CN105463119A - 利用SAMcell芯片检测物质对细胞增殖影响的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用SAMcell芯片检测物质对细胞增殖影响的方法。本发明公开的方法包括：1)将待测物质和对照物质分别与明胶溶液孵育，得到待测转染复合物和对照转染复合物；明胶溶液由明胶、纤维连接蛋白和水组成，明胶溶液中明胶的质量百分含量为0.25％-0.4％，纤维连接蛋白的质量百分含量为0.01％；2)将待测转染复合物和对照转染复合物分别固定到SAMcell芯片上，得到固定待测物质的芯片和固定对照物质的芯片；3)将细胞接种到固定待测物质的芯片和固定对照物质的芯片上进行培养，根据相同时间下细胞的数目确定待测物质对细胞增殖的影响。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中利用SAMcell芯片检测物质对细胞增殖影响的方法。
背景技术
细胞增殖是活细胞的重要生理功能之一，是生物体的重要生命特征，是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。细胞增殖已成为评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。细胞增殖的研究方法有很多，主要包括：BrdU，EdU，CCK8等方法。其中EdU检测方法是最新的细胞增殖检测方法。
EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其连有的炔烃基团在天然化合物中很少见，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中，基于荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性，广泛应用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA损伤修复、病毒繁殖等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及各种药物的细胞增殖及活力筛选实验。
目前，已经开发了一种SAMcell芯片(Self-assembledCellMicroarray，自组装细胞芯片)，该芯片在专利申请200910210565.1中公开。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何利用SAMcell芯片检测待测物质对细胞增殖的影响。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了利用SAMcell芯片检测或辅助检测待测物质对细胞增殖影响的方法。
本发明所提供的利用SAMcell芯片检测或辅助检测待测物质对细胞增殖影响的方法，包括：
1)将待测物质与明胶溶液孵育或将所述待测物质与所述明胶溶液和转染试剂孵育，得到待测转染复合物；将对照物质与所述明胶溶液孵育或将所述对照物质与所述明胶溶液和所述转染试剂孵育，得到对照转染复合物；
所述明胶溶液由明胶、纤维连接蛋白和水组成，所述明胶溶液中明胶的质量百分含量为0.25％-0.4％，纤维连接蛋白的质量百分含量为0.01％；所述对照物质对细胞的增殖无影响；
2)将所述待测转染复合物固定到SAMcell芯片上，得到固定待测物质的芯片；将所述对照转染复合物固定到SAMcell芯片上，得到固定对照物质的芯片；
3)将细胞接种到所述固定待测物质的芯片和所述固定对照物质的芯片上，在相同条件下培养，分别得到固定待测物质的细胞培养芯片和固定对照物质的细胞培养芯片，将所述固定待测物质的细胞培养芯片和所述固定对照物质的细胞培养芯片分别命名为芯片1和芯片2；统计所述芯片1和所述芯片2上的细胞数目，确定所述待测物质对所述细胞增殖的影响：如所述芯片1上的细胞数目显著大于所述芯片2上的细胞数目，所述待测物质对所述细胞的增殖具有促进作用或候选具有促进作用；如所述芯片1上的细胞数目显著小于所述芯片2上的细胞数目，所述待测物质对所述细胞的增殖具有抑制作用或候选具有抑制作用；如所述芯片1上的细胞数目等于所述芯片2上的细胞数目，所述待测物质对所述细胞的增殖没有影响或候选没有影响。
上述方法中，所述待测物质与所述对照物质均可为siRNA、质粒、DNA片段、蛋白质、多肽或小分子化合物。
上述方法中，所述待测物质可为siRNA，所述待测物质与所述明胶溶液的比例可为(1-5)μg：7.5μl(如2μg：7.5μl)。所述对照物质可为序列1和序列2所示的siRNA。
上述方法中，所述待测物质可为蛋白质，所述待测物质与所述明胶溶液的比例可为(1×10-3-1)ng：10μl(如1×10-2ng：10μl)。所述对照物质可为BSA。
上述方法中，所述待测物质可为小分子化合物，所述待测物质与所述明胶溶液的比例为(1×10-3-1)μg：10μl(如5×10-2μg：10μl)。所述对照物质可为DMSO。
上述方法中，步骤1)中所述孵育均可在室温下进行；
和/或，所述转染试剂可为Lipofectamine2000转染试剂。
上述方法中，步骤1)中所述孵育的时间可为3-10分钟(如5分钟)。
上述方法中，步骤2)中，所述将所述转染复合物固定到SAMcell芯片上可包括将所述转染复合物点在用于固定所述转染复合物的区域(即没有被聚-N-异丙基丙烯酰胺膜(PNI膜)薄膜的区域)；所述将所述对照转染复合物固定到SAMcell芯片上可包括将所述对照转染复合物点在用于固定所述转染复合物的区域(即没有被聚-N-异丙基丙烯酰胺膜(PNI膜)薄膜的区域)。
上述方法中，所述方法还可包括将所述固定待测物质的芯片进行干燥和将所述固定对照物质的芯片进行干燥。所述干燥均可在室温下进行，所述干燥的时间均可大于12小时。
上述方法中，所述细胞可为动物细胞或植物细胞。所述动物细胞可为哺乳动物细胞(如Huh7细胞、SMMC-7721细胞或HepG2细胞)。
上述方法还可包括将所述固定待测物质的芯片在室温下放置去除聚-N-异丙基丙烯酰胺膜(PNI膜)薄膜和/或将所述固定对照物质的芯片在室温下放置去除聚-N-异丙基丙烯酰胺膜(PNI膜)薄膜。所述放置时间均可为5分钟。
所述方法还可包括用PBS对所述固定待测物质的芯片和/或所述固定对照物质的芯片进行清洗。
本发明中，步骤3)中所述培养在所述细胞的适宜生长条件下进行，所述培养的时间可为24-72小时，如48小时。
本发明中，处于增殖时期的细胞数目可用Edu进行检测。
实验证明，表明，利用SAMcell芯片检测或辅助检测待测物质对细胞增殖影响的方法可以检测VCR对细胞增殖的抑制和促进作用：如CDK6的siRNA对细胞增殖的抑制作用，IGF-1蛋白对细胞增殖的促进作用以及VCR对细胞增殖的抑制作用。
本发明的方法有机结合了细胞芯片技术、定点转染技术和荧光标记技术，可以方便地、有效地、准确地检测细胞增殖并应用于大规模筛选研究。
附图说明
图1为利用SAMcell芯片技术检测CDK6siRNA对细胞增殖的影响。其中A为荧光显微镜下照片，Hoechst为细胞核染料Hoechst33342对细胞核染色的结果，用来指示细胞总数；B为定量结果。
图2为利用SAMcell芯片技术检测IGF-1蛋白对细胞增殖的影响。其中A为荧光显微镜下照片，Hoechst为细胞核染料Hoechst33342对细胞核染色的结果，用来指示细胞总数；B为定量结果。
图3为利用SAMcell芯片技术检测VCR对细胞增殖的影响。其中A为荧光显微镜下照片，Hoechst为细胞核染料Hoechst33342表示对细胞核染色的结果，用来指示细胞总数；B为定量结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的SAMcell芯片(自组装细胞芯片)包括基底，在基底上设有用于固定所述转染siRNA的区域；在基底上除用于固定所述转染siRNA的区域外的其他区域覆盖抑制细胞生长的聚-N-异丙基丙烯酰胺膜(PNI膜)；具体构建方法如下：
用去垢剂和超纯水清洗实验室常用的玻片(25毫米*25毫米)表面。在其表面滴一层聚合物薄膜，使用65微升6％(W/V)的Poly(N-isopropylacrylamide)乙醇溶液，干燥后，在室温保存12小时。根据实验室要求制备硅片掩模，利用微加工技术可在其上刻出微孔，得到SAMcell芯片(自组装细胞芯片)，SAMcell芯片的制备方法在专利申请200910210565.1中公开。
实施例1、利用SAMcell芯片技术转染siRNA检测细胞增殖
实验重复三次，每次重复实验的步骤如下(将随机siRNA作为阴性对照，随机siRNA序列为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3’(序列1)；
5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3’(序列2))：
1、在96孔板的每个孔中加入3μl含蔗糖的Opti-MEM和2.5μlLipofectamine2000转染试剂(Invitrogen；货号11668-019)，充分混匀，室温孵育5分钟；再向上述处理后的每个孔中加入2μg的siRNA(该siRNA的靶基因为CDK6，将其命名为CDK6siRNA，其序列为：5’-GUUUGUAACAGAUAUCGAUtt-3’(序列3)；
5’-AUCGAUAUCUGUUACAAACtt-3’(序列4)。)，充分混匀，室温孵育20分钟；最后向上述处理后的每个孔中加入7.5μl的明胶溶液(该溶液由明胶(Sigma公司、货号G-9391)、纤维连接蛋白(Sigma公司、货号F0895)和水组成，其中明胶在溶液中的质量百分含量为0.25％，纤维连接蛋白在溶液中的质量百分含量为0.01％)，充分混匀，室温孵育5分钟。得到混合液即为反向转染siRNA复合物。
2、利用点样仪将反向转染siRNA复合物分别交错地点在SAMcell芯片的没有被聚合物薄膜的部分区域，干燥过夜(室温，大于12h)，得到固定siRNA复合物的芯片。
3、将Huh7细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，3131C0001000700182)消化并吹打均匀，然后接种于固定siRNA复合物的芯片上，37℃温度培养48h，得到转染siRNA复合物的细胞芯片。
4、将转染siRNA复合物的细胞芯片在室温(25℃)放置5分钟，聚合物薄膜脱落，然后使用PBS水溶液(pH7.4)清洗3次，得到待检测的细胞芯片。
5、细胞增殖检测实验：
5.1、在步骤4的每张待检测的细胞芯片加入1ml包含EdU(终浓度50μM)的细胞培养基，在细胞培养箱中孵育2小时，得到固定siRNA的细胞培养芯片。
5.2、加入1mlPBS清洗2-3次，每张芯片加入1ml细胞固定液(含4％多聚甲醛的PBS溶液)，室温孵育30分钟后，弃细胞固定液。
5.3、加入1ml甘氨酸溶液(2mg/mL)，摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；加入1mlPBS，摇床清洗5分钟，弃PBS。
5.4、加入1ml渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)，摇床孵育10分钟；加入1mlPBS，摇床清洗5分钟，弃PBS。
5.5、加入500μl的1×Apollo染色反应液，避光、室温、摇床孵育30分钟后，弃染色反应液。
5.6、加入1ml渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)，摇床清洗2-3次，每次10分钟，弃渗透剂。
5.7、加入500μL甲醇清洗1次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。
5.8、加入500μL1×Hoechst33342反应液，避光、室温、摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；加入1mlPBS清洗1-3次。
将待检测芯片置于倒置荧光显微镜(Nikon,LH-M100CB)下检测，在10倍物镜下观察荧光。结果如图1所示，图中的红色代表增殖期细胞的细胞核，蓝色代表所有细胞的细胞核。可以看出，与对照(处于增殖时期的细胞的百分比为25±6.2％)相比，转染了CDK6的siRNA后，细胞增殖活力降低，处于增殖时期的细胞的百分比7±2.5％，为对照的0.28倍。在相应位置上的细胞小岛，增殖期细胞的比例显著降低。表明，利用本发明的方法可以检测CDK6的siRNA对细胞增殖的抑制作用。
实施例2、利用SAMcell芯片技术转染蛋白检测细胞增殖
实验重复三次，每次重复实验的步骤如下(将BSA作为阴性对照)：
1、取10μlIGF-1蛋白(上海紫一试剂厂)浓度为1ng/mL的IGF-1蛋白溶液(IGF-1蛋白溶液溶剂为水)加入96孔板的每个孔中；再向上述处理后的每个孔中加入10μl明胶溶液(该溶液由明胶(Sigma公司、货号G-9391)、纤维连接蛋白(Sigma公司、货号F0895)和水组成，其中明胶在溶液中的质量百分含量为0.4％，纤维连接蛋白在溶液中的质量百分含量为0.01％)，充分混匀，室温(25℃)孵育5分钟，得到混合液即为反向转染蛋白复合物。
2、利用点样仪将反向转染蛋白复合物分别交错地点在SAMcell芯片的没有被聚合物薄膜的部分区域，干燥过夜(室温，大于12h)，得到固定蛋白复合物的芯片。
3、将SMMC-7721细胞(中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，3111C0001CCC000087)消化并吹打均匀，然后接种于固定蛋白复合物的芯片上，37℃温度培养48h，得到转染蛋白复合物的细胞芯片。
4、将转染蛋白复合物的细胞芯片在室温(25℃)放置5分钟，聚合物薄膜脱落，然后使用PBS水溶液(pH7.4)清洗3次，得到待检测的细胞芯片。
5、细胞增殖检测实验：
5.1、在步骤4的每张待检测的细胞芯片加入1ml包含EdU(终浓度50μM)的细胞培养基，在细胞培养箱中孵育2小时，得到固定IGF-1的细胞培养芯片。
5.2、加入1mlPBS清洗2-3次，每张芯片加入1ml细胞固定液(含4％多聚甲醛的PBS溶液)，室温孵育30分钟后，弃细胞固定液。
5.3、加入1ml甘氨酸溶液(2mg/mL)，摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；加入1mlPBS，摇床清洗5分钟，弃PBS。
5.4、加入1ml渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)，摇床孵育10分钟；加入1mlPBS，摇床清洗5分钟，弃PBS。
5.5、加入500μl的1×Apollo染色反应液，避光、室温、摇床孵育30分钟后，弃染色反应液。
5.6、加入1ml渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)，摇床清洗2-3次，每次10分钟，弃渗透剂。
5.7、加入500μL甲醇清洗1次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。
5.8、加入500μL1×Hoechst33342反应液，避光、室温、摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；加入1mlPBS清洗1-3次。
将待检测芯片置于倒置荧光显微镜(Nikon,LH-M100CB)下检测，在10倍物镜下观察荧光。结果如图2所示，图中的红色代表增殖期细胞的细胞核，蓝色代表所有细胞的细胞核。与对照(处于增殖时期的细胞的百分比为9±1.6％)相比，转染了IGF-1蛋白后，细胞增殖活力升高，处于增殖时期的细胞的百分比为55±7.2％，为对照的6.11倍。在相应位置上的细胞小岛，增殖期细胞的比例显著升高。表明，利用本发明的方法可以检测IGF-1蛋白对细胞增殖的促进作用。
实施例3、利用SAMcell芯片技术转染小分子化合物检测细胞增殖
实验重复三次，每次重复实验的步骤如下，将DMSO作为阴性对照：
1、取10μlVCR(长春新碱；YSRIBIO)浓度为5μg/mL的VCR溶液(VCR溶液的溶剂为DMSO)加入96孔板的每个孔中；再向上述处理后的每个孔中加入10μl明胶溶液(该溶液由明胶(Sigma公司、货号G-9391)、纤维连接蛋白(Sigma公司、货号F0895)和水组成，其中明胶在溶液中的质量百分含量为0.4％，纤维连接蛋白在溶液中的质量百分含量为0.01％)，充分混匀，室温(25℃)孵育5分钟，得到混合液即为反向转染小分子化合物复合物。
2、利用点样仪将反向转染小分子化合物复合物分别交错地点在SAMcell芯片的没有被聚合物薄膜的部分区域，干燥过夜(室温，大于12h)，得到固定小分子化合物复合物的芯片。
3、将HepG2细胞(中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；3111C0001CCC000035)消化并吹打均匀，然后接种于固定小分子化合物复合物的芯片上，37℃温度培养48h，得到转染小分子化合物复合物的细胞芯片。
4、将转染小分子化合物复合物的细胞芯片在室温(25℃)放置5分钟，聚合物薄膜脱落，然后使用PBS水溶液(pH7.4)清洗3次，得到待检测的细胞芯片。
5、细胞增殖检测实验：
5.1、在步骤4的每张待检测的细胞芯片加入1ml包含EdU(终浓度50μM)的细胞培养基，在细胞培养箱中孵育2小时，得到固定VCR的细胞培养芯片。
5.2、加入1mlPBS清洗2-3次，每张芯片加入1ml细胞固定液(含4％多聚甲醛的PBS溶液)，室温孵育30分钟后，弃细胞固定液。
5.3、加入1ml甘氨酸溶液(2mg/mL)，摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；加入1mlPBS，摇床清洗5分钟，弃PBS。
5.4、加入1ml渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)，摇床孵育10分钟；加入1mlPBS，摇床清洗5分钟，弃PBS。
5.5、加入500μl的1×Apollo染色反应液，避光、室温、摇床孵育30分钟后，弃染色反应液。
5.6、加入1ml渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)，摇床清洗2-3次，每次10分钟，弃渗透剂。
5.7、加入500μL甲醇清洗1次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。
5.8、加入500μL1×Hoechst33342反应液，避光、室温、摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；加入1mlPBS清洗1-3次。
将待检测芯片置于倒置荧光显微镜(Nikon,LH-M100CB)下检测，在10倍物镜下观察荧光。结果如图3所示，图中的红色代表增殖期细胞的细胞核，蓝色代表所有细胞的细胞核。与对照(处于增殖时期的细胞的百分比为45±11％)相比，转染了VCR后，细胞增殖活力降低处于增殖时期的细胞的百分比为22±8％，为对照的0.49倍。在相应位置上的细胞小岛，增殖期细胞的比例显著降低。表明，利用本发明的方法可以检测VCR对细胞增殖的抑制作用。
Claims (10)
1.利用SAMcell芯片检测或辅助检测待测物质对细胞增殖影响的方法，包括：
1)将待测物质与明胶溶液孵育或将所述待测物质与所述明胶溶液和转染试剂孵育，得到待测转染复合物；将对照物质与所述明胶溶液孵育或将所述对照物质与所述明胶溶液和所述转染试剂孵育，得到对照转染复合物；
所述明胶溶液由明胶、纤维连接蛋白和水组成，所述明胶溶液中明胶的质量百分含量为0.25％-0.4％，纤维连接蛋白的质量百分含量为0.01％；所述对照物质对细胞的增殖无影响；
2)将所述待测转染复合物固定到SAMcell芯片上，得到固定待测物质的芯片；将所述对照转染复合物固定到SAMcell芯片上，得到固定对照物质的芯片；
3)将细胞接种到所述固定待测物质的芯片和所述固定对照物质的芯片上，在相同条件下培养，分别得到固定待测物质的细胞培养芯片和固定对照物质的细胞培养芯片，将所述固定待测物质的细胞培养芯片和所述固定对照物质的细胞培养芯片分别命名为芯片1和芯片2；统计所述芯片1和所述芯片2上的细胞数目，确定所述待测物质对所述细胞增殖的影响：如所述芯片1上的细胞数目大于所述芯片2上的细胞数目，所述待测物质对所述细胞的增殖具有促进作用或候选具有促进作用；如所述芯片1上的细胞数目小于所述芯片2上的细胞数目，所述待测物质对所述细胞的增殖具有抑制作用或候选具有抑制作用；如所述芯片1上的细胞数目等于所述芯片2上的细胞数目，所述待测物质对所述细胞的增殖没有影响或候选没有影响。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测物质与所述对照物质均为siRNA、质粒、DNA片段、蛋白质、多肽或小分子化合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述待测物质为siRNA，所述待测物质与所述明胶溶液的比例为(1-5)μg：7.5μl。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述待测物质为蛋白质，所述待测物质与所述明胶溶液的比例为(1×10-3-1)ng：10μl。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述待测物质为小分子化合物，所述待测物质与所述明胶溶液的比例为(1×10-3-1)μg：10μl。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述孵育均在室温下进行；
和/或，所述转染试剂为Lipofectamine2000转染试剂。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述孵育的时间为3-10分钟。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述将所述转染复合物固定到SAMcell芯片上包括将所述转染复合物点在用于固定所述转染复合物的区域；所述将所述对照转染复合物固定到SAMcell芯片上包括将所述对照转染复合物点在用于固定所述转染复合物的区域。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述细胞为动物细胞或植物细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述动物细胞为哺乳动物细胞。
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