CN109651811A - 磁性sf/pei纳米颗粒及其用途 - Google Patents

磁性sf/pei纳米颗粒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及磁性SF/PEI纳米颗粒及其用途。该磁性SF/PEI纳米颗粒包括：磁性核心，所述磁性核心由纳米磁性材料构成；以及壳体，所述壳体形成在所述磁性核心外表面，所述壳体由蚕丝蛋白和聚乙烯亚胺构成，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺通过静电作用相结合。与现有技术中常用的转染材料PEI相比，该磁性SF/PEI纳米颗粒可以大幅度降低对待转染细胞的细胞毒性，同时，在磁场作用下能够快速高效地集中在细胞表面从而实现高效靶向磁转染的目的，转染效率大大提高。

Description

磁性SF/PEI纳米颗粒及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及磁性SF/PEI纳米颗粒及其用途，更具体地，本发明涉及磁性SF/PEI纳米颗粒、制备磁性SF/PEI纳米颗粒的方法、细胞转染的方法以及磁性SF/PEI纳米颗粒在靶向磁转染中的用途。
背景技术
在转染应用中，PEI(聚乙烯亚胺)是一种常用的高效转染材料。高正电荷密度的PEI可与DNA结合并缩聚成纳米微粒，这些微粒可以黏合到带有负电荷的细胞表面残基，并通过內吞作用进入细胞。一旦进入细胞，胺的质子化将导致反离子大量涌入以及渗透势降低。上述变化导致的渗透膨胀使囊泡释放聚合物与DNA形成的复合物(polyplex)进入细胞质。复合物拆解后，DNA就能自由地融合到细胞核中完成转染。然而，PEI具有很强的细胞毒性，往往会导致待转染细胞的存活率较低，并且PEI不具备靶向转染的能力。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
为了解决PEI的高毒性和无法靶向转染的难题，发明人进行了大量的实验探索，研究开发出了一种新的磁性SF/PEI纳米颗粒，该新型颗粒将PEI与无毒、生物可相容、生物可降解的蚕丝蛋白(SF)相结合并包裹在纳米磁性颗粒(MNP)的外层。发明人惊喜地发现，本发明的磁性SF/PEI纳米颗粒可以显著降低转染载体的细胞毒性，提高转染效率及成功率；同时磁性内核使得磁转染变得可行，显著缩短了转染所需的时间，提高了整体转染效率并具有靶向作用。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种磁性SF/PEI纳米颗粒。根据本发明的实施例，所述磁性SF/PEI纳米颗粒包括：磁性核心，所述磁性核心由纳米磁性材料构成；以及壳体，所述壳体形成在所述磁性核心外表面，所述壳体由蚕丝蛋白和聚乙烯亚胺构成，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺通过静电作用相结合。通过研究，根据本发明实施例的磁性SF/PEI纳米颗粒的工作原理在于：PEI是转染需要的核心材料，依靠其高密度的正电荷吸引DNA附着凝聚。而SF是一种无毒、生物可相容且生物可降解的蛋白，主要作用是降低制成颗粒的总体正电荷，可以使得最终颗粒拥有一定的正电荷来吸引DNA，但又不至于过高而带来高毒性；同时，发明人发现，SF蛋白在盐溶液中的盐析作用下可促进SF/PEI混合物共同沉淀到MNP表面，从而自动组装成所述磁性SF/PEI纳米颗粒。根据本发明实施例的磁性SF/PEI纳米颗粒表面带有正电，可吸附带负电的DNA结合成载体-DNA复合物并通过磁转染方法高效靶向进入细胞。与现有技术中常用的转染材料PEI相比，根据本发明实施例的磁性SF/PEI纳米颗粒可以大幅度降低对待转染细胞的细胞毒性，同时，在磁场作用下能够快速高效地集中在细胞表面从而实现高效靶向磁转染，转染效率大大提高。
根据本发明的实施例，上述磁性SF/PEI纳米颗粒还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺的质量比为1：1～9：1，如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7或1:8。发明人发现，若所述蚕丝蛋白的质量过小，所述磁性SF/PEI纳米颗粒的细胞毒性较高；若所述蚕丝蛋白的质量过大，在制备所述磁性SF/PEI纳米颗粒的过程中会发生沉淀现象，导致无法有效形成磁性SF/PEI纳米颗粒。由此，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺的质量比为1：1～9：1时，所述磁性SF/PEI纳米颗粒的细胞毒性更小。
根据本发明的实施例，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺的总质量与所述磁性核心的质量比为5：1～15：1，如6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1或14：1。发明人发现，若所述磁性核心的质量过小，磁性SF/PEI纳米颗粒的磁性较弱，导致磁性SF/PEI纳米颗粒无法在磁场作用下快速高效地集中在目标细胞的表面，靶向磁转染的效率降低；若所述磁性核心的质量过大，会导致有机物(蚕丝+PEI)无法全部覆盖磁性核心。由此，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺的总质量与所述磁性核心的质量比为5：1～15：1时，有机物(蚕丝+PEI)可以全部覆盖磁性核心，所述磁性SF/PEI纳米颗粒可以在磁场作用下快速高效地集中在细胞表面从而实现高效靶向磁转染，转染效率更高。
根据本发明的实施例，所述聚乙烯亚胺的重均分子量为18000～25000Da，如19000、20000、21000、22000、23000或24000Da。发明人发现，若所述聚乙烯亚胺的重均分子量过大，会增加所述磁性SF/PEI纳米颗粒的细胞毒性。由此，所述聚乙烯亚胺的重均分子量为18000～25000Da时，所述磁性SF/PEI纳米颗粒的细胞毒性更小。
根据本发明的实施例，所述聚乙烯亚胺为线性聚乙烯亚胺或分枝状聚乙烯亚胺。在一些实施例中，所述聚乙烯亚胺为分枝状聚乙烯亚胺。
根据本发明的实施例，所述纳米磁性材料包括选自Fe3O4、γ-Fe2O3的至少之一。Fe3O4、γ-Fe2O3作为纳米磁性材料，其生物毒性较小。另外，考虑到对人体的毒性，不选择对生物有毒性的纳米磁性材料，例如铂钴磁性颗粒。
根据本发明的实施例，所述磁性核心的粒径为5～30nm，如7、10、13、15、17、19、23、25、27或29nm。发明人发现，若所述磁性核心的粒径过大，则磁性核心趋向于聚集，导致在制备所述磁性SF/PEI纳米颗粒的过程中，磁性SF/PEI纳米颗粒也趋向于聚集，进而导致磁性SF/PEI纳米颗粒的分散效果较差。由此，所述磁性核心的粒径为5～30nm时，可以有效制备获得所述磁性SF/PEI纳米颗粒。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备上述任一项所述的磁性SF/PEI纳米颗粒的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺进行第一混合处理；将第一混合处理产物与纳米磁性材料物质进行第二混合处理；将第二混合处理产物进行盐析处理，以便获得所述磁性SF/PEI纳米颗粒；其中，所述蚕丝蛋白和所述聚乙烯亚胺分别以溶于水的形式提供，所述纳米磁性材料物质以分散于磷酸盐缓冲液的形式提供。与现有技术中常用的转染材料PEI相比，根据本发明实施例的方法制备获得的磁性SF/PEI纳米颗粒可以大幅度降低对待转染细胞的细胞毒性，同时，在磁场作用下能够快速高效地集中在细胞表面从而实现高效靶向磁转染，转染效率大大提高。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述第二混合处理是通过如下方式进行的：将第一混合处理产物、纳米磁性材料物质以及极性溶剂进行第二混合处理，所述极性溶剂是指可以与水混溶的溶剂。在一些实施例中，所述极性溶剂包括选自甲醇、乙醇、丙酮、二甲亚砜的至少之一。发明人发现，所述极性溶剂可以和蚕丝蛋白的肽链争夺水分子，导致肽链失水而凝聚成微粒，促使微粒快速形成，使得磁性颗粒即MNP可以充分包裹进蚕丝蛋白中以便获得整体磁性。
根据本发明的实施例，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺的质量比为1：1～9：1。发明人发现，若所述蚕丝蛋白的质量过小，制备获得的所述磁性SF/PEI纳米颗粒的细胞毒性较大；若所述蚕丝蛋白的质量过大，制备过程中会发生沉淀现象，导致无法有效形成磁性SF/PEI纳米颗粒。由此，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺的质量比为1：1～9：1时，制备获得的所述磁性SF/PEI纳米颗粒的细胞毒性更小。
根据本发明的实施例，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺的总质量与所述磁性核心的质量比为5：1～15：1。发明人发现，若所述磁性核心的质量过小，制备获得的磁性SF/PEI纳米颗粒的磁性较弱，导致磁性SF/PEI纳米颗粒无法在磁场作用下快速高效地集中在目标细胞的表面，靶向磁转染的效率降低；若所述磁性核心的质量过大，会导致有机物(蚕丝+PEI)无法全部覆盖磁性核心。由此，所述蚕丝蛋白与所述磁性核心的质量比为5：1～15：1时，有机物(蚕丝+PEI)可以全部覆盖磁性核心，制备获得的所述磁性SF/PEI纳米颗粒可以在磁场作用下快速高效地集中在细胞表面从而实现高效靶向磁转染，转染效率更高。
根据本发明的实施例，所述磷酸盐缓冲液的离子强度为1.0～1.5mol/L，如1.1、1.2、1.3或1.4mol/L。
根据本发明的实施例，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.5～8.5，如为7.7、7.9、8.0、8.2、8.4。
根据本发明的实施例，所述纳米磁性材料物质包括选自Fe3O4颗粒、γ-Fe2O3颗粒的至少之一。Fe3O4颗粒、γ-Fe2O3颗粒作为纳米磁性材料物质，其生物毒性较小。另外，考虑到对人体的毒性，不选择对生物有毒性的纳米磁性颗粒，例如铂钴磁性颗粒。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种细胞转染的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将上述任一项所述的磁性SF/PEI纳米颗粒与待转染细胞混合，所述磁性SF/PEI纳米颗粒携带有待转染物质，所述待转染细胞置于磁场中，所述磁性SF/PEI纳米颗粒在所述磁场的作用下向所述待转染细胞定向移动。根据本发明实施例的细胞转染方法转染效率高，转染效果好。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述待转染物质包括选自质粒、DNA、RNA或小分子物质的至少之一。
在本发明的第四方面，本发明提出了上述任一项所述的磁性SF/PEI纳米颗粒在靶向磁转染中的用途。发明人发现，所述磁性SF/PEI纳米颗粒在磁场作用下能够快速高效地集中在细胞表面从而实现高效靶向磁转染。
附图说明
图1是根据本发明实施例的磁性SF/PEI纳米颗粒的制备及转染示意图；
图2是根据本发明实施例的利用MTT法测试含有不同SF比例的颗粒对MDA-MB-231细胞的毒性结果示意图，其中，Cell Only表示只加入MDA-MB-231细胞，ODN Only表示只加入单链DNA，MSPP表示磁性SF/PEI纳米颗粒，SPP表示不含有磁性纳米颗粒核心的SF/PEI颗粒；
图3是根据本发明实施例的磁转染测试方法示意图；
图4是根据本发明实施例的磁转染测试测试结果示意图；以及
图5是根据本发明实施例的用荧光标记DNA后用磁性颗粒运载进入细胞的结果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明将PEI与无毒，生物可相容，生物可降解的蚕丝蛋白(SF)相结合并包裹在纳米磁性颗粒(MNP)外层，从而制备出磁性SF/PEI纳米颗粒。引入的SF经实验证明能显著降低整体颗粒的细胞毒性从而提高整体转染效率。此外，颗粒体系中的磁性内核使得颗粒能在磁场作用下快速高效集中在目标细胞表面从而达到靶向高效磁转染的目的。
关于蚕丝蛋白的选择，没有特别要求，可以是常见的家蚕(英文名：Bombyx morisilkworm)蚕丝，也可以选择其他种类的蚕产出的蚕丝。
关于纳米磁性颗粒的选择，可以选择Fe3O4和γ-Fe2O3颗粒，粒径范围为5～30纳米，具体产品可使用Sigma-Aldrich产的颗粒。另外，考虑到对人体的毒性，不选择对生物有毒性的颗粒，例如铂磁性颗粒。
关于聚乙烯亚胺(PEI)的选择，没有特别要求，线性结构或分支状结构均可，优选使用分支状结构。另外，若聚乙烯亚胺重均分子量过大，例如超过25000Da则会导致毒性增加，因此优选为18000～25000Da。
如图1所示，蚕丝蛋白(SF)与聚乙烯亚胺(PEI)结合并包裹在磁性Fe3O4外层之后通过“salting-out”(盐析)法即可制备得到混合磁性纳米载体。具体地，发明人将PEI溶液与SF溶液按不同比例混合后加入到含有MNP的磷酸盐溶液中，通过盐析作用使得混合物沉淀到MNP表面，从而制备出磁性混合颗粒。
PEI是转染需要的核心材料，依靠其高密度的正电荷吸引DNA附着凝聚。
SF的主要作用是降低制成颗粒的总体正电荷，使得最终颗粒可以拥有一定的正电荷吸引DNA，但又不至于过高而带来高毒性。同时，SF蛋白在盐溶液中的盐析作用促进SF/PEI混合物共同沉淀到MNP表面而达到制备有机材料包裹磁性颗粒的目的。
本发明的磁性SF/PEI纳米颗粒表面带有正电，可吸附带负电的DNA结合成载体-DNA复合物并通过磁转染方法高效靶向进入细胞。
本发明的磁性SF/PEI纳米颗粒的颗粒内部包含的磁性颗粒使得复合物能在磁场作用下快速集中在细胞表面，大大降低转染所需要的时间，并且能通过调节磁场方向达到靶向。
另外，在将SF溶液、PEI溶液以及含有MNP溶液进行混合时，还可以进一步添加例如甲醇，乙醇，丙酮，二甲亚砜等可以和水混溶的极性溶剂，通过这些溶液和肽链争夺水分子导致肽链失水而凝聚成微粒，促使微粒快速形成，且使得磁性颗粒即MNP可以充分包裹进蚕丝蛋白中以获得整体磁性。
下面将通过具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。
实施例1
将体积比为1:9的蚕丝蛋白溶液(浓度为5mg/mL，溶剂为去离子水)与聚乙烯亚胺溶液(聚乙烯亚胺选用分支结构的聚乙烯亚胺，产自Sigma-Aldrich，编号为408727，浓度为5mg/mL，溶剂为去离子水)混合，并加入到Fe3O4纳米磁性颗粒浓度为0.1mg/mL的磷酸钠溶液(Na2HPO4+NaH2PO4，离子强度1.25M，pH8)中，使得蚕丝蛋白-聚乙烯亚胺混合溶液与纳米磁性颗粒的磷酸盐混合溶液的体积比为1:5，静置6小时，之后使用磁铁收集颗粒。
实施例2
除了不添加蚕丝蛋白溶液，只添加聚乙烯亚胺溶液，总体积量与实施例1中蚕丝蛋白溶液和聚乙烯亚胺溶液的体积量之和相同，其余步骤与实施例1相同。
实施例3
除了将蚕丝蛋白溶液与聚乙烯亚胺溶液的体积比改为1:3，其余步骤与实施例1相同。
实施例4
除了将蚕丝蛋白溶液与聚乙烯亚胺溶液的体积比改为1:1，其余步骤与实施例1相同。
实施例5
除了将蚕丝蛋白溶液与聚乙烯亚胺溶液的体积比改为3:1，其余步骤与实施例1相同。
实施例6
除了将蚕丝蛋白溶液与聚乙烯亚胺溶液的体积比改为9:1，其余步骤与实施例1相同。
实施例7
除了将蚕丝蛋白溶液与聚乙烯亚胺溶液的体积比改为19:1，其余步骤与实施例1相同。
实施例8
除了不添加聚乙烯亚胺溶液，只添加蚕丝蛋白溶液，总体积量与实施例1中蚕丝蛋白溶液和聚乙烯亚胺溶液的体积量之和相同，其余步骤与实施例1相同。
电性测试
使用Dynamic light scattering analyser(DLS)(NanoBrook 90plus PalsParticle size Analyzer,Brookhaven Instrument,NY,USA)对上述实施例1～8收集到的颗粒粒径和电性进行测定，测定结果如下表1所示。
表1：蚕丝蛋白和PEI的比例对最终生成的磁性颗粒的粒径与电性的影响
由上述表1中的数据可知，SF含量越高，总体毒性越小，但考虑到体积比为19:1时，发生了沉淀，未生成颗粒，所以优选使用SF：PEI为1：1～9：1的磁性颗粒，其中SF：PEI为9：1时磁性颗粒的毒性最小。
毒性测试
利用MTT法测试上述实施例1～8收集到的含有不同SF比例的颗粒对MDA-MB-231细胞的毒性。
MTT法的具体测试步骤如下：
1.将MDA-MB-231乳腺癌细胞(该细胞常用于测定毒性，因此采用该类细胞测定)培养在96孔板中。细胞密度5×103/孔，培养24h使细胞附着。
2.移除完全培养液，用PBS冲洗细胞2次，加入无血清的培养液，加入磁性颗粒或磁性颗粒-DNA复合体。
3.培养细胞4h，在这4h中，将一块磁铁放置与孔板下方20min(从4h的培养开始时计时)。
4.移除无血清培养液，加入完全培养液，继续培养至3天。
5.加入50微升MTT试剂(3mg/mL)，继续培养3小时，移除所有溶液，加入200微升DMSO，等待紫色结晶都溶于DMSO后，用plate reader(FLUOstar galaxy,BMG LABTECH,Germany)观察结果。
具体测定结果如图2所示，各横坐标表示磁性颗粒与DNA的质量比，Cell Only表示只加入MDA-MB-231细胞，ODN Only表示只加入单链DNA，MSPP表示磁性SF/PEI纳米颗粒，SPP表示不含有磁性纳米颗粒核心的SF/PEI颗粒。
其中，a代表细胞被纯PEI包裹的颗粒(深色柱)处理三天后的细胞活性，b、c以及d分别代表被含有不同程度(SF和PEI的质量比)SF(分别是50％，75％，90％)的颗粒(深色柱)处理过的细胞的活性。由图中结果分析可知，加入SF后颗粒对细胞的毒性显著下降。
同时用不同种类的颗粒携带具有抑制细胞增殖的ODN(单链DNA)(浅色柱)处理细胞。由图中结果分析可知，细胞活性显著低于单纯颗粒处理的组，证明磁性颗粒成功将ODN送入细胞产生作用。
结论：本发明含有一定比例的SF的磁性SF/PEI纳米颗粒可以显著降低转染载体的细胞毒性，提高转染效率及成功率。
磁转染测试
磁转染测试方法如图3所示，具体为将细胞和磁性载体(上述实施例1～8收集到的)-DNA复合物共同培养，磁场作用于左侧盖玻片区域，磁场范围为12mm。
具体测试结果如图4所示。其中，实验组(深色)以磁场以促进载体向细胞聚集，对照组(浅色)没有磁场作用。DNA以荧光素标记并用BDTM LSR II flow cytometer(BDBiosciences,USA)测定细胞对DNA的吸收(Uptake)。纵坐标为吸收量，横坐标为磁场持续时间，min表示分钟，h表示小时，M+表示有磁场作用，M-表示没有磁场作用，Oli-ODN表示Oligofectamine(12252011)，是一种商业可购的转染试剂，用于对比本申请颗粒与现存试剂的摄取效果。
由图4分析可知，在磁场存在下细胞对DNA的摄取大于处理相同时间时没有磁场的对照组，在磁场存在条件下20分钟细胞对DNA的摄取量接近没有磁场的条件下24小时的吸收。
具体实验结果如图5所示。其中，a和b是用荧光标记DNA后用磁性颗粒运载进入细胞的图，a显示磁场作用以外区域的细胞吸收，b显示磁场作用内细胞对DNA的吸收。a和b的尺寸均为325x 325μm，其中白色横条为100μm的比例尺。
由图5分析可知，磁性载体有靶向作用。
结论：本发明含有磁性内核的磁性SF/PEI纳米颗粒使得磁转染变的可行，从而降低转染所需时间，提高细胞存活率，提高整体转染效率并具有靶向作用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种磁性SF/PEI纳米颗粒，其特征在于，包括：
磁性核心，所述磁性核心由纳米磁性材料构成；以及
壳体，所述壳体形成在所述磁性核心外表面，所述壳体由蚕丝蛋白和聚乙烯亚胺构成，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺通过静电作用相结合。
2.根据权利要求1所述的磁性SF/PEI纳米颗粒，其特征在于，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺的质量比为1：1～9：1。
3.根据权利要求1所述的磁性SF/PEI纳米颗粒，其特征在于，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺的总质量与所述磁性核心的质量比为5：1～15：1。
4.根据权利要求1所述的磁性SF/PEI纳米颗粒，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的重均分子量为18000～25000Da；
任选地，所述聚乙烯亚胺为线性聚乙烯亚胺或分枝状聚乙烯亚胺，优选地，所述聚乙烯亚胺为分枝状聚乙烯亚胺；
任选地，所述纳米磁性材料包括选自Fe3O4、γ-Fe2O3的至少之一；
任选地，所述磁性核心的粒径为5～30nm。
5.一种制备权利要求1～4任一项所述的磁性SF/PEI纳米颗粒的方法，其特征在于，包括：
将所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺进行第一混合处理；
将第一混合处理产物与纳米磁性材料物质进行第二混合处理；
将第二混合处理产物进行盐析处理，以便获得所述磁性SF/PEI纳米颗粒；
其中，所述蚕丝蛋白和所述聚乙烯亚胺分别以溶于水的形式提供，所述纳米磁性材料物质以分散于磷酸盐缓冲液的形式提供。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二混合处理是通过如下方式进行的：将第一混合处理产物、纳米磁性材料物质以及极性溶剂进行第二混合处理，所述极性溶剂可以与水混溶；
任选地，所述极性溶剂包括选自甲醇、乙醇、丙酮、二甲亚砜的至少之一。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺的质量比为1：1～9：1；
任选地，所述蚕丝蛋白与所述聚乙烯亚胺的总质量与所述磁性核心的质量比为5：1～15：1；
任选地，所述磷酸盐缓冲液的离子强度为1.0～1.5mol/L；
任选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.5～8.5；
任选地，所述纳米磁性材料物质包括选自Fe3O4颗粒、γ-Fe2O3颗粒的至少之一。
8.一种细胞转染的方法，其特征在于，将权利要求1～4任一项所述的磁性SF/PEI纳米颗粒与待转染细胞混合，所述磁性SF/PEI纳米颗粒携带有待转染物质，所述待转染细胞置于磁场中，所述磁性SF/PEI纳米颗粒在所述磁场的作用下向所述待转染细胞定向移动。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待转染物质包括选自质粒、DNA、RNA或小分子物质的至少之一。
10.权利要求1～4任一项所述的磁性SF/PEI纳米颗粒在靶向磁转染中的用途。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114767876A (zh) * 2022-03-30 2022-07-22 浙江大学 一种搭载噬菌体的复合多孔微球及其制备方法
CN114984313A (zh) * 2022-04-26 2022-09-02 江苏省中医药研究院(江苏省中西医结合医院) 一种提高丝素蛋白支架压电效应的方法
CN115029381A (zh) * 2022-06-15 2022-09-09 广州蕊特生物科技有限公司 一种白蛋白细胞转染方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103255175A (zh) * 2013-05-17 2013-08-21 四川大学 一种磁性纳米基因载体系统及其制备和应用
EP2898894A1 (en) * 2014-01-27 2015-07-29 LTS LOHMANN Therapie-Systeme AG Nano-in-micro particles for intradermal delivery
CN105107473A (zh) * 2015-07-23 2015-12-02 江苏大学 一种磁性纳米复合颗粒的制备方法及其应用
CN105802998A (zh) * 2016-03-24 2016-07-27 浙江大学 一种层层包覆结构的磁性纳米球及其制备方法和应用
CN105907791A (zh) * 2016-05-06 2016-08-31 重庆医科大学附属儿童医院 均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法
CN107982239A (zh) * 2017-12-08 2018-05-04 中国医学科学院生物医学工程研究所 疏水性药物晶体为模板的蛋白基非球形微囊及制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103255175A (zh) * 2013-05-17 2013-08-21 四川大学 一种磁性纳米基因载体系统及其制备和应用
EP2898894A1 (en) * 2014-01-27 2015-07-29 LTS LOHMANN Therapie-Systeme AG Nano-in-micro particles for intradermal delivery
CN105107473A (zh) * 2015-07-23 2015-12-02 江苏大学 一种磁性纳米复合颗粒的制备方法及其应用
CN105802998A (zh) * 2016-03-24 2016-07-27 浙江大学 一种层层包覆结构的磁性纳米球及其制备方法和应用
CN105907791A (zh) * 2016-05-06 2016-08-31 重庆医科大学附属儿童医院 均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法
CN107982239A (zh) * 2017-12-08 2018-05-04 中国医学科学院生物医学工程研究所 疏水性药物晶体为模板的蛋白基非球形微囊及制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WENXING SONG等: ""Magnetic-silk/polyethyleneimine core-shell nanoparticles for targeted gene delivery into human breast cancer cells"", <INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS> *
韩长日，宋小平主编: "《精细化工品实用生产技术手册 电子与信息化学品制造技术》", 31 October 2001, 科学技术文献出版社 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114767876A (zh) * 2022-03-30 2022-07-22 浙江大学 一种搭载噬菌体的复合多孔微球及其制备方法
CN114767876B (zh) * 2022-03-30 2024-04-19 浙江大学 一种搭载噬菌体的复合多孔微球及其制备方法
CN114984313A (zh) * 2022-04-26 2022-09-02 江苏省中医药研究院(江苏省中西医结合医院) 一种提高丝素蛋白支架压电效应的方法
CN114984313B (zh) * 2022-04-26 2023-06-20 江苏省中医药研究院(江苏省中西医结合医院) 一种提高丝素蛋白支架压电效应的方法
CN115029381A (zh) * 2022-06-15 2022-09-09 广州蕊特生物科技有限公司 一种白蛋白细胞转染方法

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