CN101787375B - 一种反向非病毒载体基因转染的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种反向非病毒载体基因转染的方法，包括步骤：(1)将高分子化合物水溶液与细胞培养器皿或将生物材料细胞培养支架接触，经孵育后除去液体，制得表面改性的细胞培养器皿或表面改性的生物材料；(2)将非病毒载体与基因混合，制得非病毒载体与基因的复合物；(3)向表面改性的细胞培养器皿或表面改性的生物材料滴加非病毒载体与基因的复合物，经孵育后再加入待转染的细胞，进行基因的转染。该方法操作简单，成本低廉，可以显著提高血清存在情况下非病毒载体的基因转染效率，且可以对基因复合物的释放加以控制。

Description

一种反向非病毒载体基因转染的方法

技术领域

本发明涉及基因转染技术领域，具体涉及一种反向非病毒载体基因转染的方法。

背景技术

基因治疗自1989年首次进入临床试验以来，已经经历了近二十年的发展，其应用也从最初的针对遗传性病症的治疗扩展到对获得性疾病的防治，迄今为止已有上千例基因治疗被批准进入临床试验。而基因重组及转染技术也进入到越来越多的研究领域，如组织工程与再生医学等。对于基因重组及基因转染而言，安全性好且能产生基因高效、定位表达的载体的构建是关键所在。众所周知，基因治疗载体有病毒载体与非病毒载体两大类，病毒载体尽管具有转染效率高、基因表达持续时间长等优点，但由于其安全性差，易引起免疫反应以及易整合入基因组带来突变风险等，其使用往往受到限制。非病毒载体因其安全和易于大量获得等优点而日益受到关注，但是由于非病毒载体的转染效率普遍较低，限制了非病毒载体的广泛应用。

可见，一种成功而高效的基因转染方法的确立可以方便地应用于一大类相关载体及细胞，为非病毒基因载体在临床的广泛应用奠定基础，并可进一步推广到组织工程与再生医学、肿瘤基因治疗、树突状细胞等更多研究领域，具有重要的应用价值。

研究发现，基因转染效率的提高不仅依赖于载体技术的进步，而且与转染方法密切相关。运用非病毒载体在体外对细胞进行基因转染的常规转染方法是先将细胞加入培养器皿，然后加入载体与基因的复合物进行转染。细胞培养所需的血清通常会影响载体与基因的复合物的稳定性，导致转染效率的下降，所以大多数转染是在无血清的条件下进行的，待细胞对复合物的摄取结束后再加入血清进行培养。虽然无血清条件下的转染可以保全非病毒载体的转染效率，但是对细胞的正常生长造成了不利影响。

为了解决上述基因转染存在的问题，目前一方面尝试制备稳定性更佳的载体，另一方面尝试改变载体加入转染体系的方式来减轻血清的影响。实验显示反向转染方法能改善血清存在对基因转染效率的影响。此外，运用非病毒载体进行的基因转染表达时间短，常规转染方法对基因药物的释放可调控性差，为实现某些基因治疗中所需的持续高效基因表达常需要反复给药，而反向转染方法可实现对基因复合物释放的控制，满足长期给药或智能给药的需要。但现有技术中还未见有关于反向非病毒载体基因转染方法的报道。

发明内容

本发明提供了一种反向非病毒载体基因转染的方法，采用高分子溶液与细胞培养器皿或生物材料表面进行修饰，再将非病毒载体与基因的复合物结合到细胞培养器皿或生物材料表面后对细胞进行转染，大大提高了基因转染的效率。

一种反向非病毒载体基因转染的方法，包括步骤：

(1)将高分子化合物水溶液与细胞培养器皿或将生物材料细胞培养支架接触，经孵育后除去液体，制得表面改性的细胞培养器皿或表面改性的生物材料；

(2)将非病毒载体与基因混合，制得非病毒载体与基因的复合物；

(3)向表面改性的细胞培养器皿或表面改性的生物材料滴加非病毒载体与基因的复合物，经孵育后再加入待转染的细胞，进行基因的转染。

所述的高分子化合物可选用本领域常用的高分子化合物，主要包括合成高分子化合物如聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)等，以及天然高分子化合物及其衍生物如明胶、阴离子化的明胶、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠、白蛋白等。本发明可优选聚乙二醇、多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、明胶、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠或白蛋白中的一种。

进一步优选，分子量为200～20000的PEG、分子量为6万～30万的PLL、分子量为800～25000的PEI、分子量为1万～15万的明胶、分子量为5万～100万的透明质酸或者分子量为500～95万的壳聚糖。

所述的高分子化合物水溶液中高分子化合物的浓度优选为50μg/ml～10mg/ml。

所述的高分子化合物水溶液中还可以添加促进基因转染的物质，所述的促进基因转染的物质选自纤维连接蛋白、含有RGD序列的多肽、鱼精蛋白或组氨酸中的一种。

所述的高分子化合物水溶液中促进基因转染的物质的浓度优选为10μg/ml～5mg/ml。

所述的高分子化合物水溶液的zeta电位优选为-50mv～50mv。

所述的细胞培养器皿和生物材料细胞培养支架均为本领域常用的细胞培养容器，其中，所述的细胞培养器皿可选自常见的细胞培养板、细胞培养瓶或细胞培养皿中的一种，细胞培养板、细胞培养瓶或细胞培养皿的材料一般为聚苯乙烯类材料。

所述的生物材料细胞培养支架中采用的材料既可以为可降解生物材料也可以为不可降解生物材料，具体可选自聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、胶原、透明质酸、壳聚糖或聚对苯二甲酸乙二醇酯属聚酯(PET)中的一种。

所述方法中高分子化合物水溶液可以以滴加或浸泡的方式与细胞培养器皿或生物材料细胞培养支架接触，例如可以将高分子化合物水溶液涂布到细胞培养器皿表面或将生物材料细胞培养支架浸泡到高分子化合物水溶液中，使高分子化合物或者高分子化合物及添加的促进基因转染的物质充分结合到培养器皿或生物材料表面，对培养器皿或生物材料表面进行修饰，再将非病毒载体与基因的复合物结合到培养器皿或生物材料表面。

所述的非病毒载体为本领域常用的细胞转染用非病毒载体，可选自聚阳离子、脂质体、囊泡、树突状大分子化合物，如壳聚糖、聚乙烯亚胺(PEI)、Lipofectamine2000、

HD、NanoJuice、聚酰胺-胺(PAMAM)等非病毒载体中的一种。

所述的非病毒载体与基因的复合物的平均粒径为5nm～5μm。在此粒径范围内的非病毒载体与基因的复合物更有利于细胞对其的有效摄取。

为了保证高分子化合物能更加充分地结合到培养器皿或生物材料表面，步骤(1)中，所述的孵育时间为1h～24h。

为了保证非病毒与基因复合物能更加充分地结合到经表面改性的细胞培养器皿或生物材料上，步骤(3)中，所述的孵育时间为0.5h～24h。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明运用含有高分子化合物或者高分子化合物及蛋白多肽类促进基因转染的物质的溶液对细胞培养器皿或生物材料表面进行修饰，使非病毒载体与基因的复合物可以通过非共价键结合到培养器皿或生物材料表面，用于体外基因输送，且可以直接运用于局部给药，较直接注射基因复合物可以更好实现靶向性。

本发明可以根据基因治疗对基因释放速率及数量的要求调整高分子化合物水溶液的成分，实现基因的智能输送。

本发明操作简单，各物质都是以溶液状态加入体系中以非共价键进行结合，不涉及专业性要求高的对高分子材料表面的化学改性；另外，本发明所采用的高分子化合物及添加物容易获得且成本低廉，具有可推广性；本发明方法安全性与转染效率均佳，能改善血清存在情况下血清对基因转染效率的影响，具有很好的应用前景。

由于基因治疗方案所需治疗基因表达持续时间各异，基因复合物从生物材料表面的控制释放性能就显得尤为重要，显然反向转染方法在此方面较常规转染方法具有更大的可控性与灵活性。通过改变溶液的酸碱度、溶液中各成分的比例、高分子化合物的类型、分子量与浓度，可以改变生物材料表面的电性与亲水性，进而影响非病毒载体与基因的复合物与细胞培养器皿或生物材料表面的结合与释放。通过添加可加强细胞与材料粘附作用或可促进基因转染的蛋白质或多肽，可以增加生物材料的生物相容性以及非病毒载体的转染效率。

附图说明

图1为常规转染方法与本发明反向转染方法在无血清情况下的转染效果对比图；

图2为常规转染方法与本发明反向转染方法在无血清情况下的转染效果对比图；

图3为常规转染方法与反向转染方法在血清体积百分浓度为10％的培养液中的转染效果对比图；

图4为常规转染方法与反向转染方法在血清体积百分浓度为10％的培养液中的转染效果对比图；

图5为PEI/DNA复合物以反向转染方法转染HeLa细胞的存活率结果图。

具体实施方式

实施例1

(1)将PEG(Mw＝3400)的浓度为2mg/ml、纤维连接蛋白的浓度为20μg/ml的高分子化合物水溶液涂布到24孔细胞培养板(美国corning公司生产)，孵育4h后除去液体，用PBS缓冲液(即吐温-20的质量百分浓度为0.05％、pH7.4的磷酸盐缓冲液)清洗两次，制得表面改性的细胞培养板。

(2)以壳聚糖作为非病毒载体，与含编码虫荧光素酶的基因的质粒DNA(即pGL3质粒DNA，浙江大学药理所)混合制备壳聚糖与DNA的复合物。

(3)将壳聚糖与DNA的复合物滴加到上述表面改性的细胞培养板上，孵育2h后加入人宫颈癌HeLa细胞进行转染。

实施例2

(1)将透明质酸支架浸泡在PLL(Mw＝10万)的浓度为60μg/ml、含RGD序列的多肽(GRGDSP，由上海生工生物工程公司合成)的浓度为1mg/ml的高分子化合物水溶液中，孵育1h后除去液体，用PBS缓冲液清洗两次，制得表面改性的透明质酸支架。

(2)以Lipofectamine2000(Invitrogen公司)作为非病毒载体，与pGL3质粒DNA混合制备Lipofectamine2000与DNA的复合物。

(3)将Lipofectamine2000与DNA的复合物滴加到上述表面改性的透明质酸支架上，孵育0.5h后加入人肝癌HepG2细胞进行转染。

实施例3

(1)将阴离子化明胶(Mw＝5万)的浓度为500μg/ml、鱼精蛋白(Sigma公司)的浓度为200μg/ml的高分子化合物水溶液涂布到细胞培养皿(杭州生友公司生产)，孵育12h后除去液体，用PBS缓冲液清洗两次，制得表面改性的细胞培养皿。

(2)以

HD(罗氏公司生产)作为非病毒载体，与pGL3质粒DNA混合制备

HD与DNA的复合物。

(3)将

HD与DNA的复合物滴加到上述表面改性的细胞培养皿上，孵育5h后加入白血病K562细胞进行转染。

实施例4

(1)将PLGA支架浸泡在透明质酸(Mw＝40万)的浓度为1mg/ml的高分子化合物水溶液中，孵育24h后除去液体，用PBS缓冲液清洗两次，制得表面改性的PLGA支架。

(2)以聚酰胺PAMAM(Sigma公司)作为非病毒载体，与含编码绿色荧光蛋白的基因的质粒DNA(pEGFP-N1质粒DNA，浙江大学传染病研究所)混合制备PAMAM与DNA的复合物。

(3)将PAMAM与DNA的复合物滴加到上述表面改性的PLGA支架上，孵育18h后加入人乳腺HBL细胞进行转染。

实施例5

(1)将PET支架浸泡在白蛋白(sigma公司生产)的浓度为8mg/ml、组氨酸的浓度为500μg/ml的高分子化合物水溶液中，孵育6h后除去液体，用PBS缓冲液清洗两次，制得表面改性的PET支架。

(2)以NanoJuice(默克公司生产)作为非病毒载体，与pEGFP-N1质粒DNA混合制备NanoJuice与DNA的复合物。

(3)将NanoJuice与DNA的复合物滴加到上述表面改性的PET支架上，孵育6h后加入大鼠骨髓间充质干细胞(bMSC)进行转染。

本发明采用如下实验方法对实施例1～5进行性能测定：

1、高分子化合物水溶液zeta电位的测定

配置1mg/ml明胶溶液作为对照例，用zeta电位测定仪测量zeta电位，结果见表1。

由表1可见，可选用的高分子化合物可具有不同的带电性质，所带电荷的多少会影响到体系吸附非病毒载体与基因复合物的量，以及复合物从体系中释放的速率等。为了实现对复合物释放量与释放速率的控制，可根据实际需要选择不同带电性质的高分子化合物或对特定高分子化合物进行化学修饰。

表1

	对照例	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5
							zeta电位(mv)	-4.5	-0.2	10.3	-22.6	-7.8	-4.5

2、非病毒载体与基因的复合物的粒径与zeta电位的测定

采用PEI作为非病毒载体，与pGL3质粒DNA(浙江大学药理所)混合制备载体与DNA的复合物作为对照例，用纯水稀释，利用激光粒度测定仪测定复合纳米粒的粒径分布，利用zeta电位测定仪测量zeta电位，结果见表2。

表2显示了本发明方法适用于具有不同粒径与电位分布的非病毒载体与基因复合物，此体系不仅适用于带正电的复合物，对于常规转染方法下转染效率较低的带负电荷的复合物也可以取得更佳的转染效果。

表2

	对照例	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5
							平均粒径(nm)	136	200	223	82	241	600
zeta电位(mv)	32.2	22.7	18.3	23.9	4.41	-4.6

3、体外转染效率测定

对照例采用PEI作为非病毒载体，pGL3作为质粒DNA。将一定量载体溶解在一定体积的纯水中，与一定浓度的质粒DNA等体积混合，在室温下孵育15分钟以获得载体与DNA的复合物，用纯水进行稀释。

(1)常规转染方法：在对照例中以HeLa细胞作为模型细胞。将细胞以每孔5万个细胞的数量种在24孔板中培养24h，除去培养液，以PBS缓冲液清洗两遍，加入0.5ml不含小牛血清或小牛血清体积百分浓度为10％的DMEM培养液(GIBCO公司)，将对照例或者实施例中配好的复合物加入到细胞中，放入37℃的CO₂培养箱培养。

对于不含血清组，转染6小时后吸去转染液，每孔加0.5ml小牛血清体积百分浓度为10％的DMEM培养液，继续培养24小时；对于含血清组，转染液与细胞持续作用24h。对于EGFP质粒，24h后用荧光倒置显微镜下观察转染情况，拍片记录。对于pGL3质粒，培养好后不含血清组和含血清组均吸去24孔板中培养液，PBS缓冲液清洗两次，每孔加入200μl细胞裂解液，静置5分钟，小心吹打，吸取细胞于12000rpm、4℃离心两分钟。取上清液20μl，加入100μl虫荧光素酶底物用化学发光仪测定荧光强度。

配制浓度为0.5mg/ml的蛋白质水溶液，蒸馏水稀释至浓度25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，以每孔20μl加入到96孔板中，每孔再加入200μl二喹林甲酸(BCA)工作液(碧云天公司)，595nm紫外测吸光度，绘标准曲线。

将所得样品上清液另取10μl，稀释到20μl，加入200μlBCA工作液测吸光光度值，带入标准曲线得蛋白质含量。采用相对光单位与蛋白质量的比值作为转染效率的评价指标。

(2)反向转染方法：配置海藻酸钠浓度为200μg/ml、鱼精蛋白的浓度为400μg/ml的溶液作为对照例中的高分子溶液。滴加80μl对照例或者实施例中的高分子溶液到24板中，37℃静置1h，用PBS缓冲液清洗两次。将对照例或者实施例中制备好的载体与DNA的复合物以每孔40μl的体积滴加到24板中，37℃静置30min。

对于含血清组，细胞用胰酶消化后加入小牛血清体积百分浓度为10％、双抗(100U/ml)的DMEM培养液，吹打成细胞悬液，以每孔5万个细胞的数量加到上述24孔板中培养24h；对于不含血清组，用不含血清的培养液制备细胞悬液，以相同密度种到24孔板，6h后换成小牛血清体积分数为10％的DMEM培养液，继续培养18h。对于pGL3质粒，按(1)中相同的方法进行虫荧光素酶检测与蛋白质浓度测定。采用相对光单位与蛋白质量的比值作为转染效率的评价指标。对于EGFP质粒，24h后用荧光倒置显微镜下观察转染情况，拍片记录。

常规转染方法与本发明反向转染方法在无血清情况下的转染效果对比图，见图1和图2；常规转染方法与反向转染方法在血清体积分数为10％的培养液中的转染效果对比图，见图3和图4。

图1、图2、图3和图4显示，在无血清情况下，反向转染方法与常规转染方法的转染效率无显著性差异。但当转染时加入了体积分数为10％的血清时，运用本发明的反向转染方法可以取得显著高于常规转染方法的转染效果。

4、细胞存活率实验

反向转染方法下细胞存活率测定：96孔培养板每孔滴加20μl对照例或者实施例中用于转染的高分子化合物水溶液，37℃静置1h，用PBS缓冲液清洗两次。每孔滴加10μl PEI与DNA的复合物或者实施例中的复合物，空白对照组加10μl纯水，37℃静置30min后除去液体。细胞用胰酶消化后加入小牛血清体积百分浓度为10％、双抗(100U/ml)的DMEM培养液吹打成细胞悬液，以每孔1.5万个细胞的数量接种到96孔板中培养24h。除去培养液，PBS缓冲液清洗两次，每孔加入20μl噻唑兰(MTT)水溶液(浓度5mg/ml)和80μl培养液，4h后吸去培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，振摇10min，在酶标仪上于570nm测定A值。按以下公式计算细胞生存率(即细胞存活率)。

细胞生存率(％)＝(样品的A值/对照组的A值)×100％

PEI与DNA的复合物以反向转染方法转染HeLa细胞的存活率结果图，见图5。

由图5可看出，采用本发明的反向转染方法转染HeLa细胞时，细胞存活率良好，表明此转染方法不会对细胞的生长产生抑制。

上述测试结果表明：本发明的反向转染方法能显著改善血清存在对基因转染效率的影响，非病毒载体运用反向转染方法进行转染安全性良好。

Claims (3)

1.一种反向非病毒载体基因转染的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)将白蛋白水溶液与细胞培养器皿或生物材料细胞培养支架接触，经孵育6h后除去液体，制得表面改性的细胞培养器皿或表面改性的生物材料细胞培养支架；

(2)将非病毒载体与基因混合，制得非病毒载体与基因的复合物；

(3)向表面改性的细胞培养器皿或表面改性的生物材料细胞培养支架滴加非病毒载体与基因的复合物，经孵育6h后再加入待转染的细胞，进行基因的转染；

其中，所述的白蛋白水溶液中白蛋白的浓度为8mg/ml；

所述的白蛋白水溶液中添加有浓度为500μg/ml的组氨酸；

所述的非病毒载体选自聚阳离子、脂质体、囊泡、树突状大分子化合物中的一种；

所述的非病毒载体与基因的复合物的平均粒径为223nm～600nm。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的白蛋白水溶液的zeta电位为-50mv～50mv。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞培养器皿选自细胞培养板、细胞培养瓶或细胞培养皿中的一种；

所述的生物材料细胞培养支架中的生物材料选自聚乳酸-乙醇酸共聚物、胶原、透明质酸、壳聚糖或聚对苯二甲酸乙二醇酯属聚酯中的一种。

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