CN113423418A - 纤毛疾病的治疗 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种用于治疗患有纤毛疾病的受试者的纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中多核糖核苷酸编码其缺陷与所述纤毛疾病相关的蛋白的功能性版本，并且其中当受试者表现出呼吸系统的炎症时将所述药物组合物施用于所述受试者的呼吸系统。进一步地，本公开涉及用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法，其中所述多核糖核苷酸编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需的蛋白。

Description

纤毛疾病的治疗

本发明涉及用于治疗患有纤毛疾病(ciliopathy)的受试者的纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸编码其缺陷与所述纤毛疾病相关的蛋白的功能性版本，并且其中当所述受试者表现出呼吸系统的炎症时将所述药物组合物施用于所述受试者的呼吸系统。本发明进一步涉及一种用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法，其中所述多核糖核苷酸编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需要的蛋白。

氧气攸关许多多细胞生物体的生死，因为它对细胞的能量供应至关重要。在哺乳动物中，空气中包含的氧气可以通过呼吸系统进入生物体，呼吸系统是指参与呼吸的器官。这些器官包括例如，鼻、咽喉、喉、气管、支气管和肺。在后者中，来自环境的气体与包含在内部血液循环系统中的气体交换，从而将氧气从肺转运到生物体的不同部分中的细胞。然而，除了所需的氧气之外，其他成分也可以通过呼吸系统进入生物体，其他成分如空气中包含的刺激剂，包括污染物、致病剂和病原体，如病毒和细菌。因此，存在防御机制诸如咳嗽反射和打喷嚏，以用于将刺激剂从呼吸系统中排出。为了排出，刺激剂被包埋在由呼吸系统中的上皮细胞分泌的粘性粘液中，然后通过纤毛细胞被转运穿过(穿越，横过，across)上皮表面。

纤毛细胞可以通过多条运动纤毛(motile cilia)的同步搏动将粘液和刺激剂转运穿过上皮表面。纤毛是膜包裹的管状结构，其从上皮表面延伸到与环境接触的呼吸系统的空间中。在细胞内，纤毛的轴丝(axoneme)通过锚定结构被锚定在基体上。轴丝是微管的中央束(central bundle)，其中九个外部双微管围绕中央对单微管(即在呼吸纤毛中)。外部双微管和中央对微管通过放射辐连接。九个外部双微管中的每一个都由A细管和B细管组成，其中双微管通过一个连接蛋白-动力蛋白调节复合物(nexin-dynein regulatorycomplex)在圆周方向上相互连接。内动力蛋白臂和外动力蛋白臂连接至每个A细管。这些动力蛋白臂包含可以沿微管行走的运动蛋白，导致纤毛弯曲并且因此导致纤毛搏动(参见，例如，Lodish等人,2000,《分子细胞生物学(Molecular Cell Biology)》,第4版，纽约：W.H.Freeman，第19.4节)。使用布氏锥虫(Trypanosoma brucei)模型对纤毛结构进行的研究表明，这些结构成分中的一些表现出快速的周转，而放射辐、中央对和外动力蛋白臂的骨骼成分(skeletal components)在发育期间主要被整合在纤毛结构的远端(Vincensini等人，《生物学细胞(Biol Cell)》,2018,110:1-15)。

由于纤毛细胞的同步搏动对于流体跨上皮表面的转运至关重要，因此纤毛结构的扰动(perturbations)可以导致严重的障碍。运动性缺陷(包括降低的搏动幅度和/或频率和/或不同步性)可因例如动力蛋白臂的减少或丧失、微管排列的瓦解(包括定位错误(mislocalization))和每个轴丝的微管总数的变化及其组合而发生。就目前所知，这些功能性轴丝元件的变化是由潜在的遗传缺陷引起的。这主要是由于编码轴丝成分的基因(包括上述基因)的序列的变化。由于基因可以被转录成多核糖核苷酸，诸如mRNA，而多核糖核苷酸又可以被翻译成蛋白，基因的DNA序列从量和功能方面影响相应蛋白的合成。由于由序列改变引起的纤毛障碍(即纤毛疾病)是遗传性的，因此与包括胚胎或新生儿在内的所有发育阶段的纤毛运动性缺陷有关，纤毛疾病可能对生物体产生严重后果。

纤毛障碍的熟知的示例是原发性纤毛运动障碍(PCD)，这是一种通常与肺功能下降相关的进行性障碍。因此，需要长期治疗，包括例如胸部叩击和体位引流，以用于增强粘液清除率(clearance)且会越来越频繁，在严重情况下甚至需要肺移植。此外，PCD患者患有肺部和/或耳部的反复感染，通常还患有生育力低下、脑积水和身体偏侧(即左右轴)缺陷以及视网膜问题和/或神经系统问题。但是，不论大多数纤毛疾病的严重程度如何，到目前为止还没有用于治疗纤毛疾病(如PCD)的标准化有效策略。目前的疗法是例如，从囊性纤维化中推断出来的，并且在大多数情况下，甚至没有针对待治疗的特定纤毛疾病(如例如PCD)进行过验证。因此，需要手头有一种能够有效地治疗患有纤毛疾病(如PCD)的受试者的解决方案。

本申请通过提供如在权利要求中所述的实施例，解决了在患有纤毛疾病(如PCD)的受试者中恢复纤毛功能的需要。

特别地，本发明涉及一种用于治疗患有纤毛疾病的受试者中的纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸编码其缺陷与所述纤毛疾病相关的蛋白的功能性版本，并且其中当所述受试者表现出呼吸系统的炎症时将所述药物组合物施用于所述受试者的呼吸系统。

本发明基于这样的发现，即通过用编码所述蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸转染细胞(其显示纤毛的蛋白复合物的某种蛋白中的缺陷并且其缺陷导致适当的纤毛功能的丧失)来恢复适当的纤毛功能确实是可能的。然而，还发现纤毛细胞必须在分化期间的早期阶段被转染以达到这种效果。这导致了实际问题，因为携带纤毛的上皮细胞的前体细胞(即基底细胞)不能通过气道系统获取以进行转染，因为它们位于上皮的更深处并且不暴露在表面上。根据本发明，当患有纤毛疾病的受试者表现出呼吸系统的炎症时，通过施用多核糖核苷酸实现上皮细胞的转染。在呼吸系统的炎症期间，气道上皮表现出病变和创伤，这使得纤毛细胞的前体细胞(即尚未开始纤毛形成的基底细胞)可及。用表达相应蛋白的功能性版本的如上所述的多核糖核苷酸转染这些细胞允许能够使这些细胞变成形成功能性纤毛或至少部分功能性纤毛的细胞，从而导致可以显著减轻相应症状。

在本发明的上下文中，术语“纤毛疾病”是指与纤毛细胞的缺陷相关和/或以纤毛细胞的缺陷为特征的疾病。因此，纤毛疾病包括纤毛结构的障碍和/或纤毛功能，纤毛结构包括纤毛锚定结构、纤毛结构在细胞内锚定于其上的基体。纤毛疾病的示例包括PCD、巴-比综合征、Simpson-Golabi-Behmel综合征(2型)、莱伯先天性黑矇(leber congenitalamaurosis)、肾消耗病(nephronophthisis)、颅骨外胚层发育不良(cranioectodermaldysplasia)(Sensenbrenner)(参见例如Mitchison等人,2017,《超微病理学(Ultrastructural Pathology)》，41(6):415-427)。

如本文使用的术语“纤毛疾病”是指由受试者的DNA(例如染色体或线粒体DNA)中的遗传缺陷引起的纤毛疾病。这种遗传缺陷可以由突变引起，并且可以包括序列部分的损失、添加或交换。示例是拷贝数变异、存在/缺失变异、缺失(完全或部分)、插入、错义突变(miss-sense mutation)、无义突变、剪接位点变异或其组合。DNA中的此类变化可导致编码蛋白的可利用性发生变化，如蛋白的量的损失或减少，或者导致具有改变的功能的蛋白。

在一个优选的实施例中，术语“纤毛疾病”是指与运动纤毛的缺陷有关的疾病。这种纤毛疾病的一个示例是原发性纤毛运动障碍(PCD)。PCD是一种由运动纤毛的功能障碍引起的罕见的疾病。PCD在遗传、功能和超微结构水平上具有异质性。PCD与受损的粘液转运和清除率有关。患有PCD的受试者表现出复发性鼻塞、鼻窦感染、耳部感染、不孕、诸如完全性内脏逆位和内脏异位的位置异常(situs abnormalities)(也被称为“不定位(situsambiguous)”)和/或脑积水。在分子水平上，PCD在大多数情况下与呼吸系统的纤毛的结构、功能和生物发生的异常有关。这类异常的示例为缺失或缩短的动力蛋白臂、缺陷性中央对复合物、放射辐或连接蛋白链。此类异常以及因此与PCD相关的纤毛运动性缺陷是由编码相应成分的基因中的突变引起的，特别是由表1中所列的基因中的突变引起的，其中“A”组和“B”组是指具有致病突变的基因，其各自估计占PCD病例的至少1％和小于1％(参见Zariwala等人,

2007,2015更新，“原发性纤毛运动障碍(Primary CiliaryDyskinesia)”，编辑Adam等人,西雅图(WA):西雅图华盛顿大学(University ofWashington,Seattle)；1993-2018)。

因此，包含在根据本发明的药物组合物中的多核糖核苷酸优选地是可以被翻译成表1中所列的蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸。

更优选地，包含根据本发明的药物组合物中的多核糖核苷酸是可以被翻译成蛋白的功能性版本的mRNA，蛋白选自由以下组成的群组：DNAH5、DNAH11、CCDC39、DNAI1、CCDC40、CCDC103、SPAG1、ZMYND10、ARMC4、CCDC151、DNAI2、RSPH1、CCDC114、RSPH4A、DNAAF1(LRRC50)、DNAAF2(KTU)和LRRC6。

表1

在本公开的任何前述或其他方面和实施例的一些实施例中，所述多核糖核苷酸或修饰的多核糖核苷酸包含与SEQ ID NO:1或5至11中的一种或多种(例如，与SEQ ID NO:1或5至11所示的序列)至少85％、至少90％、至少92％或至少95％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的一级序列。在一些实施例中，所述多核糖核苷酸是修饰的多核糖核苷酸，其具有选自本文所述的任何此类水平和/或类型的修饰水平和/或类型。在某些实施例中，多核糖核苷酸的同一性百分比仅相对于SEQ ID NO:1或5至11的CCDC40编码序列-部分来测量(例如，在计算同一性百分比时不考虑UTR、其他非编码序列和GFP或表位标签)。在前述任一项的某些实施例中，这种多核糖核苷酸(或修饰的多核糖核苷酸)编码功能性CCDC40蛋白。

在本公开的任何前述或其他方面和实施例的一些实施例中，多核糖核苷酸或修饰的多核糖核苷酸包含与SEQ ID NO:2或12至14中的一种或多种(例如，与SEQ ID NO:2或12至14所示的序列)至少85％、至少90％、至少92％或至少95％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的一级序列。在一些实施例中，所述多核糖核苷酸是修饰的多核糖核苷酸，其具有选自本文所述的任何此类水平和/或类型的修饰水平和/或类型。在某些实施例中，多核糖核苷酸的同一性百分比仅相对于SEQ ID NO:2或12至14的CCDC39编码序列-部分来测量(例如，在计算同一性百分比时不考虑UTR、其他非编码序列和GFP标签或表位标签)。在前述任一项的某些实施例中，这种多核糖核苷酸(或修饰的多核糖核苷酸)编码功能性CCDC39蛋白。

在本公开的任何前述或其他方面和实施例的一些实施例中，多核糖核苷酸或修饰的多核糖核苷酸包含与SEQ ID NO:4(例如，与SEQ ID NO:4所示的序列)至少85％、至少90％、至少92％或至少95％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的一级序列。在一些实施例中，所述多核糖核苷酸是修饰的多核糖核苷酸，其具有选自本文所述的任何此类水平和/或类型的修饰水平和/或类型。在某些实施例中，多核糖核苷酸的同一性百分比仅相对于SEQ ID NO:4的MCIDAS编码序列-部分来测量(例如，在计算同一性百分比时，不考虑UTR、其他非编码序列和GFP或表位标签)。在前述任一项的某些实施例中，这种多核糖核苷酸(或修饰的多核糖核苷酸)编码功能性MCIDAS蛋白。

在某些实施例中，本公开提供了包含前述任一项多核糖核苷酸的药物组合物。此外，任何此类多核糖核苷酸(或药物组合物)可以用于本文所述的任何方法中。

在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的一个实施例中，所述纤毛疾病与包含卷曲螺旋结构域的40(CCD 40；分别参见例如，人mRNA的NCBI参考序列NM_017950.4和NP_060420.2以及蛋白CCDC40序列)蛋白中的缺陷有关或者与包含卷曲螺旋结构域的39(CCDC39，分别参见例如，人mRNA的NCBI参考序列NM_181426.2和NP_852091.1和蛋白CCDC39序列)蛋白中的缺陷有关。

CCDC40和CCDC39构建了位于放射辐和A-细管之间的复合物。CCDC40或CCDC39蛋白的缺陷版本可能由CCDC40基因中或CCDC39基因中的突变(如插入、缺失、无义和剪接位点突变)引起。特别地，编码CCDC40蛋白的DNA序列中248位的缺失和2824位与2825位之间的TGT插入似乎非常频繁。CCDC40或CCDC39的缺陷版本会导致轴丝结构的缺陷，如缺失或偏心中央对、异常放射辐和连接蛋白链、动态蛋白调节复合物的异常组装和/或内部动态蛋白臂的减少。因此，包含在根据本发明的药物组合物中的多核糖核苷酸优选地是可以被翻译成CCDC40和/或CCDC39的功能性版本的mRNA。关于参与纤毛形成的蛋白以及与纤毛疾病相关的基因和分子途径的更多信息可以在例如Reiter和Leroux的综述文章(Reiter和Leroux，2017,《自然评论分子细胞生物学(Nat Rev Mol Cell Biol)》，18(9):533-547)中找到。

本发明的药物组合物将被施用于患有纤毛疾病的受试者。在本文中，患有纤毛疾病的受试者也可以被称为患者。患者可能表现出异常的纤毛结构和/或功能和/或生物发生缺陷，导致粘液和细菌滞留在呼吸道中。对给定受试者的纤毛疾病的诊断可以基于例如对所述受试者的活检的临床发现、分子分析和/或纤毛超微结构分析，如例如还在Goutaki等人(Goutaki等人,2016,《欧洲呼吸杂志(Eur Respir J)》,48(4):1081-1095)中所综述。

在本发明的上下文中，术语“多核糖核苷酸”是指由腺苷、鸟苷、胞苷和/或尿苷残基(以修饰的形式或未修饰的形式，参见下文)组成的单链序列。在本文中，术语“编码蛋白的多核糖核苷酸”是指包含编码蛋白的编码区，即可以被翻译成氨基酸序列的多核糖核苷酸。因此，在本发明的上下文中，术语“编码蛋白的多核糖核苷酸”优选地是指mRNA，其中mRNA应被理解为意指任何多核糖核苷酸分子，如果其进入细胞，则适合于蛋白的表达或可以翻译成蛋白。

在本文中，术语“蛋白”涵盖任何种类的氨基酸序列，即两个或更多个氨基酸的链，各氨基酸通过肽键连接。在本上下文中使用的术语“蛋白”是指任何感兴趣的氨基酸序列。优选地，编码的氨基酸序列为至少5个氨基酸长，更优选地至少10个氨基酸，甚至更优选地至少50、100、200或500个氨基酸。因此，术语“蛋白”包括短肽以及多肽。关于编码的蛋白的功能，除了所述蛋白的缺陷变体与纤毛疾病有关之外，没有其他限制。在本文中，术语“与……有关”旨在包括术语“引起……”、“参与……”和/或“增强……”。

在本文中，术语“其缺陷……的蛋白”是指“缺陷蛋白”或“蛋白的缺陷版本”，并且因此，是指与所述蛋白的功能性版本相比具有改变的功能的蛋白的版本。然而，所述术语也可以涵盖完全或部分缺乏合成并且从而在细胞中完全或部分缺乏可利用性的所述蛋白的版本。在任何情况下，蛋白版本的缺陷导致所述蛋白的版本不能实现蛋白的天然功能。

实现其天然功能的蛋白的版本在本文中被称为“功能性蛋白”或“蛋白的功能性版本”，并且由与相应缺陷蛋白相同的DNA序列编码，但是没有引起DNA序列改变的缺陷，并且因此，在DNA序列中没有突变。

因此，在本发明的上下文中，“功能性蛋白”优选地是A-细管、B-细管、或连接蛋白-动力蛋白调节复合物、或放射辐、内动力蛋白臂、和/或外动力蛋白臂的构建块。

因此，术语“多核糖核苷酸编码其缺陷与所述纤毛疾病相关的蛋白的功能性版本”优选地是指编码功能性蛋白的mRNA，所述功能性蛋白参与纤毛轴丝、轴丝锚定结构或基体的结构组织并实现其天然功能。因此，根据本发明的多核糖核苷酸优选地是指编码功能性蛋白的mRNA，其在患有纤毛疾病的受试者的细胞中的存在对于缓解或预防与如由细胞的DNA序列编码的所述蛋白的缺陷相关的纤毛疾病的表现或减轻相关症状是需要的或有益的。

此外，根据本发明使用的多核糖核苷酸还可以包含进一步的功能区和/或3'或5'非编码区。3'和/或5'非编码区可以是天然地侧接于编码的蛋白的序列，或有助于所述多核糖核苷酸的稳定和/或调节的人工序列。可以通过常规实验来鉴定和研究合适的序列。进一步地，所述多核糖核苷酸还可以具有进一步的功能区，并且可以与微小RNA的调节元件和靶序列结合，例如用于在空间和时间上控制所需多核糖核苷酸的活性，所需多核糖核苷酸包括编码蛋白的序列，即例如关于特定细胞或细胞类型和/或发育阶段或特定时间范围。

根据本发明使用的多核糖核苷酸可以包含部分或完全密码子优化的序列，其来源于待使用的天然序列。密码子优化是指一种通过提高相应多核糖核苷酸的翻译效率来最大化蛋白表达的技术，因为在一些情况下存在会优先被某些物种用于给定的氨基酸的密码子。进一步地，所述多核糖核苷酸可以包括进一步的修饰以调节和/或延长作用持续时间。所述多核糖核苷酸还可能含有m7GpppG帽、内部核糖体进入位点(IRES)和/或3'端的polyA尾和/或用于促进翻译的附加序列。

在本发明的一些实施例中，根据本发明使用的多核糖核苷酸可以包含未修饰的核苷酸和修饰的核苷酸。本文使用的术语“未修饰的核苷酸”是指A、C、G和U核苷酸。本文使用的术语“修饰的核苷酸”是指A、C、G和U核苷酸的任何天然存在的或非天然存在的异构体，以及具有例如化学修饰或取代的残基的任何天然存在的或非天然存在的类似物、替代或修饰的核苷酸或其异构体。修饰的核苷酸可以具有碱基修饰和/或糖修饰。修饰的核苷酸也可以具有磷酸基团修饰，例如，关于mRNA分子的五个prime帽。修饰的核苷酸还包括通过核苷酸的共价修饰在转录后合成的核苷酸。进一步地，非修饰的核苷酸和修饰的核苷酸的任何合适的混合物都是可能的。修饰的核苷酸的许多非限制性示例可以在文献中找到(例如，Cantara等人，《核酸研究(Nucleic Acids Res)》,2011,39(增补刊_1):D195-D201；Helm和Alfonzo,《化学生物学(Chem Biol)》，2014,21(2):174-185；Carell等人,《应用化学国际版(Angew Chem Int Ed Engl)》,2012,51(29):7110-31)并且一些优选的修饰核苷酸基于其各自的核苷残基在下文中示例性提及：1-甲基腺苷、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰腺苷、2-甲基腺苷、2'-O-核糖基磷酸腺苷、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6-乙酰基腺苷、N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷、1,2'-O-二甲基腺苷、N6,2'-O-二甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N6,N6,2'-O-三甲基腺苷、2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-甲基腺苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6-2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、7-甲基腺苷、2-甲硫基-腺苷、2-甲氧基-腺苷、2'-氨基-2'-脱氧腺苷、2'-叠氮基-2'-脱氧腺苷、2'-氟-2'-脱氧腺苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺苷、7-脱氮-8-氮杂-腺苷、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤；2-硫胞苷、3-甲基胞苷、N4-乙酰胞苷、5-甲酰胞苷、N4-甲基胞苷、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羟基胞苷、赖胞苷、N4-乙酰基-2'-O-甲基胞苷、5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷、5,2'-O-二甲基胞苷、2-O-甲基胞苷、N4,2'-O-二甲基胞苷、N4,N4,2'-O-三甲基胞苷、异胞苷、假胞苷、假异胞苷、2-硫胞苷、2'-甲基-2'-脱氧胞苷、2'-氨基-2'-脱氧胞苷、2'-氟-2'-脱氧胞苷、5-碘胞苷、5-溴胞苷、2'-叠氮基-2'-脱氧胞苷、2'-氨基-2'-脱氧胞苷、2'-氟-2'-脱氧胞苷、5-氮杂-胞苷、3-甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代-5-甲基胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-l-甲基-假异胞苷、4-硫代-l-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-l-脱氮-假异胞苷、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-l-甲基-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林；1-甲基鸟苷、N2,7-二甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、2'-O-核糖磷酸鸟苷、7-甲基鸟苷、羟基怀丁苷、7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷、7-氰基-7-脱氮鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、N2,7,2'-O-三甲基鸟苷、N2,2'-O-二甲基鸟苷、1,2'-O-二甲基鸟苷、2'-O-甲基鸟苷、N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷、N2,N2J-三甲基鸟苷、异鸟苷、4-去甲基怀俄苷、环氧辫苷、未充分修饰的羟基怀丁苷、甲基化的未充分修饰的羟基怀丁苷、异怀俄苷、过氧怀丁苷、半乳糖基-辫苷、甘露糖基-辫苷、辫苷、古嘌苷、怀丁苷、甲基怀俄苷、怀俄苷、7-氨基羧丙基去甲基怀俄苷、7-氨基羧丙基怀俄苷、7-氨基羧丙基怀俄苷甲基酯、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、N1-甲基鸟苷、2'-氨基-3'-脱氧鸟苷、2'-叠氮基-2'-脱氧鸟苷、2'-氟-2'-脱氧鸟苷、2-硫尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、3-甲基尿苷、4-硫尿苷、5-甲基-2-硫尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-羧甲基尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-牛磺酰基甲基尿苷(5-taurinomethyluridine)、5-氨基甲酰基甲基尿苷、5-(羧羟甲基)尿苷甲酯、二氢尿苷、5-甲基二氢尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-(羧羟甲基)尿苷、5-(羧羟甲基)-2'-O-甲基尿苷甲酯、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫尿苷、3,2'-O-二甲基尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-氨基甲酰基羟基甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基尿苷、5,2'-O-二甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、2'-O-甲基-2-硫尿苷、2-硫代-2'-O-甲基尿苷、尿苷5-氧乙酸、5-甲氧羰基甲基尿苷、尿苷5-氧乙酸甲酯、5-甲氧基尿苷、5-氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷、5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷、5-牛磺酰基甲基-2-硫尿苷、假尿苷、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷、1-甲基假尿苷、3-甲基假尿苷、2'-O-甲基假尿苷、5-甲酰尿苷、5-氨基甲基-2-香叶基尿苷、5-牛磺酰基甲基尿苷、5-碘尿苷、5-溴尿苷、2'-甲基-2'-脱氧尿苷、2'-氨基-2'-脱氧尿苷、2'-叠氮基-2'-脱氧尿苷、2'-氟-2'-脱氧尿苷、肌苷、1-甲基肌苷、1,2'-O-二甲基肌苷、2'-O-甲基肌苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、1-牛磺酰基甲基-假尿苷、5-牛磺酰基甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酰基甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、1-甲基-l-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-l-脱氮-假尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、1,2'-O-二甲基腺苷、1,2'-O-二甲基鸟苷、1,2'-O-二甲基肌苷、2,8-二甲基腺苷、2-甲硫基亚甲基硫代-N6-异戊烯基-腺苷、2-香叶基硫尿苷、2-赖胞苷、2-甲硫基环状N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-硒尿苷、2-硫代-2'-O-甲基尿苷、2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基胞苷、2'-O-甲基鸟苷、2'-O-甲基肌苷、2'-O-甲基假尿苷、2'-O-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷5-氧乙酸甲酯、2'-O-核糖基腺苷磷酸酯、2'-O-核糖基鸟苷磷酸、3,2'-O-二甲基尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)-5,6-二氢尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷、5,2'-O-二甲基胞苷、5,2'-O-二甲基尿苷、5-(羧基羟甲基)-2'-O-甲基尿苷甲酯、55-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基尿苷、5-氨基甲基-2-香叶基硫尿苷、5-氨基甲基-2-硒尿苷、5-氨基甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-羧基羟甲基尿苷、5-羧甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-香叶基硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硒尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-氰基甲基尿苷、5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷、5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-甲基氨基甲基-2-香叶基硫尿苷、7-氨基羧丙基-去甲基怀俄苷、7-甲基鸟苷、8-甲基腺苷、N2,2'-O-二甲基鸟苷、N2,7,2'-O-三甲基鸟苷、N2,7-二甲基鸟苷、N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷、N2,N2,7-三甲基鸟苷、N2,N2,7-三甲基鸟苷、N4,2'-O-二甲基胞苷、N4,N4,2'-O-三甲基胞苷、N4,N4-二甲基胞苷、N4-乙酰基-2'-O-甲基胞苷、N6,2'-O-二甲基腺苷、N6,N6,2'-O-三甲基腺苷、N6-甲酰腺苷、N6-羟甲基腺苷、agmatidine、2-甲硫基环状N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、谷氨酰基-辫苷、加到任何核苷酸上的鸟苷、鸟苷酸化的5'末端、羟基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；最优选地假尿苷、N1-甲基-假尿苷、2'-氟-2'-脱氧胞苷、5-碘胞苷、5-甲基胞苷、2-硫尿苷、5-碘尿苷和/或5-甲基-尿苷。

此外，术语“修饰的核苷酸”包括含有诸如氘的同位素的核苷酸。术语“同位素”是指具有相同数量的质子但不同数量的中子导致不同质量数的元素。因此，例如，氢的同位素不限于氘，还包括氚。此外，多核糖核苷酸还可以含有其他元素的同位素，其他元素包括例如碳、氧、氮和磷。还可能的是，修饰的核苷酸是氘化的，或者包含氢的或氧、碳、氮或磷的另一种同位素。

多核糖核苷酸中修饰的核苷酸类型的总数可以是0、1、2、3或4。因此，在一些实施例中，一种核苷酸类型的至少一个核苷酸(例如至少一个U核苷酸)可以是修饰的核苷酸。在一些实施例中，总共两种核苷酸类型中的至少一个核苷酸(例如至少一个U核苷酸和至少一个C核苷酸)可以是修饰的核苷酸。在一些实施例中，总共三种核苷酸类型中的至少一个核苷酸(例如至少一个G核苷酸、至少一个U核苷酸和至少一个C核苷酸)可以是修饰的核苷酸。在一些实施例中，所有四种核苷酸类型中的至少一个核苷酸可以是修饰的核苷酸。在所有这些实施例中，可以修饰每种核苷酸类型的一个或多个核苷酸，每种核苷酸类型的所述修饰的核苷酸的百分比为0％、2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％。

在一些实施例中，待纯化的mRNA分子中包含的修饰的核苷酸的总百分比为0％、2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％。

因此，多核糖核苷酸的特征可以在于例如0.5-50％，优选地5-50％的U核苷酸和5-50％的C核苷酸被修饰。所述修饰的U核苷酸优选地为5-碘尿苷，并且所述修饰的C核苷酸优选地为5-碘胞苷。

在一些实施例中，多核糖核苷酸的特征可以在于15-25％的U核苷酸和3-15％，优选地5-15％的C核苷酸被修饰，其中所述修饰的U核苷酸优选地为5-甲基尿苷，并且所述修饰的C核苷酸优选地为5-碘胞苷。

在一些实施例中，多核糖核苷酸的特征可以在于30-50％的U核苷酸和10-20％的C核苷酸被修饰，其中所述修饰的U核苷酸优选地为5-碘尿苷，并且所述修饰的C核苷酸优选地为5-碘胞苷。

在一些实施例中，多核糖核苷酸的特征可以在于30-50％的U核苷酸和5-15％的C核苷酸被修饰，其中所述修饰的U核苷酸优选地为5-碘尿苷，并且所述修饰的C核苷酸优选地为5-碘胞苷。

在一些实施例中，多核糖核苷酸的特征可以在于0.5-5％的U核苷酸和25-35％的C核苷酸被修饰，其中所述修饰的U核苷酸优选地为2-硫尿苷，并且所述修饰的C核苷酸优选地为5-甲基胞苷。

多核糖核苷酸的特征还可以在于例如50-100％，优选地100％的U核苷酸被修饰。所述修饰的U核苷酸优选地为N1-甲基-假尿苷。

如上所述，根据本发明，当受试者表现出呼吸系统的炎症时，将药物组合物施用于患有纤毛疾病的患者。在本发明的上下文中，术语“炎症”是指对包括感染、创伤和超敏反应在内的损伤(insults)的细胞应答。“呼吸系统的炎症”是指呼吸系统中的炎症反应，尤其是但不限于鼻、咽、喉、气管、支气管和/或肺中的炎症反应。例如，呼吸系统中的炎症反应可能由诸如病原体、毒素、污染物和/或过敏原的刺激剂引起。在炎症期间，特定的细胞类型被激活，其可以释放例如细胞因子和介质以改变其他细胞的活性。这些过程在例如Iwasaki等人(Iwasaki等人,2017,《自然评论免疫学(Nat Rev Immunol)》,17(1):7-20)中描述。

因此，在一个实施例中，待施用多核糖核苷酸的患有纤毛疾病的受试者在治疗前已经进行过测定，以确定受试者是否患有呼吸系统的炎症，并且其中受试者已经被肯定地确定患有呼吸系统的炎症。

优选地，呼吸系统的炎症是急性炎症。急性炎症可能在数秒、数分钟、数小时和数天内发生，但可能不会在更长时间内发生。因此，急性炎症是在长达4周的时间范围内，优选地在小于3周的时间范围内发生的炎症。可以通过常规实验室方法根据局部增加的血流量、局部增加的毛细血管的通透性和/或中性粒细胞、巨噬细胞和/或淋巴细胞增加的数量来确定。有关原发性纤毛运动障碍中气道炎症的标志物的更多信息可以在例如Zihlif等人(Zihlif等人,2006,《小儿过敏(Pediatr Pulmonol)》,41(6):509-14)中找到。

通常，炎症可以被分为急性或慢性。急性炎症是身体对有害刺激的反应，并且特征在于例如粒细胞向受影响的组织的移动增加。炎症的典型体征是发热、疼痛、发红、肿胀和功能丧失。纤毛疾病(如，PCD)是一种遗传性障碍，并且因此(如果未得到治疗)是一种由功能丧失引起的永久性终身刺激，导致永久性以及因此慢性种类的炎症，通常不表现出上述症状(除了功能的丧失之外)。与慢性炎症相关的疾病的进一步的示例为例如：花粉热、牙周病、动脉粥样硬化和骨关节炎。尽管如此，患有此类疾病的患者还可能例如通过受到附加的有害刺激而患上急性炎症，并且因此导致一种或多种经典症状(如炎症的经典体征)发热、疼痛、发红、肿胀和附加的功能丧失。

因此，在一个实施例中，待施用多核糖核苷酸的患有纤毛疾病的受试者在治疗前已经进行过测定，以确定受试者是否患有呼吸系统的急性炎症，并且其中受试者已经被肯定地确定患有呼吸系统的急性炎症。

可替代地或另外地，呼吸系统的炎症是指炎症的加重(exacerbation)，优选地炎症的急性加重。加重指疾病的恶化或其症状的增加。最好在慢性阻塞性肺病(COPD)的背景下进行研究，因为加重会导致患者生活质量的下降，加速肺功能的下降，并显著增加疾病相关费用。

在临床试验的情况下，呼吸系统加重可以被定义如下：“呼吸系统加重在试验中被定义为导致开始全身性抗生素治疗的呼吸道症状(不考虑细菌培养的结果)，或者被定义为预测的一秒钟用力呼气量下降(FEV1)％相对于筛选和随机化时预测的FEV1％的平均值等于或高于10个百分点，无论是否开出抗生素。加重的发生可以通过患者访谈、体格检查和肺活量测定来评估。在每次试验访视时以及在因恶化而与试验点进行任何附加接触时，可以关于自上次与试验点接触以来的症状和合用药物与参与者进行访谈。可以通过每周关于症状和抗生素的患者日记对访谈进行补充。在所有访视时，均可以进行体格检查，检查参与者的一般状况、生命体征、耳朵、心脏和肺。”(参考例如Kobbernagel等人,2016,《BMC肺部医学(BMC Pulmonary Medicine)》,16:104)。

因此，根据一个优选的实施例，药物组合物包含用于治疗患有纤毛疾病的受试者的纤毛疾病的mRNA，其中mRNA编码其缺陷与所述纤毛疾病相关的纤毛结构蛋白的功能性版本，并且其中当患有纤毛疾病的受试者表现出呼吸系统的急性炎症，优选地急性加重时，将所述药物组合物施用于患有所述纤毛疾病的所述受试者的呼吸系统。

因此，在一个实施例中，待施用多核糖核苷酸的患有纤毛疾病的受试者在治疗前已经进行了测定，以确定受试者是否患有呼吸系统的急性炎症，优选地急性加重，并且其中受试者已经被肯定地确定患有呼吸系统的慢性炎症，优选地急性加重。

患有纤毛疾病的受试者的呼吸系统的炎症的存在或不存在可以通过常规程序来确定，例如，通过分析血液样品或通过确定患者是否患有鼻漏等。

在呼吸系统中，炎症通常由感染(特别是病毒或细菌感染)引起。因此，纤毛疾病患者中炎症的存在或不存在可以优选地通过确定感染(优选地急性感染)的存在或不存在来评估。优选地，感染是病毒和/或细菌感染。

急性感染的特征在于听诊发现、脓性咳嗽、浸润、咳血、发热、血液炎症参数升高(c反应性蛋白(CRP)>200mg/ml，血沉<100mm/h)。慢性感染的进一步特征在于移行性浸润、抗生素耐药性、持续性一般症状和中度升高的血液炎症标志物(CRP 50-100mg/ml，血沉<50mm/h)(Klinische Pneumonologie,1.Aufl.2014 Georg Thieme Verlag KG,ISBN 978-3-13-129751-8；Jaroszewski等人,2012,《临床胸腔外科(Thorac Surg Clin)》,22(3):301-24)。

在本发明的上下文中，术语“呼吸系统”包括参与呼吸的器官，如鼻、咽、喉、气管、支气管和肺。特别地，在本文中也被称为受试者的一些哺乳动物(包括人)的情况下，呼吸系统也可以被称为呼吸道。在本文中，术语“呼吸系统”和“呼吸道”可互换使用。呼吸道可以被分为上呼吸道和下呼吸道。上呼吸道包括有包含鼻腔、鼻甲、鼻前庭和鼻道的鼻子；副鼻窦；咽部和喉在声襞(声带)上方的部分。下呼吸道包括声襞以下的喉的部分、气管、支气管和细支气管。在本文中，肺被包括在下呼吸道中，并且包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡。

在本发明的上下文中，术语“药物组合物”是指包含至少一种根据本发明的多核糖核苷酸的组合物，用于向受试者施用以治疗纤毛疾病。多核糖核苷酸优选地以有效的量(即足以在待施用所述药物组合物的受试者中诱导可检测的治疗应答的量)被包括。本发明的药物组合物可以是无菌水溶液或非水溶液、悬浮液或乳液或气雾剂的形式。优选地，所述药物组合物为允许例如经由吸入、雾化、经由喷雾或液滴(例如鼻喷雾或鼻液滴)向呼吸系统施用的形式。

这对于患者是有利的，因为患者可以容易地使用喷雾、液滴、雾化器或通过吸入进行施用，便于转运，并且因此患者容易获得，而不限制任何行动自由。

在一个优选的实施例中，药物组合物包含mRNA，mRNA可以被翻译成蛋白的功能性版本，蛋白的功能性版本选自由以下组成的群组：DNAH5、DNAH11、CCDC39、DNAI1、CCDC40、CCDC103、SPAG1、ZMYND10、ARMC4、CCDC151、DNAI2、RSPH1、CCDC114、RSPH4A、DNAAF1(LRRC50)、DNAAF2(KTU)和LRRC6，并且通过使用喷雾、液滴、雾化器和/或通过吸入施用于患有由所述蛋白的缺陷引起的PCD的受试者。更优选地，所述蛋白是CCDC40和/或CCDC39。

所述药物组合物可以包含药学上可接受的载体，即化合物、材料、成分和/或组合物，其在合理的医学判断的范围内，适合用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。因此，药学上可接受的载体是一种非活性物质，其与药学活性物质一起配制，以便于根据剂量、吸附、溶解度或药代动力学考虑对其进行处理。合适的药物可接受载体的示例是本领域熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、缓冲液、水、乳液(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂和无菌溶液。特别地，水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非水溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和有机酯(如油酸乙酯)。药学上可接受的载体的进一步的示例包括但不限于盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液、柠檬酸盐、磷酸盐和其他有机酸；成盐反离子，例如钠和钾；低分子量(>10个氨基酸残基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白或明胶；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬酰胺、精氨酸或甘氨酸；碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；单糖；二糖；其他糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；螯合剂，例如EDTA；非离子表面活性剂，例如市场上可买到的商品名为吐温的聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、丙二醇、普朗尼克(Pluronics)或聚乙二醇；抗氧化剂，包括甲硫氨酸、抗坏血酸和生育酚；和/或防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)。合适的药学上可接受的载体及其制剂在《雷明顿药学科学(Remington's PharmaceuticalSciences)》，第17版,1985,麦克出版公司(Mack Publishing Co.)中更详细地描述。此外，还可以存在防腐剂、稳定剂和其他添加剂，如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体、纳米体系或脂质体等。

本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的适合于施用于呼吸系统的很多种施用形式施用于患者，如使用喷雾剂、液滴、吸入剂、雾化器等。剂量和作用的持续时间取决于所述多核糖核苷酸要实现的功能，并且在每种情况下都必须有意识地进行调整。例如，如果所述多核糖核苷酸用于(如本文的情况)基因缺陷(即改变的DNA序列)所引起的疾病的慢性疗法，则作用的持续时间将尽可能长。持续时间也可以被调整到特定的时间窗口。

在一个实施例中，药物组合物每周施用至少一次。这有利于确保所述PCD治疗的有效性和持久效果。优选地，药物组合物以每周为基础施用持续至少2周，更优选地持续至少3周，并且甚至更优选地持续至少4周。可替代地，所述药物组合物可以每周两次施用持续至少1周，优选地持续至少2周，更优选地持续至少3周，并且甚至更优选地持续至少4周。在一个实施例中，如果在如上所述的初始治疗持续四周后需要进一步的治疗，则以每周为基础进行治疗。作为每周施用的替代，可以将施用改为每月施用一次，持续更长的时间段，例如持续至少两个月，优选地持续至少3个月，更优选地持续至少4个月，甚至更优选地持续至少5个月，并且最优选地持续至少6个月。

在一个优选的实施例中，在受试者吸入适当的溶液(优选地粘液溶解剂，如高渗盐水或N-乙酰半胱氨酸(NAC)的溶液)，或用适当的溶液(优选地粘液溶解剂，如高渗盐水或N-乙酰半胱氨酸(NAC))冲洗他们的鼻腔和/或鼻窦，以除去粘液和潜在脱落的气道上皮细胞后，将药物组合物施用于受试者的呼吸系统。因此，优选的是，在受试者吸入适当的溶液(优选地粘液溶解剂，如高渗盐水或N-乙酰半胱氨酸(NAC)的溶液)和咳出位于上皮细胞上的粘液之后，将药物组合物施用至受试者的呼吸系统。这对于在施用药物组合物之前暴露上皮细胞并且因此对于增强多核糖核苷酸的转染效率是特别有利的。

因此，在一个实施例中，待施用多核糖核苷酸的患有纤毛疾病的受试者是这样的受试者，其在治疗之前已经通过吸入适当的溶液(优选地粘液溶解剂，如高渗盐水或N-乙酰半胱氨酸(NAC)的溶液)，或通过用适当的溶液(优选地粘液溶解剂，如高渗盐水或N-乙酰半胱氨酸(NAC))冲洗他们的鼻腔和/或鼻窦。

这种步骤的目的是在施用多核糖核苷酸之前从受试者的呼吸系统中物理地去除粘液。

此外，这样的受试者优选地是在治疗之前已经进行了测定以确定受试者是否患有呼吸系统的炎症，优选地急性炎症或炎症的加重的受试者，并且其中受试者已经被肯定地确定患有呼吸系统的炎症，优选地急性炎症或炎症的加重。

在优选的实施例中，所述溶液中NAC的浓度为3％至20％，优选地5％至15％，更优选地8％至12％，最优选地浓度为10％。百分比基于wt/wt。优选地，含有NAC的溶液还含有药学上可接受浓度的依地酸钠(其中依地酸盐是指乙二胺(ethylendiamin)四乙酸盐)和/或氢氧化钠。优选地，溶液是水溶液。

在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的一些实施例中，所述药物组合物进一步包含粘液溶解剂，如N-乙酰半胱氨酸(NAC)和/或包含氯化钠的高渗溶液。充当祛痰剂的NAC和包含氯化钠的高渗溶液均有利于减少患有PCD的受试者中粘性粘液的滞留。这可以减小呼吸系统感染的风险，并且因此减小患者的附加应激。

在优选的实施例中，药物组合物进一步包含如上所述浓度的NAC。

在优选的实施例中，药物组合物进一步包含高渗溶液，该高渗溶液包含浓度在2％与8％之间、优选地在3％与7％之间、更优选地在4％与7％之间的氯化钠。

在优选的实施例中，所述药物组合物进一步包含浓度在3％与20％之间、优选地在5％与15％之间、更优选在8％与12％之间、最优选地为10％的NAC，和/或包含浓度在2％与8％之间、优选地在3％与7％之间、更优选地在4％与7％之间的氯化钠的高渗溶液。

如上所述，在根据本发明的药物组合物的一个优选实施例中，所述药物组合物包含可以被翻译成蛋白的功能性版本的mRNA，该蛋白选自由以下组成的群组：DNAH5、DNAH11、CCDC39、DNAI1、CCDC40、CCDC103、SPAG1、ZMYND10、ARMC4、CCDC151、DNAI2、RSPH1、CCDC114、RSPH4A、DNAAF1(LRRC50)、DNAAF2(KTU)和LRRC6，优选地CCDC40和/或CCDC39。在下文中，这种药物组合物也被称为“第一药物组合物”。

多纤毛分化和DNA合成相关细胞周期(MCIDAS)蛋白是一种转录调节蛋白，其是多纤毛细胞分化(其包括多运动纤毛的纤毛形成)所特异性需要的(分别参考例如，人mRNA的NCBI参考序列NM_001190787.1和NP_001177716.1和蛋白MCIDAS序列；或如SEQ ID NO:4所示的优化的多核糖核苷酸序列)。

因此，在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的一些实施例中，所述药物组合物进一步包含编码多纤毛分化和DNA合成相关细胞周期(MCIDAS)蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸。

在一些实施例中，所述药物组合物是如上所述的第一药物组合物，其与包含编码MCIDAS蛋白的多核糖核苷酸的第二药物组合物一起施用。

两种药物组合物，即如上定义的进一步包含编码MCIDAS蛋白的多核糖核苷酸的第一种药物组合物或与包含编码MCIDAS蛋白的多核糖核苷酸的第二药物组合物一起施用的第一药物组合物，都是有利的，因为当在纤毛形成之前和/或在纤毛形成期间将药物组合物施用于细胞时，施用根据本发明的药物组合物在恢复纤毛细胞结构和功能方面特别有效。进一步地，优选地通过使用鼻喷雾剂和/或雾化器和/或通过吸入，优选地每周至少一次和/或持续至少4周，将两者施用于患者。

在一些实施例中，所述药物组合物包含可以被翻译成两种或更多种蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸。这可以例如使用多顺反子多核糖核苷酸来完成，多顺反子多核糖核苷酸是编码两种或更多种不同蛋白的单个多核糖核苷酸。使用例如2A肽设计这样的多顺反子多核糖核苷酸在文献中已有详细描述。作为示例，Liu等人证明了使用2A肽来产生多顺反子mRNA(Liu等人,2017,《科学报告(Scientific Reports)》,7:2193)。这些2A肽可以进一步与例如弗林蛋白酶(furin)切割位点结合，以除去由于核糖体跳跃(2A肽的功能特征)而附接到序列中第一蛋白上的附加氨基酸(2A肽的一部分)。作为示例，例如Chng等人(Chng等人,2015《单克隆抗体(Mabs)》,7(2):403-412)已经描述了使用2A肽进行弗林蛋白酶裂解的用途。因此，可以设计编码两种或更多种，优选地两种治疗性蛋白(例如CCDC40和MCIDAS)的单个多核糖核苷酸，其中两种治疗性蛋白的编码区被2A肽分开(如以上引用中所述)。

因此，在一些实施例中，除了药物组合物包含可以被翻译成两种或更多种，优选地两种蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸之外，与上述实施例所描述的相同。因此，在一些实施例中，如在上述实施例中所述的药物组合物包含多顺反子多核糖核苷酸，多顺反子多核糖核苷酸包含可以被翻译成蛋白的功能性版本的序列和可以被翻译成MCIDAS蛋白的功能性版本的序列，该蛋白选自由以下组成的群组：DNAH5、DNAH11、CCDC39、DNAI1、CCDC40、CCDC103、SPAG1、ZMYND10、ARMC4、CCDC151、DNAI2、RSPH1、CCDC114、RSPH4A、DNAAF1(LRRC50)、DNAAF2(KTU)和LRRC6，优选地CCDC40和/或CCDC39。

在一些实施例中，所述药物组合物包含可以被翻译成MCIDAS蛋白的功能性版本且包含如SEQ ID NO:4所示的优化的多核糖核苷酸序列的多核糖核苷酸，以及可以被翻译成CCDC40和/或CCDC39蛋白的功能性版本且包含如SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:5-11)和/或SEQ ID NO:2(或SEQ ID NO:12-14)所示的优化的多核糖核苷酸序列的多核糖核苷酸。优选地，通过使用鼻喷雾剂和/或雾化器，和/或通过吸入，优选地每周至少一次和/或持续至少4周，将药物组合物施用于患者。

作为MCIDAS的替代或补充，例如可以使用GemC1、FoxJ1和/或E2f4VP16。GemC1在纤毛上皮中被特异性地表达并且是纤毛生成的中枢调节因子。据报道，GemC1的异位表达足以通过上调MCIDAS和FoxJ1(多纤毛形成的两种关键转录调节因子)在气道上皮细胞中离体诱导多纤毛形成的早期步骤(Arbi M等人,2016,《EMBO报告(EMBO reports)》,17(3):400-413)。此外，在同一研究中还报道了GemC1可以直接反式激活MCIDAS和FoxJ1上游调控序列。E2f4VP16是指E2f4的一种形式，其包含来自HSV1 VP16的通用激活结构域，并且可以对与多纤毛形成相关的关键基因的表达的激活产生积极影响(Kim S等人,《科学报告(ScientificReports)》,2018,8:12369)。

因此，在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的一些实施例中，药物组合物是如上所述的第一药物组合物，并且进一步包含以下中的至少一种：编码MCIDAS蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸、编码GemC1蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸、编码FoxJ1蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸，和/或编码E2f4VP16蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸。

在药物组合物的一些实施例中，如上所述的第一药物组合物可以与第二药物组合物一起施用，第二药物组合物包含以下中的至少一种：编码MCIDAS蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸、编码GemC1蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸、编码FoxJ1蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸，和/或编码E2f4VP16蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸。

两种药物组合物(即如上定义的进一步包含编码MCIDAS、GemC1、FoxJ1和/或E2f4VP16蛋白的多核糖核苷酸的第一药物组合物，或与包含编码MCIDAS、GemC1、FoxJ1和/或E2f4VP16蛋白的多核糖核苷酸的第二药物组合物一起施用的第一药物组合物)都是有利的，因为当在细胞开始纤毛形成之前或当它们处于纤毛形成时将药物组合物施用于细胞时，根据本发明的药物组合物的施用在恢复纤毛细胞结构和功能方面特别有效。进一步地，优选地通过使用鼻喷雾剂和/或雾化器和/或通过吸入，优选地每周至少一次和/或持续至少4周，将两者施用于患者。

如上所述，在一些实施例中，除了药物组合物包含可以被翻译成两种或更多种，优选地两种蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸之外，与上述实施例所述相同。因此，在一些实施例中，如在上述实施例中所述的药物组合物包含多顺反子多核糖核苷酸。

所述药物组合物可以包含促进用多核糖核苷酸转染细胞的化合物。这类化合物的示例是在WO 2014/20723中公开的那些。

所述药物组合物可以进一步包含一种或多种剂或一种或多种试剂，用于将RNA递送和/或引入到靶细胞或靶组织中。特别地，设想这一/这些剂或试剂支持将RNA递送和/或引入到细胞或组织中。这一或这些剂或试剂可以与RNA一起被施用。待递送/引入的RNA也可以与这一/这些剂偶联(例如，与这一/这些药剂共价结合或络合)或解偶联(例如仅与这一/这些药剂混合)。相应的剂或试剂是本领域已知的(例如，Tavernier,《控制释放杂志(JControl Release)》150(3)(2011),238-47)，并且例如选自由以下组成群组：脂质和脂质体、胶束、聚合物和树枝状聚合物等。相应的剂或试剂的具体示例是GL67、EDMPC、l,2-二油烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二油烯基-3-三甲基铵丙烷(DODAP)、l,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环(XTC)和((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊并[d][1,3]二氧戊环-5-胺)(ALNY-100)、4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-Nl,N16-双十一基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-l,16-二胺(NC98-5)、C12-200、DLin-KC2-DMA、DODAP、l,2-二硬脂氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DSDM”、l,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DODMA”、l,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLinDMA”、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLenDMA”、N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵或“DODAC”、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵或“DDAB”、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵或“DMRIE”、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧丁烷-4-氧基)-l-(顺,顺-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷或“CLinDMA”、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基l-l-(顺,顺-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷或“CpLinDMA”、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺或“DMOB”、l,2-N,N'-二油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DOcarbDAP”、2,3-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基丙胺或“DLinDAP”、l,2-N,N'-二亚油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLincarbDAP”、l,2-二亚油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLinCDAP”、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[l,3]-二氧戊环或“DLin-K-DMA”、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环或“DLin-K-XTC2-DMA”或其混合物(Heyes,《控制释放杂志(J Controlled Release)》107(2005),276-287；Morrissey,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》23(8)(2005),1003-1007；WO2005/121348)。进一步的示例是N,N-二甲基-N-乙基羧酰胺基胆甾醇(DC-Chol)、l,4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪(Gao,《生物化学和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)》179(1991),280；Wolf等人,《生物技术(BioTechniques)》23(1997),139；美国专利第5,744,335号)。进一步的示例是LIPOFECTIN(DOTMA:DOPE)(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen))、LIPOFECTAMINE(DOSPA:DOPE)(英杰公司)、LIPOFECTAMINE2000.(英杰公司)、FUGENE、TRANSFECTAM(DOGS)和EFFECTENE。进一步的示例是改性的和未改性的聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚交酯、聚交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、聚赖氨酸、聚精氨酸、寡胺/多胺和聚乙烯亚胺。

剂或试剂可以是低聚物、聚合物或类脂质。它们可以包含低聚(亚烷基胺)部分，如例如在PCT/EP2014/063756中所描述的特征性低聚(亚烷基胺)部分。特别地，剂或试剂可以是在PCT/EP2014/063756中所描述的低聚物、聚合物或类脂质。这些特定剂或试剂的一个主要特征是它们含有下式(I)的共同结构实体：

这样的剂或试剂可以是选自以下的低聚(亚烷基胺)(包含其的组分)：

a)包含式(II)的多个基团作为侧链和/或作为端基的低聚物或聚合物：

其中独立地针对多个这样的基团中的式(II)的每个基团，变量a、b、p、m、n和R²至R⁶定义如下：

a是1，并且b是2到4的整数；或者a是2到4的整数，并且b是1，

p是1或2，

m是1或2；n为0或1，并且m+n为≥2；并且

R²至R⁵彼此独立地选自氢；基团-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；氨基的保护基团；和聚(乙二醇)链；

R⁶选自氢；基团-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；氨基的保护基团；–C(NH)-NH₂；聚(乙二醇)链；和受体配体，

并且其中式(II)所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供式(II)的阳离子基团；

b)包含式(III)的多个基团作为重复单元的低聚物或聚合物：

其中独立地针对多个这样的基团中的式(III)的每个基团，变量a、b、p、m、n和R²至R⁵定义如下：

a是1，并且b是2到4的整数；或者a是2到4的整数，并且b是1，

p是1或2，

m是1或2；n为0或1，并且m+n为≥2；并且

R²至R⁵彼此独立地选自氢；基团–CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷或-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；氨基的保护基团；–C(NH)-NH₂；和聚(乙二醇)链；

并且其中式(III)所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供式(III)的阳离子基团；以及

c)具有式(IV)结构的类脂质：

其中变量a、b、p、m、n和R¹到R⁶定义如下：

a是1，并且b是2到4的整数；或者a是2到4的整数，并且b是1，

p是1或2，

m是1或2；n为0或1，并且m+n为≥2；并且

R¹到R⁶彼此独立地选自氢；基团-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；氨基的保护基团；–C(NH)-NH₂；聚(乙二醇)链；以及受体配体；条件是R¹至R⁶中至少两个残基是基团-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；

并且其中式(IV)所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供式(IV)的阳离子类脂质。

优选地，这样的剂或试剂可以是选自a)和b)的低聚(亚烷基胺)(包含其的组分)，其中

a)是包含式(IIa)的多个基团作为侧链和/或作为端基的低聚物或聚合物：

-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶(IIa),

其中a、b、m、n和R²至R⁶如上所述定义，并且其中式(IIa)中所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构；和

b)是包含式(IIIa)的多个基团作为重复单元的低聚物或聚合物：

-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-(IIIa),

其中a、b、m、n和R²至R⁵如上所述定义，并且其中式(IIIa)中所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构。

此外，这样的剂或试剂可以是选自具有式(IVa)的结构的类脂质的低聚(亚烷基胺)(包含其的组分)：

R¹-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶(IVa),

其中a、b、m、n和R¹至R⁶如上所述定义，并且其中式(IVa)中所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供阳离子类脂质。

关于这样的剂或试剂，在式(II)、(IIa)、(III)、(IIIa)、(IV)或(IVa)中，n可以是1；或者m可以是1，并且n可以是1。

进一步地，关于这样的剂或试剂，在式(II)、(IIa)、(III)、(IIIa)、(IV)或(IVa)中，a可以是1，并且b可以是2；或者a可以是2，并且b可以是1。

在一些实施例中，低聚物、聚合物或类脂质可以是阳离子(例如质子化的)低聚物、聚合物或类脂质。

待使用的这种低聚物、聚合物或类脂质的一个非限制性示例是阳离子脂质，其通过将100mg的N,N'-双(2-氨基乙基)-1,3-丙二胺(0.623mmol)与575.07mg的1,2-环氧十二烷(3.12mmol，(N-1)当量，其中N是每种低聚(亚烷基胺)2倍量的伯胺加上1倍量的仲胺)混合来制备，并在80℃下在持续摇晃下混合96小时。这种低聚物、聚合物或类脂质也被称为类脂质“C12-(2-3-2)”。

待使用的剂或试剂(特别地聚合物)可以是共聚物，特别地统计共聚物。这种共聚物可以是包含交替长度的亚烷基胺重复单元的统计/无规排列的共聚物(例如，与包含非交替长度的亚烷基胺重复单元的类似排列的不太优选的聚合物相反)。共聚物可以是阳离子(例如质子化的)共聚物。待使用的共聚物是本领域已知的，并且例如描述于EP 14 199439.2、WO 01/00708、EP-A1 1 198 489和CA-A1 2,377,207中。

特别地，所述共聚物可以是包含独立地选自下式(a1)和(a2)的重复单元的多个重复单元(a)的统计共聚物：

-CH₂-CH₂-NH- (a1)

和

独立地选自下式(b1)至(b4)的重复单元的多个重复单元(b)：

-CH₂-CH₂-CH₂-NH- (b1)

其中重复单元(a)的总和与重复单元(b)的总和的摩尔比在0.7/1.0至1.0/0.7的范围内，并且

其中共聚物中包含的重复单元(a)和/或(b)的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供阳离子共聚物。

共聚物可以是统计共聚物，其中任何重复单元(a)和任何重复单元(b)被统计地分布在共聚物大分子中。它通常由在聚合反应期间产生重复单元(a)的单体与在聚合反应过期间产生重复单元(b)的单体的混合物的共聚获得。优选地，共聚物是无规共聚物，其中任何重复单元(a)和任何重复单元(b)被随机地分布在聚合物大分子中。

这种共聚物可以是线性、支化或树枝状共聚物。如本领域技术人员将理解的，具有两个价态(即与相邻单元的开放键)的式(a1)、(b1)或(b3)的重复单元导致共聚物结构以线性方式传播。因此，线性共聚物可以包含式(a1)的重复单元和一种或多种类型的式(b1)和(b3)的重复单元，但不包含式(a2)、(b2)或(b4)的重复单元。如将进一步理解的，具有三个价态的式(a2)、(b2)或(b4)的重复单元的存在在共聚物结构中提供了分支点。因此，支化共聚物包含一种或多种类型的式(a2)、(b2)和(b4)的重复单元，并且可以进一步包含一种或多种类型的式(a1)、(b1)和(b3)的重复单元。

这种共聚物可以包含独立地选自以上定义的式(a1)和(a2)的重复单元的多个重复单元(a)和独立地选自以上定义的式(b1)至(b4)的重复单元的多个重复单元(b)。优选的是包含独立地选自以上定义的式(a1)和(a2)的重复单元的多个重复单元(a)和独立地选自以上定义的式(b1)和(b2)的重复单元的多个重复单元(b)的共聚物。

优选地，这种共聚物是这样的支化共聚物，其包含一种或多种类型的选自重复单元(a2)、(b2)和(b4)的重复单元，并且任选地进一步包含一种或多种类型的式(a1)、(b1)和(b3)的重复单元，并且特别地是这样的共聚物，其包含式(a2)的重复单元和一种或多种类型的式(b2)和(b4)的重复单元，并且任选地进一步包含一种或多种类型的式(a1)、(b1)和(b3)的重复单元。与上述相符，更优选的共聚物因此是这样的支化共聚物，其包含式(a2)的重复单元和式(b2)的重复单元，并且任选地进一步包含一种或多种类型的式(a1)和(b1)的重复单元。

在共聚物中，重复单元(a)和重复单元(b)的总数通常为20或更多，优选地50或更多，并且更优选地100或更多。通常，重复单元(a)和重复单元(b)的总数为10,000或更少，优选地5,000或更少，更优选地1,000或更少。

此外，对于共聚物，优选的是重复单元(a)和(b)占共聚物中所有重复单元的80摩尔％或更多，更优选地90摩尔％或更多。进一步优选的是这样的共聚物，其中选自(a1)和(a2)的重复单元(a)和选自(b1)和(b2)的重复单元(b)占共聚物中所有重复单元的80摩尔％或更多，更优选地90摩尔％或更多。最优选的是，共聚物中的所有重复单元是重复单元(a)或(b)，特别地共聚物中的所有重复单元是选自(a1)和(a2)的重复单元(a)或选自(b1)和(b2)的重复单元(b)。

共聚物的重均分子量(如通过例如尺寸排阻色谱法相对于线性聚(环氧乙烷)标准品测量的)通常在1,000至500,000Da的范围内，优选地在2,500至250,000Da的范围内，并且更优选地5,000-50,000更低。

这种共聚物的端基通常包含一种或多种类型的独立地选自下式(c1)至(c3)的基团的基团(c)，优选地选自下式(c1)和(c2)的基团的基团(c)：

-CH₂-CH₂-NH₂ (c1)

-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂ (c2)

-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂ (c3)。

优选地，共聚物中的端基由一种或多种类型的独立地选自下式(c1)至(c3)的基团(优选地选自下式(c1)和(c2)的基团)的基团(c)组成。如本领域技术人员将理解的，端基的数目取决于共聚物的结构。虽然线性共聚物只有两个端基，但在支化共聚物中，特别地在树枝状共聚物中含有更多数目的端基。如将进一步理解的，共聚物中包含的端基(c)的氮原子中的一个或多个也可以被质子化以提供阳离子共聚物。

在共聚物中，重复单元(a)的总和与重复单元(b)的总和的摩尔比在0.7/1.0至1.0/0.7的范围内，并且优选地在0.8/1.0至1.0/0.8的范围内。这一摩尔比可以通过例如NMR来确定。因此将理解，该比率通常是针对共聚物的多种大分子确定的，并且通常表示在多种大分子中重复单元(a)的总和与重复单元(b)的总和的总比率。

如上所述，共聚物的氮原子中的一个或多个可以被质子化以产生阳离子形式(通常是低聚阳离子或聚阳离子形式)的共聚物。应当理解，重复单元(a)或(b)中或端基(c)中的伯、仲或叔氨基可以充当质子受体，特别是在水和水溶液(包括生理流体)中。因此，这样的共聚物在7.5或以下的pH的水溶液中通常具有总正电荷。如本文所指的，水溶液是其中溶剂包含50％(体积/体积)或更多、优选地80％或90％或更多并且最优选地100％水的溶液。而且，如果组合物与pH为7.5或以下的生理流体(包括例如血液和肺液)接触，则它们通常含有重复单元(a)和(b)，其中氮原子被质子化。组合物中使用的共聚物的pK_a值可以通过使用自动pK_a滴定仪的酸碱滴定来测定。然后可以根据例如亨德森-哈塞尔巴赫公式计算给定pH值下的净电荷。任何电荷都可以在数个碱中心之间共享，并且不一定可以归因于单一的点。通常，在生理pH的溶液中，组合物中使用的共聚物包含具有处于质子化状态的氨基的重复单元和具有处于非质子化状态的氨基的重复单元。

然而，如本领域技术人员将理解的，共聚物以及组合物也可以以包含阳离子形式的共聚物的干盐形式提供。

如将进一步理解的，在包含共聚物和核酸(特别是RNA，优选地单链RNA，如mRNA)的组合物中质子化氨基的正电荷的抗衡离子(阴离子)通常由包含在核酸中的阴离子部分提供。如果与核酸中的阴离子部分相比，带正电荷的基团过量存在，则正电荷可以被其他阴离子平衡，特别是通常在生理流体中遇到的那些阴离子，诸如Cl^-或HCO₃ ^-。

根据上述，优选的共聚物是无规共聚物，其中

所有重复单元中的80摩尔％或更多(更优选地所有重复单元)通过以下来形成

独立地选自下式(a1)和(a2)的重复单元的多个重复单元(a)：

-CH₂-CH₂-NH- (a1)

和

独立地选自下式(b1)和(b2)的重复单元的多个重复单元(b)：

-CH₂-CH₂-CH₂-NH- (b1)

其中重复单元(a)的总和与重复单元(b)的总和的摩尔比在0.7/1.0至1.0/0.7的范围内，更优选地在0.8/1.0至1.0/0.8的范围内；

其中所述共聚物的端基通过以下来形成

独立地选自式(c1)和(c2)的基团的基团(c)：

-CH₂-CH₂-NH₂ (c1)

-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂ (c2)；并且

其中共聚物中包含的重复单元(a)和/或(b)和/或端基(c)的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供阳离子共聚物。进一步优选的是，共聚物是支化共聚物，其包含单元(a2)和(b2)，任选地与单元(a1)和/或(b1)一起。

共聚物可以方便地用类似于制备聚亚烷基亚胺(如支化或线性聚乙烯亚胺(PEI))的已知程序来制备。将理解，用于生产共聚物的单体将必须相应地进行调整。在本文中，已经发现，单体可以方便地以定量方式反应，使得共聚物中单元(a)和(b)的比率可以通过相应地调节经历聚合的单体混合物中的单体比率来调节。虽然聚乙烯亚胺可以通过例如氮丙啶的开环聚合来制备，但是共聚物可以通过单体混合物的开环聚合来制备，单体混合物包含或由氮丙啶、氮杂环丁烷和(适用时)吡咯烷，或在优选的实施例中氮丙啶和氮杂环丁烷组成。将理解，表述“适用时”是指重复单元(b3)和(b4)或端基(c3)的存在或不存在，它们将由吡咯烷形成。未取代的环胺的开环聚合通常产生支化共聚物。线性共聚物可以例如通过合适的N-取代的氮丙啶、N-取代的氮杂环丁烷和N-取代的吡咯烷，或N-取代的氮丙啶和N-取代的氮杂环丁烷的聚合来制备，随后可以例如水解裂解附接到所得聚亚烷基亚胺链上的N-取代基，例如类似于在Katrien F.Weyts,Eric J.Goethals,“线性聚乙烯亚胺的新合成(New synthesis of linear polyethyleneimine)”,《聚合物通报(Polymer Bulletin)》,1988,19(1):13-19中公布的程序。树枝状聚合物可以根据例如Yemul等人，《胶体和聚合物科学(Colloid and Polymer Science)》，2008,286(6-7):747-752，“聚(乙烯亚胺)树枝状聚合物的合成和表征(Synthesis and characterization of poly(ethylenimine)denrimers)”中描述的方法来合成。

对于树枝状聚合物(或树枝状共聚物)的制备，可以类似地应用已知用于生产聚乙烯亚胺或聚丙烯胺树枝状聚合物的合成策略。可以使用伯胺的迈克尔加成的重复序列，然后进行非均相催化氢化(Newkome和Shreiner“具有不同1→2分支基序的聚(酰胺基胺)、聚丙烯亚胺以及相关树枝状聚合物和树枝状大分子单元：扩散法概述(Poly(amidoamine),polypropylenimine,and related dendrimers and dendrons possessing different 1→2branching motifs:An overview of the divergent procedures)”.《聚合物(Polymer)》49(2008)1-173；De Brabander-Van Den Berg等人,“聚丙烯亚胺树枝状聚合物的大规模生产(Large-scale production of polypropylenimine dendrimers)”,《高分子研讨会(Macromolecular Symposia)》(1994)77(1)51–62)，由丙烯腈结构单元来合成聚丙烯亚胺树枝状聚合物。聚乙烯亚胺树枝状聚合物可以使用乙烯基溴化物结构单元迈克尔加成到伯胺上的重复序列，随后使用Gabriel胺合成方法将烷基溴化物转化为胺来生产(Yemul&Imae，“聚(乙烯亚胺)树枝状聚合物的合成与表征(Synthesis andcharacterization of poly(ethyleneimine)dendrimers)”,《胶体聚合物科学(ColloidPolym Sci)》(2008)286:747–752)。因此，本领域技术人员将不仅能够生产具有例如丙烯亚胺和乙烯亚胺的严格交替层的树枝状聚合物。类似地，可以产生具有包含或由式(a2)、(b2)和(b4)的重复单元并且优选地重复单元(a2)和(b2)的无规组合物组成的层的树枝状聚合物代。

氮丙啶和氮杂环丁烷，或氮丙啶、氮杂环丁烷和吡咯烷的开环聚合可以在溶液中(例如在水中)进行。总单体浓度没有特别的限制，典型的浓度范围为10％wt/wt至80％wt/wt，优选地30％wt/wt至60％wt/wt。通常，聚合由质子引发，使得优选向反应体系中加入布朗斯特酸(

acid)，特别是无机酸，如硫酸。基于单体的总浓度，少量的酸通常是足够的，如0.001至0.01当量。反应以方便的速率进行，例如在50-150℃，特别是90-140℃的温度范围内进行。在这些范围内，较高分子量的共聚物通常处于较高的温度，而较低分子量的共聚物处于较低的温度。

原则上，类脂质是优选的待使用的剂或试剂，特别地与低聚物相比，并且更特别地与聚合物相比。

用于将RNA递送和/或引入到靶细胞或靶组织中的一种或多种剂或一种或多种试剂的进一步的示例是如本文别处所述的脂质体转染试剂(LTR)和磁性颗粒(MP)。

用于将RNA递送和/或引入到靶细胞或靶组织中的一种特定模式是转染。因此，可以设想待使用的RNA被转染(到(靶)细胞或组织中)，通过转染被递送/施用和/或被制备用于转染。用于转染RNA的手段和方法是本领域熟知的，并且例如，在Tavernier(loc.cit.),Yamamoto(《欧洲药剂学和生物药剂学杂志(Eur J Pharm Biopharm.)》71(3)(2009),484-9)和Kormann(《自然生物技术》.29(2)(2011),154-7)中描述。特定的转染模式为脂转染、磁转染或磁脂转染。

因此，待使用的RNA可以被制备用于脂转染，被制备用于通过脂转染被转染，通过脂转染被递送/引入和/或通过脂转染被施用。

因此，药物组合物可以(进一步)包含至少一种脂质或脂质体转染试剂或增强剂(LTR；脂质体转染试剂)。待使用的RNA可能被包含在LTR中、与LTR复合和/或由LTR递送。特别地，待使用的RNA可以被包含在包含RNA和LTR的(各自的)脂转染复合物中和/或由其递送。药物组合物可以(进一步)包含脂转染复合物。

LTR是本领域已知的，并例如由法国马赛的OzBiosciences分销。待使用的LTR可以选自由上述用于将RNA递送和/或引入到靶细胞或靶组织中的剂或试剂组成的群组。例如，这样的LTR可以是脂质或类脂质，优选地阳离子脂质或阳离子类脂质，如在PCT/EP2014/063756中公开的类脂质(例如，C12-(2-3-2)，如在EP2285772中公开的脂质(例如Dogtor)和如在EP1003711中公开的脂多胺(例如DreamFect^TM和DreamFect Gold^TM)。特定的LTR可以选自由以下组成的群组：

(i)C12-(2-3-2)；

(ii)DreamFectTM，优选地DreamFect GoldTM(DFTM/DF-GoldTM；OzBiosciences，法国马赛)；

(iii)Dogtor(OzBiosciences，法国马赛)；以及

(iv)Lipofectamine，例如如Lipofectamine 2000(美国加利福尼亚州的Invitrogene)。

原则上，Dogtor是优选的药物，DreamFect^TM是更优选的药物，并且DF-Gold^TM和C12-(2-3-2)是甚至更优选的LTR。

例如，在EP2285772中描述了如Dogtor的LTR。例如，在EP1003711中描述了如DF^TM或DF-Gold^TM的LTR。原则上，如在PCT/EP2014/063756中公开的低聚物、聚合物或类脂质，如在EP2285772中公开的特定阳离子脂质和如在EP1003711中公开的特定脂多胺是优选的LTR。如C12-(2-3-2)和DF-Gold^TM的LTR是最优选的。

脂感染复合物的非限制性示例为DF-Gold^TM/RNA脂质复合物(lipoplex)和C12-(2-3-2)/RNA脂质复合物。

C12-(2-3-2)是特别优选的具有式(V)所示的结构的LTR(参见

等人,《应用化学国际版》,2016；55(33):9591-5)：

C12-(2-3-2)优选地如例如WO 2016/075154 A1、EP 3013964和

等人,(《应用化学国际版》,2016；55(33):9591-5)所述的制备。阳离子类脂质可以通过将N1-(2-氨基乙基)-N3-(2-((3,4-二甲氧基苄基)氨基)乙基)丙烷-1,3-二胺(8.9g，1当量，28.67mmol)与1,2-环氧十二烷(42.27，8当量，229.4mmol)混合来制备，并在80℃下在持续摇晃下混合24小时，然后纯化并除去3,4-二甲氧基苄基保护基团。

可以使用C12-(2-3-2)的不同异构体，如外消旋体、S异构体和/或R异构体。优选地，C12-(2-3-2)被用作纯R异构体并且具有式(VI)所示的结构。为了获得C12-(2-3-2)的纯R异构体，可以如上面关于C12-(2-3-2)所描述的，使用1,2-环氧十二烷的R异构体进行合成来制备。

因此，在优选的实施例中，所述药物组合物包含用于治疗纤毛疾病的多核糖核苷酸，并且进一步包含具有式(V)所示的结构的类脂质，优选地如式(VI)所示。

进一步特别优选的LTR是具有式(VII)的阳离子类脂质，在本文中也被称为“dL_P”，其可以通过使用硼酸作为催化剂使N,N'-双(2-氨基乙基)-1,3-丙二胺与N-十二烷基丙烯酰胺反应来合成。对于反应，可以在100℃下在微波辐射下搅拌混合物。

因此，在进一步优选的实施例中，药物组合物包含用于治疗纤毛疾病的多核糖核苷酸，并且进一步包含具有式(VII)所示的结构的类脂质。

此外，所述药物组合物包含具有式(V)、(VI)和/或(VII)的阳离子类脂质，优选地dL_P和/或C12-(2-3-2)，更优选地dL_P和/或C12-(2-3-2)的R异构体，其包含在如下所述的制剂中。特别地，本文所述的用于将RNA递送和/或引入到靶细胞或靶组织中的剂和试剂以及本文所述的LTR可以与一种或多种(例如，两种、三种或四种)进一步的脂质(例如，胆固醇、DPPC、DOPE和/或PEG-脂质(例如，DMPE-PEG、DMG-PEG2000))组合。这些进一步的脂质可以支持剂/试剂和LTR的期望功能(分别支持和/或增加RNA到细胞或组织中的递送和/或引入并提高转染效率)，并且作为各自的“辅助脂质”。此类“辅助脂质”的具体示例为胆固醇、DPPC、DOPE和/或PEG-脂质(例如，DMPE-PEG、DMG-PEG(例如，DMG-PEG2000))。进一步的脂质(例如，“辅助脂质”)也可以是本文公开的复合物/颗粒的部分(一个或多个)。本领域技术人员能够容易地制备根据本发明的复合物/颗粒。进一步的脂质(例如“辅助脂质”)的示例在本领域中也是已知的。本领域技术人员能够容易地选择合适的进一步的脂质(例如“辅助脂质”)以及剂/试剂/LTR与进一步的脂质(例如“辅助脂质”)的比率。这样的比率可以是剂/试剂/LTR:进一步的脂质的1-4:1-5、3-4:4-6、约4:约5、约4:约5.3的摩尔比(更窄的范围是优选的)。例如，剂/试剂/LTR可以与三种进一步的脂质如DPPC、胆固醇和DMG-PEG2000以分别为8:5.3:4.4:0.9，或更特别地分别为8:5.29:4.41:0.88的摩尔比组合。

优选地，如上所述产生dL_P和/或C12-(2-3-2)，更优选地dL_P和/或C12-(2-3-2)的R异构体，并与辅助脂质DPPC和胆固醇以及PEG-脂质DMG-PEG2000一起以8:5.29:4.41:0.88的摩尔比用于配制脂质颗粒。

其中将C12-(2-3-2)(式VI)的R异构体与脂质DPPC和胆固醇以及PEG-脂质DMG-PEG2000以8:5.29:4.41:0.88的摩尔比配制的组合物在本文中也被称为“LF92”。其中dL_P(式VII)与脂质DPPC和胆固醇以及PEG-脂质DMG-PEG2000以8:5.29:4.41:0.88的摩尔比配制的组合物在本文中也被称为“LF111”。

如也在例如WO 2016/075154 A1、EP 3013964和Zhang等人(TERMIS,2019,《组织工程：A部分(Tissue Engineering:Part A)》,第25卷,1和2期)中示例性描述的，dL_P和/或C12-(2-3-2)可以用作非病毒载体，以基于mRNA分子的类脂质的正氨基和mRNA分子的负磷酸基团之间的静电相互作用与mRNA分子形成稳定的脂质复合物(Anderson,《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》14,2003,191-202)。为了稳定脂质复合物结构和减少泄漏，可以向dL_P和/或C12-(2-3-2)，更优选地dL_P和/或C12-(2-3-2)的R异构体提供有两种辅助脂质，名为1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)和胆固醇(Anderson,《药物递送(DrugDelivery)》11,2004,33-39；Liang,《胶体和界面科学杂志(Journal of Colliod andInterface Science)》278,2004,53-62)。最后，将1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)2kD(DMG-PEG2000)加入到脂质混合物中，以提供聚乙二醇化脂质体。已经熟知的是，聚乙二醇化通过增加水溶性、防止酶促降解以及限制免疫原性和抗原性反应来改善脂质体制剂的物理化学特性(Milla,《当前的药物代谢(Current Drug Metabolism)》13,2012,105-119)。整个乙醇脂质混合物的最终N/P比率为8:5.29:4.41:0.88，其代表dL_P和/或C12-(2-3-2)/DPPC/胆固醇/DMG-PEG2000的氨基分别与mRNA分子的一个磷酸基团的摩尔比。

因此，在优选的实施例中，用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物进一步包含用DPPC、胆固醇和DMG-PEG2000配制的dL_P和/或C12-(2-3-2)，优选地dL_P和/或C12-(2-3-2)的R异构体。

此外，在特别优选的实施例中，用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的所述药物组合物进一步包含用DPPC、胆固醇和DMG-PEG2000配制的dL_P和/或C12-(2-3-2)，优选地dL_P和/或C12-(2-3-2)的R异构体，其中对于dL_P和/或C12-(2-3-2)/DPPC/胆固醇/DMG-PEG2000的氨基分别与mRNA分子的一个磷酸基团的摩尔比，整个乙醇脂质混合物的最终N/P比率为8:5.29:4.41:0.88。

如上所述，与DPPC、胆固醇和DMG-PEG2000一起配制的C12-(2-3-2)的R异构体也被称为LF92制剂。

因此，在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的特别优选的实施例中，所述药物组合物进一步包含LF92制剂。

如上所述，用DPPC、胆固醇和DMG-PEG2000一起配制的dL_P也被称为LF111制剂。

因此，在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的特别优选的实施例中，所述药物组合物进一步包含LF111制剂。

在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的优选实施例中，所述药物组合物进一步包含LF92和/或LF111制剂。LF92和/或LF111是指用于细胞转染的载体制剂。这是有利的，因为LF92和/或LF111的使用与高转染效率相关联，并且因此确保编码其缺陷与纤毛疾病相关的蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸可以有效地进入细胞，优选地未分化的纤毛细胞或基底细胞，并且因此在患有PCD的受试者中恢复纤毛细胞功能。

在一个特别优选的实施例中，所述药物组合物包含LF92和/或LF111制剂、下列中的至少一种：可以被翻译成MCIDAS蛋白的功能性版本的mRNA、可以被翻译成GemC1蛋白的功能性版本的mRNA、可以被翻译成FoxJ1蛋白的功能性版本的mRNA、可以被翻译成E2f4VP16蛋白的功能性版本的mRNA以及可以被翻译成CCDC40和/或CCDC39的功能性版本的mRNA。优选地，通过使用喷雾剂、液滴和/或雾化器和/或通过吸入，优选地每周至少一次和/或持续至少4周，将这样的组合物施用于患者。

因此，在一些实施例中，除了所述药物组合物包含可以被翻译成两种或更多种，优选地两种蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸之外，与上述实施例所述相同。因此，在一些实施例中，如在上述实施例中所述的药物组合物包含多顺反子多核糖核苷酸。

本发明还涉及一种治疗患有纤毛疾病的受试者的纤毛疾病的方法，方法包括施用包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中多核糖核苷酸编码其缺陷与所述纤毛疾病相关的蛋白的功能性版本，并且其中所述药物组合物被施用至所述受试者的呼吸系统并且当受试者表现出呼吸系统的炎症时起作用。关于药物组合物的可能的实施例和优选的实施例及其施用的方式和时间，与上文关于根据本发明的药物组合物所述相同。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含编码其缺陷与纤毛疾病相关的蛋白的多核糖核苷酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)、包含氯化钠的高渗溶液和/或LF92和/或LF111制剂。

关于药物组合物和其组分，与上述关于用于治疗患有纤毛疾病的受试者的纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的描述相同。此外，这种药物组合物的其他特征也可以如上所述。

因此，在一个优选的实施例中，药物组合物可以进一步包含可以被翻译成MCIDAS的功能性版本的mRNA。

本公开还涉及编码如SEQ ID NO:1或5至11中任一项所示的人CCDC40的多核糖核苷酸。

在本公开的任何前述或其他方面和实施例的一些实施例中，所述多核糖核苷酸或修饰的多核糖核苷酸编码人CCDC40(例如，功能性人CCDC40)，并且包含与SEQ ID NO:1或5至11中的一个或多个(例如，与SEQ ID NO:1或5至11所述的序列)至少85％、至少90％、至少92％或至少95％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的一级序列。

在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含T7启动子的一部分、Ethris的最小5'非翻译区(UTR)、CYBA 5'UTR、Kozak元件，随后是编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列、CYBA 3'UTR和聚(A)尾(参见例如SEQ ID NO:1)。

在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含T7启动子的一部分、Ethris的最小5'非翻译区(UTR)、Kozak元件、随后是编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列、和聚(A)尾(参见例如SEQ ID NO:5)。

在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含T7启动子的一部分、Ethris的最小5'非翻译区(UTR)、额外的U核苷酸、TISU元件，随后是编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，和聚(A)尾(参见例如SEQ ID NO:6)。

在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含T7启动子的一部分、Ethris的最小5'非翻译区(UTR)、hAg 5'UTR、Kozak元件，随后是编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，和聚(A)尾(参见例如SEQ ID NO:7)。

在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含T7启动子的一部分、Ethris的最小5'非翻译区(UTR)、人CMV IE9 5'UTR、Kozak元件，随后是编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列、人生长激素3'UTR和聚(A)尾(参见例如SEQ ID NO:8)。

在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含T7启动子的一部分、Ethris的最小5'非翻译区(UTR)、Kozak元件、EGFP编码序列、G4S间隔区，随后是编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，以及聚(A)尾(参见例如SEQ ID NO:9)。

在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含T7启动子的一部分、Ethris的最小5'非翻译区(UTR)、Kozak元件、随后是编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列、G4S间隔区、EGFP编码序列和聚(A)尾(参见例如SEQ ID NO:10)。

在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含T7启动子的一部分、Ethris的最小5'非翻译区(UTR)、CYBA 5'UTR、Kozak元件，随后是HA标签、G4S间隔区、编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列、T2A肽、编码tdTomato的序列、CYBA 3'UTR和聚(A)尾(参见例如SEQ ID NO:11)。

在一些实施例中，所述多核糖核苷酸是修饰的多核糖核苷酸，其具有选自本文所述的任何此类水平和/或类型的修饰水平和/或类型。

在某些实施例中，多核糖核苷酸的同一性百分比仅相对于SEQ ID NO:1或5至11的CCDC40编码序列-部分来测量(例如，当计算同一性百分比时，不考虑UTR、其他非编码序列和GFP或表位标签，并且多核糖核苷酸可以包含或可以不包含这样的区域)。

在任何前述的某些实施例中，这种多核糖核苷酸(或修饰的多核糖核苷酸)编码功能性CCDC40蛋白。

本公开还涉及编码如SEQ ID NO:2或12至14中任一项所示的人CCDC39的多核糖核苷酸。

在本公开的任何前述或其他方面和实施例的一些实施例中，所述多核糖核苷酸或修饰的多核糖核苷酸编码人CCDC39，并且包含与SEQ ID NO:2或12至14中的一个或多个(例如，与SEQ ID NO:2或12至14所示的序列)至少85％、至少90％、至少92％或至少95％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的一级序列。

在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含T7启动子的一部分、Ethris的最小5'UTR、CYBA 5'UTR、Kozak元件，随后是编码人CCDC39蛋白的功能性版本的密码子优化序列、CYBA 3'UTR和聚(A)尾(参见例如SEQ ID NO:2)。

在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含T7启动子的一部分、Ethris的最小5'UTR、Kozak元件，随后是编码人CCDC39蛋白的功能性版本的密码子优化序列、和聚(A)尾(参见例如SEQ ID NO:12)。

在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含T7启动子的一部分、Ethris的最小5'UTR、附加的U核苷酸、TISU元件，随后是编码人CCDC39蛋白的功能性版本的密码子优化序列和聚(A)尾(参见例如SEQ ID NO:13)。

在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含T7启动子的一部分、Ethris的最小5'UTR、作为5'UTR的SP30(即30个核苷酸的随机序列)、Kozak元件，随后是编码人CCDC39蛋白的功能性版本的密码子优化序列，和聚(A)尾(参见例如SEQ ID NO:14)。

在一些实施例中，多核糖核苷酸是修饰的多核糖核苷酸，其具有选自本文所述的任何此类水平和/或类型的修饰水平和/或类型。

在某些实施例中，多核糖核苷酸的同一性百分比仅相对于SEQ ID NO:2或12至14的CCDC39编码序列-部分来测量(例如，当计算同一性百分比时，不考虑UTR、其他非编码序列和GFP或表位标签，并且多核糖核苷酸可以包含或可以不包含这样的区域)。

在任何前述的某些实施例中，这种多核糖核苷酸(或修饰的多核糖核苷酸)编码功能性CCDC39蛋白。

本公开还涉及编码如SEQ ID NO:4所示的人MCIDAS的多核糖核苷酸。在本公开的任何前述或其他方面和实施例的一些实施例中，多核糖核苷酸或修饰的多核糖核苷酸编码人MCIDAS，并且包含与SEQ ID NO:4(例如，与SEQ ID NO:4所示的序列)至少85％、至少90％、至少92％或至少95％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的一级序列。在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含T7启动子的一部分，Ethris的最小5'UTR、Kozak元件，随后是编码人MCIDAS蛋白的功能性版本的密码子优化序列，任选的3'UTR(其也用作基于PCR的模板生产的反向引物结合位点)，以及聚(A)尾。在一些实施例中，多核糖核苷酸是修饰的多核糖核苷酸，其具有选自本文所述的任何此类水平和/或类型的修饰水平和/或类型。在某些实施例中，多核糖核苷酸的同一性百分比仅相对于SEQ ID NO:4的MCIDAS编码序列-部分来测量(例如，当计算同一性百分比时，不考虑UTR、其他非编码序列和GFP或表位标签，并且多核糖核苷酸可以包含或可以不包含这样的区域)。在任何前述的某些实施例中，这种多核糖核苷酸(或修饰的多核糖核苷酸)编码功能性MCIDAS蛋白。

为了确定第一序列相对于第二序列的同一性百分比，使类似物(例如，甲基胞苷)与胞苷等匹配等。在某些实施例中，术语“一级序列”可以用于指多核苷酸序列，而不考虑是否修饰或修饰水平，使得与CUCUCUA相同的一级序列将包括该序列，而不管所述核苷酸中的任何一个或全部是否被修饰(例如，C、U和A中的任何更多个或更多个的类似物可能存在并且将被认为是相同的一级序列)。

在某些实施例中，同一性百分比仅通过参考给定所列序列中与例如CCDC40或CCDC39的编码序列相对应的部分来确定。而在其他实施例中，通过参考编码序列和一个或多个非编码序列来确定同一性百分比。在某些实施例中，在所列序列的整个长度上确定同一性百分比(例如，通过参考本文序列表中列出的序列的整个长度)。

此外，本发明涉及一种用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法，其中所述多核糖核苷酸编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需的蛋白，所述方法包括以下步骤：

(a)获得患有纤毛疾病的受试者的鼻刷，所述鼻刷包含未分化的基底细胞和分化的纤毛细胞，

(b)培养从步骤(a)获得的细胞作为用于获得未分化的基底细胞和去分化的纤毛细胞的浸没(submerse)细胞培养物，

(c)培养从步骤(b)获得的未分化的基底细胞和去分化的纤毛细胞作为气液界面细胞培养物并进行气升，

(d)用编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需的蛋白的多核糖核苷酸转染从步骤(c)获得的细胞，

(e)培养从步骤(d)获得的转染细胞以用于获得分化的纤毛细胞，以及

(f)使用乳酸脱氢酶测量、NucGreen测定、高速视频显微镜检查、纤毛搏动频率测量、粘液纤毛清除率测定和/或免疫荧光染色来确定所述多核糖核苷酸对纤毛形成的作用。

为了获得患者的呼吸上皮的细胞，鼻刷是有利的，因为其易于操作并且程序对于患者来说是快速且无痛的。从鼻刷获得的细胞包括可以培养为浸没细胞培养物的未分化的基底细胞和分化的纤毛细胞。通过将细胞培养为浸没细胞培养物，可以获得未分化的基底细胞和去分化的纤毛细胞，因为浸没条件诱导上皮细胞的去分化。然后，将如此获得的去分化的纤毛细胞以及鼻刷的未分化的基底细胞培养为气液界面(ALI)细胞培养物。

步骤(c)的气液界面细胞培养物是指这样的细胞培养物，其特征在于细胞的基面与液体培养基接触，而顶面则暴露于空气。可以将细胞接种到例如细胞培养插入物的可渗透膜上，细胞培养插入物最初向顶隔室(apical compartment)和底隔室(basalcompartment)提供培养基。这也可以被称为“浸没细胞培养物”。一旦达到汇合，则使细胞经历“气升”步骤，其中培养基只供应到底隔室(basal chamber)上。这模拟了在例如呼吸系统中发现的条件，并且在未分化的纤毛细胞中诱导细胞分化，包括纤毛形成。因此，可以获得模拟呼吸系统的上皮的细胞，包括例如基底细胞和纤毛细胞，用于体外的进一步研究。

然后，可以用编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需的蛋白的多核糖核苷酸转染所获得的上皮模拟细胞。因此，将所述多核糖核苷酸引入到细胞中，这可以通过病毒感染或除了病毒感染以外的手段人工进行，以在细胞中表达外源性多核糖核苷酸。然后，培养转染的细胞，以用于从基底和未分化的纤毛细胞获得分化的纤毛细胞。因此，多核糖核苷酸(如mRNA)对纤毛形成的作用可以在体外确定，同时保留模拟呼吸系统的上皮的细胞环境，如在例如受试者中可以发现的。

多核糖核苷酸对纤毛形成的作用可以通过本领域技术人员已知的各种方法来确定。这些方法包括例如乳酸脱氢酶测量、NucGreen测定、高速视频显微镜检查、纤毛搏动频率测量、粘液纤毛清除率测定和/或免疫荧光染色。因此，可以进行乳酸脱氢酶测量(LDH)，以确定在细胞周围的环境中释放的LDH的量。相应的测定可以是比色测定，其中释放的LDH的量用酶促反应测量，该酶促反应将例如碘硝基四唑鎓(iodonitrotetrazolium)或四唑鎓盐转化为红色甲臜。因此，可以通过光谱学容易地读取测定。

可替代地或另外地，可以进行NucGreen测定。NucGreen是一种与核酸结合后的永久性绿色荧光核酸染色，并且可以用于研究例如转染的毒性相关效应。可替代地或另外地，可以对由转染的多核糖核苷酸编码的蛋白进行免疫荧光染色，以确定其量和细胞定位，包括与其他蛋白的共定位。为了确定表达的蛋白的量，也可以使用蛋白印迹技术。

此外，纤毛结构缺陷或纤毛的缺乏可以例如使用专业显微镜检查来检测。筛选试验包括例如鼻一氧化氮生成率的测量、通过对鼻细胞进行高速视频显微镜检查纤毛运动、或进行包括糖精试验的体内试验。更具体的诊断需要例如通过免疫荧光和透射电镜检查纤毛。

可替代地或另外地，可以应用纤毛搏动频率测量，以使用高速视频显微镜检查来研究搏动频率、搏动纤毛和纤毛细胞的数量以及搏动同步性。这同样适用于粘液纤毛清除率测定，可以进行该测定以确定受纤毛功能影响的粘液清除率。

关于在所述方法中待使用的多核糖核苷酸，与上文结合用于治疗纤毛疾病的本发明的药物组合物所述相同。此外，这种多核糖核苷酸的其他特征也可以如上所述。

此外，多核糖核苷酸可能含有编码标志物的序列。示例包括如在所附实例以及相应的检测方法中所述的tdTomato(如例如在SEQ ID NO:3中包含的)、绿色荧光蛋白(GFP)和增强型GFP(eGFP)。这对于验证用多核糖核苷酸成功转染细胞尤其有利。

在用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法的一些实施例中，在步骤(c)中进行气升后0至12天内，优选地0至11天内，更优选地0至6天内，甚至更优选地0至4天内，并且最优选地0至48小时内转染细胞。这是有利的，因为气升步骤诱导基底和未分化的纤毛细胞的纤毛形成。

在用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法的一些实施例中，使用具有式(V)、(VI)和/或(VII)所示的结构的类脂质，用编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需的蛋白的多核糖核苷酸(优选地mRNA)转染细胞。

在用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法的一些实施例中，在步骤(b)至(e)中使用培养基G培养细胞。培养基G的组成通常如表2所示)。

表2

物质	体积	最终浓度
			DMEM/Ham's F12	100mL
Ultroser G	2mL	2％
			胎儿克隆II	2mL	2％
胰岛素	100μL	2.5μg/mL
			牛脑提取物	250μL	22.5μg/mL
转铁蛋白	100μL	2.5μg/mL
			氢化可的松	20μL	20nM
3,3',5-三碘-L-甲状腺氨酸	3.33μL	500nM
			肾上腺素	10μL	1.5μM
视黄酸	10μL	10nM
			磷酸乙醇胺	5μL	250nM
乙醇胺	100μL	250nM
			DAPT	10μL	1μM

在用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法的一些实施例中，在步骤(b)至(e)中使用表3所示的培养基之一来培养细胞。表3所示的培养基是市场上一些可以用于使ALI培养物生长的市售培养基。

表3

供应商	生长阶段	分化阶段
			LONZA	ALI-G	ALI-D
StemCell	ALI-Ex	ALI-M
			Epithelix	MucilAir	MucilAir
PELOBiotech	Pelo	Pelo

在用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法的一些实施例中，鼻刷进一步包含成纤维细胞，并且其中所述成纤维细胞的生长在步骤(b)至(e)中被抑制。这是有利的，因为与基底和未分化的纤毛细胞相比，成纤维细胞生长得更快，并且因此可以妨碍如上所述的多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的研究。

在将细胞转移到固定相的烧瓶中之前，由于1-2小时的短孵育时间，成纤维细胞可以与其余细胞分离。在该时间期间，成纤维细胞可以沉降(settle down)并粘附在细胞烧瓶上。所有其他细胞作为悬浮细胞保留在培养基中，并且之后可以很容易地被转移到“固定相烧瓶”中。

根据本发明的方法优选地导致多核糖核苷酸的鉴定，所述多核糖核苷酸对纤毛形成具有积极作用并且可以用于恢复纤毛细胞结构的功能，并且因此，导致根据第二方面的药物组合物以及其在治疗患有根据本发明第一方面的纤毛疾病的受试者的纤毛疾病中的用途。因此，关于多核糖核苷酸的特征，与上文结合本发明用于治疗纤毛疾病的药物组合物所述相同。此外，这种多核糖核苷酸的其他特征也可以如上所述。

图1：CCDC40 mRNA的翻译效率。将2/1.4/0.3/0.2/0.05x10^6HEK293细胞接种在6孔板中。接种后24小时，使用Lipofectamine2000用不同的CCDC40构建体(ETH031T06-T10，2.5μg/9.5cm²)转染细胞。转染后6、24、48、72和144小时进行细胞裂解。使用SDS-PAGE和蛋白印迹分析50μg的总蛋白裂解物。使用来自Atlas Antibodies(1:2000)的抗CCDC40抗体(HPA022974)检测CCDC40。GAPDH用作加载对照。GFP用作转染对照。

图2：在BEAS-2B、RPMI2650和HEK293细胞中CCDC40 mRNA构建体的翻译效率：将2×10^6HEK293、7.5×10^5BEAS-2B和5×10^5RPMI 2650细胞接种在6孔板中。接种后24小时，使用Lipofectamine2000用不同的CCDC40构建体(2.5μg/9.5cm²)转染细胞。转染后6小时进行细胞裂解。用SDS-PAGE和蛋白印迹(HEK293：50μg，RPMI 2650：20μg，BEAS-2B：30μg的总裂解物)分析蛋白裂解物。使用来自Atlas Antibodies(1:2000)的抗CCDC40抗体(HPA022974)检测CCDC40。

图3：LF92/CCDC40转染后的高速视频显微镜检查(HSVM)结果。每隔一天用3μg的LF92/CCDC40转染患者来源的ALI培养物。转染前和转染后每24小时，拍摄视频(每插入物20个)，并使用Sisson-Ammons视频分析(SAVA)软件来计算纤毛搏动频率(CFB)。进行了全部(Allover)16次转染(1个月)。测量在37℃下使用40倍放大倍数进行。计算的是纤毛搏动频率测量值的平均值(全视野分析，WFA)。

图4：显示为Z投影和极谱图(Polargraph)的粘液纤毛清除率(MCC)。在气升后18天，用浓度为3μg/插入物的CCDC40 mRNA/LF92转染CCDC40患者ALI培养物。在实验期间，ALI培养物被保存在培养基G中。转染(TF)每周进行一次，持续4周(＝4×TF)。使用0.5μm荧光珠在20倍放大倍数下测量粘膜纤毛清除率(MCC)。最后一次TF后一周，用来自尼康公司的Polargraph软件拍摄并分析不同区域的30秒视频。显示了一幅示例性图片。

图5：tdTomato的粘膜纤毛清除率(MCC)作为Z投影(左上)和极谱图(右上)示出，并且健康对照(右下)作为极谱图示出。上排：在ALI培养物中来自具有CCDC40突变的患者的细胞在气升后18天以3μg/插入物的浓度用tdTomato mRNA/LF111转染。在实验期间，ALI培养物被保存在培养基G中。转染(TF)每周进行一次，持续4周(＝4×TF)。使用0.5μm荧光珠以30倍放大倍数来测量粘膜纤毛清除率(MCC)。最后一次TF后一周，使用来自尼康公司的Polargraph软件拍摄并分析不同区域的20秒视频。示出了一个示例性视频。右下：健康WTALI培养物的颗粒追踪。使用0.5μm荧光珠以20倍放大倍数来测量MCC。最后一次TF后一周，使用来自尼康公司的Polargraph软件拍摄并分析不同区域的20秒视频。显示了一幅示例图片和两个分析的ROI。

图6：在气升后18天，用tdTomato mRNA/LF111或CCDC40 mRNA/LF92以3μg/插入物的剂量来转染ALI培养物中来自具有CCDC40突变的患者的细胞。在实验期间，ALI培养物被保存在培养基G中。转染(TF)每周进行一次，持续4周(＝4×TF)。使用了来自健康鼻刷的WTALI作为对照。用于冷冻包埋的样品在最后一次TF后一周制备。在20μm处切割CCDC40 mRNA和tdTomato mRNA处理的ALI膜，并用抗GAS8(红色)、抗乙酰化微管蛋白(绿色)和DAPI(蓝色)染色。用共焦显微镜拍摄图片。示出了一个示例性图像。比例尺代表10μm。

图7：在气升后18天，用tdTomato mRNA/LF111或CCDC40 mRNA/LF92以3μg/插入物的剂量来转染ALI培养物中来自具有CCDC40突变的患者的细胞。在实验期间，ALI培养物被保存在培养基G中。转染(TF)每周进行一次，持续4周(＝4×TF)。使用来自健康对照的ALI作为对照。用于冷冻包埋的样品在最后一次TF后一周制备。在20μm处切割CCDC40 mRNA和tdTomato mRNA处理的ALI膜，并用抗DNALI1(红色)、抗乙酰化微管蛋白(绿色)和DAPI(蓝色)染色。用共焦显微镜拍摄图片。示出了一个示例性图像。比例尺代表10μm。

图8：在气升后18天，用tdTomato mRNA/LF111或CCDC40 mRNA/LF92以3μg/插入物的剂量来转染ALI培养物中来自具有CCDC40突变的患者的细胞。在实验期间，ALI培养物被保存在培养基G中。转染(TF)每周进行一次，持续4周(＝4×TF)。使用来自健康对照的ALI作为对照。用于冷冻包埋的样品在最后一次TF后一周制备。在20μm处切割CCDC40 mRNA和tdTomato mRNA处理的ALI膜，并用抗CCDC39(1:200，红色)、抗乙酰化微管蛋白(1:10.000，绿色)和DAPI(蓝色)染色。用共焦显微镜拍摄图片。示出了一个示例性图像。放大40倍。

图9：转染后6小时和24小时，CCDC39蛋白(110kDa)在HEK-293&BEAS-2B中的表达。将1.4×10^5HEK-293细胞和3.5×10^5BEAS-2B细胞接种在6孔板中，并用CCDC39-RNA(ETH047T02，最小5'UTR，Lipofectamine MessengerMax；比率1:1.5)转染。在6小时和24小时后，用M-PER和Triton X-100缓冲液裂解细胞。使用50μg的蛋白裂解物进行蛋白印迹分析。使用未转染(UT)和EGFP转染的细胞的裂解物作为对照。高剂量＝0.5μg/cm²，低剂量＝0.25μg/cm²。

图10：

未处理的ALI培养物中的CCDC39蛋白(110kDa)表达。使用轴丝提取方案提取两个插入物。使用30μL、10μL和5μL的蛋白裂解物进行蛋白印迹分析。有效区域：插入物39.9＝71.25％，插入物41.2＝59.88％

图11：

在用蛋白酶体抑制剂处理后，16HBE14o-中的CCDC39蛋白(110kDa)表达。将6.0×10^5 16HBE14o-细胞接种在6孔板中并用CCDC39-RNA(Lipofectamine MessengerMax；比率1:1.5)转染。在6小时后，用M-PER缓冲液裂解细胞。使用20μg的蛋白裂解物进行蛋白印迹分析。使用未转染(UT)和EGFP转染的细胞的裂解物作为对照。高剂量＝0.5μg/cm²，低剂量＝0.25μg/cm²。RNA：ETH047T02：最小5'UTR，ETH047T03：TISU，ETH047T04：CYBA，ETH047T05：SP30。

图12：在用蛋白酶体抑制剂处理后，16HBE14o-中CCDC39蛋白(110kDa)的表达。将6.0×10^5 16HBE14o-细胞接种在6孔板中，并用CCDC39-RNA(ETH047T03，TISU 5'UTR，Lipofectamine MessengerMax；比率1:1.5)转染。在24小时后，用M-PER缓冲液裂解细胞。使用20μg的蛋白裂解物进行蛋白印迹分析。使用未转染(UT)和EGFP转染的细胞的裂解物作为对照。高剂量＝0.5μg/cm²，低剂量＝0.25μg/cm²。

本发明的其他方面和优点将在以下实例中描述，这些实例是为了举例说明而不是为了限制而给出。在本申请中引用的每个出版物、专利、专利申请或其他文件据此通过引用以其整体并入。

实例

本文描述了用于本公开的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在是限制性的。

I.材料和方法

所使用的材料、装置、软件和测试系统

材料在表4中列出。

表4

在表5中列出了装置。

表5

在表6中列出了软件。

表6

在表7中列出了测试系统。

表7

测试系统	物种	菌株
			HEK 293	人原代胚胎肾	DSMZ号：ACC305
RPMI 2650	间变性鳞状细胞癌	DSMZ号：ACC207
			BEAS-2B	支气管上皮	ATCC号：CRL 9609

I.浸没细胞培养物

1.培养

在37℃和5％CO₂含量的加湿气氛下，在细胞培养箱中培养细胞系。在使用前，在水浴中将所有试剂和溶液加热至37℃。

首先用20mL的DPBS(无Mg²⁺/Ca²⁺)洗涤汇合细胞(约90％)，以去除死亡细胞。为了使细胞脱离，向每个烧瓶中加入2mL的胰蛋白酶/EDTA溶液(0.05％)。然后在37℃下孵育细胞，直到发生细胞脱离。使用8mL的相应培养基来终止胰蛋白酶。因为LHC-9培养基几乎不含血清，所以向脱离的BEAS-2B细胞中加入至少等体积的胰蛋白酶抑制剂，以使胰蛋白酶化(trypsinisation)失活。然后，必须以每分钟1100转(rpm)将细胞溶液离心5分钟(min)，以再次去除胰蛋白酶抑制剂。然后将沉淀溶解在培养基中。对于传代，根据下次使用将细胞以不同的比率分裂。

HEK 293(DSMZ号：ACC305)

这一建立的细胞系来自通过5型腺病毒(AD 5)转化的人原代胚胎肾。在杜尔贝科改良Eagle培养基(DMEM)-GlutaMAX^TM补充剂(其含有10％的热灭活(h.i.)的胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素(P/S))中培养。这一细胞系每周分裂两次。

RPMI 2650(DSMZ号：ACC207)

这一细胞系来源于一名52岁患有鼻中隔的间变性鳞状细胞癌的男性的胸腔积液。因为纤毛上皮样形态和与细支气管上皮的相似性而选择了它。还在杜尔贝科改良Eagle培养基(DMEM)-GlutaMAX^TM补充剂(其含有10％热灭活(h.i.)的胎牛血清(FBS)+1％青霉素/链霉素(P/S)+1×非必需氨基酸溶液(NEAA))中培养。这一细胞系每周分裂1-2次。

BEAS-2B(ATCC号：CRL 9609)

BEAS-2B细胞来源于从非癌个体的尸检中获得的正常支气管上皮。然后用复制缺陷型SV40/腺病毒12杂交体感染细胞并克隆。使用的培养基是含有改良无添加剂的LHC-9。细胞根据汇合每周分裂1-2次。

用于BEAS-2B细胞的烧瓶涂覆有溶解在LHC-9中的0.01mg/mL的纤连蛋白、0.03mg/mL的胶原蛋白和0.01mg/mL的牛血清白蛋白的混合物。以0.2mL/cm²表面积的比率加入混合物。然后，必须在37℃下孵育至少6小时。在添加细胞前，用无Mg²⁺/Ca²⁺的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤烧瓶三次。

2.体外转录

为了生成用于体外转录的模板，用BstBI通过限制性消化将环状质粒线性化，并通过氯仿乙醇沉淀进一步纯化。

使用含有T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶和RNA酶抑制剂的标准体外转录混合物(包括指定的修饰的三磷酸核苷酸)产生mRNA。通过添加ARCA帽类似物来实现共转录封端。对于化学修饰的RNA的体外转录，7.5％的胞苷-5'-三磷酸被5-碘胞苷-5'-三磷酸替代，并且30％的尿苷-5'-三磷酸被5-碘尿苷-5'-三磷酸取代(Jena Biosciences)(参见例如SEQ IDNO:1)。在另一个化学修饰的RNA生产设置(setup)中，3％的胞苷-5'-三磷酸被5-碘胞苷-5'-三磷酸取代，并且15％的尿苷-5'-三磷酸被5-甲基-尿苷-5'-三磷酸取代(JenaBiosciences)(参见例如SEQ ID NO:2)。使用DNaseI消化残留模板DNA。随后，通过醋酸铵沉淀纯化mRNA，接着使用70％乙醇进行洗涤步骤。

使用快速去磷酸化试剂盒(Quick dephosphorylation Kit)对残留的未封端mRNA进行去磷酸化，然后通过醋酸铵沉淀进行纯化，随后使用70％乙醇进行洗涤步骤，并且使用100MWCO截止过滤器(cut of filter)进行超滤。

使用聚(A)聚合酶将mRNA进一步聚腺苷酸化。再次通过醋酸铵沉淀纯化mRNA，然后使用70％乙醇进行洗涤步骤，并且使用100MWCO截止过滤器进行超滤。聚(A)长度通过毛细管凝胶电泳被确定为100至250个核苷酸。

特别地，本实验中研究的CCDC40 mRNA构建体包含5'ARCA帽和PPA，并且为如下：具有Ethris的最小UTR(ETH031T06；T06；SEQ ID NO:5)、具有TISU 5'UTR但没有3'UTR(ETH031T07；T07；SEQ ID NO:6)、具有hAg 5'UTR但没有3'UTR(ETH031T08；T08；SEQ ID NO:7)、具有CYBA 5'和3'UTR(ETH031T0；T09；SEQ ID NO:1)以及具有来自人CMV IE9的5'UTR和来自人生长激素的3'UTR(ETH031T0；T10；SEQ ID NO:8)。

3.转染

为了提供至少90％的汇合，在转染前24小时将细胞接种在6孔板中。细胞计数根据读出的时间点和细胞类型而不同(比较表8)。

表8

使用不同的CCDC40 mRNA构建体以及编码增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的mRNA作为转染对照进行转染。使用

2000进行转染。在转染之前，交换培养基以为细胞提供最佳条件。脂质复合物反应需要mRNA/WFI混合物以及

2000/培养基混合物。使用125μL的每种混合物，其中mRNA与

2000的体积比为1:2，因为mRNA显示1μg/μl的储液浓度(stock concentration)。使用了不同的mRNA浓度，并相应地调整了混合物(对于示例性的移液方案，参见表9)。

表9

在制备两种混合物后，将mRNA/WFI混合物添加到

2000/培养基混合物中，并将溶液孵育持续≥5分钟，然后将其逐滴添加到接种的细胞中。为了获得更好的细胞存活率，在转染后4小时进行了另一次培养基更换。

4.CCDC40蛋白印迹

a.用于蛋白印迹的取样

对于细胞裂解，移除来自转染的培养基，并用DPBS(无Mg²⁺/Ca²⁺)洗涤细胞，然后使用康宁

细胞刮除器刮去细胞。在-20℃下冷冻样品之前，用100μL的裂解缓冲溶液[10×TritonX-100裂解缓冲液(250mM Tris-HCl，1％TritonX-100，pH：7.8)在WFI中被调节至1×并且补充有蛋白酶抑制剂cOmplete]裂解细胞。

总蛋白浓度使用Pierce^TMBCA蛋白测定试剂盒(BCA测定法)来确定。根据制造商的方案进行测定。简言之，制备了1:50BCA工作试剂(WR)稀释液。将5μL的每个样品转移至96孔板(平底，透明)中，并向每个孔中加入200μL的WR。最后一步是在37℃下孵育30分钟。使用Magellan^TM-数据分析软件在Tecan

200PRO板读取器上测量结果。

b.NET-明胶的制备

表10

物质	最终浓度
		TRIS/HCl，pH 7.5	0.2M
EDTA，pH 8.0	0.05M
		Triton-X100	0.5％(v/v)
NaCl	1.16M
		明胶	25g/L

c.SDS-PAGE和蛋白印迹

为了进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将裂解物与5μL的Bolt LDS样品缓冲液(4×)和2μL的Bolt样品还原剂(10×)混合，然后在

C中以350rpm加热至70℃持续10分钟。为了能够在一种凝胶上在样品之间进行比较，加载了相同量的总蛋白。将7μL的标志物(Precision Plus Protein^TM双色标准品)填充到每种凝胶的第一个口袋中，以使得随后能够实现准确蛋白大小估计。然后，将凝胶罐连接到电源(PowerPAC 300)上，在1A下持续30分钟。随后用抹刀(spatula)打开盒子，然后将凝胶移动至印迹台。

根据制造商的说明，使用转移系统(

Turbo^TM转移系统，30分钟，25V，1A)和合适的膜(Trans-Blot Turbo转移包Mini 0.2μm PVDF)进行印迹。通过在“三明治”上滚动滚轮，可以消除任何可能干扰蛋白转移的气泡。为了封闭游离结合位点，将膜放入到NET-明胶中，并且在平板摇动器上摇动60分钟。在75kD条带处切取凝胶，以同时检测CCDC40和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase，GAPDH)。用NET-明胶稀释抗体(抗CCDC40 6mL中的1:2000，GAPDH 10mL NET-明胶中的1:10000)，并且将膜与其相应的抗体在平板摇动器上在4℃下孵育过夜。GAPDH用作加载对照。在表11中示出了所用抗体的列表。第二天，用NET-明胶洗涤膜3次，持续10分钟，以去除非特异性结合或残留的抗体。用NET-明胶以1:10,000稀释二级抗体山羊抗兔IgG-HRP。在室温(RT)下，在平板摇动器上孵育60分钟后，再次用NET-明胶将膜洗涤3次，每次10分钟。可以通过分子成像仪(ChemiDoc^TMXRS系统)检测辣根过氧化物酶HRP缀合的二级抗体。因此，在凝胶上加入5mL的Luminata Crescendo Western HRP底物，并且孵育5分钟。未过度曝光的最后一张图片和比色图片随后被合并，并且用Image Lab^TM软件显示。此外，随后使用Image Lab^TM来确定条带强度。

表11

II.ALI培养物

1.人呼吸上皮细胞(hREC)的取样

a.鼻刷

将RPMI培养基加热至室温，并用无菌等渗盐水溶液润湿刷。使用了带有保护尖端的Celletta^TM刷式细胞收集器。在要求患者清洁他的鼻子后，他不得不坐在椅子上，其中头靠在墙上来支撑头部。使用旋转和直线运动，将刷子快速摩擦下鼻道的内侧和上侧几次。在取出刷子时，立即将其放入装有5mL的预热RPMI培养基的收集管(15mL腹管)中。在管内剧烈摇晃刷子至少40次，以使细胞从刷子上脱离。

b.固定化培养

在室温下以900rpm转速旋转管5分钟。在弃去上清液后，将沉淀溶于UG培养基[DMEM/Ham's F-12 1:1，含5mL的无菌100×抗生素/真菌学物质和10mL无菌Ultroser G]。5mL的培养基用于T25，并且25mL用于T75烧瓶。

将细胞转移至细胞培养瓶后，将细胞在37℃下在加湿培养箱中用5％CO₂孵育过夜。细胞应在20-24小时后附着。每周(周一、周三和周五)更换3次UG培养基。

2.ALI培养物的产生及转染

a.transwell插入物的涂层(Coating)(0.33cm²)

使用以下平板用于ALI培养物：具有透明聚酯膜的康宁Transwell(0.4μm孔，6.5mm直径的插入物，24孔板)。将大鼠尾胶原蛋白在乙酸中以1:5稀释，并将250μL加载于每一插入物的顶端侧。在室温下孵育平板过夜后，用巴斯德移液器吸取剩余液体，然后将平板打开盖子晾干至少5分钟(无菌)。最后，用DPBS(无Ca²⁺/Mg²⁺)洗涤插入物两次，然后在室温(无菌)下干燥过夜。插入物在4℃下储存高达一个月。

b.作为浸没培养物(固定培养物)的hREC的细胞扩增

每2至3天(星期一、星期三和星期五)用15mL预热的UG培养基喂养细胞。必须注意不要将新培养基直接添加到胶原层上，以防止胶原层的损伤和细胞的脱离。一旦细胞为80％汇合或胶原层开始脱离，细胞就被转移至ALI过滤器(在浸没培养物中约3周后)。

c.培养基G的制备

测试了不同的ALI培养基，但自制培养基G是优选的。

制备此培养基一周，但需要在4℃下储存。根据即将进行的实验大小，将批以等分试样冷冻。表2示出了培养基G的组成。

d.hREC的接种和气升(ALI培养物)

1.吸取UG培养基，用洗涤培养基[DMEM/Ham's F-12 1:1与1×无菌抗生素/抗真菌剂(AA)]或DPBS(无Ca²⁺/Mg²⁺)洗涤一次

2.如果用自制鼠尾胶原蛋白涂覆烧瓶：

a.通过加入9mL的胶原酶(1×)溶解胶原蛋白层，并在37℃下孵育45-60分钟

b.将细胞移入到15mL的腹管中，并在室温下以1000rpm离心5分钟

c.用洗涤缓冲液洗涤细胞(1000rpm，室温，持续5分钟)

d.加入2mL的胰蛋白酶EDTA(1×)，并上下轻轻地吸移以分离细胞，在37℃下孵育细胞，并摇晃腹管，直到细胞簇崩解(约5分钟)

如果用购自gibco的胶原蛋白涂覆烧瓶：

a.向细胞培养瓶中加入3ml的胰蛋白酶EDTA(1×)，直到细胞脱离(约5分钟)

3.通过加入0.5mL的FBS和5mL的洗涤培养基(wash medium)来终止胰蛋白酶

4.将细胞移入到15ml的falcon中，并用洗涤培养基洗涤细胞两次(1000rpm，室温，持续5分钟)

5.将沉淀重新悬浮在适量的ALI培养基(1-2mL，取决于沉淀大小)中，并使用细胞计数器计数细胞

6.将250μL的细胞悬浮液(400,000个细胞/mL)加入到每个在基底外侧有500μLALI培养基的胶原蛋白涂覆的transwell中

7.在加湿的5％CO₂培养箱中在37℃下孵育细胞过夜

第3-5天：ALI-生长

8.始终在显微镜下检查插入物

9.每天用ALI培养基喂养细胞，直到80-100％汇合(3-4天)

ALI-分化

10.当达到80-100％汇合时气升细胞

a.从顶端侧和基底外侧抽吸ALI培养基

b.向基底外侧隔室中加入500μL的新鲜ALI培养基

c.在37℃下在加湿的5％CO₂培养箱中孵育细胞

11.每周一次用预热的洗涤培养基(顶端)洗涤细胞，并且每2-3天(或周一–周三–周五)用ALI培养基喂养细胞

e.hREC的转染

将制剂(LF111-mRNA)在2％蔗糖中稀释至3μg/插入物(＝9μg/cm²)的最终浓度。为了去除粘液，将插入物用200μL DPBS(无Ca²⁺/Mg²⁺)在顶侧上洗涤，并在转染前在37℃下(Epithelix ALI)或200μL DPBS(无Ca²⁺/Mg²⁺)在顶侧上孵育20分钟，并且在室温下(hREC，UKM)孵育5分钟。然后，通过轻柔抽吸从顶面去除DPBS(无Ca²⁺/Mg²⁺)，而不损伤上皮。在粘液洗涤后，立即用WFI(100μL)再次洗涤细胞，以去除痕量的DPBS(无Ca²⁺/Mg²⁺)。在插入物的顶侧上加入25μL的制剂以允许细胞摄取。在培养6小时后移除载体，用200μL DPBS(无Ca²⁺/Mg^{2 +})洗涤细胞一次，并且将培养物维持为ALI，而在顶侧无液体。

3.读出测定法

采用各种读出测定法。LDH测量和NucGreen测定被用于研究转染的毒性相关效应。需要纤毛搏动频率测量(CBF)，以检查关于搏动频率和纤毛面积的百分比的纤毛搏动的方式。如果纤毛搏动导致定向流动，则可以使用粘膜纤毛清除率(MCC)测定进行研究。利用CCDC40、其异二聚体配偶体CCDC39和纤毛标志物乙酰化α-微管蛋白的免疫荧光(IF)染色来检测在处理后是否可以在纤毛中检测到CCDC40蛋白或其配偶体CCDC39。此外，动力蛋白调节复合物(DRC)的蛋白如GAS8和DNALI1也被染色。DRC由CCDC40/CCDC39锚定，并且只有在CCDC40/CCDC39被正确地整合到纤毛轴丝中时才存在。

a.LDH测量

LDH浓度使用Pierce^TM乳酸脱氢酶细胞毒性测定试剂盒(Pierce^TMLactateDehydrogenase Cytotoxicity Assay Kit)来测量。如制造商的方案中所描述的执行程序。在37℃和5％CO₂下，用100μL的DPBS(有Mg²⁺/Ca²⁺)在顶侧上孵育ALI培养物30分钟。利用96孔形式混合50μL的LDH反应混合物和50μL的孵育培养基(incubation medium)，并在室温避光孵育30分钟，加入50μL的终止溶液。在490nm和680nm下，使用微板读取器(TriStar2多模式读取器LB 942)测量甲臜的吸光度。从490nm减去680nm值，用于背景归一化。对每种插入物进行了双重测定。

b.纤毛搏动频率(CBF)测量

通过高速视频显微镜检查和Sisson-Ammons视频分析对hREC进行纤毛搏动频率(CBF)分析。视频(125fps，640×480像素分辨率)是在生理条件下，通过经由微型试管SC300加热系统将温度保持在36℃，使用附接到配备有ELWD 40x S Plan Fluor物镜的倒置相差显微镜上的Megaplus相机ES 310turbo型号记录的。

c.粘液纤毛清除率测定(MCC，荧光珠)

将ALI培养基和DPBS(无Ca²⁺/Mg²⁺)预热至室温，并将显微镜的板加热至37℃。将ALI插入物转移至新板上，并用预热的ALI培养基(备选方案DPBS，无Ca²⁺/Mg²⁺)在顶部洗涤两次。在每个插入物记录20个视频(放大40倍，Ph2)之前，向顶隔室中添加100μL的ALI培养基，以获得插入物的整体印象(SAVA软件)。将直径为0.5μm的红色荧光颗粒以1:1000稀释在DPBS(无Ca²⁺/Mg²⁺)中，并涡旋至少1分钟。将10μL的颗粒稀释液加入到100μL的ALI培养基中，涡旋，并将110μL加入顶隔室中。在处理珠时，在每一步之前涡旋以防止凝集是重要的。此外，有必要在昏暗的光线下工作，以避免褪色。

使用NIS-Elements Basic Research软件记录荧光颗粒的流动。使用20倍放大倍数(Ph1)在20-30秒内记录运动，同时使用488nm激光激发颗粒。曝光时间必须调整到每秒记录的帧数(fps)。对于7.5fps，曝光时间被设置为100ms，并且对于15fps，曝光时间被设置为50ms。用SAVA(20倍放大倍数，Ph1)分析确切的观察区域，以可视化纤毛运动和细胞层的3D结构。

对于评估和数据分析，采用尼康NIS Elemets AR软件，NIS PLUG-IN<ADVANCED 2DTRACKING><AR>(参见上文NIS Elements AR跟踪模块)。

d.ALI培养物的IF

ALI培养物的包埋

在膜制备之前，使用DPBS(无Mg²⁺/Ca²⁺，200μL，1分钟，室温)洗涤ALI插入物两次，以除去粘液。根据以下方案(参见下文)进行以下膜制备。

使用解剖刀或注射器切下transwell滤膜，然后将膜转移到含3mL DPBS(Ca²⁺/Mg^{2 +})的培养皿中。将膜切成等份(4-6)，并用Shandon Cryomatrix^TM冷冻包埋介质(中等大小)制备冷冻模具(cryomold)。将膜片放入冷冻基质(cryomatrix)中并相互平行布置，然后在干冰上孵育冷冻模具，直到冷冻基质硬化。将冷冻模具在-80℃下储存至少2小时，然后在低温恒温器下切割。

ALI膜的切割

使用Microm HM560低温恒温器切割Shandon Cryomatrix^TM中包埋的ALI膜。因此，低温恒温器被预冷却(切割前2-3小时)至-20℃(工作台为-21℃，并且腔室为-25℃)。将含有冷冻模具的ALI膜从-80℃转移至-20℃，持续至少1小时。根据膜的处理条件，在20μm下进行膜切割。将膜切片转移至Superfrost Ultra Plus载玻片上，在室温下干燥至少1小时，并在-80℃下储存过夜或者直到在-80℃下使用。

染色程序

对于使用的抗体，参见表12。

第1天：

1.室温下用1×DPBS(Ca²⁺/Mg²⁺)洗涤5分钟

2.固定：4％PFA/1×DPBS(Ca²⁺/Mg²⁺)在室温下持续15分钟

3.洗涤3×DPBS(Ca²⁺/Mg²⁺)(2次快速，1次5分钟)

4.透化：

a.0.5％Triton X-100für 5分钟或

b.0.2％Triton X-100für 10分钟(取决于所用的抗体)

5.在室温下洗涤3×DPBS(Ca²⁺/Mg²⁺)(2次快速，1次5分钟)

6.封闭：在室温下，5％正常山羊血清+在DPBS(Ca²⁺/Mg²⁺)中的2％BSA或在DPBS(Ca^{2 +}/Mg²⁺)中的5％DPBS脱脂奶→2小时

7.一级抗体：200μl在4℃下过夜

第2天：

8.用DPBS(Ca²⁺/Mg²⁺)洗涤45分钟(3×15分钟)

9.二级抗体：200μl在室温下持续1小时

10.在DPBS(Ca²⁺/Mg²⁺)中的Hoechst33342 1:1000，在室温避光持续10分钟

11.用DPBS(Ca²⁺/Mg²⁺)洗涤6×5分钟

12.安装带有Dako antifade的盖玻片

表12

e.ALI培养物上的气刷

采用气刷模型来产生分化的ALI培养物。方案是在Crespin等人,2011(研究人气道上皮细胞的分化和修复的方法(Approaches to Study Differentiation and Repair ofHuman Airway Epithelial Cells))之后建立的。

用预热的DPBS(Mg²⁺/Ca²⁺)在顶侧短暂洗涤细胞。通过运行气刷并转动小轮，将连接至气刷的压缩机设定为1kg/cm²。气刷可能需要运行一段时间以保持在恒定值。然后，用DPBS(Mg²⁺/Ca²⁺)填充气刷顶部上的小储器，并将插入物放置在没有基础培养基的新板上。通过按压至第一压力点并等待直到压缩机上的压力保持恒定，来启动气刷。然后，将气刷垂直放置在插入物的顶部上，并将气刷的杆压至略高于第一压力点[将DPBS(Mg²⁺/Ca²⁺)从储器中分散]持续2秒。之后，用预热的DPBS(Mg²⁺/Ca²⁺)短暂洗涤插入物的顶侧，并将插入物放入在适用于ALI分化的新鲜培养基中。通过显微镜观察来检查伤口。如果伤口太小(小于插入物面积的1/3)或伤口中的细胞仅轻微脱离，则重复所述程序。将培养物在37℃、5％CO₂的加湿气氛中孵育，并作为ALI培养。

III.带标签的CCDC40 mRNA

在表13中示出了研究中的mRNA。

表13

a.细胞培养

在37℃、5％CO₂下在MEM GlutaMAX^TM，10％FBS，100U/ml P/S(＝培养基(cultivation medium))中培养HEK-293细胞。

在接种前，用DPBS洗涤细胞，并使用胰蛋白酶使细胞脱离。在胰蛋白酶化后，使用含有FBS的培养基使胰蛋白酶失活。因此，使用相同或更大体积的培养基。在以1100×g离心5分钟并重新悬浮在正常生长培养基中后，使用Countess细胞计数装置对细胞进行计数。

b.体外转录

为了生成用于体外转录的模板，用BstBI通过限制性消化将环状质粒线性化，并通过氯仿乙醇沉淀进一步纯化。

使用含有T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶和RNA酶抑制剂的标准体外转录混合物产生mRNA。通过添加ARCA帽类似物来实现共转录封端。对于化学修饰的RNA的体外转录，7.5％的胞苷-5'-三磷酸被5-碘胞苷-5'-三磷酸取代，并且30％的尿苷-5'-三磷酸被5-碘尿苷-5'-三磷酸取代。在另一个

生产设置中，3％的胞苷-5'-三磷酸被5-碘胞苷-5'-三磷酸取代，并且15％的尿苷-5'-三磷酸被5-甲基-尿苷-5'-三磷酸取代。使用DNaseI消化残留模板DNA。随后通过醋酸铵沉淀纯化mRNA，然后使用70％乙醇进行洗涤步骤。

使用快速去磷酸化试剂盒对残留的未封端mRNA进行去磷酸化，然后通过醋酸铵沉淀进行纯化，随后使用70％乙醇进行洗涤步骤，并且使用100MWCO截止过滤器进行超滤。

使用聚(A)聚合酶将mRNA进一步聚腺苷酸化。再次通过醋酸铵沉淀纯化mRNA，然后使用70％乙醇进行洗涤步骤，并且使用100MWCO截止过滤器进行超滤。聚(A)长度通过毛细管凝胶电泳被确定为100至250个核苷酸。

c.接种、转染和读出

处理前24小时，将细胞接种到96孔黑色微孔板(每孔25,000个细胞)中。接种后24小时，将新鲜培养基添加到每个孔(100μL)。使用

MessengerMAX^TM转染mRNA，RNA与Lipofectamine的比率为1:1.5(w/v)。采用250ng/96孔

eGFP-CCDC40(ETH031T28或ETH031T30)或HA-CCDC40-T2A-tdTomato(ETH031T26)mRNA。所有RNA具有1mg/mL的储液浓度。为了形成脂质复合物，将mRNA在重蒸馏水中稀释。将

MessengerMAX^TM在SFM(无血清培养基)中稀释，并通过吸移(pipetting)混合。在室温下孵育10分钟后，将RNA溶液加入到

MessengerMAX^TM溶液中，混合并在室温下孵育另外的5分钟。然后，将混合物在SFM中稀释两倍，然后将脂质复合物溶液加入到孔中。在表14中，计算了一个RNA的实例。

表14

转染后6小时和24小时，通过荧光显微镜检查来检查转染效率，以10倍放大倍数拍摄照片。

IV.CCDC39

mRNA(ETH047T02；SEQ ID NO:12)在研究中编码hCCDC39，并且包含Ethris的最小UTR。总计15％的尿苷-5'-三磷酸被5-甲基-尿苷-5'-三磷酸取代，并且总计3％的胞苷-5'-三磷酸被5-碘-胞苷-5'-三磷酸取代。所使用的抗体在表15中示出。

表15

1.浸没细胞培养中的CCDC39转染和蛋白印迹

a.细胞培养

BEAS-2B细胞在涂覆的烧瓶中的LHC-9培养基中培养。对于细节，参见上文I1。实验在未涂覆的平板上进行。

将HEK-293细胞在补充有热灭活的FBS和青霉素/链霉素(P/S)的MEM GlutaMax培养基中培养。

在接种前，用DPBS洗涤细胞，并用胰蛋白酶使细胞脱离。在胰蛋白酶化后，使用用于BEAS-2B的胰蛋白酶抑制剂或用于HEK-293的含有FBS的培养基使胰蛋白酶失活。因此，使用相同或更大体积的胰蛋白酶抑制剂/培养基。在以1100×g离心5分钟并重新悬浮在正常生长培养基中后，使用Countess细胞计数装置对细胞进行计数。考虑到2mL的接种体积和6孔板形式，获得了5.0×10⁵个接种的BEAS-2B细胞和1.4×10⁶个接种的HEK-293细胞。

b.转染

在处理前24小时，以相应的密度接种细胞。接种后24小时，向每个孔中加入2mL的新鲜培养基。使用

MessengerMAX^TM转染mRNA，RNA与Lipofectamine的比率为1:1.5(w/v)。所有RNA具有1mg/mL的储液浓度。为了形成脂质复合物，将mRNA在重蒸馏水中稀释。将

MessengerMAX^TM在SFM中稀释，并通过吸移混合。在室温下孵育10分钟后，将RNA溶液加入到

MessengerMAX^TM溶液中，混合并在室温下孵育另外的5分钟。然后，将脂质复合物溶液加入到孔中。在表16中，计算了一个6孔板的转染的实例。

表16

c.细胞裂解

为了获得最佳的细胞裂解，比较了两种不同的裂解缓冲液：Triton X-100缓冲液和市售裂解缓冲液M-PER^TM，这两种缓冲液均补充有蛋白酶抑制剂cOmplete(无EDTA)和40μL/mL的DNase I溶液(以23:1:1的混合物)。因此，将细胞接种到6孔板中，并处理6小时和24小时。在处理后，收获细胞。因此，使用1mL的DPBS洗涤一次板。为了从板中移除细胞，加入另外1mL的DPBS，并从板上刮下细胞，并且将细胞移动至Eppendorf管中。为了去除DPBS，将细胞在4℃下以6250×g离心2分钟。通过添加200μL的相应缓冲液进行细胞裂解。为了确保完全裂解，将细胞在冰上孵育30分钟。在裂解后，按照制造商的说明(具有以下更改)，使用BCA蛋白测定试剂盒进行BCA测定，以确定总蛋白浓度：

·向5μL细胞裂解物中加入200μL工作试剂

·样品和标准品一式三份测量

·在37℃下孵育样品30分钟之前，以450rpm摇晃平板30秒

d.样品制备

将样品与5μL的

LDS样品缓冲液和2μL的

样品还原剂混合，然后在70℃下加热10分钟，然后进行SDS-PAGE。30μg的总蛋白用于SDS-PAGE和Bolt^TM4-12％SDS-PAGE凝胶，使用10孔。

e.SDS PAGE和印迹法

使用了

Turbo^TM系统转移。应用200V进行SDS-PAGE持续40分钟。使用

TurboTM转移系统转移30分钟。

f.抗体及封闭方法

在转移后，将膜在室温下封闭1小时。使用NET-明胶作为封闭剂。来自atlasAntibodies的抗体HPA035364用于检测CCDC39，并且来自abcam的抗体ab8227用于检测肌动蛋白。在加入抗体之前，在约60kDa处切割膜。将膜与一级抗体在4℃下孵育过夜。在室温下用封闭溶液洗涤三次(每次10分钟)后，在室温下加入辣根过氧化物酶缀合的二级抗体持续1小时(稀释1:20 000)。在室温下再次用封闭溶液洗涤膜三次，每次10分钟。

g.化学发光信号的产生

使用化学发光底物试剂盒(Luminata Crescendo,Classico或Forte Western HRP底物，取决于信号的强度)和ChemiDocTM MP系统对信号进行可视化。

2.在分化的ALI培养物中内源性CCDC39的蛋白印迹

a.细胞裂解

向每个插入物中加入250μL的ALI裂解缓冲液(对于组合物的细节，参见表17)，并在冰上孵育15分钟。在孵育前、在孵育期间(每隔5分钟)和在孵育结束时，来回吸移ALI裂解缓冲液。在转移到eppendorf管中并用150μL的ALI裂解缓冲液冲洗每个插入物后，样品被彻底涡旋。在此步骤中，可以任选地将样品储存在-20℃下，直到进一步处理。

表17

物质	储液	最终	对于10ml
				TritonX-100	10％	1％	1ml
NaCl	1.5M	150mM	1ml
				SDS	1％	0.1％	1ml
Tris	250mM	50mM	2ml
				蛋白酶抑制剂cOmplete	25×	1×	0.4ml
WFI			4.5ml

b.从全细胞裂解物中分离轴丝裂解物

将样品添加到裂解基质A管中(管之前用70％的EthOH洗涤，并去除石榴石)。固定管，并在液氮中冷冻20秒，同时移动管。将管快速插入到MP FastPrep-24(HOM-1)中，设置：6.5m/s，3×1分钟。随后，让管在冰上冷凝(condense)15分钟，然后将液体转移到新鲜的Eppendorf管中，并以1100rpm、在4℃下旋转20分钟。将上清液转移到新的Eppendorf管中，并将沉淀和上清液储存在-20℃下，直到进一步处理。

c.轴丝提取物裂解物的制备：纤毛轴丝蛋白的高盐提取

将每个沉淀重新悬浮在50μl的MMRB+0.1％Triton X-100(对于MMRB+0.1％TritonX-100的组成的细节，参见表18)中，并在冰上孵育30分钟(偶尔有轻微涡旋)。在以14,000rpm在4℃下旋转10分钟后，将上清液转移到新的Eppendorf管中，并储存在-20℃下，直到进行进一步处理。

表18

表19

物质	最终
		HEPES，pH 7.4	30mM
MgSO<sub>4</sub>	5mM
		EDTA	0.1mM
NaCl	625mM

d.用于蛋白印迹的裂解物的制备

将样品在冰上解冻，并将30μl的样品转移到新的Eppendorf管中。加入12μL的LDS样品缓冲液和5μl的10×还原剂，然后在70℃、350rpm下加热样品10分钟。将5μl、10μl和30μl的溶液每孔施加到Bolt^TM4-12％SDS-PAGE凝胶上，10孔。

e.SDS PAGE和印迹方法：参见IV 1e

f.抗体和封闭方法：参见IV 1f

g.化学发光信号产生：参见IV 1g

II.结果

在转染后6小时、24小时、48小时、72小时、144小时检测HEK293细胞中CCDC40的表达。特别地，将2/1.4/0.3/0.2/0.05×10⁶个细胞接种在6孔板中，并在接种后24小时使用

000用不同的CCDC40构建体(2.5μg/9.5cm²)转染细胞。在本实验中使用的CCDC40 mRNA构建体为T06至T10(SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8)。在转染后6小时、24小时、48小时、72小时、144小时进行细胞裂解，并且用SDS-PAGE和蛋白印迹分析50μg的总蛋白裂解物。

如在图1中可以看出的，在HEK细胞中CCDC40 mRNA转染后6小时可检测到峰值翻译效率。

除了在这种情况下将2×10⁶个HEK293、7.5×10⁵个BEAS-2B和5×10⁵个RPMI 2650细胞接种在6孔板中，并使用SDS-PAGE和蛋白印迹分析蛋白裂解物(HEK293：50μg，RPMI2650：20μg，BEAS-2B：30μg总裂解物)之外，按上述方法进行下一个实验。使用来自AtlasAntibodies(1:2000)的抗CCDC 40抗体(HPA022974)检测CCDC40。

在本文中，可以观察到T09(CYBA；SEQ ID NO:1)和T10(来自人生长激素SEQ IDNO:8的人CMV IE9和3'UTR)UTR导致转染后6小时在BEAS-2B、RPMI2650和HEK293细胞中最高的翻译效率(图2)。

然后进行了两项实验，以研究患者来源的ALI培养物中纤毛运动性的恢复。特别地，在第一个实验中使用了非分化的ALI培养物(数据未显示)(纤毛细胞具有外显子1和2的缺失，导致非常短且较少活动的纤毛)，而在第二个实验中使用了分化的ALI培养物。在这两种情况下，均用3μg的LF92/CCDC40(ETH031T09；SEQ ID NO:1)每隔一天转染ALI培养物，持续1个月，共进行16次转染。作为读出，每24小时进行高速视频显微镜检查(HSVM)和免疫荧光免疫细胞化学(IF-ICC)。在转染前和转染后每24小时，拍摄视频(每插入物20个)，并使用SAVA软件计算CFB(纤毛搏动频率)。进行了全部16次转染(1个月)。测量在37℃下使用40倍放大倍数进行。计算纤毛搏动频率(CBF)的平均值。

LF92/CCDC40的重复转染在患者来源的完全分化的ALI培养物中耐受良好。通过IF-ICC可以在22天后气道上皮细胞的天然存在的亚细胞区(即纤毛)中检测到CCDC40蛋白，并且在LF92/CCDC40转染后纤毛运动性增加，直到第18天达到正常纤毛搏动频率的约50％，如在图3中关于用分化的ALI培养物的实验所看到的。

如在“材料和方法”部分中所述，使用培养基G获得未分化的ALI培养物，并在气升后18天开始转染(TF)。用CCDC40 mRNA/LF92转染(TF)CCDC40患者ALI培养物，每周一次，持续4周(＝4×TF)。使用0.5μm荧光珠以20倍放大倍数测量粘膜纤毛清除率(MCC)。最后一次TF后一周，使用来自尼康公司的Polargraph软件拍摄并分析了不同区域的30秒视频。

重要的是，可以检测到CCDC40患者ALI在四次CCDC40 mRNA/LF92每周转染后纤毛搏动的恢复。此外，纤毛搏动是同步的，这允许定向的颗粒转运，如在图4中可以看到的。为了比较，在图5中示出了在对照(即，四倍tdTomato mRNA/LF111转染)和健康对照的情况下的颗粒转运。

因此，在纤毛细胞的分化期期间，患者ALI培养物与LF92的成功CCDC40 mRNA/LF92TF(如与tdTomato对照的比较所示)导致成功的纤毛生长、成功的纤毛搏动、成功的定向颗粒转运和成功的蛋白检测(作为CCDC40+GAS8结合配偶体的CCDC39/作为DRC复合物的一部分的DNALI1)。此外，tdTomato对照插入物未表现出任何上述效应。

图6表明在使用CCDC40 mRNA重复处理患者ALI后，在轴丝内成功掺入了GAS8蛋白，如在健康对照中一样，而在对照(tdTomato mRNA)处理的患者ALI中不存在。图7表明在使用CCDC40 mRNA重复处理患者ALI后，在轴丝内成功掺入了DNALI-1蛋白，如在健康对照中一样，而在对照(tdTomato mRNA)处理的患者ALI中不存在。图8表明在使用CCDC40 mRNA重复处理患者ALI后，在轴丝内成功掺入了CCDC39蛋白，如在健康对照中一样，而在对照(tdTomato mRNA)处理的患者ALI中不存在。

综上所述，使用分化的ALI培养物时，纤毛运动不能恢复至显著水平，但使用分化的ALI培养物时，纤毛运动部分恢复。

关于CCDC39实验，在HEK-293和BEAS-2B细胞中转染后6小时和24小时，可以通过蛋白印迹分析来检测CCDC39蛋白，如图9所中可以看到的。如图11所示，在使用蛋白酶体抑制剂的16HBE14o-中在6小时后可以检测到CCDC39(ETH047T03；SEQ ID NO:13)表达。对ETH047T02(SEQ ID NO:12)、ETH047T04(SEQ ID NO:2)和ETH047T05(SEQ ID NO:14)也进行了相同的实验，结果相当(comparable)。如图12所示，在使用蛋白酶体抑制剂的16HBE14o-中在24小时后也可以检测到CCDC39(ETH047T03；SEQ ID NO:13)表达。

下面提供了本申请中描述的示例性序列。在一些实施例中，本公开提供了多核糖核苷酸，其包含例如SEQ ID NO:1或2中列出的UTR序列，或与这些序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的序列，或对应于上述任何一种或由上述任何一种编码的多核糖核苷酸序列，如mRNA。在任何前述的某些实施例中，多核苷酸或多核糖核苷酸被修饰(例如，包含核苷酸类似物，如本文所述)。

SEQ ID NO:1

具有CYBA 5'和3'UTR的CCDC40序列(ETH031T09)：

T7启动子的部分，Ethris的最小5'UTR，CYBA5'UTR，Kozak元件，起始密码子(AUG)，编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

(UGA)，CYBA3'UTR，

^聚A：通过mRNA的后聚腺苷酸化产生的“A”尾

SEQ ID NO:2

具有CYBA UTR的CCDC39序列(ETH047T04)：

T7启动子的部分，Ethris的最小5'UTR，CYBA 5'UTR，Kozak元件，起始密码子 (AUG)，编码人CCDC39蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

CYBA3'UTR，

聚(A)尾

SEQ ID NO:3

tdTomato：

T7启动子的部分，Ethris的最小5'UTR,载体主链序列(pVAX Vektor：美国生命技术公司)，Kozak元件，起始密码子(AUG)，编码人tdTomato蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

载体主链序列的部分(pVAXVektor：美国生命技术公司)

SEQ ID NO:4

具有Ethris的最小5'UTR和任选的3'UTR的MCIDAS序列：

T7启动子的部分，Ethris的最小5'UTR，Kozak元件，起始密码子(AUG)，编码人MCIDAS蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

(UGA)，任选的3'UTR(也用作基于PCR的模板生产的反向引物结合位点)，

聚(A)尾

SEQ ID NO:5

具有Ethris的最小5'UTR的序列(ETH031T06)：

T7启动子的部分，Ethris的最小5'UTR，Kozak元件，起始密码子(AUG)，编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

聚A：通过mRNA的后聚腺苷酸化产生的“A”尾

SEQ ID NO:6

具有TISU 5'UTR的序列(ETH031T07):

T7启动子的部分，具有额外的U核苷酸的Ethris的最小5'UTR，TISU元件，起始密码 子(AUG)，编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

聚A：通过mRNA的后聚腺苷酸化产生的“A”尾

SEQ ID NO:7

具有hAg 5'UTR但没有3'UTR的序列(ETH031T08)：

T7启动子的部分，Ethris的最小5'UTR，hAg 5'UTR，Kozak元件，起始密码子(AUG)，编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

聚A：通过mRNA的后聚腺苷酸化产生的“A”尾

SEQ ID NO:8

具有CMV IE9 5'UTR和人类生长激素3'UTR的序列(ETH031T10):

T7启动子的部分，Ethris的最小5'UTR，人CMV IE9 5'UTR，Kozak元件，起始密码子 (AUG)，编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

人类生长激素3'UTR

聚A：通过mRNA的后聚腺苷酸化产生的“A”尾

SEQ ID NO:9

ETH031T28：N末端EGFP标签-CCDC40

T7启动子的部分，Ethris的最小5'UTR，Kozak元件，起始密码子(AUG)，编码EGFP蛋白的序列，

编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

聚(A)尾

SEQ ID NO:10

ETH031T30：C末端EGFP标签-CCDC40

T7启动子的部分，Ethris的最小5'UTR，Kozak元件，起始密码子(AUG)，编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

编码

蛋白的序列，

聚(A)尾

SEQ ID NO:11

ETH031T26：N末端HA标签-CCDC40-T2A肽-具有5'和3'CYBA UTR的tdTomato

T7启动子的部分，Ethris的最小5'UTR，CYBA 5'UTR，Kozak元件，起始密码子 (AUG)，HA标签，

编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

CYBA 3'UTR，

聚(A)尾

SEQ ID NO:12

ETH047T02(具有Ethris的最小UTR的CCDC39)：

T7启动子的部分，Ethris的最小5'UTR，Kozak元件，起始密码子(AUG)，编码人CCDC39蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

聚(A)尾

SEQ ID NO:13

编码人CCDC39序列并包含TISU元件作为5'UTR的RNA(ETH047T03)

T7启动子的部分，具有附加的U核苷酸的Ethris的最小5'UTR，TISU元件，起始密码 子(AUG)，编码人CCDC39蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

聚(A)尾

SEQ ID NO:14

ETH047T05：SP30；编码人CCDC39并且包含30个核苷酸的随机序列(SP30)(其用作5'UTR)的RNA，

T7启动子的部分，Ethris的最小5'UTR，SP30作为5'UTR，Kozak元件，起始密码子 (AUG)，编码人CCDC39蛋白的功能性版本的密码子优化序列，

聚(A)尾

序列表

<110> ethris GmbH

<120> 纤毛疾病的治疗

<130> AB3066 PCT S3

<150> EP 19 15 7210.6

<151> 2019-02-14

<160> 14

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 3546

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有CYBA 5’和 3’ UTR的CCDC40序列 (ETH031T09) - 编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列

<400> 1

gggagaccgc gccuagcagu gucccagccg gguucguguc gccgccacca uggcugaacc 60

uggcggagcc gccggaagau cccacccuga agauggcucu gccagcgagg gcgagaaaga 120

gggcaacaac gagagccaca uggugucccc cccagagaag gacgacggcc agaaaggcga 180

agaggccgug ggcucuaccg agcacccuga ggaagugacc acacaggccg aggccgccau 240

ugaagagggc gagguggaaa cagagggcga agccgcugug gaaggcgaag aggaagccgu 300

gucuuacggc gacgccgaga gcgaggaaga guacuacuac accgagacaa gcagccccga 360

gggccagauc ucugccgccg auaccaccua ccccuacuuc agccccccuc aggaacugcc 420

uggggaagag gccuacgaua gcguguccgg cgaagcuggc cugcagggcu uucagcagga 480

agccacaggc ccucccgaga gccgggaaag aagagugaca agccccgagc cuagccacgg 540

cgugcuggga ccaucugagc agaugggcca agugaccucu ggcccugcug ugggcagacu 600

gacaggcagc acagaggaac cucagggcca ggugcugccu augggagugc agcaccgguu 660

cagacugagc cacggcagcg acaucgagag cagcgaccug gaagaguucg ucagccagga 720

acccgugauc ccuccuggcg ugccagaugc ccaucccagg gaaggcgauc ugcccguguu 780

ccaggaccag auccagcagc ccucuaccga agagggggcu auggccgaga gaguggaaag 840

cgagggcucc gacgaagaag ccgaggacga gggaucucag cugguggugc uggaccccga 900

ccacccucug auggugcggu uucaggccgc ccugaagaac uaccugaacc ggcagaucga 960

gaagcugaaa cuggaccugc aggaacuggu gguggccaca aagcagagca gagcccagag 1020

acaggaacug ggcgugaacc uguacgaggu gcagcagcau cuggugcauc ugcagaagcu 1080

gcuggaaaag agccacgacc ggcacgccau ggccagcucu gagcgcagac agaaagagga 1140

agaacugcag gccgccagag cccuguacac caagacaugc gccgcugcca acgaggaacg 1200

gaagaagcug gcugcccugc agaccgagau ggaaaaccug gcucugcacc uguucuacau 1260

gcagaauauc gaccaggaca ugcgggacga caucagagug augacccagg ucgugaagaa 1320

ggccgagaca gagagaaucc gggccgagau ugagaagaaa aagcaggacc uguacgugga 1380

ccagcugacc accagggccc agcagcugga agaggauauc gcccuguucg aggcccagua 1440

ccuggcccag gccgaagaua cccggauccu gagaaaggcc guguccgagg ccugcaccga 1500

gaucgaugcc aucagcgugg aaaagcggcg gaucaugcag cagugggcca gcagccucgu 1560

gggcaugaag cacagagaug aggcccaccg ggccgugcug gaagcucuga gaggcuguca 1620

gcaccaggcc aagagcaccg acggcgagau cgaggccuac aagaaaucca ucaugaagga 1680

agaggaaaag aacgagaaac uggccagcau ccugaacaga accgaaaccg aggccacccu 1740

gcugcagaaa cugaccaccc agugccugac caaacaggug gcccugcagu cccaguucaa 1800

caccuacaga cugacccugc aggacaccga ggacgcccug agucaggauc agcuggaaca 1860

gaugauucug accgaggaac ugcaggcuau ccggcaggcc auucaggggg agcuggaacu 1920

gcggagaaag accgacgccg ccaucagaga gaagcugcag gaacacauga ccagcaacaa 1980

gaccaccaag uacuucaacc agcugauucu gcgccugcag aaagaaaaga ccaacaugau 2040

gacacaccug agcaagauca acggcgacau ugcccagacc acccuggaca ucacccacac 2100

cagcagcaga cuggacgccc accagaaaac ccugguggaa cuggaccagg augugaagaa 2160

agugaacgag cugaucacca acagccagag cgagaucagc cggcggacca uccugaucga 2220

gagaaagcag ggccugauca acuuccugaa caaacagcug gaaagaaugg uguccgagcu 2280

gggcggcgag gaagugggac cucuggaacu ggaaaucaag cggcugagca agcugaucga 2340

cgagcacgac ggcaaggccg ugcaggcuca agugacaugg cugcggcugc agcaggaaau 2400

ggucaaagug acccaggaac aggaagaaca gcuggccucc cuggacgcca gcaagaaaga 2460

acugcacauc auggaacaga aaaagcugcg gguggaaagc aagaucgagc aggaaaaaaa 2520

agaacagaaa gaaaucgagc accacaugaa ggaccuggac aacgaccuga agaaacugaa 2580

uaugcugaug aacaagaacc gcugcuccag cgaagaacug gaacagaaca acagagugac 2640

cgagaacgag uucgugcgga gccugaaggc cagcgagcgg gaaaccauca agaugcagga 2700

caagcugaac cagcuguccg aggaaaaagc cacacugcug aaccagcugg uggaagccga 2760

gcaccagauc augcuguggg agaagaagau ccagcuggcc aaagaaaugc ggagcagcgu 2820

ggacagcgag aucggccaga ccgaaaucag agccaugaag ggcgagaucc accggaugaa 2880

agugcggcug ggacagcugc ugaaacagca ggaaaagaug auccgggcca uggaacuggc 2940

cguggccaga cgggaaaccg ugacaaccca ggcugagggc cagcggaaga uggacagaaa 3000

ggcccugacc cggaccgacu uccaccacaa gcagcuggaa cugaggcgga agauccggga 3060

cgugcggaag gccaccgaug agugcacaaa gacagugcug gaacuggaag agacacagcg 3120

gaacgugucc uccagccugc uggaaaaaca ggaaaagcug agcgugaucc aggccgacuu 3180

cgacacccug gaagcugacc ugacaagacu gggagcccug aaaagacaga accuguccga 3240

gaucguggca cugcagaccc ggcugaaaca ucugcaggcu gugaaagagg gacgcuacgu 3300

guuccuguuc agauccaagc agucucuggu gcuggaaaga cagcggcugg acaagcggcu 3360

ggcacugauu gccaccaucc uggauagagu gcgcgacgag uacccacagu uccaggaagc 3420

acugcacaag gugucccaga ugaucgccaa caagcuggaa uccccuggcc ccagcugacc 3480

ucgccccgga ccugcccucc cgccaggugc acccaccugc aauaaaugca gcgaagccgg 3540

gauucg 3546

<210> 2

<211> 3063

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有CYBA UTR的CCDC39 序列 (ETH047T04) - 编码人CCDC39蛋白的功能性版本的密码子优化序列

<400> 2

gggagaccgc gccuagcagu gucccagccg gguucguguc gccgccacca ugagcagcga 60

guuucuggcc gaacugcacu gggaggacgg cuucgcuauu cccguggcca acgaggaaaa 120

caagcugcug gaagaucagc ugagcaagcu gaaggacgag agagccucuc ugcaggacga 180

gcugagagag uacgaggaac ggaucaacag caugaccagc cacuucaaga acgugaagca 240

agagcugagc aucacccaga gccugugcaa ggccagagag agagaaaccg agagcgagga 300

acacuucaag gcuaucgccc agcgcgagcu gggaagagug aaggaugaga uccagcggcu 360

ggaaaacgag auggccagca uccuggaaaa gaaguccgac aaagagaacg gcaucuucaa 420

ggccacacag aagcuggacg gccugaagug ccagaugaac ugggaucagc aggcccugga 480

agccuggcug gaagagucug cccacaagga uucugacgcc cugacacugc agaaguacgc 540

ccagcaggac gacaacaaga uccgggcucu gacccugcag cuggaaagac ugacccugga 600

augcaaccag aagcggaaga uccuggacaa cgagcugacc gagacaauca gcgcccagcu 660

ggaacuggau aaggccgcuc aggacuucag aaagauccac aacgagcggc aagaacugau 720

caagcagugg gagaacacca ucgagcagau gcagaaacgc gacggcgaca ucgacaacug 780

cgcccuggaa cucgcccgga ucaagcaaga gacacgcgag aaagagaacc uggucaaaga 840

gaagaucaag uuccucgagu ccgagaucgg caacaacacc gaguucgaga agcggaucag 900

cguggccgac agaaagcugc ugaagugcag aaccgccuac caggaccacg agacaagccg 960

gauucagcuc aagggcgagc uggauucucu gaaggccacc gugaacagaa ccagcagcga 1020

ucuggaagcc cugcggaaga acaucagcaa gaucaagaag gacauccacg aggaaaccgc 1080

caggcugcag aaaacaaaga accacaauga gaucauccag accaagcuga aagagaucac 1140

cgaaaagacc augagcgugg aagagaaggc cacaaaccug gaagauaugc ucaaagagga 1200

agagaaagac gucaaagagg uggacguuca acugaaccug auuaagggcg ugcuguucaa 1260

gaaggcccaa gagcugcaga ccgaaaccau gaaggaaaag gccguccugu cugagaucga 1320

gggcaccaga ucuagccuga agcaccugaa ccaucagcug cagaagcucg acuucgagac 1380

acugaagcag caagagauca uguacagcca ggauuuccac auccagcagg ucgagcggcg 1440

gaugucuaga cugaagggcg agaucaacuc cgaggaaaaa caggcccucg aggccaagau 1500

cguggaacug agaaagagcc ucgaagagaa gaagucuacc ugcggccugc uggaaaccca 1560

gauuaagaag cugcacaacg accuguacuu caucaagaaa gcccacagca agaacagcga 1620

cgagaagcag agccugauga ccaagaucaa ugagcugaac cuguucaucg aucggagcga 1680

aaaagagcug gacaaggcca agggcuucaa gcaggaccug augaucgagg acaaccugcu 1740

gaagcuggaa gugaagcgga ccagagagau gcugcacagc aaggccgagg aagugcuguc 1800

ucuggaaaag cggaagcagc agcuguacac cgccauggaa gagagaaccg aagagaucaa 1860

ggugcacaag accaugcugg cuucccagau cagauacgug gaccaagagc gcgagaacau 1920

cuccaccgag uuuagagaga gacuguccaa gaucgagaag cugaagaacc gcuacgagau 1980

ccugaccguc gugaugcugc cuccugaggg cgaagaggaa aagacccagg ccuacuacgu 2040

gaucaaggca gcccaagaaa aagaggaacu ccagagagaa ggcgacugcc uggacgccaa 2100

gauuaacaag gccgaaaaag aaaucuacgc ccucgagaac acccugcagg uccugaacag 2160

cugcaacaac aacuacaagc agagcuucaa gaaagucacc ccuagcuccg acgaguacga 2220

gcugaagauu cagcuggaag aacagaaaag agccguggac gagaaguaca gauacaagca 2280

gcggcagauc agagagcugc aagaggauau ccagagcaug gaaaacaccc uggacgugau 2340

cgagcaccug gccaacaacg ugaaagagaa gcuguccgag aaacaggccu acagcuuuca 2400

gcuguccaaa gagacagagg aacagaagcc caaacuggaa cgcgugacca agcagugcgc 2460

caagcugaca aaagagaucc ggcugcugaa agacaccaag gacgaaacca uggaagaaca 2520

agacaucaag cugcgcgaga ugaagcaguu ccacaaagug aucgacgaga ugcuggugga 2580

caucauugaa gagaacacag agauccgcau cauccugcag accuauuuuc agcagagcgg 2640

ccuggaacug ccuaccgccu cuacaaaggg cagcagacag agcagcagau ccccuagcca 2700

cacaagccug agcgccagaa gcucuagaag caccagcacc ucuaccagcc aguccagcau 2760

uaaggugcug gaacucaagu uccccgccag cucuagccuc gugggaagcc cuucuagacc 2820

uagcagcgcc ucuagcagcu ccagcaacgu gaaguccaag aaaagcucca agugaccucg 2880

ccccggaccu gcccucccgc caggugcacc caccugcaau aaaugcagcg aagccgggau 2940

ucgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060

aaa 3063

<210> 3

<211> 1644

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码tdTomato蛋白的功能性版本的密码子优化序列

<400> 3

gggagaccca agcuggcuag cguuuaaacu uaagcuuggu accgcgggcc cgggauccac 60

cggucgccac cauggugagc aagggcgagg aggucaucaa agaguucaug cgcuucaagg 120

ugcgcaugga gggcuccaug aacggccacg aguucgagau cgagggcgag ggcgagggcc 180

gccccuacga gggcacccag accgccaagc ugaaggugac caagggcggc ccccugcccu 240

ucgccuggga cauccugucc ccccaguuca uguacggcuc caaggcguac gugaagcacc 300

ccgccgacau ccccgauuac aagaagcugu ccuuccccga gggcuucaag ugggagcgcg 360

ugaugaacuu cgaggacggc ggucugguga ccgugaccca ggacuccucc cugcaggacg 420

gcacgcugau cuacaaggug aagaugcgcg gcaccaacuu cccccccgac ggccccguaa 480

ugcagaagaa gaccaugggc ugggaggccu ccaccgagcg ccuguacccc cgcgacggcg 540

ugcugaaggg cgagauccac caggcccuga agcugaagga cggcggccac uaccuggugg 600

aguucaagac caucuacaug gccaagaagc ccgugcaacu gcccggcuac uacuacgugg 660

acaccaagcu ggacaucacc ucccacaacg aggacuacac caucguggaa caguacgagc 720

gcuccgaggg ccgccaccac cuguuccugg ggcauggcac cggcagcacc ggcagcggca 780

gcuccggcac cgccuccucc gaggacaaca acauggccgu caucaaagag uucaugcgcu 840

ucaaggugcg cauggagggc uccaugaacg gccacgaguu cgagaucgag ggcgagggcg 900

agggccgccc cuacgagggc acccagaccg ccaagcugaa ggugaccaag ggcggccccc 960

ugcccuucgc cugggacauc cugucccccc aguucaugua cggcuccaag gcguacguga 1020

agcaccccgc cgacaucccc gauuacaaga agcuguccuu ccccgagggc uucaaguggg 1080

agcgcgugau gaacuucgag gacggcgguc uggugaccgu gacccaggac uccucccugc 1140

aggacggcac gcugaucuac aaggugaaga ugcgcggcac caacuucccc cccgacggcc 1200

ccguaaugca gaagaagacc augggcuggg aggccuccac cgagcgccug uacccccgcg 1260

acggcgugcu gaagggcgag auccaccagg cccugaagcu gaaggacggc ggccacuacc 1320

ugguggaguu caagaccauc uacauggcca agaagcccgu gcaacugccc ggcuacuacu 1380

acguggacac caagcuggac aucaccuccc acaacgagga cuacaccauc guggaacagu 1440

acgagcgcuc cgagggccgc caccaccugu uccuguacgg cauggacgag cuguacaagu 1500

aggcggccaa uucugcagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620

aaaaaaaaaa aaaaaaaagc ggcc 1644

<210> 4

<211> 1327

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有Ethris的最小5’ UTR和任选的 3’UTR的MCIDAS 序列 -

编码人MCIDAS蛋白的功能性版本的密码子优化序列

<400> 4

gggagacgcc accaugcaag cuuguggcgg cggagcugcu ggaagaaggg ccuucgauag 60

caucugcccc aaccggaugc uugcccuucc ugguagagcc cugcugugca agccuggcaa 120

gcccgagaga aaguucgccc cuccaagaaa guucuucccc ggcuguacug gcggcagccc 180

ugugucugug uaugaggacc cuccugaugc cgagccuaca gcucugccug cucugaccac 240

aaucgaccug caggaucugg ccgauugcag cucucugcug ggaucugaug cuccuccugg 300

cggagaucug gcugccucuc agaaucacag ccaccagaca gaggccgacu ucaaccugca 360

agacuuccgg gacaccgugg acgaccugau cagcgauagc agcagcauga ugagccccac 420

ucuggccagc ggcgauuucc cauucagccc cugugacauc agcccuuucg gcccuugucu 480

gagcccucca cuggauccua gagcacugca gagcccaccu cugaggccuc cagauguucc 540

uccaccugag caguacugga aagagguggc cgaccagaac cagagagcac ugggcgacgc 600

ucugguggaa aacaaccagc ugcacgugac ccugacacag aagcaagaag agaucgccag 660

ccugaaagaa cggaaugugc agcugaaaga gcuggccucc aggacaagac accuggccag 720

ugugcuggac aagcugauga ucacccagag cagagauugc ggagccgccg cugaaccuuu 780

ucugcugaag gccaaggcca agagaagccu ggaagaacug gugucugccg ccggacagga 840

uugcgcugaa guggaugcca uccugcgcga gaucagcgag agaugugaug aggcccugca 900

gagcagggac cccaaaagac cuagacugcu gcccgagccu gccaacaccg auaccagacc 960

uggaaaucug cacggcgccu ucagaggccu gagaaccgau ugcucuagaa gcgcccugaa 1020

ccugagccac agcgaacucg aagaaggcgg cagcuucagc acccggauca gaagccacag 1080

caccaucaga acccuggccu uuccacaggg caacgccuuc acaaucagaa ccgccaacgg 1140

cggcuacaag uucagauggg ugccaagcug agcuagccac cgggcaauac gagcucaagc 1200

cagucucaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320

aaaaaaa 1327

<210> 5

<211> 3446

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有 Ethris的最小5’UTR的序列 (ETH031T06) - 编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列

<400> 5

gggagacgcc accauggcug aaccuggcgg agccgccgga agaucccacc cugaagaugg 60

cucugccagc gagggcgaga aagagggcaa caacgagagc cacauggugu cccccccaga 120

gaaggacgac ggccagaaag gcgaagaggc cgugggcucu accgagcacc cugaggaagu 180

gaccacacag gccgaggccg ccauugaaga gggcgaggug gaaacagagg gcgaagccgc 240

uguggaaggc gaagaggaag ccgugucuua cggcgacgcc gagagcgagg aagaguacua 300

cuacaccgag acaagcagcc ccgagggcca gaucucugcc gccgauacca ccuaccccua 360

cuucagcccc ccucaggaac ugccugggga agaggccuac gauagcgugu ccggcgaagc 420

uggccugcag ggcuuucagc aggaagccac aggcccuccc gagagccggg aaagaagagu 480

gacaagcccc gagccuagcc acggcgugcu gggaccaucu gagcagaugg gccaagugac 540

cucuggcccu gcugugggca gacugacagg cagcacagag gaaccucagg gccaggugcu 600

gccuauggga gugcagcacc gguucagacu gagccacggc agcgacaucg agagcagcga 660

ccuggaagag uucgucagcc aggaacccgu gaucccuccu ggcgugccag augcccaucc 720

cagggaaggc gaucugcccg uguuccagga ccagauccag cagcccucua ccgaagaggg 780

ggcuauggcc gagagagugg aaagcgaggg cuccgacgaa gaagccgagg acgagggauc 840

ucagcuggug gugcuggacc ccgaccaccc ucugauggug cgguuucagg ccgcccugaa 900

gaacuaccug aaccggcaga ucgagaagcu gaaacuggac cugcaggaac uggugguggc 960

cacaaagcag agcagagccc agagacagga acugggcgug aaccuguacg aggugcagca 1020

gcaucuggug caucugcaga agcugcugga aaagagccac gaccggcacg ccauggccag 1080

cucugagcgc agacagaaag aggaagaacu gcaggccgcc agagcccugu acaccaagac 1140

augcgccgcu gccaacgagg aacggaagaa gcuggcugcc cugcagaccg agauggaaaa 1200

ccuggcucug caccuguucu acaugcagaa uaucgaccag gacaugcggg acgacaucag 1260

agugaugacc caggucguga agaaggccga gacagagaga auccgggccg agauugagaa 1320

gaaaaagcag gaccuguacg uggaccagcu gaccaccagg gcccagcagc uggaagagga 1380

uaucgcccug uucgaggccc aguaccuggc ccaggccgaa gauacccgga uccugagaaa 1440

ggccgugucc gaggccugca ccgagaucga ugccaucagc guggaaaagc ggcggaucau 1500

gcagcagugg gccagcagcc ucgugggcau gaagcacaga gaugaggccc accgggccgu 1560

gcuggaagcu cugagaggcu gucagcacca ggccaagagc accgacggcg agaucgaggc 1620

cuacaagaaa uccaucauga aggaagagga aaagaacgag aaacuggcca gcauccugaa 1680

cagaaccgaa accgaggcca cccugcugca gaaacugacc acccagugcc ugaccaaaca 1740

gguggcccug cagucccagu ucaacaccua cagacugacc cugcaggaca ccgaggacgc 1800

ccugagucag gaucagcugg aacagaugau ucugaccgag gaacugcagg cuauccggca 1860

ggccauucag ggggagcugg aacugcggag aaagaccgac gccgccauca gagagaagcu 1920

gcaggaacac augaccagca acaagaccac caaguacuuc aaccagcuga uucugcgccu 1980

gcagaaagaa aagaccaaca ugaugacaca ccugagcaag aucaacggcg acauugccca 2040

gaccacccug gacaucaccc acaccagcag cagacuggac gcccaccaga aaacccuggu 2100

ggaacuggac caggauguga agaaagugaa cgagcugauc accaacagcc agagcgagau 2160

cagccggcgg accauccuga ucgagagaaa gcagggccug aucaacuucc ugaacaaaca 2220

gcuggaaaga augguguccg agcugggcgg cgaggaagug ggaccucugg aacuggaaau 2280

caagcggcug agcaagcuga ucgacgagca cgacggcaag gccgugcagg cucaagugac 2340

auggcugcgg cugcagcagg aaauggucaa agugacccag gaacaggaag aacagcuggc 2400

cucccuggac gccagcaaga aagaacugca caucauggaa cagaaaaagc ugcgggugga 2460

aagcaagauc gagcaggaaa aaaaagaaca gaaagaaauc gagcaccaca ugaaggaccu 2520

ggacaacgac cugaagaaac ugaauaugcu gaugaacaag aaccgcugcu ccagcgaaga 2580

acuggaacag aacaacagag ugaccgagaa cgaguucgug cggagccuga aggccagcga 2640

gcgggaaacc aucaagaugc aggacaagcu gaaccagcug uccgaggaaa aagccacacu 2700

gcugaaccag cugguggaag ccgagcacca gaucaugcug ugggagaaga agauccagcu 2760

ggccaaagaa augcggagca gcguggacag cgagaucggc cagaccgaaa ucagagccau 2820

gaagggcgag auccaccgga ugaaagugcg gcugggacag cugcugaaac agcaggaaaa 2880

gaugauccgg gccauggaac uggccguggc cagacgggaa accgugacaa cccaggcuga 2940

gggccagcgg aagauggaca gaaaggcccu gacccggacc gacuuccacc acaagcagcu 3000

ggaacugagg cggaagaucc gggacgugcg gaaggccacc gaugagugca caaagacagu 3060

gcuggaacug gaagagacac agcggaacgu guccuccagc cugcuggaaa aacaggaaaa 3120

gcugagcgug auccaggccg acuucgacac ccuggaagcu gaccugacaa gacugggagc 3180

ccugaaaaga cagaaccugu ccgagaucgu ggcacugcag acccggcuga aacaucugca 3240

ggcugugaaa gagggacgcu acguguuccu guucagaucc aagcagucuc uggugcugga 3300

aagacagcgg cuggacaagc ggcuggcacu gauugccacc auccuggaua gagugcgcga 3360

cgaguaccca caguuccagg aagcacugca caaggugucc cagaugaucg ccaacaagcu 3420

ggaauccccu ggccccagcu gauucg 3446

<210> 6

<211> 3447

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有TISU 5’UTR的序列 (ETH031T07) - 编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列

<400> 6

gggagacugc caagauggcu gaaccuggcg gagccgccgg aagaucccac ccugaagaug 60

gcucugccag cgagggcgag aaagagggca acaacgagag ccacauggug ucccccccag 120

agaaggacga cggccagaaa ggcgaagagg ccgugggcuc uaccgagcac ccugaggaag 180

ugaccacaca ggccgaggcc gccauugaag agggcgaggu ggaaacagag ggcgaagccg 240

cuguggaagg cgaagaggaa gccgugucuu acggcgacgc cgagagcgag gaagaguacu 300

acuacaccga gacaagcagc cccgagggcc agaucucugc cgccgauacc accuaccccu 360

acuucagccc cccucaggaa cugccugggg aagaggccua cgauagcgug uccggcgaag 420

cuggccugca gggcuuucag caggaagcca caggcccucc cgagagccgg gaaagaagag 480

ugacaagccc cgagccuagc cacggcgugc ugggaccauc ugagcagaug ggccaaguga 540

ccucuggccc ugcugugggc agacugacag gcagcacaga ggaaccucag ggccaggugc 600

ugccuauggg agugcagcac cgguucagac ugagccacgg cagcgacauc gagagcagcg 660

accuggaaga guucgucagc caggaacccg ugaucccucc uggcgugcca gaugcccauc 720

ccagggaagg cgaucugccc guguuccagg accagaucca gcagcccucu accgaagagg 780

gggcuauggc cgagagagug gaaagcgagg gcuccgacga agaagccgag gacgagggau 840

cucagcuggu ggugcuggac cccgaccacc cucugauggu gcgguuucag gccgcccuga 900

agaacuaccu gaaccggcag aucgagaagc ugaaacugga ccugcaggaa cugguggugg 960

ccacaaagca gagcagagcc cagagacagg aacugggcgu gaaccuguac gaggugcagc 1020

agcaucuggu gcaucugcag aagcugcugg aaaagagcca cgaccggcac gccauggcca 1080

gcucugagcg cagacagaaa gaggaagaac ugcaggccgc cagagcccug uacaccaaga 1140

caugcgccgc ugccaacgag gaacggaaga agcuggcugc ccugcagacc gagauggaaa 1200

accuggcucu gcaccuguuc uacaugcaga auaucgacca ggacaugcgg gacgacauca 1260

gagugaugac ccaggucgug aagaaggccg agacagagag aauccgggcc gagauugaga 1320

agaaaaagca ggaccuguac guggaccagc ugaccaccag ggcccagcag cuggaagagg 1380

auaucgcccu guucgaggcc caguaccugg cccaggccga agauacccgg auccugagaa 1440

aggccguguc cgaggccugc accgagaucg augccaucag cguggaaaag cggcggauca 1500

ugcagcagug ggccagcagc cucgugggca ugaagcacag agaugaggcc caccgggccg 1560

ugcuggaagc ucugagaggc ugucagcacc aggccaagag caccgacggc gagaucgagg 1620

ccuacaagaa auccaucaug aaggaagagg aaaagaacga gaaacuggcc agcauccuga 1680

acagaaccga aaccgaggcc acccugcugc agaaacugac cacccagugc cugaccaaac 1740

agguggcccu gcagucccag uucaacaccu acagacugac ccugcaggac accgaggacg 1800

cccugaguca ggaucagcug gaacagauga uucugaccga ggaacugcag gcuauccggc 1860

aggccauuca gggggagcug gaacugcgga gaaagaccga cgccgccauc agagagaagc 1920

ugcaggaaca caugaccagc aacaagacca ccaaguacuu caaccagcug auucugcgcc 1980

ugcagaaaga aaagaccaac augaugacac accugagcaa gaucaacggc gacauugccc 2040

agaccacccu ggacaucacc cacaccagca gcagacugga cgcccaccag aaaacccugg 2100

uggaacugga ccaggaugug aagaaaguga acgagcugau caccaacagc cagagcgaga 2160

ucagccggcg gaccauccug aucgagagaa agcagggccu gaucaacuuc cugaacaaac 2220

agcuggaaag aauggugucc gagcugggcg gcgaggaagu gggaccucug gaacuggaaa 2280

ucaagcggcu gagcaagcug aucgacgagc acgacggcaa ggccgugcag gcucaaguga 2340

cauggcugcg gcugcagcag gaaaugguca aagugaccca ggaacaggaa gaacagcugg 2400

ccucccugga cgccagcaag aaagaacugc acaucaugga acagaaaaag cugcgggugg 2460

aaagcaagau cgagcaggaa aaaaaagaac agaaagaaau cgagcaccac augaaggacc 2520

uggacaacga ccugaagaaa cugaauaugc ugaugaacaa gaaccgcugc uccagcgaag 2580

aacuggaaca gaacaacaga gugaccgaga acgaguucgu gcggagccug aaggccagcg 2640

agcgggaaac caucaagaug caggacaagc ugaaccagcu guccgaggaa aaagccacac 2700

ugcugaacca gcugguggaa gccgagcacc agaucaugcu gugggagaag aagauccagc 2760

uggccaaaga aaugcggagc agcguggaca gcgagaucgg ccagaccgaa aucagagcca 2820

ugaagggcga gauccaccgg augaaagugc ggcugggaca gcugcugaaa cagcaggaaa 2880

agaugauccg ggccauggaa cuggccgugg ccagacggga aaccgugaca acccaggcug 2940

agggccagcg gaagauggac agaaaggccc ugacccggac cgacuuccac cacaagcagc 3000

uggaacugag gcggaagauc cgggacgugc ggaaggccac cgaugagugc acaaagacag 3060

ugcuggaacu ggaagagaca cagcggaacg uguccuccag ccugcuggaa aaacaggaaa 3120

agcugagcgu gauccaggcc gacuucgaca cccuggaagc ugaccugaca agacugggag 3180

cccugaaaag acagaaccug uccgagaucg uggcacugca gacccggcug aaacaucugc 3240

aggcugugaa agagggacgc uacguguucc uguucagauc caagcagucu cuggugcugg 3300

aaagacagcg gcuggacaag cggcuggcac ugauugccac cauccuggau agagugcgcg 3360

acgaguaccc acaguuccag gaagcacugc acaagguguc ccagaugauc gccaacaagc 3420

uggaaucccc uggccccagc ugauucg 3447

<210> 7

<211> 3476

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有hAg 5’UTR但没有3’UTR的序列 (ETH031T08) - 编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列

<400> 7

gggagacucu ucuggucccc acagacucag agagaacgcc accauggcug aaccuggcgg 60

agccgccgga agaucccacc cugaagaugg cucugccagc gagggcgaga aagagggcaa 120

caacgagagc cacauggugu cccccccaga gaaggacgac ggccagaaag gcgaagaggc 180

cgugggcucu accgagcacc cugaggaagu gaccacacag gccgaggccg ccauugaaga 240

gggcgaggug gaaacagagg gcgaagccgc uguggaaggc gaagaggaag ccgugucuua 300

cggcgacgcc gagagcgagg aagaguacua cuacaccgag acaagcagcc ccgagggcca 360

gaucucugcc gccgauacca ccuaccccua cuucagcccc ccucaggaac ugccugggga 420

agaggccuac gauagcgugu ccggcgaagc uggccugcag ggcuuucagc aggaagccac 480

aggcccuccc gagagccggg aaagaagagu gacaagcccc gagccuagcc acggcgugcu 540

gggaccaucu gagcagaugg gccaagugac cucuggcccu gcugugggca gacugacagg 600

cagcacagag gaaccucagg gccaggugcu gccuauggga gugcagcacc gguucagacu 660

gagccacggc agcgacaucg agagcagcga ccuggaagag uucgucagcc aggaacccgu 720

gaucccuccu ggcgugccag augcccaucc cagggaaggc gaucugcccg uguuccagga 780

ccagauccag cagcccucua ccgaagaggg ggcuauggcc gagagagugg aaagcgaggg 840

cuccgacgaa gaagccgagg acgagggauc ucagcuggug gugcuggacc ccgaccaccc 900

ucugauggug cgguuucagg ccgcccugaa gaacuaccug aaccggcaga ucgagaagcu 960

gaaacuggac cugcaggaac uggugguggc cacaaagcag agcagagccc agagacagga 1020

acugggcgug aaccuguacg aggugcagca gcaucuggug caucugcaga agcugcugga 1080

aaagagccac gaccggcacg ccauggccag cucugagcgc agacagaaag aggaagaacu 1140

gcaggccgcc agagcccugu acaccaagac augcgccgcu gccaacgagg aacggaagaa 1200

gcuggcugcc cugcagaccg agauggaaaa ccuggcucug caccuguucu acaugcagaa 1260

uaucgaccag gacaugcggg acgacaucag agugaugacc caggucguga agaaggccga 1320

gacagagaga auccgggccg agauugagaa gaaaaagcag gaccuguacg uggaccagcu 1380

gaccaccagg gcccagcagc uggaagagga uaucgcccug uucgaggccc aguaccuggc 1440

ccaggccgaa gauacccgga uccugagaaa ggccgugucc gaggccugca ccgagaucga 1500

ugccaucagc guggaaaagc ggcggaucau gcagcagugg gccagcagcc ucgugggcau 1560

gaagcacaga gaugaggccc accgggccgu gcuggaagcu cugagaggcu gucagcacca 1620

ggccaagagc accgacggcg agaucgaggc cuacaagaaa uccaucauga aggaagagga 1680

aaagaacgag aaacuggcca gcauccugaa cagaaccgaa accgaggcca cccugcugca 1740

gaaacugacc acccagugcc ugaccaaaca gguggcccug cagucccagu ucaacaccua 1800

cagacugacc cugcaggaca ccgaggacgc ccugagucag gaucagcugg aacagaugau 1860

ucugaccgag gaacugcagg cuauccggca ggccauucag ggggagcugg aacugcggag 1920

aaagaccgac gccgccauca gagagaagcu gcaggaacac augaccagca acaagaccac 1980

caaguacuuc aaccagcuga uucugcgccu gcagaaagaa aagaccaaca ugaugacaca 2040

ccugagcaag aucaacggcg acauugccca gaccacccug gacaucaccc acaccagcag 2100

cagacuggac gcccaccaga aaacccuggu ggaacuggac caggauguga agaaagugaa 2160

cgagcugauc accaacagcc agagcgagau cagccggcgg accauccuga ucgagagaaa 2220

gcagggccug aucaacuucc ugaacaaaca gcuggaaaga augguguccg agcugggcgg 2280

cgaggaagug ggaccucugg aacuggaaau caagcggcug agcaagcuga ucgacgagca 2340

cgacggcaag gccgugcagg cucaagugac auggcugcgg cugcagcagg aaauggucaa 2400

agugacccag gaacaggaag aacagcuggc cucccuggac gccagcaaga aagaacugca 2460

caucauggaa cagaaaaagc ugcgggugga aagcaagauc gagcaggaaa aaaaagaaca 2520

gaaagaaauc gagcaccaca ugaaggaccu ggacaacgac cugaagaaac ugaauaugcu 2580

gaugaacaag aaccgcugcu ccagcgaaga acuggaacag aacaacagag ugaccgagaa 2640

cgaguucgug cggagccuga aggccagcga gcgggaaacc aucaagaugc aggacaagcu 2700

gaaccagcug uccgaggaaa aagccacacu gcugaaccag cugguggaag ccgagcacca 2760

gaucaugcug ugggagaaga agauccagcu ggccaaagaa augcggagca gcguggacag 2820

cgagaucggc cagaccgaaa ucagagccau gaagggcgag auccaccgga ugaaagugcg 2880

gcugggacag cugcugaaac agcaggaaaa gaugauccgg gccauggaac uggccguggc 2940

cagacgggaa accgugacaa cccaggcuga gggccagcgg aagauggaca gaaaggcccu 3000

gacccggacc gacuuccacc acaagcagcu ggaacugagg cggaagaucc gggacgugcg 3060

gaaggccacc gaugagugca caaagacagu gcuggaacug gaagagacac agcggaacgu 3120

guccuccagc cugcuggaaa aacaggaaaa gcugagcgug auccaggccg acuucgacac 3180

ccuggaagcu gaccugacaa gacugggagc ccugaaaaga cagaaccugu ccgagaucgu 3240

ggcacugcag acccggcuga aacaucugca ggcugugaaa gagggacgcu acguguuccu 3300

guucagaucc aagcagucuc uggugcugga aagacagcgg cuggacaagc ggcuggcacu 3360

gauugccacc auccuggaua gagugcgcga cgaguaccca caguuccagg aagcacugca 3420

caaggugucc cagaugaucg ccaacaagcu ggaauccccu ggccccagcu gauucg 3476

<210> 8

<211> 3683

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有人CMV IE9 5’UTR和人类生长激素3’UTR的序列(ETH031T10) - 编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列

<400> 8

gggagaccag aucgccugga gacgccaucc acgcuguuuu gaccuccaua gaagacaccg 60

ggaccgaucc agccuccgcg gccgggaacg gugcauugga acgcggauuc cccgugccaa 120

gagugacuca ccguccuuga cacggccacc auggcugaac cuggcggagc cgccggaaga 180

ucccacccug aagauggcuc ugccagcgag ggcgagaaag agggcaacaa cgagagccac 240

augguguccc ccccagagaa ggacgacggc cagaaaggcg aagaggccgu gggcucuacc 300

gagcacccug aggaagugac cacacaggcc gaggccgcca uugaagaggg cgagguggaa 360

acagagggcg aagccgcugu ggaaggcgaa gaggaagccg ugucuuacgg cgacgccgag 420

agcgaggaag aguacuacua caccgagaca agcagccccg agggccagau cucugccgcc 480

gauaccaccu accccuacuu cagccccccu caggaacugc cuggggaaga ggccuacgau 540

agcguguccg gcgaagcugg ccugcagggc uuucagcagg aagccacagg cccucccgag 600

agccgggaaa gaagagugac aagccccgag ccuagccacg gcgugcuggg accaucugag 660

cagaugggcc aagugaccuc uggcccugcu gugggcagac ugacaggcag cacagaggaa 720

ccucagggcc aggugcugcc uaugggagug cagcaccggu ucagacugag ccacggcagc 780

gacaucgaga gcagcgaccu ggaagaguuc gucagccagg aacccgugau cccuccuggc 840

gugccagaug cccaucccag ggaaggcgau cugcccgugu uccaggacca gauccagcag 900

cccucuaccg aagagggggc uauggccgag agaguggaaa gcgagggcuc cgacgaagaa 960

gccgaggacg agggaucuca gcugguggug cuggaccccg accacccucu gauggugcgg 1020

uuucaggccg cccugaagaa cuaccugaac cggcagaucg agaagcugaa acuggaccug 1080

caggaacugg ugguggccac aaagcagagc agagcccaga gacaggaacu gggcgugaac 1140

cuguacgagg ugcagcagca ucuggugcau cugcagaagc ugcuggaaaa gagccacgac 1200

cggcacgcca uggccagcuc ugagcgcaga cagaaagagg aagaacugca ggccgccaga 1260

gcccuguaca ccaagacaug cgccgcugcc aacgaggaac ggaagaagcu ggcugcccug 1320

cagaccgaga uggaaaaccu ggcucugcac cuguucuaca ugcagaauau cgaccaggac 1380

augcgggacg acaucagagu gaugacccag gucgugaaga aggccgagac agagagaauc 1440

cgggccgaga uugagaagaa aaagcaggac cuguacgugg accagcugac caccagggcc 1500

cagcagcugg aagaggauau cgcccuguuc gaggcccagu accuggccca ggccgaagau 1560

acccggaucc ugagaaaggc cguguccgag gccugcaccg agaucgaugc caucagcgug 1620

gaaaagcggc ggaucaugca gcagugggcc agcagccucg ugggcaugaa gcacagagau 1680

gaggcccacc gggccgugcu ggaagcucug agaggcuguc agcaccaggc caagagcacc 1740

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<223> ETH031T28: N末端EGFP标签-CCDC40 - 编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列

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<223> ETH031T26: N末端HA标签-CCDC40-T2A肽-具有5' 和3’CYBA UTR 的tdTomato- 编码人CCDC40蛋白的功能性版本的密码子优化序列

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gggagaccgc gccuagcagu gucccagccg gguucguguc gccgccacca uguaccccua 60

cgacgugccc gacuacgccg gcggaggggg cagcgcugaa ccuggcggag ccgccggaag 120

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caacggcgac auugcccaga ccacccugga caucacccac accagcagca gacuggacgc 2160

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cgugcaggcu caagugacau ggcugcggcu gcagcaggaa auggucaaag ugacccagga 2460

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cgugacaacc caggcugagg gccagcggaa gauggacaga aaggcccuga cccggaccga 3060

cuuccaccac aagcagcugg aacugaggcg gaagauccgg gacgugcgga aggccaccga 3120

ugagugcaca aagacagugc uggaacugga agagacacag cggaacgugu ccuccagccu 3180

gcuggaaaaa caggaaaagc ugagcgugau ccaggccgac uucgacaccc uggaagcuga 3240

ccugacaaga cugggagccc ugaaaagaca gaaccugucc gagaucgugg cacugcagac 3300

ccggcugaaa caucugcagg cugugaaaga gggacgcuac guguuccugu ucagauccaa 3360

gcagucucug gugcuggaaa gacagcggcu ggacaagcgg cuggcacuga uugccaccau 3420

ccuggauaga gugcgcgacg aguacccaca guuccaggaa gcacugcaca agguguccca 3480

gaugaucgcc aacaagcugg aauccccugg ccccagcggc agcggcgagg gcagaggcag 3540

ccugcugacc ugcggcgacg uggaggagaa ccccggcccc auggugagca agggcgagga 3600

ggucaucaaa gaguucaugc gcuucaaggu gcgcauggag ggcuccauga acggccacga 3660

guucgagauc gagggcgagg gcgagggccg ccccuacgag ggcacccaga ccgccaagcu 3720

gaaggugacc aagggcggcc cccugcccuu cgccugggac auccuguccc cccaguucau 3780

guacggcucc aaggcguacg ugaagcaccc cgccgacauc cccgauuaca agaagcuguc 3840

cuuccccgag ggcuucaagu gggagcgcgu gaugaacuuc gaggacggcg gucuggugac 3900

cgugacccag gacuccuccc ugcaggacgg cacgcugauc uacaagguga agaugcgcgg 3960

caccaacuuc ccccccgacg gccccguaau gcagaagaag accaugggcu gggaggccuc 4020

caccgagcgc cuguaccccc gcgacggcgu gcugaagggc gagauccacc aggcccugaa 4080

gcugaaggac ggcggccacu accuggugga guucaagacc aucuacaugg ccaagaagcc 4140

cgugcaacug cccggcuacu acuacgugga caccaagcug gacaucaccu cccacaacga 4200

ggacuacacc aucguggaac aguacgagcg cuccgagggc cgccaccacc uguuccuggg 4260

gcauggcacc ggcagcaccg gcagcggcag cuccggcacc gccuccuccg aggacaacaa 4320

cauggccguc aucaaagagu ucaugcgcuu caaggugcgc auggagggcu ccaugaacgg 4380

ccacgaguuc gagaucgagg gcgagggcga gggccgcccc uacgagggca cccagaccgc 4440

caagcugaag gugaccaagg gcggcccccu gcccuucgcc ugggacaucc ugucccccca 4500

guucauguac ggcuccaagg cguacgugaa gcaccccgcc gacauccccg auuacaagaa 4560

gcuguccuuc cccgagggcu ucaaguggga gcgcgugaug aacuucgagg acggcggucu 4620

ggugaccgug acccaggacu ccucccugca ggacggcacg cugaucuaca aggugaagau 4680

gcgcggcacc aacuuccccc ccgacggccc cguaaugcag aagaagacca ugggcuggga 4740

ggccuccacc gagcgccugu acccccgcga cggcgugcug aagggcgaga uccaccaggc 4800

ccugaagcug aaggacggcg gccacuaccu gguggaguuc aagaccaucu acauggccaa 4860

gaagcccgug caacugcccg gcuacuacua cguggacacc aagcuggaca ucaccuccca 4920

caacgaggac uacaccaucg uggaacagua cgagcgcucc gagggccgcc accaccuguu 4980

ccuguacggc auggacgagc uguacaagug accucgcccc ggaccugccc ucccgccagg 5040

ugcacccacc ugcaauaaau gcagcgaagc cgggauucga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5100

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5160

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 5199

<210> 12

<211> 2963

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ETH047T02 (具有 Ethris的最小UTR的CCDC39) - 编码人CCDC39蛋白的功能性版本的密码子优化序列

<400> 12

gggagacgcc accaugagca gcgaguuucu ggccgaacug cacugggagg acggcuucgc 60

uauucccgug gccaacgagg aaaacaagcu gcuggaagau cagcugagca agcugaagga 120

cgagagagcc ucucugcagg acgagcugag agaguacgag gaacggauca acagcaugac 180

cagccacuuc aagaacguga agcaagagcu gagcaucacc cagagccugu gcaaggccag 240

agagagagaa accgagagcg aggaacacuu caaggcuauc gcccagcgcg agcugggaag 300

agugaaggau gagauccagc ggcuggaaaa cgagauggcc agcauccugg aaaagaaguc 360

cgacaaagag aacggcaucu ucaaggccac acagaagcug gacggccuga agugccagau 420

gaacugggau cagcaggccc uggaagccug gcuggaagag ucugcccaca aggauucuga 480

cgcccugaca cugcagaagu acgcccagca ggacgacaac aagauccggg cucugacccu 540

gcagcuggaa agacugaccc uggaaugcaa ccagaagcgg aagauccugg acaacgagcu 600

gaccgagaca aucagcgccc agcuggaacu ggauaaggcc gcucaggacu ucagaaagau 660

ccacaacgag cggcaagaac ugaucaagca gugggagaac accaucgagc agaugcagaa 720

acgcgacggc gacaucgaca acugcgcccu ggaacucgcc cggaucaagc aagagacacg 780

cgagaaagag aaccugguca aagagaagau caaguuccuc gaguccgaga ucggcaacaa 840

caccgaguuc gagaagcgga ucagcguggc cgacagaaag cugcugaagu gcagaaccgc 900

cuaccaggac cacgagacaa gccggauuca gcucaagggc gagcuggauu cucugaaggc 960

caccgugaac agaaccagca gcgaucugga agcccugcgg aagaacauca gcaagaucaa 1020

gaaggacauc cacgaggaaa ccgccaggcu gcagaaaaca aagaaccaca augagaucau 1080

ccagaccaag cugaaagaga ucaccgaaaa gaccaugagc guggaagaga aggccacaaa 1140

ccuggaagau augcucaaag aggaagagaa agacgucaaa gagguggacg uucaacugaa 1200

ccugauuaag ggcgugcugu ucaagaaggc ccaagagcug cagaccgaaa ccaugaagga 1260

aaaggccguc cugucugaga ucgagggcac cagaucuagc cugaagcacc ugaaccauca 1320

gcugcagaag cucgacuucg agacacugaa gcagcaagag aucauguaca gccaggauuu 1380

ccacauccag caggucgagc ggcggauguc uagacugaag ggcgagauca acuccgagga 1440

aaaacaggcc cucgaggcca agaucgugga acugagaaag agccucgaag agaagaaguc 1500

uaccugcggc cugcuggaaa cccagauuaa gaagcugcac aacgaccugu acuucaucaa 1560

gaaagcccac agcaagaaca gcgacgagaa gcagagccug augaccaaga ucaaugagcu 1620

gaaccuguuc aucgaucgga gcgaaaaaga gcuggacaag gccaagggcu ucaagcagga 1680

ccugaugauc gaggacaacc ugcugaagcu ggaagugaag cggaccagag agaugcugca 1740

cagcaaggcc gaggaagugc ugucucugga aaagcggaag cagcagcugu acaccgccau 1800

ggaagagaga accgaagaga ucaaggugca caagaccaug cuggcuuccc agaucagaua 1860

cguggaccaa gagcgcgaga acaucuccac cgaguuuaga gagagacugu ccaagaucga 1920

gaagcugaag aaccgcuacg agauccugac cgucgugaug cugccuccug agggcgaaga 1980

ggaaaagacc caggccuacu acgugaucaa ggcagcccaa gaaaaagagg aacuccagag 2040

agaaggcgac ugccuggacg ccaagauuaa caaggccgaa aaagaaaucu acgcccucga 2100

gaacacccug cagguccuga acagcugcaa caacaacuac aagcagagcu ucaagaaagu 2160

caccccuagc uccgacgagu acgagcugaa gauucagcug gaagaacaga aaagagccgu 2220

ggacgagaag uacagauaca agcagcggca gaucagagag cugcaagagg auauccagag 2280

cauggaaaac acccuggacg ugaucgagca ccuggccaac aacgugaaag agaagcuguc 2340

cgagaaacag gccuacagcu uucagcuguc caaagagaca gaggaacaga agcccaaacu 2400

ggaacgcgug accaagcagu gcgccaagcu gacaaaagag auccggcugc ugaaagacac 2460

caaggacgaa accauggaag aacaagacau caagcugcgc gagaugaagc aguuccacaa 2520

agugaucgac gagaugcugg uggacaucau ugaagagaac acagagaucc gcaucauccu 2580

gcagaccuau uuucagcaga gcggccugga acugccuacc gccucuacaa agggcagcag 2640

acagagcagc agauccccua gccacacaag ccugagcgcc agaagcucua gaagcaccag 2700

caccucuacc agccagucca gcauuaaggu gcuggaacuc aaguuccccg ccagcucuag 2760

ccucguggga agcccuucua gaccuagcag cgccucuagc agcuccagca acgugaaguc 2820

caagaaaagc uccaagugau ucgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2963

<210> 13

<211> 2964

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码人CCDC39序列并包含 TISU元件作为5’UTR的RNA (ETH047T03) - 编码人CCDC39蛋白的功能性版本的密码子优化序列

<400> 13

gggagacugc caagaugagc agcgaguuuc uggccgaacu gcacugggag gacggcuucg 60

cuauucccgu ggccaacgag gaaaacaagc ugcuggaaga ucagcugagc aagcugaagg 120

acgagagagc cucucugcag gacgagcuga gagaguacga ggaacggauc aacagcauga 180

ccagccacuu caagaacgug aagcaagagc ugagcaucac ccagagccug ugcaaggcca 240

gagagagaga aaccgagagc gaggaacacu ucaaggcuau cgcccagcgc gagcugggaa 300

gagugaagga ugagauccag cggcuggaaa acgagauggc cagcauccug gaaaagaagu 360

ccgacaaaga gaacggcauc uucaaggcca cacagaagcu ggacggccug aagugccaga 420

ugaacuggga ucagcaggcc cuggaagccu ggcuggaaga gucugcccac aaggauucug 480

acgcccugac acugcagaag uacgcccagc aggacgacaa caagauccgg gcucugaccc 540

ugcagcugga aagacugacc cuggaaugca accagaagcg gaagauccug gacaacgagc 600

ugaccgagac aaucagcgcc cagcuggaac uggauaaggc cgcucaggac uucagaaaga 660

uccacaacga gcggcaagaa cugaucaagc agugggagaa caccaucgag cagaugcaga 720

aacgcgacgg cgacaucgac aacugcgccc uggaacucgc ccggaucaag caagagacac 780

gcgagaaaga gaaccugguc aaagagaaga ucaaguuccu cgaguccgag aucggcaaca 840

acaccgaguu cgagaagcgg aucagcgugg ccgacagaaa gcugcugaag ugcagaaccg 900

ccuaccagga ccacgagaca agccggauuc agcucaaggg cgagcuggau ucucugaagg 960

ccaccgugaa cagaaccagc agcgaucugg aagcccugcg gaagaacauc agcaagauca 1020

agaaggacau ccacgaggaa accgccaggc ugcagaaaac aaagaaccac aaugagauca 1080

uccagaccaa gcugaaagag aucaccgaaa agaccaugag cguggaagag aaggccacaa 1140

accuggaaga uaugcucaaa gaggaagaga aagacgucaa agagguggac guucaacuga 1200

accugauuaa gggcgugcug uucaagaagg cccaagagcu gcagaccgaa accaugaagg 1260

aaaaggccgu ccugucugag aucgagggca ccagaucuag ccugaagcac cugaaccauc 1320

agcugcagaa gcucgacuuc gagacacuga agcagcaaga gaucauguac agccaggauu 1380

uccacaucca gcaggucgag cggcggaugu cuagacugaa gggcgagauc aacuccgagg 1440

aaaaacaggc ccucgaggcc aagaucgugg aacugagaaa gagccucgaa gagaagaagu 1500

cuaccugcgg ccugcuggaa acccagauua agaagcugca caacgaccug uacuucauca 1560

agaaagccca cagcaagaac agcgacgaga agcagagccu gaugaccaag aucaaugagc 1620

ugaaccuguu caucgaucgg agcgaaaaag agcuggacaa ggccaagggc uucaagcagg 1680

accugaugau cgaggacaac cugcugaagc uggaagugaa gcggaccaga gagaugcugc 1740

acagcaaggc cgaggaagug cugucucugg aaaagcggaa gcagcagcug uacaccgcca 1800

uggaagagag aaccgaagag aucaaggugc acaagaccau gcuggcuucc cagaucagau 1860

acguggacca agagcgcgag aacaucucca ccgaguuuag agagagacug uccaagaucg 1920

agaagcugaa gaaccgcuac gagauccuga ccgucgugau gcugccuccu gagggcgaag 1980

aggaaaagac ccaggccuac uacgugauca aggcagccca agaaaaagag gaacuccaga 2040

gagaaggcga cugccuggac gccaagauua acaaggccga aaaagaaauc uacgcccucg 2100

agaacacccu gcagguccug aacagcugca acaacaacua caagcagagc uucaagaaag 2160

ucaccccuag cuccgacgag uacgagcuga agauucagcu ggaagaacag aaaagagccg 2220

uggacgagaa guacagauac aagcagcggc agaucagaga gcugcaagag gauauccaga 2280

gcauggaaaa cacccuggac gugaucgagc accuggccaa caacgugaaa gagaagcugu 2340

ccgagaaaca ggccuacagc uuucagcugu ccaaagagac agaggaacag aagcccaaac 2400

uggaacgcgu gaccaagcag ugcgccaagc ugacaaaaga gauccggcug cugaaagaca 2460

ccaaggacga aaccauggaa gaacaagaca ucaagcugcg cgagaugaag caguuccaca 2520

aagugaucga cgagaugcug guggacauca uugaagagaa cacagagauc cgcaucaucc 2580

ugcagaccua uuuucagcag agcggccugg aacugccuac cgccucuaca aagggcagca 2640

gacagagcag cagauccccu agccacacaa gccugagcgc cagaagcucu agaagcacca 2700

gcaccucuac cagccagucc agcauuaagg ugcuggaacu caaguucccc gccagcucua 2760

gccucguggg aagcccuucu agaccuagca gcgccucuag cagcuccagc aacgugaagu 2820

ccaagaaaag cuccaaguga uucgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2964

<210> 14

<211> 2993

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ETH047T05: SP30；编码人CCDC39 并包含30个核苷酸的随机序列(SP30)（其用作 5’UTR）的 RNA

- 编码人CCDC39蛋白的功能性版本的密码子优化序列

<400> 14

gggagacauu gaaauuuauc ucuuguguug uggucgcgcc accaugagca gcgaguuucu 60

ggccgaacug cacugggagg acggcuucgc uauucccgug gccaacgagg aaaacaagcu 120

gcuggaagau cagcugagca agcugaagga cgagagagcc ucucugcagg acgagcugag 180

agaguacgag gaacggauca acagcaugac cagccacuuc aagaacguga agcaagagcu 240

gagcaucacc cagagccugu gcaaggccag agagagagaa accgagagcg aggaacacuu 300

caaggcuauc gcccagcgcg agcugggaag agugaaggau gagauccagc ggcuggaaaa 360

cgagauggcc agcauccugg aaaagaaguc cgacaaagag aacggcaucu ucaaggccac 420

acagaagcug gacggccuga agugccagau gaacugggau cagcaggccc uggaagccug 480

gcuggaagag ucugcccaca aggauucuga cgcccugaca cugcagaagu acgcccagca 540

ggacgacaac aagauccggg cucugacccu gcagcuggaa agacugaccc uggaaugcaa 600

ccagaagcgg aagauccugg acaacgagcu gaccgagaca aucagcgccc agcuggaacu 660

ggauaaggcc gcucaggacu ucagaaagau ccacaacgag cggcaagaac ugaucaagca 720

gugggagaac accaucgagc agaugcagaa acgcgacggc gacaucgaca acugcgcccu 780

ggaacucgcc cggaucaagc aagagacacg cgagaaagag aaccugguca aagagaagau 840

caaguuccuc gaguccgaga ucggcaacaa caccgaguuc gagaagcgga ucagcguggc 900

cgacagaaag cugcugaagu gcagaaccgc cuaccaggac cacgagacaa gccggauuca 960

gcucaagggc gagcuggauu cucugaaggc caccgugaac agaaccagca gcgaucugga 1020

agcccugcgg aagaacauca gcaagaucaa gaaggacauc cacgaggaaa ccgccaggcu 1080

gcagaaaaca aagaaccaca augagaucau ccagaccaag cugaaagaga ucaccgaaaa 1140

gaccaugagc guggaagaga aggccacaaa ccuggaagau augcucaaag aggaagagaa 1200

agacgucaaa gagguggacg uucaacugaa ccugauuaag ggcgugcugu ucaagaaggc 1260

ccaagagcug cagaccgaaa ccaugaagga aaaggccguc cugucugaga ucgagggcac 1320

cagaucuagc cugaagcacc ugaaccauca gcugcagaag cucgacuucg agacacugaa 1380

gcagcaagag aucauguaca gccaggauuu ccacauccag caggucgagc ggcggauguc 1440

uagacugaag ggcgagauca acuccgagga aaaacaggcc cucgaggcca agaucgugga 1500

acugagaaag agccucgaag agaagaaguc uaccugcggc cugcuggaaa cccagauuaa 1560

gaagcugcac aacgaccugu acuucaucaa gaaagcccac agcaagaaca gcgacgagaa 1620

gcagagccug augaccaaga ucaaugagcu gaaccuguuc aucgaucgga gcgaaaaaga 1680

gcuggacaag gccaagggcu ucaagcagga ccugaugauc gaggacaacc ugcugaagcu 1740

ggaagugaag cggaccagag agaugcugca cagcaaggcc gaggaagugc ugucucugga 1800

aaagcggaag cagcagcugu acaccgccau ggaagagaga accgaagaga ucaaggugca 1860

caagaccaug cuggcuuccc agaucagaua cguggaccaa gagcgcgaga acaucuccac 1920

cgaguuuaga gagagacugu ccaagaucga gaagcugaag aaccgcuacg agauccugac 1980

cgucgugaug cugccuccug agggcgaaga ggaaaagacc caggccuacu acgugaucaa 2040

ggcagcccaa gaaaaagagg aacuccagag agaaggcgac ugccuggacg ccaagauuaa 2100

caaggccgaa aaagaaaucu acgcccucga gaacacccug cagguccuga acagcugcaa 2160

caacaacuac aagcagagcu ucaagaaagu caccccuagc uccgacgagu acgagcugaa 2220

gauucagcug gaagaacaga aaagagccgu ggacgagaag uacagauaca agcagcggca 2280

gaucagagag cugcaagagg auauccagag cauggaaaac acccuggacg ugaucgagca 2340

ccuggccaac aacgugaaag agaagcuguc cgagaaacag gccuacagcu uucagcuguc 2400

caaagagaca gaggaacaga agcccaaacu ggaacgcgug accaagcagu gcgccaagcu 2460

gacaaaagag auccggcugc ugaaagacac caaggacgaa accauggaag aacaagacau 2520

caagcugcgc gagaugaagc aguuccacaa agugaucgac gagaugcugg uggacaucau 2580

ugaagagaac acagagaucc gcaucauccu gcagaccuau uuucagcaga gcggccugga 2640

acugccuacc gccucuacaa agggcagcag acagagcagc agauccccua gccacacaag 2700

ccugagcgcc agaagcucua gaagcaccag caccucuacc agccagucca gcauuaaggu 2760

gcuggaacuc aaguuccccg ccagcucuag ccucguggga agcccuucua gaccuagcag 2820

cgccucuagc agcuccagca acgugaaguc caagaaaagc uccaagugau ucgaaaaaaa 2880

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2993

Claims (15)

1.一种用于治疗患有纤毛疾病的受试者的纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸编码其缺陷与所述纤毛疾病相关的蛋白的功能性版本，并且其中当所述患者表现出呼吸系统的炎症时将所述药物组合物施用于所述患者的呼吸系统。

2.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中所述纤毛疾病是原发性纤毛运动障碍(PCD)。

3.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中所述纤毛疾病与包含卷曲螺旋结构域的40(CCDC40)蛋白中的缺陷和/或与包含卷曲螺旋结构域的39(CCDC39)蛋白中的缺陷相关。

4.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中通过分析血液样品和/或通过分析呼出的一氧化氮的量来确定患有纤毛疾病的受试者的呼吸系统的炎症的存在或不存在。

5.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中所述药物组合物的施用包括使用鼻喷雾和/或雾化器和/或通过吸入的施用。

6.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中所述药物组合物每周施用至少一次和/或施用持续至少4周。

7.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含N-乙酰半胱氨酸(NAC)和/或包含氯化钠的高渗溶液。

8.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含编码多纤毛分化和DNA合成相关细胞周期(MCIDAS)蛋白的多核糖核苷酸，并且/或者其中所述药物组合物是与包含编码MCIDAS蛋白的多核糖核苷酸的第二药物组合物一起施用的第一药物组合物。

9.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含具有式(V)所示结构的类脂质(lipidoid)：

10.一种药物组合物，其包含编码其缺陷与纤毛疾病相关的蛋白的多核糖核苷酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)、包含氯化钠的高渗溶液和/或LF92制剂。

11.一种用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法，其中所述多核糖核苷酸编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需的蛋白，所述方法包括以下步骤：

(a)获得患有纤毛疾病的受试者的鼻刷，所述鼻刷包含未分化的基底细胞和分化的纤毛细胞，

(b)培养从步骤(a)获得的所述细胞作为用于获得未分化的基底细胞和去分化的纤毛细胞的浸没细胞培养物，

(c)培养从步骤(b)获得的未分化的基底细胞和去分化的纤毛细胞作为气液界面细胞培养物并进行气升，

(d)用编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需的蛋白的多核糖核苷酸转染从步骤(c)获得的细胞，

(e)培养从步骤(d)获得的所述转染的细胞以用于获得分化的纤毛细胞，以及

(f)使用乳酸脱氢酶测量、NucGreen测定、高速视频显微镜检查、纤毛搏动频率测量、粘液纤毛清除率测定和/或免疫荧光染色来确定所述多核糖核苷酸对纤毛形成的作用。

12.根据权利要求11所述的方法，其中在步骤(c)中进行所述气升后在0至48小时内转染所述细胞。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中使用具有式(V)所示结构的类脂质，用编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需的蛋白的多核糖核苷酸转染所述细胞。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中在步骤(b)至(e)中使用培养基G来培养所述细胞。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述鼻刷进一步包括成纤维细胞，并且其中在步骤(b)至(e)中抑制所述成纤维细胞的生长。

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