CN101864078A - 聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物及制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物，为高分子物质，其中壳聚糖链上的部分自由氨基被硬脂酸或重均分子量为800Da的聚乙烯亚胺所取代。本发明在具有快速细胞摄取功能的壳聚糖-硬脂酸嫁接物的基础上，再化学修饰上小分子量的聚乙烯亚胺，不仅改善了原壳聚糖-硬脂酸嫁接物分子结构的疏水性，而且增加了相当数量的氨基，提高了分子的离子缓冲能力，并克服了聚乙烯亚胺的毒性问题。通过壳聚糖硬脂酸嫁接物的快速细胞摄取和聚乙烯亚胺强烈的“质子海绵”效应的结合，可在制备基因药物中应用，实现基因药物的高效表达和肿瘤基因治疗的有效性。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型阳离子三元嫁接物及合成方法与应用，具体为聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物与合成方法，以及聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物作为一种非病毒类基因载体在制备基因药物中的应用。
背景技术
基因治疗是指将外源基因转入病灶细胞内部，通过恢复或增添基因表达以纠正人自身基因的结构或功能上的错乱，阻止病变的进展，杀灭病变的细胞，抑制外源病原体遗传物质的复制，从而达到治疗的目的。体内成功释放外源基因的载体主要分为两大类：病毒和非病毒载体。其中，经过改造的病毒载体转染效率较高，是基因治疗的主要手段。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒等。病毒是非常有效的转基因载体，然而随着大量的应用，人们发现病毒载体缺点在于制备复杂，有免疫原性，体内不能反复应用，安全性存在隐患以及非导向性，从而病毒载体的使用受限，所以必须进一步改建。非病毒载体可以克服病毒载体的缺陷，具有低细胞毒性和低免疫反应等特点。此外，非病毒载体没有基因尺寸方面的限制，而病毒载体所携带的DNA大小被限制在6-8KDa碱基对。非病毒载体是基因载体的重要补充部分，其体外应用较多，通常利用亲水或疏水的多价阳离子聚合物来凝聚重组质粒或反义寡核苷酸，形成微粒，被细胞内吞。尽管非病毒载体转染效率目前较低，但非病毒载体由于具有低毒、低免疫反应、靶向性和易于组装等优点，人们对非病毒载体的研究也逐步深入。
聚乙烯亚胺(PEI)其每隔3个原子就有1个可质子化的氮原子，所以比起聚赖氨酸等其他聚合物，具有更高的正电荷密度，而且可以在很宽的pH范围内和DNA紧密结合，是聚阳离子复合物中使用最为广泛的载体材料。相对于其它载体，PEI价格低廉、体内外转染效果较高。自由PEI的结构在生理条件下有1/5氨基发生质子化反应，从而使溶酶体肿胀破裂，从而起到“质子海绵”作用，使PEI/DNA复合物得以释放入胞质，很大程度上减少了DNA在吞噬泡内富集并进而被降解的作用，因而可以提高转染效率。带正电的氨基基团能与DNA分子中带负电的磷酸基团相互作用，所形成的纳米级复合物能被细胞内吞。而且PEI还可以抑制溶酶体，在吞噬泡酸性环境中质子化、正电荷增加，对DNA提供更大的保护作用，有利于质粒逃离吞噬泡，因此具有较高的表达效价。但PEI作为基因递释载体还存在一定缺陷，其中一个是细胞毒性问题，如分子量为25KDa的PEI经常作为体外转染的阳性对照，但是其具有较高的毒性。
具有氨基结构、安全低毒，并具有体内抗核酶作用的壳聚糖(chitosan，CS)，是最近颇受人们关注的聚阳离子可生物降解材料。研究显示，这种材料在细胞毒性、密接DNA产物粒径大小控制等方面，具有其独特的优势；尽管采用了包括转铁蛋白配体修饰、聚乙二醇(PEG)嫁接等关键技术，但转染效率不高的问题依然存在。发明人前期的研究工作表明，低分子量的壳聚糖经疏水化修饰得到的壳聚糖硬脂酸嫁接物，在水性介质中可通过自聚集形成胶团，该嫁接物胶团具有肿瘤细胞快速摄取的功能，并具有阳离子的特性，可通过静电相互作用，密接基因药物-质粒DNA，作为一种非病毒类基因载体材料制备的基因药物研究表明，利用壳聚糖硬脂酸嫁接物制备的基因药物，与基因药物本身相比具有高度的基因表达效率，然而，其表到效率远低于市售的利用脂质体(LipofectamineTM 2000)制备的基因药物的表达
本发明采用低分子量的聚乙烯亚胺(重均分子量为800Da)对壳聚糖硬脂酸嫁接物进行进一步的化学嫁接，合成聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸三元嫁接物，并应用于基因药物的制备。通过壳聚糖硬脂酸嫁接物的快速细胞摄取和聚乙烯亚胺强烈的“质子海绵”效应的结合，实现基因药物的高效表达和肿瘤基因治疗的有效性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物，聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物为高分子物质，其单个分子由下式Ⅰ-Ⅳ所示结构单元组成：
其中，壳聚糖链上的部分自由氨基被硬脂酸或重均分子量为800Da的聚乙烯亚胺所取代：R1表示具有17个碳原子的烷基链，结构单元Ⅰ占聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物分子中结构单元的3.46-20.70％；R2表示具有2个碳原子的烷基链，与壳聚糖的脱乙酰度有关，所用壳聚糖的脱乙酰度为95％，因此，结构单元Ⅱ占聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物分子中结构单元的5％；结构单元Ⅲ占聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物分子中结构单元的69.30-86.54％；结构单元Ⅳ占聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物分子中结构单元的5％。
本发明的另一个目的是提供聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成方法，具体通过以下途径实现：
(1)壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成
精密称取重均分子量为18KDa脱乙酰度为95％的壳聚糖5.02g，加330ml蒸馏水搅拌溶解后，加入8.27-27.56g的碳二亚胺，搅拌溶解；精密称取硬脂酸1.26-4.20g溶于170ml乙醇溶液中，将上述两种溶液混合，在磁力搅拌下，80℃恒温反应4小时后，降至室温，继续搅拌6小时至反应液澄清，蒸馏水透析48小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖-硬脂酸嫁接物；
(2)聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成
精密称取壳聚糖-硬脂酸嫁接物0.2g，高碘酸钠0.01g。分别溶于20ml PH4.5的醋酸缓冲溶液中，反应前通氮气2小时除去溶解氧。然后将高碘酸钠溶液滴加入壳聚糖-硬脂酸嫁接物溶液中，冰浴4℃条件下，反应48h后加5ml乙二醇终止反应。接着用去离子水透析24小时，除去反应副产物。将0.125g重均分子量为800Da的聚乙烯亚胺(PEI)溶于5ml蒸馏水，加入到透析液中，4℃条件下，继续搅拌反应48小时后，加入硼氢化钠1g终止反应后，采用去离子水透析48小时，冷冻干燥收集聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物。
本发明的再一个目的是提供聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物在制备基因药物中的应用，具体通过以下途径实现：
精密称取聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物10mg，加10ml蒸馏水溶解，制备成1mg/ml的聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液，水浴超声15分钟后采用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用；采用5ml浓度为25mM的Na2SO4溶液溶解2.5mg质粒DNA溶液，将胶团溶液和质粒DNA溶液按照聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物与质粒DNA的重量比为1∶0.25-1∶128的比例混合后，室温放置25分钟，制备含聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的基因药物。
研究显示，由聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物制备的含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA，在人卵巢癌细胞MCF-7细胞上可实现30.8％的基因表达效率。由聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物制备的色素上皮源性因子(PEDF)质粒，荷人小细胞肺癌(A549)裸鼠模型动物上可实现62.34％的肿瘤抑制率。
本发明的有益之处是：在具有快速细胞摄取功能的壳聚糖-硬脂酸嫁接物的基础上，再化学修饰上小分子量的聚乙烯亚胺，不仅改善了原壳聚糖-硬脂酸嫁接物分子结构的疏水性，而且增加了相当数量的氨基，提高了分子的离子缓冲能力，并克服了聚乙烯亚胺的毒性问题。通过壳聚糖硬脂酸嫁接物的快速细胞摄取和聚乙烯亚胺强烈的“质子海绵”效应的结合，可实现基因药物的高效表达和肿瘤基因治疗的有效性。
附图说明
图1为壳聚糖-硬脂酸嫁接物、聚乙烯亚胺和聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的核磁共振氢谱。
图2为不同重量比例的聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物/DNA的粒径与电位。
图3含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA、市售脂质体(LipofectamineTM 2000)与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA复合物、聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA复合物与MCF-7细胞共孵育24-48小时后的的绿色荧光蛋白(GFP)的表达。
具体实施方式
本发明通过实施例作进一步的说明。
实施例1：
(1)壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成
精密称取重均分子量为18KDa脱乙酰度为95％的壳聚糖5.02g，加330ml蒸馏水搅拌溶解后，加入8.27g的碳二亚胺，搅拌溶解；精密称取硬脂酸1.26g溶于170ml乙醇溶液中，将上述两种溶液混合，在磁力搅拌下，80℃恒温反应4小时后，降至室温，继续搅拌6小时至反应液澄清，蒸馏水透析48小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖-硬脂酸嫁接物；经测定嫁接物的硬脂酸接枝率为3.46％.
(2)聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成
精密称取壳聚糖-硬脂酸嫁接物0.2g，高碘酸钠0.01g。分别溶于20ml PH4.5的醋酸缓冲溶液中，反应前通氮气2小时除去溶解氧。然后将高碘酸钠溶液滴加入壳聚糖-硬脂酸嫁接物溶液中，冰浴4℃条件下，反应48h后加5ml乙二醇终止反应。接着用去离子水透析24小时，除去反应副产物。将0.125g重均分子量为800Da的聚乙烯亚胺(PEI)溶于5ml蒸馏水，加入到透析液中，4℃条件下，继续搅拌搅拌反应48小时后，加入硼氢化钠1g终止反应后，采用去离子水透析48小时，冷冻干燥收集聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物。表示为：CSOSA15％-g-PEI。
参见图1，在聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的核磁共振氢谱中既含有壳聚糖-硬脂酸嫁接物，又含有聚乙烯亚胺，表明聚乙烯亚胺与壳聚糖-硬脂酸嫁接物的成功化学嫁接。
(3)聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物基因药物的制备
精密称取聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物(CSOSA15％-g-PEI)10mg，加10ml蒸馏水溶解，制备成1mg/ml的聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液，水浴超声15分钟后采用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用；采用5ml浓度为25mM的Na2SO4溶液溶解2.5mg含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA溶液，将胶团溶液和含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA溶液按照聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA的重量比为1∶0.25-1∶128的比例混合后，室温放置25分钟，制备含聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的基因药物-聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA的复合物。图2为CSOSA15％-g-PEI与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA的复合物的粒径与电位，其中(-○-)表示CSOSA15％-g-PEI与质粒DNA复合物的粒径；(-●-)表示CSOSA50％-g-PEI与质粒DNA复合物的粒径；(-△-)表示CSOSA15％-g-PEI与质粒DNA复合物的表面电位；(-▲-)表示CSOSA15％-g-PEI与质粒DNA复合物的表面电位。
(4)聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物与质粒DNA的复合物的体外基因表达
(a)MCF-7细胞的培养
取人卵巢癌细胞MCF-7，在含有10％小牛血清培养液中连续培养(5％CO2、37℃孵箱)。取对数生长期细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔2×105个细胞的密度接种24孔培养板，孵箱内预培养24小时。
(b)嫁接物与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA的复合物的体外基因表达
转染前24小时内，将MCF-7细胞按2×105/孔接种于24孔细胞培养板中，置37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养至80-90％融合。转染时，吸弃前一天铺制的细胞板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入嫁接物与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA的复合物混悬液以及事先调至一定pH的无血清或含10％FBS的DMEM培养基至终体积0.5ml，继续培养6小时；换用完全培养基，继续培养至72h。
将细胞从培养板上消化下来，加入一定量的PBS分散，然后超声破碎细胞，用荧光分光光度测定荧光值(激发波长488nm，发射波长508nm，狭缝5nm)。
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，再将细胞从培养板上消化下来，用一定量的PBS分散后，用流式细胞仪测定表达效率。
参见图3，是含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA、市售脂质体(LipofectamineTM 2000)与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA复合物、聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA复合物与MCF-7细胞共孵育24-48小时后的的绿色荧光蛋白(GFP)的表达。其中a)含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA，48小时，b)CSOSA15％-g-PEI与质粒DNA复合物，48小时；c)CSOSA50％-g-PEI与质粒DNA复合物，48小时d)市售脂质体(LipofectamineTM 2000)与质粒DNA复合物，24小时。
图3显示单独的含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA与细胞共孵育48小时后，基本没有绿色荧光蛋白GFP)的表达，而CSOSA15％-g-PEI与质粒DNA的复合物的绿色荧光蛋白(GFP)的表达达到30.8％，表达效率与目前常用的阳离子脂质体(LipofectamineTM 2000)稍弱，但细胞毒性明显低于阳离子脂质体。
(5)聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物与质粒DNA的复合物的体内抗肿瘤基因治疗
以色素上皮源性因子(PEDF)质粒为治疗基因，荷人小细胞肺癌(A549)裸鼠为模型动物，通过尾静脉给药，开展聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物基因药物复合物的抗肿瘤基因治疗。按嫁接物材料与pPEDF质粒的重量比为40∶1制备CSOSA15％-g-PEI与pPEDF质粒复合物，CSOSA15％-g-PEI与pPEDF质粒复合物以1.25mgpPEDF/kg/次的给药剂量，通过尾静脉方式，隔5天给药一次，共给与两次。以第一次给药开始计算，第25天处死动物，取出肿瘤，以给予葡萄糖注射液的阴性对照组的肿瘤重量为对照，计算肿瘤抑制率。经计算肿瘤抑制率为62.34％。
实施例2：
(1)壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成
精密称取重均分子量为18KDa脱乙酰度为95％的壳聚糖5.02g，加330ml蒸馏水搅拌溶解后，加入27.56g的碳二亚胺，搅拌溶解；精密称取硬脂酸4.20g溶于170ml乙醇溶液中，将上述两种溶液混合，在磁力搅拌下，80℃恒温反应4小时后，降至室温，继续搅拌6小时至反应液澄清，蒸馏水透析48小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖-硬脂酸嫁接物；经测定嫁接物的硬脂酸接枝率为20.7％.
(2)聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成
精密称取壳聚糖-硬脂酸嫁接物0.2g，高碘酸钠0.01g。分别溶于20ml PH4.5的醋酸缓冲溶液中，反应前通氮气2小时除去溶解氧。然后将高碘酸钠溶液滴加入壳聚糖-硬脂酸嫁接物溶液中，冰浴4℃条件下，反应48h后加5ml乙二醇终止反应。接着用去离子水透析24小时，除去反应副产物。将0.125g重均分子量为800Da的聚乙烯亚胺(PEI)溶于5ml蒸馏水，加入到透析液中，4℃条件下，继续搅拌搅拌反应48小时后，加入硼氢化钠1g终止反应后，采用去离子水透析48小时，冷冻干燥收集聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物。表示为：CSOSA50％-g-PEI。
(3)聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物基因药物给药系统的制备
精密称取聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物(CSOSA50％-g-PEI)10mg，加10ml蒸馏水溶解，制备成1mg/ml的聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液，水浴超声15分钟后采用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用；采用5ml浓度为25mM的Na2SO4溶液溶解2.5mg含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA溶液，将胶团溶液和含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA溶液按照聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物与质粒DNA的重量比为1∶0.25-1∶128的比例混合后，室温放置25分钟，制备聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的基因药物-聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA的复合物的粒径与电位。
(4)聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物与质粒DNA的复合物的体外基因表达
(a)MCF-7细胞的培养
取人卵巢癌细胞MCF-7，在含有10％小牛血清培养液中连续培养(5％CO2、37℃孵箱)。取对数生长期细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔2×105个细胞的密度接种24孔培养板，孵箱内预培养24小时。
(b)嫁接物与质粒DNA的复合物的体外基因表达
转染前24小时内，将MCF-7细胞按2×105/孔接种于24孔细胞培养板中，置37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养至80-90％融合。转染时，吸弃前一天铺制的细胞板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入嫁接物与质粒DNA的复合物混悬液以及事先调至一定pH的无血清或含10％FBS的DMEM培养基至终体积0.5ml，继续培养6小时；换用完全培养基，继续培养至72h。
将细胞从培养板上消化下来，加入一定量的PBS分散，然后超声破碎细胞，用荧光分光光度测定荧光值(激发波长488nm，发射波长508nm，狭缝5nm)。
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，再将细胞从培养板上消化下来，用一定量的PBS分散后，用流式细胞仪测定表达效率。
图3含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA、市售脂质体(LipofectamineTM2000)与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA复合物、聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA复合物与MCF-7细胞共孵育24-48小时后的的绿色荧光蛋白(GFP)的表达。由图可知单独的含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA与细胞共孵育48小时后，基本没有绿色荧光蛋白GFP)的表达，而CSOSA50％-g-PEI与质粒DNA的复合物的绿色荧光蛋白(GFP)的表达达到25.7％，表达效率与目前常用的阳离子脂质体(LipofectamineTM2000)稍弱，但细胞毒性明显低于阳离子脂质体。
Claims (4)
1.一种聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物，其单个分子由下式Ⅰ-Ⅳ所示结构单元组成：
其中，壳聚糖链上的部分自由氨基被硬脂酸或重均分子量为800Da的聚乙烯亚胺所取代：R1表示具有17个碳原子的烷基链，结构单元I占聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物分子中结构单元的3.46-20.70％；R2表示具有2个碳原子的烷基链，与壳聚糖的脱乙酰度有关，所用壳聚糖的脱乙酰度为95％，结构单元Ⅱ占聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物分子中结构单元的5％；结构单元Ⅲ占聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物分子中结构单元的69.30-86.54％；结构单元Ⅳ占聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物分子中结构单元的5％。
2.权利要求1所述的聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的制备方法，具体通过以下方式实现：
(1)壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成
称取重均分子量为18KDa脱乙酰度为95％的壳聚糖5.02g，加330ml蒸馏水搅拌溶解后，加入8.27-27.56g的碳二亚胺，搅拌溶解；称取硬脂酸1.26-4.20g溶于170ml乙醇溶液中，将上述两种溶液混合，在磁力搅拌下，80℃恒温反应4小时后，降至室温，继续搅拌6小时至反应液澄清，蒸馏水透析48小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖-硬脂酸嫁接物；
(2)聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成
称取壳聚糖-硬脂酸嫁接物0.2g，高碘酸钠0.01g。分别溶于20ml PH 4.5的醋酸缓冲溶液中，反应前通氮气2小时除去溶解氧，然后将高碘酸钠溶液滴加入壳聚糖-硬脂酸嫁接物溶液中，冰浴4℃条件下，反应48小时后加5ml乙二醇终止反应，再用去离子水透析24小时，除去反应副产物，将0.125g重均分子量为800Da的聚乙烯亚胺溶于5ml蒸馏水，加入到透析液中，4℃条件下，继续搅拌反应48小时后，加入硼氢化钠1g终止反应后，采用去离子水透析48小时，冷冻干燥收集聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物。
3.权利要求1所述的聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物在制备基因药物中的应用，具体通过以下途径实现：
称取聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物10mg，加10ml蒸馏水溶解，制备成1mg/ml的聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液，水浴超声15分钟后采用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用；采用5ml浓度为25mM的Na2SO4溶液溶解2.5mg质粒DNA溶液，将胶团溶液和质粒DNA溶液按照聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物与质粒DNA的重量比为1∶0.25-1∶128的比例混合后，室温放置25分钟，制备含聚乙烯亚胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的基因药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其中的质粒DNA为含绿色荧光蛋白的质粒DNA或色素上皮源性因子质粒。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20111207 Termination date: 20150601 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |