CN1221796A

CN1221796A - 生物耐受的低分子量聚氮丙啶

Info

Publication number: CN1221796A
Application number: CN98120595A
Authority: CN
Inventors: T·吉塞尔; D·菲舍; H－P·伊尔萨斯; T·彼伯
Original assignee: Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH; Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-09-30
Filing date: 1998-09-30
Publication date: 1999-07-07

Abstract

本发明涉及低分子量聚氮丙啶,含有低分子量聚氮丙啶的用于将核酸插入细胞中的载体,及此低分子量聚氮丙啶和载体的制备方法和用途。本发明涉及将核酸插入细胞中的一种载体,此载体含有一种低分子量的聚氮丙啶(LMWPEI)和一种核酸,LMWPEI的分子量低于50,000道尔顿。

Description

生物耐受的低分子量聚氮丙啶

本发明涉及低分子量聚氮丙啶(polyethylenimine)、含有低分子量聚氮丙啶的用于将核酸插入细胞中的载体、及此低分子量聚氮丙啶和载体的制备方法和用途。

在人体的临床研究方面，体内给予DNA至今没有取得任何显著成功的治疗作用。其原因尤其在于基因转移的低效性和基因信息表达的局限性[Cotton等，酶学方法学(Meth.Enzymol.)217:618-644(1993)]以及所用阳离子载体物质生物适应性的不足[Choksakulnimitr等，控制释放杂志(J.Control.Rel.)34:233-241(1995)]。尽管病毒载体，如反录病毒[Miller，自然(Nature)357:455-460(1992)]或腺病毒[Mulligan，科学(Science)260:926-932(1993)]，在体外试验中显示出很有希望的结果，但由于它们的致炎性和免疫原性，及其在细胞基因组中的诱变和整合，它们在体内的应用仍受到限制[Crystal，科学(Science)270:404-410(1995)]。非病毒的载体，不仅比病毒系统更易操纵，而且也可用一可靠而有效的方式将DNA汇集到细胞中，它提供了另一种可能的选择[Tomlinson和Rolland，控制释放杂志(J.Contr.Rel.)39:359-372(1996)]。

随着时间的推移，基于水溶性阳离子聚合物如聚合左旋赖氨酸(PLL)[Wu和Wu，生物治疗(Biotherapy)3:87-95(1991)]、二乙氨乙基-葡聚糖(DEAE-dextran)[Gopal，生物细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)(5:1183-93(1985)],dendrimers[Haensler和Szoka，生物共轭化学(Bioconjugate Chem.)4:372-379(1993)]或阳离子异丁烯酸衍生物[Wolfert等，人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)7:2123-2133(1996)]的合成载体已经发展替代了传统转染方式，即采用阳离子类脂化合物[Gao和Huang，基因治疗2:710-722(1995)]和两亲性物质[Behr，生物共轭化学5:382-389(1994)]的脂质转染法。采用阳离子聚合物的聚合转染法的突出优点在于无数可能的结构变化，会以理想方式影响聚合物及它们的质粒/聚合物络合物的物理化学特性和生物特性。现已有可能通过附加的偶合细胞特异性配体如运铁蛋白[Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.87:3410-3414(1990)]、脱唾液酸糖蛋白[Wu和Wu，生物化学杂志262:4429-4432(1987)]、各种抗体[Trubetskoy等，生物共轭化学3:323-327(1992)]和碳水化合物[Midoux等，核酸研究21:871-878(1993)]显著地增加这些载体的效能。

在许多不同的粘着和悬浮细胞系中，具有三维分支结构的阳离子聚合物聚氮丙啶(PEI)在某些情况下使转染速度大大高于平均值[Boussif等，基因治疗3:1074-1080(1996)]。例如，3T3成纤维细胞在体内可有高达95％被转化。小鼠脑中体内进行的PEI介导的基因转移导致了神经元和胶质细胞中的报告基因和Bcl2基因的长期表达，其大小与在腺病毒基因转移中相同[Abdallah等，人类基因治疗7:1947-1954(1996)]。

PEI与其他文献记载的聚合阳离子，如PLL[Zenke等，Proc.Natl.Acad.Sci.87:3655-3659(1990)]、异丁烯酸衍生物[Cherng等，药学研究13:1038-1042(1996)]或二乙氨乙基-葡聚糖(DEAE-dextran)[Gopal，分子细胞生物学5:1183-93(1985)]相比具有突出的特性。由于其交联结构和高电荷密度，它能高度凝集和络合质粒。然后能以这些络合物的形式将DNA汇集进入细胞。至今尚未最后搞清PEI/质粒络合物的吸收、细胞内过程和溶变性的机制。

PEI主要的优点在于其结构的pH依赖性变化，这导致核内体/溶酶体区室的不稳定，因而利于将络合物释放到细胞质中。尤其此分子的氨基官能团具有不同的pKa值，使PEI具有明显的缓冲能力(“质子海绵”)，在使核内体酸化时，导致聚合物的质子化和由此产生的膨胀，从而使小泡膜断裂。由核内体ATP酶介导的质子流入可能在此时导致阴离子氯化物被动注入，当PEI存在时，可导致离子总浓度的明显提高和核内体的渗透膨胀[Behr,Chimia 51:34-36(1997)]。由于此原因，转染聚合赖氨酸(PLL)所必需的氯喹之类的溶酶体剂，不会影响转染PEI的速度[Remy和Behr，类脂研究杂志6:535-544(1996)]。

WO9602655A1记载了分子量为5万道尔顿和80万道尔顿(Da)的高分子量PEI(摩尔质量分别为50,000g/mol和800,000g/mol)，用于细胞内转染DNA的用途。

根据制造商提供的信息(如Fluka,Neu Ulm)，市售的PEI分子量为60-100万道尔顿。这样的高分子量PEI制品(HMW PEI)从浓度0.01mg/ml开始，并经3小时的短期孵化后具有显著的细胞毒性。另外PEI结构不能经酶解和水解而分解，因而不能被生物降解。而且，HMW-PEI可能不经粪便和肾脏排泄。

因此体内给药至今仍在使用的HMW PEI，如用于基因治疗，有相当大的危险。

本发明涉及分子量小于50,000道尔顿的PEI，优选500Da-30,000Da的PEI(低分子量PEI:LMW PEI)；还涉及制备此LMW PEI的方法；以及LMW PEI与病毒和非病毒核苷酸序列或核酸形成络合物用以将核苷酸序列插入细胞中的用途；涉及为达到预防或治疗疾病的目的，将这一细胞给哺乳动物的用药方法；还涉及为达到预防或治疗疾病的目的，将与核苷酸序列形成络合物的LMW PEI给哺乳动物的用药方法。

本发明涉及一种载体，此载体含有一种低分子量的聚氮丙啶(LMWPEI)和一种核酸(核苷酸序列)，LMW PEI的分子量低于50,000道尔顿。本发明尤其涉及将核酸结构插入细胞中的载体，此载体含有由分子量小于50,000Da的PEI和核酸组成的络合物，核酸优选非病毒或病毒核酸结构。

LMW PEI优选分子量500至30,000道尔顿。在本发明一优选的实施例中，LWM PEI分子量1000至5000道尔顿。尤其优选分子量大约为2000道尔顿者。

本发明涉及含有低分子量PEI和核酸的载体，通过向单体氮丙啶的水溶液中加入盐酸聚合制得LMW PEI聚合物，水溶液中单体氮丙啶的浓度优选0.1％至90％，其中加入浓盐酸(37％)的浓度优选0.1％-10％。

本发明涉及一种含有低分子量PEI和核酸的载体，在0.1M pH4-pH10范围内的不同pH的磷酸盐缓冲液中进行膨胀研究，LMW PEI不出现任何浑浊或沉淀。

本发明涉及一种含有低分子量PEI和核酸的载体，当应用此载体时，转染率高于1％，优选转染率为5％或更高，在特定的实施例中，转染率可达10％或更高。

核酸可以是DNA或RNA。核酸可以是低聚核苷酸(寡核苷酸)或核酸结构。核酸优选病毒或非病毒核酸结构。核酸结构优选基因或质粒。核酸结构可以含有一个转基因。核酸结构可以含有一或多个效应基因。效应基因可以将药学活性化合物或其前体药物形式编码，和/或将酶编码。核酸结构优选成形为可使基因(如效应基因或转基因)特异性表达的形式，例如，病毒特异性(即，例如只在病毒感染的细胞内)，(靶)细胞特异性，涉及新陈代谢的特异性，细胞周期特异性，涉及进化的特异性；或使基因非特异性表达的形式。在最简单的例子中，核酸含有一个为所需的蛋白质编码的基因，和基因含有特异的启动子序列，适当情况下还有调节序列。为增强和/或扩大基因表达可以存在例如病毒启动子序列和/或增强因子序列。例如Dillon,TiBTech11,167(1993)综述了具有此特性的启动子序列和/或增强因子序列。这些序列的例子是Rous肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)和逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)，巨细胞病毒(CMV)的启动子和增强因子区域，腺(病毒)伴随病毒(AAV)的末端反向重复(ITR)序列和/或启动子序列p5、p19、p40，腺病毒的ITR和/或启动子序列，痘苗病毒的ITR和/或启动子序列，疱疹病毒的ITR和/或启动子序列，细小病毒的启动子序列和乳头瘤病毒的启动子序列(上游调节区域)。

LMW PEI与核酸作为两个起始物质通过混合而形成络合物。优选导致生成具中性或阳性电荷的络合物的混合比例。优选载体由含有高于50％(重量百分比)的LMW PEI的络合物组成。优选LMW PEI与核酸的重量比为3∶1或更高的载体，尤其优选重量比等于或高于5∶1，或等于或高于8∶1。

效应基因可以与一个配体一起表达为一融合蛋白标记物，例如当除效应基因序列之外，核酸结构也含有一个编码配体的序列时。

本发明普遍涉及一种载体，其含有一种LMW PEI、一种核酸，适当时还有一个配体。此载体的各个组分优选以共价键和/或吸附键连接。如被编码的蛋白和/或LMW PEI可以与一配体偶合。本发明尤其涉及一种载体，其中LMW PEI与细胞特异性的(或靶细胞特异性的)配体偶合。

优选细胞特异性的或靶细胞特异性的配体。靶细胞特异性配体可以与靶细胞外膜结合，优选动物或人的靶细胞。靶细胞特异性的配体对靶细胞具有高度特异性。含有靶细胞特异配体的载体可以用于核酸的靶细胞特异转移。例如靶细胞可以为内皮细胞、肌肉细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、(神经)胶质细胞、造血细胞、肿瘤细胞如白血病细胞、病毒感染细胞、支气管上皮细胞、或肝细胞，如肝的窦状细胞。

一种与内皮细胞特异性地结合的配体例如可以选自对内皮细胞专一的单克隆抗体或其片段，末端携带甘露糖的糖蛋白、糖脂或多糖，细胞因子，生长因子，吸附分子，或特别优选来自有内皮细胞向性的病毒被膜的糖蛋白。一种与平滑肌细胞特异性结合的配体可以选自对肌动蛋白专一的单细胞克隆抗体或其片段，细胞膜受体和生长因子，或尤其优选来自有平滑肌细胞向性的病毒被膜的糖蛋白。一种与巨噬细胞和/或淋巴细胞特异性结合的配体可以选自对巨噬细胞和/或淋巴细胞上的膜抗原特异的单克隆抗体，完整的免疫球蛋白，或对巨噬细胞和/或淋巴细胞上的膜抗原特异的单克隆抗体或多克隆抗体的Fc片段，细胞因子，生长因子，末端携带甘露糖的肽，蛋白质，类脂或多糖，或特别优选来自病毒被膜的糖蛋白，尤其是在核苷酸872位置有突变的流感C病毒HEF蛋白或含有催化三联体丝氨酸71、组氨酸368或369和天冬氨酸261的流感C病毒HEF断裂产物。一种与神经胶质细胞特异性结合的配体可以选自特异性与神经胶质细胞膜结构键和的抗体或抗体片段、吸附分子、末端携带甘露糖的肽、、蛋白质、类脂或多糖、生长因子，或特别优选来自具有神经胶质细胞向性的病毒被膜的糖蛋白。一种与造血细胞特异性结合的配体可以选自对干细胞因子受体特异的抗体或抗体片段、IL-1(尤其是Ⅰ或Ⅱ类受体)、IL-3(尤其是α或β受体)、IL-6或粒细胞巨噬集落刺激因子(GM-CSF)，也可以是显示此特异性的完整的免疫球蛋白或可结晶片段(FC fragments)和生长因子，如干细胞生长因子(SCF)、IL-1、IL-3、IL-6或粒细胞巨噬集落刺激因子及其与有关受体结合的片段。一种与白血病细胞特异性结合的配体可以选自抗体、抗体片段、免疫球蛋白或特异性与白血病细胞膜结构结合的Fc片段，如分化簇13(CD13)、CD14、CD15、CD33、细胞粘着分子(CAMAL)、sialosyl-Le、CD5、CD1e、CD23、M38、IL-2受体、T细胞受体、CALLA或CD19，也可以是生长因子或由此衍生的片段，或类视色素。一种特异性地与病毒传染细胞结合的配体可以选自抗体、抗体片段、完整的免疫球蛋白或对病毒抗原有特异性的Fc片段，病毒感染后它在被感染的细胞膜上表达。一种特异性地与支气管上皮细胞结合的配体可以选自运铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白如脱唾液酸血清类粘蛋白、新糖蛋白或半乳糖、胰岛素、末端携带甘露糖的肽、蛋白质、类脂或多糖、完整的免疫球蛋白或特异性与靶细胞结合的Fc片段，或特别优选来自特异性地与靶细胞结合的病毒被膜的糖蛋白。欧洲专利0790312和0846772公开了配体的其他详细的例子。

本发明进一步涉及通过氮丙啶(单体氮丙啶)的开环聚合作用制备基于聚氮丙啶的低分子量、阳离子性的共轭聚合物(LMW PEI)的方法。

在此申请中，优选按Wenker(JACS 57:2328(1935))法从乙醇胺制备氮丙啶。沸点优选在55.0℃-56.0℃。

德国专利申请665,791(1938)公开了通过向单体氮丙啶液体中加入如酸或三氟化硼等催化剂合成PEI的方法。根据此发明，在单体氮丙啶水溶液中加入盐酸使其聚合，这与Dick等发表在《大分子科学杂志》A4:1301-1314(1970)上的方法相似。

为了进行聚合反应，搅拌下在蒸馏水中制备0.1％-90％氮丙啶(单体)溶液并加入0.1-10％浓盐酸(37％)作为催化剂。聚合反应进行1-30天，优选4天，反应温度30℃-70℃，优选50℃。

以13C-NMR光谱分析法、粒度分离色谱法、光散射法和/或粘度测定法表征此聚合物。B.Vollmert(1962)“Grundriss derMakromolekularen Chemie(高分子化学概述)”，SpringerVerlag,Berlin,Pages216-225阐述了用光散射法测定分子量的方法。优选以光散射法测定分子量，尤其优选用分光光度计进行激光散射测定法，如将样品直接注入一K5测定池后用Wyatt Dawn DSP分光光度计在633nm测定。可以用在甲苯中测定的标准常数和已知的初始样品重量确定分子量。

所述的方法可以用于制备分子量在500道尔顿-50,000道尔顿的LMW PEI。因此LMW PEI的分子量显著低于HMW PEI，并显著低于5万Da这一肾脏的阈值，这意味着能够确保LMW PEI的肾排泄。

出乎意外地，就其作为将核酸或核酸结构插入细胞的载体的效能和其生物相容性而言，LMW PEI显著优于HMW PEI。分子大小在1000Da至30,000Da的LMW PEI最适用。LMW PEI可以结合DNA，凝聚DNA，并增强DNA的正电荷特性。当与含有报告基因的DNA络合后，分子量约为2000道尔顿的LMW PEI(在血清中)导致在哺乳动物细胞中报告基因的不同水平的表达(如在小鼠成纤维细胞(3T3)和人内皮细胞(ECV304)中)，这比市售高分子量(HMW)PEI的效果高100倍。同时，LMW PEI对成纤维细胞的细胞毒性显著低于HMW PEI。

本发明因此涉及分子量小于50,000道尔顿的聚氮丙啶，优选分子量为500-30,000道尔顿者(LMW PEI)，涉及制备这种LMW PEI的方法，及LMW PEI与病毒和非病毒核苷酸序列形成的络合物用于将核苷酸序列插入细胞中的用途，涉及将此细胞用于哺乳动物以达到预防或治疗疾病目的的给药方法，还涉及将与核苷酸序列形成络合物的LMW PEI用于哺乳动物以达到预防或治疗疾病目的的给药方法。

本发明涉及分子量小于50,000道尔顿的LMW PEI，优选用本申请公开的方法制备的LMW PEI。

本发明还涉及分子量小于50,000道尔顿的LMW PEI，优选1000-30,000道尔顿，尤其优选2000道尔顿的LMW PEI的用途。LMW PEI可以用于将核酸插入细胞，用于制备将核酸插入细胞的载体，或用于制备一种药物和/或用于基因治疗。

本发明进一步涉及制备将核酸插入细胞的载体的方法。例如可以通过将适量的LMW PEI与适量的核酸混合制备此载体。LMW PEI与核酸优选在水溶液中混合。

本发明进一步涉及此载体的用途。例如此载体可以用于将核酸插入细胞或靶细胞(转染或聚合转染)，或制备药物和/或用于基因治疗。本发明优选涉及此载体将非病毒或病毒核酸结构插入细胞的用途，和涉及将此转染细胞用于病人以达到预防或治疗疾病的目的的用途，这类转染细胞可以是内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肝细胞、成纤维细胞、肌肉细胞或上皮细胞，可以把这些细胞局部注入皮肤、皮下、肌肉内、伤口中、体腔内、器官或血管中。在另一优选实施例中，本发明涉及载体在预防或治疗疾病中的用途，例如，可以将载体局部注入皮肤、皮下、肌肉内、伤口中、体腔内、器官或血管中。

LMW PEI或含有LMW PEI的载体，可以用于将核酸插入细胞/靶细胞，此细胞/靶细胞可以是内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肝细胞、成纤维细胞、肌肉细胞或上皮细胞。

本发明进一步涉及将这些细胞与LMW PEI和/或载体一起孵化制备转染细胞或靶细胞的方法。优选在体外进行转染。本发明还涉及含有LMW PEI和/或本发明载体的转染细胞或靶细胞。本发明进一步涉及转染细胞作为药物的用途，或用于制备药物和/或用于基因治疗的用途。

本发明进一步涉及含有一种LMW PEI和/或一种本发明载体和/或一种转染细胞的药物。本发明也涉及将一种核酸与LMW PEI混合，适当时加入其它附加剂，制备药物的方法。

由于本发明LMW PEID的结构分支远远少于HMW PEI，并因此比HMW PEI含有更多的氨基，与HMW PEI相比有更多的机会将LMWPEI与细胞特异的配体偶合。本发明因此涉及LMW PEI与有细胞特异性的配体偶合，并涉及此偶合产物与病毒或非病毒序列形成络合物，将核苷酸序列插入细胞中的用途，或涉及为达到预防、治疗疾病的目的将此络合物给哺乳动物药用的用途。专利申请EP97101506.0和DE19649645.4已详细公开了细胞特异性配体的制备和偶合的可能性。这些专利申请在此作为参考。

LMW PEI(适当时与细胞特异性配体偶合)与病毒或非病毒核酸结构形成的络合物构成一种基因治疗的载体。在一优选的实施例中，这些载体给病人局部外用或内用于体腔、组织、血液循环、呼吸道、胃肠道或尿道，或肌肉内或皮下用药。

由本发明载体可以以一种非细胞特异或细胞特异的方式将效应基因汇集入靶细胞，此处的效应基因优选为药物活性化合物编码或为使一种活性化合物的非活性前体裂解为活性化合物的酶编码的基因。可以选择效应基因使药物活性化合物或酶与配体一起表达为融合蛋白标记物，此配体与细胞表面结合，如增殖内皮细胞或肿瘤细胞。

本发明也涉及已由本发明的LMW PEI将核酸结构插入其中的酵母或哺乳动物细胞。在特别优选的实施例中，用本发明的LMW PEI将核酸结构引入细胞系中，这些细胞系在转染后，可以用于表达转基因。这些细胞因此可以制备用于病人的药物。与核酸结构形成络合物的本发明LMW EPI的优选的用途是制成药剂治疗疾病，该制剂包括核酸结构在靶细胞中的插入，及此结构以病毒特异或靶细胞特异或代谢特异或非特异方式和细胞周期特异性方式的表达。

本发明进一步涉及哺乳动物细胞的用药方法，其中用本发明的LMW PEI将核酸结构插入细胞中，以制备一种治疗疾病的药物。如，可以从血液中分离内皮细胞，在体外用本发明载体处理，然后以静脉注入的方式进入人体。

这些在体外被转染的细胞，也可以与本发明载体组合给病人用药。这种组合意指细胞和载体，分别同时或在不同时间，在同一或不同部位用药或注射用药。

实施例：1)方法a)低分子量聚氮丙啶(LMW PEI)的制备

通过采用酸催化剂将氮丙啶在水溶液中进行开环聚合反应得到LMW PEI。对此，向10％氮丙啶单体水溶液(5ml氮丙啶单体+45ml蒸馏水，搅拌溶解)中加入1％(0.5ml)浓盐酸(37％)催化剂，在50℃搅拌4天，然后旋转蒸发并在室温真空干燥。直接将LMW PEI注入一K5测定池中，用激光色散测定法(Wyatt Dawn DSP分光光度计)在633nm测定分子量。根据在甲苯中测定的标准常数和已知的初始样品重量计算克分子量。

用分光分析法测定的分子量为2000道尔顿。用分光分析法测定的市售PEI(Fluka,Neu Ulm)的分子量为791kDa(HMW PEI)。

将LMW PEI与HMW PEI两种试样进行对照试验。b)聚核苷酸络合物的制备

按Boussif等(Boussif等，Proc.Natl.Acad.Sci.92:7297-7301(1995))的方法将DNA质粒与PEI络合。9mg50％市售HMW PEI溶液或9mgLMW PEI溶于9ml双蒸水中用1NHCl将pH调节到7.4，然后以水定溶到总体积10.0ml。制得的溶液经过滤灭菌(0.2μm)，可以在4℃储存较长时间。

对于制备络合物，10μg质粒和不同量的PEI储备液均以150mMNaCl稀释到250μl，在涡流器中混合。表1给出了制备络合物的混合比例和当量比。在室温保温10分钟后，聚合物溶液分份地滴加到质粒溶液中并在涡流器中混合。将络合物再保温10分钟后，将其加入细胞培养介质中。c)琼脂糖迁移测定法

在琼脂糖迁移测定法中检验不同PEI与质粒结合的能力。方法为，将1.35-27μgHMW PEI和2.7-90μgLMW PEI均分别与10μg质粒络合(表1)。将50μl的等分试样加载于厚度约0.5cm的1％(w/v)琼脂糖凝胶上，在80mV电压下，在pH7.4的三(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)缓冲液中展开2小时。与溴化乙锭反应后，在254nm观测DNA的位置。

为从络合物中显示质粒，在生成络合物30分钟后向每10μgDNA络合物中加入50μl或100μl葡聚糖硫酸盐溶液(Mw5000,10mg/ml,Sigma,Deisenhofen)。d)细胞培养

在本领域技术人员熟知的标准条件下进行L929小鼠成纤维细胞培养。将这些细胞散布在96孔的细胞培养皿中，细胞密度为8000个细胞/孔，培养24小时后进行细胞毒性试验。

在标准条件下以同样方法培养3T3成纤维细胞。

自发地转化的胞外病毒(ECV)304(ATCC,Rockville,MD USA)，附着于被显性正常控制码确定的人内皮细胞系，将其在Dulbecco's改良Eagle’s介质(DMEM)(Gibco,Eggenstein)中培养，此介质含5％胎牛血清(FCS)、5％马血清和1％N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷(氨)酰胺(均来自Gibco,Eggenstein)。

在37℃、相对湿度95％和5％二氧化碳条件下孵化的此细胞，达到融合后，用胰蛋白酶/乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)溶液(2.5％胰蛋白酶储备液，50mM乙二醇四乙酸溶液，pH7.4磷酸缓冲盐溶液，1∶1∶8)进行细胞传代每周两次。由于细胞以细胞簇的形式而非单个从培养基脱落，因此可分别进行1/8传代。

按照Bowman等[(1983)神经病学年刊(Ann.Neurol.)14:392-402]和Mischek等[Mischek等，细胞组织研究(Cell.Tiss.Res.)256:221-226(1989)]的方法分离和培养大脑毛细血管内皮细胞。为了进行转染实验，在分离后立即将其散布在6孔细胞培养皿中直至约50％融合。e)细胞毒性研究

按照Mosmann等的方法[Mosmann，免疫法杂志，65:55-63(1983)]，在L929小鼠成纤维细胞上，采用MTT测定法测定聚合物的细胞毒性。在极限必需培养基(DMEM)中用10％FCS和2mM谷(氨)酰胺制备聚合物的系列稀释液，然后过滤灭菌(0.2μm,Schleicher&Schuell,Dassel)。需要时调整溶液的pH和渗透压。细胞预孵化24小时后，聚合物溶液与细胞混合，并孵化1、3、12和24小时。用紫外分光光度法测定甲(formazan)浓度以对细胞生存能力定量。

在第二组试验中，只温和地用聚合物处理细胞1小时，然后清洗，在无PEI的细胞培养介质中再培养3、12、24小时。按上述方法定量测定。f)转染

将散布在3cm²培养皿中的ECV304细胞和3T3小鼠成纤维细胞，及散布在6孔培养皿中的初级内皮细胞，在试验前即刻以pH7.4磷酸盐缓冲液清洗，并提供新鲜的血清补充介质。在每孔或每盘中加入相当于3.33μgDNA的HMW PEI和LMW PEI络合物，在37℃孵化1小时。然后将细胞孵化60小时，类似于章节9的方法和按厂商说明书测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶的活性。[HMW PEI和LMW PEI络合物为相应的载体，它们分别含有HMW PEI和LMW PEI，和核酸，此处为DNA质粒]。例2：结果a)PEI的物理化学性质

用在pH4-10范围内不同pH值的0.1M磷酸盐缓冲溶液进行的膨胀研究，阐明聚合物在核内体/溶酶体区室内的反应特点。当HMW PEI在pH9和pH10溶解时，形成澄清无残渣的溶液，在pH8及以下则可以看到高度浑浊。这种浑浊在pH7及pH8基本稳定。几小时后才出现沉降。相反，在pH酸性范围，在30分钟内形成易于再次悬浮的沉积物。在同样条件下，LMW PEI不产生任何浑浊或沉淀，而形成澄清溶液。b)细胞毒性研究

在L929小鼠成纤维细胞上进行体外PEI细胞毒性测定，各种标准化组织推荐此成纤维细胞为用于测定聚合物的细胞毒性和生物相容性的标准细胞培养模型。预试验确定所形成的甲(formazan)的吸收和在1×10³-3×10⁴范围内细胞数量之间的直接、线性的比例关系。在24小时生长阶段后，8000细胞/孔与聚合物溶液混合，并孵化1、3、12和24小时。在0-1.0mg/ml范围内，可观察到的HMW PEI和LMW PEI的毒性效应在24小时内呈时间和浓度依赖性，高分子量和低分子量PEI的细胞毒性曲线显示显著的不同。因此，对于HMW PEI,IC50在0.06mg/ml(1小时孵化)和0.04mg/ml(24小时孵化)之间，而浓度在0.1和1.0mg/ml之间的LMW PEI只在孵化12小时后才有毒性，只有当浓度约为0.1mg/ml的LMW PEI经24小时孵化后才能够测得其IC50值。c)琼脂糖凝胶迁移测定法

为确定质粒和PEI之间的最佳结合和数量比例，将一定量的质粒(10μg)按规程与不同浓度的HMW PEI和LMW PEI络合，然后进行电泳分析。表1给出了所测定的络合物的混合比例、所用储备液体积和PEI的绝对量。

表1a)

质粒/HMW PEI的混合比例[当量]1+11+6.671+101+13.331+20

储备液体积[μl] HMW PEI绝对量[μg]3 1.3520 930 13.540 1860 27

b)

质粒/LMW PEI的混合比例[当量]	储备液体积[μl]	LMW PEI绝对量[μg]
质粒/LMW PEI的混合比例[当量]	储备液体积[μl]	LMW PEI绝对量[μg]	1+2	3	2.7
1+13.33	20	18	1+2	3	2.7
1+13.33	20	18	1+20	30	27
1+26.67	40	36	1+20	30	27
1+26.67	40	36	1+40	60	54
1+53.33	80	72	1+40	60	54
1+53.33	80	72	1+66.66	100	90

表1：含有a)HMW PEI和b)LMW PEI用于电泳和转染的络合物混合比例图

经溴化乙锭染色显示质粒与其络合物的位置。DNA形成两个与质粒的超螺旋环形形态相对应，并向阳极方向迁移的荧光带。用溴化乙锭不能测得HMW PEI和LMW PEI。

以1+1比例进行的DNA和HMW PEI的络合导致部分而非全部阻碍加样处质粒的迁移。降低总加样量和/或增加加样直径，会阻止形成的络合物在凝胶基质中的迁移。

按1+6到1+20比例的络合物不能检出，因为它们不显示任何荧光；这提示溴化乙锭受质粒排斥，因为其结构受到HMW PEI的充分凝聚和物理性压缩。对于这些络合物，阴电荷/阳电荷比例从1∶1.2(1+6)至1∶4(1+20)。因此络合物总体带有正电荷。

2.7μgLMW PEI几乎可以全部结合和阻止10μg质粒。然而，此络合物总体为负电荷，并向阳极迁移。然而只在LMW PEI≥54μg时能观察到完全的阳离子和DNA的凝聚。

为验证高和低分子量PEI的凝聚效应，用过量的葡聚糖硫酸盐从已形成的络合物中代替DNA，将葡聚糖硫酸盐与阳离子聚合物进行竞争性反应。对于HMW PEI和LMW PEI,DNA可以再次从络合物中释放，全部或部分DNA可以迁移进入凝胶基质。溴化乙锭可以再次进入DNA结构中，因此可以用荧光法测得DNA。d)体外转染效能

用细胞系(3T3小鼠成纤维细胞和人内皮细胞系ECV304)和初级培养物(猪脑毛细血管内皮细胞)测定PEI络合物的转染效能。Promega市售的pGL3控制载体，它在SV40启动子和增强因子控制下携带荧光素酶基因，可以作为报告基因。在络合物中混合的质粒和聚合物的比例与进行电泳的络合物相同。

测定了1.35μg至27μg HMW PEI/10μgDNA的浓度。在18μgHMW PEI得到最大转染。进一步增加聚合物浓度只导致荧光素酶表达的较小的降低。

对于LMW PEI，测定了20-80μgLMW PEI/10μgDNA的浓度。与HMW PEI的情况相反，当增加LMW PEI浓度时，在ECV细胞中测得了转染效能的稳定性增强。在80μgLMW PEI/10μgDNA时，测得报告基因活性约比用18μgHMW PEI/10μgDNA测得的活性约大100倍，这是显示的最大的活性。用最高浓度的LMW PEI进行观测，未观察到在用HMW PEI情况下出现的荧光素酶表达的下降。用3T3和ECV细胞进行的实验得出了相同的结果。

为进行对比，也在内皮初生细胞培养物上进行了β-半乳糖酶作为报告基因的转染研究，并采用了最大可耐受的无细胞毒性的剂量(MTD)的HMW PEI和LMW PEI络合物。体外MTD值为13.5μgHMW PEI/10μgDNA和90μgLMW PEI/10μgDNA。几乎不可能对培养的猪大脑毛细血管内皮细胞进行转染，这种细胞是用包含10μgDNA和13.5μg HMW PEI的络合物进行培养的。每个培养孔中只有2-3个细胞在细胞核部位显示特异性的兰色反应。经处理的细胞仅少于10％成功地进行了转染。相对而言，用含有90μgHMW PEI的和10μgDNA的络合物进行孵化导致内皮细胞中标识蛋白的显著表达。每孔中兰染细胞与总细胞数的百分比，即转染成功率，在5％-10％。用光学显微镜没有观察到聚合物/DNA络合物对细胞有任何毒性效应。

Claims

1．一种用于将核酸插入细胞内的载体，其特征在于其含有一种低分子量聚氮丙啶(LMW PEI)和一种核酸，其中LMW PEI的分子量小于50,000道尔顿。

2．根据权利要求1所述的载体，其特征在于LMW PEI的分子量为500至30,000道尔顿。

3．根据权利要求1和2中的一个或多个权利要求所述的载体，其特征在于LMW PEI的分子量为1000至5,000道尔顿。

4．根据权利要求1至3中的一个或多个权利要求所述的载体，其特征在于LMW PEI的分子量约为2000道尔顿。

5．根据权利要求1至4中的一个或多个权利要求所述的载体，其特征在于核酸是病毒或非病毒核酸结构。

6．根据权利要求1至5中的一个或多个权利要求所述的载体，其特征在于核酸结构含有一个或多个效应基因。

7．根据权利要求1至6中的一个或多个权利要求所述的载体，其特征在于其中至少一种效应基因为一种药学活性化合物或其药物前体编码。

8．根据权利要求1至7中的一个或多个权利要求所述的载体，其特征在于其中至少一种效应基因为一种酶编码。

9．根据权利要求1至8中的一个或多个权利要求所述的载体，其特征在于其中至少一种效应基因与一种细胞特异的配体一起表达为一种融合蛋白标记物。

10．根据权利要求1至9中的一个或多个权利要求所述的载体，其特征在于其中的LMW PEI与一个细胞特异的配体偶合。

11．根据权利要求1至10中的一个或多个权利要求所述的载体，其特征在于其中的细胞特异的配体与靶细胞外膜结合。

12．根据权利要求1至11中的一个或多个权利要求所述的载体，其特征在于其中的靶细胞为内皮细胞、肌肉细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、神经胶质细胞、造血细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞、支气管上皮细胞或肝细胞。

13．根据权利要求1至12中的一个或多个权利要求所述的载体，其特征在于其中LMW PEI与核酸的重量比为3∶1或更多。

14．根据权利要求1至13中的一个或多个权利要求所述的载体，其特征在于其中LMW PEI与核酸的重量比为8∶1或更多。

15．一种制备分子量小于50,000道尔顿的低分子量聚氮丙啶的方法，其特征在于此方法包括通过加入盐酸使单体氮丙啶在水溶液中聚合。

16．根据权利要求15所述的方法，其特征在于水溶液中单体氮丙啶的浓度为0.1％-90％，浓盐酸的浓度为0.1％-10％。

17．根据权利要求15和16一个或多个权利要求所述的方法，其特征在于在30℃-70℃进行聚合反应。

18．根据权利要求15至17的一个或多个权利要求所述的方法，其特征在于反应时间为1-30天。

19．一种分子量小于50,000道尔顿的低分子量聚氮丙啶，其特征在于它是由权利要求15-18的一个或多个权利要求所述的方法制备的。

20．一种分子量小于50,000道尔顿的低分子量聚氮丙啶的用途，其特征在于它用于制备如权利要求1至14一个或多个权利要求所述的载体。

21．一种制备权利要求1至14中的一或多个权利要求所述的载体的方法，其特征在于它包括将适量的LMW PEI与适量的核酸在水溶液中混合。

22．根据权利要求1至14中的一或多个权利要求所述的载体的用途，其特征在于用于将核酸插入细胞中。

23．根据权利要求22所述的载体的用途，其特征在于所述的细胞为内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肝细胞、成纤维细胞、肌肉细胞或上皮细胞。

24．一种制备转染细胞的方法，其特征在于它包括将权利要求1至14的一或多个权利要求所述的载体与这一细胞在体外孵育。

25．一种转染细胞，其特征在于含有权利要求1至14中的一或多个权利要求所述的载体。

26．一种根据权利要求25所述的转染细胞的用途，其特征是用于制备一种药物。

27．一种根据权利要求19所述的低分子量聚氮丙啶的用途，其特征是用于制备一种药物。

28．一种根据权利要求1至14中的一或多个权利要求所述的载体的用途，其特征是用于制备一种药物。

29．一种根据权利要求1至14中的一或多个权利要求所述的载体的用途，其特征是用于制备一种用于基因治疗的药物。

30．一种制备药物的方法，其特征在于它包括将一种核酸与一种LMW PEI混合。

31．一种药物，其特征在于含有一种根据权利要求1至14中的一或多个权利要求所述的载体。

32．一种药物，其特征在于含有一种如权利要求19所述的LMWPEI。

33．一种药物，其特征在于含有一种如权利要求25所述的转染细胞。