BR112021014528A2

BR112021014528A2 - Composição farmacêutica, e, método para analisar o efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese

Info

Publication number: BR112021014528A2
Application number: BR112021014528-1A
Authority: BR
Inventors: Carsten Rudolph; Kai Wohlgemuth; Sandra Cindric; Niki Tomas Loges; Johanna Raidt; Adrian Ter Steege; Verena Kretzschmann; Rebekka Kubisch-Dohmen; Christian Dohmen; Johannes GEIGER; Manish Aneja; Ludwig Weiss; Heymut Omran; Petra Pennekamp
Original assignee: Ethris Gmbh
Priority date: 2019-02-14
Filing date: 2020-02-13
Publication date: 2021-10-13
Also published as: EP3923971C0; ZA202106769B; WO2020165352A1; HUE065017T2; CN113423418A; CA3129912A1; EP3923971B1; JP2024096766A; KR20210127718A; ES2974368T3; CA3225057A1; AU2020220636A1; EP3923971A1; PL3923971T3; EP4223306A3; JP2022522412A; MX2021009388A; EP4223306A2; US20220211807A1

Abstract

composição farmacêutica, e, método para analisar o efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese. a presente descrição provê uma composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia em um sujeito que sofre de uma ciliopatia, em que o polirribonucleotídeo codifica uma versão funcional de uma proteína cujo defeito está associado com a dita ciliopatia, e em que a administração da dita composição farmacêutica no sistema respiratório do dito sujeito é realizada quando o sujeito exibe uma inflamação do sistema respiratório. adicionalmente, a presente descrição se refere a um método para analisar o efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese, em que o dito polirribonucleotídeo codifica uma proteína envolvida em, e/ou exigida por, ciliogênese.

Description

1 / 141 COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODO PARA ANALISAR O

EFEITO DE UM POLIRRIBONUCLEOTÍDEO NA CILIOGÊNESE

[001] A presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia em um sujeito que sofre de uma ciliopatia, em que o polirribonucleotídeo codifica uma versão funcional de uma proteína cujo defeito está associado com a dita ciliopatia, e em que a administração da dita composição farmacêutica no sistema respiratório do dito sujeito é realizada quando o sujeito exibe uma inflamação do sistema respiratório. A presente invenção se refere adicionalmente a um método para analisar o efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese, em que o dito polirribonucleotídeo codifica uma proteína envolvida em, e/ou exigida por, ciliogênese.

[002] O oxigênio é vital para muitos organismos multicelulares, uma vez que é crucial para o fornecimento de energia das células. Em mamíferos, o oxigênio compreendido no ar pode entrar no organismo por meio do sistema respiratório, que se refere aos órgãos envolvidos na respiração. Estes incluem, por exemplo, nariz, garganta, laringe, traqueia, brônquios e pulmões. No último, o gás do ambiente é trocado por gás compreendido no sistema circulatório sanguíneo interno, que transporta o oxigênio dos pulmões para as células em diferentes partes do organismo. Entretanto, além do oxigênio exigido, outros componentes também podem entrar no organismo por meio do sistema respiratório, tais como agentes irritantes compreendidos no ar, incluindo poluentes, patógenos e agentes causadores de doença tais como vírus e bactérias. Consequentemente, existem os mecanismos de defesa tais como reflexos da tosse e espirros para expelir o agente irritante do sistema respiratório. Para expulsão, o agente irritante é incorporado no muco viscoso, que é secretado por células epiteliais no sistema respiratório, e a seguir transportado através da superfície epitelial por células ciliadas.

[003] As células ciliadas podem transportar muco e agentes irritantes

2 / 141 através da superfície epitelial por um batimento sincronizado de múltiplos cílios móveis. Os cílios são estruturas tubulares revestidas por membrana que se estendem da superfície epitelial até o espaço do sistema respiratório que está em contato com o meio ambiente. Dentro das células, o axonema de um cílio é ancorado a um corpo basal por meio de estruturas de ancoragem. Um axonema é um feixe central de microtúbulos em que nove microtúbulos duplos externos circundam um par central de microtúbulos simples (isto é, nos cílios respiratórios). Os microtúbulos duplos externos e o par central de microtúbulos são conectados por raios radiais. Cada um dos nove microtúbulos externos de dupleto consiste em um túbulo A e um B, com os dupletos sendo circunferencialmente interconectados por um complexo regulador de nexina-dineína. O braço interno de dineína e o baço externo de dineína são conectados em cada túbulo A Esses braços de dineína contêm proteínas motoras que podem caminhar ao longo dos microtúbulos, o que resulta em flexão e, assim, batimento do cílio (conferir, por exemplo, Lodish et al, 2000, Molecular Cell Biology, 4a edição, Nova Iorque: W. H. Freeman, Section 19.4). As investigações das estruturas ciliares usando o modelo Trypanosoma brucei indicaram que alguns desses componentes estruturais exibem uma rápida renovação, enquanto os componentes esqueléticos dos raios radiais, o par central e os braços de dineína externos são incorporados principalmente na extremidade distal da estrutura ciliar durante o desenvolvimento (Vincensini et al., Biol Cell, 2018, 110:1-15).

[004] Uma vez que o batimento sincronizado das células ciliadas é crucial para o transporte de fluidos através das superfícies epiteliais, as perturbações das estruturas ciliares podem causar distúrbios graves. Defeitos de motilidade, incluindo uma amplitude reduzida e/ou frequência de batimento e/ou assincronicidade, podem ocorrer como resultado de uma redução ou perda de braços de dineína, uma desorganização do arranjo de microtúbulos, incluindo localização incorreta e mudanças no número total de

3 / 141 microtúbulos por axonema e combinações destes, por exemplo. Até onde se sabe, as alterações nesses elementos axonemais funcionais são causadas por defeitos genéticos subjacentes. Isso se deve principalmente às mudanças na sequência de um gene que codifica um componente axonemal, incluindo os anteriormente mencionados. Como os genes podem ser transcritos em polirribonucleotídeos, tais como RNAms, que por sua vez podem ser traduzidos em proteínas, a sequência de DNA de um gene afeta a síntese da respectiva proteína em termos de quantidade e funcionalidade. Uma vez que os distúrbios ciliares, isto é, ciliopatias, causados por mudanças na sequência são herdados e, assim, estão associados aos defeitos de motilidade dos cílios em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo embriões ou recém- nascidos, as ciliopatias podem ter consequências graves para o organismo.

[005] Um exemplo bem conhecido de distúrbio ciliar é a discinesia ciliar primária (PCD), um distúrbio progressivo frequentemente associado ao declínio da função pulmonar. Assim, os tratamentos de longo prazo incluindo, por exemplo, percussões torácicas e drenagem postural são necessários para intensificar a eliminação do muco com frequência crescente e, em casos graves, até mesmo transplante pulmonar. Além disso, os pacientes com PCD sofrem de infecções recorrentes nos pulmões e/ou ouvidos, muitas vezes também de subfertilidade, hidrocefalia e lateralidade corporal, ou seja, eixo esquerdo-direito, deficiências, bem como problemas retinais e/ou neurológicos. Mas, apesar da gravidade da maioria das ciliopatias, não existem estratégias eficazes padronizadas para o tratamento de ciliopatias como a PCD até o momento. As terapias atuais são, por exemplo, extrapoladas da fibrose cística e, na maioria dos casos, nem mesmo foram validadas para a ciliopatia específica a ser tratada tal como por exemplo PCD. Portanto, existe uma necessidade de apresentar soluções disponíveis para tratar com eficiência os indivíduos que sofrem de uma ciliopatia, tal como a PCD.

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[006] O presente pedido aborda a necessidade de restaurar a função ciliar em indivíduos que sofrem de uma ciliopatia, tal como PCD, provendo as modalidades, da maneira citada nas reivindicações.

[007] Em particular, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia em um sujeito que sofre de uma ciliopatia, em que o polirribonucleotídeo codifica uma versão funcional de uma proteína cujo defeito está associado com a dita ciliopatia, e em que a administração da dita composição farmacêutica no sistema respiratório do dito sujeito é realizada quando o sujeito exibe uma inflamação do sistema respiratório.

[008] A presente invenção baseia-se na constatação de que é de fato possível restaurar a função ciliar adequada transferindo células (que exibem um defeito em uma certa proteína de um complexo de proteínas dos cílios e cujo defeito leva a uma perda de função ciliar adequada) com polirribonucleotídeos que codificam uma versão funcional da dita proteína. Entretanto, verificou-se também que células ciliadas foram transfectadas em um estágio inicial durante a diferenciação, a fim de atingir este efeito. Isto leva a problemas práticos, uma vez que as células precursoras das células epiteliais que carregam os cílios, isto é, células basais, não são acessíveis para transfecção por meio do sistema de vias aéreas, uma vez que estão localizadas profundamente no epitélio e não são expostas na superfície. De acordo com a presente invenção, uma transfecção das células epiteliais por administração de um polirribonucleotídeo é realizada quando o sujeito que sofre de uma ciliopatia exibe uma inflamação do sistema respiratório. Durante uma inflamação do sistema respiratório, o epitélio das vias aéreas exibe lesões e ferimentos que tornam as células precursoras das células ciliadas acessíveis, isto é, as células basais que que ainda não iniciaram ciliogênese. A transfecção destas células com um polirribonucleotídeo, da maneira descrita anteriormente, que expressa uma versão funcional da respectiva proteína,

5 / 141 torna estas células naturalmente em células que formam cílios funcionais, ou pelo menos cílios parcialmente funcionais que podem levar a um alívio substancial dos respectivos sintomas.

[009] No contexto da presente invenção, o termo “ciliopatia” se refere às doenças associadas com, e/ou caracterizadas por, defeitos de células ciliadas. Assim, ciliopatias compreendem distúrbios de estruturas ciliares, incluindo estruturas de ancoragem ciliar, corpos basais aos quais as estruturas ciliares são ancoradas dentro de uma célula, e/ou função ciliar. Exemplos de ciliopatias incluem PCD, síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Simpson- Golabi-Behmel (tipo 2), amaurose congênita de Leber, nefronoftise, displasia cranioectodermal (Sensenbrenner) (conferir, por exemplo, Mitchison et al., 2017, Ultrastructural Pathology,41(6):415-427).

[0010] O termo “ciliopatia” da maneira aqui usada se refere a uma ciliopatia que é causada por um defeito genético no DNA de um sujeito, por exemplo, o DNA cromossomal ou o mitocondrial. Um defeito genético como este pode ser causado por uma mutação e pode compreender perda, adição ou troca de uma parte da sequência. São exemplos a variação em número de cópia, variação por presença/ausência, eliminação (completa ou parcial), inserção, mutação pontual, mutação sem sentido, variação do sítio de emenda, ou uma combinação destes. Tais alterações no DNA podem levar às alterações na disponibilidade da proteína codificada, tal como uma perda ou uma redução da quantidade de proteína, ou a uma proteína com função alterada.

[0011] Em uma modalidade preferida, o termo “ciliopatia” se refere a uma doença conectada a um defeito em cílios móveis. Um exemplo de uma ciliopatia como esta é discinesia ciliar primária (PCD). PCD é uma doença rara causada pela disfunção de cílios móveis. PCD é heterogênea no nível genético, funcional e ultraestrutural. PCD é associada com transporte e eliminação de muco prejudicados. Os sujeitos que sofrem de PCD mostram

6 / 141 congestões nasais recorrentes, infecções sinusais, infecções de ouvido, infertilidade, anormalidades de sítios tais como situs inversus totalis e heterotaxia, também referidas como “sítio ambíguo” e/ou hidrocefalia. No nível molecular, PCD está associada na maioria dos casos com anormalidades na estrutura, função e biogênese de cílios do sistema respiratório. Exemplos para tais anormalidades são braços de dineína encurtados ou ausentes, complexo de par central, raio radial ou ligações de nexina defeituosos. Tais anormalidades, e assim, defeitos de motilidade ciliar associados com PCD, são causados por mutações em genes que codificam os respectivos componentes, em particular por mutações em genes listados na Tabela 1, em que os grupos “A” e “B” se referem aos genes com mutações patogênicas, estimados para explicar pelo menos 1 % e menos de 1 % dos casos de PCD, respectivamente (conferir Zariwala et al., GeneReviews®, 2007, atualizado em 2015, Primary Ciliary Dyskinesia, editores Adam et al., Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2018).

[0012] Consequentemente, o polirribonucleotídeo compreendido na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é preferivelmente um polirribonucleotídeo que pode ser traduzido em uma versão funcional de uma proteína listada na Tabela 1.

[0013] Mais preferivelmente, o polirribonucleotídeo compreendido na composição farmacêutica, de acordo com a presente invenção, é um RNAm que pode ser traduzido em uma versão funcional de uma proteína selecionada do grupo que consiste em DNAH5, DNAH11, CCDC39, DNAI1, CCDC40, CCDC103, SPAG1, ZMYND10, ARMC4, CCDC151, DNAI2, RSPH1, CCDC114, RSPH4A, DNAAF1 (LRRC50), DNAAF2 (KTU), e LRRC6. Tabela 1 Gene Locus Proteína Grupo DNAH5 CILD3 DNAH5 A DNAH11 CILD7 DNAH11 A CCDC39 CILD14 CCDC39 A DNAI1 CILD1 DNAI1 A CCDC40 CILD15 CCDC40 A CCDC103 CILD17 CCDC103 A

7 / 141 SPAG1 CILD28 SPAG1 A ZMYND10 CILD22 ZMYND10 A ARMC4 CILD23 ARMC4 A CCDC151 CILD30 CCDC151 A DNAI2 CILD9 DNAI2 A RSPH1 CILD24 RSPH1 A CCDC114 CILD20 CCDC114 A RSPH4A CILD11 RSPH4A A DNAAF1 (LRRC50) CILD13 DNAAF1 (LRRC50) A DNAAF2 (KTU) CILD10 DNAAF2 (KTU) A LRRC6 CILD19 LRRC6 A C21orf59 CILD26 C21orf59 B CCDC65 (DRC2) CILD27 CCDC65 (DRC2) B CCNO CILD29 CCNO B DNAAF3 CILD2 DNAAF3 B DNAH1 DNAH1 B DNAH8 DNAH8 B DNAL1 CILD16 DNAL1 B DRC1 (CCDC164) CILD21 DRC1 (CCDC164) B DYX1C1 CILD25 DYX1C1 B DNAAF5 (HEATR2) CILD18 DNAAF5 (HEATR2) B HYDIN CILD5 HYDIN B

MCIDAS MCIDAS B NME8 (TXNDC3) CILD6 NME8 (TXNDC3) B RSPH3 RSPH3 B RSPH9 CILD12 RSPH9 B

[0014] Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos precedentes, ou outros, e modalidades da descrição, o polirribonucleotídeo ou polirribonucleotídeo modificado compreende uma sequência primária que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92% ou pelo menos 95% idêntica (por exemplo, pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% idêntica) a uma ou mais de SEQ ID NO: 1 ou 5 a 11 (por exemplo, à sequência apresentada em SEQ ID NO: 1 ou 5 a 11). Em algumas modalidades, o polirribonucleotídeo é um polirribonucleotídeo modificado com um nível e/ou tipo de modificação selecionado de qualquer nível e/ou tipo aqui apresentado. Em certas modalidades, a identidade percentual de um polirribonucleotídeo é medida apenas com relação à porção de sequência que codifica CCDC40 de SEQ ID NO: 1 ou 5 a 11 (por exemplo, UTRs, outras sequências não codificantes e etiquetas de GFP ou epítopo não são consideradas durante o cálculo de identidade percentual). Em certas modalidades de quaisquer dos precedentes, tal polirribonucleotídeo (ou polirribonucleotídeo modificado) codifica uma proteína CCDC40 funcional.

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[0015] Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos precedentes, ou outros, e modalidades da descrição, o polirribonucleotídeo ou polirribonucleotídeo modificado compreende uma sequência primária que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, ou pelo menos 95% idêntica (por exemplo, pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% idêntica) a uma ou mais de SEQ ID NO: 2 ou 12 a 14 (por exemplo, à sequência apresentada em SEQ ID NO: 2 ou 12 a 14). Em algumas modalidades, o polirribonucleotídeo é um polirribonucleotídeo modificado com um nível e/ou tipo de modificação selecionado de qualquer nível e/ou tipo aqui apresentado. Em certas modalidades, a identidade percentual de um polirribonucleotídeo é medida apenas com relação à porção de sequência que codifica CCDC39 de SEQ ID NO: 2 ou 12 a 14 (por exemplo, UTRs, outras sequências não codificantes, e etiquetas de GFP ou etiquetas de epítopo não são consideradas durante o cálculo de identidade percentual). Em certas modalidades de quaisquer dos precedentes, tal polirribonucleotídeo (ou polirribonucleotídeo modificado) codifica uma proteína CCDC39 funcional.

[0016] Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos precedentes, ou outros, e modalidades da descrição, o polirribonucleotídeo ou polirribonucleotídeo modificado compreende uma sequência primária que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, ou pelo menos 95% idêntica (por exemplo, pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% idêntica) à SEQ ID NO: 4 (por exemplo, à sequência apresentada em SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, o polirribonucleotídeo é um polirribonucleotídeo modificado com um nível e/ou tipo de modificação selecionado de qualquer nível e/ou tipo aqui apresentado. Em certas modalidades, a identidade percentual de um polirribonucleotídeo é medida apenas com relação a o porção de sequência que codifica MCIDAS de SEQ ID NO: 4 (por exemplo, UTRs, outras sequências não codificantes e etiquetas de GFP ou epítopo não são consideradas durante o cálculo de identidade percentual). Em certas

9 / 141 modalidades de quaisquer dos precedentes, tal polirribonucleotídeo (ou polirribonucleotídeo modificado) codifica uma proteína MCIDAS funcional.

[0017] Em certas modalidades, a descrição provê composições farmacêuticas compreendendo quaisquer dos polirribonucleotídeos precedentes. além disso, quaisquer tais polirribonucleotídeos (ou composições farmacêuticas) podem ser usados em quaisquer dos métodos aqui descritos.

[0018] Em uma modalidade da composição farmacêutica que compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia, a dita ciliopatia está associada com um defeito em um domínio com espiral enrolada contendo proteína 40 (CCDC40; conferir, por exemplo, sequências de referência NCBI NM_017950.4 e NP_060420.2 para sequência de RNAm e proteína CCDC40 de humano, respectivamente), ou com um defeito em um domínio com espiral enrolada contendo proteína 39 (CCDC39; conferir, por exemplo, sequências de referência NCBI NM_181426.2 e NP_852091.1 para sequência de RNAm e proteína CCDC39 de humano, respectivamente).

[0019] CCDC40 e CCDC39 constroem um complexo que está localizado entre raios radiais e A-túbulos. As versões de defeito da proteína CCDC40 ou CCDC39 podem ser causadas por mutações no gene CCDC40 ou no gene CCDC39, tal como mutações por inserções, eliminações, sem sentido e em sítio de emenda. Em particular, uma eliminação de posição 248 e uma inserção de TGT entre posições 2824 e 2825 na sequência de DNA que codifica a proteína CCDC40 parecem ser muito frequentes. As versões de defeito de CCDC40 ou CCDC39 dão origem aos defeitos nas estruturas do axonema, tais como pares centrais ausentes ou excêntricos, raios radiais anormais e ligações de nexina, uma montagem anormal do complexo regulatório de dineína, e/ou uma redução de braços internos de dineína. Consequentemente, o polirribonucleotídeo compreendido na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é preferivelmente um RNAm

10 / 141 que pode ser traduzido em uma versão funcional de CCDC40 e ou de CCDC39. Informação adicional em proteínas envolvidas na ciliogênese, bem como genes e vias moleculares associados às ciliopatias, podem ser verificados, por exemplo, no artigo de revisão de Reiter e Leroux (Reiter e Leroux, 2017, Nat Rev Mol Cell Biol,18(9):533-547).

[0020] A composição farmacêutica da presente invenção deve ser administrada a um sujeito que sofre de uma ciliopatia. Aqui, um sujeito que sofre de uma ciliopatia também pode ser referido como um paciente. Os pacientes podem mostrar estrutura ciliar e/ou função anormais, e/ou defeitos na biogênese que resultam na retenção de muco e bactérias no trato respiratório. O diagnóstico de uma ciliopatia para um dado sujeito pode ser baseado, por exemplo, em achados clínicos, análises moleculares e/ou análises ultraestruturais ciliares de uma biopsia do dito sujeito, por exemplo, também da maneira revisada em Goutaki et al. (Goutaki et al., 2016, Eur Respir J, 48(4):1081-1095).

[0021] No contexto da presente invenção, o termo “polirribonucleotídeo” se refere a uma sequência de fita simples constituída de resíduos de adenosina, guanosina, citidina e/ou uridina (na forma modificada ou não modificada, vide a seguir). Aqui, o termo “polirribonucleotídeo que codifica uma proteína” se refere a um polirribonucleotídeo que contém uma região codificante que codifica uma proteína, isto é, que pode ser traduzida em uma sequência de aminoácidos. Assim, no contexto da presente invenção, o termo “polirribonucleotídeo que codifica uma proteína” preferivelmente se refere a um RNAm, em que um RNAm deve ser entendido para significar qualquer molécula de polirribonucleotídeo que, se entrar na célula, é adequada para a expressão de uma proteína ou é traduzível em uma proteína.

[0022] Aqui, o termo “proteína” inclui qualquer tipo de sequência de aminoácido, isto é, cadeias de dois ou mais aminoácidos que são cada qual

11 / 141 ligados por meio de ligações de peptídeo. O termo “proteína” usado neste contexto se refere a qualquer sequência de aminoácido de interesse. Preferivelmente, a sequência de aminoácido codificada apresenta pelo menos 5 aminoácidos em tamanho, mais preferivelmente pelo menos 10 aminoácidos, ainda mais preferivelmente pelo menos 50, 100, 200 ou 500 aminoácidos. Assim, o termo “proteína” inclui peptídeos pequenos, bem como polipeptídeos. No que diz respeito à função da proteína codificada, não existe nenhuma limitação, exceto que uma variante do defeito da proteína está associada a uma ciliopatia. Aqui, o termo “associado com” é pretendido para incluir os termos “causar”, “estar envolvido em” e/ou “intensificar”.

[0023] Aqui, o termo “uma proteína cujo defeito” se refere a uma “proteína com defeito” ou “versão com defeito de uma proteína” e, assim, a uma versão de uma proteína com função alterada, em comparação com uma versão funcional da dita proteína. Entretanto, o termo também pode incluir uma versão da dita proteína com uma falta completa ou parcial de síntese e, assim, disponibilidade na célula. Em qualquer caso, o defeito da versão proteína resulta em uma versão da dita proteína que não pode cumprir a função natural da proteína.

[0024] Uma versão de uma proteína que cumpre sua função natural é referida como "proteína funcional" ou "versão funcional de uma proteína" aqui, e é codificada pela mesma sequência de DNA que a respectiva proteína com defeito, mas sem o defeito que causa mudança na sequência de DNA e, assim, sem mutação na sequência de DNA.

[0025] Consequentemente, no contexto da presente invenção, a “proteína funcional” é preferivelmente um bloco de construção de um A- túbulo, um B-túbulo, ou um complexo regulatório de nexina-dineína, ou um raio radial, um braço interno de dineína, e/ou um braço externo de dineína.

[0026] Assim, o termo “o polirribonucleotídeo codifica uma versão funcional de uma proteína cujo defeito está associado com a dita ciliopatia”

12 / 141 preferivelmente se refere a um RNAm que codifica uma proteína funcional, que está envolvida na organização estrutural de um axonema ciliar, uma estrutura que ancora o axonema ou um corpo basal e cumpre sua função natural. Assim, o polirribonucleotídeo de acordo com a presente invenção se refere preferivelmente a um RNAm que codifica uma proteína funcional, cuja presença na célula de um sujeito que sofre de ciliopatia é necessária ou benéfica para moderar ou prevenir uma manifestação da dita ciliopatia que está associada com um defeito da dita proteína, uma vez que é codificada pela sequência de DNA da célula ou para aliviar os sintomas associados.

[0027] Além disso, o polirribonucleotídeo empregado de acordo com a presente invenção também pode compreender regiões funcionais adicionais e/ou regiões não codificantes 3’ ou 5’. As regiões não codificantes 3’ e/ou 5’ podem ser sequências que flanqueiam naturalmente a proteína codificada ou sequências artificiais que contribuem para a estabilização e/ou regulação do dito polirribonucleotídeo. As sequências adequadas podem ser identificadas e investigadas por experimentos de rotina. Adicionalmente, o dito polirribonucleotídeo também pode apresentar outras regiões funcionais, e pode estar combinado com elementos reguladores e sequências alvo de micro- RNAs, por exemplo, para controle espacial e temporal da atividade do polirribonucleotídeo desejado que compreende uma sequência que codifica uma proteína, ou seja, por exemplo, com relação às células específicas ou tipos de células e/ou estágios de desenvolvimento ou períodos de tempo específicos.

[0028] O polirribonucleotídeo empregado de acordo com a presente invenção pode compreender uma sequência com códon parcialmente ou completamente otimizado, derivada da sequência natural a ser usada. A otimização do códon se refere a uma técnica que é aplicada para maximizar a expressão de proteínas aumentando a eficiência de tradução do respectivo polirribonucleotídeo, uma vez que em alguns casos existem códons que são

13 / 141 preferivelmente usados por algumas espécies para um determinado aminoácido. Adicionalmente, o dito polirribonucleotídeo pode compreender outras modificações para ajustar e/ou estender a duração da ação. O dito polirribonucleotídeo também pode conter um m7GpppG cap, um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES) e/ou uma cauda poliA na extremidade 3', e/ou sequências adicionais para promover a tradução.

[0029] Em algumas modalidades da presente invenção o polirribonucleotídeo empregado de acordo com a presente invenção pode conter nucleotídeos não modificados e modificados. O termo “nucleotídeo não modificado” aqui usado se refere aos nucleotídeos A, C, G e U. O termo “nucleotídeo modificado” aqui usados se refere a quaisquer isômeros de ocorrência natural ou de ocorrência não natural de nucleotídeos A, C, G e U, bem como a quaisquer análogos de ocorrência natural ou natural, nucleotídeo alternativo ou modificado, ou isômero deste, por exemplo com modificações químicas ou resíduos substituídos. Os nucleotídeos modificados podem apresentar uma modificação de base e/ou uma modificação de açúcar. Os nucleotídeos modificados também podem apresentar modificações no grupo fosfato, por exemplo, com relação aos cinco cap principais de uma molécula de RNAm. Os nucleotídeos modificados também incluem nucleotídeos que são sintetizados pós-transcricionalmente por modificação covalente dos nucleotídeos. Adicionalmente, qualquer mistura adequada de nucleotídeos não modificados e modificados é possível. Um número não limitante de exemplos de nucleotídeos modificados pode ser verificado na literatura (por exemplo, Cantara et al., Nucleic Acids Res, 2011, 39(Issue suppl_1):D195- D201; Helm e Alfonzo, Chem Biol, 2014, 21(2):174-185; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2012, 51(29):7110-31) e alguns nucleotídeos modificados preferíveis são mencionados de maneira exemplar a seguir, com base em seu respectivo resíduo de nucleosídeo: 1-metiladenosina, 2-metiltio-N6-hidroxinorvalil

14 / 141 carbamoiladenosina, 2-metiladenosina, 2’-O-ribosilfosfato adenosina, N6- metil-N6-treonilcarbamoiladenosina, N6-acetiladenosina, N6- glicinilcarbamoiladenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-metiladenosina, N6-treonilcarbamoiladenosina, N6,N6-dimetiladenosina, N6-(cis-hidroxi- isopentenil)adenosina, N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina, 1,2’-O- dimetiladenosina, N6,2’-O-dimetiladenosina, 2’-O-metiladenosina, N6,N6,2’- O-trimetiladenosina, 2-metiltio-N6-(cis-hidroxi-isopentenil)adenosina, 2- metiltio-N6-metiladenosina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, 2-metiltio- N6-treonil carbamoiladenosina, N6-2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina, 2-metiltio-N6-(cis-hidroxi-isopentenil)adenosina, 7- metiladenosina, 2-metiltio-adenosina, 2-metoxi-adenosina, 2’-amino-2’- desoxiadenosina, 2’-azido-2’-desoxiadenosina, 2’-fluor-2’-desoxiadenosina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 7-deaza-adenosina, 7-deaza-8-aza- adenosina, 7-deaza-2-aminopurina, 7-deaza-8-aza-2-aminopurina, 7-deaza- 2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina; 2-tiocitidina, 3- metilcitidina, N4-acetilcitidina, 5-formilcitidina, N4-metilcitidina, 5- metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 5-hidroxicitidina, lisidina, N4-acetil-2’- O-metilcitidina, 5-formil-2’-O-metilcitidina, 5,2’-O-dimetilcitidina, 2-O- metilcitidina, N4,2’-O-dimetilcitidina, N4,N4,2’-O-trimetilcitidina, isocitidina, pseudocitidina, pseudoisocitidina, 2-tio-citidina, 2’-metil-2’- desoxicitidina, 2’-amino-2’-desoxicitidina, 2’-fluor-2’-desoxicitidina, 5- iodocitidina, 5-bromocitidina, 2’-azido-2’-desoxicitidina, 2’-amino-2’- desoxicitidina, 2’-fluor-2’-desoxicitidina, 5-aza-citidina, 3-metil-citidina, 1- metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolo-pseudoisocitidina, 2-tio-5- metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-l-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-l- metil-1-deaza-pseudoisocitidina, 1-metil-l-deaza-pseudoisocitidina, 2-metoxi- citidina, 2-metoxi-5-metil-citidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina, 4-metoxi-l- metil-pseudoisocitidina, zebularina,5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5- aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina; 1-metilguanosina, N2,7-

15 / 141 dimetilguanosina, N2-metilguanosina, 2’-O-ribosilfosfato guanosina, 7- metilguanosina, hidroxiwibutosina, 7-aminometil-7-deazaguanosina, 7-ciano- 7-deazaguanosina, N2,N2-dimetilguanosina, N2,7,2’-O-trimetilguanosina, N2,2’-O-dimetilguanosina, 1,2’-O-dimetilguanosina, 2’-O-metilguanosina, N2,N2,2’-O-trimetilguanosina, N2,N2J-trimetilguanosina, Isoguanosina, 4- demetilwiosina, epoxiqueuosina, hidroxiwibutosina submodificada, hidroxiwibutosina submodificada metilada, isowiosina, peroxiwibutosina, galactosil-queuosina, manosil-queuosina, queuosina, arqueosina, wibutosina, metilwiosina, wiosina, 7-aminocarboxipropildemetilwiosina, 7- aminocarboxipropilwiosina, 7-aminocarboxipropilwiosinametilester, 7-deaza- guanosina, 7-deaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-deaza- guanosina, 6-tio-7-deaza-8-aza-guanosina, 7-metil-guanosina, 6-tio-7-metil- guanosina, 7-metilinosina, 6-metoxi-guanosina, 1-metilguanosina, 8-oxo- guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio- guanosina, N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina, N1-metilguanosina, 2’-amino-3’- desoxiguanosina, 2’-azido-2’-desoxiguanosina, 2’-fluor-2’-desoxiguanosina, 2-tiouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina, 3-metiluridina, 4-tiouridina, 5-metil-2-tiouridina, 5-metilaminometiluridina, 5-carboximetiluridina, 5- carboximetilaminometiluridina, 5-hidroxiuridina, 5-metiluridina, 5- taurinometiluridina, 5-carbamoilmetiluridina, 5-(carboxi-hidroximetil)uridina metil éster, di-hidrouridina, 5-metildi-hidrouridina, 5-metilaminometil-2- tiouridina, 5-(carboxi-hidroximetil)uridina, 5-(carboxi-hidroximetil)-2′-O- metiluridina metil éster, 5-(isopentenilaminometil)uridina, 5- (isopentenilaminometil)-2-tiouridina, 3,2’-O-dimetiluridina, 5- carboximetilaminometil-2’-O-metiluridina, 5-carbamoil-hidroximetiluridina, 5-carbamoilmetil-2’-O-metiluridina, 5-carbamoilmetil-2-tiouridina, 5- metoxicarbonilmetil-2’-O-metiluridina, 5-(isopentenilaminometil)-2’-O- metiluridina, 5,2’-O-dimetiluridina, 2’-O-metiluridina, 2’-O-metil-2- tiorudine, 2-tio-2’-O-metiluridina, ácido uridina 5-oxiacético, 5-

16 / 141 metoxicarbonilmetiluridina, metil éster do ácido uridina 5-oxiacético, 5- metoxiuridina, 5-aminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil-2- tiouridina, 5-metilaminometil-2-selenouridina, 5-metoxicarbonilmetil-2- tiouridina, 5-taurinometil-2-tiouridina, pseudouridina, 1-metil-3-(3-amino-3- carboxipropil)pseudouridina, 1-metilpseudouridina, 3-metilpseudouridina, 2’- O-metilpseudouridina, 5-formiluridina, 5-aminometil-2-geraniluridina, 5- taurinometiluridina, 5-iodouridina, 5-bromouridina, 2’-metil-2’-desoxiuridina, 2’-amino-2’-desoxiuridina, 2’-azido-2’-desoxiuridina, 2’-fluor-2’- desoxiuridina, inosina, 1-metilinosina, 1,2’-O-dimetilinosina, 2’-O- metilinosina, 5-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 4-tio-pseudouridina, 2-tio- pseudouridina, 5-carboximetil-uridina, 1-carboximetil-pseudouridina, 5- propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 5- taurinometil-2-tio-uridina, 1-taurinometil-4-tio-uridina, 5-metil-uridina, 1- metil-pseudouridina, 4-tio-l-metil-pseudouridina, 2-tio-l-metil-pseudouridina, 1-metil-l-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-l-deaza-pseudouridina, di- hidropseudouridina, 2-tio-di-hidrouridina, 2-tio-di-hidropseudouridina, 2- metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2- tio-pseudouridina, 1,2′-O-dimetiladenosina, 1,2′-O-dimetilguanosina, 1,2′-O- dimetilinosina, 2,8-dimetiladenosina, 2- metiltiometilenethio-N6-isopentenil- adenosina, 2-geraniltiouridina, 2-lisidina, 2-metiltio cíclico N6- treonilcarbamoiladenosina, 2-metiltio-N6-(cis-hidroxi-isopentenil) adenosina, 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina, 2-metiltio-N6- treonilcarbamoiladenosina, 2-selenouridina, 2-tio-2′-O-metiluridina, 2′-O- metiladenosina, 2′-O-metilcitidina, 2′-O-metilguanosina, 2′-O-metilinosina, 2′-O-metilpseudouridina, 2′-O-metiluridina, metil éster do ácido 2′-O- metiluridina 5-oxiacético, 2′-O-ribosiladenosinafosfato, 2′-O- ribosilguanosinafosfato, 3,2′-O-dimetiluridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)- 5,6-di-hidrouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina, 5,2′-O- dimetilcitidina, 5,2′-O-dimetiluridina, metil éster de 5-(carboxi-hidroximetil)-

17 / 141 2′-O-metiluridina, 55-(isopentenilaminometil)-2′-O-metiluridina, 5- aminometil-2-geraniltiouridina, 5-aminometil-2-selenouridina, 5- aminometiluridina, 5-carbamoilmetil-2′-O-metiluridina, 5-carboxi- hidroximetiluridina, 5-carboximetil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil-2- geraniltiouridina, 5-carboximetilaminometil-2-selenouridina, 5- carboximetilaminometil-2′-O-metiluridina, 5-cianometiluridina, 5-formil-2′- O-metilcitidina, 5-metoxicarbonilmetil-2′-O-metiluridina, 5-metilaminometil- 2-geraniltiouridina, 7-aminocarboxipropil-demetilwiosina, 7-metilguanosina, 8-metiladenosina, N2,2′-O-dimetilguanosina, N2,7,2′-O-trimetilguanosina, N2,7-dimetilguanosina, N2,N2,2′-O-trimetilguanosina, N2,N2,7- trimetilguanosina, N2,N2,7-trimetilguanosina, N4,2′-O-dimetilcitidina, N4,N4,2′-O-trimetilcitidina, N4,N4-dimetilcitidina, N4-acetil-2′-O- metilcitidina, N6,2′-O-dimetiladenosina, N6,N6,2′-O-trimetiladenosina, N6- formiladenosina, N6-hidroximetiladenosina, agmatidina, 2-metiltio cíclico N6-treonilcarbamoiladenosina, glutamil-queuosina, guanosina adicionada a qualquer nucleotídeo, extremidade 5’ guanilada, hidróxi-N6- treonilcarbamoiladenosina; acima de tudo preferivelmente pseudo-uridina, N1-metil-pseudo-uridina, 2´-fluor-2´-desoxicitidina, 5-iodocitidina, 5- metilcitidina, 2-tiouridina, 5-iodouridina e/ou 5-metil-uridina.

[0030] Adicionalmente, o termo “nucleotídeo modificado” compreende nucleotídeos contendo isótopos tal como deutério. O termo “isótopo” se refere a um elemento com o mesmo número de prótons, mas diferentes números de nêutrons que resultam em diferentes números de massa. Assim, os isótopos de hidrogênio, por exemplo, não são limitados ao deutério, mas incluem também trítio. Além disso, o polirribonucleotídeo também podem conter isótopos de outros elementos incluindo, por exemplo, carbono, oxigênio, nitrogênio e fósforo. Também é possível que os nucleotídeos modificados sejam deuterados ou contenham um outro isótopo de hidrogênio ou de oxigênio, carbono, nitrogênio ou fósforo.

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[0031] O número total de tipos de nucleotídeo modificado no polirribonucleotídeo pode ser 0, 1, 2, 3 ou 4. Consequentemente, em algumas modalidades, pelo menos um nucleotídeo de um tipo de nucleotídeo, por exemplo, pelo menos um nucleotídeo U, pode ser um nucleotídeo modificado. Em algumas modalidades, pelo menos um nucleotídeo de um total de dois tipos de nucleotídeo, por exemplo, pelo menos um nucleotídeo U e pelo menos um nucleotídeo C, pode ser um nucleotídeo modificado. Em algumas modalidades, pelo menos um nucleotídeo de um total de três tipos de nucleotídeo, por exemplo, pelo menos um nucleotídeo G, pelo menos um nucleotídeo U e pelo menos um nucleotídeo C, pode ser um nucleotídeo modificado. Em algumas modalidades, pelo menos um nucleotídeo de todos os quatro tipos de nucleotídeo pode ser um nucleotídeo modificado. Em todas estas modalidades, um ou mais nucleotídeos por tipo de nucleotídeo pode ser modificado, o percentual dos ditos nucleotídeos modificados por tipo de nucleotídeo sendo 0%, 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 100%.

[0032] Em algumas modalidades, o percentual total de nucleotídeos modificados compreendido nas moléculas de RNAm a serem purificadas é 0%, 2,5%, 5 %, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 100%.

[0033] Consequentemente, o polirribonucleotídeo pode ser caracterizado, por exemplo, em que 0,5 a 50%, preferivelmente 5 a 50% dos nucleotídeos U e 5 a 50% dos nucleotídeos C são modificados. Os ditos nucleotídeos U modificados são preferivelmente 5-ioduridina, e os ditos nucleotídeos C modificados são preferivelmente 5-iodcitidina.

[0034] Em algumas modalidades, pode ser caracterizado o polirribonucleotídeo no qual 15 a 25% dos nucleotídeos U e 3 a 15%, preferivelmente 5 a 15% dos nucleotídeos C são modificados, em que os ditos nucleotídeos U modificados são preferivelmente 5-metiluridina, e os ditos

19 / 141 nucleotídeos C modificados são preferivelmente 5-iodcitidina.

[0035] Em algumas modalidades, pode ser caracterizado o polirribonucleotídeo no qual 30 a 50% dos nucleotídeos U e 10 a 20% dos nucleotídeos C são modificados, em que os ditos nucleotídeos U modificados são preferivelmente 5-ioduridina, e os ditos nucleotídeos C modificados são preferivelmente 5-iodcitidina.

[0036] Em algumas modalidades, pode ser caracterizado o polirribonucleotídeo no qual 30 a 50% dos nucleotídeos U e 5 a 15% dos nucleotídeos C são modificados, em que os ditos nucleotídeos U modificados são preferivelmente 5-ioduridina e os ditos nucleotídeos C modificados são preferivelmente 5-iodcitidina.

[0037] Em algumas modalidades, pode ser caracterizado o polirribonucleotídeo no qual 0,5 a 5% dos nucleotídeos U e 25 a 35% dos nucleotídeos C são modificados, em que os ditos nucleotídeos U modificados são preferivelmente 2-tiouridina e os ditos nucleotídeos C modificados são preferivelmente 5-metilcitidina.

[0038] O polirribonucleotídeo também pode ser caracterizado, por exemplo, em que 50 a 100%, preferivelmente 100%, dos nucleotídeos U são modificados. Os ditos nucleotídeos U modificados são preferivelmente N1- metil-pseudo-uridina.

[0039] Da maneira descrita anteriormente, de acordo com a presente invenção, a administração da composição farmacêutica ao paciente que sofre de uma ciliopatia é realizada quando o sujeito mostra uma inflamação do sistema respiratório. No contexto da presente invenção, o termo “inflamação” se refere às respostas celulares a insultos, incluindo infecção, trauma e hipersensibilidade. Uma "inflamação do sistema respiratório" se refere às respostas inflamatórias no sistema respiratório, especialmente, mas sem limitação, no nariz, faringe, laringe, traqueia, brônquios e/ou pulmão. As respostas inflamatórias no sistema respiratório podem, por exemplo, ser

20 / 141 causadas por agentes irritantes, tais como patógenos, toxinas, poluentes e/ou alérgenos. Durante a inflamação, são ativados tipos de células específicas que podem liberar, por exemplo, citocinas e mediadores para modificar as atividades de outras células. Esses processos são, por exemplo, descritos em Iwasaki et al. (Iwasaki et al., 2017, Nat Rev Immunol, 17 (1): 7-20).

[0040] Assim, em uma modalidade, o sujeito que sofre de ciliopatia, no qual o polirribonucleotídeo deve ser administrado, foi submetido, antes do tratamento, a um ensaio, a fim de determinar se o sujeito sofre de uma inflamação do sistema respiratório, e em que o sujeito foi positivamente determinado por apresentar uma inflamação do sistema respiratório.

[0041] Preferivelmente, a inflamação do sistema respiratório é uma inflamação aguda. Uma inflamação aguda pode ocorrer em segundos, minutos, horas e dias, mas pode não ocorrer por períodos mais longos. Assim, uma inflamação aguda é uma inflamação que ocorre em um intervalo de tempo de até 4 semanas, preferivelmente em um período de menos de 3 semanas. Pode ser determinado por métodos laboratoriais de rotina com base em um fluxo sanguíneo aumentado localmente, uma permeabilidade aumentada localmente dos capilares e/ou um número aumentado de neutrófilos, macrófagos e/ou linfócitos. Mais informações em relação aos marcadores de inflamação das vias aéreas na discinesia ciliar primária podem ser encontradas, por exemplo, em Zihlif et al. (Zihlif et al., 2006, Pediatr Pulmonol, 41 (6): 509-14).

[0042] Em geral, a inflamação pode ser classificada tanto como aguda quanto crônica. A inflamação aguda é a resposta do corpo a um estímulo prejudicial e caracterizada, por exemplo, pelo aumento do movimento de granulócitos para o tecido afetado. Os sinais clássicos de inflamação são calor, dor, vermelhidão, inchaço e perda de função. Ciliopatias como PCD são doenças hereditárias e, como tal - se não tratadas - um estímulo permanente e vitalício causado por uma perda de função, resultando em um tipo de

21 / 141 inflamação permanente e, como tal, crônica, normalmente não mostrando os sintomas acima (além da perda de função). Exemplos adicionais para doenças associadas com inflamação crônica são, por exemplo: febre do feno, doença periodontal, aterosclerose e osteoartrite. No entanto, os pacientes que sofrem de tais doenças podem, além disso, obter uma inflamação aguda, por exemplo, recebendo um estímulo prejudicial adicional e, como consequência, um ou mais dos sintomas clássicos como sinais clássicos de inflamação são calor, dor, vermelhidão, inchaço e perda adicional de função.

[0043] Assim, em uma modalidade, o sujeito que sofre de uma ciliopatia, para a qual o polirribonucleotídeo deve ser administrado, foi submetido antes do tratamento a um ensaio, a fim de determinar se o sujeito sofre de uma inflamação aguda do sistema respiratório, e em que o sujeito foi positivamente determinado por apresentar uma inflamação aguda do sistema respiratório.

[0044] Alternativamente, ou além disso, a inflamação do sistema respiratório se refere a uma exacerbação de inflamação, preferivelmente uma exacerbação aguda de inflamação. A exacerbação se refere ao agravamento de uma doença ou aumento dos sintomas. É melhor investigada no contexto da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), uma vez que as exacerbações resultam em uma diminuição da qualidade de vida do paciente, aceleram o declínio da função pulmonar e contribuem substancialmente para os custos relacionados à doença.

[0045] No caso de um teste clínico, uma exacerbação do sistema respiratório pode ser definida da maneira a seguir: “Uma exacerbação do sistema respiratório é definida em um teste tanto como sintomas do trato respiratório, que levam ao início do tratamento com antibiótico sistêmico, independente dos resultados de cultura bacteriana, quanto como um declínio no % do volume expiratório forçado em um segundo (FEV1), previsto igual ou acima de 10 pontos percentuais com relação à média de % de FEV1%,

22 / 141 previsto em na seleção e randomização, sejam os antibióticos prescritos ou não. A ocorrência de exacerbações pode ser avaliada por meio de entrevista com o paciente, exame físico e espirometria. Em cada visita do estudo, e em qualquer contato extra com os sítios do teste atribuíveis a exacerbações, os participantes podem ser entrevistados em relação aos sintomas e à medicação concomitante desde o último contato com o sítio do teste. A entrevista pode ser complementada por um diário semanal do paciente sobre sintomas e antibióticos. Um exame físico revisando a condição geral dos participantes, sinais vitais, ouvidos, coração e pulmões pode ser realizado em todas as visitas”. (conferir, por exemplo, Kobbernagel et al., 2016, BMC Pulmonary Medicine, 16: 104).

[0046] Consequentemente, de acordo com uma modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende um RNAm para uso no tratamento de uma ciliopatia em um sujeito que sofre de uma ciliopatia, em que o RNAm codifica uma versão funcional de uma proteína de estrutura ciliar, cujo defeito está associado com a dita ciliopatia, e em que a administração da dita composição farmacêutica no sistema respiratório do dito sujeito que sofre da dita ciliopatia é realizada quando o sujeito que sofre de uma ciliopatia mostra uma inflamação aguda, preferivelmente uma exacerbação aguda, do sistema respiratório.

[0047] Assim, em uma modalidade, o sujeito que sofre de uma ciliopatia, para a qual o polirribonucleotídeo deve ser administrado, foi submetido, antes do tratamento, a um ensaio, a fim de determinar se o sujeito sofre de uma inflamação aguda, preferivelmente uma exacerbação aguda, do sistema respiratório, e em que o sujeito foi determinado positivamente por apresentar uma inflamação crônica, preferivelmente uma exacerbação aguda, do sistema respiratório.

[0048] A presença ou ausência de uma inflamação do sistema respiratório de um sujeito que sofre de uma ciliopatia pode ser determinada

23 / 141 por procedimentos de rotina, por exemplo, analisando uma amostra de sangue ou determinando se o paciente sofre de um nariz congestionado ou similares.

[0049] No sistema respiratório, as inflamações são em geral causadas por infecções, em particular infecções virais ou bacterianas. Assim, a presença ou ausência de uma inflamação em um paciente com ciliopatia pode ser, preferivelmente, avaliada determinando a presença ou ausência de uma infecção, preferivelmente uma infecção aguda. Preferivelmente, a infecção é uma infecção viral e/ou bacteriana.

[0050] As infecções agudas são caracterizadas por achados de ausculta, tosse purulenta, infiltrados, hemoptise, febre, aumento dos parâmetros de inflamação sanguínea (proteína c-reativa (PCR)> 200 mg/mL, sedimentação sanguínea <100 mm/h). As infecções crônicas são caracterizadas adicionalmente por infiltrados migratórios, resistência a antibióticos, sintomas gerais persistentes e marcadores de inflamação sanguínea moderadamente aumentados (CRP 50-100 mg/mL, sedimentação sanguínea <50 mm/h) (Klinische Pneumonologie, 1. Aufl. 2014 Georg Thieme Verlag KG, ISBN 978-3-13-129751-8; Jaroszewski et al., 2012, Thorac Surg Clin, 22 (3): 301-24).

[0051] No contexto da presente invenção, o termo “sistema respiratório” compreende órgãos envolvidos na respiração tais como nariz, faringe, laringe, traqueia, brônquios e pulmões. Em particular, o sistema respiratório também pode ser referido como trato respiratório no caso de alguns mamíferos, incluindo humanos, aqui também referidos como sujeitos. Aqui, os termos “sistema respiratório” e “trato respiratório” são usados indiferentemente. O trato respiratório pode ser dividido no trato respiratório superior e no trato respiratório inferior. O trato respiratório superior inclui o nariz, que compreende cavidade nasal, conchas nasais, vestíbulos nasais e passagens nasais; seios paranasais; a faringe, e a porção da laringe acima das pregas vocais (cordas). O trato respiratório inferior inclui a porção da laringe

24 / 141 abaixo das pregas vocais, traqueia, brônquios e bronquíolos. Aqui, os pulmões são incluídos no trato respiratório inferior e compreendem bronquíolos respiratórios, dutos alveolares, sacos alveolares e alvéolos.

[0052] No contexto da presente invenção, o termo “composição farmacêutica” se refere a uma composição compreendendo pelo menos um polirribonucleotídeo, de acordo com a presente invenção, para administração a um sujeito, a fim de tratar uma ciliopatia. O polirribonucleotídeo é preferivelmente incluído em uma quantidade eficiente, isto é, uma quantidade suficiente para induzir uma resposta terapêutica detectável no sujeito, ao qual a composição farmacêutica deve ser administrada. A composição farmacêutica da invenção pode estar na forma de uma solução aquosa ou não aquosa estéril, suspensão, ou emulsão ou aerossol. Preferivelmente, a composição farmacêutica está em uma forma que permite a administração ao sistema respiratório, por exemplo, por meio de inalação, nebulização, por meio de uma pulverização ou gotas, por exemplo uma pulverização nasal ou gotas nasais.

[0053] Isto é vantajoso para os pacientes, uma vez que uma administração usando uma pulverização, gotas, um nebulizador ou por inalação pode ser facilmente realizada pelo paciente, é confortável para transporte e, assim, facilmente disponível para o paciente sem restringir nenhuma liberdade de ação.

[0054] Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende um RNAm, que pode ser traduzido em uma versão funcional de uma proteína selecionada do grupo que consiste em DNAH5, DNAH11, CCDC39, DNAI1, CCDC40, CCDC103, SPAG1, ZMYND10, ARMC4, CCDC151, DNAI2, RSPH1, CCDC114, RSPH4A, DNAAF1 (LRRC50), DNAAF2 (KTU) e LRRC6, e é administrada a um sujeito que sofre de uma PCD causada por um defeito da dita proteína usando uma pulverização, gotas, um nebulizador e/ou por inalação. Mais preferivelmente, a proteína é

25 / 141 CCDC40 e/ou CCDC39.

[0055] A composição farmacêutica pode compreender um carreador farmaceuticamente aceitável, isto é, compostos químicos, materiais, ingredientes e/ou composições que são, no escopo do julgamento médico sensato, adequadas para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais, sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcional a uma razão risco/benefício razoável. Assim, um carreador farmaceuticamente aceitável é uma substância inativa formulada, juntamente com a substância farmaceuticamente ativa, para facilitar seu manuseio em vista de dosagem, adsorção, solubilidade ou considerações farmacocinéticas. Exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos na técnica e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, tampão, água, emulsões, tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes umectantes e soluções estéreis. Em particular, os carreadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meio tamponado. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais tal como azeite, e ésteres orgânicos tais como oleato de etila. Outros exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas sem limitação, a solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose, citrato, fosfato e outros ácidos orgânicos; contra-íons formadores de sal, por exemplo, sódio e potássio; polipeptídeos de baixo peso molecular (> 10 resíduos de aminoácidos); proteínas, por exemplo, albumina sérica ou gelatina; polímeros hidrofílicos, por exemplo, polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como histidina, glutamina, lisina, asparagina, arginina ou glicina; carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; monossacarídeos; dissacarídeos; outros açúcares, por exemplo, sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; agentes quelantes, por exemplo, EDTA; surfactantes não iônicos, por exemplo, monolaurato de polioxietileno

26 / 141 sorbitano, disponíveis no mercado com o nome comercial Tween, propilenoglicol, Plurônicos ou polietilenoglicol; antioxidantes incluindo metionina, ácido ascórbico e tocoferol; e/ou conservantes, por exemplo, cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, por exemplo, metil ou propil parabeno;catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol). Carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados e suas formulações são descritas com mais detalhes em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª edição, 1985, Mack Publishing Co. Além disso, conservantes, estabilizadores e outros aditivos também podem estar presentes, por exemplo, tais como antimicrobianos, anti-oxidantes, agentes quelantes e gases inertes, nanossistemas ou lipossomas, e similares.

[0056] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada a um paciente por meio de uma grande faixa de classes de formas de administração, conhecidas pelos versados na técnica como sendo adequadas para administração ao sistema respiratório, tal como o uso de pulverizações, gotas, inaladores, nebulizadores e similares. A dose e a duração da ação dependem da função que o referido polirribonucleotídeo deve cumprir e devem ser ajustadas deliberadamente em cada caso. A duração da ação será tão longa quanto possível, por exemplo, se o referido polirribonucleotídeo for usado, como é o caso aqui, para a terapia crônica de uma doença em virtude de um gene deficiente, ou seja, sequência de DNA alterada. A duração também pode ser ajustada para uma janela de tempo específica.

[0057] Em uma modalidade, a composição farmacêutica é administrada pelo menos uma vez por semana. Isto é vantajoso para garantir um efeito eficiente e persistente do tratamento da dita PCD. Preferivelmente, a composição farmacêutica é administrada em uma base semanal for pelo menos 2 semanas, mais preferivelmente por pelo menos 3 semanas e ainda

27 / 141 mais preferivelmente por pelo menos 4 semanas. Alternativamente, a composição farmacêutica pode ser administrada duas vezes por semana por pelo menos 1 semana, preferivelmente por pelo menos 2 semanas, mais preferivelmente por pelo menos 3 semanas e ainda mais preferivelmente por pelo menos 4 semanas. Em uma modalidade, se existir uma necessidade de tratamento adicional após um tratamento inicial por quatro semanas da maneira descrita anteriormente, o tratamento é realizado em uma base semanal. Alternativamente à administração semanal, a administração pode ser alterada para administração uma vez por mês por um período de tempo mais longo, por exemplo, por pelo menos dois meses, de preferência por pelo menos 3 meses, mais preferivelmente por pelo menos 4 meses, ainda mais preferivelmente por pelo menos 5 meses e acima de tudo preferivelmente por pelo menos 6 meses.

[0058] Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica é administrada ao sistema respiratório do sujeito após o sujeito ter inalado uma solução apropriada, preferivelmente um agente mucolítico, tal como uma salina hipertônica ou uma solução de N-acetilcisteína (NAC), ou lavado suas cavidades e/ou seios nasais com uma solução apropriada, preferivelmente um agente mucolítico, tal como uma salina hipertônica ou N-acetilcisteína (NAC), a fim de remover o muco e células epiteliais das vias aéreas potencialmente eliminadas. Assim, é preferível que a composição farmacêutica seja administrada ao sistema respiratório do sujeito após o sujeito inalar uma solução apropriada, de preferência um agente mucolítico, tal como uma solução salina hipertônica ou uma solução de N-acetilcisteína (NAC), e muco tossido localizado nas células epiteliais. Isto é especialmente vantajoso para expor células epiteliais antes de administrar a composição farmacêutica e assim, para intensificar a eficácia de transfecção do polirribonucleotídeo.

[0059] Assim, em uma modalidade, o sujeito que sofre de ciliopatia à

28 / 141 qual o polirribonucleotídeo deve ser administrado é um sujeito que foi submetido, antes do tratamento, por inalação de uma solução apropriada, de preferência um agente mucolítico, tal como uma solução salina hipertônica ou uma solução de N-acetilcisteína (NAC), ou para lavar suas cavidades e/ou seios nasais com uma solução apropriada, de preferência um agente mucolítico, como uma solução salina hipertônica ou N-acetilcisteína (NAC).

[0060] Uma etapa como esta objetiva remover fisicamente o muco do sistema respiratório do sujeito antes da administração do polirribonucleotídeo.

[0061] Além disso, tal sujeito é preferivelmente um sujeito que foi submetido, antes do tratamento, a um ensaio para determinar se o sujeito sofre de uma inflamação, de preferência uma inflamação aguda ou exacerbação da inflamação do sistema respiratório, e em que o sujeito foi positivamente determinado como tendo uma inflamação, de preferência uma inflamação aguda ou exacerbação da inflamação, do sistema respiratório.

[0062] Em modalidades preferidas, a concentração de NAC na dita solução é entre 3% e 20%, preferivelmente entre 5% e 15% mais preferivelmente entre 8% e 12%, acima de tudo preferivelmente é 10%. O percentual é baseado em peso/peso. Preferivelmente, uma solução contendo NAC também contém edetato de sódio (com edetato se referindo a etilenodiamina tetra-acetato) e/ou hidróxido de sódio em concentrações farmaceuticamente aceitáveis. Preferivelmente, a solução é uma solução aquosa.

[0063] Em algumas modalidades da composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um agente mucolítico, tal como N-acetilcisteína (NAC) e/ou uma solução hipertônica compreendendo cloreto de sódio. Tanto NAC, que atua como um expectorante, quanto uma solução hipertônica compreendendo cloreto de sódio são vantajosas para reduzir retenção de muco viscoso em sujeitos que

29 / 141 sofrem de PCD. Isto pode reduzir o risco de infecções do sistema respiratório e, assim, estresse adicional para o paciente.

[0064] Em modalidades preferidas, a composição farmacêutica compreende adicionalmente NAC em uma concentração da maneira indicada anteriormente.

[0065] Em modalidades preferidas, a composição farmacêutica compreende adicionalmente uma solução hipertônica compreendendo cloreto de sódio em uma concentração entre 2% e 8%, preferivelmente entre 3% e 7%, mais preferivelmente entre 4% e 7%.

[0066] Em modalidades preferidas, a composição farmacêutica compreende adicionalmente NAC em uma concentração entre 3% e 20%, preferivelmente entre 5% e 15% mais preferivelmente entre 8% e 12%, acima de tudo preferivelmente é 10%, e/ou uma solução hipertônica compreendendo cloreto de sódio em uma concentração entre 2% e 8%, preferivelmente entre 3% e 7%, mais preferivelmente entre 4% e 7%.

[0067] Da maneira afirmada anteriormente, em uma modalidade preferida da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, a dita composição farmacêutica compreende um RNAm que pode ser traduzido em uma versão funcional de uma proteína selecionada do grupo que consiste em DNAH5, DNAH11, CCDC39, DNAI1, CCDC40, CCDC103, SPAG1, ZMYND10, ARMC4, CCDC151, DNAI2, RSPH1, CCDC114, RSPH4A, DNAAF1 (LRRC50), DNAAF2 (KTU) e LRRC6, preferivelmente CCDC40 e/ou CCDC39. Uma composição farmacêutica como esta também é referida como “primeira composição farmacêutica” a seguir.

[0068] A proteína do ciclo celular associada à diferenciação multiciliada e síntese de DNA (MCIDAS) é uma proteína reguladora da transcrição que é especificamente necessária para a diferenciação celular multiciliada, que inclui ciliogênese de cílios móveis múltiplos (conferir, por exemplo, sequências de referência NCBI NM_001190787.1 e

30 / 141 NP_001177716.1 para RNAm humano e sequência de proteína MCIDAS, respectivamente; ou uma sequência de polirribonucleotídeo otimizada da maneira mostrada em SEQ ID NO: 4).

[0069] Consequentemente, em algumas modalidades da composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia, a dita composição farmacêutica compreende adicionalmente um polirribonucleotídeo que codifica uma versão funcional de uma proteína do ciclo celular associada à diferenciação multiciliada e síntese de DNA (MCIDAS).

[0070] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma primeira composição farmacêutica da maneira descrita anteriormente, que é administrada junto com uma segunda composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo que codifica uma proteína MCIDAS.

[0071] Tanto as composições farmacêuticas, isto é, uma primeira composição farmacêutica da maneira definida anteriormente, compreendendo adicionalmente um polirribonucleotídeo que codifica uma proteína MCIDAS, quanto uma primeira composição farmacêutica, que é administrada junto com uma segunda composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo que codifica uma proteína MCIDAS, são vantajosas, uma vez que a administração de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é especialmente eficiente na restauração da estrutura e função das células ciliares, quando a composição farmacêutica é administrada às células antes e/ou durante a ciliogênese. Além disso, ambas são preferencialmente administradas a um paciente usando um pulverizador nasal, e/ou um nebulizador, e/ou por inalação, de preferência pelo menos uma vez por semana e/ou por pelo menos 4 semanas.

[0072] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um polirribonucleotídeo que pode ser traduzido em uma versão funcional de duas ou mais proteínas. Isto pode ser realizado, por exemplo,

31 / 141 usando um polirribonucleotídeo multicistrônico que é um polirribonucleotídeo simples que codifica duas ou mais proteínas diferentes. O projeto de um polirribonucleotídeo multicistrônico como este usando, por exemplo, peptídeos 2A está bem descrito na literatura. Como um exemplo, Liu et al. demonstraram o uso de peptídeos 2A para gerar RNAms multicistrônicos (Liu et al., 2017, Scientific Reports, 7: 2193). Esses peptídeos 2A podem ser combinados adicionalmente, por exemplo, com um local de clivagem de furina para remover os aminoácidos adicionais (parte do peptídeo 2A) que são anexados à primeira proteína na sequência como uma consequência de salto do ribossomo (característica funcional do peptídeo 2A). Como um exemplo, o uso de clivagem de furina com peptídeos 2A foi descrito, por exemplo, por Chng et al.(Chng et al., 2015 MAbs, 7 (2): 403- 412). Assim, um polirribonucleotídeo simples pode ser projetado, o qual codifica duas ou mais, de preferência duas proteínas terapêuticas (por exemplo, CCDC40 e MCIDAS), onde as regiões de codificação das duas proteínas terapêuticas são separadas por um peptídeo 2A (como descrito na citação acima).

[0073] Consequentemente, em algumas modalidades, o mesmo se aplica da maneira descrita para as modalidades anteriores, exceto que a composição farmacêutica compreende um polirribonucleotídeo que pode ser traduzido em versões funcionais de duas ou mais, preferivelmente duas proteínas. Assim, em algumas modalidades, a composição farmacêutica da maneira descrita nas modalidades anteriores compreende um polirribonucleotídeo multicistrônico compreendendo uma sequência que pode ser traduzida em uma versão funcional de uma proteína selecionada do grupo que consiste em DNAH5, DNAH11, CCDC39, DNAI1, CCDC40, CCDC103, SPAG1, ZMYND10, ARMC4, CCDC151, DNAI2, RSPH1, CCDC114, RSPH4A, DNAAF1 (LRRC50), DNAAF2 (KTU) e LRRC6, preferivelmente CCDC40 e/ou CCDC39, e uma sequência que pode ser traduzida em uma

32 / 141 versão funcional de uma proteína MCIDAS.

[0074] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um polirribonucleotídeo que pode ser traduzido em uma versão funcional de uma proteína MCIDAS, e que compreende uma sequência otimizada de polirribonucleotídeo da maneira mostrada em SEQ ID NO: 4, e um polirribonucleotídeo que pode ser traduzido em uma versão funcional de uma proteína CCDC40 e/ou CCDC39, e que compreende uma sequência otimizada de polirribonucleotídeo da maneira mostrada em SEQ ID NO: 1 (ou SEQ ID NO: 5 a 11) e/ou SEQ ID NO: 2 (ou SEQ ID NO: 12 a 14). Preferivelmente, é administrada a um paciente usando uma pulverização nasal, e/ou um nebulizador e/ou por inalação, preferivelmente pelo menos uma vez por semana e/ou por pelo menos 4 semanas.

[0075] Alternativamente, ou adicionalmente, MCIDAS, GemC1, FoxJ1, e/ou E2f4VP16 podem ser usadas, por exemplo. GemC1 é especificamente expressa em epitélios ciliados e é um regulador central da ciliogênese. Foi relatado que a expressão ectópica de GemC1 foi suficiente para induzir as etapas iniciais da multiciliogênese em células epiteliais das vias aéreas ex vivo pela regulação positiva de MCIDAS e FoxJ1, dois reguladores transcricionais chave da multiciliogênese (Arbi M et al., 2016, relatórios EMBO, 17 (3): 400-413). Além disso, foi relatado no mesmo estudo que GemC1 pode trans-ativar as sequências regulatórias à montante de MCIDAS e FoxJ1 diretamente. E2f4VP16 refere-se a uma forma de E2f4 que contém um domínio de ativação genérico de HSV1 VP16, e pode ter um efeito positivo na ativação da expressão de genes-chave associados à multiciliogênese (Kim S et al., Scientific Reports, 2018, 8:12369).

[0076] Consequentemente, em algumas modalidades da composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia, a dita composição farmacêutica é uma primeira composição farmacêutica da maneira descrita anteriormente, e compreende ainda pelo

33 / 141 menos um dos seguintes: um polirribonucleotídeo que codifica uma versão funcional de uma proteína MCIDAS, um polirribonucleotídeo que codifica uma versão funcional de uma proteína GemC1, um polirribonucleotídeo que codifica uma versão funcional de uma proteína FoxJ1, e/ou um polirribonucleotídeo que codifica uma versão funcional de uma proteína E2f4VP16.

[0077] Em algumas modalidades da composição farmacêutica, uma primeira composição farmacêutica da maneira descrita anteriormente pode ser administrada junto com uma segunda composição farmacêutica, compreendendo pelo menos um dos seguintes: um polirribonucleotídeo que codifica uma versão funcional de uma proteína MCIDAS, um polirribonucleotídeo que codifica uma versão funcional de uma proteína GemC1, um polirribonucleotídeo que codifica uma versão funcional de uma proteína FoxJ1, e/ou um polirribonucleotídeo que codifica uma versão funcional de uma proteína E2f4VP16.

[0078] Ambas as composições farmacêuticas, isto é, uma primeira composição farmacêutica da maneira definida anteriormente, compreendendo adicionalmente um polirribonucleotídeo que codifica uma proteína MCIDAS, GemC1, FoxJ1 e/ou E2f4VP16, ou uma primeira composição farmacêutica que é administrada junto com uma segunda composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo que codifica uma proteína MCIDAS, GemC1, FoxJ1, e/ou E2f4VP16, são vantajosas, uma vez que a administração de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é especialmente eficiente em restaurar a estrutura e função da célula ciliar, quando a composição farmacêutica é administrada às células antes das células iniciarem ciliogênese, ou enquanto estão na ciliogênese. Adicionalmente, ambas são preferivelmente administradas a um paciente usando uma pulverização nasal, e/ou um nebulizador, e/ou por inalação, preferivelmente pelo menos uma vez por semana e/ou por pelo menos 4 semanas.

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[0079] Da maneira mencionada anteriormente, em algumas modalidades, o mesmo se aplica da maneira descrita para as modalidades anteriores, exceto que a composição farmacêutica compreende um polirribonucleotídeo que pode ser traduzido em versões funcionais de duas ou mais, preferivelmente duas proteínas. Assim, em algumas modalidades, a composição farmacêutica descrita nas modalidades anteriores compreende um polirribonucleotídeo multicistrônico.

[0080] A composição farmacêutica pode compreender compostos que facilitam a transfecção de células com polirribonucleotídeos. Exemplos de tais compostos são aqueles descritos em WO 2014/20723.

[0081] A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente um ou mais agente(s) ou um ou mais reagente(s) para liberar e/ou introduzir o RNA em uma célula alvo ou um tecido alvo. Em particular, considera-se que este(s) agente(s) ou reagente(s) auxilia(m) a liberação e/ou introdução do RNA na célula ou tecido. Este(s) agente(s) ou reagente(s) pode(m) ser administrado(s) junto(s) com o RNA. O RNA a ser liberado/introduzido também pode ser acoplado com (por exemplo, ligado covalentemente a ou complexado com) ou não acoplado com (por exemplo, apenas misturado com) este(s) agente(s( ou reagente(s). Os respectivos agentes ou reagentes são conhecidos na técnica (por exemplo, Tavernier, J Control Release 150(3) (2011), 238-47) e são, por exemplo, selecionados do grupo que consiste em lipídeos e lipossomas, micelas, polímeros e dendrímeros, entre outros. Exemplos particulares dos respectivos agentes ou reagentes são GL67, EDMPC, DOTAP (l,2-dioleil-3-trimetilamônio propano), DODAP (1,2- dioleil-3-dimetilamônio propano), DOTMA (l,2-di-0-octadecenil-3- trimetilamônio propano), XTC (2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[l,3]- dioxolano) e MC3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoato), ALNY- 100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2- di((9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dienil)tetra-hidro-3aH-ciclopenta[d] [1,3]dioxol-

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5-amina)), NC98-5 (4,7,13-tris(3-oxo-3-(undecilamino)propil)-Nl,N16- diundecil- 4,7,10, 13-tetra-aza-hexadecano-l,16-diamida), C12-200, DLin- KC2 -DMA, DODAP, l,2-disteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano ou “DSDMA”, l,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano ou “DODMA”, 1,2- dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano ou “DLinDMA”, 1,2- dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano ou “DLenDMA”, cloreto de N- dioleil-N,N-dimetilamônio ou “DODAC”, brometo de N,N-diestearil-N,N- dimetilamônio ou “DDAB”, brometo de N-(l,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N- dimetil-N-hidróxi etil amônio ou “DMRIE”, 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3- beta-oxibutan-4-oxi)-l-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano ou “CLinDMA”, 2-[5'-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetil-1- (cis,cis-9',1-2'-octadecadienoxi)propano ou “CpLinDMA”, N,N-dimetil-3,4- dioleiloxibenzilamina ou “DMOBA”, l,2-N,N'-dioleilcarbamil-3- dimetilaminopropano ou “DOcarbDAP”, 2,3-Dilinoleoiloxi-N,N- dimetilpropilamina ou “DLinDAP”, l,2-N,N'-Dilinoleilcarbamil-3- dimetilaminopropano ou “DLincarbDAP”, l,2-Dilinoleoilcarbamil-3- dimetilaminopropano ou “DLinCDAP”, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil- [l,3]-dioxolano ou “DLin-K-DMA”, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[l,3]- dioxolano ou “DLin-K-XTC2-DMA”, ou misturas destes (Heyes, J Controlled Release 107 (2005), 276-287; Morrissey, Nat.

Biotechnol. 23(8) (2005), 1003-1007; WO2005/121348). Exemplos adicionais são DC-Col (N,N- dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), l,4-bis(3-N-oleilamino- propil)piperazina (Gao, Biochem.

Biophys.

Res.

Comm. 179 (1991), 280; Wolf, et al BioTechniques 23 (1997), 139; patente U.S. 5.744.335). Exemplos adicionais são LIPOFECTIN (DOTMA:DOPE) (Invitrogen, Carlsbad, Calif), LIPOFECTAMINE (DOSPA:DOPE) (Invitrogen), LIPOFECTAMINE2000. (Invitrogen), FUGENE, TRANSFECTAM (DOGS), e EFFECTENE.

Exemplos adicionais são poliacrilados modificados e não modificados, polialquicianoacrilatos, polilactídeo, copolímeros de polilactídeo-

36 / 141 poliglicolídeo, policaprolactonas, dextrana, albumina, gelatina, alginato, colágeno, quitosana, ciclodextrinas, polilisina, poliarginina, oligo/poliaminas e polietilenimina.

[0082] Os agentes ou reagentes podem ser oligômeros, polímeros ou lipidoides. Podem compreendem frações oligo(alquileno amina), por exemplo, como as frações de oligo(alquileno amina) características descritas em PCT/EP2014/063756. Em particular, os agentes ou reagentes podem ser os oligômeros, polímeros ou lipidoides descritos em PCT/EP2014/063756. Uma característica principal destes agentes ou reagentes particulares é que estes contêm uma seguinte entidade estrutural comum da fórmula (I): N {CH2 (CH2)a N [CH2 (CH2)b N]p}m [CH2 (CH2)a N]n (I)

[0083] Tais agentes ou reagentes podem ser (um componente compreendendo) um oligo(alquileno amina) selecionado de: a) um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (II) como uma cadeia lateral e/ou como um grupo terminal: R2 R4 N {CH2 (CH2)a N [CH2 (CH2)b N]p}m [CH2 (CH2)a N]n R6 R3 R5 (II) em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R6 são definidas da maneira a seguir, independentemente para cada grupo da fórmula (II) em uma pluralidade de tais grupos: A é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m+n é ≥ 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro, selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-

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(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenil C3-C18 com uma ligação dupla C-C; um grupo protetor para um grupo amino; e uma cadeia de um poli(etileno glicol); R6 é selecionado de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, - CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2- R7, em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenil C3-C18 com uma ligação dupla C-C; um grupo protetor para um grupo amino; –C(NH)-NH2; uma cadeia de um poli(etileno glicol); e um ligante receptor, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (II) podem ser protonados para prover um grupo catiônico da fórmula (II); b) um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (III) como unidades de repetição: R2 R4

N {CH2 (CH2)a N [CH2 (CH2)b N]p}m [CH2 (CH2)a N]n

R3 R5 (III) em que as variáveis a, b, p, m, n e R2 a R5 são definidas da maneira a seguir, independentemente para cada grupo da fórmula (III) em uma pluralidade de tais grupos: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m+n é ≥ 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro, selecionados de hidrogênio; um grupo –CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7 ou -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenil C3-C18 com uma ligação dupla C- C; um grupo protetor para um grupo amino; –C(NH)-NH2; e uma cadeia de um poli(etileno glicol);

38 / 141 e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (III) podem ser protonados para prover um grupo catiônico da fórmula (III); e c) um lipidoide com a estrutura da fórmula (IV): R2 R4 R1 N {CH2 (CH2)a N [CH2 (CH2)b N]p}m [CH2 (CH2)a N]n R6 R3 R5 (IV) em que as variáveis a, b, p, m, n e R1 a R6 são definidas da maneira a seguir: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m+n é ≥ 2; e R1 a R6 são independentemente um do outro selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenil C3-C18 com uma ligação dupla C-C; um grupo protetor para um grupo amino; –C(NH)-NH2; uma cadeia de um poli(etileno glicol); e um ligante receptor; contanto que pelo menos dois resíduos entre R1 a R6 são um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)- O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7, em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenil C3-C18 com uma ligação dupla C-C; e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IV) podem ser protonados para prover um lipidoide catiônico da fórmula (IV).

[0084] Preferivelmente, tais agentes ou reagentes podem ser (um componente compreendendo) um oligo(alquileno amina) selecionado de a) e b), em que a) é um oligômero ou polímero compreendendo uma

39 / 141 pluralidade de grupos da fórmula (IIa) como uma cadeia lateral e/ou como um grupo terminal: -NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IIa), em que a, b, m, n, e R2 a R6 são definidos da maneira descrita anteriormente, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIa) podem ser protonados para prover um cationic oligômero ou polímera estrutura; e b) é um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (IIIa) como unidades de repetição: -NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n- (IIIa), em que a, b, m, n, e R2 a R5 são definidos da maneira descrita anteriormente, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIIa) podem ser protonados para prover um oligômero catiônico ou estrutura de polímero.

[0085] Além disso, tais agentes ou reagentes podem ser (um componente compreendendo) um oligo(alquileno amina) selecionado de um lipidoide com a estrutura da fórmula (IVa): R1-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6 (IVa), em que a, b, m, n, e R1 a R6 são definidos da maneira descrita anteriormente, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IVa) podem ser protonados para prover um lipidoide catiônico.

[0086] Em relação a tais agentes ou reagentes, na fórmula (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) ou (IVa), n pode ser 1; ou m pode ser 1 e n pode ser 1.

[0087] Adicionalmente, em relação a tais agentes ou reagentes, na fórmula (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) ou (IVa), a pode ser 1 e b pode ser 2; ou a pode ser 2 e b pode ser 1.

[0088] Em algumas modalidades, o oligômero, polímero ou lipidoide pode ser um oligômero catiônico (por exemplo, protonado), polímero ou lipidoide.

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[0089] Um exemplo não limitante de um oligômero, polímero ou lipidoide como este a ser empregado é um lipídeo catiônico que foi preparado misturando 100 mg de N,N′-Bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina (0,623mmol) com 575,07 mg de 1,2-Epoxidodecano (3,12 mmol, (N-1) eq., onde N apresenta a quantidade 2x de amina primária e a quantidade 1x de amina secundário per oligo(alquileno amina)), e misturado por 96 horas a 80°C em agitação constante.Um oligômero, polímero ou lipidoide como este também é referido como lipidoide “C12-(2-3-2)”.

[0090] Um agente ou reagente, em particular um polímero, a ser empregado pode ser um copolímero, em particular um copolímero estatístico. Um copolímero como este pode ser um copolímero que contém um arranjo estatístico/aleatório de unidades de repetição de alquileno amina de tamanho alternado (por exemplo, em contraste com um polímero menos preferido, que contém arranjos análogos de unidades de repetição de alquileno amina de tamanho não alternado). O copolímero pode ser um copolímero catiônico (por exemplo, protonado). Os copolímeros a serem empregados são conhecidos na técnica e são, por exemplo, descritos em EP 14 19 9439.2, WO 01/00708, EP- A1 1 198 489 e CA-A1 2,377,207.

[0091] Em particular, o copolímero pode ser um copolímero estatístico compreendendo uma pluralidade de unidades de repetição (a) independentemente selecionadas das unidades de repetição das seguintes fórmulas (a1) e (a2): CH2 CH2 NH (a1) CH2 CH2 N (a2), e uma pluralidade de unidades de repetição (b) independentemente selecionadas das unidades de repetição das seguintes fórmulas (b1) a (b4): CH2 CH2 CH2 NH (b1)

41 / 141 CH2 CH2 CH2 N (b2) CH2 CH2 CH2 CH2 NH (b3) CH2 CH2 CH2 CH2 N (b4) em que a razão molar da soma das unidades de repetição (a) para a soma das unidades de repetição (b) está na faixa de 0,7/1,0 a 1,0/0,7, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio das unidades de repetição (a) e/ou (b) contidos no copolímero podem ser protonados para prover um copolímero catiônico.

[0092] O copolímero pode ser um copolímero estatístico, em que quaisquer unidades de repetição (a) e quaisquer unidades de repetição (b) são distribuídas estatisticamente na macromolécula do copolímero. É obtido tipicamente a partir da copolimerização de uma mistura de monômeros que rende, durante a reação de polimerização, as unidades de repetição (a) com monômeros que rendem, durante a reação de polimerização, as unidades de repetição (b). Preferivelmente, o copolímero é um copolímero aleatório, em que quaisquer unidades de repetição (a) e quaisquer unidades de repetição (b) são distribuídas aleatoriamente na macromolécula do polímero.

[0093] Um copolímero como este pode ser um copolímero linear, ramificado ou dendrítico. Como será entendido pelos versados na técnica, uma unidade de repetição da fórmula (a1), (b1) ou (b3) com duas valências (isto é, ligações abertas para unidades vizinhas) leva a uma propagação da estrutura do copolímero de uma maneira linear. Assim, um copolímero linear pode compreender unidades de repetição da fórmula (a1) e um ou mais tipo das unidades de repetição das fórmulas (b1) e (b3), mas nenhuma das unidades de repetição da fórmula (a2), (b2) ou (b4). Como será adicionalmente entendido, a presença de uma unidade de repetição da fórmula (a2), (b2) ou (b4) com três valências provê um ponto de ramificação na estrutura do copolímero. Assim, um copolímero ramificado compreende um

42 / 141 ou mais tipos das unidades de repetição das fórmulas (a2), (b2) e (b4), e pode compreender adicionalmente um ou mais tipos das unidades de repetição das fórmulas (a1), (b1) e (b3).

[0094] Um copolímero como este pode compreender uma pluralidade de unidades de repetição (a) independentemente selecionadas das unidades de repetição das fórmulas (a1) e (a2) definidas anteriormente, e uma pluralidade de unidades de repetição (b) independentemente selecionadas das unidades de repetição das fórmulas (b1) a (b4) definidas anteriormente. São preferidos copolímeros compreendendo uma pluralidade de unidades de repetição (a) independentemente selecionadas das unidades de repetição das fórmulas (a1) e (a2) definidas anteriormente, e uma pluralidade de unidades de repetição (b) independentemente selecionadas das unidades de repetição das fórmulas (b1) e (b2) definidas anteriormente.

[0095] Preferivelmente, um copolímero como este é um copolímero ramificado que compreende um ou mais tipos de unidades de repetição, selecionadas das unidades de repetição (a2), (b2) e (b4), e que compreendem adicionalmente de maneira adicional um ou mais tipos das unidades de repetição das fórmulas (a1), (b1) e (b3), e em particular um copolímero que compreende unidades de repetição da fórmula (a2) e um ou mais tipo das unidades de repetição das fórmulas (b2) e (b4), e que compreende adicionalmente de maneira opcional um ou mais tipos das unidades de repetição das fórmulas (a1), (b1) e (b3). Em alinhamento com os anteriores, um copolímero mais preferido é, assim, um copolímero ramificado que compreende unidades de repetição da fórmula (a2) e unidades de repetição da fórmula (b2), e que compreende adicionalmente de maneira opcional um ou mais tipos das unidades de repetição das fórmulas (a1) e (b1).

[0096] Nos copolímeros, o número total das unidades de repetição (a) e unidades de repetição (b) é tipicamente 20 ou mais, preferivelmente 50 ou mais e mais preferivelmente 100 ou mais. Tipicamente, o número total das

43 / 141 unidades de repetição (a) e unidades de repetição (b) é 10.000 ou menos, preferivelmente 5.000 ou menos, mais preferivelmente 1.000 ou menos.

[0097] Além disso, é preferível para os copolímeros que as unidades de repetição (a) e (b) representam 80 mol% ou mais, mais preferivelmente 90 mol% ou mais de todas as unidades de repetição no copolímero. Adicionalmente, são preferidos copolímeros nos quais as unidades de repetição (a) selecionadas de (a1) e (a2), e unidades de repetição (b) selecionadas de (b1) e (b2) representam 80 mol% ou mais, mais preferivelmente 90 mol% ou mais de todas as unidades de repetição no copolímero. É acima de tudo preferível que todas as unidades de repetição no copolímero são unidades de repetição (a) ou (b), em particular que todas as unidades de repetição no copolímero são unidades de repetição (a) selecionadas de (a1) e (a2), ou unidades de repetição (b) selecionadas de (b1) e (b2).

[0098] O peso molecular médio ponderal do copolímero, da maneira medida, por exemplo, por meio de cromatografia por exclusão de tamanho com relação aos padrões de óxido de poli(etileno) linear, varia em geral de

1.000 a 500.000 Da, preferivelmente de 2.500 a 250.000 Da e mais preferivelmente 5.000 a 50.000 menos.

[0099] Os grupos terminais de um copolímero como este compreendem tipicamente um ou mais tipos de grupos (c) independentemente selecionados de grupos das fórmulas (c1) a (c3) a seguir, preferivelmente de grupos das fórmulas (c1) e (c2) a seguir: CH2 CH2 NH2 (c1) CH2 CH2 CH2 NH2 (c2) CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 (c3).

[00100] Preferivelmente, os grupos terminais no copolímero consistem em um ou mais tipos de grupos (c) independentemente selecionados de grupos das fórmulas (c1) a (c3) a seguir, preferivelmente de grupos das

44 / 141 fórmulas (c1) e (c2). Como será entendido pelos versados na técnica, os números de grupos terminais dependem da estrutura do copolímero. Embora um copolímero linear apresente apenas dois terminais, grandes números de grupos terminais são contidos em um copolímero ramificado, em particular em um dendrítico. Como será entendido adicionalmente, igualmente um ou mais dos átomos de nitrogênio dos grupos terminais (c) contidos no copolímero podem ser protonados para prover um copolímero catiônico.

[00101] No copolímero, a razão molar da soma das unidades de repetição (a) para a soma das unidades de repetição (b) está na faixa de 0,7/1,0 a 1,0/0,7, e preferivelmente na faixa de 0,8/1,0 a 1,0/0,8. Esta razão molar pode ser determinada, por exemplo, por meio de RMN. Será assim entendido que a razão é em geral determinada por uma pluralidade de macromoléculas do copolímero, e tipicamente indica a razão geral da soma de unidades de repetição (a) para a soma de unidades de repetição (b) na pluralidade de macromoléculas.

[00102] Da maneira indicada anteriormente, um ou mais dos átomos de nitrogênio do copolímero pode ser protonado para resultar em um copolímero em uma forma catiônica, tipicamente uma forma oligocatiônica ou policatiônica. Será entendido que os grupos amino primários, secundários, ou terciários nas unidades de repetição (a) ou (b), ou nos grupos terminais (c), podem agir como aceptores de próton, especialmente na água e soluções aquosas, incluindo fluidos fisiológicos. Assim, tais copolímeros apresentam tipicamente uma carga geral positiva em uma solução aquosa, em um pH abaixo de 7,5. Uma solução aquosa, da maneira aqui referida, é uma solução na qual o solvente compreende 50% (vol./vol.) ou mais, preferivelmente 80 ou 90% ou mais, e acima de tudo preferivelmente 100% de água. Igualmente, se as composições estiverem em contato com um fluido fisiológico com um pH abaixo de 7,5 incluindo, por exemplo, sangue e fluido pulmonar, estes contêm tipicamente unidades de repetição (a) e (b), em que os átomos de

45 / 141 nitrogênio são protonados. Os valores de pKa dos copolímeros usados nas composições podem ser determinados por titulação ácido-base usando um titulador de pKa automatizado. A carga líquida em um dado valor de pH pode então ser calculada, por exemplo, a partir da equação Henderson–Hasselbach. Qualquer carga pode ser compartilhada através de vários centros básicos e não pode ser necessariamente atribuída a um único ponto. Tipicamente, em soluções com pH fisiológico, os copolímeros usados nas composições compreendem unidades de repetição com grupos aminos em estado protonado, e unidades de repetição com grupos aminos em estado não protonado.

[00103] Entretanto, como será entendido pelos versados na técnica, os copolímeros, bem como as composições, também podem ser providos como uma forma de sal seco que contém o copolímero em uma forma catiônica.

[00104] Como será entendido adicionalmente, contra-íons (ânions) para as cargas positivas de grupos aminos protonados em composições compreendendo o copolímero e ácido nucleico, em particular RNA, preferivelmente RNA de fita simples tal como RNAm, são tipicamente providos pelas frações aniônicas contidas no ácido nucleico. Se os grupos carregados positivamente estiverem presentes em excesso, comparado ás frações aniônicas no ácido nucleico, cargas positivas podem ser equilibradas por outros ânions, em particular aqueles tipicamente encontrados em fluidos fisiológicos, tal como Cl- ou HCO3-.

[00105] Em alinhamento com os anteriores, um copolímero preferido é um copolímero aleatório, em que 80 mol% ou mais de todas as unidades de repetição, mais preferivelmente todas as unidades de repetição, são formadas por uma pluralidade de unidades de repetição (a) independentemente selecionadas das unidades de repetição das seguintes fórmulas (a1) e (a2):

46 / 141 CH2 CH2 NH (a1) CH2 CH2 N (a2), e uma pluralidade de unidades de repetição (b) independentemente selecionadas das unidades de repetição das seguintes fórmulas (b1) e (b2): CH2 CH2 CH2 NH (b1) CH2 CH2 CH2 N (b2), em que a razão molar da soma das unidades de repetição (a) para a soma das unidades de repetição (b) está na faixa de 0,7/1,0 a 1,0/0,7, mais preferivelmente na faixa de 0,8/1,0 a 1,0/0,8; em que os grupos terminais do copolímero são formados por grupos (c) independentemente selecionados de grupos das fórmulas (c1) e (c2): CH2 CH2 NH2 (c1) CH2 CH2 CH2 NH2 (c2); e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio das unidades de repetição (a) e/ou (b) e/ou dos grupos terminais (c) contidos no copolímero podem ser protonados para prover um copolímero catiônico. É adicionalmente preferível que o copolímero é um copolímero ramificado, compreendendo unidades (a2) e (b2), opcionalmente juntas com unidades (a1) e/ou (b1).

[00106] Os copolímeros podem ser preparados convenientemente com procedimentos análogos àqueles conhecidos para a preparação de polialquilenoiminas, tal como polietilenoimina ramificado ou linear (PEI). Será entendido que os monômeros usados para a produção dos copolímeros terão que ser ajustados em conformidade. Aqui, verificou-se que os monômeros podem ser reagidos convenientemente de uma maneira quantitativa, de maneira tal que a razão das unidades (a) e (b) no copolímero

47 / 141 possa ser ajustada pelo ajuste da razão de monômero, adequadamente, na mistura de monômero submetida à polimerização. Enquanto polietilenoimina pode ser preparada, por exemplo, por meio da polimerização de abertura de anel de aziridina, os copolímeros podem ser preparados por meio de polimerização de abertura de anel de uma mistura de monômero compreendendo ou consistindo em aziridina, azetidina e, onde aplicável, pirrolidina ou, em modalidades preferidas, de aziridina e azetidina. Será entendido que a expressão “onde aplicável” se refere à presença ou ausência de unidades de repetição (b3) e (b4), ou grupos terminais (c3), que seriam formados pela pirrolidina. A polimerização de abertura de anel das aminas cíclicas não substituídas leva em geral aos copolímeros ramificados. Os copolímeros lineares podem ser preparados, por exemplo, por meio de polimerização de aziridinas substituídas por N, azetidinas substituídas por N e pirrolidinas substituídas por N, ou aziridinas substituídas por N e azetidinas substituídas por N adequadas, que pode ser seguida, por exemplo, por uma clivagem hidrolítica de substituintes N anexados à cadeia de polialquileneimina resultante, por exemplo, em analogia com o procedimento publicado em Katrien F. Weyts, Eric J. Goethals, Newynthesis of linear polyethyleneimine, Polymer Bulletin, 1988, 19 (1): 13-19. Dendrímeros podem ser sintetizados, por exemplo, de acordo com o método descrito em Yemul et al, Colloid and Polymer Science, 2008, 286 (6-7): 747-752, Synthesis and characterization of poly(ethylenimine) denrimers.

[00107] Para a preparação de um dendrímero (ou copolímero dendrítico), estratégias sintéticas que podem ser aplicadas de maneira análoga são conhecidas para a produção de dendrímeros de polietilenoimina ou polipropilenoamina. Os dendrímeros de polipropilenimina podem ser sintetizados a partir de blocos de construção de acrilonitrila, usando uma sequência repetitiva de uma adição de Michael a uma amina primária, seguido por uma hidrogenação catalisada heterogeneamente (Newkome and Shreiner

48 / 141 Poly(amidoamine), polypropilenimine, and related dendrimers and dendrons possessing different 1®2 branching motifs: An overview of the divergent procedures. Polymer 49 (2008) 1-173; De Brabander-Van Den Berg et al. Large-scale production of polypropilenimine dendrimers, Macromolecular Symposia (1994) 77 (1) 51-62). Dendrímeros de polietilenimina podem ser produzidos usando uma sequência repetitiva de uma adição de Michael de um bloco de construção de brometo de vinila a uma amina primária, seguido por uma conversão de brometo de alquila em amina usando um método de síntese de amina de Gabriel (Yemul & Imae, Synthesis and characterization of poly(ethyleneimine) dendrimers, Colloid Polym Sci (2008) 286:747-752). Consequentemente, os versados na técnica serão capazes de produzir não apenas dendrímeros com camadas estritamente alternadas, por exemplo, propilenimina e etilenimina podem ser produzidas. Similarmente, as gerações de dendrímero com camadas compreendendo ou consistindo em composições aleatórias de unidades de repetição da fórmula (a2), (b2) e (b4) e, preferivelmente, unidades de repetição (a2) e (b2) podem ser geradas.

[00108] A polimerização de abertura de anel de aziridina e azetidina, ou de aziridina, azetidina e pirrolidina, pode ser realizada em solução, por exemplo, em água. A concentração de monômero total não é particularmente limitada, concentrações típicas variam de 10% p/p a 80% p/p, preferivelmente 30% p/p a 60% p/p. Tipicamente, a polimerização é iniciada por prótons, de maneira tal que é preferível adicionar um ácido de Brønsted, em particular um ácido mineral tal como ácido sulfúrico ao sistema de reação. Quantidades pequenas de ácido são em geral suficientes, tais como 0,001 a 0,01 equivalentes, com base na concentração total de monômeros. A reação continua em taxas convenientes, por exemplo, na faixa de temperatura de 50 a 150°C, em particular 90 a 140°C. Nestas faixas, copolímeros de pesos moleculares maiores estão em geral em temperaturas maiores, e copolímeros de pesos moleculares menores em temperaturas menores.

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[00109] A princípio, um lipidoide é um agente ou reagente preferido a ser empregado, em particular comparado a um oligômero e, mais particular, a um polímero.

[00110] Exemplos adicionais do um ou mais agente(s) ou um ou mais reagente(s) para liberar e/ou introduzir o RNA em uma célula alvo, ou um tecido alvo, são os reagentes de transfecção lipossomal (LTR’S) e partículas magnéticas (MPs), da maneira aqui descrita em outra parte.

[00111] Um modo particular para liberar e/ou introduzir o RNA em células alvo ou tecido alvo é transfecção. Consequentemente, o RNA a ser empregado pode ser considerado para ser transfectado (em células ou tecido (alvo)), para ser liberado/administrado por meio de transfecção e/ou para ser preparado para transfecção. Os meios e métodos para a transfecção de RNA são bem conhecidos na técnica e são, por exemplo, descritos em Tavernier (loc. cit.), Yamamoto (Eur J Pharm Biopharm. 71(3) (2009), 484-9) e Kormann (Nat Biotechnol. 29(2) (2011), 154-7). Modos particulares de transfecção são lipofecção, magnetofecção ou magnetolipofecção.

[00112] Consequentemente, o RNA a ser empregado pode ser preparado por lipofecção, preparado para ser transfectado por lipofecção, liberado/introduzido por meio de lipofecção, e/ou administrado por meio de lipofecção.

[00113] Assim, a composição farmacêutica pode compreender (adicionalmente) pelo menos um lipídeo ou reagente ou intensificador de transfecção lipossomal (LTR; reagente de transfecção lipossomal). O RNA a ser empregado pode ser compreendido em, complexado com, e/ou liberado pelo LTR. Em particular, o RNA a ser empregado pode ser compreendido em e/ou liberado por (respectivos) complexos de lipofecção compreendendo o RNA e o LTR. A composição farmacêutica pode compreender (adicionalmente) os complexos de lipofecção.

[00114] Os LTRs são conhecidos na técnica e são, por exemplo,

50 / 141 distribuídos por OzBiosciences, Marseille, França. LTRs a serem empregados podem ser selecionados do grupo que consiste nos agentes ou reagentes descritos anteriormente para liberar e/ou introduzir o RNA em uma célula alvo ou um tecido alvo. Por exemplo, tais LTRs podem ser lipídeos ou lipidoides, preferivelmente lipídeos catiônicos ou lipidoides catiônicos, como os lipidoides descritos em PCT/EP2014/063756 (por exemplo, C12-(2-3-2), os lipídeos descritos em EP2285772 (por exemplo, Dogtor) e as lipopoliaminas descritas em EP1003711 (por exemplo, DreamFectTM e DreamFect GoldTM). Um LTR particular pode ser selecionado do grupo que consiste em (i) C12-(2-3-2); (ii) DreamFectTM, preferivelmente DreamFect GoldTM (DFTM/DF-GoldTM; OzBiosciences, Marseille, França); (iii) Dogtor (OzBiosciences, Marseille, França); e (iv) Lipofectamina como, por exemplo, Lipofectamina 2000 (Invitrogene, CA, USA).

[00115] A princípio, Dogtor é preferido, DreamFectTM é um mais preferido e DF-GoldTM e C12-(2-3-2) são LTR(s) ainda mais preferidos.

[00116] LTRs como Dogtor são, por exemplo, descritos em EP2285772. LTRs como DFTM ou DF-GoldTM são, por exemplo, descritos em EP1003711. A princípio, os oligômeros, polímeros ou lipidoides descritos em PCT/EP2014/063756, os lipídeos catiônicos particulares descritos em EP2285772 e as lipopoliaminas particulares descritas em EP1003711 são LTRs preferidos. LTRs como C12-(2-3-2) e DF-GoldTM são mais preferidos.

[00117] Exemplos não limitantes de complexos de lipofecção são lipoplexos de DF-GoldTM/RNA e lipoplexos de C12-(2-3-2)/RNA.

[00118] C12-(2-3-2) é um LTR particularmente preferido, com a estrutura mostrada na fórmula (V) (conferir Jarzębińska et al., Angew Chem Int Ed Engl., 2016; 55(33):9591-5):

51 / 141 Fórmula (V) C12-(2-3-2) é preferivelmente preparado da maneira descrita, por exemplo, em WO 2016/075154 A1, EP 3013964, e Jarzębińska et al. (Angew Chem Int Ed Engl., 2016;55(33):9591-5). O lipidoide catiônico pode ser preparado misturando N1-(2-aminoetil)-N3-(2-((3,4- dimetoxibenzil)amino)etil)propano-1,3-diamina (8,9 g, 1 eq., 28,67 mmol) com 1,2-Epoxidodecano (42,27, 8 eq., 229,4 mmol), e misturado por 24 horas a 80 °C em agitação constante, seguido por purificação e remoção do grupo de proteção 3,4-dimetoxibenzil.

[00119] Isômeros diferentes, de C12-(2-3-2) podem ser usados tais como um racemato, um S-isômero, e/ou um R-isômero. Preferivelmente, C12-(2-3-2) é usado como R-isômero e apresenta a estrutura mostrada na fórmula (VI). Para obter R-isômeros puros de C12-(2-3-2), estes podem ser preparados da maneira descrita anteriormente para C12-(2-3-2), usando o R- isômero de 1,2-Epxoidodecano para síntese.

Fórmula (VI)

[00120] Consequentemente, em modalidades preferidas, a composição farmacêutica compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia, e compreende adicionalmente um lipidoide com a estrutura mostrada na fórmula (V), preferivelmente da maneira mostrada na fórmula (VI).

[00121] Um LTR particularmente preferido adicional é um lipidoide catiônico com fórmula (VII), aqui também referido como “dL_P”, que pode ser sintetizado por meio da reação de N,N′-Bis(2-aminoetil)-1,3- propanodiamina com N-Dodecilacrilamida, usando ácido bórico como

52 / 141 catalisador. Para a reação, a mistura pode ser agitada a 100 °C em irradiações de micro-ondas.

[00122] Consequentemente, em modalidades preferidas adicionais, a composição farmacêutica compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia, e compreende adicionalmente um lipidoide com com a estrutura mostrada na fórmula (VII).

Fórmula (VII)

[00123] Além disso, a composição farmacêutica compreende um lipidoide catiônico com fórmula (V), (VI) e/ou (VII), preferivelmente dL_P e/ou C12-(2-3-2), mais preferivelmente dL_P e/ou o R-isômero de C12-(2-3- 2) compreendido em uma formulação da maneira descrita a seguir. Em particular, os agentes e reagentes aqui descritos para liberar e/ou introduzir o RNA em uma célula alvo ou um tecido alvo, e os aqui descritos LTRs podem ser combinados com um ou mais (por exemplo, dois, três ou quatro) lipídeo(s) adicional(s) (como, por exemplo, colesterol, DPPC, DOPE e/ou PEG-lipídeos (por exemplo, DMPE-PEG, DMG-PEG2000)). Estes lipídeos adicionais podem auxiliar a função desejada dos agentes/reagentes e LTRs (auxiliam e/ou aumentam a liberação e/ou introdução de RNA na célula ou tecido, e melhoram a eficiência de transfecção, respectivamente), e funcionam como “lipídeos auxiliares” respectivos. Os exemplos particulares de tais “lipídeos auxiliares” são colesterol, DPPC, DOPE e/ou PEG-lipídeos (por exemplo, DMPE-PEG, DMG-PEG (por exemplo, DMG-PEG2000). Os lipídeos adicionais (por exemplo, “lipídeos auxiliares”) também podem ser parte(s) dos complexos/partículas aqui descritos. Os versados na técnica poderão preparar facilmente complexos/partículas de acordo com a invenção.

53 / 141 Exemplos de lipídeos adicionais (por exemplo, “lipídeos auxiliares”) também são conhecidos na técnica. Os versados na técnica poderão escolher facilmente lipídeos adicionais adequados (por exemplo, “lipídeos auxiliares”) e razões dos agentes/reagentes/LTRs e os lipídeos adicionais (por exemplo, “lipídeos auxiliares”). Tais razões podem ser razões molares de 1-4 : 1-5, 3-4 : 4-6, cerca de 4 : cerca de 5, cerca de 4 : cerca de 5,3 de agentes/reagentes/ LTRs : lipídeo(s) adicional(s) (as faixas mais estreitas são preferidas). Por exemplo, os agentes/reagentes/LTRs podem ser combinados com três lipídeos adicionais, como DPPC, colesterol e DMG-PEG2000, em uma razão molar de 8 : 5,3 : 4,4 : 0,9, respectivamente ou, mais particular, 8 : 5,29 : 4,41 : 0,88, respectivamente.

[00124] Preferivelmente, dL_P e/ou C12-(2-3-2), mais preferivelmente dL_P e/ou o R-isômero de C12-(2-3-2), é gerado da maneira descrita anteriormente e usado com lipídeos auxiliares DPPC, e colesterol e PEG- lipídeo DMG-PEG2000 nas razões molares 8:5,29:4,41:0,88 para formular partículas lipoides.

[00125] Uma composição na qual o R-isômero de C12-(2-3-2) (fórmula VI) é formulado com os lipídeos DPPC, e colesterol e PEG-lipídeo DMG-PEG2000 nas razões molares 8:5,29:4,41:0,88 também é referido aqui como “LF92”. Uma composição na qual o dL_P (fórmula VII) é formulado com os lipídeos DPPC, e colesterol e PEG-lipídeo DMG-PEG2000 nas razões molares 8:5,29:4,41:0,88 é também é aqui referido como “LF111”.

[00126] Como descrito igualmente de maneira exemplar, por exemplo, em WO 2016/075154 A1, EP 3013964, e Zhang et al. (TERMIS, 2019, Tissue Engineering: Part A, Vol. 25, Números 1 e 2), dL_P e/ou C12-(2-3-2) podem ser usados como um vetor não viral, para preparar um lipoplexo estável com moléculas de RNAm, com base na interação eletrostática entre os grupos aminos de lipidoide positivos e grupos fosfatos negativos de moléculas de RNAm (Anderson, Human Gene Therapy 14, 2003, 191-202). Para estabilizar

54 / 141 a estrutura de lipoplexo e reduzir o extravazamento, dL_P e/ou C12-(2-3-2), mais preferivelmente dL_P e/ou o R-isômero de C12-(2-3-2), pode ser fornecido com dois lipídeos auxiliares intitulados 1,2-dipalmitoil-sn-glicero- 3-fosfocolina (DPPC) e colesterol (Anderson, Drug Delivery 11, 2004, 33-39; Liang, Journal of Colliod and Interface Science 278, 2004, 53-62). No final, 1,2-dimiristoil-sn-glicerol, metoxipolietileno glicol (DMG-PEG) 2kD (DMG- PEG2000) deve ser adicionado à mistura de lipídeo para prover um lipossoma PEGuilado. Já é bem conhecido que a PEGuilação melhora a característica físico-química da formulação de lipossoma aumentando a solubilidade da água, protegendo da degradação enzimática e limitando reações imunogênicas e antigênicas (Milla, Current Drug Metabolism 13, 2012, 105-119). Razões N/P finais para mistura total de lipídeo etanoico deve ser 8 : 5,29 : 4,41 : 0,88 significando razões molares de grupo amino de dL_P e/ou C12-(2-3-2) / DPPC / colesterol / DMG-PEG2000, respectivamente, para um grupo fosfato de molécula de RNAm.

[00127] Consequentemente, em modalidades preferidas, a composição farmacêutica compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia adicional, compreendendo dL_P e/ou C12-(2-3-2), preferivelmente dL_P e/ou o R-isômero de C12-(2-3-2), formulado com DPPC, colesterol e DMG-PEG2000.

[00128] Além disso, em modalidades particularmente preferidas, a composição farmacêutica compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia compreendendo adicionalmente dL_P e/ou C12- (2-3-2), preferivelmente dL_P e/ou o R-isômero de C12-(2-3-2), formulado com DPPC, colesterol e DMG-PEG2000, com razões de N/P final para mistura inteira de lipídeo etanóico de 8 : 5,29 : 4,41 : 0,88 para razões molares de grupo amino de dL_P e/ou C12-(2-3-2) / DPPC / colesterol / DMG- PEG2000, respectivamente, para grupo fosfato de molécula de RNAm.

[00129] R-isômeros de C12-(2-3-2) formulados com DPPC, colesterol,

55 / 141 e DMG-PEG2000, da maneira descrita anteriormente, também são referidos como formulação LF92.

[00130] Consequentemente, em modalidades particularmente preferidas da composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia, a dita composição farmacêutica compreende adicionalmente uma formulação LF92.

[00131] dL_P formulado com DPPC, colesterol e DMG-PEG2000, da maneira descrita anteriormente, também são referidos como formulação LF111.

[00132] Consequentemente, em modalidades particularmente preferidas da composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia, a dita composição farmacêutica compreende adicionalmente uma formulação LF111.

[00133] Em uma modalidade preferida da composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia, a dita composição farmacêutica compreende adicionalmente uma formulação LF92 e/ou LF111. LF92 e/ou LF111 se refere a uma formulação carreadora que é usada para transfecção celular. Isto é vantajoso, uma vez que o uso de LF92 e/ou LF111 é associado com altas eficiências de transfecção e, assim, garante que o polirribonucleotídeo que codifica uma versão funcional de uma proteína cujo defeito está associado com o ciliopatia possa entrar eficientemente em uma célula, preferivelmente uma célula ciliar ou célula basal não diferenciada e, assim, restabelecer a função celular ciliada no sujeito que sofre de PCD.

[00134] Em uma modalidade particularmente preferida, a composição farmacêutica compreende uma formulação de LF92 e/ou LF111, pelo menos uma das seguintes: um RNAm que pode ser traduzido em uma versão funcional de uma proteína MCIDAS, um RNAm que pode ser traduzido em

56 / 141 uma versão funcional de uma proteína GemC1, um RNAm que pode ser traduzido em uma versão funcional de uma proteína FoxJ1, um RNAm que pode ser traduzido em uma versão funcional de uma proteína E2f4VP16; e um RNAm que pode ser traduzido em uma versão funcional de CCDC40 e/ou CCDC39. Preferivelmente, uma composição como esta é administrada a um paciente usando uma pulverização, gotas e/ou um nebulizador, e/ou por inalação, preferivelmente pelo menos uma vez por semana e/ou por pelo menos 4 semanas.

[00135] Consequentemente, em algumas modalidades, o mesmo se aplica da maneira descrita para as modalidades anteriores, exceto que a composição farmacêutica compreende um polirribonucleotídeo que pode ser traduzido em versões funcionais de duas ou mais, preferivelmente duas proteínas. Assim, em algumas modalidades, a composição farmacêutica da maneira descrita nas modalidades anteriores compreende um polirribonucleotídeo multicistrônico.

[00136] A presente invenção também se refere a um método para tratar uma ciliopatia em um sujeito que sofre de uma ciliopatia, compreendendo a administração de uma composição farmacêutica que compreende um polirribonucleotídeo, em que o polirribonucleotídeo codifica uma versão funcional de uma proteína cujo defeito está associado com a dita ciliopatia, e em que a dita composição farmacêutica é administrada ao sistema respiratório do dito sujeito, e é realizada quando o sujeito mostra uma inflamação do sistema respiratório. Em relação às modalidades possíveis e modalidades preferidas da composição farmacêutica, e suas maneiras e tempo de administração, o mesmo se aplica conforme estabelecido aqui anteriormente, em conexão com a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção.

[00137] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo que codifica uma

57 / 141 proteína cujo defeito está associado com uma ciliopatia e N-acetilcisteína (NAC), uma solução hipertônica compreendendo cloreto de sódio, e/ou uma formulação de LF92 e/ou LF111.

[00138] Em relação à composição farmacêutica e seus componentes, o mesmo se aplica da maneira descrita anteriormente, em conexão com a composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia, em um sujeito que sofre de uma ciliopatia. Além disso, igualmente as outras características de uma composição farmacêutica como esta podem ser da maneira descrita anteriormente.

[00139] Consequentemente, em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica pode compreender adicionalmente um RNAm que pode ser traduzido em uma versão funcional de MCIDAS.

[00140] A presente descrição também se refere a um polirribonucleotídeo que codifica CCDC40 de humano, da maneira mostrada em qualquer de SEQ ID NO: 1 ou 5 a 11.

[00141] Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos precedentes, ou outros, e modalidades da descrição, o polirribonucleotídeo ou polirribonucleotídeo modificado codifica CCDC40 de humano (por exemplo, CCDC40 de humano funcional) e compreende uma sequência primária que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, ou pelo menos 95% idêntica (por exemplo, pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% idêntica) a uma ou mais de SEQ ID NO: 1 ou 5 a 11 (por exemplo, à sequência apresentada em SEQ ID NO: 1 ou 5 a 11).

[00142] Em certas modalidades, o dito polirribonucleotídeo contém em sua extremidade 5’ uma parte do promotor T7, região não traduzida 5’ mínima de Ethris (UTR), uma UTR 5’ de CYBA, um elemento de Kozak, seguido por uma sequência com códon otimizado que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, uma UTR 3’ de CYBA, e uma cauda poli(a) (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 1).

58 / 141

[00143] Em certas modalidades, o dito polirribonucleotídeo contém em sua extremidade 5’ uma parte do promotor T7, região não traduzida 5’ mínima de Ethris (UTR), um elemento de Kozak, seguido por uma sequência com códon otimizado que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, e uma cauda poli(a) (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 5).

[00144] Em certas modalidades, o dito polirribonucleotídeo contém em sua extremidade 5’ uma parte do promotor T7, região não traduzida 5’ mínima de Ethris (UTR), um nucleotídeo U adicional, um elemento TISU, seguido por uma sequência com códon otimizado que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, e uma cauda poli(a) (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 6).

[00145] Em certas modalidades, o dito polirribonucleotídeo contém em sua extremidade 5’ uma parte do promotor T7, região não traduzida 5’ mínima de Ethris (UTR), uma UTR 5’ de hAg, um elemento de Kozak, seguido por uma sequência com códon otimizado que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, e uma cauda poli(a) (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 7).

[00146] Em certas modalidades, o dito polirribonucleotídeo contém em sua extremidade 5’ uma parte do promotor T7, região não traduzida 5’ mínima de Ethris (UTR), uma UTR 5’ de CMV IE9 de humano, um elemento de Kozak, seguido por uma sequência com códon otimizado que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, uma UTR 3’ do hormônio do crescimento humano, e uma cauda poli(a) (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 8).

[00147] Em certas modalidades, o dito polirribonucleotídeo contém em sua extremidade 5’ uma parte do promotor T7, região não traduzida 5’ mínima de Ethris (UTR), um elemento de Kozak, uma sequência que codifica EGFP, um espaçador de G4S, seguido por uma sequência com códon

59 / 141 otimizado que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, e uma cauda poli(a) (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 9).

[00148] Em certas modalidades, o dito polirribonucleotídeo contém em sua extremidade 5’ uma parte do promotor T7, região não traduzida 5’ mínima de Ethris (UTR), um elemento de Kozak, seguido por uma sequência com códon otimizado que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, um espaçador de G4S, uma sequência que codifica EGFP, e uma cauda poli(a) (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 10).

[00149] Em certas modalidades, o dito polirribonucleotídeo contém em sua extremidade 5’ uma parte do promotor T7, região não traduzida 5’ mínima de Ethris (UTR), uma UTR 5’ de CYBA, um elemento de Kozak seguido por uma etiqueta HA, um espaçador de G4S, uma sequência com códon otimizado que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, um peptídeo T2A, uma sequência que codifica tdTomato, uma UTR 3’ de CYBA, e uma cauda poli(a) (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 11).

[00150] Em algumas modalidades, o polirribonucleotídeo é um polirribonucleotídeo modificado com um nível e/ou tipo de modificação selecionado de qualquer nível e/ou tipo aqui apresentado.

[00151] Em certas modalidades, a identidade percentual de um polirribonucleotídeo é medida apenas com relação à porção de sequência que codifica CCDC40 de SEQ ID NO: 1 ou 5 a 11 (por exemplo, UTRs, outras sequências não codificantes e etiquetas de GFP ou epítopo não são consideradas durante o cálculo de identidade percentual, e o polirribonucleotídeo pode ou não conter tais regiões).

[00152] Em certas modalidades de quaisquer dos precedentes, tal polirribonucleotídeo (ou polirribonucleotídeo modificado) codifica uma proteína CCDC40 funcional.

[00153] A presente descrição também se refere a um

60 / 141 polirribonucleotídeo que codifica CCDC39 de humano, da maneira mostrada em qualquer de SEQ ID NO: 2 ou 12 a 14.

[00154] Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos precedentes, ou outros, e modalidades da descrição, o polirribonucleotídeo ou polirribonucleotídeo modificado codifica CCDC39 de humano, e compreende uma sequência primária que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92% ou pelo menos 95% idêntica (por exemplo, pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% idêntica) a uma ou mais de SEQ ID NO: 2 ou 12 a 14 (por exemplo, à sequência apresentada em SEQ ID NO: 2 ou 12 a 14).

[00155] Em certas modalidades, o dito polirribonucleotídeo contém em sua extremidade 5’ uma parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, uma UTR 5’ de CYBA, um elemento de Kozak, seguido por uma sequência com códon otimizado que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC39 de humano, uma UTR 3’ de CYBA, e uma cauda poli(a) (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 2).

[00156] Em certas modalidades, o dito polirribonucleotídeo contém em sua extremidade 5’ uma parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, um elemento de Kozak, seguido por uma sequência com códon otimizado que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC39 de humano, e uma cauda poli(a) (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 12).

[00157] Em certas modalidades, o dito polirribonucleotídeo contém em sua extremidade 5’ uma parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, um nucleotídeo U adicional, um elemento TISU, seguido por uma sequência com códon otimizado que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC39 de humano, e uma cauda poli(a) (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 13).

[00158] Em certas modalidades, o dito polirribonucleotídeo contém em sua extremidade 5’ uma parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, um SP30 como UTR 5’ (isto é, uma sequência aleatória de 30 nucleotídeos), um

61 / 141 elemento de Kozak, seguido por uma sequência com códon otimizado que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC39 de humano, e uma cauda poli(a) (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 14).

[00159] Em algumas modalidades, o polirribonucleotídeo é um polirribonucleotídeo modificado com um nível e/ou tipo de modificação selecionado de qualquer nível e/ou tipo aqui apresentado.

[00160] Em certas modalidades, a identidade percentual de um polirribonucleotídeo é medida apenas com relação à porção de sequência que codifica CCDC39 de SEQ ID NO: 2 ou 12 a 14 (por exemplo, UTRs, outras sequências não codificantes e etiquetas de GFP ou epítopo não são consideradas durante o cálculo de identidade percentual, e o polirribonucleotídeo pode ou não conter tais regiões).

[00161] Em certas modalidades de quaisquer dos precedentes, tal polirribonucleotídeo (ou polirribonucleotídeo modificado) codifica uma proteína CCDC39 funcional.

[00162] A presente descrição também se refere a um polirribonucleotídeo que codifica MCIDAS de humano da maneira mostrada em SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos precedentes, ou outros, e modalidades da descrição, o polirribonucleotídeo ou polirribonucleotídeo modificado codifica MCIDAS de humano e compreende uma sequência primária que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92% ou pelo menos 95% idêntica (por exemplo, pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% idêntica) à SEQ ID NO: 4 (por exemplo, à sequência apresentada em SEQ ID NO: 4). Em certas modalidades, o dito polirribonucleotídeo contém em sua extremidade 5’ uma parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, um elemento de Kozak, seguido por uma sequência com códon otimizado que codifica uma versão funcional de um MCIDAS de humano proteína, uma UTR 3’ opcional que também funciona como sítio de ligação ao iniciador reverso para produção de molde baseado em PCR, bem como

62 / 141 uma cauda poli(a). Em algumas modalidades, o polirribonucleotídeo é um polirribonucleotídeo modificado com um nível e/ou tipo de modificação selecionado de qualquer nível e/ou tipo aqui apresentado. Em certas modalidades, a identidade percentual de um polirribonucleotídeo é medida apenas com relação à porção de sequência que codifica MCIDAS de SEQ ID NO: 4 (por exemplo, UTRs, outras sequências não codificantes e etiquetas de GFP ou epítopo não são consideradas durante o cálculo de identidade percentual, e o polirribonucleotídeo pode ou não conter tais regiões). Em certas modalidades de quaisquer dos precedentes, tal polirribonucleotídeo (ou polirribonucleotídeo modificado) codifica uma proteína MCIDAS funcional.

[00163] Para propósitos de determinar identidade percentual de uma primeira sequência com relação a uma segunda sequência, um análogo (por exemplo, metilcitidina) corresponde à citidina, etc. Em certas modalidades, o termo “sequência primária” pode ser usado para se referir a uma sequência de polinucleotídeo independentemente, ou ao nível de modificação, de maneira tal que uma sequência primária idêntica a CUCUCUA possa incluir esta sequência, independente de qualquer um ou todos os nucleotídeos citados serem modificados (por exemplo, análogos de qualquer um ou mais de C, U e A podem estar presentes e são considerados a mesma sequência primária).

[00164] Em certas modalidades, a identidade percentual é determinada apenas por referência à porção de uma dada sequência listada que corresponde à sequência codificante, por exemplo, para CCDC40 ou CCDC39. Embora em outras modalidades, a identidade percentual é determinada por referência tanto à sequência codificante quanto a uma ou mais sequências não codificantes. Em certas modalidades, a identidade percentual é determinada através do tamanho total de uma sequência listada (por exemplo, por referência ao tamanho total de uma sequência listada na sequência de listagem aqui).

[00165] A presente invenção se refere além disso a um método para

63 / 141 analisar o efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese, em que o dito polirribonucleotídeo codifica uma proteína envolvida em, e/ou exigida por, ciliogênese, o dito método compreendendo as etapas de: (a) obter uma escova nasal de um sujeito com uma ciliopatia, a dita escova nasal compreendendo células basais não diferenciadas e células ciliadas diferenciadas, (b) cultivar as células obtidas da etapa (a) as uma cultura de célula submersa para obter células basais não diferenciadas e células ciliadas desdiferenciadas, (c) cultivar células basais não diferenciadas e células ciliadas desdiferenciadas obtidas a partir da etapa (b) como uma cultura de célula de interface ar-líquido e realizar um air-lift, (d) transfectar células obtidas da etapa (c) com um polirribonucleotídeo que codifica uma proteína envolvida em, e/ou exigida por, ciliogênese, (e) cultivar as células transfectadas obtidas da etapa (d) para obter células ciliadas diferenciadas, e (f) determinar o efeito do dito polirribonucleotídeo na ciliogênese usando uma medição de lactato desidrogenase, um ensaio NucGreen, uma microscopia de vídeo de alta velocidade, uma medição de frequência de batimento ciliar, um ensaio de eliminação mucociliar, e/ou coloração de imunofluorescência.

[00166] Para obter células do epitélio respiratório de um paciente, uma escova nasal é vantajosa, pois é de fácil manuseio e o procedimento é rápido e indolor para o paciente. As células obtidas a partir de uma escova nasal compreendem células basais não diferenciadas e células ciliadas diferenciadas que podem ser cultivadas como uma cultura de células submersas. Cultivando as células como cultura de células submersas, células basais não diferenciadas e células ciliadas desdiferenciadas podem ser obtidas, uma vez que as

64 / 141 condições submersas induzem uma desdiferenciação de células epiteliais. As células ciliadas desdiferenciadas assim obtidas, bem como as células basais indiferenciadas da escova nasal, devem então ser cultivadas como uma cultura de células de interface ar-líquido (ALI).

[00167] Uma cultura de células de interface ar-líquido da etapa (c) se refere a uma cultura de células que é caracterizada pela superfície basal das células estar em contato com um meio de cultura líquido, ao passo que a superfície apical está exposta ao ar. As células podem ser semeadas, por exemplo, em uma membrana permeável de uma inserção de cultura de células, que é inicialmente fornecida com meio de cultura para os compartimentos apical e basal. Isso também pode ser referido como "cultura de células submersas". Uma vez que a confluência é atingida, as células são então submetidas a uma etapa de “air-lift”, onde o meio é fornecido apenas para a câmara basal. Isso mimetiza as condições encontradas, por exemplo, no sistema respiratório e induz a diferenciação celular, incluindo ciliogênese em células ciliares não diferenciadas. Assim, células que mimetizam o epitélio do sistema respiratório, incluindo, por exemplo, células basais e ciliadas, podem ser obtidas para investigação adicional in vitro.

[00168] As células que mimetizam o epitélio obtidas podem então ser transfectadas com um polirribonucleotídeo que codifica uma proteína envolvida e/ou exigida para a ciliogênese. Assim, o referido polirribonucleotídeo é introduzido nas células, o que pode ser feito artificialmente por infecção viral ou por meios diferentes da infecção viral para expressar o polirribonucleotídeo exógeno nas células. As células transfectadas são então cultivadas para obter células ciliadas diferenciadas a partir de células ciliadas basais e não diferenciadas. Assim, o efeito de um polirribonucleotídeo como um RNAm na ciliogênese pode ser determinado in vitro conservando ao mesmo tempo um ambiente das células que mimetiza o epitélio do sistema respiratório, uma vez que pode ser encontrado, por

65 / 141 exemplo, em um sujeito.

[00169] O efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese pode ser determinado por vários métodos conhecidos pelos versados na técnica. Esses métodos incluem, por exemplo, uma medição de lactato desidrogenase, um ensaio NucGreen, uma microscopia de vídeo de alta velocidade, uma medição de frequência de batimento ciliar, um ensaio de eliminação mucociliar, e/ou coloração de imunofluorescência. Assim, uma medição de lactato desidrogenase (LDH) pode ser realizada para determinar a quantidade de LDH liberada no ambiente ao redor das células. O respectivo ensaio pode ser um ensaio colorimétrico, em que a quantidade de LDH liberada é medida com uma reação enzimática que converte, por exemplo, iodonitrotetrazólio ou um sal de tetrazólio em um formazan de cor vermelha. Assim, o ensaio pode ser facilmente lido por espectroscopia.

[00170] Alternativamente, ou adicionalmente, um ensaio NucGreen pode ser realizado. NucGreen é uma coloração de ácido nucléico fluorescente verde permanente, mediante a ligação aos ácidos nucléicos, e pode ser usado para investigar efeitos de transfecção relacionados à toxicidade, por exemplo. Alternativamente, ou adicionalmente, a coloração de imunofluorescência da proteína codificada pelo polirribonucleotídeo transfectado pode ser realizada para determinar sua quantidade e localização celular, incluindo a co- localização com outras proteínas. Para determinar a quantidade da proteína expressa, também é possível usar a tecnologia Western Blot.

[00171] Além disso, defeitos estruturais ciliares ou falta de cílios podem ser detectados, por exemplo, usando microscopia especializada. Os testes de triagem incluem a medição da taxa de produção de óxido nítrico nasal, motilidade ciliar por microscopia de vídeo de alta velocidade de células nasais, ou testes in vivo, incluindo um teste de sacarina, por exemplo. Um diagnóstico mais específico requer, por exemplo, o exame dos cílios por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

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[00172] Alternativamente, ou adicionalmente, a medição da frequência do batimento ciliar pode ser aplicada para investigar a frequência do batimento, o número de cílios e células ciliadas batendo, e a sincronicidade do batimento usando microscopia de vídeo de alta velocidade. O mesmo se aplica aos ensaios de eliminação mucociliar que podem ser realizados para determinar a taxa de eliminação do muco que é afetada pela função ciliar.

[00173] Em relação ao polirribonucleotídeo a ser empregado no método descrito, o mesmo se aplica, da maneira descrita anteriormente, em relação à composição farmacêutica da presente invenção para uso no tratamento de uma ciliopatia. Além disso, também as outras características de tal polirribonucleotídeo podem ser da maneira descrita anteriormente.

[00174] Além disso, o polirribonucleotídeo pode conter uma sequência que codifica um marcador. Os exemplos incluem tdTomato (da maneira compreendida, por exemplo, em SEQ ID NO: 3), proteína fluorescente verde (GFP) e GFP intensificada (eGFP), da maneira descrita nos exemplos anexos, juntamente com os respectivos métodos de detecção. Isto é especialmente vantajoso para validar uma transfecção satisfatória de uma célula com o polirribonucleotídeo.

[00175] Em algumas modalidades do método para analisar o efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese, as células são transfectadas em 0 a 12 dias, preferivelmente em 0 a 11 dias, mais preferivelmente em 0 a 6 dias, ainda mais preferivelmente 0 a 4 dias, e acima de tudo preferivelmente 0 a 48 horas após o air-lift ser realizado na etapa (c). Isso é vantajoso, uma vez que a etapa de air-lift induz ciliogênese de células ciliares basais e não diferenciadas.

[00176] Em algumas modalidades do método para analisar o efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese, as células são transfectadas com um polirribonucleotídeo, preferivelmente um RNAm, que codifica uma proteína envolvida em, e/ou exigida por, ciliogênese usando um lipidoide com a

67 / 141 estrutura mostrada na fórmula (V), (VI) e/ou (VII).

[00177] Em algumas modalidades do método para analisar o efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese, as células são cultivadas nas etapas (b) a (e) usando Meio G. A composição do Meio G é tipicamente da maneira mostrada na Tabela 2). Tabela 2 Substância Volume Concentração final DMEM/Ham’s F12 100 mL Ultroser G 2 mL 2% Clone fetal II 2 mL 2% Insulina 100 µL 2,5 µg/mL Extrato de cérebro bovino 250 µL 22,5 µg/mL Transferrina 100 µL 2,5 µg/mL Hidrocortisona 20 µL 20 nM 3,3’,5-Triiodo-L-tironina 3,33 µL 500 nM Epinefrina 10 µL 1,5 µM Ácido retinóico 10 µL 10 nM Fosforiletanolamina 5 µL 250 nM Etanolamina 100 µL 250 nM DAPT 10 µL 1 µM

[00178] Em algumas modalidades do método para analisar o efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese, as células são cultivadas nas etapas (b) a (e) usando um dos meios mostrados na Tabela 3. Os meios mostrados na Tabela 3 são alguns meios disponíveis comercialmente no mercado que podem ser usados para crescer cultura ALI. Tabela 3 Fornecedor Fase de Crescimento Fase de Diferenciação LONZA ALI-G ALI-D StemCell ALI-Ex ALI-M Epithelix MucilAir MucilAir PELOBiotech Pelo Pelo

[00179] Em algumas modalidades do método para analisar o efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese, a escova nasal compreende adicionalmente fibroblastos e na qual o crescimento dos referidos fibroblastos é inibido nas etapas (b) a (e). Isto é vantajoso porque os fibroblastos crescem mais rápido em comparação com as células ciliares basais e não diferenciadas e podem, assim, dificultar a investigação do efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese, da maneira descrita anteriormente.

[00180] Antes de transferir as células para o frasco da fase estacionária,

68 / 141 os fibroblastos podem ser separados do resto das células em virtude de um período de incubação curto, de 1 a 2 horas. Durante esse tempo, os fibroblastos podem se estabelecer e aderir ao frasco de células. Todas as outras células permanecem no meio como células em suspensão e podem ser facilmente transferidas depois para o “frasco da fase estacionária”.

[00181] O método de acordo com a presente invenção resulta preferivelmente na identificação de um polirribonucleotídeo que tem um efeito positivo na ciliogênese, e que pode ser usado para restaurar a estrutura da célula ciliar em função e, assim, em uma composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto, e seu uso em tratar uma ciliopatia em um sujeito que sofre de uma ciliopatia de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Assim, em relação às características do polirribonucleotídeo, o mesmo se aplica da maneira descrita anteriormente, em conexão com a composição farmacêutica da presente invenção para a utilização no tratamento de uma ciliopatia. Além disso, também as outras características de tal polirribonucleotídeo podem ser da maneira descrita anteriormente.

[00182] Figura 1: Eficiência de tradução de RNAm de CCDC40. 2/1,4/0,3/0,2/0,05x10^6 células HEK293 foram semeadas em placas de 6 poços. 24 horas após semeadura, as células foram transfectadas com diferentes construções de CCDC40 (ETH031T06-T10, 2,5 µg/9,5 cm²) usando Lipofectamine 2000. Lise celular foi realizada 6, 24, 48, 72 e 144 horas após transfecção. 50 µg de lisado proteico total foram analisados com SDS-PAGE e Western Blot. CCDC40 foi detectado usando anticorpo anti- CCDC40 (HPA022974) de Atlas Antibodies (1:2000). GAPDH funcionou como um controle de carga. GFP funcionou como um controle de transfecção.

[00183] Figura 2: Eficiência de tradução de RNAm de construções de CCDC40 em BEAS-2B, RPMI2650, e células HEK293: 2x10^6 HEK293, 7,5x10^5 BEAS-2B e 5x10^5 células RPMI 2650 foram semeadas em placas de 6 poços. 24 horas após semeadura, as células foram transfectadas com

69 / 141 diferentes construções de CCDC40 (2,5 µg/9.5 cm²) usando Lipofectamine

2000. Lise celular foi realizada 6 horas após transfecção. lisados proteicos foram analisados com SDS-PAGE e Western Blot (HEK293: 50 µg, RPMI 2650: 20 µg, BEAS-2B: 30 µg de lisado total). CCDC40 foi detectado usando anticorpo anti-CCDC40 (HPA022974) de Atlas Antibodies (1:2000).

[00184] Figura 3: Resultados de microscopia de vídeo de alta velocidade (HSVM) após a transfecção de LF92/CCDC40. Culturas de ALI derivadas de pacientes foram transfectadas em dias alternados com 3 µg de LF92/CCDC40. Antes da transfecção e a cada 24 horas após a transfecção, vídeos (20 por inserção) foram feitos e CFB (frequência de batimento ciliar) foi calculado usando o software SAVA (Sisson-Ammons Video Analysis). Ao todo, 16 transfecções (1 mês) foram realizadas. A medição foi realizada a 37°C usando a magnificação 40x. São calculados os valores médios das medições de frequência de batimento ciliar (Whole Field Analysis, WFA)

[00185] Figura 4: Eliminação mucociliar (MCC) mostrada como projeção Z e Polargraph. A cultura de ALI do paciente CCDC40 foi transfectada com RNAm/LF92 de CCDC40 em uma concentração de 3 µg/inserção, 18 dias mediantes air-lift. As culturas ALI foram mantidas em Meio G durante o experimento. As transfecções (TFs) foram realizadas uma vez por semana durante 4 semanas (= 4x TF). A eliminação mucociliar (MCC) foi medida usando 0,5 pm de esferas fluorescentes com ampliação de 20x. Vídeos de 30 segundos de diferentes áreas foram feitos e analisados com o software Polargraph da Nikon uma semana após o último TF. Uma imagem exemplar é mostrada.

[00186] Figura 5: Eliminação mucociliar (MCC) mostrada como Projeção Z (lado superior esquerdo) e Polargraph (lado superior direito) para um tdTomato, e Polargraph de um controle saudável (lado inferior direito). Linha superior: as células do paciente com mutação CCDC40 em cultura ALI foram transfectadas com RNAm de tdTomato/ LF111 em uma concentração

70 / 141 de 3 μg/inserção, 18 dias após air-lift. As culturas ALI foram mantidas em Meio G durante o experimento. As transfecções (TFs) foram realizadas uma vez por semana durante 4 semanas (= 4x TF). A eliminação mucociliar (MCC) foi medida usando 0,5 µm de esferas fluorescentes com uma ampliação de 30x. Vídeos de 20 segundos de diferentes áreas foram feitos e analisados com o software Polargraph da Nikon uma semana após a última TF. Um vídeo exemplar foi mostrado. Lado inferior direito: rastreamento de partículas de cultura WT ALI saudável. MCC foi avaliada usando esferas fluorescentes de 0,5 µm com ampliação de 20x. Vídeos de 20 segundos de diferentes áreas foram realizados e analisados com o software Polargraph da Nikon uma semana após a última TF. Uma imagem exemplar e duas ROIs analisadas são mostradas.

[00187] Figura 6: Células de paciente com mutação CCDC40 em cultura ALI foram transfectadas com RNAm de tdTomato/LF111 ou com RNAm de CCDC40/LF92 em uma dose de 3 µg/inserção, 18 dias mediante air-lift. As culturas ALI foram mantidas em Meio G durante o experimento. As transfecções (TFs) foram realizadas uma vez por semana durante 4 semanas (= 4x TF). Como controle, foram usados WT ALI de escovas nasais saudáveis. Amostras para crioincorporação foram preparadas uma semana após a última TF. Membranas ALI tratadas com RNAm de CCDC40 e RNAm de tdTomato foram cortadas em 20 µm e coradas com anti-GAS8 (vermelho), anti-tubulina acetilada (verde) e DAPI (azul). As fotos foram tiradas com o microscópio confocal. Uma imagem exemplar é mostrada. A barra de escala representa 10 µm.

[00188] Figura 7: Células de paciente com mutação de CCDC40 em cultura ALI foram transfectadas tanto com RNAm de tdTomato/LF111 quanto com RNam de CCDC40/LF92 em uma dose de 3 µg/inserção, 18 dias mediante air-lift. As culturas ALI foram mantidas em Meio G durante o experimento. As transfecções (TFs) foram realizadas uma vez por semana

71 / 141 durante 4 semanas (= 4x TF). Como um controle, ALI de controles saudáveis foram usados. Amostras para crioincorporação foram preparadas uma semana após a última TF. Membranas ALI tratadas com RNAm de CCDC40 e RNAm de tdTomato foram cortadas em 20 µm e coradas com anti-DNALI1 (vermelho), anti-tubulina acetilada (verde) e DAPI (azul). As fotos foram tiradas com o microscópio confocal. Uma imagem exemplar é mostrada. A barra de escala representa 10 µm.

[00189] Figura 8: Células de paciente com mutação de CCDC40 em cultura de ALI foram transfectadas tanto com RNAm de tdTomato/LF111 quanto com RNAm de CCDC40/LF92 em uma dose de 3 µg/inserção, 18 dias mediante air-lift. As culturas ALI foram mantidas em Meio G durante o experimento. As transfecções (TFs) foram realizadas uma vez por semana por 4 semanas (= 4x TF). Como um controle, ALI de controles saudáveis foram usadas. Amostras para crio-incorporação foram preparadas uma semana após a última TF. Membranas ALI tratadas com RNAm de CCDC40 e RNAm de tdTomato foram cortadas em 20 µm e coradas com anti-CCDC39 (1:200, vermelho), tubulina anti-acetilada (1:10.000, verde) e DAPI (azul). Fotos foram tiradas com o microscópio confocal. Uma imagem exemplar é mostrada. Ampliação 40x.

[00190] Figura 9: a expressão de proteína CCDC39 (110 kDa) em HEK-293 & BEAS-2B, 6 horas & 24 horas após transfecção. 1,4x10^5 células HEK-293 e 3,5x10^5 células BEAS-2B foram semeadas em placas de 6 poços e transfectadas com CCDC39-RNA (ETH047T02, UTR 5´ mínima, Lipofectamine MessengerMax; Razão 1:1,5). Após 6 horas e 24 horas, as células foram lisadas com M-PER e com tampão Triton X-100. 50 µg de lisado de proteína foram usados por análise Western blot. Como um controle, o lisado de células transfectadas EGFP e não transfectadas (UT) foi usado. Dose alta = 0,5 µg/cm2, dose baixa = 0,25 µg/cm2.

[00191] Figura 10: Expressão de proteína CCDC39 (110 kDa) em

72 / 141 culturas ALI não tratadas. Duas inserções foram extraídas usando o protocolo de extração axonemal. 30, 10 e 5 µL de lisado de proteína foram usados para análise Western blot. Área ativa: Inserção 39,9 = 71,25%, Inserção 41,2 = 59,88%.

[00192] Figura 11: Expressão de proteína CCDC39 (110 kDa) em 16HBE14o- após tratamento com inibidor de proteassoma. 6,0x10^5 células 16HBE14o- foram semeadas em placas de 6 poços e transfectadas com CCDC39-RNA (Lipofectamine MessengerMax; Razão 1:1,5). Após 6 horas, as células foram lisadas com tampão M-PER. 20 µg de lisado de proteína foram usados para análise de Western blot. Como um controle, lisado de células transfectadas EGFP e não transfectadas (UT) foi usado. Dose alta = 0,5 µg/cm2, Dose baixa = 0,25 µg/cm2. RNA: ETH047T02: UTR 5´ mínima, ETH047T03: TISU, ETH047T04: CYBA, ETH047T05: SP30.

[00193] Figura 12: Expressão de proteína CCDC39 (110 kDa) em 16HBE14o- após tratamento com inibidor de proteassoma. 6,0x10^5 células 16HBE14o- foram semeadas em placas de 6 poços e transfectadas com CCDC39-RNA (ETH047T03, TISU 5´UTR, Lipofectamine MessengerMax; Razão 1:1,5). Após 24 horas, as células foram lisadas com tampão M-PER. 20 µg de lisado de proteína foram usados para análise Western blot. Como um controle, o lisado de células transfectadas EGFP e não transfectadas (UT) foi usado. Dose alta = 0,5 µg/cm2, dose baixa = 0,25 µg/cm2.

[00194] Outros aspectos e vantagens da invenção serão descritos nos exemplos a seguir, os quais são fornecidos com propósitos de ilustração e não a título de limitação. Cada publicação, patente, pedido de patente ou outro documento citado neste pedido é aqui incorporado pela referência na sua íntegra. Exemplos

[00195] Métodos e materiais são aqui descritos para uso na presente descrição; outros métodos e materiais adequados conhecidos na técnica

73 / 141 também podem ser usados. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendidos como limitantes. I. Material e Métodos Materiais, Dispositivos, Software e Sistemas de teste usados

[00196] Os materiais são listados na Tabela 4. Tabela 4 Substância/Consumível/Química Fornecedor Cat # DPBS (sem Mg2+/Ca2+) Thermo Fisher Scientific 14190-169 Meio LHC-9 Thermo Fisher Scientific 12677019 DMEM (1x) - GlutaMAX™ Suplemento Thermo Fisher Scientific 21885 BEAS-2B ATCC CRL 9609 HEK 293 DSMZ ACC305 Inibidor de tripsina Thermo Fisher Scientific R007100 RPMI 2650 DSMZ ACC207) Fibronectina Merck Millipore FC010 Colágeno Corning Incorporated 354236 Pierce™ Albumina sérica bovina Thermo Fisher Scientific 23209 DPBS (com Mg2+/Ca2+), para aerógrafo Thermo Fisher Scientific 14040133 Lipofectamine® 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027 Raspadores de célula Corning® Corning Incorporated CORN3010 Inibidor de protease completo Sigma Aldrich 11873580001 Kit de ensaio de proteína BCA Pierce™ Thermo Fisher Scientific 23225 Tampão de amostra Bolt LDS (4x) Thermo Fisher Scientific B0007 Agente redutor de amostra Bolt (10x) Thermo Fisher Scientific B0009 Padrões de duas cores Precision Plus Protein™ BIO-RAD 161-0374 Trans-Blot Turbo Transfer Pack Mini 0,2μm PVDF BIO-RAD 1704156 Substrato Luminata Crescendo Western HRP Merck Millipore WBLUR0500 mAb de coelho GAPDH (D16H11)XP® Cell Signaling 5174 Anticorpo anti-CCDC40 Sigma Aldrich HPA022974 IgG-HRP anti-coelho de cabra Santa Cruz sc-2004 Escova coletora de célula Celletta™ Engelbrecht Medizin-und 9100060 Labortechnik Ultroser G Pall Life Sciences 15950 Gelatina Caelo 01704140 NaCl Carl Roth 0601.1 TRIS Carl Roth AE15.3 TRIS/HCl Carl Roth A9090.3 EDTA Carl Roth X986.1 NaOH (32%) Carl Roth T196.1 FBS (cultura submersa) Thermo Fisher Scientific 10500-064 Penicilina-Estreptomicina Thermo Fisher Scientific 15140-122 Colágeno I, cauda de rato Gibco A1048301 Ácido acético 100% Carl Roth 3738.1 Corning Transwell Costar 3470 Tripsina/EDTA 1x Sigma Aldrich T3924 Colagenase tipo 4 Worthington Biochemical LS004188 Company Antibióticos/Antimicóticos 100 x Thermo Scientific 15240 Meio PneumaCult ALI STEMCELL Technologies 5001 Sacarose (CAS# 57-50-1) Sigma Aldrich S1888 Kit de ensaio de citotoxicidade de lactato Pierce Biotechnology 88954 desidrogenase Reagente NucGreen™ Dead 488 ReadyProbes® Life Technologies R37109

74 / 141 Substância/Consumível/Química Fornecedor Cat # Conectar NaCl 0,9% Mini-Plasco® (Solução salina BBraun 9511711 isotônica) FBS (cultura ALI) Thermo Fisher Scientific A3160801 Meio de incorporação congelado Shandon Thermo Fisher Scientific 6769006 Cryomatrix™ Lâminas Superfrost Ultra Plus Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ Paraformaldeído Sigma Aldrich P6148 Soro de cabra Abcam Ab7481 BSA livre de IgG livre de protease Jackson Immunoresearch 001-000-161 Leite desnatado (Blotting Grade) Carl Roth T145.2 Hoechst33342 Thermo Fisher Scientific H3570 Anticorpo monoclonal alfa-tubulina anti-acetilado Sigma Aldrich T6793 Anticorpo policlonal anti-CCDC40 Proteintech 25049-1-AP Anticorpos policlonal anti-CCDC39 Atlas antibodies HPA035364 Anticorpo Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A11035 Anticorpo Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11029 Insulina Sigma Aldrich I9278 Extrato de cérebro bovino Lonza CC-4098 Transferrina Sigma Aldrich T8158 Hidrocortisona Sigma Aldrich H4001 Sal de sódio de 3,3’,5-Triiodo-L-tironina Sigma Aldrich T6397 Epinefrina Sigma Aldrich E4642 Ácido retinóico Sigma Aldrich R2625 Fosforiletanolamina Sigma Aldrich P0503 Etanolamina Sigma Aldrich E0135 DAPT Tocris 2634 PBS (sem Mg2+/Ca2+) Thermo Fisher Scientific 14190-94 PBS 10x (com Mg2+/Ca2+) Thermo Fisher Scientific AM9625 Triton-X 100 (cultura ALI) Sigma Aldrich T8787 Triton X-100 (cultura submersa) Sigma Aldrich T9284 DMEM/Ham’s F-12 1:1 Invitrogen 11039 Ultroser G Pall Life Sciences 15950-017 Plasmídeo circular Ethris BstBI New England BioLabs Clorofórmio Sigma Aldrich 288306 Etanol Sigma Aldrich 34852-M Análogo ARCA cap Jena Biosciences Citidina-5´-trifosfato Jena Biosciences 5-Iodocitidina-5´-trifosfato Jena Biosciences Uridina-5´-trifosfato Jena Biosciences 5-Iodouridina-5´-trifosfato Jena Biosciences Citidina-5´-trifosfato Jena Biosciences 5-Iodocitidina-5´-trifosfato Jena Biosciences Uridina-5´-trifosfato Jena Biosciences 5-Metil-uridina-5´-trifosfato Jena Biosciences DNaseI Thermo Fisher Scientific Acetato de amônio Sigma Kit de desfosforilação rápida New England BioLabs Poli(a) polimerase New England BioLabs β-Mercaptoetanol Sigma-Aldrich M3148 Placa de 6-poços Omnilab CORN3506 Kit de ensaio de proteína BCA Thermo Fisher Scientific 23225 Antioxidante Bolt Thermo Fisher Scientific BT0005 Gel SDS-PAGE 4 a 12% BoltTM Thermo Fisher Scientific NW04120BOX Tampão de corrida MES SDS Bolt™ (20x) Thermo Fisher Scientific B0002 Completo, coquetel inibidor de protease livre de Sigma-Aldrich 11873580001

EDTA Solução de DNase I (2500 U/mL) Thermo Fisher Scientific 90083

75 / 141 Substância/Consumível/Química Fornecedor Cat # DPBS Life Technologies 14040133 DTT Sigma Aldrich 646563 EDTA Carl Roth 8040.3 FBS inativado pelo calor Thermo Fisher Scientific 10500064 HEPES Carl Roth HN78.2 Meio LHC-9 Thermo Fisher Scientific 12680013 Substrato Luminata Classico Western HRP Merck Millipore WBLUC0500 MEM GlutaMax Thermo Fisher Scientific 41090028 Tampão M-PERTM Thermo Fisher Scientific 78501 MgSO4 Carl Roth T888.1 Penicinila/Estreptomicina Thermo Fisher Scientific 15140122 SDS 10% Thermo Fisher Scientific 24730020 Desoxicolato de sódio Sigma-Aldrich D6750-10G SuperSignalTM West Festo Thermo Fisher Scientific 34095 Frascos T175 Corning/Omnilab CORN431080 Frascos T75 Corning/Omnilab CORN430641 Trans-Blot® Turbo™ Mini PVDF Transfer Packs Bio-Rad 1704156 Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-100ML TRYPSIN-EDTA (0,05%) Thermo Fisher Scientific 25300054 Reagente de transfecção Lipofectamine® Thermo Fisher Scientific LMRNA003 MessengerMAX™ Água bidestilada Kerndl 22501 Membranas ALI Sigma-Aldrich CLS3470 Substrato Luminata Forte Western HRP Merck Millipore WBLUF0500 MMRB (conferir Tabela 18) Nitrogênio líquido WFI B Braun 3703444 T7 RNA Polimerase Thermo Fisher Scientific Pirofosfatase inorgânica Thermo Fisher Scientific Inibidor de RNAse Thermo Fisher Scientific HCL Roth 4625.2 Frascos T175 (CORN431080) Corning/Omnilab Frascos T75 (CORN430641) Corning/Omnilab

[00197] Os dispositivos são listados na Tabela 5. Tabela 5 Dispositivo Fornecedor Leitor de placas Tecan Infinite® 200 PRO Tecan Thermomixer® C Eppendorf Power PAC 300 BIO-RAD Sistema de transferência Trans-Blot® Turbo™ BIO-RAD Sistema ChemiDoc™ XRS BIO-RAD Leitor TriStar2 Multimode LB 942 Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany Microscopia de vídeo em alta velocidade Ammons Engineering, Mt Morris, MI, USA Nikon Eclipse Ti-S Nikon MEA53300 ELWD 40x S Plan Fluor o Nikon, MEA48430 Sistema de aquecimento Minitube SC300 Minitube International AG Lâminas Superfrost Ultra Plus Thermo Fisher Scientific Corte de filtro 100 MWCO Sartorius Cryostat Microm HM560 Microm ChemiDoc Bio-Rad Dispositivo de contagem de célula Countess (C10281) Thermo Fisher Scientific Microscópio de fluorescência (DMi8) Leica Tanque Mini Gel Thermo Fisher Scientific Sistema de transferência Trans-Blot® Turbo™ Bio-Rad Tubos Lysing Matrix A MP Biomedicals MP FastPrep-24 (HOM-1) MP Biomedicals

76 / 141 Dispositivo Fornecedor Microplacas pretas de 96 poços (655090) Greiner

[00198] O software é listado na Tabela 6. Tabela 6 Software Provider Software de análise de dados Magellan™ Tecan Image Lab™ BIO-RAD Análise de vídeo Sisson-Ammons (software SAVA) Ammons Engineering, Mt Morris, MI, USA Megaplus câmera modelo ES 310 turbo Redlake Inc., USA Pesquisa básica NIS-Elements Nikon Software Nikon NIS Elemets AR Nikon

[00199] O sistema de teste é listado em Tabela 7. Tabela 7 Sistema de Teste Espécie Cepa HEK 293 Rim embrionário primário humano DSMZ no.: ACC305 RPMI 2650 Carcinoma de célula escamosa anaplásica DSMZ no.: ACC207 BEAS-2B Epitélio brônquico ATCC no.: CRL 9609 I. Cultura de célula submersa

1. Cultivo

[00200] As linhagens celulares foram cultivadas em uma incubadora de células, em atmosfera umidificada a 37°C e teor de 5% de CO2. Todos os reagentes e soluções foram aquecidos a 37°C em banho-maria antes do uso.

[00201] Células confluentes (cerca de 90%) foram primeiro lavadas com 20 mL de DPBS (sem Mg2+/Ca2+) para remover células mortas. Para separar as células, 2 mL de solução de Tripsina/EDTA (0,05%) foram adicionados por frasco. As células foram então incubadas a 37 ° C até ocorrer a separação das células. 8 mL do respectivo meio foram usados para parar a Tripsina. Em decorrência de o Meio LHC-9 estar quase livre de soro, pelo menos um volume igual de inibidor de tripsina foi adicionado às células BEAS-2B separadas para inativar a tripsinização. A solução da célula teve que ser centrifugada posteriormente por 5 minutos (min) em 1.100 revoluções por minuto (rpm) para remover o inibidor de tripsina novamente. O precipitado foi então resolvido no meio. Para passagem, as células foram divididas em proporções diferentes de acordo com o uso a seguir. HEK 293 (DSMZ no.: ACC305)

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[00202] Esta linhagem celular estabelecida foi de um rim embrionário primário humano transformado por adenovírus tipo 5 (AD5). Foi cultivada em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) - GlutaMAX ™ suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (h.i.) (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Esta linhagem celular foi dividida duas vezes por semana. RPMI 2650 (DSMZ no.: ACC207)

[00203] Essa linhagem celular teve origem no derrame pleural de um homem de 52 anos com carcinoma espinocelular anaplásico de septo nasal. Foi escolhida em decorrência da morfologia ciliada epitelóide e da semelhança com o epitélio bronquiolar. Também foi cultivada em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) - Suplemento GlutaMAX ™ com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (h.i.) (FBS) + 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) + solução 1x de aminoácido não essencial (NEAA). Esta linhagem celular foi dividida 1 a 2 vezes por semana. BEAS-2B (ATCC no.: CRL 9609)

[00204] Células BEAS-2B foram derivadas de epitélio brônquico normal, obtido de autópsia de indivíduos não cancerosos. As células foram então infectadas com um híbrido SV40/adenovírus 12 com defeito de replicação e clonadas. O meio de cultura utilizado foi o LHC-9 com modificação, sem aditivos. Também foram divididas 1 a 2 vezes por semana, dependendo da confluência.

[00205] Os frascos uados para células BEAS-2B foram revestidos com uma mistura de 0,01 mg/mL de fibronectina, 0,03 mg/mL de colágeno e 0,01 mg/mL de albumina sérica bovina dissolvida em LHC-9. A mistura foi adicionada em uma razão de 0,2 mL por cm2 de área de superfície. Posteriormente, foi necessária incubação a 37°C por pelo menos 6 horas. Antes da adição das células, os frascos foram lavados três vezes com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) sem Mg2+/ Ca2+.

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2. Transcrição in vitro

[00206] Para gerar moldes para a transcrição in vitro, os plasmídeos circulares foram linearizados por digestão de restrição com BstBI e purificados adicionalmente por precipitação com clorofórmio e etanol.

[00207] RNAm foi produzido usando uma mistura de transcrição in vitro padrão (incluindo nucleotídeos trifosfato modificados indicados) contendo T7 RNA polimerase, pirofosfatase inorgânica e inibidor de RNase. A cobertura co-transcricional foi atingida pela adição de um análogo de cap ARCA. Para a transcrição in vitro de RNA quimicamente modificado, 7,5% de Citidina-5'-Trifosfato foram substituídos por 5-lodocitidina-5'-Trifosfato e 30% de Uridina-5'-Trifosfato foram substituídos por 5-Iodouridina-5'- Trifosfato (Jena Biosciences), respectivamente (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 1). Em outra configuração de produção de RNA quimicamente modificado, 3% de Citidina-5'-Trifosfato foram substituídos por 5- lodocitidina-5'-Trifosfato e 15% de Uridina-5'-Trifosfato foram substituídos por 5-Metil-Uridina-5'-Trifosfato (Jena Biosciences), respectivamente (conferir, por exemplo, SEQ ID NO: 2). O DNA molde residual foi digerido usando DNasel. Subsequentemente, RNAm foi purificado por precipitação com acetato de amônio, seguido por uma etapa de lavagem usando etanol a 70%.

[00208] A desfosforilação do RNAm não coberto residual foi realizada usando um Kit de desfosforilação rápida, seguido por purificação por precipitação de acetato de amônio, seguido por uma etapa de lavagem usando etanol 70% e ultrafiltração usando um corte de filtro de 100 MWCO.

[00209] O RNAm foi ainda poliadenilado usando uma poli(A)polimerase. Novamente o RNAm foi purificado por precipitação com acetato de amônio, seguido por uma etapa de lavagem usando etanol 70% e ultrafiltração usando um corte de filtro de 100 MWCO. O tamanho de poli(A) foi determinado por eletroforese em gel capilar para estar entre 100 e 250

79 / 141 nucleotídeos.

[00210] Em particular, o RNAm de construções de CCDC40 investigadas neste experimento compreendeu um cap 5’ARCA e PPA, e foram os seguintes: com UTR mínima de Ethris(ETH031T06; T06; SEQ ID NO: 5), com UTR 5’ TISU, mas sem UTR 3’ (ETH031T07; T07; SEQ ID NO: 6), com UTR 5’ hAg, mas sem UTR 3’ (ETH031T08; T08; SEQ ID NO: 7), com UTR 5’ e 3’ CYBA (ETH031T0; T09; SEQ ID NO: 1), e com UTR 5’ de CMV IE9 de humano, e UTR 3’ de hormônio do crescimento humano (ETH031T0; T10; SEQ ID NO: 8).

3. Transfecção

[00211] Para prover pelo menos 90% de confluência, células foram semeadas em placas de 6 poços 24 horas antes da transfecção. As contagens de célula diferiram de acordo com o ponto de tempo de leitura e tipo de célula (comparar Tabela 8). Tabela 8 Células/poço x106 Tempo HEK 293 RPMI 2650 BEAS-2B 6h 2 0,6 0,75 24 h 1,4 0,4 0,5 48 h 1 0,3 - 72 h 0,75 0,2 - 144 h 0,125 0,05 -

[00212] A transfecção foi realizada usando diferentes construções de RNAm de CCDC40, bem como a codificação de RNAm para proteína fluorescente verde intensificar (eGFP) como um controle de transfecção. A transfecção foi realizada usando Lipofectamine®2000 Antes da transfecção, o meio de cultura foi trocado para fornecer as condições ideais para as células. A reação de lipoplex exigiu uma mistura de RNAm/WFI, bem como uma mistura de Lipofectamine®2000/meio. 125 μL de cada mistura foram usados com proporção de volume de 1:2 de RNAm para Lipofectamine®2000, uma vez que os RNAms mostraram uma concentração de estoque de 1 µg/µL. Diferentes concentrações de RNAm foram usadas e a mistura foi ajustada adequadamente (ver Tabela 9 para um esquema de pipetagem exemplar).

80 / 141 Tabela 9 µg RNA/poço RNA em μL +WFI em μL Lipofectamine® 2000 em +meio livre de soro em μL μL 5 5 120 10 115 2,5 2,5 122,5 5 120 1 1 124 2 123

[00213] Após preparar ambas as misturas, a mistura de RNAm/WFI foi adicionada à mistura Lipofectamine®2000/Meio, e a solução foi incubada por ≥ 5 minutos antes de adicioná-la em gotas às células semeadas. Para obter uma melhor viabilidade das células, uma troca de meio adicional foi realizada 4 horas após a transfecção.

4. Western blot de CCDC40 a. Amostragem para Western blot

[00214] Para lise celular, o meio de cultura de transfecção foi removido e as células foram lavadas com DPBS (sem Mg2+/Ca2+) e a seguir raspadas utilizando raspadores de célula Corning®. As células foram lisadas com 100 μL de uma solução de tampão de lise [tampão de lise 10x TritonX-100 (Tris- HCI 250 mM, TritonX-100 a 1%, pH: 7,8) foi ajustado para 1x em WFI e complementado com inibidor de protease completo] antes das amostras serem congeladas a -20 ° C.

[00215] A concentração total de proteína foi determinada usando Kit de ensaio de proteína BCA Pierce™ (ensaio BCA). O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, foi preparada uma diluição 1:50 do reagente de trabalho BCA (WR). 5 μL de cada amostra foram transferidos para uma placa de 96 poços (fundo plano, transparente) e 200 μL de WR foram adicionados por poço. A última etapa foi uma incubação a 37°C por 30 minutos. Os resultados foram medidos em um leitor de placas Tecan Infinite®200 PRO, usando Magellan ™-Software de Análise de Dados. b. Preparação de NET-Gelatina Tabela 10

81 / 141 Substância Concentração final TRIS/HCl, pH 7.5 0,2 M EDTA, pH 8.0 0,05 M Triton-X100 0,5% (v/v) NaCl 1,16 M Gelatina 25/L c. SDS-PAGE e Western blot

[00216] Para realizar a eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio- poliacrilamida (SDS-PAGE), os lisados foram misturados com 5 μL de tampão de amostra Bolt LDS (4x) e 2 μL de agente redutor de amostra Bolt (10x,) e a seguir aquecidos a 70°C por 10 minutos e 350 rpm no Thermomixer®C. Para possibilitar a comparação entre as amostras em um gel, a mesma quantidade de proteína total foi adicionada. 7 μL do marcador (Padrões de cor dupla Precision Plus Protein™) foram preenchidos na primeira bolsa de cada gel, para permitir a estimativa precisa do tamanho da proteína posteriormente. O tanque de gel foi então conectado à fonte de alimentação (Power PAC 300) por 30 minutos em 1 A. Posteriormente, o cassete foi aberto com uma espátula e o gel foi movido para a estação de transferência.

[00217] O sistema de transferência (Trans-Blot® Turbo™ Transfer System, 30 min, 25 V, 1 A) e membranas adequadas (Trans-Blot Turbo Transfer Pack Mini 0,2 μm PVDF) foram usados para transferência, de acordo com as instruções do fabricante. Ao passar um rolo sobre o “sanduíche”, foram eliminadas quaisquer bolhas que pudessem interferir na transferência da proteína. Para bloquear os locais de ligação livres, a membrana foi colocada em uma NET-gelatina e agitada por 60 minutos em um agitador de placa. O gel foi cortado na banda de 75 kD para detectar CCDC40 e gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) ao mesmo tempo. Os anticorpos foram diluídos com NET-gelatina (Anti-CCDC40 1:2000 em 6 mL, GAPDH 1:10.000 em 10 mL de NET-gelatina) e as membranas foram incubadas com seu anticorpo correspondente em um agitador de placa por toda a noite a 4°C. GAPDH funciona como um controle

82 / 141 de carga. Uma lista de anticorpos empregados foi mostrada na Tabela 11. No dia seguinte, a membrana foi lavada três vezes com NET-gelatina por 10 minutos, para remover os anticorpos que não estavam especificamente ligados ou residuais. O anticorpo secundário anti-coelho IgG-HRP de cabra foi diluído 1:10.000 com NET-gelatina. Após uma incubação de 60 minutos em um misturador de placas, em temperatura ambiente (RT), as membranas foram lavadas novamente três vezes por 10 minutos com NET-gelatina. O anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre HRP pode ser detectado por meio de um imageador molecular (Sistema ChemiDoc™ XRS). Portanto, 5 mL de substrato Luminata Crescendo Western HRP foram adicionados ao gel e incubados por 5 minutos. A última imagem que ainda não tinha sido superexposta e a imagem colorimétrica foram mescladas e ilustradas com o software Image Lab™. Além disso, as intensidades da banda foram determinadas posteriormente com Image Lab™. Tabela 11 Nome Fabricante Uso GAPDH (D16H11)XP® mAb de Cell Signalling Anticorpo primário coelho Anti-CCDC40 SIGMA-ALDRICH Anticorpo primário IgG-HRP anti-coelho de cabra SCBT Anticorpo secundário II. Cultura ALI

1. Amostragem de Células Epiteliais Respiratórias Humanas (hREC) a. Escovação Nasal

[00218] O meio RPMI foi aquecido em temperatura ambiente, e a escova foi umedecida com solução salina isotônica estéril. Um coletor de células com escova Celletta ™ com ponta protetora foi aplicado. Após solicitar ao paciente para limpar o nariz, o mesmo teve que se sentar em uma cadeira com a cabeça contra a parede para segurar a cabeça. A escova foi esfregada algumas vezes rapidamente no lado medial e superior do meato nasal inferior, com movimentos rotatórios e lineares. Ao retirar a escova, esta foi imediatamente colocada em um tubo coletor (cornículo de 15 mL) com 5 mL de meio RPMI pré-aquecido. A escova foi agitada vigorosamente dentro

83 / 141 do tubo por pelo menos 40 vezes para separar as células da escova. b. Cultura estacionária

[00219] O tubo foi centrifugado em 900 rpm durante 5 minutos, em temperatura ambiente. Após descartar o sobrenadante, o precipitado foi resolvido em meio UG [DMEM/Ham's F-12 1:1 com 5 mL de anibióticos/micóticos 100x estériis e 10 mL de Ultroser G estéril]. 5 mL de meio foram para um frasco T25 e 25 mL para um frasco T75.

[00220] Tendo transferido as células para o frasco de cultura de células, as células foram incubadas a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 por toda a noite. As células devem ser aderidas após 20 a 24 horas. O meio UG foi substituído 3 vezes por semana (segunda-feira, quarta- feira e sexta-feira).

2. Geração e transfecção de cultura de ALI a. Revestimento de inserções transpoço (0.33 cm²)

[00221] As seguintes placas foram utilizadas para cultura de ALI: Corning Transwell com membrana de poliéster transparente (poros de 0,4 pm, inserções de 6,5 mm de diâmetro, placas de 24 poços). O colágeno da cauda do rato foi diluído 1:5 em ácido acético e 250 μL foram aplicados no lado apical de cada inserção. Após incubar as placas por toda a noite em temperatura ambiente, o líquido restante foi aspirado com uma pipeta Pasteur e a placa deixada para secar com a tampa aberta por pelo menos 5 minutos (estéril). Finalmente, as inserções foram lavadas duas vezes com DPBS (sem Ca2+/Mg2+) e a seguir secas por toda a noite em temperatura ambiente (estéril). As inserções foram armazenadas a 4°C por até um mês. b. Expansão celular de hREC com cultura submersa (cultura estacionária)

[00222] As células foram alimentadas a cada 2 a 3 dias (segunda-feira, quarta-feira e sexta-feira) com 15 mL de meio UG pré-aquecido. Foi necessário ter cuidado para não adicionar novo meio diretamente na camada de colágeno, para evitar danos à camada de colágeno e o desprendimento das

84 / 141 células. Assim que as células estavam 80% confluentes ou a camada de colágeno começou a se separar, as células foram transferidas para filtros ALI (aproximadamente após 3 semanas em cultura submersa). c. Preparação do Meio G

[00223] Diferentes meios de ALI foram testados, mas o Meio G artesanal foi preferido. Este meio foi preparado pata uma semana, mas precisou ser armazenado a 4°C. Os lotes foram congelados em alíquotas com base no tamanho do próximo experimento. A Tabela 2 mostra a composição do Meio G. d. Semeadura e air-lift de hREC (cultura ALI)

[00224] 1. Aspirar o meio UG, lavar uma vez com meio de lavagem [DMEM/Ham’s F-12 1:1 com antibióticos/antimicóticos (AA) estéril 1x] ou DPBS (sem Ca2+/Mg2+)

2. No caso de frascos revestidos com colágeno de cauda de rato artesanal: a. Dissolver camada de colágeno adicionando 9 mL de colágeno (1x) e incubar por 45 a 60 minutos a 37 °C b. Transferir células em um tubo cornículo de 15 mL e centrifugar em 1.000 rpm, temperatura ambiente por 5 min c. Lavar células com tampão de lavagem (1.000 rpm, temperatura ambiente, por 5 min) d. Adicionar 2 mL de Tripsina EDTA (1x) e pipetar suavemente para cima e para baixo para separar as células, incubar as células a 37 °C e agitar o cornículo até os grupamentos celulares se desintegrarem (aproximadamente 5 minutos) No caso de frascos revestidos com colágeno obtido de gibco: a. Adicionar 3 mL de Tripsina EDTA (1x) ao frasco de cultura célula até as células se separarem (aproximadamente 5 minutos)

3. Parar a tripsina adicionando 0,5 mL de FBS e 5 mL de meio

85 / 141 de lavagem

4. Células de transferência em um falcon de 15 mL e células de lavagem duas vezes com meio de lavagem (1.000 rpm, temperatura ambiente, por 5 minutos)

5. Ressuspender precipitado em quantidade apropriada de meio ALI (1 a 2 mL, depende do tamanho do precipitado) e contar as células usando contador de célula

6. Adicionar 250 µL da suspensão celular (400.000 células/mL) em cada transpoço revestido com colágeno com 500 µL de meio ALI no lado basolateral

7. Células incubadas a 37 °C em uma incubadora umidificada, com 5% de CO2 por toda a noite Dia 3 a 5: ALI-Crescimento

8. Verificar inserções no microscópio consistentemente

9. Nutrir células com meio ALI a cada dia até 80 a 100% de confluência (3 a 4 dias) ALI-Diferenciação

10. Air-lift das células quando 80 a 100% de confluência é atingida a. Aspirar o meio ALI tanto do lado apical quanto basolateral b. Adicionar 500 µL de meio ALI fresco ao compartimento basolateral c. Incubar células a 37 °C em uma incubadora umidificada, com 5% de CO2

11. Lavar células com meio de lavagem pré-aquecido (apical) uma vez por semana e nutrir células com meio ALI a cada 2 a 3 dias (ou Segunda-feira – Quarta-feira– Sexta-feira) e. Transfecção de hREC

[00225] As formulações (LF111-RNAm) foram diluídas em sacarose

86 / 141 2% para uma concentração final de 3 µg / inserção (= 9 μg / cm2). Para remover o muco, as inserções foram lavadas com 200 μL de DPBS (sem Ca2+/Mg2+) no lado apical e incubadas por 20 min a 37°C (Epithelix ALI), ou 200 μL de DPBS (sem Ca2+/Mg2+) no lado apical, e incubadas por 5 minutas em temperatura ambiente (hREC, UKM) antes da transfecção. Em seguida, DPBS (sem Ca2+/Mg2+) da superfície apical foi removido por aspiração suave sem danificar o epitélio. Imediatamente após a lavagem do muco, as células foram lavadas novamente com WFI (100 μL) para remover vestígios de DPBS (sem Ca2+/Mg2+). 25 μL da formulação foram adicionados no lado apical da inserção para permitir a absorção celular. A remoção do carreador foi realizada após 6 horas de incubação, as células foram lavadas uma vez com 200 μL de DPBS (sem Ca2+/Mg2+) e a cultura foi mantida como ALI sem líquido no lado apical.

3. Ensaios de leitura

[00226] Vários ensaios de leitura são empregados. A medição de LDH e o ensaio NucGreen foram usados para investigar os efeitos da transfecção relacionados à toxicidade. As medições da frequência do batimento ciliar (FSC) foram necessárias para examinar a forma de batimento ciliar em relação à frequência do batimento, e a porcentagem da área ciliada. Se o batimento ciliar levar a um fluxo direcionado, pode ser estudado usando o Ensaio de Eliminação Mucociliar (MCC). Colorações de imunofluorescência (IF) para CCDC40, seu parceiro heterodímero CCDC39 e o marcador ciliar alfa-tubulina acetilada foram utilizados para detectar se, após o tratamento, a proteína CCDC40 ou seu parceiro CCDC39 podem ser detectados nos cílios. Além disso, proteínas do complexo regulador de dineína (DRC), como GAS8 e DNALI1, foram coradas. O DRC é ancorado por CCDC40 / CCDC39 e presente apenas se CCDC40/CCDC39 estiverem corretamente integrados ao axonema ciliar. a. Medição de LDH

87 / 141

[00227] A concentração de LDH é medida usando o kit do ensaio de citotoxicidade de lactato desidrogenase Pierce™. O procedimento é realizado da maneira descrita no protocolo do fabricante. As culturas ALI foram incubadas no lado apical com 100 μL de DPBS (com Mg2+/Ca2+) por 30 min a 37°C e 5% de CO2. 50 μL da mistura de reação de LDH e 50 μL do meio de incubação foram misturados utilizando um formato de 96 poços, e incubados protegidos da luz em temperatura ambiente por 30 min, adicionando 50 μL de solução de parada. A absorbância do formazan foi medida em 490 nm e 680 nm usando um leitor de microplacas (TriStar2 Multimode Reader LB 942). O valor de 680 nm foi subtraído de 490 nm para a normalização de fundo. Foi realizada uma dupla determinação para cada inserção. b. Medição da frequência de batimento ciliar (CBF)

[00228] As análises de frequência de batimento ciliar (CBF) de hRECs foram realizadas por microscopia de vídeo de alta velocidade e análise de vídeo Sisson-Ammons. Os vídeos (125 fps, resolução de 640x480 pixels) foram gravados usando uma câmera Megaplus modelo ES 310 turbo, acoplada a um microscópio de contraste de fase invertido equipado com uma objetiva ELWD 40x S Plan Fluor, sob condições fisiológicas, mantendo a temperatura a 36°C por um sistema de aquecimento Minitube SC300. c. Ensaio de eliminação mucociliar (MCC, esferas de fluorescência)

[00229] O meio ALI e DPBS (sem Ca2+/Mg2+) foram pré-aquecidos em temperatura ambiente e a placa do microscópio foi aquecida a 37°C. As inserções ALI foram transferidas para uma nova placa e lavadas apicalmente duas vezes com meio ALI pré-aquecido (DPBS alternativo sem Ca2+/ Mg2+). 100 μL de meio ALI foram adicionados ao compartimento apical antes de gravar 20 vídeos por inserção (ampliação de 40x, Ph2), para obter uma impressão geral da inserção (software SAVA). As partículas fluorescentes vermelhas com um diâmetro de 0,5 pm foram diluídas 1:1000 em DPBS (sem Ca2+/Mg2+) e agitadas por vórtex por pelo menos 1 min. 10 μL da diluição de

88 / 141 partículas foram adicionados a 100 μL de meio ALI, agitados em vórtex, e 110 μL foram adicionados ao compartimento apical. Durante o manuseio das esferas, foi importante agitar em vórtex antes de cada etapa para evitar aglutinação. Além disso, o trabalho com luz reduzida foi necessário para evitar o branqueamento.

[00230] O fluxo das partículas fluorescentes foi registrado com o software NIS-Elements Basic Research. O movimento foi registrado ao longo de 20 a 30 segundos, usando uma ampliação de 20x (Ph1), excitando ao mesmo tempo as partículas com um laser de 488 nm. O tempo de exposição teve que ser ajustado para o número de quadros gravados por segundo (fps). Para 7,5 fps, o tempo de exposição foi definido para 100 ms e para 15 fps a 50 ms. A área de observação exata foi analisada com SAVA (aumento de 20x, Ph1) para visualizar o movimento ciliar e as estruturas 3D da camada celular.

[00231] Para avaliação e análise de dados, é utilizado o software Nikon NIS Elemets AR, NIS PLUG-EM <ADVANCED 2D TRACKING> <AR> (vide módulo de rastreamento NIS Elements AR anterior). d. SE de cultura ALI Incorporação de cultura ALI

[00232] Antes da preparação da membrana, a inserção ALI foi lavada duas vezes com DPBS (sem Mg2+/Ca2+, 200 μL, 1 min, temperatura ambiente) para remover o muco. A preparação da membrana a seguir é realizada de acordo com o seguinte protocolo (ver abaixo).

[00233] A membrana do filtro do transpoço foi cortada usando um bisturi ou uma seringa, antes de transferir a membrana para uma placa de Petri com 3 mL de DPBS (Ca2+/Mg2+). A membrana foi cortada em pedaços iguais (4-6) e os criomoldes foram preparados com meio de incorporação congelado Shandon Cryomatrix ™ (tamanho intermediário). Pedaços de membrana foram colocados na criomatriz e dispostos paralelamente uns aos outros antes dos criomoldes serem incubados em gelo seco até que a criomatriz

89 / 141 endurecesse. Os criomoldes foram armazenados a -80°C por pelo menos 2 horas antes do corte no criostato. Corte de membranas de ALI

[00234] As membranas ALI integradas em Shandon Cryomatrix ™ foram cortadas usando o criostato Microm HM560. Portanto, o criostato foi pré-resfriado (2 a 3 horas antes do corte) a -20°C (mesa a -21°C e câmara a - 25°C). A membrana ALI contendo criomoldes foi transferida de -80°C para - 20°C por pelo menos 1 hora. O corte da membrana foi realizado em 20 μm, dependendo das condições de manuseio da membrana. As fatias de membrana foram transferidas para lâminas Superfrost Ultra Plus, secas por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente e armazenadas a -80°C por toda a noite, ou até o uso, a -80°C. Procedimento de coloração

[00235] Para anticorpos aplicados, vide Tabela 12.

[00236] Dia 1:

1. Lavar com DPBS 1x (Ca2+/Mg2+) por 5 minutos em temperatura ambiente

2. Fixação: PFA 4%/DPBS 1x (Ca2+/Mg2+) por 15 minutos em temperatura ambiente

3. Lavar com DPBS 3x (Ca2+/Mg2+) (2x rápido, 1x 5 minutos)

4. Permeabilização: a. Triton X-100 0,5% por 5 min ou b. Triton X-100 0,2% por 10 minutos (depende do anticorpo usado)

5. Lavar com DPBS 3x (Ca2+/Mg2+) (2x rápido, 1x 5 minutos) em temperatura ambiente

6. Bloqueio: 5% de soro de cabra normal + BSA 2% em DPBS (Ca2+/Mg2+), ou leite desnatado 5% em DPBS (Ca2+/Mg2+)  2 horas em temperatura ambiente

90 / 141

7. 1º anticorpo: 200 µL por toda a noite a 4°C Dia 2:

1. Lavar por 45 minutos com DPBS (Ca2+/Mg2+) (3x 15min)

2. 2º anticorpo: 200 µL por 1 hora em temperatura ambiente

3. Hoechst 33342 1:1000 em DPBS (Ca2+/Mg2+) por 10 minutos em temperatura ambiente, no escuro

4. Lavar 6x 5 minutos com DPBS (Ca2+/Mg2+)

5. Montar as lamínulas com antifade Dako Tabela 12 Nome Espécie Diluição Reatividade Número de Catálogo alfa-tubulina anti- IgG2b de camundongo, 1:10000 humano T6793 acetilada monoclonal clone 6-11B-1 anti-CCDC40 IgG de coelho 1:200 humano 25049-1-AP policlonal anti-CCDC39 coelho, purificado por 1:300 humano HPA035364 policlonal afinidade anti-GAS8 policlonal IgG de coelho 1:200 Humano HPA041311 anti-DNALI1 coelho, isolado por 1:200 humano HPA028305 policlonal afinidade Alexa Fluor 546 IgG anti-coelho de cabra 1:1000 humano A11035 (H+L) Alexa Fluor 488 IgG anti-camundongo de 1:1000 humano A11029 cabra (H+L) DAPI - 1:000 - 62249 e. Aerógrafo em cultura ALI

[00237] Um modelo de aerógrafo foi empregado para gerar cultura de ALI em diferenciação. O protocolo foi estabelecido posteriormente por Crespin et al. 2011 (Approaches to Study Differentiantion and Repair of Human Airway Epithelial Cells).

[00238] As células foram rapidamente lavadas no lado apical com DPBS pré-aquecido (Mg2+/Ca2+). O compressor conectado ao aerógrafo foi ajustado para 1 kg/cm2 rodando o aerógrafo e girando a roda pequena. O aerógrafo pode precisar funcionar por algum tempo para permanecer em um valor constante. Em seguida, o pequeno reservatório no topo do aerógrafo foi preenchido com DPBS (Mg2+/Ca2+) e a inserção foi colocada em uma nova placa sem meio basal. O aerógrafo foi iniciado pressionando até o primeiro ponto de pressão, e aguardando até que a pressão no compressor

91 / 141 permanecesse constante. Em seguida, o aerógrafo foi colocado verticalmente no topo da inserção e a alavanca do aerógrafo foi pressionada muito pouco além do primeiro ponto de pressão [dispersão do DPBS (Mg2+/Ca2+) do reservatório] por 2 segundos. Em seguida, o lado apical da inserção foi rapidamente lavado com DPBS pré-aquecido (Mg2+/Ca2+), e a inserção foi colocada em meio fresco aplicável para diferenciação de ALI. A lesão foi verificada por observação microscópica. Caso fosse muito pequena (menos de 1/3 da área de inserção), ou as células da lesão estivessem apenas ligeiramente separadas, o procedimento era repetido. As culturas foram incubadas em atmosfera umidificada a 37°C, 5% de CO2 e cultivadas como ALI. III. RNAms de CCDC40 marcados

[00239] Os RNAms em estudo são mostrados na Tabela 13. Tabela 13

NTP I NTP I NTP II NTP II ID do RNA ORF UTR 5´ UTR 3´ modificado modificado modificado modificad [%] [Nome] [%] o [Nome]

ETH 031T28 eGFP- 5-Metil- 5-Iodo- mínimo no 15 3 (SEQ ID NO: hCCDC40 UTP CTP 9)

ETH 031T30 hCCDC40- 5-Metil- 5-Iodo- mínimo no 15 3 (SEQ ID NO: eGFP UTP CTP 10) ETH HA- 031T26 CCDC40- 5-Metil- 5-Iodo- CYBA CYBA 15 3 (SEQ ID NO: T2A- UTP CTP 11) tdTomato a. Cultura de célula

[00240] Células HEK-293 são cultivadas em MEM GlutaMAX ™, 10% de FBS, 100 U/mL de P/S (= meio de cultivo) a 37°C, 5% de CO2.

[00241] Antes da semeadura, as células são lavadas com DPBS e separadas com Tripsina. Após a tripsinização, a tripsina é desativada usando meio de cultivo contendo FBS. Portanto, um volume igual ou maior de meio de cultura é usado. Após centrifugação por 5 minutos, em 1100 x g, e ressuspensão em meio de crescimento normal, as células são contadas usando

92 / 141 um dispositivo de contagem de células Countess. b. Transcrição in vitro

[00242] Para gerar modelos para a transcrição in vitro, os plasmídeos circulares foram linearizados por digestão de restrição com BstBI, e posteriormente purificados por precipitação com clorofórmio e etanol.

[00243] O RNAm foi produzido usando uma mistura de transcrição padrão in vitro, contendo T7 RNA polimerase, pirofosfatase inorgânica e inibidor de RNase. A cobertura co-transcricional foi atingida pela adição de um análogo de cap ARCA. Para a transcrição in vitro de RNA quimicamente modificado, 7,5% de citidina-5'-trifosfato foram substituídos por 5- iodocitidina-5'-trifosfato e 30% de uridina-5'-trifosfato foram substituídos por 5-iodouridina-5'-trifosfato, respectivamente. Em outra configuração de produção de SNIM®RNA, 3% de citidina-5'-trifosfato foi substituído por 5- iodocitidina-5'-trifosfato e 15% de uridina-5'-trifosfato foi substituído por 5- metil-uridina-5 '-trifosfato, respectivamente.O DNA molde residual foi digerido usando DNasel. Subsequentemente, o RNAm foi purificado por precipitação com acetato de amônio, seguido por uma etapa de lavagem usando etanol a 70%.

[00244] A desfosforilação do RNAm não coberto residual foi realizada usando um Kit de desfosforilação rápida, seguido por purificação por precipitação de acetato de amônio, seguido por uma etapa de lavagem usando etanol a 70% e ultrafiltração usando um corte de filtro de 100 MWCO.

[00245] O RNAm foi poliadenilado adicionalmente usando uma poli(A) polimerase. Novamente, o RNAm foi purificado por precipitação com acetato de amônio, seguido por uma etapa de lavagem usando etanol a 70%, e ultrafiltração usando um corte de filtro de 100 MWCO. O tamanho de poli(A) foi determinado por eletroforese em gel capilar para estar entre 100 e 250 nucleotídeos. c. Semeadura, transfecção e leitura

93 / 141

[00246] As células foram semeadas em microplacas pretas de 96 poços (25.000 células por poço) 24 horas antes do tratamento. 24 horas após a semeadura, p meio fresco foi adicionado a cada poço (100 μL). O RNAm foi transfectado usando Lipofectamine® MessengerMAX ™ em uma proporção de RNA para Lipofectamina de 1:1,5 (p/v). 250 ng/96 poços de RNAm ( 758 ng/cm2) de eGFP-CCDC40 (ETH031T28 ou ETH031T30) ou HA-CCDC40- T2A-tdTomato (ETH031T26) foi empregado. Todos os RNAs tinham uma concentração de estoque de 1 mg/mL. Para a formação de lipoplex, o RNAm foi diluído em água bidestilada. Lipofectamine®MessengerMAX ™ foi diluído em SFM (meio sem soro) e foi misturado por pipetagem. Após incubação de 10 min em RT, a solução de RNA foi adicionada à solução Lipofectamine® MessengerMAX ™, misturada e incubada por mais 5 min em RT. Posteriormente, a mistura foi diluída duas vezes em SFM antes de adicionar a solução de Lipoplex aos poços. Na Tabela 14, foi calculado um exemplo para um RNA. Tabela 14 Volume Total adicionado às ng RNA/poço RNA [μL] H2O [µL] MM [μL] SFM [μL] células [μL] 250 4,5 108 6,76 105,76 25 6 horas e 24 horas após a transfecção, a eficiência de transfecção foi examinada por microscopia de fluorescência, as fotos foram tiradas em ampliação de 10x.

IV. CCDC39

[00247] O RNAm (ETH047T02; SEQ ID NO: 12) em estudo codifica hCCDC39 e compreende a UTR mínima de Ethris. No total, 15% do uridina- 5'-trifosfatos foram substituídos por 5-metil-uridina-5'-trifosfatos e, no total, 3% dos citidina-5'-trifosfatos por 5-iodo-citidina-5'-trifosfatos. Os anticorpos usados são mostrados na Tabela 15. Tabela 15 Tipo de Número de anticorpo Nome Fornecedor Número do Catálogo anticorpo Primeiro 207 CCDC39 Atlas Antibodies HPA035364 Primeiro 219 Actina Abcam ab8227 Segundo IgG anti-coelho de cabra Abcam ab205718 IgG anti-coelho de H&L (HRP) cabra H&L (HRP)

1. Transfecção de CCDC39 e Western blot em cultura de célula submersa

94 / 141 a. Cultura de células

[00248] As células BEAS-2B foram cultivadas em meio LHC-9, em frascos revestidos. Para detalhes, vide I 1 anterior. Os experimentos foram realizados em placas não revestidas.

[00249] As células HEK-293 foram cultivadas em meio MEM GlutaMax, suplementado com FBS inativado por calor, e penicilina/estreptomicina (P/S).

[00250] Antes da semeadura, as células foram lavadas com DPBS e separadas usando Tripsina. Após a tripsinização, a tripsina foi desativada usando um inibidor de tripsina para BEAS-2B, ou meio de cultivo contendo FBS para HEK-293. Portanto, um volume igual ou maior de inibidor de tripsina/meio de cultura foi usado. Após centrifugação por 5 min em 1100 x g, e ressuspensão em meio de crescimento normal, as células foram contadas usando um dispositivo de contagem de células Countess. Considerando um volume de semeadura de 2 mL e um formato de placa de 6 poços, foram obtidas 5,0x105 células BEAS-2B semeadas, e 1,4x106 células HEK-293 semeadas. b. Transfecção

[00251] As células foram semeadas em suas respectivas densidades 24 horas antes do tratamento. 24 horas após a semeadura, 2 mL de meio fresco foram adicionados em cada poço. O RNAm foi transfectado usando Lipofectamine®MessengerMAX™, em uma proporção de RNA para Lipofectamina de 1:1,5 (p/v). Todos os RNAs tinham uma concentração de estoque de 1 mg/mL. Para a formação de lipoplex, o RNAm foi diluído em água bidestilada. Lipofectamine®MessengerMAX™ foi diluído em SFM e foi misturado por pipetagem. Após incubação de 10 minutos em temperatura ambiente, a solução de RNA foi adicionada à solução de Lipofectamine® MessengerMAX™, misturada e incubada por mais 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, a solução de Lipoplex foi adicionada aos poços. Na

95 / 141 Tabela 16, um exemplo de transfecção é calculado para uma placa de 6 poços. Tabela 16 RNA H2O Volume total adicionado às ng/poço MM [μL] SFM [μL] [μL] [µL] células [μL] Dose alta 5000 5,0 120 7,5 117,5 250 Dose baixa 2500 2,5 122,5 3,75 121,25 250 c. Lise celular

[00252] Para obter a lise celular ideal, dois tampões de lise diferentes foram comparados, um tampão Triton X-100 e o tampão de lise disponível comercialmente M-PER™, ambos complementados com inibidor de protease completo, sem EDTA e 40 μL/mL de solução de DNase I (em uma mistura de 23:1:1). Portanto, as células foram semeadas em uma placa de 6 poços e tratadas por 6 horas e 24 horas. Após o tratamento, as células foram coletadas. Portanto, as placas foram lavadas uma vez usando 1 mL de DPBS. Para remover as células da placa, outro 1 mL de DPBS foi adicionado e as células foram raspadas das placas e movidas para tubos Eppendorf. Para remover DPBS, as células foram centrifugadas em 6250x g durante 2 minutos, a 4°C. A lise celular foi realizada adicionando 200 μL do respectivo tampão. Para garantir a lise completa, as células foram incubadas em gelo durante 30 min. Após a lise, o ensaio BCA foi realizado para determinar a concentração de proteína total, usando um kit de ensaio de proteína BCA, de acordo com as instruções do fabricante, com as seguintes alterações: • 200 μL de reagente de trabalho foram adicionados a 5 μL de lisado celular • As amostras e o padrão foram medidos em triplicata • Antes da incubação das amostras a 37 ° C por 30 minutos, a placa foi agitada por 30 segundos em 450 rpm d. Preparação da amostra

[00253] As amostras são misturadas com 5 μL de tampão de amostra Bolt® LDS e 2 μL de agente redutor de amostra Bolt® e, em seguida, aquecidas por 10 min a 70 ° C antes de realizar SDS-PAGE. 30 μg de proteína

96 / 141 total foram usados para SDS-PAGE e gel de SDS-PAGE Bolt™ 4-12%, 10 poços foram empregados. e. SDS Page e Método de transferência

[00254] Foi usado o sistema de transferência Trans-Blot® Turbo™. SDS-PAGE foi realizada aplicando 200 V por 40 minutos. A transferência foi realizada usando o sistema de transferência TransBlot® TurboTM por 30 minutos. f. Anticorpo e método de bloqueio

[00255] Após transferência, as membranas foram bloqueadas em RT por 1 hora. NET-gelatina foi usada como reagente de bloqueio. O anticorpo HPA035364 da Atlas Antibodies foi usado para a detecção de CCDC39, e o anticorpo ab8227 de ab8227 para a detecção de Actina. As membranas foram cortadas em cerca de 60 kDa antes dos anticorpos serem adicionados. As membranas foram incubadas durante a noite a 4°C com os anticorpos primários. Após três lavagens (10 minutos cada) com solução de bloqueio em RT, o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano foi adicionado em RT por 1 hora (diluído 1:20.000). As membranas foram lavadas novamente três vezes com solução de bloqueio, por 10 minutos cada em RT. g. Desenvolvimento de Sinal Quimioluminescente

[00256] Os sinais foram visualizados com um kit de substrato quimioluminescente (substrato Luminata Crescendo, Classico ou Forte Western HRP, dependendo da intensidade do sinal) e o Sistema ChemiDocTM MP.

2. Western blot de CCDC39 endógena em cultura de ALI diferenciada a. Lise celular

[00257] 250 μL de tampão de lise ALI (para detalhes da composição, conferir Tabela 17) foram adicionados por inserção e incubados em gelo por 15 minutos. Antes, durante (a cada 5 minutos) e no final da incubação, o

97 / 141 tampão de lise ALI foi pipetado para a frente e para trás. Após a transferência para tubos Eppendorf e enxágue de cada inserção com 150 μL de tampão de lise ALI, as amostras foram completamente agitadas em vórtex. Nesta etapa, as amostras podem ser opcionalmente armazenadas a -20 ° C até processamento adicional. Tabela 17 Substância Estoque Final Para 10 mL TritonX-100 10% 1% 1 mL NaCl 1,5 M 150 mM 1 mL SDS 1% 0,1% 1 mL Tris 250 mM 50 mM 2 mL Inibidor de protease completo 25 x 1x 0,4 mL WFI 4,5 mL b. Separação de lisado axonemal do lisado de célula inteira

[00258] As amostras foram adicionadas aos tubos da matriz de lise A (os tubos foram lavados antes com EtOH 70% e a granada foi removida). Os tubos foram presos e congelados em nitrogênio líquido por 20 segundos, enquanto o tubo era movido. Os tubos foram rapidamente inseridos em MP FastPrep-24 (HOM-1), configurações: 6,5 m/s, 3x 1 min. Posteriormente, os tubos foram deixados para condensar no gelo por 15 minutos, antes de transferir o líquido para tubos Eppendorf novos e girar em 1100 rpm, 4°C, por 20 minutos. O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e o sedimento e o sobrenadante foram armazenados a -20°C até processamento posterior. c. Preparação do lisado de extrato axonemal: extração de alto teor de sal da proteína axonemal ciliar

[00259] Cada precipitado foi ressuspenso em 50 µL de MMRB + 0,1% Triton X-100 (para detalhes da composição de MMRB + 0,1% TritonX-100 vide Tabela 18) e incubado no gelo por 30 minutos (com agitação em vórtex suave ocasional). Após girar em 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos, o sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e armazenado a - 20°C até processamento posterior. Tabela 18

98 / 141 Substância Estoque Final Volume para 1 mL HMEN (conferir Tabela 19) 1x - 982 µL DTT (por exemplo, Sigma 646563) 1M 2 mM 2 µL β-Mercaptoetanol (por exemplo, Sigma 100% 70 mM 5 µL M3148) TritonX-100 10% 0,1% 10 µL Inibidor de protease completo 25x 1x 40 µL (Roche/Sigma 11873580001) Tabela 19 Substância Final HEPES, pH 7,4 30 mM MgSO4 5 mM EDTA 0,1 mM NaCl 625 d. Preparação de lisados para Western blot

[00260] As amostras foram descongeladas em gelo e 30 μL de amostra foram transferidos para novos tubos Eppendorf. 12 μL de tampão de amostra LDS e 5 μL de agente redutor 10x foram adicionados antes do aquecimento das amostras a 70°C, 350 rpm por 10 minutos. 5, 10 e 30 μL foram aplicados por poço a um gel 4 a 12% SDS-PAGE Bolt ™, 10 poços. e. SDS Page e Método de transferência: conferir IV 1 e g. Anticorpo e método de bloqueio: conferir IV 1 f h. Desenvolvimento de sinal quimioluminescente: conferir IV 1 g II. Resultados

[00261] A expressão de CCDC40 foi determinada em células HEK293 após 6 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas e 144 horas após transfecção. Em particular, 2/1,4/0,3/0,2/0,05x106 células foram semeadas em placas de 6 poços, e as células foram transfectadas 24 horas após a semeadura com diferentes construções CCDC40 (2,5 μg/9,5 cm2) usando Lipofectamine®

2000. O RNAm de construções de CCDC40 usados nesta experiência foram de T06 a T10 (SEQ ID NO: 1, e SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 8). A lise celular foi realizada 6, 24, 48, 72 e 144 horas após a transfecção e 50 μg de lisado de proteína total foram analisados com SDS-PAGE e Western Blot.

[00262] Como pode ser visto na Figura 1, um pico de eficiência de tradução foi detectável 6 horas após a transfecção de RNAms de CCDC40 em células HEK.

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[00263] O experimento seguinte foi realizado conforme descrito anteriormente, exceto que, neste caso, 2x106 células HEK293, 7,5x105 BEAS- 2B e 5x105 RPMI 2650 foram semeadas em placas de 6 poços, e os lisados de proteína foram analisados com SDS-PAGE e Western Blot (HEK293: 50 μg, RPMI 2650: 20 μg, BEAS-2B: 30 μg de lisado total). CCDC40 foi detectada usando o anticorpo anti-CCDC40 (HPA022974) da Atlas Antibodies (1:2000).

[00264] Aqui, pode ser observado que UTRs de T09 (CYBA; SEQ ID NO: 1) e T10 (CMV IE9 de humano e UTR 3 'do hormônio de crescimento humano SEQ ID NO: 8) levaram à maior eficiência de tradução 6 horas após a transfecção em células BEAS-2B, RPMI2650 e HEK293 (Figura 2).

[00265] Dois experimentos foram realizados para investigar a restauração da motilidade ciliar em culturas ALI derivadas de pacientes. Em particular, no primeiro experimento, uma cultura ALI não diferenciada (dados não mostrados) foi usada (as células ciliares tiveram uma eliminação do exon 1 e 2, resultando em cílios muito curtos e menos móveis), enquanto no segundo experimento uma cultura ALI diferenciada foi usada. Em ambos os casos, a cultura ALI foi transfectada com 3 μg de LF92/CCDC40 (ETH031T09; SEQ ID NO: 1) em dias alternados durante 1 mês, para um total de 16 transfecções. Como leitura, foi realizada microscopia de vídeo de alta velocidade (HSVM) a cada 24 horas e imunocitoquímica de imunofluorescência (IF-ICC). Antes da transfecção e a cada 24 horas após a transfecção, vídeos (20 por inserção) foram feitos e CFB (frequência de batimento ciliar) foi calculado usando o software SAVA. Ao todo, 16 transfecções (1 mês) foram realizadas. A medição foi feita a 37°C usando a ampliação de 40x. São calculados os valores médios da frequência de batimento ciliar (CBF).

[00266] A transfecção repetida de LF92/CCDC40 foi bem tolerada em culturas ALI totalmente diferenciadas, derivadas de pacientes. A proteína

100 / 141 CCDC40 pode ser detectada na região subcelular de ocorrência natural, ou seja, cílios, das células epiteliais das vias aéreas após 22 dias por IF-ICC, e a motilidade dos cílios aumentou após a transfecção LF92/CCDC40 até o dia 18 para ~ 50% da frequência de batimento ciliar normal, pois pode pode ser visto na Figura 3 para o experimento com a cultura diferenciada ALI.

[00267] Da maneira descrita na seção Material e Métodos, uma cultura ALI indiferenciada foi obtida usando o Meio G, e as transfecções (TF) começaram 18 dias após air-lift. As transfecções (TFs) de CCDC40 de cultura ALI de paciente com RNAm de CCDC40//LF92 foram realizadas uma vez por semana, durante 4 semanas (= 4x TF). A eliminação mucociliar (MCC) foi medida usando grânulos fluorescentes de 0,5 μm com ampliação de 20x. Os vídeos de 30 segundos de diferentes áreas são realizados e analisados com o software Polargraph da Nikon uma semana após a última TF.

[00268] De maneira importante, a restauração do batimento ciliar em ALI de paciente com CCDC40 após quatro transfecções semanais de RNAm de CCDC40/LF92 pode ser detectada. Além disso, o batimento dos cílios foi sincronizado, o que permitiu um transporte de partículas direcionado, como pode ser visto na Figura 4. Para comparação, o transporte de partículas é mostrado na Figura 5 no caso de um controle, isto é, quatro vezes a transfecção de RNAm/LF111 de tdTomato e um controle saudável.

[00269] Assim, TF satisfatória de RNAm de CCDC40/LF92 da cultura ALI de paciente com LF92, da maneira indicada por uma comparação com o controle de tdTomato, durante a fase de diferenciação das células ciliares, resultou em crescimento de cílios satisfatório, batimento ciliar satisfatório, transporte de partículas direcionado satisfatório, e detecção de proteína satisfatória (CCDC39 como parceiro de ligação de CCDC40 + GAS8/DNALI1 como parte do complexo DRC). Além disso, as inserções de controle tdTomato não mostraram nenhum dos efeitos acima mencionados.

[00270] A figura 6 demonstra a incorporação satisfatória da proteína

101 / 141 GAS8 nos axonemas após tratamento ALI de paciente repetido com RNAm de CCDC40, como em controles saudáveis, que está ausente em ALIs de pacientes tratados com controle (RNAm de tdTomato). A figura 7 demonstra a incorporação satisfatória da proteína DNALI-1 nos axonemas após tratamento ALI de pacientes repetido com RNAm de CCDC40, como em controles saudáveis, que está ausente em ALIs de pacientes tratados com controle (RNAm de tdTomato). A figura 8 demonstra a incorporação bem- sucedida da proteína CCDC39 nos axonemas após tratamento ALI de paciente repetido com RNAm de CCDC40, como em controles saudáveis, que está ausente em ALIs de pacientes tratados com controle (RNAm de tdTomato).

[00271] Para resumir, a motilidade dos cílios não pode ser restaurada em um nível significativo com o uso da cultura ALI diferenciada, mas parcialmente restaurada com o uso da cultura ALI diferenciada.

[00272] Com relação aos experimentos CCDC39, as proteínas CCDC39 podem ser detectadas por análises Western Blot 6 horas e 24 horas após a transfecção em células HEK-293 e BEAS-2B, como pode ser visto na Figura 9. Da maneira mostrada na Figura 11, CCDC39 (ETH047T03; SEQ ID NO: 13) a expressão pode ser detectada após 6 horas em 16HBE14o- usando o inibidor de proteassoma. A mesma experiência também foi realizada para ETH047T02 (SEQ ID NO: 12), ETH047T04 (SEQ ID NO: 2) e ETH047T05 (SEQ ID NO: 14) com resultados comparáveis. Como mostrado na Figura 12, a expressão de CCDC39 (ETH047T03; SEQ ID NO: 13) também pode ser detectada após 24 horas em 16HBE14o- usando o inibidor de proteassoma.

[00273] Sequências exemplares descritas no pedido são providas a seguir. A descrição provê, em algumas modalidades, polirribonucleotídeos compreendendo, por exemplo, as sequências UTR estabelecidas em SEQ ID NO: 1 ou 2, ou uma sequência pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a tais sequências, ou uma sequência de polirribonucleotídeo, tal como

102 / 141 um RNAm, correspondendo a ou codificado por qualquer um dos anteriores. Em certas modalidades de quaisquer dos precedentes, o polinucleotídeo ou polirribonucleotídeo é modificado (por exemplo, compreende análogos de nucleotídeo, da maneira aqui descrita). SEQ ID NO: 1

[00274] Sequência de CCDC40 com UTR 5’ e 3’ CYBA (ETH031T09): Parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, UTR 5’ CYBA, elemento Kozak, códon inicial (AUG), sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, códon de parada (UGA), UTR 3’ CYBA, parte de sítio de restrição para BstBI, poliA : cauda de “A” produzida por meio de pós-adenilação de RNAm

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UGACCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCCGCCAGGUGCACCCACCUGCAAUAAAUGCA GCGAAGCCGGGAUUCG-poliA SEQ ID NO: 2 Sequência de CCDC39 com UTRs CYBA (ETH047T04): Parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, UTR 5’ CYBA, elemento Kozak, códon inicial (AUG), sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC39 de humano, códon de parada (UGA), CYBA UTR 3’, parte de sítio de restrição para BstBI, cauda poli(a)

GGGAGACCGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUGUCGCCG CCACCAUGAGCAGCGAGUUUCUGGCCGAACUGCACUGGGAGGAC GGCUUCGCUAUUCCCGUGGCCAACGAGGAAAACAAGCUGCUGGA AGAUCAGCUGAGCAAGCUGAAGGACGAGAGAGCCUCUCUGCAGG ACGAGCUGAGAGAGUACGAGGAACGGAUCAACAGCAUGACCAGC CACUUCAAGAACGUGAAGCAAGAGCUGAGCAUCACCCAGAGCCU GUGCAAGGCCAGAGAGAGAGAAACCGAGAGCGAGGAACACUUCA AGGCUAUCGCCCAGCGCGAGCUGGGAAGAGUGAAGGAUGAGAUC CAGCGGCUGGAAAACGAGAUGGCCAGCAUCCUGGAAAAGAAGUC CGACAAAGAGAACGGCAUCUUCAAGGCCACACAGAAGCUGGACG GCCUGAAGUGCCAGAUGAACUGGGAUCAGCAGGCCCUGGAAGCC UGGCUGGAAGAGUCUGCCCACAAGGAUUCUGACGCCCUGACACU GCAGAAGUACGCCCAGCAGGACGACAACAAGAUCCGGGCUCUGA CCCUGCAGCUGGAAAGACUGACCCUGGAAUGCAACCAGAAGCGG AAGAUCCUGGACAACGAGCUGACCGAGACAAUCAGCGCCCAGCU

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GGAACUGGAUAAGGCCGCUCAGGACUUCAGAAAGAUCCACAACG AGCGGCAAGAACUGAUCAAGCAGUGGGAGAACACCAUCGAGCAG AUGCAGAAACGCGACGGCGACAUCGACAACUGCGCCCUGGAACU CGCCCGGAUCAAGCAAGAGACACGCGAGAAAGAGAACCUGGUCA AAGAGAAGAUCAAGUUCCUCGAGUCCGAGAUCGGCAACAACACC GAGUUCGAGAAGCGGAUCAGCGUGGCCGACAGAAAGCUGCUGAA GUGCAGAACCGCCUACCAGGACCACGAGACAAGCCGGAUUCAGC UCAAGGGCGAGCUGGAUUCUCUGAAGGCCACCGUGAACAGAACC AGCAGCGAUCUGGAAGCCCUGCGGAAGAACAUCAGCAAGAUCAA GAAGGACAUCCACGAGGAAACCGCCAGGCUGCAGAAAACAAAGA ACCACAAUGAGAUCAUCCAGACCAAGCUGAAAGAGAUCACCGAA AAGACCAUGAGCGUGGAAGAGAAGGCCACAAACCUGGAAGAUAU GCUCAAAGAGGAAGAGAAAGACGUCAAAGAGGUGGACGUUCAA CUGAACCUGAUUAAGGGCGUGCUGUUCAAGAAGGCCCAAGAGCU GCAGACCGAAACCAUGAAGGAAAAGGCCGUCCUGUCUGAGAUCG AGGGCACCAGAUCUAGCCUGAAGCACCUGAACCAUCAGCUGCAG AAGCUCGACUUCGAGACACUGAAGCAGCAAGAGAUCAUGUACAG CCAGGAUUUCCACAUCCAGCAGGUCGAGCGGCGGAUGUCUAGAC UGAAGGGCGAGAUCAACUCCGAGGAAAAACAGGCCCUCGAGGCC AAGAUCGUGGAACUGAGAAAGAGCCUCGAAGAGAAGAAGUCUA CCUGCGGCCUGCUGGAAACCCAGAUUAAGAAGCUGCACAACGAC CUGUACUUCAUCAAGAAAGCCCACAGCAAGAACAGCGACGAGAA GCAGAGCCUGAUGACCAAGAUCAAUGAGCUGAACCUGUUCAUCG AUCGGAGCGAAAAAGAGCUGGACAAGGCCAAGGGCUUCAAGCAG GACCUGAUGAUCGAGGACAACCUGCUGAAGCUGGAAGUGAAGCG GACCAGAGAGAUGCUGCACAGCAAGGCCGAGGAAGUGCUGUCUC UGGAAAAGCGGAAGCAGCAGCUGUACACCGCCAUGGAAGAGAGA ACCGAAGAGAUCAAGGUGCACAAGACCAUGCUGGCUUCCCAGAU CAGAUACGUGGACCAAGAGCGCGAGAACAUCUCCACCGAGUUUA

107 / 141

GAGAGAGACUGUCCAAGAUCGAGAAGCUGAAGAACCGCUACGAG AUCCUGACCGUCGUGAUGCUGCCUCCUGAGGGCGAAGAGGAAAA GACCCAGGCCUACUACGUGAUCAAGGCAGCCCAAGAAAAAGAGG AACUCCAGAGAGAAGGCGACUGCCUGGACGCCAAGAUUAACAAG GCCGAAAAAGAAAUCUACGCCCUCGAGAACACCCUGCAGGUCCU GAACAGCUGCAACAACAACUACAAGCAGAGCUUCAAGAAAGUCA CCCCUAGCUCCGACGAGUACGAGCUGAAGAUUCAGCUGGAAGAA CAGAAAAGAGCCGUGGACGAGAAGUACAGAUACAAGCAGCGGCA GAUCAGAGAGCUGCAAGAGGAUAUCCAGAGCAUGGAAAACACCC UGGACGUGAUCGAGCACCUGGCCAACAACGUGAAAGAGAAGCUG UCCGAGAAACAGGCCUACAGCUUUCAGCUGUCCAAAGAGACAGA GGAACAGAAGCCCAAACUGGAACGCGUGACCAAGCAGUGCGCCA AGCUGACAAAAGAGAUCCGGCUGCUGAAAGACACCAAGGACGAA ACCAUGGAAGAACAAGACAUCAAGCUGCGCGAGAUGAAGCAGUU CCACAAAGUGAUCGACGAGAUGCUGGUGGACAUCAUUGAAGAGA ACACAGAGAUCCGCAUCAUCCUGCAGACCUAUUUUCAGCAGAGC GGCCUGGAACUGCCUACCGCCUCUACAAAGGGCAGCAGACAGAG CAGCAGAUCCCCUAGCCACACAAGCCUGAGCGCCAGAAGCUCUA GAAGCACCAGCACCUCUACCAGCCAGUCCAGCAUUAAGGUGCUG GAACUCAAGUUCCCCGCCAGCUCUAGCCUCGUGGGAAGCCCUUC UAGACCUAGCAGCGCCUCUAGCAGCUCCAGCAACGUGAAGUCCA AGAAAAGCUCCAAGUGACCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCCGCCAGGUGCAC CCACCUGCAAUAAAUGCAGCGAAGCCGGGAUUCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO: 3 tdTomato: Parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, sequência da cadeia principal do vetor (pVAX Vektor: Life Technologies) , elemento Kozak, códon inicial (AUG),

108 / 141 sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma proteína tdTomato, códon de parada (UAG), parte de sítio de restrição para NotI, parte da sequência da cadeia principal do vetor (pVAX Vektor: Life Technologies)

CCAAGCUGGCUAGCGUUUAAACUUAAGCUUGGUACCGCGGGCCCGGG GGGAGAC AUCCACCGGUC GCCACCAUGGUGAGCAAGGGCGAGGAGGUCAUCAAAG AGUUCAUGCGCUUCAAGGUGCGCAUGGAGGGCUCCAUGAACGGC CACGAGUUCGAGAUCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCUACGA GGGCACCCAGACCGCCAAGCUGAAGGUGACCAAGGGCGGCCCCC UGCCCUUCGCCUGGGACAUCCUGUCCCCCCAGUUCAUGUACGGC UCCAAGGCGUACGUGAAGCACCCCGCCGACAUCCCCGAUUACAA GAAGCUGUCCUUCCCCGAGGGCUUCAAGUGGGAGCGCGUGAUGA ACUUCGAGGACGGCGGUCUGGUGACCGUGACCCAGGACUCCUCC CUGCAGGACGGCACGCUGAUCUACAAGGUGAAGAUGCGCGGCAC CAACUUCCCCCCCGACGGCCCCGUAAUGCAGAAGAAGACCAUGG GCUGGGAGGCCUCCACCGAGCGCCUGUACCCCCGCGACGGCGUG CUGAAGGGCGAGAUCCACCAGGCCCUGAAGCUGAAGGACGGCGG CCACUACCUGGUGGAGUUCAAGACCAUCUACAUGGCCAAGAAGC CCGUGCAACUGCCCGGCUACUACUACGUGGACACCAAGCUGGAC AUCACCUCCCACAACGAGGACUACACCAUCGUGGAACAGUACGA GCGCUCCGAGGGCCGCCACCACCUGUUCCUGGGGCAUGGCACCG GCAGCACCGGCAGCGGCAGCUCCGGCACCGCCUCCUCCGAGGAC AACAACAUGGCCGUCAUCAAAGAGUUCAUGCGCUUCAAGGUGCG CAUGGAGGGCUCCAUGAACGGCCACGAGUUCGAGAUCGAGGGCG AGGGCGAGGGCCGCCCCUACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCUG AAGGUGACCAAGGGCGGCCCCCUGCCCUUCGCCUGGGACAUCCU GUCCCCCCAGUUCAUGUACGGCUCCAAGGCGUACGUGAAGCACC CCGCCGACAUCCCCGAUUACAAGAAGCUGUCCUUCCCCGAGGGC UUCAAGUGGGAGCGCGUGAUGAACUUCGAGGACGGCGGUCUGGU GACCGUGACCCAGGACUCCUCCCUGCAGGACGGCACGCUGAUCU

109 / 141

ACAAGGUGAAGAUGCGCGGCACCAACUUCCCCCCCGACGGCCCC GUAAUGCAGAAGAAGACCAUGGGCUGGGAGGCCUCCACCGAGCG CCUGUACCCCCGCGACGGCGUGCUGAAGGGCGAGAUCCACCAGG CCCUGAAGCUGAAGGACGGCGGCCACUACCUGGUGGAGUUCAAG ACCAUCUACAUGGCCAAGAAGCCCGUGCAACUGCCCGGCUACUA CUACGUGGACACCAAGCUGGACAUCACCUCCCACAACGAGGACU ACACCAUCGUGGAACAGUACGAGCGCUCCGAGGGCCGCCACCAC CUGUUCCUGUACGGCAUGGACGAGCUGUACAAGUAGGCGGCCAAUUCUG CAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

GCGGCC SEQ ID NO: 4 Sequência MCIDAS com UTR mínima de Ethris 5’ e UTR 3’ opcional: Parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, elemento Kozak, códon inicial (AUG), sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma proteína MCIDAS de humano, códon de parada (UGA), UTR 3’ opcional (também funciona como sítio de ligação ao iniciador reverso para PCR com base na produção de molde), sítio de restrição para NheI, cauda poli(a)

GGGAGACGCCACCAUGCAAGCUUGUGGCGGCGGAGCU GCUGGAAGAAGGGCCUUCGAUAGCAUCUGCCCCAACCGGAUGCU UGCCCUUCCUGGUAGAGCCCUGCUGUGCAAGCCUGGCAAGCCCG AGAGAAAGUUCGCCCCUCCAAGAAAGUUCUUCCCCGGCUGUACU GGCGGCAGCCCUGUGUCUGUGUAUGAGGACCCUCCUGAUGCCGA GCCUACAGCUCUGCCUGCUCUGACCACAAUCGACCUGCAGGAUC UGGCCGAUUGCAGCUCUCUGCUGGGAUCUGAUGCUCCUCCUGGC GGAGAUCUGGCUGCCUCUCAGAAUCACAGCCACCAGACAGAGGC CGACUUCAACCUGCAAGACUUCCGGGACACCGUGGACGACCUGA UCAGCGAUAGCAGCAGCAUGAUGAGCCCCACUCUGGCCAGCGGC

110 / 141

GAUUUCCCAUUCAGCCCCUGUGACAUCAGCCCUUUCGGCCCUUG UCUGAGCCCUCCACUGGAUCCUAGAGCACUGCAGAGCCCACCUC UGAGGCCUCCAGAUGUUCCUCCACCUGAGCAGUACUGGAAAGAG GUGGCCGACCAGAACCAGAGAGCACUGGGCGACGCUCUGGUGGA AAACAACCAGCUGCACGUGACCCUGACACAGAAGCAAGAAGAGA UCGCCAGCCUGAAAGAACGGAAUGUGCAGCUGAAAGAGCUGGCC UCCAGGACAAGACACCUGGCCAGUGUGCUGGACAAGCUGAUGAU CACCCAGAGCAGAGAUUGCGGAGCCGCCGCUGAACCUUUUCUGC UGAAGGCCAAGGCCAAGAGAAGCCUGGAAGAACUGGUGUCUGCC GCCGGACAGGAUUGCGCUGAAGUGGAUGCCAUCCUGCGCGAGAU CAGCGAGAGAUGUGAUGAGGCCCUGCAGAGCAGGGACCCCAAAA GACCUAGACUGCUGCCCGAGCCUGCCAACACCGAUACCAGACCU GGAAAUCUGCACGGCGCCUUCAGAGGCCUGAGAACCGAUUGCUC UAGAAGCGCCCUGAACCUGAGCCACAGCGAACUCGAAGAAGGCG GCAGCUUCAGCACCCGGAUCAGAAGCCACAGCACCAUCAGAACC CUGGCCUUUCCACAGGGCAACGCCUUCACAAUCAGAACCGCCAA CGGCGGCUACAAGUUCAGAUGGGUGCCAAGCUGAGCUAGCCACC GGGCAAUACGAGCUCAAGCCAGUCUCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO: 5 Sequência com UTR mínima de Ethris 5’ (ETH031T06): Parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, elemento Kozak, códon inicial (AUG), sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, códon de parada (UGA), parte de sítio de restrição para BstBI, poliA : cauda de “A” produzida por meio de pós-adenilação de RNAm

GGGAGACGCCACCAUGGCUGAACCUGGCGGAGCCGCCG GAAGAUCCCACCCUGAAGAUGGCUCUGCCAGCGAGGGCGAGAAA

111 / 141

GAGGGCAACAACGAGAGCCACAUGGUGUCCCCCCCAGAGAAGGA CGACGGCCAGAAAGGCGAAGAGGCCGUGGGCUCUACCGAGCACC CUGAGGAAGUGACCACACAGGCCGAGGCCGCCAUUGAAGAGGGC GAGGUGGAAACAGAGGGCGAAGCCGCUGUGGAAGGCGAAGAGG AAGCCGUGUCUUACGGCGACGCCGAGAGCGAGGAAGAGUACUAC UACACCGAGACAAGCAGCCCCGAGGGCCAGAUCUCUGCCGCCGA UACCACCUACCCCUACUUCAGCCCCCCUCAGGAACUGCCUGGGG AAGAGGCCUACGAUAGCGUGUCCGGCGAAGCUGGCCUGCAGGGC UUUCAGCAGGAAGCCACAGGCCCUCCCGAGAGCCGGGAAAGAAG AGUGACAAGCCCCGAGCCUAGCCACGGCGUGCUGGGACCAUCUG AGCAGAUGGGCCAAGUGACCUCUGGCCCUGCUGUGGGCAGACUG ACAGGCAGCACAGAGGAACCUCAGGGCCAGGUGCUGCCUAUGGG AGUGCAGCACCGGUUCAGACUGAGCCACGGCAGCGACAUCGAGA GCAGCGACCUGGAAGAGUUCGUCAGCCAGGAACCCGUGAUCCCU CCUGGCGUGCCAGAUGCCCAUCCCAGGGAAGGCGAUCUGCCCGU GUUCCAGGACCAGAUCCAGCAGCCCUCUACCGAAGAGGGGGCUA UGGCCGAGAGAGUGGAAAGCGAGGGCUCCGACGAAGAAGCCGAG GACGAGGGAUCUCAGCUGGUGGUGCUGGACCCCGACCACCCUCU GAUGGUGCGGUUUCAGGCCGCCCUGAAGAACUACCUGAACCGGC AGAUCGAGAAGCUGAAACUGGACCUGCAGGAACUGGUGGUGGCC ACAAAGCAGAGCAGAGCCCAGAGACAGGAACUGGGCGUGAACCU GUACGAGGUGCAGCAGCAUCUGGUGCAUCUGCAGAAGCUGCUGG AAAAGAGCCACGACCGGCACGCCAUGGCCAGCUCUGAGCGCAGA CAGAAAGAGGAAGAACUGCAGGCCGCCAGAGCCCUGUACACCAA GACAUGCGCCGCUGCCAACGAGGAACGGAAGAAGCUGGCUGCCC UGCAGACCGAGAUGGAAAACCUGGCUCUGCACCUGUUCUACAUG CAGAAUAUCGACCAGGACAUGCGGGACGACAUCAGAGUGAUGAC CCAGGUCGUGAAGAAGGCCGAGACAGAGAGAAUCCGGGCCGAGA UUGAGAAGAAAAAGCAGGACCUGUACGUGGACCAGCUGACCACC

112 / 141

AGGGCCCAGCAGCUGGAAGAGGAUAUCGCCCUGUUCGAGGCCCA GUACCUGGCCCAGGCCGAAGAUACCCGGAUCCUGAGAAAGGCCG UGUCCGAGGCCUGCACCGAGAUCGAUGCCAUCAGCGUGGAAAAG CGGCGGAUCAUGCAGCAGUGGGCCAGCAGCCUCGUGGGCAUGAA GCACAGAGAUGAGGCCCACCGGGCCGUGCUGGAAGCUCUGAGAG GCUGUCAGCACCAGGCCAAGAGCACCGACGGCGAGAUCGAGGCC UACAAGAAAUCCAUCAUGAAGGAAGAGGAAAAGAACGAGAAAC UGGCCAGCAUCCUGAACAGAACCGAAACCGAGGCCACCCUGCUG CAGAAACUGACCACCCAGUGCCUGACCAAACAGGUGGCCCUGCA GUCCCAGUUCAACACCUACAGACUGACCCUGCAGGACACCGAGG ACGCCCUGAGUCAGGAUCAGCUGGAACAGAUGAUUCUGACCGAG GAACUGCAGGCUAUCCGGCAGGCCAUUCAGGGGGAGCUGGAACU GCGGAGAAAGACCGACGCCGCCAUCAGAGAGAAGCUGCAGGAAC ACAUGACCAGCAACAAGACCACCAAGUACUUCAACCAGCUGAUU CUGCGCCUGCAGAAAGAAAAGACCAACAUGAUGACACACCUGAG CAAGAUCAACGGCGACAUUGCCCAGACCACCCUGGACAUCACCC ACACCAGCAGCAGACUGGACGCCCACCAGAAAACCCUGGUGGAA CUGGACCAGGAUGUGAAGAAAGUGAACGAGCUGAUCACCAACAG CCAGAGCGAGAUCAGCCGGCGGACCAUCCUGAUCGAGAGAAAGC AGGGCCUGAUCAACUUCCUGAACAAACAGCUGGAAAGAAUGGUG UCCGAGCUGGGCGGCGAGGAAGUGGGACCUCUGGAACUGGAAAU CAAGCGGCUGAGCAAGCUGAUCGACGAGCACGACGGCAAGGCCG UGCAGGCUCAAGUGACAUGGCUGCGGCUGCAGCAGGAAAUGGUC AAAGUGACCCAGGAACAGGAAGAACAGCUGGCCUCCCUGGACGC CAGCAAGAAAGAACUGCACAUCAUGGAACAGAAAAAGCUGCGGG UGGAAAGCAAGAUCGAGCAGGAAAAAAAAGAACAGAAAGAAAU CGAGCACCACAUGAAGGACCUGGACAACGACCUGAAGAAACUGA AUAUGCUGAUGAACAAGAACCGCUGCUCCAGCGAAGAACUGGAA CAGAACAACAGAGUGACCGAGAACGAGUUCGUGCGGAGCCUGAA

113 / 141

GGCCAGCGAGCGGGAAACCAUCAAGAUGCAGGACAAGCUGAACC AGCUGUCCGAGGAAAAAGCCACACUGCUGAACCAGCUGGUGGAA GCCGAGCACCAGAUCAUGCUGUGGGAGAAGAAGAUCCAGCUGGC CAAAGAAAUGCGGAGCAGCGUGGACAGCGAGAUCGGCCAGACCG AAAUCAGAGCCAUGAAGGGCGAGAUCCACCGGAUGAAAGUGCGG CUGGGACAGCUGCUGAAACAGCAGGAAAAGAUGAUCCGGGCCAU GGAACUGGCCGUGGCCAGACGGGAAACCGUGACAACCCAGGCUG AGGGCCAGCGGAAGAUGGACAGAAAGGCCCUGACCCGGACCGAC UUCCACCACAAGCAGCUGGAACUGAGGCGGAAGAUCCGGGACGU GCGGAAGGCCACCGAUGAGUGCACAAAGACAGUGCUGGAACUGG AAGAGACACAGCGGAACGUGUCCUCCAGCCUGCUGGAAAAACAG GAAAAGCUGAGCGUGAUCCAGGCCGACUUCGACACCCUGGAAGC UGACCUGACAAGACUGGGAGCCCUGAAAAGACAGAACCUGUCCG AGAUCGUGGCACUGCAGACCCGGCUGAAACAUCUGCAGGCUGUG AAAGAGGGACGCUACGUGUUCCUGUUCAGAUCCAAGCAGUCUCU GGUGCUGGAAAGACAGCGGCUGGACAAGCGGCUGGCACUGAUUG CCACCAUCCUGGAUAGAGUGCGCGACGAGUACCCACAGUUCCAG

GAAGCACUGCACAAGGUGUCCCAGAUGAUCGCCAACAAGCUGGA AUCCCCUGGCCCCAGCUGAUUCG-poliA SEQ ID NO: 6 Sequência com UTR 5’ TISU (ETH031T07): Parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris com nucleotídeo U adicional, TISU elemento, códon inicial (AUG), sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, códon de parada (UGA), parte de sítio de restrição para BstBI, poliA: cauda de “A” produzida por meio de pós-adenilação de RNAm

GGGAGACUGCCAAGAUGGCUGAACCUGGCGGAGCCGCC GGAAGAUCCCACCCUGAAGAUGGCUCUGCCAGCGAGGGCGAGAA AGAGGGCAACAACGAGAGCCACAUGGUGUCCCCCCCAGAGAAGG

114 / 141

ACGACGGCCAGAAAGGCGAAGAGGCCGUGGGCUCUACCGAGCAC CCUGAGGAAGUGACCACACAGGCCGAGGCCGCCAUUGAAGAGGG CGAGGUGGAAACAGAGGGCGAAGCCGCUGUGGAAGGCGAAGAG GAAGCCGUGUCUUACGGCGACGCCGAGAGCGAGGAAGAGUACUA CUACACCGAGACAAGCAGCCCCGAGGGCCAGAUCUCUGCCGCCG AUACCACCUACCCCUACUUCAGCCCCCCUCAGGAACUGCCUGGG GAAGAGGCCUACGAUAGCGUGUCCGGCGAAGCUGGCCUGCAGGG CUUUCAGCAGGAAGCCACAGGCCCUCCCGAGAGCCGGGAAAGAA GAGUGACAAGCCCCGAGCCUAGCCACGGCGUGCUGGGACCAUCU GAGCAGAUGGGCCAAGUGACCUCUGGCCCUGCUGUGGGCAGACU GACAGGCAGCACAGAGGAACCUCAGGGCCAGGUGCUGCCUAUGG GAGUGCAGCACCGGUUCAGACUGAGCCACGGCAGCGACAUCGAG AGCAGCGACCUGGAAGAGUUCGUCAGCCAGGAACCCGUGAUCCC UCCUGGCGUGCCAGAUGCCCAUCCCAGGGAAGGCGAUCUGCCCG UGUUCCAGGACCAGAUCCAGCAGCCCUCUACCGAAGAGGGGGCU AUGGCCGAGAGAGUGGAAAGCGAGGGCUCCGACGAAGAAGCCGA GGACGAGGGAUCUCAGCUGGUGGUGCUGGACCCCGACCACCCUC UGAUGGUGCGGUUUCAGGCCGCCCUGAAGAACUACCUGAACCGG CAGAUCGAGAAGCUGAAACUGGACCUGCAGGAACUGGUGGUGGC CACAAAGCAGAGCAGAGCCCAGAGACAGGAACUGGGCGUGAACC UGUACGAGGUGCAGCAGCAUCUGGUGCAUCUGCAGAAGCUGCUG GAAAAGAGCCACGACCGGCACGCCAUGGCCAGCUCUGAGCGCAG ACAGAAAGAGGAAGAACUGCAGGCCGCCAGAGCCCUGUACACCA AGACAUGCGCCGCUGCCAACGAGGAACGGAAGAAGCUGGCUGCC CUGCAGACCGAGAUGGAAAACCUGGCUCUGCACCUGUUCUACAU GCAGAAUAUCGACCAGGACAUGCGGGACGACAUCAGAGUGAUGA CCCAGGUCGUGAAGAAGGCCGAGACAGAGAGAAUCCGGGCCGAG AUUGAGAAGAAAAAGCAGGACCUGUACGUGGACCAGCUGACCAC CAGGGCCCAGCAGCUGGAAGAGGAUAUCGCCCUGUUCGAGGCCC

115 / 141

AGUACCUGGCCCAGGCCGAAGAUACCCGGAUCCUGAGAAAGGCC GUGUCCGAGGCCUGCACCGAGAUCGAUGCCAUCAGCGUGGAAAA GCGGCGGAUCAUGCAGCAGUGGGCCAGCAGCCUCGUGGGCAUGA AGCACAGAGAUGAGGCCCACCGGGCCGUGCUGGAAGCUCUGAGA GGCUGUCAGCACCAGGCCAAGAGCACCGACGGCGAGAUCGAGGC CUACAAGAAAUCCAUCAUGAAGGAAGAGGAAAAGAACGAGAAA CUGGCCAGCAUCCUGAACAGAACCGAAACCGAGGCCACCCUGCU GCAGAAACUGACCACCCAGUGCCUGACCAAACAGGUGGCCCUGC AGUCCCAGUUCAACACCUACAGACUGACCCUGCAGGACACCGAG GACGCCCUGAGUCAGGAUCAGCUGGAACAGAUGAUUCUGACCGA GGAACUGCAGGCUAUCCGGCAGGCCAUUCAGGGGGAGCUGGAAC UGCGGAGAAAGACCGACGCCGCCAUCAGAGAGAAGCUGCAGGAA CACAUGACCAGCAACAAGACCACCAAGUACUUCAACCAGCUGAU UCUGCGCCUGCAGAAAGAAAAGACCAACAUGAUGACACACCUGA GCAAGAUCAACGGCGACAUUGCCCAGACCACCCUGGACAUCACC CACACCAGCAGCAGACUGGACGCCCACCAGAAAACCCUGGUGGA ACUGGACCAGGAUGUGAAGAAAGUGAACGAGCUGAUCACCAACA GCCAGAGCGAGAUCAGCCGGCGGACCAUCCUGAUCGAGAGAAAG CAGGGCCUGAUCAACUUCCUGAACAAACAGCUGGAAAGAAUGGU GUCCGAGCUGGGCGGCGAGGAAGUGGGACCUCUGGAACUGGAAA UCAAGCGGCUGAGCAAGCUGAUCGACGAGCACGACGGCAAGGCC GUGCAGGCUCAAGUGACAUGGCUGCGGCUGCAGCAGGAAAUGGU CAAAGUGACCCAGGAACAGGAAGAACAGCUGGCCUCCCUGGACG CCAGCAAGAAAGAACUGCACAUCAUGGAACAGAAAAAGCUGCGG GUGGAAAGCAAGAUCGAGCAGGAAAAAAAAGAACAGAAAGAAA UCGAGCACCACAUGAAGGACCUGGACAACGACCUGAAGAAACUG AAUAUGCUGAUGAACAAGAACCGCUGCUCCAGCGAAGAACUGGA ACAGAACAACAGAGUGACCGAGAACGAGUUCGUGCGGAGCCUGA AGGCCAGCGAGCGGGAAACCAUCAAGAUGCAGGACAAGCUGAAC

116 / 141

CAGCUGUCCGAGGAAAAAGCCACACUGCUGAACCAGCUGGUGGA AGCCGAGCACCAGAUCAUGCUGUGGGAGAAGAAGAUCCAGCUGG CCAAAGAAAUGCGGAGCAGCGUGGACAGCGAGAUCGGCCAGACC GAAAUCAGAGCCAUGAAGGGCGAGAUCCACCGGAUGAAAGUGCG GCUGGGACAGCUGCUGAAACAGCAGGAAAAGAUGAUCCGGGCCA UGGAACUGGCCGUGGCCAGACGGGAAACCGUGACAACCCAGGCU GAGGGCCAGCGGAAGAUGGACAGAAAGGCCCUGACCCGGACCGA CUUCCACCACAAGCAGCUGGAACUGAGGCGGAAGAUCCGGGACG UGCGGAAGGCCACCGAUGAGUGCACAAAGACAGUGCUGGAACUG GAAGAGACACAGCGGAACGUGUCCUCCAGCCUGCUGGAAAAACA GGAAAAGCUGAGCGUGAUCCAGGCCGACUUCGACACCCUGGAAG CUGACCUGACAAGACUGGGAGCCCUGAAAAGACAGAACCUGUCC GAGAUCGUGGCACUGCAGACCCGGCUGAAACAUCUGCAGGCUGU GAAAGAGGGACGCUACGUGUUCCUGUUCAGAUCCAAGCAGUCUC UGGUGCUGGAAAGACAGCGGCUGGACAAGCGGCUGGCACUGAUU GCCACCAUCCUGGAUAGAGUGCGCGACGAGUACCCACAGUUCCA

GGAAGCACUGCACAAGGUGUCCCAGAUGAUCGCCAACAAGCUGG AAUCCCCUGGCCCCAGCUGAUUCG-poliA SEQ ID NO: 7 Sequência com UTR 5’ hAg, mas sem UTR 3’ (ETH031T08): Parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, hAg 5’UTR, elemento Kozak, códon inicial (AUG), sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, códon de parada (UGA), parte de sítio de restrição para BstBI, poliA: cauda de “A” produzida por meio de pós-adenilação de RNAm

GGGAGACUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACGC CACCAUGGCUGAACCUGGCGGAGCCGCCGGAAGAUCCCACCCUG AAGAUGGCUCUGCCAGCGAGGGCGAGAAAGAGGGCAACAACGAG

117 / 141

AGCCACAUGGUGUCCCCCCCAGAGAAGGACGACGGCCAGAAAGG CGAAGAGGCCGUGGGCUCUACCGAGCACCCUGAGGAAGUGACCA CACAGGCCGAGGCCGCCAUUGAAGAGGGCGAGGUGGAAACAGAG GGCGAAGCCGCUGUGGAAGGCGAAGAGGAAGCCGUGUCUUACGG CGACGCCGAGAGCGAGGAAGAGUACUACUACACCGAGACAAGCA GCCCCGAGGGCCAGAUCUCUGCCGCCGAUACCACCUACCCCUACU UCAGCCCCCCUCAGGAACUGCCUGGGGAAGAGGCCUACGAUAGC GUGUCCGGCGAAGCUGGCCUGCAGGGCUUUCAGCAGGAAGCCAC AGGCCCUCCCGAGAGCCGGGAAAGAAGAGUGACAAGCCCCGAGC CUAGCCACGGCGUGCUGGGACCAUCUGAGCAGAUGGGCCAAGUG ACCUCUGGCCCUGCUGUGGGCAGACUGACAGGCAGCACAGAGGA ACCUCAGGGCCAGGUGCUGCCUAUGGGAGUGCAGCACCGGUUCA GACUGAGCCACGGCAGCGACAUCGAGAGCAGCGACCUGGAAGAG UUCGUCAGCCAGGAACCCGUGAUCCCUCCUGGCGUGCCAGAUGC CCAUCCCAGGGAAGGCGAUCUGCCCGUGUUCCAGGACCAGAUCC AGCAGCCCUCUACCGAAGAGGGGGCUAUGGCCGAGAGAGUGGAA AGCGAGGGCUCCGACGAAGAAGCCGAGGACGAGGGAUCUCAGCU GGUGGUGCUGGACCCCGACCACCCUCUGAUGGUGCGGUUUCAGG CCGCCCUGAAGAACUACCUGAACCGGCAGAUCGAGAAGCUGAAA CUGGACCUGCAGGAACUGGUGGUGGCCACAAAGCAGAGCAGAGC CCAGAGACAGGAACUGGGCGUGAACCUGUACGAGGUGCAGCAGC AUCUGGUGCAUCUGCAGAAGCUGCUGGAAAAGAGCCACGACCGG CACGCCAUGGCCAGCUCUGAGCGCAGACAGAAAGAGGAAGAACU GCAGGCCGCCAGAGCCCUGUACACCAAGACAUGCGCCGCUGCCA ACGAGGAACGGAAGAAGCUGGCUGCCCUGCAGACCGAGAUGGAA AACCUGGCUCUGCACCUGUUCUACAUGCAGAAUAUCGACCAGGA CAUGCGGGACGACAUCAGAGUGAUGACCCAGGUCGUGAAGAAGG CCGAGACAGAGAGAAUCCGGGCCGAGAUUGAGAAGAAAAAGCAG GACCUGUACGUGGACCAGCUGACCACCAGGGCCCAGCAGCUGGA

118 / 141

AGAGGAUAUCGCCCUGUUCGAGGCCCAGUACCUGGCCCAGGCCG AAGAUACCCGGAUCCUGAGAAAGGCCGUGUCCGAGGCCUGCACC GAGAUCGAUGCCAUCAGCGUGGAAAAGCGGCGGAUCAUGCAGCA GUGGGCCAGCAGCCUCGUGGGCAUGAAGCACAGAGAUGAGGCCC ACCGGGCCGUGCUGGAAGCUCUGAGAGGCUGUCAGCACCAGGCC AAGAGCACCGACGGCGAGAUCGAGGCCUACAAGAAAUCCAUCAU GAAGGAAGAGGAAAAGAACGAGAAACUGGCCAGCAUCCUGAACA GAACCGAAACCGAGGCCACCCUGCUGCAGAAACUGACCACCCAG UGCCUGACCAAACAGGUGGCCCUGCAGUCCCAGUUCAACACCUA CAGACUGACCCUGCAGGACACCGAGGACGCCCUGAGUCAGGAUC AGCUGGAACAGAUGAUUCUGACCGAGGAACUGCAGGCUAUCCGG CAGGCCAUUCAGGGGGAGCUGGAACUGCGGAGAAAGACCGACGC CGCCAUCAGAGAGAAGCUGCAGGAACACAUGACCAGCAACAAGA CCACCAAGUACUUCAACCAGCUGAUUCUGCGCCUGCAGAAAGAA AAGACCAACAUGAUGACACACCUGAGCAAGAUCAACGGCGACAU UGCCCAGACCACCCUGGACAUCACCCACACCAGCAGCAGACUGG ACGCCCACCAGAAAACCCUGGUGGAACUGGACCAGGAUGUGAAG AAAGUGAACGAGCUGAUCACCAACAGCCAGAGCGAGAUCAGCCG GCGGACCAUCCUGAUCGAGAGAAAGCAGGGCCUGAUCAACUUCC UGAACAAACAGCUGGAAAGAAUGGUGUCCGAGCUGGGCGGCGAG GAAGUGGGACCUCUGGAACUGGAAAUCAAGCGGCUGAGCAAGCU GAUCGACGAGCACGACGGCAAGGCCGUGCAGGCUCAAGUGACAU GGCUGCGGCUGCAGCAGGAAAUGGUCAAAGUGACCCAGGAACAG GAAGAACAGCUGGCCUCCCUGGACGCCAGCAAGAAAGAACUGCA CAUCAUGGAACAGAAAAAGCUGCGGGUGGAAAGCAAGAUCGAGC AGGAAAAAAAAGAACAGAAAGAAAUCGAGCACCACAUGAAGGA CCUGGACAACGACCUGAAGAAACUGAAUAUGCUGAUGAACAAGA ACCGCUGCUCCAGCGAAGAACUGGAACAGAACAACAGAGUGACC GAGAACGAGUUCGUGCGGAGCCUGAAGGCCAGCGAGCGGGAAAC

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CAUCAAGAUGCAGGACAAGCUGAACCAGCUGUCCGAGGAAAAAG CCACACUGCUGAACCAGCUGGUGGAAGCCGAGCACCAGAUCAUG CUGUGGGAGAAGAAGAUCCAGCUGGCCAAAGAAAUGCGGAGCAG CGUGGACAGCGAGAUCGGCCAGACCGAAAUCAGAGCCAUGAAGG GCGAGAUCCACCGGAUGAAAGUGCGGCUGGGACAGCUGCUGAAA CAGCAGGAAAAGAUGAUCCGGGCCAUGGAACUGGCCGUGGCCAG ACGGGAAACCGUGACAACCCAGGCUGAGGGCCAGCGGAAGAUGG ACAGAAAGGCCCUGACCCGGACCGACUUCCACCACAAGCAGCUG GAACUGAGGCGGAAGAUCCGGGACGUGCGGAAGGCCACCGAUGA GUGCACAAAGACAGUGCUGGAACUGGAAGAGACACAGCGGAACG UGUCCUCCAGCCUGCUGGAAAAACAGGAAAAGCUGAGCGUGAUC CAGGCCGACUUCGACACCCUGGAAGCUGACCUGACAAGACUGGG AGCCCUGAAAAGACAGAACCUGUCCGAGAUCGUGGCACUGCAGA CCCGGCUGAAACAUCUGCAGGCUGUGAAAGAGGGACGCUACGUG UUCCUGUUCAGAUCCAAGCAGUCUCUGGUGCUGGAAAGACAGCG GCUGGACAAGCGGCUGGCACUGAUUGCCACCAUCCUGGAUAGAG UGCGCGACGAGUACCCACAGUUCCAGGAAGCACUGCACAAGGUG

UCCCAGAUGAUCGCCAACAAGCUGGAAUCCCCUGGCCCCAGCUG AUUCG-poliA SEQ ID NO: 8 Sequência com CMV IE9 UTR 5’ de humano e UTR 3’ do hormônio do crescimento humano (ETH031T10): URT 5’ mínima de Ethris, CMV IE9 UTR 5’ Parte do promotor T7, de humano, elemento Kozak, códon inicial (AUG), sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, códon de parada (UGA), UTR 3’ do hormônio do crescimento humano, parte de sítio de restrição para BstBI, poliA: cauda de “A” produzida por meio de pós-adenilação de RNAm

GGGAGACCAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCC AUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUG

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121 / 141

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122 / 141

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UCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCC UAAUAAAAUUAAGUUGCAUCUUCG-poliA SEQ ID NO: 9 ETH031T28: CCDC40 com etiqueta EGFP N terminal Parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, elemento Kozak, espaçador G4S códon inicial (AUG), sequência que codifica um EGFP proteína, , sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma

123 / 141 proteína de CCDC40 de humano, códon de parada (UGA), parte de sítio de restrição para BstBI, cauda poli(a)

GGGAGACGCCACCAUGGUGAGCAAGGGCGAGGAGCUGU UCACCGGGGUGGUGCCCAUCCUGGUCGAGCUGGACGGCGACGUAA ACGGCCACAAGUUCAGCGUGUCCGGCGAGGGCGAGGGCGAUGCCA CCUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGCU GCCCGUGCCCUGGCCCACCCUCGUGACCACCCUGACCUACGGCGU GCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUGAAGCAGCACGACUUC UUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACGUCCAGGAGCGCACCAUCU UCUUCAAGGACGACGGCAACUACAAGACCCGCGCCGAGGUGAAGUU CGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAUCGAGCUGAAGGGCAUCGAC UUCAAGGAGGACGGCAACAUCCUGGGGCACAAGCUGGAGUACAACU ACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGACAAGCAGAAGAACGGC AUCAAGGUGAACUUCAAGAUCCGCCACAACAUCGAGGACGGCAGCG UGCAGCUCGCCGACCACUACCAGCAGAACACCCCCAUCGGCGACGG CCCCGUGCUGCUGCCCGACAACCACUACCUGAGCACCCAGUCCGCC CUGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGAUCACAUGGUCCUGCUGG AGUUCGUGACCGCCGCCGGGAUCACUCUCGGCAUGGACGAGCUGU ACAAGGGCGGAGGGGGCAGCGCUGAACCUGGCGGAGCCGCCGGAAGAUCC CACCCUGAAGAUGGCUCUGCCAGCGAGGGCGAGAAAGAGGGCAA CAACGAGAGCCACAUGGUGUCCCCCCCAGAGAAGGACGACGGCC AGAAAGGCGAAGAGGCCGUGGGCUCUACCGAGCACCCUGAGGAA GUGACCACACAGGCCGAGGCCGCCAUUGAAGAGGGCGAGGUGGA AACAGAGGGCGAAGCCGCUGUGGAAGGCGAAGAGGAAGCCGUGU CUUACGGCGACGCCGAGAGCGAGGAAGAGUACUACUACACCGAG ACAAGCAGCCCCGAGGGCCAGAUCUCUGCCGCCGAUACCACCUA CCCCUACUUCAGCCCCCCUCAGGAACUGCCUGGGGAAGAGGCCU ACGAUAGCGUGUCCGGCGAAGCUGGCCUGCAGGGCUUUCAGCAG GAAGCCACAGGCCCUCCCGAGAGCCGGGAAAGAAGAGUGACAAG

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126 / 141

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AAAAAAA SEQ ID NO: 10 ETH031T30: CCDC40 com etiqueta EGFP C terminal Parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, elemento Kozak, códon inicial (AUG), sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, espaçador G4S, sequência que codifica um EGFP proteína, códon de parada (UGA), parte de sítio de restrição para BstBI, cauda poli(a)

GGGAGACGCCACCAUGGCUGAACCUGGCGGAGCCGCCG GAAGAUCCCACCCUGAAGAUGGCUCUGCCAGCGAGGGCGAGAAA GAGGGCAACAACGAGAGCCACAUGGUGUCCCCCCCAGAGAAGGA CGACGGCCAGAAAGGCGAAGAGGCCGUGGGCUCUACCGAGCACC CUGAGGAAGUGACCACACAGGCCGAGGCCGCCAUUGAAGAGGGC GAGGUGGAAACAGAGGGCGAAGCCGCUGUGGAAGGCGAAGAGG AAGCCGUGUCUUACGGCGACGCCGAGAGCGAGGAAGAGUACUAC UACACCGAGACAAGCAGCCCCGAGGGCCAGAUCUCUGCCGCCGA UACCACCUACCCCUACUUCAGCCCCCCUCAGGAACUGCCUGGGG AAGAGGCCUACGAUAGCGUGUCCGGCGAAGCUGGCCUGCAGGGC

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129 / 141

UUCCACCACAAGCAGCUGGAACUGAGGCGGAAGAUCCGGGACGU GCGGAAGGCCACCGAUGAGUGCACAAAGACAGUGCUGGAACUGG AAGAGACACAGCGGAACGUGUCCUCCAGCCUGCUGGAAAAACAG GAAAAGCUGAGCGUGAUCCAGGCCGACUUCGACACCCUGGAAGC UGACCUGACAAGACUGGGAGCCCUGAAAAGACAGAACCUGUCCG AGAUCGUGGCACUGCAGACCCGGCUGAAACAUCUGCAGGCUGUG AAAGAGGGACGCUACGUGUUCCUGUUCAGAUCCAAGCAGUCUCU GGUGCUGGAAAGACAGCGGCUGGACAAGCGGCUGGCACUGAUUG CCACCAUCCUGGAUAGAGUGCGCGACGAGUACCCACAGUUCCAG GAAGCACUGCACAAGGUGUCCCAGAUGAUCGCCAACAAGCUGGA AUCCCCUGGCCCCAGCGGCGGAGGGGGCAGCGUGAGCAAGGGCGAGGAGC UGUUCACCGGGGUGGUGCCCAUCCUGGUCGAGCUGGACGGCGACG UAAACGGCCACAAGUUCAGCGUGUCCGGCGAGGGCGAGGGCGAUG CCACCUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAA GCUGCCCGUGCCCUGGCCCACCCUCGUGACCACCCUGACCUACGG CGUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUGAAGCAGCACGAC UUCUUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACGUCCAGGAGCGCACCA UCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUACAAGACCCGCGCCGAGGUGAA GUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAUCGAGCUGAAGGGCAU CGACUUCAAGGAGGACGGCAACAUCCUGGGGCACAAGCUGGAGUAC AACUACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGACAAGCAGAAGAA CGGCAUCAAGGUGAACUUCAAGAUCCGCCACAACAUCGAGGACGGC AGCGUGCAGCUCGCCGACCACUACCAGCAGAACACCCCCAUCGGCG ACGGCCCCGUGCUGCUGCCCGACAACCACUACCUGAGCACCCAGUC CGCCCUGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGAUCACAUGGUCCUG CUGGAGUUCGUGACCGCCGCCGGGAUCACUCUCGGCAUGGACGAG CUGUACAAGUGAUUCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

130 / 141 SEQ ID NO: 11 ETH031T26: CCDC40 com etiqueta HA N terminal- peptídeo T2A -tdTomato com UTRs 5’ e 3’ Parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, UTR 5’ CYBA, espaçador G4S elemento Kozak, códon inicial (AUG), etiqueta HA, , sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC40 de humano, peptídeo T2A , tdTomato, códon de parada (UGA), UTR 3’ CYBA, parte de sítio de restrição para BstBI, cauda poli(a)

GGGAGACCGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUG UCGCCGCCACCAUGUACCCCUACGACGUGCCCGACUACGCCGGCGGAGGGGGCAGCGCUG AACCUGGCGGAGCCGCCGGAAGAUCCCACCCUGAAGAUGGCUCU GCCAGCGAGGGCGAGAAAGAGGGCAACAACGAGAGCCACAUGGU GUCCCCCCCAGAGAAGGACGACGGCCAGAAAGGCGAAGAGGCCG UGGGCUCUACCGAGCACCCUGAGGAAGUGACCACACAGGCCGAG GCCGCCAUUGAAGAGGGCGAGGUGGAAACAGAGGGCGAAGCCGC UGUGGAAGGCGAAGAGGAAGCCGUGUCUUACGGCGACGCCGAGA GCGAGGAAGAGUACUACUACACCGAGACAAGCAGCCCCGAGGGC CAGAUCUCUGCCGCCGAUACCACCUACCCCUACUUCAGCCCCCCU CAGGAACUGCCUGGGGAAGAGGCCUACGAUAGCGUGUCCGGCGA AGCUGGCCUGCAGGGCUUUCAGCAGGAAGCCACAGGCCCUCCCG AGAGCCGGGAAAGAAGAGUGACAAGCCCCGAGCCUAGCCACGGC GUGCUGGGACCAUCUGAGCAGAUGGGCCAAGUGACCUCUGGCCC UGCUGUGGGCAGACUGACAGGCAGCACAGAGGAACCUCAGGGCC AGGUGCUGCCUAUGGGAGUGCAGCACCGGUUCAGACUGAGCCAC GGCAGCGACAUCGAGAGCAGCGACCUGGAAGAGUUCGUCAGCCA GGAACCCGUGAUCCCUCCUGGCGUGCCAGAUGCCCAUCCCAGGG AAGGCGAUCUGCCCGUGUUCCAGGACCAGAUCCAGCAGCCCUCU ACCGAAGAGGGGGCUAUGGCCGAGAGAGUGGAAAGCGAGGGCUC CGACGAAGAAGCCGAGGACGAGGGAUCUCAGCUGGUGGUGCUGG

131 / 141

ACCCCGACCACCCUCUGAUGGUGCGGUUUCAGGCCGCCCUGAAG AACUACCUGAACCGGCAGAUCGAGAAGCUGAAACUGGACCUGCA GGAACUGGUGGUGGCCACAAAGCAGAGCAGAGCCCAGAGACAGG AACUGGGCGUGAACCUGUACGAGGUGCAGCAGCAUCUGGUGCAU CUGCAGAAGCUGCUGGAAAAGAGCCACGACCGGCACGCCAUGGC CAGCUCUGAGCGCAGACAGAAAGAGGAAGAACUGCAGGCCGCCA GAGCCCUGUACACCAAGACAUGCGCCGCUGCCAACGAGGAACGG AAGAAGCUGGCUGCCCUGCAGACCGAGAUGGAAAACCUGGCUCU GCACCUGUUCUACAUGCAGAAUAUCGACCAGGACAUGCGGGACG ACAUCAGAGUGAUGACCCAGGUCGUGAAGAAGGCCGAGACAGAG AGAAUCCGGGCCGAGAUUGAGAAGAAAAAGCAGGACCUGUACGU GGACCAGCUGACCACCAGGGCCCAGCAGCUGGAAGAGGAUAUCG CCCUGUUCGAGGCCCAGUACCUGGCCCAGGCCGAAGAUACCCGG AUCCUGAGAAAGGCCGUGUCCGAGGCCUGCACCGAGAUCGAUGC CAUCAGCGUGGAAAAGCGGCGGAUCAUGCAGCAGUGGGCCAGCA GCCUCGUGGGCAUGAAGCACAGAGAUGAGGCCCACCGGGCCGUG CUGGAAGCUCUGAGAGGCUGUCAGCACCAGGCCAAGAGCACCGA CGGCGAGAUCGAGGCCUACAAGAAAUCCAUCAUGAAGGAAGAGG AAAAGAACGAGAAACUGGCCAGCAUCCUGAACAGAACCGAAACC GAGGCCACCCUGCUGCAGAAACUGACCACCCAGUGCCUGACCAA ACAGGUGGCCCUGCAGUCCCAGUUCAACACCUACAGACUGACCC UGCAGGACACCGAGGACGCCCUGAGUCAGGAUCAGCUGGAACAG AUGAUUCUGACCGAGGAACUGCAGGCUAUCCGGCAGGCCAUUCA GGGGGAGCUGGAACUGCGGAGAAAGACCGACGCCGCCAUCAGAG AGAAGCUGCAGGAACACAUGACCAGCAACAAGACCACCAAGUAC UUCAACCAGCUGAUUCUGCGCCUGCAGAAAGAAAAGACCAACAU GAUGACACACCUGAGCAAGAUCAACGGCGACAUUGCCCAGACCA CCCUGGACAUCACCCACACCAGCAGCAGACUGGACGCCCACCAG AAAACCCUGGUGGAACUGGACCAGGAUGUGAAGAAAGUGAACG

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134 / 141

GCCACUACCUGGUGGAGUUCAAGACCAUCUACAUGGCCAAGAAGCC CGUGCAACUGCCCGGCUACUACUACGUGGACACCAAGCUGGACAUC ACCUCCCACAACGAGGACUACACCAUCGUGGAACAGUACGAGCGCU CCGAGGGCCGCCACCACCUGUUCCUGUACGGCAUGGACGAGCUGU ACAAGUGACCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCCGCCAGGUGCACCCA CCUGCAAUAAAUGCAGCGAAGCCGGGAUUCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO: 12 ETH047T02 (CCDC39 com UTR mínima de Ethris): Parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, elemento Kozak, códon inicial (AUG), sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC39 de humano, códon de parada (UGA), parte de sítio de restrição para BstBI, cauda poli(a)

GGGAGACGCCACCAUGAGCAGCGAGUUUCUGGCCGAAC UGCACUGGGAGGACGGCUUCGCUAUUCCCGUGGCCAACGAGGAA AACAAGCUGCUGGAAGAUCAGCUGAGCAAGCUGAAGGACGAGAG AGCCUCUCUGCAGGACGAGCUGAGAGAGUACGAGGAACGGAUCA ACAGCAUGACCAGCCACUUCAAGAACGUGAAGCAAGAGCUGAGC AUCACCCAGAGCCUGUGCAAGGCCAGAGAGAGAGAAACCGAGAG CGAGGAACACUUCAAGGCUAUCGCCCAGCGCGAGCUGGGAAGAG UGAAGGAUGAGAUCCAGCGGCUGGAAAACGAGAUGGCCAGCAUC CUGGAAAAGAAGUCCGACAAAGAGAACGGCAUCUUCAAGGCCAC ACAGAAGCUGGACGGCCUGAAGUGCCAGAUGAACUGGGAUCAGC AGGCCCUGGAAGCCUGGCUGGAAGAGUCUGCCCACAAGGAUUCU GACGCCCUGACACUGCAGAAGUACGCCCAGCAGGACGACAACAA GAUCCGGGCUCUGACCCUGCAGCUGGAAAGACUGACCCUGGAAU GCAACCAGAAGCGGAAGAUCCUGGACAACGAGCUGACCGAGACA AUCAGCGCCCAGCUGGAACUGGAUAAGGCCGCUCAGGACUUCAG

135 / 141

AAAGAUCCACAACGAGCGGCAAGAACUGAUCAAGCAGUGGGAGA ACACCAUCGAGCAGAUGCAGAAACGCGACGGCGACAUCGACAAC UGCGCCCUGGAACUCGCCCGGAUCAAGCAAGAGACACGCGAGAA AGAGAACCUGGUCAAAGAGAAGAUCAAGUUCCUCGAGUCCGAGA UCGGCAACAACACCGAGUUCGAGAAGCGGAUCAGCGUGGCCGAC AGAAAGCUGCUGAAGUGCAGAACCGCCUACCAGGACCACGAGAC AAGCCGGAUUCAGCUCAAGGGCGAGCUGGAUUCUCUGAAGGCCA CCGUGAACAGAACCAGCAGCGAUCUGGAAGCCCUGCGGAAGAAC AUCAGCAAGAUCAAGAAGGACAUCCACGAGGAAACCGCCAGGCU GCAGAAAACAAAGAACCACAAUGAGAUCAUCCAGACCAAGCUGA AAGAGAUCACCGAAAAGACCAUGAGCGUGGAAGAGAAGGCCACA AACCUGGAAGAUAUGCUCAAAGAGGAAGAGAAAGACGUCAAAG AGGUGGACGUUCAACUGAACCUGAUUAAGGGCGUGCUGUUCAAG AAGGCCCAAGAGCUGCAGACCGAAACCAUGAAGGAAAAGGCCGU CCUGUCUGAGAUCGAGGGCACCAGAUCUAGCCUGAAGCACCUGA ACCAUCAGCUGCAGAAGCUCGACUUCGAGACACUGAAGCAGCAA GAGAUCAUGUACAGCCAGGAUUUCCACAUCCAGCAGGUCGAGCG GCGGAUGUCUAGACUGAAGGGCGAGAUCAACUCCGAGGAAAAAC AGGCCCUCGAGGCCAAGAUCGUGGAACUGAGAAAGAGCCUCGAA GAGAAGAAGUCUACCUGCGGCCUGCUGGAAACCCAGAUUAAGAA GCUGCACAACGACCUGUACUUCAUCAAGAAAGCCCACAGCAAGA ACAGCGACGAGAAGCAGAGCCUGAUGACCAAGAUCAAUGAGCUG AACCUGUUCAUCGAUCGGAGCGAAAAAGAGCUGGACAAGGCCAA GGGCUUCAAGCAGGACCUGAUGAUCGAGGACAACCUGCUGAAGC UGGAAGUGAAGCGGACCAGAGAGAUGCUGCACAGCAAGGCCGAG GAAGUGCUGUCUCUGGAAAAGCGGAAGCAGCAGCUGUACACCGC CAUGGAAGAGAGAACCGAAGAGAUCAAGGUGCACAAGACCAUGC UGGCUUCCCAGAUCAGAUACGUGGACCAAGAGCGCGAGAACAUC UCCACCGAGUUUAGAGAGAGACUGUCCAAGAUCGAGAAGCUGAA

136 / 141

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AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO: 13 RNA que codifica sequência de CCDC39 de humano e contém elemento TISU como UTR 5’ (ETH047T03) Parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris com nucleotídeo U adicional, elemento TISU, códon inicial (AUG), sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC39 de

137 / 141 cauda humano, códon de parada (UGA), parte de sítio de restrição para BstBI, poli(a)

GGGAGACUGCCAAGAUGAGCAGCGAGUUUCUGGCCGA ACUGCACUGGGAGGACGGCUUCGCUAUUCCCGUGGCCAACGAGG AAAACAAGCUGCUGGAAGAUCAGCUGAGCAAGCUGAAGGACGAG AGAGCCUCUCUGCAGGACGAGCUGAGAGAGUACGAGGAACGGAU CAACAGCAUGACCAGCCACUUCAAGAACGUGAAGCAAGAGCUGA GCAUCACCCAGAGCCUGUGCAAGGCCAGAGAGAGAGAAACCGAG AGCGAGGAACACUUCAAGGCUAUCGCCCAGCGCGAGCUGGGAAG AGUGAAGGAUGAGAUCCAGCGGCUGGAAAACGAGAUGGCCAGCA UCCUGGAAAAGAAGUCCGACAAAGAGAACGGCAUCUUCAAGGCC ACACAGAAGCUGGACGGCCUGAAGUGCCAGAUGAACUGGGAUCA GCAGGCCCUGGAAGCCUGGCUGGAAGAGUCUGCCCACAAGGAUU CUGACGCCCUGACACUGCAGAAGUACGCCCAGCAGGACGACAAC AAGAUCCGGGCUCUGACCCUGCAGCUGGAAAGACUGACCCUGGA AUGCAACCAGAAGCGGAAGAUCCUGGACAACGAGCUGACCGAGA CAAUCAGCGCCCAGCUGGAACUGGAUAAGGCCGCUCAGGACUUC AGAAAGAUCCACAACGAGCGGCAAGAACUGAUCAAGCAGUGGGA GAACACCAUCGAGCAGAUGCAGAAACGCGACGGCGACAUCGACA ACUGCGCCCUGGAACUCGCCCGGAUCAAGCAAGAGACACGCGAG AAAGAGAACCUGGUCAAAGAGAAGAUCAAGUUCCUCGAGUCCGA GAUCGGCAACAACACCGAGUUCGAGAAGCGGAUCAGCGUGGCCG ACAGAAAGCUGCUGAAGUGCAGAACCGCCUACCAGGACCACGAG ACAAGCCGGAUUCAGCUCAAGGGCGAGCUGGAUUCUCUGAAGGC CACCGUGAACAGAACCAGCAGCGAUCUGGAAGCCCUGCGGAAGA ACAUCAGCAAGAUCAAGAAGGACAUCCACGAGGAAACCGCCAGG CUGCAGAAAACAAAGAACCACAAUGAGAUCAUCCAGACCAAGCU GAAAGAGAUCACCGAAAAGACCAUGAGCGUGGAAGAGAAGGCCA CAAACCUGGAAGAUAUGCUCAAAGAGGAAGAGAAAGACGUCAA

138 / 141

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139 / 141

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AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO: 14 ETH047T05: SP30; RNA que codifica CCDC39 de humano e que contém sequência aleatória de 30 nucleotídeos (SP30) que foi usada como UTR 5’ Parte do promotor T7, URT 5’ mínima de Ethris, SP30 as UTR 5’, elemento Kozak, códon inicial (AUG), sequência de códon otimizada que codifica uma versão funcional de uma proteína de CCDC39 de humano, códon de parada (UGA), parte de sítio de restrição para BstBI, cauda poli(a)

GGGAGACAUUGAAAUUUAUCUCUUGUGUUGUGGUCGC GCCACCAUGAGCAGCGAGUUUCUGGCCGAACUGCACUGGGAGGA CGGCUUCGCUAUUCCCGUGGCCAACGAGGAAAACAAGCUGCUGG AAGAUCAGCUGAGCAAGCUGAAGGACGAGAGAGCCUCUCUGCAG GACGAGCUGAGAGAGUACGAGGAACGGAUCAACAGCAUGACCAG CCACUUCAAGAACGUGAAGCAAGAGCUGAGCAUCACCCAGAGCC UGUGCAAGGCCAGAGAGAGAGAAACCGAGAGCGAGGAACACUUC AAGGCUAUCGCCCAGCGCGAGCUGGGAAGAGUGAAGGAUGAGAU CCAGCGGCUGGAAAACGAGAUGGCCAGCAUCCUGGAAAAGAAGU CCGACAAAGAGAACGGCAUCUUCAAGGCCACACAGAAGCUGGAC

140 / 141

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia em um sujeito que sofre de uma ciliopatia, em que o polirribonucleotídeo codifica uma versão funcional de uma proteína cujo defeito está associado com a dita ciliopatia, e em que a administração da dita composição farmacêutica no sistema respiratório do dito paciente é realizada quando o paciente exibe uma inflamação do sistema respiratório.

2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a dita ciliopatia é discinesia ciliar primária (PCD).

3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a dita ciliopatia está associada com um defeito em um domínio com espiral enrolada contendo proteína 40 (CCDC40), e/ou com um defeito em um domínio com espiral enrolada contendo proteína 39 (CCDC39).

4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a presença ou ausência de uma inflamação do sistema respiratório de um sujeito que sofre de uma ciliopatia é determinada analisando uma amostra de sangue e/ou analisando a quantidade de óxido nítrico exalado.

5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que administração da composição farmacêutica compreende administração usando uma pulverização nasal e/ou um nebulizador e/ou por inalação.

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a composição farmacêutica é administrada pelo menos uma vez por semana e/ou por pelo menos 4 semanas.

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a composição farmacêutica compreende adicionalmente N-acetilcisteína (NAC) e/ou uma solução hipertônica compreendendo cloreto de sódio.

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a dita composição farmacêutica compreende adicionalmente um polirribonucleotídeo que codifica uma diferenciação multiciliada e proteína do ciclo celular associado à síntese de DNA (MCIDAS), e/ou em que a dita composição farmacêutica é uma primeira composição farmacêutica que é administrada junto com uma segunda composição farmacêutica, compreendendo um polirribonucleotídeo que codifica uma proteína MCIDAS.

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polirribonucleotídeo para uso no tratamento de uma ciliopatia como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a dita composição farmacêutica compreende adicionalmente um lipidoide com a estrutura mostrada na fórmula (V): fórmula (V)

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polirribonucleotídeo que codifica uma proteína para um defeito que está associado com uma ciliopatia e N-acetilcisteína (NAC), uma solução hipertônica compreendendo cloreto de sódio, e/ou uma formulação LF92.

11. Método para analisar o efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese, caracterizado pelo fato de que o dito polirribonucleotídeo codifica uma proteína envolvida em e/ou exigida para ciliogênese, o dito método compreendendo as etapas de: (a) obter uma escova nasal de um sujeito com uma ciliopatia, a dita escova nasal compreendendo células basais não diferenciadas e células ciliadas diferenciadas, (b) cultivar as células obtidas da etapa (a) como uma cultura de célula submersa para obter células basais não diferenciadas e células ciliadas desdiferenciadas, (c) cultivar células basais não diferenciadas e células ciliadas desdiferenciadas obtidas a partir da etapa (b) como uma cultura de interface ar-líquido e realizar air-lift, (d) transfectar células obtidas da etapa (c) com um polirribonucleotídeo que codifica uma proteína envolvida em e/ou exigida para ciliogênese, (e) cultivar as células transfectadas obtidas da etapa (d) para obter células ciliadas diferenciadas, e (f) determinar o efeito do dito polirribonucleotídeo na ciliogênese usando uma medição de lactato desidrogenase, um ensaio NucGreen, uma microscopia de vídeo de alta velocidade, uma medição de frequência de batimento ciliar, um ensaio de eliminação mucociliar, e/ou coloração de imunofluorescência.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as células são transfectadas em 0 a 48 horas após air-lift ser realizado na etapa (c).

13. Método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que as células são transfectadas com um polirribonucleotídeo que codifica uma proteína envolvida em e/ou exigida para ciliogênese, usando um lipidoide com a estrutura mostrada na fórmula (V).

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que as células são cultivadas nas etapas (b) a (e) usando Meio G.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que a escova nasal compreende adicionalmente fibroblastos, e em que o crescimento dos ditos fibroblastos é inibido nas etapas (b) a (e).