga aaagcggaag cagcagcugu acaccgccau 1800 ggaagagaga accgaagaga ucaaggugca caagaccaug cuggcuuccc agaucagaua 1860 cguggaccaa gagcgcgaga acaucuccac cgaguuuaga gagagacugu ccaagaucga 1920 gaagcugaag aaccgcuacg agauccugac cgucgugaug cugccuccug agggcgaaga 1980 ggaaaagacc caggccuacu acgugaucaa ggcagcccaa gaaaaagagg aacuccagag 2040 agaaggcgac ugccuggacg ccaagauuaa caaggccgaa aaagaaaucu acgcccucga 2100 gaacacccug cagguccuga acagcugcaa caacaacuac aagcagagcu ucaagaaagu 2160 caccccuagc uccgacgagu acgagcugaa gauucagcug gaagaacaga aaagagccgu 2220 ggacgagaag uacagauaca agcagcggca gaucagagag cugcaagagg auauccagag 2280 cauggaaaac acccuggacg ugaucgagca ccuggccaac aacgugaaag agaagcuguc 2340 cgagaaacag gccuacagcu uucagcuguc caaagagaca gaggaacaga agcccaaacu 2400 ggaacgcgug accaagcagu gcgccaagcu gacaaaagag auccggcugc ugaaagacac 2460 caaggacgaa accauggaag aacaagacau caagcugcgc gagaugaagc aguuccacaa 2520 agugaucgac gagaugcugg uggacaucau ugaagagaac acagagaucc gcaucauccu 2580 gcagaccuau uuucagcaga gcggccugga acugccuacc gccucuacaa agggcagcag 2640 acagagcagc agauccccua gccacacaag ccugagcgcc agaagcucua gaagcaccag 2700 caccucuacc agccagucca gcauuaaggu gcuggaacuc aaguuccccg ccagcucuag 2760 ccucguggga agcccuucua gaccuagcag cgccucuagc agcuccagca acgugaaguc 2820 caagaaaagc uccaagugau ucgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2963 <210> 13 <211> 2964 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA encoding for human CCDC39 sequence and contains TISU element as 5’ UTR (ETH047T03) - codon optimized sequence encoding a functional version of a human CCDC39 protein <400> 13 gggagacugc caagaugagc agcgaguuuc uggccgaacu gcacugggag gacggcuucg 60 cuauucccgu ggccaacgag gaaaacaagc ugcuggaaga ucagcugagc aagcugaagg 120 acgagagagc cucucugcag gacgagcuga gagaguacga ggaacggauc aacagcauga 180 ccagccacuu caagaacgug aagcaagagc ugagcaucac ccagagccug ugcaaggcca 240 gagagagaga aaccgagagc gaggaacacu ucaaggcuau cgcccagcgc gagcugggaa 300 gagugaagga ugagauccag cggcuggaaa acgagauggc cagcauccug gaaaagaagu 360 ccgacaaaga gaacggcauc uucaaggcca cacagaagcu ggacggccug aagugccaga 420 ugaacuggga ucagcaggcc cuggaagccu ggcuggaaga gucugcccac aaggauucug 480 acgcccugac acugcagaag uacgcccagc aggacgacaa caagauccgg gcucugaccc 540 ugcagcugga aagacugacc cuggaaugca accagaagcg gaagauccug gacaacgagc 600 ugaccgagac aaucagcgcc cagcuggaac uggauaaggc cgcucaggac uucagaaaga 660 uccacaacga gcggcaagaa cugaucaagc agugggagaa caccaucgag cagaugcaga 720 aacgcgacgg cgacaucgac aacugcgccc uggaacucgc ccggaucaag caagagacac 780 gcgagaaaga gaaccugguc aaagagaaga ucaaguuccu cgaguccgag aucggcaaca 840 acaccgaguu cgagaagcgg aucagcgugg ccgacagaaa gcugcugaag ugcagaaccg 900 ccuaccagga ccacgagaca agccggauuc agcucaaggg cgagcuggau ucucugaagg 960 ccaccgugaa cagaaccagc agcgaucugg aagcccugcg gaagaacauc agcaagauca 1020 agaaggacau ccacgaggaa accgccaggc ugcagaaaac aaagaaccac aaugagauca 1080 uccagaccaa gcugaaagag aucaccgaaa agaccaugag cguggaagag aaggccacaa 1140 accuggaaga uaugcucaaa gaggaagaga aagacgucaa agagguggac guucaacuga 1200 accugauuaa gggcgugcug uucaagaagg cccaagagcu gcagaccgaa accaugaagg 1260 aaaaggccgu ccugucugag aucgagggca ccagaucuag ccugaagcac cugaaccauc 1320 agcugcagaa gcucgacuuc gagacacuga agcagcaaga gaucauguac agccaggauu 1380 uccacaucca gcaggucgag cggcggaugu cuagacugaa gggcgagauc aacuccgagg 1440 aaaaacaggc ccucgaggcc aagaucgugg aacugagaaa gagccucgaa gagaagaagu 1500 cuaccugcgg ccugcuggaa acccagauua agaagcugca caacgaccug uacuucauca 1560 agaaagccca cagcaagaac agcgacgaga agcagagccu gaugaccaag aucaaugagc 1620 ugaaccuguu caucgaucgg agcgaaaaag agcuggacaa ggccaagggc uucaagcagg 1680 accugaugau cgaggacaac cugcugaagc uggaagugaa gcggaccaga gagaugcugc 1740 acagcaaggc cgaggaagug cugucucugg aaaagcggaa gcagcagcug uacaccgcca 1800 uggaagagag aaccgaagag aucaaggugc acaagaccau gcuggcuucc cagaucagau 1860 acguggacca agagcgcgag aacaucucca ccgaguuuag agagagacug uccaagaucg 1920 agaagcugaa gaaccgcuac gagauccuga ccgucgugau gcugccuccu gagggcgaag 1980 aggaaaagac ccaggccuac uacgugauca aggcagccca agaaaaagag gaacuccaga 2040 gagaaggcga cugccuggac gccaagauua acaaggccga aaaagaaauc uacgcccucg 2100 agaacacccu gcagguccug aacagcugca acaacaacua caagcagagc uucaagaaag 2160 ucaccccuag cuccgacgag uacgagcuga agauucagcu ggaagaacag aaaagagccg 2220 uggacgagaa guacagauac aagcagcggc agaucagaga gcugcaagag gauauccaga 2280 gcauggaaaa cacccuggac gugaucgagc accuggccaa caacgugaaa gagaagcugu 2340 ccgagaaaca ggccuacagc uuucagcugu ccaaagagac agaggaacag aagcccaaac 2400 uggaacgcgu gaccaagcag ugcgccaagc ugacaaaaga gauccggcug cugaaagaca 2460 ccaaggacga aaccauggaa gaacaagaca ucaagcugcg cgagaugaag caguuccaca 2520 aagugaucga cgagaugcug guggacauca uugaagagaa cacagagauc cgcaucaucc 2580 ugcagaccua uuuucagcag agcggccugg aacugccuac cgccucuaca aagggcagca 2640 gacagagcag cagauccccu agccacacaa gccugagcgc cagaagcucu agaagcacca 2700 gcaccucuac cagccagucc agcauuaagg ugcuggaacu caaguucccc gccagcucua 2760 gccucguggg aagcccuucu agaccuagca gcgccucuag cagcuccagc aacgugaagu 2820 ccaagaaaag cuccaaguga uucgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2964 <210> 14 <211> 2993 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ETH047T05: SP30; RNA encoding for human CCDC39 and containing random sequence of 30 nucleotides (SP30) which was used as 5’ UTR - codon optimized sequence encoding a functional version of a human CCDC39 protein <400> 14 gggagacauu gaaauuuauc ucuuguguug uggucgcgcc accaugagca gcgaguuucu 60 ggccgaacug cacugggagg acggcuucgc uauucccgug gccaacgagg aaaacaagcu 120 gcuggaagau cagcugagca agcugaagga cgagagagcc ucucugcagg acgagcugag 180 agaguacgag gaacggauca acagcaugac cagccacuuc aagaacguga agcaagagcu 240 gagcaucacc cagagccugu gcaaggccag agagagagaa accgagagcg aggaacacuu 300 caaggcuauc gcccagcgcg agcugggaag agugaaggau gagauccagc ggcuggaaaa 360 cgagauggcc agcauccugg aaaagaaguc cgacaaagag aacggcaucu ucaaggccac 420 acagaagcug gacggccuga agugccagau gaacugggau cagcaggccc uggaagccug 480 gcuggaagag ucugcccaca aggauucuga cgcccugaca cugcagaagu acgcccagca 540 ggacgacaac aagauccggg cucugacccu gcagcuggaa agacugaccc uggaaugcaa 600 ccagaagcgg aagauccugg acaacgagcu gaccgagaca aucagcgccc agcuggaacu 660 ggauaaggcc gcucaggacu ucagaaagau ccacaacgag cggcaagaac ugaucaagca 720 gugggagaac accaucgagc agaugcagaa acgcgacggc gacaucgaca acugcgcccu 780 ggaacucgcc cggaucaagc aagagacacg cgagaaagag aaccugguca aagagaagau 840 caaguuccuc gaguccgaga ucggcaacaa caccgaguuc gagaagcgga ucagcguggc 900 cgacagaaag cugcugaagu gcagaaccgc cuaccaggac cacgagacaa gccggauuca 960 gcucaagggc gagcuggauu cucugaaggc caccgugaac agaaccagca gcgaucugga 1020 agcccugcgg aagaacauca gcaagaucaa gaaggacauc cacgaggaaa ccgccaggcu 1080 gcagaaaaca aagaaccaca augagaucau ccagaccaag cugaaagaga ucaccgaaaa 1140 gaccaugagc guggaagaga aggccacaaa ccuggaagau augcucaaag aggaagagaa 1200 agacgucaaa gagguggacg uucaacugaa ccugauuaag ggcgugcugu ucaagaaggc 1260 ccaagagcug cagaccgaaa ccaugaagga aaaggccguc cugucugaga ucgagggcac 1320 cagaucuagc cugaagcacc ugaaccauca gcugcagaag cucgacuucg agacacugaa 1380 gcagcaagag aucauguaca gccaggauuu ccacauccag caggucgagc ggcggauguc 1440 uagacugaag ggcgagauca acuccgagga aaaacaggcc cucgaggcca agaucgugga 1500 acugagaaag agccucgaag agaagaaguc uaccugcggc cugcuggaaa cccagauuaa 1560 gaagcugcac aacgaccugu acuucaucaa gaaagcccac agcaagaaca gcgacgagaa 1620 gcagagccug augaccaaga ucaaugagcu gaaccuguuc aucgaucgga gcgaaaaaga 1680 gcuggacaag gccaagggcu ucaagcagga ccugaugauc gaggacaacc ugcugaagcu 1740 ggaagugaag cggaccagag agaugcugca cagcaaggcc gaggaagugc ugucucugga 1800 aaagcggaag cagcagcugu acaccgccau ggaagagaga accgaagaga ucaaggugca 1860 caagaccaug cuggcuuccc agaucagaua cguggaccaa gagcgcgaga acaucuccac 1920 cgaguuuaga gagagacugu ccaagaucga gaagcugaag aaccgcuacg agauccugac 1980 cgucgugaug cugccuccug agggcgaaga ggaaaagacc caggccuacu acgugaucaa 2040 ggcagcccaa gaaaaagagg aacuccagag agaaggcgac ugccuggacg ccaagauuaa 2100 caaggccgaa aaagaaaucu acgcccucga gaacacccug cagguccuga acagcugcaa 2160 caacaacuac aagcagagcu ucaagaaagu caccccuagc uccgacgagu acgagcugaa 2220 gauucagcug gaagaacaga aaagagccgu ggacgagaag uacagauaca agcagcggca 2280 gaucagagag cugcaagagg auauccagag cauggaaaac acccuggacg ugaucgagca 2340 ccuggccaac aacgugaaag agaagcuguc cgagaaacag gccuacagcu uucagcuguc 2400 caaagagaca gaggaacaga agcccaaacu ggaacgcgug accaagcagu gcgccaagcu 2460 gacaaaagag auccggcugc ugaaagacac caaggacgaa accauggaag aacaagacau 2520 caagcugcgc gagaugaagc aguuccacaa agugaucgac gagaugcugg uggacaucau 2580 ugaagagaac acagagaucc gcaucauccu gcagaccuau uuucagcaga gcggccugga 2640 acugccuacc gccucuacaa agggcagcag acagagcagc agauccccua gccacacaag 2700 ccugagcgcc agaagcucua gaagcaccag caccucuacc agccagucca gcauuaaggu 2760 gcuggaacuc aaguuccccg ccagcucuag ccucguggga agcccuucua gaccuagcag 2820 cgccucuagc agcuccagca acgugaaguc caagaaaagc uccaagugau ucgaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2993

Claims (15)

1. 섬모병증을 앓고 있는 대상체에서 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물로서, 여기서 폴리리보뉴클레오티드는 상기 섬모병증과 연관된 결함을 갖는 단백질의 기능적 버전을 코딩하고, 여기서 상기 환자의 호흡기계에 대한 상기 제약 조성물의 투여는 환자가 호흡기계의 염증을 나타낼 때 실시되는 것인 제약 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 섬모병증이 원발성 섬모 이상운동증 (PCD)인, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 섬모병증이 코일드-코일 도메인 함유 40 (CCDC40) 단백질에서의 결함 및/또는 코일드-코일 도메인 함유 39 (CCDC39) 단백질에서의 결함과 연관되는 것인, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 섬모병증을 앓고 있는 대상체의 호흡기계의 염증의 존재 또는 부재가 혈액 샘플을 분석함으로써 및/또는 발산된 산화질소의 양을 분석함으로써 결정되는 것인, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물의 투여가 비강 스프레이 및/또는 네뷸라이저를 사용한 투여 및/또는 흡입에 의한 투여를 포함하는 것인, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물이 1주에 적어도 1회 및/또는 적어도 4주 동안 투여되는 것인, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물이 N-아세틸시스테인 (NAC) 및/또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 고장성 용액을 추가로 포함하는 것인, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제약 조성물이 다섬모 분화 및 DNA 합성 연관 세포 주기 (MCIDAS) 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드를 추가로 포함하고/거나 상기 제약 조성물이, MCIDAS 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 제약 조성물과 함께 투여되는 제1 제약 조성물인, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제약 조성물이 화학식 (V)에 제시된 구조를 갖는 리피도이드를 추가로 포함하는 것인, 섬모병증을 치료하는데 사용하기 위한 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물.
   

   
10. 섬모병증과 연관된 결함에 대한 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드, 및 N-아세틸시스테인 (NAC), 나트륨 클로라이드를 포함하는 고장성 용액, 및/또는 LF92 제형을 포함하는 제약 조성물.
11. 하기 단계를 포함하는, 섬모발생에 대한 폴리리보뉴클레오티드의 효과를 분석하는 방법으로서, 여기서 상기 폴리리보뉴클레오티드는 섬모발생에 수반되고/거나 그에 요구되는 단백질을 코딩하는 것인 방법:
    (a) 섬모병증을 가진 대상체의 코 브러시를 수득하며, 상기 코 브러시는 미분화된 기저 세포 및 분화된 섬모 세포를 포함하는 것인 단계,
    (b) 단계 (a)로부터 수득된 세포를 미분화된 기저 세포 및 탈분화된 섬모 세포를 수득하기 위한 침지 세포 배양물로서 배양하는 단계,
    (c) 단계 (b)로부터 수득된 미분화된 기저 세포 및 탈분화된 섬모 세포를 기액 계면 세포 배양물로서 배양하고 에어 리프트를 수행하는 단계,
    (d) 단계 (c)로부터 수득된 세포를 섬모발생에 수반되고/거나 그에 요구되는 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계,
    (e) 분화된 섬모 세포를 수득하기 위해 단계 (d)로부터 수득된 형질감염된 세포를 배양하는 단계, 및
    (f) 락테이트 데히드로게나제 측정, 누크그린 검정, 고속 비디오 현미경검사, 섬모 박동 주파수 측정, 점액섬모 청소 검정 및/또는 면역형광 염색을 사용하여 섬모발생에 대한 상기 폴리리보뉴클레오티드의 효과를 결정하는 단계.
12. 제11항에 있어서, 세포가 단계 (c)에서 에어 리프트가 수행된 후 0 내지 48시간 이내에 형질감염되는 것인 방법.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 세포가 화학식 (V)에 제시된 구조를 갖는 리피도이드를 사용하여 섬모발생에 수반되고/거나 그에 요구되는 단백질을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드로 형질감염되는 것인 방법.
14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 배지 G를 사용하여 단계 (b) 내지 (e)에서 배양되는 것인 방법.
15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 코 브러시가 섬유모세포를 추가로 포함하고, 상기 섬유모세포의 성장이 단계 (b) 내지 (e)에서 억제되는 것인 방법.

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