CN112587676B - 一种多功能阳离子柔性纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多功能阳离子柔性纳米颗粒，由包括刚性醛基单体和柔性阳离子聚合物的物料制备得到。本发明提供的纳米颗粒包括刚性醛基单体和柔性阳离子聚合物的物料制备得到，交联聚合物纳米颗粒通过微波辅助制备合成，具有制备简单、尺寸分散均匀、反应位点丰富和生物相容性良好等优点。本发明提供的阳离子纳米颗粒可以有效担载DNA和RNA，不仅是一种优良的基因载体，而且还具有良好的光动力效果；尾静脉注射后，纳米颗粒能够有效的在肿瘤部位蓄积，具有良好荧光成像、光声成像、基因治疗和光动力治疗等功能；荧光成像和光声成像指导的基因联合光动力疗法可以有效的抑制肿瘤的生长。本发明还提供了一种多功能阳离子柔性纳米颗粒和应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，尤其涉及一种多功能阳离子柔性纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
光动力疗法是一种新兴的肿瘤治疗方法，在光照条件下，光敏剂能够产生活性氧物质，进而杀伤杀死肿瘤细胞。与传统的化疗相比，光动力疗法能够有效的避免肿瘤细胞的耐药性问题(参见Wang K,Zhang z,Lin L,Chen J,Hao K,Tian H,Chen X.Covalentorganic nanosheets integrated heterojunction with two strategies to overcomehypoxic-tumor photodynamic therapy.Chemistry of Materials.2019,31(9),3312-3323.)。光动力疗法具有良好的肿瘤治疗效果，但是在担载光敏剂的过程中，疏水性的卟啉单体往往会出现部分的荧光淬灭现象，影响了其在成像方面的应用(参见Jin J,Zhu Y,Zhang Z,Zhang W.Enhancing the Efficacy of Photodynamic Therapy through aPorphyrin/POSS Alternating Copolymer.Angew.Chem.2018,57,16354-16358.)。荧光成像对癌症治疗具有重要的指导作用，因此设计合理的载体担载光敏剂，保持其荧光性能和光动力性能具有重要意义。
基因治疗是一种新兴的治疗手段，通过载体担载特定的基因，可以实现细胞对特定基因的沉默或表达，具有一定的特异性，在临床应用方面具有巨大的潜力。但是单一的基因治疗对癌细胞的杀伤有限，结合其他的疗法如化疗、光动力治疗法等能够更好的起到协同抗肿瘤的效果。
聚乙烯亚胺(PEI)是一种良好的基因转染材料，通常作为基因转染的黄金标准来使用。但是在实际应用过程中，高分子量的聚乙烯亚胺具有很大的细胞毒性(参见Guan X,Guo Z,Lin L,Chen J,Tian H,Chen X.Ultrasensitive pH Triggered Charge/SizeDualRebound Gene Delivery System.Nano Letters.2016,16(11),6823-6831.)。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种多功能阳离子柔性纳米颗粒及其制备方法和应用，本发明提供的多功能阳离子柔性纳米颗粒为一种同时具有光动力效果和基因转染能力的纳米载体。
本发明提供了一种多功能阳离子柔性纳米颗粒，由包括刚性醛基单体和柔性阳离子聚合物的物料制备得到。
优选的，所述的刚性醛基单体包括对苯二甲醛、均三苯甲醛、四醛基苯基卟啉、4,4'-联苯二甲醛、三(4-甲酰苯基)胺、1,3,5-三(4-甲酰基苯基)苯和4,4',4″,4″′-(乙烯-1,1,2,2-四基)四苯甲醛中的一种或几种。
优选的，所述柔性阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、PAMAM和壳聚糖中的一种或几种。
优选的，所述刚性醛基单体和柔性阳离子聚合物的质量比为1：(0.1～20)。
本发明提供了一种上述技术方案所述的多功能阳离子柔性纳米颗粒的制备方法，包括：
将刚性醛基单体和柔性阳离子聚合物溶解于溶剂中加热，得到多功能阳离子柔性纳米颗粒。
优选的，所述加热的温度为60～120℃。
优选的，所述加热的方法包括微波加热或溶剂热。
优选的，所述微波加热的时间为5～15min；所述溶剂热加热的时间为1～12h。
优选的，所述加热完成后还包括：
将得到的加热产物进行透析，得到多功能阳离子柔性纳米颗粒；
所述透析过程中的截流分子量为3500～100000Da。
本发明提供了一种上述技术方案所述的多功能阳离子柔性纳米颗粒在荧光成像和/或光声成像中的应用。
本发明提供了一种上述技术方案所述的多功能阳离子柔性纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供了一种新型的多功能阳离子柔性共价有机框架纳米颗粒，该纳米颗粒由包括刚性醛基单体和柔性阳离子聚合物的物料制备得到，交联聚合物纳米颗粒通过微波辅助制备合成，具有制备简单、尺寸分散均匀、反应位点丰富和生物相容性良好等优点。本发明提供的阳离子纳米颗粒可以有效担载DNA和RNA，不仅是一种优良的基因载体，而且还具有良好的光动力效果；尾静脉注射后，纳米颗粒能够有效的在肿瘤部位蓄积，具有良好荧光成像、光声成像、基因治疗和光动力治疗等功能；荧光成像和光声成像指导的基因联合光动力疗法可以有效的抑制肿瘤的生长。
本发明为了最大程度减少光敏剂卟啉的荧光淬灭，提高载体的基因转染效果；采用光敏剂四醛基苯基卟啉来交联PEI，得到了一种同时具有良好的基因转染能力和光动力效果的纳米载体。本发明提供的纳米颗粒为具有光动力效果和基因转染能力的纳米载体，该纳米颗粒在尾静脉注射后可以有效的在肿瘤组织蓄积，在荧光成像和光声成像的指导下进行基因和光动疗法联合抗肿瘤。
附图说明
图1为本发明实施例21制备的PEI-Por纳米颗粒的扫描电镜图片；
图2为本发明实施例21制备到的PEI-Por纳米颗粒在Hela-Luc细胞中的RNA沉默效果；
图3为本发明实施例21制备到的PEI-Por纳米颗粒在B16F10细胞中的DNA转染效果；
图4为本发明实施例21制备到的PEI-Por纳米颗粒对4T1细胞的细胞毒性检测结果；
图5为本发明实施例21制备到的PEI-Por纳米颗粒在4T1荷瘤小鼠模型的体内成像图片；
图6为本发明实施例21制备到的PEI-Por纳米颗粒在4T1荷瘤小鼠模型的肿瘤图片；
图7为本发明实施例21制备到的PEI-Por纳米颗粒在4T1荷瘤小鼠模型的生存期曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员经改进或润饰的所有其它实例，都属于本发明保护的范围。应理解，本发明实施例仅用于说明本发明的技术效果，而非用于限制本发明的保护范围。实施例中，所用方法如无特别说明，均为常规方法。
本发明提供了一种多功能阳离子柔性纳米颗粒，由包括刚性醛基单体和柔性阳离子聚合物的物料制备得到。
在本发明中，所述刚性醛基单体优选选自对苯二甲醛、均三苯甲醛、四醛基苯基卟啉、4,4'-联苯二甲醛、三(4-甲酰苯基)胺、1,3,5-三(4-甲酰基苯基)苯和4,4',4″,4″′-(乙烯-1,1,2,2-四基)四苯甲醛中的一种或几种，更优选为四醛基苯基卟啉。
在本发明中，所述柔性阳离子聚合物优选选自聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)、PAMAM(酰胺-胺型树枝状高分子，树枝状聚酰胺胺)和壳聚糖中的一种或几种，更优选为聚乙烯亚胺(PEI)，最优选为枝化PEI，所述PEI的分子量优选为400～40000Da，更优选为25000Da；所述PLL的分子量优选为1000～40000Da；所述PAMAM优选为1～8代；所述壳聚糖的分子量优选为5000～400000Da。
在本发明中，所述刚性醛基单体和柔性阳离子聚合物的质量比优选为1：(0.1～20)，更优选1：(0.5～10)，更优选为1：(1～5)，最优选为1：1。
本发明提供了一种上述技术方案所述的多功能阳离子柔性纳米颗粒的制备方法，包括：
将刚性醛基单体和柔性阳离子聚合物溶解于溶剂中加热，得到多功能阳离子柔性纳米颗粒。
在本发明中，所述溶剂优选为乙醇。本发明对所述溶剂的用量没有特殊的限制，本领域技术人员可根据实际情况选择合适用量的溶剂使刚性醛基单体和柔性阳离子聚合物溶解即可。
在本发明中，所述加热温度优选为60～120℃，更优选为80～100℃，最优选为100℃。
在本发明中，所述加热的方法优选为微波加热或溶剂热法，更优选为微波加热；所述微波加热的时间优选为5～15min，更优选为10min；所述溶剂热的时间优选为1～12h，更优选为5～10h，最有选为6～8h。
在本发明中，所述加热完成后优选还包括：
将得到的加热产物进行透析，得到多功能阳离子柔性纳米颗粒；
所述透析过程中的截流分子量为3500～100000Da。
在本发明中，所述透析过程中透析袋的截流量优选为3500～100000Da，更优选为5000～8000Da，最有选为7000Da；所述透析的天数优选为2～4d，更优选为3天；所述透析优选每4h换一次水。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的多功能阳离子柔性纳米颗粒在荧光成像和/或光声成像中的应用，所述应用可以为所述多功能阳离子柔性纳米颗粒可以作为荧光成像和/或光学成像使用的制剂。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的多功能阳离子柔性纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用，如所述多功能阳离子柔性纳米颗粒可以作为担载基因的载体，还可以作为光动力治疗过程中的光敏剂。
本发明提供的多功能阳离子柔性共价有机框架纳米颗粒具有制备简单、尺寸均匀、良好的基因转染能力和光动力治疗效果等优点；纳米颗粒能够在肿瘤部位有效蓄积；在体内应用中，具有的良好的荧光成像和光声成像能力，随着尾静脉注射材料的时间延长，肿瘤部位荧光信号和光声信号不断增强；在荧光成像和光声成像的指导下，该纳米颗粒可以进行精准的基因和光动力联合抗肿瘤治疗。
本发明以下实施例中所用原料均为市售商品，四醛基苯基卟啉(Cas：150805-46-2)购买于上海腾赛生物科技有限公司，枝化PEI购自Sigma-Aldrich。
实施例
按照下述方法制备PEI-Por纳米颗粒(多功能阳离子柔性纳米颗粒)：
将四醛基苯基卟啉10mg和不同分子量的枝化PEI溶于乙醇中进行微波加热，乙醇的体积为5mL，微波加热时间为10min，加热温度为100℃；将得到的加热产物进行透析，透析袋的截流量为7000Da，透析3d，每4h换一次水，得到尺寸均匀的多功能交联聚合物PEI-Por纳米颗粒；四醛基苯基卟啉和枝化PEI的质量比如表1所示。
表1本发明实施例中四醛基苯基卟啉和枝化PEI的质量比
采用扫描电镜对本发明实施例21制备得到的纳米颗粒进行分析，检测结果如图1所示，结果表明，本发明实施例21制备出的纳米颗粒平均大小在120nm左右。
性能检测:
细胞培养：
选用4T1、B16F10、MCF7、293T、CHO和HeLa细胞用于评价材料的细胞毒性和DNA转染能力，B16F10-Luc、MCF7-Luc和HeLa-Luc细胞用于评价材料的RNA转染能力；先进行细胞培养：
采用含10％的胎牛血清、体积分数为5％的二氧化碳培养箱进行连续细胞培养，培养温度为37℃；将储存于液氮中的细胞取出，放于37℃恒温水浴中，待溶液完全溶解后迅速转移到装有5mL上述培养基的离心管中，混匀后1000转离心5min；保留离心管中的细胞沉淀，加入10mL培养基转放于培养皿中，放入上述恒温培养箱中进行培养，每隔一天换一次培养基。
细胞毒性：
选用4T1细胞系评价材料的细胞毒性，将上述培养后的细胞按照每孔1×104的密度种植于96孔板中，200μL培养液培养过夜后，将不同浓度的实施例21制备的纳米颗粒(40、20、10、5和2.5μg/mL)与细胞共培养24h；随后加入CCK-8 20μL，培养1h后，酶标仪震荡5min，在450nm下检测每个孔的吸光值；通过以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100；
A样品为实验组的吸光度；
A空白为不加实施例21制备的纳米颗粒的对照组的吸光度。
检测得到的细胞毒性数据如图4所示(图中横坐标为实施例21制备的纳米颗粒的浓度，纵坐标为细胞存活率，黑色为不加光照，红色为进行激光辐射)，结果显示，在纳米颗粒浓度达到40μg/mL时，细胞的存活率仍然大于80％，说明本发明实施例制备的纳米颗粒具有良好的生物相容性。
DNA转染：
选用B16F10细胞系和荧光素酶DNA来评价材料对DNA的转染能力：将上述培养的细胞按照每孔1×104的密度种植于96孔板中，200μL培养液培养过夜；将实施例21制备的纳米颗粒与荧光素酶质粒DNA以不同的比例混合后(纳米颗粒与DNA的比例分别是10/1、20/1和40/1)，与细胞培养48h，之后吸出培养基，加入细胞裂解液(用于裂解细胞，释放荧光素酶)和荧光素酶底物(用于检测荧光素酶的表达量，荧光素酶能够催化荧光素产生荧光)，荧光仪测量荧光强度。
在B16F10细胞中检测得到的DNA转染数据如图3所示(图中横坐标为不同实验材料，纵坐标为荧光活性，不同颜色代表不同的混合比例，见图示)，结果显示，本发明实施例制备的纳米颗粒具有良好的DNA转染能力，相比于PEI25K具有更好的DNA递送能力。
RNA转染：
选用HeLa-Luc细胞系和沉默荧光素酶的siRNA来评价材料的RNA的转染能力：将上述培养的细胞按照每孔1×104的密度种植于96孔板中，200μL培养液培养过夜；将实施例21制备的纳米颗粒与沉默荧光素酶的siRNA以不同的比例混合后(混合比例分别为2.5/1、5/1、10/1、20/1和40/1)，与细胞培养48h，之后吸出培养基，加入裂解液和荧光素酶底物，荧光仪测量荧光强度。
在HeLa-Luc细胞中检测得到的RNA转染数据如图2所示(图中横坐标为不同混合比例，纵坐标为荧光素酶活性，黑色为无作用siRNA，红色为有作用siRNA)，结果显示，本发明实施例制备的纳米颗粒能够达到50％以上的基因沉默效率，这表明本发明实施例制备的纳米颗粒是一种优良的RNA载体。
光动力治疗：
选用4T1细胞系评价材料的细胞毒性：将上述培养后的细胞按照每孔1×104的密度种植于96孔板中，200μL培养液培养过夜后，将不同浓度的实施例21制备的纳米颗粒(浓度分别为2.5、5、10、20和40μg/mL)与细胞共培养6h，随后进行光照处理：激光密度为200mW，照射时间为5min；照射结束后，继续培养24h；随后加入CCK-8 20μL，培养1h后，酶标仪震荡5min，在450nm下检测每个孔的吸光值；通过以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100；
A样品为实验组的吸光度；
A空白为不加实施例21制备的纳米颗粒的对照组的吸光度。
在4T1细胞中检测得到的光动力细胞毒性如图4所示，结果显示经激光辐射后细胞的存活率明显下降，在实施例21制备的纳米颗粒浓度为20μg/mL时已经可以达到80％的细胞致死率，而不加光照组存活率却在80％以上，表明实施例制备的纳米颗粒具有良好的光动力性能。
荧光成像：
选用4T1肿瘤模型，采用20g左右的Balb/C白鼠25只，按照每只小鼠1.0×106细胞的密度接种于小鼠腋下，待瘤体积长至200～300mm3时，将实施例21制备的纳米粒颗粒通过尾静脉注入老鼠体内，分别在6h、12h、24h、36h和48h将老鼠解剖，取出脏器，采用荧光成像仪器进行成像(黄光激发，红光发射)，结果显示，24h内随着时间的延长，肿瘤部位的荧光强度逐渐增强；说明实施例21制得的纳米颗粒具有良好的肿瘤特异性荧光成像功能；检测结果如图5所示(图中横坐标为心肝脾肺肾瘤)，结果显示随着时间的延长种瘤部位的纳米颗粒蓄积量逐渐增加，并在24h达到峰值，表明实施例制备的纳米颗粒能够很好的种瘤组织蓄积且具有良好的成像能力。
基因和光动力联合治疗：
选用4T1肿瘤模型，采用20g左右的Balb/C小白鼠，接种癌细胞后，待肿瘤长至100mm3，将实施例21制备的纳米颗粒与shPD-L1基因(纳米颗粒与基因比例为20/1)混合后，通过尾静脉注入老鼠体内，24h后，采用激光器照射肿瘤处，激光器功率为300mW/cm2，照射时间为10min，光照结束后对老鼠体重和瘤体积变化进行追踪3周；21d后，结果表明单纯的光动力或者基因治疗能一定程度的抑制肿瘤的生长，但是却不能根除；只有光动力加基因治疗联合抗肿瘤才能有效的抑制抑瘤的生长甚至一定比例上清除肿瘤；检测结果如图6所示(治疗分为5组，每组5只，分别是PBS组、单纯纳米颗粒组PEI-Por、纳米颗粒+基因治疗组PEI-Por/shPD-L1、纳米颗粒+光照组PEI-Por+L和纳米颗粒+基因治疗+光照组PEI-Por/shPD-L1+L，图中右上角缺失肿瘤处为肿瘤治愈消失了)，检测得到的生存期曲线如图7所示(绿色线与紫色线重合，蓝色线与黄色线重合)。
按照上述4T1肿瘤模型的检测方法，选用B16F10肿瘤模型，采用20g左右的Balb/C小白鼠，接种癌细胞后，待肿瘤长至100mm3，将实施例21制备的纳米颗粒与基因混合后，通过尾静脉注入老鼠体内，24h后，采用激光器照射肿瘤处，激光器功率为300mW/cm2，照射时间为10min，光照结束后对老鼠体重和瘤体积变化进行追踪3周；21d后，检测结果表明，单纯的光动力或者基因治疗能一定程度的抑制肿瘤的生长，但是却不能根除；只有光动力加基因治疗联合抗肿瘤才能有效的抑制抑瘤的生长甚至一定比例上清除肿瘤。
按照上述4T1肿瘤模型的检测方法，选用MCF7肿瘤模型，采用20g左右的Balb/C裸鼠，接种癌细胞后，待肿瘤长至100mm3，将实施例21制备的纳米颗粒与基因混合后，通过尾静脉注入老鼠体内，24h后，采用激光器照射肿瘤处，激光器功率为300mW/cm2，照射时间为10min，光照结束后对老鼠体重和瘤体积变化进行追踪3周；21d后，检测结果表明单纯的光动力或者基因治疗能一定程度的抑制肿瘤的生长，但是却不能根除；只有光动力加基因治疗联合抗肿瘤才能有效的抑制抑瘤的生长甚至一定比例上清除肿瘤。
由以上实施例可知，本发明提供的新型的多功能阳离子柔性共价有机框架纳米颗粒具有制备简单、尺寸均匀、良好的基因转染能力和光动力治疗效果等优点，纳米颗粒粒径在120nm左右，能够通过EPR效应被动靶向到肿瘤组织，在肿瘤部位进行有效的蓄积。在体内应用中，该纳米颗粒显示出良好的荧光成像能力，随着尾静脉注射材料的时间延长，肿瘤部位荧光信号不断增强。在荧光成像的指导下，该纳米颗粒可以进行精准的基因和光动力联合抗肿瘤治疗，与对照组相比，联合治疗组具有更好的抗肿瘤效果。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种多功能阳离子柔性纳米颗粒，由包括刚性醛基单体和柔性阳离子聚合物的物料制备得到；所述刚性醛基单体为四醛基苯基卟啉；
所述柔性阳离子聚合物为聚乙烯亚胺。
2.根据权利要求1所述的多功能阳离子柔性纳米颗粒，其特征在于，所述刚性醛基单体和柔性阳离子聚合物的质量比为1：（0.1~20）。
3.一种权利要求1所述的多功能阳离子柔性纳米颗粒的制备方法，包括：
将刚性醛基单体和柔性阳离子聚合物溶解于溶剂中加热，得到多功能阳离子柔性纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述加热的温度为60~120 ℃。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述加热的方法包括微波加热或溶剂热。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述加热完成后还包括：
将得到的加热产物进行透析，得到多功能阳离子柔性纳米颗粒；
所述透析过程中的截流分子量为3500~100000 Da。
7.一种权利要求1所述的多功能阳离子柔性纳米颗粒在制备荧光成像制剂和/或制备光声成像制剂中的应用。
8.一种权利要求1所述的多功能阳离子柔性纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
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