CN103214672B - 一种低分子量pei衍生物及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可降解含亚胺键的低分子量PEI衍生物、其制备方法及其在核酸药物输送中的应用。所述的低分子量PEI衍生物结构式为：或其中，x为1～20，y为1～20。其制备方法为：将低分子量的聚乙烯亚胺与邻苯二甲醛或间苯二甲醛按摩尔比为1∶1-1∶3.5配置为无水乙醇溶液，在无水无氧环境下，室温发生醛基与氨基的缩合反应，得到低分子量PEI衍生物。该衍生物具有较高的转染活性和较低的细胞毒性，在不同的细胞中均有较好的生物活性，是一种高效、低毒的基因输送载体。

Description

一种低分子量PEI衍生物及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种低分子量PEI衍生物及其制备方法和应用，特别涉及一种可降解含亚胺键的低分子量PEI衍生物、其制备方法和其在核酸药物(DNA和RNA)输送中的应用。

背景技术

基因治疗，是将外源性基因物质(DNA或RNA)导入细胞，促进或者抑制特定蛋白的表达，或者取代、修复有问题的基因，从而达到疾病治疗的目的。基因治疗在其发展过程中遇到了一系列技术瓶颈，其中最重要的瓶颈之一是基因物质安全有效的体内输送。

目前常用的基因输送载体可以分为病毒载体及非病毒载体。其中，病毒载体虽然具有较高的转染效率，但由于病毒的变异会引起潜在的致病危险，并且病毒表面成分会引起人体免疫反应，同时病毒载体的制备和纯化困难且担载基因量小；而非病毒载体具有基因担载密度和担载量大、制备简单，便于化学修饰等优势。因此，非病毒基因载体被认为是更理想的基因物质输送载体。但是非病毒载体也存在着化学毒性大的缺点，例如聚乙烯亚胺(PEI)是目前研究最为广泛的非病毒载体，其中分支状分子量为25kDa的PEI转染效率最高，但是PEI25kDa同时因其烷基骨架无法降解而导致其细胞累计毒性较大。多数的国内外专家将其研究集中在可降解的PEI衍生物方面。

犹他大学的SungWanKim等人在《缓控释杂志》(JournalofControlledRelease2005，103：209-219)上发表“Polyethyleniminewithacid-labilelinkagesasabiodegradablegenecarrier(用酸降解连接剂聚PEI作为基因载体)”的文章，该文章采用戊二醛作为连接剂与低分子量PEI(1800Da)交联，生成特征性的含有亚胺键连接的可降解聚乙烯亚胺类，其结构特点是：与基因形成的复合物被细胞摄取后，凝聚基因在细胞内的内吞体和溶酶体的酸性条件下，与低分子量PEI直接相连的亚胺键断开，生成无细胞毒性的低分量PEI，但是含亚胺键的聚合结构不能保证这一载体携带核酸进入细胞之前足够稳定，另外，与PEI25KDa对照，其转染活性也一般。

Jin等人申请一项题为“Polycationicgenecarriersformedofendogenousaminogroup-bearingmonomers(内源性氨基基团的单体形成聚阳离子基因载体)”的PCT专利(WO2009/100645A1)，该专利中采用人体内源性专职凝聚基因的小分子单体精胺分别与1，4-丁二醇二氯甲酸酯、1，4-丁二酰氯和乙二醛等三个连接剂缩合得到分别含有氨酯键、酰胺键和亚胺键等聚精胺阳离子，这些聚精胺阳离子均表现出良好的核酸输送能力，而且，聚合物通过生物响应性降解能够回归到精胺内源性单体的初始状态，具有良好的生物相容性，但该技术的缺陷在于：含有氨酯键、酰胺键的降解速率比较慢，导致核酸物质无法及时从内涵体里逃逸，影响核酸输送效率；含有亚胺键的降解速率比较快，但是载体的不稳定性致使其输送的核酸物质尚未到达胞质，便从胞外释放出来，转染效率大大降低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的上述不足，提供一种可降解含亚胺键的低分子量PEI衍生物、其制备方法及其在核酸药物(DNA和RNA)输送中的应用。本发明使用低毒而无转染活性的低分子量聚乙烯亚胺与安全性已知的药物代谢产物邻苯二甲醛或间苯二甲醛制备的可降解含亚胺键的低分子量PEI衍生物作为基因载体具有高效、低毒、可降解为起始状态小分子的优点，可以用于基因物质(DNA和RNA)的输送。

本发明的技术方案如下：

一种可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺(PEI)衍生物，其结构式为：

其中，x为1～20，y为1～20。

优选地，所述可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物的基本构建单元为低分子量聚乙烯亚胺(PEI)，所述低分子量聚乙烯亚胺(PEI)选自重均分子量Mw＝800Da/数均分子量Mn＝600Da或重均分子量Mw＝1300Da/数均分子量Mn＝1200Da或重均分子量Mw＝2000Da/数均分子量Mn＝1800Da或重均分子量Mw低于2000Da的任一低分子量聚乙烯亚胺(PEI)。本发明中低分子量聚乙烯亚胺采用以上的毒性小或无毒的小分子量PEI，以尽量降低其化学毒性。

一种可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺(PEI)衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将低分子量聚乙烯亚胺(PEI)与邻苯二甲醛或间苯二甲醛按摩尔比为1∶1-1∶3.5的比例加到无水乙醇溶剂中，得到反应体系；具体地，可以将低分子量聚乙烯亚胺(PEI)、邻苯二甲醛或间苯二甲醛分别溶解，或者共同溶解在无水乙醇中；发明人经过多次实验证明，在低分子量聚乙烯亚胺(PEI)与邻苯二甲醛或间苯二甲醛的摩尔比为1∶1-1∶3.5的范围内都可以实现本发明目的，而如果采用高于最高比例的摩尔比，则得到的产物不溶于水，如果采用低于最低比例的摩尔比，得到的衍生物分子量较太小，不能满足本发明目的需要；其中低分子量聚乙烯亚胺(PEI)与邻苯二甲醛或间苯二甲醛的摩尔比较优地为1∶2.5，以下实施例中，将仅以该优选比例为例进行说明，但这并不限制本发明在上述定义的1∶1-1∶3.5的范围内都可以实施并达到本发明的目的，因此不能理解为本发明的保护范围受到以下优选实施例的限制。

(2)在无水无氧条件下，搅拌、摇动或震荡反应体系，使上述低分子量聚乙烯亚胺(PEI)与邻苯二甲醛或间苯二甲醛发生缩合反应，然后进行分离纯化，即得可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺(PEI)衍生物。通常，反应温度采用室温。

其中，低分子量聚乙烯亚胺(PEI)与邻苯二甲醛反应得到的衍生物记为PEI-OP，低分子量聚乙烯亚胺(PEI)与间苯二甲醛反应得到的衍生物记为PEI-IP。

优选地，所述低分子量聚乙烯亚胺(PEI)选自重均分子量Mw＝800Da/数均分子量Mn＝600Da或重均分子量Mw＝1300Da/数均分子量Mn＝1200Da或重均分子量Mw＝2000Da/数均分子量Mn＝1800Da或重均分子量Mw低于2000Da的任一低分子量聚乙烯亚胺(PEI)。

优选地，所述分离纯化包括以下步骤：将制备的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺(PEI)衍生物用超纯水溶解后，置于活化后的透析袋中透析，所述透析袋的截留分子量可根据需要在7k～10k之间选择；透析结束后，用微孔滤膜过滤，所述微孔滤膜的孔径可根据需要在0.22～0.45μm之间选择，最后预冻、冻干。采用这种分离纯化方法能尽可能保证获得的高分子的分子量较大且分布较为均一。

优选地，所述透析的时间为12～48小时，具体的透析时间可根据需要选择。由于透析时间太短可能会造成透析不完全，有小分子化合物存在；而透析时间过长聚合物可能会降解，所以本发明优选透析时间为12～48小时，既能保证透析完全，又尽量不使聚合物降解。

一种上述的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺(PEI)衍生物在基因物质输送中的用途。

一种基因物质输送复合物，该复合物是按照如下方法步骤制备而得：将上述的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺(PEI)衍生物溶液加入到DNA或RNA核酸溶液中，混合均匀，然后室温下孵育，即得到该基因物质输送复合物。

优选地，所述DNA或RNA核酸选自DNA疫苗、siRNA或microRNA。

优选地，所述孵育的时间为20～120分钟。由于孵育时间太短可能造成聚阳离子与核酸物质复合不完全，时间过长又不利于核酸稳定存在，所以本发明选取孵育的时间为20～120分钟，既保证了聚阳离子与核酸物质复合完全，又可以使核酸稳定存在。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

第一，本发明制备的含有亚胺键结构的可降解低分子量聚乙烯亚胺PEI衍生物结构简单、易于合成；

第二，本发明制备的含有亚胺键结构的可降解低分子量聚乙烯亚胺PEI衍生物在不同的细胞株中均表现出较高的转染活性(与PEI25KDa和lipofectamine2000相比)，同时具有较低的细胞毒性。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1为本发明实施例1中PEI-OP的合成路线图；

图2为实施例1中PEI-OP的¹H-NMR谱图；

图3为实施例1中PEI-OP的FT-IR谱图；

图4为实施例1中PEI-OP/pDNA复合物的琼脂糖凝胶电泳图；

图5为实施例1中PEI-OP/pDNA复合物的粒径分布和Zeta电位图；

图6为实施例1中PEI-OP/pDNA复合物的原子力显微镜图；

图7为实施例1中PEI-OP/pDNA复合物的透射电子显微镜图；

图8、图9、图10为实施例1中PEI-OP/pDNA复合物的细胞转染图；

图11、图12、图13为实施例1中PEI-OP的细胞毒性图；

图14为实施例2中PEI-IP的合成路线图；

图15为实施例2中PEI-IP的FT-IR谱图；

图16为实施例2中PEI-IP/pDNA复合物的粒径分布和Zeta电位图；

图17为实施例2中PEI-IP/pDNA复合物的细胞转染图；

图18为实施例2中PEI-IP的细胞毒性图。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下实施例中，对可降解含亚胺键的低分子量PEI衍生物与核酸物质形成纳米颗粒复合物(polyplex)的理化性质进行表征的表征方法包括：琼脂糖凝胶电泳、原子力显微镜、透射电子显微镜、动态光散射和Zeta电位测试；其中，与核酸物质形成纳米颗粒复合物(polyplex)的细胞摄取、基因转染选用的DNA质粒是荧光素酶质粒，与核酸物质形成纳米颗粒复合物(polyplex)的基因转染和细胞毒性测试选用的细胞是COS-7细胞、Hella细胞和SMMC-7721细胞。

实施例1

本实施例中PEI-OP的合成路线如图1所示。整个合成反应在无水无氧的环境中进行，具体在本实施例中，采用高纯氮气保护，将PEI800Da和邻苯二甲醛在摩尔比为1：2.5的条件下反应，反应溶剂采用无水乙醇，其中该无水乙醇的处理过程为：无水乙醇加入无水硫酸镁后静置48h，然后蒸馏，得到的新鲜无水乙醇备用。用上述得到的新鲜无水乙醇分别溶解1.2g的PEI800Da和0.268g邻苯二甲醛，配成20mL和50mL溶液。反应在室温条件下搅拌进行，将PEI800Da和邻苯二甲醛混合的方式可以采用：用恒压滴液漏斗逐滴的把邻苯二甲醛溶液加入到PEI800Da溶液中，进行反应，反应24小时。

反应结束后，首先用减压旋转蒸发仪在减压和低温的条件下把反应体系中的大部分溶剂除去，然后将得到的产品用少量超纯水溶解，并置于截留分子量为10000Da的透析袋中透析48小时。透析结束后，得到的溶液用0.22μm的微孔滤膜过滤，所的产品转移到预先准备好的西林瓶中。最后将产品在-20℃冰箱预冻8h后用冷冻干燥机冻干，24h后停止冻干，得到最终产物PEI-OP。

上述得到的PEI-OP的¹H-NMR(CD₃OD和D₂O，300MHz)谱图如图2所示：其中，A样品为邻苯二甲醛，B样品为PEI800Da，C样品为PEI-OP，A样品中δ10.406和10.477为邻苯二甲醛上醛基(-CH＝O)氢的信号，B样品中δ2.541处为PEI800Da氨基氢的信号，C样品中δ7.504为亚胺键(-C＝N)上氢的信号。

上述得到的PEI-OP的FT-IR谱图(溴化钾压片)如图3所示：图中出现1662cm^-1(-CH＝N-)，2942cm^-1、2835cm^-1(-CH2-)，3422cm^-1(-NH-)的特征衍射峰。图2的核磁共振谱图和图3的红外光谱均证明本实施例成功得到了目标产物PEI-OP。

对上述PEI-OP进行分子量测定，测定方法为凝胶渗透色谱(GPC)法，聚乙二醇(PEG)标准品以及实施例制备的PEI-OP为样品，分别用超纯水溶解配制成10mg/mL的溶液，摇匀静置，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，进样20μL，记录色谱图。并计算得出PEI-OP的分子量和分布如下：PEI-OP的数均分子量重均分子量

实施例2

采用实施例1得到的PEI-OP制备基因物质输送复合物，具体方法和步骤如下：

称取一定量聚合物PEI-OP溶解于超纯水中，浓度为2.0mg/mL，并用0.45μm的微孔滤膜过滤后备用；吸取一定量pDNA溶液并用超纯水稀释成20μg/mL的pDNA储备液。按照设定的一系列PEI-OP和pDNA的质量比：0，0.5，1，3，5，10，20，30，50，将PEI-OP溶液稀释成相应浓度，再迅速加入到相同体积且浓度恒定的pDNA溶液中，使pDNA终浓度是2μg/mL，最后轻轻吹打、均匀混合，室温下孵育20～30分钟，即得到一系列不同质量比的基因物质输送复合物溶液。

对上述得到的复合物溶液进行如下理化性质表征：

1.琼脂糖凝胶电泳

称取1.0g琼脂糖，加入100mL1×TAE缓冲液(电泳缓冲液)，在微波炉中加热溶解，待温度降至65℃，加入4μL溴化乙啶(EB)，配制成1.0％琼脂糖溶液(含0.5μg/mL溴化乙啶)，将该溶液倒入制胶槽中，插入样品梳，室温放置0.5-1小时固化成胶。然后，拔出样品梳，电泳槽中加入TAE缓冲液稍稍没过凝胶，等待上样。接着，按照复合物的制备方法来配制不同质量比的复合物溶液，PEI-OP/pDNA质量比依次为0，0.5，1，3，5，10，20，30，50。Marker(电泳参照物)选用DS^TM5000(100-5000bp)，上样5μL；6×上样缓冲液(溴酚兰-甘油指示剂，含0.25％溴酚兰，40％甘油)1μL与复合物溶液5μL均匀混合，上样6μL。在90mV电压下电泳50分钟，最后，置于紫外凝胶成像系统观察并记录电泳图，结果如图4所示。图4中可见，当PEI-OP与pDNA复合物的质量比为0.5时，聚合物PEI-OP已经完全阻滞了DNA分子的迁移。该实验证明，PEI-OP具有很强的凝聚质粒DNA形成复合物纳米颗粒的能力，从而发挥保护pDNA的作用，以避免其在细胞吞噬前被降解。

2.粒径分布和Zeta电位测定

按照上述的复合物的制备方法来配制不同质量比的复合物溶液，选择测定PEI-OP/pDNA的质量比依次为0.5，1，3，5，10，20，30，50，样品量各为2mL。

测定过程如下：在温室条件下，首先预热动态光散射纳米粒度分析仪30分钟，再吸取1mL复合物溶液加入到微量样品池中，然后将微量样品池放入粒度分析仪的测试槽中，设置测试温度为25℃，介质为水，粘度为0.890cP，折射率为1.330，对于粒径分布测试，光散射角度为90℃，检测波长为659.0nm，每个样品测试3次，每次运行时间为1.5分钟，记录每个样品粒径的平均值及其多分散性(PDI)；对于Zeta电位测试，介电常数为78.54，pH值为7.0，Zeta电位分析模型为Smoluchowski方程(极性溶剂：Henrys方程F(ka)近似于1.5)，每个样品测试3次，每次自动运行10次，记录每个样品Zeta电位的平均值及其迁移率。结果如图5所示，复合物的粒径稳定在50-200nm；复合物的Zeta电位分布在0-20mV之间。以上数据说明本实施例得到的复合物具有较小的粒径和较小的Zeta电位，从而有利于复合物的细胞内吞，进而发挥转染作用。

3.原子力显微镜观察

依据上述粒径测量的结果，选取PEI-OP/pDNA质量比为5∶1的复合物，通过原子力显微镜(AtomicForceMicroscope)来观察该复合物的形态。

首先将PEI-OP与pDNA配制成复合物溶液，然后用移液枪吸取5-10μL的复合物溶液小心翼翼的滴加在新鲜剥离的云母片上。云母片置于干燥器中自然晾干。在轻敲模式(TappingMode)下进行原子力显微镜检测，记录200nm比例下捕捉复合物颗粒的图片，记录相位图和高度图；如图6所示，复合物可形成纳米颗粒，粒径在50-110nm之间，该测试结果进一步证明了复合物可形成较小的纳米颗粒。

4.透射电镜观察

按照复合物的制备方法来配制PEI-OP/pDNA质量比为5∶1的复合物溶液，样品量为100μL。先吸取10μL复合物溶液缓慢滴于400目的铜网上，室温下自然晾干，最后使用透射电子显微镜来观察样品的形态，记录透射电镜图。结果如图7所示，当PEI-OP加入到DNA分子里，通过静电作用力络合形成复合物，呈现出类球形的纳米颗粒，其形态规则、均匀，透射电镜图显示是DNA分子被包裹于聚合物里面，复合物粒径尺寸在20-80nm之间，与上述的动态光散射粒径仪测得的尺寸基本一致。

5.细胞转染实验

选择COS-7细胞、Hela细胞和SMMC-7721细胞作为研究PEI-OP与核酸复合物细胞转染的受体细胞。按照5-10×10⁴个数/mL细胞液的细胞密度转48孔细胞板，将加入细胞的48孔板置于37℃5％细胞培养箱里培养24小时。24h后每孔加入复合物溶液的体积是50μL，平行3个复孔，每孔加入pDNA的质量是500ng，稀释介质是磷酸盐缓冲溶液(PBS)，所需考察复合物中PEI-OP/pDNA的质量比依次为0，5，10，20，30，50，70，100。接着，从培养箱中取出48孔细胞板，吸去培养液，每孔用200μLPBS冲溶液冲洗一次，再吸去PBS缓冲溶液，每孔加入250μL含酚红DMEM高糖培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基)，随后将一系列不同质量比的复合物溶液依次加入到细胞板中，置于37℃5％细胞培养箱里培养4小时。然后，从培养箱中取出48孔细胞板，吸去培养液，每孔用200μLPBS缓冲溶液冲洗一次，再吸去PBS缓冲溶液，每孔加入500μL含10％胎牛血清的含酚红DMEM高糖培养基，最后再置于37℃5％细胞培养箱里培养。44小时之后，测定细胞转染的效率。同时，采用MicroBCA法测定细胞裂解液里的总蛋白含量。通过样品的相对发光强度除以样品的总蛋白浓度后所得数值(RLU/mgprotein)来衡量细胞转染效率(即荧光素酶蛋白的表达量)，每个样品平行测试3次，取平均值作图。结果如图8-图10所示，该结果显示PEI-OP在不同类型细胞中均具备理想的输送pDNA的能力。

6.PEI-OP的细胞毒性实验

采用噻唑兰法(MTT)定量考察PEI-OP对COS-7细胞、Hela细胞和SMMC-7721细胞的细胞毒性。首先，按照5-10×10⁴个数/mL细胞液的细胞密度转96孔细胞板，置于37℃5％细胞培养箱里培养过夜。其次，配制一系列不同浓度的聚合物溶液，每孔加入聚合物溶液的体积是100μL，平行5个复孔，稀释介质是无酚红DMEM高糖培养基，所需考察聚合物的浓度依次为0，5，10，20，40，50，100，单位是μg/mL。接着，从培养箱中取出96孔细胞板，吸去培养液，每孔用100μLPBS缓冲溶液冲洗一次，再吸去磷酸盐缓冲溶液，将一系列不同浓度的聚合物溶液依次加入到细胞板中，置于37℃5％细胞培养箱里培养4小时。然后，从培养箱中取出96孔细胞板，吸去培养液，每孔用100μLPBS缓冲溶液冲洗一次，再吸去PBS缓冲溶液，每孔加入112.5μL无酚红DMEM高糖培养基和12.5μLMTT(噻唑蓝)溶液(5mg/mL)，继续置于37℃5％细胞培养箱里培养。6小时之后，从培养箱中取出96孔细胞板，吸去培养液，每孔加入150μL分子生物级二甲基亚砜，轻微摇匀，待蓝紫色结晶物甲赞(formazan)完全溶解，最后，使用多功能酶标仪测定样品在570nm和630nm处的吸光度值。每个样品平行测试5次，取平均值作图(PEI800Da作为对照组)。细胞存活率(百分比)是以待测样的吸光度值相比正常细胞的吸光度值(即聚合物溶液的浓度为0)来表示。结果如图11-13所示，PEI-OP在一系列工作浓度范围内对COS-7细胞、Hela细胞和SMMC-7721细胞的毒性均很低，细胞存活率均在80～120％。

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于，采用间苯二甲醛代替邻苯二甲醛，采用与实施例1相同的制备方法，得到PEI-IP，其合成路线图参见图14。

图15为本实施例得到的PEI-IP的FT-IR谱图(溴化钾压片)，图中出现亚胺键的特征衍射峰，证明本实施例成功得到了目标产物PEI-IP。

对上述得到的复合物溶液进行如下理化性质表征：

1.粒径分布和Zeta电位测定

按照上述的复合物的制备方法来配制不同质量比的复合物溶液，选择测定PEI-IP/pDNA的质量比依次为0.5，1，3，5，10，20，30，50，样品量各为2mL。

测定过程如下：在温室条件下，首先预热动态光散射纳米粒度分析仪30分钟，再吸取1mL复合物溶液加入到微量样品池中，然后将微量样品池放入粒度分析仪的测试槽中，设置测试温度为25℃，介质为水，粘度为0.890cP，折射率为1.330，对于粒径分布测试，光散射角度为90℃，检测波长为659.0nm，每个样品测试3次，每次运行时间为1.5分钟，记录每个样品粒径的平均值及其多分散性(PDI)；对于Zeta电位测试，介电常数为78.54，pH值为7.0，Zeta电位分析模型为Smoluchowski方程(极性溶剂：Henrys方程F(ka)近似于1.5)，每个样品测试3次，每次自动运行10次，记录每个样品Zeta电位的平均值及其迁移率。结果如图16所示，复合物的粒径稳定在100-150nm；复合物的Zeta电位分布在2-10mV之间。以上数据说明本实施例得到的复合物具有较小的粒径和较小的Zeta电位，从而有利于复合物的细胞内吞，进而发挥转染作用。

2.细胞转染实验

选择COS-7细胞作为研究PEI-IP与核酸复合物细胞转染的受体细胞。按照5-10×10⁴个数/mL细胞液的细胞密度转48孔细胞板，将加入细胞的48孔板置于37℃5％细胞培养箱里培养24小时。24h后每孔加入复合物溶液的体积是50μL，平行3个复孔，每孔加入pDNA的质量是500ng，稀释介质是磷酸盐缓冲溶液(PBS)，所需考察复合物中PEI-OP/pDNA的质量比依次为0，5，10，20，30，50，70，100。接着，从培养箱中取出48孔细胞板，吸去培养液，每孔用200μLPBS冲溶液冲洗一次，再吸去PBS缓冲溶液，每孔加入250μL含酚红DMEM高糖培养基，随后将一系列不同质量比的复合物溶液依次加入到细胞板中，置于37℃5％细胞培养箱里培养4小时。然后，从培养箱中取出48孔细胞板，吸去培养液，每孔用200μLPBS缓冲溶液冲洗一次，再吸去PBS缓冲溶液，每孔加入500μL含10％胎牛血清的含酚红DMEM高糖培养基，最后再置于37℃5％细胞培养箱里培养。44小时之后，测定细胞转染的效率。同时，采用MicroBCA法测定细胞裂解液里的总蛋白含量。通过样品的相对发光强度除以样品的总蛋白浓度后所得数值(RLU/mgprotein)来衡量细胞转染效率(即荧光素酶蛋白的表达量)，每个样品平行测试3次，取平均值作图。图17为PEI-IP在COS-7细胞中的转染活性图，该图结果表明PEI-IP在COS-7细胞中有较好的转染效率。

3.PEI-IP的细胞毒性实验

采用噻唑兰法(MTT)定量考察PEI-IP对COS-7细胞、Hela细胞和SMMC-7721细胞的细胞毒性。首先，按照5-10×10⁴个数/mL细胞液的细胞密度转96孔细胞板，置于37℃5％细胞培养箱里培养过夜。其次，配制一系列不同浓度的聚合物溶液，每孔加入聚合物溶液的体积是100μL，平行5个复孔，稀释介质是无酚红DMEM高糖培养基，所需考察聚合物的浓度依次为0，5，10，20，40，50，100，单位是μg/mL。接着，从培养箱中取出96孔细胞板，吸去培养液，每孔用100μLPBS缓冲溶液冲洗一次，再吸去磷酸盐缓冲溶液，将一系列不同浓度的聚合物溶液依次加入到细胞板中，置于37℃5％细胞培养箱里培养4小时。然后，从培养箱中取出96孔细胞板，吸去培养液，每孔用100μLPBS缓冲溶液冲洗一次，再吸去PBS缓冲溶液，每孔加入112.5μL无酚红DMEM高糖培养基和12.5μLMTT(噻唑蓝)溶液(5mg/mL)，继续置于37℃5％细胞培养箱里培养。6小时之后，从培养箱中取出96孔细胞板，吸去培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜(分子生物级)，轻微摇匀，待蓝紫色结晶物甲赞(formazan)完全溶解，最后，使用多功能酶标仪测定样品在570nm和630nm处的吸光度值。每个样品平行测试5次，取平均值作图(PEI25KDa作为对照组)。细胞存活率(百分比)是以待测样的吸光度值相比正常细胞的吸光度值(即聚合物溶液的浓度为0)来表示。结果如图18所示，图中结果表明PEI-IP对细胞的毒性随着浓度的增大而增大，在相同浓度下细胞存活率比PEI25KDa高60-80％。

实施例4

本实施例与实施例1的不同之处在于，低分子量聚乙烯亚胺(PEI)选用Mw＝1300Da/数均分子量Mn＝1200Da的低分子量聚乙烯亚胺。并且，在产物的分离纯化过程中：透析袋的截留分子量为7k，透析时间为12h；透析后过滤所使用的微孔滤膜的孔径为0.45μm。

实施例5

本实施例与实施例1的不同之处在于，低分子量聚乙烯亚胺(PEI)选用Mw＝2000Da/数均分子量Mn＝1800Da的低分子量聚乙烯亚胺。

本发明构建的含亚胺键结构的PEI在内涵体的酸性条件下亚胺键降解，释放出的游离伯氨基能够增强质子海绵效应，有助于核酸物质从内涵体-溶酶体里逃逸，再释放到细胞质或者进入细胞核，最后本身代谢为无毒的低分子量化合物。该PEI衍生物具有较高的转染活性和较低的细胞毒性，在不同的细胞中均有较好的生物活性，是一种高效、低毒的基因输送载体。

Claims (9)

1.一种可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，其结构式为：

其中，x为1～20,y为1～20。

2.根据权利要求1所述的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，所述可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物的基本构建单元为低分子量聚乙烯亚胺，所述低分子量聚乙烯亚胺选自重均分子量Mw低于2000Da的任一低分子量聚乙烯亚胺。

3.一种可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将低分子量聚乙烯亚胺与邻苯二甲醛或间苯二甲醛按摩尔比为1：1-1:3.5的比例加到无水乙醇或氯仿溶剂中，得到反应体系；所述低分子量聚乙烯亚胺选自重均分子量Mw低于2000Da的任一低分子量聚乙烯亚胺；

(2)在无水无氧条件下，搅拌、摇动或震荡反应体系，使低分子量聚乙烯亚胺与邻苯二甲醛或间苯二甲醛发生缩合反应，然后进行分离纯化，即得可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物；其中，

所述分离纯化包括以下步骤：将制备的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物用超纯水溶解后，置于活化后的透析袋中透析，所述透析袋的截留分子量为7k～10k；透析结束后，用微孔滤膜过滤，所述微孔滤膜的孔径为0.22～0.45μm，最后预冻、冻干。

4.根据权利要求3所述的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于，所述低分子量聚乙烯亚胺与邻苯二甲醛或间苯二甲醛的摩尔比优选为1：2.5。

5.根据权利要求3所述的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于，所述透析的时间为12～48小时。

6.如权利要求1所述的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物在基因物质输送中的用途。

7.一种基因物质输送复合物，其特征在于，该复合物是按照如下方法步骤制备而得：将权利要求1所述可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物溶液加入到DNA或RNA核酸溶液中，混合均匀，然后室温下孵育，即得到该基因物质输送复合物。

8.如权利要求7所述的基因物质输送复合物，其特征在于，所述DNA或RNA核酸选自DNA疫苗、siRNA或microRNA。

9.如权利要求7所述的基因物质输送复合物，其特征在于，所述孵育的时间为20～120分钟。