CN106117307A - 使用软刻芯片改变结晶基底粗糙度用于蛋白质结晶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种使用软刻芯片改变结晶基底粗糙度用于蛋白质结晶的方法，首先设计和制作满足蛋白质结晶要求的PDMS芯片，然后将蛋白质结晶溶液滴加在PDMS表面，静置结晶。本发明通过设计PDMS芯片实现可控和均一粗糙度的结晶界面，来提高基底表面蛋白质形核几率，从而达到提高蛋白质结晶成功率的目的。通过本发明，可使蛋白质结晶条件筛选成功率提高1～5倍。

Description

使用软刻芯片改变结晶基底粗糙度用于蛋白质结晶的方法
技术领域
本发明涉及一种使用软刻芯片技术改造蛋白质结晶基底的方法，特别是通过软刻技术改变结晶界面粗糙度来提高蛋白质结晶成功率的方法。
背景技术
蛋白质是生命活动的执行者，其结构是功能研究的前提和基础，因此，蛋白质结构的解析对阐明其生物学功能具有非常重要的意义。目前，蛋白质结构数据库中，有88％以上的结构都是通过X-射线衍射技术获得的，而高质量的蛋白质晶体是通过X-射线衍射技术获得结构的前提和基础。目前，蛋白质结晶条件筛选成功率低是制约X-射线衍射技术发展的重要瓶颈，因此，如何提高蛋白质结晶成功率是亟待解决的重要问题。
形核是蛋白质结晶的第一步，也是最重要的一步。通常只有蛋白质溶液浓度达到过饱和才能逾越形核势垒，晶核才能形成，继而晶体才能生长。而对于一些比较珍贵的蛋白质样品，浓度很难达到过饱和，晶核不能形成，直接导致了结晶成功率低的问题。通过在结晶体系中直接引入异相核是一种提高结晶成功率的有效手段，蛋白质溶液不需要跨越形核势垒，就可以直接在异相核表面堆积，进而进行晶体生长。对结晶板表面进行改性处理是一种最为方便和快捷的提高蛋白质结晶成功率的方法，研究表明直接改变结晶界面的粗糙度会显著影响蛋白质结晶成功率。文献“Guo Y Z,Yin D C,Lu Q Q,et al.Enhancement ofnucleation during hanging drop protein crystallization using HF Treatment ofcover glasses[J].Cryst.Res.Technol,2010,45(2):158-166.”中报道，使用氢氟酸蚀刻盖玻片以改变其界面的粗糙度，在悬滴法中使用经过处理的盖玻片可以有效提高蛋白质结晶成功率。结晶界面表面粗糙度的大小对蛋白质结晶成功率影响十分显著，只有在结晶界面粗糙度合适的条件下，蛋白质结晶成功率才能显著提高。结晶界面表面粗糙度的改变都是在实验室通过化学反应的方法得到，如氢氟酸腐蚀等，在该结晶界面的表面粗糙度很难控制到均一的程度，结晶是蛋白质分子有序堆积的过程，粗糙度均一的结晶界面会更加有利于蛋白质结晶，因此，制备具有均一可控表面粗糙度的结晶板能显著促进蛋白质结晶。
微流控技术由于其具有高通量、集成化、低消耗等优点，在蛋白质微型化结晶中的应用具有重要地位。目前，已应用于微量蛋白质结晶与筛选的技术包括基于聚二甲基硅氧烷(Polydimethyl iloxane，PDMS)材料的微泵微阀技术等。在微流控芯片制作工艺中，通常采用模塑法中的软刻技术，利用PDMS材料制备出微米级的结构。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种使用软刻芯片改变结晶基底粗糙度用于蛋白质结晶的方法，基于表面粗糙度对蛋白质结晶的影响，及软刻技术可以在PDMS材料表面制作粗糙度可控和均一的基底，以此将该基底应用于蛋白质结晶条件的筛选，能够提高结晶成功率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案包括以下步骤：
第一步，制作PDMS芯片，包括以下步骤：
(1)在PDMS芯片界面上设计紧密排列的微柱阵列，每根微柱的直径为5～300μm，微柱的高度为5～300μm，微柱的间距为5～300μm；或者设计一系列有间隔的微柱阵列，阵列中每根微柱的直径在5～300μm之间，微柱的高度在5～300μm之间，微柱的间距为5～300μm之间，每组阵列中微柱在长1mm～1cm、宽1mm～1cm的区域内紧密排列，每组阵列间的间距为1mm～1cm；
(2)芯片制备，包括以下内容：
a)用98％浓硫酸和双氧水按照3：1的体积比配成洗液清洗单抛硅片，清洗后的硅片用超纯水冲洗，用无水乙醇和丙酮分别浸泡1min后再用超纯水冲洗，200℃烘干硅片上的水分，得到基片；
b)将阴性光刻胶倒在基片上，用涂膜仪涂布，形成均匀的光刻胶薄层；
c)将制备好的基片置于65～95℃烘干；
d)将烘干的基片在光刻机上曝光45s；
e)用显影剂对光刻处理的基片显影3min，吹干，得到制作PDMS芯片的模板；
(3)芯片制备，包括以下内容：
a)用三甲基氯硅烷蒸汽熏模板3min；
b)按照10：1的体积比量取PDMS预聚物和固化剂，混合均匀；
c)将混合均匀的PDMS预聚物和固化剂倾倒至模板上，抽真空脱气至其中无气泡；
d)将模板置于80℃环境中固化，得到刻有微柱阵列的PDMS；
e)将固化好的PDMS放置于无凹槽密封的蛋白质结晶板表面，备用；
第二步，配置浓度为0.001～1M、pH值在3～10的缓冲液，所述的缓冲液包括所有可以减少溶液体系内pH改变，维持体系酸碱度的溶液，用缓冲液来溶解蛋白质，使蛋白质在溶液中的终浓度达到1～100mg/ml，得到蛋白质溶液；
第三步，将结晶试剂与蛋白质溶液按照(0.01～50)：1的体积比混合，得到蛋白质结晶溶液体系；
第四步，将蛋白质结晶溶液滴加在PDMS表面，在0～60℃下静置1～720h结晶。
所述的缓冲液包括但不限于Tris系统、磷酸、碳酸、醋酸、柠檬酸盐、磷酸盐、柠檬酸、巴比妥酸、硼酸盐。
本发明的有益效果是：通过设计PDMS芯片实现可控和均一粗糙度的结晶界面，来提高基底表面蛋白质形核几率，从而达到提高蛋白质结晶成功率的目的。通过本发明，可使蛋白质结晶条件筛选成功率提高1～5倍。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明，本发明包括但不仅限于下述实施例。
本发明的技术方案提供一种通过使用软刻技术在PDMS表面构建可控和均一粗糙度的结晶表面来筛选蛋白质晶体的方法，具体的技术方案步骤如下：
第一步：PDMS芯片设计和制作：(1)PDMS芯片的设计：基于一般蛋白质分子及其聚合物的直径，我们在PDMS芯片界面上设计紧密排列的微柱阵列，其中每根微柱的直径在5～300μm之间，微柱的高度在5～300μm之间，微柱的间距为5～300μm之间；或者设计一系列有间隔的微柱阵列，阵列中每根微柱的直径在5～300μm之间，微柱的高度在5～300μm之间，微柱的间距为5～300μm之间，每组阵列中微柱在长1mm～1cm之间，宽度为1mm～1cm之间的区域内紧密排列，每组阵列间的间距为1mm～1cm；(2)芯片及模板制备：a)准备基片：用98％浓硫酸：双氧水按照体积比3：1的比例配成的洗液清洗单抛硅片，清洗后的硅片用超纯水冲洗，无水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超纯水冲洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蚀刻的基片；b)铺片：将阴性光刻胶倒在基片上，用涂膜仪涂布，形成均匀的光刻胶薄层，制备不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：将制备好的基片置于电热板上，65～95℃烘干；d)光刻：将烘干的基片在光刻机上曝光45s；e)显影：用显影剂对光刻处理的基片显影3min，吹干备用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制备：a)预处理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易与模板剥离；b)配制PDMS：按照体积比10：1称取PDMS预聚物(A胶)和固化剂(B胶)，用混匀机混合均匀；c)脱气：将混合均匀的PDMS混合物倾倒至模板上，抽真空脱气至其中无气泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加热，使其固化，得到刻有微柱阵列的PDMS；e)制备覆盖PDMS的结晶板：将固化好的PDMS放置于无凹槽密封的蛋白质结晶板表面，备用；
第二步：蛋白质溶液的配置：配置浓度为0.001～1M，pH值在3～10的缓冲液(指所有可以减少溶液体系内pH改变，维持体系酸碱度的溶液)，用缓冲液来溶解蛋白质，使蛋白质在溶液中的终浓度达到1～100mg/ml，得到蛋白质溶液；
第三步：加入结晶试剂，制备蛋白质结晶体系：将结晶试剂(指所有用于蛋白质结晶的试剂)与蛋白质溶液按照(0.01～50)：1体积比混合，得到蛋白质结晶溶液体系；
第四步：结晶：将蛋白质结晶溶液滴加在PDMS芯片表面，在0～60℃下静置1～720h结晶。在显微镜下观察，统计出现蛋白质晶体的条件数目。
所述的缓冲液指可以在一定程度上抵消、减轻外界环境变化例如外加强酸或强碱等对溶液酸碱度的影响，从而使溶液的pH值能够维持相对稳定的溶液。包括但不限于Tris系统、磷酸、碳酸、醋酸、柠檬酸盐、磷酸盐、柠檬酸、巴比妥酸、硼酸盐。
实施例1：蛋白酶K结晶条件的筛选
第一步：PDMS芯片设计和制作：(1)PDMS芯片的设计：在PDMS芯片界面上设计一系列紧密排列的微柱阵列，微柱的直径在5μm，微柱的高度在10μm，微柱的间距为100μm；(2)芯片及模板制备：a)准备基片：用98％浓硫酸：双氧水按照体积比3：1配成的洗液清洗单抛硅片，清洗后的硅片用超纯水冲洗，无水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超纯水冲洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蚀刻的基片；b)铺片：将阴性光刻胶倒在基片上，用涂膜仪涂布，形成均匀的光刻胶薄层，制备不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：将制备好的基片置于电热板上，65～95℃烘干；d)光刻：将烘干的基片在光刻机上曝光45s；e)显影：用显影剂对光刻处理的基片显影3min，吹干备用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制备：a)预处理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易与模板剥离；b)配制PDMS：按照体积比10:1称取PDMS预聚物(A胶)和固化剂(B胶)，用混匀机混合均匀；c)脱气：将混合均匀的PDMS混合物倾倒至模板上，抽真空脱气至其中无气泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加热，使其固化；e)制备覆盖PDMS的结晶板：将固化好的PDMS放置于无凹槽密封的蛋白质结晶板表面，备用；
第二步：将美国Sigma公司的蛋白酶K，按照终浓度为30mg/ml溶于pH为5，0.025MHEPES-Na缓冲液中，得到蛋白质溶液；
第三步：本实施例用Hampton公司的IndexTM试剂盒的96种结晶试剂筛选蛋白酶K晶体，将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为0.01：1滴加在PDMS无凹槽密封的蛋白质结晶板，得到蛋白质结晶体系；
第四步：将整个结晶体系置于50℃条件下静置2h结晶。显微镜下观察统计出现蛋白酶K晶体的条件数目。
经过统计得到如下结果：有56种结晶条件出现了蛋白酶K晶体，结晶成功率为58.33％。与现有的商业结晶板筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了1.3倍。
实施例2：溶菌酶蛋白结晶条件的筛选
第一步：PDMS芯片设计和制作：(1)PDMS芯片的设计：在PDMS芯片界面上设计微柱阵列在长度为1mm和宽度为0.5mm的区域内紧密排列，阵列间的间距为1mm，其中微柱的直径为50μm，微柱的高度为10μm，微柱的间距为100μm；(2)芯片及模板制备：a)准备基片：用98％浓硫酸：双氧水按照体积比3：1的比例配成的洗液清洗单抛硅片，清洗后的硅片用超纯水冲洗，无水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超纯水冲洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蚀刻的基片；b)铺片：将阴性光刻胶倒在基片上，用涂膜仪涂布，形成均匀的光刻胶薄层，制备不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：将制备好的基片置于电热板上，65～95℃烘干；d)光刻：将烘干的基片在光刻机上曝光45s；e)显影：用显影剂对光刻处理的基片显影3min，吹干备用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制备：a)预处理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易与模板剥离；b)配制PDMS：按照体积比10:1称取PDMS预聚物(A胶)和固化剂(B胶)，用混匀机混合均匀；c)脱气：将混合均匀的PDMS混合物倾倒至模板上，抽真空脱气至其中无气泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加热，使其固化；e)制备覆盖PDMS的结晶板：将固化好的PDMS放置于无凹槽密封的蛋白质结晶板表面，备用；
第二步：将日本Seikagaku公司的溶菌酶按照终浓度为10mg/ml溶于pH为4.6，0.1M的醋酸钠缓冲液中，得到蛋白质溶液；
第三步：将氯化钠溶液与蛋白质溶液按照体积比为0.1：1滴加在PDMS无凹槽密封的蛋白质结晶板，得到蛋白质结晶体系；
第四步：将整个结晶体系置于4℃条件下静置336h结晶。显微镜下观察统计出现溶菌酶蛋白晶体的条件数目。
经过统计得到如下结果：有64种结晶条件出现了溶菌酶蛋白晶体，结晶成功率为66.67％。与现有的商业结晶板筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了1.7倍。
实施例3：核糖核酸酶A结晶条件的筛选
第一步：PDMS芯片设计和制作：(1)PDMS芯片的设计：在PDMS芯片界面上设计一系列微柱阵列，每组微柱阵列在长度为1cm和宽度为1mm的区域内紧密排列，阵列间的间距为1mm，微柱的直径为30μm，微柱的高度为100μm，微柱的间距为20μm；(2)芯片及模板制备：a)准备基片：用98％浓硫酸：双氧水按照体积比3：1的比例配成的洗液清洗单抛硅片，清洗后的硅片用超纯水冲洗，无水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超纯水冲洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蚀刻的基片；b)铺片：将阴性光刻胶倒在基片上，用涂膜仪涂布，形成均匀的光刻胶薄层，制备不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：将制备好的基片置于电热板上，65～95℃烘干；d)光刻：将烘干的基片在光刻机上曝光45s；e)显影：用显影剂对光刻处理的基片显影3min，吹干备用，得到PDMS芯片的模板；(3)芯片制备：a)预处理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易与模板剥离；b)配制PDMS：按照体积比10:1称取PDMS预聚物(A胶)和固化剂(B胶)，用混匀机混合均匀；c)脱气：将混合均匀的PDMS混合物倾倒至模板上，抽真空脱气至其中无气泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加热，使其固化；e)制备覆盖PDMS的结晶板：将固化好的PDMS放置于无凹槽密封的蛋白质结晶板表面，备用；
第二步：将美国Sigma公司的核糖核酸酶A，按照终浓度为70mg/ml溶于pH为7，0.05M HEPES-Na缓冲液中，得到蛋白质溶液；
第三步：本实施例用Hampton公司的Crystal Screen和Crystal Screen 2试剂盒的98种结晶试剂筛选核糖核酸酶A晶体，将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为1：1滴加在PDMS无凹槽密封的蛋白质结晶板，得到蛋白质结晶体系；
第四步：将整个结晶体系置于20℃条件下静置72h结晶。显微镜下观察统计出现核糖核酸酶A晶体的条件数目。
经过统计得到如下结果：有42种结晶体系出现了核糖核酸酶A晶体，结晶成功率为43.75％。与现有的商业结晶板筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了4.7倍。
实施例4：纤维素酶结晶条件的筛选
第一步：PDMS芯片设计和制作：(1)PDMS芯片的设计：在PDMS芯片界面上设计紧密排列的微柱阵列，微柱的直径为100μm，微柱的高度为20μm，微柱的间距为50μm；(2)芯片及模板制备：a)准备基片：用98％浓硫酸：双氧水按照体积比3：1的比例配成的洗液清洗单抛硅片，清洗后的硅片用超纯水冲洗，无水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超纯水冲洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蚀刻的基片；b)铺片：将阴性光刻胶倒在基片上，用涂膜仪涂布，形成均匀的光刻胶薄层，制备不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：将制备好的基片置于电热板上，65～95℃烘干；d)光刻：将烘干的基片在光刻机上曝光45s；e)显影：用显影剂对光刻处理的基片显影3min，吹干备用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制备：a)预处理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易与模板剥离；b)配制PDMS：按照体积比10:1称取PDMS预聚物(A胶)和固化剂(B胶)，用混匀机混合均匀；c)脱气：将混合均匀的PDMS混合物倾倒至模板上，抽真空脱气至其中无气泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加热，使其固化；e)制备覆盖PDMS的结晶板：将固化好的PDMS放置于无凹槽密封的蛋白质结晶板表面，备用；
第三步：本实施例用Hampton公司IndexTM试剂盒的96种结晶试剂筛选纤维素酶晶体，将结晶试剂与纤维素酶蛋白溶液按照体积比为10：1滴加在PDMS无凹槽密封的蛋白质结晶板，得到蛋白质结晶体系；
第四步：将整个结晶体系置于15℃条件下静置480h结晶。显微镜下观察统计出现纤维素酶晶体的条件数目。
经过统计得到如下结果：有18种结晶体系中出现了纤维素酶晶体，结晶成功率为18.75％。与现有的商业结晶板筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了1.8倍。
实施例5：刀豆球蛋白结晶条件的筛选
第一步：PDMS芯片设计和制作：(1)PDMS芯片的设计：在PDMS芯片界面上设计一系列微柱阵列，每组阵列中，微柱在长度为5mm和宽度为5mm的区域内紧密排列，阵列间距为1cm；微柱的直径为35μm，微柱的高度为205μm，微柱的间距为100μm，(2)芯片及模板制备：a)准备基片：用98％浓硫酸：双氧水按照体积比3：1的比例配成的洗液清洗单抛硅片，清洗后的硅片用超纯水冲洗，无水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超纯水冲洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蚀刻的基片；b)铺片：将阴性光刻胶倒在基片上，用涂膜仪涂布，形成均匀的光刻胶薄层，制备不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：将制备好的基片置于电热板上，65～95℃烘干；d)光刻：将烘干的基片在光刻机上曝光45s；e)显影：用显影剂对光刻处理的基片显影3min，吹干备用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制备：a)预处理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易与模板剥离；b)配制PDMS：按照体积比10:1称取PDMS预聚物(A胶)和固化剂(B胶)，用混匀机混合均匀；c)脱气：将混合均匀的PDMS混合物倾倒至模板上，抽真空脱气至其中无气泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加热，使其固化；e)制备覆盖PDMS的结晶板：将固化好的PDMS放置于无凹槽密封的蛋白质结晶板表面，备用；
第二步：将美国Sigma公司的刀豆球蛋白按照终浓度为2mg/ml溶于pH为6，0.005MHEPES-Na缓冲液中，得到蛋白质溶液；
第三步：本实施例用Hampton公司Crystal Screen和Crystal Screen 2试剂盒的98种结晶试剂筛选刀豆球蛋白晶体，将结晶试剂与刀豆球蛋白溶液按照体积比为40：1滴加在PDMS无凹槽密封的蛋白质结晶板，得到蛋白质结晶体系；
第四步：将整个结晶体系置于30℃条件下静置168h结晶。显微镜下观察统计出现刀豆球蛋白晶体的条件数目。
经过统计得到如下结果：有23种结晶体系中出现了刀豆球蛋白晶体，结晶成功率为23.96％。与现有的商业结晶板筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了1.77倍。

Claims (2)

1.一种使用软刻芯片改变结晶基底粗糙度用于蛋白质结晶的方法，其特征在于包括下述步骤：
第一步，制作PDMS芯片，包括以下步骤：
(1)在PDMS芯片界面上设计紧密排列的微柱阵列，每根微柱的直径为5～300μm，微柱的高度为5～300μm，微柱的间距为5～300μm；或者设计一系列有间隔的微柱阵列，阵列中每根微柱的直径在5～300μm之间，微柱的高度在5～300μm之间，微柱的间距为5～300μm之间，每组阵列中微柱在长1mm～1cm、宽1mm～1cm的区域内紧密排列，每组阵列间的间距为1mm～1cm；
(2)芯片制备，包括以下内容：
a)用98％浓硫酸和双氧水按照3：1的体积比配成洗液清洗单抛硅片，清洗后的硅片用超纯水冲洗，用无水乙醇和丙酮分别浸泡1min后再用超纯水冲洗，200℃烘干硅片上的水分，得到基片；
b)将阴性光刻胶倒在基片上，用涂膜仪涂布，形成均匀的光刻胶薄层；
c)将制备好的基片置于65～95℃烘干；
d)将烘干的基片在光刻机上曝光45s；
e)用显影剂对光刻处理的基片显影3min，吹干，得到制作PDMS芯片的模板；
(3)芯片制备，包括以下内容：
a)用三甲基氯硅烷蒸汽熏模板3min；
b)按照10：1的体积比量取PDMS预聚物和固化剂，混合均匀；
c)将混合均匀的PDMS预聚物和固化剂倾倒至模板上，抽真空脱气至其中无气泡；
d)将模板置于80℃环境中固化，得到刻有微柱阵列的PDMS；
e)将固化好的PDMS放置于无凹槽密封的蛋白质结晶板表面，备用；
第二步，配置浓度为0.001～1M、pH值在3～10的缓冲液，所述的缓冲液包括所有可以减少溶液体系内pH改变，维持体系酸碱度的溶液，用缓冲液来溶解蛋白质，使蛋白质在溶液中的终浓度达到1～100mg/ml，得到蛋白质溶液；
第三步，将结晶试剂与蛋白质溶液按照(0.01～50)：1的体积比混合，得到蛋白质结晶溶液体系；
第四步，将蛋白质结晶溶液滴加在PDMS表面，在0～60℃下静置1～720h结晶。
2.根据权利要求1所述的使用软刻芯片改变结晶基底粗糙度用于蛋白质结晶的方法，其特征在于：所述的缓冲液包括但不限于Tris系统、磷酸、碳酸、醋酸、柠檬酸盐、磷酸盐、柠檬酸、巴比妥酸、硼酸盐。
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