CN107849574B

CN107849574B - 增加rna分子的翻译效率的utr

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Publication number: CN107849574B
Application number: CN201680042823.8A
Authority: CN
Inventors: C·鲁道夫; M·K·阿内嘉; M·菲瑞姿; J·盖革
Original assignee: Ethris GmbH
Current assignee: Ethris GmbH
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2036-06-30
Also published as: CA2990881A1; ES2732774T3; EP3112469A1; AU2016287436A1; DK3317415T3; EP3317415B1; AU2016287436B2; CN107849574A; KR102581977B1; EP3112469B1; US20190194669A1; CA2990881C; JP2018519830A; JP6752234B6; JP6752234B2; EP3317415A1; KR20180035789A; DK3112469T3; US11136585B2; WO2017001554A1

Abstract

描述了一种RNA分子，其包含(a)编码多肽的编码区；和(b)所述编码区上游的一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：1所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：1相比显示1至4个取代，并且其导致具有与包含UTR——包含SEQ ID NO：1——的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子；和/或(c)所述编码区下游的一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包含UTR——包含SEQ ID NO：2——的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子；其中由所述编码区编码的所述多肽不是细胞色素b‑245α多肽(CYBA)。而且，描述了编码根据本发明的RNA分子的核酸分子。此外，描述了包含根据本发明的核酸分子的载体和包含根据本发明的载体的宿主细胞。此外，描述了包含根据本发明的RNA分子和任选的药学上可接受的载体的药物组合物。而且，描述了包含根据本发明的RNA分子的试剂盒。最后，描述了如(b)中所定义的一个或多个UTR和/或如(c)中所定义的一个或多个UTR用于增加将RNA分子的编码区翻译成由所述编码区编码的多肽或蛋白质的效率的用途。

Description

增加RNA分子的翻译效率的UTR

本发明涉及RNA分子，其包含(a)编码多肽的编码区；和(b)所述编码区上游的一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：1所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：1相比显示1至4个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子相同或更高翻译效率的RNA分子；和/或(c)所述编码区下游的一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子相同或更高翻译效率的RNA分子；其中由所述编码区编码的所述多肽不是细胞色素b-245α多肽(CYBA)。而且，本发明涉及编码根据本发明的RNA分子的核酸分子。此外，本发明涉及包含根据本发明的核酸分子的载体和包含根据本发明的载体的宿主细胞。此外，本发明涉及包含根据本发明的RNA分子和任选的药学上可接受的载体的药物组合物。而且，本发明涉及包含根据本发明的RNA分子的试剂盒。最后，本发明涉及如(b)中所定义的一个或多个UTR和/或如(c)中所定义的一个或多个UTR用于增加将RNA分子的编码区翻译成由所述编码区编码的多肽或蛋白质的效率的用途。

近年来，信使RNA(mRNA)作为新的药物实体越来越相关。与基于DNA的基因治疗相反，mRNA不需要被转运到细胞核中，而是在细胞质中直接翻译成蛋白质(1,2)。这使得mRNA在避免潜在的插入诱变——DNA基因药物不太可能但存在的风险——方面更安全。因此，mRNA疗法正成为各种医学适应症中基因和蛋白替代治疗的有希望的替代方案(1-4)。然而，不得不克服常规mRNA的强免疫原性以及有限的稳定性以进一步建立其临床适用性。就此而言，mRNA稳定性，特别是mRNA的翻译速率，对于设想的医学应用而言是必要的参数，因为它决定了例如mRNA药物的剂量给药和给药间隔。

已经证实几种策略在增加稳定性和减少由施用于细胞或生物体的mRNA触发的免疫原性应答方面都是成功的。其中包括化学修饰的核苷酸(5)。Kormann等已经显示用2-硫代尿苷(thiouridine)和5-甲基胞苷仅替换25％的尿苷和胞苷残基足以增加mRNA的稳定性以及减少由体外外部施用的mRNA触发的先天免疫的激活(WO2012/0195936A1；WO2007024708A2)。

此外，已经报道mRNA中的非翻译区(UTR)在调节mRNA稳定性和mRNA翻译中起关键作用。已知UTR通过它们与RNA结合蛋白的相互作用而影响翻译起始、延伸和终止，以及mRNA稳定和细胞内定位(6,7)。根据UTR内的具体动机，它可以增强或减少mRNA的转换(翻转，turnover)(8-11)。最近，已经公布了关于mRNA半衰期的数据和相应的UTR序列(12,43)。

因此，尽管在现有技术中已经描述了用于增加mRNA稳定性、减少施用于细胞或生物体的mRNA触发的免疫原性应答、和增加翻译效率的手段和方法，仍然需要改进，特别是关于增加翻译效率的另外的或替代的手段——由于翻译效率是用于设想的医学应用的基本参数，因为它决定例如mRNA药物的剂量给药和给药间隔并且最终决定最终产品即编码的肽或蛋白质的生物利用度。

本申请通过提供如权利要求中限定的实施方式来解决该需要。

特别地，本申请令人惊讶地发现，当与给定(外来)mRNA融合时，特定的UTR赋予增加的翻译效率。UTR衍生自人细胞色素b-245α多肽(CYBA)基因的mRNA。CYBA基因包含特异性的5’和3’UTR。一般来说，已知5’UTR动机(motive)如上游开放阅读框(uORF)或内部核糖体进入位点(IRES)参与基因调控，特别是在翻译起始中(13)。3’UTR可以包含比5’UTR甚至更多的调控功能，其中一些甚至阻碍mRNA翻译(14)。

本发明的发现更令人惊讶，因为在现有技术中没有描述CYBA 5’UTR单元的调节动机。虽然已知CYBA的3’UTR含有两种调节动机，但是本发明的发现——在与给定mRNA融合时CYBA UTR赋予增加的翻译效率——仍然是令人惊讶的，因为这两种动机在mRNA的稳定性的背景中而不是在翻译效率的增加中被描述。更具体地，已知CYBA的3’UTR包含多腺苷酸化信号(PAS)，其已知与细胞质聚腺苷酸化元件结合蛋白(CPEB)以及与分裂和聚腺苷酸化信号因子(CPSF)相互作用(11)。已知CPEB负责细胞质中聚腺苷酸尾的延长，而CPSF通过在特定位点处分裂用于即将加入的聚腺苷酸而引发前mRNA(11,14)。包含在CYBA 3’UTR中的第二调控基序是胰岛素3’UTR稳定性元件(INS_SCE)(15)。已显示INS_SCE序列在还原条件下与多嘧啶片结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein)(PTB)结合，增加了胰岛素的mRNA半衰期(15)。因此，CYBA的3’UTR的两种调控动机均主要与mRNA稳定性有关。

显示存在于人CYBA基因的编码链上的人CYBA基因的5’-和3’UTR的核苷酸序列的DNA序列示于下表1中。

表1：人CYBA基因UTR的遗传密码

表1显示了人CYBA基因UTR的确切遗传密码。从5’到3’端显示DNA序列。3’UTR的多腺苷酸化信号(PAS)用粗体字表示，胰岛素3’UTR稳定性元件(INS_SCE)用下划线表示。5’UTR由71个碱基对组成，而3’UTR含有70个碱基对。两种UTR都比平均的人UTR短，其在5’UTR的情况下由约200个核苷酸组成，在3’UTR的情况下由约1000个核苷酸组成。

在上面的表1中，显示人CYBA基因5’-和3’UTR的DNA序列分别显示为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

鉴于本发明主要涉及RNA分子的事实，在下文中对相应的RNA序列进行参考。源于上述DNA序列SEQ ID NO：5对应于RNA水平上的以下UTR序列：

5’-CGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUGUCGCC-3‘(SEQ ID NO:1)。

该5’UTR序列紧接在人类CYBA基因的起始密码子之前。

源于上述DNA序列SEQ ID NO：6对应于RNA水平上的以下UTR序列：

5’-CCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCCGCCAGGUGCACCC

CCUGCAAUAAAUGCAGCGAAGCCGGGA-3‘(SEQ ID NO:2))。

影响mRNA翻译效率的另一个重要特征是位于3’末端上的聚腺苷酸尾。已经显示，聚腺苷酸尾延长至120个核苷酸对蛋白质表达具有有益的作用，可能是因为较长的聚腺苷酸尾对抗mRNA降解的保护作用(16)。与长聚腺苷酸尾相反，聚腺苷酸尾短于50个核苷酸的mRNA据说根本不被翻译(11,17)。因此，在mRNA疗法中，重组mRNA构建物有利地配备有120个核苷酸或更多的聚腺苷酸尾。真核细胞中大多数mRNA转录物的降解开始于3’至5’核酸外切脱腺苷化，导致去除大部分聚腺苷酸尾。随后，已知负责mRNA体其余部分的降解的两条主要途径发挥作用。一方面，5’末端被Dcp1/Dcp2复合物去帽，随后是被Xrn1p催化的5’-3’核酸外切降解。另一方面，外来体使得能够3’-5’核糖核酸外切降解，保留5’帽(18)。此外，已知5’帽与3’聚腺苷酸尾的相互作用导致mRNA的环状形式。假设mRNA的环形状在翻译第一个终止密码子后增加核糖体的起始速率并且也保护mRNA免于降解(19)。

本申请尤其令人惊讶地发现，由于将其编码序列结合缩短的CYBA 5’-和3’-UTR位于两侧，可将天然CYBA mRNA的翻译效率的增加赋予外源mRNA。在这方面值得注意的是，分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的本发明的5’UTR和3’UTR比显示人CYBA基因5’-和3’UTR的上述DNA序列——分别显示为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6——短。

这已经通过mRNA转染延时电影的单细胞分析来完成，最近已经显示该电影能够评估个体表达时程(26)，而据报道可能使用常规微图案在附着部位的规则网格上定位细胞(27)。

因此，本申请已经证明，该技术提供了快速筛选和比较外源mRNA上的不同UTR组合的解决方案(resolution)。为了解决这，已经选择了去稳定增强的绿色荧光蛋白(d2EGFP)的编码序列来人为地缩短细胞内报道蛋白的生命周期(28)。所述组合包括分别在5’或3’末端，在5’末端和3’末端，在5’末端插入各自的CYBA UTR，与在3’末端的3’UTR的两个重复，或者没有5’UTR的3’UTR的两个重复组合。所有这些都与没有UTR的对照构建物进行比较。评估来自每个比较的转录物的蛋白质和功能性mRNA寿命以及表达速率。将mRNA转染后基因表达动力学的单细胞分析与基于群体的方法(流式细胞术、荧光显微镜成像和萤光素酶活性的生物发光测量)进行比较。令人惊讶地表明，与对照相比，所有UTR组合的三天时间内的总蛋白质表达得到改善。

该发现导致提供如权利要求中所表征的实施方式。因此，本发明涉及RNA分子，包含：

(a)编码多肽的编码区；和

(b)所述编码区上游的一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：1所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：1相比显示1至4个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子；和/或

(c)所述编码区下游的一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子；

其中由所述编码区编码的所述多肽不是细胞色素b-245α多肽(CYBA)。

根据本发明使用的核糖核酸(RNA)分子涉及被组装为称为G、A、U和C的核苷酸的链的聚合物分子。RNA中的每个核苷酸含有核糖，碳编号1’到5’。含氮碱基连接到1’位，通常，腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U)。在聚合物RNA分子中，磷酸基连接到一个核糖的3’位和下一个核糖的5’位。因此，聚合物RNA分子中的核苷酸彼此共价连接，其中来自一个核苷酸的磷酸基与随后核苷酸上的3’碳结合，从而形成磷酸二酯键。因此，RNA链具有5’末端和3’末端，针对核糖环上的碳命名。按照惯例，上游和下游涉及RNA转录发生的5’至3’方向。优选地，RNA分子是信使RNA(mRNA)分子。mRNA是RNA分子的一个大家族，它将来自DNA的遗传信息传递给核糖体，在那里它们指定基因表达的蛋白质产物的氨基酸序列。在通过RNA聚合酶转录初级转录物mRNA(称为前mRNA)之后，加工后的成熟mRNA被翻译成氨基酸的聚合物：蛋白质，如在分子生物学的中心法则中所概述的。如在DNA中，mRNA遗传信息在核苷酸序列中，其被排列成各自由三个碱基组成的密码子。每个密码子编码一个特定的氨基酸，除了终止蛋白质合成的终止密码子。

如下文将更详细概述的，本发明的核糖核酸(RNA)分子包含两个或甚至三个主要模块，即(a)编码多肽的编码区，(b)所述编码区上游的一个或多个UTR，和/或(c)所述编码区下游的一个或多个UTR，其与模块(b)的UTR(一个或多个)不同。因此，本发明的RNA分子就其结构而言类似于天然存在的“正常”mRNA分子，其包含编码区以及(5’和3’)非翻译区(UTR)以及，任选地，聚腺苷酸尾。

根据本发明使用的术语“编码区”涉及由密码子组成的聚合物RNA分子，所述密码子根据由“遗传密码”提供的信息被核糖体解码并翻译成蛋白质。编码区通常以起始密码子开始并以终止密码子结束。通常，起始密码子是AUG三联体，终止密码子是UAA、UAG或UGA。除了编码蛋白质，编码区的部分可以作为外显子剪接增强子或外显子剪接沉默子充当在前mRNA中的调节序列。编码根据本发明使用的多肽或蛋白质的基因的编码区也称为编码序列或CDS(来自编码DNA序列)，并且是基因的DNA或RNA部分，由编码多肽或蛋白质的外显子组成。如上所述，该区域的边界是起始密码子更接近5’末端，终止密码子更靠近3’末端。mRNA中的编码区的侧面是5’非翻译区(5’UTR)和3’非翻译区(3’UTR)，它们也是外显子的部分。编码区或CDS是mRNA转录物的那部分，即编码根据本发明使用的多肽的编码区的部分，其被核糖体翻译成多肽或蛋白质。

根据本发明使用的术语“非翻译区”或“UTR”涉及起始密码子上游和终止密码子下游的mRNA部分，其不被翻译，因此分别被称为5’非翻译区(5'UTR)和3’非翻译区(3’UTR)。这些区域用编码区转录，因此在成熟mRNA中存在时是外显子的。

如本发明所用，3’非翻译区(3’-UTR)涉及紧跟翻译终止密码子的信使RNA(mRNA)部分。mRNA分子从DNA序列转录，然后被翻译成蛋白质。mRNA分子的几个区域不被翻译成蛋白质，包括5’帽、5’UTR、3’UTR和聚腺苷酸尾。

如在本发明中使用的，5’非翻译区(5’UTR)(也称为前导序列或前导RNA)是直接位于起始密码子上游的mRNA的区域。5’UTR开始于转录起始位点，并在编码区的起始密码子(通常为AUG)之前的一个核苷酸(nt)终止。在原核生物中，5’UTR的长度往往是3-10个核苷酸长，而在真核生物中它往往更长，一般从100到几千个核苷酸长，但有时在真核生物中也出现更短的UTR。

如在本发明中使用的，3’UTR可以包含已知影响mRNA的聚腺苷酸化和稳定性的3’-非翻译区内的调节区。许多3’-UTR也含有AU丰富的元件(ARE)。此外，3’-UTR含有序列AAUAAA，其指导将称为聚(A)尾的数百个腺嘌呤残基添加到mRNA转录物的末端。

如将在下面进一步更详细地概述的，根据本发明使用的RNA分子还可以含有聚腺苷酸尾。聚腺苷酸尾是通过称为聚腺苷酸化的过程添加到前mRNA的3’末端的长的腺嘌呤核苷酸(通常数百个)序列。该尾促进从核输出和翻译，并保护mRNA免于降解。聚腺苷酸化是向信使RNA添加聚(A)尾。聚(A)尾由多个腺苷一磷酸组成，换言之，其是只有腺嘌呤碱基的一段RNA。在真核生物中，聚腺苷酸化是产生用于翻译的成熟信使RNA(mRNA)的过程的一部分。

如上所述，本发明的RNA分子优选包含两个或三个主要模块，即，(a)编码多肽的编码区；和(b)所述编码区上游的一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：1所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：1相比显示1至4个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子；和/或(c)所述编码区下游的一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子。

因此，本发明的RNA分子必须包含两个主要模块，即上述模块(a)和模块(b)以及任选的模块(c)。

在另一个优选的实施方式中，本发明的RNA分子包含三个主要模块，即上述模块(a)和模块(b)以及模块(c)。然而，虽然模块(a)是强制性的，但是也可以设想RNA分子也可缺少模块(b)或(c)中的一个。

RNA分子的一个模块，即“编码多肽的编码区”(模块(a))没有特别限制，并且可以是将在给定细胞中表达的任何期望的编码区。因此，该模块可以是编码期望的多肽即期望的最终产物的编码区。关于“编码多肽的编码区”，本发明没有限制，因为编码区的性质取决于将在细胞中产生的期望产物。这样的编码区还可以是不同于已知天然序列并含有突变(即，点突变、插入突变、缺失及其组合)的核苷酸序列。此外，这样的编码区可以部分地或完全地是来源于作为模块(a)使用的天然序列的密码子优化的序列。密码子优化是通过增加感兴趣基因的翻译效率使蛋白质表达最大化的技术。已知天然基因不随机使用可用的密码子，而是对相同氨基酸的特定密码子表现出某种偏好。因此，由于遗传密码的简并性——一个氨基酸可以由几个密码子编码——将感兴趣基因的核苷酸序列转化成相同或另一个物种的一组优选密码子。然而，排除了细胞色素b-245α多肽(CYBA)基因的编码区(模块(a))，因此，本发明的RNA分子是包含模块(a)即编码多肽的编码区的RNA分子，然而，其中(a)中所述编码多肽的编码区不是编码细胞色素b-245α多肽(CYBA)的编码区。编码细胞色素b-245α多肽(CYBA)以及相应的氨基酸序列的编码区在本领域是已知的。已知细胞色素b-245α多肽能够产生超氧化物并已知参与吞噬作用。编码细胞色素b-245α多肽(CYBA)的编码区的实例显示在SEQ ID NO：9中。因此，在优选的实施方式中，本发明的RNA分子是包含模块(a)即编码多肽的编码区的RNA分子，其中(a)中所述编码多肽的编码区不是如SEQ ID NO：9所示的编码细胞色素b-245α多肽(CYBA)的编码区或这样的编码区，其显示与SEQ ID NO：9至少x％同一性的氨基酸序列，其中x是90和100之间的整数，优选95、96、97、98或99。作为一个例子，在DNA水平上，表示编码细胞色素b-245α多肽(CYBA)的多肽的编码区的序列示于SEQ IDNO：8。

如上所述，模块(a)不受特别限制，并且可以是将在给定细胞中表达的任何期望的编码区域。因此，在本发明的上下文中，“编码区”应理解为是指如果引入细胞中，则可翻译成多肽/蛋白质或其片段的任何多核糖核苷酸分子。这里术语“多肽”和“蛋白质”包括任何种类的氨基酸序列，即通过肽键各自连接的两个或更多个氨基酸的链，还包括肽和融合蛋白。

在优选的实施方式中，“编码多肽的编码区”含有核糖核苷酸序列，其编码多肽/蛋白质或其片段——其在细胞中或细胞附近的功能是需要的或有益的，例如，这样的蛋白质，其缺乏其缺陷形式是疾病或病的触发因素，提供其可以调节或预防疾病或病，或这样的蛋白质，其在细胞或其附近促进对身体有利的过程。编码区可以含有完整蛋白质或其功能变体的序列。此外，编码区的核糖核苷酸序列可以编码充当因子、诱导物、调节剂、刺激物或酶或其功能片段的蛋白质，其中该蛋白质是其功能是治疗疾病特别是代谢紊乱或者启动体内过程如新血管、组织等的形成所必需的蛋白质。这里，功能变体被理解为是指片段，所述片段在细胞中可承担细胞中其功能是需要的或者其缺乏或缺陷形式为致病的蛋白质的功能。

在优选的实施方式中，“编码多肽的编码区”编码具有治疗或预防效果的治疗上或药学上有活性多肽或蛋白质。如此，包含所述“编码多肽的编码区”的本发明的RNA分子可用于核酸治疗和相关应用。在本上下文中，根据本发明，将RNA分子的编码区翻译成由引入的外源RNA分子的所述编码区编码的多肽或蛋白质的增加的效率可以意欲补偿或补充内源基因表达，特别是在其中内源基因缺陷或沉默，导致不存在、不足或缺陷或功能失调的基因表达产物情况下，举例如具有许多代谢和遗传性疾病如囊性纤维化、血友病或肌营养不良症等的情况。将RNA分子的编码区翻译成本发明的引入的外源RNA分子的多肽的增加的效率也可以意欲使表达的产物与任何内源细胞过程如基因表达的调节、信号转导和其它细胞过程相互作用或干扰。将RNA分子的编码区翻译成引入的外源RNA分子的多肽的增加的效率也可意图在转染或转导的细胞位于或使其位于其中的生物体的情况下产生免疫应答。实例是抗原呈递细胞如树突状细胞的遗传修饰，以使其呈递抗原用于接种目的。另一个实例是将RNA分子的编码区翻译成多肽的增加的效率，其中所述编码区编码细胞因子。这可，例如，在肿瘤中是期望的以引发肿瘤特异性免疫应答。此外，将RNA分子的编码区翻译成外源RNA分子的多肽的增加的效率也可以意图体内或离体产生瞬时遗传修饰的细胞用于细胞疗法如用于再生医学的修饰的T细胞或前体细胞或干细胞或其它细胞。

在其他优选的实施方式中，“编码多肽的编码区”可以编码参与生长过程和血管生成的蛋白质，其例如在受控再生中是必需的，然后可以通过引入根据发明的RNA分子而具体形成。这可以例如用于生长过程或用于治疗骨缺损、组织缺陷以及在植入和移植的情况下。

如上所述，包含“编码多肽的编码区”的本发明的RNA分子可适当地用于任何情况，其中将天然存在于体内但由于基因缺陷或疾病而不存在或以缺陷形式或太少数量存在的多肽或蛋白质将被提供给身体。已知蛋白质和编码它们的基因，其缺乏或缺陷与疾病有关。根据本发明，可以使用编码完整多肽或蛋白质的编码区的各自完整形式。

由单个基因的突变引起的许多遗传病是已知的，并且是用于mRNA治疗方法的候选者。由单基因突变引起的疾病，如囊性纤维化、血友病和许多其他疾病，关于某些性状将在后代中出现的可能性，可以是显性或隐性的。虽然显性等位基因在只有一个拷贝等位基因的个体中显示表型，但是对于隐性等位基因，个体必须具有两个拷贝，来自每个亲本的一个拷贝，以变得明显。相反，多基因疾病是由两个或更多基因引起的，各自疾病的表现常常是变数(流畅的，fluent)并与环境因素有关。多基因疾病的实例是高血压、升高的胆固醇水平、癌症、神经退行性疾病、精神疾病等。同样在这些情况下，代表这些基因中的一个或多个的治疗性mRNA可以对那些患者有益。此外，遗传病一定不从父母的基因传下来，但也可由新的突变引起。同样在这些情况下，代表正确基因序列的治疗性mRNA可以对患者有益。

在ONIM(人类孟德尔遗传数据库，Online Mendelian Inheritance in Man)网页(http://onim.org)上可获得一个在线目录，目前具有22,993条目的人类基因和遗传病以及它们各自的基因和对其表型的描述。每一个的序列都可以从Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)获得。作为非限制性实例，下面的表2列出了一些先天性疾病和相应的基因(或多个)。由于细胞信号通路的高度相互作用，某个基因的突变导致多种致病症状，其中仅有特征性的一种列于表2。

在本发明的一些实施方式中，治疗性蛋白质选自表2中列出的细胞蛋白质。因此，本发明的组合物可以包含编码治疗性细胞蛋白质的mRNA，其中编码的治疗性蛋白质是表2中列出的一种或其同系物。

在本发明的另一个实施方式中，治疗性蛋白质选自表2中列出的分泌蛋白质。因此，本发明的组合物可以包含编码治疗性融合蛋白的mRNA，其中所编码的治疗性蛋白质或其同系物是表2中所列的一种，第二种蛋白质是允许治疗性蛋白质分泌的信号肽。信号肽是存在于所述治疗性蛋白质的N-末端的短的、通常5-30个氨基酸长的氨基酸序列，并且通过某些细胞器(即内质网、高尔基体或内体)将融合蛋白导向细胞的分泌途径。因此，这种融合蛋白从细胞或细胞器分泌，或者在细胞区室或细胞表面插入到细胞膜(例如多跨跨膜蛋白(multi-spanning trans-membrane protein))中。

因此，在本发明的优选实施方式中，“编码多肽的编码区”(模块(a))可以编码但不限于引起、易患或避免疾病的以下基因。可被治疗(或预防)的这种病症的非限制性实例包括其中所述多肽、蛋白质或肽选自下面表2中概述的那些。

在一些实施方式中，“编码多肽的编码区”可以翻译成包含以等于或大于天然蛋白质的水平的细胞活性的部分或全长蛋白质。在一些实施方式中，“编码多肽的编码区”编码具有治疗或预防效果的治疗上或药学上有活性的多肽、蛋白质或肽，其中所述多肽、蛋白质或肽选自如下面表2中概述的那些。“编码多肽的编码区”可用于表达具有等于或小于天然蛋白质的水平的细胞活性的部分或全长蛋白质。这可以允许治疗可以指示RNA分子施用的疾病。

表2：人类基因和遗传病的非限制性实例

上述表2显示了其中缺陷导致可用本发明的RNA分子治疗的疾病的基因的实例，其中RNA分子包含“编码多肽的编码区”，其编码完整形式的蛋白质或上面公开的缺陷基因的功能片段。在特别优选的实施方式中，可以提及遗传性疾病，其例如影响肺，例如SPB(表面活性蛋白B)缺乏、ABCA3缺乏、囊性纤维化和α1-抗胰蛋白酶缺乏，或者其影响血浆蛋白质(例如先天性血色素沉着病(铁调素(hepcidin)缺乏)、血栓性血小板减少性紫癜(TPP，ADAMTS 13缺乏)并引起凝血缺陷(例如血友病a和b)和补体缺陷(例如C蛋白缺乏)、免疫缺陷如例如SCID(引起在不同基因如RAG1、RAG2、JAK3、IL7R、CD45、CD3δ、CD3ε的突变)或缺乏——由于缺乏腺苷脱氨酶例如(ADA-SCID)、败血性肉芽肿病(例如由gp-91-phox基因p47-phox基因、p67-phox基因或p33-phox基因的突变引起)和贮积病如戈谢病、法布里病、克拉伯病、MPS I、MPS II(亨特综合征)、MPS VI、糖原贮积病II型或muccopolysacchaidoses。

包含“编码肽的编码区”的本发明对其可以是有用的其它病症包括病症如SMN1相关的脊髓性肌萎缩(SMA)；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；GALT相关的半乳糖血症；囊性纤维化(CF)；SLC3A1相关的病症，包括胱氨酸尿症；COL4A5相关的病症，包括奥尔波特综合征；半乳糖脑苷脂酶缺乏；X连锁肾上腺脑白质营养不良和肾上腺髓质神经病；弗里德赖希共济失调；Pelizaeus-Merzbacher病；TSC1和TSC2相关的结节性硬化症；Sanfilippo B综合征(MPSIIIB)；CTNS相关的胱氨酸病；FMR1相关的病症，包括脆性X综合征、脆性X关联性震颤/共济失调综合症和脆性X卵巢早衰综合征；Prader-Willi综合征；遗传性出血性毛细血管扩张症(AT)；Niemann-Pick病C1型；神经元蜡样脂脂褐质沉积症相关的疾病，包括幼年神经元蜡样脂脂褐质沉积症(JNCL)、少年Batten病、Santavuori-Haltia病、Jansky-Bielschowsky病、和PTT-1和TPP1缺乏；EIF2B1、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B4和EIF2B5相关的童年共济失调伴中枢神经系统髓鞘形成减少(hypomyelination)/消失白质；CACNA1A和CACNB4相关的发作性共济失调2型；MECP2相关的病症，包括Classic Rett综合征、MECP2相关的严重新生儿脑病和PPM-X综合征；CDKL5相关的非典型Rett综合征；肯尼迪氏病(SBMA)；Notch-3相关脑的常染色体显性动脉病伴皮层下梗死和脑白质病(CADASIL)；SCN1A和SCN1B相关的癫痫症；聚合酶G相关的病症，包括Alpers-Huttenlocher综合征、POLG相关的感觉共济失调神经病、构音困难、和眼肌瘫痪(ophthalmoparesis)、和常染色体显性和隐性渐进性外眼肌麻痹伴线粒体DNA缺失；X-连锁肾上腺发育不全；X连锁丙种球蛋白缺乏血症；法布里病；和威尔森氏病。

在所有这些疾病中，蛋白质，例如酶，是有缺陷的，其可以通过用根据本发明的RNA的治疗进行治疗，这使得由缺陷的基因或其功能性片段编码的蛋白质可获得。转录物替代疗法/酶替代疗法不影响潜在的遗传缺陷，但是增加患者缺乏的酶的浓度。作为实例，在庞佩氏病中，转录物替代疗法/酶替代疗法替代缺乏的溶酶体酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)。

因此，可由根据本发明的模块(a)的“编码多肽的编码区”编码的蛋白质的非限制性实例是促红细胞生成素(EPO)、生长激素(growth hormone)(生长激素(somatotropin)、hGH)、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、生长因子如GM-SCF、G-CSF、MPS、蛋白C、铁调素、ABCA3和表面活性蛋白B。可以用根据本发明的RNA治疗的疾病的其它例子是血友病A/B、法布里病、CGD、ADAMTS13、Hurler’s病、X染色体介导的A-γ-球蛋白血症、腺苷脱氨酶相关的免疫缺陷和新生儿中的呼吸窘迫综合征，其与SP-B相关。特别优选地，根据本发明的RNA分子的“编码多肽的编码区”含有表面活性蛋白B(SP-B)或促红细胞生成素的序列。可以由根据本发明的RNA分子的“编码多肽的编码区”编码的蛋白质的其他实例是生长因子如人生长激素hGH、BMP-2或血管生成因子。

可选地，核酸可以编码全长抗体或更小的抗体(例如，重链和轻链两者)以赋予对象免疫性。在另一个实施方式中，“编码多肽的编码区”可以编码功能性单克隆或多克隆抗体，其可用于靶向和/或灭活生物靶标(例如，刺激性细胞因子如肿瘤坏死因子)。类似地，“编码多肽的编码区”可编码例如用于治疗膜性增生性肾小球肾炎II型或急性溶血性尿毒症综合征的功能性抗肾病因子抗体，或者可选地可编码用于治疗VEGF介导的疾病如癌症的抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体。

模块(a)即“包括在其5’末端的起始密码子的编码多肽的编码区”可以是编码可用于基因组编辑技术的多肽或蛋白质的编码区。基因组编辑是一种使用核酸酶在生物体基因组中插入、缺失或置换DNA的基因工程。这些核酸酶在基因组中的期望位置处产生位点特异性断裂。引起的断裂通过非同源末端连接或同源重组来修复，导致基因组中的靶向突变，从而“编辑”基因组。断裂可以是单链断裂或双链断裂(DSB)，而双链断裂(DSB)是优选的。利用不同多肽或蛋白质的许多基因组编辑系统是本领域已知的，即，例如，CRISPR-Cas系统、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)和基于转录激活剂样效应物的核酸酶(TALEN)。Trends inBiotechnology,2013,31(7),397-405中综述了用于基因组工程的方法。

因此，在优选的实施方式中，“包括在其5’末端的起始密码子的编码多肽的编码区”含有编码Cas(CRISPR相关蛋白)蛋白家族的多肽或蛋白质——优选Cas9(CRISPR相关蛋白9)——的核苷酸序列。可以在基于CRISPR/Cas9的方法和/或CRISPR/Cas9基因组编辑技术中使用Cas蛋白家族的蛋白质，优选Cas9。Nat.Biotechnol.,2014,32(4):347-355中综述了用于基因组编辑、调控和靶向的CRISPR-Cas系统。

在另一个优选的实施方式中，“包括在其5’末端的起始密码子的编码多肽的编码区”含有编码大范围核酸酶的核苷酸序列。大范围核酸酶是内切脱氧核糖核酸酶，其与“常规”内切脱氧核糖核酸酶相反，识别大的识别位点(例如，12至40个碱基对的双链DNA序列)。结果，在任何给定的基因组中，各自的位点只出现几次，优选地仅一次。因此，大范围核酸酶被认为是最特异的天然存在的限制酶，因此是基因组编辑技术中的合适工具。

在另一个优选的实施方式中，“包括在其5’末端的起始密码子的编码多肽的编码区”含有编码锌指核酸酶(ZFN)的核苷酸序列。ZFN是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制酶。锌指结构域可以被设计以靶向特定的期望的DNA序列，并且这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的独特序列。通过利用内源DNA修复机制，ZFN可以用来精确地改变高等生物的基因组，因此是基因组编辑技术中的合适工具。

在另一个优选的实施方式中，“包括在其5’末端的起始密码子的编码多肽的编码区”含有编码转录激活剂样效应物核酸酶(TALEN)的核苷酸序列。TALEN是限制酶，其可被设计以切割DNA的特定序列。TALEN是融合蛋白，其中TAL效应物DNA结合结构域与核酸酶的DNA切割结构域融合。可以将转录激活剂样效应物(TALE)设计以实际上结合任何期望的DNA序列。因此，当与核酸酶组合时，可以在特定的期望位置切割DNA。

第二模块(b)是一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：1所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：1相比显示1至4个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子。

该上下文中的“一个或多个”意指RNA分子的模块(b)可以包含一个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：1所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：1相比显示1至4个取代，并且其导致具有与包括含有本发明的SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子。RNA分子也可以包含本发明的这些UTR中的两个、三个或四个。可选地，RNA分子也可以包含本发明的这些UTR中的五个或甚至更多。

第三模块(c)是一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：2的UTR(即上述模块(c))的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子。

在该上下中，“一个或多个”意指RNA分子的模块(c)可以包含一个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包括含有本发明的SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子。RNA分子也可以包含本发明的这些UTR中的两个、三个或四个。可选地，RNA分子也可以包含本发明的这些UTR中的五个或甚至更多。

天然人细胞色素b-245α多肽(CYBA)mRNA的全长序列是本领域已知的，并具有如SEQ ID NO：7所示的序列。在所附实例中，来自天然人细胞色素b-245α多肽(CYBA)mRNA的核苷酸36至71的序列已被用作CYBA mRNA的5’UTR片段(即核苷酸序列5’-CGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUGUCGCC-3’(SEQ ID NO：1))，并且来自天然人细胞色素b-245α多肽(CYBA)mRNA的核苷酸657至723的序列已被用作CYBA mRNA的3’UTR(即核苷酸序列5’-CCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCCGCCAGGUGCACCCACCUGCAAUAAAUGCAGCGAAGCCGGGA-3’(SEQ ID NO：2))。

然而，本发明中使用的UTR并不特别限定于上述SEQ ID NO：1的特定序列，也可以是包含与SEQ ID NO：1相比显示1至4个取代的序列的UTR序列。可选地，UTR序列还可以是包含与SEQ ID NO：1相比显示1至3个取代的序列的序列。UTR序列还可以是包含与SEQ ID NO：1相比显示1至2个取代的序列的序列。最优选地，UTR序列还可以是包含与SEQ ID NO：1相比显示1个取代的序列的序列。

优选地，与SEQ ID NO：1相比，上述核苷酸取代的位置在SEQ ID NO：1的序列中的位置32处进行。优选地，在该位置的核苷酸“U”被“C”取代。这种取代是优选的，因为它使得(部分)存在于SEQ ID NO：1中的CYBA的Kozak元件更靠近脊椎动物的Kozak共有序列。脊椎动物的Kozak共有序列具有GCCRCCAUGG序列(起始密码子加下划线，而“R”表示任何嘌呤)，而CYBA的Kozak元件具有GuCGCCAUGG序列(起始密码子加下划线，而与脊椎动物共有序列的偏差由小写字母“u”表示)。

与SEQ ID NO：1相比，具有上述取代中的一个或多个的UTR序列(一个或多个)可以导致与包括含有SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子在翻译效率方面相同或相似的能力——优选与包括含有SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子在翻译效率方面相比更高能力——的RNA分子。与包括含有SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子在翻译效率方面相比，给定的修饰的UTR序列的关于翻译效率的性质/能力可以由技术人员通过本领域已知的方法以及如所附实施例中所概述的来确定。

翻译效率是细胞内mRNA翻译成多肽或蛋白质的速率。给定mRNA的翻译效率被测量为每个时间单位每个mRNA翻译的蛋白质或多肽的数量。翻译是细胞核糖体产生蛋白质的过程，是技术人员所熟知的。简而言之，在翻译中，由DNA转录产生的信使RNA(mRNA)被核糖体解码以产生特定的氨基酸链或多肽或蛋白质。

因此，包含修饰的UTR序列的给定RNA分子的翻译效率优选地与相同的给定RNA——但包含SEQ ID NO：1的UTR——的翻译效率相比更高。因此，每个时间单位每个RNA翻译的由包含修饰的UTR序列的RNA分子的编码区编码的蛋白质或多肽的数量高于每个时间单位每个RNA翻译的由包含SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子的编码区编码的蛋白质或多肽的数量。

如果包含修饰的UTR序列的给定RNA分子的翻译效率与相同的给定RNA——但包含SEQ ID NO：1的UTR——的翻译效率相比相似或相同，则每个时间单位每个RNA翻译的由包含修饰的UTR序列的RNA分子的编码区编码的蛋白质或多肽的数量与每个时间单位每个RNA翻译的由包含SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子的编码区编码的蛋白质或多肽的数量相似或相同。

“翻译效率”可以例如通过在所附实施例中描述的方法来确定，并且如下所概述。

在本发明的上下文中，翻译效率是关于在相同的时间点在细胞中编码各自蛋白质的mRNA的量，在某一时间点在所述细胞内mRNA翻译成蛋白质的速率。因此，翻译效率是在某个时间点在细胞内翻译成蛋白质的mRNA与编码各自蛋白质的mRNA的量之商。两个参数，即被翻译成蛋白质的mRNA以及编码各自蛋白质的mRNA的量，可以通过本领域已知的方法来确定。如在所附实施例中已经完成的，作为非限制性实例，细胞内翻译成蛋白质的mRNA的量可以例如通过流式细胞术(FC)测定，而编码各自蛋白质的mRNA的量可以例如通过qPCR来测量。

UTR(一个或多个)——其包含SEQ ID NO：1所示的序列或这样的序列，其与SEQ IDNO：1相比显示1至4个取代，并且其导致具有与如本发明使用的包括含有SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子——不特别限于上述特定序列和上述取代，但也可以涉及UTR序列(一个或多个)，其包含与SEQ ID NO：1相比显示核苷酸(一个或多个)添加(一个或多个)的序列。核苷酸(一个或多个)的添加可以是侧翼的。因此，可以在本发明的UTR(一个或多个)的3’末端或5’末端添加额外的核苷酸(一个或多个)。额外的核苷酸(一个或多个)包含多至0(无变化)、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，优选多至20个核苷酸或甚至更优选多至30个核苷酸的多核苷酸链。鉴于添加核苷酸可能不会改变本发明的UTR(一个或多个)的上述功能特性的原理，核苷酸的添加也可具有多至40、50、60、70、80、90或甚至100个核苷酸或甚至更多，多至200、300、400或500个核苷酸的长度，只要这些序列具有与SEQ ID NO：1相似的能力(在上述翻译效率方面)，优选如上文定义的SEQ ID NO：1更高的翻译效率。

可选地，或者除了核苷酸(一个或多个)的这些侧翼添加之外，可以散布核苷酸(一个或多个)的添加。因此，可以将额外的核苷酸(一个或多个)添加/插入到本发明的UTR(一个或多个)的核苷酸序列内。这些核苷酸(一个或多个)插入包含1、2或3个核苷酸，只要这些序列具有与SEQ ID NO：1相似的能力(在上述翻译效率方面)，优选如上文定义的SEQ IDNO：1更高的翻译效率。

本发明使用的UTR不特别限于以上SEQ ID NO：1的特定序列及其修饰。相反，SEQID NO：1的特定序列及其修饰仅限定CYBA 5’核心区。因此，在优选的实施方式中，如SEQ IDNO：1所示的UTR在5’末端(即上游)延伸至少1个核苷酸。在另一个优选的实施方式中，如SEQID NO：1所示的UTR在5’末端(即上游)延伸1至20个核苷酸。因此，在优选的实施方式中，SEQID NO：1的序列在5’末端(即上游)延伸20个核苷酸，如相对于SEQ ID NO：1在SEQ ID NO：10的核苷酸序列(或SEQ ID NO：11的相应RNA序列)中所示。在其他优选的实施方式中，SEQ IDNO：1的序列在5’末端(即，上游)延伸18、15、13、10、7或5个核苷酸，如相对于SEQ ID NO：1在SEQ ID NO：10的核苷酸序列(或SEQ ID NO：11的相应RNA序列)中所示。在其他优选的实施方式中，SEQ ID NO：1的序列在5’末端(即上游)延伸4、5或2个核苷酸，如相对于SEQ ID NO：1在SEQ ID NO：10的核苷酸序列(或SEQ ID NO：11的相应RNA序列)中所示。在其他优选的实施方式中，SEQ ID NO：1的序列在5’末端(即上游)延伸1个核苷酸，如相对于SEQ ID NO：1在SEQ ID NO：10的核苷酸序列(或SEQ ID NO：11的相应RNA序列)中所示。

SEQ ID NO：10是以上显示为SEQ ID NO：5的人CYBA基因5’UTR的遗传密码的部分(如在DNA水平上所定义的)，而SEQ ID NO：11是相应的RNA序列。

在5’末端(即上游)延伸的这些UTR序列也可以如上文对于SEQ ID NO：1所定义的进行修饰。因此，就实际的情形，同样地适用于如上文定义的在SEQ ID NO：1的UTR的上下文中上面已经阐述的在5’末端延伸的UTR。

此外，用于本发明的UTR也不特别限于上述SEQ ID NO：2的特定序列，但也可以是包含与SEQ ID NO：2相比显示1至7个取代的序列的UTR序列。可选地，UTR序列还可以是包含与SEQ ID NO：2相比显示1至6个取代的序列的序列。UTR序列还可以是包含与SEQ ID NO：2相比显示1至5个取代的序列的序列。UTR序列还可以是包含与SEQ ID NO：2相比显示1至4个取代的序列的序列。UTR序列还可以是包含与SEQ ID NO：2相比显示1至3个取代的序列的序列。UTR序列还可以是包含与SEQ ID NO：2相比显示1至2个取代的序列的序列。UTR序列还可以是包含与SEQ ID NO：2相比显示1至3个取代的序列的序列。最优选地，UTR序列还可以是包含与SEQ ID NO：2相比显示1个取代的序列的序列。

与SEQ ID NO：2相比，具有上述取代中的一个或多个的UTR序列(一个或多个)可以导致与包括含有SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子在翻译效率方面相同或相似的能力——优选与包括含有SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子在翻译效率方面相比更高能力——的RNA分子。与包括含有SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子在翻译效率方面相比，给定的修饰的UTR序列的关于翻译效率的性质/能力可以由技术人员通过本领域已知的方法以及如所附实施例中所概述的来确定。

因此，包含修饰的UTR序列的给定RNA分子的翻译效率优选地与相同的给定RNA——但是包含SEQ ID NO：2的UTR——的翻译效率相比更高。因此，每个时间单位每个RNA翻译的由包含修饰的UTR序列的RNA分子的编码区编码的蛋白质或多肽的数量高于每个时间单位每个RNA翻译的由包含SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子的编码区编码的蛋白质或多肽的数量。

如果包含修饰的UTR序列的给定RNA分子的翻译效率与相同的给定RNA——包含SEQ ID NO：2的UTR——的翻译效率相比相似或相同，则每个时间单位每个RNA翻译的由包含修饰的UTR序列的RNA分子的编码区编码的蛋白质或多肽的数量与每个时间单位每个RNA翻译的由包含SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子的编码区编码的蛋白质或多肽的数量相似或相同。

UTR(一个或多个)——其包含SEQ ID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ IDNO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包括含有如本发明中所使用的SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子——不特别限于上述特定序列和上述取代，但也可以涉及UTR序列(一个或多个)，其包含与SEQ ID NO：2相比显示核苷酸(一个或多个)添加(一个或多个)的序列。核苷酸(一个或多个)的添加可以是侧翼的或散布的。因此，可以在本发明的UTR(一个或多个)的3’末端或5’末端添加额外的核苷酸(一个或多个)。可选地，或者除了这些侧翼额外核苷酸(一个或多个)之外，额外的核苷酸(一个或多个)也可以在本发明的UTR(一个或多个)的核苷酸序列内。额外的核苷酸(一个或多个)包含多至0(无变化)、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，优选多至20个核苷酸或甚至更优选多至30个核苷酸的多核苷酸链。鉴于添加核苷酸可能不改变本发明的UTR(一个或多个)的上述功能特性的原理，所以核苷酸的添加也可具有多至40、50、60、70、80、90或甚至100个核苷酸或甚至更多，多至200、300、400或500个核苷酸的长度，只要这些序列具有与SEQ ID NO：2相似的能力(在上述翻译效率方面)，优选如上文定义的SEQ ID NO：2更高的翻译效率。

本发明的UTR(一个或多个)以及含有这种UTR(一个或多个)的RNA分子可以通过本领域技术人员已知的方法重组(例如在体内或体外系统中)或合成产生/合成。

更具体地，本发明的UTR和含有这种UTR(一个或多个)的RNA分子可以通过本领域技术人员已知的方法在体内系统中重组地产生。

可选地，可以使用例如体外转录系统在体外系统中产生本发明的UTR和含有这种UTR(一个或多个)的RNA分子。体外转录系统通常是已知的，并且通常需要含有“编码”模块(b)和/或模块(c)的DNA序列的纯化的线性DNA模板，如以下进一步详细概述的，其中所述DNA序列处于适当的启动子的控制下。而且，体外转录系统通常也需要核糖核苷三磷酸、包括DTT和镁离子的缓冲系统、以及合适的RNA聚合酶，其为“编码”模块(b)和/或(c)的DNA序列体外转录到本发明的UTR(一个或多个)中提供酶活性。

此外，本发明的UTR和含有这样的UTR(一个或多个)的RNA分子可以化学地合成，例如通过使用固相载体和标准技术在自动化核苷酸序列合成仪上的常规化学合成或通过各自的DNA序列的化学合成以及随后的其体外或体内转录。

根据上文，本发明提供RNA分子/多核糖核酸分子，优选修饰的多核糖核酸分子，其中所述RNA分子的一个模块，即“包含在其5’末端的起始密码子的编码区”(模块(a))编码多肽。术语核酸和多核苷酸可互换使用，并且包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。术语核苷酸包括脱氧核苷酸和核糖核苷酸。术语核糖核酸和多核糖核苷酸可互换使用，并且在某些实施方式中，包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质，其中大于50％的核苷酸是核糖核苷酸。在某些实施方式中，多核糖核苷酸包含核苷酸的聚合物，其中大于60％、70％、75％、80％、90％、大于95％、大于99％或100％的核苷酸是核糖核苷酸。其中一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸的多核糖核苷酸可以称为修饰的多核糖核苷酸。然而，术语多核糖核苷酸可以包括修饰的多核糖核苷酸。

RNA分子/多核糖核苷酸的序列可以源自，例如，包含感兴趣基因的遗传信息的任何合适的核酸。核酸的实例包括来自包含感兴趣基因(一个或多个)的任何细菌或古细菌细胞的基因组DNA、RNA或cDNA。多核苷酸可以源自携带突变基因和多态性的核酸。本发明的RNA分子/多核糖核苷酸包含这样的序列，其没有特别限制并可以包含，作为模块A，在给定细胞中表达的任何期望的编码区。在优选的实施方式中，所述序列可以是编码如上所概述的期望的多肽/蛋白质的编码区。优选地，与上述一致，RNA分子/多核糖核苷酸还包含位于模块A的起始密码子上游(5’)的非翻译序列、位于模块A的终止密码子下游(3’)的非翻译序列、或位于模块A的起始密码子上游(5’)的非翻译序列和位于模块A的终止密码子下游(3’)的非翻译序列。在优选的实施方式中，本发明的RNA分子/多核糖核苷酸可以是修饰的RNA分子/多核糖核苷酸。

除了四种典型的核糖核苷酸，即腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷之外，还存在这些核碱基的每一种的许多类似物。有时遍及和在文献中，这些类似物或包括这些类似物中的一种或多种的RNA分子/多核糖核苷酸被称为修饰的(例如修饰的核苷酸或修饰的核糖核苷酸)。一些类似物与上述规则(标准的，canonical)的核碱基不同，但是也可以存在于自然界中。其他类似物是非天然存在的。考虑任何一种类型的类似物。

在某些实施方式中，本发明的RNA分子/多核糖核苷酸包含核苷酸类似物(例如，包含修饰的多核糖核苷酸的多核糖核苷酸)。下文提供了示例性的核苷酸类似物(例如，U的类似物；C的类似物；A的类似物；G的类似物)。另外，在某些实施方式中，本公开的RNA分子/多核糖核苷酸或其它核酸还可以(除此之外或可选地)包含磷酸二酯主链中或者核碱基之间的连接中的修饰。可形成本公开的RNA分子/多核糖核苷酸的部分或全部的示例性核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁(locked)核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2'-氨基官能化的2’-氨基-LNA和具有2’-氨基官能化的2’-氨基-α-LNA)或其杂化物。

在某些实施方式中，修饰可以在核酸/多核苷酸分子的一个或多个核苷或主链上。在某些实施方式中，修饰可以在核苷和主链连接上。在某些实施方式中，修饰可以体外改造成多核苷酸。在某些实施方式中，修饰的核糖核苷酸/核苷酸还可以通过经典/天然核苷酸/核糖核苷酸的共价修饰在转录后合成。

本发明的RNA分子/多核糖核苷酸可以是修饰的RNA分子/多核糖核苷酸，并且在某些实施方式中，可以包含嘌呤的类似物和/或嘧啶的类似物。在某些实施方式中，本发明的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸包含嘧啶类似物，如尿苷的类似物和/或胞苷的类似物。在某些实施方式中，本发明的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸包含尿苷的类似物和胞苷的类似物。在某些实施方式中，修饰的RNA分子/多核糖核苷酸不包含腺苷的类似物和/或鸟苷的类似物。在某些实施方式中，RNA分子/多核糖核苷酸包含单一类型的尿苷的类似物和单一类型的胞苷的类似物(例如一种类似物，而不是单一类似物分子——单一类似物可以以本文描述的几个百分比中的任一个存在)。在其他实施方式中，RNA分子/多核糖核苷酸包含一种以上类型的尿苷和/或胞苷的类似物，以及任选地和如果存在的话，一种或多种腺苷和/或鸟苷的类似物(或两者中的任一者或两者都不存在)。

在一些情况下，修饰的尿苷(例如尿苷类似物)选自2-硫代尿苷、5’-甲基尿苷、假尿苷、5-碘尿苷(I5U)、4-硫代尿苷(S4U)、5-溴尿苷(Br5U)、2’-甲基-2’-脱氧尿苷(U2’m)、2’-氨基-2’-脱氧尿苷(U2’NH₂)、2’-叠氮基-2’-脱氧尿苷(U2’N₃)和2’-氟-2’-脱氧尿苷(U2’F)。在一些情况下，修饰的胞苷(例如胞苷的类似物)选自5-甲基胞苷、3-甲基胞苷、2-硫代胞苷、2’-甲基-2’-脱氧胞苷(C2’m)、2’-氨基-2’-脱氧胞苷(C2’NH2)、2’-氟-2’-脱氧胞苷(C2’F)、5-碘胞苷(I5C)、5-溴胞苷(Br5C)和2’-叠氮基-2’-脱氧胞苷(C2’N3)。注意，当提到类似物时，前述也指其5’三磷酸盐形式的类似物。在某些实施方式中，胞苷类似物是5-碘胞苷，尿苷类似物是5-碘尿苷。

在一些实施方式中，RNA分子/多核糖核苷酸是经修饰的RNA分子/多核糖核苷酸。在一些情况下，与非修饰的(或未修饰的)RNA分子/多核糖核苷酸相比，修饰的RNA分子/多核糖核苷酸更稳定至少25％。在一些情况下，与未修饰的RNA分子/多核糖核苷酸相比，修饰的RNA分子/多核糖核苷酸可以更稳定至少30％，更稳定至少35％，更稳定至少40％，更稳定至少45％，更稳定至少50％，更稳定至少55％，更稳定至少60％，更稳定至少65％，更稳定至少70％，更稳定至少75％，更稳定至少80％，更稳定至少85％，更稳定至少90％或更稳定至少95％。在某些实施方式中，体内测量稳定性。在某些实施方式中，体外测量稳定性。在某些实施方式中，通过测量多核糖核苷酸的半衰期来量化稳定性。

本发明的RNA分子/多核糖核苷酸可具有已经以相同形式修饰的核苷酸或另外不同修饰的核苷酸的混合物。修饰的核苷酸可以具有在信使RNA中天然或不天然存在的修饰。可以使用各种修饰的核苷酸的混合物。例如，RNA分子/多核糖核苷酸内的一个或多个修饰的核苷酸可以具有天然修饰，而另一部分具有在mRNA中未被天然发现的修饰。另外，一些修饰的核苷酸可以具有碱基修饰，而其他修饰的核苷酸具有糖修饰。以相同的方式，所有修饰可能是碱基修饰，或者所有修饰可能是糖修饰或其任何合适的混合。在一些情况下，修饰的RNA分子/多核糖核苷酸的稳定性可以通过改变修饰的多核糖核苷酸内的修饰的碱基的性质来选择性地优化。

表2：U的类似物的非限制性实例

表3：C的类似物的非限制性实例

表4：A的类似物的非限制性实例

表5：G的类似物的非限制性实例

在某些实施方式中，类似物(例如修饰的核苷酸)可以选自吡啶-4-酮核糖核苷、5-碘尿苷、5-碘胞苷、5-氮杂-尿苷、2'-氨基-2'-脱氧胞苷、2'-氟-2'-脱氧胞苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基(propynyl)-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-taurino甲基尿苷、1-taurino甲基-假尿苷、5-taurino甲基-2-硫代-尿苷、1-taurino甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、1-甲基-l-去氮杂(deaza)-假尿苷、2-硫代-1-甲基-l-去氮杂(deaza)-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷(pseudoisocytidine)、3-甲基-胞苷、N4-乙酰胞苷、5-甲酰胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-l-甲基-假异胞苷、4-硫代-l-甲基-1-去氮杂-假异胞苷、1-甲基-l-去氮杂-假异胞苷、zebularine、5-氮杂-zebularine、5-甲基-zebularine，5-氮杂-2-硫代-zebularine、2-硫代-zebularine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-l-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-2-氨基嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-去氮杂-2,6-二氨基嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷(glycinylcarbamoyladenosine)、N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷、wybutosine、7-去氮杂-鸟苷、7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-去氮杂-鸟苷、6-硫代-7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。

在某些实施方式中，本发明的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸不包括假尿苷。在某些实施方式中，本发明的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸不包括5-甲基胞苷。在某些实施方式中，本发明的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸不包括5-甲基尿苷。在某些实施方式中，本发明的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸包含U的类似物和C的类似物，其中这样的U的类似物可以全部是相同的类似物或可以是不同的类似物(例如，多于一种类似物)，并且其中这样的C的类似物可以全部是相同的类似物或者可以是不同的类似物(例如，多于一种类似物)。在某些实施方式中，本发明的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸不包括腺苷的类似物和鸟苷的类似物。

如本文详细描述的，当RNA分子/多核糖核苷酸包含修饰的多核糖核苷酸时，类似物可以作为某一比例的化合物中的核苷酸存在(例如，如本文所述，给定百分比的给定核碱基可以是类似物)。

包含至少一个修饰的核苷酸的RNA分子/多核糖核苷酸是修饰的RNA分子/多核糖核苷酸。在某些实施方式中，至少约5％的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸包括修饰的或非天然存在的(例如，类似物或修饰的)腺苷、胞苷、鸟苷或尿苷，如本文所述的类似物核苷酸。在一些情况下，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸包括修饰的或非天然存在的(例如，类似物或修饰的)腺苷、胞苷、鸟苷或尿苷。在一些情况下，至多约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸包括修饰的或非天然存在的腺苷、胞苷、鸟苷或尿苷。

在优选的实施方式中，本发明的RNA分子含有修饰和未修饰的核苷酸的组合。优选地，本发明的RNA分子含有如WO 2011/012316中所述的修饰和未修饰的核苷酸的组合。这样的RNA分子也是已知的并且作为“

-RNA”商业化。据报道WO2011/012316中描述的RNA分子显示增加的稳定性和降低的免疫原性。在优选的实施方式中，在这种修饰的RNA分子中，5-50％的胞苷核苷酸和5-50％的尿苷核苷酸被修饰。含腺苷和鸟苷的核苷酸可以是未修饰的。腺苷和鸟苷核苷酸可以是未修饰的或部分修饰的，并且它们优选以未修饰的形式存在。优选10-35％是胞苷和尿苷核苷酸被修饰，特别优选修饰的胞苷核苷酸的含量在7.5-25％的范围内，修饰的尿苷核苷酸的含量在7.5-25％的范围内。已经发现实际上相对低的含量，例如修饰的胞苷和尿苷核苷酸的每种(each)仅10％可以达到期望的性质。特别优选修饰的胞苷核苷酸是5-甲基胞苷残基，修饰的尿苷核苷酸是2-硫代尿苷残基。最优选地，修饰的胞苷核苷酸的含量和修饰的尿苷核苷酸的含量分别为25％。

在某些其他实施方式中，在这样的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸分子中，5-50％的胞苷是C的类似物，并且5-50％的尿苷是U的类似物。在某些实施方式中，在这样的修饰的多核糖核苷酸分子中，5-40％的胞苷是C的类似物，并且5-40％的尿苷是U的类似物。在某些实施方式中，在这样的修饰的RNA分子/多核苷酸分子中，5-30％的胞苷是C的类似物，并且5-30％的尿苷是U的类似物。在某些实施方式中，在这样的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸分子中，10-30％的胞苷是C的类似物，并且10-30％的尿苷是U的类似物。在某些实施方式中，在这样的修饰的多核糖核苷酸分子中，5-20％的胞苷是C的类似物，并且5-20％的尿苷是U的类似物。在某些实施方式中，在这样的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸分子中，5-10％的胞苷核苷酸和5-10％的尿苷核苷酸被修饰。在某些实施方式中，在这样的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸分子中，25％的胞苷核苷酸和25％的尿苷核苷酸被修饰。在某些实施方式中，含腺苷和鸟苷的核苷酸可以是未修饰的。在某些实施方式中，腺苷和鸟苷核苷酸可以是未修饰的或部分修饰的，并且它们优选以未修饰的形式存在。

如上所述，在某些实施方式中，U的类似物是指单一类型的U的类似物。在某些实施方式中，U的类似物是指两种或更多种的U的类似物。在某些实施方式中，C的类似物指单一类型的C的类似物。在某些实施方式中，C的类似物是指两种或更多种的C的类似物。

在某些实施方式中，作为胞苷类似物的RNA分子/多核糖核苷酸中胞苷的百分比不同于作为尿苷类似物的RNA分子/多核糖核苷酸中的尿苷的百分比。在某些实施方式中，胞苷类似物的百分比低于尿苷类似物的百分比。如上所述，这可以在存在或不存在腺苷和鸟苷的类似物的情况下，但是在某些实施方式中，是在不存在腺苷的类似物和鸟苷的类似物的情况下。在某些实施方式中，本公开的多核糖核苷酸包含小于15％、小于10％、小于5％或小于2％的腺苷类似物、鸟苷类似物或两者。

在某些实施方式中，本发明的RNA分子/多核糖核苷酸包含胞苷的类似物和尿苷的类似物，并且5-20％的胞苷是胞苷的类似物并且25-45％的尿苷是尿苷的类似物。换句话说，RNA分子/多核糖核苷酸包含修饰的和未修饰的胞苷和修饰的和未修饰的尿苷，并且5-20％的胞苷包含胞苷的类似物，而25-45％的尿苷包括尿苷的类似物。在其它实施方式中，RNA分子/多核糖核苷酸包含5-10％胞苷类似物和30-40％尿苷类似物，如7-9％胞苷类似物，如约7、7.5或8％，如32-38％的尿苷类似物，如约33、34、35、36％。

在某些实施方式中，可以使用本文所述的尿苷的类似物和胞苷的类似物中的任何一种，任选地排除假尿苷。在某些实施方式中，胞苷的类似物包括下述或由下述组成(例如，在由其组成的情况下，它是使用的单一类似物类型)：5-碘胞苷，且尿苷的类似物包括下述或由下述组成(例如，在由其组成的情况下，它是使用的单一类似物类型)：5-碘尿苷。

在任何前述的某些实施方式中，给定核苷酸的类似物的百分比是指输入百分比(例如起始反应中的类似物的百分比，如起始体外转录反应)。在任何前述的某些实施方式中，给定核苷酸的类似物的百分比是指输出(例如合成的或转录的化合物中的百分比)。

本发明的RNA分子/多核糖核苷酸分子可以通过本领域技术人员已知的方法在体内系统中重组地产生，其在下面进一步更详细地描述。

可选地，本发明的修饰的多核糖核苷酸分子可以使用例如体外转录系统在体外系统中产生，所述体外转录系统在下面进一步详细描述。能够产生RNA分子/多核糖核苷酸的体外转录系统需要修饰的和未修饰的核苷三磷酸的输入混合物以产生具有本发明期望特性的修饰的RNA分子/多核糖核苷酸。在某些实施方式中，在这样的输入混合物中5-50％的胞苷是胞苷的类似物，并且在这样的输入混合物中5-50％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，在这样的输入混合物中5-40％的胞苷是胞苷的类似物，并且在这样的输入混合物中5-40％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，在这样的混合物中5-30％的胞苷是胞苷的类似物，在这样的输入混合物中5-30％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，在这样的混合物中5-30％的胞苷是胞苷的类似物，并且在这样的混合物中10-30％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，在这样的输入混合物中5-20％的胞苷是胞苷的类似物，并且在这样的输入混合物中5-20％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，在这样的输入混合物中5-10％的胞苷是胞苷的类似物，并且在这样的输入混合物中5-10％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，在这样的输入混合物中25％的胞苷是胞苷的类似物，并且在这样的输入混合物中25％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，输入混合物不包含腺苷和/或鸟苷的类似物。在其他实施方式中，任选地，输入混合物包含腺苷和/或鸟苷的一种或多种类似物(或者两者中的任何一种或两种都没有)。

在某些实施方式中，作为胞苷类似物的输入混合物中胞苷的百分比与作为尿苷类似物的输入混合物中尿苷的百分比不同。在某些实施方式中，输入混合物中胞苷类似物的百分比低于输入混合物中尿苷类似物的百分比。如上所述，这可能在输入混合物中存在或不存在腺苷和鸟苷的类似物的情况下，但在某些实施方式中，是在输入混合物中不存在腺苷的类似物和鸟苷的类似物的情况下。

在某些实施方式中，用于产生本发明的RNA分子/多核糖核苷酸的体外转录系统的核苷酸的输入混合物包含胞苷的类似物和尿苷的类似物，并且输入混合物的5-20％的胞苷是胞苷的类似物和输入混合物的25-45％的尿苷是尿苷的类似物。换言之，输入混合物包含修饰的和未修饰的胞苷和修饰的和未修饰的尿苷，并且输入混合物的5-20％的胞苷包含胞苷的类似物，而输入混合物的25-45％的尿苷包含尿苷的类似物。在其它实施方式中，输入混合物包含5-10％胞苷的类似物和30-40％尿苷的类似物，如7-9％胞苷的类似物，如7、7.5或8％，如32-38％尿苷的类似物，如33、34、35、36％。

在某些实施方式中，可以使用本文所述的尿苷的类似物和胞苷的类似物中的任何一种，任选地排除假尿苷。在某些实施方式中，胞苷的类似物包括下述或由下述组成(例如，它是使用的单一C类似物类型)：5-碘胞苷，并且尿苷的类似物包括下述或由下述组成(例如，它是使用的单一U类似物类型)：5-碘胞苷。

示例性的类似物在上表中描述。应当理解，对于编码期望多肽(模块(a))的修饰的多核糖核苷酸，除非另外指出，考虑修饰的类似物和水平跨编码期望多肽(模块(a))的整个多核糖核苷酸，包括5’和3’非翻译区(例如，修饰的水平基于体外转录反应中的类似物的输入比，使得类似物可以在被转录的位置并入)。

此外，修饰的RNA分子/多核糖核苷酸分子可以化学合成，例如通过使用固相载体和标准技术在自动化核苷酸序列合成仪上的常规化学合成或通过各自的DNA序列的化学合成以及随后的其体外或体内转录。

在分子生物学和遗传学中，上游和下游都指RNA分子中的相对位置。在本发明的上下文中，上游朝向RNA分子的5’末端，下游朝向分子的3’末端。

因此，在一个实施方式中，UTR模块(b)(即一个或多个UTR，包含SEQ ID NO：1所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：1相比具有1至4个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子，如上文所定义的)位于模块(a)的编码区的上游。而且，在一个实施方式中，UTR模块(c)(即一个或多个UTR，包含SEQID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子，如上文所定义的)位于模块(a)的编码区的下游。然而，优选地，编码多肽的编码区(即模块(a))位于UTR模块(b)和UTR模块(c)之间，因此，RNA分子优选具有5’-(b)-(a)-(c)-3’的排列。

如果RNA分子仅包含一个UTR模块(即，或模块(b))(即一个或多个UTR，包含SEQ IDNO：1所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：1相比显示1至4个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子，如上文所定义的)或模块(c)(即一个或多个UTR，包含SEQ ID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ IDNO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子，如上文所定义的)，RNA分子优选具有5’-(b)-(a)-3’或5’-(a)-(c)-3’的排列。

RNA分子可以以模块(a)、(b)和/或(c)的融合RNA序列的形式存在，即(融合)RNA分子，其通过组合至少两个编码所述模块的核苷酸序列而制备的杂合基因的表达形成。通常，如下文将进一步更详细解释的，这可以通过将cDNA克隆到允许RNA分子翻译的表达载体中来完成。因此，编码本发明的RNA分子的DNA分子可以是融合的DNA序列，即嵌合分子，其通过将两个或更多个多核苷酸通过来自与另一个核苷酸上的3’碳结合的一个核苷酸的磷酸基连接而形成，在一个模块的各个末端与另一个分子的末端之间形成磷酸二酯键。以这种方式，就本发明而言，编码所述至少两个模块，优选所有三个模块的上述DNA分子以DNA分子的形式连接在一起。一旦在框内克隆，然后就将这样的重组DNA分子转录到其编码所述蛋白质、多肽或酶分子的相应的RNA核酸序列中。

可选地，至少两个模块，优选所有三个模块也可以通过化学共轭物共价连接。因此，如下面将进一步更详细地概述的，RNA分子的模块可以单独地化学合成，并且随后如上面所概述的通过磷酸二酯键以共价键连接。

在下文中，描述了相对于编码区(a)的本发明的UTR模块(b)和/或(c)的优选排列，其中UTR模块(b)(对应于上文定义的CYBA mRNA的5’UTR片段)位于编码区的上游(即在编码区的5’末端)和/或UTR模块(c)(对应于上述定义的CYBA mRNA的3’UTR)位于编码区的下游(即在编码区的3’末端)。

因此，在优选的实施方式中，根据前述内容，本发明涉及RNA分子，其包含(a)编码多肽的编码区；和(b)一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：1所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：1相比显示1至4个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子，其中(a)中的所述编码多肽的编码区不是如上述本文所定义的编码细胞色素b-245α多肽(CYBA)的编码区并且其中如(b)中定义的所述UTR(一个或多个)位于如(a)中定义的编码区的5’末端。

在优选的实施方式中，根据前述内容，本发明涉及RNA分子，其包含(a)编码多肽的编码区；和(c)一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包括含有SEQID NO：2的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子，其中(a)中的所述编码多肽的编码区不是如上述本文所定义的编码细胞色素b-245α多肽(CYBA)的编码区并且其中如(c)中定义的所述UTR(或多个)位于如(a)中定义的编码区的3’末端。

在优选的实施方式中，根据前述内容，本发明涉及RNA分子，其包含(a)编码多肽的编码区；和(b)一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：1所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：1相比显示1至4个取代，并且其导致具有与包括含有SEQID NO：1的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子；和(c)一个或多个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子，其中(a)中所述编码多肽的编码区不是如上述本文所定义的编码细胞色素b-245α多肽(CYBA)的编码区并且其中如(b)中所定义的所述UTR(一个或多个)位于(a)中所定义的所述编码区的5’末端和其中如(c)中定义的所述UTR(一个或多个)位于如(a)中定义的编码区的3’末端。

在优选的实施方式中，根据前述内容，本发明涉及RNA分子，其包含(a)编码多肽的编码区；和(b)一个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：1所示的序列或这样的序列，其与SEQ IDNO：1相比显示1至4个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：1的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子；和(c)两个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子；其中(a)中的所述编码多肽的编码区不是如上述本文所定义的编码细胞色素b-245α多肽(CYBA)的编码区并且其中所述RNA分子包含在如(a)中所定义的编码区的5’末端处如(b)中定义的所述一个UTR，并且其包含在如(a)中定义的编码区的3’末端处如(c)中定义的所述两个UTR。

在优选的实施方式中，根据前述内容，本发明涉及RNA分子，其包含(a)编码多肽的编码区；和(c)两个UTR，所述UTR包含SEQ ID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ IDNO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子，其中(a)中的所述编码多肽的编码区不是如上述本文所定义的编码细胞色素b-245α多肽(CYBA)的编码区并且其中所述RNA分子包含在如(a)中定义的编码区的3’末端处(c)中定义的所述两个UTR。

如上所述，本发明的RNA分子也可以包含聚腺苷酸尾。如本文所用，聚腺苷酸尾涉及位于RNA的3’末端的腺嘌呤核苷酸序列。聚腺苷酸尾通常通过称为聚腺苷酸化的过程添加到RNA的3’末端。因此，本发明涉及任何上述RNA，其中所述RNA分子包含在3’末端的聚腺苷酸尾。

聚腺苷酸尾的长度没有特别的限制。然而，在优选的实施方式中，本发明的RNA分子包含在3’末端的聚腺苷酸尾，其中聚腺苷酸尾具有至少50、60、70、80、90、100或110个核苷酸的长度。在更优选的实施方式中，本发明的RNA分子包含在3’末端的聚腺苷酸尾，其中聚腺苷酸尾具有至少120个核苷酸的长度。在其它优选的实施方式中，本发明的RNA分子包含在3’末端的聚腺苷酸尾，其中聚腺苷酸尾具有至少150、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸的长度。

如果本发明的RNA分子是通过本文下面进一步描述的体外转录方法产生的，则聚腺苷酸尾位于邻近RNA构建物的3’末端的UTR的RNA的3’末端，而包含本发明的RNA分子的质粒在聚腺苷酸尾下游的体外转录之前被线性化，以确保体外转录的RNA分子含有所述聚腺苷酸尾。

根据本发明的构建物可以不仅包括上述三个主要模块(a)、(b)和/或(c)。相反，可能期望在各个模块之间放置(a)连接体部分/多个连接体部分和/或(a)多克隆位点(一个或多个)，其可以例如便于构建物的构建。合适的连接体部分和多克隆位点是技术人员已知的。

优选地，本发明的构建物包含源自质粒pVAX1(Invitrogen)的多克隆位点。如实施例部分中概述的所有构建物都来源于先前在WO2013/182683A1中描述的构建物pVAXA120。

与模块(a)(即，编码区域)相比，本发明的RNA分子内的UTR模块(b)和/或(c)的位置没有特别限制，并且因此在本发明的RNA分子的各个模块之间可存在不是主要模块(a)、(b)和/或(c)的部分的填充有一个或多个核苷酸G、A、U和/或C的间隔或间隙。

在该上下文中，“一个或多个核苷酸G、A、U/和或C”意指本发明的RNA分子的各个模块之间的间隔或间隙用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸G、A、U和/或C填充。在其它优选的实施方式中，本发明的RNA分子的各个模块之间的间隔或间隙用20、30、40、50、60、70、80、90、100或110或更多个核苷酸G、A、U和/或C填充。

然而，在优选的实施方式中，相对于模块(a)(即编码区)，在本发明的RNA分子内，UTR模块(b)或(c)直接邻近模块(a)的编码区的起始密码子定位，之间没有任何间隔或间隙，即直接在模块(a)的编码区的起始密码子的上游。

在另一个优选的实施方式中，相对于模块(a)(即，编码区域)，在本发明的RNA分子内，UTR模块(b)或(c)直接邻近模块(a)的编码区的终止密码子定位，之间没有任何间隔或间隙，即直接在模块(a)的编码区的终止密码子的下游。

在一个优选的实施方式中，相对于模块(a)(即，编码区域)，在本发明的RNA分子内，UTR模块(b)直接邻近模块(a)的编码区的起始密码子定位，之间没有任何间隔或间隙，即直接在模块(a)的编码区的起始密码子的上游，并且相对于模块(a)(即，编码区域)，在本发明的RNA分子内，UTR模块(c)直接邻近模块(a)的编码区的终止密码子定位，之间没有任何间隔或间隙，即直接在模块(a)的编码区的终止密码子的下游。

如上所述，RNA分子可以以模块(a)、(b)和/或(c)的融合RNA序列的形式存在，即通过杂合基因——通过组合至少两个编码所述模块的核苷酸序列而制备——的转录形成的(融合)RNA分子。通常，这是通过将cDNA克隆到允许整个RNA分子转录的表达载体中来完成的。已知用于制备融合构建物的多种方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生“编码”本发明的RNA分子的合成的双链核酸分子。这样的双链核酸分子(即DNA分子)在一条链上(即在编码链上)包含对应于本发明的RNA分子的DNA序列，因此“编码”本发明的RNA分子。换言之，当转录时，这样的双链核酸/DNA分子在链上包含遗传信息，如上面本文所定义的本发明的RNA分子。在本发明的上下文中，术语“编码(“coding”或“encoding”)”不是仅以其常规意义使用，即涉及编码蛋白质的基因的DNA(并且因此涉及可被翻译成多肽或蛋白质氨基酸序列的遗传信息)。相反，就本发明而言，在其中编码模块(a)、(b)和/或(c)的单个DNA序列被“融合”或连接成单个(嵌合)DNA分子的构建物中，构建物还包含不翻译成蛋白质的组分(即模块(b)和/或模块(c))。尽管如此，对应于模块(b)和/或模块(c)的DNA序列提供了本发明的UTR结构的信息，即“密码”，因此本发明中的术语“编码”还涉及UTR的遗传信息，如果例如存在于在一条链上包含本发明的RNA分子的双链核酸分子中，则UTR的遗传信息可以被表达，即转录。因此，本发明上下文中的术语“编码”，尽管通常仅用于涉及蛋白质的编码/表达，但应理解其方式为可将核酸分子转录成包含编码蛋白质或多肽(即模块(a))的部分和编码UTR(即模块(b)和/或(b))的部分的本发明的RNA分子，其中后者代表当表达时的最终产物，因为UTR不翻译成蛋白质或多肽。可以通过标准分子生物学技术将这种双链核酸插入表达载体中用于融合蛋白的生产(参见例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning,Alaboratory manual,2nd Ed,1989)。术语“载体”如本发明意义上的“表达载体”或“克隆载体”应理解为环状、双链的DNA单位，其在细胞内独立于染色体DNA复制并且其用作携带遗传物质进入细胞的载体，在细胞中它可以复制和/或表达(即转录成RNA并翻译成氨基酸序列)。含有外源DNA的载体被称为重组DNA。载体本身通常是DNA序列，其通常由插入物(即，不翻译成蛋白质的模块(b)和/或模块(c)和模块(a)编码区)和充当载体“骨架”的更大序列组成。本发明意义上的质粒最经常在细菌中发现，并用于重组DNA研究以在细胞之间转移基因，并且像这样如在本发明意义上使用的是“载体”的亚群。

因此，本发明还涉及编码本发明的RNA分子的核酸分子。

核酸是，例如编码本发明的RNA分子的三个主要模块中的两个(即，模块(a)和模块(b)或模块(c))的DNA。可选地，核酸，优选DNA，编码全部三个主要模块(即，模块(a)和模块(b)和模块(c))。本发明的上述核酸分子优选是重组核酸分子，但也可以包含天然存在的核酸分子。因此，本发明的核酸分子可以具有天然来源，合成的或半合成的。它可以包含DNA、RNA、锁核酸以及PNA，并且它可以是其杂化物。

对本领域技术人员显而易见的是，可以将调节序列添加至编码RNA分子的本发明的核酸分子。例如，可以使用允许诱导表达本发明的多核苷酸即RNA分子的启动子、转录增强子和/或序列。合适的诱导型系统是例如Gossen and Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992),5547-5551)和Gossen,Trends Biotech.12(1994),58-62所描述的四环素调节的基因表达或如Crook,EMBO J.8(1989),513-519所描述的地塞米松诱导的基因表达系统。

此外，所述核酸分子可以含有例如硫酯键和/或核苷酸类似物。所述修饰可用于稳定核酸分子抵抗细胞中的内切核酸酶和/或外切核酸酶。所述核酸分子可以从含有允许所述核酸分子在细胞中转录的嵌合基因的合适载体转录。在本发明的上下文中，所述核酸分子也可以被标记。用于检测核酸的方法在本领域是公知的，例如Southern和Northern印迹、PCR或引物延伸。

本发明的核酸分子(一个或多个)可以是重组产生的嵌合核酸分子，其包含单独或组合的任何前述核酸分子。优选地，本发明的核酸分子是载体的部分。

因此，本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体。因此，本发明涉及载体，优选包含本发明的核酸的表达载体。

本发明的载体可以是例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或在基因工程中常规使用的另一个载体，并且可以包含另外的基因，如允许在合适的宿主细胞中和在合适的条件下选择所述载体的标记基因。

此外，除了编码本发明的RNA分子的核酸分子的序列之外，本发明的载体还可以包含表达控制元件，允许在合适的宿主中编码区的正确表达。这样的控制元件是本领域技术人员已知的，并且可以包括启动子、剪接盒、翻译起始密码子、用于将插入物引入载体的翻译和插入位点。优选地，本发明的核酸分子可操作地连接至允许在真核或原核细胞中表达的所述表达控制序列。因此，本发明涉及包含本发明的核酸分子的载体，其中当用载体转染真核和/或原核(宿主)细胞时，核酸分子可操作地连接至被宿主细胞识别的控制序列。

确保在真核和原核(宿主)细胞中表达的控制元件是本领域技术人员公知的。如上所述，它们通常包含确保转录起始的调控序列和任选地确保转录终止和转录物稳定化的聚腺苷酸信号。

然而，根据本发明，载体本身包含聚腺苷酸尾的序列并不重要。如上所述，如果本发明的RNA分子是通过本文下面进一步描述的体外转录方法产生的，则以上聚腺苷酸尾是本发明构建物的部分(并且不一定最初位于克隆载体上)，并且位于RNA的3’末端，邻近在RNA构建物的3’末端的UTR。如果本发明的RNA分子通过体外转录方法产生，则包含本发明的RNA分子的质粒在聚腺苷酸尾下游的体外转录之前线性化，以确保体外转录的RNA分子含有所述的聚腺苷酸尾。

另外的调控元件可以包括转录以及翻译增强子、和/或天然相关或异源的启动子区域。允许在例如哺乳动物宿主细胞中表达的可能的调控元件包含CMV-HSV胸苷激酶启动子、SV40、RSV启动子(Rous肉瘤病毒)、人延伸因子1α启动子、糖皮质激素诱导的MMTV启动子小鼠乳腺肿瘤病毒)、金属硫蛋白-或四环素-诱导型启动子或增强子，如CMV增强子或SV40-增强子。为了在神经细胞中表达，设想可以使用神经丝-、PGDF-、NSE-、PrP-或thy-1-启动子。所述启动子是本领域已知的，并且尤其在Charron,J.Biol.Chem.270(1995),25739-25745中被描述。为了在原核细胞中表达，已经描述了许多启动子，包括例如tac-lac启动子或trp启动子。除了负责转录起始的元件之外，这种调控元件还可以包含转录终止信号，例如多核苷酸下游的SV40-聚腺苷酸位点或tk-聚腺苷酸位点。在该上下文中，合适的表达载体是本领域已知的，如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-vitrogene)、pSPORT1(GIBCO BRL)、pX(Pagano,Science 255(1992),1144-1147)、酵母双杂交载体如pEG202和dpJG4-5(Gyuris,Cell 75(1995),791-803)或原核表达载体如λgt11或pGEX(Amersham-Pharmacia)。

此外，本发明的载体也可以是表达载体。本发明的核酸分子和载体可以设计用于直接引入或通过脂质体、病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)、电穿孔、弹道(例如基因枪)或其它递送系统引入细胞。另外，杆状病毒系统可以用作本发明的核酸分子的真核表达系统。

本发明还涉及包含本发明的载体的宿主细胞。因此，本发明涉及用本发明的载体转染或转化的宿主或携带本发明的载体的非人宿主，即宿主细胞或宿主，其通常用根据本发明的核酸分子或包含这种核酸分子的载体进行遗传修饰。术语“遗传修饰”是指宿主细胞或宿主除了其天然基因组之外还包含根据本发明的核酸分子或载体，其被引入细胞或宿主中或其前辈/亲本之一中。核酸分子或载体可以作为基因组外的独立分子，优选作为能够复制的分子存在于遗传修饰的宿主细胞或宿主中，或者它可以稳定整合到宿主细胞或宿主的基因组中。用根据本发明的载体转化宿主细胞可以通过标准方法进行，例如Sambrook andRussell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold SpringHarbor,NY,USA；Methods in Yeast Genetics,A Laboratory Course Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,1990中所描述的。宿主细胞在满足使用的特定宿主细胞的要求——特别是在pH值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、微量元素等方面——的营养培养基中培养。

本发明的宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。合适的原核细胞是通常用于克隆的那些，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。此外，真核细胞包含例如真菌或动物细胞。合适的真菌细胞的实例是酵母细胞，优选酵母属的那些，最优选酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)种的那些酵母细胞。合适的动物细胞例如是昆虫细胞、脊椎动物细胞，优选哺乳动物细胞，如例如，HEK293、NSO、CHO、COS-7、MDCK、U2-OSHela、NIH3T3、MOLT-4、Jurkat、PC-12、PC-3、IMR、NT2N、Sk-n-sh、CaSki、C33A。本领域已知的其它合适的细胞系可以从细胞系保藏库获得，例如Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)或American Type Culture Collection(ATCC)。根据本发明，进一步设想原代细胞/细胞培养物可以起到宿主细胞的作用。所述细胞特别源自昆虫(如物种果蝇或蠊的昆虫)或哺乳动物(如人、猪、小鼠或大鼠)。所述宿主细胞还可以包含来自和/或衍生自细胞系如神经母细胞瘤细胞系的细胞。上面提到的原代细胞在本领域中是公知的，尤其包括原代星形细胞、(混合的)脊椎培养物或海马培养物。

本发明还涉及通过在培养基中培养包含编码本发明的各个模块或本发明的整个RNA分子的表达载体的宿主细胞，并从宿主细胞或培养基回收RNA分子而产生本发明的RNA分子的方法。本发明还涉及用于产生本发明的RNA分子的方法，其包括培养本发明的宿主细胞并任选地从培养物中回收RNA分子。回收和/或随后纯化本发明的RNA分子的方法是本领域技术人员已知的。

本发明还涉及通过本领域技术人员已知的方法在体外反应中产生本发明的RNA分子的方法。更具体地，本发明的RNA分子可以使用体外转录系统在体外产生。体外转录系统通常是已知的，并且通常需要含有“编码”如上面所概述的模块(b)和/或模块(c)的DNA序列的纯化的线性DNA模板，其中所述DNA序列处于合适的启动子的控制之下。而且，体外转录系统通常还需要核糖核苷三磷酸、包括DTT和镁离子的缓冲系统、以及合适的RNA聚合酶——其为将DNA序列体外转录成本发明的RNA分子提供酶活性。

通常用于使用体外转录产生RNA分子的方法是本领域技术人员熟知的，并且例如在Methods Mol.Biol.703(2011):29-41中描述。

如上所述，如果本发明的RNA分子是通过如本文在下面进一步描述的体外转录方法产生的，则上述聚腺苷酸尾可以是本发明的构建物的部分(并且不一定最初位于克隆载体上)并且位于RNA的3’末端，邻近RNA构建物的3’末端的UTR。如果本发明的RNA分子通过体外转录方法产生，则包含本发明的RNA分子的质粒在聚腺苷酸尾下游的体外转录之前线性化，以确保体外转录的RNA分子含有所述的聚腺苷酸尾。

可选地，本发明的RNA分子也可以化学合成，例如通过使用固相载体和标准技术在自动化核苷酸序列合成仪上常规化学合成。

本发明还涉及通过本领域技术人员已知的和如上所述的方法在体外反应中产生本发明的RNA分子并从反应中回收RNA分子的方法。

回收和/或随后纯化本发明的RNA分子的方法是本领域技术人员已知的。

如上所定义的RNA分子在医学环境中和在某些疾病的治疗中，特别是在基于RNA的治疗中特别有用。因此，本发明还涉及包含本发明的RNA分子、本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的宿主细胞和任选地药学上可接受的载体的药物组合物。

术语“治疗”等在本文中用于通常意指获得期望的药理学和/或生理学效果。因此，本发明的治疗可以涉及某种疾病的(急性)状态的治疗，但是也可以涉及就完全或部分预防疾病或其症状而言的预防性治疗。优选地，术语“治疗”应理解为在部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不利作用和/或症状方面是治疗性的。在这方面，“急性”意指着受试者表现出疾病的症状。换言之，待治疗的受试者实际上是需要治疗的，在本发明的上下文中术语“急性治疗”涉及在疾病的发作或疾病的爆发之后实际治疗疾病采取的措施。治疗也可以是预防性(prophylactic)或预防性(preventive)治疗，即为预防疾病而采取的措施，例如为了预防感染和/或疾病的发作。

本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的多种施用形式施用。施用可以全身、局部、口服、通过气雾剂，包括但不限于片剂、针注射、使用吸入器、乳膏、泡沫、凝胶、洗剂和软膏。

如上所述，本发明涉及药物组合物，其包含有效量的根据上述的本发明的RNA分子(或核酸分子、载体或宿主细胞)和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。

赋形剂或载体是与活性成分(即，根据上述的本发明的构建物)一起配制的无活性物质，用于加大(bulking-up)含有有效活性成分的制剂的目的。赋形剂通常被称为“填充剂”、“填料”或“稀释剂”。当生产剂型时，加大(bulking up)允许方便和准确地分配药物。它们还可以用于各种治疗增强目的，如促进药物吸收或溶解度，或其它药物代谢动力学考虑。赋形剂在制造过程中也是有用的，除了有助于体外稳定性如在预期的保存期限内防止变性，还通过促进粉末流动性或不粘性，有助于处理所涉及的活性物质。适当赋形剂的选择还取决于给药途径和剂型、以及活性成分和其它因素。

因此，与上述一致，包含有效量的本发明的核酸的药物组合物可以是固体、液体或气体形式，尤其可以是(一种)粉末形式(或多种)、(一种)片剂(或多种)、(一种)溶液(或多种)或(一种)气雾剂(或多种)。优选，所述药物组合物任选地包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。

合适的药物载体、赋形剂和/或稀释剂的实例在本领域中是公知的，并包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂如油/水乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含这种载体的组合物可以通过众所周知的常规方法配制。这些药物组合物可以以合适的剂量，即以本领域技术人员通过本领域已知的方法可以容易地确定的“有效量”施用给受试者。给药方案将由主治医师和临床因素决定。如在医学领域中众所周知的，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者或受试者的大小、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康、和同时施用的其他药物。

因此，优选地，本发明的构建物以有效量被包括。术语“有效量”是指足以在将要施用药物组合物的受试者中诱导可检测的治疗应答的量。根据上述，药物组合物中本发明的构建物的含量不受限制，只要其可用于如上所述的治疗即可，但是优选含有每个总组合物按重量计0.0000001-10％。此外，本文所述的构建物优选用于载体中。通常，在载体中使用适量的药学上可接受的盐以使组合物等渗。载体的实例包括但不限于盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。优选地，可接受的赋形剂、载体或稳定剂在所用的剂量和浓度下是无毒的，包括缓冲剂如柠檬酸盐、磷酸盐和其它有机酸；成盐抗衡离子，例如钠和钾；低分子量(>10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白或明胶；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬酰胺、精氨酸或甘氨酸；碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；单糖；二糖；其他糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；螯合剂，例如EDTA；非离子表面活性剂，例如吐温、Pluronics或聚乙二醇；抗氧化剂，包括甲硫氨酸、抗坏血酸和生育酚；和/或防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)。合适的载体及其制剂在Remington'sPharmaceutical Sciences,17th ed.,1985,Mack Publishing Co中被更详细地描述。

治疗进展可以通过定期评估来监测。本发明的RNA分子或本发明的药物组合物可以在无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液以及乳膏和栓剂中。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。也可以存在防腐剂和其它添加剂，如，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，取决于药物组合物的预期用途，本发明的药物组合物可以包含另外的剂。所述剂可以是，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯，市场上可得，具有商品名Tween、丙二醇、EDTA、柠檬酸盐、蔗糖以及适用于药物组合物预期用途的其它剂，其对本领域技术人员是熟知的。

根据本发明，术语“药物组合物”涉及用于施用于患者，优选人类患者的组合物。

本发明的药物组合物可以用于基于RNA的治疗。如上所述，包含“编码多肽的编码区”的本发明的RNA分子可以用于基于RNA的治疗，其中“编码多肽的编码区”编码具有治疗或预防效果的治疗上或药学上有活性的多肽或蛋白质。因此，在优选的实施方式中，本发明的药物组合物可以用于上述表2中所述疾病的治疗或预防中的基于RNA的治疗。因此，根据本发明的基于RNA的治疗可以用于如上表2中所述的疾病的治疗或预防。

因此，本发明的药物组合物可以用于这些情况下基于RNA的治疗，其中上述表2中描述的基因缺陷导致可以随后通过用本发明的RNA分子的转录物替代疗法/酶替代疗法而治疗或预防的疾病，其中所述RNA分子包含“编码多肽的编码区”，其编码完整形式的蛋白质或其功能性片段，从而补偿所公开的缺陷基因。在特别优选的实施方式中，本发明的药物组合物可用于以下疾病的治疗或预防中的基于RNA的治疗：溶酶体疾病，如戈谢病、法布里病、MPS I、MPS II(亨特综合征)、MPS VI和糖原贮积病如例如糖原贮积病I型(von Gierecke’s病)、II型(庞培氏病)、III型(柯里氏病、IV型(安德森病)、V型(麦卡德尔病、VI型(Hers病)、VII型(Tauri’s病)、VII型、IX型、X型、XI型(Fanconi-Bickel综合征)、XI型或0型。转录物替代疗法/酶替代疗法有益地不影响潜在的遗传缺陷，但是增加患者缺乏的酶的浓度。作为实例，在庞培氏病中，转录物替代疗法/酶替代疗法替代缺乏的溶酶体酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)。

在其他优选的实施方式中，本发明的药物组合物可以用于根据本发明的基于RNA的治疗，其中“编码多肽的编码区”编码具有治疗或预防效果的治疗上或药学上有活性的多肽、蛋白或肽，其中所述多肽、蛋白质或肽选自由表2中概述的基因编码的群组。

在其它优选的实施方式中，根据本发明的基于RNA的治疗可以用于治疗癌症、心血管疾病、病毒感染、免疫功能障碍、自身免疫性疾病、神经障碍、遗传代谢性疾病或遗传病或任何疾病——其中细胞中产生的蛋白质或蛋白质片段可对患者(patent)具有有益效果。癌症的例子包括头颈癌、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、骨癌、脑癌、宫颈癌、直肠癌、结肠癌、结直肠癌、阑尾癌、眼癌、胃癌、白血病、淋巴瘤、肝癌、皮肤癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、阴道癌、外阴癌、子宫内膜癌、贲门癌和肉瘤。

心血管疾病的实例包括动脉粥样硬化、冠状动脉心脏病、肺心病和心肌病。

免疫功能障碍和自身免疫疾病的实例包括但不限于，风湿性疾病、多发性硬化和哮喘。

病毒感染的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒以及乙型和丙型肝炎病毒的感染。

神经障碍的实例包括但不限于帕金森病、多发性硬化症和痴呆。

遗传代谢性疾病的实例包括但不限于戈谢病和苯丙酮尿症。

本发明还涉及基于RNA的治疗的方法。因此，本发明涉及通过基于RNA治疗的疾病诸如癌症、心血管疾病、病毒感染、免疫功能障碍、自身免疫性疾病、神经障碍、遗传代谢性疾病或遗传病的治疗方法。关于治疗方法的优选实施方式，加以必要的修改同样适用，如上文在用于如上所定义的基于RNA的治疗的RNA分子或药物组合物的上下文中所阐述的。

在本发明中，在优选的实施方式中，受试者是哺乳动物，如狗、猫、猪、牛、绵羊、马、啮齿动物例如大鼠、小鼠和豚鼠、或灵长类例如大猩猩、黑猩猩和人。在最优选的实施方式中，受试者是人。

本发明还涉及包含本发明的RNA分子、本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的宿主细胞的试剂盒。关于优选的实施方式，加以必要的修改同样适用，如上文在根据本发明的RNA分子、核酸分子、载体或宿主细胞的上下文中所阐述的。有利的是，本发明的试剂盒进一步包含任选的(一种)缓冲剂(或多种)、贮存溶液和/或进行上面和下面的用途和方法所需的剩余试剂或材料。此外，本发明的试剂盒的部分可以单独包装在小瓶或瓶子中，或者组合在容器或多容器单元中。本发明的试剂盒尤其可以有利地用于实施本发明的方法、本发明的RNA分子的制备，并且可以用于本文提及的多种应用，例如上面和下面所概述的用途。可以包括在试剂盒中的另一个组件是针对使用试剂盒的人的使用说明。试剂盒的制造优选遵循本领域技术人员已知的标准程序。

最后，本发明还涉及一个或多个UTR——所述UTR包含SEQ ID NO：1所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：1相比显示1至4个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ IDNO：1的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子；和/或一个或多个UTR——所述UTR包含SEQ ID NO：2所示的序列或这样的序列，其与SEQ ID NO：2相比显示1至7个取代，并且其导致具有与包括含有SEQ ID NO：2的UTR的RNA分子相同或更高的翻译效率的RNA分子——用于增加将RNA分子的编码区翻译成由上述编码区编码的多肽或蛋白质的效率的用途，如上面所定义的。关于用途的优选实施方式，加以必要的修改同样适用，如上文在本发明的RNA分子的上下文中所阐述的。

图1：A549细胞的荧光显微镜检查和流式细胞术数据。

(A)治疗性mRNA的示意图，由5’CAP、5’UTR、编码区、3’UTR和聚腺苷酸尾组成。

(B)在转染后24h以4倍放大(JULYTM)拍摄的荧光显微镜照片。与对照相比，所有构建物显示出改善的蛋白质表达水平。

(C)由FC确定的d2EGFP阳性细胞的百分比对于所有构建物是相似的。碘化丙啶用于检测死细胞。应用的门确保排除死细胞和未转染的细胞。

(D)转染后48h，与对照相比，稳定化的构建物的持续的蛋白质表达更高。

图2：通过FC确定的A549细胞(A)和Huh7细胞(B)的蛋白质表达的时程。在对数线性图中对时间绘制标准化到对照的平均荧光强度。随着转染后时间的增加，稳定化的构建物的升高的蛋白质表达水平变得越来越明显。分别对应于对照、5’UTR和3’UTR构建物以及对应于构建物5’+3’、5’+2×3’和2×3’的条被画上不同的阴影，如图的右侧所示。

图3：用于平行单细胞测定以测试不同稳定化的mRNA构建物的微结构多通道载玻片。

(A)细胞粘附，具有两者之间细胞排斥的PEG区域的微结构蛋白质图案允许有序的细胞排列。荧光标记的纤连蛋白用于使微图案可视化。

(B)微通道内附着于纤连蛋白图案的荧光A549细胞(接种后3小时)。

(C)mRNA脂转染的示意图(左侧)和我们的分析解决方案下面的反应方案(右侧)。

(D)A549细胞中mRNA介导的d2EGFP表达的示例性时程。黑线代表了对理论翻译模式的拟合(fit)。

图4：具有构建物图示的表达速率K、mRNA寿命和d2EGFP寿命的分布以及相应的平均值。

(A)表达速率K的分布，表达速率K是mRNA分子的初始数量和翻译速率的乘积。分布形状相似的事实指示转染动力学和翻译速率非常相似。

(B)mRNA半衰期的分布在其宽度上显示出很大的变化。作为对眼睛的指导，虚线指示对照的平均半衰期。

(C)d2EGFP半衰期的分布。如预期的那样，不同构建物的分布被类似地成形并显示可比较的平均值。作为眼睛的指导，基于所有测量的半衰期的d2EGFP的总体平均半衰期以虚线显示。

(D)拟合率(fitted rate)的平均值和相应的标准偏差(std)。虽然对照构建物在两种细胞类型中均产生高的平均K值，但是与稳定化的构建物相比，该构建物的短的mRNA半衰期导致小的AUC值。这可以在图6中看到。构建物的示意图可以在右侧看到。所有构建物具有相同的5’帽和聚腺苷酸尾。分析来自895个单个A549和1355个Huh7细胞的数据。

图5：不同构建物的主曲线。将具有起始时间的A549(A)和Huh7(B)细胞的群体平均数移至零。深灰色、中灰色和浅灰色曲线分别对应于对照/5’UTR/3’UTR构建物。曲线对应于如在右侧相应指示的构建物。

图6：不同构建物的AUC和mRNA寿命延长因子。

(A)AUC的示意图，说明mRNA翻译与mRNA和蛋白质降解之间的相互作用(interplay)。

(B)和(C)不同构建物的AUC，如针对t→∞所分析的。十字显示不同实验的相对AUC，这些条对应于所有单细胞AUC的平均值。

(D)和(E)mRNA寿命延长因子。与对照相比，所有修饰导致延长的mRNA寿命。在A549(D)和Huh7(E)细胞中观察到类似的趋势。(D)和(E)中的误差条表示标准偏差。

图7：Huh7细胞的荧光显微镜检查和流式细胞术数据。

(A)在转染后24h以4倍放大(JULYTM)拍摄的荧光显微镜照片。与对照相比，所有构建物均显示出改善的蛋白质表达水平。

(B)由FC确定的d2EGFP阳性细胞的百分比对于所有构建物是相似的。碘化丙啶用于检测死细胞。应用的门确保排除死细胞和未转染的细胞。

(C)转染后48h，与对照相比，稳定化的构建物的持续的蛋白质表达更高。

图8：在A549和Huh7细胞中通过qRT-PCR测定mRNA半衰期。

根据材料和方法部分中所述的方案转染细胞。在A549(参见图8A)和Huh7(参见图8B)中测定了所有mRNA构建物在4、8、24、36、48、60、72小时的绝对mRNA定量。从该数据中计算了mRNA的半衰期。将物理半衰期标准化到对照。

图9：微结构基底上的转染效率。

借助LipofectamineTM2000或DOGTOR的帮助用SNIM RNA转染的A549细胞和Huh7细胞的转染细胞的百分比和相应的标准偏差。发现用LipofectamineTM2000转染的细胞的转染效率更高。

图10：直接测量的d2EGFP半衰期的分布。

(A)Huh7细胞中放线菌酮诱导的d2EGFP降解的示例性时程。黑线是蛋白质降解的简单指数拟合。

(B)在A549细胞中测量的d2EGFP半衰期的分布，产生2.46h(标准偏差0.71h)的平均半衰期。(C)在Huh7细胞中测量的d2EGFP半衰期的分布，产生4.04h(标准偏差1.82h)的平均半衰期。

图11：单细胞AUC的分布。根据下面的等式3计算AUC。A549数据显示在左栏中，Huh7数据显示在右栏中。

图12：具有表5中所示的不同基因的UTR的构建物#2至(o)#5与CYBA-UTR#1构建物的比较。

本发明的其他方面和优点将在以下实施例中描述，这些实施例是为了说明的目的而给出的，而不是为了限制。本申请中引用的每个出版物、专利、专利申请或其他文件在此以其全部通过引用并入。

实施例

I.材料和方法

质粒载体

将去稳定化增强型绿色荧光蛋白(d2EGFP)从pd2EGFP-N1(Clonetech)切除，并克隆到pVAXA120(3)中以产生pVAXA120-d2EGFP。基于之前公布的关于mRNA稳定性的数据，预选的CYBA基因的5’和3’UTR序列通过Eurofins MWG(德国)合成，并克隆在pVAXA120-d2EGFP中d2EGFP的上游(5’UTR)和/或下游(3’UTR或2×3’UTR)，由此产生具有各自UTR组合的构建物。

mRNA产生

为了产生体外转录的mRNA(IVT mRNA)，将质粒通过NotI消化在聚腺苷酸尾的下游线性化，并通过氯仿提取和乙醇沉淀来纯化。使用RiboMax大规模RNA生产系统-T7(Promega，德国)将纯化的线性质粒用作体外转录的模板。向反应混合物中加入抗反向帽类似物(Anti-Reverse Cap Analog)(ARCA)以产生5’加帽的mRNA。此外，为了产生SNIM mRNA，加入化学修饰的核苷酸即甲基-CTP和硫代-UTP(Jena Bioscience，德国)到ATP:CTP:UTP:甲基-CTP:硫代-UTP:GTP为7.57mM:5.68mM:5.68mM:1.89mM:1.89mM:1.21mM的的终浓度。将完全的IVT混合物在37℃温育2小时，随后在37℃下用DNasel消化DNA 20分钟。将RNA用乙酸铵(终浓度2.5M)沉淀，并用70％EtOH洗涤。洗涤步骤进行两次。最后，将RNA沉淀重新悬浮在无RNA酶的水中。在1％琼脂糖凝胶上验证所有的mRNA。示例性mRNA构建物的图示可以在图1A中看到。UTR的确切序列上面表1下面的文本中给出。

表3：二级结构(mfold)

在表3中，列出了mRNA构建物的特征，如在两个末端和在UTR内发现的最小自由能(free minimum energy)(ΔG)和二级结构。折叠平台mfold被用来预测mRNA二级结构(40)。对于每个构建物，我们比较了八个具有最高自由能的二级结构。预测2x3’UTR和3’UTR构建物的最高自由能值。除了与编码序列(cds)结合的对照构建物外，每个mRNA构建物的5’末端部分地与3’UTR或5’UTR结合。有趣的是，2x3’mRNA构建物的5’末端与其自身形成稳定的发夹。然而，5’末端附近的发夹环也可以阻碍蛋白质翻译(41)。在3’UTR和5’+3’UTRmRNA构建物的3’末端中发现另一个特征：在那里，3’末端与5’末端结合，使彼此的距离最小化，因此赋予更快的翻译开始。与5’UTR不同，每个mRNA构建物的3’UTR与其自身形成至少一个发夹。

流式细胞术(FC)

实验设置看起来如下：在96孔板中每孔接种150μL培养基中的20,000个细胞并在接种后24小时转染。使用市售转染试剂Lipofectamine^TM2000以5pg mRNA/细胞的剂量转染细胞。以每1μg mRNA 2.5μl Lipofectamine^TM2000的比制备复合物。为了形成脂复合物(lipoplexes)，Lipofectamine^TM2000和mRNA分别在OptiMEM转染培养基中分别以50μl的总体积稀释。将这些混合物在室温温育5分钟。然后将mRNA溶液与Lipofectamine^TM2000溶液混合，之后在室温再温育20分钟。温育后，将900μl OptiMEM加入到脂复合物溶液中。最后，将50μl的复合物溶液加入到细胞中并温育1小时。对于每种mRNA构建物，制备生物学一式三份。温育后，弃去脂复合物溶液，并向每个孔中加入新鲜的150μl培养基。使用FC在8、24、36、48、60和72小时后测量d2EGFP表达。在这些时间点的每个时间点拍摄荧光显微镜图像。对于FC测量，弃去细胞培养基，用1×DPBS(Gibco Life Technology)洗涤细胞。随后，每孔加入20μl TrypLE Express(Gibco Life Technology)，并在37℃温育5分钟。通过加入补充有2％FBS的80μl 1xPBS中和反应。通过移液将细胞混合，并转移到适合于流式细胞计数测量的96孔板中。最后，每孔加入5μl碘化丙啶(终浓度1μg/ml)，并用Attune Auto Sampler(Applied Biosystems)测量。在用JULY^TM显微镜进行FC分析之前拍摄荧光图像。

定量实时PCR

使用qRT-PCR分析在A549和Huh7细胞中以4、8、24、36、48、60和72小时的时间间隔测定d2EGFP mRNA量。此外，mRNA表达动力本身用于计算每个UTR的mRNA半衰期。这里，细胞类似于上述方案转染(见FC)。发现200.000个细胞/孔的细胞密度足以进行RNA分离。根据制造商的方案使用NucleoSpin RNA(Macherey Nagel)进行RNA分离。通过分光光度测量和凝胶分析检查分离的总RNA的RNA浓度和质量。此外，使用来自第一链cDNA合成试剂盒(ThermoScientific)的Oligo(dT)，将0.5μg每种UTR构建物和对照的总RNA用于cDNA合成。用125nM的每种d2EGFP-Primer(正向引物：5’-CAA CCA CTA CCT GAG CAC CC-3’(SEQ ID NO:3)；反向引物：5’-GTC CAT GCC GAG AGT GAT CC-3’(SEQ ID NO:4))，使用SsoAdvanced^TMUniversal

Green Supermix(BioRad)测试相等量的cDNA(1:50稀释)。作为绝对定量的标准，将由IVT生产的纯d2EGFP mRNA用于cDNA的合成。绝对的mRNA定量在Lightcycler96装置(Roche)上进行。

表面图案化和样品制备

通过在作为衬底的顶部(ibidi GmbH)上的选择性氧等离子体处理(FemtoDiener，40W，3分钟)和随后的钝化来生产微结构表面。使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)印模(由光刻法制造的母版浇铸(cast from a master))作为掩模来实现选择性。暴露于等离子体的部分通过与含水缓冲液(10mM HEPES pH 7.4和150mM NaCl)中以1mg/ml浓度的PLL(20k)–g(3.5)-PEG(2k)温育30分钟而被钝化。之后，用PBS冲洗样品，去除PDMS印模。然后将箔片固定到粘性的六通道载玻片(粘性μ-载玻片VI)。每个通道装满50μg/ml纤连蛋白的PBS溶液1小时，以使剩余的部分细胞粘附。用PBS彻底冲洗探针三次。细胞接种前将样品在室温下储存在细胞培养基中。对于该研究，使用30μm×30μm的正方形粘附位点，因为这个大小对于A549以及Huh7细胞的单细胞粘附是合理的。细胞以每个通道10,000个细胞的密度接种，以使得每个细胞粘附岛上可以粘附大致一个细胞。为了获得如图3A所示的荧光微图案，使用了与Alexa Fluor 488缀合的20μg/ml纤连蛋白和30μg/ml纤维蛋白原的混合物。

材料

FBS、Leibovitz’s L-15培养基(Gibco)、Lipofectamine^TM2000和OptiMEM(Gibco)购自德国Invitrogen。无菌PBS在内部制备。Ham’s F-12K、DMEM和胰蛋白酶-EDTA购自德国c.c.pro GmbH。通道载玻片购自德国ibidi。纤连蛋白购自瑞典Yo Proteins。PLL-g-PEG购自瑞士SuSoS AG。Alexa Fluor 488购自德国Life Technologies。质粒pd2EGFP-N1购自德国BD Biosciences Clontech。

细胞培养

使人肺泡腺癌细胞系(A549，ATCC CCL-185)在补充有10％FBS的Ham's F12K培养基中生长。将人肝细胞瘤上皮细胞系(Huh7,JCRB0403,JCRB Cell Bank,日本)在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。所有细胞系在5％CO₂水平的潮湿气氛中生长。

体外转染

转染前三小时，将每通道10,000个细胞接种在6通道载玻片中。使用市售转染试剂Lipofectamine^TM2000以每1μg mRNA 2.5μl Lipofectamine^TM2000的比以5pg mRNA/细胞的剂量转染细胞。如下制备复合物形成物：将Lipofectamine^TM2000和mRNA分别稀释在OptiMEM转染培养基中各总计达45μl的总体积。这些混合物在室温下温育5分钟。然后将Lipofectamine^TM2000溶液与mRNA溶液混合，然后在室温下再温育20分钟。请注意，微通道在所有后续冲洗步骤中都不会是空的：即刻转染之前，将细胞用PBS洗涤。最后，将含有不同mRNA构建物的脂复合物溶液填充到六个通道中。因此可以在相同的实验条件下测量所有五种不同的mRNA构建物加参考构建物。将细胞在37℃(5％CO₂水平)以90μl的总转染体积温育1小时。此后除去转染培养基，并用PBS洗涤细胞。随后，将细胞与含有10％FBS的Leibovitz's L-15培养基重新温育。在显微镜监测d2EGFP表达之前，将一滴防蒸发油(德国ibidiGmbH)加入到每个培养基储液器的顶部。

数据获得和定量图像分析

在配有物镜(CFI PlanFluor DL-10×,Phase1,N.A.0.30；Nikon)和温度控制的显微镜载物台安装架的机动倒置显微镜(Nikon,Eclipse Ti-E)上进行活细胞成像。我们使用带有温度控制器的ibidi加热系统(Ibidi GmbH，德国)在整个测量中将样品温度稳定在37℃(±2℃)。为了获取细胞图像，我们使用冷却的CCD照相机(CLARA-E,Andor)。使用汞光源(C-HGFIE Intensilight,Nikon)进行照明，并且使用具有滤光片组41024(ChromaTechnology Corp.,BP450-490,FT510,LP510-565)的滤光片立方体用于d2EGFP检测。照明快门控制被用来防止漂白。转染后至少25小时，以10倍的放大倍数以600ms的恒定曝光时间以10分钟的间隔拍摄图像。将荧光图像合并成单图像序列文件。单细胞表达动力学的特征参数的定量分析允许在表达效率和稳定性方面比较各种载体的性能。图像分析由几个步骤组成，并使用基于ImageJ的内部开发的软件完成。首先，矩形网格与原来的延时电影叠加，并调整到下面的细胞模式的大小和方向。接下来，软件通过读出所有正方形的荧光强度来自动检测表达d2EGFP的细胞。未被占用的正方形被用于背景校正。该软件计算细胞在整个序列上的荧光，并将相应的强度与每个细胞荧光的时程连接起来。最后，提取每个正方形的单细胞荧光强度。

然后如最近所述通过使用IgorPro软件将每个时程与mRNA-诱导的蛋白质表达的分析溶液进行拟合来分析数据(参见等式1)，IgorPro软件是mRNA和d2EGFP的微分方程的解决方案(solution)，

在图3C中描绘了假设用于mRNA诱导的蛋白质表达的基本简单化的模型的图示。

II.实施例1：通过流式细胞术(FC)的荧光显微镜检查和分析

为了评价不同UTR组合对转基因表达动力学的影响，使用LipofectamineTM2000和含有5’UTR单独、3’UTR、5’+3’UTR、3’UTR的两个拷贝和5’+2×3’UTR的不同d2EGFPmRNA构建物转染两种不同的细胞系。图1A中可以看到所有构建物的构造单元的图示。

在转染后三天的不同时间点，使用FC定量d2EGFP表达。图1C中显示了t＝24h的示例性点图，显示了活的A549细胞的d2EGFP表达水平(参见图7B中相应的Huh7数据)。另外，我们使用荧光显微镜对细胞成像(参见图1B和D以及图7A和C)。转染后24小时证实了所有mRNA构建物的可比较的转染效率(图1B和图8A)。由此，可以排除差异转移效率成为观察到的表达动力学差异的因果因素。基于荧光显微镜检查图像，在转染后48小时检测到所有构建物的d2EGFP表达的显著降低(参见图1B和D、图7A和C)。然而，对于所有UTR稳定化的mRNA，发现相对于对照的更高的EGFP表达水平。更具体地，含有3’UTR的mRNA构建物似乎比没有3’UTR的构建物的表达增强。这针对A549和Huh7细胞观察到(分别参见图1和图7)。在晚于48h的时间点，这种效果甚至更明显(数据未显示)。在图2A和B中，显示了两种细胞类型中所有构建物通过FC测定的平均荧光强度(MFI)的时程。

此处，在所有时间点，所有含UTR的mRNA构建物在两种细胞系中都显示比对照构建物更高的MFI值。总之，荧光显微镜检查和FC数据表明配备有CYBA UTR的mRNA分子显示超过24小时的持续d2EGFP表达。

III.实施例2：定量实时PCR

作为另外的方法进行qRT-PCR测量以确定不同构建物的“物理”mRNA半衰期。我们选择的引物与d2EGFP的结合发生在起始密码子下游600nt处。因此，物理mRNA半衰期的测量损害了完整的mRNA和已经被去帽但还没有被降解或者被去帽并降解至599碱基的那些mRNA。它还包括从翻译池中移出并存储在P体(29-32)中的mRNA。尽管完整的mRNA有助于d2EGFP表达，但是后者的去帽和/或部分降解的转录物组和P-体中的那些不会导致任何表达。与A549和Huh7细胞中的对照相比，测定物理mRNA半衰期没有显示UTR的任何显著的寿命延长(分别参见图8A和B)。有趣的是，在两种细胞系中反而观察到5’、3’、5’+2×3’和2×3’UTR构建物的mRNA物理半衰期减少。

在A549和Huh7细胞中通过qRT-PCR测定mRNA半衰期

在另一个实验中，用qRT-PCR研究了不同mRNA构建物的mRNA半衰期，这是常规方法(参见图8A和B)。因此，如本文所述转染mRNA构建物。最后，获得每个特定时间点的绝对mRNA量，并计算每种提供有UTR的mRNA的mRNA半衰期。观察到与对照相比，对任何选择的mRNA构建物没有显著的mRNA稳定化作用。

IV.实施例3：单细胞表达式阵列

如图3A和B所示的微结构的细胞粘附的基底被制造为单细胞延时显微镜检查的平台。

矩形方块用细胞外基质蛋白纤连蛋白功能化，而周围暗区用细胞排斥PLL-g-PEG钝化。细胞以适当稀释的细胞密度接种，使得约三小时后，细胞粘附到矩形方块。这种细胞自组织过程已经在(27)之前详细研究过。方块的大小是30μm，用于单细胞的最佳填充。方块之间的距离足够大(60μm)，以最小化同时粘附到一个以上方块的细胞的桥连作用。每个方块荧光信号的延时荧光显微镜检查和自动图像分析产生数百个单独的时程。图3D中显示了一组典型的背景校正的原始数据。黑线表示mRNA翻译的数学表达式的示例性拟合(也参见材料和方法部分)。如最近所述(26)通过使用IgorPro软件将每个时程与mRNA-诱导的蛋白质表达的分析解决方案拟合来分析数据，

这里，G表示蛋白质的量，K是表达速率，δ是mRNA降解速率，β是报道蛋白d2EGFP的降解速率。表达率K＝m₀·k₇₁是细胞内mRNA分子的初始量(m0)和翻译速率kTL的乘积。等式1描述的时程将在下面的部分“蛋白质表达的主曲线”中详细讨论。

V.实施例4：在细胞阵列上的体外转染

在典型的实验中，细胞在转染前被允许粘附到微图案3小时。六个微通道中的每一个填充有不同的脂复合物溶液，其含有感兴趣的构建物之一。在最初的实验中，我们比较了两种不同的市售转染试剂(即LipofectamineTM 2000和DOGTOR)。发现LipofectamineTM2000的转染效率高于DOGTOR(参见图9)。因为使用LipofectamineTM2000获得高于80％的另外获得的高细胞存活率(数据未显示)，所以所有进一步的转染实验都使用LipofectamineTM2000进行。由于mRNA介导的蛋白质表达在转染后不久开始，所以温育时间保持最小。因此，调节mRNA剂量与温育时间之间的比以实现高转染效率(也参见图9)以及由报道蛋白的过表达引起的可忽略的毒性效应。在5pg/细胞的mRNA剂量下，发现1小时的温育时间是最佳的。

微结构基底上的转染效率

评估成功转染的细胞的百分比以比较两种不同的转染剂，并确保转染效率不受微结构细胞生长的阻碍(参见图9)。在这里，所有细胞都在微结构蛋白质阵列上生长。与DOGTOR相比，我们获得了Lipofectamine^TM2000更高的转染效率。使用商业的活/死细胞活力测定(Molecular Probes，Germany)，我们发现高于80％的细胞存活率(数据未显示)。

VI.实施例5：表达速率

两种细胞类型的所有结果均基于在相同实验条件下的四次独立测量。已经分析了大约数千个A549细胞和数千个Huh7细胞的延时数据。获得的表达速率K的分布如图4A所示，相应的平均值可见于图4D。

发现平均表达速率和它们的分布形状对于不同构建物是相当相似的。

VII.实施例6；mRNA半衰期

我们根据

将拟合的mRNA降解速率δ转换成mRNA半衰期。

图4B分别显示了A549和Huh7细胞中不同稳定化的mRNA构建物的半衰期分布。在此，对于稳定化的构建物而言，变得明显的是，与参考构建物相比，基础分布的平均半衰期和广度增加。

图4D给出了所有确定的半衰期的概述。对于A549和Huh7细胞，我们发现与不含任何稳定化UTR的对照构建物(A549细胞5.8小时，Huh7细胞7.8小时)相比，UTR元件稳定的mRNA的半衰期更长。延长寿命的作用在A549细胞中更为明显。

VIII.实施例7：蛋白质半衰期

蛋白质(d2EGFP)降解寿命的分布呈现在图4C中。如预期的那样，所表达的蛋白质的半衰期对于不同的mRNA构建物不变。如图4D所示，测定的平均寿命范围为A549细胞4.2至4.9小时和Huh7细胞5.6至8.5小时。变异系数约为0.29(A549)和0.45(Huh7)，因此显著小于我们发现的在mRNA寿命上的分布的高达0.6的变异系数。作为对照，还测量了替代方法中的半衰期，其中翻译在转染后给定时间点t0加入放线菌酮而被抑制(参见图10)。在这种情况下，蛋白质表达被诱导一段时间然后停止。抑制后荧光的指数衰减产生蛋白质寿命。与没有抑制的上述实验相比，发现这些半衰期缩短了约两倍。然而，在两个实验中，Huh7细胞中的蛋白质寿命的相对比相对于A549细胞中的是相同的。

报道蛋白的降解速率

为了检查拟合的d2EGFP降解速率，在微结构的六通道载玻片中独立测量A549和Huh7细胞内的d2EGFP的降解速率。抗生素放线菌酮阻断蛋白质合成，干扰肽基转移酶活性(42)。监测单细胞荧光强度时程约20h(参见图10)。对照实验确保荧光强度的降低不是由于发色团的光漂白。单细胞时程通过单指数拟合来拟合，产生蛋白质降解速率的分布。发现A549细胞中的平均降解速率为0.28/h(标准偏差0.08/h)和Huh7细胞中的平均降解速率为0.17/h(标准差0.08/h)，分别相当于2.46h和4.04h的蛋白质寿命。虽然这些寿命显著短于通过mRNA介导的蛋白质表达的单细胞时程分析确定的寿命，但是Huh7和A549细胞内d2EGFP的平均寿命之间的比是相同的(4.04h/2.46h＝1.64，如通过与拟合mRNA表达的分析解决方案所测定的7.4h/4.5h＝1.64相比通过平移阻断所测量的)。

IX.实施例8：蛋白质表达的主曲线

如图5A(A549)和B(Huh7)所描绘的，mRNA诱导的蛋白质表达的特征在所谓的蛋白质表达的主曲线中变得明显。

主曲线是起始时间校正的单细胞痕迹的群体平均值，即所有的起始时间都转移到时间点零。如在参考文献(26)中之前所述，将荧光强度转换成d2EGFP的实际数目。在主曲线图中说明了3’和5’+3’稳定化的mRNA构建物的优越性质。这些构建物显示随着时间的蛋白质表达的最浅的减少，和因此与其他构建物相比最长的半衰期和更高的蛋白质表达值。

X.实施例9：曲线下面积(AUC)

在药物代谢动力学中，药物的总暴露被称为“曲线下面积”。基因治疗中的类似表达是人为表达的蛋白质随时间的量，即(表达对时间)曲线下面积(AUC)的积分。AUC是同时量化mRNA构建物的翻译效率和稳定性的手段。它可以解释为在mRNA上编码的蛋白质的累积时间剂量，因此描述了所选mRNA构建物的功效。考虑到生物化学速率模型(参见图3A)，可以明确计算AUC：

AUC＝0.48·m₀k_TL·τ_mBNA·τ_d:EGFP (等式3)

因此，最佳的治疗性mRNA构建物应该理想地具有长的mRNA，τmRNA，以及蛋白质半衰期，τd2EGFP，和高翻译效率，kTL。另外，决定治疗性mRNA初始量m0的转移效率与AUC成正比。蛋白质表达的理论时程和计算的AUC的说明性解释可以在图6A中看到。

如果没有蛋白质降解(β＝0)，则由于mRNA翻译和mRNA降解的平衡通量，细胞内蛋白质的量将达到稳态水平。在这种情况下，表达动力学遵循

对于δ等于零的情况以相似的方式也是如此。这与d2EGFP蛋白的持久指数衰减(遵循e^-β1)的叠加导致如图6A所示的AUC的特征性形状。图6B和C显示总的平均相对AUC以及标准化至对照的平均AUC的“每实验”相对AUC，后者是用对照构建物转染后蛋白质表达的AUC。在两种细胞类型中，对于3’UTR-和5’+3’UTR-稳定化的构建物发现最高的相对AUC。这与观察到的这些构建物的长半衰期是一致的，因为它们有助于AUC，如等式3中所见。详细的单细胞AUC分布可以在图11中找到。

更具体地，假设根据图3C的翻译和降解的生物化学速率等式(4)和(5)，mRNA转染后表达的蛋白质的量由

给出。

曲线下面积(AUC)通过积分来自t₀的表达水平G_d2EGFP(t)来计算，当表达式设置为长时间(t＞∞)时：

τ＝t-t₀。

使用τ_MHNA＝ln2/δ、τ_d2EGFP＝ln2/β和K＝m₀·k_TL获得等式3：

AUC＝0.48·m_θ·k_TL·τ_mRNA·τ_d2EGFP

G_d2EGFP(t)和AUC的时程在图6A中示意地描绘。

图11中可以看到实验单细胞AUC分布。由于AUC从mRNA和蛋白质寿命线性依赖，所以单细胞AUC分布与正文的图4B和4C所示的mRNA和蛋白质半衰期分布密切相关。

XI.实施例10：寿命延长因子

图6D和E分别显示A549和Huh7细胞的寿命延长因子。如所预期的，所有稳定化的构建物都产生高于1的寿命延长因子，这意味着在任一末端插入UTR都会导致mRNA稳定。然而，3’UTR mRNA构建物显示比2x3’UTR构建物更长的mRNA寿命。类似地，5’+3’UTR构建物比5’+2×3’构建物更稳定。这些结果适用于两种细胞类型。有趣的是，在所有情况下，A549细胞中的稳定效应比Huh7细胞显著地更明显。

XI.实施例11：与CYBA-UTR构建物相比，具有不同基因的UTR的构建物的比较

具有如下表4中所示的不同基因的UTR的构建物#2至#5已与CYBA-UTR构建物#1进行比较，以便在稳定性和生产力方面优化mRNA结构。基于具有长的mRNA半衰期的公开数据(Hoen et al.,2010)选择基因的五种不同的细胞UTR。这些细胞UTR是CYBA、DECR1、GMFG、MAPBPIP和MYL6B。从UTR数据库(http://utrdb.ba.itb.cnr.it/search)获得每个细胞基因的5’和3’非翻译区的序列，并将其克隆到5个不同的组合中，该组合是单独的5’UTR、单独的3’UTR、5’+3’UTR、5’+2×3’UTR和2×3’UTR。

首先，将非翻译区序列克隆到主链pVAX1-A120中。在5’UTR的情况下，通过5’末端的HindIII限制位点和3’末端的BamHI限制位点发生克隆，并插入编码Metridia萤光素酶(MetLuc)的报道基因的上游。3’UTR的限制位点是EcoRI(5’末端)和PstI(3’末端)，并被克隆到MetLuc的下游。含有单独的5’UTR和每种细胞UTR的5’+3’UTR的质粒由Eurofins MWGOperon生产。这些质粒通过电穿孔转化到大肠杆菌(DH10B)中。其他组合，包括单独的3’UTR、5’+2×3’UTR和2×3’UTR在内部被克隆。具有3’UTR的质粒的克隆通过HindIII(平端)和BamHI(平端)消化简单地切除出主链的5’UTR进行。通过将含有3’UTR(BamHI/PstI平端)的MetLuc插入到包含5’+3’UTR的pVAX1-A120MetLuc的主链中，从而替换MetLuc并在主链的各3’UTR的前面插入第二个3’UTR，来克隆含有5’UTR+2x3’UTR的构建物。最后，通过从含有5’+2×3’UTR的质粒中去除5’UTR(HindIII和BamHI，均为平端)来产生含有2×3’UTR的构建物。克隆后，电穿孔后在大肠杆菌(DH10B)中扩增所有质粒。

其次，通过体外转录产生化学修饰的mRNA。为此目的，质粒用XbaI消化而被线性化并用氯仿/乙醇沉淀而纯化。体外转录试剂盒(Promega)包括所需的T7聚合酶酶混合物以及合适的缓冲剂。该转录混合物还含有未修饰的核苷酸腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)、尿苷三磷酸(UTP)和胞嘧啶三磷酸(CTP)以及化学修饰的核苷酸甲基-CTP和硫代-UTP(JenaBioscience,GmbH,Jena,Germany)，具有7.13mM:1.14mM:5.36mM:5.36mM:0.536mM:0.536mM的ATP:GTP:UTP:CTP:甲基-CTP:硫代-UTP的终浓度。另外，将帽结构类似物ARCA(抗逆转帽类似物)加入到混合物中以确保在正确方向上包含5’-帽。最后，将线性化的DNA加入到反应混合物中。IVT混合物在37℃温育2小时。剩余DNA的消化通过加入DNA酶I并进一步在37℃再温育20分钟来进行。通过加入预先冷却的乙酸铵至终浓度2.5M进行RNA沉淀。用70％乙醇洗涤RNA沉淀。洗涤步骤进行两次。最后，RNA被重新悬浮在无RNA酶的水中。用分光光度计测量装置测定RNA浓度，并在琼脂糖凝胶上测试纯度。

在IVT之后，在两种不同的细胞系中，即在NIH3T3和A549中测试不同的mRNA。对于筛选实验，使用非病毒核酸递送系统，如脂转染(lipofection)。在第一转染实验中，测试不同的转染剂以比较蛋白质表达和细胞活力(数据未显示)。接下来，进行包括剂量滴定的筛选实验以评估剂量依赖性效应。实验设置如下：在96孔板中每孔接种在150μl DMEM完全培养基中的5000个细胞(NIH3T3)并在接种后24小时转染。使用市售转染试剂Dreamfect Gold(DFG)以500ng/孔(100pg mRNA/细胞)的起始剂量转染细胞。以每1μg mRNA 4μl DreamfectGold的比制备复合物。为形成脂复合物，将mRNA(3.6pg)以每种mRNA 340μl的总体积分别在没有补充物的DMEM中稀释。在96孔板中，将14.4μL DFG与5.6μl水在为每种mRNA稀释液制备的一个孔中混合。当将mRNA稀释液加入到DFG并通过上下移液混合时发生复合物形成。混合物在室温下温育20分钟。同时，制备稀释系列。在复合物混合物下方的剩余七个孔中，每孔加入180μl没有补充剂的DMEM。温育时间后，将180μl复合物溶液移出并加入到稀释系列的第一孔中。这个过程一直进行到最后的稀释步骤。最后，将50μl复合物溶液加入到细胞中并温育4小时。对于每种mRNA构建物，制备生物学一式三份。4小时后，从细胞培养板中取出完全的上清液用于测量，并向每个孔中加入150μl新鲜培养基。使用多标记读板仪在4、24、48、72、96、120和144小时后测量生物发光。至此，将50μl上清液与20μl腔肠素(coelenterazin)混合，测量所产生的光。最后，观察随时间的蛋白质的量，并将其描绘为曲线下面积(AUC)。

结果显示在图12中。

表4：构建物#1至#5的总结。

XIII.讨论

mRNA稳定性及其表达的确定是开发新的mRNA治疗时要考虑的两个主要因素。在此，5’UTR、3’UTR、5’+3’UTR、5’+2×3’UTR和两个拷贝3’UTR的不同UTR组合被用于在稳定性和其表达方面改善mRNA。还评估了d2EGFP时程的AUC，因为总蛋白表达与持续的治疗效果相关。为了获得详细的时间分辨数据并监测单细胞水平的蛋白质表达动力学，使用微结构单细胞阵列用于平行定量测量mRNA稳定性和翻译效率。细胞的常规排列保证了可重现的微环境，并且实现了快速和自动化的图像分析，这是可比较的高通量单细胞研究的先决条件。该方法允许测定(i)蛋白质半衰期、(ii)表达速率和(iii)功能性mRNA半衰期的分布函数。

在A549和Huh7细胞中，d2EGFP的平均蛋白质半衰期是狭窄分布的并且不依赖UTR序列。计算的A549细胞4.5小时和Huh7细胞7.4小时的半衰期值可归因于所比较的细胞系之间的细胞类型特异性差异。之前已经公布了d2EGFP半衰期的这种细胞特异性差异。使用类似的成像细胞计数方法对NIH3T3细胞进行研究，在12小时的测量窗口内记录了2.8h的半衰期(33)。Li等人已经报道了CHO细胞小于两小时的更短的半衰期。(34)。此处，蛋白质降解仅通过蛋白质印迹和流式细胞术测量3小时。

为了从单细胞数据分析验证我们的发现，另外测定了使用放线菌酮直接测量的d2EGFP寿命(参见图10)。与从单细胞数据分析观察到的值相比，发现寿命更短。这可能是由于在单细胞数据分析中，假定mRNA分子的恒定初始数量为组合表达速率K＝m_v·k_TL的部分(参见等式1)。但是，无论细胞在1小时的温育时间后洗涤的事实如何，从观察开始，mRNA分子的数目仍然可能不是恒定的。因此，可用于翻译，后来导致蛋白质表达的mRNA分子，可能导致从单细胞表达时程拟合获得的更长的半衰期值。当比较针对A549细胞测定的平均半衰期与针对Huh7细胞测定的平均半衰期时，发现两种测量方法大致1.64的相同比。而且，即使是对mRNA和蛋白质半衰期的可能的系统性高估也没有改变mRNA表现的定性顺序。

表达速率取决于mRNA分子的起始数目m0以及翻译速率KTL。要注意的是，由于递送过程的固有随机性，成功递送的mRNA分子的数量变化。然而，预期mRNA分子的平均数目是相同的，因为在所有实验中严格保持转染方案。相反，各种UTR构建物的翻译活性(KTL)可能不同。尽管如此，对于所有构建物，表达速率K的分布以及平均值是非常相似的事实(参见图3A和D)指示翻译速率仅受插入的UTR影响。

最感兴趣的参数是mRNA半衰期。这里将功能性mRNA半衰期与物理性mRNA半衰期进行比较。单细胞转染研究的结果表明，将5’或3’UTR插入到mRNA序列中可增加其功能性mRNA半衰期。在该研究中测试的所有修饰导致延长的mRNA半衰期(参见图2和3)，由此导致如通过荧光显微成像和FC所测量的延长的表达(参见图1)。与功能性mRNA半衰期相反，通过qRT-PCR确定的物理mRNA半衰期显示在两种细胞系中5’、3’、5’+2×3’和2×3’UTR的mRNA稳定性降低(参见图8A和B)。一个主要的差异是两种方法中每个测量的mRNA的翻译能力。在测量功能性mRNA半衰期的情况下，mRNA参与活性翻译，而不管检测到的mRNA的翻译状态如何，都监测物理mRNA半衰期。Gallie等已报道了类似的发现(35)。据信，物理mRNA半衰期不是mRNA翻译能力的适当指示物。可以从其功能半衰期(表达寿命)和产生的总蛋白质的量(曲线下面积)判断mRNA的翻译能力。对于治疗性mRNA，分子尽可能长时间地发挥功能并产生最大可能的蛋白质是必要的。这导致了功能性mRNA半衰期和产生的蛋白质的总量两者都是用于鉴定、比较和测试mRNA治疗学的更好测度的结论。此外，半衰期的异质分布指出了单细胞测量技术的重要性，因为在全体测量中这些效应是模糊的(见图2、4和8A和B)。有趣的是，对于单独的5’UTR观察到对蛋白质表达的正面影响，尽管到目前为止，还没有发现CYBA 5’UTR中已知的基序。第一次，已经显示在任一末端的CYBA UTRs足以增加两种细胞系中蛋白质表达的峰值和持续性。这些发现与声称5’UTR和3’UTR的个体或协同行为的出版物一致(14)。与Holtkamp等人(16)相反，与单个3’UTR相比，用3’UTR的两个连续拷贝可以观察到蛋白质表达或mRNA稳定性没有额外增加(参见图4)。相反，它甚至导致5’+3’对5’+2×3’UTR插入和3’对2×3’UTR插入的更短的寿命。这可能是由于在Holtkamp等人(16)的研究中使用了不同类型的细胞(即树突细胞)的事实。对肝细胞也已报道了相似的细胞类型特异性效应(39)。影响mRNA稳定性和其翻译效率的另一个促成因素可以是不同mRNA的二级结构。之前已经报道了mRNA二级结构在调节基因表达中的这种作用(36,37)。

表3中总结了本研究中使用的mRNA构建物的重要结构特征以及它们的最小自由能。

5’+3’UTR稳定化的构建物的持续蛋白质表达可以是由于5’到3’末端的结合，这促进了mRNA的环化(19)。因为在5’UTR内没有稳定的二级结构可以被发现，所以假定这个特征使得早期表达能够开始(38)。相反，3’UTR内的二级结构被鉴定。这些可能保护mRNA免于3’-5’降解途径。两个3’UTR显示甚至更多的具有最小自由能的二级结构(两个发夹)，表明更持久的表达。总之，这些发现可以是与5’UTR相比2x3’UTR的次的开始表达以及在含有3’UTR的mRNA构建物的晚期时间点的持续表达的解释。根据蛋白质半衰期，用UTR稳定的mRNA获得更长的半衰期值。在两种细胞系中观察到这种情况，细胞特异性差异最可能影响绝对值。在A549细胞中，与对照的5.8h相比，具有UTR的构建物的mRNA半衰期的范围是13.0h至23.0h。在Huh7细胞中，与对照mRNA的7.8h的半衰期相比，对于含有UTR的构建物测量了从9.9h到13.6h的半衰期。在A549细胞中3’UTR稳定的mRNA的半衰期与之前报道的类似稳定的mRNA的mRNA寿命是一致的(16,26)。mRNA和蛋白质的稳定性和衰减动力学在不同细胞类型中不同这一事实很可能是由于mRNA和蛋白质之间相互作用的复杂网络的差异，这很可能是细胞类型依赖性的。

总之，我们在A549和Huh7细胞中的结果独立于分析方法(FC或单细胞分析)，表明持续的、高水平的蛋白质表达可以由CYBA UTR稳定的mRNA诱导。UTR组合的选择取决于应用实验的需要。当期望具有降低的mRNA衰减的持续蛋白质表达，用单独的3’UTR稳定的mRNA可用于此目的。然而，5’+3’UTR的组合产生了早期开始、高峰和累积蛋白质表达的额外期望的特征。

在此证明，mRNA诱导的蛋白质表达的单细胞分析是表征和改善mRNA构建物的药物代谢动力学性质的手段。使用这种方法，可能系统地评估不同mRNA构建物的细胞内生物利用度，以鉴定产生持续蛋白质表达的序列。在两种细胞类型中使用单细胞模型FC分析，对于通过UTR插入稳定的构建物，发现了蛋白质表达的延长的持续时间。在发展mRNA治疗学的情况下，这个发现是期望的。具有一段时间里持续蛋白质表达(AUC)的信使RNA构建物是期望的并且允许适当减少的给具有最终治疗结果的患者给药。

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Claims

1.RNA分子，其包含

(a)编码多肽的编码区；和

(b)所述编码区上游的一个或多个UTR，所述UTR由SEQ ID NO：1所示的序列组成；和/或

(c)所述编码区下游的一个或多个UTR，所述UTR由SEQ ID NO：2所示的序列组成；

其中由所述编码区编码的所述多肽不是细胞色素b-245α多肽。

2.根据权利要求1所述的RNA分子，其中如权利要求1(b)中所定义的所述一个或多个UTR位于如权利要求1(a)中所定义的所述编码区的5’末端。

3.根据权利要求1所述的RNA分子，其中如权利要求1(c)中所定义的所述一个或多个UTR位于如权利要求1(a)中所定义的所述编码区的3’末端。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的RNA分子，其中如权利要求1(b)中所定义的所述一个或多个UTR位于如权利要求1(a)中所定义的所述编码区的5’末端，和其中如权利要求1(c)中所定义的所述一个或多个UTR位于如权利要求1(a)中所定义的所述编码区的3’末端。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的RNA分子，其包含在如权利要求1(a)中所定义的所述编码区的5’末端处的如权利要求1(b)中所定义的一个UTR并且其包含在如权利要求1(a)中所定义的所述编码区的3’末端处的如权利要求1(c)中所定义的两个UTR。

6.根据权利要求1或3所述的RNA分子，其包含在如权利要求1(a)中所定义的所述编码区的3’末端处的如权利要求1(c)中所定义的两个UTR。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的RNA分子，其中所述RNA分子包含在3'末端的聚腺苷酸尾。

8.根据权利要求7所述的RNA分子，其中所述聚腺苷酸尾具有至少120个核苷酸的长度。

9.编码权利要求1至8中任一项所述的RNA分子的核酸分子。

10.包含权利要求9所述的核酸分子的载体。

11.包含权利要求10所述的载体的宿主细胞。

12.药物组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的RNA分子、根据权利要求9所述的核酸分子、根据权利要求10所述的载体或根据权利要求11所述的宿主细胞和药学上可接受的载体。

13.权利要求12所述的药物组合物，用于基于RNA的治疗。

14.试剂盒，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的RNA分子、根据权利要求9所述的核酸分子、根据权利要求10所述的载体或根据权利要求11所述的宿主细胞。

15.权利要求1(b)中所定义的一个或多个UTR和/或权利要求1(c)中所定义的一个或多个UTR用于增加将RNA分子的编码区翻译成由所述编码区编码的多肽的效率的用途。

16.权利要求1(b)中所定义的一个或多个UTR和/或权利要求1(c)中所定义的一个或多个UTR用于增加将RNA分子的编码区翻译成由所述编码区编码的蛋白质的效率的用途。