CN101659722B - 甲基丙烯酸酯聚合物及其复合物及它们的制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物，该聚合物自组装修饰的纳米金复合物(PDMAEMAGNPs)及其与质粒DNA的复合物，本发明还公开了上述聚合物、复合物的制备方法及其在作为基因的载体中的应用。本发明的PDMAEMAGNPs与GFP DNA(绿色荧光蛋白表达基因)的复合物，在浓度为30μg/mL时，对HEK 293T细胞的转染效率为30％，对HEK 293T细胞、HeLa细胞和293细胞的存活率大于80％。PDMAEMAGNPs/CpG ODN(人未甲基化寡聚脱氧核苷酸)复合物在体外及体内基因治疗中有明显效果。PDMAEMAGNPs/p53 DNA(肿瘤抑制基因)纳米复合物对肿瘤生长抑制率30-37％。
Description
技术领域
本发明涉及一种甲基丙烯酸酯聚合物、该聚合物的纳米金复合物及其质粒DNA的复合物，本发明还涉及这些聚合物、复合物的制备方法及其在作为基因载体方面的应用。
背景技术
金纳米粒子的研究已经有150年历史。金纳米粒子具有抗氧化性强、生物相容性好、密度高和光电特性好的优点，基于金纳米粒子的生物分析方法已经取得了很多成果。表面包被有单分子层的金纳米团簇(Au2MPCs)同核酸、蛋白质和细胞膜等生物物质发生作用，能应用于生物医学的各个研究领域。
美国CytImmune Sciences公司与荷兰的OctoPlus公司合作开发胶体金纳米颗粒作为可能输送抗癌蛋白质TNF(肿瘤坏死因子)的技术，并计划于2003年进入I期临床试验。尽管TNF具有明显的癌治疗潜能，但是，在不引起副作用(如低血压和一些病例完全器官衰竭导致死亡)的情况下，治疗量TNF从未被成功地输送过。动物模型试验表明，当TNF与胶体金(由氯化金和枸橼酸金组成)偶合时，TNF能被安全地输送有效剂量。CytImmune公司的科学家发现，通过与金偶合能消除生物活性物质的毒性。因为TNF与胶体金的表面结合，所以CytImmune公司的第一个配方是用TNF将胶体金纳米颗粒饱和，并将其注入小鼠体内。但随后发现在循环过程中这些胶体金颗粒被器官如肝和胰脏摄取而不能到达肿瘤。因此，即使能输送较大剂量的TNF，但生物活性未见改善。随后，研究人员发现，在TNF分子之间放入线性聚乙二醇(PEG)片段，使之与圆形的胶体金纳米颗粒边缘结合。这些PEG片段当与血液接触时被水合，使得整个颗粒被淹没在水中，从而产生令人惊异的作用。它还被免疫系统认为是参与人体内循环的一部分。CytImmune公司所用的胶体金纳米颗粒为25nm，足以通过围绕肿瘤血管上的洞(直径约100nm)。由于健康器官或血管之间的空间仅为5nm，因此胶体金颗粒能进入肿瘤，但不能进入任何健康器官。一旦颗粒进入肿瘤，TNF即发挥其生物作用。动物试验结果显示胶体金技术输送到肿瘤的TNF数量比其它方法高10倍。由于输送所用的胶体金极为微量，所以难于确定它的可能毒性。科学家还认为，在输送有效成份后胶体金纳米颗粒通过肾过滤，不会因积累而构成对人体的威胁。胶体金第一次被开发用作TNF药物输送，这项技术现已获得美国和欧洲专利。目前，它不仅被开发用于输送TNF，还将输送紫杉醇等其它物质。
文献[1]报道了阳离子脂质双层包裹的金纳米粒子调节对哺乳动物细胞转染的影响。二甲基二十八烷基溴化铵(DODAB)，阳离子脂质体双层膜包裹的Au纳米颗粒(AuNPs)在血清中能够有效的传递两种质粒DNA到人胚胎肾肝细胞(HEK 293)中，AuNPs的转染效率约是DODAB的5倍。AuNPs与DNA的相互作用由染料插入试验和凝胶电泳表征，文献提出了理解和控制阳离子脂质体和DNA相互作用的新观点，为构建金纳米粒子基因传递载体提供了新方法。
平均分子量为2kDa(PEI2)的支化聚乙烯亚胺(PEI)与金纳米颗粒(GNPs)共价键连接[2]构成PEI2-GNPs融合物，PEI2-GNPs与质粒DNA的复合物体外转染猴肾细胞(COS-7)的效率是PEI2的12倍。而PEI2-GNPs和N-十二烷基-PEI2与质粒DNA的复合物对上述细胞的转染效率进一步提高。具体转染数据是：单独的PEI2转染效率为4％，PEI2-GNPs转染效率为25％，而PEI2-GNPs和N-十二烷基-PEI2混合物与质粒DNA的复合物的转染效率为50％。
文献[3]报道了通过可逆加成-断裂连迁移聚合(RAFT)合成精细共聚物稳定的金属纳米颗粒的制备。反应通过室温条件自发还原硫代酯末端基团成巯基，在金属复合物或金属溶胶的水溶液中生成共聚物稳定的金属纳米颗粒。共聚物稳定的纳米颗粒包括Au(HAuCl4)，Ag(AgNO3)，Pt(Na2PtCl6.6H2O)，和Rh(Na3RhCl6)，使用0.01wt％的盐溶液和1.0M NaBH4作为还原试剂，NaBH4：末端硫代酯聚合物的摩尔比率是25∶1，通过13000rpm离心1小时，得到共价键连接的聚合物胶体溶液。
文献[4]报道了脂肪链季铵盐修饰的混合单层保护的金颗粒(MMPCs)对哺乳动物细胞的转染，通过β牛乳糖转移和活化证实这种转染试剂与孵育期间DNA与纳米颗粒的比率，单层核中电荷的数量，季铵盐周围的缩水填充等因素有关。MMPCs和质粒DNA复合物的重量比(w/w)为30∶1，在10％和100μM氯喹溶液中转染293T细胞效率是60kDa聚乙烯亚胺的8倍。
文献[5]报道了寡聚核酸修饰的金纳米颗粒用于控制细胞中蛋白质表达，这种修饰的金纳米颗粒是一种细胞内在化基因调控试剂，它与互补核酸结合率高于单一寡聚核酸修饰，没有细胞毒性，能高效浓缩核酸，也很难被活性核酸酶降解，细胞摄取率达99％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高细胞转染率、低细胞毒性的端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物、此聚合物与金纳米粒子自组装构建的金纳米复合物及其与质粒DNA的复合物。
本发明的另一个目的在于提供端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物与、此聚合物与金纳米粒子自组装构建的金纳米复合物的制备方法。
本发明的第三个目的在于端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯、此聚合物与金纳米粒子自组装构建的金纳米复合物在作为基因载体中的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
一种端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物，其结构式如下：
其中，n＝25-57，所述的聚合物的数均摩尔质量为4000-9000Da，数均摩尔质量和重均摩尔质量比在1.1-1.35之间，对[H+]缓冲容量在2.0-3.8μmol/mg。
一种端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯自组装修饰的纳米金复合物，其结构式如下：
其中，n＝25-57，所述的聚合物的数均摩尔质量为4000-9000Da，数均摩尔质量和重均摩尔质量比在1.1-1.35之间，对[H+]缓冲容量在2.0-3.8μmol/mg。
一种端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯自组装修饰的纳米金复合物，所述的纳米复合物为端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物嫁接1-9个金原子构成的纳米颗粒。
一种端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯自组装修饰的纳米金复合物与质粒DNA的复合物，所述的质粒DNA选自p53DNA，绿色荧光蛋白质粒DNA，或人未甲基化寡聚脱氧核苷酸质粒DNA。
所述的纳米金复合物质量浓度为30mg/mL，所述的纳米金复合物与质粒DNA质量比为5∶1，10∶1，15∶1或20∶1。
所述的纳米金复合物与质粒DNA的复合物，其特征在于，嫁接在金表面的端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物与质粒DNA正负电荷比的范围为4-12。
一种端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物的制备方法，通过以下步骤实现：
a.通过乙基黄原酸钾和溴乙烷反应得到乙基黄原酸乙酯；
b.乙基黄原酸乙酯和2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯在偶氮二异丁腈催化下进行可逆加成-断裂连迁移聚合反应，得到黄原酸乙酯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯；
c.将步骤b中的产物黄原酸乙酯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯溶解在四氢呋喃溶液中，滴加过硫酸铵溶液，充氮气后，加入正丁胺，反应混合物加入己烷沉淀、过滤，得到端巯基聚2-二甲氨基-甲基丙烯酸酯。
一种端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯自组装修饰的纳米金复合物的制备方法，通过以下步骤实现：
将氯金酸与端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物混合，添加去离子水后，搅拌，还原，静置，磷酸盐缓冲溶液透析，并定容。
一种端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物在作为基因载体中的应用。
一种端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯自组装修饰的纳米金复合物在作为基因载体中的应用。
本发明具有如下有益效果：
PDMAEMAGNPs和PDMAEMAGNPs/质粒DNA纳米复合物的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2)稳定，Zeta电位研究表明纳米基因复合物带正电，用扫描电镜观察PDMAEMAGNPs/GFP质粒DNA纳米复合物的粒径在80-200nm，该粒径范围的纳米复合物有利于对细胞有效转染，并具有绿色荧光蛋白表达效果；PDMAEMAGNPs/CpG ODN纳米复合物对小鼠具有体外免疫疗效；PDMAEMAGNPs/p53DNA纳米复合物对鼠肿瘤具有体内外治疗效果，具体效果如下：
1.PDMAEMAGNPs/GFP DNA纳米复合物缓冲溶液中呈现紫红色胶体、稳定、结合基因能力强。
2.PDMAEMAGNPs/GFP DNA纳米复合物转染HEK 293T细胞后有利于质粒DNA释放，转染效率为30％。
3.PDMAEMAGNPs和PDMAEMAGNPs/GFP DNA纳米复合物浓度在30μg/mL时，细胞存活率大于80％。
4.PDMAEMAGNPs/CpG ODN纳米复合物对小鼠的脾细胞和胰腺细胞的体外免疫活性显示免疫效果大于30％。
5.PDMAEMAGNPs/p53DNA纳米复合物对鼠骨肉瘤细胞的体外和体内基因治疗效果显示有明显的肿瘤受抑制。
6.MPDMAEMA/GFP DNA纳米复合物对293T细胞的转染效率小于5％，但细胞毒性与PDMAEMAGNPs基本相同。
具体实施方式
例1：乙基黄原酸乙酯的合成
在500mL圆底烧瓶中加入100mL三氯甲烷，0.1mol溴乙烷，0.11mol乙基黄原酸钠，室温下搅拌72h，减压过滤分离，用三氯甲烷洗涤，饱和碳酸氢钠洗涤，无水硫酸镁干燥，蒸馏除去溶剂，得到黄色油状液体，硅胶柱色谱分离，洗脱剂为己烷和乙酸乙酯混合溶剂(体积比90∶10)，得到乙基黄原酸乙酯。
1H NMR(CDCl3)：1.11，3.57，2.91，1.31
13C NMR(CDCl3)：13.5，60.5，72.0，24.5，15.5
合成路线：
实例2：黄原酸乙酯基聚2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯(OPDMAEMA)的合成
在5mL圆底烧瓶中加入1g 2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)，4mg偶氮二异丁腈(AIBN)，80mg乙基黄原酸乙酯和2mL四氢呋喃，[乙基黄原酸乙酯]∶[AIBN]＝20。液氮冷冻去除氧气，再减压去氧后密封，70℃水浴中反应48h。冷却至室温后加入过量己烷沉淀、分离聚合物-黄原酸乙酯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯(OPDMAEMA)。聚合物用1H NMR表征，D4-甲醇和D-氯仿为溶剂。
1H NMR(CDCl3)：1.11，3.57，1.69，1.33，0.96，2.27，4.18，2.64
13C NMR(CDCl3)：13.5，60.5，172.0，50.6，39.7，16.4，14，22.1，41.2，58.2，66.1，174.5
实例3：由OPDMAEMA制备端巯基聚2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯(MPDMAEMA)
将OPDMAEMA溶解在四氢呋喃溶液中，滴加数滴过硫酸铵溶液，充氮气30min后，加入正丁胺，在氮气保护下搅拌5h。反应混合物加入到10倍过量的己烷中，沉淀、过滤，得到端巯基聚2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯(MPDMAEMA)。
1H NMR(CDCl3)：1.5，1.9，1.33，0.96，1.69，4.18，2.64，2.27
13C NMR(CDCl3)：44.9，42.4，16.4，13.6，24.3，174.5，65.7，58.2，41.2
实例4：MPDMAEMA在纳米金表面的自组装产物(PDMAEMAGNPs)
在100mL的园底烧瓶中加入4mL氯金酸(重量比1000∶1)，30mgMPDMAEMA浓度为(10mg/mL)，3mL去离子水，剧烈搅拌15min。然后加入10vL(100mM)硼氢化钠，继续搅拌60min。静置过夜，然后在磷酸盐缓冲溶液中透析24h，定容为2mg/mL，得到PDMAEMAGNPs复合物。
| MPDMAEMA(mg/mL) | 10* | 30** | 100*** |
| HAuCl4(0.1％)/mL | 4 | 4 | 4 |
| 颜色 | 紫色 | 红色 | 红色 |
| 粒径(nm) | 70-100 | 20-30 | 10-15 |
*最终形成复合物记为：a
**最终形成复合物记为：b
***最终形成复合物记为：c
实例5：PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物
PDMAEMAGNPs(b)磷酸钠缓冲溶液与GFP DNA混合(质量比为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1)，在37℃下震摇30min，用去离子水透析4h，滴加到洁净的硅片上，用扫描电镜观察形貌。且于4℃冰箱中储存，用于细胞转染和检验细胞毒性。
| PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA(质量比) | 5∶1 | 10∶1 | 15∶1 | 20∶1 |
| 颜色 | 浅红色 | 浅红色 | 浅红色 | 浅红色 |
| 粒径(nm) | 80-200 | 80-200 | 80-200 | 80-200 |
实例6.PDMAEMAGNPs/GFP DNA纳米复合物在十二烷基硫酸钠和氯化钠溶液中的稳定性
PDMAEMAGNPs/GFP DNA纳米复合物对盐溶液的稳定性用凝胶电泳实验证明。十二烷基硫酸钠(SDS)浓度为1％和10％；氯化钠溶液浓度为0.5M，1M和1.5M。结果显示PDMAEMAGNPs/质粒DNA纳米复合物在大于1M氯化钠溶液或1％十二烷基硫酸钠溶液中稳定性差。
实例7.PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物转染HEK 293T细胞
PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物加入到平面培养的细胞中，24孔板中每孔种植5万个HEK 293T细胞，转染时间为6h。更换新鲜培养基，继续培养36h，用流式细胞仪研究PDMAEMAGNPs(b)与GFP DNA在各种质量比例条件下细胞的绿色荧光蛋白表达效率。
| PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA(质量比) | 5∶1 | 10∶1 | 15∶1 | 20∶1 |
| 荧光蛋白表达效率％ | 31 | 39 | 36 | 34 |
实例8.PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物转染HeLa细胞
PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物加入到平面培养的细胞中，24孔板中每孔种植5万个HEK 293T细胞，转染时间为6h。更换新鲜培养基，继续培养36h，用流式细胞仪研究PDMAEMAGNPs(b)与GFP DNA在各种质量比例条件下细胞的绿色荧光蛋白表达效率。
| PDMAEMAGNPs(b)/GFPDNA(质量比) | 5∶1 | 10∶1 | 15∶1 | 20∶1 |
| 荧光蛋白表达效率％ | 2.1 | 3.7 | 3.5 | 3.8 |
实例9.PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物转染293细胞
PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物加入到平面培养的细胞中，24孔板中每孔种植5万个HEK 293T细胞，转染时间为6h。更换新鲜培养基，继续培养30h，用流式细胞仪研究PDMAEMAGNPs(b)与GFP DNA在各种质量比例条件下细胞的绿色荧光蛋白表达效率。
| PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA(质量比) | 5∶1 | 10∶1 | 15∶1 | 20∶1 |
| 荧光蛋白表达效率％ | 3.0 | 3.6 | 3.4 | 3.1 |
实例10.MPDMAEMA/GFP DNA纳米复合物转染HEK 293T细胞
MPDMAEMA/GFP DNA纳米复合物加入到平面培养的细胞中，24孔板中每孔种植5万个HEK 293T细胞，转染时间为6h。更换新鲜培养基，继续培养36h，用流式细胞仪研究MPDMAEMA与GFP DNA在各种质量比例条件下细胞的绿色荧光蛋白表达效率。
| PDMAEMA/GFP DNA(质量比) | 5∶1 | 10∶1 | 15∶1 | 20∶1 |
| 荧光蛋白表达效率％ | 3.3 | 4.2 | 3.9 | 3.5 |
实例11.MPDMAEMA/GFP DNA纳米复合物转染HeLa细胞
MPDMAEMA/GFP DNA纳米复合物加入到平面培养的细胞中，24孔板中每孔种植5万个HEK 293T细胞，转染时间为6h。更换新鲜培养基，继续培养36h，用流式细胞仪研究MPDMAEMA与GFP DNA在各种质量比例条件下细胞的绿色荧光蛋白表达效率。
| MPDMAEMA/GFPDNA(质量比) | 5∶1 | 10∶1 | 15∶1 | 20∶1 |
| 荧光蛋白表达效率％ | 1.7 | 1.7 | 2.5 | 3.5 |
实例12.MPDMAEMA/GFP DNA纳米复合物转染293细胞
MPDMAEMA/GFP DNA纳米复合物加入到平面培养的细胞中，24孔板中每孔种植5万个HEK 293T细胞，转染时间为6h。更换新鲜培养基，继续培养30h，用流式细胞仪研究PDMAEMA与GFP DNA在各种质量比例条件下细胞的绿色荧光蛋白表达效率。
| MPDMAEMA/GFP DNA(质量比) | 5∶1 | 10∶1 | 15∶1 | 20∶1 |
| 荧光蛋白表达效率％ | 2.2 | 3.2 | 2.9 | 2.8 |
实例13：PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物对小鼠肺和脊髓内鞘的体内转染
PDMAEMAGNPs(b)质量浓度为30μg/mL，PDMAEMAGNPs与GFPDNA的质量比分别为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1。分别对小鼠尾静脉注射四种比例的PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物，48h后处死小鼠，取小鼠肺和脊髓进行切片，在荧光显微镜下计数PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA转染小鼠肺和脊髓内鞘的效率。
| PDMAEMAGNPs(b)/GFPDNA(质量比) | 5∶1 | 10∶1 | 15∶1 | 20∶1 |
| 小鼠肺转染效率％ | 1.2 | 3.5 | 2.7 | 2.2 |
| 脊髓内鞘转染效率％ | 30 | 33 | 34 | 35 |
实例14.PDMAEMAGNPs(b)对HEK 293T细胞的毒性
两万个HEK 293T细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM培养基/10％胎牛血清溶液中PDMAEMAGNPs(b)浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM培养基代替，每孔分别加入20μL MTT(噻唑兰)。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性。
| PDMAEMAGNPs(b)(μg/mL) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 细胞存活率％ | 92 | 87 | 82 | 73 | 65 | 57 |
实例15.PDMAEMAGNPs(b)对HeLa细胞的毒性
两万个HeLa细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM培养基/10％胎牛血清溶液中PDMAEMAGNPs(b)浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM培养基代替，每孔分别加入20μLMTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性。
| PDMAEMAGNPs(b)(μg/mL) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 细胞存活率％ | 92 | 87 | 82 | 73 | 65 | 57 |
实例16.PDMAEMAGNPs(b)对293细胞的毒性
两万个293细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM培养基/10％胎牛血清溶液中PDMAEMAGNPs浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM培养基代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性。
| PDMAEMAGNPs(b)(μg/mL) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 细胞存活率％ | 92 | 87 | 82 | 73 | 65 | 57 |
实例17.MPDMAEMA对HEK 293T细胞的毒性
两万个HEK 293T细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM培养基/10％胎牛血清溶液中MPDMAEMA浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM培养基代替，每孔分别加入20μLMTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性。
| MPDMAEMA(μg/mL) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 细胞存活率％ | 90 | 85 | 84 | 78 | 75 | 66 |
实例18.MPDMAEMA对HeLa细胞的毒性
两万个HeLa细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM培养基/10％胎牛血清溶液中MPDMAEMA浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM培养基代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性。
| MPDMAEMA(μg/mL) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 细胞存活率％ | 91 | 89 | 85 | 83 | 79 | 73 |
实例19.MPDMAEMA对293细胞的毒性
两万个293细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM培养基/10％胎牛血清溶液中MPDMAEMA浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM培养基代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性。
| MPDMAEMA(μg/mL) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 细胞存活率％ | 90 | 86 | 84 | 83 | 77 | 71 |
实例20.PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物对HEK 293T细胞的毒性
两万个HEK 293T细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM培养基/10％胎牛血清溶液中PDMAEMAGNPs/GFP DNA纳米复合物浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM培养基代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性。
| PDMAEMAGNPs(b)(μg/mL) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 细胞存活率％ | 92 | 87 | 82 | 73 | 65 | 57 |
实例21.PDMAEMAGNPs/GFP DNA纳米复合物对HeLa细胞的毒性
两万个HeLa细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM培养基/10％胎牛血清溶液中PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM培养基代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性。
| PDMAEMAGNPs(b)(μg/mL) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 细胞存活率％ | 90 | 84 | 83 | 78 | 69 | 63 |
实例22.PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物对293细胞的毒性
两万个293细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM培养基/10％胎牛血清溶液中PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM培养基代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性。
| PDMAEMAGNPs(b)(μg/mL) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 细胞存活率％ | 91 | 85 | 84 | 76 | 69 | 61 |
实例23.PDMAEMAGNPs(b)/CpG ODN纳米复合物对小鼠的脾细胞和胰腺细胞的体外免疫活性
固定PDMAEMAGNPs的浓度为30μg/mL，改变CpG ODN的浓度，对小鼠脾细胞和胰腺细胞分别用上述不同比例的PDMAEMAGNPs/CpG ODN纳米复合物孵育3天，用酶标仪测试脾细胞免疫和胰腺细胞活性。
| PDMAEMAGNPs(b)/CpG ODN(质量比) | 5∶1 | 10∶1 | 15∶1 | 20∶1 |
| 脾细胞免疫活性％ | 30 | 33 | 37 | 38 |
| 胰腺细胞活性％ | 33 | 35 | 36 | 35 |
实例24.PDMAEMAGNPs(b)/p53DNA纳米复合物对鼠骨肉瘤细胞的体外治疗
固定PDMAEMAGNPs(b)的浓度为30μg/mL，改变p53DNA的浓度，使其质量比分别为5∶1，10∶1，15∶1和20∶1，对鼠骨肉瘤细胞的体外基因进行治疗。鼠骨肉瘤细胞用PDMAEMAGNPs(b)/p53DNA纳米复合物孵育3天，测试体外基因治疗显示肿瘤增长受抑制率。
| PDMAEMAGNPs(b)/p53DNA(质量比) | 5∶1 | 10∶1 | 15∶1 | 20∶1 |
| 肿瘤增长受抑制率％ | 30 | 37 | 35 | 36 |
实例25.PDMAEMAGNPs(b)/p53DNA纳米复合物对鼠骨肉瘤细胞的体内基因治疗
固定PDMAEMAGNPs(b)的浓度为30μg/mL，改变p53DNA的浓度，使其质量比分别为5∶1，10∶1，15∶1和20∶1，对鼠骨肉瘤细胞的体内基因进行治疗。鼠骨肉瘤细胞用PDMAEMAGNPs(b)/p53DNA纳米复合物孵育3天，测试体外基因治疗显示肿瘤增长受抑制率。
| PDMAEMAGNPs(b)/p53DNA(质量比) | 5∶1 | 10∶1 | 10∶1 | 20∶1 |
| 肿瘤增长受抑制率％ | 31 | 36 | 35 | 33 |
结论及分析
MPDMAEMA在金纳米颗粒上组装构建的PDMAEMAGNPs纳米材料，在金含量固定的条件下，PDMAEMAGNPs的粒径随着MPDMAEMA含量的增大由100nm逐渐变小到约10nm，溶液的颜色由紫色逐渐变成亮红色。MPDMAEMA组装到金表面的质量百分含量由10增加到40以上。
PDMAEMAGNPs(b)浓缩GFP DNA的复合物的形貌特征是GFP DNA被PDMAEMAGNPs中的PDMAEMA浓缩，形成粒径大于PDMAEMAGNPs的纳米颗粒；PDMAEMAGNPs/GFP DNA复合物在1％十二烷基硫酸钠中不稳定，在高浓度氯化钠溶液中不稳定，在去离子水或磷酸钠缓冲溶液中稳定；PDMAEMAGNPs/GFP DNA复合物对HEK 293T细胞的绿色荧光蛋白表达结果显示转染效率大于30％，对HeLa细胞和293细胞的转染效率低。
对小鼠实验结果表明，PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA复合物对小鼠的脊髓内鞘细胞的转染效率高30％，而对小鼠的肺转染效率很低。PDMAEMAGNPs(b)/CpG ODN纳米复合物对小鼠的脾细胞和胰腺细胞的体外免疫活性显示免疫效果大于30％。PDMAEMAGNPs(b)/p53DNA纳米复合物对鼠骨肉瘤细胞的体外和体内基因治疗效果显示肿瘤受抑制率高于30％。
上述PDMAEMAGNPs，PDMAEMAGNPs(b)/GFP DNA复合物纳米复合物的细胞毒性结果显示，没有明显的细胞毒性。表明对癌细胞的免疫结果和对肿瘤的抑制效果显示阳性。
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Claims (9)
1.一种端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物，其结构式如下：
其中，n＝25-57，所述的聚合物的数均摩尔质量为4000-9000Da，重均摩尔质量和数均摩尔质量比在1.1-1.35之间，对[H+]缓冲容量在2.0-3.8μmol/mg。
2.一种端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯自组装修饰的纳米金复合物，其结构式如下：
其中，n＝25-57，所述的复合物的数均摩尔质量为4000-9000Da，重均摩尔质量和数均摩尔质量比在1.1-1.35之间，对[H+]缓冲容量在2.0-3.8μmol/mg。
3.如权利要求2所述的纳米金复合物，其特征在于，所述的纳米复合物为端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物嫁接1-9个金原子构成的纳米颗粒。
4.一种如权利要求2所述的端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯自组装修饰的纳米金复合物与质粒DNA的复合物，其特征在于，所述的质粒DNA选自p53DNA，绿色荧光蛋白质粒DNA，或人未甲基化寡聚脱氧核苷酸质粒DNA。
5.如权利要求4所述的纳米金复合物与质粒DNA的复合物，其特征在于，所述的纳米金复合物与质粒DNA质量比为5∶1，10∶1，15∶1或20∶1，所述的纳米金复合物的质量浓度为30μg/mL。
6.如权利要求4或5所述的纳米金复合物与质粒DNA的复合物，其特征在于，所述端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物嫁接在金表面，该嫁接在金表面的端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物与质粒DNA正负电荷比的范围为4-12。
7.一种如权利要求2所述的端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯自组装修饰的纳米金复合物的制备方法，通过以下步骤实现：
将氯金酸与端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物混合，添加去离子水后，搅拌，还原，静置，磷酸盐缓冲溶液透析，并定容。
8.如权利要求1所述的端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯聚合物在作为基因载体中的应用。
9.如权利要求2所述的纳米金复合物在作为基因载体中的应用。
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