JPH1028583A - 核酸運搬体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、細胞に核酸を導入するための新規
核酸運搬体、並びに当該核酸運搬体および核酸を含む、
核酸の細胞内への導入を促進するための調節剤を提供す
ることを目的とする。 【解決手段】本発明の核酸運搬体は、１つまたは複数の
塩基性アミノ酸残基、及び分子内に水酸基を有する１つ
または複数のアミノ酸残基を含むぺブチドからなる核酸
結合性領域、ならびに標的指向性付与領域を有すること
を特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞に核酸を導入する
ための新規核酸運搬体に関する。より詳しくは、本発明
は核酸を細胞内に効率良く安全に導入するための核酸結
合性領域を有する核酸運搬体に関するものである。

【０００２】本発明はまた、当該核酸運搬体および核酸
を含む、核酸の細胞内への導入を促進するための調節剤
に関する。

【０００３】

【従来の技術】遺伝子治療とは、薬剤として作用する外
来遺伝子（以下、「薬物遺伝子」という）を体内に導入
し発現させることで疾患の治療を行おうとする全く新し
い治療方法である。遺伝子治療によって治療効果が期待
できる疾患は先天性、後天性を問わず遺伝子の異常が原
因で発症する疾患すべてが含まれるが、特に、致死的で
あり、かつ治療法が確立されていない癌やＡＩＤＳに対
しては非常に有用性の高い治療方法であると考えられて
いる。

【０００４】遺伝子治療は、異常（原因）遺伝子をその
ままにして、新しい（正常）遺伝子を付け加える付加遺
伝子療法（Ａｕｇｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ）と、異常遺伝子を正常遺伝子で置き換え
る置換遺伝子療法（Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ）に大別される。

【０００５】遺伝子治療の臨床応用としては、１９８９
年米国において初めて遺伝子治療の臨床試験が行われて
以来、すでにイタリア、オランダ、フランス、イギリ
ス、中国においても臨床試験が開始されている。しかし
ながら、遺伝子治療の臨床応用において、薬物遺伝子を
効率良く安全に標的細胞へ導入するための最適な遺伝子
の形態や方法の開発が大きな技術的課題の１つとなって
いる。

【０００６】１９８０年代初期には、マイクロインジェ
クション等物理的手法の応用が試みられたが、疾患治療
のために必要な薬物遺伝子を安定かつ効率良く導入する
ことができず、臨床応用には至らなかった。その後、外
来遺伝子を効率良く細胞に導入するための担体となる組
み換えウイルス（ウイルスベクター）が開発され、初め
て遺伝子治療の臨床応用が可能となった（Miller,A.D.,
Hum. Gene Ther., 1:5-14、1990）。

【０００７】現在最も注目されているウイルスベクター
は、マウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎ
ｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ：以下、ＭｏＭＬ
Ｖ）由来のレトロウイルスベクタ一であり、本ウイルス
の生活環の利点を利用したものである。レトロウイルス
は宿主に感染後、白己の遺伝情報をゲノムＤＮＡに組み
込ませるという性質を持つ（Miller D.G.,et al.,Mol.C
ell.Biol.,10,8,4239,1990）ことから、薬物遺伝子を持
続的に発現させるためには都合が良い。また、種々の細
胞種に感染可能であることから、これら多くの種類の細
胞がＭｏＭＬＶべクターを用いた治療の対象となりう
る。一方、この性質はウイルスベクターの生体への投与
を不可能にしている。宿主範囲が広いということは、言
い換えれば生体に投与した際に標的細胞への集積性が乏
しいということであり、治療効果や副作用の点から静脈
内投与法などの全身性の投与法は行なうことができな
い。従って、現在の治療法は標的細胞を生体から一度分
離し、試験管内で遺伝子導入を行なった後、再び生体に
戻す治療法（米国特許第５,３９９,３４６号）が行われ
ている（ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入法）。この方法は標
的細胞に対して確実に薬物遺伝子を導入でき、治療効果
も期待できるが、ウイルスベクターを取り扱うための特
殊な設備や、細胞を大量に培養する設備を必要とするこ
とからこのような治療を実施できる施設は限定されてし
まう。以上のような理由から、ｉｎ ｖｉｖｏでも遺伝
子導入が可能なウイルスベクターの開発が望まれてい
る。

【０００８】また、ウイルスベクターを生産するために
種々のウイルスベクター産生細胞が開発されている（Mi
ller A.D.and Buttlmore C., Mol.Cell.Biol., 6, 289
5, 1986）が、治療に必要な量のウイルスベクターを生
産するためには大量の細胞を培養する必要があり、一般
的な薬物の生産コストに比べて非常に高価になってしま
うという欠点もある。

【０００９】このようなウイルベクターにかわる遺伝子
導入のための担体として、核醗が負電荷を有しているこ
とを利用し、これを正電荷を有する合成ポリアミノ酸へ
結合させ、生成された複合体（以下、ボリアミノ酸／遺
伝子複合体）を目的の細胞もしくは細胞内へ送達しよう
とする試みがなされている。Ｗｕらは、ポリリジンを遺
伝子の担体としてポリアミノ酸／遺伝子複合体を調製
し、これを細胞に作用させることで遺伝子を導入して発
現させることに成功している（G.Y.Wu and C.H.Wu, Adv
anced Drug Delivery Revlews,12,159,1993）。

【００１０】しかしながら、この複合体は濃度が増加と
共に沈殿を生じることが知られている。このような性質
は、実際に疾患の治療を行なう際に大きな問題となる。
特に、静脈内へポリアミノ酸／遺伝子複合体を投与する
ことは血管の塞栓や血栓等を引き起こす原因となりうる
ため不可能である。また、局所的に投与される場合で
も、注射針の詰まりの問題や、標的細胞に対して治療を
するために必要な量の遺伝子を導入できない等の問題が
あり、実際に治療で用いるためにはこれらの問題を解決
しなければならない。

【００１１】一方、生体に投与された薬物遺伝子は、標
的細胞に特異的に作用し、その他の細胞には影響を及ぼ
さないことが必須である。これは特に副作用の点から極
めて重要な問題である。従来の薬物療法においても、薬
物等の体内挙動を厳密に制御し、標的器官の細胞に望ま
しいパターンで薬効を発現させることで薬物投与の最適
化を計ろうとする薬物送達システム（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ：ＤＤＳ）が盛んに検討され
ている。

【００１２】標的部位の細胞にのみ薬物等を集積させる
ための手段としては、従来より標的細胞の表面に存在す
る各種受容体によるエンドサイトーシス（Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒＭｅｄｉａｔｅｄ Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｌｓ：ＲＭ
Ｅ〉機構が多く用いられている。ＲＭＥは低濃度の高分
子ぺブチドやタンパク質等のリガンドを濃縮的に細胞内
に取り込むことが可能であり、肝臓、腎臓、小腸、肺、
筋肉、脂肪、胎盤などの組織細胞または上皮細胞の他、
各種分泌細胞、種々の組織の毛細血管内皮細胞、更には
赤血球、白血球、肥満細胞、貪食細胞、繊維芽細胞など
といった非常に多くの細胞に存在することが知られてい
る。

【００１３】取り込むリガンドは細胞によって異なる
が、栄養物質輸送タンパク質、ペプチド ホルモン、成
長因子、免疫グロブリン、血漿中タンパク質、リソソー
ム酵素、細胞毒素など多数の高分子ペブチドやタンパク
質がＲＭＥ機構によって取り込まれることが報告されて
いる。なかでも、糖鎖末端にガラクトース残基（Ｇａ
ｌ）やＮ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡ
ｃ）を持つ物質を取り込む機構は肝実質細胞に特異的で
あり、高分子キャリアーとしてのアシアロ糖タンパク質
の利用のみならず、既に知られている生理活性ペプチド
に適切な糖鎖を結合したり、逆に糖鎖を切り離したりす
ることによって（ただし生理活性が低下しない場合）、
肝指向性を持たせたり持たせなかったりすることができ
る、このような糖鎖によるターゲティングは現在活発に
研究されている（M.Monslgny,et al., Advanced Drug D
elivery Revlews,14,1,1994）。

【００１４】また、ＲＭＥ機構の中には、細胞が必要と
する栄養素を血漿中タンパク質と結合したまま受容体介
在的に取り込む場合がある。このようなタンパク質は特
に輸送タンパク質またはキャリアータンパク質と呼ば
れ、その受容体は輸送受容体（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ）と呼ばれることがある。輸送タンパク
質は細胞内で分解される場合と、分解されずに再利用さ
れる場合とがある。これに対し、内在化された受容体は
多くの場合速やかに細胞膜表面にリサイクルして再利用
されるため、標的組織が比較的高濃度のリガンドにさら
されても表面受容体数が負に制御されにくく、リガンド
の取り込みが持続的で、ＤＤＳへの応用に好適である。
低密度リポタンバク質（ＬＤＬ）、ビタミンＢ１２の輸
送タンパク質であるトランスコバラミン１１、鉄の輸送
タンパク質であるトランスフェリン、ブロテアーゼの輸
送タンパク質であるα２−マクログロブリンも受容体と
ともに内在化され、細胞内で結合リガンドを遊離するこ
とによって必須栄養物質の細胞内取り込みを担っている
ことが知られている。このような生体機能をＤＤＳに利
用することができれば、特異性および効率性が高まるの
みならず、異物として認識されないために細網内皮系の
細胞群に捕捉されることがないなどの、生体適合性の面
からも極めて優れたシステムを構築することが可能とな
る。このシステムを用いれば、単に標的細胞に結合して
ゆっくりと薬物を放出するのではなく、ＲＭＥを利用し
て細胞内に薬物キャリアー複合体を速やかに取り込んだ
後にリソソーム内におけるキャリアータンバク質の分解
によって薬物を遊離し効果を現わすため、受容体を持つ
細胞に対して徴量で治療効果を期待でき、同時に副作用
を抑えることも可能となる。

【００１５】以上述べたようなＤＤＳの手法を遺伝子治
療の分野に応用しようとする試みもなされるようになっ
てきた。Ｗｕらは、肝実質細胞に存在するアシアロ糖蛋
白レセブターに着目し、アシアロオロソムコイドを結合
させたポリ−Ｌ−リジンとプラスミドＤＮＡの複合体を
調製し、これを肝実質細胞に作用させることでプラスミ
ドＤＮＡ由来の遺伝子を発現させることに成功している
（G.Y.Wu and C.H.Wu,Advanced Drug Delivery Revlew
s,12,159,1993）。

【００１６】しかしながら、前述したようにポリ−Ｌ−
リジンとＤＮＡの複合体は沈殿物を生じやすく、沈殿を
生じないように複合体を形成させるための諸条件には制
限がある。一方、沈殿を生じないように複合体を形成さ
せると、複合体における運搬体と核酸との比は遺伝子導
入効率に人きく影響するため（G.Y.Wu and C.H.Wu,Bioc
hem.,2 7,887,1988）、この比率が必ずしも遺伝子治療
をするための最適な比率にならない、という矛盾した問
題があった。

【００１７】よって、遺伝子治療において薬物遺伝子を
標的細胞に導入するための特異的、且つ効率が高い運搬
体が必要とされていた。

【００１８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、細胞に核酸
を導入するための新規核酸運搬体を提供することを目的
とする。本発明の核酸運搬体は、核酸を細胞内に効率良
く安全に導入するための核酸結合性領域を有することを
特徴とする。

【００１９】本発明はまた、当該核酸運搬体および核酸
を含む、核酸の細胞内への導入を促進するための調節剤
を提供することを目的とする。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題解
決のため鋭意研究に努めた結果、遺伝子を運搬するため
の核酸運搬体中の核酸結合領域として、１つまたは複数
の塩基性アミノ酸残基、及び分子内に水酸基を有する１
つまたは複数のアミノ酸残基を含むぺブチドを用いれ
ば、核酸を細胞内に効率良く安全に導入できることを見
いだし、本願発明を完成した。即ち、本発明の核酸運搬
体は核酸結合領域として上記構成を採用することにより
核酸と可溶性の複合体を形成するため、ポリ−Ｌ−リジ
ンを用いた場合のように沈殿を生じるという問題を生じ
ることなく、核酸を効率よく細胞内に導入することを初
めて可能にしたものである。

【００２１】さらに、本発明の核酸運搬体は、核酸を標
的細胞または細胞内の標的部位に特異的に運ぶための標
的指向性付与領域を有する。核酸と複合体を形成した本
発明の核酸運搬体は、この標的指向性領域の存在によ
り、生体に投与後分解されることなく核酸を標的細胞ま
たは標的部位に特異的に送達する。

【００２２】以下、この発明の構成および好ましい態様
について詳説する。

【００２３】核酸運搬体 本発明の核酸運搬体は、核酸結合領域、標的指向性付与
領域およびポリエチレングリコール領域を含む。

【００２４】「核酸結合領域」とは核酸と親和性を有す
る領域である。この領域の存在により核酸運搬体は所望
の核酸と複合体を形成することが可能となる。本発明の
核酸結合領域は、１つまたは複数の塩基性アミノ酸残
基、及び分子内に水酸基を有する１つまたは複数のアミ
ノ酸残基を含むぺブチドであることを特徴とする。限定
するわけではないが、前記塩基性アミノ酸は、Ｌ−リジ
ン、Ｄ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｄ−アルギニン、Ｌ
−オルニチン、Ｄ−オルニチン、Ｌ−ヒスチジンおよび
Ｄ−ヒスチジンからなるグループから選択され、一つの
分子内に水酸基を有するアミノ酸はＬ−セリン、Ｄ−セ
リン、Ｌ一トレオニン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−チロシン
およびＤ−チロシンからなるグループから選択されるの
が好ましい。塩基性アミノ酸残基と水酸基を有するアミ
ノ酸残基の組成比はモル比で５０：１から１：５０、好
ましくは２０：１から１：２０であり、より好ましくは
１０：１から１：１０である。

【００２５】好ましい核酸結合領域は、限定するけでは
ないが、例えば、ポリ−Ｌ−リジン−Ｌ−セリン コポ
リマー、ポリ−Ｄーリジン−Ｌ−セリン コポリマー、
ポリ−Ｌ−リジン−Ｄ−セリン コポリマー、ポリ−Ｄ
−リジン−Ｄ−セリン コポリマー、ポリ−Ｌ−オルニ
チン−Ｌ−セリン コポリマー、ボリ−Ｄ−オルニチン
−Ｌ−セリン コポリマー、ポリ−Ｌ−オルニチン−Ｄ
−セリン コポリマー、ポリ−Ｄ−オルニチン−Ｄ−セ
リン コポリマー、ポリ−Ｌ−ヒスチジン−Ｌ−セリン
コポリマー、ポリ−Ｄ−ヒスチジン−Ｌ−セリン コ
ポリマー、ポリ−Ｌ−ヒスチジン−Ｄ−セリン コポリ
マー、ポリ−Ｄ−ヒスチジン−Ｄ−セリン コポリマ
ー、ポリ−Ｌ−リジン−Ｌ−セリン ＰＥＧブロックコ
ボリマー、ポリ−Ｄ−リジン−Ｌ−セリン ＰＥＧブロ
ックコポリマー、ポリ−Ｌ−リジン−Ｄ−セリン ＰＥ
Ｇブロックコボリマー、ポリ−Ｄ−リジン−Ｄ−セリン
ＰＥＧブロックコボリマー、ポリ−Ｌ−オルニチン−
Ｌ−セリン ＰＥＧブロックコボリマー、ポリ−Ｄ−オ
ルニチン−Ｌ−セリン ＰＥＧブロックコポリマー、ポ
リ−Ｌ−オルニチン−Ｄ−セリン ＰＥＧブロックコボ
リマー、ポリ−Ｄ−オルニチン−Ｄ−セリン ＰＥＧブ
ロックコボリマー、ポリ−Ｌ−ヒスチジン−Ｌ−セリン
ＰＥＧブロックコポリマー、ポリ−Ｄ−ヒスチジン−
Ｌ−セリン ＰＥＧブロックコポリマー、ポリ−Ｌ−ヒ
スチジン−Ｄ−セリン ＰＥＧブロックコポリマー、ポ
リ−Ｄ−ヒスチジン−Ｄ−セリン ＰＥＧブロックコポ
リマー等である。特に好ましい核酸結合領域は、ポリ−
Ｌ−リジン−Ｌ−セリン コポリマーである。

【００２６】これらの核酸結合領域の分子量は、約２０
０から約５００,０００であり、好ましくは１０００以
上５００,０００以下であり、より好ましくは２,０００
以上１００,０００以下である。

【００２７】「標的指向性付与領域」は、遺伝子治療の
対象となる標的細胞の表面若しくは標的細胞内部位に存
在する各種受容体に対するリガンド、細胞が必要とする
栄養素を取り込むための輸送タンパク質に対するリガン
ド等、特に制限なく用いることができる。当業者は、核
酸を標的となる細胞等に特異的に運搬するのに必要なそ
のような領域を容易に選択することができるであろう。
例えば、ペブチドホルモン、成長因子、免疫グロブリ
ン、リソゾーム酵素、細胞毒素を用いることが可能であ
る。または、末端にガラクトース残基（Ｇａｌ）、Ｎ−
アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮａｃ）を用いる
ことにより、肝指向性を持たせることもせることもでき
る。あるいは、細胞膜との融合性を高めるために、例え
ば、インフルエンザ由来の膜融合性タンパク質やアデノ
ウイルス由来膜融合性タンパク質を遺伝子担体に付加す
ることも可能である。

【００２８】ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子
量は２００から２５０,０００以上まで用いることが可
能であるが、１,０００以上１００,０００以下であるこ
とが好ましく、１,０００以上５０,０００以下であるこ
とがより好ましい。

【００２９】調節剤 本発明はさらに、前記核酸運搬体および核酸を含む調節
剤を提供する。本発明の核酸運搬体は核酸と複合体を形
成し、所望の核酸を標的細胞または細胞部位に送達す
る。

【００３０】本発明の運搬体によって細胞内に導入でき
る核酸の大きさ、種類等は特に限定されない。核酸の種
類としては、例えば、線状二本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖Ｄ
ＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ等がある。例えば、
本発明の運搬体の利用により、細胞に有用なタンパク質
をコードする構造遺伝子を導入して、該遺伝子を発現さ
せることができる。構造遺伝子が導入された場合、後述
の実施例５に示すように非常に高い遺伝子発現を示す。
また、アンチセンスを導入して特定の遺伝子の発現の制
御を行うことができる。このほか、リボザイム、トリプ
レックス、アプタマー等の運搬体としても利用できる。
さらに、核酸には、ホスフェート結合をホスフォチオエ
ート結合に置換した、ホスフォチオエートヌクレオチド
等の誘導体も含む。

【００３１】また、限定されるわけではないが、核酸１
μｇに対して約０.１−１０００μｇ、好ましくは１−
２００μｇの運搬体を使用する。

【００３２】一例として、構造遺伝子及び当該遺伝子を
細胞内で発現させるための発現カセットを含む遺伝子発
現ベクターを、本発明の核酸運搬体を用いて細胞に導入
することができる。

【００３３】遺伝子は例えば、疾患に対応する薬剤遺伝
子、即ち、疾患に対して拮抗的に作用する遺伝子が用い
られる。薬剤遺伝子には、例えば、酵素欠損症に対して
は止常な酵素をコードする遺伝子、ウイルス感染症に対
してはウイルス感染細胞を殺傷するためのチミジンキナ
ーゼ、ジフテリアトキシン等の毒素をコードする遺伝子
やウイルスの複製等を阻害するアンチセンス、トリブル
ヘリックス、リボザイム、デコイ、トランスドミナント
ミュータント等をコードする遺伝子、癌に対しては癌細
胞を殺傷するためのチミジンキナーゼ、ジフテリアトキ
シン等の毒素をコードする遺伝子や癌遺伝子を不活性化
するためのアンチセンス、リボザイム、トリブルヘリッ
クス等をコードする遺伝子や、癌細胞を正常化するため
のｐ５３等の癌抑制遺伝子、抗癌剤に対する多剤耐性に
関与する遺伝子を不活性化するためのアンチセンス、ト
リブルヘリックス、リボザイム等をコードする遺伝子、
家族性高コレステロール血症に対してはＬＤＬレセブタ
ーをコードする遺伝子が含まれる。

【００３４】発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発
現させることができるものであれば、特に制限されるこ
となく何でも用いることができる。当業者はそのような
発現カセットを容易に選択することができる。好ましく
は、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセッ
トであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝
子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、
ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットで
ある。発現カセットに用いられる遣伝子プロモーター
は、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒ
ト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉
腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイ
ルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、Ａ型肝炎
ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、バピ
ローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフル
エンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、バ
ルボウイルスＢＩ９、ポリオウイルス等のウイルス由来
のプロモーター、アルブミンや熱ショック蛋白等の哺乳
類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ
型プロモーター等を含む。

【００３５】本発明の調節剤は、まず患者から標的細胞
を体外に取り出し、目的とする遺伝子を導入した後に再
びその細胞を患者の体内に戻すという自家移植による遺
伝子治療（ex vivo 遺伝子治療）にも、遺伝子を直接患
者に投与する遺伝子治療（invivo 遺伝子治療）にも使
用できる。また、遺伝子治療は、異常（原因）遺伝子を
そのままにして、新しい（正常）遺伝子を付け加える方
法（Augmentation Gene Therapy）と、異常遺伝子を正
常遺伝子で置き換える方法（Replacement GeneTherap
y）に大別できるが、どちらにも使用できる。

【００３６】本発明の調製剤の投与は、限定するわけで
はないが、一般に非経口的に行われ、例えば注射投与す
ることにより好ましく実施できる。本発明の調節剤の使
用量は、その使用方法、使用目的等により異なるが、例
えば、注射投与して用いる場合には、１日量約０.１μ
ｇ／ｋｇ−１０００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好まし
く、より好ましくは、１日量約１μｇ／ｋｇ−１００ｍ
ｇ／ｋｇである。

【００３７】さらに、本発明を利用することにより、温
度刺激により各種マーカー遺伝子および治療用遺伝子が
発現されるように設計されたベクターを導入した後、例
えば温熱療法等の温度刺激を与えることにより、遺伝子
刺激における部位特異的遺伝子発現が可能となる。

【００３８】以下、実施例を挙げて本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらの例によって制限される
ものではない。

【００３９】

【実施例】実施例１：ガラクトース修飾ポリーＬーリジン−Ｌーセ
リン ＰＥＧブロックコポリマー（Ｇａｌ−ＰＬＳＰ）
の調製 ε−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジン−Ｎ−カルボン酸無
水物１.０ｇ（シグマ社）及びペンジル−Ｌ−セリン−
Ｎ−カルボン酸無水物１.０ｇ（シグマ社〉を、ＤＭＦ
（和光純薬）３０ｍｌに溶解し、クロロホルム（和光純
薬）１５ｍｌを添加した。片末端メトキシ片末端アミノ
基のポリエチレンオキシド日本油脂）４.０ｇをクロロ
ホルム１５ｍｌに溶解した液を添加した。

【００４０】２６時間後、反応混合液を３３０ｍｌのジ
エチルエーテル（和光純薬）に滴下することで生成した
ポリマーを沈殿させ、ろ過により回収した。さらにジエ
チルエーテルで洗浄後、減圧乾燥し、臭化水素酢酸液
（和光純薬）で脱保護を行ないポリ−Ｌ−リジン−Ｌ−
セリン ＰＥＧブロックコポリマー（ＰＬＳＰ）４．６
ｇを得た。ＰＬＳＰのガラクトース修飾はＭｏｎｓｌｇ
ｎｙらの方法（MonsignyM. et. al., Biol. Cell, 51,1
87,1984）に従った。

【００４１】実施例２：ブラスミドｐＣＡＧＧＳＬｕｃ
の構築 図１に示したように、ＣＭＶ−ＩＥエンハンサー、ニワ
トリ３−アクチンブロモーター配列の下流にルシフェフ
ーゼをコードする遺伝子配列を挿入したプラスミドを遺
伝子組み換え法（J.Sambrook,et al., Molecular C1oni
ng）により構築した。

【００４２】実施例３：Ｇａｌ −ＰＬＳＰ／ｐＣＡＧ
ＧＳＬｕｃ複合体及びポリ−Ｌ−リジン／ｐＣＡＧＧＳ
Ｌｕｃ複合体の調製 実施例１で得られたＧａｌ−ＰＬＳＰあるいはポリ−Ｌ
−リジン（Ｓｉｇｍａ社）、及び実施例２の操作により
得られたブラスミドｐＣＡＧＧＳＬｕｃを各々０.１５
ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ
７.３（以下、ＨＢＳ）に溶解した。ブラスミドｐＣＡ
ＧＧＳＬｕｃは３μｇを１７５μｌのＨＢＳに溶解し
た。Ｇａｌ−ＰＬＳＰ及びポリ−Ｌ−リジンはブラスミ
ドｐＣＡＧＧＳＬｕｃに対して様々な重量比になるよう
に秤量し、７５μｌのＨＢＳに溶解した。各々の溶液を
混合後、室温で３０分放置してＧａｌ−ＰＬＳＰ／ｐＣ
ＡＧＧＳＬｕｃ複合体、あるいはポリ−Ｌ−リジン／ｐ
ＣＡＧＧＳＬｕｃ複合体を調製した。

【００４３】実施例４：Ｇａｌ −ＰＬＳＰ／ｐＣＡＧ
ＧＳＬｕｃ複合体及びポリ−Ｌ−リジン／ｐＣＡＧＧＳ
Ｌｕｃ複合体のフィルターによるろ過 実施例３により調製したＧａｌ−ＰＬＳＰ／ｐＣＡＧＧ
ＳＬｕｃ複合体及びポリ−Ｌ−リジン／ｐＣＡＧＧＳＬ
ｕｃ複合体を膜孔径０.２２μｍのフィルター（ミリポ
ア社）で濾過した。ろ液を回収し、分光光度計（ベック
マン社 ＤＵ６４０型）により波長２６０ｎｍでの吸光
度を測定した。

【００４４】結果を図２に示す。ポリ−Ｌ−リジン／ｐ
ＣＡＧＧＳＬｕｃ複合体では、ろ液中へのブラスミド遺
伝子の回収率が２０％以下であったのに対し、Ｇａｌ−
ＰＬＳＰ／ｐＣＡＧＧＳＬｕｃ複合体では７８％以上で
あった。この結果は、ポリ−Ｌ−リジン／ｐＣＡＧＧＳ
Ｌｕｃ複合体が不溶性の粒子状物質を形成しているのに
対し、Ｇａｌ−ＰＬＳＰ／ｐＣＡＧＧＳＬｕｃ複合体で
は、膜孔径０.２２μｍのフィルターを通過することが
可能な、より小さなサイズの複合体が形成されているこ
とを示すものである。

【００４５】実施例５：Ｇａｌ−ＰＬＳＰ／ｐＣＡＧＧ
ＳＬｕｃ複合体によるＨｅｐＧ２細胞への遺伝子導入 ＨｅｐＧ２細胞を１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＢＩ
Ｏ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣ
Ｏ ＢＲＬ社）中で５０％コンフレントの状態になるま
で培養（１２ウェルの細胞培養プレートを使用）した。
培養液を１％のＦＣＳを含むＤＭＥＭに交換した後、実
施例３により調製したＧａｌ−ＰＬＳＰ／ｐＣＡＧＧＳ
Ｌｕｃ複合体、あるいは、ポリ−Ｌ−リジン／ｐＣＡＧ
ＧＳＬｕｃ複合体の全量（２５０μｌ）を添加した。３
７℃のＣ０₂インキュベーター内に４時間放置し、培養
液を１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭに交換した後、さら
に７２時間、３７℃のＣ０₂インキュベーター内で培養
した。

【００４６】実施例６：ＨｅｐＧ２細胞におけるルシフ
ェフーゼ活性の測定 実施例５の操作後、各ウェル内の培養液を取り除き、Ｐ
ＢＳで２回洗浄した。１００μｌのピッカジーン培養細
胞溶解剤ＬＵＣ／ＰＧＣ−５０（東洋インキ社）を加え
室温で１５分間放置後、溶解させた細胞をエッペンチュ
ーブに入れ、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離して上
清（細胞抽出液）を回収した。上記細胞抽出液１０μｌ
とＬＵＣ 混合液（東洋インキ社）４００μｌを混合
し、ルミノメーター（Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５６０１，Ｂ
ｅｒｔｈｏｌｄ社）でルシフェフーゼ活性を測定した。
基質溶液として１００μｌのｌｍＭルシフェリンを用い
た。

【００４７】結果を図３に示す。遺伝子発現の指標とな
るルシフェフーゼ活性は、Ｇａｌ−ＰＬＳＰの比が大き
くなるほど増加した。これと比較して、ポリ−Ｌ−リジ
ン／ｐＣＡＧＧＳＬｕｃ複合体では、ポリ−Ｌ−リジン
の比に関係なくルシフェフーゼ活性はＧａｌ−ＰＬＳＰ
／ｐＣＡＧＧＳＬｕｃ複合体よりも低かった。これらの
結果はＧａｌ−ＰＬＳＰが遺伝子治療用の遺伝子担体と
して非常に有用性が高いことを示すものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ブラスミドｐＣＡＧＧＳＬｕｃの模
式図を示す。

【図２】 図２は、本発明の核酸運搬体Ｇａｌ−ＰＬＳ
Ｐ及び対照のポリ−Ｌ−リジンを用いた場合のブラスミ
ドｐＣＡＧＧＳＬｕｃの回収率を示す。

【図３】 図３は、本発明の核酸運搬体Ｇａｌ−ＰＬＳ
Ｐ及び対照のポリ−Ｌ−リジンを用いた場合のルシフェ
ラーゼ活性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸結合領域、標的指向性付与領域およ
   びポリエチレングリコール領域を含む核酸運搬体であっ
   て、前記核酸領域が、１つまたは複数の塩基性アミノ酸
   残基、及び分子内に水酸基を有する１つまたは複数のア
   ミノ酸残基を含むぺブチドである、請求項１に記載の核
   酸運搬体。
2. 【請求項２】 核酸結合領域中の塩基性アミノ酸残基
   が、Ｌ−リジン、Ｄ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｄ−ア
   ルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−オルニチン、Ｌ−ヒス
   チジンおよびＤ−ヒスチジンからなるグループから選択
   され、そして分子内に水酸基を有するアミノ酸残基がＬ
   −セリン、Ｄ−セリン、Ｌ一トレオニン、Ｄ−トレオニ
   ン、Ｌ−チロシンおよびＤ−チロシンからなるグループ
   から選択される、請求項１に記載の核酸運搬体。
3. 【請求項３】 核酸結合領域に含まれる塩基性アミノ酸
   と水酸基を有するアミノ酸の組成比がモル比で、５０：
   １から１：５０であり、核酸結合領域の分子量が２００
   から５００,０００であり、そしてポリエチレングリコ
   ール領域の分子量が２００から２５０,０００である、
   請求項２に記載の核酸運搬体。
4. 【請求項４】 核酸結合領域がポリ−Ｌ−リジン−Ｌ−
   セリンである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載
   の核酸運搬体。
5. 【請求項５】 標的指向性付与領域が、細胞膜若しくは
   細胞内に存在する受容体、または物質輸送タンパク質に
   対応するリガンドである、請求項１ないし４のいずれか
   １項に記載の核酸運搬体。
6. 【請求項６】 標的指向性付与領域が、少なくとも１残
   基以上のガラクトース残基を含む、請求項５に記載の核
   酸運搬体。
7. 【請求項７】 請求項１ないし６のいずれか１項に記載
   の核酸運搬体および核酸を含む、核酸の細胞内への導入
   を促進するための調節剤。
8. 【請求項８】前記核酸が、細胞内で発現させる遺伝子配
   列を含む遺伝子発現ベクターである、請求項７に記載の
   調節剤。
9. 【請求項９】 遺伝子発現ベクターが哺乳動物由来の細
   胞内で発現させるための遺伝子配列を含む、請求項８に
   記載の調節剤。
10. 【請求項１０】 遺伝子発現ベクターが遺伝子治療用の
    薬物遺伝子を含む、請求項８また９に記載の調節剤。