CN104349794A - 信使rna的肺递送 - Google Patents

信使rna的肺递送 Download PDF

Info

Publication number
CN104349794A
CN104349794A CN201380027591.5A CN201380027591A CN104349794A CN 104349794 A CN104349794 A CN 104349794A CN 201380027591 A CN201380027591 A CN 201380027591A CN 104349794 A CN104349794 A CN 104349794A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mrna
lung
pei
infection
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380027591.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104349794B (zh
Inventor
J·盖格
M·K·阿内加
C·鲁道夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
Ethris GmbH
Original Assignee
Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU filed Critical Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
Publication of CN104349794A publication Critical patent/CN104349794A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104349794B publication Critical patent/CN104349794B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于在肺中表达mRNA的方法，其中-将待表达的mRNA与聚乙烯亚胺(PEI)组合来提供包含mRNA和PEI的组合；-将包含mRNA和PEI的组合施用至肺，在肺中所述组合进入肺细胞；以及-在肺细胞中表达mRNA。

Description

信使RNA的肺递送
技术领域
本发明涉及一种用于在肺中表达mRNA的方法。
背景技术
信使RNA(mRNA)是由主要以腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷为核苷的核苷磷酸构建模块所构建起来的聚合物，信使RNA作为中间载体从细胞核中的DNA携带遗传信息到细胞质中，在细胞质中它被翻译成蛋白。因此，它们适合作为用于基因表达的替代品。
细胞中生化过程的澄清和人类基因组的澄清，已经揭示了基因缺乏与疾病之间的关系。因此，长期以来希望通过基因疗法治愈基因缺乏所导致的疾病。期待很高，但就此方面的最初尝试失败了并且只报道了最近的进展。基因疗法的第一种方法在于在载体中将缺乏的或缺陷的(defective)基因的完整DNA带到细胞核中以实现完整基因的表达，由此提供缺失或有缺陷的蛋白。这些尝试大部分都没有成功，不太成功的尝试压力在于实质性的副作用，特别是提高的肿瘤发生。只是最近报道了更有希望的结果，然而距离获得批准还相差甚远。
此外，还有一些疾病是由于缺乏蛋白或蛋白的缺陷，而缺乏这些蛋白归因于遗传缺陷。在这样的情况下，也考虑通过施用DNA来体内产生相关的蛋白。也可以通过零或低副作用的核酸疗法，提供在代谢中发挥作用并且出于病理或非病理的原因而被破坏或抑制的因子。
还已提出了使用mRNA用于遗传病的疗法以便治疗导致疾病的基因缺陷。这方面的优势在于仅需要将mRNA引入细胞的细胞质，而不需要转位至核中。转位至核中是困难且低效的；而且如果载体或其部分被并入基因组中的话，存在相当大的改变染色体DNA的风险。
诚然，能够证明体外转录的信使RNA其实也可以表达于哺乳动物组织中，然而在尝试使用mRNA用于疾病疗法中出现了进一步的障碍。mRNA的稳定性缺乏有这样的影响，即期望的蛋白不能在哺乳动物组织中以足够的量获得。mRNA触发大量免疫反应的事实导致了另一实质性缺点。据推测，通过结合到Toll样受体如TLR3、TLR7、TLR8和解旋酶RIG-1，产生这些强烈的免疫反应。
为了防止免疫反应，在WO 2007/024708A中提议使用这样的RNA，即在RNA中四个核糖核苷酸中的一个被替换为修饰的核苷酸。特别是，研究了当尿苷完全由假尿苷取代时，mRNA的行为如何。已经发现，这样的RNA分子免疫原性显著更低。此外，还提出了使用具有编码蛋白或蛋白片段的序列的RNA，其中RNA含有未修饰的和修饰的核苷酸的组合，其中5至50％的尿苷核苷酸以及5至50％的胞苷核苷酸分别是修饰的尿苷核苷酸和修饰的胞苷核苷酸。已经发现，这样的RNA分子免疫原性显著更低，甚至更稳定。还提出，通过在小鼠中气管内气雾的重复应用，这样的RNA可用于预防患有表面活性剂蛋白B(SP-B)缺乏症的小鼠死亡。这些观察从而证明这种RNA有希望来治疗威胁生命的遗传性和获得性肺疾病，并解决远远没有得到满足的医疗需求。然而，考虑到在患者中进行应用，由于需要进行麻醉并且使用临床上标准使用的雾化器所导致的RNA降解，这种应用程序还不适合重复的气雾应用。
为了能够利用RNA给身体的肺提供必要的或有益的蛋白和/或治疗由于缺失的或缺乏的蛋白所导致的疾病，希望可获得这样一种方法用于重复的气雾应用，其避免重复麻醉患者。然而，同时这种方法不应导致显著程度的RNA功效降低。
在EP 1 173 224B1中，提出使用聚乙烯亚胺(PEI)25kDa/DNA制剂用于向肺进行基因的气雾递送，相较于体外转染，这适于克服先前未解决的雾化过程中伴随的重复麻醉和功效显著降低的问题。人们发现，PEI/DNA制剂耐受喷射雾化器(jet-nebulizer)诱导的转染效率降低，并且当通过喷射雾化器体内递送时，优于以前优化的基于脂质的制剂。具体地，EP 1 173 224B1公开了一种靶向疗法(如经由呼吸道的基因疗法)的方法，其包括经由个体呼吸道通过小颗粒气雾递送复合有聚乙烯亚胺的遗传大分子的水性分散剂的步骤。根据该发明方法有代表性的遗传大分子的实例包括DNA、RNA和其它核酸种类。然而，该发明被缩减到仅仅在专利所含实施例中实施用于DNA的递送，而非用于mRNA。此外，通过将溶于水的质粒DNA和适当量的溶于PBS的PEI进行混合，形成编码兴趣基因的质粒DNA与PEI的复合物。然而，Rudolph等人(Mol Ther.2005,12:493-501)表明当在低渗蒸馏水中组装和雾化时，PEI-DNA复合物在小鼠肺中分别产生比在等渗5％葡萄糖或Hepes缓冲盐水中57-和185-倍高的表达水平。令人惊奇地，当在PBS中组装和雾化时，PEI-DNA复合物完全无效。这主要归因于以下事实：PBS中配制的PEI基因载体产生大的直径(848±142nm)，这在动力学上是不稳定的，并导致沉淀。也发现，复合至PEI的气雾化的纳克量级pDNA 350ng)，比通过气管内插管直接应用至小鼠肺的140倍高剂量(50μg)的同一载体，产生15倍高的转染水平。
此外，Bettinger等人(Nucleic Acids Res.2001,29:3882-91)证明脂质复合物，而非基于聚乙烯亚胺(分枝PEI 25和线性PEI 22kDa)、聚(L-赖氨酸)(PLL，54kDa)的聚合复合物(polyplexes)或树枝状聚合物，在转染的B16-F10细胞中介导有效的mRNA翻译。在无细胞翻译实验以及随后的细胞质注射入Rat1细胞中采用PEI 25kDa/mRNA或者PLL 54kDa/mRNA的表达缺乏，表明这些聚合复合物过于稳定以至于不能释放mRNA。这表明mRNA和转染试剂之间静电相互作用的强度对所达到的表达水平有显著影响，热力学稳定的聚合复合物载体(如PEI-mRNA)不太适合mRNA翻译。通过使用更短的聚阳离子降低载体和mRNA之间的静电相互作用赋予表达的大幅度提高，相较于DOTAP/mRNA，使用低分子量PEI和PLL形成的mRNA聚合复合物实现了5倍高的萤光素酶表达水平。然而，使用低分子量聚阳离子形成的聚合复合物失去了其内体裂解(endosomolytic)活性，并且需要氯喹介导mRNA的表达。通过将低分子量PEI缀合至膜活性肽蜂毒肽以恢复内体裂解(endosomolysis)，并在没有氯喹时证实了高水平的mRNA表达。总之，这些观察表明单链mRNA结合至阳离子聚合物比pDNA的结合更强很多。这进一步得到Huth等人的证实(J.Gene Med.2006,8:1416–1424)，其提出作为核进入、转录和成功转基因表达的前提，细胞质RNA参与pDNA从阳离子聚合物的释放。总之，这些观察表明PEI 25kDa无法调解功能mRNA到细胞中的递送。
因为涉及插管的连续重复治疗与生活质量的要求不相适应，基于本发明的任务是提供一种用于信使RNA肺递送的适合的和非侵入性方法，以产生所述mRNA编码的蛋白的肺表达。
现有技术缺少用于mRNA肺递送的非侵入性方法。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种用于通过非侵入性的肺应用来递送mRNA治疗剂的方法，其导致在肺内产生有效水平的编码的蛋白。
因此，本发明提供了一种用于在肺中表达mRNA的方法，其中
-将待表达的mRNA与聚乙烯亚胺(PEI)组合来提供包含mRNA和PEI的组合；
-将包含mRNA和PEI的组合施用至肺，在肺中所述组合进入肺细胞；以及
-mRNA在肺细胞中表达。
本发明特别适用于人类医疗。因此，根据本发明待治疗的肺优选是人类患者的肺，优选患有肺缺陷(pulmonary defect)的人类患者，肺缺陷尤其选自：表面活性剂蛋白B(SPB)缺乏症、ATP结合盒亚家族A成员3(ABCA3)缺乏症、囊性纤维化、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、肺癌、表面活性剂蛋白C(SPC)缺乏症、肺泡蛋白沉积症、结节病、急性和慢性支气管炎、肺气肿、McLeod-综合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管哮喘、支气管扩张、肺尘埃沉着病、石棉沉着病、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、婴儿呼吸窘迫综合征(IRDS)、肺水肿、肺嗜酸粒细胞增多、洛夫勒肺炎、Hamman-Rich综合征、特发性肺纤维化、间质性肺病、原发性纤毛运动障碍、肺动脉高压(PAH)和STAT5b缺乏症。
此外，人类患者的肺可以作为生物反应器，用于将mRNA表达的蛋白从肺细胞分泌到血液循环中，如促红细胞生成素，凝血缺陷比如血友病A和B，补体缺陷比如蛋白C缺乏症、血栓性血小板减少性紫癜(TTP，ADAMTS 13缺乏症)和先天性血色素沉着症(如铁调素缺乏症)。
从肺细胞表达的mRNA也可用于抗肺感染性疾病的疫苗接种，比如呼吸道合胞病毒(RSV)感染、副流感病毒(PIV)感染、流感病毒感染、鼻病毒感染、和严重急性呼吸综合征(冠状病毒(SARS-CoV)感染、结核病、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)感染、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)感染、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染、以及流感嗜血杆菌感染。对于这样的疫苗接种目的，递送的mRNA编码一种或多种病原体的抗原。
本发明过程中待施用的PEI通常不是关键的(Morimoto等人Mol.Ther.7(2003),254-261)，然而，本发明的过程中使用具有1kDa至1000kDa分子量，优选10kDa至50kDa，尤其是20至30kDa的PEI是有利的。
根据本发明优选的实施方式，PEI包含靶向配体，优选IP1受体配体，更优选前列腺环素(prostacyclin)类似物，尤其是伊洛前列素(Iloprost)5-{(E)-(1S,5S,6R,7R)-7-羟基-6-[(E)-(3S,4RS)-3-羟基-4-甲基-1-辛烯-6-炔基]-双环[3.3.0]辛-3-亚基)戊酸)或曲前列尼尔(Treprostinil)((1R,2R,3aS,9aS)-[[2,3,3a,4,9,9a-六氢-2-羟基-1-[(3S)-3-羟基辛烷基]-1H-苯并[f]茚-5-基]氧基]乙酸)；或β2-肾上腺素受体配体，尤其是克仑特罗(clenbuterol)(Elfinger等人J.Control.Release 2009,135:234-241)、乳铁蛋白(Elfinger等人Biomaterials 2007,28:3448-3455)、糖醛酸(Weiss等人Biomaterials 2006,27:2302-2312)或凝集素(Bies等人Adv.Drug Deliv.Rev.2004,56:425-435)。
IP1受体配体，更优选前列腺环素类似物，用于向肺细胞尤其是向支气管或肺泡上皮细胞靶向特异性递送基于PEI的药物制剂的用途，已被WO 2011/076391A所公开并且获得。
利用根据本发明的方法，优选向肺细胞递送具有医疗益处的mRNA，尤其是取代、破坏、拮抗或抑制在肺或在此患者中具有致病作用的基因的mRNA。尤其优选递送在该肺细胞中取代缺陷基因的mRNA。
因此，本发明的优选实施方式是这样的方法和组合物，其中mRNA编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)、表面活性剂蛋白B(SPB)、ATP结合盒亚家族A成员3(ABCA3)或α-1抗胰蛋白酶(A1AT)、表面活性剂蛋白C(SPC)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、因子VIII、因子IX、van Willebrand因子、ADAMTS 13、铁调素、血管紧张素转换酶II或者病毒和细菌病原体的抗原。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含mRNA和PEI，其用于在肺中表达mRNA的方法中。根据本发明的药物组合物尤其适于治疗肺缺陷，肺缺陷尤其选自：表面活性剂蛋白B(SPB)缺乏症、ATP结合盒亚家族A成员3(ABCA3)缺乏症、囊性纤维化、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症；肺癌、表面活性剂蛋白C(SPC)缺乏症、肺泡蛋白沉积症、结节病、急性和慢性支气管炎、肺气肿、McLeod-综合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管哮喘、支气管扩张、肺尘埃沉着病、石棉沉着病、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、婴儿呼吸窘迫综合征(IRDS)、肺水肿、肺嗜酸粒细胞增多、洛夫勒肺炎、Hamman-Rich综合征、特发性肺纤维化、间质性肺病、原发性纤毛运动障碍、肺动脉高压(PAH)和STAT5b缺乏症、凝血缺陷，尤其是血友病A和B；补体缺陷，尤其是蛋白C缺乏症、血栓性血小板减少性紫癜和先天性血色素沉着症，尤其是铁调素缺乏症；肺感染性疾病，优选呼吸道合胞病毒(RSV)感染、副流感病毒(PIV)感染、流感病毒感染、鼻病毒感染、和严重急性呼吸综合征(冠状病毒(SARS-CoV)感染、结核病、绿脓杆菌感染、洋葱伯克霍尔德氏菌感染、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染、以及流感嗜血杆菌感染。
根据本发明优选的药物组合物进一步包含至少一种碳氟化合物。无论全氟化碳的分子结构和蒸汽压力如何，采用全氟化碳的气雾治疗普遍表现出改善的气体交换以及降低的肺炎症反应。虽然在蒸汽压力和分子结构上的差异可以产生不同的最佳剂量策略，证明主要的几种不同的全氟化碳适于气雾治疗，例如全氟环醚(perfluorocycloether)(FC77)、全氟溴辛烷(perfluorooctylbromide)、或者全氟三丁胺(FC43)。
因此，本发明优选以气雾的形式提供。在一个优选实施方式中，旨在用于肺施用的根据本发明的药物组合物与全氟化碳组合，所述全氟化碳在药物组合物之前施用、或与药物组合物同时施用以便提高转染效率。
在一个优选实施方式中，以适合通过肺吸收的形式提供根据本发明的mRNA/PEI组合，例如通过吸入。对于此，本领域技术人员公知合适的配方。在这种情况下，该制剂是可以通过普通雾化器或吸入器被引入到呼吸道的形式，例如作为液体用于雾化或作为粉末。用于作为液体进行施用的装置是公知的，并且与喷嘴喷射雾化器相比，以低剪切力操作的超声雾化器或带有多孔振荡膜的雾化器是合适的。粉末气雾也合适。与糖蔗糖一起冷冻干燥之后，可以获得作为粉末的复合有PEI的mRNA，其然后可以粉碎至可吸入的大小并且显示生物活性。
优选，通过高压喷雾，作为气雾气管内施用mRNA/PEI的组合。
在一个本发明尤其优选的实施方式中，提供作为含有磁颗粒的气雾的药物制剂，尤其是提供这样的制剂，其中气雾含有直径是至少5nm且至多800nm的磁颗粒以及mRNA/PEI的组合(EP 1 924 244A)。磁颗粒通常具有至少50nm且至多750nm的直径，优选具有至少100nm且至多700nm的直径，更优选具有至少150nm且至多600nm的直径，又更优选具有至少200nm且至多500nm的直径，尤其优选具有至少250nm且至多450nm的直径，最优选具有至少300nm且至多400nm的直径。
根据一个优选的实施方式，在气雾中将PEI偶联至磁颗粒。
优选地，根据本发明的含有磁颗粒的气雾由金属和/或其氧化物和/或氢氧化物组成，或者含有金属和/或其氧化物和/或氢氧化物。根据一个优选的实施方式，磁颗粒由金属组成，或者含有金属，并且金属选自铁、钴或镍、磁性铁氧化物或氢氧化物如Fe3O4、γ-Fe2O3、二或三价铁离子与其它二或三价金属离子(如Co2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Cr3+、Gd3+、Dy3+或Sm3+)的双氧化物或氢氧化物、及其任意混合物。
在应用这种含有磁颗粒的气雾时，可以通过磁场将含有磁颗粒的气雾沉积在待治疗的呼吸道和/或肺的区域表面。优选，磁场具有至少100mT(毫特斯拉)，至少200mT，至少500mT或至少1T(特斯拉)的场强。优选，磁场具有大于1T/m或大于10T/m的磁场梯度。根据该方法的一个优选实施方式中，磁场是脉冲、振荡或脉冲-振荡磁场。优选，磁场与患者的呼吸动态匹配，并且仅在呼气和吸气的、吸气和呼气之间的静息停顿期间激活(EP 1 924 244A)。
特别合适的是PEI 25kDa，其用于配制编码蛋白或蛋白片段的mRNA，并且其中在蒸馏水中产生所述制剂，并使用喷射雾化器将制剂作为气雾应用至肺。
通过使用具有低pH和低电导的水性缓冲液和溶剂来制备本发明尤其优选的实施方式。PBS缓冲液具有7.4的pH和16,500±500μS/cm的电导(于25℃)。如果采用更低的电导和/或更低pH的溶液，则根据本发明的组合物中的mRNA出人意料地表现出提高的稳定性。例如，高压灭菌的超纯水具有1±0.2μS/cm的电导(美国药典要求25℃时的电导上限为1.3)以及5.0至7.0的pH。经0.2-μm滤器过滤的自来水具有300±5μS/cm的电导。在本发明的优选实施方式中，应用比PBS缓冲液具有更低pH和更低电导的水性缓冲液和溶剂。因此，根据本发明的药物组合物优选具有6.5以下的pH，优选3至6，尤其是4至5.5，和/或具有10000μS/cm或更低，优选1000或更低，尤其是100或更低的25℃电导(即，在25℃时的电导)。例如，尤其优选的实施方式含有药学上可接受的水(注射用水)，如在美国药典中所定义的(代替缓冲液，如PBS)。
当然，根据本发明的药物制剂可进一步含有药学上可接受的载体和/或其它辅助化合物，尤其是通常以待递送至人肺的气雾组合物的形式提供的化合物。
因为复制缺陷型病毒具有高的转染效率，它们最成功地用于基因疗法领域。然而，插入诱变和诱导不想要的免疫反应的风险对于它们的安全应用仍然是至关重要的。另一方面，作为更安全的替代，非病毒载体已被广泛研究用于质粒DNA(pDNA)递送，尽管它们的基因转移效率仍然比病毒载体低很多倍，这主要归因于pDNA转运至核中的效率不足。替代pDNA，在非病毒基因递送领域中信使RNA(mRNA)最近出现作为有吸引力且有前景的替代。相比pDNA，这种策略集结了多种优势：i)由于mRNA在细胞质中发挥其功能，因此能够避免核膜，而核膜对于pDNA而言是主要的障碍；ii)可排除插入诱变的风险；iii)有效启动子的确定和使用得以省略；iv)重复应用是可行的；v)mRNA在非分裂细胞中同样有效，和vi)可以避免载体诱导的免疫原性。
基于mRNA的基因转移载体已作为DNA制成的载体的有吸引力的替代出现，并用于遗传性疾病或(抗肿瘤)免疫接种的潜在治疗。在癌症的免疫疗法中已证明了它的成功应用，这不仅是因为它能够在一个步骤中将整个抗原的所有表位一起递送，还因为操纵和纯化相当简单。此外，因为mRNA不整合到基因组中，并且转染的持续时间短，这种策略在药物安全性方面具有几个优势。编码多种抗原的mRNA组合向树突细胞(DC)的递送，是一种在癌症患者中诱导免疫反应的强有力且有前景的方法。
迄今为止，质粒DNA(pDNA)已经主要用于非病毒基因的转移。然而，它很难被转染到非分裂的哺乳动物细胞中，除此之外，细菌未甲基化的DNA CpG基序通过Toll样受体9(TLR9)诱导强烈的免疫反应。例如，借助于电穿孔、阳离子聚合物或阳离子脂质，仅1-10％的DC得以转染。另一方面，mRNA的电穿孔转染效率先前已经证明能够达到高达95％的转染细胞。这些观察表明，mRNA转移比pDNA转移有效得多，这主要是因为mRNA没有必要被转运到核中。因此，曾报道过早期显著更高的蛋白表达。
虽然应当强调上面列出的使用mRNA用于非病毒基因转移的优势，但必须指出的是mRNA面临着大约13种不同的核苷修饰，包括真核细胞中的甲基化，并且体外转录的mRNA会导致由TLR3、TLR7和TLR8介导的强烈免疫反应，这体现了对其成功体内应用的一个重大挑战。然而，修饰的核苷酸可有助于减少这些免疫刺激作用，如将在后面讨论。
在真核细胞中成熟的mRNA由五个主要部分组成：帽结构([m7Gp3N(N：任意核苷酸)]、5'非翻译区(5'UTR)、开放阅读框(ORF)、3'非翻译区(3'UTR)、以及100-250个腺苷残基的尾(聚(A)尾)。可以从带有噬菌体启动子(例如T7、SP6或T3)的质粒DNA获得体外转录的mRNA。体外转录是使用市售可获得的试剂盒获得足够量的功能性mRNA的一种常用技术。迄今为止，可行性和技术精度已被显著改善。
人们发现有三分之一到二分之一的帽在体外转录过程中以相反方向并入，使它们不能被帽结合蛋白，真核起始因子4E(eIF4E)所识别。与正常的帽结构不同，发现抗-反向帽类似物(anti-reverse cap analog)(ARCA)m2 7,3′OGp3G和m73′dGp3G能够避免帽以错误的方向并入，其中在抗-反向帽类似物中正常帽的3'OH基团被去除或替换为OCH3。随后，已经报道了大量关于ARCA的修饰。有趣的是，人们发现不仅C3'位置上的修饰，在C2'位置上的修饰也防止反向并入。此外，四磷酸ARCA可以比其它帽类似物更有效地促进翻译。其结果是，体外ARCA带帽的转录物(ARCA-mRNA)比正常带帽的转录物(CAP-mRNA)在兔网织红细胞裂解物中表现出显著更高的翻译效率。此外，已经报道发现m2 7,3′OGppCH2pG或m2 7,3′OGpCH2ppG在体外耐受人类Dcp2(脱帽酶中的一种)的水解，并且增加mRNA的稳定性，其中m2 7,3′OGppCH2pG或m2 7,3′OGpCH2ppG中α-β-键或β-γ-键中的桥氧分别被亚甲基取代(Grudzien等人，2006.J Biol Chem,281,1857-67)。然而，相较于m2 7,3′OGp3G，m2 7,3′OGppCH2pG仅表现出对eIF4E的52-68％的亲和性。据最近报道，ARCA(S-ARCA)上的硫代磷酸酯稳定并提高翻译效率。已经发现，用取代ARCA(m2 7,2′OGppspG(D2))上β-磷酸配基(moiety)的非桥氧的硫带帽的荧光素酶(luc)mRNA，比正常的帽，以5.1倍而被更加有效地翻译。另一种非对映异构体形式(D1)显示2.8倍高的翻译效率。在S-ARCA和ARCA之间的翻译效率没有显著差异。然而，发现相比正常的帽(86分钟)或ARCA(155分钟)，D2中的t1/2(257分钟)被强烈地延长了。因此看来硫代磷酸酯有助于耐受水解。
聚(A)尾在mRNA的翻译和稳定性中起重要作用。聚(A)尾结合聚腺苷结合蛋白(PABP)。PABP和eIF4G的N-末端相互作用，从而导致mRNA的环化。此外，聚(A)尾能够结合大量PABP，PABP与eIF4G的相互作用导致eIF4E对帽结构的亲和性增加。帽-聚(A)共同相互作用来自mRNA的5'和3'末端之间的物理相互作用。一旦聚(A)尾被删除或缩短至小于12个残基，通过切割5'帽结构以及5'至3'的外切核酸消化或者3'至5'的降解来发生mRNA的降解。这些观察表明，聚(A)尾对于抑制mRNA的脱帽以及降解是非常重要的。对于体外转录，除非模板质粒DNA含有聚(d(A/T)尾，其可能由聚(A)聚合酶进行后-聚腺苷酸化(post-polyadenylated)。然而，在这种情况下，聚(A)尾长度可能会随着反应的不同而发生变化，尽管在一种方法中这种变化出乎意料地低。
有趣的是，据报道虽然带帽的聚腺苷酸化mRNA的翻译被在运输中(in trans)外源聚(A)的添加所抑制，带帽的非聚腺苷酸化mRNA的翻译在某些聚(A)浓度下被刺激。然而，在兔网织红细胞裂解物中在运输中(in trans)添加由10-180个残基组成的外源聚(A)，使得帽以100个腺苷残基聚(A)尾的mRNA的翻译被刺激11倍。使用脂质转染通过ARCA-luc mRNA-A100的共转染，添加15-600个残基范围内的聚(A)尾导致蛋白表达2.3倍的刺激。
此外，已经报道帽结构和聚(A)尾各自独立地对蛋白表达水平有贡献。使用脂质转染在小鼠树突细胞(JAWSII)中，ARCA-luc mRNA-A64或100比CAP-lucmRNA-A64或100分别显示出25倍、和50倍高的荧光素酶活性。此外，ARCA-lucmRNA-A100比CAP-luc mRNA-A64显示700倍高的荧光素酶活性。因此，长的聚(A)尾结合修饰的帽结构ARCA，极大地改善了在树突细胞中的表达效率。
取决于酶促反应的性质，荧光素酶的活性只间接地测量蛋白表达水平，这意味着对翻译效率的实际作用仍有待确定。检查了聚(A)尾的长度(A0、A20、A40、A60、A80和A100)是否不仅在树突细胞中还在其它细胞类型中影响表达水平。有趣的是，发现在UMR-106(一种来自大鼠的成骨细胞样骨肉瘤细胞系)中使用长度达A60的聚(A)尾时翻译效率增加，然后随着聚(A)尾长度的增加翻译效率降低。因此，聚(A)长度对翻译的作用可能是细胞类型依赖性的。
还在树突细胞中对mRNA修饰对其稳定性和翻译效率的影响进行了研究。发现各种重要因素通过i)将聚(A)的长度延伸到A120；ii)当进行模板质粒载体的线性化时，使用IIS型限制酶比如SapI和BpiI以避免聚(A)尾3'末端的突出(overhang)，并且获得游离末端(free-ending)的聚(A)尾；iii)将人β珠蛋白基因中的两个连续3'UTR克隆到ORF和聚(A)尾之间，来提高mRNA的稳定性和翻译效率。
已评估了各种转染试剂递送mRNA的能力。然而，到现在为止大多数出版物建议用于mRNA的转染的脂质复合物，基于聚乙烯亚胺(PEI，25和22kDa)的多聚复合物产生相当差的结果。然而，尽管DEAE-葡聚糖、聚(L-赖氨酸)和树枝状聚合物能够在体外将mRNA转染至细胞中，仅仅在很少的文献中描述聚阳离子的使用。
利用阳离子脂质在哺乳动物细胞中进行mRNA转移的可行性已经在上世纪80年代末期得以描述。并入脂质体(lipofectin)中的DOTMA(一种合成的阳离子脂质)用于在体外将mRNA有效转染至不同的细胞系。不同量的所应用的mRNA产生萤光素酶活性的线性响应。目前，DOTAP似乎是最有效的最广泛使用的阳离子脂质，在体外和体内都相对便宜且有效的进行mRNA递送应用。此外，可使用阳离子聚合物用于mRNA转染。迄今为止基于可还原的聚阳离子的某些合成载体超过了25kDa PEI的mRNA转染效率。然而，是否那些修饰的载体可被直接用于体内的基因转移，仍然有待研究。关于转染的机制，据发现阳离子聚合物或脂质之间的结合强度代表着影响mRNA表达效率的关键参数之一。然而，对于质粒DNA递送有效且紧密结合mRNA的阳离子聚合物如分枝PEI 25kDa和线性PEI 22kDa，没有产生可检测的表达，而低分子量的PEI 2kDa与mRNA结合的效率较低，但在内体裂解剂(endosomolytic agents)(比如，媲美DOTAP的氯喹或化学连接的蜂毒肽)存在时导致了高的表达水平。这些观察表明，单链的mRNA结合阳离子聚合物比pDNA的结合更强。表明作为核进入和转录的前提，细胞质RNA参与pDNA从阳离子聚合物的释放。因此，为mRNA的递送设计新型的阳离子聚合物，必须小心处理用于pDNA递送的核酸结合强度和有效的阳离子聚合物可能不适合mRNA递送的问题。
除了聚合物和脂质体载体系统，在过去的几年期间变得更为突出的一个有趣的其它选择是使用电穿孔。已经开发了递送外源RNA的规程，其在人造血细胞和人胚胎干细胞中产生了50-90％的转染效率。由于mRNA不必要进入核中，可以施加软电脉冲，从而降低细胞毒性。电穿孔的另一优势可能是，RNA直接穿梭到细胞质中，因此可能不被固有RNA受体所感知，这可以避免不期望的免疫反应。
已经证明体内应用细菌DNA可导致强烈的免疫反应，尤其是通过非甲基化的CpG基序。与仅诱导轻度细胞因子反应的裸露DNA相比，其与阳离子脂质的复合物导致强大的细胞因子反应。改变阳离子脂质的施用途径没有显著改变炎性细胞因子的表达，而静脉注射或气雾递送之后PEI-DNA比阳离子脂质产生更低的肺细胞因子水平，这可能是由于其不同的内体摄取，并因此与TLR9受体相互作用。
较少探索对RNA递送的反应。DNA和RNA均通过激活Toll样受体(TLR)刺激哺乳动物固有免疫系统。在人类和小鼠中总共鉴定了十三种TLR(简单命名为TLR1至TLR13)，并且在其它哺乳动物的物种中发现了这些TLR的许多等价形式。值得注意的是，不同的TLR可以识别一些结构无关的配体。TLR介导的固有免疫系统具有蝴蝶结(bow-tie)形的结构，其中多种病原体及其分子体现为更少量的配体。不同TLR的亚细胞定位在一定程度上和它们配体的分子模式相关联。因此，TLR3、TLR7、TLR8和TLR9位于细胞内，所有这些都参与核酸样结构的识别。TLR3识别dsRNA、siRNA和mRNA，而TLR7和TLR8结合ssRNA，且通过TLR9的介导识别CpG DNA基序。
与DNA CpG的甲基化相符(通过TLR9来抑制识别)，RNA的免疫原性似乎受到相似类型修饰的控制。体外转录的RNA通过树突细胞导致强烈的TNF-α反应，如果它们没有表现出哺乳动物典型的修饰的话。有趣的是，特定的核苷酸修饰(如N6-甲基化腺苷或假尿苷)显著降低TLR3、TLR7和TLR8介导的细胞因子分泌和DC激活。因此，有可能通过将修饰NTP引入体外转录反应来消除过大的体内免疫反应。仅将25％的尿苷和胞苷替换为2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷，在人外周血单核细胞(PBMC)中协同性地降低mRNA对模式识别受体(如TLR3、TLR7、TLR8和RIG-I)的结合。正如通过细胞培养上清和小鼠血清的流式细胞术和细胞因子ELISA所证实的，这些修饰实质性地在体外和体内降低了固有免疫系统的激活，并且同时提高了mRNA的稳定性，从而允许在>80％的培养的人类和小鼠II型肺泡上皮细胞中延长的高水平的细胞蛋白表达。克服mRNA固有的免疫原性对于新型疗法而言或者在再生医学领域中被认为是至关重要的，其中新型疗法需要例如重复给药以便治疗遗传和代谢性疾病。
不同于上述内容，RNA的强烈免疫刺激作用被用于治疗性疫苗接种。尤其是树突细胞(DC)作为抗原递呈细胞(APC)被疫苗免疫原所靶向，随后是抗原特异性T细胞和B细胞的激活。一些体内和体外研究表明，采用mRNA靶向DC诱导肿瘤免疫或抗肿瘤反应。相比pDNA的转染，基于mRNA的基因转移导致更高的DC肿瘤抗原载量并具有刺激细胞毒性T淋巴细胞反应的更高潜能。除了抗肿瘤方法外，还可以利用RNA转染的DC治疗或预防感染性疾病(如AIDS、丙型肝炎或真菌感染)。另一种实现RNA疫苗接种的优越策略是通过编码抗原和RNA复制酶的双顺反子复制型RNA来表达靶向抗原，从而利用甲病毒的能力产生大量病毒mRNA。一旦细胞被转染，则合成基因组负链的复制酶复合物扩增病毒RNA，其中负链本身代表了由RNA复制酶合成许多基因组RNA正链的模板。这种方法已经用在小鼠模型中来打破对黑素瘤的耐受性并提供免疫。
本发明现在已使得将mRNA有效递送至肺细胞中的合适方式成为可能，并允许在这些细胞中有效表达mRNA编码的蛋白。
在下面的实施例和附图中更详细地解释本发明，但不限制于此。
附图说明
图1显示了相较于未治疗的小鼠(w/o)，用含有EPO mRNA和PEI 25kDa组合(表示为EPO)、或者含有化学修饰的EPO mRNA和PEI 25kDa组合(表示为EPO mod)的气雾治疗24小时后，通过ELISA测量的小鼠肺裂解物中EPO的表达结果。当相较于未治疗的小鼠，两个治疗组的EPO水平显著增加。
图2显示用含有化学修饰的MetLuc mRNA和PEI 25kDa组合(表示为Met-Luc)、或者作为对照含有化学修饰的EGFPLuc mRNA和PEI 25kDa组合(表示为EGFP-Luc)的气雾治疗24小时后，通过发光活性测量的小鼠肺裂解物中Metridia萤光素酶表达的结果。相较于用化学修饰的EGFPLuc mRNA/PEI 25kDa治疗的对照小鼠时，用化学修饰的MetLuc mRNA/PEI 25kDa治疗的小鼠组中，Metridia萤光素酶水平显著增加。
图3显示作为与PEI 25kDa的组合通过肺气雾递送时，化学修饰的Luc mRNA在小鼠肺细胞中有效地表达(图3a+b)。
图4显示对于包含帽-1的化学修饰的Luc mRNA，荧光素酶表达最高。
图5显示作为与PEI 25kDa的组合通过肺气雾递送时，化学修饰的Luc mRNA在猪肺细胞中有效地表达(图5B)，而在用雾化水治疗的对照动物的肺中没有看到Luc表达(图5A)。
图6显示注射用水(WFI)在PEI制剂中稳定化学修饰的mRNA；道：
1-在水+肝素中修饰的mRNA
2–在PBS+肝素中修饰的mRNA
3-在pH为7.4的PBS/水+肝素中brPEI 25kDa/修饰的mRNA(根据Densmore等人EP 1 173 224B1的方法)
4在-pH为7.4的PBS+肝素中brPEI 25kDa/修饰的mRNA(Ethris方法)
5-在pH为7.4的水+肝素中brPEI 25kDa/修饰的mRNA
6-在pH为6.0的水+肝素中brPEI 25kDaI/修饰的mRNA
7-在pH为5.0的水+肝素中brPEI 25kDa/修饰的mRNA。
具体实施方式
实施例
1.将与聚乙烯亚胺(PEI)配制的化学修饰的和未经修饰的编码促红细胞生成素(EPO)和Metridia荧光素酶(metLuc)的mRNA，在体内气雾应用至小鼠的肺
化学品
分枝PEI(平均MW＝25kDa)获自Sigma-Aldrich(Schnelldorf，德国)，并且无需进一步纯化即可使用。PEI稀释于双蒸水中，用HCl将pH调节至7。无内毒素的双蒸水购自Delta Pharma(Boehringer Ingelheim，德国)。
mRNA的生产
将小鼠EPO(mEPO)cDNA克隆至pVAXA120载体
通过EcoRI消化将编码mEPO的cDNA从pCR4EPO质粒(购自OpenBiosystems，目录号MMM1013-99829153)切下，并克隆至pVAXA120的相应位点。使用PmeI消化筛选克隆的插入以及使用NheI(单消化)和SmaI-XbaI(双消化)筛选克隆的方向。所有三种消化均正确的克隆用于RNA生产。
mEPO mRNA的生产
为了产生体外转录的模板，在37℃用XbaI(Fermentas)过夜消化对聚(A)尾的下游进行质粒的线性化，并用氯仿提取和乙酸钠沉淀进行纯化，如Sambrook等人所描述的(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,和Maniatis,T(1989).In MolecularCloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.，卷1、2、3)。在1％琼脂糖凝胶上确认质粒模板的完全线性化。
在30和37℃，用RiboMAX大规模RNA生产系统-T7(Promega，德国)按照制造商的规程使用抗-反向帽类似物(ARCA；P1-(5'-(3'-o-甲基)-7-甲基-鸟基)P3-(5'-(鸟基))三磷酸，钠盐，Jena Biosciences，德国)进行pVAXA120-mEPO的体外转录。对于化学修饰的mEPO mRNA(EPO mod)的体外转录，25％的胞苷-5'-三磷酸和尿苷-5'-三磷酸被取代为5-甲基胞苷-5'-三磷酸(TriLink，USA)和2-硫代尿苷-5'-三磷酸(TriLink，USA)。通过氯仿提取和PD-10柱上的尺寸排阻层析(GE Healthcare，德国)进行mRNA的纯化。通过转染支气管上皮细胞系(BEAS-2B)和人胚上皮肾细胞系(HEK 293)并通过ELISA测量mEPO的量(R&DSystems，德国)筛选所产生的mRNA的活性。可以通过比较用在30℃生产的mEPOmRNA转染的BEAS-2B与用在37度℃生产的mEPO mRNA转染的BEAS-2B，来定量显著升高的mEPO量。
将Metridia荧光素酶(MetLuc)ORF克隆至pVAXA120载体
合成编码MetLuc(Clonetech sequence)的ORF，并通过GeneArt AG(德国)克隆到pVAXA120的BamHI/EcoRI位点。获得的pVAXA120-MetLuc质粒进一步用于体外转录。
生产化学修饰的MetLuc mRNA
为了产生体外转录的模板，在37℃用XbaI(Fermentas)过夜消化对聚(A)尾的下游进行质粒的线性化，并用氯仿提取和乙酸钠沉淀进行纯化，如Sambrook等人所描述的(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,和Maniatis,T(1989).In MolecularCloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.，卷1、2、3)。在1％琼脂糖凝胶上确认质粒模板的完全线性化。
在30℃，用RiboMAX大规模RNA生产系统-T7(Promega，德国)按照制造商的规程使用抗-反向帽类似物(ARCA；P1-(5'-(3'-o-甲基)-7-甲基-鸟基)P3-(5'-(鸟基))三磷酸，钠盐，Jena Biosciences，德国)进行pVAXA120-MetLuc的体外转录。对于化学修饰的MetLuc mRNA的体外转录，25％的胞苷-5'-三磷酸和尿苷-5'-三磷酸被取代为5-甲基胞苷-5'-三磷酸(TriLink，USA)和2-硫代尿苷-5'-三磷酸(TriLink，USA)。通过氯仿提取和PD-10柱上的尺寸排阻层析(GE Healthcare，德国)进行mRNA的纯化。通过转染鼠成纤维细胞系(NIH-3T3)并使用Metridia萤光素酶报告基因实验测量MetLuc的活性，来筛选所产生的mRNA的活性。
动物
六到八周龄的雌性BALB/c小鼠获自法国Janvier,Route Des Chênes SecsBP5,F-53940Le Genest St.Isle，并在无特定病原体的条件下维持。在实验前，让小鼠适应动物机构的环境至少七天。所有的动物程序经当地伦理委员会批准和控制，并根据保护动物生命的德国法律的指南进行。
制备PEI-mRNA的聚合复合物
聚合复合物按照如下配制：mRNA和PEI稀释于4.0ml的双蒸馏水中得到浓度分别为250μg/ml的mRNA和326.3μg/ml的PEI(对应着10的N/P比)。用移液器将mRNA溶液移至PEI溶液，通过上下吹吸混合以得到125μg/ml的最终mRNA浓度。使用前在环境温度下将复合物孵育20分钟。本发明的过程中观察到只使用水而没有任何缓冲液用于复合(complexation)是特别有利的，这是因为否则纳米颗粒会聚集或在小鼠肺中失效(Rudolph等人J.Mol Ther.2005,12:493-501)。
气雾装置的设计
对于全身装置中的雾化程序，小鼠被放置在9.8×13.2×21.5cm的塑料盒中，可以用盖子密封。在盒子一个窄的侧面上，设置四个小孔作为气雾的流出。贯穿整体在对面的窄的侧面上，通过2.1cm直径的连接件将盒子连接至15.4cm宽×41.5cm长的塑料圆筒上。圆筒底部均匀铺上150克硅胶(1-3mm，#85330；Fluka，瑞士)用于干燥喷射雾化器喷射雾化器(PARIplus，PARI GmbH)产生的气雾，其中喷射雾化器连接到所述圆筒的另一端(详细描述在Rudolph等人JGene Med.2005,7:59-66中)。
测量肺匀浆中的EPO和MetLuc活性
施用二十四小时后，通过腹膜注射美托咪定(11.5μg/kg BW)、咪达唑仑(115μg/kg BW)和芬太尼(1.15μg/kg BW)麻醉小鼠，通过中线切口打开腹膜。通过中线切口打开腹膜后，从动物中解剖肺并用PBS灌注。在液氮中快速冷冻肺，并在冷冻状态下用研钵和研杵进行匀浆化。加入含25mM Tris pH7.4、0.1％TritonX-100和完全蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics GmbH,Penzberg,德国)的400μl裂解缓冲液后，将样本在冰上孵育20分钟。随后以10,000rcf对蛋白裂解物离心5分钟。通过ELISA(R&D Biosystems)测量上清中的EPO活性，和通过加入腔肠素(coelenterazine)时的发光活性测量来分析MetLuc活性，如等人Biomacromolecules 2010,11:1802-1809所描述的)。
结果：
第一个实验表明，作为与PEI 25kDa的组合经肺气雾递送时，未修饰的和化学修饰的EPO mRNA都在动物的肺细胞中有效地表达。这表明用于向肺递送的方法不依赖于mRNA的化学组成。第二个实验表明，作为与PEI 25kDa的组合经肺气雾递送时，Metridia萤光素酶有效地在动物的肺细胞中表达。这表明，用于向肺递送的方法不限制于一种编码mRNA，其并不依赖于mRNA编码的序列。总之，这表明通过根据本发明的方法和药物制剂可以正确地解决本发明的目的。
2.将与聚乙烯亚胺(PEI)配制的化学修饰的编码萤火虫荧光素酶(Luc)的mRNA，在体内气雾应用至小鼠的肺
化学品
分枝PEI(平均MW＝25kDa)获自Sigma-Aldrich(Schnelldorf，德国)，并且无需进一步纯化即可使用。PEI稀释于水中，用HCl将pH调节至7.4。无内毒素的水购自B.Braun(Melsungen，德国)。
化学修饰的Luc mRNA的生产
为了产生体外转录(IVT)的模板，通过用NotI限制性消化来进行质粒pVAXA120-Luc的线性化。进一步通过氯仿-乙醇-沉淀纯化模板。通过非变性琼脂糖凝胶电泳确定模板的质量。用含有核糖核苷三磷酸、抗-反向帽类似物(ARCA，m7,3'-OGpppG)和T7RNA聚合酶的标准IVT混合物进行IVT。使用25％的5-甲基-胞苷-5'-三磷酸和25％的2-硫代-尿苷-5'-三磷酸引入修饰。ARCA用于确保仅在所需的方向上并入帽。为了使用后-加帽(post capping)程序生成含有帽-0或帽-1结构的mRNA，无需任何帽类似物进行IVT产生含有5'末端三磷酸的mRNA。用痘苗病毒加帽酶、rGTP和作为甲基供体的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)进行加帽，以便将7-甲基尿苷酸帽-0结构(m7GpppG)加入mRNA的5’末端。为了在mRNA 5’末端邻近帽-0结构的第一个核苷酸的2'-邻位加入甲基(其中帽-0结构是通过后-加帽所获得的)，使用mRNA帽2'-邻-甲基转移酶和SAM。这种甲基化产生mRNA帽的帽-1结构(m7GpppGm)。通过醋酸铵沉淀进行mRNA纯化。修饰的Luc RNA重悬于注射用水(Aqua ad injectabilia)并且使用UV测量、非变性琼脂糖凝胶电泳并转染至NIH3T3细胞中进行质量控制。
动物
六到八周龄的雌性BALB/c小鼠获自法国Janvier,Route Des Chênes SecsBP5,F-53940Le Genest St.Isle，并在无特定病原体的条件下维持。在实验前，让小鼠适应动物机构的环境至少七天。所有的动物程序经当地伦理委员会批准和控制，并根据保护动物生命的德国法律的指南进行。
制备PEI-mRNA的聚合复合物
聚合复合物按照如下配制：mRNA和PEI稀释于4.0ml的双蒸馏水中得到浓度分别为250μg/ml的mRNA和326.3μg/ml的PEI(对应着10的N/P比)。用移液器将mRNA溶液移至PEI溶液，通过上下吹吸混合以得到125μg/ml的最终mRNA浓度。使用前在环境温度下将复合物孵育20分钟。本发明的过程中观察到只使用水而没有任何缓冲液用于复合是特别有利的，这是因为否则纳米颗粒会聚集或在小鼠肺中失效(Rudolph等人J.Mol Ther.2005,12:493-501)。
气雾装置的设计
对于全身装置的雾化程序，小鼠被放置在9.8×13.2×21.5cm的塑料盒中，可以用盖子密封。在盒子一个窄的侧面上，设置四个小孔作为气雾的流出。贯穿整体在对面的窄的侧面上，通过2.1cm直径的连接件将盒子连接至15.4cm宽×41.5cm长的塑料圆筒上。圆筒底部均匀铺上150克硅胶(1-3mm，#85330；Fluka，瑞士)用于干燥喷射雾化器(PARIplus，PARI GmbH)产生的气雾，其中喷射雾化器连接到所述圆筒的另一端(详细描述在Rudolph等人J Gene Med.2005,7:59-66中)。
利用体内生物发光成像测量小鼠肺中的Luc活性
施用二十四小时后，通过腹膜注射美托咪定(11.5μg/kg BW)、咪达唑仑(115μg/kg BW)和芬太尼(1.15μg/kg BW)麻醉小鼠。通过鼻内途径应用D-荧光素底物(每只小鼠3mg/50μl PBS)(Buckley SM,Howe SJ,Wong SP,Buning H,McIntosh J,等人(2008)Luciferin detection after intra-nasal vector delivery isimproved by intra-nasal rather than intra-peritoneal luciferin administration.Hum GeneTher)。用IVIS 100成像系统(Xenogen,Alameda,USA)10分钟后测量生物发光，以及相机设置为：视野10、f1f-光圈、高分辨率像素以及10分钟的曝光时间。使用Living Image Software 2.50版本(Xenogen,Alameda,USA)定量和分析信号。
结果：
实验表明，作为与PEI 25kDa的组合经肺气雾递送时，化学修饰的Luc mRNA在小鼠肺细胞中有效地表达(图3)。对于包含帽-1的化学修饰的Luc mRNA，荧光素酶的表达最高(图4)。总之，这表明通过根据本发明的方法和药物制剂可以正确地解决本发明的目的。
3.将与聚乙烯亚胺(PEI)配制的化学修饰的编码萤火虫荧光素酶(Luc)的mRNA，在体内气雾应用至猪的肺
化学品
参见如上实施例2。
生产化学修饰的Luc mRNA
参见如上实施例2。
实验程序
通过术前给予2mg/kg体重的阿扎哌隆、15mg/kg体重的氯胺酮、0.1mg/kg体重的阿托品使猪开始镇静，随后将静脉管插入至外侧耳静脉中。根据需要通过静脉注射3-5mg/kg体重的丙泊酚麻醉猪。根据需要，用1％丙泊酚连续静脉输注来维持麻醉。通气参数和呼气末(endexpiratory)二氧化碳匹配，必要时进行调整。使用脉搏血氧饱和度仪、二氧化碳图(capnography)、直肠温度探头和反射情况连续监测麻醉、呼吸和心血管参数。猪以10ml/kg/h接受平衡电解质溶液输注。麻醉的持续时间大约为80-120分钟。完成气雾应用之后(Aeroneb网雾化器)，镇静之后，通过向外侧耳静脉推注100mg/kg体重的戊巴比妥处死猪。切下肺，并从肺的各区域收集切成约1cm厚的组织标本切片，随后在37℃(5％二氧化碳)培养箱中，在细胞培养基质中孵育24小时。对于荧光素酶活性的测量，组织标本在37℃在含有PBS中D-萤光素底物(100μg/ml)的介质浴中孵育30分钟，并进行离体萤光素酶生物发光成像(IVIS100，Xenogen,Alameda,USA)。
PEI-mRNA聚合复合物的制备
使用双通道注射器泵(KDS-210-CE，KD Scientific)形成聚合复合物。mRNA和PEI各自在12.0ml双蒸馏水中稀释分别得到500μg/ml的mRNA和650μg/ml的PEI浓度(对应着10的N/P比)。使用注射器泵的抽拉功能以5ml/min的速度将两种溶液填充到单独的20mL注射器中。为了混合两种样本，两个注射器通过导管(Safeflow Extension Set,B.Braun)连接至t-组件。使用注射器泵的输注功能以40mL/min的速度进行混合。使用前该复合物在环境温度下孵育30分钟。本发明的过程中观察到只使用水而没有任何缓冲液用于复合是特别有利的，这是因为否则纳米颗粒会聚集或在小鼠肺中失效(Rudolph等人J.Mol Ther.2005,12:493-501)。
结果：
实验表明，作为与PEI 25kDa的组合经肺气雾递送时，化学修饰的Luc mRNA在猪的肺细胞中有效地表达(图5B)，而在用雾化水治疗的对照动物肺中没有看到Luc表达(图5A)。总之，这表明通过根据本发明的方法和药物制剂可以正确地解决本发明的目的。
4.注射用水(WFI)在PEI制剂中稳定化学修饰的mRNA
通过琼脂糖凝胶电泳检验了与PBS相比，注射用水对mRNA稳定性的作用(图6)。正如降解的mRNA产物的弥散带(smear)所示，PBS中复合有PEI的mRNA导致mRNA早在室温下孵育4h后就降解了，然而，正如较少的mRNA降解产物(图5)以及主要的mRNA产物更强的条带强度所示的，WFI中PEI/mRNA制剂被显著地得以稳定。这种效果对于大的mRNA(如CFTR mRNA)比更短的LucmRNA更明显，而且在室温下孵育24小时后变得甚至更明显。重要的是，mRNA降解随着pH的降低而降低，并且在pH＝5时达到最小。这一观察解释了在PEI制剂中使用WFI用于mRNA气雾递送最有利的性质和必要性，因为在pH值＝5时WFI通常呈酸性pH，并因此本质上在水性PEI制剂中稳定mRNA使其抵抗降解。
实验程序
mRNA-PEI聚合复合物的制备。以10mg/ml和5mg/ml在注射用水(WFI，B.Braun，Melsungen)或Dulbecco's PBS(Life technologies，Darmstadt)中制备分枝PEI 25kDa(Sigma-Aldrich，Schnelldorf)储备溶液，用HCl将pH调节至7.4、pH 6.0或pH 5.0。
25μl修饰的mRNA(1μg/μl)和3.3μl PEI储备溶液(10mg/ml)稀释于50μl WFI或D-PBS中分别产生0.5μg/μl mRNA和0.66μg/μl PEI的浓度(对应于10的N/P比)。根据专利(EP 1173224B1)，25μl修饰的mRNA(1μg/μl)和D-PBS中6.6μl PEI储备溶液(5mg/ml)稀释于50μl的WFI。缓慢地涡旋混合PEI溶液，将DNA溶液加入其中使最终体积为100μl。使用前，允许混合物在室温下静置20分钟。
对于使用非变性琼脂糖凝胶电泳的释放实验，1μl聚合复合物溶液加入到4μl肝素溶液(WFI中40mg/ml)。在室温下将混合物孵育10分钟。孵育后，加入5μl的2×RNA上样染料(Thermo Fisher)，在70℃将样本孵育10分钟。随后，将样本在冰上放置2分钟，然后上样到1％琼脂糖凝胶上。将凝胶在180V运行1-1.5小时，并使用Intas Gel Documentation系统观察。

Claims (25)

1.用于在肺中表达mRNA的方法，其中
-将待表达的mRNA与聚乙烯亚胺(PEI)组合来提供包含mRNA和PEI的组合物；
-将包含mRNA和PEI的组合物施用至肺，在肺中所述组合物进入肺细胞；以及
-在肺细胞中表达mRNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肺是人类患者的肺，优选患有肺缺陷的人类患者，肺缺陷尤其选自：表面活性剂蛋白B(SPB)缺乏症、ATP结合盒亚家族A成员3(ABCA3)缺乏症、囊性纤维化、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、肺癌、表面活性剂蛋白C(SPC)缺乏症、肺泡蛋白沉积症、结节病、急性和慢性支气管炎、肺气肿、McLeod-综合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管哮喘、支气管扩张、肺尘埃沉着病、石棉沉着病、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、婴儿呼吸窘迫综合征(IRDS)、肺水肿、肺嗜酸粒细胞增多、洛夫勒肺炎、Hamman-Rich综合征、特发性肺纤维化、间质性肺病、原发性纤毛运动障碍、肺动脉高压(PAH)和STAT5b缺乏症、凝血缺陷，尤其是血友病A和B；补体缺陷，尤其是蛋白C缺乏症、血栓性血小板减少性紫癜和先天性血色素沉着症，尤其是铁调素缺乏症；肺感染性疾病，优选呼吸道合胞病毒(RSV)感染、副流感病毒(PIV)感染、流感病毒感染、鼻病毒感染和严重急性呼吸综合征(冠状病毒(SARS-CoV)感染、结核病、绿脓杆菌感染、洋葱伯克霍尔德氏菌感染、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染、以及流感嗜血杆菌感染。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PEI具有1kDa至1000kDa的分子量，优选具有10kDa至50kDa的分子量，尤其是具有20至30kDa的分子量。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述PEI包含靶向配体，优选IP1受体配体，更优选前列腺环素类似物，尤其是伊洛前列素5-{(E)-(1S,5S,6R,7R)-7-羟基-6-[(E)-(3S,4RS)-3-羟基-4-甲基-1-辛烯-6-炔基]-双环[3.3.0]辛烷-3-亚基)戊酸)或曲前列尼尔((1R,2R,3aS,9aS)-[[2,3,3a,4,9,9a-六氢-2-羟基-1-[(3S)-3-羟基辛烷基]-1H-苯并[f]茚-5-基]氧基]乙酸)；或β2-肾上腺素受体配体，尤其是克仑特罗、乳铁蛋白、糖醛酸或凝集素。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述mRNA编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)、表面活性剂蛋白B(SPB)、ATP结合盒亚家族A成员3(ABCA3)或α-1抗胰蛋白酶(A1AT)、表面活性剂蛋白C(SPC)、促红细胞生成素、因子VIII、因子IX、van Willebrand因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、ADAMTS 13、铁调素、血管紧张素转换酶II或者病毒和细菌病原体的抗原。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述包含mRNA和PEI的组合物气管内施用至肺，优选作为气雾，尤其是通过高压喷射。
7.包含mRNA和PEI的药物组合物，其用于在肺中表达mRNA的方法。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其用于治疗肺缺陷，肺缺陷尤其选自：表面活性剂蛋白B(SPB)缺乏症、ATP结合盒亚家族A成员3(ABCA3)缺乏症、囊性纤维化、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、肺癌、表面活性剂蛋白C(SPC)缺乏症、肺泡蛋白沉积症、结节病、急性和慢性支气管炎、肺气肿、McLeod-综合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管哮喘、支气管扩张、肺尘埃沉着病、石棉沉着病、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、婴儿呼吸窘迫综合征(IRDS)、肺水肿、肺嗜酸粒细胞增多、洛夫勒肺炎、Hamman-Rich综合征、特发性肺纤维化、间质性肺病、原发性纤毛运动障碍、肺动脉高压(PAH)和STAT5b缺乏症、凝血缺陷，尤其是血友病A和B；补体缺陷，尤其是蛋白C缺乏症、血栓性血小板减少性紫癜和先天性血色素沉着症，尤其是铁调素缺乏症；肺感染性疾病，优选呼吸道合胞病毒(RSV)感染、副流感病毒(PIV)感染、流感病毒感染、鼻病毒感染和严重急性呼吸综合征(冠状病毒(SARS-CoV)感染、结核病、绿脓杆菌感染、洋葱伯克霍尔德氏菌感染、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染、以及流感嗜血杆菌感染。
9.根据权利要求7或8所述的药物组合物，其中所述PEI具有1kDa至1000kDa的分子量，优选具有10kDa至50kDa的分子量，尤其是具有20至30kDa的分子量。
10.根据权利要求7至9任一项所述的药物组合物，其中所述PEI包含靶向配体，优选IP1受体配体，更优选前列腺环素类似物，尤其是伊洛前列素5-{(E)-(1S,5S,6R,7R)-7-羟基-6-[(E)-(3S,4RS)-3-羟基-4-甲基-1-辛烯-6-炔基]-双环[3.3.0]辛烷-3-亚基)戊酸)或曲前列尼尔((1R,2R,3aS,9aS)-[[2,3,3a,4,9,9a-六氢-2-羟基-1-[(3S)-3-羟基辛烷基]-1H-苯并[f]茚-5-基]氧基]乙酸)；或β2-肾上腺素受体配体，尤其是克仑特罗、乳铁蛋白、糖醛酸或凝集素。
11.根据权利要求7至10任一项所述的药物组合物，其中所述mRNA编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)、表面活性剂蛋白B(SPB)、ATP结合盒亚家族A成员3(ABCA3)或α-1抗胰蛋白酶(A1AT)、表面活性剂蛋白C(SPC)、促红细胞生成素、因子VIII、因子IX、van Willebrand因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、ADAMTS 13、铁调素、血管紧张素转换酶II或者病毒和细菌病原体的抗原。
12.根据权利要求7至11任一项所述的药物组合物，还包含至少一种碳氟化合物。
13.根据权利要求7至12任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是气雾。
14.根据权利要求13所述的药物制剂，其中所述气雾包含磁颗粒，尤其是具有至少5nm并且至多800nm直径的磁颗粒。
15.根据权利要求14所述的药物制剂，其中磁颗粒具有至少50nm并且至多750nm的直径，优选具有至少100nm并且至多700nm的直径，更优选具有至少150nm并且至多600nm的直径，更优选具有至少200nm并且至多500nm的直径，特别优选具有至少250nm并且至多450nm的直径，最优选具有至少300nm并且至多400nm的直径。
16.根据权利要求7至15任一项所述的药物组合物，其中所述PEI偶联至磁颗粒。
17.根据权利要求14至16任一项所述的药物组合物，其中所述磁颗粒由金属和/或其氧化物和/或其氢氧化物组成，或者包含金属和/或其氧化物和/或其氢氧化物。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述金属选自铁、钴或镍；以及氧化物或氢氧化物选自Fe3O4、γ-Fe2O3、二或三价铁离子与Co2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Cr3+、Gd3+、Dy3+或Sm3+的双氧化物或氢氧化物、及其任意混合物。
19.根据权利要求14至18任一项所述的药物组合物，其中通过磁场将包含磁颗粒的气雾沉积在待治疗的呼吸道和/或肺的区域表面。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述磁场具有至少100mT(毫特斯拉)，至少200mT，至少500mT或至少1T(特斯拉)的场强。
21.根据权利要求19或20所述的药物组合物，其中所述磁场具有大于1T/m或大于10T/m的磁场梯度。
22.根据权利要求19至21任一项所述的药物组合物，其中所述磁场是脉冲、振荡或脉冲-振荡磁场。
23.根据权利要求19至22任一项所述的药物组合物，其中所述磁场与患者的呼吸动态匹配，并且仅在呼气和吸气的、吸气和呼气之间的静息停顿期间激活。
24.根据权利要求7至23任一项所述的药物组合物，其中所述组合物具有6.5以下的pH，优选具有3至6的pH，尤其是具有4至5.5的pH。
25.根据权利要求7至24任一项所述的药物组合物，其中所述组合物具有10000μS/cm或更低的25℃电导，优选具有1000μS/cm或更低的25℃电导，尤其是具有100μS/cm或更低的25℃电导。
CN201380027591.5A 2012-06-08 2013-06-07 信使rna的肺递送 Active CN104349794B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261657344P 2012-06-08 2012-06-08
US61/657,344 2012-06-08
PCT/EP2013/061811 WO2013182683A1 (en) 2012-06-08 2013-06-07 Pulmonary delivery of messenger rna

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104349794A true CN104349794A (zh) 2015-02-11
CN104349794B CN104349794B (zh) 2019-01-04

Family

ID=48782278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380027591.5A Active CN104349794B (zh) 2012-06-08 2013-06-07 信使rna的肺递送

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20150126589A1 (zh)
EP (2) EP3800254A1 (zh)
JP (1) JP6208750B2 (zh)
KR (2) KR102087643B1 (zh)
CN (1) CN104349794B (zh)
AU (1) AU2013273504B2 (zh)
BR (1) BR112014029807A2 (zh)
CA (1) CA2873274C (zh)
DK (1) DK2858677T3 (zh)
EA (1) EA037448B1 (zh)
ES (1) ES2826203T3 (zh)
HK (1) HK1209340A1 (zh)
IN (1) IN2014DN09744A (zh)
WO (1) WO2013182683A1 (zh)
ZA (1) ZA201408184B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107849565A (zh) * 2015-06-30 2018-03-27 埃泽瑞斯公司 Atp结合盒家族的编码多核糖核苷酸及其制剂
CN108603876A (zh) * 2015-12-30 2018-09-28 维森盖特有限公司 用于自动检测和监测发育异常和施用化学预防的系统和方法
CN113423418A (zh) * 2019-02-14 2021-09-21 埃泽瑞斯公司 纤毛疾病的治疗

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3338765T (pt) 2009-12-01 2019-03-18 Translate Bio Inc Derivado de esteróide adequado para a administração de arnm em doenças genéticas humanas
EP2338520A1 (de) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
HRP20220796T1 (hr) 2010-10-01 2022-10-14 ModernaTX, Inc. Ribonukleinske kiseline koje sadrže n1-metil-pseudouracil i njihove uporabe
WO2012116715A1 (en) † 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in newborns and infants
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
AU2012267531B2 (en) 2011-06-08 2017-06-22 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods for mRNA delivery
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3492109B1 (en) 2011-10-03 2020-03-04 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
RS63244B1 (sr) 2011-12-16 2022-06-30 Modernatx Inc Kompozicije modifikovane mrna
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2013151664A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins
EP3536787A1 (en) 2012-06-08 2019-09-11 Translate Bio, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
HUE042640T2 (hu) 2013-03-14 2019-07-29 Translate Bio Inc CFTR-mRNS-készítmények, valamint kapcsolódó eljárások és alkalmazások
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
SG11201602503TA (en) 2013-10-03 2016-04-28 Moderna Therapeutics Inc Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
EP3060258A1 (en) 2013-10-22 2016-08-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for phenylketonuria
ES2707966T3 (es) 2013-10-22 2019-04-08 Translate Bio Inc Terapia de ARNm para la deficiencia en síntesis de argininosuccinato
PL3116900T3 (pl) 2014-03-09 2021-03-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Kompozycje użyteczne w leczeniu niedoboru transkarbamylazy ornitynowej (otc)
KR20220158867A (ko) * 2014-04-25 2022-12-01 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 메신저 rna 의 정제 방법
US9943595B2 (en) 2014-12-05 2018-04-17 Translate Bio, Inc. Messenger RNA therapy for treatment of articular disease
JP6929791B2 (ja) 2015-02-09 2021-09-01 デューク ユニバーシティ エピゲノム編集のための組成物および方法
EP3288594B1 (en) 2015-04-27 2022-06-29 The Trustees of The University of Pennsylvania Dual aav vector system for crispr/cas9 mediated correction of human disease
CN107849574B (zh) 2015-06-30 2021-11-05 埃泽瑞斯公司 增加rna分子的翻译效率的utr
EP3325018A4 (en) 2015-07-22 2019-04-24 Duke University HIGH EFFICIENCY SCREENING OF REGULATORY ELEMENT FUNCTION USING EPIGENOUS EDITING TECHNOLOGIES
EP3341727B1 (en) 2015-08-25 2022-08-10 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases
WO2017066497A2 (en) 2015-10-13 2017-04-20 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
EP4349405A3 (en) 2015-10-22 2024-06-19 ModernaTX, Inc. Respiratory virus vaccines
WO2017201347A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
DK3463483T3 (da) * 2016-05-27 2024-03-04 Transcriptx Inc Behandling af primær ciliedyskinesi med syntetisk messenger-RNA
US10927383B2 (en) 2016-06-30 2021-02-23 Ethris Gmbh Cas9 mRNAs
WO2018010815A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Formulation for administration of rna
AU2017368050A1 (en) 2016-11-29 2019-06-20 Puretech Lyt, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
US11103578B2 (en) 2016-12-08 2021-08-31 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
US11104887B2 (en) 2017-01-03 2021-08-31 Ethris Gmbh Ornithine transcarbamylase coding polyribonucleotides and formulations thereof
EP3585417B1 (en) 2017-02-27 2023-02-22 Translate Bio, Inc. Method of making a codon-optimized cftr mrna
LT3589730T (lt) 2017-02-28 2024-03-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenoasocijuoto viruso (aav) monofiletinės grupės f vektorius, ir jo panaudojimo būdai
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
KR20230093072A (ko) 2017-03-01 2023-06-26 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 안구 장애에 대한 유전자 치료
WO2018200542A1 (en) 2017-04-24 2018-11-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for ocular disorders
AU2018265531B2 (en) 2017-05-11 2024-07-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
WO2018213476A1 (en) 2017-05-16 2018-11-22 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr
WO2018218359A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating peroxisomal disorders
BR112020010977A2 (pt) 2017-11-30 2020-11-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania terapia de gene para mucopolissacaridose iiib
JP7389744B2 (ja) 2017-11-30 2023-11-30 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア ムコ多糖症ｉｉｉａ型のための遺伝子療法
US20210137846A1 (en) 2018-04-25 2021-05-13 Ethris Gmbh Cryoprotective agents for particulate formulations
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
US11065260B1 (en) * 2020-04-13 2021-07-20 Alan C Nelson Method of treatment for reducing pulmonary inflammation in a patient with pathogen infection using oral prostacyclin analog drugs
CA3177407A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 James M. Wilson Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
JP2023531451A (ja) 2020-06-17 2023-07-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 遺伝子療法患者の治療のための組成物及び方法
MX2023000658A (es) 2020-07-13 2023-02-23 Univ Pennsylvania Composiciones utiles para el tratamiento de la enfermedad de charcot-marie-tooth.
EP4196139A2 (en) * 2020-08-12 2023-06-21 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria-based vaccines, therapeutics, and rna delivery platforms
JP2023544803A (ja) 2020-10-07 2023-10-25 レジェンクスバイオ インコーポレーテッド Ｃｌｎ２疾患の眼症状に対する遺伝子療法
KR20230118075A (ko) 2020-10-09 2023-08-10 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 파브리병 치료를 위한 조성물 및 방법
JP2023551911A (ja) 2020-12-01 2023-12-13 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アンジェルマン症候群の治療のための組成物及びその使用
TW202237850A (zh) 2020-12-01 2022-10-01 賓州大學委員會 具有組織特異性靶向基序的新穎構成物及含有其之組成物
AU2022214429A1 (en) 2021-02-01 2023-09-14 Regenxbio Inc. Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
WO2022221276A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful for treating spinal and bulbar muscular atrophy (sbma)
US20240207452A1 (en) 2021-04-23 2024-06-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel compositions with brain-specific targeting motifs and compositions containing same
WO2023087019A2 (en) 2021-11-15 2023-05-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
WO2023102517A1 (en) 2021-12-02 2023-06-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of fabry disease
AR128239A1 (es) 2022-01-10 2024-04-10 Univ Pennsylvania Composiciones y métodos útiles para el tratamiento de trastornos mediados por c9orf72
WO2023183300A1 (en) * 2022-03-22 2023-09-28 The Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for prevention and treatment of genetic disease
WO2023250511A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression
WO2024121160A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Ethris Gmbh Regulator(s) of energy homeostasis-encoding rna molecule(s) with increased translation efficiency
WO2024130070A2 (en) 2022-12-17 2024-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav capsids with cardiac- and skeletal muscle- specific targeting motifs and uses thereof
WO2024130067A2 (en) 2022-12-17 2024-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav mutant vectors with cardiac and skeletal muscle-specific targeting motifs and compositions containing same

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002000870A2 (en) * 2000-06-26 2002-01-03 Christian Plank Method for transfecting cells using a magnetic field
CN1744886A (zh) * 2003-01-31 2006-03-08 诺瓦提斯公司 使用pei/单链寡核糖核苷酸复合物下调靶基因
CN101180400A (zh) * 2004-05-24 2008-05-14 Mida科技有限公司 含有rna配体的纳米颗粒
EP2338520A1 (de) * 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5756353A (en) * 1991-12-17 1998-05-26 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol-and liposome-based delivery
FR2722506B1 (fr) * 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
WO1999064094A1 (en) * 1998-06-12 1999-12-16 Aradigm Corporation Methods of delivering aerosolized polynucleotides to the respiratory tract
CN1354678A (zh) * 1999-04-02 2002-06-19 研究发展基金会 用于气溶胶传递的聚乙烯亚胺:dna制剂
US20020086842A1 (en) * 2000-06-26 2002-07-04 Christian Plank Method for transfecting cells using a magnetic field
WO2004033620A2 (en) * 2001-11-02 2004-04-22 Insert Therapeutics, Inc. Methods and compositions for therapeutic use of rna interference
GB0313259D0 (en) * 2003-06-09 2003-07-16 Consejo Superior Investigacion Magnetic nanoparticles
MXPA05013983A (es) * 2003-06-30 2006-03-02 Canji Inc Encapsulacion polimerica de adenovirus.
GB0508110D0 (en) * 2005-04-22 2005-06-01 Univ Keele Gene delivery
LT2578685T (lt) 2005-08-23 2019-06-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rnr, apimančios modifikuotus nukleozidus ir jų panaudojimo būdai
DE102005042768A1 (de) * 2005-09-08 2007-03-15 Ludwig-Maximilian-Universität Magnetfeld-gesteuerter Wirkstofftransfer für die Aerosoltherapie
WO2009127230A1 (en) * 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
WO2010037408A1 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
JPWO2010110314A1 (ja) * 2009-03-27 2012-10-04 協和発酵キリン株式会社 核酸を含有する肺高血圧症治療剤
WO2011113065A2 (en) * 2010-03-12 2011-09-15 Intezyne Technologies, Incorporated Pegylated polyplexes for polynucleotide delivery

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002000870A2 (en) * 2000-06-26 2002-01-03 Christian Plank Method for transfecting cells using a magnetic field
CN1744886A (zh) * 2003-01-31 2006-03-08 诺瓦提斯公司 使用pei/单链寡核糖核苷酸复合物下调靶基因
CN101180400A (zh) * 2004-05-24 2008-05-14 Mida科技有限公司 含有rna配体的纳米颗粒
EP2338520A1 (de) * 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107849565A (zh) * 2015-06-30 2018-03-27 埃泽瑞斯公司 Atp结合盒家族的编码多核糖核苷酸及其制剂
US11479768B2 (en) 2015-06-30 2022-10-25 Ethris Gmbh ATP-binding cassette family coding polyribonucleotides and formulations thereof
CN108603876A (zh) * 2015-12-30 2018-09-28 维森盖特有限公司 用于自动检测和监测发育异常和施用化学预防的系统和方法
CN113423418A (zh) * 2019-02-14 2021-09-21 埃泽瑞斯公司 纤毛疾病的治疗

Also Published As

Publication number Publication date
US20150126589A1 (en) 2015-05-07
CA2873274A1 (en) 2013-12-12
ES2826203T3 (es) 2021-05-17
HK1209340A1 (zh) 2016-04-01
EA201401337A1 (ru) 2015-05-29
WO2013182683A1 (en) 2013-12-12
IN2014DN09744A (zh) 2015-07-31
DK2858677T3 (da) 2020-08-31
KR20190045403A (ko) 2019-05-02
AU2013273504A1 (en) 2014-11-27
EP3800254A1 (en) 2021-04-07
JP2015518874A (ja) 2015-07-06
CA2873274C (en) 2021-06-01
EP2858677B1 (en) 2020-08-05
EA037448B1 (ru) 2021-03-30
AU2013273504B2 (en) 2017-12-07
BR112014029807A2 (pt) 2017-06-27
JP6208750B2 (ja) 2017-10-04
CN104349794B (zh) 2019-01-04
EP2858677A1 (en) 2015-04-15
ZA201408184B (en) 2015-10-28
KR20150020288A (ko) 2015-02-25
KR102087643B1 (ko) 2020-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104349794A (zh) 信使rna的肺递送
US20210095272A1 (en) Rna with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
US20230157955A1 (en) Vesicle compositions for oral delivery
CA3194553A1 (en) Proteolipid vesicles formulated with fusion associated small transmembrane proteins
TW202342064A (zh) 編碼抗融合多肽之環狀多核糖核苷酸
Kwak et al. Advanced approaches to overcome biological barriers in respiratory and systemic routes of administration for enhanced nucleic acid delivery to the lung
WO2024207543A1 (zh) 增加共转染mRNA的蛋白表达水平和表达时长的重组基因及其应用
Langel Additional Gene Therapeutic Platforms
Kwok The challenges and current advances in delivering RNAi as therapeutics
Hou Lipid Nanoparticle-Messenger RNA Formulations against Infections
TW202417632A (zh) 新穎指環病毒科(anelloviridae)載體組合物及方法
KR20220092764A (ko) 세포 번역이 가능한 구조를 갖는 rna 발현카세트를 유효성분으로 하는 복합입자 및 이의 용도
CN117460537A (zh) 核酸递送
JPWO2004075924A1 (ja) 遺伝子導入促進剤及びそれを含む遺伝子導入用組成物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant