CN110687069A - 一种基于微流控的高通量结晶条件筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，包括以下步骤，S1、将PDMS和交联剂的混合物，倒入清洁后的模具中，抽真空后，加热固化，将固化后的PDMS从模具中剥离，并粘贴在基板上，加热固化，得到微流控芯片；S2、待结晶物、溶剂和反溶剂混合均匀输出分散相，将微流控芯片的通道分别灌注连续相和分散相，在若干结晶条件下生成含有晶体的液滴；S3、收集含有晶体的液滴；S4、识别晶体形貌，根据晶体形貌筛选出对应的结晶条件；微流控芯片可作为微反应器，具有高通量处理、反应迅速、试剂消耗少、操作灵活、自动化和集成化等优点。
Description
技术领域
本发明涉及结晶技术领域，更具体地，涉及一种基于微流控的高通量结晶条件筛选方法。
背景技术
药物晶体，是药物在结晶时由于受各种因素影响，使分子内或分子间成键方式发生改变，致使分子或原子在晶格空间排列不同，形成不同的晶体结构；同一药物的不同晶型在溶解度、溶出速率、稳定性、生物有效性等方面可能会有显著不同，从而影响了药物的生物利用度及疗效；该现象在口服固体制剂方面表现得尤为明显；同时，在制药工业高效生产过程中，药物结晶起着至关重要的纯化作用，因此，探讨药物在不同结晶条件下形成的晶体进而筛选出适合临床应用的药物晶型是非常有必要的。
然而，受制于药物种类的多样性、药物有机分子在二维/三维空间排列的灵活性和晶体形成条件的复杂性，传统的药物晶体筛选方法不但耗费大量的人力物力时间成本，还需巨大的试药消耗量与及复杂的筛选工艺。
微流控技术，以其样品及试剂用量少、集成度高、能耗低、反应速度快、成本低且可提供大规模反应等特点得到广泛的认可和应用；将高通量筛选技术引入到微流控技术，在探讨药物在不同影响条件形成晶体中可扮演着重要的角色，但是传统的微流控技术引入药物晶体表征手段的同时，需要人为处理大量的表征数据，无疑增加结果分析的难度。
发明内容
本发明的主要目的在于克服上述不足之处，提供一种基于微流控的高通量结晶条件筛选方法。
本发明的技术方案为：
本发明提供的一种基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，包括以下步骤，
S1、将PDMS和交联剂的混合物，倒入清洁后的模具中，抽真空后，加热固化，将固化后的PDMS从模具中剥离，并粘贴在基板上，加热固化，得到微流控芯片；
S2、待结晶物、溶剂和反溶剂混合均匀输出分散相，将微流控芯片的通道分别灌注连续相和分散相，在若干结晶条件下生成含有晶体的液滴；
S3、收集含有晶体的液滴；
S4、识别晶体形貌，根据晶体形貌筛选出对应的结晶条件。
进一步的，所述步骤S1中，PDMS和交联剂的质量比为10：1或5：1。
进一步的，所述步骤S1中，加热固化的温度为60 ℃-100 ℃，时间为1 h-6 h。
进一步的，所述步骤S2中，溶剂包括乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯或乙醚。
进一步的，所述步骤S2中，反溶剂包括纯水、二氯甲烷、氯仿、溴乙烷、甲苯、四氯化碳、正辛烷、正己烷或异辛烷。
进一步的，所述步骤S2中，连续相包括二甲基硅油、聚二甲基硅氧烷、液体石蜡或矿物油，其中，连续相可加入或不加入一定体积比的表面活性剂。
进一步的，所述步骤S2中，结晶条件包括待结晶物浓度、溶剂和反溶剂的配比、溶剂、pH、结晶温度、结晶时间或杂质。
进一步的，所述步骤S3中，通过阵列微坑或微通道收集含有晶体的液滴。
进一步的，所述步骤S4中，利用光学显微镜、X射线衍射光谱、差示扫描量热仪法、热重分析或红外光谱识别液滴的晶体形貌。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，具有样品和试剂的消耗量较少、成本低、结晶条件筛选范围大、集成度高、能耗低、反应速度快的特点，结合图像识别-大数据分析处理技术，还可以推广到更多不同种类能产生晶体的药物，筛选出有利于药物发挥临床疗效和有助于在工业生产过程中纯化药物的药物晶体结晶条件，加速新药研发到临床应用的进程。
2、微流控芯片可作为微反应器，具备分析速度快、液滴之间无交叉污染、高通量、成本低等的优点，克服了传统药物结晶技术具有复杂性、高成本和耗时长等难点，结合图像识别-大数据分析处理技术的引入，可以在短时间内自动化筛选大量药物晶体的结晶条件，有利于药物晶体的纯化。
3、本发明的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，不仅适用于药物结晶条件的筛选，还适用于其它晶体结晶条件的筛选，比如蛋白质晶体、MOFs晶体等。
附图说明
图1为本发明的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法的流程图；
图2为本发明的“T”型液滴生成通道的微流控芯片结构示意图；
图3为本发明的油包水液滴内吲哚美辛晶体的光学显微镜图片；
图4为本发明的水凝胶液滴内吲哚美辛晶体（立方体状）的光学显微镜图片；
图5为本发明的水凝胶液滴内吲哚美辛晶体（四边形片状）的光学显微镜图片；
图6为吲哚美辛在溶剂与反溶剂的体积比为6：4条件下的XRD图谱；
图7为吲哚美辛在溶剂与反溶剂的体积比为7：3条件下的XRD图谱；
图8为吲哚美辛在溶剂与反溶剂的体积比为8：2条件下的XRD图谱；
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征更易被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围作出更为清楚的界定。
实施例1
本实施例的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，用于筛选吲哚美辛的结晶条件，如图1为基于微流控的高通量结晶条件筛选方法的流程图。
如图2，本实施例采用“T”型通道法，也可采用共流聚焦法、共轴流法等；以聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）为材料的模塑法制备微流控芯片，也可采用注塑法、软光刻法等。
本实施例的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，包括以下步骤：
S1、以PDMS和铝片为材料，利用Adobe Illustrator CC 2018软件设计“T”型液滴生成通道结构，也可利用其它软件如SolidWorks、AutoCAD、CorelDRAW等，均可用于通道结构的设计，再利用高分辨率高功率激光雕刻机将通道结构雕刻在铝片上，通过把握雕刻时间以控制通道的雕刻深度，雕刻结束后进行抛光处理，使铝片表面粗糙度降低，以获得光亮、平整的表面；将铝片模具用洗洁精清洗3遍，然后分别置于100 ml乙醇、100 ml丙酮、100 ml纯水中超声30 min以清洗模具表面的脏物，并用氮气吹干；将PDMS A组和B组分交联剂(SYLGARDTM184 Silicone Elastomer Curing Agent)以10：1的质量比混合均匀，浇注于制作好的铝片模具上，在真空干燥箱中抽真空，在80 ℃下烘1.5 h，充分固化，将已固化的PDMS从铝片模具上剥离下来，即可得到刻印有“T”型液滴生成通道的PDMS芯片，使用旋涂仪在600rpm的转速下将PDMS均匀涂在玻璃表面上，再将刻印有“T”型液滴生成通道的PDMS芯片轻轻地粘贴在玻璃上，置于80 ℃的烘箱中1 h，固化，即得完整的微流控芯片；
吲哚美辛-乙醇饱和溶液的制备：称取0.2 g吲哚美辛，不断往EP管加入200 μl乙醇(购于Aladdin公司)，边加边超声震荡，直至药物刚溶解至剩有一点点沉淀，6000 rpm离心10min，除去沉淀，取上清液待用。
S2、液滴的连续相（油相）可选择如下：1、粘度分别为10 mPa、20 mPa、50 mPa、100mPa、200 mPa、500 mPa的二甲基硅油(购于Aladdin公司)；2、粘度分别为10 mPa、20 mPa、50mPa、100 mPa、200 mPa、500 mPa的二甲基硅油(购于Aladdin公司)分别混有体积为1%、2%、3%、4%的span80(天津致远化学试剂有限公司)；3、体积分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%的PDMS (购于道康宁公司)；4、体积分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%的PDMS (购于道康宁公司)分别混有体积为1%、2%、3%、4%的span80(天津致远化学试剂有限公司)；5、分别混有体积为1%、2%、3%、4% span80的液滴石蜡(购于Aladdin公司)；6、不加表面活性剂的液滴石蜡(购于Aladdin公司)等。
利用“Y”字型混合通道将吲哚美辛-乙醇饱和溶液、反溶剂混合均匀输出为分散相，本实施例中，反溶剂为纯水，采用“T”型通道法使用连续相（加/不加表面活性剂：如span80；）将分散相切割成大小均匀的含有吲哚美辛晶体的油包水液滴，也可采用共流聚焦法、共轴流法等；
利用多组分混合通道将水凝胶溶液、吲哚美辛-乙醇饱和溶液、反溶剂混合均匀输出为分散相，反溶剂为纯水，采用“T”型通道法使用连续相（加/不加表面活性剂：如span80；）将分散相切割成大小均匀的含有吲哚美辛晶体的水凝胶液滴，也可采用共流聚焦法、共轴流法等。
具体的，水凝胶溶液的配置：按照0.1%、0.2%、0.5%等的体积比，分别称取0.05 g、0.1 g、0.25 g的琼脂糖置于200 ml锥形瓶中，量筒量取50 ml超纯水(购于Aladdin公司)并倒入锥形瓶中，微波炉加热至沸腾，即可得到澄清的水凝胶溶液，使用织物加热套持续加热60 ℃以防止水凝胶溶液冷却固化。
微流控芯片的通道端口可连接内径为0.5 mm或1 mm的管道，并连接注射泵，调节注射速度，油相（连续相）总灌注速度为900 μl/分钟，水相（分散相）总灌注速度为300 μl /分钟，使其生成连续、稳定、粒径均匀的水凝胶液滴或油包水液滴；如图4、5均为水凝胶液滴内吲哚美辛晶体的光学显微镜图片，其中，图4为立方体状晶体，图5为四边形片状晶体。
通过增加或更改水相（分散相），以及改变水相（分散相）的灌注速度，从而设置不同吲哚美辛浓度(0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL等浓度)、不同极性溶剂(乙醇、丙酮等溶剂)、不同pH环境(pH=2、4、6、8、10等)、不同结晶温度、不同结晶时间等影响吲哚美辛晶体结晶的条件，进而生成对应不同结晶条件下的液滴。
S3、收集含有晶体的液滴：用阵列微坑或微通道粘贴固定于移动平台载物台上，联机软件设置移动平台的移动步径，自动收集含有吲哚美辛晶体的液滴，具体的，以PDMS为材料的模塑法、注塑法、软光刻法等制备微流控液滴收集芯片，分别含有10ⅹ10、50ⅹ50、100ⅹ100个不同大小的阵列微坑，阵列微坑的大小可根据生成液滴的数量和直径进行设计，将微流控液滴收集芯片粘贴固定于移动平台的载物台上，联机软件控制移动平台移动步径，自动收集对应不同结晶条件的液滴；亦可以，以PDMS为材料的模塑法、注塑法、软光刻法等制备刻印有“S”型通道的微流控液滴收集芯片，将刻印有“S”型通道的已固化的PDMS芯片粘贴于正方体玻璃片或者透明塑料片上，粘贴固定于移动平台载物台上，用以收集对应不同结晶条件某一系列液滴，其中，“S”型通道的大小、长度和尺寸可随着液滴的数量和直径进行设计。
S4、将装有液滴的微流控液滴收集芯片置于光学显微镜载物台上，打开显微镜照明，调节焦距，利用显微镜控制软件自动连续拍照功能，自动收集液滴内晶体的外观形态图片，利用python语言、mobilenetv2网络来对晶体形貌的识别筛选，如图3为油包水液滴内吲哚美辛晶体的光学显微镜图片。
用药勺取0.8 mg吲哚美辛晶体放入玻璃样品架样品槽内，然后用毛玻璃轻压，使之充满，再轻轻抹去多余的晶体粉末，使样品表面与玻璃架表面在同一平面内，置于X-射线粉末衍射测试，如图6-8分别为吲哚美辛在不同溶剂与反溶剂的体积比条件下的XRD图谱。
利用计算机，将光学显微镜、扫描电镜得到的晶体形貌图片利用python语言、mobilenetv2网络图像识别技术对吲哚美辛晶体的晶型识别处理，将XRD图谱等表征手段得到的数据利用大数据技术（包括ETL工具、SQL等）和分析技术（包括自然语言处理技术、机器学习等）技术进行数据结果筛选，进而筛选出吲哚美辛晶体结晶的最佳条件。
具体的，由图6-8的吲哚美辛在不同溶剂与反溶剂的体积比条件下的XRD图谱，得到筛选出产生四边形片状晶体结晶的条件为：吲哚美辛乙醇饱和溶液与反溶剂水体积之比为7：3；如图7所示，并在该结晶条件下进行晶体生长实验，通过单因素或多因素控制变量法重复上述的筛选方法，利用光学显微镜、红外光谱和X-射线单晶衍射法（SCXRD）持续监控，观察液滴晶体的生成，探讨晶体动力学中的光谱变化规律，进而验证在该结晶条件下晶体生长情况。
本实施例的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，微流控芯片可作为微反应器，具有高通量处理、反应迅速、试剂消耗少、操作灵活、自动化和集成化等优点，用于药物研发的具体过程，如快速生成并分析大样本库，在微小液滴内形成局部高浓度，进行自动化精确平行操控，结合图像识别-大数据分析处理技术的引入，可以在短时间内自动化筛选大量药物晶体的结晶条件，有利于药物晶体的纯化。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1、将PDMS和交联剂的混合物，倒入清洁后的模具中，抽真空后，加热固化，将固化后的PDMS从模具中剥离，并粘贴在基板上，加热固化，得到微流控芯片；
S2、待结晶物、溶剂和反溶剂混合均匀输出分散相，将微流控芯片的通道分别灌注连续相和分散相，在若干结晶条件下生成含有晶体的液滴；
S3、收集含有晶体的液滴；
S4、识别晶体形貌，根据晶体形貌筛选出对应的结晶条件。
2.根据权利要求1所述的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，其特征在于，所述步骤S1中，PDMS和交联剂的质量比为10：1或5：1。
3.根据权利要求1所述的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，其特征在于，所述步骤S1中，加热固化的温度为60 ℃-100 ℃，时间为1 h-6 h。
4.根据权利要求1所述的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，其特征在于，所述步骤S2中，溶剂包括乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯或乙醚。
5.根据权利要求1所述的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，其特征在于，所述步骤S2中，反溶剂包括纯水、二氯甲烷、氯仿、溴乙烷、甲苯、四氯化碳、正辛烷、正己烷或异辛烷。
6.根据权利要求1所述的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，其特征在于，所述步骤S2中，连续相包括二甲基硅油、聚二甲基硅氧烷、液体石蜡或矿物油。
7.根据权利要求1所述的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，其特征在于，所述步骤S2中，结晶条件包括待结晶物浓度、溶剂和反溶剂的配比、溶剂、pH、结晶温度、结晶时间或杂质。
8.根据权利要求1所述的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，其特征在于，所述步骤S3中，通过阵列微坑或微通道收集含有晶体的液滴。
9.根据权利要求1所述的基于微流控的高通量结晶条件筛选方法，其特征在于，所述步骤S4中，利用光学显微镜、X射线衍射光谱、差示扫描量热仪法、热重分析或红外光谱识别液滴的晶体形貌。
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