CN117018228A - 用合成信使rna治疗原发性纤毛运动障碍 - Google Patents

用合成信使rna治疗原发性纤毛运动障碍 Download PDF

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    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Abstract

本发明公开了编码肽、蛋白质、酶及其功能片段的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以被有效地递送至器官如肺，并在所述器官的细胞内表达。本发明的多核糖核苷酸可用于治疗与纤毛维持和功能相关的疾病或病况，诸如DNAI1或DNAH5的轴丝功能受损。

Description

用合成信使RNA治疗原发性纤毛运动障碍
本申请是申请日为2017年05月26日、申请号为201780046586.7、发明名称为“用合成信使RNA治疗原发性纤毛运动障碍”的中国专利申请(其对应PCT申请的申请日为2017年05月26日、申请号为PCT/US2017/034723)的分案申请。
交叉引用
本申请是于2016年5月27日提交的序列号为62/342,784的美国临时专利申请的继续申请，该美国临时专利申请的全部内容通过引用并入本文，并且我们根据35U.S.C.§120要求该申请的优先权。
发明背景
信使RNA(mRNA)是含有许多连接的核苷酸的聚合物，每个核苷酸由糖、磷酸和碱基组成。每种mRNA聚合物沿着核苷酸链来存储遗传信息。信使RNA聚合物将遗传信息从细胞核中的DNA携带至制造蛋白质的细胞质。mRNA中的每个核苷酸三联体被称为密码子，并且每个密码子指定经翻译的蛋白质中氨基酸的身份。
细胞还可以摄取并翻译外源RNA，但许多因素影响有效的摄取和翻译。例如，免疫系统将许多外源RNA识别为外来物，并触发旨在使RNA失活的反应。
发明内容
本发明提供了可以编码所选择的蛋白质的多核糖核苷酸及包含该多核糖核苷酸的组合物。在一些情况下，本发明提供了用于治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的核酸构建体的组合物，该核酸构建体包含在所述受试者的细胞内提供动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的异源或增强表达的密码子，从而治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者。所述核酸构建体可以是例如互补的脱氧核糖核酸DNA模板。所述核酸构建体可以以一定的水平编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体，所述水平与暴露于包含不含有所述编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的密码子的核酸构建体的组合物的细胞内水平相比增加至少约1.5倍、至少约5倍或另一合适的量。在一些情况下，所述构建体的密码子与哺乳动物如人的动力蛋白轴丝中间链1mRNA至少70％同源。
在一些情况下，所述构建体包含处于编码动力蛋白轴丝中间链1的密码子序列侧翼的5′和/或3′非翻译区(UTR)，其中所述非翻译区增强所述蛋白质在所述受试者的细胞内的表达。所述3′非编码区可包含3′-帽独立的翻译增强子(3′-CITE)。在一些情况下，所述3′非编码区还可以包含在密码子序列与3′非编码区或5′非编码区之间的至少一个中间序列区，或者源自组蛋白的核苷酸序列的3′-茎环区。在一些情况下，所述密码子序列包含开放阅读框(ORF)。所述处于密码子序列(例如，ORF)侧翼的3′非编码区可包含聚腺苷尾，其中所述聚腺苷尾中的腺苷数目改善了翻译效率，并延长了所述动力蛋白轴丝中间链1mRNA的半衰期。在一些情况下，所述聚腺苷尾的长度为至多200个腺苷。所述聚腺苷尾可包含一定百分比的经化学修饰的核苷酸。在一些情况下，所述聚腺苷尾中少于20％的核苷酸经化学修饰。在一些情况下，构建体中少于30％的编码动力蛋白轴丝中间链1的核苷酸是经化学修饰的核苷酸。在所述核苷酸包含经化学修饰的核苷酸的情况下，该经化学修饰的核苷酸可选自假尿苷、1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、5-碘尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基胞苷和5-碘胞苷。在一些情况下，所述经化学修饰的核苷酸是1-甲基假尿苷。在一些情况下，所述经修饰的核苷酸是假尿苷。在其他情况下，所述经修饰的核苷酸是1-甲基假尿苷和假尿苷的组合。除了用于治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的包含多核糖核苷酸的组合物之外，在一些情况下，本发明进一步提供了包含至少一种另外的编码选自下组的蛋白质的核酸构建体的组合物：含犰狳重复序列蛋白4(ARMC4)、21号染色体开放阅读框59(C21orf59)、含卷曲螺旋域蛋白103(CCDC103)、含卷曲螺旋域蛋白114(CCDC114)、含卷曲螺旋域蛋白39(CCDC39)、含卷曲螺旋域蛋白40(CCDC40)、含卷曲螺旋域蛋白65(CCDC65)、细胞周期蛋白O(CCNO)、动力蛋白(轴丝)装配因子1(DNAAF1)、动力蛋白(轴丝)装配因子2(DNAAF2)、动力蛋白(轴丝)装配因子3(DNAAF3)、动力蛋白(轴丝)装配因子5(DNAAF5)、动力蛋白轴丝重链11(DNAH11)、动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)、动力蛋白轴丝重链6(DNAH6)、动力蛋白轴丝重链8(DNAH8)、动力蛋白轴丝中间链2(DNAI2)、动力蛋白轴丝轻链1(DNAL1)、动力蛋白调节复合物亚单位1(DRC1)、阅读障碍易感性1候选物1(DYX1C1)、生长停滞特异性8(GAS8)、轴丝中心对装置蛋白(HYDIN)、含富含亮氨酸重复序列蛋白6(LRRC6)、NME/NM23家族成员8(NME8)、口-面-指综合征1(OFD1)、色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)、径向辐头1同源物(衣藻属)(RSPH1)、径向辐头4同源物A(衣藻属)(RSPH4A)、径向辐头9同源物(衣藻属)(RSPH9)、精子相关抗原1(SPAG1)和含锌指MYND型10(ZMYND10)。
本发明提供了包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的组合物，该核酸构建体包含在患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的细胞内提供所述动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的异源或增强表达的密码子。本文所述的组合物可包含的阳离子聚合物的胺基团的摩尔数与经修饰的多核糖核苷酸的磷酸基团的摩尔数之比为至少约4。在一些情况下，所述组合物被配制于纳米颗粒或纳米胶囊中。在其他情况下，所述组合物被配制于阳离子脂质、阳离子聚合物或纳米乳剂中。所述组合物可被配制用于向受试者施用。所述组合物中的核酸构建体可包含在患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的细胞内提供所述动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的异源或增强表达的密码子。在一些情况下，少于30％的所述编码动力蛋白轴丝中间链1的核苷酸是经化学修饰的核苷酸。在一些情况下，所述构建体的密码子与哺乳动物如人的动力蛋白轴丝中间链1mRNA至少70％同源。在一些情况下，所述构建体包含处于编码所述动力蛋白轴丝中间链1的密码子序列侧翼的5′或3′非编码区，其中所述非编码区增强所述蛋白质在所述受试者的细胞内的表达。在其他情况下，所述构建体包含处于编码所述动力蛋白轴丝中间链1的密码子序列侧翼的3′非编码区，其中所述3′非编码区包含3′-帽独立的翻译增强子(3′-CITE)。所述3′非编码区可包含源自组蛋白的核苷酸序列的3′-茎环区。所述3′非编码区可包含源自转移相关肺腺癌转录物1(MALAT1)的核苷酸序列的3′-三螺旋结构。所述处于密码子序列侧翼的3′非编码区可包含聚腺苷尾，其中该聚腺苷尾中的腺苷数目改善了所述动力蛋白轴丝中间链1蛋白的翻译效率。在一些情况下，所述聚腺苷尾中腺苷的数目改善了所述动力蛋白轴丝中间链1蛋白的半衰期。在一些情况下，所述聚腺苷尾的长度为至多200个腺苷。在一些情况下，一定百分比的聚腺苷尾包含经修饰的核苷酸。在一些情况下，该聚(A)尾中少于20％的腺苷经修饰。在一些情况下，所述构建体包含一定百分比的经化学修饰的核苷酸。在一些情况下，少于30％的所述编码动力蛋白轴丝中间链1的核苷酸经化学修饰。当存在经化学修饰的核苷酸时，其可以选自假尿苷、1-甲基假尿苷、5-甲氧基尿苷、2-硫尿苷、5-碘尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、2′-氨基-2′-脱氧胞苷、2′-氟-2′-脱氧胞苷和5-碘胞苷。在一些情况下，所述经化学修饰的核苷酸是假尿苷或1-甲基假尿苷。在一些情况下，所述组合物进一步包含至少一种另外的核酸构建体。所述至少一种另外的核酸构建体编码选自下组的蛋白质：含犰狳重复序列蛋白4(ARMC4)、21号染色体开放阅读框59(C21orf59)、含卷曲螺旋域蛋白103(CCDC103)、含卷曲螺旋域蛋白114(CCDC114)、含卷曲螺旋域蛋白39(CCDC39)、含卷曲螺旋域蛋白40(CCDC40)、含卷曲螺旋域蛋白65(CCDC65)、细胞周期蛋白O(CCNO)、动力蛋白(轴丝)装配因子1(DNAAF1)、动力蛋白(轴丝)装配因子2(DNAAF2)、动力蛋白(轴丝)装配因子3(DNAAF3)、动力蛋白(轴丝)装配因子5(DNAAF5)、动力蛋白轴丝重链11(DNAH11)、动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)、动力蛋白轴丝重链6(DNAH6)、动力蛋白轴丝重链8(DNAH8)、动力蛋白轴丝中间链2(DNAI2)、动力蛋白轴丝轻链1(DNAL1)、动力蛋白调节复合物亚单位1(DRC1)、阅读障碍易感性1候选物1(DYX1C1)、生长停滞特异性8(GAS8)、轴丝中心对装置蛋白(HYDIN)、含富含亮氨酸重复序列蛋白6(LRRC6)、NME/NM23家族成员8(NME8)、口-面-指综合征1(OFD1)、色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)、径向辐头1同源物(衣藻属)(RSPH1)、径向辐头4同源物A(衣藻属)(RSPH4A)、径向辐头9同源物(衣藻属)(RSPH9)、精子相关抗原1(SPAG1)和含锌指MYND型10(ZMYND10)。
本发明还提供了被配制用于向受试者施用的核酸构建体、载体或分离的核酸。在一些情况下，所述制剂包含治疗有效量的编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体。所述核酸构建体可以是编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的cDNA构建体，或任何一种前述的另外的核酸构建体。在一些情况下，本发明提供了包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的组合物，其中所述核酸构建体包含SEQ ID NO 14-16中的任一个。在一些情况下，本发明提供了包含编码动力蛋白轴丝重链5的核酸构建体的组合物，其中所述核酸构建体包含SEQ ID NO 17-18中的任一个。
通过其中仅示出并描述了本发明的说明性实施方案的以下具体实施方式，本公开内容的其他方面和优点将会对本领域技术人员而言变得显而易见。如将认识到的，本发明能够具有其他的和不同的实施方案，并且能够在各个明显的方面对其若干细节进行修改，所有这些都不背离本公开内容。因此，附图和说明书在本质上将会被视为是说明性而非限制性的。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别且单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
本发明的新特征在随附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对在其中利用到本发明原理的说明性实施方式加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：
图1是琼脂糖凝胶，示出了加帽和未加帽的DNAI1 RNA的产生。
图2是Western印迹，示出了转染后6小时、24小时和48小时在HEK-293细胞中DNAK1mRNA的翻译。
图3示出了编码动力蛋白轴丝中间链1(DNAI1)的转录后聚腺苷酸化RNA转录物的片段分析仪数据。
图4示出了编码动力蛋白轴丝中间链1(DNAI1)的转录后聚腺苷酸化RNA转录物的片段分析仪数据。
图5示出了编码动力蛋白轴丝中间链1(DNAI1)的质粒的聚腺苷酸化尾大小的PAGE数据。
图6示出了体外转录的包含未经修饰的核苷酸的DNAI1 mRNA的片段分析仪数据。
图7示出了体外转录的包含50％假尿苷(Ψ)的DNAI1 mRNA的片段分析仪数据。
图8示出了体外转录的包含100％假尿苷(Ψ)的DNAI1 mRNA的片段分析仪数据。
图9示出了体外转录的、转录后聚腺苷酸化的包含100％1-甲基假尿苷的DNAI1mRNA的片段分析仪数据。
图10示出了通过斑点印迹检测的双链RNA含量。
图11示出了体外转录的编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的基于HPLC的核苷酸组成分析，其用未经修饰的核苷酸转录。
图12示出了体外转录的编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的基于HPLC的核苷酸组成分析，其用50％Ψ转录。
图13示出了体外转录的编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的基于HPLC的核苷酸组成分析，其用100％Ψ转录。
图14是示出了HEK-293、A549和MLE-15细胞中DNAI1蛋白的相对表达水平的图。
图15示出了用DNAI1 mRNA变体转染的A549细胞中的IL-6诱导。
图16示出了用DNAI1 mRNA变体转染的A549细胞中的IL-6诱导。
图17是示出了HEK-293、A549和MLE-15细胞中DNAI1蛋白的相对表达的图。
图18示出了DNAI1转录物对A549细胞中IL-6的诱导。
图19示出了DNAI1转录物对A549细胞中IL-6的诱导。
图20示出了使用CellTiter-Glo试验测定的，用不同量的每种DNAI1 mRNA转染后，A549细胞的细胞活力。
图21示出了使用CellTiter-Glo试验测定的，用不同量的每种DNAI1 mRNA转染后，A549细胞的细胞活力。
图22示出了DNAI1转录物对HepG2细胞中IP-10的诱导。
图23示出了使用CellTiter-Glo试验测定的，用不同量的每种DNAI1 mRNA转染后，HepG2细胞的细胞活力。
图24示出了动力蛋白轴丝中间链1(DNAI1)蛋白或其他对照物在HEK-293细胞中的峰值表达。
图25示出了完全分化的人气道上皮细胞中DNAI1的表达。
图26示出了与SEQ ID NO 14的多核糖核苷酸(A)相比，表达SEQ ID NO 15的多核糖核苷酸(B)的DNAI1的总体质量改善。
图27示出了与SEQ ID NO 14的多核糖核苷酸(A)相比，SEQ ID NO 15的多核糖核苷酸(B)在A549细胞中的翻译效率的总体改善。
图28示出了与已知浓度的聚-IC的已知浓度相比，SEQ ID NO 15的多核糖核苷酸的双链RNA含量的分析。
图29示出了未经修饰的和含100％m1Ψ的DNAI1 mRNA的HPLC纯化。
图30示出了使用HPLC纯化，富含全长的、未经修饰的mRNA转录物的级分在A549细胞中的示例翻译活性和免疫原性。
具体实施方式
尽管本文中已经示出并描述了本发明的多个实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以实例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员可想到多种变化、改变和替代。应当理解，可以使用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。
如本文所用的术语“受试者”通常是指人。在一些情况下，受试者也可以是动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、兔和各种其他动物。受试者可以是任何年龄的，如，受试者可以是婴儿、幼儿、儿童、青春期前的儿童、青少年、成年或老年个体。
如本文所用的术语“疾病”通常是指影响部分或全部受试者的异常生理状况，如导致例如内衬于呼吸道(下呼吸道和上呼吸道、鼻窦、咽鼓管、中耳)、各种肺细胞、输卵管中的纤毛或精子细胞的鞭毛的活动缺陷的疾病(例如，原发性纤毛运动障碍)或另一种异常。
如本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，该核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，其包含嘌呤和嘧啶碱基、嘌呤和嘧啶类似物、经化学或生物化学修饰的天然或非天然的或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或核糖核酸的DNA拷贝(cDNA)的序列，所有这些都可以重组产生、人工合成或者从天然来源分离并纯化。多核苷酸和核酸可以以单链或双链存在。多核苷酸的主链可包含糖和磷酸基团(如通常在RNA或DNA中可见的)或类似物或取代的糖或磷酸基团。多核苷酸可包含天然存在的或非天然存在的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物(analogue)(或类似物(analog))。
如本文所用的术语“多核糖核苷酸”通常是指包含核糖核酸的多核苷酸聚合物。该术语还指包含经化学修饰的核糖核苷酸的多核苷酸聚合物。多核糖核苷酸可由可在自然界中发现的D-核糖糖形成。
如本文所用的术语“多肽”通常是指由通过酰胺键(肽键)连接在一起的氨基酸残基单体组成的聚合物链。多肽可以是至少三个氨基酸的链、蛋白质、重组蛋白、抗原、表位、酶、受体或结构类似物或其组合。如本文所用，形成多肽的L-对映体氨基酸的缩写如下：丙氨酸(A，Ala)；精氨酸(R，Arg)；天冬酰胺(N，Asn)；天冬氨酸(D，Asp)；半胱氨酸(C，Cys)；谷氨酸(E，Glu)；谷氨酰胺(Q，Gln)；甘氨酸(G，Gly)；组氨酸(H，His)；异亮氨酸(I，Ile)；亮氨酸(L，Leu)；赖氨酸(K，Lys)；甲硫氨酸(M，Met)；苯丙氨酸(F，Phe)；脯氨酸(P，Pro)；丝氨酸(S，Ser)；苏氨酸(T，Thr)；色氨酸(W，Trp)；酪氨酸(Y，Tyr)；缬氨酸(V，Val)。X或Xaa可以表示任何氨基酸。
如本文所用的术语“工程化的”通常是指已在遗传上进行设计和操作以在细胞内提供多核苷酸的多核苷酸、载体和核酸构建体。工程化的多核苷酸可以在体外部分或完全合成。工程化的多核苷酸还可以克隆。工程化的多核糖核苷酸可含有一种或多种碱基或糖类似物，如在信使RNA中非天然存在的核糖核苷酸。工程化的多核糖核苷酸可包含存在于转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、指导RNA(gRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、SmY RNA、剪接前导RNA(SL RNA)、CRISPR RNA、长非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)或其他合适的RNA中的核苷酸类似物。
综述
本发明提供了使用编码蛋白质或蛋白质片段的核酸来治疗与纤毛维持和功能相关的病况的组合物和方法。许多真核细胞携带附属物，该附属物通常被称为纤毛或鞭毛，其内核包含被称为轴丝的细胞骨架结构。轴丝可用作细胞骨架结构的骨架，既为结构提供支撑，又在一些情况下使其弯曲。通常，轴丝的内部结构对于纤毛和鞭毛均是共同的。纤毛通常可见于气道、生殖系统和其他器官和组织的内衬中。鞭毛是类似于纤毛的可推动细胞如精子细胞前进的尾状结构。
如果气道中没有正常起作用的纤毛，则细菌可留在呼吸道中并引起感染。在呼吸道中，纤毛以协调的方式前后移动，以将粘液移向咽喉。粘液的这种移动有助于清除肺部的液体、细菌和颗粒。许多患有纤毛和鞭毛功能障碍的婴儿在出生时都经历呼吸问题，这表明纤毛在清除胎儿肺部的液体方面起重要作用。从儿童早期开始，患有纤毛功能障碍的受试者可能发生频繁的呼吸道感染。
原发性纤毛运动障碍是以慢性呼吸道感染、内脏位置异常和无法生育(不育)为特征的病况。这种病况的体征和症状是由异常的纤毛和鞭毛引起的。患有原发性纤毛运动障碍的受试者通常具有全年的鼻塞和慢性咳嗽。慢性呼吸道感染可导致被称为支气管扩张的病况，其损害从气管通向肺部的被称为支气管的通道，并且可导致危及生命的呼吸问题。
在一些情况下，本发明的核酸构建体、载体或组合物包含编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的一种或多种核苷酸序列，并且该序列在受试者的细胞内提供了动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的异源或增强表达。在一些情况下，所述核酸构建体、载体或组合物还包含SEQ ID NO 1-9的5′非翻译区(UTR)和3′UTR的遗传密码，如下所示。
原发性纤毛运动障碍、相关病况及其治疗
本发明的方法、构建体和组合物提供了治疗原发性纤毛运动障碍(PCD)(也称为纤毛不动综合征或Kartagener综合征)的方法。PCD通常被认为是一种罕见的、纤毛致病的、常染色体隐性遗传病症，其经常导致内衬于呼吸道(下呼吸道和上呼吸道、鼻窦、咽鼓管、中耳)和输卵管的纤毛以及精子细胞的鞭毛的活动缺陷。
一些患有原发性纤毛运动障碍的个体在其胸部和腹部内具有器官位置异常。这些异常在胚胎发育的早期出现，此时发生身体左侧与右侧之间的差异。大约50％的原发性纤毛运动障碍患者发生内脏镜像逆转(完全性内脏逆位)。例如，在这些个体中，心脏位于身体的右侧而非左侧。当原发性纤毛运动障碍患者具有完全性内脏逆位时，他们通常被认为患有Kartagener综合征。
大约12％的原发性纤毛运动障碍患者患有被称为内脏异位综合征或内脏对称位的以心脏、肝、肠或脾异常为特征的病况。这些器官可能在结构上异常或位置不正确。此外，受影响的个体可能缺乏脾(无脾)或具有多个脾(多脾)。内脏异位综合征是由在胚胎发育期间建立身体左侧和右侧中的问题引起的。内脏异位的严重程度在受影响的个体之间差异很大。
原发性纤毛运动障碍也可导致不育。可能需要鞭毛的剧烈移动来推动精子细胞向前进入雌性卵细胞。因为患有原发性纤毛运动障碍的受试者的精子不能正常移动，所以患有原发性纤毛运动障碍的男性通常无法生育孩子。在一些受影响的女性中发生不育症，并且这通常与输卵管中的纤毛异常相关。
原发性纤毛运动障碍的另一个特征是复发性耳部感染(中耳炎)，特别是在幼儿中。如果不进行治疗，则中耳炎可导致永久性听力损失。耳部感染可能与内耳中的纤毛异常有关。
罕见地，患有原发性纤毛运动障碍的个体在脑中会积聚液体(脑积水)，这可能是由于大脑中的纤毛异常所致。
例如，本发明的多核糖核苷酸可用于治疗这样的受试者，该受试者患有原发性纤毛运动障碍或与基因(其功能与纤毛维持和纤毛功能有关)的缺陷或功能障碍有关的任何其他病况，或者处于患原发性纤毛运动障碍或与基因(其功能与纤毛维持和纤毛功能有关)的缺陷或功能障碍有关的任何其他病况的危险中。与原发性纤毛运动障碍相关的基因的非限制性实例包括：含犰狳重复序列蛋白4(ARMC4)、21号染色体开放阅读框59(C21orf59)、含卷曲螺旋域蛋白103(CCDC103)、含卷曲螺旋域蛋白114(CCDC114)、含卷曲螺旋域蛋白39(CCDC39)、含卷曲螺旋域蛋白40(CCDC40)、含卷曲螺旋域蛋白65(CCDC65)、细胞周期蛋白O(CCNO)、动力蛋白(轴丝)装配因子1(DNAAF1)、动力蛋白(轴丝)装配因子2(DNAAF2)、动力蛋白(轴丝)装配因子3(DNAAF3)、动力蛋白(轴丝)装配因子5(DNAAF5)、动力蛋白轴丝重链11(DNAH11)、动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)、动力蛋白轴丝重链6(DNAH6)、动力蛋白轴丝重链8(DNAH8)、动力蛋白轴丝中间链2(DNAI2)、动力蛋白轴丝轻链1(DNAL1)、动力蛋白调节复合物亚单位1(DRC1)、阅读障碍易感性1候选物1(DYX1C1)、生长停滞特异性8(GAS8)、轴丝中心对装置蛋白(HYDIN)、含富含亮氨酸重复序列蛋白6(LRRC6)、NME/NM23家族成员8(NME8)、口-面-指综合征1(OFD1)、色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)、径向辐头1同源物(衣藻属)(RSPH1)、径向辐头4同源物A(衣藻属)(RSPH4A)、径向辐头9同源物(衣藻属)(RSPH9)、精子相关抗原1(SPAG1)和含锌指MYND型10(ZMYND10)。
在一些情况下，所述组合物包含编码动力蛋白轴丝中间链1(DNAI1)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。DNAI1基因可以提供关于制备蛋白质的指令，该蛋白质是称为动力蛋白的一组蛋白质(复合物)的一部分。该复合物在纤毛内起作用。纤毛的前后协调移动可以移动细胞或细胞周围的液体，而动力蛋白产生纤毛移动所需的力。在纤毛(轴丝)的核心内，动力蛋白复合物是称为内动力蛋白臂(IDA)和外动力蛋白臂(ODA)的结构的一部分，这取决于它们的位置。动力蛋白臂的协调移动导致整个轴丝前后弯曲。IDA和ODA具有蛋白质组分(亚单位)的不同组合，这些蛋白质组分按重量被分类为重链、中间链或轻链。DNAI1基因提供了关于制备在ODA中所见的中间链1的指令。其他亚单位可以由在相同或不同组合物中施用于受试者的不同基因产生。或者，其他亚单位可以由编码内动力蛋白臂或外动力蛋白臂的功能组分的单个核酸构建体产生。
已发现DNAI1基因中的至少21个突变引起原发性纤毛运动障碍，这是一种以呼吸道感染、器官位置异常和无法生育(不育)为特征的病况。DNAI1基因突变导致缺失或异常的中间链1。如果没有该亚单位的正常版本，则ODA无法正确形成，并可能会缩短或缺失。结果，纤毛不能产生前后弯曲所需的力。有缺陷的纤毛导致原发性纤毛运动障碍的特征。在一些情况下，本发明提供了经工程化以替代或补充包含IVS1+2_3insT(219+3insT)突变的内源DNAI1蛋白的功能的核酸。在一些情况下，本发明提供了经工程化以替代或补充包含第二常见的A538T突变的内源DNAI1蛋白的功能的核酸。
在一些情况下，所述组合物包含编码动力蛋白轴丝中间链2(DNAI2)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。DNAI2基因是呼吸道纤毛和精子鞭毛的动力蛋白复合物的一部分。该基因的突变与9型原发性纤毛运动障碍相关，这是以运动纤毛异常、导致慢性炎症和支气管扩张的呼吸道感染以及精子尾部异常为特征的病症。
在一些情况下，所述组合物包含编码含犰狳重复序列蛋白4(ARMC4)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由ARMC4基因编码的蛋白质包含十个犰狳重复基序(ARM)和一个HEAT重复序列，并且已显示定位于纤毛轴丝和呼吸细胞的纤毛基部。ARMC4基因的突变可导致呼吸道纤毛中的部分外动力蛋白臂(ODA)缺陷。
在一些情况下，所述组合物包含编码21号染色体开放阅读框59(C21orf59)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由C21orf59基因编码的蛋白质在动力蛋白臂装配和运动纤毛功能中可起关键作用。该基因的突变可导致原发性纤毛运动障碍。
在一些情况下，所述组合物包含编码含卷曲螺旋域蛋白103(CCDC103)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由CCDC103基因编码的蛋白质可用作纤毛运动所需的动力蛋白附着因子。
在一些情况下，所述组合物包含编码含卷曲螺旋域蛋白114(CCDC114)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由CCDC114基因编码的蛋白质可用作纤毛细胞中外动力蛋白臂对接复合物的组分。该基因的突变可引起原发性纤毛运动障碍20。
在一些情况下，所述组合物包含编码含卷曲螺旋域蛋白39(CCDC39)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由CCDC39基因编码的蛋白质可用作调节纤毛节拍的动力蛋白调节和内动力蛋白臂复合物的装配体。该基因的缺陷是14型原发性纤毛运动障碍(CCDC39)的原因。
在一些情况下，所述组合物包含编码含卷曲螺旋域蛋白40(CCDC40)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由CCDC40基因编码的蛋白质可以与CCDC39一起发挥作用以形成(通过相似性)确定96纳米(nm)重复长度以及纤毛和鞭毛中组分的排列的分子标尺。外动力蛋白臂复合物装配可能不需要CCDC40，但CCDC39的轴丝募集可能需要CCDC40。在一些情况下，CCD40和CCD39可以由在相同或不同组合物中施用于受试者的不同基因产生。或者，CCD40和CCD39可以由编码内动力蛋白臂或外动力蛋白臂的功能组分的单个核酸构建体产生。CCD40基因的缺陷是14型原发性纤毛运动障碍(CILD14)的原因。
在一些情况下，所述组合物包含编码含卷曲螺旋域蛋白65(CCDC65)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由CCDC65基因编码的蛋白质可用作精子细胞蛋白质。CCDC65已被证明在成人睾丸、精母细胞和精子细胞中高度表达。该蛋白质在微管连接蛋白-动力蛋白调节复合物的装配中起关键作用。该基因的突变与27型原发性纤毛运动障碍相关。
在一些情况下，所述组合物包含编码细胞周期蛋白O(CCNO)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。
在一些情况下，所述组合物包含编码动力蛋白(轴丝)装配因子1(DNAAF1)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由DNAAF1基因编码的蛋白质被认为是纤毛特异性的，并且它可能是纤毛结构稳定性所需的。该基因的突变与13型原发性纤毛运动障碍有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码动力蛋白(轴丝)装配因子2(DNAAF2)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由DNAAF2基因编码的蛋白质可以参与为纤毛提供动力的动力蛋白臂复合物的预装配。该基因的突变与10型原发性纤毛运动障碍(CILD10)有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码动力蛋白(轴丝)装配因子3(DNAAF3)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由DNAAF3基因编码的蛋白质可能是轴丝内和轴丝外动力蛋白臂装配所需的，并且它可以在装配动力蛋白复合物以供转运至纤毛中起作用。该基因的突变与2型原发性纤毛运动障碍(CILD2)有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码动力蛋白(轴丝)装配因子5(DNAAF5)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由DNAAF5基因编码的蛋白质被认为是轴丝动力蛋白臂的预装配或稳定性所需的，并且其仅见于具有运动纤毛和鞭毛的生物体中。该基因的突变与原发性纤毛运动障碍-18有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码动力蛋白轴丝重链11(DNAH11)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由DNAH11基因编码的蛋白质可以产生纤毛外动力蛋白臂蛋白质。DNAH11被认为是参与呼吸道纤毛移动的微管依赖性运动ATP酶。该基因的突变与7型原发性纤毛运动障碍(CILD7)和内脏异位综合征有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。DNAH5基因可以提供关于制备蛋白质的指令，该蛋白质是被称为动力蛋白的一组蛋白质(复合物)的一部分。纤毛的协调前后移动可以移动细胞或细胞周围的液体。动力蛋白可以产生纤毛移动所需的力。超过80种DNAH5突变与原发性纤毛运动障碍有关。该基因的突变与原发性纤毛运动障碍和内脏异位综合征有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码动力蛋白轴丝重链6(DNAH6)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。
在一些情况下，所述组合物包含编码动力蛋白轴丝重链8(DNAH8)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由DNAH8基因编码的蛋白质可用作呼吸道纤毛的生成力的蛋白质。DNAH8可产生朝向微管负端的力。动力蛋白具有ATP酶活性；产生力的动力冲程被认为是在释放ADP时发生的。DNAH8可参与精子运动和精子鞭毛装配。DNAH8也称为ATP酶和hdhc9。
在一些情况下，所述组合物包含编码动力蛋白轴丝轻链1(DNAL1)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由DNAL1基因编码的蛋白质可用作呼吸道纤毛的生成力的蛋白质。DNAL1可用作外动力蛋白臂复合物的组分。该复合物充当以ATP依赖性方式提供用来移动纤毛的力的分子马达。该基因的突变与16型原发性纤毛运动障碍(CILD16)有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码动力蛋白调节复合物亚单位1(DRC1)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由DRC1基因编码的蛋白质可用作呼吸道纤毛的生成力的蛋白质。DRC1可以编码调节纤毛动力蛋白装配的微管连接蛋白-动力蛋白复合物(N-DRC)的中心组分。该基因的突变与21型原发性纤毛运动障碍(CILD21)有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码阅读障碍易感性1候选物1(DYX1C1)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由DYX1C1基因编码的蛋白质可用作呼吸道纤毛的生成力的蛋白质。DYX1C1可以编码含四肽重复结构域的蛋白质。经编码的蛋白质可以与雌激素受体和热激蛋白Hsp70和Hsp90相互作用。该基因的突变也与阅读和拼写缺陷有关，并且涉及该基因的染色体易位与发育性阅读障碍的易感性有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码生长停滞特异性8(GAS8)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。
在一些情况下，所述组合物包含编码轴丝中心对装置蛋白(HYDIN)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由HYDIN基因编码的蛋白质可以在纤毛运动中起作用。该基因的突变与5型原发性纤毛运动障碍(CILD5)有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码含富含亮氨酸重复序列蛋白6(LRRC6)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由LRRC6基因编码的蛋白质含有几个富含亮氨酸的重复结构域，并且似乎参与纤毛的运动。该基因的突变与19型原发性纤毛运动障碍(CILD19)有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码NME/NM23家族成员8(NME8)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由NME8基因编码的蛋白质可用作呼吸道纤毛的生成力的蛋白质。NME8蛋白包含N末端硫氧还蛋白结构域和三个C末端核苷二磷酸激酶(NDK)结构域。该基因的突变与6型原发性纤毛运动障碍(CILD6)有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码口-面-指综合征1(OFD1)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。OFD1基因产生的蛋白质的功能尚不清楚，但它可在包括大脑、面部、四肢和肾在内的身体许多部位的早期发育中发挥关键作用。在该病症的最常见形式——I型口-面-指综合征的患者中已发现了约100种OFD1基因突变。该基因的突变与原发性纤毛运动障碍和朱伯特综合征有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由RPGR基因编码的蛋白质对于正常视力和纤毛功能可能是重要的。该基因的突变与原发性纤毛运动障碍、X连锁色素性视网膜炎、进行性视力丧失、慢性呼吸道和鼻窦感染、复发性耳部感染(中耳炎)和听力丧失有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码径向辐头1同源物(RSPH1)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由RSPH1基因编码的蛋白质可能在雄性减数分裂中以及在轴丝中心对和径向辐的构建中起重要作用。该基因的突变与24型原发性纤毛运动障碍(CILD24)有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码径向辐头4同源物A(RSPH4A)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由RSPH4A基因编码的蛋白质可以是径向辐头的组分。该基因的突变与11型原发性纤毛运动障碍(CILD11)有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码径向辐头9同源物(RSPH9)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由RSPH9基因编码的蛋白质可以是运动纤毛和鞭毛中的径向辐头的组分。该基因的突变与12型原发性纤毛运动障碍(CILD12)有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码精子相关抗原1(SPAG1)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由SPAG1基因编码的蛋白质可能在纤毛动力蛋白臂的细胞质装配中起作用。该基因的突变与28型原发性纤毛运动障碍(CILD28)有关。
在一些情况下，所述组合物包含编码含锌指MYND型10(ZMYND10)的核酸构建体，并且在受试者的细胞内翻译后，该构建体产生治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的多肽。由ZMYND10编码的蛋白质可以在内和外动力蛋白臂(分别为IDA和ODA)的轴丝装配中起作用，用于构建纤维运动所需的适当轴丝。该基因的突变与22型原发性纤毛运动障碍(CILD22)有关。
治疗可包括治疗受试者(例如，患有疾病的患者和/或具有病况的实验动物)。在一些情况下，该病况是原发性纤毛运动障碍(PCD)或Kartagener综合征。在一些情况下，该病况与一种或多种在被称为纤毛的细胞结构内起作用的蛋白质的缺陷广泛相关。在一些情况下，该受试者是人。可在疾病的临床发作之前向受试者提供治疗。可在疾病的临床发作之后向受试者提供治疗。可以在疾病的临床发作后1分钟或之后、5分钟或之后、10分钟或之后、30分钟或之后、1小时或之后、2小时或之后、3小时或之后、4小时或之后、5小时或之后、6小时或之后、12小时或之后、1天或之后、1周或之后、6个月或之后、12个月或之后或者2年或之后向受试者提供治疗。可在疾病的临床发作后向受试者提供大于或等于1分钟、大于或等于10分钟、大于或等于30分钟、大于或等于1小时、大于或等于2小时、大于或等于3小时、大于或等于4小时、大于或等于5小时、大于或等于6小时、大于或等于12小时、大于或等于1天、大于或等于1周、大于或等于1个月、大于或等于6个月、大于或等于12个月、大于或等于2年或者更长的时间段的治疗。可在疾病的临床发作后向受试者提供小于或等于2年、小于或等于12个月、小于或等于6个月、小于或等于1个月、小于或等于1周、小于或等于1天、小于或等于12小时、小于或等于6小时、小于或等于5小时、小于或等于4小时、小于或等于3小时、小于或等于2小时、小于或等于1小时、小于或等于30分钟、小于或等于10分钟或者小于或等于1分钟的时间段的治疗。治疗还可包括在临床试验中治疗人。
可以施用含有本文所述的工程化多核糖核苷酸的组合物用于预防性和/或治疗性处理。在治疗性应用中，可向已患有疾病如原发性纤毛运动障碍的受试者施用一定量的核酸构建体或载体，该量足以提供治愈或至少改善该疾病症状的量的经编码的多肽。还可以施用核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物以减少疾病发展、收缩或恶化的可能性。对该用途有效的量可根据疾病或病况的严重程度和病程，核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物的转染效率，经编码的多肽对靶分子的亲和力，既往疗法，受试者的健康状况、体重、对药物的反应，以及治疗医师的判断而变化。
在一些情况下，本发明的多核苷酸可以编码与同原发性纤毛运动障碍相关的蛋白质至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的多肽，该蛋白质例如是含犰狳重复序列蛋白4(ARMC4)、21号染色体开放阅读框59(C21orf59)、含卷曲螺旋域蛋白103(CCDC103)、含卷曲螺旋域蛋白114(CCDC114)、含卷曲螺旋域蛋白39(CCDC39)、含卷曲螺旋域蛋白40(CCDC40)、含卷曲螺旋域蛋白65(CCDC65)、细胞周期蛋白O(CCNO)、动力蛋白(轴丝)装配因子1(DNAAF1)、动力蛋白(轴丝)装配因子2(DNAAF2)、动力蛋白(轴丝)装配因子3(DNAAF3)、动力蛋白(轴丝)装配因子5(DNAAF5)、动力蛋白轴丝重链11(DNAH11)、动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)、动力蛋白轴丝重链6(DNAH6)、动力蛋白轴丝重链8(DNAH8)、动力蛋白轴丝中间链2(DNAI2)、动力蛋白轴丝轻链1(DNAL1)、动力蛋白调节复合物亚单位1(DRC1)、阅读障碍易感性1候选物1(DYX1C1)、生长停滞特异性8(GAS8)、轴丝中心对装置蛋白(HYDIN)、含富含亮氨酸重复序列蛋白6(LRRC6)、NME/NM23家族成员8(NME8)、口-面-指综合征1(OFD1)、色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)、径向辐头1同源物(衣藻属)(RSPH1)、径向辐头4同源物A(衣藻属)(RSPH4A)、径向辐头9同源物(衣藻属)(RSPH9)、精子相关抗原1(SPAG1)和含锌指MYND 10型(ZMYND10)。
可以以任何顺序或同时施用多种核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物。可将核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物一起或分开包装在包含靶向相同靶分子的多核糖核苷酸的单个包装中或多个包装中。可以多个剂量给予核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物中的一种或全部。如果不同时施用，则多个剂量之间的时间可能不同。
可在症状发作后将核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物尽快地施用于受试者。可在检测到或怀疑疾病或病症发作后尽快施用核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物，并持续治疗该疾病所必需的一段时间，例如，约1个月、约6个月、约12个月、约18个月、约24个月或任何适当的时间长度。每个受试者的治疗时间长度可能不同。
改变编码区中的核苷酸使用以增加转录物疗法的mRNA稳定性
寡核苷酸的水解提示，在单链(ss)RNA中连接两个核糖核苷酸的磷酸二酯键的反应性取决于那些核苷酸的性质。在pH 8.5下，当嵌入ssRNA十二聚体中时，二核苷酸易切割性可以变化一个数量级。在接近生理条件下，RNA的水解通常涉及2'-氧亲核试剂对5'-氧阴离子离去基团的相对侧上的相邻磷靶中心的SN2型攻击，从而产生具有2',3'-环磷酸和5'-羟基末端的两个RNA片段。更具反应性的可剪切磷酸二酯键可包括5'-UpA-3'(R1＝U1，R2＝A)和5'-CpA-3'(R1＝C，R2＝A)，因为在这些步骤时的骨架可能最容易采用2'-OH对相邻磷酸二酯键的SN2型亲核攻击所需的“串联(in-line)”构象。此外，干扰素调节的、dsRNA活化的抗病毒途径产生与锚蛋白重复序列结合从而导致RNA酶L内切核糖核酸酶活化的2'-5'寡腺苷酸。RNA酶L在UA和UU二核苷酸处有效切割ssRNA。最后，富含U的序列是RNA传感器的有效活化剂，其包括导致全局尿苷含量降低的Toll样受体7和8以及RIG-I，这是降低治疗性mRNA免疫原性的潜在有吸引力的方法。
旨在减少经修饰的mRNA的密码子内以及密码子间的更具反应性的5'-U(U/A)-3'二核苷酸数目的经改变的核苷酸使用方案，部分地减轻了由RNA的固有化学不稳定性所带来的限制。同时，降低RNA转录物中的U含量使其免疫原性更低。本发明涉及包含改变的开放阅读框(ORF)的RNA转录物。特别地，提出了一种方法，该方法包括大幅减少蛋白质编码区内的5'-U(U/A)-3'二核苷酸，从而得到稳定的治疗性mRNA。
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核酸构建体、载体和工程化的多核糖核苷酸
本发明提供了编码一种或多种感兴趣的多肽的核酸分子，如多核苷酸。术语核酸包括任何包含核苷酸聚合物的化合物和/或物质。含有超过50％的核糖碱基或核糖核苷酸类似物的核苷酸聚合物被称为多核糖核苷酸。核苷酸聚合物可以使用编码蛋白质或其功能片段如DNAI1或DNAH5的改变的核苷酸使用。工程化多核苷酸的序列可以源自，例如，DNA、RNA、mRNA转录物、基因组DNA、线粒体DNA、线粒体RNA或包含感兴趣的基因的遗传信息的其他合适的核酸。所述核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物可以源自携带突变基因和多态性的核酸。
除了四种规范核糖核苷酸，即腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷外，几种细胞RNA还含有许多结构上多样的核糖核苷酸。已在转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)和小核RNA(snRNA)中鉴别了大约100种结构上不同的核苷酸或核苷酸类似物。在tRNA中，一些核苷酸可以是氨基酰化和密码子识别的特异性和效率的重要决定因素。该类结构上多样的核糖核苷酸可以是经修饰的核糖核苷酸或核苷酸类似物。在一些情况下，本发明的多核苷酸被工程化为包含核糖核苷酸类似物。
在一些情况下，核酸构建体、载体或多核苷酸被工程化为包含四种经典核糖核苷酸，并且可以在施用于受试者后经转录后修饰。例如，在一些情况下，本发明提供了包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的组合物、载体或核酸构建体，其中少于30％的编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸是核苷酸类似物。在其他情况下，少于27.5％、少于25％、少于22.5％、少于20％、少于17.5％、少于15％、少于12.5％、少于10％、少于7.5％、少于5％或少于2.5％的编码动力蛋白轴丝中间链1的核苷酸是核苷酸类似物。
可形成本发明多核苷酸的示例性核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或其杂合体。可形成本发明多核苷酸的至少一部分的示例性经修饰的核苷酸包括但不限于假尿苷(Ψ)和1-甲基假尿苷(m1Ψ)。
化学修饰可以位于核酸分子的一个或多个核苷或骨架上。它们可位于核苷和骨架连接上。可在体外将修饰工程化成多核苷酸。通过经典核糖核苷酸的共价修饰，经修饰的核糖核苷酸和核酸类似物也可在转录后被引入。
本发明的核酸构建体、载体或工程化多核糖核苷酸可包含嘌呤和嘧啶类似物。在一些情况下，本发明的多核糖核苷酸包含经修饰的嘧啶，如经修饰的尿苷。在一些情况下，尿苷类似物选自假尿苷(Ψ)、1-甲基假尿苷(m1Ψ)、2-硫尿苷(s2U)、5-甲基尿苷(m5U)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、4-硫尿苷(s4U)、5-溴尿苷(Br5U)、2′O-甲基尿苷(U2′m)、2′-氨基-2′-脱氧尿苷(U2′NH2)、2′-叠氮基-2′-脱氧尿苷(U2′N3)和2′-氟-2′-脱氧尿苷(U2'F)。
在一些情况下，所述核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物以一定的水平编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体，该水平与暴露于包含不含有编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的密码子的核酸构建体的组合物的细胞内水平相比增加至少约1.5倍。在一些情况下，该倍数为至少约1.1、至少约1.2、至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90或至少约100。
多核糖核苷酸可具有相同的核苷酸类似物或经修饰的核苷酸，或者不同的核苷酸类似物或经修饰的核苷酸的混合物。核苷酸类似物或经修饰的核苷酸可具有在信使RNA中天然或非天然存在的结构变化。可使用各种类似物或经修饰的核苷酸的混合物。例如，多核苷酸内的一种或多种类似物可以具有天然修饰，而另一部分具有在mRNA中非天然存在的修饰。另外，一些类似物或经修饰的核糖核苷酸可具有碱基修饰，而其他经修饰的核糖核苷酸具有糖修饰。同样地，所有修饰可能是碱基修饰，或者所有修饰是糖修饰或其任何合适的混合物。
核苷酸类似物或经修饰的核苷酸可选自吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-l-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-l-甲基-假异胞苷、4-硫代-l-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、zebularine、5-氮杂-zebularine、5-甲基-zebularine、5-氮杂-2-硫代-zebularine、2-硫代-zebularine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。
在一些情况下，至少约5％的核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物包含非天然存在的(例如，经修饰的、类似物或工程化的)尿苷、腺苷、鸟嘌呤或胞嘧啶，如本文所述的核苷酸。在一些情况下，该组合物中100％的经修饰的核苷酸是1-甲基假尿苷或假尿苷。在一些情况下，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物包含非天然存在的尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶。在一些情况下，至多约99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％的核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物包含非天然存在的尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶。
本发明的核酸构建体、载体或工程化多核糖核苷酸可包含一个或多个启动子序列和任何相关的调节序列。启动子序列和/或相关的调节序列可包含任何数目的经修饰或未经修饰的核苷酸，以及任何数目的核酸类似物。启动子序列和/或任何相关的调节序列可包含，例如，至少2个碱基或碱基对、至少3个碱基或碱基对、至少4个碱基或碱基对、至少5个碱基或碱基对、至少6个碱基或碱基对、至少7个碱基或碱基对、至少8个碱基或碱基对、至少9个碱基或碱基对、至少10个碱基或碱基对、至少11个碱基或碱基对、至少12个碱基或碱基对、至少13个碱基或碱基对、至少14个碱基或碱基对、至少15个碱基或碱基对、至少16个碱基或碱基对、至少17个碱基或碱基对、至少18个碱基或碱基对、至少19个碱基或碱基对、至少20个碱基或碱基对、至少21个碱基或碱基对、至少22个碱基或碱基对、至少23个碱基或碱基对、至少24个碱基或碱基对、至少25个碱基或碱基对、至少26个碱基或碱基对、至少27个碱基或碱基对、至少28个碱基或碱基对、至少29个碱基或碱基对、至少30个碱基或碱基对、至少35个碱基或碱基对、至少40个碱基或碱基对、至少50个碱基或碱基对、至少75个碱基或碱基对、至少100个碱基或碱基对、至少150个碱基或碱基对、至少200个碱基或碱基对、至少300个碱基或碱基对、至少400个碱基或碱基对、至少500个碱基或碱基对、至少600个碱基或碱基对、至少700个碱基或碱基对、至少800个碱基或碱基对、至少900个碱基或碱基对、至少1000个碱基或碱基对、至少2000个碱基或碱基对、至少3000个碱基或碱基对、至少4000个碱基或碱基对、至少5000个碱基或碱基对、至少10000个碱基或至少碱基对或更多。启动子序列和/或相关的调节序列可包含任何数目的经修饰或未经修饰的核苷酸，例如，至多10000个碱基或碱基对、至多5000个碱基或碱基对、至多4000个碱基或碱基对、至多3000个碱基或碱基对、至多2000个碱基或碱基对、至多1000个碱基或碱基对、至多900个碱基或碱基对、至多800个碱基或碱基对、至多700个碱基或碱基对、至多600个碱基或碱基对、至多500个碱基或碱基对、至多400个碱基或碱基对、至多300个碱基或碱基对、至多200个碱基或碱基对、至多100个碱基或碱基对、至多75个碱基或碱基对、至多50个碱基或碱基对、至多40个碱基或碱基对、至多35个碱基或碱基对、至多30个碱基或碱基对、至多29个碱基或碱基对、至多28个碱基或碱基对、至多27个碱基或碱基对、至多26个碱基或碱基对、至多25个碱基或碱基对、至多24个碱基或碱基对、至多23个碱基或碱基对、至多22个碱基或碱基对、至多21个碱基或碱基对、至多20个碱基或碱基对、至多19个碱基或碱基对、至多18个碱基或碱基对、至多17个碱基或碱基对、至多16个碱基或碱基对、至多15个碱基或碱基对、至多14个碱基或碱基对、至多13个碱基或碱基对、至多12个碱基或碱基对、至多11个碱基或碱基对、至多10个碱基或碱基对、至多9个碱基或碱基对、至多8个碱基或碱基对、至多7个碱基或碱基对、至多6个碱基或碱基对、至多5个碱基或碱基对、至多4个碱基或碱基对、至多3个碱基或碱基对或至多2个碱基或碱基对。
在一些情况下，启动子序列或相关调节区中少于所有的核苷酸是核苷酸类似物或经修饰的核苷酸。例如，在一些情况下，启动子或相关调节区中少于或等于99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的核苷酸是核酸类似物或经修饰的核苷酸。在一些情况下，启动子或相关调节区中的所有核苷酸是核酸类似物或经修饰的核苷酸。
本发明的核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物可包含工程化的5′帽结构，或者可在细胞内将5'-帽添加至多核糖核苷酸上。mRNA的5′帽结构可以参与同mRNA帽结合蛋白(CBP)的结合，该mRNA帽结合蛋白(CBP)通过CBP与聚(A)结合蛋白的缔合以形成成熟的假性环状mRNA种类而负责细胞中的mRNA稳定性和翻译能力。5′帽结构还可以参与核输出、增加mRNA稳定性以及有助于在mRNA剪接期间去除5′近端内含子。
核酸构建体、载体或工程化多核糖核苷酸可以在5′-末端加帽，以在末端鸟苷帽残基与mRNA分子的5′-末端转录的有义核苷酸之间产生5′-GpppN-3′-三磷酸连接。帽结构可包含通过5′-5′三磷酸桥连接至第一核苷酸的经修饰的或未经修饰的7-甲基鸟苷。然后可使该5′-鸟苷酸帽甲基化，以产生N7-甲基-鸟苷酸残基(帽-0结构)。mRNA的5′末端的末端和/或前末端(anteterminal)转录核苷酸的核糖也可任选地是2′-O-甲基化的(帽-1结构)。通过水解和切割鸟苷酸帽结构的5'-脱帽可以针对核酸分子，如mRNA分子，以供降解。
在一些情况下，帽可以包含进一步的修饰，包括mRNA的5′末端的前2个核糖的2′-羟基的甲基化。例如，真核帽-1在第一核糖上具有甲基化的2′-羟基，而帽-2在前两个核糖上具有甲基化的2′-羟基。5′帽可以在化学上类似于RNA分子的3′末端(帽核糖的5′碳键合，以及加帽转录物的5′-末端和3′-末端上的游离3′-羟基)。这样的双重修饰可以提供针对5′外切核酸酶的显著抗性。可与工程化多核糖核苷酸一起使用的5′帽结构的非限制性实例包括但不限于：m7G(5′)ppp(5′)N(帽-0)、m7G(5′)ppp(5′)N1mpNp(帽-1)和m7G(5′)-ppp(5′)N1mpN2mp(帽-2)。
对本发明的经修饰mRNA的修饰可产生不可水解的帽结构，从而防止脱帽并因此延长mRNA半衰期，同时促进有效翻译。因为帽结构水解需要切割5′-ppp-5′三磷酸酯键，所以在加帽反应期间可以使用经修饰的核苷酸。例如，根据制造商的说明书，可以将来自NewEngland Biolabs(Ipswich,MA)的牛痘加帽酶与鸟苷α-硫代磷酸核苷酸一起使用，以在5′-ppp-5′帽中产生硫代磷酸酯键。可以使用另外的经修饰的鸟苷核苷酸，如α-甲基-膦酸和硒-磷酸核苷酸。另外的修饰包括但不限于：糖环的2′-羟基上mRNA的5′-末端和/或5′-前末端核苷酸的核糖的2′-O-甲基化。多个不同的5′-帽结构可用于产生多核糖核苷酸的5′-帽。
经修饰的mRNA可以在转录后加帽。根据本发明，5′末端帽可包含内源帽或帽类似物。根据本发明，5′末端帽可包含鸟嘌呤类似物。有用的鸟嘌呤类似物包括但不限于：肌苷、N1-甲基-鸟苷、2′氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
此外，核酸构建体、载体或工程化多核糖核苷酸可含有一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列可在不存在5′帽结构的情况下启动蛋白质合成。IRES序列也可以是唯一的核糖体结合位点，或者它可用作mRNA的多个核糖体结合位点之一。含有多于一个功能性核糖体结合位点的工程化多核糖核苷酸可以编码由核糖体(“多顺反子(polycistronic)或多顺反子(multicistronic)多核苷酸”)翻译的几种肽或多肽。本文描述的工程化多核苷酸可包含至少一个IRES序列、两个IRES序列、三个IRES序列、四个IRES序列、五个IRES序列、六个IRES序列、七个IRES序列、八个IRES序列、九个IRES序列、十个IRES序列，或者工程化多核糖核苷酸中存在另一合适的数目。根据本发明可使用的IRES序列的实例包括但不限于来自烟草蚀纹病毒(TEV)、小核糖核酸病毒(例如，FMDV)、瘟病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的IRES序列。IRES序列可以衍生自例如可商购的载体，如可从ClontechTM、GeneCopoeiaTM或Sigma-AldrichTM获得的IRES序列。IRES序列可以是，例如，至少150个碱基或碱基对、至少200个碱基或碱基对、至少300个碱基或碱基对、至少400个碱基或碱基对、至少500个碱基或碱基对、至少600个碱基或碱基对、至少700个碱基或碱基对、至少800个碱基或碱基对、至少900个碱基或碱基对、至少1000个碱基或碱基对、至少2000个碱基或碱基对、至少3000个碱基或碱基对、至少4000个碱基或碱基对、至少5000个碱基或碱基对或者至少10000个个碱基或碱基对。IRES序列可以是至多10000个碱基或碱基对、至多5000个碱基或碱基对、至多4000个碱基或碱基对、至多3000个碱基或碱基对、至多2000个碱基或碱基对、至多1000个碱基或碱基对、至多900个碱基或碱基对、至多800个碱基或碱基对、至多700个碱基或碱基对、至多600个碱基或碱基对、至多500个碱基或碱基对、至多400个碱基或碱基对、至多300个碱基或碱基对、至多200个碱基或碱基对、至多100个碱基或碱基对、至多50个碱基或碱基对或者至多10个碱基或碱基对。
本发明的核酸构建体、载体或工程化多核糖核苷酸可包含一个或多个非翻译区。非翻译区可包含任何数目的经修饰的或未经修饰的核苷酸。基因的非翻译区(UTR)被转录，但不被翻译成多肽。在一些情况下，非翻译序列可以增加核酸分子的稳定性和翻译的效率。可将UTR的调节特征引入本发明的经修饰的mRNA分子中，例如，以增加该分子的稳定性。还可引入特定特征以确保转录物的受控下调，以防该特定特征被错误地引导至不希望的器官部位。一些5′UTR在翻译启动中起作用。5′UTR可包含参与核糖体启动许多基因翻译的过程的Kozak序列。Kozak序列可具有共有GCC(R)CCAUGG，其中R是位于起始密码子(AUG)上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)。5′UTR可形成参与翻译延伸因子的结合的二级结构。在一些情况下，通过工程构建通常在特定靶器官的丰富表达的基因中所见的特征，可以增加本发明的工程化多核苷酸分子的稳定性和蛋白质产生。例如，引入肝表达的mRNA(如白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子VIII)的5′UTR可用来增加肝中工程化多核苷酸的表达。同样地，将来自肌肉蛋白质(MyoD、肌球蛋白、肌红蛋白、肌细胞生成蛋白、力蛋白)的5′UTR用于内皮细胞(Tie-1、CD36)、用于骨髓细胞(C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CD1 lb、MSR、Fr-1、i-NOS)、用于白细胞(CD45、CD18)、用于脂肪组织(CD36、GLUT4、ACRP30、脂连蛋白)和用于肺上皮细胞(SP-A/B/C/D)，可用来增加工程化多核苷酸在所需细胞或组织中的表达。
可将其他非UTR序列掺入本发明的多核糖核苷酸的5′(或3′UTR)UTR中。该5′和/或3′UTR可以提供多核糖核苷酸的稳定性和/或翻译效率。例如，可将内含子或内含子序列的部分掺入工程化多核糖核苷酸的侧翼区。内含子序列的掺入也可以提高多核糖核苷酸的翻译速率。
3′UTR可以具有嵌入其中的腺苷和尿苷的延伸段。这些富含AU的特征在具有高转换率的基因中特别普遍。基于它们的序列特征和功能性质，富含AU的元件(ARE)可以分为几类：I类ARE在富U区域内含有AUUUA基序的几个分散的拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚物。含有该类型的ARE的分子包括GM-CSF和TNF-α。III类ARES尚未很好地确定。这些富U区域不含有AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成蛋白是该类别的两个充分研究的实例。与ARE结合的蛋白质可能使信使不稳定，而ELAV家族的成员，如HuR，可增加mRNA的稳定性。HuR可与所有三个类别的ARE结合。将HuR特异性结合位点工程构建到核酸分子的3′UTR内可导致HuR结合，从而导致信息的体内稳定。
3′UTR富含AU的元件(ARE)的工程化可用于调节工程化多核糖核苷酸的稳定性。可以将ARE的一个或多个拷贝工程构建到多核糖核苷酸中来调节多核糖核苷酸的稳定性。可以对ARE进行鉴别、去除或突变，以增加细胞内稳定性，从而增加所得蛋白质的翻译和产生。可以使用工程化多核糖核苷酸在相关细胞系中进行转染实验，并且可以在转染后的不同时间点测定蛋白质产生。例如，可以用不同的ARE工程化分子转染细胞，并通过使用相关蛋白质的ELISA试剂盒，测定在转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天产生的蛋白质。
非翻译区可包含任何数目的核苷酸。非翻译区在长度上可包含约1个至约10个碱基或碱基对、约10个至约20个碱基或碱基对、约20个至约50个碱基或碱基对、约50个至约100个碱基或碱基对、约100个至约500个碱基或碱基对、约500个至约1000个碱基或碱基对、约1000个至约2000个碱基或碱基对、约2000个至约3000个碱基或碱基对、约3000个至约4000个碱基或碱基对、约4000个至约5000个碱基或碱基对、约5000个至约6000个碱基或碱基对、约6000个至约7000个碱基或碱基对、约7000个至约8000个碱基或碱基对、约8000个至约9000个碱基或碱基对或者约9000个至约10000个碱基或碱基对的长度。非翻译区在长度上可包含例如至少1个碱基或碱基对、至少2个碱基或碱基对、至少3个碱基或碱基对、至少4个碱基或碱基对、至少5个碱基或碱基对、至少6个碱基或碱基对、至少7个碱基或碱基对、至少8个碱基或碱基对、至少9个碱基或碱基对、至少10个碱基或碱基对、至少20个碱基或碱基对、至少30个碱基或碱基对、至少40个碱基或碱基对、至少50个碱基或碱基对、至少60个碱基或碱基对、至少70个碱基或碱基对、至少80个碱基或碱基对、至少90个碱基或碱基对、至少100个碱基或碱基对、至少200个碱基或碱基对、至少300个碱基或碱基对、至少400个碱基或碱基对、至少500个碱基或碱基对、至少600个碱基或碱基对、至少700个碱基或碱基对、至少800个碱基或碱基对、至少900个碱基或碱基对、至少1000个碱基或碱基对、至少2000个碱基或碱基对、至少3000个碱基或碱基对、至少4000个碱基或碱基对、至少5000个碱基或碱基对、至少6000个碱基或碱基对、至少7000个碱基或碱基对、至少8000个碱基或碱基对、至少9000个碱基或碱基对或者至少10000个碱基或碱基对的长度。
本发明的工程化多核糖核苷酸可包含一个或多个内含子。内含子可包含任何数目的经修饰的或未经修饰的核苷酸。内含子可包含例如至少1个碱基或碱基对、至少50个碱基或碱基对、至少100个碱基或碱基对、至少150个碱基或碱基对、至少200个碱基或碱基对、至少300个碱基或碱基对、至少400个碱基或碱基对、至少500个碱基或碱基对、至少600个碱基或碱基对、至少700个碱基或碱基对、至少800个碱基或碱基对、至少900个碱基或碱基对、至少1000个碱基或碱基对、至少2000个碱基或碱基对、至少3000个碱基或碱基对、至少4000个碱基或碱基对或者至少5000个碱基或碱基对。在一些情况下，内含子可包含例如至多10000个碱基或碱基对、至多5000个碱基或碱基对、至多4000个碱基或碱基对、至多3000个碱基或碱基对、至多2000个碱基或碱基对、至多1000个碱基或碱基对、至多900个碱基或碱基对、至多800个碱基或碱基对、至多700个碱基或碱基对、至多600个碱基或碱基对、至多500个碱基或碱基对、至多400个碱基或碱基对、至多300个碱基或碱基对、至多200个碱基或碱基对或者至多100个碱基或碱基对。
在一些情况下，内含子中一定百分比的核苷酸被修饰。例如，在一些情况下，内含子中少于99％、少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％或少于1％的核苷酸被修饰。在一些情况下，内含子中的所有核苷酸均被修饰。
本发明的工程化多核糖核苷酸可包含聚A序列。聚A序列(例如，聚A尾)可包含任何数目的核苷酸。聚A序列在长度上可包含约1个至约10个碱基或碱基对、约10个至约20个碱基或碱基对、约20个至约50个碱基或碱基对、约50个至约100个碱基或碱基对、约100个至约500个碱基或碱基对、约500个至约1000个碱基或碱基对、约1000个至约2000个碱基或碱基对、约2000个至约3000个碱基或碱基对、约3000个至约4000个碱基或碱基对、约4000个至约5000个碱基或碱基对、约5000个至约6000个碱基或碱基对、约6000个至约7000个碱基或碱基对、约7000个至约8000个碱基或碱基对、约8000个至约9000个碱基或碱基对或者约9000个至约10000个碱基或碱基对的长度。在一些实例中，聚A序列的长度为至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190或至少约200个核苷酸。聚A序列在长度上可包含例如至少1个碱基或碱基对、至少2个碱基或碱基对、至少3个碱基或碱基对、至少4个碱基或碱基对、至少5个碱基或碱基对、至少6个碱基或碱基对、至少7个碱基或碱基对、至少8个碱基或碱基对、至少9个碱基或碱基对、至少10个碱基或碱基对、至少20个碱基或碱基对、至少30个碱基或碱基对、至少40个碱基或碱基对、至少50个碱基或碱基对、至少60个碱基或碱基对、至少70个碱基或碱基对、至少80个碱基或碱基对、至少90个碱基或碱基对、至少100个碱基或碱基对、至少200个碱基或碱基对、至少300个碱基或碱基对、至少400个碱基或碱基对、至少500个碱基或碱基对、至少600个碱基或碱基对、至少700个碱基或碱基对、至少800个碱基或碱基对、至少900个碱基或碱基对、至少1000个碱基或碱基对、至少2000个碱基或碱基对、至少3000个碱基或碱基对、至少4000个碱基或碱基对、至少5000个碱基或碱基对、至少6000个碱基或碱基对、至少7000个碱基或碱基对、至少8000个碱基或碱基对、至少9000个碱基或碱基对或者至少10000个碱基或碱基对的长度。聚A序列可包含至多100个碱基或碱基对、至多90个碱基或碱基对、至多80个碱基或碱基对、至多70个碱基或碱基对、至多60个碱基或碱基对、至多50个碱基或碱基对、至多40个碱基或碱基对、至多30个碱基或碱基对、至多20个碱基或碱基对、至多10个碱基或碱基对或者至多5个碱基或碱基对的长度。
在一些情况下，聚-A序列中一定百分比的核苷酸被修饰。例如，在一些情况下，聚-A序列中少于99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％的核苷酸被修饰。在一些情况下，聚-A中的所有的核苷酸均被修饰。
连接体序列可包含任何数目的核苷酸。连接体可在N-3或C-5位置处与经修饰的核碱基附接。与核碱基附接的连接体可以是二甘醇、双丙二醇、三甘醇、三丙二醇、四甘醇、四甘醇、二价烷基、烯基、炔基部分、酯、酰胺或醚部分。连接体序列在长度上可包含约1个至约10个碱基或碱基对、约10个至约20个碱基或碱基对、约20个至约50个碱基或碱基对、约50个至约100个碱基或碱基对、约100个至约500个碱基或碱基对、约500个至约1000个碱基或碱基对、约1000个至约2000个碱基或碱基对、约2000个至约3000个碱基或碱基对、约3000个至约4000个碱基或碱基对、约4000个至约5000个碱基或碱基对、约5000个至约6000个碱基或碱基对、约6000个至约7000个碱基或碱基对、约7000个至约8000个碱基或碱基对、约8000个至约9000个碱基或碱基对或者约9000个至约10000个碱基或碱基对的长度。连接体序列在长度上可包含例如至少1个碱基或碱基对、2个碱基或碱基对、3个碱基或碱基对、4个碱基或碱基对、5个碱基或碱基对、6个碱基或碱基对、7个碱基或碱基对、8个碱基或碱基对、9个碱基或碱基对、10个碱基或碱基对、20个碱基或碱基对、30个碱基或碱基对、40个碱基或碱基对、50个碱基或碱基对、60个碱基或碱基对、70个碱基或碱基对、80个碱基或碱基对、90个碱基或碱基对、100个碱基或碱基对、200个碱基或碱基对、300个碱基或碱基对、400个碱基或碱基对、500个碱基或碱基对、600个碱基或碱基对、700个碱基或碱基对、800个碱基或碱基对、900个碱基或碱基对、1000个碱基或碱基对、2000个碱基或碱基对、3000个碱基或碱基对、4000个碱基或碱基对、5000个碱基或碱基对、6000个碱基或碱基对、7000个碱基或碱基对、8000个碱基或碱基对、9000个碱基或碱基对或者10000个碱基或碱基对的长度。连接体的长度为至多10000个碱基或碱基对、至多5000个碱基或碱基对、至多4000个碱基或碱基对、至多3000个碱基或碱基对、至多2000个碱基或碱基对、至多1000个碱基或碱基对、至多900个碱基或碱基对、至多800个碱基或碱基对、至多700个碱基或碱基对、至多600个碱基或碱基对、至多500个碱基或碱基对、至多400个碱基或碱基对、至多300个碱基或碱基对、至多200个碱基或碱基对或者至多100个碱基或碱基对。
在一些情况下，连接体序列中一定百分比的核苷酸被修饰。例如，在一些情况下，连接体序列中少于99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％的核苷酸被修饰。在一些情况下，连接体序列中的所有的核苷酸均被修饰。
在一些情况下，核酸构建体、载体或工程化多核糖核苷酸可在3′非翻译区(UTR)之前包含至少一个终止密码子。在一些情况下，核酸构建体、载体或工程化多核糖核苷酸包含多个终止密码子。终止密码子可选自TGA、TAA和TAG。终止密码子可以是经修饰的或未经修饰的。在一些情况下，所述核酸构建体、载体或工程化多核糖核苷酸包含终止密码子TGA和一个另外的终止密码子。在一些情况下，所述核酸构建体、载体或工程化多核糖核苷酸包括添加TAA终止密码子。
编码的多肽
在一些情况下，本发明提供了用于治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的方法，该方法包括向受试者施用包含编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白(DNAI1)、含犰狳重复序列蛋白4(ARMC4)、21号染色体开放阅读框59(C21orf59)、含卷曲螺旋域蛋白103(CCDC103)、含卷曲螺旋域蛋白114(CCDC114)、含卷曲螺旋域蛋白39(CCDC39)、含卷曲螺旋域蛋白40(CCDC40)、含卷曲螺旋域蛋白65(CCDC65)、动力蛋白(轴丝)装配因子1(DNAAF1)、动力蛋白(轴丝)装配因子2(DNAAF2)、动力蛋白(轴丝)装配因子3(DNAAF3)、动力蛋白(轴丝)装配因子5(DNAAF5)、动力蛋白轴丝重链11(DNAH11)、动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)、动力蛋白轴丝重链8(DNAH8)、动力蛋白轴丝中间链2(DNAI2)、动力蛋白轴丝轻链1(DNAL1)、动力蛋白调节复合物亚单位1(DRC1)、阅读障碍易感性1候选物1(DYX1C1)、轴丝中心对装置蛋白(HYDIN)、含富含亮氨酸重复序列蛋白6(LRRC6)、NME/NM23家族成员8(NME8)、口-面-指综合征1(OFD1)、色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)、径向辐头1同源物(衣藻属)(RSPH1)、径向辐头4同源物A(衣藻属)(RSPH4A)、径向辐头9同源物(衣藻属)(RSPH9)、精子相关抗原1(SPAG1)和含锌指MYND型10(ZMYND10)或任何前述的变体的核酸构建体的组合物，该核酸构建体包含在受试者的细胞内提供所述蛋白质或其变体的异源或增强表达的密码子，从而治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者。
所述编码的多肽是由通过酰胺键(肽键)连接在一起的氨基酸残基单体组成的聚合物链。该氨基酸可以是L-光学异构体、D-光学异构体或其组合。多肽可以是至少三个氨基酸的链、肽模拟物、蛋白质、重组蛋白质、抗体(单克隆或多克隆)、抗原、表位、酶、受体、维生素或结构类似物或其组合。在受试者体内翻译的多核糖核苷酸可以在受试者的细胞、组织内或许多细胞和组织中产生充足的特定肽或蛋白质供应。在一些情况下，可在特定靶细胞类型或靶组织的胞质溶胶内体内翻译多核糖核苷酸。在一些情况下，多核糖核苷酸可在体内翻译以提供其基因与原发性纤毛运动障碍相关的蛋白质、其功能片段；或与人DNAI1或人DNAH5蛋白质至少70％同源的蛋白质。在一些情况下，多核糖核苷酸可在各种非靶细胞类型或靶组织中体内翻译。作为靶细胞或非靶细胞的细胞的非限制性实例包括：a)皮肤细胞，例如：角质形成细胞、黑素细胞、膀胱上皮细胞；b)神经细胞，例如：神经元、许旺细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞；c)肝脏细胞，例如：肝细胞；d)肠细胞，例如：杯形细胞、肠细胞(enterocytes)；e)血细胞，例如：淋巴或骨髓细胞；和f)生殖细胞，例如：精子和卵子。组织的非限制性实例包括结缔组织、肌肉组织、神经组织或上皮组织。在一些情况下，靶细胞或靶组织是癌细胞、组织或器官。
多核苷酸序列可源自一个或多个物种。例如，多核苷酸序列可源自人(智人(Homosapiens))、小鼠(例如，小家鼠(Mus musculus))、大鼠(例如，褐家鼠(Rattus norvegicus)或黑家鼠(Rattus rattus))、微生物(例如，衣藻属)或任何其他合适的生物。多核苷酸序列可以是一个或多个物种的序列的嵌合组合。
在一些情况下，所述内源翻译机制可将翻译后修饰添加至编码的肽。翻译后修饰可涉及添加可靶向多肽以用于膜定位的疏水基团，添加辅因子以增加酶活性，或者添加较小的化学基团。编码的多肽也可以经翻译后修饰以接受其他肽或蛋白质部分的添加。例如，泛素化可导致泛素与编码的多肽的共价连接，SUMO化可导致SUMO(小泛素相关的修饰剂)与编码的多肽的共价连接，ISG化可导致ISG15(干扰素刺激基因15)的共价连接。
在一些情况下，所述编码的多肽可以经翻译后修饰以经历其他类型的结构改变。例如，该编码的多肽可被蛋白水解切割，并且一个或多个蛋白水解片段可以调节细胞内途径的活性。该编码的多肽可以在细胞内折叠。在一些情况下，所述编码的多肽在辅因子和分子伴侣的存在下折叠。折叠的多肽可具有二级结构和三级结构。折叠的多肽可与其他折叠的肽相缔合以形成四级结构。折叠的肽可形成具有四聚体四级结构的功能性多亚单位复合物，如抗体分子。可从多核糖核苷酸表达形成抗体的类别或同种型的各种多肽。
编码的多肽可以经翻译后修饰以改变编码的氨基酸的化学性质。例如，编码的多肽可经历翻译后的瓜氨酸化或去亚胺基化，精氨酸向瓜氨酸的转化。编码的多肽可经历翻译后脱酰胺作用；谷氨酰胺向谷氨酸或者天冬酰胺向天冬氨酸的转化。编码的多肽可经历消除，通过磷酸苏氨酸和磷酸丝氨酸的β-消除，或者通过丝氨酸和苏氨酸的脱水，以及通过半胱氨酸的脱羧作用，进行烯烃的转化。编码的蛋白质也可经历氨基甲酰化，赖氨酸向高瓜氨酸的转化。编码的蛋白质也可经历外消旋化，例如，通过脯氨酰异构酶对脯氨酸的外消旋化，或通过蛋白质-丝氨酸差向异构酶对丝氨酸的外消旋化。在一些情况下，编码的蛋白质可经历丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化。
多个生物分子的活性可以通过由多核糖核苷酸编码的分子进行调节。可以由编码的多核苷酸调节其活性的分子的非限制性实例包括：氨基酸、肽、肽模拟物、蛋白质、重组蛋白、抗体(单克隆或多克隆)、抗体片段、抗原、表位、碳水化合物、脂质、脂肪酸、酶、天然产物、核酸(包括DNA、RNA、核苷、核苷酸、结构类似物或其组合)、营养物、受体和维生素。
表3中公开了可以是本发明多核苷酸的一部分的核苷酸序列的非限制性实例。
可以将多肽序列工程化为具有所需的改变的密码子使用，如SEQ ID NO 15-16的改变的密码子使用或SEQ ID NO 17-18的改变的密码子使用。可以使用计算机软件，例如，产生SEQ ID NO 14的密码子使用。多肽序列可与内源多肽的氨基酸序列共享一定百分比的同源性。多肽序列可与内源多肽的氨基酸序列共享至多10％的同源性、至多20％的同源性、至多30％的同源性、至多40％的同源性、至多50％的同源性、至多60％的同源性、至多70％的同源性、至多80％的同源性、至多90％的同源性或至多99％的同源性。可使用多种方法和软件程序来确定两种或更多种肽之间的同源性，如NCBI BLAST、Clustal W、MAFFT、ClustalOmega、AlignMe、Praline或其他合适的方法或算法。
免疫原性
许多药剂，包括包含各种大小的分子(多核苷酸、蛋白质或酶)的组合物，当施用于受试者时可引发免疫应答。在许多情况下，免疫系统将该组合物识别为异物并中和其药物作用。本发明的多核糖核苷酸和组合物可具有低免疫原性或非免疫原性，从而引发由免疫系统引起的小应答，或根本不引发任何免疫应答。
免疫原性也可通过测定例如TNF-α和IL-8水平以及对TLR-3、TLR-7、TLR-8和解旋酶RIG-1的结合能力来确定。为了由此确定多核糖核苷酸是否具有希望的低免疫原性，可在向受试者施用多核糖核苷酸后测定一种或多种因子的量。多肽的免疫原性可根据向受试者施用多肽后白细胞数目的增加来确定。在一些情况下，在向受试者施用组合物后，该受试者表现出白细胞数目增加少于90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％或少于10％。本发明的多核糖核苷酸可以引发最小的或不显著的炎性或免疫反应。
为了确定多核糖核苷酸的免疫原性，可以使用多种方法。非常合适的方法是确定细胞中的炎性标记物或简单的白细胞计数，作为对多核糖核苷酸的施用的反应。在实施例中描述了这样的方法。可以测定与炎症相关的细胞因子，例如TNF-α、IFN-α、IFN-β、IP-10、IL-8、IL-6和/或IL-12。树突细胞活化标记物的表达也可用于估计免疫原性。免疫反应的进一步指示可以是与Toll样受体TLR-3、TLR-7和TLR-8以及解旋酶RIG-1的结合的检测。
与施用多核糖核苷酸之前的水平相比，多核糖核苷酸的免疫原性可被确定为炎性标记物水平或白细胞计数的总体增加。例如，未经修饰的或经修饰的工程化多核糖核苷酸可以向细胞或受试者施用，并且可以测量作为对施用多核糖核苷酸的反应的在规定的时间间隔内炎性标记物的分泌。
组合物
在一些情况下，本发明提供了包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的组合物，其中该核酸构建体包含编码动力蛋白轴丝中间链1的互补脱氧核糖核酸，该组合物被配制用于向受试者施用。在一些情况下，本发明提供了包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的组合物，该核酸构建体包含在患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的细胞内提供动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的异源或增强表达的密码子。在一些情况下，本发明提供了包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的组合物，其中少于30％的编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸是核苷酸类似物，如假尿苷或1-甲基假尿苷。在一些情况下，将这些构建体的编码序列工程化为在蛋白质编码区中具有改变的核苷酸使用以增加其稳定性。
在一些情况下，所述构建体的密码子与哺乳动物动力蛋白轴丝中间链1蛋白质或人动力蛋白轴丝中间链1蛋白质至少70％同源。该构建体也可包含处于编码感兴趣的蛋白质如动力蛋白轴丝中间链1的密码子序列侧翼的3′或5′非编码区，其中该非编码区增强该蛋白质在受试者的细胞内的表达。处于密码子侧翼的3′非编码区可包含3′-帽独立的翻译增强子(3′-CITE)或源自组蛋白的核苷酸序列的3′-茎环区或源自转移相关肺腺癌转录物1(MALAT1)的核苷酸序列的3′-三螺旋结构。处于密码子侧翼的3′非编码区可包含聚腺苷尾，其中该聚腺苷尾中的腺苷数目改善了感兴趣的蛋白质如动力蛋白轴丝中间链1蛋白质的翻译效率或半衰期。在一些情况下，所述聚腺苷尾的长度为至多200个腺苷。在一些情况下，一定百分比的聚腺苷尾包含核酸类似物。聚腺苷尾中少于50％、40％、30％、20％、10％或5％的核酸可以是核酸类似物。
当所述组合物包含一定百分比的核苷酸类似物时，该核苷酸类似物可选自假尿苷、1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基胞苷、2′-氨基-2′-脱氧胞苷和2′-氟-2′-脱氧胞苷。在一些情况下，所述核酸类似物是假尿苷或1-甲基假尿苷。在一些情况下，所述核酸类似物是5-甲氧基尿苷。
在一些情况下，所述组合物包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸和/或核酸类似物。任选地，所述组合物可进一步包含至少一种另外的核酸构建体。所述至少一种另外的核酸构建体可编码选自下组的蛋白质：含犰狳重复序列蛋白4(ARMC4)、21号染色体开放阅读框59(C21orf59)、含卷曲螺旋域蛋白103(CCDC103)、含卷曲螺旋域蛋白114(CCDC114)、含卷曲螺旋域蛋白39(CCDC39)、含卷曲螺旋域蛋白40(CCDC40)、含卷曲螺旋域蛋白65(CCDC65)、动力蛋白(轴丝)装配因子1(DNAAF1)、动力蛋白(轴丝)装配因子2(DNAAF2)、动力蛋白(轴丝)装配因子3(DNAAF3)、动力蛋白(轴丝)装配因子5(DNAAF5)、动力蛋白轴丝重链11(DNAH11)、动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)、动力蛋白轴丝重链8(DNAH8)、动力蛋白轴丝中间链2(DNAI2)、动力蛋白轴丝轻链1(DNAL1)、动力蛋白调节复合物亚单位1(DRC1)、阅读障碍易感性1候选物1(DYX1C1)、轴丝中心对装置蛋白(HYDIN)、含富含亮氨酸重复序列蛋白6(LRRC6)、NME/NM23家族成员8(NME8)、口-面-指综合征1(OFD1)、色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)、径向辐头1同源物(衣藻属)(RSPH1)、径向辐头4同源物A(衣藻属)(RSPH4A)、径向辐头9同源物(衣藻属)(RSPH9)、精子相关抗原1(SPAG1)和含锌指MYND型10(ZMYND10)。
所述组合物可包含工程化多核糖核苷酸、载体或核酸构建体。“裸”多核苷酸组合物可成功地向受试者施用，并且在没有载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂的帮助下被受试者的细胞所摄取(Wolff等人1990,Science,247,1465-1468)。然而，在许多情况下，用可增加内吞摄取的制剂来包封多核苷酸可以增加本发明的组合物的有效性。为了克服该挑战，在一些情况下，所述组合物包含核酸构建体、载体或编码动力蛋白轴丝中间链1的分离的核酸，其中该核酸构建体包含编码动力蛋白轴丝中间链1的互补脱氧核糖核酸，该组合物被配制用于向受试者施用。
将多核糖核苷酸递送至多细胞生物体的另一技术挑战是鉴别对在受试者的细胞或组织内翻译的多核糖核苷酸提供高效递送的组合物。已经认识到，裸核酸的施用可能是非常低效的，并且可能无法提供将多核苷酸施用于多细胞生物体的合适的方法。
为了解决该挑战，可将包含工程化多核糖核苷酸的组合物用药物载体进行包封或配制。该制剂可以是但不限于：纳米颗粒、聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)微球、类脂质(lipidoid)、脂质复合物(lipoplex)、脂质体、聚合物、碳水化合物(包括单糖)、阳离子脂质、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶、纤维蛋白胶、纤维蛋白粘合剂、纤维蛋白原、凝血酶、快速消除的脂质纳米颗粒(reLNP)及其组合。包含本文公开的工程化多核糖核苷酸的组合物可包含按重量/体积计约1％至约99％的载体系统。载体系统中存在的载体的量基于几种不同因素或由配制师作出的选择，例如，多核糖核苷酸的最终浓度和增溶剂的量。已显示各种载体适用于递送不同类别的治疗剂。在这些载体中，由生物相容性聚合物聚(D,L-丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)和聚丙交酯(PLA)配制的可生物降解的纳米颗粒已显示出对不同治疗剂进行持续地细胞内递送的潜力。
组合物中的工程化多核苷酸的负载重量百分比可以是至少0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。PLGA微球中经修饰的mRNA的包封效率可以是至少50％、至少70％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％。
本发明描述了包含含有交错的不相同的亚烷基胺单元的寡聚(亚烷基胺)的纳米颗粒、低聚物、聚合物或类脂质，其可用于将多核苷酸(在一些情况下为工程化的多核糖核苷酸)递送至细胞或组织中。本文公开的组合物可稳定至少约1分钟、5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、1小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、2周、4周、6周、8周、10周、12周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或1年。本文公开的制剂可以在例如至少约0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃或80℃的温度下稳定。本发明的组合物可具有所需的密度。该组合物的密度可以改善组合物的性质，如组合物的流变性。
纳米颗粒
本发明还提供了核酸构建体、工程化多核糖核苷酸或能够在施用于受试者后转移的载体的基于纳米颗粒的制剂。在一些情况下，所述施用是经肺的，并且工程化多核糖核苷酸可以主动地或被动地从施用部位完整移动至全身血液供应，并随后沉积在不同的细胞或组织(例如，乳房)中。包含编码治疗性蛋白质的工程化多核糖核苷酸的纳米颗粒的这种转移构成了肺部以外的活性药物成分的非侵入性全身递送，从而导致产生针对全身可及的非肺细胞或组织的功能性蛋白质，其中该治疗性蛋白质例如是动力蛋白轴丝中间链1(DNAI1)、含犰狳重复序列蛋白4(ARMC4)、21号染色体开放阅读框59(C21orf59)、含卷曲螺旋域蛋白103(CCDC103)、含卷曲螺旋域蛋白114(CCDC114)、含卷曲螺旋域蛋白39(CCDC39)、含卷曲螺旋域蛋白40(CCDC40)、含卷曲螺旋域蛋白65(CCDC65)、细胞周期蛋白O(CCNO)、动力蛋白(轴丝)装配因子1(DNAAF1)、动力蛋白(轴丝)装配因子2(DNAAF2)、动力蛋白(轴丝)装配因子3(DNAAF3)、动力蛋白(轴丝)装配因子5(DNAAF5)、动力蛋白轴丝重链11(DNAH11)、动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)、动力蛋白轴丝重链6(DNAH6)、动力蛋白轴丝重链8(DNAH8)、动力蛋白轴丝中间链2(DNAI2)、动力蛋白轴丝轻链1(DNAL1)、动力蛋白调节复合物亚单位1(DRC1)、阅读障碍易感性1候选物1(DYX1C1)、生长停滞特异性8(GAS8)、轴丝中心对装置蛋白(HYDIN)、含富含亮氨酸重复序列蛋白6(LRRC6)、NME/NM23家族成员8(NME8)、口-面-指综合征1(OFD1)、色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)、径向辐头1同源物(衣藻属)(RSPH1)、径向辐头4同源物A(衣藻属)(RSPH4A)、径向辐头9同源物(衣藻属)(RSPH9)、精子相关抗原1(SPAG1)和含锌指MYND型10(ZMYND10)或其功能片段。
纳米颗粒可以是粒径为约10纳米(nm)至5000nm、10nm至1000nm，或60nm至500nm，或70nm至300nm的颗粒。在一些实例中，纳米颗粒的粒径为约60nm至225nm。该纳米颗粒可包含包封一种或多种多核糖核苷酸的包封剂(例如，包衣)，该多核糖核苷酸可以是工程化的多核糖核苷酸。该纳米颗粒可包含工程化和/或天然存在的多核糖核苷酸。该包封剂可以是聚合材料，如PEI或PEG。
可用作递送剂的类脂质或脂质纳米颗粒可包含可选自C12-200、MD1、98N12-5、DLin-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、PEG化脂质及其类似物的脂质。合适的纳米颗粒可包含各种比率的一种或多种脂质。例如，本发明的组合物可包含40:30:25:5比率的C12-200:DOPE:胆固醇:DMG-PEG2000或40:20:35:5比率的HGT5001:DOPE:胆固醇:DMG-PEG2000。纳米颗粒可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种脂质或其他合适数目的脂质。纳米颗粒可由任何合适比率的脂质形成，该脂质选自C12-200、MD1、98N12-5、DLin-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA、PLGA、PEG、PEG-DMG。
纳米颗粒制剂的平均大小可包含60纳米(nm)至225nm的经修饰的mRNA。包含经修饰的mRNA的纳米颗粒制剂的多分散指数PDI可以是0.03至0.15。该纳米颗粒制剂的ζ电位在pH 7.4下可以为-10至+10。经修饰的mRNA的制剂可包含致融脂质、胆固醇和PEG脂质。该制剂可具有50:10:38.5:1.5-3.0(阳离子脂质:致融脂质:胆固醇:聚乙二醇(PEG)脂质)的摩尔比。该PEG脂质可选自但不限于PEG-c-DOMG和PEG-DMG。该致融脂质可以是DSPC。本发明的脂质纳米颗粒可以配制在诸如但不限于纤维蛋白密封剂的密封剂中。
寡聚(亚烷基胺基团)
还已经认识到，尽管用一些制剂包封多核苷酸可以增加组合物的内吞摄取，但由细胞摄取的多核苷酸可能不能在细胞内被有效翻译。一些制剂可以有效地用于递送质粒DNA和/或siRNA，然而不适用于递送多核糖核苷酸。本发明提供了可用于向受试者有效递送和翻译多核糖核苷酸组合物的制剂。
可以设计本发明的组合物，以提供在细胞内有效翻译的多核糖核苷酸。本发明的组合物可包含以三个或更多个单元为一组的交错长度的亚烷基胺单元的排列，并且在组合物中含有乙烯胺单元，用于用任何的多核苷酸如工程化多核糖核苷酸来转染细胞。与非交错长度的亚烷基胺单元的类似排列相比，本发明的组合物可以向细胞提供更有效的多核糖核苷酸的递送。
可以提供低聚物、聚合物或类脂质，其共享如式(I)所示的共同结构实体：
本发明的组合物可包含选自以下的寡聚(亚烷基胺)：
a)包含多个作为侧链和/或作为末端基团的式(II)基团的低聚物或聚合物：
其中独立地针对多个该类基团中的每个式(II)基团，变量a、b、p、m、n以及R2至R6如下定义：
a为1，且b为2至4的整数；或者a为2至4的整数，且b为1，p为1或2，
m为1或2；n为0或1，且m+n≥2；且
R2至R5彼此独立地选自：氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；针对氨基的保护基；和聚(乙二醇)链；
R6选自：氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；针对氨基的保护基；-C(NH)-NH；聚(乙二醇)链；和受体配体，
且其中可以使式(II)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供式(II)的阳离子基团。
b)包含多个作为重复单元的式(III)基团的低聚物或聚合物：
其中独立地针对多个该类基团中的每个式(III)基团，变量a、b、p、m、n以及R2至R5如下定义：
a为1，且b为2至4的整数；或者a为2至4的整数，且b为1，p为1或2，
m为1或2；n为0或1，且m+n≥2；且
R2至R5彼此独立地选自：氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7、-CH2-R7或-CH2-，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；针对氨基的保护基；和聚(乙二醇)链；
且其中可以使式(III)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供式(III)的阳离子基团。
c)具有式(IV)结构的类脂质：
其中变量a、b、p、m、n以及R2至R6如下定义：
a为1，且b为2至4的整数；或者a为2至4的整数，且b为1，p为1或2，
m为1或2；n为0或1，且m+n≥2；且
R2至R6彼此独立地选自：氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；针对氨基的保护基；聚(乙二醇)链；和受体配体；条件是R1至R6中的至少两个残基是基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；
且其中可以使式(IV)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供式(IV)的阳离子基团。
烯基和亚烯基的非限制性实例包括直链、支链和环状烯基。烯烃或烯基的烯烃可以是，例如，E、Z、顺式、反式、末端或外-亚甲基。亚烯基可以是，例如，取代的或未取代的C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30、C31、C32、C33、C34、C35、C36、C37、C38、C39、C40、C41、C42、C43、C44、C45、C46、C47、C48、C49或C50基团。
式(II)、式(III)和式(IV)的寡聚(亚烷基胺)结构的特征在于它们可以以交错的方式将较短(为了说明也被称为“S”型)的亚乙基胺单元(即，a或b为1)与较长(为了说明也被称为“L”型)的亚烷基胺单元(即，a或b中的另一个是2至4的整数)组合。可质子化单元的这种排列可以在所得基团的适合性方面提供优势，从而提供用于将多核糖核苷酸递送至细胞中的媒介物。
本发明的组合物可包含多个作为侧链或作为末端基团的式(II)寡聚(亚烷基胺)基团：
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6(II)，
其中独立地针对多个该类基团中的每个式(II)基团，变量a、b、p、m、n以及R2至R6如下定义：
a为1，且b为2至4的整数；或者a为2至4的整数，且b为1，p为1或2，
m为1或2；n为0或1，且m+n≥2；且
R2至R5彼此独立地选自：氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；针对氨基的保护基；-C(NH)-NH2-；和聚(乙二醇)链；
R6选自：氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C16烷基或C3-C16烯基；针对氨基的保护基；-C(NH)-NH；聚(乙二醇)链；和受体配体。
在一些情况下，R2至R5为氢，且R6选自：氢；针对氨基的保护基；-C(NH)-NH2和聚(乙二醇)链。在一些情况下，R2至R6为氢。在一些情况下，R7选自具有一个C-C双键的C8-C18烷基或C8-C18烯基，或选自具有一个C-C双键的C8-C12烷基或C8-C12烯基，或选自具有一个C-C双键的C10-C12烷基或C10-C12烯基。本发明的组合物可包含一个或多个式(II)-(IV)的亚烷基。
在一些情况下，可在根据本发明的组合物中使用的低聚物或聚合物包含多个作为重复单元的式(III)寡聚(亚烷基胺)基团：
NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-(III)
其中独立地针对多个该类基团中的每个式(III)基团，变量a、b、p、m、n以及R2至R5如下定义：
a为1，且b为2至4的整数；或者a为2至4的整数，且b为1，p为1或2，
m为1或2；n为0或1，且m+n≥2；且
R2至R5彼此独立地选自：氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7、-CH2-R7或-CH2-，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；针对氨基的保护基；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；以及内体逃逸效应物和受体配体。在一些情况下，R2至R5为氢。在一些情况下，R7选自具有一个C-C双键的C8-C18烷基或C8-C18烯基。R7可选自具有一个C-C双键的C8-C12烷基或C8-C12烯基。作为替代，R7可选自具有一个C-C双键的C10-C12烷基或C10-C12烯基。
可使式(III)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供式(III)的阳离子基团。
任选地，包含多个作为重复单元的式(III)基团的低聚物或聚合物可另外包含一个或多个作为侧链和/或作为末端基团的式(II)寡聚(亚烷基胺)基团。
在作为重复单元的多个式(III)基团中，式(III)基团中的两个、三个或更多个可被包含于低聚物或聚合物中。通常，包含2至9个重复单元的物质在本文中被称为低聚物，包含10个或更多个重复单元的物质被称为聚合物。因此，在含有多个作为重复单元的式(III)基团的聚合物中，可存在10个或更多个式(III)基团。应当理解，式(III)基团可以在聚合物或低聚物内具有相同的结构，或者可以在式(III)的范围内具有两种或更多种不同的结构。在一些情况下，可以以序列定义的聚合物的文库的形式提供含有多个作为重复单元的式(III)基团的低聚物或聚合物，该序列定义的聚合物在受控的逐步聚合作用中由不同的式(III)基团来制备。
根据上述式(II)和式(III)，亚烷基胺单元可以在交错链中重复一次，如此可以得到-S-L-L-S-或-L-S-S-L-型的寡聚(亚烷基胺)部分，其中S代表较短的亚乙基胺单元，且L代表较长的亚烷基胺单元。在一些情况下，式(II)和式(III)的基团是其中不发生重复的基团，即其中p为1，使得较短或较长的单元不成对出现。式(II)基团可以是式(IIa)的寡聚(亚烷基胺)基团，且式(III)基团可以是式(IIIa)的寡聚(亚烷基胺)基团：
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6(IIa)，
其中a、b、m、n以及R2至R6如式(II)中所定义，并且其中可以使式(IIa)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供阳离子低聚物或聚合物结构；
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-(IIIa)，
其中a、b、m、n以及R2至R5如式(III)中所定义，并且其中可以使式(IIIa)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供阳离子低聚物或聚合物结构。
此外，在一些情况下，在式(II)和式(III)的寡聚(亚烷基胺)基团中，n可以为1。在一些情况下，m为1，且n为1。在一些情况下，式(II)基团为式(IIb)的寡聚(亚烷基胺)基团，且式(III)基团为式(IIIb)的寡聚(亚烷基胺)基团：
-NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-(NR5)-R6(IIb)，
其中a、b以及R2至R6如式(II)中所定义，并且其中可以使式(IIb)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供阳离子低聚物或聚合物结构；
-NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-NR5-(IIIb)，
其中a、b以及R2至R5如式(III)中所定义，并且其中可以使式(IIIb)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供阳离子低聚物或聚合物结构。
关于式(II)、式(IIa)、式(IIb)和式(III)、式(IIIa)、式(IIIb)的寡聚(亚烷基胺)基团中的亚烷基胺单元的长度，其中一个交错单元可以为亚乙基胺单元(即，a或b为1)。另一交错单元可以为亚丙基胺单元、亚丁基胺单元或亚戊基胺单元(即，a或b中的另一个可以是2至4的整数)。在一些情况下，a或b中的另一个可以是2或3，而在一些情况下，a为1且b为2，或者a为2且b为1。在一些情况下，采用式(IIc)寡聚(亚烷基胺)基团代替基团(II)，或者除了基团(II)之外还采用式(IIc)寡聚(亚烷基胺)基团；和/或采用式(IIIc)寡聚(亚烷基胺)基团代替基团(III)，或者除了基团(III)之外还采用式(IIIc)寡聚(亚烷基胺)基团。基团(IIc)和基团(IIIc)的化学式如下：
-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5-R6(IIc)，
其中R2至R6如式(II)中所定义，并且其中R2至R6为氢，并且其中可以使式(IIc)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供阳离子低聚物或聚合物结构；
-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5-(IIIc)，
其中R2至R5如式(III)中所定义，并且其中可以使式(IIIc)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供阳离子低聚物或聚合物结构。
在一些情况下，式(II)、式(IIa)、式(IIb)和式(IIc)中的基团R2至R6或式(III)、式(IIIa)、式(IIIb)和式(IIIc)中的基团R2至R5可以为针对氨基的保护基。保护基的非限制性实例包括叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或苄氧羰基(Cbz)。
在一些情况下，式(II)、式(IIa)、式(IIb)和式(IIc)中的基团R1至R6或式(III)、式(IIIa)、式(IIIb)和式(IIIc)中的基团R2至R5为受体配体，如Philipp和Wagner在“Gene andCell Therapy-Therapeutic Mechanisms and Strategy”,第3版,第15章,CRC Press,Taylor&Francis Group LLC,Boca Raton 2009中所描述的受体配体。Pfeifer等人2010,Ther.Deliv.1(1):133-48中描述了靶向肺组织的受体配体的实例。受体配体可包括：合成的环状或线性肽，如通过针对与特定细胞表面结构或特定细胞类型的结合筛查肽文库而产生的，环状或线性RGD肽，合成或天然的碳水化合物如唾液酸、半乳糖或甘露糖，或通过例如碳水化合物与肽反应产生的合成配体，特异性识别细胞表面结构的抗体，叶酸，表皮生长因子及其衍生的肽，转铁蛋白，抗转铁蛋白受体抗体，纳米抗体和抗体片段，可与细胞表面分子(例如，细胞表面受体)结合的获批药物，等等。
就式(II)、式(IIa)、式(IIb)和式(IIc)中的任何基团R1至R6或式(III)、式(IIIa)、式(IIIb)和式(IIIc)中的任何基团R2至R5是聚(乙二醇)链而言，该聚(乙二醇)链的分子量可为约100g/mol至20,000g/mol、约1,000g/mol至10,000g/mol或约1,000g/mol至5,000g/mol。
在一些情况下，基团(II)可以是式(IId)的寡聚(亚烷基胺)基团：
-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH-H(IId)，
其中可以使式(IId)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供阳离子聚合物或树状聚体结构。在一些情况下，基团(III)是式(IIId)的寡聚(亚烷基胺)基团：
-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH-(IIId)
其中可以使式(IIId)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供阳离子聚合物或树状聚体结构。
类脂质
工程化的多核糖核苷酸可被包封在类脂质制剂中。类脂质制剂可以是具有脂质特征的任何材料，如脂肪、蜡、甾醇、脂溶性维生素(如维生素A、D、E和K)、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂等。例如，脂质制剂或类脂质制剂可包含：脂质，如在科学文献中被称为辅助脂质的胆固醇、DOPE、DOPC或DSPC；和/或PEG化脂质；或可用于制备脂质复合物的任何其他脂质。包含工程化多核糖核苷酸的制剂可以是可包含至少一种脂质的纳米颗粒。类脂质制剂可以是脂质纳米颗粒。该脂质可以选自但不限于：DOPE、DOPC、DSPC、胆固醇、DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG和PEG化脂质。在另一方面，该脂质可以是阳离子脂质，诸如但不限于DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA和DODMA。
含有类脂质的组合物可以是约40-60％的类脂质、约40-60％的胆固醇和约5-20％的PEG-脂质(以重量百分比计，基于组合物的总重量)。含有类脂质的组合物可以是约50-60％的类脂质、约40-50％的胆固醇和约5-10％的PEG-脂质。含有类脂质的组合物可以是约50-75％的类脂质、约20-40％的胆固醇和约1-10％的PEG-脂质。含有类脂质的组合物可以是约60-70％的类脂质、约25-35％的胆固醇和约5-10％的PEG-脂质。可利用例如Akinc等人2007,Nat Biotech,26,561-569；Akinc等人2009,Mol Ther,17,872-9；Love等人2010,PNAS,107,1864-9；US 8,450,298、WO2006/138380中描述的技术来得到组合物。RNA/类脂质复合物可以形成适用于将RNA如单链RNA或mRNA递送至细胞中的颗粒。
本发明的组合物可以是由式(IV)类脂质包封的工程化多核糖核苷酸。
R1-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-[CH2-(CH2)b-NR4]p}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6(IV)，
其中变量a、b、p、m、n以及R1至R6如下定义：
a为1，且b为2至4的整数；或者a为2至4的整数，且b为1，
p为1或2，
m为1或2；n为0或1，且m+n≥2；且
R1至R6彼此独立地选自：氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；针对氨基的保护基；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体；条件是R1至R6中的至少两个残基是基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基。
在一些情况下，R1至R6独立地选自：氢；基团-CH2-C(OH)H-R7或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；针对氨基的保护基；和聚(乙二醇)链；条件是R1至R6中的至少两个残基是基团-CH2-C(OH)H-R7或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基。在一些情况下，R1至R6独立地选自：氢；和基团-CH2-CH(OH)-R7或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C16烷基或C3-C16烯基；条件是R1至R6中的至少两个残基是基团-CH2-CH(OH)-R7或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基。在一些情况下，R1和R6独立地选自：氢；和基团-CH2-CH(OH)-R7或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基；并且R2至R5均是基团-CH2-CH(OH)-R7或-CH(R7)-CH2-OH，其中R7选自具有一个C-C双键的C3-C18烷基或C3-C18烯基。在一些情况下，R7选自具有一个C-C双键的C8-C16烷基或C8-C18烯基，或选自具有一个C-C双键的C8-C12烷基或C8-C12烯基，或选自具有一个C-C双键的C10-C12烷基或C10-C12烯基。
可使式(IV)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供式(IV)的阳离子类脂质。
根据上述式(IV)，亚烷基胺单元可以在交错链中重复一次，如此可以得到-S-L-L-S-或-L-S-S-L-型的寡聚(亚烷基胺)部分，其中S代表较短的亚乙基胺单元，且L代表较长的亚烷基胺单元。在一些情况下，式(IV)类脂质是其中不发生重复的类脂质，即其中p为1，使得较短或较长的单元不成对出现。式(IV)类脂质可以是式(IVa)的类脂质：
R1-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR}m-[CH2-(CH2)a-NR5]n-R6(IVa)，
其中a、b、m、n以及R1至R6如式(IV)中所定义，并且其中可以使式(IVa)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供阳离子类脂质；
在一些情况下，所述类脂质是式(IV)类脂质。在一些情况下，式(IV)类脂质中“n”为1。在一些情况下，式(IV)类脂质中“m”为1且n为1。在一些情况下，式(IV)类脂质是式(IVb)类脂质：
R-NR2-CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4-CH2-(CH2)a-NR5-R6(IVb)，
其中a、b以及R1至R6如式(III)中所定义，其中可以使式(IVb)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供阳离子类脂质。
关于式(IV)、式(IVa)和式(IVb)的类脂质中的亚烷基胺单元的长度，应当理解，交错单元之一需要是亚乙基胺单元(即，a或b为1)。另一交错单元可以是亚丙基胺单元、亚丁基胺单元、亚戊基胺单元或其他合适的单元(即，a或b中的另一个为2至4的整数)。在一些情况下，式(IV)类脂质是式(IVc)类脂质：
R1-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5-RS(IVc)
其中R1至R6如式(IV)中所定义，并且其中可以使式(IVc)中所示的一个或多个氮原子质子化，从而提供阳离子类脂质。
在一些情况下，式(IV)、式(IVa)、式(IVb)和式(IVc)中的基团R1至R6为针对氨基的保护基。保护基的非限制性实例包括叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或苄氧羰基(Cbz)。
关于式(IV)、式(IVa)、式(IVb)和式(IVc)中的基团R1至R6是受体配体，如Philipp和Wagner在“Gene and Cell Therapy-Therapeutic Mechanisms and Strategy”,第3版,第15章,CRC Press,Taylor&Francis Group LLC,Boca Raton 2009中所描述的受体配体。Pfeifer等人2010,Ther.Deliv.1(1):133-48中描述了靶向肺组织的受体配体的实例。受体配体可包括：合成的环状或线性肽，如通过针对与特定细胞表面结构或特定细胞类型的结合筛查肽文库而产生的，环状或线性RGD肽，合成或天然的碳水化合物如唾液酸、半乳糖或甘露糖，或通过例如碳水化合物与肽反应而产生的合成配体，特异性识别细胞表面结构的抗体，叶酸，表皮生长因子及其衍生的肽，转铁蛋白，抗转铁蛋白受体抗体，纳米抗体和抗体片段，可与细胞表面分子(例如，细胞表面受体)结合的获批药物，等等。
就式(IV)、式(IVa)、式(IVb)和式(IVc)中的基团R1至R6是聚(乙二醇)链而言，该聚(乙二醇)链的分子量可为约100g/mol至20,000g/mol、约1,000g/mol至10,000g/mol或约1,000g/mol至5,000g/mol。在一些情况下，PEG链的分子量可以提供具有所需密度的组合物。
多个类脂质分子可以与工程化多核糖核苷酸缔合。例如，组合物可包含1个工程化多核糖核苷酸比100个类脂质分子、1个工程化多核糖核苷酸比1,000个类脂质分子、10个工程化多核糖核苷酸比1,000个类脂质分子或者100个工程化多核糖核苷酸比10,000个类脂质分子。工程化多核糖核苷酸与类脂质的复合物可以形成颗粒。该颗粒的直径可以在例如10纳米至1,200纳米的范围内。在一些情况下，该颗粒的直径为10纳米至500纳米。在一些情况下，该颗粒的直径为20纳米至150纳米。
向受试者的施用
本文进一步描述了将多核苷酸(例如，多核糖核苷酸、核酸构建体或载体)施用于受试者的方法。该多核糖核苷酸可以经由递送剂(如含有包封多核糖核苷酸的包封剂的颗粒或胶囊)提供给受试者。该递送剂可以是治疗剂。该受试者可以是人，如患有疾病或病况(例如，原发性纤毛运动障碍(PCD)、Kartagener综合征或癌症)的人。可以将递送剂以给定剂量施用于受试者(例如，自我施用，或者由第三方如保健提供者施用)，并且该剂量可以随时间而增加、随时间而降低或保持恒定。该剂量可以基于受试者中疾病(如罕见疾病或癌症)的进展或消退而改变。
本发明的多核糖核苷酸可以与一种或多种药学上可接受的载体一起配制以向受试者施用。在一些情况下，该多核糖核苷酸可经配制用于靶向递送至靶细胞或细胞群体。在一些情况下，该多核糖核苷酸可经配制用于非靶向递送至细胞或细胞群体。然后该多核糖核苷酸的编码的多肽产物被转录并在受体细胞内积累。
组合物可以是本文所述的任何工程化多核糖核苷酸与其他化学组分如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂的组合。该组合物有助于将化合物施用于生物体。药物组合物可以通过各种形式和途径作为药物组合物以治疗有效量进行施用，该途径包括例如静脉内施用、皮下施用、肌内施用、口服施用、直肠施用、气雾剂施用、肠胃外施用、经眼施用、经肺施用、经皮施用、阴道施用、经耳施用、经鼻施用和局部施用。
可以以局部或全身方式施用组合物，例如，经由将化合物直接注射至器官中，任选地以贮库型制剂或持续释放制剂的形式施用。可以以快速释放制剂的形式、以延长释放制剂的形式或以中间释放制剂的形式来提供药物组合物。快速释放形式可提供立即释放。延长释放制剂可提供控制释放或持续延迟释放。
对于通过吸入施用而言，活性化合物可以是气雾剂、雾、蒸气、喷雾或粉末的形式。使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，以从加压包装或雾化器提供气雾喷雾的形式方便地递送药物组合物。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供递送计量的量的阀来确定。供吸入器或吹入器中使用的例如明胶的胶囊和药筒可配制为含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
眼睛包含几个结构上和功能上不同的血管床，这些血管床提供对维持视力至关重要的眼部组件。这些血管床包括视网膜和脉络膜脉管系统以及位于角膜周边的角膜缘脉管系统，该视网膜和脉络膜脉管系统分别供应视网膜的内部和外部。
可以通过任何合适的形式或途径，将包含工程化多核糖核苷酸的药物组合物施用于眼睛，该途径包括例如局部施用、口服施用、全身施用、玻璃体内施用、前房内施用、结膜下施用、眼球下施用、眼球后施用、眼内施用、后巩膜下施用、眼周施用、视网膜下施用和脉络膜上腔施用。可以通过将制剂注射到眼睛的任何部位来施用组合物，该部位包括前房、后房、玻璃体腔(玻璃体内)、视网膜本身和/或视网膜下间隙。也可以经由非侵入性方法递送组合物。施用制剂的非侵入性模式可包括使用无针注射装置。可以采用多种施用途径来有效递送药物组合物。
可将本发明的工程化多核苷酸递送至任何合适的眼细胞，包括例如内皮细胞，如血管内皮细胞；视网膜细胞，如视网膜色素上皮细胞(RPE)；角膜细胞；成纤维细胞；星形胶质细胞；胶质细胞、周细胞；虹膜上皮细胞；神经起源的细胞；纤毛上皮细胞；米勒细胞；围绕和附接于眼睛的肌细胞，如外直肌细胞、眼眶脂肪细胞、巩膜和巩膜外层细胞；小梁网细胞；和结缔组织细胞。
在将本文公开的组合物施用于受试者后，受试者的细胞对该组合物可具有至少约80％、90％或95％的转染效率。在一些情况下，相对于未包封的多核糖核苷酸，包封的组合物在施用于受试者后的转染效率为至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、450％或500％。在一些情况下，相对于仅含有未经修饰的多核糖核苷酸的组合物，包含经修饰的多核糖核苷酸(在一些情况下还包含未经修饰的多核糖核苷酸)的组合物在施用于受试者后的转染效率为至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、450％或500％。通过向组合物的外层添加载体，如穿过细胞的肽或阳离子涂层，可提高该组合物的转染效率。组合物的转染效率可以通过组合物的密度来调节。
制备包含本文所述的工程化多核糖核苷酸的组合物的方法，包括将化合物与一种或多种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体一起配制以形成固体、半固体或液体组合物。固体组合物包括，例如，粉末、片剂、可分散的颗粒、胶囊、扁囊剂和栓剂。液体组合物包括，例如，其中溶解有化合物的溶液，包含化合物的乳液，或包含含有本文公开的化合物的脂质体、胶束或纳米颗粒的溶液。半固体组合物包括例如凝胶、悬浮液和乳膏。该组合物可以是液体溶液或悬浮液的形式，可以是适合于在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或者可以作为乳液。这些组合物还可含有少量无毒的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和其他药学上可接受的添加剂。
药学上可接受的赋形剂的非限制性实例可见于，例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.,Eds.,Pharmaceutical DosageForms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems,第七版.(Lippincott Williams&Wilkins1999)，其中的每一个通过引用而整体并入。
可以以各种剂量提供包含多核苷酸(例如，多核糖核苷酸)的组合物。一定剂量的多核苷酸或多核糖核苷酸可以是约1μg至约1000μg、约1μg至约500μg、约1μg至约1000μg、约10μg至约500μg、约20μg至约500μg、约25μg至约500μg、约30μg至约500μg、约40μg至约500μg、约50μg至约500μg、约10μg至约250μg、约20μg至约250μg、约30μg至约250μg、约40μg至约250μg、约50μg至约250μg、约1μg至约200μg、约10μg至约200μg、约20μg至约200μg、约30μg至约200μg、约40μg至约200μg、约50μg至约200μg、约25μg至约50μg、约25μg至约100μg、约25μg至约150μg、约25μg至约200μg、约25μg至约250μg、约25μg至约300μg、约25μg至约350μg、约25μg至约400μg、约25μg至约450μg、约25μg至约500μg、约50μg至约750μg或约25μg至约1000μg的工程化多核糖核苷酸。在一些情况下，一定剂量的多核苷酸是约1mg至约100mg、约1mg至约50mg、约10mg至约50mg、约20mg至约50mg、约25mg至约50mg、约30mg至约50mg、约40mg至约50mg、约50mg至约100mg、约1mg至约25mg、约2mg至约25mg、约3mg至约25mg、约4mg至约25mg、约5mg至约25mg、约1mg至约20mg、约1mg至约20mg、约2mg至约20mg、约3mg至约20mg、约4mg至约20mg或约5mg至约20mg的工程化多核糖核苷酸。
制剂中(例如，在包封的药剂内)多聚核苷酸的百分比可以是大于或等于0.25重量％的多核糖核苷酸、0.5重量％的多核糖核苷酸、0.75重量％的多核糖核苷酸、1重量％的多核糖核苷酸、1.25重量％的多核糖核苷酸、1.5重量％的多核糖核苷酸、1.75重量％的多核糖核苷酸、2重量％的多核糖核苷酸、2.25重量％的多核糖核苷酸、2.5重量％的多核糖核苷酸、2.75重量％的多核糖核苷酸、3重量％的多核糖核苷酸、3.25重量％的多核糖核苷酸、3.5重量％的多核糖核苷酸、3.75重量％的多核糖核苷酸、4重量％的多核糖核苷酸、4.25重量％的多核糖核苷酸、4.5重量％的多核糖核苷酸、4.75重量％的多核糖核苷酸、5重量％的多核糖核苷酸、5.25重量％的多核糖核苷酸、5.5重量％的多核糖核苷酸、5.75重量％的多核糖核苷酸、6重量％的多核糖核苷酸、6.25重量％的多核糖核苷酸、6.5重量％的多核糖核苷酸、6.75重量％的多核糖核苷酸、7重量％的多核糖核苷酸、7.25重量％的多核糖核苷酸、7.5重量％的多核糖核苷酸、7.75重量％的多核糖核苷酸、8重量％的多核糖核苷酸、8.25重量％的多核糖核苷酸、8.5重量％的多核糖核苷酸、8.75重量％的多核糖核苷酸、9重量％的多核糖核苷酸、9.25重量％的多核糖核苷酸、9.5重量％的多核糖核苷酸、9.75重量％的多核糖核苷酸、10重量％的多核糖核苷酸、10.25重量％的多核糖核苷酸、10.5重量％的多核糖核苷酸、10.75重量％的多核糖核苷酸、11重量％的多核糖核苷酸、11.25重量％的多核糖核苷酸、11.5重量％的多核糖核苷酸、11.75重量％的多核糖核苷酸、12重量％的多核糖核苷酸、12.25重量％的多核糖核苷酸、12.5重量％的多核糖核苷酸、12.75重量％的多核糖核苷酸、13重量％的多核糖核苷酸、13.25重量％的多核糖核苷酸、13.5重量％的多核糖核苷酸、13.75重量％的多核糖核苷酸、14重量％的多核糖核苷酸、14.25重量％的多核糖核苷酸、14.5重量％的多核糖核苷酸、14.75重量％的多核糖核苷酸、15重量％的多核糖核苷酸、15.25重量％的多核糖核苷酸、15.5重量％的多核糖核苷酸、15.75重量％的多核糖核苷酸、16重量％的多核糖核苷酸、16.25重量％的多核糖核苷酸、16.5重量％的多核糖核苷酸、16.75重量％的多核糖核苷酸、17重量％的多核糖核苷酸、17.25重量％的多核糖核苷酸、17.5重量％的多核糖核苷酸、17.75重量％的多核糖核苷酸、18重量％的多核糖核苷酸、18.25重量％的多核糖核苷酸、18.5重量％的多核糖核苷酸、18.75重量％的多核糖核苷酸、19重量％的多核糖核苷酸、19.25重量％的多核糖核苷酸、19.5重量％的多核糖核苷酸、19.75重量％的多核糖核苷酸、20重量％的多核糖核苷酸、20.5重量％的多核糖核苷酸、21重量％的多核糖核苷酸、21.5重量％的多核糖核苷酸、22重量％的多核糖核苷酸、22.5重量％的多核糖核苷酸、23重量％的多核糖核苷酸、23.5重量％的多核糖核苷酸、24重量％的多核糖核苷酸、24.5重量％的多核糖核苷酸或25重量％的多核糖核苷酸。或者，制剂中(例如，在包封的药剂内)多核糖核苷酸的百分比可以将小于约25％的多核糖核苷酸、24.5％的多核糖核苷酸、24％的多核糖核苷酸、23.5％的多核糖核苷酸、23％的多核糖核苷酸、22.5％的多核糖核苷酸、22％的多核糖核苷酸、21.5％的多核糖核苷酸、21％的多核糖核苷酸、20.5％的多核糖核苷酸、20％的多核糖核苷酸、19.5％的多核糖核苷酸、19％的多核糖核苷酸、18.5％的多核糖核苷酸、18％的多核糖核苷酸、17.5％的多核糖核苷酸、17％的多核糖核苷酸、16.5％的多核糖核苷酸、16％的多核糖核苷酸、15.5％的多核糖核苷酸、15％的多核糖核苷酸、14.5％的多核糖核苷酸、14％的多核糖核苷酸、13.5％的多核糖核苷酸、13％的多核糖核苷酸、12.5％的多核糖核苷酸、12％的多核糖核苷酸、11.5％的多核糖核苷酸、11％的多核糖核苷酸、10.5％的多核糖核苷酸、10％的多核糖核苷酸、9.5％的多核糖核苷酸、9％的多核糖核苷酸、8.5％的多核糖核苷酸、8％的多核糖核苷酸、7.5％的多核糖核苷酸、7％的多核糖核苷酸、6.5％的多核糖核苷酸、6％的多核糖核苷酸、5.5％的多核糖核苷酸、5％的多核糖核苷酸、4.5％的多核糖核苷酸、4％的多核糖核苷酸、3.5％的多核糖核苷酸、3、％的多核糖核苷酸2.5％的多核糖核苷酸、2％的多核糖核苷酸、1.5％的多核糖核苷酸、1％的多核糖核苷酸、0.5％的多核糖核苷酸或0.1％的多核糖核苷酸。
在一些情况下，本发明的包封的组合物可在使用该装置约1秒至约30分钟内、约1秒至20分钟内、约1秒至10分钟内、约1秒至5分钟内、约1秒至2分钟内、约1秒至1分钟内、约1秒至约30秒内、约30秒至30分钟内、约30秒至20分钟内、约30秒至10分钟内、约30秒至5分钟内、约30秒至2分钟内、约30秒至约1分钟内、约1分钟至约30分钟内、约1分钟至约25分钟内、约1分钟至约20分钟内、约1分钟至约15分钟内、约1分钟至约10分钟内、约5分钟至约30分钟内、约5分钟至约25分钟内、约5分钟至约20分钟内、约5分钟至约15分钟内、约5分钟至约10分钟内、约10分钟至约30分钟内、约10分钟至约25分钟内、约10分钟至约20分钟内或约10分钟至约15分钟内在受试者中产生多核糖核苷酸、药物载体、包封剂或聚合物材料(例如：聚乙二醇或聚乙烯亚胺)的血浆浓度、血清浓度或血液浓度。该多核糖核苷酸、药物载体、包封剂或聚合物材料(例如：聚乙二醇或聚乙烯亚胺)的血浆浓度、血清浓度或血液浓度可以是峰值浓度或平均浓度。
本发明提供了包括但不限于以下实施方式：
1.一种用于治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用包含编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的核酸构建体的组合物，该核酸构建体包含在受试者的细胞内提供动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的异源或增强表达的密码子，从而治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者。
2.根据实施方式1所述的方法，其中所述核酸构建体是互补的脱氧核糖核酸构建体。
3.根据实施方式1所述的方法，其中所述核酸构建体以一定的水平编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体，所述水平与暴露于包含不含有编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的密码子的核酸构建体的组合物的细胞内水平相比增加至少约1.5倍。
4.根据实施方式3所述的方法，其中所述倍数为至少约5。
5.根据实施方式1所述的方法，其中所述构建体的密码子与哺乳动物动力蛋白轴丝中间链1mRNA至少70％同源。
6.根据实施方式5所述的方法，其中所述构建体的密码子与人动力蛋白轴丝中间链1mRNA至少70％同源。
7.根据实施方式1所述的方法，其中所述构建体包含处于编码动力蛋白轴丝中间链1的密码子序列侧翼的3′或5′非编码区，其中所述非编码区增强所述蛋白质在受试者的细胞内的表达。
8.根据实施方式7所述的方法，其中所述构建体包含处于编码动力蛋白轴丝中间链1的密码子序列侧翼的3′非编码区，其中所述3′非编码区包含3′-帽独立的翻译增强子(3′-CITE)。
9.根据实施方式7所述的方法，其进一步包含在所述密码子序列与所述3′非编码区或所述5′非编码区之间的至少一个中间序列区。
10.根据实施方式7所述的方法，其中所述密码子序列包含开放阅读框(ORF)序列。
11.根据实施方式7所述的方法，其中所述构建体包含处于编码动力蛋白轴丝中间链1的密码子序列侧翼的3′非编码区，其中所述3′非编码区包含源自组蛋白的核苷酸序列的3′-茎环区。
12.根据实施方式7所述的方法，其中处于所述密码子序列侧翼的3′非编码区包含聚腺苷尾，其中所述聚腺苷尾中的腺苷数目改善了动力蛋白轴丝中间链1蛋白的翻译效率。
13.根据实施方式7所述的方法，其中处于所述密码子序列侧翼的3′非编码区包含聚腺苷尾，其中所述聚腺苷尾中的腺苷数目延长了动力蛋白轴丝中间链1mRNA的半衰期。
14.根据实施方式12或13所述的方法，其中所述密码子序列包含开放阅读框(ORF)序列。
15.根据实施方式12、13或14所述的方法，其中所述聚腺苷尾的长度为至多200个腺苷。
16.根据实施方式12、13或14所述的方法，其中一定百分比的所述聚腺苷尾包含核苷酸类似物。
17.根据实施方式12、13或14所述的方法，其中所述聚腺苷尾中少于20％的核苷酸是核苷酸类似物。
18.根据实施方式1所述的方法，其中所述构建体包含非规范核苷酸类似物。
19.根据实施方式18所述的方法，其中少于30％的所述编码动力蛋白轴丝中间链1的核苷酸是核苷酸类似物。
20.根据实施方式18所述的方法，其中所述核苷酸类似物选自假尿苷、1-甲基假尿苷和5-甲氧基尿苷。
21.根据实施方式18所述的方法，其中所述核苷酸类似物是假尿苷。
22.根据实施方式18所述的方法，其中所述核苷酸类似物是1-甲基假尿苷。
23.根据实施方式18所述的方法，其中所述核苷酸类似物是5-甲氧基尿苷。
24.根据实施方式18所述的方法，其中所述核苷酸类似物是假尿苷和1-甲基假尿苷。
25.根据实施方式1所述的方法，其中所述组合物进一步包含至少一种另外的编码选自下组的蛋白质的核酸构建体：含犰狳重复序列蛋白4(ARMC4)、21号染色体开放阅读框59(C21orf59)、含卷曲螺旋域蛋白103(CCDC103)、含卷曲螺旋域蛋白114(CCDC114)、含卷曲螺旋域蛋白39(CCDC39)、含卷曲螺旋域蛋白40(CCDC40)、含卷曲螺旋域蛋白65(CCDC65)、细胞周期蛋白O(CCNO)、动力蛋白(轴丝)装配因子1(DNAAF1)、动力蛋白(轴丝)装配因子2(DNAAF2)、动力蛋白(轴丝)装配因子3(DNAAF3)、动力蛋白(轴丝)装配因子5(DNAAF5)、动力蛋白轴丝重链11(DNAH11)、动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)、动力蛋白轴丝重链6(DNAH6)、动力蛋白轴丝重链8(DNAH8)、动力蛋白轴丝中间链2(DNAI2)、动力蛋白轴丝轻链1(DNAL1)、动力蛋白调节复合物亚单位1(DRC1)、阅读障碍易感性1候选物1(DYX1C1)、生长停滞特异性8(GAS8)、轴丝中心对装置蛋白(HYDIN)、含富含亮氨酸重复序列蛋白6(LRRC6)、NME/NM23家族成员8(NME8)、口-面-指综合征1(OFD1)、色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)、径向辐头1同源物(衣藻属)(RSPH1)、径向辐头4同源物A(衣藻属)(RSPH4A)、径向辐头9同源物(衣藻属)(RSPH9)、精子相关抗原1(SPAG1)和含锌指MYND型10(ZMYND10)。
26.根据实施方式1所述的方法，其中所述组合物包含的阳离子聚合物的胺基团的摩尔数与经修饰的多核糖核苷酸的磷酸基团的摩尔数之比为至少约4。
27.根据实施方式1所述的方法，其中所述组合物被配制于纳米颗粒或纳米胶囊中。
28.根据实施方式1所述的方法，其中所述组合物被配制于阳离子脂质、阳离子聚合物或纳米乳剂中。
29.一种组合物，其包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码动力蛋白轴丝中间链1的互补脱氧核糖核酸，该组合物被配制用于向受试者施用。
30.一种组合物，其包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体，所述核酸构建体包含在患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的细胞内提供所述动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的异源或增强表达的密码子。
31.一种组合物，其包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体，其中少于30％的编码动力蛋白轴丝中间链1的核苷酸是核苷酸类似物。
32.根据实施方式29、30或31所述的组合物，其中所述构建体的密码子与哺乳动物人动力蛋白轴丝中间链1蛋白至少70％同源。
33.根据实施方式32所述的组合物，其中所述构建体的密码子与人动力蛋白轴丝中间链1蛋白至少70％同源。
34.根据实施方式29、30或31所述的组合物，其中所述构建体包含处于编码动力蛋白轴丝中间链1的密码子序列侧翼的3′或5′非编码区，其中所述非编码区增强所述蛋白质在所述受试者的细胞内的表达。
35.根据实施方式29、30或31所述的组合物，其中所述构建体包含处于编码动力蛋白轴丝中间链1的密码子序列侧翼的3′非编码区，其中所述3′非编码区包含3′-帽独立的翻译增强子(3′-CITE)。
36.根据实施方式29、30或31所述的组合物，其中所述构建体包含处于编码动力蛋白轴丝中间链1的密码子序列侧翼的3′非编码区，其中所述3′非编码区包含源自组蛋白的核苷酸序列的3′-茎环区。
37.根据实施方式29、30或31所述的组合物，其中处于所述密码子序列侧翼的3′非编码区包含聚腺苷尾，其中所述聚腺苷尾中的腺苷数目改善了动力蛋白轴丝中间链1蛋白的翻译效率。
38.根据实施方式29、30或31所述的组合物，其中处于所述密码子序列侧翼的3′非编码区包含聚腺苷尾，其中所述聚腺苷尾中的腺苷数目改善了动力蛋白轴丝中间链1mRNA的半衰期。
39.根据实施方式29、30或31所述的组合物，其中所述聚腺苷尾的长度为至多200个腺苷。
40.根据实施方式29、30或31所述的组合物，其中一定百分比的所述聚腺苷尾包含核苷酸类似物。
41.根据实施方式29、30或31所述的组合物，其中所述聚腺苷尾中少于20％的核酸是核苷酸类似物。
42.根据实施方式29或30所述的组合物，其中所述构建体包含一定百分比的核苷酸类似物。
43.根据实施方式42所述的组合物，其中少于30％的所述编码动力蛋白轴丝中间链1的核苷酸是核苷酸类似物。
44.根据实施方式42所述的组合物，其中少于20％的所述编码动力蛋白轴丝中间链1的核苷酸是核苷酸类似物。
45.根据实施方式31或42所述的组合物，其中所述核苷酸类似物是假尿苷。
46.根据实施方式31或42所述的组合物，其中所述核苷酸类似物是1-甲基假尿苷。
47.根据实施方式31或42所述的组合物，其中所述核苷酸类似物是5-甲氧基尿苷。
48.根据实施方式31或42所述的组合物，其中所述核苷酸类似物是假尿苷和1-甲基假尿苷。
49.根据实施方式29、30或31所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种另外的核酸构建体。
50.根据实施方式49所述的组合物，其中所述至少一种另外的核酸构建体编码选自下组的蛋白质：含犰狳重复序列蛋白4(ARMC4)、21号染色体开放阅读框59(C21orf59)、含卷曲螺旋域蛋白103(CCDC103)、含卷曲螺旋域蛋白114(CCDC114)、含卷曲螺旋域蛋白39(CCDC39)、含卷曲螺旋域蛋白40(CCDC40)、含卷曲螺旋域蛋白65(CCDC65)、细胞周期蛋白O(CCNO)、动力蛋白(轴丝)装配因子1(DNAAF1)、动力蛋白(轴丝)装配因子2(DNAAF2)、动力蛋白(轴丝)装配因子3(DNAAF3)、动力蛋白(轴丝)装配因子5(DNAAF5)、动力蛋白轴丝重链11(DNAH11)、动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)、动力蛋白轴丝重链6(DNAH6)、动力蛋白轴丝重链8(DNAH8)、动力蛋白轴丝中间链2(DNAI2)、动力蛋白轴丝轻链1(DNAL1)、动力蛋白调节复合物亚单位1(DRC1)、阅读障碍易感性1候选物1(DYX1C1)、生长停滞特异性8(GAS8)、轴丝中心对装置蛋白(HYDIN)、含富含亮氨酸重复序列蛋白6(LRRC6)、NME/NM23家族成员8(NME8)、口-面-指综合征1(OFD1)、色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)、径向辐头1同源物(衣藻属)(RSPH1)、径向辐头4同源物A(衣藻属)(RSPH4A)、径向辐头9同源物(衣藻属)(RSPH9)、精子相关抗原1(SPAG1)和含锌指MYND型10(ZMYND10)。
51.根据实施方式30或31所述的组合物，其中所述核酸构建体进一步被配制用于向受试者施用。
52.根据实施方式51所述的组合物，其中所述制剂包含治疗有效量的编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体。
53.根据实施方式29、30或31所述的组合物，其中所述核酸构建体包含编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的cDNA。
54.一种载体，其包含根据实施方式29、30或31所述的核酸构建体。
55.一种分离的核酸，其包含根据实施方式29、30或31所述的核酸构建体。
56.一种用于在受试者中产生外源编码的蛋白质的方法，该方法包括在受试者的细胞内，向所述受试者施用包含编码选自下组的蛋白质的核酸构建体的组合物：含犰狳重复序列蛋白4(ARMC4)、21号染色体开放阅读框59(C21orf59)、含卷曲螺旋域蛋白103(CCDC103)、含卷曲螺旋域蛋白114(CCDC114)、含卷曲螺旋域蛋白39(CCDC39)、含卷曲螺旋域蛋白40(CCDC40)、含卷曲螺旋域蛋白65(CCDC65)、动力蛋白(轴丝)装配因子1(DNAAF1)、动力蛋白(轴丝)装配因子2(DNAAF2)、动力蛋白(轴丝)装配因子3(DNAAF3)、动力蛋白(轴丝)装配因子5(DNAAF5)、动力蛋白轴丝重链11(DNAH11)、动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)、动力蛋白轴丝重链8(DNAH8)、动力蛋白轴丝中间链2(DNAI2)、动力蛋白轴丝轻链1(DNAL1)、动力蛋白调节复合物亚单位1(DRC1)、阅读障碍易感性1候选物1(DYX1C1)、轴丝中心对装置蛋白(HYDIN)、含富含亮氨酸重复序列蛋白6(LRRC6)、NME/NM23家族成员8(NME8)、口-面-指综合征1(OFD1)、色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)、径向辐头1同源物(衣藻属)(RSPH1)、径向辐头4同源物A(衣藻属)(RSPH4A)、径向辐头9同源物(衣藻属)(RSPH9)、精子相关抗原1(SPAG1)和含锌指MYND型10(ZMYND10)，其中所述核酸构建体的密码子针对所述蛋白质在所述受试者的细胞内的表达进行优化，并且其中在翻译后，所述构建体产生治疗所述受试者的多肽。
57.一种组合物，其包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含SEQ ID NO 14-16中的任一个。
实施例
实施例1：DNAI1 RNA包含的产生
该实验证明了DNAI1互补的脱氧核糖核酸构建体的产生。
方法：在GenScript合成DNAI1。用HindIII和EcoRI HF限制酶消化pUC57/DNAI1。此外，对消化的pVAX120载体和DNAI1 cDNA进行凝胶纯化并连接(DNAI1的ORF经密码子优化)。利用未经修饰的核苷酸使用标准的体外翻译程序来产生RNA。使用痘苗病毒加帽系统和帽2′-O-甲基转移酶进行加帽反应。图1是琼脂糖凝胶，其示出了加帽和未加帽的DNAI1 RNA的产生。注意，在该实验中，DNAI1 cDNA连接至pVAX120中，得到包含聚(A)尾的构建体。
实施例2：DNAI核糖核酸在哺乳动物细胞中的表达
该实验证明了DNAI1在HEK-293细胞中的表达(翻译)。图2是Western印迹，其示出了转染后6小时、24小时和48小时，DNAK1 mRNA在293细胞中的翻译。对于该实验，使用3.75μl信使最大转染试剂，用2.5μg DNAI1 RNA转染6孔板中的5x105个293细胞/孔。转染后6、24和48小时，将细胞从孔中刮下、沉淀，并将沉淀物在RIPA缓冲液中裂解。用来自Abcam的抗DNAI1 ab166912来探测印迹。转染C末端FLAG标记的DNAI1质粒DNA作为对照，并且该质粒与mRNA之间的分子量差异可能归因于pENTRY载体中的FLAG标签。
实施例3：用于治疗患有原发性纤毛运动障碍的人类受试者的包含工程化多核糖 核苷酸的组合物的制剂。
如下配制组合物：
编码DNAI1基因序列、NCBI参考序列的核酸构建体：NM_012144，如实施例1所述制备。支链的聚乙烯亚胺购自Sigma AldrichTM。Linear in vivo-(聚乙烯亚胺)购自Polyplus/>(Illkirch,France)，并且无需进一步纯化即可使用。遵循制造商的方案，使用制造商提供的无菌10％葡萄糖溶液和购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)的HPLC级水，将jetPEI在5％葡萄糖(最终浓度)中稀释。在5％葡萄糖(终浓度)中稀释核酸构建体后，RNA和jetPEI溶液以1:1的比例组合/混合，最终N/P比为8。然后通过鼻内滴注来施用mRNA。或者，该核酸构建体也可被配制为通过雾化或嗅闻脂质复合物制剂来施用。
实施例4：转录后聚腺苷酸化反应时间对RNA质量的影响
检测了转录后聚腺苷酸化反应时间对RNA质量的影响。体外转录(IVT)后聚腺苷酸化反应时间通常为60-90分钟，并且通常提供至多约200As的聚A长度。因为mRNA易于水解，所以其经常在转录后的聚腺苷酸化反应期间随时间而降解。为了保持DNAI1聚A尾的最佳长度并使RNA质量最大化，构建了编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的核酸构建体(聚A尾已包含在模板中)。
用来产生DNAI1 mRNA的、编码具有和不具有聚-A序列的DNAI1基因序列的核酸构建体的概述在以下示出：
图3示出了片段分析仪数据，以确定从DNAI1-pCMV6Entry质粒产生的DNAI1 mRNA的长度，该DNAI1 mRNA在转录后聚腺苷酸化，反应时间为0-60分钟。这表明更长的聚腺苷酸化反应时间导致增加的转录物长度。图4示出了片段分析仪数据，以检测这些DNAI1mRNA的质量，该DNAI1 mRNA在转录后聚腺苷酸化，反应时间为0-60分钟。这些结果表明，随着聚腺苷酸化反应的进行，RNA经历降解，如通过更长的反应时间导致峰值％减少和峰值前弥散％增加所证明的。图5示出了通过8％ PAGE所确定的，DNAI1-pVAX质粒模板中聚-A序列的长度。
实施例5：体外RNA产生和质量控制
进行以下实验，以比较以不同比率掺入特定的经化学修饰的核苷酸对不同细胞类型中的翻译效率和免疫原性的影响。
实验包括：1)核酸构建体的体外转录；2)核酸构建体的体外加帽；3)分析转录RNA的完整性；4)dsRNA的免疫斑点印迹分析；和5)分析转录RNA的核苷酸组成。遵循用于RNA的体外转录(IVT)和加帽的通用方案，并进行一些修改。用于编码DNAI1基因的核酸构建体的IVT反应在37℃下、在20mM MgCl2和7.5mM的每种核糖核苷酸的存在下进行6小时。
表5示出了在体外从编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体转录的各种特定的经化学修饰的核苷酸。
结果：
紫外线测量
模板聚(A)长度-片段分析仪
对用作体外转录模板的DNAI1核酸构建体(SEQ ID NO:5)的聚(A)尾长度的分析表明，与原始克隆载体(pVAX-A120)相比，A残基的数目得以维持。该初始载体含有120个腺苷核苷酸，而在该核酸构建体上检测到100至150bp之间的条带(图5)。用Eco RI和Not I来消化模板以去除聚(A)片段：预期12个非聚(A)核苷酸是该片段的一部分。G*AATTCtgcag-聚(A)–GC*GGCCGC＝12nt加上EcoRI/NotI产生的片段中的聚(A)。
RNA弥散分析-片段分析仪
针对为DNAI1产生的所有转录物，检测到约2,000nt的峰。在片段分析仪上对体外产生的转录物进行的评价表明，加帽的转录物保持良好的完整性：在重复实验中观察到弥散含量(RNA降解和/或水解的指标)的有限检测。简言之，在片段分析仪(DNF-471标准灵敏度RNA分析试剂盒(15nt Lower Marker))上分析2μL的200ng/μL样品。使用PROSize 2.0软件进行数据分析。大小测量准确度约为±5％内；大小测量精确度约为5％ CV内，量化准确度约为±20％内；并且量化精确度约为10％ CV内。图6示出了仅包含规范核苷酸即腺苷5′-三磷酸、鸟苷5′-三磷酸、胞苷5′-三磷酸和尿苷5′-三磷酸的体外反应的片段分析仪数据。图7示出了包含假尿苷和尿苷5′-三磷酸的50％/50％混合物的体外反应的片段分析仪数据。图8示出了包含100％假尿苷5′-三磷酸的体外反应的片段分析仪数据。图9示出了包含100％1-甲基-假尿苷5′-三磷酸的体外反应的片段分析仪数据。表7总结了RNA弥散分析的结果。
通过斑点印迹法检测的双链RNA含量显示出其与J2抗体的反应性。图10示出了通过斑点印迹分析法检测的来自编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的体外转录RNA的双链RNA含量，以及用表5所示的各种特定修饰所转录的DNAI1构建体的双链RNA含量。
核苷组成分析
表8-10示出了来自编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的体外转录RNA的核苷酸组成分析。表5示出了各种特定的核苷酸修饰。图11-13示出了在转录物经核酸酶消化并且随后进行去磷酸化后所获得的各个核糖核苷酸的相应HPLC色谱图。
表8示出了用未经修饰的核苷酸转录的，来自编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的体外转录RNA的核苷酸组成分析。图11示出了相应的HPLC色谱图。
表9示出了用50％假尿苷转录的，来自编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的体外转录RNA的核苷酸组成分析。图12示出了相应的HPLC色谱图。使用相同的反相HPLC条件，疏水性1-甲基-假尿苷的保留时间平均为约9.5分钟，并与所研究的所有其他核糖核苷酸完全分离(数据未显示)。
*使用经验吸收系数比ε262/ε260＝1.001(Ψ)所估计的浓度
表10示出了用100％假尿苷转录的，来自编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体的体外转录RNA的核苷酸组成分析。图13示出了相应的HPLC色谱图。
*使用经验吸收系数比ε262/ε260＝1.001(Ψ)所估计的浓度
实施例6：翻译效率
在三种细胞系中评估上述DNAI1转录物的翻译效率：1)HEK-293人胚肾细胞；2)A549腺癌人肺泡基底上皮细胞；3)MLE-15鼠肺上皮细胞。用每种DNAI1转录物一式三份转染每种细胞系，并用Western印迹法来分析所得细胞提取物的DNAI1蛋白表达。简言之，在转染前18小时在6孔板中每孔接种1x106个(HEK-293、MLE-15)或2x106个(A549)细胞。使用MessengerMax转染试剂以1:37.5的RNA:MessengerMax比，用约100ng的每种RNA来转染细胞。在转染后6小时收获细胞，并在RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8，150mM NaCl，1％Triton X-100，0.1％ SDS，0.5％牛磺胆酸钠)中制备全细胞提取物。在含有2.5％β-巯基乙醇的1x LDS样品缓冲液中制备来自每种提取物的3.5μg总蛋白质，并将其加载至4-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶上。然后将凝胶在30V恒定电压下运行30分钟，然后在150V下运行1小时。将蛋白质在含有10％甲醇的1x NuPAGE转移缓冲液中在25V下转移至PVDF膜持续1小时。转移后，使用抗DNAI1抗体，通过Western印迹法来检测DNAI1蛋白，并使用碱性磷酸酶化学发光底物进行显色。通过使用Sypro Ruby总蛋白质染色作为上样对照，对Western印迹值进行归一化，并将其表示为相对于未经修饰的RNA的相对表达。每个数据点是三个生物(转染)重复的平均值±标准偏差。
图14、图15和图16分别示出了DNAI1蛋白在HEK-293、A549和MLE-15细胞中的表达。DNAI1被表达为699个氨基酸，79.3kDa的蛋白质。含有假尿苷(Ψ)的转录物在所有三种细胞类型中均表达良好，表达水平等于或高于未经修饰的RNA。类似地，含有1-甲基假尿苷(m1Ψ)的转录物在A549和MLE15细胞中产生等于或高于未经修饰的RNA的表达水平(未检测该转录物在HEK-293细胞中的表达)。重要的是，每种转录物的表达水平及其相对排序在每种细胞系中是相似的，从而表明没有对DNAI1翻译的细胞类型特异的影响。图17是示出了HEK-293、A549和MLE-15细胞中DNAI1蛋白的相对表达的图。通过使用总蛋白质染色，对Western印迹信号值进行归一化，并将其绘制为相对于未经修饰的DNAI1 mRNA的平均表达±标准偏差。
表11是上述每种细胞系中DNAI1蛋白的相对表达的总结。
实施例7：编码人DNAI1的核酸构建体的体外免疫原性
通过测定细胞因子的产生，在两种细胞系即A549腺癌人肺泡基底上皮细胞和HepG2人肝癌细胞中检测上述转录物的免疫原性。在A549细胞中测定响应于转录物的IL-6的产生，而在HepG2细胞中测定IP-10的产生。用滴定的每种RNA一式三份转染每种细胞系。简言之，在转染前24小时，在96孔板中每孔接种20,000个(A549)或40,000个(HepG2)细胞。然后使用MessengerMax试剂以1:1.5的RNA:MessengerMax比，用滴定的每种转录物来转染细胞：对于未经修饰的50％Ψ和100％Ψ转录物，每孔250ng至7ng；对于100％m1ΨmRNA，每孔1000ng至32ng。
转染后18小时收获培养上清液。取出上清液后立即使用CellTiter-Glo测定试剂盒(Promega)测定细胞活力，该试剂盒测定ATP水平作为代谢活性细胞的指示。针对IL-6检测，将A549细胞培养上清液在测定缓冲液中1:20稀释，并使用IL-6高灵敏度人ELISA试剂盒(Abcam ab46042)来测定IL-6水平。使用人IP-10ELISA试剂盒SimpleStep(Abcamab173194)在未稀释的HepG2细胞培养上清液中检测IP-10。
图18和19示出了用DNAI1转录物处理的A549细胞中IL-6的诱导。对于图18所示的测定，将细胞暴露于RNA-MessengerMax复合物18小时，而对于图19所示的测定，在转染后2小时去除RNA-MessengerMax复合物。在这两种情况下，在18小时时收获细胞培养上清液，用于通过ELISA来检测IL-6。图20和图21示出了使用CellTiter-Glo测定法测定的图18和19中所示测定的细胞活力。图22示出了DNAI1转录物对HepG2细胞中IP-10的诱导。对于该测定，将细胞暴露于RNA-MessengerMax复合物18小时。然后通过ELISA测定由各种量的每种DNAI1mRNA所诱导的IP-10表达。图23示出了使用CellTiter-Glo测定法测定的图22中所示测定的细胞活力。
实施例8：HEK293细胞中DNAI1 mRNA的翻译
图24示出了在HEK293细胞中编码动力蛋白轴丝中间链1(DNAI1)的核酸或核酸对照的峰值表达。如图24所示，在HEK293细胞中，DNAI1核酸构建体在HEK293细胞中的翻译在6小时时达到峰值，但在48小时时仍然存在。
实施例9：在施用脂质复合物配制的含100％m1Ψ的DNAI1 mRNA后，DNAI1蛋白在未 分化的和完全分化的人气道上皮细胞(HAEC)以及小鼠气管上皮细胞(MTEC)中的表达。
通过Western印迹法来评估用脂质复合物配制的DNAI1-HA mRNA处理后DNAI1蛋白在原代人气道上皮细胞和小鼠气管上皮细胞中的表达。用于该实验的含100％m1Ψ的转录物由含有HA表位标签的DNAI1替代密码子使用模板(SEQ ID NO 15)产生。将原代人上皮细胞保持在浸没液体培养物(对于未分化的培养物)中或保持在气-液界面处，并使其分化约3周而成为完全分化的有纤毛上皮细胞。接下来，将12μg或24μg脂质复合物配制的DNAI1-HAmRNA施加至完全分化的培养物的顶侧或者直接施加至未分化的液体培养物。将细胞处理一次或者连续两天每天处理一次。然后在最终处理后24或48小时收获细胞，并在RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8，150mM NaCl，1％ Triton X-100，0.1％SDS，0.5％牛磺胆酸钠)中制备全细胞提取物。在4％-12％ Bis-Tris SDS-PAGE凝胶上分离来自每种提取物的总蛋白质，并将其转移到PVDF膜上。使用抗HA抗体，通过Western印迹法来检测DNAI1-HA蛋白，并使用增强的化学发光底物进行显色。如图25所示，DNAI1-HA蛋白在未分化和完全分化的有纤毛人气道上皮细胞中以及在小鼠气管上皮细胞中均以高水平表达。
实施例10：编码区中改变的核苷酸使用增加转录物疗法的mRNA稳定性。
旨在减少经修饰的mRNA的密码子内以及密码子中更具反应性的二核苷酸的数目的改变的核苷酸使用方案，部分地减轻了由RNA固有的化学不稳定性所施加的限制。同时，降低RNA转录物中的U含量使其免疫原性更低。可以在(+)反应性二核苷酸去除和(+)U-减少之前进行传统密码子优化(CO)，通常产生被称为CO++的ORF。
图26示出了与SEQ ID NO 14的多核糖核苷酸(A)相比，表达SEQ ID NO 15的多核糖核苷酸(B)的DNAI1的总体质量改善。根据用改变的密码子使用策略而工程化的多核糖核苷酸中片段分析仪迹线的主RNA峰值％的增加来判断总体质量的改善。此外，与传统优化(CO)的转录物相比，以CO++优化的开放阅读框(即改变的密码子使用)为特征的DNAI1 mRNA显示出在转染的A549细胞中翻译效率的改善(参见图27)。在此，在转染前18小时，在6孔板中每孔接种1.25x106个细胞。使用MessengerMax转染试剂以1:12的RNA:MessengerMax比，用约100ng的每种RNA来转染细胞，并在转染后6小时收获细胞。使用抗DNAI1抗体的Western印迹分析显示DNAI1蛋白表达为699个氨基酸，79.3kDa蛋白质。相对翻译效率表示为三个生物(转染)重复的平均值。
如图28所示，观察到与感测双链RNA含量的J2抗体的反应性发生改变。基于与已知浓度的聚-IC的比较，当将200ng体外转录的mRNA进行点样时，以CO++ORF为特征的DNAI1编码mRNA的dsRNA含量平均为39ng，而具有CO ORF的RNA经估计含有68ng dsRNA污染物。
实施例11：未经修饰的和含100％ m1Ψ的DNAI1 mRNA的HPLC纯化。
采用DNAI1 mRNA的反相高效液相色谱法(HPLC)来纯化全长RNA，并去除污染物，如使用T7 RNA聚合酶在体外转录期间产生的长dsRNA。图29中示出了使用无孔RNASep C18semi prep(100mm x 21.2mm，柱体积(CV)约2.4mL)柱以及含有三乙基乙酸铵(TEAA)作为离子配对剂并具有逐渐增加的乙腈含量的流动相所得到的分级分离和纯化结果。通过片段分析仪对纯化的级分的评价所判断的，观察到使用半制备(semi-prep)RNASep柱的总体质量的改善和全长RNA的富集。未经修饰的(A、B)和含100％m1Ψ的DNAI1 mRNA种类(C、D)均实现了这种质量改善。
如图30所示，对于A549细胞中富含全长、未经修饰的mRNA转录物的级分，观察到翻译活性的适度改善(A和B)。在此，在转染前18小时，在6孔板中每孔接种1x106个A549细胞。使用MessengerMax转染试剂以1:12的RNA:MessengerMax比，用约100ng的每种RNA来转染细胞，并在转染后6小时收获细胞。使用1:2000兔抗DNAI1(AbCam ab166912，针对重组DNAI1片段的兔单克隆抗-DNAI1)抗体的Western印迹分析显示，DNAI1蛋白表达为699个氨基酸，79.3kDa蛋白质(C)。相对翻译效率表示为三个生物(转染)重复的平均值±标准偏差。
重要的是，HPLC很容易在半制备规模上去除晚洗脱的斑点印迹活性物质。仅在晚洗脱的级分F7和未纯化的对照转录物内观察到与J2抗体反应的可检测的双链RNA含量，而在所有其他HPLC纯化的DNAI1mRNA级分F1至F6(D)中未检测到。通过监测响应于转染的mRNA的IL-6产生，在A549细胞中进一步检测未经修饰的、HPLC纯化的转录物的免疫原性。用滴定的每种RNA一式三份转染每种细胞系。简言之，在转染前18小时，在96孔板中每孔接种20,000个细胞。然后使用MessengerMax试剂以1:1.5的RNA:MessengerMax比，用滴定的每种转录物(每孔250ng至7ng)来转染细胞。针对产生最高相对DNAI1蛋白水平的HPLC纯化的级分F3，观察到IL-6响应的降低(对于用125ng RNA转染的细胞，未纯化的参照DNAI1 mRNA：(727+/-109pg/mL)>F3(73+/-30pg/mL))(E)。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员而言明显的是，这些实施方案仅以举例的方式提供。并非旨在通过说明书中提供的具体实例来限制本发明。尽管已经参照前述说明书对本发明进行了描述，但对本文实施方案的描述和说明不应以限制性的意义来理解。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到多种变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面并不限于本文阐述的具体描绘、配置或相对比例，其取决于多种条件和变量。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。因此可以预计，本发明还应当涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同项。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。

Claims (10)

1.一种用于治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用包含编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的核酸构建体的组合物，该核酸构建体包含在受试者的细胞内提供动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的异源或增强表达的密码子，从而治疗患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸构建体是互补的脱氧核糖核酸构建体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸构建体以一定的水平编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体，所述水平与暴露于包含不含有编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的密码子的核酸构建体的组合物的细胞内水平相比增加至少约1.5倍。
4.一种组合物，其包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码动力蛋白轴丝中间链1的互补脱氧核糖核酸，该组合物被配制用于向受试者施用。
5.一种组合物，其包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体，所述核酸构建体包含在患有原发性纤毛运动障碍或处于患原发性纤毛运动障碍危险中的受试者的细胞内提供所述动力蛋白轴丝中间链1蛋白或其变体的异源或增强表达的密码子。
6.一种组合物，其包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体，其中少于30％的编码动力蛋白轴丝中间链1的核苷酸是核苷酸类似物。
7.一种载体，其包含根据权利要求4、5或6所述的核酸构建体。
8.一种分离的核酸，其包含根据权利要求4、5或6所述的核酸构建体。
9.一种用于在受试者中产生外源编码的蛋白质的方法，该方法包括在受试者的细胞内，向所述受试者施用包含编码选自下组的蛋白质的核酸构建体的组合物：含犰狳重复序列蛋白4(ARMC4)、21号染色体开放阅读框59(C21orf59)、含卷曲螺旋域蛋白103(CCDC103)、含卷曲螺旋域蛋白114(CCDC114)、含卷曲螺旋域蛋白39(CCDC39)、含卷曲螺旋域蛋白40(CCDC40)、含卷曲螺旋域蛋白65(CCDC65)、动力蛋白(轴丝)装配因子1(DNAAF1)、动力蛋白(轴丝)装配因子2(DNAAF2)、动力蛋白(轴丝)装配因子3(DNAAF3)、动力蛋白(轴丝)装配因子5(DNAAF5)、动力蛋白轴丝重链11(DNAH11)、动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)、动力蛋白轴丝重链8(DNAH8)、动力蛋白轴丝中间链2(DNAI2)、动力蛋白轴丝轻链1(DNAL1)、动力蛋白调节复合物亚单位1(DRC1)、阅读障碍易感性1候选物1(DYX1C1)、轴丝中心对装置蛋白(HYDIN)、含富含亮氨酸重复序列蛋白6(LRRC6)、NME/NM23家族成员8(NME8)、口-面-指综合征1(OFD1)、色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)、径向辐头1同源物(衣藻属)(RSPH1)、径向辐头4同源物A(衣藻属)(RSPH4A)、径向辐头9同源物(衣藻属)(RSPH9)、精子相关抗原1(SPAG1)和含锌指MYND型10(ZMYND10)，其中所述核酸构建体的密码子针对所述蛋白质在所述受试者的细胞内的表达进行优化，并且其中在翻译后，所述构建体产生治疗所述受试者的多肽。
10.一种组合物，其包含编码动力蛋白轴丝中间链1的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含SEQ ID NO 14-16中的任一个。
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