KR20180035789A - Rna 분자의 번역 효율을 증가시키는 utr - Google Patents

Abstract

(a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및 (b) 상기 코딩 영역의 상류에 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들); 및/또는 (c) 상기 코딩 영역의 하류에 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)을 포함하는 RNA 분자로서; 여기서 상기 코딩 영역에 의해 코딩된 상기 폴리펩티드가 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)가 아닌, RNA 분자가 기재되어 있다. 게다가, 본 발명에 따른 RNA 분자를 코딩하는 핵산 분자가 기재되어 있다. 추가로, 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포가 기재되어 있다. 추가로, 본 발명에 따른 RNA 분자 및 임의로 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 기재되어 있다. 게다가, 본 발명에 따른 RNA 분자를 포함하는 키트가 기재되어 있다. 마지막으로, RNA 분자의 코딩 영역을 상기 코딩 영역에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 단백질로 번역하는 효율을 증가시키기 위한 (b)에 정의된 바와 같은 하나 이상의 UTR(들) 및/또는 (c)에 정의된 바와 같은 하나 이상의 UTR(들)의 용도가 기재되어 있다.

Description

RNA 분자의 번역 효율을 증가시키는 UTR

본 발명은 (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및 (b) 상기 코딩 영역의 상류에 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들); 및/또는 (c) 상기 코딩 영역의 하류에 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)을 포함하는 RNA 분자로서; 여기서 상기 코딩 영역에 의해 코딩된 상기 폴리펩티드가 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)가 아닌, RNA 분자에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 본 발명에 따른 RNA 분자를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 본 발명에 따른 RNA 분자 및 임의로 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 본 발명에 따른 RNA 분자를 포함하는 키트에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 RNA 분자의 코딩 영역을 상기 코딩 영역에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 단백질로 번역하는 효율을 증가시키기 위한 (b)에 정의된 바와 같은 하나 이상의 UTR(들) 및/또는 (c)에 정의된 바와 같은 하나 이상의 UTR(들)의 용도에 관한 것이다.

최근에, 전령 RNA (mRNA)가 신약 실재(new drug entity)로서 점점 더 관련성이 높아졌다. DNA 기반 유전자 치료제와는 대조적으로, mRNA는 핵으로 수송될 필요가 있는 것이 아니라 세포질에서 단백질로 직접 번역된다 (1,2). 이로 인해, DNA 유전자 의약의 있을 법하지는 않으나 현존하는 위험인 잠재적인 삽입 돌연변이 유발을 피하는데 있어서 mRNA가 더 안전하게 된다. 결과적으로, mRNA 치료제는 폭넓은 다양한 의학적 적응증에서 유전자 및 단백질 대체 요법의 유망한 대안으로 드러나고 있다 (1-4). 그러나, 통상적인 mRNA의 강한 면역원성뿐만 아니라 제한된 안정성은 극복되어 그의 임상 적용성을 추가로 확립하여야 한다. 이와 관련하여, mRNA 안정성 및 특히 mRNA의 번역률(translation rate)은 이것이, 예를 들어, mRNA 약물의 투여 및 투여 간격을 결정하기 때문에 예상되는 의학적 적용에 필수적인 매개 변수이다.

몇몇 전략이 안정성을 증가시키는 것뿐만 아니라 세포 또는 유기체에게 투여된 mRNA에 의해 촉발된 면역원성 반응을 감소시키는데도 성공적인 것으로 입증되었다. 이들 중에는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함시키는 것이 있다 (5). 코르만(Kormann) 등은 단지 25%의 우리딘 및 시티딘 잔기를 2-티오우리딘 및 5-메틸-시티딘으로 대체하는 것이 시험관내에서 외부 투여된 mRNA에 의해 촉발된 선천 면역의 활성화를 감소시키는 것뿐만 아니라 mRNA 안정성을 증가시키기에 충분하다는 것을 보여주었다 (WO2012/0195936 A1; WO2007024708 A2).

또한, mRNA에서의 비번역 영역(untranslated region) (UTR)은 mRNA 안정성 및 mRNA 번역 둘 다를 조절하는데 중추적인 역할을 하는 것으로 보고되었다. UTR은 RNA 결합 단백질과의 그의 상호 작용을 통해 mRNA 안정화 및 세포내 국소화뿐만 아니라, 번역 개시, 신장(elongation), 및 종결에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다 (6,7). UTR 내에 특정 모티프에 따라, 이는 mRNA 회전율(turnover)을 높이거나 낮출 수 있다 (8-11). 최근에, mRNA 반감기 및 상응하는 UTR 서열에 대한 데이터가 공개되었다 (12, 43).

따라서, 비록 선행 기술에 mRNA의 안정성을 증가시키고, 세포 또는 유기체에게 투여된 mRNA에 의해 촉발된 면역원성 반응을 감소시키고 번역 효율을 증가시키기 위한 수단 및 방법이 이미 기재되어 있긴 하지만, 특히 번역 효율을 증가시키기 위한 추가 또는 대체 수단에 관한 개선이 여전히 필요한데 그 이유는 번역 효율은 이것이, 예를 들어, mRNA 약물의 투여 및 투여 간격을 결정하고, 궁극적으로는, 최종 생성물, 즉, 코딩된 펩티드 또는 단백질의 생체이용률을 결정하기 때문에 예상되는 의학적 적용에 필수적인 매개 변수이기 때문이다.

본 출원은 청구범위에 정의된 바와 같은 실시양태를 제공함으로써 이러한 필요성을 해결한다.

특히, 본 출원은 놀랍게도, 특정한 UTR이 주어진 (외래) mRNA에 융합될 때 증가된 번역상 효율을 부여한다는 것을 밝혀냈다. UTR은 인간 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA) 유전자의 mRNA로부터 유래된다. CYBA 유전자는 특정 5' 및 3' UTR을 포함한다. 일반적으로, 5' UTR 모티프 예컨대 상류 개방형 해독틀(upstream open reading frame) (uORF) 또는 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site) (IRES)가 유전자 조절, 특히 번역 개시에 관여한다는 것은공지되어 있다 (13). 3' UTR은 5' UTR보다 훨씬 더 많은 조절 기능을 포함할 수 있으며, 이들 중 일부는 mRNA 번역을 심지어 방해한다 (14).

선행 기술에 CYB5' UTR 단위에 대하여 어떠한 조절 모티프도 기재된 바가 없기 때문에, 본 발명의 발견은 더욱더 놀랍다. 비록 CYBA의 3' UTR이 두 가지 조절 모티프를 함유하는 것으로 공지되어 있긴 하지만, CYBA UTR이 주어진 mRNA에 융합될 때 증가된 번역상 효율을 부여한다는 본 발명의 발견은 그럼에도 불구하고 놀라운데, 그 이유는 이들 두 가지 모티프는 mRNA의 안정성의 맥락에서 기재되며 번역상 효율의 증가의 맥락에서 기재되지 않기 때문이다. 보다 구체적으로, CYBA의 3' UTR은 세포질의 폴리아데닐화 요소 결합 단백질(cystoplasmic polyadenylation element binding protein) (CPEB)과, 뿐만 아니라 절단 및 폴리아데닐화 신호전달 인자(cleavage and polyadenylation signaling factor) (CPSF)와 상호 작용하는 것으로 공지된 폴리아데닐화 신호 (PAS)를 보유하는 것으로 공지되어 있다 (11). CPEB는 세포질에서 폴리-A 테일(poly-A tail)의 연장의 원인이 되는 것으로 공지되어 있으며, 한편 CPSF는 폴리-A의 다가오는 첨가를 위해 특정 부위에서 절단을 통해 pre-mRNA를 프라이밍한다 (11, 14). CYB3' UTR에 함유된 제2 조절 모티프는 인슐린 3' UTR 안정성 요소 (INS_SCE)이다 (15). INS_SCE 서열은 환원 조건하에 폴리피리미딘 트랙 결합 단백질(polypyrimidine tract binding protein) (PTB)에 결합하여, 인슐린의 mRNA 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다 (15). 따라서, CYBA의 3' UTR의 조절 모티프 둘 다 mRNA 안정성과 주로 관련되어 있다.

인간 CYBA 유전자의 코딩 가닥 상에 존재하는 인간 CYBA 유전자의 5'- 및 3' UTR의 뉴클레오티드 서열을 표시하는 DNA 서열을 하기 표 1에 나타냈다.

표 1 은 인간 CYBA 유전자 UTR의 정확한 유전 코드를 나타낸다. DNA 서열은 5'에서 3' 말단으로 표시된다. 3' UTR의 폴리아데닐화 신호 (PAS)는 볼드체로 표시되고 인슐린 3'UTR 안정성 요소 (INS_SCE)는 밑줄이 그어졌다. 5 'UTR은 71개의 염기쌍으로 이루어지며, 한편 3' UTR은 70개의 염기 쌍을 함유한다. UTR 둘 다 5'UTR의 경우에 약 200개의 뉴클레오티드 및 3'UTR의 경우에 대략 1000개의 뉴클레오티드로 이루어진 평균 인간 UTR보다 더 짧다.

상기 표 1에서, 인간 CYBA 유전자 5'- 및 3' UTR을 표시하는 DNA 서열은 각각 서열번호 5 및 서열번호 6으로서 나타내진다.

본 발명이 주로 RNA 분자에 관한 것이라는 사실을 고려하여, 상응하는 RNA 서열이 하기에 언급된다.

상기 DNA 서열로부터 유래된 서열번호 5는 RNA 수준에서 하기 UTR 서열에 상응한다:

5'-CGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUGUCGCC-3' (서열번호 1).

이 5'UTR 서열은 인간 CYBA 유전자의 시작 코돈 바로 앞에 있다.

상기 DNA 서열로부터 유래된 서열번호 6은 RNA 수준에서 하기 UTR 서열에 상응한다:

5'-CCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCCGCCAGGUGCACCC ACCUGCAAUAAAUGCAGCGAAGCCGGGA-3' (서열번호 2).

mRNA 번역 효율에 영향을 미치는 또 다른 중요한 특징은 3' 말단에 위치하는 폴리-A 테일이다. 폴리-A 테일의 120개의 뉴클레오티드로의 연장은, 짐작컨대 더 긴 폴리-A 테일의 mRNA 분해에 대한 보호 효과 때문에, 단백질 발현에 유익한 영향을 미치는 것으로 나타났다 (16). 긴 폴리-A 테일과 대조적으로, 50개의 뉴클레오티드보다 더 짧은 폴리-A 테일을 가진 mRNA는 전혀 번역되지 않는다고 주장된다 (11, 17). 그러므로, mRNA 요법에서, 재조합 mRNA 구축물에는 유리하게는 120개의 뉴클레오티드 또는 그 초과의 폴리-A 테일이 제공되어야 한다. 진핵 세포에서 대부분의 mRNA 전사물의 분해는 3'에서 5' 엑소뉴클레오리틱 탈아데닐화(exonucleolytic deadenylation)로 시작하여, 대부분의 폴리 A-테일의 제거를 결과한다. 그 후에, mRNA 바디(body)의 나머지의 분해의 원인이 되는 두 가지 주요 경로가 작동하기 시작하는 것으로 공지된다. 한편으로는, 5' 말단은 Dcp1/Dcp2 복합체에 의해 탈캐핑(decapping)된 후에, Xrn1p에 의해 촉매되는 5'-3' 엑소뉴클레오리틱 분해가 뒤따른다. 다른 한편으로는, 엑소솜은 3'-5' 엑소리보뉴클레오리틱 분해를 가능하게 하며 5' 캡(cap)은 유지된다 (18). 게다가, 3' 폴리-A 테일과의 5' 캡 상호 작용은 mRNA의 원형 형태(circular form)를 결과한다는 것이 공지되어 있다. mRNA의 원형 형상은 첫 번째 정지 코돈을 번역한 후에 리보솜의 개시율(initiation rate)을 증가시키고 분해에 대하여 mRNA를 또한 보호하는 것으로 추정된다 (19).

본 출원은, 그 중에서도, 놀랍게도, 천연 CYBA mRNA의 번역상 효율의 증가는 단축된 CYB5'- 및 3'-UTR의 조합으로 그의 코딩 서열을 플링킹(flanking)함으로써 외래 mRNA에 부여될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 이 점에서 각각 서열번호 1 및 서열번호 2에 나타낸 바와 같은, 본 발명의 5' UTR 및 3'UTR 둘 다가 각각 서열번호 5 및 서열번호 6으로서 나타낸 인간 CYBA 유전자 5'- 및 3' UTR을 표시하는 상기 DNA 서열보다 더 짧다는 것은 주목할 만하다.

이것은 mRNA 형질감염(transfection) 타임 랩스(time-lapse) 무비(movie)의 단세포 분석에 의해 행하여졌는데 이는 개별 발현 시간 과정을 평가할 수 있는 것으로 최근 밝혀졌으며 (26) 한편 부착 부위의 정규 격자(regular grid) 상에 세포를 위치시키기 위해 규칙적인 미세패턴을 사용할 수 있다고 보고되었다 (27).

그러므로, 본 출원은 이 기술이 외래 mRNA에 대한 상이한 UTR 조합을 신속하게 스크리닝하고 비교하는 해결책을 제공한다는 것을 입증하였다. 이를 해결하기 위해, 불안정화된 증강된 녹색 형광 단백질(destabilized enhanced green fluorescent protein) (d2EGFP)의 코딩 서열을 선택하여 인위적으로 세포 내부에서 리포터 단백질의 생명 주기를 단축시켰다 (28). 조합은 5' 또는 3' 말단에서, 각각, 5'- 및 3' 말단 둘 다에서, 3 '말단에서 3' UTR의 2개의 반복부, 또는 5 'UTR 없이 3' UTR의 2개의 반복부와 조합된 5' 말단에서 각각의 CYBA UTR의 삽입을 포함하였다. 이들 모두는 UTR이 없는 대조군 구축물과 비교되었다. 비교된 전사물 각각으로부터의 발현률(expression rate) 및 단백질 및 기능적 mRNA 수명을 평가하였다. mRNA 형질감염 후 유전자 발현 역학에 대한 단세포 분석을 모집단 기반 방법 (유동 세포측정법, 형광 현미경검사 영상화, 및 루시퍼라제 활성의 생체발광 측정)과 비교하였다. 놀랍게도 대조군과 비교하여 모든 UTR 조합에 대해 3일의 기간에 걸쳐 전체 단백질 발현이 개선되는 것으로 나타났다.

이러한 발견은 청구범위에서 특징지어지는 실시양태를 제공한다. 따라서, 본 발명은

(a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및

(b) 상기 코딩 영역의 상류에 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들); 및/또는

(c) 상기 코딩 영역의 하류에 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)

을 포함하는 RNA 분자로서;

여기서 상기 코딩 영역에 의해 코딩된 상기 폴리펩티드가 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)가 아닌, RNA 분자에 관한 것이다.

본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 리보핵산 (RNA) 분자는 G, A, U 및 C로 명명되는 뉴클레오티드의 쇄로서 어셈블리되는 중합체 분자에 관한 것이다. RNA의 각각의 뉴클레오티드는, 1'부터 5'까지 넘버링되어 있는 탄소와 함께, 리보스 당을 함유한다. 1' 위치, 일반적으로, 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G) 또는 우라실 (U)에 질소 염기가 부착된다. 중합체 RNA 분자에서 포스페이트 기는 하나의 리보스의 3' 위치 및 그 다음의 리보스의 5' 위치에 부착된다. 따라서, 중합체 RNA 분자에서의 뉴클레오티드는 서로 공유 결합되며 여기서 하나의 뉴클레오티드로부터의 포스페이트 기가 후속 뉴클레오티드 상의 3' 탄소와 결합함으로써, 포스포디에스테르 결합을 형성한다. 따라서, RNA 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고 있어, 리보스 고리 상의 탄소에 대해 명명된다. 통상적으로, 상류 및 하류는 RNA 전사가 일어나는 5'에서 3' 방향에 관한 것이다. 바람직하게는, RNA 분자는 전령 RNA (mRNA) 분자이다. mRNA는 DNA에서 리보솜으로 유전 정보를 전달하는 RNA 분자의 큰 패밀리이며, 여기서 RNA 분자들이 유전자 발현의 단백질 생성물의 아미노산 서열을 구체화한다. RNA 폴리머라제에 의한 1차 전사물 mRNA (pre-mRNA로 공지됨)의 전사 후에, 프로세싱된 성숙 mRNA는 분자 생물학의 기본 원리에 요약된 바와 같이 아미노산의 중합체: 단백질로 번역된다. DNA에서와 같이, mRNA 유전 정보는, 각각 3개의 염기로 이루어진 코돈으로 배열되는 뉴클레오티드의 서열에 있다. 각각의 코돈은 단백질 합성을 종결시키는 정지 코돈을 제외하고, 특정 아미노산을 코딩한다.

이하에 더 상세히 개요를 서술하는 바와 같이, 본 발명의 리보핵산 (RNA) 분자는 두 가지 또는 심지어 세 가지 주요 모듈, 즉, (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역, (b) 상기 코딩 영역의 상류에 하나 이상의 UTR, 및/또는 (c) 상기 코딩 영역의 하류에 모듈 (b)의 UTR(들)과 상이한 하나 이상의 UTR을 포함한다. 따라서, 본 발명의 RNA 분자는 그 구조와 관련하여, 코딩 영역뿐만 아니라 (5' 및 3') 비번역 영역 (UTR)뿐만 아니라, 임의로, 폴리-A 테일을 보유하는, 자연에서 발생하는 "정상적인" mRNA 분자와 유사하다.

본 발명에 따라 사용된 바와 같은 용어 "코딩 영역"은 코돈으로 구성된 중합체 RNA 분자에 관한 것으로, 코돈은 "유전 코드"에 의해 제공된 정보에 따라 리보솜에 의해 디코딩(decoding)되고 단백질로 번역된다. 코딩 영역은 통상적으로 시작 코돈으로 시작하여 정지 코돈으로 종료된다. 일반적으로, 시작 코돈은 AUG 트리플렛이며, 정지 코돈은 UAA, UAG 또는 UGA이다. 단백질-코딩 이외에도, 코딩 영역의 부분은 엑손의 스플라이싱 인핸서(exonic splicing enhancer) 또는 엑손의 스플라이싱 사일런서(silencer)로서 pre-mRNA에서 조절 서열로서 역할을 할 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 바와 같은 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자 코딩의 코딩 영역은 또한 코딩 서열 또는 CDS (코딩 DNA 서열로부터)로서 공지되어 있으며, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는, 엑손으로 구성된 유전자의 DNA 또는 RNA의 부분이다. 언급한 바와 같이, 상기 영역은 시작 코돈에 의해 5' 말단에 더 가까이 그리고 정지 코돈으로 3' 말단에 더 가까이 경계를 이룬다. mRNA에서의 코딩 영역은, 또한 엑손의 부분인 5 프라임 비번역 영역 (5 'UTR) 및 3 프라임 비번역 영역 (3' UTR)에 의해 플랭킹된다. 코딩 영역 또는 CDS는, mRNA 전사물의 부분, 즉, 리보솜에 의해 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는, 본 발명에 따라 사용된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역의 부분이다.

본 발명에 따라 사용된 바와 같은 용어 "비번역 영역" 또는 "UTR"은 번역되지 않고, 따라서 각각 5 프라임 비번역 영역 (5' UTR) 및 3 프라임 비번역 영역 (3' UTR)으로 칭해지는 mRNA 상류의 시작 코돈 및 하류의 정지 코돈의 절편(section)에 관한 것이다. 이들 영역은 코딩 영역으로 전사되며 따라서 이들은 성숙 mRNA에 존재함에 따라 엑손이다.

본 발명에서 사용된 바와 같이, 3' 비번역 영역 (3'-UTR)은 번역 종결 코돈을 바로 뒤따르는 전령 RNA (mRNA)의 절편에 관한 것이다. mRNA 분자는 DNA 서열로부터 전사되며 나중에 단백질로 번역된다. mRNA 분자의 몇몇 영역은 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 테일을 포함하여 단백질로 변역되지 않는다.

본 발명에서 사용된 바와 같이, 5' 비번역 영역 (5' UTR) (선도 서열(Leader Sequence) 또는 선도 RNA로도 공지됨)은 시작 코돈으로부터 직접 상류에 있는 mRNA의 영역이다. 5' UTR은 전사 시작 부위에서 시작하며 코딩 영역의 시작 코돈 (통상 AUG) 전에 하나의 뉴클레오티드 (nt)로 종료된다. 원핵 생물에서, 5 'UTR의 길이는 3-10개의 뉴클레오티드 길이의 경향이 있으며 한편 진핵 생물에서 길이가 더 길어지는 경향이 있어, 일반적으로 100개에서 수천개의 뉴클레오티드 길이의 경향이 있지만 때때로 또한 더 짧은 UTR이 진핵 생물에서 발생한다.

본 발명에서 사용된 바와 같이, 3'UTR은 mRNA의 안정성 및 폴리아데닐화에 영향을 미치는 것으로 공지된 3'-비번역 영역 내에 조절 영역을 포함할 수 있다. 많은 3'-UTR은 AU 풍부 요소(AU-rich element) (ARE)를 또한 함유한다. 더욱이, 3'-UTR은 mRNA 전사물의 말단에 폴리(A) 테일로 칭해지는 수백개의 아데닌 잔기의 첨가를 지시하는 AAUAAA 서열을 함유한다.

이하에 추가로 더 상세히 개요를 서술하는 바와 같이, 본 발명에 따라 사용된 바와 같은 RNA 분자는 폴리-A 테일을 또한 함유할 수 있다. 폴리-A 테일은 폴리아데닐화로 칭해지는 과정에 의해 pre-mRNA의 3' 말단에 첨가된 아데닌 뉴클레오티드의 긴 서열 (종종 수백개)이다. 이 테일은 핵으로부터 유출(export) 및 번역을 촉진하고, mRNA가 분해되지 못하도록 한다. 폴리아데닐화는 전령 RNA에 폴리(A) 테일을 첨가하는 것이다. 폴리(A) 테일은 다수의 아데노신 모노포스페이트로 이루어져 있으며; 환언하면, 이는 아데닌 염기만을 갖는 RNA의 신장(stretch)이다. 진핵 생물에서, 폴리아데닐화는 번역을 위해 성숙 전령 RNA (mRNA)를 생산하는 과정의 부분이다.

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 RNA 분자는 바람직하게는 두 가지 또는 세 가지 주요 모듈, 즉, (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및 (b) 상기 코딩 영역의 상류에 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들); 및/또는 (c) 상기 코딩 영역의 하류에 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)을 포함한다.

따라서, 본 발명의 RNA 분자는 두 가지 주요 모듈, 즉, 상기 모듈 (a) 및 모듈 (b) 및 임의로 또한 모듈 (c)를 포함하는 것이 필수적이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 세 가지 주요 모듈, 즉, 상기 모듈 (a) 및 모듈 (b) 및 모듈 (c)를 포함한다. 그러나, 모듈 (a)는 필수적이지만, RNA 분자는 또한 모듈 (b) 또는 (c) 중 하나가 결핍될 수 있다는 것이 또한 예상된다.

RNA 분자의 한 모듈, 즉, "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역" (모듈 (a))은 특히 제한되지는 않으며 주어진 세포에서 발현되는 임의의 원하는 코딩 영역일 수있다. 따라서, 이 모듈은 원하는 폴리펩티드, 즉, 원하는 최종 생성물을 코딩하는 코딩 영역일 수 있다. 본 발명은 "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"에 대하여 제한되지는 않으며 그 이유는 코딩 영역의 본성은 세포에서 생성되는 원하는 생성물에 따라 달라지기 때문이다. 이러한 코딩 영역은 또한 공지된 천연 서열과 상이하고 돌연변이 (즉 점 돌연변이, 삽입 돌연변이, 결실 및 그의 조합)를 함유하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 게다가, 이러한 코딩 영역은 부분적으로 또는 전체 범위로 모듈 (a)로서 사용되는 천연 서열로부터 유래된 코돈 최적화된 서열일 수 있다. 코돈 최적화는 관심 유전자의 번역상 효율을 증가시킴으로써 단백질 발현을 최대화하는 기술이다. 천연 유전자는 이용 가능한 코돈을 무작위로 사용하는 것이 아니라, 동일한 아미노산에 대해 특정 코돈에 대해 특정 선호를 나타내는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 유전 코드의 축퇴(degeneracy) 때문에 - 하나의 아미노산은 수개의 코돈에 의해 코딩될 수 있어 - 관심 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 동일 또는 또 다른 종의 바람직한 코돈 세트로 형질전환시킨다. 그러나, 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA) 유전자의 코딩 영역 (모듈 (a))은 제외되며, 따라서, 본 발명의 RNA 분자는 모듈 (a), 즉, 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역을 포함하는 RNA 분자이나, 여기서 (a)에서의 폴리펩티드를 코딩하는 상기 코딩 영역은 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)를 코딩하는 코딩 영역이 아니다. 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)를 코딩하는 코딩 영역뿐만 아니라 상응하는 아미노산 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드는 수퍼옥시드를 생성할 수 있는 것으로 공지되어 있으며 식균 작용에 관여하는 것으로 공지되어 있다. 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)를 코딩하는 코딩 영역의 예는 서열번호 9에 나타냈다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 모듈 (a), 즉, 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역을 포함하는 RNA 분자이며 여기서 (a)에서의 폴리펩티드를 코딩하는 상기 코딩 영역은 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)를 코딩하는 코딩 영역 또는 서열번호 9와 적어도 x% 동일한 아미노산 서열을 나타내는 코딩 영역이 아니며 여기서 x는 90 내지 100의 정수, 바람직하게는 95, 96, 97, 98 또는 99이다). 예로서, DNA 수준에서, 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)를 코딩하는 폴리펩티드의 코딩 영역을 나타내는 서열을 서열번호 8에 나타냈다.

언급한 바와 같이, 모듈 (a)는 특히 제한되지는 않으며 주어진 세포에서 발현되는 임의의 원하는 코딩 영역일 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, "코딩 영역"은 세포 내로 도입되는 경우, 폴리펩티드/단백질 또는 그의 단편으로 번역가능한 임의의 폴리리보뉴클레오티드 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 여기에서 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 임의의 종류의 아미노산 서열, 즉 펩티드 결합을 통해 각각 연결된 2개 이상의 아미노산의 쇄를 망라하며, 또한 펩티드 및 융합 단백질을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은 세포 내 또는 세포 부근에서 기능이 필요하거나 유익한 폴리펩티드/단백질 또는 그의 단편, 예를 들어, 그의 결핍되거나 결함이 있는 형태가 질환 또는 질병의 촉발 인자이며, 이의 제공으로 질환 또는 질병을 완화시키거나 예방할 수 있는 단백질, 또는 세포 또는 그 부근에서 신체에 유익한 과정을 촉진할 수 있는 단백질을 코딩하는 리보뉴클레오티드 서열을 함유한다. 코딩 영역은 완전 단백질 또는 그의 기능적 변이체에 대한 서열을 함유할 수 있다. 추가로, 코딩 영역의 리보뉴클레오티드 서열은 인자, 유도 인자, 조절 인자, 자극 인자 또는 효소, 또는 그의 기능적 단편으로서 작용하는 단백질을 코딩할 수 있는데, 여기서 이 단백질은 장애, 특히 대사 장애를 치료하기 위해 또는 생체내에서의 과정, 예컨대 새로운 혈관, 조직 등의 형성을 시작하기 위해 기능이 필요한 단백질이다. 여기에서, 기능적 변이체는, 세포에서의 기능이 필요하거나 그의 결핍되거나 결함이 있는 형태가 병원성인 단백질의 기능을 세포에서 수행할 수 있는 단편을 의미하는 것으로 이해된다.

바람직한 실시양태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은 치료 또는 예방 효과를 갖는 치료상 또는 제약상 활성인 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 이와 같이, 상기 "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"을 포함하는 본 발명의 RNA 분자는 핵산 요법 및 관련 적용에서 사용될 수 있다. 이 맥락에서, 본 발명에 따라, 도입된 외인성 RNA 분자의 상기 코딩 영역에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 단백질로 RNA 분자의 코딩 영역을 번역하는 증가된 효율은 내인성 유전자 발현을 보완하거나 보충하도록 의도될 수 있으며, 특히, 내인성 유전자가 결함이 있거나 침묵하여, 유전자 발현의 전혀 없거나, 불충분하거나 결함이 있거나 기능 장애가 있는 생성물을 야기하는 경우이며, 예컨대 많은 대사성 및 유전성 질환 예컨대 두서너 가지 예만 들면 낭성 섬유증, 혈우병 또는 근위축증이 있는 경우이다. 본 발명의 도입된 외인성 RNA 분자의 폴리펩티드로 RNA 분자의 코딩 영역을 번역하는 증가된 효율은 발현의 생성물이 유전자 발현, 신호 전달 및 기타 세포 과정의 조절과 같은 임의의 내인성 세포 과정과 상호 작용하거나 상기 과정에 지장을 주도록 또한 의도될 수 있다. 도입된 외인성 RNA 분자의 폴리펩티드로 RNA 분자의 코딩 영역을 번역하는 증가된 효율은 형질감염된 또는 형질도입된 세포가 거주하거나 거주하게 되는 유기체와 관련하여 면역 반응을 야기하도록 또한 의도될 수 있다. 예는 백신 접종을 목적으로 항원을 제시하게 하도록 수지상(dendritic) 세포와 같은 항원-제시 세포의 유전자 변형이다. 또 다른 예는 상기 코딩 영역이 시토카인을 코딩하는, 폴리펩티드로 RNA 분자의 코딩 영역을 번역하는 증가된 효율이다. 이는, 예를 들어, 종양-특이적 면역 반응을 도출하기 위해 종양에 바람직할 수 있다. 더욱이, 외인성 RNA 분자의 폴리펩티드로 RNA 분자의 코딩 영역을 번역하는 증가된 효율은 세포 요법을 위한 유전자 변형된 세포, 예컨대 재생 의학을 위한 변형된 T-세포 또는 전구체 또는 줄기 또는 기타 세포를 일시적으로 생체내 또는 생체외에서 생성하도록 또한 의도될 수 있다.

다른 바람직한 실시양태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은, 예를 들어 제어된 재생에서 필수적인 성장 과정 및 혈관 형성에 관여하는 단백질을 코딩 할 수 있고, 그 다음에 본 발명에 따른 RNA 분자의 도입에 의해 특이적으로 형성 될 수 있다. 이는 예를 들어 성장 과정에서 또는 골 결함, 조직 결함의 치료에 그리고 착상 및 이식의 맥락에서 유용할 수 있다.

언급한 바와 같이, "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"을 포함하는 본 발명의 RNA 분자는 체내에 자연적으로 존재할 것이지만 유전자 결함 또는 질환 때문에 존재하지 않거나 부족한 형태로 존재하거나 너무 적은 양으로 존재하는 폴리펩티드 또는 단백질이 신체에 제공되어야 하는 임의의 경우에 적절하게 사용될 수 있다. 그의 결핍 또는 결함이 질환과 관련되어 있는, 단백질 및 이들을 코딩하는 유전자가 공지되어 있다. 무손상 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역의 각각의 무손상 버전은 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.

단일 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는, 수많은 유전적 장애가 공지되어 있으며 mRNA 치료 접근법에 대한 후보이다. 낭성 섬유증, 혈우병 및 많은 다른 것들과 같이 단일 유전자 돌연변이에 의해 유발된 장애는 특정 소질이 자손에 나타날 가능성에 관하여 우성 또는 열성이 될 수 있다. 우성 대립 유전자가 단지 하나의 카피의 대립 유전자를 갖는 개체에서 표현형을 나타내지만, 열성 대립 유전자의 경우 분명해지기 위해서는 개체는 각각의 부모로부터 하나씩 두 개의 카피를 가져야 한다. 그에 반해서, 다유전자 장애는 둘 이상의 유전자에 의해 유발되며, 각각의 질환의 징후는 종종 일정하지 않으며 환경 요인과 연관이 있다. 다유전자 장애의 예는 고혈압, 상승된 콜레스테롤 수준, 암, 신경변성 장애, 정신병 및 기타 장애이다. 또한 이들 경우에 이들 유전자 중 하나 이상을 나타내는 치료용 mRNA는 그러한 환자들에게 유익할 수 있다. 더욱이, 유전적 장애는 부모의 유전자로부터 대물림되었을 리는 없으나, 새로운 돌연변이에 의해 유발될 수도 있다. 또한 이들 경우에 정확한 유전자 서열을 나타내는 치료용 mRNA는 환자들에게 유익할 수 있다.

인간 유전자 및 유전적 장애의 현재 22,993개 항목을 그 각각의 유전자 및 그 표현형에 대한 기재와 함께 가진 온라인 카탈로그는 ONIM (Man in Online Mendelian Inheritance in Man) 웹 페이지 (http://onim.org)에서 이용 가능하고; 각각의 서열은 유니프로트 데이터베이스(Uniprot database) (http://www.uniprot.org)로부터 이용 가능하다. 비제한적 예로서, 하기 표 2는 선천성 질환, 및 상응하는 유전자(들)를 열거한다. 세포 신호 전달 경로의 상호 작용의 정도가 높기 때문에, 특정 유전자의 돌연변이는 병원성 증상을 배가시키며 그 중 특징적인 것만을 표 2에 열거하였다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 치료용 단백질은 표 2에 열거된 세포성 단백질로부터 선택된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 치료용 세포성 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함할 수 있으며, 여기서 코딩된 치료용 단백질은 표 2에 열거된 것 또는 그의 동족체이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 치료용 단백질은 표 2에 열거된 분비된 단백질로부터 선택된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 치료용 융합 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함할 수 있으며, 여기서 코딩된 치료용 단백질 또는 그의 동족체는 표 2에 열거된 것이며 제2 단백질은 치료용 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드이다. 신호 펩티드는 짧고, 전형적으로 5-30개의 아미노산 길이의, 상기 치료용 단백질의 N-말단에 존재하는 아미노산 서열이며 특정 소기관 (즉 소포체, 골지체 또는 엔도솜)을 통해 세포의 분비 경로를 향해 융합 단백질을 야기한다. 따라서, 이러한 융합 단백질은 세포로부터 또는 세포성 소기관으로부터 분비되거나 세포성 구획에서 또는 세포 표면에서 세포성 막 (예를 들어 다중 폭(multi-spanning) 막관통 단백질)에 삽입된다.

따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서 "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역" (모듈 (a))은 질환을 유발하거나, 질환에 취약하게 하거나, 질환으로부터 보호하는 하기 유전자를 코딩할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 치료 (또는 예방)될 수 있는 이러한 장애의 비제한적인 예는 상기 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드가 하기 표 2에 개요를 서술하는 바와 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들을 포함한다.

일부 실시양태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은 천연 단백질의 것 이상의 수준에서 세포 활성을 포함하는 부분 또는 전체 길이의 단백질로 번역될 수 있다. 일부 실시양태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은 치료 또는 예방 효과를 갖는 치료상 또는 제약상 활성인 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드를 코딩하며, 여기서 상기 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드는 표 2에 개요를 서술한 바와 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다. "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은 은 천연 단백질의 것 이하의 수준에서 세포 활성을 가진 부분 또는 전체 길이의 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 이는 RNA 분자의 투여가 지시될 수 있는 질환의 치료를 허용할 수 있다.

상기 표 2는 유전자의 예를 나타내며 여기서 결함은 본 발명의 RNA 분자로 치료될 수 있는 질환을 야기하며 여기서 RNA 분자는 상기 개시된 결손 유전자의 단백질 또는 그의 기능적 단편의 무손상 버전을 코딩하는 "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 유전 질환이 언급될 수 있는데, 이는 예를 들어 폐에 영향을 미치는 것, 예컨대 SPB (계면활성제 단백질 B) 결핍, ABCA3 결핍, 낭성 섬유증 및 α1-항트립신 결핍, 또는 혈장 단백질에 영향을 미치고 (예를 들어 선천성 혈색소증 (헵시딘 결핍), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TPP, ADAMTS 13 결핍)) 응고 결함 (예를 들어 혈우병 a 및 b) 및 보체 결함 (예를 들어 단백질 C 결핍), 면역 결함 예컨대 예를 들어 SCID (상이한 유전자 예컨대: RAG1, RAG2, JAK3, IL7R, CD45, CD3δ, CD3ε에서 돌연변이에 의해 유발) 또는 예를 들어 아데노신 데스아미나제의 결핍으로 인한 결핍증 (ADA-SCID), 폐혈성 육아종증 (예를 들어 gp-91-phox 유전자, p47-phox 유전자, p67-phox 유전자 또는 p33-phox 유전자의 돌연변이에 의해 유발) 및 축적병 예컨대 고셰병, 파브리병, 크라베병(Krabbe's disease), MPS I, MPS II (헌터 증후군), MPS VI, 글리코겐 축적병 유형 II 또는 점액다당류증을 유발하는 것이다.

"펩티드를 코딩하는 코딩 영역"을 포함하는 본 발명이 유용할 수 있는 기타 장애는 장애 예컨대 SMN1-관련 척수성 근위축 (SMA); 근위축 측삭 경화증 (ALS); GALT-관련 갈락토스혈증; 낭성 섬유증 (CF); SLC3A1-관련 장애, 예를 들어 시스틴뇨증; COL4A5-관련 장애, 예를 들어 알포트(Alport) 증후군; 갈락토세레브로시다제 결핍증; X-연관 부신백질이영양증 및 부신척수신경병증; 프리드라이히 운동실조; 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease); TSC1 및 TSC2-관련 결절성 경화증; 산필립포 B 증후군(Sanfilippo B syndrome) (MPS IIIB); CTNS-관련 시스틴증; 취약 X 증후군, 취약 X-연관 진전/운동실조 증후군 및 취약 X 조기 폐경 증후군을 포함한 FMR1-관련 장애: 프라더-윌리 증후군; 유전성 출혈 모세혈관확장증 (AT); 니만-픽 병 유형 C1; 신경원성 세로이드 리포푸신증(neuronal ceroid lipofuscinosis)-관련 질환, 예를 들어 소아 신경원성 세로이드 리포푸신증(Juvenile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis) (JNCL), 소아 바텐병(Juvenile Batten disease), 산타부오리-할티아병(Santavuori-Haltia disease), 얀스키-빌쇼스키병(Jansky-Bielschowsky disease), 및 PTT-1 및 TPP1 결핍증; EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 및 EIF2B5-관련, 중추신경계 저수초형성증/소멸 백색질을 가진 아동기 운동실조; CACNA1A 및 CACNB4-관련 2형 발작성 운동 실조(Episodic Ataxia Type 2); MECP2-관련 장애, 예를 들어 전형적 레트 증후군(Classic Rett Syndrome), MECP2-관련 중증 신생아 뇌병증(Severe Neonatal Encephalopathy) 및 PPM-X 증후군; CDKL5-관련 비전형 레트 증후군(Atypical Rett Syndrome); 케네디병(Kennedy's disease) (SBMA); 노치(Notch)-3 관련 대뇌 상염색체 우성 동맥병증 (피질하 경색 및 백색질 뇌증을 가짐) (CADASIL); SCN1A 및 SCN1B-관련 발작 장애; 폴리머라제 G-관련 장애, 예를 들어 알퍼스-후텐로처 증후군(Alpers-Huttenlocher syndrome), POLG-관련 감각 실조 신경병증(sensory ataxic neuropathy), 구음 장애, 및 안근마비, 및 상염색체 우성 및 열성 진행성 외 안근마비 (미토콘드리아 DNA 결실을 가짐); X-연관 부신 형성저하증; X-연관 무감마글로불린혈증; 파브리병; 및 윌슨병을 포함한다.

모든 이들 질환에서, 단백질, 예를 들어 효소가 결함이 있으며, 이는 본 발명에 따른 RNA로 처리함으로써 치료될 수 있으며, 이는 이용 가능한 결손 유전자 또는 그의 기능적 단편에 의해 코딩된 단백질을 이용할 수 있게 한다. 전사물 대체 요법/효소 대체 요법은 근본적인 유전적 결함에 영향을 미치는 것이 아니라, 환자가 결핍된 효소의 농도를 증가시킨다. 예로서, 폼페병에서, 전사물 대체 요법/효소 대체 요법은 결핍 리소솜 효소 산 알파-글루코시다제 (GAA)를 대체한다.

따라서, 본 발명에 따른 모듈 (a)의 "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"에 의해 코딩될 수 있는 단백질의 비제한적인 예는 에리트로포이에틴 (EPO), 성장 호르몬 (소마토트로핀, hGH), 낭성 섬유증 막관통 전도도 조절 인자 (CFTR), 성장 인자 예컨대 GM-SCF, G-CSF, MPS, 단백질 C, 헵시딘, ABCA3 및 계면활성제 단백질 B이다. 본 발명에 따른 RNA로 치료될 수 있는 질환의 추가 예는 혈우병 A/B, 파브리병, CGD, ADAMTS13, 헐러병(Hurler's disease), X 염색체-매개 A-γ-글로불린혈증, 아데노신 데아미나제-관련 면역결핍 및 신생아에서 호흡 곤란 증후군 (이는 SP-B와 연관됨)이다. 특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 RNA 분자의 "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은 계면활성제 단백질 B (SP-B)에 대한 또는 에리트로포이에틴에 대한 서열을 함유한다. 본 발명에 따른 RNA 분자의 "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"에 의해 코딩될 수 있는 단백질의 추가 예는 성장 인자 예컨대 인간 성장 호르몬 hGH, BMP-2 또는 혈관형성 인자이다.

대안적으로 핵산은 전장 항체 또는 보다 작은 항체 (중쇄 및 경쇄 둘 다)를 코딩하여 대상체에게 면역을 부여할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은 기능적 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 코딩할 수 있으며, 이는 생물학적 표적 (예를 들어, 자극성 시토카인 예컨대 종양 괴사 인자)을 표적화 및/또는 불활성화하는데 유용할 수 있다. 유사하게, "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은, 예를 들어, 막증식 사구체 신염 제II형 또는 급성 용혈 요독 증후군의 치료에 유용한 기능성 항-신장 인자 항체를 코딩할 수 있거나, 대안적으로 VEGF-매개 질환, 예컨대 암의 치료에 유용한 항-혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 항체를 코딩할 수 있다.

모듈 (a), 즉, "폴리펩티드를 코딩하는, 그의 5' 말단에서 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은, 유전자 편집 기술에서 사용될 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역일 수 있다. 게놈 편집은 뉴클레아제를 사용하는 유기체의 게놈에서 DNA가 삽입, 결실 또는 대체되는 유전 공학의 한 유형이다. 이들 뉴클레아제는 게놈에서 원하는 위치에서 부위-특이적 파단(break)을 생성한다. 유도된 파단은 비-상동성 말단 연결 또는 상동성 재조합에 의해 복구되어, 게놈에서 표적화된 돌연변이를 결과함으로써, 게놈을 "편집"한다. 파단은 단일 가닥 파단 또는 이중 가닥 파단 (DSB)일 수 있지만 이중 가닥 파단 (DSB)이 바람직하다. 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 이용하는 수많은 게놈 편집 시스템, 즉, 예를 들어, CRISPR-Cas 시스템, 메가뉴클레아제(meganuclease), 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease) (ZFN) 및 전사 활성화제-유사 이펙터-기반 뉴클레아제 (TALEN)가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 게놈 공학을 위한 방법은 문헌 [Trends in Biotechnology, 2013, 31 (7), 397-405]에 검토되어 있다.

따라서, 바람직한 실시양태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 말단에서 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 Cas (CRISPR 연관 단백질) 단백질 패밀리, 바람직하게는 Cas9 (CRISPR 연관 단백질 9)의 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. Cas 단백질 패밀리, 바람직하게는 Cas9의 단백질은, CRISPR/Cas9 기반 방법 및/또는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술에서 사용될 수 있다. 게놈 편집, 조절 및 표적화를 위한 CRISPR-Cas 시스템은 문헌 [Nat. Biotechnol., 2014, 32(4):347-355]에 검토되어 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 말단에서 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 메가뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 메가뉴클레아제는 "통상적인" 엔도데옥시리보뉴클레아제와 대조적으로, 큰 인식 부위 (예를 들어, 12 내지 40개 염기 쌍의 이중 가닥 DNA 서열)를 인식하는 엔도데옥시리보뉴클레아제이다. 결과적으로, 각각의 부위는, 임의의 주어진 게놈에서 단지 수회, 바람직하게는 단지 1회 발생한다. 따라서 메가뉴클레아제는 가장 특이적인 자연적으로 발생하는 제한 효소로 간주되며, 따라서 유전자 편집 기술에서 적합한 도구이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 말단에서 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. ZFN은 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 DNA-절단 도메인에 융합시킴으로써 생성된 인위적인 제한 효소이다. 아연 핑거 도메인은 특정의 원하는 DNA 서열을 표적화하도록 조작될 수 있으며, 이로 인해 아연-핑거 뉴클레아제는 복잡한 게놈 내에서 특유한 서열을 표적화할 수 있게 된다. 내인성 DNA 복구 기계류를 이용함으로써, ZFN은 고등 생물의 게놈을 정확하게 변경하는데 사용될 수 있으며, 따라서, 유전자 편집 기술에서 적합한 도구이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 말단에서 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. TALEN은 DNA의 특정 서열을 커팅하도록 조작될 수 있는 제한 효소이다. TALEN은 TAL 이펙터 DNA-결합 도메인이 뉴클레아제의 DNA 절단 도메인에 융합되어 있는 융합 단백질이다. 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE)는 실제적으로 임의의 원하는 DNA 서열을 결합하도록 조작 될 수 있다. 따라서, 뉴클레아제와 조합될 때, DNA는 특정의 원하는 위치에서 커팅될 수 있다.

제2 모듈 (b)는 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)이다.

이 맥락에서 "하나 이상"은 RNA 분자의 모듈 (b)가 본 발명의 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나의 UTR을 보유할 수 있음을 의미한다. RNA 분자는 본 발명의 이들 UTR 중 2개, 3개 또는 4개를 또한 보유할 수 있다. 대안적으로, RNA 분자는 본 발명의 이들 UTR 중 5개 또는 심지어 그 초과를 또한 보유할 수 있다.

제3 모듈 (c)는 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들) (즉, 상기 모듈 (c))이다.

이 맥락에서 "하나 이상"은 RNA 분자의 모듈 (c)가 본 발명의 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나의 UTR을 보유할 수 있음을 의미한다. RNA 분자는 본 발명의 이들 UTR 중 2개, 3개 또는 4개를 또한 보유할 수 있다. 대안적으로, RNA 분자는 본 발명의 이들 UTR 중 5개 또는 심지어 그 초과를 또한 보유할 수 있다.

천연의 인간 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA) mRNA의 전장 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있으며 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 첨부된 실시예에서, 천연의 인간 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA) mRNA의 뉴클레오티드 36 내지 71로부터의 서열이 CYBA mRNA의 5' UTR 단편으로서 사용되었으며 (즉, 뉴클레오티드 서열 5'-CGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUGUCGCC-3' (서열번호 1))

천연의 인간 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA) mRNA의 뉴클레오티드 657 내지 723으로부터의 서열이 CYBA mRNA의 3' UTR로서 사용되었다 (즉, 뉴클레오티드 서열

5'-CCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCCGCCAGGUGCACCC ACCUGCAAUAAAUGCAGCGAAGCCGGGA-3' (서열번호 2)).

그러나, 본 발명에서 사용된 바와 같은 UTR은 서열번호 1의 상기 특정 서열로 특히 제한되지는 않으나 또한 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함하는 UTR 서열일 수 있다. 대안적으로, UTR 서열은 또한 서열번호 1과 비교하여 1 내지 3개의 치환을 나타내는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. UTR 서열은 또한 서열번호 1과 비교하여 1 내지 2개의 치환을 나타내는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. 가장 바람직하게는, UTR 서열은 또한 서열번호 1과 비교하여 1개의 치환을 나타내는 서열을 포함하는 서열일 수 있다.

바람직하게는, 서열번호 1과 비교하여 상기 뉴클레오티드 치환의 위치는 서열번호 1의 서열의 위치 32에서 수행된다. 바람직하게는, 이 위치에서 뉴클레오티드 "U"는 "C"에 의해 치환된다. 이 치환이 바람직한데 그 이유는 그것이 척추동물의 Kozak 공통 서열(consesus sequence)에 더 가까이 서열번호 1에 (부분적으로) 존재하는 CYBA의 Kozak 요소를 가져오기 때문이다. 척추동물의 Kozak 공통 서열은 GCCRCCAUGG의 서열을 가지며 (시작 코돈은 밑줄이 그어져 있으며 한편 "R"은 임의의 푸린을 나타낸다) 한편 CYBA의 Kozak 요소는 GuCGCCAUGG의 서열을 가지며 (시작 코돈은 밑줄이 그어져 있으며 한편 척추동물 공통 서열로부터의 이탈은 소문자 "u"로 표시된다).

서열번호 1과 비교하여 상기 치환 중 하나 이상을 갖는 UTR 서열(들)은 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 번역 효율 면에서 동일하거나 유사한 능력, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 번역 효율 면에서 더 높은 능력으로 RNA 분자를 결과할 수 있다. 번역 효율에 대하여 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 번역 효율 면에서 비교하여 주어진 변형된 UTR 서열의 특성/능력은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 및 첨부된 실시예에서 개요를 서술한 바와 같이 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.

번역 효율은 세포 내에서 폴리펩티드 또는 단백질로의 mRNA 번역의 비율이다. 주어진 mRNA의 번역 효율은 시간 단위당 mRNA당 번역되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수로서 측정된다. 번역은 세포 리보솜이 단백질을 생성시키는 과정이며 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 간단히 말하자면, 번역에서, DNA로부터 전사에 의해 생성되는 전령 RNA (mRNA)는 리보솜에 의해 디코딩되어 특정 아미노산 쇄 또는 폴리펩티드 또는 단백질을 생성시킨다.

따라서, 변형된 UTR 서열을 보유하는 주어진 RNA 분자의 번역 효율은 바람직하게는, 서열번호 1의 UTR을 보유하는 것을 제외하고는 동일한 주어진 RNA의 번역 효율과 비교하여 더 높다. 따라서, 시간 단위당 RNA당 번역되는 변형된 UTR 서열을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩된 단백질 또는 폴리펩티드의 수는 시간 단위당 RNA당 번역되는 서열번호 1의 UTR을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수보다 높다.

변형된 UTR 서열을 보유하는 주어진 RNA 분자의 번역 효율이 서열번호 1의 UTR을 보유하는 것을 제외하고는 동일한 주어진 RNA의 번역 효율과 비교하여 유사하거나 동일한 경우에, 시간 단위당 RNA당 번역되는 변형된 UTR 서열을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩된 단백질 또는 폴리펩티드의 수는 시간 단위당 RNA당 번역되는 서열번호 1의 UTR을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수와 유사하거나 동일하다.

"번역 효율"은, 예를 들어, 첨부된 실시예에서 기재되고 이하에 개요를 서술한 바와 같은 방법에 의해 결정될 수 있다.

번역 효율은, 본 발명의 맥락에서, 동일한 시점에서 상기 세포에서 각각의 단백질을 코딩하는 mRNA의 양과 관련하여 특정 시점에서 세포 내에서 단백질로 번역된 mRNA의 비율이다. 따라서, 번역 효율은 특정 시점에서 세포 내에서 단백질로 번역된 mRNA의 몫(quotient) 및 각각의 단백질을 코딩하는 mRNA의 양이다. 매개 변수 둘 다, 즉, 단백질로 번역된 mRNA뿐만 아니라 각각의 단백질을 코딩하는 mRNA의 양은, 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 첨부된 실시예에서 비제한적 예로서 행해진 바와 같이, 세포 내에서 단백질로 번역된 mRNA의 양은, 예를 들어, 유동 세포측정법 (FC)에 의해 결정될 수 있으며 한편 각각의 단백질을 코딩하는 mRNA의 양은, 예를 들어, qPCR에 의해 측정될 수 있다.

본 발명에서 사용된 바와 같은, 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 UTR(들)은 상기 특정 서열 및 상기 기재된 치환에 특히 제한되지는 않으나 또한 서열번호 1과 비교하여 (하나의) 뉴클레오티드(들) 첨가(들)를 나타내는 서열을 포함하는 (하나의) UTR 서열(들)에 관한 것일 수 있다. (하나의) 뉴클레오티드(들)의 첨가는 플랭킹일 수 있다. 따라서, 추가적 뉴클레오티드(들)는 본 발명의 UTR(들)의 3'-말단 또는 5'-말단에 첨가될 수 있다. 추가적 뉴클레오티드(들)는 0 (변화 없음), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개까지의 뉴클레오티드, 바람직하게는 20개까지의 뉴클레오티드 또는 훨씬 더 바람직하게는 30개까지의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 쇄를 포함한다. 뉴클레오티드의 첨가가 본 발명의 UTR(들)의 상기 기능적 특성을 변화시킬 가능성은 없을 것이라는 이론적 근거에 비추어, 뉴클레오티드의 첨가는 또한 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 심지어 100개까지의 뉴클레오티드 또는 훨씬 더, 200, 300, 400 또는 500개까지의 뉴클레오티드 서열의 길이를 가질 수 있는데 이는 이들 서열이 서열번호 1과 유사한 능력 (상기-기재된 번역 효율의 면에서), 바람직하게는 상기 정의된 바와 같이 서열번호 1보다 더 높은 번역 효율을 갖는 한이다.

대안적으로, 또는 (하나의) 뉴클레오티드(들)의 이들 플랭킹 첨가 이외에도 (하나의) 뉴클레오티드(들)의 첨가가 산재될 수 있다. 따라서, 추가적 뉴클레오티드(들)는 본 발명의 UTR(들)의 뉴클레오티드 서열에 첨가/삽입될 수 있다. 이들 뉴클레오티드(들) 삽입은 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드를 포함하는데 이는 이들 서열이 서열번호 1과 유사한 능력 (상기-기재된 번역 효율의 면에서), 바람직하게는 상기 정의된 바와 같이 서열번호 1보다 더 높은 번역 효율을 갖는 한이다.

본 발명에서 사용된 바와 같은 UTR은 서열번호 1의 상기 특정 서열 및 그의 변형에 특히 제한되지는 않는다. 더 정확히 말하면, 서열번호 1의 특정 서열 및 그의 변형은 CYB5' 코어 영역을 단지 정의한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 UTR은 적어도 1개의 뉴클레오티드에 의해 5' 말단 (즉, 상류)에서 연장된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 UTR은 1 내지 20개의 뉴클레오티드에 의해 5' 말단 (즉, 상류)에서 연장된다. 그러므로, 바람직한 실시양태에서, 서열번호 1의 서열은 서열번호 1에 대하여 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 (또는 서열번호 11의 상응하는 RNA 서열)에 나타낸 바와 같이 5' 말단 (즉, 상류)에서 20개의 뉴클레오티드에 의해 연장한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 서열번호 1의 서열은 서열번호 1에 대하여 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 (또는 서열번호 11의 상응하는 RNA 서열)에 나타낸 바와 같이 5' 말단 (즉, 상류)에서 18, 15, 13, 10, 7 또는 5개의 뉴클레오티드에 의해 연장한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 서열번호 1의 서열은 서열번호 1에 대하여 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 (또는 서열번호 11의 상응하는 RNA 서열)에 나타낸 바와 같이 5' 말단 (즉, 상류)에서 4, 5 또는 2개의 뉴클레오티드에 의해 연장한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 서열번호 1의 서열은 서열번호 1에 대하여 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 (또는 서열번호 11의 상응하는 RNA 서열)에 나타낸 바와 같이 5' 말단 (즉, 상류)에서 1개의 뉴클레오티드에 의해 연장한다.

서열번호 10은 서열번호 5 (DNA 수준에서 정의된 바와 같이)로 나타낸 인간 CYBA 유전자 5'UTR의 유전 코드의 부분이며 한편 서열번호 11은 상응하는 RNA 서열이다.

5' 말단 (즉, 상류)에서 연장되는 이들 UTR 서열은 서열번호 1에 대해 상기 본원에 정의된 바와 같이 또한 변형될 수 있다. 따라서, 서열번호 1의 UTR의 맥락에서 상기 설명된 바와 같이 상기 정의된 바와 같이 5 '말단에서 연장되는 UTR에 필요한 변경을 가하여 동일하게 적용된다.

게다가, 본 발명에서 사용된 바와 같은 UTR은 서열번호 2의 상기 특정 서열로 또한 특히 제한되지는 않으나 또한 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열을 포함하는 UTR 서열일 수 있다. 대안적으로, UTR 서열은 또한 서열번호 2와 비교하여 1 내지 6개의 치환을 나타내는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. UTR 서열은 또한 서열번호 2와 비교하여 1 내지 5개의 치환을 나타내는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. UTR 서열은 또한 서열번호 2와 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. UTR 서열은 또한 서열번호 2와 비교하여 1 내지 3개의 치환을 나타내는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. UTR 서열은 또한 서열번호 2와 비교하여 1 내지 2개의 치환을 나타내는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. UTR 서열은 또한 서열번호 2와 비교하여 1 내지 3개의 치환을 나타내는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. 가장 바람직하게는, UTR 서열은 또한 서열번호 2와 비교하여 1개의 치환을 나타내는 서열을 포함하는 서열일 수 있다.

서열번호 2와 비교하여 상기 치환 중 하나 이상을 갖는 UTR 서열(들)은 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 번역 효율 면에서 동일하거나 유사한 능력, 바람직하게는 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 번역 효율 면에서 더 높은 능력으로 RNA 분자를 결과할 수 있다. 번역 효율에 대하여 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 번역 효율 면에서 비교하여 주어진 변형된 UTR 서열의 특성/능력은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 및 첨부된 실시예에서 개요를 서술한 바와 같이 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.

번역 효율은 세포 내에서 폴리펩티드 또는 단백질로의 mRNA 번역의 비율이다. 주어진 mRNA의 번역 효율은 시간 단위당 mRNA당 번역되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수로서 측정된다. 번역은 세포 리보솜이 단백질을 생성시키는 과정이며 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 간단히 말하자면, 번역에서, DNA로부터 전사에 의해 생성되는 전령 RNA (mRNA)는 리보솜에 의해 디코딩되어 특정 아미노산 쇄 또는 폴리펩티드 또는 단백질을 생성시킨다.

따라서, 변형된 UTR 서열을 보유하는 주어진 RNA 분자의 번역 효율은 바람직하게는, 서열번호 2의 UTR을 보유하는 것을 제외하고는 동일한 주어진 RNA의 번역 효율과 비교하여 더 높다. 따라서, 시간 단위당 RNA당 번역되는 변형된 UTR 서열을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수는 시간 단위당 RNA당 번역되는 서열번호 2의 UTR을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수보다 높다.

변형된 UTR 서열을 보유하는 주어진 RNA 분자의 번역 효율이 서열번호 2의 UTR을 보유하는 것을 제외하고는 동일한 주어진 RNA의 번역 효율과 비교하여 유사하거나 동일한 경우에, 시간 단위당 RNA당 번역되는 변형된 UTR 서열을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수는 시간 단위당 RNA당 번역되는 서열번호 2의 UTR을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수와 유사하거나 동일하다.

"번역 효율"은, 예를 들어, 첨부된 실시예에서 기재되고 이하에 개요를 서술한 바와 같은 방법에 의해 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용된 바와 같은, 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 UTR(들)은 상기 특정 서열 및 상기 기재된 치환에 특히 제한되지는 않으나 또한 서열번호 2와 비교하여 (하나의) 뉴클레오티드(들) 첨가(들)를 나타내는 서열을 포함하는 (하나의) UTR 서열(들)에 관한 것일 수 있다. 뉴클레오티드(들)의 첨가는 플랭킹이거나 산재될 수 있다. 따라서, 추가적 뉴클레오티드(들)를 본 발명의 UTR(들)의 3'-말단 또는 5'-말단에 첨가할 수 있다. 대안적으로, 또는 이들 플랭킹 추가적 뉴클레오티드(들) 이외에도, 추가적 뉴클레오티드(들)는 또한 본 발명의 UTR(들)의 뉴클레오티드 서열 내에 있을 수 있다. 추가적 뉴클레오티드(들)는 0 (변화 없음), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개까지의 뉴클레오티드, 바람직하게는 20개까지의 뉴클레오티드 또는 훨씬 더 바람직하게는 30개까지의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 쇄를 포함한다. 뉴클레오티드의 첨가가 본 발명의 UTR(들)의 상기 기능적 특성을 변화시킬 가능성은 없을 것이라는 이론적 근거에 비추어, 뉴클레오티드의 첨가는 또한 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 심지어 100개까지의 뉴클레오티드 또는 훨씬 더, 200, 300, 400 또는 500개까지의 뉴클레오티드 서열의 길이를 가질 수 있는데 이는 이들 서열이 서열번호 2와 유사한 능력 (상기-기재된 번역 효율의 면에서), 바람직하게는 상기 정의된 바와 같이 서열번호 2보다 더 높은 번역 효율을 갖는 한이다.

본 발명의 UTR(들)뿐만 아니라 이러한 UTR(들)을 함유하는 RNA 분자는 재조합으로 (예를 들어, 생체내 또는 시험관내 시스템에서) 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 합성적으로 생성/합성될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 UTR 및 이러한 UTR(들)을 함유하는 RNA 분자는 재조합으로 생체내 시스템에서 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 UTR 및 이러한 UTR(들)을 함유하는 RNA 분자는, 예를 들어, 시험관내 전사 시스템을 사용하는 시험관내 시스템에서 생성될 수 있다. 시험관내 전사 시스템은 일반적으로 공지되어 있으며 이하에 더 상세히 개요를 서술한 바와 같이 모듈 (b) 및/또는 모듈 (c)를 "코딩하는" DNA 서열을 함유하는 정제된 선형 DNA 주형을 통상 필요로 하며 여기서 상기 DNA 서열은 적절한 프로모터의 제어하에 있다. 게다가, 시험관내 전사 시스템은 또한 리보뉴클레오시드 트리포스페이트, DTT 및 마그네슘 이온을 포함하는 완충제 시스템, 및 본 발명의 UTR(들)로 모듈 (b) 및/또는 모듈 (c)를 "코딩하는" DNA 서열의 시험관내 전사에 효소 활성을 제공하는 적절한 RNA 폴리머라제를 통상적으로 필요로 한다.

더욱이, 본 발명의 UTR 및 이러한 UTR(들)을 함유하는 RNA 분자는, 예를 들어, 고상 지지체 및 표준 기술을 사용하는 자동화된 뉴클레오티드 서열 합성기 상에서 통상적인 화학적 합성에 의해 또는 각각의 DNA-서열의 화학적 합성 및 동일한 DNA 서열의 후속 시험관내 또는 생체내 전사에 의해 화학적으로 합성될 수 있다.

상기에 따르면, 본 발명은 RNA 분자/폴리리보핵산 분자, 바람직하게는 변형된 폴리리보핵산 분자를 제공하며, 상기 RNA 분자의 한 모듈, 즉, "그의 5' 말단에서 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역" (모듈 (a))은 폴리펩티드를 코딩한다. 용어 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 교대해서 사용되며 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 용어 뉴클레오티드는 데옥시뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 용어 리보핵산 및 폴리리보뉴클레오티드는 교대해서 사용되며, 특정 실시양태에서, 50% 초과의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드인 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 초과, 95% 초과, 99% 초과 또는 100%의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드인 뉴클레오티드의 중합체를 포함한다. 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 폴리리보뉴클레오티드로서 언급될 수 있다. 그러나, 용어 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 폴리리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드의 서열은, 예를 들어, 관심 유전자의 유전 정보를 포함하는 임의의 적합한 핵산으로부터 유래될 수 있다. 핵산의 예는 관심 유전자(들)를 포함하는 임의의 박테리아 또는 고세균으로부터의 게놈 DNA, RNA 또는 cDNA를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 돌연변이된 유전자 및 다형성을 갖는 핵산으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 특히 제한되지는 않으며 모듈 A로서, 주어진 세포에서 발현되는 임의의 원하는 코딩 영역을 포함할 수 있는 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 서열은 상기에서 개요를 서술한 바와 같이 원하는 폴리펩티드/단백질을 코딩하는 코딩 영역일 수 있다. 바람직하게는, 상기에 따라, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 모듈 A의 시작 코돈의 상류에 (5') 위치된 비번역 서열, 모듈 A의 정지 코돈의 하류에 (3') 위치된 비번역 서열, 또는 모듈 A의 시작 코돈의 상류에 (5') 위치된 비번역 서열 및 모듈 A의 정지 코돈의 하류에 (3') 위치된 비번역 서열 둘 다를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드일 수 있다.

4가지 전통적인 리보뉴클레오티드, 즉, 아데노신, 구아노신, 시티딘 및 우리딘 이외에도, 이들 핵염기들 각각의 수많은 유사체가 존재한다. 때때로 문헌 전반에 걸쳐 그리고 문헌에서, 이들 유사체, 또는 이들 유사체 중 하나 이상을 포함하는 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 변형된 (예를 들어, 변형된 뉴클레오티드 또는 변형된 리보뉴클레오티드) 것으로서 언급된다. 일부 유사체는 상기 규범적인 핵염기와 상이하나, 자연에 존재할 수 있다. 기타 유사체는 자연적으로 발생하지 않는다. 둘 중 어느 유형의 유사체도 고려된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다 (예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다). 예시적인 뉴클레오티드 유사체는 이하에 제공된다 (예를 들어, U의 유사체; C의 유사체; A의 유사체; G의 유사체). 게다가, 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 또는 기타 핵산은 포스포디에스테르 백본에서의 또는 핵염기 사이의 결합에서의 변형을 (추가적으로 또는 대안으로) 또한 포함할 수 있다. 본 개시내용의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드의 부분 또는 전부를 형성할 수 있는 예시적인 핵산은 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 트레오스 핵산 (TNA), 글리콜 핵산 (GNA), 펩티드 핵산 (PNA), 잠김(locked) 핵산 (LNA, 베타-D-리보 배위를 갖는 LNA, 알파-L-리보 배위를 갖는 알파-LNA (LNA의 부분입체 이성질체), 2'-아미노 관능화를 갖는 2'-아미노-LNA, 및 2'-아미노 관능화를 갖는 2'-아미노-알파-LNA) 또는 그의 하이브리드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

특정 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오시드(들) 상에서 또는 핵산/폴리뉴클레오티드 분자의 백본 상에서 일 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형은 뉴클레오시드 상에서 및 백본 연결 상에서 둘 다일 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형은 시험관내 폴리뉴클레오티드로 조작될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 리보뉴클레오티드/뉴클레오티드는 전통적/천연 뉴클레오티드/리보뉴클레오티드의 공유 변형에 의해 전사후에 또한 합성될 수 있다.

본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드일 수 있거나, 특정 실시양태에서, 푸린의 유사체 및/또는 피리미딘의 유사체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 피리미딘 유사체, 예컨대 우리딘의 유사체 및/또는 시티딘의 유사체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 우리딘의 유사체 및 시티딘의 유사체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 아데노신의 유사체 및/또는 구아노신의 유사체를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 단일 유형의 우리딘 유사체 및 단일 유형의 시티딘 유사체 (예를 들어, 단일 분자의 유사체가 아닌, 한 유형의 유사체 - 단일 유사체는 본원에 기재된 몇몇 백분율 중 어느 하나로 존재할 수 있다)를 포함한다. 다른 실시양태에서, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 우리딘 및/또는 시티딘의 하나 초과 유형의 유사체 및, 임의로 그리고 존재할 경우, 아데노신 및/또는 구아노신의 하나 이상의 유사체 (또는 둘 중 하나 또는 둘 다 없음)를 포함한다.

일부 경우에 변형된 우리딘 (예를 들어, 우리딘의 유사체)은 2-티오우리딘, 5'-메틸우리딘, 슈도우리딘, 5-아이오도우리딘 (I5U), 4-티오우리딘 (S4U), 5-브로모우리딘 (Br5U), 2'-메틸-2'-데옥시우리딘 (U2'm), 2'-아미노-2'-데옥시우리딘 (U2'NH₂), 2'-아지도-2'-데옥시우리딘 (U2'N₃), 및 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘 (U2'F)로부터 선택된다. 일부 경우에, 변형된 시티딘 (예를 들어, 시티딘의 유사체)은 5-메틸시티딘, 3-메틸시티딘, 2-티오-시티딘, 2'-메틸-2'-데옥시시티딘 (C2'm), 2'-아미노-2'-데옥시시티딘 (C2'NH2), 2'-플루오로-2'-데옥시시티딘 (C2'F), 5-아이오도시티딘 (I5C), 5-브로모시티딘 (Br5C) 및 2'-아지도-2'-데옥시시티딘 (C2'N3)으로부터 선택된다. 유사체를 지칭할 때, 전술한 것은 또한 그의 5' 트리포스페이트 형태의 유사체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 시티딘 유사체는 5-아이오도시티딘이고 우리딘 유사체는 5-아이오도우리딘이다.

일부 실시양태에서, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 비-변형 (또는 비변형된) RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드와 비교하여 적어도 25% 더 안정적이다. 일부 경우에, 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 비-변형 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드와 비교하여 적어도 30% 더 안정적, 적어도 35% 더 안정적, 적어도 40% 더 안정적, 적어도 45% 더 안정적, 적어도 50% 더 안정적, 적어도 55% 더 안정적, 적어도 60% 더 안정적, 적어도 65% 더 안정적, 적어도 70% 더 안정적, 적어도 75% 더 안정적, 적어도 80% 더 안정적, 적어도 85% 더 안정적, 적어도 90% 더 안정적, 또는 적어도 95% 더 안정적이다. 특정 실시양태에서, 안정성은 생체내에서 측정된다. 특정 실시양태에서, 안정성은 시험관내에서 측정된다. 특정 실시양태에서, 안정성은 폴리리보뉴클레오티드의 반감기를 측정함으로써 정량화된다.

본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 동일한 형태로 변형된 뉴클레오티드 또는 상이한 변형된 뉴클레오티드의 혼합물을 가질 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 전령 RNA에서 자연적으로 발생하거나 자연적으로 발생하지 않는 변형을 가질 수 있다. 다양한 변형된 뉴클레오티드의 혼합물이 사용될 수 있다. 예를 들어 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 내에 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드는 자연 변형을 가질 수 있으며, 한편 또 다른 부분은 mRNA에서 자연적으로 발견되지 않는 변형을 갖는다. 게다가, 일부 변형된 뉴클레오티드는 염기 변형을 가질 수 있으며, 한편 다른 변형된 뉴클레오티드는 당 변형을 갖는다. 동일한 방법으로, 모든 변형은 염기 변형이거나 모든 변형은 당 변형 또는 그의 임의의 적합한 혼합인 것이 가능한다. 일부 경우에, 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드의 안정성은 변형된 폴리리보뉴클레오티드 내에서 변형된 염기의 성질을 변화시킴으로써 선택적으로 최적화될 수 있다.

<표 2>

특정 실시양태에서, 유사체 (예를 들어, 변형된 뉴클레오티드)는 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드, 5-아이오도우리딘, 5-아이오도시티딘, 5-아자-우리딘, 2'-아미노-2'-데옥시시티딘, 2'-플루오르-2'-데옥시시티딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-히드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카르복시메틸-우리딘, 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-l-메틸-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-l-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-l-데아자-슈도우리딘, 디히드로우리딘, 디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, 5-메틸시티딘, N4-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-l-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-l-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-l-데아자-슈도이소시티딘, 제불라린, 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 4-메톡시-l-메틸-슈도이소시티딘, 2-아미노푸린, 2,6-디아미노푸린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노푸린, 7-데아자-8-아자-2-아미노푸린, 7-데아자-2,6-디아미노푸린, 7-데아자-8-아자-2,6- 디아미노푸린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐) 아데노신, N6-글리시닐카르바모일아데노신, N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카르바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신, 와이부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 슈도우리딘을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 5-메틸 시티딘을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 5-메틸 우리딘을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 U의 유사체 및 C의 유사체를 포함하며, 여기서 이러한 U의 유사체는 모두 동일한 유사체일 수 있거나 상이한 유사체 (예를 들어, 하나 초과 유형의 유사체)일 수 있으며, 여기서 이러한 C의 유사체는 모두 동일한 유사체일 수 있거나 상이한 유사체 (예를 들어, 하나 초과 유형의 유사체)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 아데노신의 유사체 및 구아노신의 유사체를 포함하지 않는다.

본원에 상세히 기재된 바와 같이, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드가 변형된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 경우, 유사체는 화합물 내에 뉴클레오티드의 특정 비율로서 존재할 수 있다 (예를 들어, 주어진 핵염기의 주어진 백분율은 본원에 기재된 바와 같이 유사할 수 있다).

적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 5%의 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 변형되거나 자연적으로 발생하지 않는 (예를 들어, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 또는 우리딘의 유사체 또는 변형된) 아데노신, 시티딘, 구아노신, 또는 우리딘, 예컨대 본원에 기재된 유사체 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%의 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 변형되거나 자연적으로 발생하지 않는 (예를 들어, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 또는 우리딘의 유사체 또는 변형된) 아데노신, 시티딘, 구아노신, 또는 우리딘을 포함한다. 일부 경우에, 많아야 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%의 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 변형되거나 자연적으로 발생하지 않는 아데노신, 시티딘, 구아노신, 또는 우리딘을 포함한다.

바람직한 실시양태에서 본 발명의 RNA 분자는 변형된 뉴클레오티드와 비변형된 뉴클레오티드의 조합을 함유한다. 바람직하게는, 본 발명의 RNA 분자는 WO　2011/012316에 기재된 바와 같이 변형된 뉴클레오티드와 비변형된 뉴클레오티드의 조합을 함유한다. 이러한 RNA 분자는 또한 "SNIM^®-RNA"로서 공지되어 상업화되어 있다. WO　2011/012316에 기재된 RNA 분자는 증가된 안정성 및 감소된 면역원성을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 변형된 RNA 분자에서 5 내지 50%의 시티딘 뉴클레오티드 및 5 내지 50%의 우리딘 뉴클레오티드가 변형되어 있다. 아데노신- 및 구아노신-함유 뉴클레오티드는 비변형될 수 있다. 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드는 비변형되거나 부분 변형될 수 있고, 이들은 바람직하게는 비변형된 형태로 존재한다. 바람직하게는 10 내지 35%의 시티딘 및 우리딘 뉴클레오티드가 변형되며 특히 바람직하게는 변형된 시티딘 뉴클레오티드의 함량은 7.5 내지 25% 범위에 있고, 변형된 우리딘 뉴클레오티드의 함량은 7.5 내지 25% 범위에 있다. 실제로는 상대적으로 낮은 함량, 예를 들어, 각각 단지 10%의 변형된 시티딘 및 우리딘 뉴클레오티드는 원하는 특성을 달성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 변형된 시티딘 뉴클레오티드가 5-메틸시티딘 잔기이고 변형된 우리딘 뉴클레오티드가 2-티오우리딘 잔기인 것이 특히 바람직하다. 가장 바람직하게는, 변형된 시티딘 뉴클레오티드의 함량 및 변형된 우리딘 뉴클레오티드의 함량은 각각 25%이다.

특정 다른 실시양태에서, 이러한 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자에서, 5 내지 50%의 시티딘은 C의 유사체이며 5 내지 50%의 우리딘은 U의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 이러한 변형된 폴리리보뉴클레오티드 분자에서 5 내지 40%의 시티딘은 C의 유사체이며 5 내지 40%의 우리딘은 U의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 이러한 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자에서 5 내지 30%의 시티딘은 C의 유사체이며 5 내지 30%의 우리딘은 U의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 이러한 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자에서 10 내지 30%의 시티딘은 C의 유사체이며 10 내지 30%의 우리딘은 U의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 이러한 변형된 폴리리보뉴클레오티드 분자에서 5 내지 20%의 시티딘은 C의 유사체이며 5 내지 20%의 우리딘은 U의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 이러한 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자에서 5 내지 10%의 시티딘 뉴클레오티드및 5 내지 10%의 우리딘 뉴클레오티드는 변형된 것이다. 특정 실시양태에서, 이러한 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자에서 25%의 시티딘 뉴클레오티드 및 25%의 우리딘 뉴클레오티드는 변형된 것이다. 특정 실시양태에서, 아데노신- 및 구아노신-함유 뉴클레오티드는 비변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드는 비변형되거나 부분적으로 변형될 수 있으며, 이들은 바람직하게는 비변형된 형태로 존재한다.

상기 언급된 바와 같이, 특정 실시양태에서, U의 유사체는 단일 유형의 U의 유사체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, U의 유사체는 2종 이상의 유형의 U의 유사체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, C의 유사체는 단일 유형의 C의 유사체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, C의 유사체는 2종 이상의 유형의 C의 유사체를 지칭한다.

특정 실시양태에서, 시티딘의 유사체인 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 중 시티딘의 백분율은 우리딘의 유사체인 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 중 우리딘의 백분율과 동일하지 않다. 특정 실시양태에서, 시티딘의 유사체의 백분율은 우리딘의 유사체의 백분율보다 낮다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 아데노신 및 구아노신의 유사체의 존재 또는 부재하에 있을 수 있으나, 특정 실시양태에서, 아데노신의 유사체 및 구아노신의 유사체의 부재하에 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리리보뉴클레오티드는 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 2% 미만의 아데노신의 유사체, 구아노신의 유사체 또는 둘 다를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 시티딘의 유사체 및 우리딘의 유사체를 포함하며, 5 내지 20%의 시티딘은 시티딘의 유사체이며 25 내지 45%의 우리딘은 우리딘의 유사체이다. 환언하면, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 변형된 및 비변형된 시티딘 및 변형된 및 비변형된 우리딘을 포함하며, 5 내지 20%의 시티딘은 시티딘의 유사체를 포함하며 한편 25 내지 45%의 우리딘은 우리딘의 유사체를 포함한다. 다른 실시양태에서, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 5 내지 10%의, 시티딘의 유사체 및 30 내지 40%의, 우리딘의 유사체, 예컨대 7-9%의, 시티딘의 유사체, 예컨대 약 7, 7.5 또는 8% 및, 예컨대 32-38%의, 우리딘의 유사체, 예컨대 약 33, 34, 35, 36%를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 우리딘의 유사체 및 시티딘의 유사체 중 어느 한 유사체는, 임의로 슈도우리딘을 제외하고, 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 시티딘의 유사체는 (예를 들어, 그로 이루어진 경우에, 그것은 사용된 단일 유사체 유형이다) 5-아이오도시티딘을 포함하거나 그로 이루어지며 우리딘의 유사체는 (예를 들어, 그로 이루어진 경우에, 그것은 사용된 단일 유사체 유형이다) 5-아이오도우리딘을 포함하거나 그로 이루어진다.

전술한 내용 중 어느 하나의 특정 실시양태에서, 주어진 뉴클레오티드의 유사체의 백분율은 투입(input) 백분율 (예를 들어, 출발 반응, 예컨대 출발 시험관내 전사 반응 중 유사체의 백분율)을 지칭한다. 전술한 내용 중 어느 하나의 특정 실시양태에서, 주어진 뉴클레오티드의 유사체의 백분율은 산출(output) (예를 들어, 합성되거나 전사된 화합물 중의 백분율)을 지칭한다.

본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자는 이하에 추가로 더 상세히 기재되는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 생체내 시스템에서 재조합으로 생성될 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 변형된 폴리리보뉴클레오티드 분자는 예를 들어, 이하에 추가로 더 상세히 기재되는 시험관내 전사 시스템을 사용하여 시험관내 시스템에서 생성될 수 있다. RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있는 시험관내 전사 시스템은 본 발명의 원하는 특성을 가진 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드를 생성시키기 위해 변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트와 비변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트의 투입 혼합물을 필요로 한다. 특정 실시양태에서, 5 내지 50%의 시티딘은 이러한 투입 혼합물 중 시티딘의 유사체이며 5 내지 50%의 우리딘은 이러한 투입 혼합물 중 우리딘의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 5 내지 40%의 시티딘은 이러한 투입 혼합물 중 시티딘의 유사체이며 5 내지 40%의 우리딘은 이러한 투입 혼합물 중 우리딘의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 5 내지 30%의 시티딘은 이러한 혼합물 중 시티딘의 유사체이며 5 내지 30%의 우리딘은 이러한 투입 혼합물 중 우리딘의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 5 내지 30%의 시티딘은 이러한 혼합물 중 시티딘의 유사체이며 10 내지 30%의 우리딘은 이러한 혼합물 중 우리딘의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 5 내지 20%의 시티딘은 이러한 투입 혼합물 중 시티딘의 유사체이며 5 내지 20%의 우리딘은 이러한 투입 혼합물 중 우리딘의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 5 내지 10%의 시티딘은 이러한 투입 혼합물 중 시티딘의 유사체이며 5 내지 10%의 우리딘은 이러한 투입 혼합물 중 우리딘의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 25%의 시티딘은 이러한 투입 혼합물 중 시티딘의 유사체이며 25%의 우리딘은 이러한 투입 혼합물 중 우리딘의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 투입 혼합물은 아데노신의 유사체 및/또는 구아노신을 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, 임의로, 투입 혼합물은 아데노신 및/또는 구아노신의 하나 이상의 유사체 (또는 둘 중 하나 또는 둘 다 없음)를 포함한다.

특정 실시양태에서, 시티딘의 유사체인 투입 혼합물 중 시티딘의 백분율은 우리딘의 유사체인 투입 혼합물 중 우리딘의 백분율과 동일하지 않다. 특정 실시양태에서, 투입 혼합물 중 시티딘의 유사체의 백분율은 투입 혼합물 중 우리딘의 유사체의 백분율보다 낮다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 투입 혼합물 중 아데노신 및 구아노신의 유사체의 존재 또는 부재하에 있을 수 있으나, 특정 실시양태에서, 투입 혼합물 중 아데노신의 유사체 및 구아노신의 유사체의 부재하에 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드를 생성하는 시험관내 전사 시스템을 위한 뉴클레오티드의 투입 혼합물은 시티딘의 유사체 및 우리딘의 유사체를 포함하며, 투입 혼합물의 5 내지 20%의 시티딘은 시티딘의 유사체이며 투입 혼합물의 25 내지 45%의 우리딘은 우리딘의 유사체이다. 환언하면, 투입 혼합물은 변형된 및 비변형된 시티딘 및 변형된 및 비변형된 우리딘을 포함하며, 투입 혼합물의 5 내지 20%의 시티딘은 시티딘의 유사체를 포함하며 한편 투입 혼합물의 25 내지 45%의 우리딘은 우리딘의 유사체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 투입 혼합물은 5 내지 10%의, 시티딘의 유사체 및 30 내지 40%의, 우리딘의 유사체, 예컨대 7-9%의, 시티딘의 유사체, 예컨대 7, 7.5 또는 8% 및, 예컨대 32-38%의, 우리딘의 유사체, 예컨대 33, 34, 35, 36%를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 우리딘의 유사체 및 시티딘의 유사체 중 어느 한 유사체는, 임의로 슈도우리딘을 제외하고, 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 시티딘의 유사체는 (예를 들어, 그것은 사용된 단일 C 유사체 유형이다) 5-아이오도시티딘을 포함하거나 그로 이루어지며 우리딘의 유사체는 (예를 들어, 그것은 사용된 단일 U 유사체 유형이다) 5-아이오도우리딘을 포함하거나 그로 이루어진다.

예시적인 유사체는 상기 표에 기재되어 있다. 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 폴리리보뉴클레오티드 (모듈 (a))의 경우, 달리 명시되지 않는 한, 유사체 및 변형의 수준은 5' 및 3' 비번역 영역을 포함한, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 전체 폴리리보뉴클레오티드 (모듈 (a))에 걸쳐 고려된다는 점 (예를 들어, 변형의 수준은 유사체가 전사되는 위치에 혼입될 수 있도록 시험관내 전사 반응에서 유사체의 투입 비율을 기준으로 한다)을 이해하여야 한다.

더욱이, 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자는, 예를 들어, 고상 지지체 및 표준 기술을 사용하는 자동화된 뉴클레오티드 서열 합성기 상에서 통상적인 화학적 합성에 의해 또는 각각의 DNA 서열의 화학적 합성 및 동일한 DNA 서열의 후속 시험관내 또는 생체내 전사에 의해 화학적으로 합성될 수 있다.

분자 생물학과 유전학에서 상류 및 하류는 둘 다 RNA 분자의 상대적 위치를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 상류는 RNA 분자의 5'말단을 향하며 하류는 분자의 3' 말단을 향한다.

따라서, 한 실시양태에서, UTR 모듈 (b) (즉, 상기에 정의된 바와 같이 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들))는 모듈 (a)의 코딩 영역의 상류에 위치한다. 게다가, 한 실시양태에서, UTR 모듈 (c) (즉, 상기에 정의된 바와 같이 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들))은 모듈 (a)의 코딩 영역의 하류에 위치한다. 그러나, 바람직하게는, 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역 (즉, 모듈 (a))은 UTR 모듈 (b)와 UTR 모듈 (c) 사이에 위치하며, 따라서, RNA 분자는 바람직하게는 5'-(b)-(a)-(c)-3'의 배열을 갖는다.

RNA 분자가 하나의 UTR 모듈 (즉, 모듈 (b) (즉, 상기에 정의된 바와 같이 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들) 또는 모듈 (c) (즉, 상기에 정의된 바와 같이 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들) 중 어느 하나)을 단지 보유하는 경우에 RNA 분자는 바람직하게는 5'-(b)-(a)-3' 또는 5'-(a)-(c)-3'의 배열을 갖는다.

The RNA 분자는 모듈 (a), (b) 및/또는 (c)의 융합 RNA 서열의 형태, 즉, 상기 모듈을 코딩하는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열을 조합함으로써 제조된 하이브리드 유전자의 발현에 의해 형성되는 (융합) RNA 분자로 존재할 수 있다. 전형적으로, 이하에 추가로 더 상세히 설명되는 바와 같이, 이것은 RNA 분자의 번역을 가능하게 하는 발현 벡터 내로 cDNA를 클로닝함으로써 완수될 수 있다. 따라서, 본 발명의 RNA 분자를 코딩하는 DNA 분자는 융합 DNA 서열일 수 있으며, 즉 하나의 모듈의 각각의 말단과 또 다른 분자의 말단 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는, 또 다른 뉴클레오티드 상의 3' 탄소에 결합된 하나의 뉴클레오티드로부터 포스페이트 기를 통해 2종 이상의 폴리뉴클레오티드를 연결함으로써 형성되는 키메라 분자일 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 적어도 2개의 모듈, 바람직하게는 모든 3개의 모듈을 코딩하는 상기 DNA 분자는 본 발명의 면에서 DNA 분자의 형태로 함께 연결된다. 일단 프레임에 클로닝되면, 그 다음에 이러한 재조합 DNA 분자는 상기 단백질, 폴리펩티드 또는 효소 분자를 코딩하는 그의 상응하는 RNA 핵산 서열로 전사된다.

대안적으로, 적어도 2개의 모듈, 바람직하게는 모든 세개의 모듈은 화학적 접합체에 의해 또한 공유 결합될 수 있다. 따라서, 이하에 추가로 더 상세히 개요를 서술하는 바와 같이, RNA 분자의 모듈은 개별적으로 화학적으로 합성되며 그 후에 상기에 개요를 서술한 바와 같이 포스포디에스테르 결합에 공유 결합으로 결합될 수 있다.

하기에서, 코딩 영역 (a)와 관련하여 본 발명의 UTR 모듈 (b) 및/또는 (c)의 바람직한 배열이 기재되며, 여기서 UTR 모듈 (b) (CYBA mRNA의 상기-정의된 5' UTR 단편에 상응)은 코딩 영역의 상류에 (즉, 코딩 영역의 5' 말단에) 위치하며/하거나 UTR 모듈 (c) (CYBA mRNA의 상기-정의된 3' UTR에 상응)는 코딩 영역의 하류에 (즉, 코딩 영역의 3' 말단에) 위치된다.

따라서, 바람직한 실시양태에서, 그리고 전술한 바에 따르면, 본 발명은 (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및 (b) 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)을 포함하는 RNA 분자로서, 여기서 (a)에서의 폴리펩티드를 코딩하는 상기 코딩 영역이 상기 본원에 정의된 바와 같이 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)를 코딩하는 코딩 영역이 아니며 여기서 (b)에 정의된 바와 같은 상기 UTR(들)은 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 5' 말단에 위치하는 것인, RNA 분자에 관한 것이다.

바람직한 실시양태에서, 그리고 전술한 바에 따르면, 본 발명은 (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및 (c) 상기 코딩 영역의 하류에 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)을 포함하는 RNA 분자로서, 여기서 (a)에서의 폴리펩티드를 코딩하는 상기 코딩 영역이 상기 본원에 정의된 바와 같이 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)를 코딩하는 코딩 영역이 아니며 여기서 (c)에 정의된 바와 같은 상기 UTR(들)은 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 말단에 위치하는 것인, RNA 분자에 관한 것이다.

바람직한 실시양태에서, 그리고 전술한 바에 따르면, 본 발명은 (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및 (b) 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들); 및 (c) 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)을 포함하는 RNA 분자로서, 여기서 (a)에서의 폴리펩티드를 코딩하는 상기 코딩 영역이 상기 본원에 정의된 바와 같이 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)를 코딩하는 코딩 영역이 아니며 여기서 (b)에 정의된 바와 같은 상기 UTR(들)은 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 5' 말단에 위치하며 여기서 (c)에 정의된 바와 같은 상기 UTR(들)은 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 말단에 위치하는 것인, RNA 분자에 관한 것이다.

바람직한 실시양태에서, 그리고 전술한 바에 따르면, 본 발명은 (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및 (b) 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나의 UTR; 및 (c) 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 2개의 UTR을 포함하는 RNA 분자로서, 여기서 (a)에서의 폴리펩티드를 코딩하는 상기 코딩 영역이 상기 본원에 정의된 바와 같이 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)를 코딩하는 코딩 영역이 아니며 여기서 상기 RNA 분자는 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 5' 말단에 (b)에 정의된 바와 같은 하나의 UTR을 포함하며 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 말단에 (c)에 정의된 바와 같은 상기 2개의 UTR을 포함하는 것인, RNA 분자에 관한 것이다.

바람직한 실시양태에서, 그리고 전술한 바에 따르면, 본 발명은 (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및 (c) 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 2개의 UTR을 포함하는 RNA 분자로서, 여기서 (a)에서의 폴리펩티드를 코딩하는 상기 코딩 영역이 상기 본원에 정의된 바와 같이 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)를 코딩하는 코딩 영역이 아니며 여기서 상기 RNA 분자는 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 말단에 (c)에 정의된 바와 같은 상기 2개의 UTR을 포함하는 것인, RNA 분자에 관한 것이다.

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 RNA 분자는 폴리-A 테일을 또한 보유할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 폴리-A 테일은 RNA의 3' 말단에 위치한 아데닌 뉴클레오티드의 서열에 관한 것이다. 폴리-A 테일은 폴리아데닐화로 칭해지는 과정에 의해 RNA의 3' 말단에 통상적으로 첨가된다. 따라서, 본 발명은 RNA 분자가 3' 말단에서 폴리-A 테일을 포함하는 것인, 상기-기재된 RNA 중 어느 하나에 관한 것이다.

폴리-A 테일의 길이는 특히 제한되지는 않는다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 3' 말단에서 폴리-A 테일을 포함하며 여기서 폴리-A 테일는 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 110개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 3' 말단에서 폴리-A 테일을 포함하며 여기서 폴리-A 테일은 적어도 120개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 3' 말단에서 폴리-A 테일을 포함하며 여기서 폴리-A 테일은 적어도 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.

본 발명의 RNA 분자가 이하에 추가로 본원에 기재된 바와 같이 시험관내 전사 방법에 의해 생성되는 경우에 폴리-A 테일은 RNA 구축물의 3' 말단에 있는 UTR에 인접한 RNA의 3' 말단에 위치하며 한편 본 발명의 RNA 분자를 보유하는 플라스미드는 폴리-A 테일의 하류에 시험관내 전사 이전에 선형화되어 시험관내 전사된 RNA 분자가 상기 폴리-A 테일을 함유하는 것을 보장하도록 한다.

본 발명에 따른 구축물은 상기 세 가지 주요 모듈 (a), (b) 및/또는 (c)를 단지 포함하지 않을 수 있다. 더 정확히 말하면, 개별 모듈 (a) 사이에, 예를 들어, 구축물의 구축을 용이하게 할 수 있는, 링커 모이어티/모이어티 및/또는 (a) 다중 클로닝 부위(들)가 배치되는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 링커 모이어티 및 다중 클로닝 부위는 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

바람직하게는, 본 발명의 구축물은 플라스미드 pVAX1 (인비트로겐(Invitrogen))로부터 유래되는 다중 클로닝 부위를 보유한다. 실시예 부분에서 개요를 서술한 바와 같은 모든 구축물은 WO2013/182683 A1에 이전에 기재된 구축물 pVAX A120으로부터 유래한다.

모듈 (a) (즉, 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내에 UTR 모듈 (b) 및/또는 (c)의 위치는 특히 제한되지는 않으며, 따라서, 본 발명의 RNA 분자의 개별 모듈 사이에 주요 모듈 (a), (b) 및/또는 (c)의 부분이 아닌 하나 이상의 뉴클레오티드 G, A, U 및/또는 C로 채워진 스페이싱(spacing) 또는 갭(gap)이 있을 수 있다.

이 맥락에서 "하나 이상의 뉴클레오티드 G, A, U 및/또는 C"는 본 발명의 RNA 분자의 개별 모듈 사이에 스페이싱 또는 갭이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드 G, A, U 및/또는 C로 채워짐을 의미한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자의 개별 모듈 사이에 스페이싱 또는 갭은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 110개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 G, A, U 및/또는 C로 채워진다.

그러나, 바람직한 실시양태에서, 모듈 (a) (즉, 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내에 UTR 모듈 (b) 또는 (c)는, 그 사이에 어떠한 스페이싱 또는 갭이 없이 모듈 (a)의 코딩 영역의 시작 코돈에 바로 인접하게, 즉, 모듈 (a)의 코딩 영역의 시작 코돈의 바로 상류에 배치된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 모듈 (a) (즉, 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내에 UTR 모듈 (b) 또는 (c)는, 그 사이에 어떠한 스페이싱 또는 갭이 없이 모듈 (a)의 코딩 영역의 종결 코돈 (즉, 정지 코돈)에 바로 인접하게, 즉, 모듈 (a)의 코딩 영역의 종결 코돈/정지 코돈의 바로 하류에 배치된다.

바람직한 실시양태에서, 모듈 (a) (즉, 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내에 UTR 모듈 (b)는, 그 사이에 어떠한 스페이싱 또는 갭이 없이 모듈 (a)의 코딩 영역의 시작 코돈에 바로 인접하게, 즉, 모듈 (a)의 코딩 영역의 시작 코돈의 바로 상류에 배치되며 모듈 (a) (즉, 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내에 UTR 모듈 (c)는, 그 사이에 어떠한 스페이싱 또는 갭이 없이 모듈 (a)의 코딩 영역의 종결 코돈 (즉, 정지 코돈)에 인접하게 바로, 즉, 모듈 (a)의 코딩 영역의 종결 코돈/정지 코돈의 바로 하류에 배치된다.

상기에서 언급한 바와 같이, RNA 분자는 모듈 (a), (b) 및/또는 (c)의 융합 RNA 서열의 형태, 즉, 상기 모듈을 코딩하는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열을 조합함으로써 제조된 하이브리드 유전자의 전사에 의해 형성되는 (융합) RNA 분자로 존재할 수 있다. 전형적으로, 이것은 전체 RNA 분자의 전사를 가능하게 하는 발현 벡터 내로 cDNA를 클로닝함으로써 완수된다. 본 발명의 RNA 분자를 "코딩하는" 합성 이중 가닥 핵산 분자를 생성하기 위해 핵산 합성, 하이브리드화 및/또는 증폭을 포함한, 융합 구축물을 제조하기 위한 여러 가지의 방법이 공지되어 있다. 이러한 이중 가닥 핵산 분자 (즉, DNA 분자)는 한 가닥 상에 (즉, 코딩 가닥 상에) 본 발명의 RNA 분자에 상응하는 DNA 서열을 함유하며, 따라서, 본 발명의 RNA 분자를 "코딩한다". 환언하면, 이러한 이중 가닥 핵산/DNA 분자는 전사시, 유전 정보, 즉 상기 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 RNA 분자를 가닥 상에 포함한다. 본 발명의 맥락에서 용어 "코딩(coding)" 또는 "코딩하는(encoding)"은 그의 통상적인 의미, 즉 단백질을 코딩하는 유전자의 DNA (및, 따라서, 폴리펩티드 또는 단백질 아미노산 서열로 변역될 수 있는 유전 정보)와 관련되도록 단지 사용되는 것이 아니다. 더 정확히 말하면, 본 발명의 면에서, 모듈 (a), (b) 및/또는 (c)를 코딩하는 개별 DNA 서열이 단일 (키메라) DNA 분자에 "융합" 또는 연관되어 있는 구축물에서, 구축물은 또한 단백질로 번역되지 않는 성분 (즉, 모듈 (b) 및/또는 모듈 (c))을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 모듈 (b) 및/또는 모듈 (c)에 상응하는 DNA 서열은 본 발명의 UTR의 구조에 대한 정보, 즉, "코드"를 제공하며, 따라서, 본 발명에서의 용어 "코딩하는"은 또한, 예를 들어, 한 가닥 상에 본 발명의 RNA 분자를 보유하는 이중 가닥 핵산 분자에 존재할 경우, 발현, 즉, 전사될 수 있는, UTR의 유전 정보에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 용어 "코딩하는"은, 비록 이것은 통상적으로 단백질의 코딩/발현과 관련되도록 단지 사용되긴 하지만, 핵산 분자가 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 부분 (즉, 모듈 (a)) 및 UTR을 "코딩하는" 부분 (즉, 모듈 (b) 및/또는 (c))을 보유하며, 여기서 후자는 UTR이 단백질 또는 폴리펩티드로 번역되지 않기 때문에 발현시 최종 생성물을 나타내는 것인, 본 발명의 RNA 분자로 전사될 수 있는 방식으로 이해되어야 한다. 이러한 이중 가닥 핵산은 표준 분자 생물학 기술에 의한 융합 단백질 생산을 위한 발현 벡터에 삽입될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd Ed, 1989] 참조). 용어 "벡터" 예컨대 "발현 벡터" 또는 "클로닝 벡터"는 본 발명의 의미에서 염색체 DNA와 독립적으로 세포 내에서 복제되며 유전 물질을 세포 내로 운반하는 비히클로서 사용되는 DNA의 원형의 이중 가닥 단위로서 이해되며, 여기서 이는 복제 및/또는 발현 (즉, RNA로 전사되며 아미노산 서열로 번역)될 수 있는 것으로 이해된다. 외래 DNA를 함유하는 벡터는 재조합 DNA로 칭해진다. 벡터 그 자체는 일반적으로, 벡터의 "백본"으로서 역할을 하는 더 큰 서열 및 삽입물 (즉, 모듈 (a) 코딩 영역 및 단백질로 번역되지 않는 모듈 (b) 및/또는 모듈 (c))로 이루어진 DNA 서열이다. 본 발명의 의미에서 플라스미드는 박테리아에서 가장 흔히 발견되며 재조합 DNA 연구에서 세포 사이에 유전자 전달에 사용되며 이와 같이 본 발명의 의미에서 사용된 바와 같이 보통 말하는, "벡터"의 하위 집단이다.

따라서, 또한 본 발명은 본 발명의 RNA 분자를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

핵산은, 예를 들어, 본 발명의 RNA 분자의 세 가지 주요 모듈 중 두 가지 (즉, 모듈 (a) 및 모듈 (b) 또는 모듈 (c))를 코딩하는 DNA이다. 대안적으로, 핵산, 바람직하게는 DNA는 모든 세 가지 주요 모듈 (즉, 모듈 (a) 및 모듈 (b) 및 모듈 (c))을 코딩한다. 본 발명의 상기 핵산 분자는 바람직하게는 재조합 핵산 분자일 수 있으나 또한 자연적으로 발생하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 분자는 천연 기원, 합성 또는 반합성일 수 있다. 그것은 DNA, RNA, 잠김 핵산뿐만 아니라 PNA를 포함할 수 있으며, 그것은 그의 하이브리드일 수 있다.

RNA 분자를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자에 조절 서열이 첨가될 수 있다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 즉 RNA 분자의 유도 발현을 가능하게 하는 프로모터, 전사 인핸서 및/또는 서열을 사용할 수 있다. 예를 들어, 적합한 유도가능 시스템은, 예를 들어, 문헌 [Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547-5551], 및 [Gossen, Trends Biotech. 12 (1994), 58-62]에 기재된 바와 같은 테트라시클린-조절 유전자 발현, 또는 예를 들어 문헌 [Crook, EMBO J. 8 (1989), 513-519]에 기재된 바와 같은 덱사메타손-유도가능 유전자 발현 시스템이다.

더욱이, 상기 핵산 분자는, 예를 들어, 티오에스테르 결합 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 함유할 수 있다. 상기 변형은 세포에서 엔도- 및/또는 엑소뉴클레아제에 대한 핵산 분자의 안정화에 유용할 수 있다. 상기 핵산 분자는 세포에서의 상기 핵산 분자의 전사를 가능하게 하는 키메라 유전자를 함유하는 적절한 벡터로부터 전사될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 상기 핵산 분자는 또한 표지될 수 있다. 핵산의 검출 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 서던(Southern) 및 노던(Northern) 블롯팅, PCR 또는 프라이머 신장법(primer extension)이 있다.

본 발명의 핵산 분자(들)는 앞서 언급한 핵산 분자 중 어느 한 분자를 단독으로 또는 조합하여 포함하는 재조합으로 생성된 키메라 핵산 분자일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 벡터의 부분이다.

따라서 또한 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 또는 예를 들어 유전 공학에서 통상적으로 사용되는 또 다른 벡터일 수 있으며, 적합한 숙주 세포에서 및 적합한 조건 하에 상기 벡터의 선택을 가능하게 하는 추가 유전자 예컨대 마커 유전자를 포함할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 벡터는, 본 발명의 RNA 분자를 코딩하는 핵산 분자의 서열 이외에도, 적합한 숙주에서 코딩 영역의 적절한 발현을 가능하게 하는, 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 이러한 제어 요소는 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 프로모터, 스플라이스 카세트, 번역 시작 코돈, 번역 및 벡터에 삽입물을 도입하기 위한 삽입 부위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 발현을 가능하게 하는 상기 발현 제어 서열과 작동가능하도록 연결된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것으로서, 여기서 진핵 및/또는 원핵 (숙주) 세포가 벡터로 형질감염되는 경우 핵산 분자가 숙주 세포에 의해 인식되는 제어 서열에 작동가능하도록 연결된다.

진핵 및 원핵 (숙주) 세포에서 발현을 보장하는 제어 요소는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 상기 본원에 언급된 바와 같이, 이들은 통상 전사의 개시를 보장하는 조절 서열 및 임의로 전사물의 안정화 및 전사의 종결을 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다.

그러나, 본 발명에 따르면, 벡터 자체가 폴리-A 테일을 위한 서열을 보유하는 것은 중요하지 않다. 상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 RNA 분자가 이하에 추가로 본원에 기재된 바와 같이 시험관내 전사 방법에 의해 생성되는 경우에 상기 폴리-A 테일은 본 발명의 구축물의 부분이며 (반드시 클로닝 벡터에 원래 위치하는 것은 아니며) RNA 구축물의 3' 말단에 있는 UTR에 인접한 RNA의 3' 말단에 위치한다. 본 발명의 RNA 분자가 시험관내 전사 방법에 의해 생성되는 경우에 본 발명의 RNA 분자를 보유하는 플라스미드는 폴리-A 테일의 하류에 시험관내 전사 이전에 선형화되어 시험관내 전사된 RNA 분자가 상기 폴리-A 테일을 함유하는 것을 보장하도록 한다.

추가 조절 요소는 전사뿐만 아니라 번역 인핸서, 및/또는 자연적으로-연관된 또는 이종 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유동물 숙주 세포에서 발현을 허용하는 가능한 조절 요소는 CMV-HSV 티미딘 키나제 프로모터, SV40, RSV-프로모터 (라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus)), 인간 신장 인자 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도가능 MMTV-프로모터 마우스 유방 종양 바이러스(Mouse Mammary Tumor Virus)), 메탈로티오네인- 또는 테트라시클린-유도가능 프로모터, 또는 인핸서, 예컨대 CMV 인핸서 또는 SV40-인핸서를 포함한다. 신경 세포에서의 발현의 경우, 신경미세섬유(neurofilament)-, PGDF-, NSE-, PrP- 또는 thy-1-프로모터가 사용될 수 있는 것으로 예상된다. 상기 프로모터는 관련 기술분야, 그 중에서도, 문헌 [Charron, J. Biol. Chem. 270 (1995), 25739-25745]에 공지되어 있다. 원핵 세포에서의 발현의 경우, 예를 들어, tac-lac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함한, 다수의 프로모터가 기재되어 있다. 전사의 개시의 원인이 되는 요소 외에도, 이러한 조절 요소는 폴리뉴클레오티드의 하류에 전사 종결 신호, 예컨대 SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위를 또한 포함할 수 있다. 이 맥락에서, 적합한 발현 벡터는 관련 기술분야 예컨대 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1 (파마시아(Pharmacia)), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (인비트로겐), pSPORT1 (GIBCO BRL), pX (문헌 [Pagano, Science 255 (1992), 1144-1147]), 효모 2-하이브리드 벡터, 예컨대 pEG202 및 dpJG4-5 (문헌 [Gyuris, Cell 75 (1995), 791-803]), 또는 원핵생물 발현 벡터, 예컨대 람다 gt11 또는 pGEX (아머샴-파마시아(Amersham-Pharmacia))에 공지되어 있다.

더욱이, 본 발명의 벡터는 또한 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자 및 벡터는 세포 내로 직접 도입을 위해 또는 리포솜, 바이러스 벡터 (예를 들어 아데노바이러스, 레트로바이러스), 전기천공법, 탄도 (예를 들어 유전자 총) 또는 다른 전달 시스템을 통한 도입을 위해 설계될 수 있다. 게다가, 바큘로바이러스 시스템이 본 발명의 핵산 분자에 대한 진핵생물 발현 시스템으로서 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질감염되거나 형질 전환된 숙주 또는 본 발명의 벡터를 운반하는 비인간 숙주, 즉 본 발명에 따른 핵산 분자로 또는 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터로 유전자 변형된 숙주 세포 또는 숙주에 관한 것이다. 용어 "유전자 변형된"은 숙주 세포 또는 숙주가 그의 자연 게놈 이외에도 세포 또는 숙주에 또는 그의 전임자/부모 중 하나에 도입된 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터를 포함함을 의미한다. 핵산 분자 또는 벡터는 게놈 밖의 독립 분자로서, 바람직하게는 복제 가능한 분자로서 유전자 변형된 숙주 세포 또는 숙주에 존재할 수 있거나, 그것은 숙주 세포 또는 숙주의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있다. 본 발명에 따른 벡터로 숙주 세포를 형질 전환시키는 것은, 예를 들어 문헌 [Sambrook and Russell (2001), Molecular Clonining: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Methods in Yeast genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 의해 수행될 수 있다. 숙주 세포는, 특히 pH 값, 온도, 염분 농도, 통기, 항생제, 비타민, 미량 원소 등의 관점에서, 사용된 특정 숙주 세포의 요건을 충족시키는 영양 배지에서 배양된다.

본 발명의 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 적합한 원핵 세포는 클로닝에 일반적으로 사용되는 것들 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이다. 더욱이, 진핵 세포는, 예를 들어, 진균 또는 동물 세포를 포함한다. 적합한 진균 세포의 예는 효모 세포, 바람직하게는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 것들, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 종의 것들을 포함한다. 적합한 동물 세포는, 예를 들어, 곤충 세포, 척추동물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대 예를 들어 HEK293, NSO, CHO,COS-7, MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, 저캇(Jurkat), PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A이다. 관련 기술분야에 공지된 추가의 적합한 세포주는 세포주 보관소, 예컨대, 예를 들어, 더 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (DSMZ) 또는 더 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(the American Type Culture Collection) (ATCC)으로부터 입수가능하다. 본 발명에 따라서, 1차 세포/세포 배양은 숙주 세포로서 기능할 수 있다는 것이 더욱이 예상된다. 상기 세포는 특히 곤충 (예컨대 초파리(Drosophila) 또는 바퀴(Blatta) 종의 곤충) 또는 포유동물 (예컨대 인간, 돼지, 마우스 또는 쥐)에서 유래된다. 상기 숙주 세포는 신경모세포종 세포주와 같은 세포주로부터의 세포 및/또는 상기 세포주로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다. 상기 언급한 1차 세포는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 그 중에서도, 1차 성상교세포, (혼합된) 척추 배양물 또는 해마 배양물을 포함한다.

또한 본 발명은 본 발명의 개별 모듈 또는 본 발명의 전체 RNA 분자를 코딩하는 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고, 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 RNA 분자를 회수함으로써 본 발명의 RNA 분자를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 숙주 세포의 배양 및 임의로 배양물로부터 RNA 분자를 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 RNA 분자를 생성시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 RNA 분자를 회수하고/거나 그 후에 정제하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

본 발명은 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 공지된 방법에 의해 본 발명의 RNA 분자를 시험관내 반응으로 생성시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 RNA 분자는 시험관내 전사 시스템을 사용하여 시험관내에서 생성될 수 있다. 시험관내 전사 시스템은 통상적으로 공지되어 있으며 상기에 개요를 서술한 바와 같이 모듈 (b) 및/또는 모듈 (c)를 "코딩하는" DNA 서열을 함유하는 정제된 선형 DNA 주형을 통상적으로 필요로 하며 여기서 상기 DNA 서열은 적절한 프로모터의 제어하에 있다. 게다가, 시험관내 전사 시스템은 또한 리보뉴클레오시드 트리포스페이트, DTT 및 마그네슘 이온을 포함하는 완충제 시스템, 및 본 발명의 RNA 분자로의 시험관내 전사에 효소 활성을 제공하는 적절한 RNA 폴리머라제를 통상적으로 필요로 한다.

시험관내 전사를 사용하여 RNA 분자를 생성시키는 데 통상적으로 사용되는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Methods Mol. Biol. 703 (2011):29-41]에 기재되어 있다.

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 RNA 분자가 이하에 추가로 본원에 기재된 바와 같이 시험관내 전사 방법에 의해 생성되는 경우에 상기 폴리-A 테일은 본 발명의 구축물의 부분이며 (반드시 클로닝 벡터에 원래 위치하는 것은 아니며) RNA 구축물의 3' 말단에 있는 UTR에 인접한 RNA의 3' 말단에 위치한다. 본 발명의 RNA 분자가 시험관내 전사 방법에 의해 생성되는 경우에 본 발명의 RNA 분자를 보유하는 플라스미드는 폴리-A 테일의 하류에 시험관내 전사 이전에 선형화되어 시험관내 전사된 RNA 분자가 상기 폴리-A 테일을 함유하는 것을 보장하도록 한다.

대안적으로, 본 발명의 RNA 분자는, 예를 들어, 고상 지지체 및 표준 기술을 사용하는 자동화된 뉴클레오티드 서열 합성기 상에서 통상적인 화학적 합성에 의해 화학적으로 또한 합성될 수 있다.

본 발명은 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 공지된 방법에 의해 그리고 상기에 개요를 서술한 바와 같이 본 발명의 RNA 분자를 시험관내 반응으로 생성시키고 반응으로부터 RNA 분자를 회수하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 RNA 분자를 회수하고/거나 그 후에 정제하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

상기 정의된 바와 같은 RNA 분자는 의학적 환경에서 및 특정 질환의 치료, 특히 RNA-기반 요법에서 특히 유용하다. 따라서, 또한 본 발명은 본 발명의 RNA 분자, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 숙주 세포 및 임의로 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

용어 "치료" 등은 바람직한 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 일반적으로 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 따라서, 본 발명의 치료는 특정 질환의 (급성) 상태의 치료에 관한 것일 수 있으나, 또한 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 면에서의 예방을 위한 치료에 관한 것일 수 있다. 바람직하게는, 용어 "치료"는 질환 및/또는 유해 효과 및/또는 질환에 기인 한 증상을 부분적으로 또는 완전히 치유한다는 면에서 치료적임을 이해하여야 한다. 이 점에서 "급성"은 대상체가 질환의 증상을 나타내는 것을 의미한다. 환언하면, 치료되는 대상체는 치료를 실제로 필요로 하며 본 발명의 맥락에서 용어 "급성 치료"는 질환이 발병하거나 질환이 발생한 후에 질환을 실제로 치료하기 위해 취해치는 조치에 관한 것이다. 치료는 또한, 예를 들어, 질환의 발병 및/또는 감염을 예방하기 위해, 예방을 위한 또는 예방적 치료, 즉, 질환 예방을 위해 취해지는 조치일 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 통상의 기술자에게 공지된 광범위한 부류의 투여 형태를 통해 투여될 수 있다. 투여는 연고, 로션, 겔, 발포제, 크림 및 흡입기의 사용, 주사침, 정제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 에어로졸을 통해, 경구, 국소적, 전신적일 수 있다.

언급한 바와 같이, 본 발명은 유효량의 상기에 따른 본 발명의 RNA 분자 (또는 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포) 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는, 제약 조성물에 관한 것이다.

부형제 또는 담체는 강력한 활성 성분을 함유하는 제제를 벌크 업(bulking-up)하기 위한 목적으로, 활성 성분, 즉 상기에 따른 본 발명의 구축물과 함께 제제화되는 불활성 물질이다. 부형제는 종종 "증량제(bulking agent)", "충전제", 또는 "희석제"로 지칭된다. 벌크 업은 투여 형태를 제조할 때 약물 물질을 편리하고 정확하게 조제할 수 있게 한다. 그들은 또한 다양한 치료-향상 목적, 예컨대 약물 흡수 또는 용해도 촉진, 또는 다른 약물동태학적 고려 사항에 기여할 수 있다. 부형제는 또한, 시험관내 안정성 예컨대 예상 저장 기간(shelf life)에 걸친 변성의 예방을 돕는 것 외에도, 예컨대 분말 유동성 또는 비-점착 특성을 촉진시킴으로써, 관련 활성 물질의 취급을 돕기 위해, 제조 공정에서 유용할 수 있다. 적절한 부형제의 선택은 또한 투여 경로 및 투여 형태, 뿐만 아니라 활성 성분 및 기타 인자에 따라 달라진다.

따라서, 상기에 따라, 유효량의 본 발명의 핵산을 포함하는 제약 조성물은 고체, 액체 또는 기체 형태일 수 있고, 그 중에서도, (하나의) 분말(들), (하나의) 정제(들), (하나의) 용액(들) 또는 (하나의) 에어로졸(들)의 형태일 수 있다. 상기 제약 조성물이 제약상 허용되는 담체 및/또는 희석제를 임의로 포함하는 것이 바람직하다.

적합한 제약 담체, 부형제 및/또는 희석제의 예는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 인산염 완충 식염수, 물, 에멀젼, 예컨대 수중유 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제제화될 수 있다. 이들 제약 조성물은 대상체에게 적합한 양으로, 즉 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있는 "유효량"으로 투여될 수 있다. 투여 요법은 담당 의사와 임상적 인자에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 널리 공지된 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자 또는 대상체의 체격, 신체 표면적, 연령, 투여할 특정한 화합물, 성별, 시간 및 투여 경로, 일반적인 건강, 및 공동으로 투여되는 다른 약물을 포함한, 많은 인자에 따라 달라진다.

따라서, 바람직하게는, 본 발명의 구축물은 유효량을 포함된다. 용어 "유효량"은 제약 조성물이 투여될 대상체에서 검출 가능한 치료 반응을 유도하기에 충분한 양을 지칭한다. 상기에 따르면, 제약 조성물 중 본 발명의 구축물의 함량은 상기 기재된 바와 같이 치료에 유용한한 제한되지는 않으나, 바람직하게는 총 조성물당 0.0000001-10 중량%를 함유한다. 추가로, 본원에 기재된 구축물은 바람직하게는 담체 중에 사용된다. 일반적으로, 적절한 양의 제약상 허용되는 염이 담체 중에 사용되어 조성물을 등장성으로 만든다. 담체의 예는 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하나 이제 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 허용되는 부형제, 담체 또는 안정제는 사용된 투여량 및 농도에서 비독성이며, 예를 들어 완충제 예컨대 시트레이트, 포스페이트, 및 기타 유기산 완충액; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨 및 칼륨; 저 분자량 (> 10 아미노산 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민 또는 젤라틴; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 히스티딘, 글루타민, 리신 아스파라긴, 아르기긴, 또는 글리신; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함한 탄수화물; 모노사카라이드; 디사카라이드; 기타 당류, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈(Tween), 플루로닉(Pluronics) 또는 폴리에틸렌 글리콜; 메티오닌, 아스코르브산 및 토코페롤을 포함한 항산화제; 및/또는 보존제, 예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레솔)을 포함한다. 적합한 담체 및 그의 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985, Mack Publishing Co.]에 더 상세히 기재되어 있다.

주기적 평가에 의해 치료 진전을 모니터링할 수 있다. 본 발명의 RNA 분자 또는 제약 조성물은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼뿐만 아니라 크림 및 좌제로 있을 수 있다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일, 및 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 에멀젼, 예를 들어 식염수 및 완충 매질을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제 예컨대, 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 제약 조성물은 제약 조성물의 의도된 용도에 따라 추가의 작용제를 포함할 수 있다. 상기 작용제는, 예를 들어, 상업적 명칭 트윈으로 시판되고 있는, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 프로필렌 글리콜, EDTA, 시트레이트, 수크로스뿐만 아니라 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 제약 조성물의 의도된 사용에 적합한 다른 작용제일 수 있다.

본 발명에 따라서, 용어 "제약 조성물"은 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제약 조성물은 RNA-기반 요법에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 상기에서 언급한 바와 같이, "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"을 포함하는 본 발명의 RNA 분자는 RNA-기반 요법에서 사용될 수 있으며 여기서 "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은 치료 또는 예방 효과를 갖는 치료상 또는 제약상 활성인 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 상기 표 2에 열거된 바와 같이 질환의 치료 또는 예방에서 RNA-기반 요법에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 RNA-기반 요법은 상기 표 2에 열거된 바와 같이 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.

따라서, 본 발명의 제약 조성물은 상기 표 2에 기재된 유전자 결함이 질환을 야기한 다음에 이를 본 발명의 RNA 분자를 사용한 전사물 대체 요법/효소 대체 요법에 의해 치료 또는 예방할 수 있는 경우에 RNA-기반 요법에서 사용하기 위한 것일 수 있으며, 여기서 RNA 분자는 상기 개시된 결손 유전자를 보완하는 단백질 또는 그의 기능적 단편의 무손상 버전을 코딩하는 "폴리펩티드에 대한 코딩 영역"을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 리소솜 질환 예컨대 고셰병, 파브리병, MPS I, MPS II (헌터 증후군), MPS VI 및 글리코겐 축적병 예컨대 예를 들어 글리코겐 축적병 제I형 (폰 기에르케병), 제II형 (폼페병), 제III형 (코리병), 유형 IV (안데르센병(Andersen's disease)), 제V형 (맥아들병), 제VI형 (헤르병(Hers diease)), 제VII형 (타우리병(Tauri's disease)), 제VII형, 제IX형, 제X형, 제XI형 (판코니-비켈 증후군(Fanconi-Bickel syndrome)), 제XI형, 또는 제0형의 치료 또는 예방에서 RNA-기반 요법에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 전사물 대체 요법/효소 대체 요법은 근본적인 유전적 결함에 유익하게 영향을 미치지 않으나, 환자가 결핍된 효소의 농도를 증가시킨다. 예로서, 폼페병에서, 전사물 대체 요법/효소 대체 요법은 결핍된 리소솜 효소 산 알파-글루코시다제 (GAA)를 대체한다.

다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 본 발명에 따라서 RNA-기반 요법에서 사용하기 위한 것일 수 있으며 여기서 "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은 치료 또는 예방 효과를 갖는 치료상 또는 제약상 활성인 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드를 코딩하며, 여기서 상기 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드는 표 2에 개요를 상술한 바와 같이 유전자에 의해 코딩된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 RNA-기반 요법은 암, 심혈관 질환, 바이러스 감염, 면역 기능 장애, 자가 면역 질환, 신경 장애, 유전성 대사 장애 또는 유전적 장애 또는 세포에서 생성된 단백질 또는 단백질 단편이 환자에 유익한 효과를 가질 수 있는 임의의 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 암의 예는 두경부암, 유방암, 신장암, 방광암, 폐암, 전립선암, 골암, 뇌암, 자궁 경부암, 항문암, 결장암, 결장직장암, 맹장암, 안암, 위암, 백혈병, 림프종, 간암, 피부암, 난소암, 음경암, 췌장암, 고환암, 갑상선암, 질암, 외음부암, 자궁 내막 암, 심장 암 및 육종을 포함한다.

심혈관 질환의 예는 죽상동맥경화증, 관상동맥성 심질환, 폐성 심질환 및 심근병증을 포함한다.

면역 기능 장애 및 자가 면역 질환의 예는 류마티스성 질환, 다발성 경화증 및 천식을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

바이러스 감염의 예는 인간 면역결핍 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 유두종바이러스뿐만 아니라 B형 및 C형 간염 바이러스에 의한 감염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

신경 장애의 예는 파킨슨병, 다발성 경화증 및 치매를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

유전성 대사 장애의 예는 고셰병 및 페닐케톤뇨증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 또한 RNA-기반 요법의 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 질환 예컨대 암, 심혈관 질환, 바이러스 감염, 면역 장애, 자가 면역 질환, 신경 장애, 유전성 대사 장애 또는 유전적 장애의 RNA-기반 요법에 의한 치료 방법에 관한 것이다. 치료 방법의 바람직한 실시양태에 관해서는, 상기 정의된 바와 같은 RNA-기반 요법에서 사용하기 위한 RNA 분자 또는 제약 조성물의 맥락에서 상기 설명된 바와 같이 필요한 변경을 가하여 동일하게 적용된다.

본 발명에서, 대상체는, 바람직한 실시양태에서, 포유 동물 예컨대 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 말, 설치류, 예를 들어, 래트, 마우스, 및 기니아 피그, 또는 영장류, 예를 들어, 고릴라, 침팬지, 및 인간이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 RNA 분자, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 키트에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에 관해서, 본 발명에 따른 RNA 분자, 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포의 맥락에서 상기 설명된 바와 같이, 필요한 변경을 가하여 동일하게 적용된다. 유리하게는, 본 발명의 키트는, 상기 및 하기 용도 및 방법의 수행에 필요한, 임의로 (하나의) 완충제(들), 저장 용액 및/또는 잔여 시약 또는 물질을 추가로 포함한다. 더욱이, 본 발명의 키트의 부분은 바이알 또는 병에 또는 용기 또는 다중 용기 단위로 조합하여 개별적으로 포장될 수 있다. 본 발명의 키트는, 그 중에서도, 본 발명의 방법, 본 발명의 RNA 분자의 제조를 수행하기 위해 유리하게 사용될 수 있고, 본 발명의 RNA 분자의 제조를 위해 유리하게 사용될 수 있고, 예를 들어, 상기 및 하기에 개요를 상술한 바와 같은 용도에서, 본원에 언급된 여러 가지 적용에서 사용될 수 있을 것이다. 키트에 포함될 수 있는 또 다른 구성 요소는 그의 사용에 대해 키트를 사용하는 사람에 대한 사용 설명서이다. 키트의 제조는 바람직하게는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 절차를 따른다.

마지막으로, 또한 본 발명은 RNA 분자의 코딩 영역을 상기에 정의되어 있는 바와 같이 상기 코딩 영역에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 단백질로 번역하는 효율을 증가시키기 위한, 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들); 및/또는 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)의 용도에 관한 것이다. 용도의 바람직한 실시양태에 관해서, 본 발명의 RNA 분자의 맥락에서 상기 설명된 바와 같이, 필요한 변경을 가하여 동일하게 적용된다.

[도면의 간단한 설명]

도 1: A549 세포의 형광 현미경검사 및 유동 세포측정법.

(A) 5' CAP, 5' UTR, 코딩 영역, 3' UTR 및 폴리-A 테일로 이루어진, 치료용 mRNA의 개략도.

(B) 형질감염 24시간 후에 4x 배율 (JULYTM)로 취한 형광 현미경검사. 모든 구축물은 대조군과 비교하여 개선된 단백질 발현 수준을 나타냈다.

(C) FC에 의해 결정된 바와 같은 d2EGFP 양성 세포의 백분율은 모든 구축물에 대해 유사하다. 아이오딘화프로피디움을 사용하여 죽은 세포를 검출하였다. 적용된 게이트는 죽은 세포와 비형질감염 세포의 배제를 보장하였다.

(D) 형질감염 48시간 후에, 지속적 단백질 발현은 대조군과 비교하여 안정화된 구축물에서 더 높았다.

도 2: A549 세포 (A) 및 Huh7 세포 (B)에 대해 FC에 의해 결정된 바와 같은 단백질 발현의 시간 과정. 대조군에 대해 정규화된 평균 형광 강도는 로그-선형 플롯에서 시간에 대해 플롯팅된다. 형질감염 후의 시간이 증가함에 따라, 안정화 된 구축물의 상승된 단백질 발현 수준이 점점 더 분명해진다. 대조군, 5'UTR 및 3'UTR 구축물 각각 뿐만 아니라 구축물 5'+3', 5'+2x3' 및 2x3'에 상응하는 막대는 도면의 우측에 나타낸 바와 같이 상이하게 음영 처리되어 있다.

도 3: 상이하게 안정화된 mRNA 구축물을 시험하는 평행 단세포 검정을 위한 미세구조화된 다중-채널 슬라이드.

(A) 그 사이의 세포-반발성(cell-repellent) PEG 영역을 가진 세포-부착성, 미세구조화된 단백질 패턴은 정렬된 세포 배열을 가능하게 한다. 형광성으로 표지된 피브로넥틴을 사용하여 미세패턴을 가시화하였다.

(B) 마이크로채널(microchannel) 내부에 피브로넥틴 패턴에 부착하는 형광 A549 세포 (시딩 후 3시간).

(C) 우리의 분석 용액에 기저를 이루는 반응식 (우측에) 및 mRNA 리포펙션 (좌측에)의 개략도.

(D) A549 세포에서 mRNA-매개 d2EGFP 발현의 예시적인 시간 경과. 흑색 선은 이론상 번역 모델에 대한 대표적인 피트(fit)이다.

도 4: 발현률 K의 분포, mRNA 수명 및 d2EGFP 수명 및 상응하는 평균값과 구축물의 개략도.

(A) 초기 mRNA 분자 수와 번역률의 곱인 발현률 K의 분포. 분포가 유사하게 형상화된다는 사실은 형질감염 동역학 및 번역률이 매우 유사하다는 것을 나타낸다.

(B) mRNA 반감기의 분포는 그의 광대함에 큰 변화를 보인다. 겉으로 보기에 참고로, 점선은 대조군의 평균 반감기를 나타낸다.

(C) d2EGFP 반감기의 분포. 예상대로, 상이한 구축물의 분포는 유사하게 형상화되고 평균값이 필적할 만하다. 겉으로 보기에 참고로, 모든 측정된 반감기를 기준으로 한 d2EGFP의 전체 평균 반감기를 점선으로 나타냈다.

(D) 적합률(fitted rate)의 평균값 및 상응하는 표준 편차 (std). 비록 대조군 구축물이 두 세포 유형 모두에서 높은 평균 K 값을 산출하긴 하지만, 이 구축물의 짧은 mRNA 반감기는 안정화된 구축물과 비교하여 작은 AUC 값을 야기한다. 이는 도 6에서 볼 수 있다. 구축물의 개략도는 우측에서 볼 수 있다. 모든 구축물은 동일한 5'캡 및 폴리-A 테일을 갖는다. 895 단일 A549 및 1355 Huh7 세포로부터의 데이터를 분석하였다.

도 5: 상이한 구축물의 마스터곡선(Mastercurve). 개시 시간이 0으로 이동 된 A549 (A) 및 Huh7 (B) 세포의 모집단 평균. 짙은 회색, 중간 회색 및 밝은 회색 곡선은 각각 대조군 제어/5'UTR/3'UTR 구축물에 상응한다. 곡선은 우측에 상응하게 표시된 바와 같은 구축물에 상응한다.

도 6: 상이한 구축물의 AUC 및 mRNA 수명 연장 인자.

(A) mRNA 번역과 단백질 및 mRNA의 분해 사이의 상호 작용을 설명하기 위한 AUC의 개략도.

(B) 및 (C) ｔ → ∞에 대해 분석된 바와 같이 상이한 구축물의 AUC.

십자가는 상이한 실험의 상대적 AUC를 나타내며, 막대(bar)는 모든 단세포 AUC의 평균에 상응한다.

(D) 및 (E) mRNA 수명 연장 인자. 모든 변형은 대조군과 비교하여 연장된 mRNA 수명을 결과한다. 유사한 경향이 A549 (D) 및 Huh7 (E) 세포에서 관찰된다. (D) 및 (E)의 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.

도 7: Huh7 세포의 형광 현미경검사 및 유동 세포측정법 데이터.

(A) 형질감염 24시간 후에 4x 배율 (JULYTM)로 찍은 형광 현미경검사. 모든 구축물은 대조군과 비교하여 개선된 단백질 발현 수준을 나타냈다.

(B) FC에 의해 결정된 바와 같은 d2EGFP 양성 세포의 백분율은 모든 구축물에 대해 유사하다. 아이오딘화프로피디움을 사용하여 죽은 세포를 검출하였다. 적용된 게이트는 죽은 세포와 비형질감염 세포의 배제를 보장하였다.

(C) 형질감염 48시간 후에, 지속적 단백질 발현은 대조군과 비교하여 안정화된 구축물에서 더 높았다.

도 8: A549 및 Huh7 세포에서 qRT-PCR에 의한 mRNA 반감기의 결정

물질 및 방법 부분에 기재된 바와 같은 프로토콜에 따라 세포를 형질감염시켰다. 모든 mRNA 구축물에 대한 4, 8, 24, 36, 48, 60, 72시간의 절대 mRNA 정량은 A549 (도 8A 참조) 및 Huh7 (도 8B 참조)에서 결정되었다. 이 데이터로부터 mRNA 반감기를 계산하였다. 물리적 반감기는 대조군으로 정규화하였다.

도 9: 미세구조화된 기질에 대한 형질감염 효율.

리포펙타민(Lipofectamine)TM2000 또는 DOGTOR를 활용하여 SNIM RNA로 형질감염된 A549 세포 및 Huh7 세포에 대한 형질감염된 세포의 백분율 및 상응하는 표준 편차. 리포펙타민TM2000으로 형질감염된 세포에서 더 높은 형질감염 효율이 밝혀졌다.

도 10: 직접 측정 된 d2EGFP 반감기의 분포

(A) Huh7 세포에서 시클로헥스이미드-유도 d2EGFP 분해의 예시적인 시간 과정. 흑색 선은 단백질 분해에 대한 단순 지수 피트(simple exponential fit)이다.

(B) 2.46　h (std 0.71　h)의 평균 반감기를 산출하는, A549 세포에서 측정된 d2EGFP 반감기의 분포. (C) 4.04　h (std 1.82　h)의 평균 반감기를 산출하는, Huh7 세포에서 측정된 d2EGFP 반감기의 분포.

도 11: 단세포 AUC의 분포. AUC는 하기 수학식 3에 따라 계산되었다. A549 데이터는 좌측 열에 나타냈고, Huh7 데이터는 우측 열에 나타냈다.

도 12: 표 5에 명시된 바와 같이 상이한 유전자의 UTR을 갖는 구축물 #2 내지 #5와 CYBA-UTR #1 구축물의 비교.

본 발명의 다른 측면 및 이점은 하기 실시예에 기재될 것이며, 이는 예시적인 목적으로 제시되는 것이며 제한하기 위한 것은 아니다. 본 출원에 인용된 각각의 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

실시예

I. 물질 및 방법

플라스미드 벡터

불안정화된 증강된 녹색 형광 단백질 (d2EGFP)을 pd2EGFP-N1 (클론테크(Clonetech))로부터 절제하고 pVAXA120 (3)에서 클로닝하여 pVAXA120-d2EGFP를 생성시켰다. mRNA 안정성에 관하여 이전에 공개된 데이터에 기초하여, CYBA 유전자의 미리 선택된 5' 및 3' UTR 서열을 유로핀즈(Eurofins) MWG (독일)에 의해 합성하였으며 pVAXA120-d2EGFP에서 d2EGFP의 상류에서 (5'UTR) 및/또는 하류에서 (3'UTR 또는 2x3'UTR) 클로닝함으로써여, 각각의 UTR 조합을 가진 구축물을 생성시켰다.

mRNA 제조

시험관내 전사된 mRNA (IVT mRNA)를 생성시키기 위해, 플라스미드를 NotI 소화(digestion)에 의해 폴리-A 테일의 하류에서 선형화시키고, 클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 정제된 선형 플라스미드를 리보맥스(RiboMax) 대규모 RNA 제조 시스템(Large Scale RNA Procution System)-T7 (프로메가(Promega), 독일)을 사용하여 시험관내 전사용 주형으로서 사용하였다. 항-역전 캡 유사체(Anti-Reverse Cap Analog) (ARCA)를 반응 믹스에 첨가하여 5' 캡핑된 mRNA를 생성시켰다. 또한 SNIM mRNA의 생산을 위해, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 즉 메틸-CTP 및 티오-UTP (예나 바이오사이언스(Jena Bioscience), 독일)를 ATP:CTP:UTP:메틸-CTP:티오-UTP:GTP의 7.57 mM:5.68 mM:5.68 mM:1.89 mM:1.89 mM:1.21 mM의 최종 농도에 첨가하였다. 완전 IVT 믹스를 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 DNaseI로 37℃에서 20분 동안 DNA를 소화시켰다. RNA를 암모늄 아세테이트 (최종 농도 2.5M)으로 침전시키고 70% EtOH로 세척하였다. 세척 단계를 2회 수행하였다. 마지막으로, RNA 펠렛을 RNAse-비함유 물에 재현탁시켰다. 모든 mRNA가 1% 아가로스 겔에서 확인되었다. 예시적인 mRNA 구축물의 개략도를 도 1A에서 볼 수 있다. UTR의 정확한 서열은 상기 표 1 아래 본문에 제시하였다.

<표 3> 이차 구조 ( mfold )

표 3에, 양 말단 및 UTR 내에서 발견되는 mRNA 구축물 예컨대 자유 최소 에너지 (G) 및 이차 구조의 특징을 열거하였다. 폴딩 플랫폼 mfold를 사용하여 mRNA이차 구조를 예측하였다 (40). 각각의 구축물에 대해, 우리는 최고 자유 에너지를 갖는 8개 이차 구조를 비교하였다. 최고 자유 에너지 값은 2x3 'UTR 및 3'UTR 구축물에 대해 예측된다. 각각의 mRNA 구축물의 5' 말단은 3'UTR 또는 5'UTR과 부분적으로 결합하나, 대조군 구축물은 코딩 서열 (cds)에 결합한다. 흥미롭게도, 2x3' mRNA 구축물의 5' 말단은 그 자체로 안정적인 헤어핀을 형성한다. 그러나, 5' 말단 근처의 헤어핀 루프는 단백질 번역을 또한 방해할 수 있다 (41). 또 다른 특징은 3 'UTR 및 5'+3' UTR mRNA 구축물의 3' 말단에서 발견되었다: 따라서, 3' 말단은 5' 말단과 결합하여, 서로로부터의 거리를 최소화하여 더 빠른 번역 개시를 가능하게 한다. 5'UTR과는 달리, 각각의 mRNA 구축물의 3'UTR은 적어도 하나의 헤어핀을 그 자체로 형성한다.

유동 세포측정법 ( FC )

실험 설정은 다음과 같다: 150 μl 배지 중 20.000개 세포를 96-웰 플레이트에서 웰당 시딩하고 시딩 후 24시간 형질감염시켰다. 세포를 시판 형질감염 시약 리포펙타민^TM2000을 사용하여 5 pg mRNA/세포의 용량으로 형질감염시켰다. 복합체를 1 μg mRNA당 2.5 μl 리포펙타민^TM2000의 비로 제조하였다. 리포플렉스(lipoplex)의 형성을 위해, 리포펙타민^TM2000 및 mRNA를 각각 50 μl의 전체 부피로 옵티MEM(OptiMEM) 형질감염 배지에서 개별적으로 희석하였다. 이들 혼합물을 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 다음에 mRNA 용액을 리포펙타민^TM2000 용액과 혼합한 후, 실온에서 또 다른 20분 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 900 μl의 옵티MEM를 리포플렉스 용액에 첨가하였다. 마지막으로, 50 μl의 복합체 용액을 세포에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 mRNA 구축물에 대해, 생물학적 삼중물을 제조하였다. 인큐베이션 후, 리포플렉스-용액을 버리고 새로운 150 μl 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. d2EGFP 발현은 FC를 이용하여 8, 24, 36, 48, 60 및 72시간 후에 측정하였다. 이들 시점 각각에서 형광 현미경검사 영상을 취하였다. FC 측정을 위해, 세포 배양 배지를 버리고 세포를 1xDPBS (깁코 라이프 테크놀로지(Gibco Life Technology))로 세척하였다. 그 후에, 20 μl의 TrypLE 익스프레스(Express) (깁코 라이프 테크놀로지)를 웰 당 첨가하고 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 2% FBS가 보충된 80 μl 1xPBS를 첨가함으로써 반응을 중화시켰다. 세포를 피펫팅(pipetting)함으로써 혼합하고 유동 세포 측정에 적절한 96 웰 플레이트로 옮겼다. 마지막으로, 5 μl의 아이오딘화프로피디움 (최종 농도 1 μg/ml)을 웰당 첨가하고 어툰 오토 샘플러(Attune Auto Sampler) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))로 측정하였다. 줄라이(JULY)^TM 현미경을 사용하여 FC 분석 전에 형광 영상을 취하였다.

정량적 실시간 PCR

qRT-PCR 분석을 사용하여 A549 및 Huh7 세포에서 4, 8, 24, 36, 48, 60 및 72시간의 시간 간격으로 d2EGFP mRNA 양을 결정하였다. 게다가, mRNA 발현 동역학 그 자체는 각각의 UTR의 mRNA 반감기를 계산하는데 사용되었다. 여기에서, 상기 세포는 상기 기재된 프로토콜과 유사하게 형질감염시켰다 (FC 참조). 200.000개 세포/웰의 세포 밀도가 RNA 단리에 충분한 것으로 밝혀졌다. RNA 단리는 뉴클레오스핀(NucleoSpin) RNA (마쉐레이 마겔(Macherey Nagel))를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 단리된 전체 RNA는 분광 광도 측정 및 겔 분석에 의해 RNA 농도 및 품질에서 검사되었다. 추가로, 각각의 UTR 구축물 및 대조군의 0,5 μg의 전체 RNA를 퍼스트 스트랜드(First Strand) cDNA 합성 키트(Synthesis Kit) (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))로부터 올리고(dT)를 사용하여 cDNA 합성에 사용하였다. 동등한 양의 cDNA (1:50로 희석)를 에스소어드벤스트(SsoAdvanced)™ 유니버셜(Universal) SYBR® 그린 슈퍼믹스(Green Supermix) (바이오라드(BioRad))를 사용하여 125 nM의 각각의 d2EGFP-프라이머 (정방향 프라이머: 5'-CAA CCA CTA CCT GAG CAC CC-3' (서열번호 3); 역방향 프라이머: 5'-GTC CAT GCC GAG AGT GAT CC-3' (서열번호 4))로 시험하였다. 절대 정량의 표준으로서, IVT에 의해 생성된 순수한 d2EGFP mRNA를 cDNA 합성에 사용하였다. 절대 mRNA 정량화는 라이트사이클러(Lightcycler) 96 장치 (로슈(Roche)) 상에서 수행하였다.

표면 패턴화 및 샘플 준비

미세구조화된 표면은 선택적인 산소 플라즈마 처리 (펨토 디에너(Femto Diener), 3분 동안 40 W)에 의해 기재 (이비디 게엠베하(ibidi GmbH))로서의 최상부에서 후속 부동태화와 함께 제조되었다. 선택성은 폴리디메틸실록산 (PDMS) 스탬프 (포토리소그래피에 의해 제조된 마스터(master)로부터 주조)를 마스크로서 사용하여 달성되었다. 플라즈마에 노출된 부분을 수성 완충제 (10　mM HEPES pH　7.4 및 150　mM NaCl)에서 1 mg/ml의 농도로 PLL(20k)-g(3.5)-PEG(2k)로 30분 동안 인큐베이션에 의해 부동태화하였다. 그 후, 샘플을 PBS로 세정하고 PDMS 스탬프를 제거하였다. 그 다음에 호일을 부착성 6-채널 슬라이드 (점성의 μ- 슬라이드 VI)에 고정시켰다. 각각의 채널을 1시간 동안 PBS 중의 50　μg/ml 피브로넥틴의 용액으로 채워 나머지 구역을 세포-부착성이 되도록 하였다. 프로브를 PBS로 3회 철저히 세정하였다. 샘플은 세포 시딩 전에 세포 배지에 실온에서 보관하였다. 이 연구에 대해, 30 μm x 30 μm의 정사각형 부착 부위가 사용되었는데, 그 이유는 이 크기가 A549뿐만 아니라 Huh7 세포의 단세포 부착에 대해 합리적으로 판명되었기 때문이다. 세포를 채널당 10,000개 세포의 밀도로 시딩하여 대략 하나의 세포가 각각의 세포-부착 섬(island)에 부착할 수 있도록 하였다. 도 3A에 나타낸 바와 같은 형광 미세패턴을 수득하기 위해, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488과 접합된 30　μg/ml 피브리노겐과 20　μg/ml 피브로넥틴의 혼합물을 사용하였다.

물질

FBS, 레이보비츠(Leibovitz)의 L-15 배지 (깁코), 리포펙타민^TM2000, 및 옵티MEM (깁코)을 인비트로겐 (독일)으로부터 구매하였다. 멸균 PBS를 자체에서(in-house) 준비하였다. 햄(Ham)의 F-12K, DMEM, 및 트립신-EDTA를 체.체.프로 게엠베하(c.c.pro GmbH) (독일)로부터 구매하였다. 채널 슬라이드를 이비디 (독일)로부터 구매하였다. 피브로넥틴을 요 프로테인즈(Yo Proteins) (스웨덴)로부터 구매하였다. PLL-g-PEG를 수소에스 아게(SuSoS AG) (스위스)로부터 구매하였다. 알렉사 플루오르 488을 라이프 테크롤로지즈(Life Technologies) (독일)로부터 구매하였다. 플라스미드 pd2EGFP-N1을 BD 바이오사이언시즈 클론테크(BD Biosciences Clontech) (독일)로부터 구매하였다.

세포 배양

인간 폐포 선암 세포주 (A549, ATCC CCL-185)를 10% FBS가 보충된 햄의 F12K 배지에서 성장시켰다. 인간 간암 상피 세포주 (Huh7, JCRB0403, JCRB 세포 은행(Cell Bank), 일본)를 10% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 모든 세포주를 5% CO₂ 수준의 가습 분위기에서 성장시켰다.

시험관내 형질감염

형질감염 3시간 전에, 채널당 10.000개 세포를 6-채널 슬라이드에 시딩하였다. 세포를 시판 형질감염 시약 리포펙타민^TM2000을 사용하여 1 μg mRNA 당 2.5 μl 리포펙타민^TM2000의 비로 5 pg mRNA/세포의 용량으로 형질감염시켰다. 복합체 형성은 다음과 같이 준비하였다: 리포펙타민^TM2000 및 mRNA를 각각 45 μl의 전체 부피로 옵티MEM 형질감염 배지에서 개별적으로 희석하였다. 이들 혼합물을 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 다음에 리포펙타민^TM2000 용액을 mRNA 용액과 혼합한 후, 실온에서 또 다른 20분 인큐베이션하였다. 모든 후속 세정 단계 동안에 마이크로채널은 결코 비어 있지 않았음에 주목한다: 형질감염 직전에, 세포를 PBS로 세척하였다. 마지막으로, 상이한 mRNAs 구축물을 함유하는 리포플렉스 용액을 6개 채널에 채웠다. 따라서 모든 5개의 상이한 mRNA 구축물에 더하여 참조 구축물은 동일한 실험 조건하에서 측정될 수 있었다. 세포를 1시간 동안 37℃ (5% CO₂ 수준)에서 90 μl의 전체 형질감염 부피로 인큐베이션하였다. 그 후에 형질감염 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하였다. 그 후에, 세포는 10% FBS를 함유하는 레이보비츠의 L-15 배지로 다시 인큐베이션하였다. d2EGFP 발현을 현미경으로 모니터링하기 전에 각각의 배지 저장고의 최상부에 항-증발 오일 (이비디 게엠베하, 독일)을 첨가하였다.

데이터 수집 및 정량적 영상 분석

생 세포 영상화(Live-cell imaging)는 현미경 단계용 온도 제어 장착 프레임과 대물 렌즈 (CFI 플랜플루오르(PlanFluor) DL-10×, 상1, NA 0.30, 니콘(Nikon))가 장착된 전동 도립 현미경 (니콘, 이클립스(Eclipse) Ti-E) 상에서 수행하였다. 우리는 측정 전반에 걸쳐 37℃ (± 2℃)에서 샘플의 온도를 안정화시키기 위해 온도 제어기를 갖춘 이비디 가열 시스템 (이비디 게엠베하, 독일)을 사용하였다. 세포 영상을 획득하기 위해, 우리는 냉각된 CCD 카메라 (CLARA-E, 안도르(Andor))를 사용하였다. 수은 광원 (C-HGFIE 인텐시라이트(Intensilight), 니콘)을 조명에 사용하고 필터 세트 41024 (크로마 테크놀로지 코포레이션(Chroma Technology Corp.), BP450-490, FT510, LP510-565)를 갖춘 필터 큐브를 d2EGFP 검출에 사용하였다. 조명 셔터 제어(illumination shutter control)를 사용하여 표백을 방지하였다. 형질감염 후 적어도 25시간 동안 10분 간격으로 600 ms의 일정한 노출 시간으로 10배 배율로 영상을 취하였다. 형광 영상을 단일 영상 시퀀스 파일로 통합하였다. 단세포 발현 동역학의 특징적인 매개 변수의 정량 분석은 발현 효율 및 안정성의 면에서 다양한 벡터 성능의 비교를 가능하게 한다. 영상 분석은 여러 단계로 이루어져 있으며 ImageJ를 기반으로 하는 자체 개발 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 먼저, 직사각형 격자에 원본 타임 랩스 무비가 겹쳐지고 근본적인 세포-패턴의 크기 및 방향으로 조정되었다. 그 다음에, 소프트웨어는 모든 스퀘어의 형광 강도를 판독함으로써 d2EGFP-발현 세포를 자동으로 검출하였다. 비어 있는 스퀘어는 배경 수정에 사용되었다. 소프트웨어는 전체 서열에 대해 세포의 형광을 계산하고 상응하는 강도를 세포당 형광의 시간 과정에 연결한다. 마지막으로, 스퀘어당 단세포 형광 강도를 추출하였다.

그 다음에, 데이터는 mRNA와 d2EGFP에 대한 미분 방정식에 대한 솔루션인, IgorPro 소프트웨어를 사용하여 mRNA-유도 단백질 발현에 대한 분석 용액으로 각각의 시간 과정을 피팅함으로써 최근에 기재된 바와 같이 분석되었다 (수학식 1 참조),

( 수학식 4)

(수학식 5)

mRNA-유도 단백질 발현에 대해 근본적인 단순화한 모델의 개략도를 도 3C에 도시하였다.

II. 실시예 1 : 형광 현미경검사 및 유동 세포측정법 ( FC )을 통한 분석

트랜스진 발현 동역학에 대한 상이한 UTR 조합의 영향을 평가하기 위해, 5' UTR 단독, 3' UTR, 5'+3' UTR, 두 개의 카피의 3'UTR 및 5'+2x3' UTR을 함유하는 상이한 d2EGFP mRNA 구축물을 가진 리포펙타민TM2000을 사용하여 2개의 상이한 세포주를 형질감염시켰다. 모든 구축물의 빌딩 블록의 개략도를 도 1A에서 볼 수 있다.

형질감염 후 3일까지의 상이한 시점에서, d2EGFP 발현은 FC를 사용하여 정량화되었다. 살아있는 A549 세포의 d2EGFP 발현 수준을 도시하는 t=24h에 대한 예시적인 도트 플롯을 도 1C에 나타냈다 (상응하는 Huh7 데이터에 대해서는 도 7B 참조). 게다가, 우리는 형광 현미경검사를 사용하여 세포를 영상화하였다 (도 1B 및 D 및 도 7A 및 C). 모든 mRNA 구축물에 대한 필적하는 형질감염 효율을 형질감염 후 24시간 확인하였다 (도 1B 및 도 8A). 그렇게 함으로써, 발현 동역학에서의 관찰된 차이에 대한 원인 인자가 되는 감별 전달 효율(differential transfer efficiency)을 배제할 수 있다. 형광 현미경검사 영상을 기초로 하여, 형질감염 48시간 후 모든 구축물에 대한 d2EGFP 발현의 급격한 감소가 검출되었다 (도 1B 및 D, 도 7A 및 C). 그러나, 모든 UTR-안정화된 mRNA에 대해 대조군과 비교하여 더 높은 EGFP 발현 수준이 밝혀졌다. 보다 구체적으로, 3 'UTR를 함유하는 mRNA 구축물은 3' UTR이 없는 구축물보다 발현을 증강시키는 것으로 보였다. 이것은 A549 및 Huh7 세포에서 관찰되었다 (도 1 및 도 7 각각 참조). 48시간 이후의 시점에서, 이 효과는 훨씬 더 두드러졌다 (데이터는 표시되지 않음). 도 2 A 및 B에서, FC에 의해 결정된 바와 같은 평균 형광 강도 (MFI)의 시간 경과는 두 세포 유형 모두에서 모든 구축물에 대해 나타냈다.

또한 여기에서, 모든 UTR-함유 mRNA 구축물은 모든 시점에서 세포 주 둘 다에서 대조군 구축물보다 더 높은 MFI 값을 나타냈다. 종합하면, 형광 현미경검사 및 FC 데이터는 CYBA UTR이 제공된 mRNA 분자는 24시간이 넘는 동안 지속 d2EGFP 발현을 나타낸다는 점을 시사한다.

III. 실시예 2 : 정량적 실시간 PCR

추가 접근법으로서의 qRT-PCR 측정을 수행하여 상이한 구축물의 "물리적" mRNA 반감기를 결정하였다. 우리가 선택한 프라이머의 d2EGFP에 대한 결합은 시작 코돈의 600nt 하류에서 일어났다. 그러므로, 물리적 mRNA 반감기의 측정은 무손상 mRNA와 탈캡핑되었으나 아직 분해되지 않은 것들 또는 탈캡핑되고 또한 염기 599까지 분해된 것들 둘 다를 손상시킨다. 이는 번역 풀에서 제거되어 P-바디(body)에 저장되어 있는 mRNA를 또한 포함한다 (29-32). 비록 무손상 mRNA가 d2EGFP 발현의 한 원인이 되긴 하지만, 탈캡핑된 및/또는 부분적으로 분해된 전사물의 후자의 군, 및 P-바디에서의 것들은 어떠한 발현도 야기하지 않는다. 물리적 mRNA 반감기의 결정은 A549 및 Huh7 세포에서 대조군과 비교하여 UTR의 어떠한 유의한 수명 연장도 나타내지 않았다 (도 8A 및 B 각각 참조). 흥미롭게도, 대신 5', 3', 5'+2x3' 및 2x3' UTR 구축물에 대한 mRNA 물리적 반감기의 감소가 세포주 둘 다에서 관찰되었다.

A549 및 Huh7 세포에서 qRT - PCR에 의한 mRNA 반감기의 결정

추가적인 실험에서, qRT-PCR을 사용하여 상이한 mRNA 구축물의 mRNA 반감기를 조사하였고, 이는 통상적인 접근법이다 (도 8A 및 B 참조). 따라서, mRNA 구축물은 본원에 기재된 바와 같이 형질감염되었다. 결국, 각각의 특정 시점에서의 절대 mRNA 양을 얻어 UTR이 공급된 각각의 mRNA에 대한 mRNA 반감기를 계산하였다. 대조군과 비교하여 선택된 mRNA 구축물 중 어느 한 구축물에 대해서도 어떠한 유의한 mRNA 안정화 효과도 관찰되지 않았다.

IV. 실시예 3 : 단세포 발현 어레이

도 3A 및 B에 나타낸 바와 같은 미세구조화된, 세포-부착성 기질이 단세포 타임 랩스 현미경검사에 대한 플랫폼으로서 제작되었다.

직사각형 스퀘어는 세포외 기질 단백질 피브로넥틴으로 기능화되어 있으며, 한편 주변 어두운 영역은 세포 반발성 PLL-g-PEG로 부동태화되어 있다. 세포를 적절하게 묽은 세포 밀도로 시딩하여, 약 3시간 후에 세포가 직사각형 스퀘어에 부착되었다. 이러한 세포 자기 조직화(cellular self-organization) 과정은 이전에 상세히 연구되었다 (27). 스퀘어의 크기는 단세포로의 최적의 충전을 위해 30 μm이었다. 스퀘어 사이의 거리는 동시에 1개 초과의 스퀘어에 부착되어 있는 세포의 브릿징(bridging) 효과를 최소화하기에 충분할 정도로만 컸다 (60 μm). 스퀘어당 형광 신호의 자동 영상 분석 및 타임 랩스 형광 현미경검사는 수백 가지 개별 시간 과정을 산출한다. 배경 수정된 원시 데이터의 전형적인 세트를 도 3D에 나타냈다. 흑색 선은 mRNA 발현에 대한 수학적 발현에 대한 예시적인 피트를 나타낸다 (물질 및 방법 섹션 또한 참조). 데이터를 IgorPro 소프트웨어를 사용하여 mRNA-유도 단백질 발현에 대한 분석 용액으로 각각의 시간 과정을 피팅함으로써 최근에 (26) 기재된 바와 같이 분석되었다.

(수학식 1)

여기에서, G는 단백질 양을 의미하며, K는 발현률이며, δ는 mRNA 분해율(degradation rate)이며, β는 리포터 단백질 d2EGFP의 분해율이다. 발현률

은 세포 내 mRNA 분자의 초기 양 (m0)과 번역률 kTL이 곱이다. 수학식 1에 의해 기재되는 시간 과정은 이하의 섹션 "단백질 발현의 마스터곡선"에서 상세히 논의될 것이다.

V. 실시예 4 : 세포 어레이에 대한 시험관내 형질감염

전형적인 실험에서, 세포를 형질감염 3시간 전에 마이크로패턴에 부착시켰다. 6개의 마이크로채널 각각을 관심 구축물 중 하나를 함유하고 있는, 리포플렉스 용액으로 채웠다다. 초기 실험에서, 우리는 두개의 상이한, 시판되는 형질감염 시약 (즉 리포펙타민TM 2000 및 DOGTOR)을 비교하였다. DOGTOR의 경우보다 더 높은 형질감염 효율이 리포펙타민TM 2000의 경우 발견되었다 (도 9 참조). 추가로 얻은 80% 초과의 높은 세포 생존률을 리포펙타민TM2000으로 얻었기 때문에 (데이터는 표시되지 않음), 모든 추가 형질감염 실험은 리포펙타민 TM2000을 사용하여 수행되었다. 형질감염 직후 mRNA-매개 단백질 발현이 시작됨에 따라, 인큐베이션 시간은 최소로 유지되었다. 따라서, mRNA 투여량과 인큐베이션 시간 사이의 비율을 조정하여 높은 형질감염 효율 (도 9를 또한 참조) 및 리포터 단백질의 과발현에 의해 유발되는 무시할 수 있는 독성 효과를 달성하였다. 5 pg/세포의 mRNA 용량에서, 1시간의 인큐베이션 시간이 최적인 것으로 밝혀졌다.

미세구조화된 기질에 대한 형질감염 효율

성공적으로 형질감염된 세포의 백분율을 평가하여 두 가지 상이한 형질감염제를 비교하고 형질감염 효율이 미세구조화된 세포 성장에 의해 방해받지 않는 것을 보장하였다 (도 9 참조). 여기에서, 모든 세포는 미세구조화된 단백질 어레이 상에서 성장하였다. 우리는 DOGTOR와 비교하여 리포펙타민^TM2000의 경우 더 높은 형질감염 효율을 얻었다. 시판 살아있는/죽은 세포 생존률 검정(Live/Dead cell viability assay) (몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes), 독일)을 사용하여, 80% 초과의 높은 세포 생존률을 밝혀냈다 (데이터는 표시되지 않음).

VI. 실시예 5 : 발현률

두 세포 유형에 대한 모든 결과는 동일한 실험 조건하에 4가지 독립적인 측정에 기초하였다. 약 1000개의 A549 세포와 1000개의 Huh7 세포의 타임 랩 데이터를 분석하였다. 얻어진 발현률 K의 분포를 도 4A에 나타냈고, 상응하는 평균값은 도 4D에서 볼 수 있다.

평균 발현률 및 그의 분포의 형상 둘 다가 상이한 구축물에 대해 꽤 유사한 것으로 밝혀졌다.

VII. 실시예 6 : mRNA 반감기

우리는 수학식 2에 따라 피팅된 mRNA-분해율 δ를 mRNA 반감기로 전환시켰다

(수학식 2)

도 4B는 A549 및 Huh7 세포 각각에서 상이하게 안정화된 mRNA 구축물의 반감기 분포를 나타낸다. 여기에서, 안정화된 구축물에 대하여, 평균 반감기 및 근본적인 분포의 광대함이 참조 구축물과 비교하여 증가한다는 것이 명백해졌다.

모든 결정된 반감기의 개요는 도 4D에 제시하였다. A549 및 Huh7 세포 둘 다에 대해, 우리는 어떠한 안정화 UTR도 함유하지 않는 대조군 구축물과 비교하여 UTR 요소에 의해 안정화된 mRNA에 대해 더 긴 반감기를 밝혀냈다 (A549 세포의 경우 5.8시간 및 Huh7 세포의 경우 7.8시간). 수명 연장 효과는 A549 세포에서 더 두드러졌다.

VIII. 실시예 7 : 단백질 반감기

단백질 (d2EGFP) 분해 수명의 분포는 도 4C에 제시하였다. 예상대로, 발현된 단백질의 반감기는 상이한 mRNA 구축물에 따라 다르지 않다. 결정된 평균 수명은 도 4D에 나타낸 바와 같이 A549 세포에 대해서는 4.2 내지 4.9 시간이고, Huh7 세포에 대해서는 5.6 내지 8.5 시간이다. 변이 계수는 약 0.29 (A549) 및 0.45 (Huh7)이므로, mRNA 수명에 대한 분포에서 우리가 밝혀낸 0.6까지의 변이 계수보다 상당히 작다. 대조군으로서, 형질감염 후, 주어진 시점, t0에서 시클로헥스이미드를 첨가함으로써 번역이 억제되는 대안적 접근법으로 반감기가 또한 측정되었다 (도 10 참조). 이 경우에, 단백질 발현이 잠시 동안 유도된 다음에 정지된다. 억제 후 형광에서 지수적 붕괴로 단백질 수명을 산출한다. 이들 반감기는 억제가 없는 상기 실험과 비교하여, 약 2배로 더 작은 것으로 밝혀졌다. 그러나, 두 실험에서, A549 세포에서와 비교하여 Huh7 세포에서의 단백질 수명의 상대적인 비율은 동일하다.

리포터 단백질의 분해율

피팅된 d2EGFP 분해율을 점검하기 위해, A549 및 Huh7 세포 내의 d2EGFP의 분해율을 미세구조화된 6-채널 슬라이드에서 독립적으로 측정하였다. 단백질 합성을 펩티딜 트랜스퍼라제 활성에 지장을 주는 항생제 시클로헥스이미드에 의해 차단하였다 (42). 단세포 형광 강도 시간 과정은 대략 20시간 동안 모니터되었다 (도 10 참조). 제어 실험은 형광 강도의 감소가 발색단의 광퇴색으로 인한 것이 아니라는 것을 보장하였다. 단세포 시간 과정은 단일 지수적 피트에 의해 피팅되어, 단백질 분해율의 분포를 산출하였다. 평균 분해율은 2.46　h 및 4.04　h 각각의 단백질 수명에 상응하는, A549 세포에서 0.28/h (std 0.08/h) 및 Huh7 세포에서 0.17/h (std 0.08/h)인 것으로 밝혀졌다. 이들 수명은 mRNA 매개 단백질 발현의 단세포 시간 과정 분석에 의해 결정된 바와 같은 수명보다 상당히 짧긴 하지만, Huh7 및 A549 세포 내의 d2EGFP의 평균 수명 사이의 비는 동일하다 (mRNA 발현을 위한 분석 용액을 피팅함으로써 결정된 바와 같은 7.4　h/4.5　h=1.64와 비교하여 번역 차단에 의해 측정된 바와 같은 4.04　h/2.46　h=1.64).

IX. 실시예 8 : 단백질 발현의 마스터곡선

mRNA 유도 단백질 발현의 특징은 도 5A (A549) 및 B (Huh7)에 도시된 바와 같이 단백질 발현의 소위 마스터곡선에서 명백해졌다.

마스터곡선은 발병 시간을 보정한 단세포 추적(trace)의 모집단 평균이며, 즉 모든 발병 시간을 시점 0으로 이동시켰다. 형광 강도를 참고문헌 (26)에서 이전에 기재된 바와 같이 d2EGFP의 실제 수로 변환시켰다. 3' 및 5'+3'-안정화된 mRNA 구축물의 우수한 특성은 마스터곡선 플롯에 도시되어 있다. 이들 구축물은 시간이 지남에 따라 단백질 발현의 가장 피상적인 감소 및 그러므로 가장 긴 반감기와 더불어, 다른 구축물과 비교하여 더 높은 단백질 발현 값을 나타냈다.

X. 실시예 9 : 곡선하 면적 ( AUC )

약물동태학에서, 약물의 총 노출은 "곡선하 면적"으로 공지되어 있다. 유전자 요법에서의 유사 발현은 인위적으로 발현된 단백질의 양을 시간의 경과에 따라 적분한 값, 즉 (발현-대-시간) 곡선하 면적 (AUC)이다. AUC는 번역상 효율과 mRNA 구축물의 안정성을 동시에 정량화하는 수단이다. 이것은 mRNA 상에 코딩되는 단백질의 누적 시간-용량으로 해석될 수 있으므로, 선택된 mRNA 구축물의 효능을 기재한다. 생화학적 속도(biochemical rate) 모델 (도 3A 참조)을 고려해 볼 때, AUC는 명시적으로 계산될 수 있다:

(수학식 3)

그러므로 최적의 치료용 mRNA 구축물은 바람직하게는 긴 mRNA, ^τmRNA 뿐만 아니라, 단백질 반감기, ^τd2EGFP 및 높은 번역상 효율, kTL을 가져야 한다. 게다가, 치료용 mRNA의 초기 양, m0을 결정하는 전달 효율(transfer efficiency)은 AUC에 직접적으로 비례한다. 단백질 발현의 이론적 시간 과정 및 계산된 AUC에 대한 실례가 되는 설명은 도 6A에서 볼 수 있다.

단백질 분해가 없다면 (β = 0), 세포 내 단백질의 양은 mRNA 번역 및 mRNA 분해의 균형 잡힌 플럭스(flux)의 결과로서 정상 상태(steady state) 수준에 이를 것이다. 이 경우에, 발현 역학은

에 따른다. δ가 0과 같은 경우에 대해서도 유사한 방식으로 마찬가지일 것이다. 이것을 d2EGFP 단백질의 영구적이고 지수적 붕괴 (

에 따름)로 중첩하면 도 6A에 나타낸 바와 같이 AUC의 특징적인 형상을 결과한다. 도 6B 및 C는 전체 평균 상대 AUC뿐만 아니라 대조군의 평균 AUC로 정규화된 "실험당" 상대 AUC를 나타내며, 후자는 대조군 구축물로 형질감염 후 단백질 발현의 AUC이다. 두 세포 유형 모두에서, 가장 높은 상대 AUC가 3'UTR- 및 5'+3'UTR-안정화된 구축물에서 밝혀졌다. 이것은 이들 구축물에 대해 관찰된 긴 반감기와 일치하는데, 그 이유는 이들이 수학식 3에서 보이는 바와 같이 AUC에 기여하기 때문이다. 세부적인 단세포 AUC 분포는 도 11에서 찾을 수 있다.

보다 구체적으로, 도 3C에 따른 번역 및 분해에 대한 생화학적 속도의 수학식 (4) 및 (5)를 가정하면, mRNA 형질감염후의 발현된 단백질의 양은 수학식 1에 의해 주어진다.

(수학식 1)

곡선하 면적 (AUC)은 발현이 장시간 (t → ∞)으로 설정될 때 발현 수준 G_d2EGFP(t)을 t0으로부터 적분하여 계산된다:

여기서

이다.

을 사용하여, 수학식 3을 얻는다:

G_d2EGFP(t) 및 AUC의 시간 과정은 도 6A에 개략적으로 도시하였다.

실험적 단세포 AUC 분포는 도 11에서 볼 수 있다. AUC가 mRNA 및 단백질 수명으로부터 선형적으로 의존하기 때문에, 단세포 AUC 분포는 본문의 도 4B 및 4C에 나타낸 mRNA 및 단백질 반감기 분포와 밀접하게 관련되어 있다.

XI. 실시예 10 : 수명-연장 인자

A549 및 Huh7 세포에 대한 수명-연장 인자는 도 6D 및 E에 각각 나타냈다. 예상대로, 모든 안정화된 구축물은 하나보다 높은 수명-연장 인자를 산출하는데, 이는 양쪽 말단에 UTR의 삽입이 mRNA 안정화를 유발한다는 것을 의미한다. 그러나, 3'UTR mRNA 구축물은 2x3'UTR 구축물보다 더 긴 mRNA 수명을 나타낸다. 유사하게, 5'+3'UTR 구축물은 5'+ 2x3' 구축물보다 더 안정적이다. 이들 결과는 두 세포 유형 모두에 유효하다. 흥미롭게도, 안정화 효과는 모든 경우에 Huh7 세포에서보다 A549 세포에서 상당히 더 두드러진다.

XI. 실시예 11 : CYBA - UTR 구축물과 비교하여 상이한 유전자의 UTR을 갖는 구축물의 비교

하기 표 4에 명시된 바와 같이 상이한 유전자의 UTR을 갖는 구축물 #2 내지 #5를 안정성 및 생산성 면에서 mRNA 구축물을 최적화하기 위하여 CYBA-UTR 구축물 #1과 비교하였다. 유전자의 5가지 상이한 세포 UTR은 긴 mRNA 반감기를 특징으로하는 출판물 데이터 (Hoen et al., 2010)에 기초하여 선택되었다. 이들 세포 UTR은 CYBA, DECR1, GMFG, MAPBPIP 및 MYL6B이다. 각각의 세포 유전자의 5' 및 3' 비번역 영역의 서열은 UTR 데이터베이스 (http://utrdb.ba.itb.cnr.it/search)로부터 얻었으며, 이는 5'UTR 단독, 3'UTR 단독, 5'+3'UTR, 5'+2x3'UTR 및 2x3'UTR인, 5가지 상이한 조합으로 클로닝되었다.

첫째로, 비번역 영역 서열이 백본 pVAX1-A120에 클로닝되었다. 5'UTR의 경우에, 5'말단 상의 HindIII 제한 부위와 3'말단 상의 BamHI 제한 부위를 통해 클로닝이 일어났으며, 메트리디아 루시퍼라제(Metridia luciferase)를 코딩하는 리포터 유전자의 상류에 삽입되었다. 3'UTR에 대한 제한 부위는 EcoRI (5'말단) 및 PstI (3'말단)이고 MetLuc의 하류에서 클로닝되었다. 각각의 세포 UTR에 대해 5' UTR 단독 및 5'+3'UTR을 함유하는 플라스미드를 유로핀즈 MWG 오페론(Operon)에 의해 제조하였다. 이들 플라스미드는 전기 천공법을 통해 이. 콜라이(E. coli) 박테리아 (DH10B)로 형질전환되었다. 3'UTR 단독, 5'+2x3'UTR 및 2x3' UTR을 함유하는 다른 조합이 자체에서 클로닝되었다. 3'UTR을 가진 플라스미드의 클로닝은 단순히 HindIII (블런트(blunt)) 및 BamHI (블런트) 소화를 통해 백본의 5'UTR을 커팅해 냄으로써 수행되었다. 5'UTR+2x3'UTR을 함유하는 구축물은 5'+3'UTR을 포함하는 pVAX1-A120 MetLuc의 백본에 3'UTR (BamHI/PstI 블런트)을 함유하는 MetLuc를 삽입함으로써, MetLuc를 대체하고 백본의 각각의 3'UTR 앞에 제2의 3'UTR을 삽입함으로써 클로닝되었다. 마지막으로, 2x3'UTR을 함유하는 구축물은 5'+2x3'UTR을 함유하는 플라스미드로부터 5'UTR (HindIII 및 BamHI, 둘 다 블런트)을 제거함으로써 생성되었다. 클로닝 후, 모든 플라스미드는 전기 천공법 후에 이. 콜라이 박테리아 (DH10B)에서 증폭되었다.

두 번째로, 화학적으로 변형된 mRNA를 시험관내 전사에 의해 생성시켰다. 그 목적을 위해, 플라스미드를 XbaI 소화로 선형화시키고 클로로포름/에탄올 침전에 의해 정제하였다. 시험관내 전사 키트 (프로메가)는 필요한 T7 폴리머라제 효소 믹스뿐만 아니라 적합한 완충제를 포함하였다. 전사는 또한 비변형된 뉴클레오티드 아데노신-트리포스페이트 (ATP), 구아노신-트리포스페이트 (GTP), 우리딘-트리포스페이트 (UTP) 및 시토신-트리포스페이트 (CTP)뿐만 아니라 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 메틸-CTP 및 티오-UTP (예나 바이오사이언스, 게엠베하, 예나, 독일)를 7.13 mM:1.14 mM:5.36 mM:5.36 mM:0.536 mM:0.536 mM의 ATP:GTP:UTP:CTP:메틸-CTP:티오-UTP의 최종 농도로 함유하였다. 게다가, 캡 구조 유사체 ARCA (항-역전 캡 유사체)를 믹스에 첨가하여 오른 방향으로 5'-캡의 혼입을 보장하였다. 마지막으로, 선형화된 DNA를 반응 믹스에 첨가하였다. IVT 믹스를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 나머지 DNA의 소화는 DNase I의 첨가 및 37℃에서 또 다른 20분 동안의 추가 인큐베이션에 의해 가능해졌다. 최종 농도 2.5 M으로 미리 냉각된 암모늄-아세테이트를 첨가함으로써 RNA 침전을 수행하였다. RNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하였다. 세척 단계를 2회 수행하였다. 마지막으로, 상기 RNA를 RNAse-비함유 물에 재현탁시켰다. 분광 광도계로 RNA 농도를 결정하고 순도를 아가로스 겔에서 시험하였다.

IVT 후, 상이한 mRNA는 두가지 상이한 세포주, 즉, NIH3T3 및 A549에서 시험하였다. 스크리닝 실험을 위해, 리포펙션과 같은 비-바이러스성 핵산 전달 시스템이 사용되었다. 첫 번째 형질감염 실험에서, 상이한 형질감염제를 시험하여 단백질 발현 및 세포 생존률을 비교하였다 (데이터는 나타내지 않음). 다음으로, 용량 적정을 포함한 스크리닝 실험을 수행하여 용량 의존 효과를 평가하였다. 실험 설정은 다음과 같다: 150 μl DMEM 완전 배지 중 5000개 세포 (NIH3T3)를 96-웰 플레이트에 웰당 시딩하고 시딩 후 24시간 형질감염시켰다. 시판 형질감염 시약 드림펙트 골드(Dreamfect Gold) (DFG)를 사용하여 500 ng/웰 (100 pg mRNA/세포)의 출발 용량으로 세포를 형질감염시켰다. 복합체를 1 μg mRNA 당 4 μl 드림펙트 골드의 비로 제조하였다. 리포플렉스의 형성을 위해, mRNA (3.6 μg)를 각각의 mRNA에 대해 340 μl의 전체 부피로 보충물 없이 DMEM에서 개별적으로 희석하였다. 96 웰 플레이트에서 각각의 mRNA 희석을 위해 준비된 하나의 웰에서 14.4 μl DFG를 5.6 μl 물과 혼합하였다. 복합체 형성은 mRNA 희석액을 DFG에 첨가하고 위 아래로 피펫팅에 의해 혼합했을 때 일어났다. 혼합물을 20분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 한편, 희석 시리즈가 준비되었다. 복합체 믹스 아래에 있는 나머지 7개의 웰에서, 웰당 보충물이 없는 180 μl DMEM을 첨가하였다. 인큐베이션 시간 후에 180 μl의 복합체 용액을 제거하고 희석 시리즈의 첫 번째 웰에 첨가하였다. 이 절차는 마지막 희석 단계까지 수행되었다. 마지막으로, 50 μl의 복합체 용액을 세포에 첨가하고 4시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 mRNA 구축물에 대해, 생물학적 삼중물을 제조하였다. 4시간 후, 완전 상청액을 측정용 세포 배양 플레이트로부터 제거하고 새로운 150 μl 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 다중라벨 플레이트 판독기를 사용하여 4, 24, 48, 72, 96, 120 및 144 시간 후에 생체 발광을 측정하였다. 여기에 50 μl의 상청액을 20 μl의 코엘렌테라진과 혼합하여 생성된 빛을 측정하였다. 마지막으로 시간 경과에 따른 단백질 양이 관찰되었고 곡선하 면적 (AUC)으로 도시하였다.

결과는 도 12에 나타냈다.

<표 4>

구축물 #1 내지 #5의 요약.

XIII. 논고

mRNA 안정성 및 그의 발현의 결정은 새로운 mRNA 요법 개발에 관해 고려해야 할 두 가지 중요한 인자이다. 여기에서, 상이한 조합의 UTR, 5' UTR, 3'UTR, 5'+3' UTR, 5'+2x3' UTR, 및 두 개의 카피의 3' UTR을 사용하여 안정성 및 그의 발현의 면에서 mRNA를 개선하였다. d2EGFP 시간 과정의 AUC는 총 단백질 발현이 지속 치료 효과와 관련되기 때문에 또한 평가된다. 단세포 수준에서 상세한 시간-분해된(time-resolved) 데이터를 얻고 단백질 발현 역학을 모니터링하기 위해, mRNA 안정성 및 번역상 효율의 평행, 정량 측정을 위한 미세구조화된 단세포 어레이를 사용하였다. 세포의 규칙적인 배열은 재현가능한 미세 환경을 보장하였으며 비교가 가능한 대량신속처리(high-throughput)의 단세포 연구의 전제 조건인 신속하고 자동화된 영상-분석을 가능하게 하였다. 이 접근법은 (i) 단백질 반감기, (ii) 발현률, 및 (iii) 기능적 mRNA 반감기에 대한 분포 함수의 결정을 가능하게 한다.

A549 및 Huh7 세포 둘 다에서, d2EGFP의 평균 단백질 반감기는 UTR 서열과 독립적으로 좁게 분포되어 있었다. A549 세포의 경우 4.5시간 및 Huh7 세포의 경우 7.4시간의 계산된 반감기 값은 비교된 세포주 사이의 세포 유형 특이적 차이에 기인할 수 있을 것이다. d2EGFP 반감기의 이러한 세포 특이적 차이는 이전에 발표되어 있다. 유사한 영상화 세포측정 접근법을 사용한 NIH3T3 세포에서의 연구는, 12시간의 측정 기간(measurement window) 이내에 2.8시간의 반감기를 기록하였다 (33). CHO 세포에 대해 2시간 미만의 훨씬 더 짧은 반감기가 리(Li) 등에 의해 보고되었다 (34). 여기에서, 단백질 분해는 단지 3시간 동안의 유동 세포측정법 및 웨스턴 블롯팅에 의해 측정하였다.

단세포 데이터 분석으로부터의 우리의 조사 결과를 검증하기 위해, 시클로헥스이미드를 사용하여 직접 측정한 d2EGFP 수명을 추가로 결정하였다 (도 10 참조). 단세포 데이터 분석으로부터 관찰된 값과 비교하여 더 짧은 수명이 밝혀졌다. 이는 단세포 데이터 분석에서 일정한 초기 수의 mRNA 분자가, 조합된 발현률

의 부분으로서 가정되었다는 사실로 인한 것일 수 있다 (수학식 1 참조). 그러나, 1시간 인큐베이션 시간 후에 세포를 세척하였음에도 불구하고, mRNA 분자의 수는 관찰의 시작부터 일정하지 않을 가능성이 여전히 있다. 결과적으로, 단백질 발현을 야기하는, 번역을 위해 나중에 이용가능한 mRNA 분자는 단세포 발현의 시간 과정 피팅으로부터 더 긴 반감기 값을 결과할 수 있다. Huh7 세포에 대해 결정된 평균 반감기가 A549 세포에 대해 결정된 평균 반감기와 비교될 때, 두 측정 방법의 경우 대략 1.64의 동일한 비가 밝혀졌다. 또한, mRNA와 단백질 반감기에 대한 가능한 체계적인 과대 평가조차도 mRNA 성능의 질적인 순서를 변화시키지 않는다.

발현률은 mRNA 분자의 초기 수, m0, 뿐만 아니라 번역률 KTL에 따라 달라진다. 성공적으로 전달된 mRNA 분자의 수는 전달 과정의 본질적인 확률 성 (stochasticity)으로 인해 다양하다는 점을 주목해야 한다. 그러나, mRNA 분자의 평균 수는 형질감염 프로토콜이 모든 실험에서 용의주도하게 유지되어 왔기 때문에 동일할 것으로 예상된다. 그에 반해서, 다양한 UTR 구축물의 번역 활성 (KTL)은 다양할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 발현률 K의 분포뿐만 아니라 평균값이 모든 구축물에 대해 다소 유사하다는 사실 (도 3A 및 도 3D 참조)은 번역률이 삽입된 UTR에 의해 단지 영향을 받는다는 것을 나타낸다.

최고 관심 매개 변수는 mRNA 반감기이다. 여기에서 기능적 mRNA 반감기가 물리적 mRNA 반감기와 비교되었다. 단세포 형질감염 연구의 결과는 5' 또는 3' UTR의 mRNA 서열에의 임의의 삽입은 그의 기능적 mRNA 반감기를 증가시킨다는 것을 시사한다. 이 연구에서 시험된 모든 변형은 연장된 mRNA 반감기를 야기하여 (도 2 및 도 3 참조), 형광 현미경 영상화 및 FC (도 1 참조)에 의해 측정된 바와 같이 발현을 연장시켰다. 기능적 mRNA 반감기와 대조적으로, qRT-PCR에 의해 결정된 물리적 mRNA 반감기는 두 세포주 모두에서 5', 3', 5'+2x3' 및 2x3' UTR에 대한 mRNA 안정성에서 감소를 나타냈다 (도 8A 및 B 참조). 하나의 주요 차이는 두 방법 모두에서 모든 측정된 mRNA에 대한 번역 능력이다. 기능적 mRNA 반감기를 측정하는 경우에, mRNA는 적극적인 번역에 관여하며, 한편 물리적 mRNA 반감기는 검출된 mRNA의 번역 상태에 관계없이 모니터링된다. 유사한 조사 결과들이 갈리(Gallie) 등 (35)에 의해 보고되었다. 물리적 mRNA 반감기는 mRNA의 번역 능력의 적절한 지표가 아니라고 여겨진다. mRNA에 대한 번역 능력은 그의 기능적 반감기 (발현의 수명)와 생성된 총 단백질의 양 (곡선하 면적)으로부터 판단될 수 있다. 치료용 mRNA의 경우, 분자가 가능한 한 오랫동안 기능적이며 최대의 가능한 단백질을 생성시키는 것이 필수적이다. 이것은 기능적 mRNA 반감기 및 생성된 단백질의 총량 둘 다가 mRNA 치료제를 확인하고, 비교하고, 시험하는 더 양호한 척도라는 결론을 이끌어낸다. 더욱이, 반감기의 불균일 분포는 앙상블 측정에서, 이들 영향이 불분명하기 때문에 단세포 측정 기술의 중요성을 지적한다 (도 2, 4, 및 8A 및 B).

흥미롭게도, 비록 지금까지 CYB5 'UTR에서의 어떠한 공지된 모티프도 발견되지 않았지만, 5' UTR 단독에 대해 단백질 발현에 대한 긍정적인 효과가 관찰되었다. 처음으로, 양쪽 말단에서 CYBA UTR이 두 세포주 모두에서 단백질 발현의 피크 및 지속성 둘 다를 증가시키는 데 충분한 것으로 나타났다. 이들 조사 결과들은 5' UTR 및 3' UTR의 개별적 또는 상승작용적 거동을 주장하는 출판물과 일치한다 (14). 홀트캠프(Holtkamp) 등 (16)과 대조적으로, 하나의 단일 3' UTR과 비교하여 두 개의 순차적 카피의 3'UTR로 단백질 발현 또는 mRNA 안정성의 어떠한 추가적 증가도 관찰될 수 없었다 (도 4 참조). 반대로, 이는 심지어 5'+3' 대 5'+2x3' UTR 삽입 및 3' 대 2x3' UTR 삽입 둘 다에 대한 더 짧은 수명을 결과하였다. 이것은 홀트캠프 등 (16)에 의한 연구에서 상이한 유형의 세포 (즉, 수지상 세포)가 사용되었다는 사실로 인한 것일 수 있다. 유사한 세포 유형 특이적 효과가 간세포에서도 보고되었다 (39). mRNA 안정성과 그의 번역 효율 둘 다에 영향을 미치는 또 다른 기여 인자는 상이한 mRNA의 이차 구조일 수 있다. 유전자 발현 조절에 있어서 mRNA 이차 구조의 이러한 효과는 이전에 보고된 바 있다 (36,37).

현재 연구에서 사용된 mRNA 구축물에 대한 그의 최소 자유 에너지와 함께 중요한 구조적 특성을 표 3에 요약하였다.

5' + 3'UTR 안정화된 구축물의 지속적인 단백질 발현은 mRNA의 원형화(circularization)를 촉진하는 5'의 3' 말단으로의 결합으로 인한 것일 수 있다 (19). 5 'UTR 내에 어떠한 안정적인 이차 구조가 발견될 수 없기 때문에, 이 특징은 조기 발현 발생을 가능하게 하는 것으로 추정된다 (38). 그에 반해서, 3' UTR 내에 이차 구조가 확인되었다. 이들은 3'-5' 분해 경로로부터 mRNA를 보호할 수 있다. 2개의 3' UTR은 최상의 최소 자유 에너지를 지닌 훨씬 더 많은 이차 구조 (2개의 헤어핀)를 나타냈고, 이는 더 지속적인 발현을 나타내는 것이다. 종합하면, 이들 조사 결과들은 3' UTR을 함유하는 mRNA 구축물의 추후 시점에서의 지속적인 발현 및 5'UTR과 비교하여 2x3 'UTR의 더 열등한 발현 발생에 대한 설명이 될 수 있다.

단백질 반감기에 따라, UTR로 안정화된 mRNA에 대해 더 긴 반감기 값이 얻어졌다. 이것은 절대 값에 영향을 미칠 가능성이 가장 높은 세포 특이적 차이가 있는 세포주 둘 다에서 관찰되었다. A549 세포에서, UTR을 가진 구축물의 mRNA 반감기는 대조군의 5.8시간과 비교하여 13.0시간 내지 23.0시간의 범위였다. Huh7 세포에서는, 대조군 mRNA에 대한 7.8시간의 반감기와 대조적으로, 9.9시간 내지 13.6시간의 반감기가 UTR-함유 구축물에 대해 측정되었다. A549 세포에서 3'UTR-안정화된 mRNA의 반감기는 이전에 보고된 유사하게 안정화된 mRNA의 mRNA 수명과 잘 일치한다 (16,26). 단백질 및 mRNA의 붕괴 동역학 및 안정성이 상이한 세포 유형에 있어서 상이하다는 사실은 세포 유형 의존성일 가능성이 높은 단백질과 mRNA 사이의 상호 작용의 복잡한 네트워크에서의 차이로 인한 것일 가능성이 가장 높다.

종합하면, 분석법 (FC 또는 단세포 분석)과 관계없이 A549 및 Huh7 세포 둘 다에서의 우리의 결과는 CYBA UTR 안정화된 mRNA에 의해 지속적이고 높은 수준의 단백질 발현이 유도될 수 있음을 시사한다. UTR 조합의 선택은 적용의 실험의 필요에 따라 달라진다. 감소된 mRNA 붕괴를 가진 지속적인 단백질 발현이 요구되는 경우, 3' UTR 단독으로 안정화된 mRNA가 목적을 충족시킬 수 있다. 그러나, 5'+3' UTR의 조합은 조기 발병, 높은 피크 및 누적 단백질 발현의 추가적인 바람직한 특징을 결과한다.

여기에서 mRNA-유도 단백질 발현의 단세포 분석은 mRNA 구축물의 약물동태학적 특성을 특성화하고 개선시키는 수단임이 입증된다. 이 접근법을 사용하여, 상이한 mRNA 구축물의 세포내 생체이용률을 체계적으로 평가하여 지속적인 단백질 발현을 초래하는 서열을 확인하는 것이 가능하다. 두 가지 세포 유형에서 FC 분석 및 단세포 모델을 사용하는 UTR 삽입에 의해 안정화된 구축물에 대해 단백질 발현의 지속성이 연장된 것으로 밝혀졌다. 이 조사 결과는 mRNA 치료제 개발의 경우에 바람직하다. 일정 기간 (AUC)에 걸쳐 지속적인 단백질 발현을 가진 전령 RNA 구축물이 바람직하며, 최종 치료 결과와 함께 환자에게 적절한 감소된 투여를 가능하게 한다.

참고 문헌

1. G. Tavernier, O. Andries, J. Demeester, N. N. Sanders, S. C. De Smedt and J. Rejman, J Control Release, 2011, 150, 238-247.

2. A. Yamamoto, M. Kormann, J. Rosenecker and C. Rudolph, Eur J Pharm Biopharm, 2009, 71, 484-489.

3. M. S. D. Kormann, G. Hasenpusch, M. K. Aneja, G. Nica, A. W. Flemmer, S. Herber-Jonat, M. Huppmann, L. E. Mays, M. Illenyi, A. Schams, M. Griese, I. Bittmann, R. Handgretinger, D. Hartl, J. Rosenecker and C. Rudolph, Nat Biotech, 2011, 29, 154-157.

4. M. Esteller, Nat Rev Genet, 2011, 12, 861-874.

5. K. Kariko and D. Weissman, Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2007, 10, 523.

6. G. Pesole, G. Grillo, A. Larizza and S. Liuni, Briefings in Bioinformatics, 2000, 1, 236-249.

7. T. V. Pestova, J. R. Lorsch and C. U. Hellen, Cold Spring Harbor Monograph Archive, 2007, 48, 87-128.

8. L. Barrett, S. Fletcher and S. Wilton, Cell. Mol . Life Sci ., 2012, 69, 3613-3634.

9. F. Mignone, G. Grillo, F. Licciulli, M. Iacono, S. Liuni, P. J. Kersey, J. Duarte, C. Saccone and G. Pesole, Nucleic Acids Research, 2005, 33, D141-D146.

10. M. J. Moore, Science, 2005, 309, 1514-1518.

11. X. Pichon, L. A. Wilson, M. Stoneley, A. Bastide, H. A. King, J. Somers and A. E. Willis, Current Protein & Peptide Science, 2012, 13, 294-304.

12. P. A. C. 't Hoen, M. Hirsch, E. J. d. Meijer, R. X. d. Menezes, G. J. van Ommen and J. T. d. Dunnen, Nucleic Acids Research, 2011, 39, 556-566.

13. G. Pesole, F. Mignone, C. Gissi, G. Grillo, F. Licciulli and S. Liuni, Gene, 2001, 276, 73-81.

14. F. Gebauer and M. W. Hentze, Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, 5, 827-835.

15. L. Tillmar, C. Carlsson and N. Welsh, Journal of Biological Chemistry, 2002, 277, 1099-1106.

16. S. Holtkamp, S. Kreiter, A. Selmi, P. Simon, M. Koslowski, C. Huber, O. Tureci and U. Sahin, Blood, 2006, 108, 4009-4017.

17. C. H. d. Moor, H. Meijer and S. Lissenden, Seminars in Cell & Developmental Biology, 2005, 16, 49-58.

18. N. L. Garneau, J. Wilusz and C. J. Wilusz, Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8, 113-126.

19. E. Szostak and F. Gebauer, Briefings in Functional Genomics, 2012.

20. S. Tyagi, Nat Meth, 2009, 6, 331-338.

21. H. Y. Park, H. Lim, Y. J. Yoon, A. Follenzi, C. Nwokafor, M. Lopez-Jones, X. Meng and R. H. Singer, Science, 2014, 343, 422-424.

22. C. Miller, B. Schwalb, K. Maier, D. Schulz, S. D?mcke, B. Zacher, A. Mayer, J. Sydow, L. Marcinowski, L. D?lken, D. E. Martin, A. Tresch and P. Cramer, Molecular Systems Biology, 2011, 7.

23. T. Nolan, R. E. Hands and S. A. Bustin, Nat. Protocols, 2006, 1, 1559-1582.

24. M. Rabani, J. Z. Levin, L. Fan, X. Adiconis, R. Raychowdhury, M. Garber, A. Gnirke, C. Nusbaum, N. Hacohen, N. Friedman, I. Amit and A. Regev, Nat Biotech, 2011, 29, 436-442.

25. B. Schwanhausser, D. Busse, N. Li, G. Dittmar, J. Schuchhardt, J. Wolf, W. Chen and M. Selbach, Nature, 2011, 473, 337-342.

26. C. Leonhardt, G. Schwake, T. R. St?gbauer, S. Rappl, J.-T. Kuhr, T. S. Ligon and J. O. R?dler, Nanomedicine : Nanotechnology , Biology and Medicine, 2014, 10, 679-688.

27. P. J. F. Rottgermann, A. P. Alberola and J. O. Radler, Soft Matter, 2014.

28. P. Corish and C. Tyler-Smith, Protein Engineering, 1999, 12, 1035-1040.

29. J. J. Rossi, Nat Cell Biol, 2005, 7, 643-644.

30. U. Sheth and R. Parker, Cell, 2006, 125, 1095-1109.

31. A. Jakymiw, K. M. Pauley, S. Li, K. Ikeda, S. Lian, T. Eystathioy, M. Satoh, M. J. Fritzler and E. K. L. Chan, Journal of Cell Science, 2007, 120, 1317-1323.

32. R. Parker and U. Sheth, Molecular Cell, 2007, 25, 635-646.

33. M. Halter, A. Tona, K. Bhadriraju, A. L. Plant and J. T. Elliott, Cytometry Part A, 2007, 71A, 827-834.

34. X. Li, X. Zhao, Y. Fang, X. Jiang, T. Duong, C. Fan, C.-C. Huang and S. R. Kain, Journal of Biological Chemistry, 1998, 273, 34970-34975.

35. D. R. Gallie, Genes & Development, 1991, 5, 2108-2116.

36. J.-M. Chen, C. F?rec and D. Cooper, Hum Genet, 2006, 120, 301-333.

37. P. Gaspar, G. Moura, M. A. Santos and J. L. Oliveira, Nucleic acids research, 2013, 41, e73-e73.

38. J. R. Babendure, J. L. Babendure, J.-H. Ding and R. Y. Tsien, RNA (New York, N.Y, 2006, 12, 851-861.

39. B. T. Kren and C. J. Steer, FASEB J., 1996, 10, 559-573.

40. Zuker, M. (2003) Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic acids research, 31, 3406-3415.

41. Babendure, J.R., Babendure, J.L., Ding, J.-H. and Tsien, R.Y. (2006) Control of mammalian translation by mRNA structure near caps. RNA (New York, N.Y, 12, 851-861.

42. Siegel, M.R. and Sisler, H.D. (1963) Inhibition of Protein Synthesis in vitro by Cycloheximide. Nature, 200, 675-676.

43. Friedel CC, D?lken L, Ruzsics Z, Koszinowski UH, Zimmer R. (2009) Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic acids research, 37, e115.

SEQUENCE LISTING <110> ETHRIS GmbH <120> UTRs INCREASING THE TRANSLATION EFFICIENCY OF RNA MOLECULES <130> IPA171311-DE <150> EP 15174683.1 <151> 2015-06-30 <160> 11 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..36 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="5’ UTR of the human cytochrome b-245 alpha polypeptide (CYBA) gene" /organism="Artificial Sequence" <400> 1 cgcgccuagc agugucccag ccggguucgu gucgcc 36 <210> 2 <211> 64 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..64 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="3’ UTR of the human cytochrome b-245 alpha polypeptide (CYBA) gene" /organism="Artificial Sequence" <400> 2 ccucgccccg gaccugcccu cccgccaggu gcacccaccu gcaauaaaug cagcgaagcc 60 ggga 64 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..20 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="d2EGFP-forward Primer" /organism="Artificial Sequence" <400> 3 caaccactac ctgagcaccc 20 <210> 4 <211> 20 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cytochrome b-245 alpha polypeptide <400> 9 Met Gly Gln Ile Glu Trp Ala Met Trp Ala Asn Glu Gln Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Ile Leu Ile Thr Gly Gly Ile Val Ala Thr Ala Gly Arg 20 25 30 Phe Thr Gln Trp Tyr Phe Gly Ala Tyr Ser Ile Val Ala Gly Val Phe 35 40 45 Val Cys Leu Leu Glu Tyr Pro Arg Gly Lys Arg Lys Lys Gly Ser Thr 50 55 60 Met Glu Arg Trp Gly Gln Lys Tyr Met Thr Ala Val Val Lys Leu Phe 65 70 75 80 Gly Pro Phe Thr Arg Asn Tyr Tyr Val Arg Ala Val Leu His Leu Leu 85 90 95 Leu Ser Val Pro Ala Gly Phe Leu Leu Ala Thr Ile Leu Gly Thr Ala 100 105 110 Cys Leu Ala Ile Ala Ser Gly Ile Tyr Leu Leu Ala Ala Val Arg Gly 115 120 125 Glu Gln Trp Thr Pro Ile Glu Pro Lys Pro Arg Glu Arg Pro Gln Ile 130 135 140 Gly Gly Thr Ile Lys Gln Pro Pro Ser Asn Pro Pro Pro Arg Pro Pro 145 150 155 160 Ala Glu Ala Arg Lys Lys Pro Ser Glu Glu Glu Ala Ala Val Ala Ala 165 170 175 Gly Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gln Val Asn Pro Ile Pro Val Thr Asp 180 185 190 Glu Val Val 195 <210> 10 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..56 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="extended '5' UTR of the human cytochrome b-245 alpha polypeptide (CYBA) gene" /organism="Artificial Sequence" <400> 10 ggagcgcagg ggcggcagtg cgcgcctagc agtgtcccag ccgggttcgt gtcgcc 56 <210> 11 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..56 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="extended '5' UTR of the human cytochrome b-245 alpha polypeptide (CYBA) gene" /organism="Artificial Sequence" <400> 11 ggagcgcagg ggcggcagug cgcgccuagc agugucccag ccggguucgu gucgcc 56

Claims (15)

1. (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및
   (b) 상기 코딩 영역의 상류에, 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열, 또는 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내고 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 생성하는 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들); 및/또는
   (c) 상기 코딩 영역의 하류에, 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열, 또는 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내고 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 생성하는 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)
   을 포함하는 RNA 분자로서,
   여기서 상기 코딩 영역에 의해 코딩된 상기 폴리펩티드는 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)가 아닌 것인, RNA 분자.
2. 제1항에 있어서, 제1항의 (b)에 정의된 바와 같은 상기 UTR(들)이 제1항의 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 5' 말단에 위치하는 것인, RNA 분자.
3. 제1항에 있어서, 제1항의 (c)에 정의된 바와 같은 상기 UTR(들)이 제1항의 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 말단에 위치하는 것인, RNA 분자.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항의 (b)에 정의된 바와 같은 상기 UTR(들)이 제1항의 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 5' 말단에 위치하고 제1항의 (c)에 정의된 바와 같은 상기 UTR(들)이 제1항의 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 말단에 위치하는 것인, RNA 분자.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항의 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 5' 말단에 제1항의 (b)에 정의된 바와 같은 하나의 UTR을 포함하며 제1항의 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 말단에 제1항의 (c)에 정의된 바와 같은 2개의 UTR을 포함하는, RNA 분자.
6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 제1항의 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 말단에 제1항의 (c)에 정의된 바와 같은 2개의 UTR을 포함하는, RNA 분자.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 말단에서 폴리-A 테일을 포함하는, RNA 분자.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리-A 테일이 적어도 120개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인, RNA 분자.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 RNA 분자를 코딩하는 핵산 분자.
10. 제9항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
11. 제10항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 RNA 분자, 제9항에 따른 핵산 분자, 제10항에 따른 벡터 또는 제11항에 따른 숙주 세포 및 임의로 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
13. 제12항에 있어서, RNA-기반 요법에서 사용하기 위한, 제약 조성물.
14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 RNA 분자, 제9항에 따른 핵산 분자, 제10항에 따른 벡터 또는 제11항에 따른 숙주 세포를 포함하는 키트.
15. RNA 분자의 코딩 영역을 상기 코딩 영역에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 단백질로 번역하는 효율을 증가시키기 위한 제1항의 (b)에 정의된 바와 같은 하나 이상의 UTR(들) 및/또는 제1항의 (c)에 정의된 바와 같은 하나 이상의 UTR(들)의 용도.

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