CN107723305B - 一种用于基因转染中可光场调控基因快速释放的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于基因转染中可光场调控基因快速释放的方法，该方法中使用具有光伏效应的p+/n型或n+/p型硅基板作为基因承载平台，吸附质粒或质粒/载体复合物，培养细胞；也可采用聚合物薄膜层修饰硅基板再作为基因承载平台；细胞培养后，通过光场照射可使基因快速释放，由细胞摄入完成基因传递及表达。其中p+/n型硅基板中硼元素扩散深度为100～600nm，扩散浓度为1×1015～5×1018原子/cm2，n+/p型硅基板中磷元素扩散深度为50‑500nm，扩散浓度为5×1015～1×1020原子/cm2。本方法可广泛用于基因功能研究和基因治疗等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物医用领域，具体涉及一种用于基因转染中可光场调控基因快速释放的方法。
背景技术
21世纪是生命科学的世纪，这已经成为人们的共识，生命科学已逐渐成为生物学、物理学、化学、信息学等各门科学共同探索的领域。随着生命科学的发展，细胞重编程、细胞治疗等生命科学技术研究取得了显著的进步，这些技术可望在生物医学研究和临床等方面获得广泛的应用。这些技术中，在细胞体外培养阶段实现特定基因的转染、表达是其主要技术环节。而且，基因转染本身也是基因功能研究基因治疗等技术的主要手段，因此，体外培养条件下实现易于操作、安全、高效的基因转染技术有着重要的意义。
自2001年起，很多研究者将目标由传统基因转染(液相转染)转向表面介导基因转染(固相转染)，两种转染方法有很大区别。从细胞水平来说，传统基因转染先将细胞铺板，然后将基因/载体复合物加入到细胞培养基中，复合物凭借重力作用沉降到贴壁的细胞膜表面，进而通过胞吞作用进入靶细胞。而表面介导基因转染是以材料表面作为基因/载体复合物承载平台，将复合物或基因通过特异性、非特异性相互作用固定在材料表面上，然后培养细胞，细胞摄取材料表面的DNA进而达到转染的目的。从生命体水平来说，传统基因转染是将基因/载体复合物注射到体内，通过血液循环复合物到达靶细胞，被靶细胞摄取达到基因转染的目的，而表面介导基因转染则是将固定了基因或基因/载体复合物的材料植入到体内靶细胞附近，靶细胞摄取材料上的基因完成基因转染。表面介导基因转染可实现基因在细胞周围的聚集，增加了与细胞的接触几率，提高转染效率；表面介导基因转染可以实现基因的局部浓缩，减少基因/载体复合物用量，具有更好地安全性；表面介导基因转染中基因处于锚定状态，转染过程可在血清环境中完成，具有更高的临床应用价值。另外，表面介导基因转染过程包括复合物的固定、复合物的释放等过程，这为复合物的固定量及复合物的释放过程的控制提供了更多的可能性。
在药物、基因、蛋白等释放体系中，长时间可持续的释放过程应用范围广，但是某种特定时间下基因短时间内的快速释放在某些疾病的基因治疗或一些时间限制的医疗过程中具有重要的应用价值。表面介导基因转染技术为基因在特定时间下的可控释放提供了可能性。近年来Burcu S等通过外加电场使聚阳离子层和DNA发生解聚，实现DNA的释放[B.S.Aytar et al.Rapid Release of Plasmid DNA from Surfaces Coated withPolyelectrolyte Multilayers Promoted by the Application of ElectrochemicalPotentials,Acs Applied Materials&Interfaces,4(2012)2726-2734.]。但是外加电场操作复杂、电压或电流对细胞活性有一定的影响。G.B.Demirel等用具有紫外光响应性的偶氮苯衍生物修饰材料表面，获得了具有紫外光响应性的表面，紫外光场下通过偶氮苯构型的变化调控材料表面与DNA的相互作用力，从而可控地释放DNA[G.B.Demirel etal.Photocontrollable DNA hybridization on reversibly photoresponsivesurfaces,Journal of Materials Chemistry,21(2011)10415-10420.]。光场具有易于操作，非接触性控制等优点，利用具有光场响应性的材料基质作为DNA的承载平台，在光场的作用下调控基因转染过程对于基因治疗的临床应用具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于基因转染中可光场调控基因快速释放的方法，采用该方法可光场调控表面介导基因转染中基因/载体复合物在特定时间下快速释放，易于操作、可控性高。
一种用于基因转染中可光场调控基因快速释放的方法，包括以下步骤：
(1)以具有光伏效应的p+/n型或n+/p型硅基板表面作为基因承载平台，在硅基板上吸附质粒或质粒/载体复合物，然后进行细胞培养；
(2)细胞培养后，通过光场照射处理，使吸附在基板表面的质粒或质粒/载体复合物快速释放，从而被细胞摄入，完成基因传递及表达。
上述技术方案中，所述的p+/n型硅基板中硼原子扩散深度为100～600nm，扩散浓度为5×1015～1×1020原子/cm2；所述的n+/p型硅基板中磷元素扩散深度为50-500nm，扩散浓度为5×1015～1×1020原子/cm2。
进一步的，在所述的硅基板上先制备一层具有良好生物相容性的聚合物薄膜层，再作为基因承载平台，在其上吸附质粒或质粒/载体复合物，进行细胞培养。在所述的p+/n型硅基板表面制备正电性的聚合物薄膜层；在所述的n+/p型硅基板表面制备负电性的聚合物薄膜层。聚合物薄膜的制备方法可以为旋涂法、或浸泡法。
所述正电性的聚合物为聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖、聚赖氨酸、聚精氨酸；所述的负电性的聚合物为聚组氨酸，聚丙烯酸、牛血清白蛋白、聚苯乙烯磺酸钠或聚谷氨酸。
所述的质粒/载体复合物中载体为阳离子脂质体、金纳米颗粒、金纳米棒、或聚多肽。所述的质粒可以采用p-GFP或其他功能基因，质粒吸附浓度可以为2μg/mL，细胞接种密度为5×104细胞/孔(48孔板)，1×105细胞/孔(24孔板)。
所述的光场照射处理过程为：通常在细胞达到较好的粘附增值状态时，用波长为400～700nm的可见光从基因承载平台的表面照射，照射1～30分钟，光照强度30～200mw/cm2。
或者为：用波长为300～400nm的紫外光从基因承载平台的表面照射，照射5～20分钟，光场强度为1mw～5mw/cm2。
本发明中所述的p+/n、n+/p型硅基板及聚合物薄膜层修饰的p+/n、n+/p硅基板具有良好的生物相容性，并且聚合物修饰方法简单、成本低，易于实现。本发明中使用的光场对细胞和组织损伤小，操作方便，可控性强，具有很强的实用性，便于推广应用。
附图说明
图1是PS培养板和p+/n硅基板上培养细胞48h后的吸光度值。
图2是p+/n硅基板吸附p-GFP/lipofectamine2000复合物后的荧光显微镜图。
图3是p+/n硅基板吸附p-GFP/lipofectamine2000复合物后经可见光照后的荧光显微镜图。
图4是不同时间点下施加光照p-GFP/lipofectamine2000复合物释放量。
图5是流式细胞仪分析基因转染效率的数据图，(a)无光照(b)可见光照射。
具体实施方式
下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
实施例1
1)将硼原子扩散深度为400nm，扩散浓度为1×1020原子/cm2的p+/n型硅片切成1cm×1cm的方片，经高温高压灭菌后备用。该硅片具有良好的生物相容性，如图1所示。制备p-DNA/lipofectamine复合物过程如下：取适量的lipofectamine分散于PBS缓冲液中，取适量的p-DNA分散于PBS缓冲液中(其中Vlipofectamine：Mp-DNA＝3μL：1μg)，室温放置10min，然后将p-DNA分散液逐滴加入到lipofectamine分散液中，室温放置5min。将基板浸泡在复合物溶液中，500μL溶液/孔，4℃放置12h。
2)吸附过程完成后，将基板用PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，然后用碘化吡啶(PI)室温染色30min，荧光显微镜观察吸附的复合物，如图2所示。吸附过程完成后，将基板用PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，然后置于新的孔板中，加入500μLPBS溶液，用波长为400-700nm强度为100mw/cm2的可见光卤素冷光源从基板上部入射，照射10min，将基板用PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，然后用碘化吡啶(PI)室温染色30min，荧光显微镜观察吸附的复合物，如图2所示。对比图2和图3可以发现，未培养细胞情况下，在可见光照射下大部分复合物从基板释放。
3)如步骤1)的吸附过程完成后，将基板用PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，然后置于新的孔板中，加入500μL PBS溶液，在不同的时间点下(0h、2h、8h)用波长为400-700nm强度为100mw/cm2的可见光卤素冷光源从基板上部入射，照射10min，用溶液轻轻冲洗基板3次，溶液经DAPI染色后，用荧光酶标仪测试DNA的释放量。如图4所示，与无光照组相比，在不同的时间点(0h、2h、8h)施加光照均能使DNA从基板快速释放。
4)如步骤1)的吸附过程完成后，将基板用PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，然后置于新的孔板中，接种细胞，细胞接种密度为1*105细胞/孔，培养2h后，实验组用波长为400-700nm强度为100mw/cm2的可见光卤素冷光源从基板上部入射，照射10min。培养48h后，经胰酶消化后收集细胞，用流式细胞计数仪测试转染效率。如图5所示，无光照时转染效率为5.61％，可见光照时转染效率为29.23％。
实施例2
1)将硼原子扩散深度为200nm，扩散浓度为1×1018原子/cm2的p+/n型硅片切成1cm×1cm的方片，经高温高压灭菌后备用。制备p-DNA/lipofectamine复合物过程如下：取适量的lipofectamine分散于PBS缓冲液中，取适量的p-DNA分散于PBS缓冲液中(其中Vlipofectamine：Mp-DNA＝3μL：1μg)，室温放置10min，然后将p-DNA分散液逐滴加入到lipofectamine分散液中，室温放置5min。将基板浸泡在复合物溶液中，500μL溶液/孔，4℃放置12h。
2)吸附完成后将基板用PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，然后置于新的孔板中，接种细胞，细胞接种密度为1×105细胞/孔，培养2h后，实验组用波长为400-700nm强度为100mw/cm2的可见光卤素冷光源从基板上部入射，照射10min。培养48h后，经胰酶消化后收集细胞，用流式细胞计数仪测试转染效率。无光照时转染效率为6.71％，可见光照时转染效率为30.05％。
实施例3
1)将硼原子扩散深度为200nm，扩散浓度为1×1018原子/cm2的p+/n型硅片切成1cm×1cm的方片。将基板浸泡在壳聚糖溶液中(浓度为5mg/ml)，浸泡6h后PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，紫外灭菌30min，备用。
2)制备p-DNA/lipofectamine复合物过程如下：取适量的lipofectamine分散于PBS缓冲液中，取适量的p-DNA分散于PBS缓冲液中(其中Vlipofectamine：Mp-DNA＝3μL：1μg)，室温放置10min，然后将p-DNA分散液逐滴加入到lipofectamine分散液中，室温放置5min。将步骤1中的制备的聚合物层修饰的基板浸泡在复合物溶液中，500μL溶液/孔，4℃放置12h。
3)吸附完成后将基板用PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，然后置于新的孔板中，接种细胞，细胞接种密度为1×105细胞/孔，培养2h后，实验组用波长为400-700nm强度为100mw/cm2的可见光卤素冷光源从基板上部入射，照射10min。培养48h后，经胰酶消化后收集细胞，用流式细胞计数仪测试转染效率。无光照时转染效率为6.71％，可见光照时转染效率为35.05％。
实施例4
1)将硼原子扩散深度为200nm，扩散浓度为1×1018原子/cm2的p+/n型硅片切成1cm×1cm的方片。将聚乙烯亚胺(分子量20kD)溶液(浓度为5mg/ml)滴在上述基板上，以800rpm的速度旋涂40s，之后将其置于37℃下保温0.5h。紫外灭菌30min，备用。
2)制备p-DNA/lipofectamine复合物过程如下：取适量的lipofectamine分散于PBS缓冲液中，取适量的p-DNA分散于PBS缓冲液中(其中Vlipofectamine：Mp-DNA＝3μL：1μg)，室温放置10min，然后将p-DNA分散液逐滴加入到lipofectamine分散液中，室温放置5min。将步骤1中的制备的聚合物层修饰的基板浸泡在复合物溶液中，500μL溶液/孔，4℃放置12h。
3)吸附完成后将基板用PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，然后置于新的孔板中，接种细胞，细胞接种密度为1×105细胞/孔，培养2h后，实验组用波长为400-700nm强度为100mw/cm2的可见光卤素冷光源从基板上部入射，照射10min。培养48h后，经胰酶消化后收集细胞，用流式细胞计数仪测试转染效率。无光照时转染效率为6.41％，可见光照时转染效率为33.45％。
实施例4
1)将硼原子扩散深度为200nm，扩散浓度为1×1018原子/cm2的p+/n型硅片切成1cm×1cm的方片。将聚赖氨酸溶液(浓度为6mg/ml)滴在上述基板上，以800rpm的速度旋涂40s，之后将其置于37℃下保温0.5h。紫外灭菌30min，备用。
2)制备p-DNA/lipofectamine复合物过程如下：取适量的lipofectamine分散于PBS缓冲液中，取适量的p-DNA分散于PBS缓冲液中(其中Vlipofectamine：Mp-DNA＝3μL：1μg)，室温放置10min，然后将p-DNA分散液逐滴加入到lipofectamine分散液中，室温放置5min。将步骤1中的制备的聚合物层修饰的基板浸泡在复合物溶液中，500μL溶液/孔，4℃放置12h。
3)吸附完成后将基板用PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，然后置于新的孔板中，接种细胞，细胞接种密度为1×105细胞/孔，培养2h后，实验组用波长为400-700nm强度为30mw/cm2的可见光卤素冷光源从基板上部入射，照射10min。培养48h后，经胰酶消化后收集细胞，用流式细胞计数仪测试转染效率。无光照时转染效率为6.21％，可见光照时转染效率为29.45％。
实施例5
1)将硼原子扩散深度为200nm，扩散浓度为1×1018原子/cm2的p+/n型硅片切成1cm×1cm的方片。将聚赖氨酸溶液(浓度为6mg/ml)滴在上述基板上，以800rpm的速度旋涂40s，之后将其置于37℃下保温0.5h。紫外灭菌30min，备用。
2)制备p-DNA/lipofectamine复合物过程如下：取适量的lipofectamine分散于PBS缓冲液中，取适量的p-DNA分散于PBS缓冲液中(其中Vlipofectamine：Mp-DNA＝3μL：1μg)，室温放置10min，然后将p-DNA分散液逐滴加入到lipofectamine分散液中，室温放置5min。将步骤1中的制备的聚合物层修饰的基板浸泡在复合物溶液中，500μL溶液/孔，4℃放置12h。
3)吸附完成后将基板用PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，然后置于新的孔板中，接种细胞，细胞接种密度为1×105细胞/孔，培养2h后，实验组用波长为400-700nm强度为30mw/cm2的可见光卤素冷光源从基板上部入射，照射20min。培养48h后，经胰酶消化后收集细胞，用流式细胞计数仪测试转染效率。无光照时转染效率为6.21％，可见光照时转染效率为45.96％。
实施例6
1)将磷原子扩散深度为100nm，扩散浓度为5×1015原子/cm2的n+/p型硅片切成1cm×1cm的方片，经高温高压灭菌后备用。取适量的p-DNA分散于PBS缓冲液中室温放置10min，将基板浸泡在p-DNA溶液中，500μL溶液/孔，4℃放置12h。
2)吸附完成后将基板用PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，然后置于新的孔板中，接种细胞，细胞接种密度为1×105细胞/孔，培养2h后，实验组用波长为400-700nm强度为50mw/cm2的可见光卤素冷光源从基板上部入射，照射10min。培养48h后，经胰酶消化后收集细胞，用流式细胞计数仪测试转染效率。无光照时转染效率为5.91％，可见光照时转染效率为19.18％。
实施例7
1)将磷原子扩散深度为200nm，扩散浓度为1×1016原子/cm2的n+/p型硅片切成1cm×1cm的方片。将牛血清白蛋白(浓度为5mg/ml)滴在上述基板上，以800rpm的速度旋涂40s，之后将其置于37℃下保温0.5h。紫外灭菌30min，备用。
2)制备p-DNA/lipofectamine复合物过程如下：取适量的lipofectamine分散于PBS缓冲液中，取适量的p-DNA分散于PBS缓冲液中(其中Vlipofectamine：Mp-DNA＝3μL：1μg)，室温放置10min，然后将p-DNA分散液逐滴加入到lipofectamine分散液中，室温放置5min。将步骤1中的制备的聚合物层修饰的基板浸泡在复合物溶液中，500μL溶液/孔，4℃放置12h。
3)吸附完成后将基板用PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，然后置于新的孔板中，接种细胞，细胞接种密度为1×105细胞/孔，培养2h后，实验组用波长为400-700nm强度为50mw/cm2的可见光卤素冷光源从基板上部入射，照射20min。培养48h后，经胰酶消化后收集细胞，用流式细胞计数仪测试转染效率。无光照时转染效率为8.31％，可见光照时转染效率为36.96％。
实施例8
1)将磷原子扩散深度为300nm，扩散浓度为1×1017原子/cm2的n+/p型硅片切成1cm×1cm的方片。将聚苯乙烯磺酸钠(浓度为8mg/ml)滴在上述基板上，以800rpm的速度旋涂40s，之后将其置于37℃下保温0.5h。紫外灭菌30min，备用。
2)制备p-DNA/lipofectamine复合物过程如下：取适量的lipofectamine分散于PBS缓冲液中，取适量的p-DNA分散于PBS缓冲液中(其中Vlipofectamine：Mp-DNA＝3μL：1μg)，室温放置10min，然后将p-DNA分散液逐滴加入到lipofectamine分散液中，室温放置5min。将步骤1中的制备的聚合物层修饰的基板浸泡在复合物溶液中，500μL溶液/孔，4℃放置12h。
3)吸附完成后将基板用PBS轻轻冲洗3次然后用超纯水轻轻冲洗3次，然后置于新的孔板中，接种细胞，细胞接种密度为1×105细胞/孔，培养2h后，实验组用波长为300～400nm强度为2mw/cm2的紫外光光源从基板上部入射，照射20min。培养48h后，经胰酶消化后收集细胞，用流式细胞计数仪测试转染效率。无光照时转染效率为7.51％，紫外光照时转染效率为20.36％。
实施例9
1)将磷原子扩散深度为300nm，扩散浓度为1×1017原子/cm2的n+/p型硅片切成1cm×1cm的方片。将聚苯乙烯磺酸钠(浓度为8mg/ml)滴在上述基板上，以800rpm的速度旋涂40s，之后将其置于37℃下保温0.5h。紫外灭菌30min，备用。
2)制备p-DNA/金纳米颗粒复合物过程如下：取适量的金纳米颗粒分散于超纯水中，取适量的p-DNA分散于超纯水中(其中M金纳米颗粒：Mp-DNA＝10:1)，室温放置10min，然后将p-DNA分散液逐滴加入到金纳米颗粒分散液中，室温放置20min。将步骤1中的制备的聚合物层修饰的基板浸泡在复合物溶液中，500μL溶液/孔，4℃放置12h。
3)吸附完成后将基板用超纯水轻轻冲洗3次，然后置于新的孔板中，接种细胞，细胞接种密度为1×105细胞/孔，培养2h后，实验组用波长为400-700nm强度为50mw/cm2的可见光卤素冷光源从基板上部入射，照射15min。培养48h后，经胰酶消化后收集细胞，用流式细胞计数仪测试转染效率。无光照时转染效率为7.51％，可见光照时转染效率为38.45％。
Claims (4)
1.一种用于基因转染中可光场调控基因快速释放的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以具有光伏效应的p+/n型或n+/p型硅基板表面作为基因承载平台，在硅基板上吸附质粒或质粒/载体复合物，然后进行细胞培养；
细胞培养后，通过光场照射处理，使吸附在基板表面的质粒或质粒/载体复合物快速释放，从而被细胞摄入，完成基因传递及表达；
所述的p+/n型硅基板中硼原子扩散深度为200-400nm，扩散浓度为1×1018~1×1020原子/cm2；或所述的n+/p型硅基板中磷元素扩散深度为100nm，扩散浓度为5×1015原子/cm2；
所述的光场照射处理过程为：用波长为400~700nm的可见光从基因承载平台的表面照射，照射10分钟，光照强度50~100mw/cm2。
2.一种用于基因转染中可光场调控基因快速释放的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以具有光伏效应的p+/n型或n+/p型硅基板表面作为基因承载平台，在硅基板上吸附质粒或质粒/载体复合物，然后进行细胞培养；
细胞培养后，通过光场照射处理，使吸附在基板表面的质粒或质粒/载体复合物快速释放，从而被细胞摄入，完成基因传递及表达；
所述的p+/n型硅基板中硼原子扩散深度为200nm，扩散浓度为1×1018原子/cm2；或所述的n+/p型硅基板中磷元素扩散深度为200-300nm，扩散浓度为1×1016~1×1017原子/cm2；
在所述的硅基板上先制备一层具有良好生物相容性的聚合物薄膜层，再作为基因承载平台，在其上吸附质粒或质粒/载体复合物，进行细胞培养；其中在所述的p+/n型硅基板表面制备正电性的聚合物薄膜层，在所述的n+/p型硅基板表面制备负电性的聚合物薄膜层；
所述的光场照射处理过程为：用波长为400~700nm的可见光从基因承载平台的表面照射，照射10~20分钟，光照强度30~100mw/cm2；或用波长为300~400nm的紫外光从基因承载平台的表面照射，照射20分钟，光场强度为2mw/cm2。
3.如权利要求2所述的用于基因转染中可光场调控基因快速释放的方法，其特征在于，所述正电性的聚合物为聚乙烯亚胺（PEI）、壳聚糖、聚赖氨酸或聚精氨酸；所述的负电性的聚合物为聚组氨酸、聚丙烯酸、牛血清白蛋白、聚苯乙烯磺酸钠或聚谷氨酸。
4.如权利要求1或2所述的用于基因转染中可光场调控基因快速释放的方法，其特征在于，所述的质粒/载体复合物中载体为阳离子脂质体、金纳米颗粒、金纳米棒或聚多肽。
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| A Novel pH/Light-Triggered Surface for DNA Adsorption and Release;GçkÅen Birlik Demirel;《ChemPhysChem》;20140606;第15卷(第8期);全文 * |
| Rapid Release of Plasmid DNA from Surfaces Coated with Polyelectrolyte Multilayers Promoted by the Application of Electrochemical Potentials;Burcu S. Aytar等;《ACS Appl Mater Interfaces》;20140531;第4卷(第5期);摘要 * |
| 反向基因转染技术的最近研究进展;张鹏飞 等;《化学进展》;20150112;第27卷(第1期);第108页左栏；第105页右栏最后一段；第111页左栏第2段 * |
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