CN104257630A - 聚阳离子核酸复合物纳米颗粒及制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗血管增生药物的技术领域,特别涉及一种治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物及制备方法、应用。本发明的治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒,所述纳米颗粒包含聚阳离子核酸材料和基因物质,所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比为1~100:1。治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒包含聚阳离子核酸材料和基因物质。与现有技术相比,本发明的纳米颗粒可有效抑制血管增生,可实现基因物质的输送,并且,不存在体内毒性和体内免疫原性的问题,由于纳米颗粒不带电荷,还可避免体内非靶组织的粘附,实现体内病变细胞靶向,从而有效提高靶向效果,且不影响体内病变细胞的内吞。
Description
技术领域
本发明涉及治疗血管增生药物的技术领域,特别涉及一种治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物及制备方法、应用。
背景技术
新生血管可伴发于创伤修复、肿瘤生长、眼内缺血性病变等多种情况。新生血管的生成是一个相当复杂的生物学过程,目前的大量研究表明,血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)及其家族成员能特异性地促进内皮细胞分裂、增殖及迁移,在新生血管形成过程中起重要作用。
VEGF是一类糖蛋白,广泛分布于人和动物体内的脑、肾、肝、脾、肺、骨骼等组织。人类成熟的VEGF以五种亚型存在——VEGFl21、VEGFl45、VEGFl65、VEGFl89、VEGF206,均系通过不同的剪接方式来自同一基因。除VEGF外,VEGF家族主要还包括胎盘生长因子(placenta growth factor,P1GF)、VEGF—B、VEGF—C、VEGF—D、VEGF—E,该些家族成员与VEGF具有相似的结构、功能及分布。
由于在新生血管生成中的重要作用,VEGF家族与新生血管生成相关性疾病及某些生理过程关系密切。VEGF家族在肿瘤新生血管的生成中起重要作用。
关于VEGF家族和眼内新生血管的研究表明,VEGF家族中VEGF在与缺氧有关的眼内新生血管化过程中起关键作用。在眼内新生血管活动眼中(糖尿病视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞等),玻璃体内VEGF含量明显增加。而在玻璃体内注射VEGF亦可诱导视网膜新生血管化。另外,临床实验发现抗VEGF疗法可观显抑制眼内新生血管反应。
VEGF家族和胚胎血管生成VEGF在胚胎血管生成中起主导作用。现已证明,在人3个月孕早期和足月的胎盘中VEGF mRNA即已存在。在动物实验中发现,只要缺乏VEGF两个等位基因中的任何1个,胚胎均最终死亡,原因是心血管系统形成失败。
由于VEGF家族能明显促进新生血管生成,故可从不同层次抑制其功能,来预防和治疗新生血管相关性疾病。目前,抑制剂主要针对VEGF。
现有的抗VEGF抑制策略包括:
1)蛋白抗体可直接中和VEGF蛋白,从而抑制VEGF的生物效应。
2)可溶性VEGF受体能特异地结合VEGF,间接阻断VEGF与其受体作用。
3)VEGF受体阻断剂与VEGF受体结合,进而阻止其与VEGF作用,也起到了抑制VEGF的作用。
4)反义VEGF一组特异的核苷酸序列,能与VEGF mRNA结合,干扰VEGFmRNA的翻译和VEGF蛋白的生成。
5)VEGF信号传导阻断剂与VEGF受体结合后将产生受体自磷酸化等一系列信号传导,通过阻断传导途径,达到抑制VEGF作用的目的。
可特异性结合VEGFl65的制剂哌加他尼钠(Pegaptanib,商品名Macugen)是最早获批用于眼科的抗VEGF类药物;此后,能广泛结合VEGFl65及其他所有VEGF-A异构体的雷珠单抗(Ranibizumab,商品名Lucentis)相继上市。这些抗VEGF制剂为治疗新生血管及血管性疾病导致的黄斑水肿带来革命性的改变。如果Ranibizumab的显著疗效是由于其广泛结合所有VEGF-A异构体而非仅仅结合VEGF165,那么广谱结合VEGF家族所有成员的药物则有望获得更好疗效。能广谱作用于VEGF家族成员的新一代抗VEGF药物阿柏西普(Aflibercept,眼用制剂VEGF Trap-Eye,商品名Eylea)已于2011年11月上市。
虽然单抗药物已经取得一系列临床治疗作用,但仍存在不少问题,比如单抗的靶点单一,目前仅针对VEGF165,对于其他VEGF亚型缺乏针对性。且单抗的研发成本高,周期长,制备成本高。
siRNA是一段21-25个碱基对的RNA分子,发现于单细胞生物抵御病毒侵袭的机制。单细胞生物针对入侵病毒的mRNA序列合成出一段与之互补的siRNA,主动结合mRNA,从而阻断病毒的复制。siRNA因其独特的靶点特异性、结构可设计性和代谢安全性,成为科研界普遍看好的新的治疗药物。然而,在过去的20年里,研究人员设计了一系列的载体用于siRNA的体内输送,但仅有极少数进入临床阶段,迄今,仍未有一个载体得到FDA认证,一个有效载体的缺位,导致核酸物质体内输送仍然处于临床瓶颈期。
将核酸物质输送到靶细胞的胞浆或细胞核内,需要克服一系列的体内输送屏障,因此,核酸载体是否高效,是其能否用于临床治疗的关键所在。核酸物质输送的载体一般为以下两类:(1)病毒载体:病毒载体(如慢病毒载体、腺病毒载体)作为基因的输送载体,虽然有较高的体外转染活性,然而,其免疫原性与易导致突变的缺点为临床试验带来了巨大的安全问题,使得其应用受限。(2)非病毒载体:非病毒载体的优势主要在于,在保证预期的转染活性的条件下,可以大大降低病毒载体所带来的免疫原性与诸多炎症反应,其一般为以下两种载体设计:(a)阳离子脂质体;(b)聚阳离子基因载体。而目前研究更多的主要集中于聚阳离子基因载体与阳离子脂质体的修饰,使之适用于基因物质的靶向输送。阳离子脂质体具有较高的体内外转染活性,然而,由于表面的正电荷影响其体内的正常分布,同时,由于选用阳离子脂质,免疫原性与炎症反应在动物试验中也成为不可避免的缺点之一(Gao,K.&Huang,L.Nonviral methodsfor siRNA delivery.Molecular pharmaceutics 6,651-658(2008).)。
由于siRNA序列与沉默对象蛋白的高度特异性,以及当前siRNA合成的低成本,使siRNA序列可实现低成本的开发,并可同时实现多靶点蛋白的沉默,从而可生成低成本、高效、高安全性的产品。目前,已有大量文献报道构建靶序列5’-GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3’(Takei Y,et al.A small interfering RNAtargeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics.Cancer research2004;64(10):3365-70.)以及5’-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA-3’(Filleur S,et al.SiRNA-mediated inhibition of vascular endothelial growth factor severely limitstumor resistance to antiangiogenic thrombospondin-1and slows tumorvascularization and growth.Cancer research 2003;63(14):3919-22.)可有效抑制人体VEGF的表达。
发明内容
本发明目的在于提供一种治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒,以解决现有的抑制血管增生的抗VEGF药物存在的上述技术问题。
本发明的另一目的在于提供上述的治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒的制备方法,以解决现有的抑制血管增生的抗VEGF药物存在的上述技术问题。
本发明的再一目的在于提供上述的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒在制备治疗血管增生的药物中的应用。
本发明目的通过以下的技术方案实现:
一种治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒,所述纳米颗粒包含聚阳离子核酸材料和基因物质,所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比为1~100:1。
优选地,所述聚阳离子核酸材料由低分子量的聚乙烯亚胺(PEI)与含二甲醛的链接剂以亚胺键构成,所述聚阳离子核酸材料的结构式为:
其中,X为含二甲醛的链接剂衍生的基团。
优选地,所述聚乙烯亚胺的分子量低于2000。
优选地,所述聚乙烯亚胺选自直链聚乙烯亚胺或支链聚乙烯亚胺。
优选地,所述链接剂选自戊二醛、对苯二甲醛、间苯二甲醛、邻苯二甲醛、2,5-咪唑二甲醛、2,4-吡啶二甲醛、2,5-吡啶二甲醛、2,6-吡啶二甲醛、2,5-哒嗪二甲醛或2,6-哒嗪二甲醛的其中一种。
优选地,所述基因物质选自RNA或DNA,所述RNA包括5’-GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3’或5’-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA-3’;所述DNA为构建的质粒DNA,所述质粒DNA包括功能基因序列、启动子序列和抗性基因,所述质粒DNA的功能基因序列包括5’-GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3’或5’-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA-3’。
优选地,所述RNA的分子量为19-22bp。
优选地,所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比为优选为5~50:1,更优选为10~30:1。
上述的治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
聚阳离子核酸材料的水溶液和基因物质的水溶液混合,在室温静置20-60分钟即可制成所述纳米颗粒。
上述的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒在制备治疗血管增生的药物中的应用。
与现有技术相比,本发明有以下有益效果:
本发明的纳米颗粒可有效抑制血管增生,可实现基因物质的输送,并且,不存在体内毒性和体内免疫原性的问题,由于纳米颗粒不带电荷,还可避免体内非靶组织的粘附,实现体内病变细胞靶向,从而有效提高靶向效果,且不影响体内病变细胞的内吞。
附图说明
图1为OPEI的合成路线图;
图2为PEI 800Da的红外谱图;
图3为OPEI的红外谱图;
图4为本发明的纳米颗粒的粒径、zeta电位示意图;
图5为本发明的纳米颗粒的透射电镜示意图;
图6为本发明的纳米颗粒的凝胶电泳示意图;
图7为聚阳离子核酸材料的细胞毒性示意图;
图8为小鼠肿瘤模型及肿瘤组织切片的示意图(其中,A-D为取下的肿瘤组织,A为生理盐水组的肿瘤,B为裸DNA组的肿瘤,C为PEI组的肿瘤,D为OPEI组的肿瘤;E-H为肿瘤组织的染色切片,红色为血管,E为生理盐水组肿瘤的组织切片,F为裸DNA组肿瘤的组织切片,G为PEI组肿瘤的组织切片,H为OPEI组肿瘤的组织切片)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1 聚阳离子核酸材料(OPEI)的合成
聚阳离子核酸材料(OPEI)的合成路线如图1所示。整个反应在无水无氧(高纯氮气保护)的环境中进行,直链的PEI 800Da和邻苯二甲醛在摩尔比为1:2.5的条件下反应,反应溶剂为无水乙醇(在无水乙醇中加入无水硫酸镁后静置48h,然后蒸馏得到新鲜的无水乙醇备用)。PEI 800Da的红外图谱如图2所示。用无水乙醇分别溶解PEI 800Da(1摩尔)和邻苯二甲醛(2.5摩尔),分别配成20mL和50mL的溶液。反应在室温条件下搅拌进行,用恒压滴液漏斗逐滴地把邻苯二甲醛溶液加入到PEI 800Da溶液中。24h后停止反应,首先用减压旋转蒸发仪在减压和低温的条件下把其中的大部分溶剂除去,然后产品用少量超纯水溶解,置于截留分子量为10000Da的透析袋中透析48小时。透析结束后溶液用0.22μm的微孔滤膜过滤,转移到预先准备好的西林瓶中。最后将产品在-20℃冰箱预冻8h后用冷冻干燥机冻干,24h后停止冻干,得到最终产物OPEI。对产品进行红外检测,红外图谱如图3所示。产品的结构如下图:
其中,邻苯二甲醛可由戊二醛、对苯二甲醛、间苯二甲醛、2,5-咪唑二甲醛、2,4-吡啶二甲醛、2,5-吡啶二甲醛、2,6-吡啶二甲醛、2,5-哒嗪二甲醛或2,6-哒嗪二甲醛的任意一种代替。
实施例2 OPEI包裹质粒DNA的纳米颗粒的制备
将实施例1中制备的OPEI配成水溶液,浓度为2μg/μl,用灭菌水稀释成20ng/μl、40ng/μl、100ng/μl、200ng/μl、1000ng/μl和2000ng/μl溶液。另外将含有5’-GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3’的质粒DNA的配成水溶液,浓度为20ng/μl。将OPEI水溶液等体积加入至质粒DNA水溶液,涡旋5min,并静置20min,即得一系列纳米颗粒的溶液。
实施例3 纳米颗粒的粒径与电位的表征
将实施例2制备的一系列颗粒溶液放入BIC90plus粒度电位分析仪的测试槽中,该一系列颗粒溶液的颗粒中OPEI与质粒DNA的质量比1、2、5、10、50、100,设置测试温度为25℃,介质为水,粘度为0.89cp,折射率为1.330,光散射角度为90。,检测波长为659nm,每个样品测试3次,每次运行时间为2min,记录粒径平均值。检测结果如图4所示。
将实施例2制备的一系列颗粒溶液放入BIC90plus粒度电位分析仪的测试槽中,该一系列颗粒溶液的颗粒中OPEI与质粒DNA的质量比1、2、5、10、50、100,设置测试温度为25℃,介质为水,粘度为0.89cp,折射率为1.330,介电常数为78.54,pH值为7.0,zeta电位分析模型为Smoluchowski方程,每个样品测试3次,每次自动运行10次,记录zeta电位平均值,结果如图4所示。
在基因输送系统中,形成小且紧实的颗粒非常关键,因为会影响细胞的摄取及基因转染效率。颗粒的粒径和zeta电位可以展现载体包裹DNA的能力。从图5中可以发现,当复合物颗粒中OPEI与质粒DNA的质量比为1的条件下,粒径为370nm左右,PDI小于0.3,均匀且分布狭窄,说明在此质量比下,OPEI并没有包裹质粒DNA形成纳米颗粒。随着质量比的增加,颗粒的粒径逐步变小,颗粒100-120nm之间,而PDI在0.1-0.3之间,表明颗粒分布较均匀。同时,Zeta电位从负值逐步变成正值,Zeta电位稳定在10mV-20mV之间,分散体系较为稳定。当OPEI与质粒DNA的质量比继续上升时,纳米颗粒的粒径没有变小,而是略有增大,粒径为100nm-150nm左右。以上数据说明纳米颗粒具有较小的粒径和较小的Zeta电位,有利于细胞内吞复合物,发挥转染作用。
实施例4 纳米颗粒的透射电镜测试
按照实施例2的制备方法来配制OPEI/质粒DNA质量比为1:l的复合物纳米颗粒溶液,样品量为100μL。吸取10μl,滴加在400目的铜网上,自然晾干,最后使用透射电子显微镜来观察样品的形态,记录透射电镜图。结果如图5所示,结果显示纳米颗粒的粒径在200nm以下。
实施例5 纳米颗粒的凝胶电泳测试
称取1.0g琼脂糖,加入100ml 1×TAE缓冲液,在微波炉中加热溶解,待温度降至65℃,加入溴化乙啶(EB),配制成1.0%琼脂糖溶液(含0.5μg/ml溴化乙啶),倒入制胶槽中,插入样品梳,室温放置0.5-1小时等胶凝固。然后,拔出样品梳,电泳槽中加入TAE缓冲液没过凝胶,等待上样。按照实施例2的制备方法来配制聚阳离子核酸材料与基因物质不同质量比的纳米颗粒水溶液,聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比依次为0、1、2、5、10、50、100。Marker选用DSTM5000(100–5000bp),上样2μl;6×上样缓冲液(溴酚兰-甘油指示剂,含0.25%溴酚兰,40%甘油)1μl与纳米颗粒水溶液5μl均匀混合,上样6μl。在110mV电压下电泳45分钟,最后,置于紫外凝胶成像系统观察并记录电泳图。结果如图6所示,结果显示纳米颗粒的粒径在200nm以下。
实施例6 OPEI的细胞毒性检测
采用MTT法测定细胞毒性,选用COS-7、Hela、SMMC-7721细胞考察细胞毒性,以8000个/孔的细胞密度转96孔细胞板,置于37℃5%细胞培养箱里培养过夜。配制1、2、4、8、15mg/mL的系列不同浓度的OPEI溶液,每孔加入100μL,稀释介质是DMEM高糖培养基(无血清无酚红),从培养箱中取出96孔细胞板,吸去培养液,每孔用100μL磷酸盐缓冲溶液冲洗一次,再弃去磷酸盐缓冲溶液,将不同浓度的OPEI溶液依次加入到细胞板中,平行测定3个孔。置于细胞培养箱里培养4小时。然后,吸去培养液,每孔用100μL磷酸盐缓冲溶液冲洗一次,再弃去磷酸盐缓冲溶液,每孔加入100μL DMEM高糖培养基(无血清无酚红)和25μL MTT溶液(5mg/mL),继续于培养箱里培养。6小时之后,吸去培养液,每孔加入100μL二甲基亚砜,放置充分溶甲瓒,采用多功能酶标仪测定样品在570nm和630nm处的吸光度值(以630nm处为对照)。结果如图7所示,结果显示OPEI的毒性较低。
实施例7 本发明的纳米颗粒抑制血管增生的效果试验
BALB/c雌性裸鼠(5周龄,体重20±2g),SPF级环境下饲养1周,取SMMC7721生长最佳状态的传代细胞,按细胞数4×106/ml细胞液,0.1ml接种于BALB/c小鼠后肢近背部皮下。继续饲养2周,使用游标卡尺测量并观察肿瘤的生长状况,按照如下公式来计算肿瘤的体积:肿瘤体积(mm3)=(长×宽×宽)/2。当肿瘤体积达到150-200mm3的时候,分为A为生理盐水组的肿瘤,B为裸DNA组的肿瘤,C为PEI组的肿瘤,D为OPEI组的肿瘤,进行肿瘤局部给药,其中,生理盐水组注射生理盐水,裸DNA组注射裸DNA,PEI组注射PEI和基因物质的复合物,OPEI组注射本发明的纳米颗粒。
二周后处死小鼠,取肿瘤组织,进行CD31染色,具体染色步骤如下:(1)石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。(2)抗原修复:组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min,停火8min,转中低火7min,此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。(3)阻断内源性过氧化物酶:切片放入3%过氧化氢溶液,室温避光孵育25min,将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。(4)封闭非特异性结合位点:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走),滴加封闭液均匀覆盖组织,室温封闭30min。(5)加一抗:甩掉封闭液,在圈内滴加用抗体稀释液按一定比例稀释好的一抗覆盖组织。切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(6)加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加组化试剂盒内与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织,室温孵育50min。(7)DAB显色:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下控制显色时间,阳性为棕黄色,自来水冲洗切片终止显色。(8)复染细胞核:Harris苏木素复染3min左右,自来水洗,1%的盐酸酒精分化数秒,自来水冲洗,氨水返蓝,流水冲洗。(9)脱水封片:将切片依次放入70%酒精5min-80%酒精5min-90%酒精5min-95%酒精5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。结果如图8所示,其中,A-D为取下的肿瘤组织,A为生理盐水组的肿瘤,B为裸DNA组的肿瘤,C为PEI组的肿瘤,D为OPEI组的肿瘤;E-H为肿瘤组织的染色切片,红色为血管,E为生理盐水组肿瘤的组织切片,F为裸DNA组肿瘤的组织切片,G为PEI组肿瘤的组织切片,H为OPEI组肿瘤的组织切片。实验结果显示:本发明的纳米颗粒抑制血管增生的效果很好。
以上公开的仅为本申请的几个具体实施例,但本申请并非局限于此,任何本领域的技术人员能思之的变化,都应落在本申请的保护范围内。
Claims (10)
1.一种治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒,其特征在于,所述纳米颗粒包含聚阳离子核酸材料和基因物质,所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比为1~100:1。
2.如权利要求1所述的纳米颗粒,其特征在于,所述聚阳离子核酸材料由低分子量的聚乙烯亚胺(PEI)与含二甲醛的链接剂以亚胺键构成,所述聚阳离子核酸材料的结构式为:
其中,X为含二甲醛的链接剂衍生的基团。
3.如权利要求2所述的纳米颗粒,其特征在于,所述聚乙烯亚胺的分子量低于2000。
4.如权利要求2所述的纳米颗粒,其特征在于,所述聚乙烯亚胺选自直链聚乙烯亚胺或支链聚乙烯亚胺。
5.如权利要求2所述的纳米颗粒,其特征在于,所述链接剂选自戊二醛、对苯二甲醛、间苯二甲醛、邻苯二甲醛、2,5-咪唑二甲醛、2,4-吡啶二甲醛、2,5-吡啶二甲醛、2,6-吡啶二甲醛、2,5-哒嗪二甲醛或2,6-哒嗪二甲醛的其中一种。
6.如权利要求1所述的纳米颗粒,其特征在于,所述基因物质选自RNA或DNA,所述RNA包括5’-GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3’或5’-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA-3’;所述DNA为构建的质粒DNA,所述质粒DNA包括功能基因序列、启动子序列和抗性基因,所述质粒DNA的功能基因序列包括5’-GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3’或5’-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA-3’。
7.如权利要求6所述的纳米颗粒,其特征在于,所述RNA的分子量为19-22bp。
8.如权利要求1所述的纳米颗粒,其特征在于,所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比为优选为5~50:1,更优选为10~30:1。
9.权利要求1所述的治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
聚阳离子核酸材料的水溶液和基因物质的水溶液混合,在室温静置20-60分钟即可制成所述纳米颗粒。
10.权利要求1所述的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒在制备治疗血管增生的药物中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150107 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |