CN103131728B - 一种多功能化的石墨烯基因载体和基于该基因载体的基因转染试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，设计一种多功能化的石墨烯基因载体和基于该载体的基因转染试剂及其制备方法。该多功能化的石墨烯，由三部分组成，包括石墨烯，阳离子聚合物，和活性试剂，其中活性试剂包括表面活性剂、或细胞穿透肽(Cell‑penetrating peptide)、或细胞核定位信号肽(Nuclear localization signal peptide)中的一种或几种，阳离子聚合物和活性试剂连接到石墨烯上。本发明通过多功能化方式，增加该基因载体在基因转染过程中的稳定性、分散性、生物相容性，减小毒性，并采取多个基因转染促进机制，增加转染效率。经基因转染实验，结果表明，在多种细胞株中具有较高的转染效率，较低的毒性。本发明的主要用途为基因转染，可用于细胞生物学研究、生产基因制品、以及基因疗法。
Description
技术领域：本发明涉及一种多功能化的纳米材料及其制备方法，尤其是一种多功能化的石墨烯基因转染试剂及其制备方法
背景技术：
基因转染过程是真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。基因转染技术不仅是研究转基因和基因表达的重要工具，而且是目前基因治疗的关键步骤。目前，主要的基因转染试剂为病毒型转染试剂与人工合成型转染试剂。病毒型转染试剂基因携带能力有限，缺乏靶向性，操作危险(Putnam，D.Nat Mater 5，439-451，2006)，因此人们更倾向于使用人工合成型的基因转染试剂。目前人工合成型基因转染试剂主要是阳离子脂质体类、阳离子肽类和阳离子聚合物类，或者是上述几种的复合物。然而，当前的人工合成型基因转染试剂同病毒型试剂相比，仍然具有较低的转染效率，并且毒性高。这在很大程度上限制了它的应用(Mastrobattista，E.，et.al.Nat Rev Drug Discov 5，115-121，2006)。
脂质体本身会参与细胞生理活动，引起基因表达的上调或下调。如参与蛋白激酶C通路调节(Bottega R，et al.Biochemistry 31，9025-30，1992)、抑制ATP酶的活性(Datiles MJ et al.Biochim Biophys Acta 1777：362-8.2008)、与线粒体膜发生作用(Beavis AD.J Biol Chem.264：1508-15，1989)、转染siRNA造成脱靶效应等等。脂质体这些作用是造成细胞毒性的根本原因，并对相关研究数据产生严重的干扰。目前新一代转染试剂的开发大多聚焦在非脂质体的阳离子聚合物上。
有证据显示，在阳离子聚合物类基因转染试剂中绝大多数聚合物分子处于游离状态(例如在聚乙烯亚胺体系中，游离聚合物分子占85％，这部分聚合物并不参与负载DNA，但是，在基因转染过程中它是导致其毒性的最主要原因(Lungwitz U.，et al.Eur J PharmBiopharm 60：247-66，2005)。为改善其性能，人们尝试使用交联方法将阳离子聚合物制成纳米颗粒(Dong W.，et al.Acta Biochim Biophys Sin(shanghai).38：780-7，2006)、或将阳离子聚合物功能化到纳米粒子上，包括有机、或无机纳米粒子，并观察到毒性的降低。(David AG，et al.Angew Chem Int Edit，49，3280-3294，2010)
石墨烯作为一种新型的二维平面型材料，厚度只有单层碳原子，其尺寸可调；它很容易被引入各种官能团，如羟基、羧基、环氧基等，因此是一个理想的多功能化的纳米材料。初步的毒理学实验显示，石墨烯在细胞内(Chang Y，et al.Toxicol Lett，200，201-10，2011)和小鼠模型(Yang K，et al.ACS Nano 5，516-22，2010)中具有较低的毒性。
有文献报道，将聚乙烯亚胺通过物理吸附(Feng L，et al.Nanoscale，3，2011)或共价键(Chen BA，et al，J Mater Chem 21，7736-41，2011)连接到氧化石墨烯上，并观察到了毒性的降低。但是，通过物理吸附方法得到的聚乙烯亚胺功能化石墨烯不稳定，在盐水中沉淀。通过共价键连接到氧化石墨烯上虽然稳定，但是，与DNA质粒混合后，其稳定性仍然受溶液电荷性质影响严重，转染过程受操作方式、试剂用量等影响巨大，并且仍然存在一定的毒性。另外，其基因转染过程仅仅由阳离子聚合物一个因素控制，其转染效率仍然有限，对非肿瘤细胞的转染效率尤其低下。
因此获得更加稳定存在、并具有多个基因转染促进机制的多功能纳米基因转染试剂，仍然是当前基因转染试剂开发应用中的关键。
发明内容：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种多功能化的石墨烯基因载体及其制备方法，以及基于这种多功能化的石墨烯基因载体的基因转染试剂及其制备方法。
多功能化的石墨烯基因载体是一种多功能化的石墨烯，由三部分组成，包括石墨烯，阳离子聚合物，和活性试剂，其中活性试剂包括表面活性剂、或细胞穿透肽(Cell-penetrating peptide)、或细胞核定位信号肽(Nuclear localization signal peptide)中的一种或几种，所说的阳离子聚合物和活性试剂连接到石墨烯上。
所述的石墨烯为平均尺寸为小于30纳米。所述的阳离子聚合物为聚乙烯亚胺，壳聚糖，聚赖氨酸，聚N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶，支化的聚酰胺-胺型树状物，聚丙烯亚胺树状物。所述的表面活性剂为单臂或多臂聚乙二醇。所述的细胞穿透肽是有助于增加细胞对载体摄取的氨基酸序列，该细胞穿透肽含有Arg-Gly-Asp氨基酸序列。所述的细胞核定位信号肽是有助于将载体输送至细胞核的氨基酸序列，该细胞核定位信号肽含有SEQ ID NO.1氨基酸序列。
下面给出本发明所述的多功能石墨烯基因转染试剂的设计原理。本发明针对当前基因转染试剂存在的问题，提出了解决方案，如下。该多功能化的石墨烯基因载体使用石墨烯，石墨烯本身的细胞毒性小，作为基因载体将产生较小毒性。石墨烯平均尺寸小于30纳米，以利于其进入细胞，并增加其转染速率，以提高转染效率；使用阳离子聚合物负载基因，其阳离子性质有利于通过正负电荷相互作用将带有负电荷的基因进行负载；其形成的阳离子聚合物-基因复合物带有阳离子性质，有利于细胞对其进行摄取。所选用的阳离子聚合物能够并利于脱除内涵体，以利于释放基因，从而避免基因被水解；选用的表面活性剂以增强其在水以及血清中的溶解性，以减小聚集，并减小与细胞内蛋白质的相互作用，从而减小毒性，并增加转染效率；选用的细胞穿透肽可通过与细胞表面蛋白质作用而进一步增加细胞的摄取，而增加转染效率，尤其是对多种细胞株都有效；选用的细胞核定位信号肽可通过与细胞内蛋白质作用而有助于将载体输送至细胞核；阳离子聚合物和表面活性剂、或细胞穿透肽、或细胞核定位信号肽连接到石墨烯上，而去除了主要导致毒性的游离分子，进一步减小了毒性。因此该多功能化的石墨烯基因载体具有多个基因转染促进机制，因此该基因转染系统较传统的阳离子脂质体、阳离子聚合物、以及基于纳米粒子的转染体系具有较大改进，其转染性能具有毒性低、效率高的特点。
该多功能化的石墨烯基因载体的制备方法，包括以下步骤(1)，或步骤(1)和步骤(3)，或步骤(2)和步骤(3)：
(1)将1g氧化石墨烯分散于100ml水中，加入1g阳离子聚合物，0.2g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，超声、搅拌，反应时间为5～24h。过滤、洗涤，获得阳离子聚合物功能化的氧化石墨烯，分散于水中。
(2)将1g氧化石墨烯分散在水中，加入0.5g阳离子聚合物、0.5g端基含有氨基的表面活性剂、0.2g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、搅拌，反应时间为5～24h。过滤、洗涤，获得阳离子聚合物与表面活性剂功能化的氧化石墨烯，分散于水中。
(3)将步骤(1)或(2)制成的阳离子聚合物功能化的氧化石墨烯、或阳离子聚合物与表面活性剂功能化的氧化石墨烯中，加入0.1g 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)，搅拌，反应时间为0.5～4h，过滤、洗涤，获得活化的功能化氧化石墨烯，加入0.1g端基含有巯基的细胞穿透肽、或细胞核定位信号肽、或其混合物，反应时间为5-24h，过滤、洗涤，获得多功能化的石墨烯基因载体。
基于该多功能化的石墨烯基因载体制备的基因转染试剂的制备方法，是将该多功能化的石墨烯基因载体分散于溶剂中，该溶剂含有水、盐水、或细胞培养液。
本发明与现有技术相比具有的有益效果：
(1)基因载体具有较好的溶解性，尤其是与基因混合后在盐水及血清中具有较好的稳定分散，具有较低的毒性。
(2)基因载体具有表面活性剂的功能化，减小了与细胞内蛋白质的作用，具有较好的生物相容性。
(2)基因载体去除了游离阳离子高分子，具有较低的毒性。
(3)基因载体具有多个基因转染促进机制，基于该基因载体的基因转染试剂具有较高的转染效率。
(4)基因载体选用石墨烯平均尺寸小于30纳米，有助于细胞摄取，具有较高的转染效率。
(5)基于该基因载体制备的基因转染试剂，体现该基因载体所具有的特性，在细胞毒方面具有极大的突破。传统商业化试剂如lipofectamine 2000在使用后4-8h内需要更换培养液，本转染试剂无需更换培养液。
(6)该基因转染试剂使用方便，受操作方式、用量影响小，操作方便，结果重复性好。传统商业化试剂如lipofectamine2000需要在无血清的培养液中使用，本基因转染试剂可在有血清的培养液中进行操作，且用量在1个数量级内变化均可获得较高的转染效率。
(7)本发明对多种细胞株有效，包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞。部分转染试剂，如基于实施例6所述的转染试剂的转染效率与lipofectamine 2000相当，其中，对多种细胞株的转染效率超过lipofectamine 2000，如H293T，U20s，尤其是对非肿瘤细胞primary humanskin fibroblasts，具有很好的转染效果。该实施例6对多种细胞的转染效率如图3所示。
附图说明：
图1.多功能化的石墨烯基因载体的原子力分析图，标尺为200nm。
图2.基于该多功能化的石墨烯基因载体的基因转染试剂与lipofectamine 2000在H293T细胞株内对绿色荧光蛋白转染效果图。样品分别为a：实施例4；b：实施例5；c：实施例6；d：lipofectamine 2000；e：
实施例1.
图3.基于该多功能化的石墨烯基因载体的基因转染试剂对多种细胞株内绿色荧光蛋白转染效率，样品为实施例6。横坐标：1：H293T；2：COS-7：3：CV-1；4：Hela；5：CHO；6：PC12；7：HUVEC：8：K562；9：Primary human skin fibroblasts；10：primary umanpreadipocytes；11：KB；12：U20s；13：CaCo2
具体实施方式
多功能化的石墨烯基因载体是一种多功能化的石墨烯，由三部分组成，包括石墨烯，阳离子聚合物，和活性试剂，其中活性试剂包括表面活性剂、或细胞穿透肽、或细胞核定位信号肽中的一种或几种，所说的阳离子聚合物和活性试剂连接到石墨烯上。其中阳离子聚合物为聚乙烯亚胺，壳聚糖，聚赖氨酸，聚N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶，支化的聚酰胺-胺型树状物，聚丙烯亚胺树状物；表面活性剂包括2-6臂聚乙二醇；细胞穿透肽包括Arg-Gly-Asp氨基酸序列；细胞核定位信号肽包括SEQ ID NO.1氨基酸序列。该多功能化石墨烯基因载体具有分散性好，多个基因转染促进机制，去除游离阳离子聚合物，因此基于该多功能化石墨烯基因载体的基因转染试剂具有转染效率高、生物相容性好、毒性低的特点，使用方便、重复性好。
实施例1.聚乙烯亚胺和2臂聚乙二醇功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备聚乙烯亚胺和2臂聚乙二醇功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
将1g氧化石墨烯分散在水中，加入0.5g聚乙烯亚胺(Mw＝2,500)、0.5g端基含有氨基的2臂聚乙二醇(Mw＝2000)、0.2g 1g(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，超声、搅拌，反应时间为5～24h。过滤、洗涤，获得阳离子聚合物与表面活性剂功能化的氧化石墨烯。将其分散于水中制成基因转染试剂。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，如图1所示。zeta电势为+30mV。
(2)基因转染效率评价
将实验所需的细胞种在24孔板内达到覆盖率50％，每孔0.5ml培养液(含血清与抗生素)。将1g表达绿色荧光蛋白(GFP)的质粒加入100ul含血清与抗生素的培养液中，加入2ul转染试剂，轻轻混匀，室温孵育20-30min。该混合液在细胞培养液中10000g离心30min无聚集。待细胞于37℃的5％CO2孵育箱中孵育4h后，将上述混合物加入细胞培养液中。于37℃的5％CO2孵育箱中孵育48h后，将细胞分离，使用流式细胞仪进行荧光检测GFP的转染效果。转染效率为70％。
(3)基因转染试剂细胞毒性评价
细胞毒性评价采用台盼蓝染料排斥法。去步骤(2)中分离出的10μl细胞与10μl台盼蓝染料混合，使用细胞计数器进行计数，获得细胞存活率。测得细胞存活率为90％。
实施例2.聚乙烯亚胺和6臂聚乙二醇功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备基因载体及基因转染试剂：除反应原料使用6臂聚乙二醇替代2臂聚乙二醇外，其他实验步骤同实施例1。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，zeta电势为+33mV。
(2)基因转染效率评价：除加入1μl，2μl，5μl，10μl，15μl，20μl转染试剂外，步骤同实施例1。该基因转染试剂与GFP质粒混合液在细胞培养液中10000g离心30min均无聚集。48h转染效率分别为50％，75％，77％，75％，70％，65％。
(3)基因转染试剂细胞毒性评价：步骤同实施例1。测得细胞存活率为98％，96％，95％，94％，93％，90％。
实施例3.聚乙烯亚胺和4臂聚乙二醇功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备基因载体及基因转染试剂：除反应原料使用4臂聚乙二醇替代2臂聚乙二醇外，其他实验步骤同实施例1。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，zeta电势为+28mV。
(2)基因转染效率评价：步骤同实施例1。该基因转染试剂与GFP质粒混合液在细胞培养液中10000g离心30min无聚集。48h转染效率为65％。
(3)基因转染试剂细胞毒性评价：步骤同实施例1。测得细胞存活率为92％。
实施例4.聚乙烯亚胺、2臂聚乙二醇、Arg-Gly-Asp功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备聚乙烯亚胺和2臂聚乙二醇功能化的氧化石墨烯：步骤同实施例1。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，zeta电势为+33mV。
(2)肽的功能化：
向步骤(1)制成的聚乙烯亚胺和2臂聚乙二醇功能化的氧化石墨烯中，加入0.1g4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)，搅拌，反应时间为0.5～4h，过滤、洗涤，获得活化的功能化氧化石墨烯，加入0.1g氨基酸序列SEQ IDNO.2，反应时间为5-24h，过滤、洗涤，获得多功能化的石墨烯基因载体。
(3)基因转染效率评价：步骤同实施例1。该基因转染试剂与GFP质粒混合液在细胞培养液中10000g离心30min无聚集。48h转染效率为80％。
(4)基因转染试剂细胞毒性评价：步骤同实施例1。测得细胞存活率为95％。
实施例5.聚乙烯亚胺、2臂聚乙二醇、SEQ ID NO.1功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备聚乙烯亚胺和2臂聚乙二醇功能化的氧化石墨烯：步骤同实施例1。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，zeta电势为+30mV。
(2)肽的功能化：除反应原料使用SEQ ID NO.3替代SEQ ID NO.2外，其他实验步骤同实施例4。zeta电势为+42mV。
(3)基因转染效率评价：步骤同实施例1。该基因转染试剂与GFP质粒混合液在细胞培养液中10000g离心30min无聚集。48h转染效率为85％。
(4)基因转染试剂细胞毒性评价：步骤同实施例1。测得细胞存活率为93％。
实施例6.聚乙烯亚胺、2臂聚乙二醇、Arg-Gly-Asp、和SEQ ID NO.1功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备聚乙烯亚胺和2臂聚乙二醇功能化的氧化石墨烯：步骤同实施例1。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，zeta电势为+30mV。
(2)肽的功能化：除反应原料使用0.05g SEQ ID NO.3和0.05g SEQ ID NO.2的混合物替代SEQ ID NO.2外，其他实验步骤同实施例4。zeta电势为+42mV。
(3)基因转染效率评价：步骤同实施例1。该基因转染试剂与GFP质粒混合液在细胞培养液中10000g离心30min无聚集。48h转染效率为95％。
(4)基因转染试剂细胞毒性评价：步骤同实施例1。测得细胞存活率为95％。
(5)对多种细胞株的细胞毒性评价，均参照步骤(4)，采取标准方法进行。其转染效果见图3.
实施例7.聚乙烯亚胺、Arg-Gly-Asp、和SEQ ID NO.1功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备聚乙烯亚胺功能化的氧化石墨烯：除使用1g聚乙烯亚胺替代聚乙烯亚胺与2臂聚乙二醇的混合物外，步骤同实施例1。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，zeta电势为+40mV。
(2)肽的功能化：步骤同实施例6。zeta电势为+46mV。
(3)基因转染效率评价：步骤同实施例1。该基因转染试剂与GFP质粒混合液在细胞培养液中10000g离心30min无聚集。48h转染效率为95％。
(4)基因转染试剂细胞毒性评价：步骤同实施例1。测得细胞存活率为90％。
实施例8.壳聚糖和2臂聚乙二醇功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备基因载体及基因转染试剂：除反应原料使用壳聚糖替代聚乙烯亚胺外，其他实验步骤同实施例1。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，zeta电势为+30mV。
(2)基因转染效率评价：步骤同实施例1。该基因转染试剂与GFP质粒混合液在细胞培养液中10000g离心30min无聚集。48h转染效率为25％。
(3)基因转染试剂细胞毒性评价：步骤同实施例1。测得细胞存活率为98％。
实施例9.聚赖氨酸和2臂聚乙二醇功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备基因载体及基因转染试剂：除反应原料使用壳聚糖替代聚乙烯亚胺外，其他实验步骤同实施例1。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，zeta电势为+25mV。
(2)基因转染效率评价：步骤同实施例1。该基因转染试剂与GFP质粒混合液在细胞培养液中10000g离心30min无聚集。48h转染效率为15％。
(3)基因转染试剂细胞毒性评价：步骤同实施例1。测得细胞存活率为85％。
实施例10.聚N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶和2臂聚乙二醇功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备基因载体及基因转染试剂：除反应原料使用聚N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶替代聚乙烯亚胺外，其他实验步骤同实施例1。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，zeta电势为+34mV。
(2)基因转染效率评价：步骤同实施例1。该基因转染试剂与GFP质粒混合液在细胞培养液中10000g离心30min无聚集。48h转染效率为39％。
(3)基因转染试剂细胞毒性评价：步骤同实施例1。测得细胞存活率为90％。
实施例11.支化的聚酰胺-胺型树状物和2臂聚乙二醇功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备基因载体及基因转染试剂：除反应原料使用支化的聚酰胺-胺型树状物替代聚乙烯亚胺外，其他实验步骤同实施例1。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，zeta电势为+35mV。
(2)基因转染效率评价：步骤同实施例1。该基因转染试剂与GFP质粒混合液在细胞培养液中10000g离心30min无聚集。48h转染效率为42％。
(3)基因转染试剂细胞毒性评价：步骤同实施例1。测得细胞存活率为91％。
实施例11.聚丙烯亚胺树状物和2臂聚乙二醇功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备基因载体及基因转染试剂：除反应原料使用聚丙烯亚胺树状物替代聚乙烯亚胺外，其他实验步骤同实施例1。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，zeta电势为+33mV。
(2)基因转染效率评价：步骤同实施例1。该基因转染试剂与GFP质粒混合液在细胞培养液中10000g离心30min无聚集。48h转染效率为55％。
(3)基因转染试剂细胞毒性评价：步骤同实施例1。测得细胞存活率为92％。
实施例12.壳聚糖、2臂聚乙二醇、Arg-Gly-Asp、和SEQ ID NO.1功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备基因载体及基因转染试剂：实验步骤同实施例8。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，zeta电势为+30mV。
(2)肽的功能化：步骤同实施例6。zeta电势为+38mV。
(2)基因转染效率评价：步骤同实施例1。该基因转染试剂与GFP质粒混合液在细胞培养液中10000g离心30min无聚集。48h转染效率为60％。
(3)基因转染试剂细胞毒性评价：步骤同实施例1。测得细胞存活率为97％。
实施例13.聚N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶、2臂聚乙二醇、Arg-Gly-Asp、和SEQ IDNO.1功能化的石墨烯基因载体及基因转染试剂
(1)制备基因载体及基因转染试剂：实验步骤同实施例10。原子力结果显示平均尺寸小于30nm以下，zeta电势为+38mV。
(2)肽的功能化：步骤同实施例6。zeta电势为+42mV。
(3)基因转染效率评价：步骤同实施例1。该基因转染试剂与GFP质粒混合液在细胞培养液中10000g离心30min无聚集。48h转染效率为68％。
(4)基因转染试剂细胞毒性评价：步骤同实施例1。测得细胞存活率为92％。
Claims (2)
1.一种多功能化的石墨烯基因载体，其特征在于，它是一种多功能化的石墨烯，由三部分组成，包括氧化石墨烯，阳离子聚合物，和活性试剂，其中活性试剂包括表面活性剂、或细胞穿透肽(Cell-penetrating peptide)、或细胞核定位信号肽(Nuclear localizationsignal peptide)中的一种或几种，其特征是阳离子聚合物和活性试剂连接到氧化石墨烯上，氧化石墨烯平均尺寸小于30纳米；其中阳离子聚合物为聚乙烯亚胺，壳聚糖，聚赖氨酸，聚N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶，支化的聚酰胺-胺型树状物，聚丙烯亚胺树状物；表面活性剂为单臂或多臂聚乙二醇；细胞穿透肽是有助于增加细胞对载体摄取的氨基酸序列，为Arg-Gly-Asp氨基酸序列；细胞核定位信号肽是有助于将载体输送至细胞核的氨基酸序列，为SEQ ID NO.1氨基酸序列。
2.基于权利要求1所述的一种多功能化的石墨烯基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(2)，或步骤(1)和步骤(3)，或步骤(2)和步骤(3)：其中氧化石墨烯平均尺寸小于30纳米；阳离子聚合物为聚乙烯亚胺，壳聚糖，聚赖氨酸，聚N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶，支化的聚酰胺-胺型树状物，聚丙烯亚胺树状物；表面活性剂为单臂或多臂聚乙二醇；细胞穿透肽是有助于增加细胞对载体摄取的氨基酸序列，为Arg-Gly-Asp氨基酸序列；细胞核定位信号肽是有助于将载体输送至细胞核的氨基酸序列，为SEQ ID NO.1氨基酸序列；
(1)将1g氧化石墨烯分散于100ml水中，加入1g阳离子聚合物，0.2g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、超声、搅拌，反应时间为5～24h；过滤、洗涤，获得阳离子聚合物功能化的氧化石墨烯，分散于水中；
(2)将1g氧化石墨烯分散在水中，加入0.5g阳离子聚合物、0.5g端基含有氨基的表面活性剂、0.2g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、搅拌，反应时间为5～24h；过滤、洗涤，获得阳离子聚合物与表面活性剂功能化的氧化石墨烯，分散于水中；
(3)将步骤(1)或(2)制成的阳离子聚合物功能化的氧化石墨烯、或阳离子聚合物与表面活性剂功能化的氧化石墨烯中，加入0.1g 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)，搅拌，反应时间为0.5～4h，过滤、洗涤，获得活化的功能化氧化石墨烯，加入0.1g端基含有巯基的细胞穿透肽、或细胞核定位信号肽、或其混合物，反应时间为5-24h，过滤、洗涤，获得多功能化的氧化石墨烯。
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| CN201110372228.XA CN103131728B (zh) | 2011-11-22 | 2011-11-22 | 一种多功能化的石墨烯基因载体和基于该基因载体的基因转染试剂及其制备方法 |
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