CN103966155B - 一种利用自组装细胞芯片转染蛋白质或化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用自组装细胞芯片转染蛋白质或化合物的方法。本发明提供了自组装细胞芯片在转染蛋白质或化合物中的应用和利用自组装细胞芯片转染蛋白质或化合物的方法；其中自组装细胞芯片包括基底，在所述基底上设有用于固定所述蛋白质或化合物的区域；在所述基底上除用于固定所述蛋白质或化合物的区域外的其他区域覆盖抑制细胞生长的聚-N-异丙基丙烯酰胺膜。本发明的实验证明，本发明发现SAMcell芯片可以用来定点转染蛋白质或化合物，该方法有机结合了细胞芯片技术和定点转染技术，可以有效的应用于蛋白质或化合物的大规模筛选研究。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用自组装细胞芯片转染蛋白质或化合物的方法。
背景技术
2001年Ziauddin等人首先发明了反向转染技术，将可以表达报告基因的质粒点在玻璃片上，待复合物晾干之后，在上面培养细胞，两天以后观察转染效果。这种技术的出现让生物学家们有机会抛弃孔板技术而改用芯片技术来进行高通量的筛选工作。这种基于芯片的反向转染技术有几大优点：（1）因为反向转染转染试剂和核酸用量极低，大大降低了成本；（2）所有细胞都在一个培养皿中，所以它们具有可比性，这样实验重复性高；（3）下游操作简单，比如细胞染色等等，只需将芯片统一处理即可。但这种方法还有一个缺点，就是只有在最后进行荧光拍照的时候才知道哪个位置点了核酸，也就是定位的问题。
目前，已经发明了一种SAMcell芯片（Self-assembledCellMicroarray，自组装细胞芯片）技术。该技术的主要核心是：（1）应用反向转染技术；（2）利用一种在低温下可以溶解在水中的高聚物的特性来解决定位的问题。这种高聚物叫做聚-N-异丙基丙烯酰胺（PolyN-isopropylacrylamide，PNI）。当它在水中被加热到32℃以上时，它会萎缩脱水，只剩自身体积的10%左右，而这个过程是可逆的。它的另一特性是细胞不能在其表面生长。利用了PNI的特性，首先在干燥环境中把PNI铺在芯片上，晾干，然后用等离子刻蚀机刻蚀，直到把PNI膜刻穿，刻蚀的大小可以用模具来控制，经过刻蚀的地方细胞就可以在上面生长。其后在上面点上反向转染的复合物，接下来在上面培养细胞，细胞贴壁之后，把温度降到32℃以下，PNI膜就会溶解脱落，洗涤之后就会形成细胞岛。
这种技术有很多优点。首先，应用微细加工技术，圆形区域的误差可以控制在不到万分之一，这样就可以对芯片进行十分精确的控制；其次，实验过程中，所有的细胞岛都在相同的培养条件下孵育，所以所有的实验组都是可以比较的；第三，由于所有的细胞岛在同一张芯片上，这样在后期处理过程中，操作简便而且成本较低。可以预见，这种技术在未来的生物研究中具有十分广阔的应用前景。SAMcell芯片技术已经成为了生物学家们在研究基因功能时的得力助手，但目前都是应用于转染核酸，对于转染其他物质如蛋白等未有研究。
发明内容
本发明的一个目的是提供自组装细胞芯片的应用。
本发明提供的自组装细胞芯片在转染蛋白质或化合物中的应用；所述自组装细胞芯片包括基底，在所述基底上设有用于固定所述蛋白质或化合物的区域；在所述基底上除用于固定所述蛋白质或化合物的区域外的其他区域覆盖抑制细胞生长的聚-N-异丙基丙烯酰胺膜。
上述应用中，所述蛋白质为表皮生长因子或转化生长因子β；所述化合物为G418。
本发明的另一个目的是提供一种定点转染蛋白质或化合物的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1）将待转染物质通过明胶包裹得到转染复合物；
所述待转染物质为蛋白质或化合物；
2）将所述转染复合物固定到自组装细胞芯片上，得到固定待转染物质的芯片；
所述自组装细胞芯片包括基底，在所述基底上设有用于固定所述转染蛋白质或化合物的区域；在所述基底上除用于固定所述转染蛋白质或化合物的区域外的其他区域覆盖抑制细胞生长的聚-N-异丙基丙烯酰胺膜；
3）将目的细胞接种到所述固定待转染物质的芯片上，培养；实现所述待转染物质转染到所述目的细胞中。
上述方法中，
步骤1）中，所述将待转染物质通过明胶包裹得到转染复合物的方法包括如下步骤：将待转染物质溶液与明胶溶液混匀，孵育，得到转染复合物；
步骤2）中，所述将所述转染复合物固定到自组装细胞芯片上的方法包括如下步骤：先将所述转染复合物点样在所述自组装细胞芯片上的用于固定所述转染蛋白质或化合物的区域，再进行干燥。
上述方法中，
所述待转染物质为蛋白质或化合物；
所述待转染物质溶液为待转染物质水溶液；
所述明胶溶液由明胶、纤维连接蛋白和水组成，其中明胶在溶液中的质量百分含量为0.4%，纤维连接蛋白在溶液中的质量百分含量为0.01%。
上述方法中，
步骤1）中，所述蛋白质与所述明胶的质量比为1：1×106-1×108，所述蛋白质与所述明胶的质量比具体为1:4×106；
所述化合物与所述明胶的质量比为1:3-5，所述化合物与所述明胶的质量比具体为1:4；
步骤3）中，所述目的细胞和所述蛋白质的配比为1×104-1×107个：1纳克，所述目的细胞和所述蛋白质的配比具体为4×106个：1纳克；
所述目的细胞和所述化合物的配比为10-1×107个：1纳克，所述目的细胞和所述化合物的配比具体为20个：1纳克。
上述方法中，
步骤1）中，所述孵育的温度为25-28℃，所述孵育的时间为5min-30min；所述孵育的温度具体为25℃，所述孵育的时间具体为5min；
步骤2）中，所述干燥的时间为2-20h；所述干燥的时间具体为12h；
步骤3）中，所述培养的温度为34-45℃；所述培养时间为12-48小时；所述培养的温度具体为37℃；所述培养时间具体为24小时。
上述方法中，
所述蛋白质为表皮生长因子或转化生长因子β；
所述化合物为G418；
所述目标细胞为Hela细胞或含有GFP蛋白表达的Hela细胞，其中在本发明的实施例中，含有GFP蛋白表达的Hela细胞为Hela-H2B-GFP。
本发明的实验证明，SAMcell芯片可以作为蛋白质或化合物的有效载体而实现定点转染，相对于传统的利用多孔板的方法有以下优点：
1、采用聚合物包裹蛋白质或化合物，使得这些分子有控制地释放到周围的溶液中，而不对相邻的点阵造成交叉污染，达到定点释放的目的；
2、蛋白质或化合物在点制的区域集中作用细胞，作用效果明显；
3、所有的细胞都在相同的培养条件下孵育，实验组的平行性会非常好；
4、芯片作为载体更加集成化，使得蛋白质或者化合物的用量大大降低；
5、芯片是一个开放性体系，后期处理过程中，操作简便而且成本较低。
SAMcell芯片转染蛋白质或化合物的方法相对于之前的核酸芯片具有如下优点：
1、蛋白质或化合物更容易进入细胞或者直接作用于细胞表面，所以不需要用转染试剂，成本大大降低；
2、由于该种方法不需要使用转染试剂，可以采用更加低温进行储存，比如-20度，延长了保存期；
3、蛋白质或化合物比核酸见效快，因此通常24小时后就可以观测表型，而不用等到48或96小时后，缩短了实验周期。
总之，本发明发现SAMcell芯片可以用来定点转染蛋白质或化合物，该方法有机结合了细胞芯片技术和定点转染技术，可以有效的应用于蛋白质或化合物的大规模筛选研究。
附图说明
图1为利用自组装细胞芯片转染蛋白质结果图
图2为利用自组装细胞芯片转染蛋白质结果统计图
图3为利用自组装细胞芯片转染化合物结果图
图4为利用自组装细胞芯片转染化合物结果统计图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的SAMcell芯片（自组装细胞芯片）包括基底，在基底上设有用于固定所述转染蛋白质或化合物的区域；在基底上除用于固定所述转染蛋白质或化合物的区域外的其他区域覆盖抑制细胞生长的聚-N-异丙基丙烯酰胺膜（PNI膜）；具体构建方法如下：
用去垢剂和超纯水清洗实验室常用的玻片（25毫米*25毫米）表面。在其表面滴一层聚合物薄膜，使用65微升6%（W/V）的Poly（N-isopropylacrylamide）乙醇溶液，干燥后，在室温保存12小时。根据实验室要求制备硅片掩模，利用微加工技术可在其上刻出微孔，得到SAMcell芯片（自组装细胞芯片），该方法也在专利申请200910210565.1中公开。
下述实施例中所用的Hela-H2B-GFP细胞记载在如下文献中，B.Neumann,etal.,"Phenotypicprofilingofthehumangenomebytime-lapsemicroscopyrevealscelldivisiongenes,"Nature,vol.464,pp.721-7,Apr12010，公众可从苏州吉诺瑞生物科技有限公司获得。
实施例1、利用SAMcell芯片技术转染蛋白质
在现代生物领域，科学家们对蛋白质以及多肽的功能尤其关注，本研究中试图将SAMcell芯片技术应用在筛选蛋白质以及多肽的领域。
表皮生长因子（EGF）（SinoBio公司，货号C029A）和转化生长因子（TGF）β（CellSignalingTechnology公司，货号5154LC）
EGF溶液为将表皮生长因子（EGF）溶解在高纯水中得到的溶液；
TGF液为将转化生长因子（TGF）β溶解在高纯水中得到的溶液。
1、取10ul浓度为1ng/mL的EGF溶液和10ul浓度为1ng/mL的TGF溶液分别加入96孔板的每个孔中；再向上述处理后的每个孔中加入10ul明胶溶液（该溶液由明胶（Sigma公司、货号G-9391）、纤维连接蛋白（Sigma公司、货号F0895）和水组成，其中明胶在溶液中的质量百分含量为0.4%，纤维连接蛋白在溶液中的质量百分含量为0.01%）；蛋白EGF或TFG与明胶的质量比均为1:4×106；充分混匀，室温（25℃）孵育5分钟，得到混合液即为反向转染蛋白质EGF复合物和反向转染蛋白质TGF复合物。
2、利用点样仪将反向转染蛋白质EGF复合物和反向转染蛋白质TGF复合物分别交错地点在SAMcell芯片的用于固定蛋白质的部分区域，其余部分不点任何物质作为对照，干燥过夜（室温，大于12h），得到固定蛋白质的芯片；
3、将Hela-H2B-GFP细胞消化并吹打均匀，然后接种于固定蛋白质的芯片上（细胞和蛋白质的配比为4×106个：1纳克），37℃温度培养24h，得到转染蛋白质的芯片；实现蛋白质转染到Hela-H2B-GFP细胞中，其中，EGF/TFG、明胶、细胞的配比为0.025ng:1×105ng：1×105个；
4、将转染蛋白质的芯片在室温（25℃）放置5分钟，PNI膜脱落，然后使用PBS水溶液（pH7.4）清洗3次，得到含有转染蛋白质细胞小岛的待检测芯片。由于只在芯片上的某些位置上进行蛋白质点样，其余部分不点任何物质作为对照；因此，同一张芯片上既有转染了蛋白质的细胞小岛，又有未转染蛋白质的细胞小岛（对照组，Mock）。
将待检测芯片置于倒置荧光显微镜（Nikon,LH‐M100CB）下检测，在10倍物镜下观察绿色荧光。以未转染蛋白质的细胞小岛为阴性对照（mock）。
结果如图1所示，图中的绿色代表Hela-H2B-GFP细胞的细胞核；可以看出，表皮生长因子（EGF）和转化生长因子（TGF）可以显著促进细胞的生长，在对应含有两种生长因子的位置上，细胞的生长速度明显快于对照组。
统计每个小岛内的细胞个数，结果如图2所示。
以阴性对照（Mock）细胞小岛的作为1，其余各小岛中的相对细胞个数为其余各小岛中的细胞个数/阴性对照（Mock）细胞小岛。
转染表皮生长因子（EGF）细胞小岛的相对细胞个数为3.8；
转染转化生长因子（TGF）细胞小岛的相对细胞个数为2.7；
阴性对照（Mock）细胞小岛的相对细胞个数为1.0。
从此实验结果可以得出以下结论：
1、在芯片上点有EGF或者TGF的区域细胞明显生长旺盛，而没有点蛋白的区域（对照组）生长较慢。说明SAMcell芯片技术可以有效应用于转染蛋白质，并且不会干扰到相邻的位点。
2、蛋白的使用量非常小，只有纳克级别，大大节约了用量，而得到的效果是非常显著的。
3、实验过程中并没有使用转染试剂帮助转染，而蛋白可以很好的作用并起到效果，大大降低了成本。
4、接种细胞后24小时就可以看到明显的效果，缩短了实验周期。
5、从图1和图2可以看出，同一张芯片上平行的三组复孔平行性很好。
实施例2、利用SAMcell芯片技术转染化合物G418
目前通过筛选化学物质对细胞各种表型的影响，来确定该化学物质是否可以成为化合物，SAMcell芯片技术应用于化合物筛选。实验中选取G418（Cellgrog公司，货号30-234-CI）作为测试化合物，G418是一种抗生素，它也被称作遗传霉素，G418一般用于对含有特定抗性基因的稳定细胞株的筛选，普通的细胞没有该抗性基因，所以它对普通的细胞具有致死效果。
G418溶液：将G418溶于PBS水溶液（pH7.4）中，得到G418溶液，G418在G418溶液中的终浓度为1mg/mL。
1、取10ul浓度为1mg/mL的G418溶液加入96孔板的每个孔中；再向上述处理后的每个孔中加入10ul明胶溶液（该溶液由明胶（Sigma公司、货号G-9391）、纤维连接蛋白（Sigma公司、货号F0895）和水组成，其中明胶在溶液中的质量百分含量为0.4%，纤维连接蛋白在溶液中的质量百分含量为0.01%），且G418和明胶的质量比为1:4，充分混匀；室温（25℃）孵育5分钟，得到混合液即为转染G418复合物；
2、利用点样仪将转染G418复合物（混合液）交错地点在SAMcell芯片的用于固定化合物的区域，干燥过夜（12h），得到固定G418的芯片；
3、将Hela-H2B-GFP细胞接种到固定G418的芯片上（细胞和G418的配比：20个细胞/1纳克），37℃温度培养48h。得到转染G418的芯片；实现G418转染到Hela-H2B-GFP细胞中，其中，明胶、G418和细胞的配比为1×105ng：2.5×104ng:5×105个；
4、将转染G418的芯片在室温（25℃）放置5分钟，PNI膜脱落，然后使用PBS水溶液（pH7.4）清洗3次，得到含有转染G418细胞小岛的待检测芯片。其中未加入G418为阴性对照。由于只在芯片上的某些位置上进行化合物点样，其余部分不点任何物质作为对照；因此，同一张芯片上既有转染了化合物的细胞小岛，又有未转染化合物的细胞小岛（对照组，Mock）。
将待检测芯片置于倒置荧光显微镜（Nikon,LH-M100CB）下检测，在10倍物镜下观察绿色荧光。以未转染化合物的细胞小岛为阴性对照（Mock）；
结果如图3所示（其中左图为点样示意图，右图为荧光照片），左图中白色代表转染G418混合物，黑色代表没有加入G418的阴性对照(Mock)；从图中可以看出，含有G418的位置，细胞生存数量相对对照组很少，而没有G418的细胞就生长得很好，说明了SAMcell芯片可以有效地转染G418这种化学物质，而且基本上没有交叉污染的情况出现。
统计每个小岛内的细胞个数，结果如图4所示。
转染G418细胞小岛的相对细胞个数为0.1（图中纵坐标为相对细胞个数）；
阴性对照（Mock）细胞小岛的相对细胞个数为1.0（图中纵坐标为相对细胞个数）。
从此实验结果可以得出以下结论：
1、在芯片上点有G418的区域细胞明显死亡率高，而没有点G418的区域（对照组）生长状态良好。说明SAMcell芯片技术可以有效应用于转染化合物，并且不会干扰到相邻的位点。
2、化合物的使用量非常小，只有微克级别，大大节约了用量，而得到的效果是非常显著的。
3、实验过程中并没有使用转染试剂帮助转染，而化合物可以很好的作用并起到效果，大大降低了成本。
4、从图3和图4可以看出，同一张芯片上平行的副孔之间平行性很好。
综上所述，对以SAMcell芯片技术为基础的转染体系进行开发，并发现这一转染体系可以应用于转染siRNA、质粒、蛋白质或多肽和化学物质等领域，从而成为核酸、蛋白质与多肽和生物化学等诸多领域中进行高通量筛选的有力工具。
Claims (4)
1.一种定点转染蛋白质的方法，包括如下步骤：
1)将待转染物质通过明胶包裹得到转染复合物；
所述待转染物质为蛋白质；
2)将所述转染复合物固定到自组装细胞芯片上，得到固定待转染物质的芯片；
所述自组装细胞芯片包括基底，在所述基底上设有用于固定所述转染蛋白质的区域；在所述基底上除用于固定所述转染蛋白质的区域外的其他区域覆盖抑制细胞生长的聚-N-异丙基丙烯酰胺膜；
3)将目的细胞接种到所述固定待转染物质的芯片上，培养；实现所述待转染物质转染到所述目的细胞中；
步骤1)中，所述将待转染物质通过明胶包裹得到转染复合物的方法包括如下步骤：将待转染物质溶液与明胶溶液混匀，孵育，得到转染复合物；
步骤2)中，所述将所述转染复合物固定到自组装细胞芯片上的方法包括如下步骤：先将所述转染复合物点样在所述自组装细胞芯片上的用于固定所述转染蛋白质的区域，再进行干燥；
所述待转染物质溶液为待转染物质水溶液；
所述明胶溶液由明胶、纤维连接蛋白和水组成，其中明胶在溶液中的质量百分含量为0.4％，纤维连接蛋白在溶液中的质量百分含量为0.01％；
步骤1)中，所述蛋白质与所述明胶的质量比为1：1×106-1×108；
步骤3)中，所述目的细胞和所述蛋白质的配比为1×104-1×107个：1纳克；
所述蛋白质为表皮生长因子或转化生长因子β；
所述目标细胞为Hela细胞或含有GFP蛋白表达的Hela细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述蛋白质与所述明胶的质量比为1:4×106；
步骤3)中，所述目的细胞和所述蛋白质的配比为4×106个：1纳克。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述孵育的温度为25-28℃，所述孵育的时间为5min-30min；步骤2)中，所述干燥的时间为2-20h；步骤3)中，所述培养的温度为34-45℃；所述培养时间为12-48小时。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述孵育的温度为25℃，所述孵育的时间为5min；
步骤2)中，所述干燥的时间为12h；
步骤3)中，所述培养的温度为37℃；所述培养时间为24小时。
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