JP3938954B2

JP3938954B2 - 新規なグラフト共重合体、それを用いた薬剤、及びそれを用いて薬物を特定細胞に取り込ませる方法

Info

Publication number: JP3938954B2
Application number: JP21930596A
Authority: JP
Inventors: 厚丸山; 敏宏赤池; 武後藤; 圭史米村; 周英野崎; 哲郎上野
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Priority date: 1996-08-01
Filing date: 1996-08-01
Publication date: 2007-06-27
Anticipated expiration: 2016-08-01
Also published as: JPH1045630A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なグラフト共重合体、それを用いた薬剤、及びそれを用いて薬物を特定細胞に取り込ませる方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学の急速な発展により、様々な分子生物学的手法の開発が行われ、遺伝子情報の解析および遺伝子の機能解明がなされている。さらに、このようにして得られた成果を治療方法等に応用する試みが数多く行われている。
【０００３】
その中でも、最も進歩の著しい分野の１つとして遺伝子治療分野があげられる。種々の遺伝性疾患における原因遺伝子の発見、解読が行われ、遺伝子治療は基礎的実験の段階から、実際の臨床応用の段階までに発展しつつある。例えば、米国においては、１９９５年６月までに８１の遺伝子治療プロトコールがＮＩＨの組換えＤＮＡ委員会（ＲＡＣ）で承認され、先天性免疫不全症、家族性高コレステロール血症、嚢胞性線維症等の遺伝性疾患および各種の癌を対象とし、既に２００人以上の患者に対して臨床試験が行われている（実験医学Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．３，３０３−３０７（１９９４））。
【０００４】
遺伝子治療は病気を細胞レベルの根本から治療できる方法ではあるが、臨床応用における大きな技術的課題の１つとして、外来遺伝子を効率良く安全に標的細胞へ導入する方法についていくつかの問題が指摘されている。即ち、遺伝子治療は、異常（病原）遺伝子をそのままにして、新しい（正常）遺伝子を付け加える付加遺伝子療法（ＡｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）と、異常遺伝子を正常遺伝子で置き換える置換遺伝子療法（ＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）に大別されるが、いずれの療法の場合にも、正常遺伝子を効率良く安全に標的細胞へ導入する方法が必要とされる。
【０００５】
例えば、１９８０年代初期にはマイクロインジェクションなど物理的手法の応用が試みられたが、遺伝子の導入効率が低く、安定に導入することができず、さらには大量細胞培養技術の限界等の問題点があった。
【０００６】
また、外来遺伝子を効率良く標的細胞に導入するためのキャリアーとなる組換えウイルス（ウイルスベクター）が開発され、初めて遺伝子治療の臨床応用が可能となった。現在、遺伝子治療への使用が検討されているウイルスベクターには、以下に示すようにいくつかの種類が知られているが、これらは一般的に生産方法が非常に複雑であると同時に、それぞれの安全性を保証する方法が確立されていないという問題点がある。例えば、遺伝子治療に使用可能なウイルスベクターとして、現在最も注目されているウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ：ＭｏｌｏｎｅｙＭｕｒｉｎｅＬｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓ）由来のレトロウイルスベクターであり、本ウイルスの増殖様式の利点を利用したものである。レトロウイルスは、エンベロープをもつＲＮＡウイルスであり、そのエンベロープ蛋白と宿主細胞側のレセプターが結合することにより細胞内に侵入する。侵入後、単一鎖ウイルスＲＮＡが逆転写酵素により二重鎖ＤＮＡに変換され、感染細胞ゲノムＤＮＡに組み込まれる。しかしながら、このような組み込みが起こるためには、細胞が分裂増殖していなければならない。従って、実用的に一番問題となるのは、非分裂細胞に遺伝子導入できない点である。そのため、多くの先天性代謝異常症で問題となる神経細胞の遺伝子修復が行えない。神経細胞以外にも、遺伝子治療の対象細胞となっている造血幹細胞、肝細胞、筋細胞なども、通常はほとんど静止期にあるため、遺伝子導入効率は低い。体外に取り出した細胞については、遺伝子導入効率を高めるために分裂を促進するような処理を行うことが可能であるが、生体内でこれらの細胞に遺伝子導入を行うことは難しい。
【０００７】
また、アデノウイルスベクターは非分裂細胞へも遺伝子が導入できるものとして最近注目されている。しかし、アデノウイルスベクターでは外来遺伝子が標的細胞ゲノムＤＮＡ内に組み込まれないため、数週問から長くても数カ月で遺伝子導入の効果はなくなってしまう。そのため遺伝子導入を頻繁に繰り返す必要があり、患者への肉体的、身体的な負担の増加、抗アデノウイルス抗体が産生されることによる遺伝子導入効率の低下などが問題となっている。現在、嚢胞性線維症の治療のためにアデノウイルスベクターを経気管支鏡的に肺に投与する臨床試験が開始されているが、アデノウイルス粒子の免疫原性および細胞毒性に起因するとみられる炎症反応が発生する可能性が指摘されている。
【０００８】
さらに、へルペスウイルスベクターは神経細胞への外来遺伝子導入が可能なベクターとして期待されているが、細胞毒性が強く、さらにウイルス自体のゲノムサイズが１５０ｋｂと非常に大きいために開発は進んでいない。さらに、ＨＩＶベクターはウイルス自体の宿主特性により、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球に対して特異的遺伝子導入を可能とするベクターとして開発された（ＳｈｉｍａｄａＴ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８８，１０４３（１９９１））。しかしながら、ＨＩＶベクターには最大の欠点として野生株混入の可能性という問題がある。また、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ‐ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ）ベクターに関しては、野生型のＡＡＶは第１９染色体の特定の位置に組み込まれることが見出され、遺伝子組み込み位置をターゲティングできるベクターとして注目された。しかし最近の研究によると、組換えＡＡＶベクターはこの特性を失っており、外来遺伝子は染色体の非特異的位置に組み込まれると指摘されている。さらにＡＡＶベクターは導入できる外来遺伝子のサイズに限界があり、５ｋｂ以下の遺伝子しかベクター内にパッケージングできないという欠点もある。
【０００９】
一方、ウイルスベクター以外にも、各種の人工的な遺伝子導入システムを用いて遺伝子治療を行おうとする試みが多くなされている。例えば、正電荷を有する脂質による遺伝子−脂質複合体が遺伝子治療用非ウイルスキャリアーとして開発されている。しかしながら、これらのキャリアーは、大量に用いた場合に細胞毒性が高い等の問題点が指摘されている（ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３，３２３‐３２７（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８９，７９３４‐７９３８（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６９，１２９１８‐１２９２４（１９９４）、特表平６‐５０５９８０、特表平６‐５０７１５８）。
【００１０】
また、核酸およびその誘導体が負電荷を有することを利用し、正電荷を有する合成高分子誘導体との間で静電的複合体を形成させることにより、標的となる細胞もしくは細胞内へ遺伝子を送達させることを試みた研究報告もなされている（ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３，３２３‐３２７（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８９，７９３４‐７９３８（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６９，１２９１８‐１２９２４（１９９４）、特表平６‐５０５９８０、特表平６‐５０７１５８）。しかしながら、従来の正電荷を有する合成高分子誘導体は、単独で用いた場合には細胞毒性が高いことが指摘されている（ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１，１４９‐１５３（１９９０））。それと同時に、これら従来の合成高分子誘導体が生体内へ投与された場合は、異物として認識されることにより、アナフィラキシーショック等の免疫系への影響も問題点とされている。
【００１１】
さらには、異物として認識されにくいという理由から、生体由来の核タンパク質を用いた試みも検討されている。核タンパク質は、核酸およびその誘導体と特異的に結合する性質を有していることから、静電的複合体を形成することにより、遺伝子導入用ベクターとなり得る可能性がある。核タンパク質であるヒストンタンパク質を用い、それらをプラスミドＤＮＡ用のキャリアーとして研究をおこなっている例がある（ＹａｓｕｆｕｍｉＫａｎｅｄａ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４３，３７５‐３７８（１８８９）、ＭｉｒｊａｍＢｒｅｅｕｗｅｒａｎｄＤａｖｉｄＳ．Ｇｏｌｄｆａｒｂ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６０，９９９‐１００８（１９９０）、ＪｉａｎＣｈｅｎ，ｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．５，４２９‐４３５（１９９４））。しかし、これらの例においても、遺伝子を細胞に取り込ませる方法についてのみ検討されており、必ずしも多くの細胞種において遺伝子の発現効率を向上させることを目的としているわけではなく、多くの細胞種において遺伝子を効率よく細胞質内に導入するためのベクターとしては必ずしも充分ではないという問題がある。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
このように、従来は、
（１）ＤＮＡ等と充分に安定な複合体を形成する点、
（２）ＤＮＡ等を特定の細胞または組織へ選択性よく送達させる点、及び
（３）ＤＮＡ等を細胞質内へ充分に取り込ませる点
の全ての要件を充分に満たすキャリアーは未だ存在しなかった。
【００１３】
そこで、本発明の目的は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び陰イオン性化合物からなる群から選択される薬物と安定な複合体を形成し、該薬物を特定の細胞または組織へ送達することを可能とし、さらには該薬物の細胞質内への移行性を向上させることが可能な化合物を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び陰イオン性化合物からなる群から選択される薬物を特定の細胞または組織へ送達しかつ細胞質内へ充分に取り込ませることが可能な薬物を提供することにある。
【００１５】
また、本発明の更に他の目的は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び陰イオン性化合物からなる群から選択される薬物を特定の細胞または組織へ送達しかつ細胞質内へ充分に取り込ませることが可能な方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、特定の構造を有するグラフト共重合体を用いることによって上記従来の問題点を解決することが可能なことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、ポリカチオン性アミノ酸に生体膜親和性基を導入してなるポリカチオン性誘導体と、特定細胞に対して標的性を示す標的リガンドとを含むことを特徴とするグラフト共重合体にある。
【００１８】
また、本発明は、ポリカチオン性アミノ酸に生体膜親和性基を導入してなるポリカチオン性誘導体と、特定細胞に対して標的性を示す標的リガンドとを含むことを特徴とするグラフト共重合体と、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び陰イオン性化合物からなる群から選択される薬物とを含むことを特徴とする薬剤にある。
【００１９】
さらに、本発明は、ポリカチオン性アミノ酸に生体膜親和性基を導入してなるポリカチオン性誘導体と、特定細胞に対して標的性を示す標的リガンドとを含むことを特徴とするグラフト共重合体を用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び陰イオン性化合物からなる群から選択される薬物を特定細胞に取り込ませることを特徴とする方法にある。
【００２０】
上記本発明のグラフト共重合体にあっては、主としてポリカチオン性アミノ酸によってＤＮＡ、ＲＮＡ又は陰イオン性化合物といった薬物との安定な複合体形成が達成され、主として生体膜親和性基によって前記薬物の細胞質内への移行性向上が達成され、更に主として標的リガンドによって特定の細胞または組織への送達性が達成される。従って、このようなグラフト共重合体を含有する本発明の薬剤並びにかかるグラフト共重合体を用いる本発明の方法によれば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は陰イオン性化合物といった薬物が安定な複合体の形で特定の細胞または組織へ送達され、そして細胞質内へ充分に取り込まれる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明のグラフト共重合体、並びにそれを用いた本発明の薬剤及び方法をそれぞれの実施の形態に即してさらに詳しく説明する。
【００２２】
先ず、本発明のグラフト共重合体について説明する。
【００２３】
本発明のグラフト共重合体は、前述のように、ポリカチオン性アミノ酸に生体膜親和性基を導入してなるポリカチオン性誘導体と、特定細胞に対して標的性を示す標的リガンドとを含む。
【００２４】
本発明にかかるポリカチオン性アミノ酸は、治療用、診断用等のＤＮＡ、ＲＮＡ又は陰イオン性化合物とイオン性結合を形成するものであり、ポリリジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、並びにリジン、ヒスチジン、オルニチン及びアルギニンのうちの少なくとも一つを含むアミノ酸共重合体が好ましいものとして挙げられ、特にリジンオリゴマー（ポリリジン）が好ましい。ポリリジンを使用すると特にＤＮＡ等と強力な結合が形成されかつＤＮＡ等のリン酸基間のイオン反発が和らげられ、得られる複合体がより安定化する傾向にあるからである。
【００２５】
また、前記ポリカチオン性アミノ酸は、数平均重合度（アミノ酸数）が８〜１００のものであることが好ましく、１０〜４０のものであることがより好ましい。上記数平均重合度が８未満ではアミノ酸のカチオン量が少な過ぎるため、アニオン性であるＤＮＡ等との複合体形成が困難となる傾向にあり、他方、１００を超えると複合体の立体障害が生じるため、薬物としての機能を果たさなくなる傾向にあるからである。
【００２６】
本発明にかかる生体膜親和性基は、生体膜親和性を向上させて薬物の細胞への導入を向上させる官能基であり、炭素数が４〜１８でありかつ不飽和数が０〜４である脂肪族炭化水素基、コレステロール誘導体、及びホスファチジルエタノールアミン誘導体が好ましいものとして挙げられ、特に炭素数が４〜１８のアルキル基が好ましい。上記炭素数が４未満では疎水性が低下し、生体膜との親和性が低下する傾向にあり、他方、１８を超えると逆に疎水性が過剰になり過ぎて生体膜との親和性が低下する傾向にあるからである。
【００２７】
本発明にかかる標的リガンドは、特定の細胞又は組織に対する特異性を示すものであり、抗体、酵素、糖鎖、核酸、合成アミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、生体由来多糖、及びそれらの修飾体（誘導体）が挙げられ、更に好ましいものとしては以下のものが挙げられる。すなわち、ガラクトース残基を有するポリスチレン誘導体（対肝細胞特異性）、ヒアルロン酸誘導体（対肝細胞特異性）、抗ＣＤ４抗体の誘導体（対リンパ球特異性）、細胞接着因子の誘導体（対内皮細胞特異性）、抗ＣＥＡ抗体の誘導体（対ガン細胞特異性）、トランスフェリンの誘導体（対血液脳関門特異性）等が挙げられる。
【００２８】
なお、本発明のグラフト共重合体は、上記の生体膜親和性基を導入してなるポリカチオン性誘導体と上記の標的リガンドとを含むグラフト共重合体であればよく、これらは好ましくは脂肪族炭化水素基、特に好ましくはビニル基及び／又はメタクリロイル基、によって結合される。
【００２９】
また、本発明のグラフト共重合体は、主鎖部分の数平均重合度が１０〜２００であり、かつ側鎖部分の数（分枝数）が１〜１００であることが好ましい。主鎖部分の数平均重合度が１０未満ではリガンドの不足によって細胞から認識されなくなる傾向にあり、他方、２００を超えると分子量が大きくなり、細胞への取り込みが低下すること及び生体内での代謝が悪くなる傾向にあるからである。また、側鎖部分の数が１００を超えると分子量が大きくなり、細胞への取り込みが低下すること及び生体内での代謝が悪くなる傾向にあるからである。
【００３０】
なお、本発明のグラフト共重合体において上記標的リガンドの重合体とポリカチオン性誘導体のうちいずれが主鎖部分（幹重合体）となるかは特に制限されないが、好ましくは標的リガンドの重合体が主鎖部分（幹重合体）となり、ポリカチオン性誘導体が側鎖部分（枝重合体）となる。
【００３１】
次に、本発明のグラフト共重合体として特に好ましいものについて説明する。すなわち、下記一般式（Ｉ）：
【００３２】
【化２】

【００３３】
［式中、Ｒは炭素数が４〜１８のアルキル基であり、Ｘ₁及びＸ₂はそれぞれ水素原子であり、ａは１０〜２００、好ましくは５０〜１００、の整数であり、ｂは１〜１００、好ましくは１〜２０、の整数であり、ｐは８〜１００、好ましくは１０〜４０、の整数である］
で表わされるグラフト共重合体が特に好ましい。上記一般式（Ｉ）で表わされるグラフト共重合体によれば、実施例の説明で詳述するように、特定のＤＮＡが安定な複合体の形で肝細胞に選択的に送達され、そして同細胞質内に充分に取り込まれる傾向にあるからである。
【００３４】
なお、上記一般式中のａ及びｂが上記範囲外では細胞や組織に対する特異性が低下すること及び細胞内への取り込みが低下する傾向にあり、またｐが上記範囲外ではＤＮＡ等との複合体形成及び薬物としての機能を果たさなくなる傾向にある。
【００３５】
次に、本発明のグラフト共重合体を製造するための方法について説明する。
【００３６】
かかるグラフト共重合体の合成方法としては、
ｉ）幹重合体上の重合開始点から単量体を重合して枝重合体を成長させる方法、ii）枝重合体の片末端に重合性の基が導入されたいわゆるマクロモノマーと、幹重合体を生成するための単量体との共重合による方法
のいずれも採用可能であるが、後者の方法が好ましい。
【００３７】
そして、上記ii）の合成方法において、上記標的リガンドをチオール誘導体、マレイミド誘導体、カルボン酸誘導体又はビニル誘導体とし、他方上記ポリカチオン性誘導体をチオール誘導体、マレイミド誘導体、カルボン酸誘導体又はビニル誘導体とし（マクロモノマー：反応中間物質）、これらを共有結合により共重合せしめる方法が特に好ましい。この方法によれば、本発明のグラフト共重合体を効率良く製造することが可能な傾向にあるからである。
【００３８】
なお、本発明にかかるポリカチオン性アミノ酸誘導体の合成方法は、望ましい重合度等に応じて適宜選択されるが、例えば以下に示す重合方法が挙げられる。すなわち、例えば、ε−カルボオベンゾキシ−リジン−Ｎ−カルボン酸無水物およびベンジル−セリン−Ｎ−カルボン酸無水物を、片末端アミノ基のポリエチレンオキシド（分子量２００〜２５０，０００）等の第１級アミンを開始剤として重合させる方法である。この場合、ポリエチレンオキシド−ポリアミノ酸ブロックコポリマーにおけるポリアミノ酸部分の分子量は、特には限定されないが５００〜５０，０００であることが望ましい。
【００３９】
また、本発明にかかるポリカチオン性アミノ酸に前記生体膜親和性基を導入する方法としては、次に示す有機合成法により実施することも可能である。すなわち、例えば、ｎ−ブチルアミン、ｎ−ヘキシルアミン等のアルキルアミンを開始剤としてＺ−リジンのＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させ、ついでＮ末端をアシル化し、さらにアミノ基を脱保護して疎水的な末端を持つポリリジンマクロモノマーを合成することが可能である。
【００４０】
次に、本発明の薬剤、並びに薬物を細胞に取り込ませる本発明の方法について説明する。
【００４１】
本発明の薬剤は、前述のように、前記本発明のグラフト共重合体と、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び陰イオン性化合物からなる群から選択される薬物とを含むものである。また、本発明の方法は、前記本発明のグラフト共重合体を用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び陰イオン性化合物からなる群から選択される薬物を前記特定細胞に取り込ませる方法である。
【００４２】
本発明のグラフト共重合体によって細胞内に導入可能な核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の大きさ、種類等は特に限定されないが、例えば、線状二本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡが採用可能である。また、本発明のグラフト共重合体によって細胞内に導入可能な陰イオン性化合物としては、プラバスタチン、ジゴキシン、フェニルブタゾン、ワルファリン、クロルチアシド、インシュリン、カルシトニン等が挙げられる。
【００４３】
また、本発明のグラフト共重合体を使用することにより、細胞に有用なタンパク質をコードする構造遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させることが可能になる。例えばアンチセンスを導入して特定の遺伝子の制御を行うことが可能となる。さらに、本発明のグラフト共重合体はリボザイム、トリプレックス、アプタマー等のキャリアーとしても利用可能である。なお、オリゴヌクレオチドとしては、ホスホジエステル体、ホスホロチオエート体、またはその他の誘導体を好ましく使用可能である。
【００４４】
本発明のグラフト共重合体の使用量については特に限定されることなく、使用目的に応じて最適化される。例えば、核酸１μｍｏｌに対して約０．１〜１０００μｍｏｌのグラフト共重合体を使用することが好ましい。
【００４５】
本発明のグラフト共重合体は、さらに、患者から標的細胞を体外に取り出し、目的とする遺伝子を導入した後に再びその細胞を患者の体内に戻すという自家移植による遺伝子治療（ｅｘｖｉｖｏ遺伝子治療）にも、遺伝子を直接患者に投与する遺伝子治療（ｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療）にも好ましく使用できるものである。また、遺伝子治療方法として、異常（原因）遺伝子をそのままにして、新しい（正常）遺伝子を付け加える方法（ＡｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）と、異常遺伝子を正常遺伝子で置き換える方法（ＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）があるが、どちらにも好ましく使用できる。
【００４６】
本発明のグラフト共重合体を用いた薬剤（調製剤）の投与方法は特に限定されず、経口的並びに非経口的に投与することが可能であり、注射、経皮、経粘膜、経鼻又は経口投与が好ましい。この場合、本発明のグラフト共重合体の使用量は、その使用方法、使用目的等により異なるが、例えば、核酸を含むキャリアーとして注射投与して用いる場合には、例えば、１日量約０．１μｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、より好ましくは、１日量約１μｇ／ｋｇ−５０ｍｇ／ｋｇである。
【００４７】
なお、本発明の薬剤の剤形は特に制限されず、用途等に応じて注射剤、貼付剤、経口投与剤等の剤形が適宜採用される。また、本発明の薬剤の剤形等に応じて、薬理学的に許容される範囲の添加剤、例えば賦形剤、安定化剤、溶剤、溶解助剤、分散剤、が前記グラフト共重合体及び前記薬物に適宜加えられる。
【００４８】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
実施例１［一方の末端にメタクリロイル基、他方の末端にアルキルアミン基を有するリジンオリゴマーの合成］
１−１：（アルキルアミン基をＣ末端に有するＺ−保護リジンオリゴマーの合成）
先ず、ｅ−Ｚ（カルボベンゾキシ）−リジンＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ：図１中の化合物（２））を既知の手法により合成し、再結晶法により精製した。次に、５．３ｇ（１７．３ｍｍｏｌ）のＮＣＡを脱水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２０ｍｌ）に溶かし、所定量（ＮＣＡの１／１０、１／２０あるいは１／４０当量）のｎ−ドデシルアミン（図１中の化合物（１））を重合開始剤（Ｉ）として加え、室温で２日間反応させた。その後、大過剰（約１リットル）のエチルエーテルに反応後のＤＭＦ溶液を滴下し、リジンオリゴマーを沈殿物として得た。そして、得られたリジンオリゴマーをＤＭＦ／エチルエーテル系で再結晶させて精製し、減圧下乾燥させて、ドデシルアミン基をＣ末端に有するリジンオリゴマーを得た。
【００５０】
なお、上記の反応過程におけるＮＣＡ／開始剤比（［Ｍ］／［Ｉ］比）を表１に示すように変えることにより、得られるリジンオリゴマーの数平均重合度及び数平均分子量を制御した。
【００５１】
また、ｎ−ドデシルアミンのかわりにｎ−ブチルアミン、ｎ−ヘキシルアミンを使用した以外は上記方法と同様にして、それぞれブチルアミン基あるいはヘキシルアミン基をＣ末端に有するリジンオリゴマー（図１中の化合物（３））を得た。
【００５２】
得られたリジンオリゴマーの数平均重合度及び数平均分子量を表１に示す。
【００５３】
【表１】

【００５４】
１−２：（Ｚ−保護リジンオリゴマーのＮ末端へのメタクリロイル基の導入）
１−１で得られたリジンオリゴマー２００ｍｇを脱水ＤＭＦ５ｍｌに溶解した。この溶液に、メタクリロイルクロライド７５ｍｇおよびトリエチルアミン１４８ｍｇを加え室温で３時間反応させた。その後、反応後のＤＭＦ溶液を大過剰のエチルエーテル（約１００ｍｌ）に加え、沈殿したオリゴマーを回収した。さらに、得られたオリゴマーをＤＭＦ／エチルエーテル系で再結晶させて精製した。
【００５５】
得られたオリゴマーを¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆中）により測定したところ、表２に示すＮＭＲシグナルが検出された。従って、得られたオリゴマーは、Ｃ末端にアルキルアミン基、Ｎ末端にメタクリロイル基が導入されたＺ−保護リジンオリゴマー（図１中の化合物（４））であることが確認された。
【００５６】
【表２】

【００５７】
１−３：（アルキルアミン基をＣ末端に、メタクリロイル基をＮ末端に有するＺ−保護リジンオリゴマーからのＺ−基の脱保護）
１−２で得られたオリゴマー１００ｍｇを、１ｍｌのトリフロロ酢酸と０．２５ｍｌのチオアニソールとの混合物に溶解し、室温で３時間反応させた。その後、反応溶液を大過剰のエチルエーテル（約５０ｍｌ）に加え、沈殿したオリゴマーを回収した。さらに、得られたオリゴマーをＤＭＦ／エチルエーテル系で再結晶させて精製した。
【００５８】
得られたオリゴマーを¹Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ中）により測定したところ、表３に示すＮＭＲシグナルが検出された。従って、得られたオリゴマーは、１−２で得られたＺ−保護リジンオリゴマー（図１中の化合物（４））からＺ基が脱保護されたリジンオリゴマー（図１中の化合物（５））であることが確認された。また、ＮＭＲシグナルからは、脱保護過程における副反応は検出されなかった。
【００５９】
【表３】

【００６０】
実施例２（機能性オリゴマーと肝特異性合成高分子（ＰＶＬＡ）との共重合体の合成）
ガラクトース残基を有するスチレン誘導体であるＮ−Ｐ−ビニルベンジル−Ｄ−ラクトンアミド（ＶＬＡ：図１中の化合物（６））のポリマー（ＰＶＬＡ）を標的リガンドとして用いた。そして、ＰＶＬＡと実施例１で得られたリジンオリゴマー（図１中の化合物（５））との共重合体｛ＰＶＬＡ−リジンオリゴマー誘導体（ＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体）｝を、実施例１で得られたメタクリロイル基を末端に有するリジンオリゴマーのラジカル重合性を利用し、合成標的リガンドＰＶＬＡのモノマーであるＶＬＡとの共重合反応により以下のようにして合成した。
【００６１】
先ず、重合管中にＶＬＡ１ｇと実施例１で得られたリジンオリゴマー０．１〜０．３ｇとをジメチルスルフォキシド５ｍｌに溶解した。これにＮ、Ｎ’−アゾビス（イソブチロニトリル）を最終濃度２０ｍＭになるように加え、脱気後封管し、６０℃で２日間反応させた。その後、重合管を開管し、反応溶液を透析チューブに移して２週間水に対して透析し、内容物を凍結乾燥して重合体を得た。
得られた重合体を¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆中）により測定したところ、表４に示すＮＭＲシグナルが検出された。このようにリジンオリゴマーおよびＰＶＬＡ双方に由来するシグナルが観察され、ＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体（図１中の化合物（７））が合成されていることが確認された。
【００６２】
また、¹Ｈ−ＮＭＲにより各ＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体中のリジン含量を測定した結果を表５に示す。
【００６３】
【表４】

【００６４】
【表５】

実施例３（ＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体のプラスミドＤＮＡとの結合性評価試験）
実施例２で得られたＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体｛Ｂ１０２（ブチル末端、ＰＬＬ１０量体、ポリリジン含量１４ｗｔ％）、Ｂ２０２（ブチル末端、ＰＬＬ２０量体、ポリリジン含量１４ｗｔ％）、Ｈ１０２（ヘキシル末端、ＰＬＬ１０量体、ポリリジン含量１４ｗｔ％）｝とプラスミドＤＮＡとの複合体形成能を、以下のようにしてゲル電気泳動により観察した。
【００６５】
すなわち、６．８ｋｂｐのプラスミドＤＮＡ（ｐＳＶ：ｐＳＶβ−ガラクトシダーゼコントロールプラスミド、プロメガ社製）とＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体とをさまざまな比（図２に示すチャージ比）で混合した後、アガロースゲル電気泳動で解析した。得られた電気泳動図（ゲルのバンドのトレース図）を図２（ａ）〜図２（ｃ）に示す。
【００６６】
複合体のバンドは、コントロール（プラスミドＤＮＡのみ）のバンドよりも泳動距離が短いことより、複合体が形成されていることが確認された。また、図２（ａ）〜図２（ｃ）から明らかなように、いずれのＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体においてもチャージ比１以上で複合体のバンドが現れていることから、チャージ比１以上でプラスミドＤＮＡと完全に複合体を形成していることが確認された。
【００６７】
実施例４（ＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）との結合性評価試験）
実施例２で得られたＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体｛Ｂ１０２（ブチル末端、ＰＬＬ１０量体、ポリリジン含量１４ｗｔ％）、Ｂ２０２（ブチル末端、ＰＬＬ２０量体、ポリリジン含量１４ｗｔ％）、Ｈ１０２（ヘキシル末端、ＰＬＬ１０量体、ポリリジン含量１４ｗｔ％）｝とオリゴヌクレオチドとの複合体形成能を、以下のようにしてゲル電気泳動により観察した。
【００６８】
すなわち、オリゴヌクレオチド（４０ｍｅｒ）とＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体とをさまざまな比（図３に示すチャージ比）で混合した後、ポリアクリルアミド電気泳動でフリーのオリゴヌクレオチド量を解析した。得られた電気泳動図（ゲルのバンドのトレース図）を図３（ａ）〜図３（ｃ）に示す。
【００６９】
図３（ａ）〜図３（ｃ）から明らかなように、Ｂ１０２においてはチャージ比２０のレーンでフリーのオリゴヌクレオチド（複合体を形成していないもの）が全く観察されなくなり、Ｂ２０２においてはチャージ比１０のレーンでフリーのオリゴヌクレオチドが全く観察されなくなり、Ｈ１０２においてはチャージ比５のレーンでフリーのオリゴヌクレオチドが全く観察されなくなった。従って、いずれのＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体においてもオリゴヌクレオチドと完全に複合体を形成しており、しかもヘキシル基を有するグラフト共重合体はブチル基を有するものより更に結合性が高いことが確認された。
【００７０】
実施例５（ＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体とオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）との複合体の安定性評価試験）
オリゴヌクレオチドおよびＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体／オリゴヌクレオチド複合体をそれぞれ血清（ＦＣＳ（牛胎児血清）５０％）で処理した。オートラジオグラフィのパターンから血清中の安定性を確認したところ、オリゴヌクレオチド単独では３０分でほとんど分解されるのに対し、上記複合体ではかなり安定であることが確認された。
【００７１】
また、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）後のゲルを切り出し、液体シンチレーションで上記複合体から解離されたオリゴヌクレオチドを直接測定し、これを定量した。
【００７２】
なお、上記複合体から解離されたオリゴヌクレオチドを定量する際、複合体に関与していないフリーのオリゴヌクレオチドをバックグラウンドとして除く必要があるため、ＰＡＡ（ポリアクリル酸）を添加した場合のフリーのオリゴヌクレオチドの定量値からＰＡＡを添加しない場合の値を差し引いた値をインタクトのオリゴヌクレオチド量とした。
【００７３】
そして、血清（ＦＣＳ５０％）処理時間０の時において上記複合体に結合しているオリゴヌクレオチド量を１００％として、血清処理時間経過に伴うその量の減少を観察し、得られた結果を図４に示す。
【００７４】
図４から明らかなように、複合体形成時間（複合体を形成させるための反応時間）が３時間の場合、Ｂ１０−２０（ブチル末端、ＰＬＬ１０量体、ポリリジン含量２０ｗｔ％）を用いた複合体の安定性がやや低かったものの、Ｈ１０−２０（ヘキシル末端、ＰＬＬ１０量体、ポリリジン含量２０ｗｔ％）を用いた複合体及びＢ２０−２０（ブチル末端、ＰＬＬ２０量体、ポリリジン含量２０ｗｔ％）を用いた複合体にあっては少なくとも５時間程度まではオリゴヌクレオチドが多量に分解されてしまうことはないことが確認された。
【００７５】
また、複合体形成時間を２４時間にしてＢ２０−２０／オリゴヌクレオチド複合体を得てみたところ、得られた複合体は、形成時間が３時間の場合の複合体と殆ど同様の安定性であった。
【００７６】
実施例６（ＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体とオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）との複合体の、肝ガン由来細胞に対する相互作用評価試験）
テキサスレッドで蛍光標識を付したオリゴヌクレオチドとＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体とを混合した後、アシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＰＲ）を持つ肝ガン由来細胞（ＨｅｐＧ２）培養系に加え、３７℃で２時間培養させた。その後、上記の細胞培養系を洗浄、固定した後、共焦点レーザー走査顕微鏡によりテキサスレッドの発色による蛍光像を観察した。得られた蛍光像及び透過光像の写真を図５（ａ）〜（ｆ）に示す。
【００７７】
なお、図５（ａ）及び図５（ｂ）はそれぞれオリゴヌクレオチドのみを用いた場合の蛍光像及び透過光像であり、図５（ｃ）及び図５（ｄ）はそれぞれＨ１０−１４（ヘキシル末端、ＰＬＬ１０量体、ポリリジン含量１４ｗｔ％）とオリゴヌクレオチドとの複合体を用いた場合の蛍光像及び透過光像であり、図５（ｅ）及び図５（ｆ）はそれぞれＨ４０−１４（ヘキシル末端、ＰＬＬ４０量体、ポリリジン含量１４ｗｔ％）とオリゴヌクレオチドとの複合体を用いた場合の蛍光像及び透過光像である。
【００７８】
図５（ａ）〜（ｆ）から明らかなように、ＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体の存在によりオリゴヌクレオチドは細胞内に取り込まれ、その取り込み量は１０倍量のフリーオリゴヌクレオチドを細胞と相互作用させたときと同様、あるいはそれより多かった。すなわち、ＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体が、ＨｅｐＧ２細胞へのオリゴヌクレオチドの取り込みを促進することが確認された。
【００７９】
また、Ｈ２０−１４（ヘキシル末端、ＰＬＬ２０量体、ポリリジン含量１４ｗｔ％）とオリゴヌクレオチドとの複合体（共重合体／ＤＮＡ＝１／１）を用いた場合の平面蛍光像、断面蛍光像及び平面透過光像の写真をそれぞれ図６（ａ）〜（ｃ）に示す。
【００８０】
細胞の蛍光断面像を観察したところ（図６（ｂ））、細胞内に明るい赤色の発色が見られ、オリゴヌクレオチドが細胞内部まで導入されていることが確認された。
【００８１】
実施例７（ＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体とオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）との複合体の、細胞選択性評価試験）
実施例６と同様に、テキサスレッドで蛍光標識を付したオリゴヌクレオチドとＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体とを混合した後、ＡＳＧＰＲを持つＨｅｐＧ２細胞培養系及びＡＳＧＰＲを持たないＰＡＮＣ細胞培養系にそれぞれ加え、３７℃で２時間培養させた。その後、上記の細胞培養系を洗浄、固定した後、共焦点レーザー走査顕微鏡によりテキサスレッドの発色による蛍光像を観察した。得られた蛍光像及び透過光像の写真を図７（ａ）〜（ｄ）に示す。
【００８２】
なお、図７（ａ）及び図７（ｂ）はそれぞれＨｅｐＧ２細胞培養系に添加した場合の蛍光像及び透過光像であり、図７（ｃ）及び図７（ｄ）はそれぞれＰＡＮＣ細胞培養系に添加した場合の蛍光像及び透過光像である。また、共重合体としてはＨ４０−１２（ヘキシル末端、ＰＬＬ４０量体、ポリリジン含量１２ｗｔ％）を用い、ＤＮＡ／共重合体の比率は２／１である。
【００８３】
図７（ａ）〜（ｄ）から明らかなように、ＰＡＮＣ細胞に比べてＨｅｐＧ２細胞においてより強い赤色の発色が観察されており、従ってＰＶＬＡ／ＰＬＬグラフト共重合体によってオリゴヌクレオチドが細胞特異選択的にＨｅｐＧ２細胞に送達されていることが確認された。
【００８４】
【発明の効果】
以上、詳しく説明した通り、本発明のグラフト共重合体によれば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び陰イオン性化合物からなる群から選択される薬物と安定な複合体が形成され、該薬物を特定の細胞または組織へ送達しかつ細胞質内への移行性を向上させることが可能となる。
【００８５】
従って、このようなグラフト共重合体を含有する本発明の薬剤並びにかかるグラフト共重合体を用いる本発明の方法によれば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は陰イオン性化合物といった薬物を安定な複合体の形で特定の細胞または組織へ送達し、そして細胞質内へ充分に取り込ませることが可能となる。
【００８６】
それゆえ、上記本発明のグラフト共重合体は、その性質に基づき、各種遺伝子疾患、あるいはエイズ等のウイルス病に対する遺伝子治療薬の生体内運搬体として有用となる。また、本発明のグラフト共重合体は、ウイルスをはじめとして、遺伝子工学技術による種々の有用動植物の創出にも大きく寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のグラフト共重合体の合成経路の一例を示す化学反応式図である。
【図２】（ａ）〜（ｃ）はぞれぞれ、本発明のグラフト共重合体とプラスミドＤＮＡとの結合性を解析した結果を示すアガロースゲル電気泳動図である。
【図３】（ａ）〜（ｃ）はぞれぞれ、本発明のグラフト共重合体とオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）との結合性を解析した結果を示すポリアクリルアミド電気泳動図である。
【図４】本発明のグラフト共重合体とオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）との複合体の血清処理時安定性を示すグラフである。
【図５】（ａ）及び（ｂ）はそれぞれオリゴヌクレオチドのみを肝ガン由来細胞（ＨｅｐＧ２）に取り込ませた状態を示す蛍光写真及び透過光写真であり、（ｃ）〜（ｆ）はそれぞれ本発明のグラフト共重合体を用いてオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞に取り込ませた状態を示す蛍光写真及び透過光写真である。
【図６】（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ本発明のグラフト共重合体を用いてオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞に取り込ませた状態を示す平面蛍光写真、断面蛍光写真及び平面透過光写真である。
【図７】（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ本発明のグラフト共重合体を用いてオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞に取り込ませた状態を示す蛍光写真及び透過光写真であり、（ｃ）及び（ｄ）はそれぞれ本発明のグラフト共重合体を用いてオリゴヌクレオチドをＰＡＮＣ細胞に取り込ませた状態を示す蛍光写真及び透過光写真である。

Claims

下記一般式（Ｉ）：

［式中、Ｒは炭素数が４〜１８のアルキル基であり、Ｘ_１及びＸ_２はそれぞれ水素原子であり、ａは１０〜２００の整数であり、ｂは１〜１００の整数であり、ｐは８〜１００の整数である］
で表されることを特徴とする、グラフト共重合体。
ａが５０〜１００の整数であり、ｂが１〜２０の整数であり、ｐが１０〜４０の整数である、請求項１に記載のグラフト共重合体。
請求項１又は２に記載のグラフト共重合体と、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び陰イオン性化合物からなる群から選択される薬物とを含むことを特徴とする薬剤。