JP5025059B2 - 核酸を細胞に導入するための配合剤 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子移入の分野、特に担体と、核酸分子とコポリマーとからなる複合体との配合剤に関する。
【0002】
遺伝子治療の戦略を臨床的に実行に移すためには、安定で効率的な遺伝子ベクターを使用できることが必須である。しかし、体細胞遺伝子治療をねらいとした全身適用の場合、既知の遺伝子移入媒体のほとんどが、なおも問題を有する。
【0003】
原則的に、インビボでの効率的な遺伝子移入を得るために、以下の2つの輸送問題を解決すべきである:1)生体での適用部位から標的細胞への移入すべき物質(例えば、プラスミドDNA、オリゴヌクレオチド)の移入(細胞外局面)、および2)細胞表面から細胞質または核への移入すべき物質の移入(細胞局面)。受容体によって媒介される遺伝子移入に関する本質的な前提条件は、ウイルスの大きさを有する粒子にDNAを圧縮して、細胞におけるエンドサイトーシスによる取り込み後に内部小胞からDNAを放出することである。この前提は、DNAを、その化学的特性によって細胞でのエンドサイトーシスによる取り込み後に内部小胞(エンドソーム、ライソゾーム)からDNA複合体が確実に放出される特異的陽イオンポリマーと共にDNAを圧縮することによって満たされる(ボーシフ(Boussif)ら、1995;フェラーリ(Ferrari)ら、1997;ヘーンスラーおよびスゾカ(Haensler & Szoka)、1993;タン(Tang)ら、1996)。そのような作用はまた、pH依存的膜破壊ペプチドをDNA複合体に組み込むことによって得られる(プランク(Plank)ら、1994;国際公開公報第93/07283号)。DNA複合体の適した組成物を用いて、特異的取り込みおよび細胞への有効な遺伝子移入は、受容体リガンド相互作用によって得ることができる(カーチェイス(Kircheis)ら、1997;ザンタ(Zanta)ら、1997)。陽イオン性ペプチドとのDNAの複合体も同様に、受容体によって媒介される遺伝子移入に特に適している(ゴッツチョーク(Gottschalk)ら、1996;ワドワ(Wadhwa)ら、1997;プランク(Plank)ら、1999)。
【0004】
とりわけ、輸送問題の細胞外局面の解決がかなり不十分であるという事実によって、非ウイルスベクターに関して得ることができる有望な研究知見を臨床的に実践に移すことはより難しい。この問題の一つの理由は、全身適用(例えば、オプソニン化、血清蛋白質の接着)の際に血液および組織成分と強く相互作用するという非ウイルス遺伝子移入ベクターの物理化学的性質であり、そのために特定の標的細胞に向けられた受容体媒介遺伝子移入は特に制限される。ポリ(エチレングリコール)によってDNA複合体表面を改変すると、その血液蛋白質との結合特徴をかなり減少させることが示されている(プランク(Plank)ら、1996;オグリス(Ogris)、1998;国際公開公報第98/59064号)。非ウイルスベクターを用いるもう一つの制限は、インビボでのDNA複合体の不十分な溶解性(または安定性)である。既知の方法では、DNA複合体は生理食塩液濃度で凝集し、溶液から沈殿するために、十分に高い(例えば、1 mg/ml)濃度で静脈内に使用するためにDNAをポリカチオンと複合体を形成させることはこれまで不可能であった。
【0005】
同様の問題はまた、低分子量化学化合物を適用する場合にも起こる。「古典的な」薬剤の分野において、生物学的に分解可能な合成ポリマーは、生物において確実により長く保持され、標的臓器において所望の生物学的利用率が得られる剤形で薬剤を包装するために用いられる(「徐放性」)。この目的のため、ポリエチレングリコールによるコロイド粒子表面の改変は、望ましくないオプソニン化が抑制されるように形成される。多数の医学適用において用いられる生物学的に分解可能なポリマーの合成および特徴付けに関しては、十分な文献がある(クームス(Coombes)ら、1997)。物質と適用に応じて、ポリマーのバックボーンにおける化学的結合は変化する。生理的環境における望ましい不安定性は、エステル結合、アミド結合、ペプチド結合またはウレタン結合を適切に配置することによって得ることができ、それによって酵素の作用に対する感受性を意図的に変化させることができる。組み合わせ合成原理は、生物学的に有効な物質の迅速かつ効率的な合成にとって有効であることが証明されている(バルクレンホール(Balklenhohl)ら、1996)。ごく少数のパラメータを系統的に変化させることによって、所望の基本構造を有する多くの化合物を得ることができる(ブロッキーニ(Brocchini)ら、1997)。適した意味のある生物学的選択系を用いて、所望の特徴を有する化合物を、この化合物プールから選択することが可能である。
【0006】
米国特許第5,455,027号において、薬理学的に活性な物質がアルカンの官能基側鎖に共有結合している、酸化ポリアルキレンと官能基を有するアルカンとの交互の単位からなるポリマーが記載されている。
【0007】
近年、非ウイルス遺伝子移入系の適用に関して、以下の本質的な点が明らかになっている。
【0008】
a) プラスミドDNAと陽イオンポリマーとの複合体は、インビトロおよびインビボでの遺伝子移入に適しており、二級および三級アミノ基を有するポリマーとの複合体はまた、固有のエンドソーム溶解活性を有し、これによって効率的な遺伝子移入を得ることができる(ボーシフ(Boussif)ら、1995;タン(Tang)ら、1996)。
【0009】
b) 陽イオン部分の特定の鎖長から、分岐陽イオン性ペプチドはDNAとの効率的な結合にとって、および特定のDNA複合体の形成にとって適している(プランク(Plank)ら、1999)。
【0010】
c) ポリカチオンDNA複合体は、血液成分と強く相互作用して、補体系を活性化する(プランク(Plank)ら、1996)。
【0011】
d) 微粒子構造と血液成分との強い相互作用は、ポリエチレングリコールによる改変によって減少または阻害しうる;これはまた、ポリカチオンDNA複合体にも当てはまる(プランク(Plank)ら、1996;オグリス(Ogris)ら、1999)。
【0012】
したがって、本発明の基礎となる技術的問題は、核酸陽イオン複合体に基づく新しい改善された非ウイルス遺伝子移入系を提供することであった。
【0013】
本発明の基礎となる技術的問題を解決するために、核酸または核酸複合体は、複合体を物理的に安定化させ、それらをオプソニン化から保護する荷電ポリマーによってコーティングすると仮定した。
【0014】
本発明は、第一の局面において以下の一般式Iを有する荷電コポリマーに関する。
【化4】
式中、Rは両親媒性ポリマーまたはそのホモもしくはヘテロ二官能誘導体であり、
式中Xは、
i)アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体、ペプチドもしくはペプチド誘導体、またはスペルミンもしくはスペルミジン誘導体である;または
ii)式中、Xは
【化5】
であり、式中、
aはH、または選択的にハロゲンもしくはジアルキルアミノ置換C1〜C6アルキルである;ならびに
b、c、およびdは、同じまたは異なる、選択的にハロゲンもしくはジアルキルアミノ置換C1〜C6アルキレンである;または
iii)式中、Xは、
【化6】
であり、
式中、
aはH、または選択的にハロゲンもしくはジアルキルアミノ置換C1〜C6アルキルである;ならびに
bおよびcは同じまたは異なり、選択的にハロゲンもしくはジアルキルアミノ置換C1〜C6アルキレンである;または
iv)式中、
Xは官能基三つW1Y1Z1を有する置換芳香族化合物であり、式中W、YおよびZは、以下に示す意味を有する;
式中
W、YまたはZは、同じまたは異なる置換基CO、NH、OもしくはS、またはSH、OH、NH、またはNH2と反応することができるリンカーであり;および
イフェクター分子Eは、
陽イオン性もしくは陰イオン性ペプチドまたはペプチド誘導体、スペルミンもしくはスペルミジン誘導体、グリコサミノグリカン、または非ペプチド性オリゴ/ポリカチオンもしくはポリアニオンである;
式中、
mおよびnは独立して互いに0、1、または2である;
式中
pは好ましくは3〜20であり;および
lは1〜5であり、好ましくは1である。
lが>1である場合、X-Zm-En部分は同じまたは異なる。
【0015】
本発明の意味において、芳香族化合物は、環原子6〜10個を有する単環式または二環式芳香族炭化水素基であり、これは、上記の置換基を別にして、選択的に一つまたはそれ以上のさらなる置換基、好ましくはC1〜C6-アルキル、-O-(C1〜C6-アルキル)、ハロゲン、好ましくはフッ素、塩素、または臭素、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ-(C1〜C6-アルキル)アミノ、ジ-(C1〜C6-アルキル)アミノからなる群より選択される置換基一つ、二つ、または三つによって独立して置換することができる。フェニル基が好ましい。
【0016】
本発明の意味において、芳香族化合物はまた、ヘテロアリール基となりうる;すなわち、N、O、またはSの基からなる群より選択される環原子一つ、二つ、または三つを互いに独立して含み、残りの環原子がCである、環原子5〜10個を有する単環式または二環式芳香族炭化水素基となりうる。
【0017】
特に明記していなければ、アルキルアミノまたはジアルキルアミノは、C1〜C6-アルキル基一つまたは二つによって置換されたアミノ基であり、アルキル基が2個の場合、アルキル基2個はまた、環を形成してもよい。特に明記していない限り、C1〜C6-アルキルは一般的に、互いに異なっていてもよく同じであってもよい一つまたはそれ以上のハロゲン原子(群)、好ましくはフッ素によって選択的に置換されうる、炭素原子(群)1〜6個を有する分岐または非分岐炭化水素基を表す。その例は以下の炭化水素基であってもよい:
メチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル(イソプロピル)、n-ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、ヘキシル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-1-メチルプロピル、および1-エチル-2-メチルプロピル。
【0018】
特に明記していない限り、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、または1,1-ジメチルエチルのような炭素原子1〜4個を有する低級アルキル基が好ましい。
【0019】
したがって、アルキレンは、互いに異なっていてもよく、または同じであってもよい一つまたはそれ以上のハロゲン原子(群)、好ましくはフッ素によって選択的に置換してもよい、炭素原子1〜6個を有する分岐または非分岐の二価炭化水素架橋を意味する。
【0020】
両親媒性ポリマーRは、酸化ポリアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールまたはこれらのポリマーのコポリマーであることが好ましい。
【0021】
適した酸化ポリアルキレンの例は、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、ポリイソプロピレングリコール、ポリブチレングリコールである。
【0022】
本発明の枠組みにおいて、酸化ポリアルキレン、特にPEGが好ましい。
【0023】
酸化ポリアルキレンは、コポリマー中に、またはチオ、カルボキシ、もしくはアミノ誘導体として存在してもよい。
【0024】
ポリマーRは、好ましくは分子量500〜10,000、好ましくは1,000〜10,000を有する。
【0025】
Xがアミノ酸であるi)の場合、官能基三つを有するアミノ酸をコポリマーの合成のために用いることができ、この場合これらの基の二つはポリマーと共重合することができ、一つは、イフェクター分子Eとカップリングすることができる;この場合Zは不要である。天然のアミノ酸であるグルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、オルニチン、およびチロシンが好ましい。原則として、合成アミノ酸もまた、天然のアミノ酸の代わりに用いてもよい(例えば、対応するスペルミンおよびスペルミジン誘導体)。
【0026】
i)の場合、アミノ酸誘導体も合成に用いてもよく、このアミノ酸誘導体はポリマーと共重合するために官能基二個を有し、イフェクター分子をカップリングするためのリンカーによるアミノ酸(グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、またはオルニチン)の改変によって得られる。このように、Zは不要である(m=0);リンカーの例は、ピリジルチオメルカプトアルキルカルボキシレート(図1を参照のこと)またはマレイミドアルカンカルボキシレートである。
【0027】
i)の場合、Xはまたペプチド(誘導体)であってもよい。ペプチドまたはペプチド誘導体が電荷を有しない場合、Eをそれに直接、またはZによってカップリングさせる。
【0028】
Xが正電荷もしくは負電荷を持つペプチドまたはペプチド誘導体、スペルミンもしくはスペルミジン誘導体である場合、X自身がイフェクター分子となる(ZおよびEは不要である、m=n=0)。最も単純な場合、ペプチドはこの場合二つまたはそれ以上の同一もしくは異なる天然または合成アミノ酸の直鎖状配列からなり、このときアミノ酸は、ペプチドが全体的に負のまたは正の電荷のいずれかとなるように選択される。または、ペプチドは分岐してもよい。これらの場合、そのようなペプチドはイフェクターであり、Z、およびEは不要である(m=n=0)。適した陽イオン性ペプチドのタイプの例はプランクら(Plank、1999年)に記載されている。
【0029】
適した陰イオン性ペプチド誘導体Xは、一般式(ペプチド)n-B-スペーサー-(Xaa)を有する。ペプチドは全体的に負電荷を有するアミノ酸またはアミノ酸誘導体の配列である。好ましくはペプチドはアミノ酸3個〜30個からなり、より好ましくはグルタミン酸および/またはアスパラギン酸残基のみからなる。nは、Bに含まれる官能基に応じた分岐数を表す。Bは分岐分子であり、好ましくはリジン、またはii)〜iv)の場合にはタイプXの分子である。スペーサーは、アミノ酸2〜10個からなるペプチドであるか、またはカルボン酸バックボーンにおいて炭素原子3〜9個を有する有機アミノカルボン酸、例えば6-アミノヘキサン酸である。スペーサーは、ポリマーバックボーンから荷電イフェクター分子を空間的に引き離す役割を有する。Xaaは好ましくは、三官能アミノ酸であり、特にグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、一般的にi)〜iv)の場合では、タイプXの化合物となりうる。
【0030】
または、i)の場合、Xは、ペプチドの改変がアミノ酸とは異なる荷電基であるペプチド誘導体となることができ、そのような基の例は、ノイラミン酸またはグリコサミノグリカン硫酸塩のような、スルホン酸基または荷電炭化水素基である。ペプチドの改変は、ペプチド合成の過程で直接または後述の最終的なペプチドについて標準的な方法に従って実施することができる。
【0031】
i)の場合のように、イフェクター分子Eは、ポリカチオン性もしくはポリアニオン性ペプチドまたはペプチド誘導体、またはスペルミンもしくはスペルミジン誘導体となりうる。最も単純な場合において、ペプチドはまた、この場合二つまたはそれ以上の同一もしくは異なる天然または合成アミノ酸の直鎖状配列であり、式中アミノ酸はペプチドが全体的に正荷電または負荷電のいずれかとなるように選択される。または、ペプチドは分岐となりうる。適した分枝陽イオン性ペプチドのタイプの例はプランクら(Plank、1999年)に記載されている。適した陰イオン分子Eは、一般式(ペプチド)n-B-スペーサー-(Xbb)を有し、Xbbは、好ましくはXに直接またはZを通じてカップリングすることができる反応基を有するアミノ酸である。
【0032】
イフェクターペプチドEのZへのまたは直接Xへのカップリングは、当初からペプチドに存在する反応基、または後に導入された反応基、例えばチオール基(システイン中の、またはメルカプトアルカン酸基を導入することによって)によって行われる。または、Zに応じて、カップリングは既存のアミノ基またはカルボン酸基によって、または後に導入されたアミノ酸基またはカルボン酸基によって起こってもよい。
【0033】
i)の場合のように、またはEは、ペプチドの改変がアミノ酸とは異なる荷電基であるペプチド誘導体となりえて、そのような置換基の例は、ノイラミン酸または硫酸化炭化水素基のようなスルホン酸基、または荷電炭化水素基である。この場合もまた、Xとのカップリングは、直接またはZを通じて起こる。
【0034】
一般式Iのコポリマー
【化7】
は、強く交互のブロックコポリマーとして構築することが好ましい。
【0035】
選択的に、コポリマーは、標的細胞に対する細胞リガンド(受容体リガンドL)として改変される。この場合、リンカー位置Zのほとんどにおいて、Eが存在する。それらの間に、陽イオン性または陰イオン性イフェクターEの代わりに、細胞リガンドがリンカーZの個々の位置にカップリングする。または、リガンドはイフェクター分子Eの個々の位置にカップリングする。好ましくは、E対Lの比は、約10:1〜4:1である。
【0036】
受容体リガンドは生物学的起源であってもよく(例えば、トランスフェリン、抗体、炭化水素基)または合成起源(例えば、RGDペプチド、合成ペプチド、合成ペプチドの誘導体)であってもよい;適したリガンドの例は、国際公開公報第93/07283号に記載されている。本発明のコポリマーは、以下の方法に従って生成することができる。
【0037】
ペプチドまたはペプチド類似体である場合、共重合パートナーXまたはX-Zm-Emは、Fmocプロトコール(フィールズ(Fields)ら、1990)に従う標準的な方法に従って、例えば固相で(固相ペプチド合成、SPPS)合成される。アミノ酸誘導体はTBTU/HOBtによって、またはHBTU/HOBt(フィールズ(Fields)ら、1991)によって活性化される。イオンアミノ酸の位置に関して、以下の誘導体をそのN末端Fmoc保護型として用いる:
(a)陽イオン側鎖:R(Pbf)、K(Boc、Trt)、オルニチン(Boc)、カルボキシスペルミンまたはスペルミジン(Boc)。
(b)陰イオン側鎖:D(O-tert、Bu)、E(O-tert、Bu)。
【0038】
(ペプチド)n-B-スペーサー-(Xaa)または(ペプチド)n-B-スペーサー-(Xbb)の分岐部位Bに関しては、Fmoc-K-(Fmoc)-OHが用いられる。ペプチドはTFA/DCMによって樹脂から離れている。
【0039】
重合パートナーXは、その後の共重合において一般構造式(ペプチド)n-B-スペーサー-(Xaa)を有するペプチドである場合、カルボキシル位置でベンジル保護基を有するグルタミン酸またはアスパラギン酸がXaaの位置で用いられる。これは水素化分解によって選択的に除去される(フェリックス(Felix)ら、1978)。ペプチド鎖のN末端アミノ酸位置は、保護基がペプチドとPEGとの共重合後に一段階で分離することができるように、Boc保護されたアミノ酸を有する。
【0040】
重合パートナーXがリンカーを含むアミノ酸誘導体である場合(例えば、3-メルカプトプロピオン酸、6-アミノヘキサン酸)、ペプチド化学の古典的な方法に従って液相において得ることができる。メルカプトプロピオン酸を、2,2'-ジチオジピリジンと反応させて、クロマトグラフィーによって精製する。反応生成物は、HOBt/EDC活性化を用いて、カルボキシル保護グルタミン酸(O-t.ブチル)と反応する(図1参照)。6-Fmocアミノヘキサン酸も同様に反応する。カルボキシル保護基をTFA/DCM中で除去し、得られたグルタミン酸誘導体をクロマトグラフィー方法によって精製する。
【0041】
コポリマーの生成は、以下の原理に従って行うことができ、PEGペプチドコポリマーによって説明する。
【0042】
(1)ポリ(PEG-O-OC-)マトリクス(「ポリエステル」)
イオン性の部分的に側鎖が保護されたペプチドジカルボン酸またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸誘導体と、規定の分子量範囲のPEG高分子単量体(市販の、分子量400〜20,000、例えばフルカ社(Fluka)との共重合によって、PEGエステルバックボーン上にマトリクスが得られる。これは、生理的環境において加水分解不安定性の系である(ウルブリッヒ(Ulbrich)ら、1985)。
【0043】
p(PEG-ペプチド)-コポリマーは、確立された方法に従って、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド/DMAP、好ましくは強く交互の配列(ザリプスキー(Zalipsky)ら、1984;ナタン(Nathan, A.)、1992)によって形成される。ジクロロメタン溶液において側鎖保護ペプチドまたはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸誘導体と共に存在するPEG高分子単量体に対して、DCC/DMAPを加える。得られた尿素誘導体を分離した後、冷エーテルによる沈殿によってポリマーを得ることができる。残りの側鎖保護基は、ジクロロメタン中でTFAによって分離される(これらの条件下で、PEG-エステル結合も同様に安定である(ザリプスキー(Zalipsky)ら、1984)。イオンポリマーは、沈殿および最終クロマトグラフィー段階によって得られる。反応の操作によって、重合度、およびポリマーにおけるPEG単位あたりの荷電比を制御することができる。
【0044】
(2)ポリ(PEG-HN-OC)マトリクス(「ポリアミド」)
加水分解能が早すぎると予想され、このようにコポリマー-DNA複合体が遺伝子治療適用に用いられる全身適用の場合に、不安定性が高すぎると予想される場合には、ポリエステルの代わりとして、アミドポリマーマトリクスを構築してもよい。この場合、PEG高分子単量体の代わりに、上記の合成と類似の方法で、イオン性ペプチドまたはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸誘導体と共重合するジアミノ-PEG誘導体を用いる。この合成の間、加水分解安定性のアミド構造が得られる。ジアミノ改変ポリエチレングリコールは、規定の分子量範囲500〜20,000の基本物質として市販されている(例えば、フルカ社)。ペプチド成分の残りの酸不安定側鎖保護基は、例えばTFA/DCMによって分離して、ポリマーをクロマトグラフィー方法によって精製する。
【0045】
別の段階において、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸誘導体のコポリマーを、適した反応基を含む陰イオンもしくは陽イオン性ペプチドと反応させる。例えば、3-(2'-チオ-ピリジル)-メルカプトプロピオニル-グルタミン酸のコポリマーを、遊離のシステイン-チオール基を含むペプチドと反応させる。6-Fmoc-アミノヘキサノイルグルタミン酸から得られたコポリマーから、Fmoc基をアルカリ条件で除去する。生成物をカルボキシル活性化保護ペプチドと反応させる。ペプチド保護基(t-BocまたはO-t.ブチル)をDCM/TFA中で除去し、得られた生成物をクロマトグラフィーによって精製する。または、Ahx(6−アミノヘキサン酸)のアミノ基を二官能リンカーによって誘導体にして、その後ペプチドと反応させることができる。
【0046】
リガンドLは、イフェクターEでまたはリガンドでカルボキシル基を活性化することによって、またはスクシニミジル-ピリジル-ジチオプロピオネート(SPDP;ピアス社(Pierce)、またはシグマ社(Sigma))のような二官能リンカーを挿入することによって直接カップリングすることができる。反応生成物はゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーによって精製することができる。
【0047】
この共重合混合物はまた、組み合わせ原理を用いて反応させることができる。この場合、主にポリマーRのタイプと分子量(重合度)、重合化パートナーX-Zm-Enの同一性、またはイフェクター分子E(例えば、グルタミン酸の増加数を有する一連の陰イオン性ペプチド)、および総重合化程度pは、選択可能な変数である。
【0048】
PEG高分子単量体の分子量、用いられるイオン種と共にコポリマーにおけるその占有率とポリマーマトリクスの重合度を変化させることによって、異なるコポリマーの相同配列の迅速で平行な構築が可能となり、その後核酸と複合体を形成した後、様々な非ウイルスベクターの構築が可能となるいくつかのパラメータの系が確立される。この合成の考え方を、細胞培養プレートの規模(例えばプレート一枚あたり96ウェル)において実践する。この目的のため、化学合成を必要なミクロの規模に適合させる(反応容量は500 μlの範囲)。これによって、生物アッセイ法において同時に合成されたポリマーの直接移入が可能となり、このように、複数の系の迅速なスクリーニングの一因となり、適した化合物が同定される一因となる。遺伝子移入のための本発明のポリマーの好ましい使用に関して生物学的選択法を実施するために、コポリマーを例えばDNA複合体と反応させ、目的とする用途(例えば、遺伝子移入)に関してポリマーの特徴の評価を可能にする試験を行う。そのような選択方法は、コポリマーによってコーティングしたナノ粒子について用いることができる。そのようなスクリーニングおよび選択方法は、例えば、96ウェルプレートのフォーマットでの補体活性化試験として役立ちうる(プランク(Plank)ら、1996)、または同じフォーマットでの血清アルブミンもしくは塩によって誘導された凝集の比濁法となりうる、または同じフォーマットでのインビトロ遺伝子移入試験となりうる(プランク(Plank)ら、1999)、または同じフォーマットでの蛍光測光法となりうる。
【0049】
そのような分析によって、例えば、組み合わせ合成混合物のコポリマーが、その溶解度がインビボでの遺伝子移入適用にとって十分となるようにDNA複合体の表面を改変することに適していること、血液循環中の滞留時間および作用期間が、標的細胞への受容体媒介遺伝子移入が起こるために十分に増加するように、血液成分および組織成分との相互作用が減少していることが示される。
【0050】
本発明のコポリマーは、好ましくは高等真核細胞に核酸を輸送するために用いられる。
【0051】
したがって、もう一つの局面において、本発明は、一つまたはそれ以上の核酸分子と一般式Iの一つまたはそれ以上の荷電コポリマーとを含む複合体に関する。
【0052】
好ましくは、核酸分子は有機ポリカチオンまたは陽イオン性脂質と縮合される。
【0053】
もう一つの局面において、本発明は、このようにそれらがイオン相互作用によってその表面に結合している一般式Iの荷電コポリマーを有するという特徴を有する、核酸と有機陽イオンもしくは陽イオン性脂質との複合体に関する。
【0054】
細胞に輸送されるべき核酸は、DNAsまたはRNAsとなりうるが、この場合ヌクレオチド配列および大きさに関して制限はない。本発明の複合体に含まれる核酸は主に、細胞において得られる生物作用によって定義され、例えば遺伝子治療の範囲内で用いる場合には、発現されるべき遺伝子もしくは遺伝子断片によって、または欠損遺伝子もしくは任意の標的配列の意図する置換もしくは修復によって(ヨーン(Yoon)ら、1996;クレン(Kren)ら、1998)、または阻害されるべき遺伝子の標的配列によって(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを用いる場合)定義される。好ましくは、細胞に輸送されるべき核酸は、治療的に有効な蛋白質をコードする配列を含むプラスミドDNAである。癌治療の範囲内で用いるために、配列は例えば、インターロイキン-2、IFN-α、IFN-γ、TNF-αのようなサイトカインの一つまたはそれ以上をコードする、または基質と組み合わせて用いられる自殺遺伝子をコードする。いわゆる遺伝子腫瘍ワクチン接種において用いるために、複合体は、一つまたはそれ以上の腫瘍抗原の断片をコードするDNAを、選択的に一つまたはそれ以上のサイトカインをコードするDNAと組み合わせて含む。治療的に有効な核酸のさらなる例は国際公開公報第93/07283号に示される。
【0055】
本発明のコポリマーは、核酸-ポリカチオン複合体を立体的に安定化させる、および体液成分(例えば、血清蛋白質)とのその望ましくない相互作用を減少または阻害するという特徴を有する。
【0056】
真核細胞に輸送するために核酸との複合体形成に適した有機ポリカチオンは既知である;負電荷を持つ核酸との相互作用のために、これは圧縮されて、細胞によって取り込まれるために適した形にされる。その例は、同種直鎖状イオンポリアミノ酸(ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチンのような)、または異種直鎖混合陽イオン中性ポリアミノ酸(二つまたはそれ以上の陽イオン基および中性アミノ基からなる)、分岐鎖および直鎖陽イオン性ペプチド(プランク(Plank)ら、1999;ワドワ(Wadhwa)ら、1997)、非ペプチドポリカチオン(直鎖または分岐鎖ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン)、デンドリマー(規定の直径および正確な数の末端アミノ基で合成することができる球形ポリカチオン;ヘーンスラーおよびスゾカ(Haensler and Szoka)、1993;タン(Tang)ら、1996;国際公開公報第95/02397号)、陽イオン炭化水素、例えばキトサン(エルバッヒャー(Erbacher)ら、1998)のような、受容体媒介遺伝子移入のために用いられるポリカチオン(欧州特許第0388 758号;国際公開公報第93/07283号)である。ポリカチオンはまた、脂質によって改変してもよい(ゾウ(Zhou)ら、1994;国際公開公報第97/25070号)。
【0057】
さらに適した陽イオンは、一部市販されている陽イオン性脂質(リー(Lee)ら、1997)である(例えば、リポフェクタミン、トランスフェクタム)。
【0058】
以下において、「ポリカチオン」という用語は、特に明記していない限り、ポリカチオンと陽イオン性脂質の双方の代理として用いられる。
【0059】
本発明の意味において、好ましいポリカチオンは、ポリエチレンイミン、ポリリジン、およびデンドリマー、例えばポリアミドアミンデンドリマー(「PAMAM」デンドリマー)である。
【0060】
ポリカチオンの大きさおよび/または荷電は大きく変化しうる;これは、核酸と共に形成された複合体が生理的塩濃度で解離しないように選択されるが、これはエチジウムブロマイド置換アッセイ法によって容易に決定することができる(プランク(Plank)ら、1999)。さらなる段階において、規定量の核酸を、選択したポリカチオンの増加量と共にインキュベートして、形成された複合体をトランスフェクトすべき細胞に適用して遺伝子発現(一般的にレポーター遺伝子構築物、例えば、ルシフェラーゼによって)を標準的な方法によって測定する。
【0061】
核酸複合体の形成は、静電気的相互作用によって起こる。ポリカチオンに関連して、DNAは、そのような複合体が表面負電荷を示すように過剰量で存在しうる;逆の場合、すなわち核酸を縮合するポリカチオンが過剰量で存在する場合、複合体は表面正電荷を有する。本発明の意味において、ポリカチオンは過剰量で存在する。
【0062】
正電荷が過剰に存在する場合、ポリカチオンと核酸の比は、ゼータ電位が約+20 mV〜+50 mVとなるように調節し、特定のポリカチオン、例えばポリリジンを用いる場合、上記のレベル以上であってもよい。
【0063】
負電荷が過剰に存在する場合、ゼータ電位は約−50 mV〜−20 mVとなる。
【0064】
ゼータ電位の測定は、例えば、エルバッヒャーら(Erbacher、1998)によって記載されているように、確立された標準的な方法に従って行う。
【0065】
ポリカチオンは、選択的に細胞リガンドまたは抗体と結合させる;適したリガンドは国際公開公報第93/07283号に記載されている。腫瘍治療の際の標的細胞に向けられる遺伝子移入の場合、腫瘍細胞への遺伝子移入を増加させることができる腫瘍細胞関連受容体に対するリガンドまたは抗体(例えば、CD87;uPA-R)が好ましい。
【0066】
複合体が生成される間、核酸、一般的にプラスミドDNAを、電荷が過剰量存在するポリカチオン(選択的に、受容体リガンドによって誘導体化する)と共にインキュベートする。このプロセスの間、受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞によって取り込むことができる粒子が形成される。その後、複合体を本発明に係って負電荷を持つコポリマー、好ましくはポリエチレングリコールコポリマーと共にインキュベートする。コポリマーにおけるイフェクターEは、ポリカチオンペプチドであることが好ましい。または、コポリマーをまず核酸と混合した後、ポリカチオンとインキュベートする、または第三の方法として、コポリマーを最初にポリカチオンと混合してから核酸と共にインキュベートする。
【0067】
または、核酸は静電欠乏において存在するポリカチオンと共にインキュベートしてから、陽イオン性コポリマーを加える。この場合も同様に、混合段階の順序は、上記の陰イオン性コポリマーに関して記述したように、変化しうる。個々の成分の相対的部分は、得られたDNA複合体が弱い正の、中性の、または弱い負のゼータ電位を示すように選択される(+10 mV〜−10 mV)。
【0068】
正電荷を持つコポリマーを用いる場合、それらは核酸を結合および縮合する唯一のポリカチオン分子として用いることができる;このように、ポリカチオンまたは陽イオン性脂質の一部は不要である。この場合、個々の成分の相対的部分は、得られたDNA複合体が弱い正の、中性の、または弱い負のゼータ電位を示すように選択される(+10 mV〜−10 mV)。
【0069】
複合体において、選択的にポリカチオンおよび/またはコポリマーは、同一または異なる細胞リガンドによって改変される。
【0070】
本発明の核酸複合体は、その大きさが一般式Iの静電気的結合コポリマーによって安定化され、このように凝集に対して保護されており、長期間(数週間)溶液中で保存できるという長所を有する。さらに、それらは結合したコポリマーの保護作用によって体液の成分(例えば、血清蛋白質)と相互作用しない、または相互作用の程度が低いという長所を有する。
【0071】
さらなる局面において、本発明は、治療的に有効な核酸、本発明のコポリマー、および選択的に有機ポリカチオンまたは陽イオン性脂質を含む薬学的組成物に関する。
【0072】
本発明の薬学的組成物は、凍結乾燥型で存在することが好ましく、選択的に、容易に用いられる溶液において生理的濃度が得られる量で、蔗糖またはデキストロースのような糖を添加することが好ましい。組成物はまた、凍結濃縮型で存在しうる。本発明の組成物はまた、超低温型(凍結保存型)または冷溶液として存在しうる。
【0073】
さらなる局面において、本発明の正電荷または負電荷を持つコポリマーは、古典的な薬学的調製物を適用するために開発されたコロイド粒子を立体的に安定化させる目的、および体液の成分(例えば、血清蛋白質)との望ましくない相互作用を減少または抑制する目的に役立つ。さらに、受容体リガンドによって改変された本発明のコポリマーは、標的細胞に対する特異性が増加した薬剤を移入するために、上記のナノ粒子の表面に受容体リガンドを結合させるために用いることができる(「薬剤のターゲティング」)。
【0074】
さらなる局面において、本発明は、担体と、一つまたはそれ以上の核酸分子と一つまたはそれ以上の本発明のコポリマーとを含む複合体との配合剤に関する。
【0075】
コポリマーと核酸分子の好ましい態様に関して、上記の説明が当てはまる。
【0076】
この意味において、担体は、形質転換すべき細胞にインビボまたはインビトロで接触させることができ、核酸(群)とコポリマー(群)との複合体を有する物体または物質である。好ましくは、担体は、密着して結合した材料、すなわち固体物質、特に好ましくは、例えばゲル、スポンジ、ホイル、粉末、顆粒、またはリボンのようなプラスチックまたは変形可能な固体物質である。担体は、生物学的に非再吸収性または生物学的に再吸収性の材料からなりうる。
【0077】
担体はまた、好ましくは核酸分子の存在下で、本発明のコポリマーのクロスリンクによって生成される担体であってもよい。このように、例えば、既知の遺伝子ベクターを導入する可能性(裸のDNA、裸のRNA、リポプレックス、ポリプレックス)、ならびに本発明に係ってクロスリンクしたポリマーにおいて、選択的に化学修飾されたオリゴヌクレオチドおよびリボザイムを導入する可能性が存在する。この目的のために、クロスリンクは、例えば、インサイチューで遺伝子ベクター、DNA、オリゴヌクレオチド等の存在下において、水溶性溶媒または有機溶媒においてクロスリンクを誘発する物質を加えることによって起こる。クロスリンク剤の性質は、コポリマーの構造に依存する。したがって、例えば、図2に示されたポリマーバックボーンは、例えば、システイニル-システインまたは非アミノ酸様ジチオールのようなジチオールを加えることによってクロスリンクすることができる。カルボン酸を含むコポリマーのクロスリンクは、カルボン酸の活性化の際に任意のジアミンを加えることによって起こりうる(例えば、インサイチューでの活性化エステルに対するカルボン酸の反応)(ナタン(Nathan)ら、Macromolecules 25(1992)、4476〜4484)。一級または二級アミンを有するポリマーバックボーンは、例えば、活性化ジカルボン酸を加えることによって起こりうる。クロスリンクの後、調製物は、被膜が形成されるまで乾燥させることができる。
【0078】
生物学的に非再吸収性の材料の例はシリコン(例えば、カテーテル用)である。しかし、インプラントとして体内に導入することができる異なる生物学的に非再吸収性の材料を用いることも可能であり、および/または例えば、形成手術においてすでに用いられている。その例は、PTFE(例えば、血管置換のため)ポリウレタン(例えば、カテーテル)、金属材料(例えば、医療用スチール、内部人工器官用のチタン合金2;血管支持体として用いられる金属メッシュ(ステント))である。
【0079】
好ましくは、担体は、生物学的に再吸収可能な材料である。その例は、トロンビンまたはフィブリノーゲンから生成されるフィブリン接着剤、キチン、オキシセルロース、ゼラチン、ポリエチレングリコールカーボネート、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸のような脂肪族ポリエステル、およびポリアミドおよびポリウレタンまたはポリエーテルのようなそれに由来するアミノ酸化合物、ならびに対応する混合重合化物である。その上、他の生物学的に分解可能なポリマー、特にヒドロゲルに基づくいわゆる自己硬化性接着剤を担体として用いることができる。特に、生体内で酵素的におよび/または加水分解プロセスによって分解することができる任意の材料は、生物学的に再吸収性の材料として適している。その例はまた、生体再吸収性の化学的に明確な硫酸カルシウム、燐酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ無水物、精製蛋白質または部分精製細胞外マトリクスからなる担体である。担体コラーゲンが特に好ましく、特に、例えばシグマ社またはコラーゲンコーポレーション(Collagen Corporation)によって販売されている軟骨および皮膚コラーゲンから生成されたコラーゲンマトリクスが好ましい。コラーゲンマトリクス生成の例は、例えば、米国特許第4,394,370号および第4,975,527号に記載されている。
【0080】
担体は、コラーゲンに由来することが非常に好ましく、特にコラーゲンスポンジであることが好ましい。一般的に、グルコサミノグリカンのよう負電荷を持つ多糖類は、イオン的相互作用によってコラーゲンに結合する。結合は、コラーゲン細繊維における正電荷を持つアミノ酸(リジン、ヒドロキシリジンおよびアルギニン)に、またはカルシウムのような二価陽イオンによって媒介されると負電荷を持つアミノ酸にも起こりうる。さらに、コラーゲンのイオン結合特性は、酸またはアルカリ溶液による前処理およびその後の凍結乾燥によって意図的に影響を及ぼすことができる。コラーゲン化学における既知のこれらの技術によって、担体材料としてのコラーゲンとDNA複合体の間にイオン結合を生成するために、本発明の複合体の懸濁液によってコラーゲン材料を浸漬することが可能である。
【0081】
コラーゲンにおいて、正電荷を持つアミノ酸は短い陽イオン部分に濃縮されない。しかし、担体のそのような構造的特徴は、DNAの効率的な結合にとって必要である。担体材料とのより強固な結合を得るために、後者をさらに、ペプチド(プランク(Plank)ら、Human Gene Therapy 10(1999)、319〜333)またはポリエチレンイミン(PEI)のような陽イオン物質結合DNAによって誘導体化することができる。この目的のため、コラーゲンスポンジを例えば、二官能能カップリング試薬であるスクシニミジル・ピリジル・ジチオプロピオネート(SPDP)によって改変する。ポリエチレンイミンをイミノチオランによって誘導体化して、これによってチオール基を導入する。カップリングすべき陽イオン性ペプチドは、C末端にシステインを有する。チオール基はジスルフィド架橋を形成することによってSPDP誘導体化コラーゲンスポンジと反応する。そのようにして得られたスポンジ誘導体は、DNAに強固に結合するはずであり、DNAの放出はかなり遅れて起こると予想される。
【0082】
本発明の配合剤を生成するために、例えば、乾燥コラーゲン材料を5%グルコース中でDNA/コポリマー複合体と共にインキュベートすることができる。次に、スポンジを凍結乾燥する。
【0083】
一般的に、本発明の配合剤は、担体が、複合体が再度放出されるように複合体を吸収するまたはそれと結合するように、対応する担体を、核酸とコポリマーとの複合体に接触させることによって生成することができる。対応する方法は、当業者に既知である(ボナディオ(Bonadio)ら、(1999)、Nat. Med. 5(7):753〜759;シェア(Shea, L.D.)ら、(1999)、Nat. Biotechnol. 17(6):551〜554)。実施例において、担体としてのコラーゲンスポンジと、核酸/コポリマー複合体との配合剤の生成を記述する。
【0084】
本発明の配合剤は、核酸を細胞に移入するために用いることができ、好ましくは高等真核細胞に、好ましくは脊椎動物細胞、特には哺乳類の細胞にインビトロおよびインビボで移入するために用いることができる。
【0085】
インビボ適用に関連して、特に配合剤をインプラントとして、例えば皮下に直接、または例えば、カテーテル、人工関節、または内部人工器官のコーティングとして導入することが可能である(例えば、組織の組み込みを改善するため)。可能性がある適用は創傷の被覆であり、例えば火傷または圧迫潰瘍のような広範囲の皮膚欠損を覆うこと、および現代の組織工学技術のための担体材料としてである(ムーニーおよびミコス(Mooney, D.J. and Mikos, A.G.)ら、Sci. Am. 280(4):60〜65)。さらに、コーティングした材料の加工は、一般的な組織接着剤系によって生物において意図的に導入され、固定され、デポーの形で有効となる(トランスフェクション)粉末の形となりうる。
【0086】
その上、本発明はまた、選択的に薬学的に許容される添加剤と共に、本発明の配合剤を含む薬学的組成物にも関する。
【0087】
上記のように担体を含むキットは、本発明のコポリマー、または本発明のコポリマーと核酸分子との複合体と共に、本発明の主題である。
【0088】
実施例1:一般式Iの荷電コポリマーの調製
【化8】
1.1 3-(2'- チオピリジル )- メルカプトプロピオニルグルタミン酸および O,O'- ビス (2- アミノエチル ) ポリ ( エチレングリコール )6000 、または O,O'- ビス (2- アミノエチル ) ポリ ( エチレングリコール )3400 (ジアミノ -PEG-3400 ;フルカ社)からのコポリマーバックボーンの調製
この場合、一般式Iにおいて:
W=Y=NH、である;
式中、
X=3-メルカプトプロピオニルグルタミン酸、すなわちリンカー部分3-(2'-チオピリジル)-メルカプトプロピオン酸のグルタミン酸へのカップリングによって誘導したi)の場合のアミノ酸誘導体;
したがって、Zは省略される(m=0)。
【0089】
a) 3-メルカプトプロピオン酸と2,2'-ジチオジピリジンとの反応(1);
DPTP 1 g(フルカ社)を無水エタノール(メルク社(Merck)4 mlに溶解した。トリエチルアミン(アルドリッチ社(Aldrich)))100 μlを加えた後、3-メルカプトプロピオン酸87 μl(1 mmol)を加えた。1時間後、反応混合物を少量ずつ逆相HPLCによって分離した:調製的C18-カラム(バイダック(Vydac))、218TP1022)、流速25 ml/分、0.1%トリフルオロ酢酸、0〜40%アセトニトリルを24分、40〜100%アセトニトリルを5分、100%アセトニトリルを5分。生成物のピークは、約20%アセトニトリルで溶出された。生成物の画分をプールして凍結乾燥した。
【0090】
本発明プロトコールの変法において、RP-HPLC精製を行う前に、攪拌しながら水を徐々に加えることによって過剰量のDTDPを沈殿させる。沈殿物をエタノール中で2回再溶解させて、水を加えて再沈殿させた。合わせた水相を上記のようにRP-HPLCによって精製する。
【0091】
b) 3-(2'-チオピリジル)-メルカプトプロピオニル-グルタミン酸(2b)の合成:
a)において得られた生成物1(図1を参照:0.5 mmol)をジクロロメタン25 mlに溶解した。グルタミン酸-ジ-t-ブチルエステル(Glu(OtBu)OtBu、バケム社(Bachem))、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(アルドリッチ社)、N-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(アルドリッチ社)およびジイソプロピルエチルアミン(アルドリッチ社)各1 mmolを氷中で攪拌して冷却しながら50 mlポリプロピレンチューブに段階的に加えた。反応の48時間後、混合物をロータリーエバポレーターによって油性残査まで濃縮した。残査を酢酸エチル20 mlに溶解した。この溶液を0.5 M塩酸によって、飽和炭酸水素ナトリウム溶液および飽和塩化ナトリウム溶液によってそれぞれ2回抽出した。有機層をロータリーエバポレーターによって油性残査まで濃縮して、高真空下で一晩乾燥させた(生成物2a:図1を参照)。t-ブチル保護基を除去するために、生成物2aをさらに精製せずにジクロロメタン:トリフルオロ酢酸(2:1)30 mlに再溶解して、室温で2時間攪拌した。溶液をロータリーエバポレーターで油性残渣になるまで濃縮し、その後氷冷エーテルで洗浄した。高真空下で乾燥させた後、生成物を100 mM HEPES、pH 7.4に溶解して、少量ずつRP-HPLCによって精製した(生成物1と同じ条件)。生成物の画分をプールした。生成物2b(図1参照)は、収率270 μmol(全ての段階について27%)で得られた。計算分子量は344.05。実際の分子量は345.0(MH+)であった。
【0092】
c1) ピリジル-(2-ジチオプロピオニル)グルタミン酸(2b)とO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000(ジアミノPEG-6000:フルカ社)との共重合化
生成物2bをジメチルホルムアミド3 ml(フルカ社)に溶解してジクロロメタンによって20 mlに希釈した。この溶液5 ml(67.5 μmol)を、ジアミノ-PEG-6000 506 mg(84 μmol、1.25等量に相当;フルカ社)、ジシクロヘキシルカルボジイミド30 mg(135 μmol、2等量、1 M DMF溶液135 μl)およびジメチルアミノピリジン2 mg(0.25等量、1 M DMF溶液)と共に段階的に混合した。2時間後、ニンヒドリンアッセイ法のために10μlを採取したところ、ごくかすかな青色染色を示した。攪拌しながら−20℃に冷却後、粗生成物3(図1参照)をt-ブチル-メチルエーテルとの反応混合からの沈殿によって得た。生成物を真空で乾燥させた。一部を水に溶解して、不溶性残査を濾過によって除去した後ゲル濾過によって精製した(ウルトラフリーMC、ミリポア社)。この目的のため、製造元の指示に従って、XK16/40カラム(ファルマシア社)にスーパーデックス75(ファルマシア社)を充填した。粗生成物各20 mgのアリコットを20 mM HEPES、pH 7.3を溶出剤として流速1 ml/分で精製した。主画分は、先行する明らかに分離された高分子量画分の後に、見かけの分子量40.000 Daで溶出し、これを個々に回収した。
【0093】
c2) ピリジル-(2-ジチオプロピオニル)-グルタミン酸(2b)とO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400(ジアミノPEG-3400:フルカ社)との共重合化(生成物4;図1参照)
生成物4は、生成物3と同じセットアップおよび精製法によって得た。生成物をゲル濾過後、見かけの分子量22.800 Daで溶出する(副画分は64 kDの生成物、全体の14%、および46 kDaの生成物、全体の32%であった)主な画分(全ての画分の54%)として単離した。
【0094】
コポリマーバックボーンを生じる合成段階a)〜c)の反応スキームを図1に示す:3-メルカプトプロピオン酸を2,2'-ジチオジピリジンと反応させる。生成物(1)をカルボキシル保護グルタミン酸(生成物2a)とカップリングさせる。t-ブチル保護基を切断した後、3-(2'-チオピリジル)-メルカプトプロピオニル-グルタミン酸(2b)が得られ、これをO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000またはO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400と共にDCC活性化の下で共重合させた。この手順によって生成物3および4をそれぞれ生じる。
【0095】
1.2 ペプチド合成
ペプチドは、アプライドバイオシステムズ社(Applied )431Aペプチドシンセサイザーを用いてFastMoc(登録商標)プロトコールに従って合成した。
【0096】
i) ペプチドYE5C(配列[Ac-YEEEEE]2-ahx-C)は、保護基トリチル(システイン)、ジ-Fmoc(リジン)、およびO-t-ブチル(グルタミン酸)を用いるシステインローディングクロロトリチル樹脂330 mg(0.5 mmol/g;バケム社)を用いて合成した。保護アミノ酸各1 mmolを用いた。分岐点(リジン)後、二重カップリングを行った。N末端のアセチル化は、2 mmolジイソプロピルエチルアミンの存在下で2 mmol無水酢酸のN-メチルピロリドン溶液2 mlを用いて樹脂をカップリングしたペプチド上で実施した。ペプチドは、樹脂から切断した後、粗生成物として得て(水500 μl、チオアニソール500 μl、エタンジチオール250 μlのトリフルオロ酢酸溶液10 ml)、ジエチルエーテルによって沈殿させた。粗生成物は、100 mM HEPES pH 7.9に溶解して、潅流クロマトグラフィーによって精製した(ポロス20 HQ、ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)社、4×100 mm PEEKカラムに充填、0〜0.5 M NaCl8分、流速10 ml/分)。50 mM燐酸ナトリウム緩衝液の6 M塩酸グアニジニウム溶液中でのペプチドの280 nmでの吸光度係数は、2560 M-1cm-1である(ギルおよびフォンヒッペル(Gill and von Hippel)、1989)。
【0097】
ii) ペプチドINF7
は、クロロトリチル樹脂(0.5 mmol/g)上で同じ方法に従って合成し、YE5Cについて記述したように、樹脂から切断して、ジエチルエーテルによって沈殿させた。粗生成物を真空下で乾燥させた。各20 mgのアリコットを1 M炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液pH 8 500 μlに溶解して、ゲル濾過によって精製した(ファルマシア社のセファデックスG-10をファルマシア社のHR10/30カラムに充填。流速1 ml/分。溶出剤:20 mM HEPES pH 7.3/150 mM NaClまたは100 mM TEABまたは100 mM炭酸水素アンモニウム)。吸光度係数:278 nm 12600;279 nm 12665;280 nm 12660 M-1cm-1。
【0098】
iii) ペプチドSFO29-ahx(配列K2K-ahx-C)を同様に合成し(500 mg Fmoc-Cys(Trt)-クロロトリチル樹脂、バケム社;0.5 mmol/g)、標準的な方法に従って精製した(溶出剤として0.1%TFAを用いるセファデックスG10;逆相HPLC、0.1%TFA-アセトニトリル勾配)。分岐点でのリジンは、α,ε-ジ-Fmoc-L-リジンであり、その後のリジンはα-Fmoc-ε-Boc-L-リジンであった。
【0099】
iv) ペプチドE4E(配列、[EEEE]2KGGE)は、類似のように合成した。合成規模:0.25 mmol Fmoc-Glu-(OBzl)-クロロトリチル樹脂。樹脂のローディングは、塩化O-クロロトリチル樹脂(アレクシス(Alexis))の対応する量の無水ジクロロメタン懸濁液によって行い、Fmoc-Glu-(OBzl)OHおよびジイソプロピルエチルアミン各2等量を混合した。数時間振とうさせた後、樹脂を濾過して、ジメチルホルムアミド、メタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン、およびジエチルエーテルによって数回洗浄した。改変Fmocプロトコールを用いる。N末端アミノ酸は、Boc保護基を有し、配列(E(Boc)[E(tBu)]3)2KGGE(OBzl)OH(E4EPROT)による固相合成から、完全に保護された塩基安定性のペプチド誘導体を生じた。
【0100】
樹脂からの切断は、室温でジクロロメタン/酢酸/トリフルオロエタノール8:1:1で実施した。C末端グルタミン酸のベンジルエステル保護基は、標準的な方法に従って活性炭上でH2/パラジウムによって選択的に除去した。
【0101】
ペプチド塊は、ペプチドの同一性を確認するエレクトロスプレー質量分析によって決定した。
【0102】
1.3 コポリマーバックボーンそれぞれ( 4 )および( 5 )へのペプチドのカップリング
C末端システイン含有ペプチドと1.1で得られたコポリマーバックボーンの1.2等量(ポリマー中のチオピリジル基に関して)の20 mM HEPES、pH 7.4溶液を混合して室温で15時間振とうまたは攪拌する。
【0103】
用いる等量の決定に関して、使用可能なチオピリジルカップリング部位は、希釈したポリマー溶液と2-メルカプトエタノールとを反応させ、その後放出された2-チオピリドンの波長342 nmでの吸光度を測定することによって決定する。システイン含有ペプチドの遊離のチオール基の濃度は、ランバート・ベール法に従って波長412 nmでエルマン試薬によって決定する。
【0104】
放出されたチオピリドンの342 nmでの吸光度によって決定される反応が完了した後、反応混合液の容量を減少させて、生成物をゲル濾過によって分画した(スーパーデックス75、ファルマシア社)。
【0105】
1.3.1 コポリマーP3YE5Cの調製
システインチオールと3-メルカプトプロピオニル-グルタミン酸基とのジスルフィド架橋によってカップリングした分岐ペプチドYE5C、配列(YEEEEE)2K(ahx)Cを用いた。
【0106】
a) コポリマーP3YE5Cは、生成物(4)の画分3(22.800 Da)と精製ペプチドから調製した。生成物として、見かけの分子量35.000 Daの化合物が得られた。用いたペプチドとコポリマーバックボーンの分子量に関して、このことは、p=6の重合の程度を意味する(6反復単位)。
【0107】
b) コポリマーP6YE5Cは、生成物(3)の画分3(40.200 Da)および精製ペプチドから調製した。生成物として見かけの分子量55.800 Daの化合物が得られた。重合度は約7である。
【0108】
1.3.2 コポリマーP3INF7の調製
エンドソーム溶解ペプチドINF7を用いて、3-メルカプトプロピオニルグルタミン酸基にシステインチオールのジスルフィド架橋によってカップリングする。
【0109】
a) コポリマーP3INF7は、生成物(4)の画分3(22.800 Da)と精製インフルエンザペプチドとから調製した。
【0110】
b) コポリマーP6INF7は、生成物(3)の画分3(40.200 Da)と精製インフルエンザペプチドINF7とから調製した。
【0111】
1.3.3 受容体リガンド改変(「ラクトシル化」)コポリマーの調製
ラクトシル化ペプチドSFO29-ahx1容量と分岐ペプチドYE5C9容量を用いて、これをシステインチオールのジスルフィド架橋によって3-メルカプトプロピオニルグルタミン酸基にカップリングした。コポリマー(4)および(5)をそれぞれ3.32 μmol(固有のチオピリジル基に関して)を20 mM HEPES pH 7.4に溶解して、ラクトシル化SFO29-ahx 500 nmolおよびペプチドYE5C 4.48 μmolのHEPES緩衝液での混合液1.1mlと共にインキュベートした。これは、使用可能なチオピリジル基に対してペプチドからの遊離のチオール基の1.5倍過剰に相当する。総ペプチドにおけるラクトシル化ペプチドは10%である。反応は一晩定量的に進行した。生成物を記載のようにゲル濾過によって精製した(スーパーデックス75)。
【0112】
1.3に従ってコポリマーバックボーンにカップリングしたペプチドの反応スキームを図2に示す。遊離のチオール基を有するペプチドを生成物(3)または(4)にそれぞれ、例えばペプチドINF7(左)またはペプチドYE5Cにカップリングさせる。これによって、生成物P3INF7 O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400)、P6INF7 O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000)を生成し、同様にP3YE5CおよびP6YE5Cを生成する。
【0113】
実施例2:コポリマーバックボーンFmoc-6-アミノヘキサノイルグルタミン酸および O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000(ジアミノ-PEG-6000;フルカ社)、または O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400(ジアミノ-PEG-3400;フルカ社)の調製
この場合、一般式Iにおいて:
W=Y=NH;X=Fmoc-6-アミノヘキサノイル-グルタミン酸である。
【0114】
これは、i)のXがFmoc-6-アミノヘキサン酸のグルタミン酸へのカップリングによって得られるアミノ酸誘導体であることを意味する。イフェクター分子Eのカップリングに関して、Zは省略することができ、またはSPDPもしくはEMCSのような二官能リンカーとなりうる。
【0115】
ポリマーバックボーンとのカップリングに適したイフェクターは、タイプE4EPROT(Zは省略)またはYE5Cタイプのペプチドとなりうる。後者の場合、ペプチドは、システインチオールによってリンカー分子Zと反応する(SPDPまたはEMCSのように)。
【0116】
a) ジ-ペプチドFmoc-6-アミノヘキサン酸-GluOH(6)の合成:
Fmoc保護6-アミノヘキサン酸(2.82 mmol)1 g、Glu(OtBu)OtBu 1.2等量、および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール1.2等量をジクロロメタン200 mlに溶解する。0℃に冷却した後、N-エチルN'-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド1.2等量およびジイソプロピルエチルアミン1.7 mlを混合物に加えた(pH=8)。0℃で1時間後、混合物を室温で18時間攪拌した。溶媒を蒸留によって完全に除去し、残査を酢酸エチルに溶解して0.5 N塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム溶液および飽和塩化ナトリウム溶液によって抽出した。溶媒を蒸発させた後、凍結乾燥させるとFmoc-6-アミノヘキサノイル-Glu(OtBu)OtBu(5)が生成された。
【0117】
ジ-t-ブチル保護誘導体(5)を30 mlのジクロロメタン/トリフルオロ酢酸2:1に溶解して、室温で1時間攪拌した。反応が完了すると(逆相HPLCによって評価)、溶媒を初回容量の約5%に濃縮した。生成物(6)は、ジエチルエーテルからの沈殿によって生成した。最終精製は、アセトニトリル/水/0.1%TFA勾配によるRP-HPLCによって実施した。
【0118】
b) Fmoc-6-アミノヘキサン酸-GluOH(6)のO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400'(ジアミノ-PEG-3400、フルカ社)との共重合、生成物(7):
10 mg(6)、O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400' 1.5等量、ジシクロヘキシルカルボジイミド2等量、および4-(ジメチルアミノ)-ピリジン 0.25等量をジクロロメタン5 mlに溶解する。室温で30分攪拌してその容積を減少させた後、溶液を濾過して蒸留によって溶媒を完全に除去した。残査を水500 μlに懸濁して、凍結乾燥した。
【0119】
Fmoc保護基(20%ピペリジンのジメチルホルムアミドまたはジクロロメタン溶液)をポリマーから除去した後、標準的なペプチドカップリング化学によって、遊離のC末端を示す任意のペプチドとコポリマーを結合させることができる。
【0120】
実施例3:保護ペプチドE4EPROTからのコポリマーバックボーンおよび O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000(ジアミノ-PEG-6000;フルカ社)、または O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400(ジアミノ-PEG-3400;フルカ社)の調製
この場合、一般式Iにおいて:
W=Y=NHであり;X=分岐ペプチドE4EPROTである。
【0121】
本実施例において、i)のポリ陰イオン性ペプチドXは、イフェクターを表す。したがって、ZおよびEを省略する(m=n=0)。
【0122】
E4EPROTのO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000'(ジアミノ-PEG-6000、フルカ社)(8)との共重合;
E4EPROT 50 μmol、O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000' 1.5等量、ジシクロヘキシルカルボジイミド2等量、および4-(ジメチルアミノ-)ピリジン0.25等量をジクロロメタン10 mlに溶解した。4℃で4時間攪拌して、濃縮した後、溶液を濾過してから蒸留によって溶媒を完全に除去した。残査を水500 μlに懸濁して凍結乾燥した。
【0123】
残りの酸不安定性側鎖保護基を切断するために、5%までのスカベンジャー(好ましくは、エタンジチオール、トリエチルシラン、チオアニソール)を含むトリフルオロ酢酸を文献に記載された方法に従って加えて、2時間攪拌した。粗生成物をジエチルエーテルからの沈殿によって単離した。最終精製は、上記のようにゲル濾過(スーパーデックス75、ファルマシア社)によって実施した。
【0124】
図3は、反応スキームを示す。完全に保護されたペプチドE4EPROTのC末端グルタミン酸のカルボキシレート1上のベンジル保護基を、選択的に活性炭上のH2/パラジウムによって選択的に切断する。生成物をDCC活性化によってO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000またはO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400と共重合する。最終段階において、N末端に配置されたグルタミン酸の保護基をTFAのDCA溶液によって切断する。
【0125】
実施例4:補体活性化試験
アッセイ法は、本質的にプランクら(Plank、1996)が記載したとおりに実施した。
【0126】
a) コポリマーP6INF7を有するおよび有しないポリリジン-DNA複合体:
ポリリジン(平均側鎖170;シグマ社)-DNAは、pCMVLuc 64 μgのHBS溶液800 μlをpL 256 μgのHBS 溶液800 μlに加えて、ピペッティングによって混合することによって保存溶液として調製した。これは、計算荷電比6.3に相当する。陽性対照として、ポリプレックスのこの懸濁液各50 μlを、96ウェルプレートのカラム1 A-Fに加え、GVB2+緩衝液100 μlと混合した。他の全てのウェルにGVB2+緩衝液50μlを加えた。プランクら(Plank、1996)に記載のように100 μlをカラム1からカラム2等に移した。
【0127】
さらに、ポリリジン-DNA保存溶液各350 μlをポリマーP6INF7の35 nmol、70 nmol、および105 nmol(INF7部分を指す)と混合して、15分インキュベーションの後、GVB2+緩衝液によって1050 μlに希釈した。得られた懸濁液各150 μlを、96ウェルプレートのカラム1、列A〜Fに分配した。GVB2+緩衝液での一連の1.5倍希釈および補体活性化アッセイの残りは、上記のように、そしてプランクら(Plank、1996)が記載したように実施した。
【0128】
カラム1の成分の最終濃度はDNAに関して2/3 μg、pLに関して8/3 μg、および総容積200 μlあたりポリマーに関して0 nmol、5 nmol、10 nmol、15 nmol(INF7と呼ぶ)である。
【0129】
b) コポリマーコーティングを有するおよび有しないPEI-DNA複合体による補体の活性化:
アッセイ法は以下のように実施した:
PEI(25 kD、アルドリッチ社)-DNA複合体は、DNA溶液(20 mM HEPES pH 7.4において80 μg/ml)およびPEI溶液(20 mM HEPES、pH 7.4において83,4 μg/ml)の等量を合わせることによって調製した。過剰量の未結合PEIを除去するために、DNA複合体をセントリコン-100フィルターチューブ(ミリポア社(Millipore))において350×gで15分間を3回遠心した。遠心の間、試験管に20 mM HEPES pH 7.4を当初の容積まで満たした。最終遠心段階の後、DNA濃度300 μg/mlに対応するDNA複合体保存溶液が得られた。この溶液182 μlのアリコットを20 mM HEPES pH 7.4によって2520 μlに希釈した。各610 μlのアリコット(各DNA 13.2 μgに相当)をピペットで採取して、P6YE5Cの20 mM HEPES pH 7.4溶液277.6 μlに加えた。得られた溶液を5 M NaClによって塩濃度150 mMに調節した。得られた溶液各150 μlを96ウェルプレートのカラム1、A〜Fに移した。GVB2+緩衝液での一連の希釈を記載のように実施した(プランク(Plank)ら、1996)。
【0130】
同様にして、より高い濃度のPEI-DNA複合体(86 ng DNA/μl)各610 μlをポリマーP3YE5Cの溶液各277.6 μlと共にインキュベートした。溶液は用いたDNA量に対するペプチドYE5Cの0、1、2、3荷電等量を含んだ。15分後、5 M NaCl各27.45 μlを加えた(総量915 μlが得られる)。得られた溶液各150 μlを96ウェルプレートのカラム1、列A〜Fに移した(これは、DNA 8.6 μgおよびPEI各9μgに対応する)。GVB2+緩衝液における一連の希釈および残りのアッセイ法はpL-DNAに関して先に記述したように実施した。
【0131】
補体活性化アッセイ法の結果を図4に示す。
【0132】
A) コポリマーP6INF7の存在下および非存在下におけるポリリジン-DNA複合体による補体の活性化
CH50値は、アッセイ法のセットアップにおいてヒツジ赤血球の50%溶解を生じる特定の血清希釈を指す。CH50maxの値は、無処置のヒト血清について得られる特定のCH50値を意味する。本明細書に記載の実験セットアップにおいて、ヒト血清を遺伝子ベクターと共にインキュベートした。このように処理した血清について得られたCH50値は、遺伝子ベクターが補体カスケードを活性化する場合にはCH50maxより低い。データはCH50maxの百分率として示す。ポリリジン-DNA複合体について認められた強い補体活性化は、コーティングポリマーP6INF7によって完全に阻害されうる。
【0133】
B) 遊離型またはポリマー結合型であるペプチドINF7自身の補体活性化は弱い。 ポリリジン-DNA複合体に組み入れられると、この補体活性化は消失する。
【0134】
C) コポリマーP3YE5Cの存在下でのPEI-DNA複合体(N/P=8)による補体の活性化
保護されていないDNA複合体は、補体系の強い活性化因子である。コポリマーP3YE5Cは、コポリマーの加えた量に依存して補体活性化を減少させるが、調べた範囲では完全な保護には至らない。
【0135】
D) 対照的に、コポリマーP6YE5Cは、少量加えた場合でも補体活性化に対して完全に保護する。
【0136】
実施例5:赤血球溶解アッセイ法
アッセイ法は、ペプチドが、pH依存的に天然の膜を溶解できるか否かを調べる検査となる。
【0137】
本アッセイ法において用いた赤血球は、以下のように得た:新鮮血液をボランティアから採取して、直ちにアルセバー溶液10 mlに希釈した(ホエイレー(Whaley)、1985;プランク(Plank)ら、1996)。各3 mlのアリコットを対応する緩衝液(クエン酸またはHBS各40 ml;緩衝液を加えた後、振とうして、2500×gで遠心し、上清を捨てる)。赤血球の濃度は、541 nmでの「吸光度係数」2.394×10-8 ml/個によって測定する。吸光度係数を得るため、アリコットにおける細胞数を、ノイバウエル計算盤を用いて決定した後、1%トライトンX-1001μlを加えて、この溶液の541 nmでの吸光度を測定した。
【0138】
INF7とコポリマーカップリングしたINF7(P3INF7)のアリコットをそれぞれ96ウェルプレートのカラム1に、それぞれ10 mMクエン酸ナトリウムpH 5/150 mM NaCl 150 μlおよびHBS緩衝液に加えた(通常、45 μmolペプチドに対応する)。他の全てのウェルに緩衝液各150 μlを加えた(それぞれクエン酸およびHBS)。多チャンネルピペッターを用いて100 μlをカラム1からカラム2に移し、ピペッティングによって混合した。100 μlをカラム2からカラム3に移して同様にした。カラム11の余剰物100μlは廃棄して、カラム12は緩衝液のみを含む、得られた一連の1.5倍希釈液を緩衝液各50 μlによって100 μlに希釈した(それぞれ、クエン酸およびHBS)。次に、3×106個ヒト赤血球をそれぞれ加えて、プレートをパラフィンによって密封してインキュベーターシェーカー(シリーズ25インキュベーターシェーカー;ニューブランズウィックサイエンティフィック社(New Brunswick Scientific Co.)、ニュージャージー州、アメリカ)で400 rpmで37℃で1時間振とうする。次に、プレートを2500×gで遠心し、上清各150 μlを平底96ウェルプレートに移して、放出されたヘモグロビンをELISAプレートリーダーを用いて410 nmで測定した。100%溶解は、1%トライトンX-1001μlをカラム12(平底プレートに移す前)の個々のウェルに加えることによって決定した。0%溶解は、カラム12における無処置の試料から決定した。
【0139】
赤血球溶解アッセイ法の結果を図5に示す:ペプチドINF7は、強いpH依存的活性を示す。コポリマーP3INF7の合成に関して、4つの分画(分子量が小さくなる順に1〜4)をクロマトグラフィーによる分離(スーパーデックス、ファルマシア社(Pharmacia))によって単離した。これらのうち、画分2と3は、遊離のペプチドINF7より高い溶解活性を示した。全ての場合について、溶解活性は厳密にpH依存的であり、すなわち、中性pHでは溶解を認めなかった(示していない)。
【0140】
実施例6:動的光散乱と電子顕微鏡によるDNA複合体の大きさの決定
PEI-DNAポリプレックスの調製とポリマーコーティングの適用:DNA (pCMVLuc)各40 μgの20 mM HEPES pH 7.4溶液333 μlをピペットで採取してPEI(25 kD、アルドリッチ社)41.7 μgのHEPES pH 7.4溶液333 μlに加えて混合した。10〜15分インキュベートした後、ポリマーP3YE5CおよびP6YE5Cのそれぞれ0、0.5、1、1.5、2荷電等量または3荷電等量のHEPES溶液各333 μlを加えた(または、第二の実験では0、1、2、3等量および5等量)。ペプチドYE5Cについて述べると、これはDNA1μgあたりポリマー0 pmol、152 pmol、303 pmol、455 pmol、606 pmol、または909 pmolに相当する。DOTAP/コレステロール-DNA複合体はDOTAP/コレステロール(1:1mol/mol)リポソームの20 mM HEPES pH 7.4溶液330 μlおよび等量のDNAから荷電比5で調製した。リポプレックスをコポリマーP3YE5C0、1、2、3、および5等量の緩衝液溶液330 μlと共にインキュベートした。複合体の最終DNA濃度は10 μg/mlであった。
【0141】
DNA複合体の大きさは、ポリマーを添加した後直ちに動的光散乱(ゼータマスター3000、マルベルンインストルメンツ社(Malvern Instruments))によって測定し、その後数時間の間様々な時点で測定した。また一方、大きさはエルバッヒャーら(Erbacher、1998)およびエルバッヒャーら(Erbacher、1999)に記載のように、電子顕微鏡によって測定した。
【0142】
図6は、コポリマーP3YE5Cの存在下でのPEI-DNA複合体(N/P=8)の電子顕微鏡写真を示す。
【0143】
A) コポリマーの1荷電等量(用いたDNAの荷電に関する)の存在下
粒子の大きさは20〜30 nmである。
【0144】
B) コポリマーの2荷電等量の存在下
粒子の大部分は大きさ約20 nm付近を示す。これらは単分子DNA複合体である、すなわち、プラスミド分子1個が粒子1個にパッケージングされている。
【0145】
C) BSAを最終濃度1 mg/mlとなるように加えた後のコポリマーの1.5荷電等量の存在下で一晩インキュベーション
コポリマー保護DNA複合体は、同じ条件で直ちに沈殿する保護されていないPEI-DNA複合体とは対照的に、安定なままであり、凝集しない(示していない)。
【0146】
実施例7:DNA複合体のゼータ電位の測定
マルベルン機器を用いて、実施例6と同じ試料にゼータ電位測定を行った。屈折指数、粘度、および誘電率のパラメータは、脱イオン水の値に設定し、これは概算としての場合に限って有効である。
【0147】
図7は、加えたコポリマーP3YE5Cの量に依存したPEI-DNA複合体およびDOTAP/コレステロール-DNA複合体のゼータ電位を示す。複合体の表面電荷の測定値であるゼータ電位は、加えたコポリマーの量を増加させると高度の正から中性を越えて、わずかに負に低下した。これは、コポリマーがDNA複合体に結合して、その静電気的電荷を中和または遮蔽していることを示している。
【0148】
実施例8:DNA複合体の調製とトランスフェクション
細胞培養とトランスフェクション実験の以下の実施例に関して、特に明記していない限り以下の材料および方法を用いた:
【0149】
a) 96ウェルプレートでの細胞培養における遺伝子移入
トランスフェクション前の当日に接着細胞を平底プレートに20,000〜30,000個/ウェルの密度で播種する(細胞分裂速度に応じて。細胞はトランスフェクションの間70〜80%コンフルエントであるべきである)。
【0150】
トランスフェクション前、培地を吸引によって除去する。トランスフェクションのために、培地150 μlを細胞に加えて、次にDNA複合体50 μlを加える。
【0151】
b) DNA複合体の組成:好ましくはDNAの最終濃度1μg/ウェル
計算は必要量の1.2倍に関して行う。1成分(DNA、PEI、ポリマー)あたり容量20 μlを用いる。最後に、DNA複合体50 μlをトランスフェクションに用いる。緩衝液:20 mM HEPES pH 7.4/150 mM NaCl=HBS。用いた緩衝液の容量は一定である。
【0152】
個々の実験96個についてDNA複合体を必要とする場合、計算は例えば、個々の実験100個を行うように計算すると適当である:
DNA:HBS 20×100 μl=総容量2 ml中に1μg×100×1.2=120 μg。
【0153】
ポリエチレンイミン(PEI):N/P比8を得るために、以下の式による計算は:
【数1】
PEI 125.09 μgが必要であることを示し、総容量は20×100 μl=2 ml HBSである。
【0154】
コーティングポリマー:この場合、例えば、コーティングポリマーを上記のDNAおよびPEI量に関して2荷電等量(DNAに関して)の量で用いる場合、濃度11.1 μmol/mlでのコーティングポリマーの必要量は、以下の式に従って:
【数2】
は、
【数3】
であり、これも同様にHBSによって2 mlに希釈する。
【0155】
これは、DNA各1μgを用いる実験100回の例である。通常、実験約5回を実施し、例えば、N/P比は4、5、6、7、8でコーティングポリマーの各0、1、2、3荷電等量を調べる。
【0156】
c) DNA複合体の混合:
必要な希釈を調製した後、DNAを激しく攪拌しながらPEIに加える。15分後、あらかじめ形成されたPEI-DNA複合体にコーティングポリマーを加え、再度激しく攪拌する。さらに30分後、DNA複合体各50 μlを、培地150 μl中に存在する細胞に加える。
【0157】
用いた容器のタイプは、計算された総容積に依存する。上記の例において、PEIは、14 mlのポリプロピレンチューブ(例えば、ファルコン2059)において提供されることが適しているが、他の2つの成分は、6mlチューブ(例えば、ファルコン2063)で提供される。96ウェルにおける個々の実験に関して、成分はまた96ウェルにおいて混合することができる。最終容量が1〜1.5 mlの場合、エッペンドルフチューブが適している。激しく攪拌する代わりにマイクロピペットを混合のために用いることができる。
【0158】
3cmディッシュへの変換(6ウェルプレート):
3cmディッシュの場合、DNA量2〜5μgを用いることが適しており、成分あたりの容量は例えば各100 μlである。計算は、上記と同様にして行う。12ウェルプレートの場合、アッセイあたりDNA約1 μgを用いることが適している。
【0159】
図8は、DNA複合体の調製を略図で示す:好ましくは、ポリカチオンをまずプラスミドDNAと共にインキュベートして、正電荷を持つDNA複合体(例えば、PEI、N/P=8)を形成する。次に、負電荷を持つコポリマーを加え、これはあらかじめ形成された複合体に静電気的に結合する。コポリマーは、アステリスクによって示すように(右)、受容体リガンドによって改変することができる。
【0160】
d) ルシフェリン基質緩衝液
ルシフェリン基質緩衝液として、60 mMジチオスレイトール、10 mM硫酸マグネシウム、1 mM ATP、30 μM D-(-)-ルシフェリンの25 mMグリシル-グリシン緩衝液溶液pH 7.8を用いた。
【0161】
e) 細胞溶解物における蛋白質定量
溶解物の蛋白質含有量は、バイオラッド(Bio-Rad)蛋白質アッセイ法(バイオラッド社)を用いて測定した:溶解物10 μl(または5μl)に、透明な96ウェルプレート(「平底」タイプ、ヌンク社(Nunc)、デンマーク)の1ウェルあたり、蒸留水150 μl(または155 μl)およびバイオラッド蛋白質アッセイ色素濃縮物40 μlを加えた。吸光度は、吸光度リーダー「バイオルミン690」およびコンピュータープログラム「Xペリメント」(いずれもモレキュラー・ダイナミクス社(Molecular Dynamics)、アメリカ)を用いて630 nmで測定した。標準曲線として、濃度50、33.3、22.3、15、9.9、6.6、4.4、2.9、2.0、1.3、0.9ng BSA/μl、および0 ng BSA/μlを測定した。ウシ血清アルブミン(BSA)は、バイオラッド蛋白質アッセイ標準物質IIとして購入した。このように、結果は最終的に蛋白質1 mgあたりのルシフェラーゼのpgとして表記しうる。
【0162】
実施例9:コポリマーP3YE5Cの存在下および非存在下でのPEI(25 kD)-DNA複合体によるK562細胞への遺伝子移入
K562細胞(ATCC番号 CCL243)は、37℃で5%CO2大気中で、10%FCS、100単位/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシンおよび2 mM グルタミンを添加したRPMI-1640培地において培養した。トランスフェクション前の夕方、デスフェロキサミンを最終濃度10 μMとなるように加えた。トランスフェクションの直前に、培地を交換した。培地各160 μl中に細胞50,000個を96ウェルプレートのウェルに播種した。トランスフェリン-PEI(hTf-PEI 25 kD)を、本質的にカーチェイスら(Kircheis、1997)が記載した通りに還元的アミノ付加によって調製した。PEI分子1個あたりトランスフェリン分子を平均で1.7個をカップリングした生成物が得られた。
【0163】
予備実験において、高いトランスフェクションを生じ、受容体リガンドの影響を明らかに示すhTf-PEIポリプレックスの組成物を決定した。
【0164】
hTf-PEI(32.4 μg:量はhTfを指す)のHBS溶液 600 μlをPEI(25 kD)36 μgのHBS溶液600 μlと合わせた。DNA(pCMVLuc)40 μgのHBS溶液600 μlをピペットによって採取してこの混合物に加えて、混合した。15分後、得られた溶液270 μlをポリマーP3YE5CのHBS溶液またはHBSのみの各90 μlにそれぞれ加えた。これらの溶液は、適用したDNAの荷電に関して0/0.5/1/1.5/2/3荷電等量を含むポリマー量を含んだ。同様にして、PEIの等量(DNA 40 μg+PEI 42 μg+コーティングポリマー)によってhTfを有しないDNA複合体を調製した。得られた混合物各60 μl(DNA1μg/ウェルの量に相当)を丸底96ウェルプレートのウェル5個のそれぞれに加えて、K562細胞50,000個のRPMI培地160 μlをそれぞれ加えた。24時間後、細胞を遠心によって沈降させた。上清を吸引によって除去して、溶解緩衝液(250 mMトリスpH 7.8;0.1%トライトンX-100)100 μlを加えた。15分間インキュベートして、ピペッティングによって混合した後、96ウェルプレートのフォーマットでルシフェラーゼアッセイを行うために、試料各10 μlを不透明なプレート(コスター社(Coster))に移した。試料にルシフェリン基質緩衝液100 μlを加えた。光放出の測定は、マイクロプレートシンチレーションおよびルミネッセンスカウンター「トップカウント」(キャンベラ・パッカード社(Canberra-Packard)、ドライアイヒ)を用いて実施した。計数時間は12秒間であり、計数の遅延は10分、バックグラウンド計数は自動的に差し引いた。標準物質として、各ルシフェラーゼ100、50、25、12.6、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39、0.2、0.1、0.05、0.025、0.013、0.007 ng、および0 ngの溶解緩衝液溶液(連続2倍希釈)各10 μlを同じ条件で測定した。較正曲線はこれらの測定から得られた。
【0165】
図9は、コポリマーP3YE5Cを付加した場合の、受容体リガンドとしてのトランスフェリンの存在下および非存在下でのK562細胞におけるPEI-DNA複合体(N/P=8)による遺伝子移入実験の結果を示す。コポリマーは、遺伝子移入を妨害せず、受容体リガンドがDNA複合体に存在する場合にはその改善でさえも示す。細胞抽出物における総蛋白質含有量に対して標準化したルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を示す(1試料あたり3個の平均値および標準偏差)。
【0166】
実施例10:コーティングポリマーP3INF7の存在下および非存在下でのポリリジン-DNA複合体による乳癌細胞株MDA-MB435Sのトランスフェクション
MDA-MB435S細胞(ATCC??ヒト乳癌細胞株)を37℃で5%CO2大気中で、10%FCS、100単位/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシンおよび2 mM グルタミンを添加したDMEM培地において培養した。トランスフェクション前の夕方、細胞を平底96ウェルプレートに1ウェルあたり20,000個の密度で播種した。
【0167】
DNA複合体は以下のように調製した:
1ウェルあたりの計算:得られるDNAの量は、HBSの総量60 μl中に1μg/ウェルであり、pL170の量は4μgである。この量を1.2倍した。DNA複合体は、下記の表に示すように混合して、最初にDNAをポリリジンに加えて、15分後、この混合物をポリマーP3INF7および緩衝液にそれぞれ加えた。実験は1試料あたり3個ずつ実施した。DNA複合体各60 μlを細胞に加えて、これに培地150 μlを加えた。4時間後、培地を交換した。24時間後、PBSによって洗浄して、溶解緩衝液100 μlを加えて、ルシフェラーゼおよび蛋白質アッセイ法を実施例9に記載のように実施した。
【0168】
図10は、コポリマーP3INF7の存在下および非存在下でポリリジン-DNA複合体によるヒト哺乳類癌細胞株MDA-MB435Sへの遺伝子移入実験の結果を示す。コポリマーの非存在下では、測定可能なレポーター遺伝子発現を認めなかった。コポリマーのpH依存的膜破壊、それによるエンドソーム溶解活性は、効率的な遺伝子移入を生じる。P3INF7の5 nmolおよび10 nmolはそれぞれ、適用したコポリマー結合ペプチドINF7の量を意味する。
【0169】
実施例11:コーティングポリマーの存在下でのリポフェクション(図11)
NIH3T3細胞(ATCC番号 CRL 1658)を37℃で5%CO2大気中で、10%FCS、100単位/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシンおよび2 mM グルタミンを添加したDMEM培地において培養した。
【0170】
トランスフェクション前の夕方、細胞を6ウェルプレートに1ウェルあたり500,000個の密度で播種した。
【0171】
DNA複合体の調製:
DNA 16 μgの20 mM HEPES pH 7.4溶液240 μlに、DOTAP/コレステロールリポソーム242 nmolの同じ緩衝液溶液240 μlを加えた。これによって荷電比(+/-)は5となる。得られた溶液のうち、210 μlをピペットによって採取して、ポリマーP3YE5C6.36 nmolを含む溶液105 μl(ペプチド部分YE5Cに関して;これはDNA3荷電等量に相当する)に加えた。対照実験に関して、DOTAP/コレステロール-DNA 210 μlをピペットで採取して20 mM HEPES pH 7.4 105 μlに加えた。得られたDNA複合体各90 μlを細胞に加え、これを新鮮な培地800 μlによって維持した。これはDNA 2μg/ウェルに相当する。実験は1試料あたり3個ずつ実施した。
【0172】
同じようにして、実験をDOTAP/コレステロールの代わりにリポフェクタミン(Lipofectamin)(登録商標)について実施した。この場合、荷電比7(+/-)を生じるリポフェクタミン(DOSPA)の量を用いた。
【0173】
DNA複合体を添加した30分後、新鮮な培地各1 mlを細胞に加えて、3時間後、さらに2mlを加えた。培地は交換しなかった。複合体を添加した22時間後、細胞をPBSによって洗浄して、溶解緩衝液500 μlによって溶解した。細胞溶解物のアリコットをルシフェラーゼアッセイ法および蛋白質含有量測定に用いた。
【0174】
図11は、コポリマーP3YE5Cの存在下および非存在下でのNIH3T3細胞のリポフェクションの結果を示す。DOTAP/コレステロール-DNAによるトランスフェクションもリポフェクタミンによるトランスフェクションも有意に減少しなかった(コポリマーの3荷電等量。DOTAP/コレステロール-DNAはこの組成物において中性のゼータ電位を示す;図7を参照)。
【0175】
実施例12:P6YE5Cの存在下および非存在下におけるDOTAP/コレステロール-DNAとPEI-DNAによるHepG2細胞のトランスフェクション
HepG2細胞(ATCC HB 8065)を37℃で5%CO2大気中で、10%FCS、100単位/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシンおよび2 mM グルタミンを添加したDMEM培地において培養した。
【0176】
トランスフェクションの2日前、細胞を6ウェルプレートに1ウェルあたり500,000個の密度で播種した。DOTAP/コレステロール-DNAによるトランスフェクションは、今回は、ポリマーP6YE5Cを用いたことを除いては、NIH3T3細胞に関して先に記載した通りに正確に実施した。さらに、DNA7μgのHEPES緩衝液105 μlをピペットで採取して同じ容量に溶解したPEI 25 kD 7,3 μgに加えた。15分インキュベートした後、この溶液をピペットによって採取して、YE5Cの3荷電等量を含むポリマーP6YE5C溶液105 μlに加えた。この溶液各90 μlを細胞に加えた。実験は1試料あたり3個ずつ実施した。
【0177】
図12は、コポリマーP6YE5Cの存在下および非存在下におけるHepG2細胞への遺伝子移入を示す。DOTAP/コレステロール-DNAによるトランスフェクションは、有意に阻害されない。PEI-DNA複合体によるトランスフェクションは減少する(コポリマーの3荷電等量)。
【0178】
実施例13:インビボでの静脈内遺伝子移入
a) 対照(PEI-DNA、N/P=8):
DNA(pLuc)150 μgの20 mM HEPES pH 7.4溶液337.5 μlをピペットによって採取してPEI(25 kD、アルドリッチ社)156.4 μgを同容積のHEPES緩衝液溶液に加えた。15分後、50%グルコース75 μlを加えた。この溶液のうち、各100 μlをマウスの尾静脈に注入した(動物あたりの用量はDNA 20 μgに相当する)。
【0179】
b) 対照(DOTAP/コレステロール-DNA;荷電比+/-=5):
DOTAP-コレステロールリポソームを標準的なプロトコールに従って調製した(バロン(Barron)ら、1998)。この場合、DOTAP対コレステロールのモル比1:1であって、DOTAPの5%グルコース中での最終濃度が5 mMであるリポソームを調製した。DNA 130 μgの20 mM HEPES pH 7.4溶液191.1 μlを、リポソーム懸濁液393.5 μlに加えた。15分後、50%グルコース65 μlを加えた。この溶液のうち、各100 μlをマウスの尾静脈に注入した(動物あたりの用量はDNA 20 μgに相当する)。
【0180】
c) コポリマーコーティングを有するPEI-DNA(N/P=8):
DNA 150 μgの溶液2475 μlを同じ容量のPEI(25 kD)156.4 μgに激しく攪拌しながら加えた。15分後、ポリマーP3YE5C3荷電等量(適用したDNA量の荷電に関して)のHEPES緩衝液溶液2475 μlを激しく攪拌しながら加えた。さらに30分後、DNA複合体をセントリコン30チューブにおいて遠心によって濃縮し、DNA濃度454 μg/mlを得た。次に、50%グルコースおよび20 mM HEPES pH 7.4を加えることによって、この溶液を最終濃度がDNA 200 μg/ml、および5%グルコースとなるように調節した。この溶液のうち、各100 μlをマウスの尾静脈に注射した(動物あたりの用量はDNA 20 μgに相当する)。
【0181】
d) コポリマーをコーティングしたDOTAP/コレステロール-DNA(5:1):
リポソーム懸濁液393.9 μlをピペットによって採取してDNA 130 μgの水溶液65.3 μlに直接加えた。15分後、P3YE5C3荷電等量のHEPES緩衝液216.9 μlを加えて、さらに30分後、5%グルコース75 μlを加えた。この溶液のうち、各115.5 μlをマウスの尾静脈に注射した(動物あたりの用量はDNA 20 μgに相当する)。
【0182】
図13は、インビボ遺伝子移入実験の結果を示す:結合したコポリマーP3YE5C(3荷電等量)を有するおよび有しないPEI-DNA複合体およびDOTAP/コレステロール-DNA複合体をマウスの尾静脈に注射した(n=6)。動物を注射24時間後に屠殺して、臓器におけるレポーター遺伝子の発現を測定した。各時間において、注射部位で最高の活性を測定した。PEI-DNAコポリマーでは、有意なレポーター遺伝子発現を肺および心臓において認めたのに対し、DOTAP/コレステロール-DNAによる肺への遺伝子移入はコポリマーの適用によって阻害された。
【0183】
実施例14:PEI-DNA複合体の立体的安定化
PEI-DNA複合体は実施例6の記載通りに正確に調製した(それぞれ、PEI-DNA、N/P=8、0/1.5/3荷電等量のコポリマーP3YE5CおよびP6YE5C)。複合体の大きさは動的光散乱によって20〜30 nmであると決定された。その後5 M NaClを最終濃度150 mMとなるように加えた。コポリマーを有しないPEI-DNAは、直ちに凝集した(5分後、>500 nmの粒子集団が測定可能であった、15分後では粒子の大部分が>1000 nmであった;複合体は一晩の間に溶液から沈殿した)。P3YE5CまたはP6YE5C(1.5または3荷電等量)の存在下ではそれぞれ、粒子の大きさは少なくとも3日間安定であった。
【0184】
同様に、BSAを最終濃度1 mg/mlとなるように加えると、PEI-DNAは直ちに沈殿した。P3YE5CおよびP6YE5C(1.5荷電等量およびそれ以上)の存在下ではそれぞれ、粒子径は少なくとも24時間安定であった(図6Cも参照のこと)。
【0185】
実施例15:COPROGs(コポリマー保護遺伝子ベクター)をローディングしたコラーゲンスポンジの調製
プラスミドDNA溶液(CMVプロモーターの制御下でルシフェラーゼをコードする、濃度0.5 mg/ml水溶液)各500 μlを、マイクロピペットを用いてポリエチレンイミン溶液(25 kD;アルドリッチ社;521 μg/ml水溶液)各500 μlに加えて、ピペッティングによって直ちに混合した。得られたベクター溶液をPROCOP(「保護コポリマー」)P6YE5Cの水溶液500 μlに加え、直ちにピペッティングによって混合した。PROCOP溶液は、P6YE5C各2荷電等量を含んだ。荷電等量はPROCOP中の(負)電荷とDNAの負電荷の係数を表す。用いられるPROCOPのnmol量を以下の式によって計算する:
【数4】
【0186】
用いられるPROCOPのマイクロリットルでの量は以下の式に従って計算し:
【数5】
式中、CEは、PROCOPの荷電等量であり、CPROCOPはコポリマーの濃度である。ポリマーの濃度はポリマー中の(陰イオン)ペプチドの(負)電荷に関して表し、これは、ペプチドにおけるチロシンの吸光度に基づくペプチド濃度の光分析によって決定する。
【0187】
得られた水性ベクター浮遊液をプールした。ベクター浮遊液各3 mlを、マイクロピペッターを用いて4.5×5 cmのタコトップスポンジに適用した(あらかじめ、市販のスポンジを滅菌ベンチ内でこの大きさの小片に切断して、重量を測定し、ガラスのペトリ皿に入れて提供する)。室温で2〜3時間インキュベートした後、ペトリ皿を短時間、凍結乾燥機(ヘトシックCD4、ヘト社(Heto))の真空に入れて、その後真空チャンバーから通常の圧力に急激に戻す(「真空負荷」)。これによって、スポンジにおける気泡が消失し、スポンジは液体に完全に浸漬する。全体で4時間インキュベートした後、凍結乾燥機で先に凍結せずにスポンジをペトリ皿において一晩乾燥させる。その後スポンジは、実験動物に埋め込むまでパラフィン密封したペトリ皿において4℃で保存した。
【0188】
実施例16:従来の遺伝子ベクターをローディングしたコラーゲンスポンジの調製
(a) 裸のプラスミド DNA のローディング
滅菌条件において、5%グルコース5 mlに溶解したプラスミドDNA 500 μgを、ピペットによって4.5×5 cmのタコトップスポンジに適用した。これは、DNA約20 μg/cm2に相当する。4℃で24時間インキュベートした後、スポンジを凍結乾燥して(凍結乾燥機ヘトシックCD4、ヘト社、真空<10 μバール)、滅菌条件で約1.5×1.5 cmの小片に切断した。その結果、そのようなスポンジ片はDNA約45 μgのローディングに対応する。
【0189】
そのような調製物を実施例19に記載のようにインビトロ遺伝子移入に用いた。
【0190】
図15は、レポーター遺伝子が最初から低く発現されることを示すが、これは短期間の後に検出不能となる。
【0191】
(b) ポリエチレンイミン/ DNA スポンジ
PEIの前処置とDNA複合体の調製:
PEI(分子量25 kD)を滅菌蒸留水、またはHBS緩衝液に溶解して、PEI 100 mgあたり濃塩酸80 μlを加えて中和した。この溶液を、セントリコン30濃縮機(アミコン・ミリポア社(Amicon-Millipore))によって、または透析(分子量カットオフ12〜14 kD)によって低分子量成分から分離した。溶液の濃度は、1級アミンを定量するニンヒドリンアッセイ法によって決定した。
【0192】
DNA複合体を形成するために、pDNAとPEI溶液の等量を合わせた。DNAをPEI溶液に振とうさせながら加えた。PEIの量は窒素対燐酸比(N/P比)がそれぞれ、8:1および10:1となるように選択した。この比はPEI中の窒素原子対DNAのヌクレオチドの燐酸塩(=負電荷)のモル比である。
【0193】
計算:
【数6】
(330=ヌクレオチドの平均分子量;43=1級アミンを考慮に入れたPEIの反復単位の分子量)
【0194】
PEI-DNA複合体のスポンジへのローディング:
DNA 250 μg、375 μg、または500 μgを含み、N/P比が8または10であるPEI-DNA複合体溶液5 mlを、大きさ4.5×5cmのタコトップまたはレソルバスポンジにピペットによって適用した。4.5×5 cmあたりDNA 250 μgは、DNA 10 μg/cm2に相当し、4.5×5 cmあたりDNA 375 μgは、DNA 15 μg/cm2に相当し、および4.5×5 cmあたりDNA 500 μgは、DNA 20 μg/cm2に相当する。4℃で24時間インキュベートした後、調製物を凍結乾燥して滅菌条件で約1.5×1.5 cm片に切断した(DNA 22,5 μg、34 μg、または45 μgに相当)。
【0195】
そのような調製物を実施例19に記載のようにインビトロでの遺伝子移入に用いた。
【0196】
図15は、高い遺伝子発現を示す。遺伝子発現は数週間にわたってアッセイした。スポンジ上の発現の増加を認めた(示していない)。
【0197】
(c) リポソーム/ DNA スポンジ
DOTAP粉末からの陽イオンリポソームの調製:
シラン処理したねじ口ガラス管において、5 mM DOTAPのクロロホルム溶液を調製した。均一な脂質被膜が試験管の内表面に形成されるように、クロロホルムをロータリーエバポレーター(ロタベイパーR、ビュキ社(Buchi)、スイス)によって除去した。酸素を除去するために、ロータリーエバポレーターにアルゴンガスを通気した。試験管を凍結乾燥器の真空に一晩供した。次に、脂質被膜を5%グルコース溶液15 mlによって、最初は30秒間激しく攪拌しながら、次に超音波処理(超音波装置:ソノレックスRK510H、バンデリン(Bandelin)30分を行って再度水和し、これによって安定なリポソーム浮遊液が形成された。
【0198】
DOTAPリポプレックスの調製:
4.5×5cmスポンジに関して、1.5×1.5 cmあたりDNA 20 μgを得るためには、DNA 222 μgが必要である。正電荷がDOTAPに由来し、負電荷がDNAに由来する場合、荷電比(+/-)は、5:1であるべきである。DNA 222 μgは、負電荷0,67 μmolに相当する。ポリスチレン管において、DOTAPリポソーム3.35 μmolを5%グルコース溶液によって容量2.5 mlに希釈した。これに、またDNA 222 μgのグルコース溶液2.5 mlを軽く振とうさせながら加えた。
【0199】
DOTAPリポプレックスのスポンジへの適用:
上記のように調製したリポソーム/DNA溶液5 mlを、滅菌条件下でピペットを用いて4.5×5 cmタコトップスポンジ上に均一に分布させた。4℃で24時間インキュベートした後、スポンジを凍結乾燥してその後1.5×1.5 cmに切断した。
【0200】
(d)DNA/DOTAP スポンジ
DNA (pCMVLuc)500 μgの5%グルコース溶液をピペットで採取して、滅菌条件下で4.5×5 cmのタコトップスポンジに加え、4℃で24時間インキュベートして、その後凍結乾燥した。これは1×1 cmあたりDNA 20 μg、1.5×1.5 cmあたりDNA 45 μgにそれぞれ相当する。
【0201】
予備実験において、0.01%メチルバイオレットクロロホルム溶液をコラーゲンスポンジにローディングすることによって、スポンジ構造全体が溶液で均一に湿潤していることが証明された。このことから、脂質のクロロホルム溶液に関してもこれが可能であると結論した。所望の荷電比は5でなければならない。DNA 500 μgに関して、これはDOTAP量7.6 μmolを必要とする。したがって、1 mg/ml DOTAPのクロロホルム溶液5 mlをスポンジにローディングした。その後、スポンジを−20℃でインキュベートした後、室温で一晩インキュベートした(クロロホルムを蒸発させるため)。スポンジを滅菌条件で約1.5×1.5 cmの小片に切断した。
【0202】
(e) DOTAP/DNA スポンジ
所望の荷電比は、この場合も5:1であった。1 mg/ml DOTAPのクロロホルム溶液5 mlをピペットを用いて、4.5×5 cmタコトップ、ティシューフリース、およびレソルバスポンジにそれぞれ適用し、−20℃で約1時間インキュベートした。クロロホルムは室温で一晩蒸発させた。DNA(pCMVLuc)500 μgの5%グルコース溶液をピペットで4.5×5cmスポンジあたり5 ml適用して、4℃で24時間インキュベートし、その後凍結乾燥した。これはDNA 20 μg/cm2に相当する。
【0203】
(f) DOTAP- コレステロール /DNA スポンジ
所望の荷電比(+/-)はこの場合も5:1であり、所望のDNA負荷は20 μg/cm2であった。したがって、DOTAP5 mgとコレステロール2.95 mg(これは各305 nmolである)をクロロホルム各2.5 mlに溶解して、その後合わせた。この溶液をピペットによって4.5×5 cmのタコトップスポンジに適用して、−20℃で1時間インキュベートした後、室温でクロロホルムを蒸発させた。DNA(pCMVLuc)500 μgの5%グルコース溶液5 mlをピペットで4.5×5cmスポンジに適用して、4℃で24時間インキュベートし、凍結乾燥した。その後、スポンジを約1.5×1.5 cmの小片に切断した。
【0204】
変法:
DOTAP:コレステロール=1:0.9溶液180 mlを、クロロホルム中での総脂質濃度2 mMで調製した。タコトップスポンジ(ナイコムド(Nycomed))を半分(=4.5×5cm)に切断して、50 mlのポリプロピレンねじ口管においてこの溶液各30 mlに浸漬した後、シェーカーインキュベーター内で2時間インキュベートした。スポンジがクロロホルム溶液に完全に浸漬されるように、凍結乾燥器において、間欠的にキャップを開けてチューブを短時間わずかに排液した(「真空負荷」)。スポンジを最終的にクロロホルム浴からガラスのペトリ皿に移して、真空下で一晩乾燥させた。DNA(pCMVLuc)500 μgの5%グルコース溶液5 mlをピペットで4.5×5cmスポンジに滴下して室温で4時間インキュベートして、凍結乾燥した。その後スポンジを1.5×1.5 cm片に切断した。そのような調製物は、実施例19に記載したように、インビトロでの遺伝子移入のために用いた。
【0205】
当初、急速に退色する高い発現が培養皿の細胞に認められる。対照的に、スポンジ上の発現は一定のままであり、長期間持続する。図15。
【0206】
(g) DNA/PEI-SH-SPDP スポンジ
(i) PEIのスポンジへの共有カップリング:
15.5 mM SPDPの無水エタノール溶液0.5 mlを0.1 M HEPES pH 7.92mlに加えて、混合し、ピペットによって4.5×5 cmのタコトップスポンジに適用して、37℃で一晩インキュベートした。コラーゲン中のリジンのアミノ基はSPDPにおける活性化エステルのカルボキシル基との求核置換反応において反応する。
【0207】
未結合のSPDPは、上清において200〜400 nmでこれ以上の吸光度が光分析によって測定されなくなるまで、蒸留水によって定量的に洗浄した(14 mlファルコンチューブにおいて;ベクトン・ディッキンソン社(Becton Dickinson)、アメリカ)。その後、スポンジを凍結乾燥して、約1.5×1.5 cm片に切断する。スポンジ片の重量を測定した(ザルトリウス社(Sartorius)のMC1天秤、ゲッチンゲン)。カップリングしたSPDPを測定するため、スポンジ片をHBS2mlおよびβ-メルカプトエタノール3μlと共にインキュベートした。この手順において放出されたチオピリドンを342 nmで光分析によって測定した(ε=8080 l/mol)。置換は、以下の式に従って計算する:
【数7】
【0208】
平均すると、置換は約20 nmol SPDP/mgコラーゲンであった。しかし同様に、0.45 nmol SPDP/mgコラーゲンを有するスポンジも調製した。
【0209】
(ii) イミノチオラン(トラウト試薬)によるPEIの誘導体化
PEIをSPDPに共有結合によってカップリングするために、そしてこれをスポンジにジスルフィド架橋によってカップリングするために、チオール基をPEIに導入しなければならない。これは、2-イミノチオランのPEIへのカップリングによって行った。
【0210】
PEIを、アルゴンによってすすぎながら2倍過剰量のイミノチオランと混合した。1/15容量1 M HEPES pH 7.9を加えた。次に反応を室温で約20分継続した。セントリコン30チューブにおいて繰り返し遠心を行うことによって、過剰量の試薬を除去した。PEI上の遊離のチオール基をエルマン試薬によって決定した。
【0211】
(iii) PEI-イミノチオラン誘導体のSPDP-コラーゲンとのカップリング
PEIの5倍から10倍過剰量(PEI上の遊離のチオール基対スポンジ上のチオピリジル基の比に関して)をSPDP-スポンジ片に加えた。室温で7日後、反応は完了した。これを、342 nmでの吸光度の光分析による測定によって決定した。スポンジ上のSPDPの100%がPEI-SHと反応した。
【0212】
カップリングしたポリエチレンイミンの量は以下に従って計算する:
【数8】
【0213】
スポンジは上清において342 nmでの吸光度がこれ以上検出されなくなるまで水ですすいだ。次にスポンジを凍結乾燥した。
【0214】
(iv) PEI-SH-SPDP-スポンジへのDNAの適用
DNA(pCMVLuc)20 μgの5%グルコース溶液500 μlをピペットで1.5×1.5 cmスポンジ片にローディングして、4℃で24時間インキュベートして、凍結乾燥した。
【0215】
(v) DNA/ペプチド-SPDP-スポンジ
スポンジにSPDPを記述のようにローディングした。20 nmol SPDP/mgコラーゲンの平均的な置換を得た。しかし同様に、12.8 nmol SPDP/mgコラーゲンを有するスポンジも調製した。配列(KKKK)2KGGCのペプチドSFO7-SHの0.1 M HEPES pH 7.9溶液300 μlをSPDP基に対して2倍モル濃度過剰量でスポンジに適用した。反応は、チューブの空気空間をアルゴンで手短にすすいだ14 mlファルコンチューブ中で実施した。室温で2日後、反応は60%完了であった。これは上清の342 nmでの吸光度によって測定した(放出されたチオピリドンの定量)。カップリングしたペプチド量の計算は、PEIに関して記述したように実施した。
【0216】
ペプチド-SPDPスポンジは280 nmでの吸光度が測定できなくなるまで蒸留水で洗浄した。その後、スポンジを凍結乾燥した。
【0217】
(vi) ペプチド-SPDPスポンジへのDNAの適用
DNA(pCMVLuc)20 μgの5%グルコース溶液をピペットで1.5×1.5 cmスポンジ片あたり500 μl適用して4℃で24時間インキュベートして、凍結乾燥した。
【0218】
実施例17:ウィスター系ラットへの皮下埋め込みとレポーター遺伝子発現の測定
(a) 実験動物
体重300〜400 gの72ヶ月齢のウィスターラット(チャールスリバードイツGmbH、スルツフェルド)を実験動物として使用した。ラットをマクロロン4型ケージに最大収容5匹の群で維持した。唯一の栄養として、動物に、ラットマウス用固形飼料アルトロミン1324(アルトロミン社(Altomin)、ラゲ/リッペ、ドイツ)を自由に与え、水を自由に与えた。動物は滅菌した埃のない軟チップ上で維持し、これを週に2回交換する。実験動物維持の規則に従って、動物は、室温20〜25℃で一定の空気換気を維持する従来の動物飼育施設の専用室に順応させた。相対湿度は60〜70%である。照明は明暗サイクル各12時間である。光の強度は50〜100ルクスである。動物は施設の動物施設において実験前少なくとも2週間維持して、手術前に絶食していない。
【0219】
(b) スポンジの埋め込み
(i)材料:
・ イソフルラン(アボット(Abbot) GmbH、ヴィースバーデン、ドイツ)による麻酔装置(MDSマトリクス麻酔装置):
これは滅菌空気を処理して新鮮な空気を提供する換気装置を有する循環システムである。長所は、注射された麻薬の必要なく外科的に認容される一定の吸入と、麻酔の深さの微調整が可能であることである。
【0220】
前投薬は必要なく、動物は麻酔後数分以内に意識を回復する。
・ 蓋付きの透明なアクリルガラス全身チャンバー
・ 頭部チャンバー
・ 加熱パッド(レベル2に設定、〜38℃)
・ それぞれ手術台とラット用の緑色のカバー布
・ バリカン
・ 皮膚消毒剤(キュタスペクト(Cutaspect)(登録商標)F、ボードケミー社(Bode Chemie)、ハンブルグ、ドイツ)
・ ベパンテン(Bepanthen)(登録商標)ロシュ眼科用軟膏(ホフマン・ラロシュ(Hofman-La Roche) AG、グレンザック-ヴィーレン、ドイツ)
・ ラット識別のための耐水性ペン
・ 滅菌使い捨て手袋
・ 以下からなる機器の滅菌手術セット:
解剖用鉗子1
手術用鉗子1
鈍麻刃を備えたレクサー鋏1
凸面メッツェンバウム鋏(尖/尖)1
針固定ガーゼ綿1
・ 手術用縫合糸:モノフィル、ブルー、長さ45 cm、先尖りの添付針を有する4/0プロレン(4/0 Prolene)(登録商標)縫合糸
・ 滅菌使い捨て15番メス
・ 1実験群あたり番号をつけて重量を測定したスポンジ14個(動物7匹)
【0221】
(ii) 手術:
動物を、環境に適応させるために手術の約15分前に手術室に移動した。麻酔装置に接続した全身用チャンバーに、麻酔を開始する前に酸素/4%イソフルラン(350 cm3/分)を約2分間満たした。これは、最も迅速であることを保証する麻酔薬の対応する濃度を得るために実施し、麻酔のこのより緩やかな開始を可能にする(短い興奮段階)。ラットを全身チャンバーに入れて、吸入ガスの初回濃度を、1〜2分後、正向反射が失われ(ラットは仰向けのままである)、麻酔段階III. 1〜2に達するまで一定に保持する。ラットをチャンバーから取り出し、腹部を下に向けて置き、頭部チャンバーを提供する。動物が麻酔段階III. 2、手術に耐えられる段階(足の引っ込め反射が陰性でなければならない)に達すると、イソフルランの供給を1.5%に減少する。眼瞼反射の喪失による角膜の乾燥を防止するために油脂性眼科用軟膏を両眼に適用する。腰部領域(最後の肋骨と後肢との間の背部領域)に、バリカンを用いて7×2cmの領域の毛を刈った後洗浄して、皮膚領域をキュタセプト噴霧ガーゼ綿によって消毒する。皮膚を内側から約2 cm外科用鉗子でつかみ、背腹方向にメスで1cmの切開部を作成する。メッツェンバウム鋏を用いて、皮膚切開部を鈍器で広げ、皮下組織を頭蓋方向に約3cm皮下剥離する。創傷の頭蓋末梢部は外科用鉗子によって開いておき、調製したスポンジを皮下剥離した組織の中を頭蓋方向に可能な限り遠くに進行させる。切開部をU型クランプで閉じる。同じ手順を左側についても繰り返す(5〜7を参照)。O2潅流を継続している間はイソフルランの供給を中止する。燕下反射が再出現した後、ノバルジン(Novalgin)(登録商標)(活性物質:メタミゾールナトリウム;ヘキストAG社(Hoechst AG)、フランクフルト、ドイツ)0.1 mlを非ステロイド性鎮痛薬として動物に経口投与する。動物を意識が完全に回復するまで個別ケージに収容して、約1時間後元のケージに戻す。
【0222】
(c) スポンジの回収
(i) 材料:
・ イソフルラン(アボットGmbH、ヴィースバーデン、ドイツ)による麻酔装置(MDSマトリクス麻酔装置):
・ 蓋付きの透明なアクリルガラス全身チャンバー
・ 頭部チャンバー
・ 滅菌使い捨て手袋
・ 機器滅菌手術セット(上記参照)
・ 50,000 I.E.ヘパリン(ラチオファーム(ratiopharm)(登録商標)GmbH、ウルム/ドノータル(Ulm/Donautal)、ドイツ、ヘパリンナトリウム25,000 I.Eの2×5ml注射液)を有する、等張塩化ナトリウム注入液(デルタファーマ(Delta-Pharma) GmbH、ヒューリンゲン、ドイツ)1000 ml
・ 注入チューブ
・ 蝶型カニューレ19G
【0223】
動物は、可能な限り早く血液排出組織を得るためにスポンジ回復の前に還流する。これは、その後のルシフェラーゼアッセイ法をおそらく妨害する多くの要因(例えば、ヘモグロビン)を最小限に減少させることをねらいとする。2 mlねじ付きキャップホモジネーションチューブ(使い捨て、円錐形の2.0 mlのキャップ付きねじ口チューブ、VWRサイエンティフィックプロダクツ(VWR scientific products)、ウェストチェスター、アメリカ)に、大きいホモジナイゼーションビーズ(ジルコニアビーズ、直径2.5 mm、バイオスペックプロダクツインク(Biospec Products)、バートルスビル、アメリカ)および動物実験用溶解緩衝液各750 μl(10 ml、5×レポーター溶解緩衝液;プロメガコーポレーション(Promega Corporation)、マジソン、アメリカ;+40 ml dd H2O+プロテアーゼ阻害剤コンプリート(登録商標);ベーリンガーマンハイムGmbH、ドイツ、1錠)を0.3 mlの印まで満たす。これらのチューブに回復したスポンジを入れる。
【0224】
(ii) 方法:
ラットをスポンジの埋め込み1〜2に関して記述したように前処置して麻酔した。動物を背側位に置いた。腹腔をはさみで正中線で切開して、臍帯前胸板から胸骨柄に伸びる切開部を作製した。減張切開を最終肋骨の左右に作製した。尾大静脈を暴露して、蝶型カニューレを腎静脈との接合部の尾位に挿入する。注入溶液を接続する。約5mlを注入した後、尾大静脈を挿入点の尾側位でメスによって切開する。動物を注入溶液100〜150 mlで潅流して、肝臓の明確な脱色が明らかになるまで血液を除去(desanguinize)する。ラットを背側位に置く。メスを用いて、頭蓋方向に腰部領域から伸びる正中領域の皮膚を約7cm切開する;減張切開を埋め込み創傷の左右尾側に作製する。鋏とメスをそれぞれ用いてスポンジを大きく解離させ、周辺組織と共に摘出する(結合組織および背側最長筋の約1cm部分)。各回収したスポンジ(周辺組織)を1×PBS緩衝液で洗浄し;スポンジと組織を分離して、予め調製してラベルを付けたホモジナイゼーションチューブに移す。次に満たしたチューブを氷中入れて、可能であれば直ちに処理する。
【0225】
(iii) 試料のプロセシング:
氷中で絶えず保存した試料をミニビードビーター(Mini Bead Beater)(登録商標)(バイオスペックプロダクツインク、バートルスビル、アメリカ)を用いて3×20秒間ホモジナイズした後、14,000 rpmで4℃で10分遠心する。
【0226】
ルシフェラーゼアッセイ法:
チューブ1本あたり、上清20 μlを採取して、コスター(Coster)(登録商標)96ウェルプレートに移す(半透明プレート-固体黒色96ウェル、コーニングコスターコーポレーション(Corning Coster Corporation)、ケンブリッジ、アメリカ)。ウェル1個あたり、ルシフェラーゼ緩衝液(プロメガルシフェラーゼアッセイシステム、プロメガコーポレーション、マジソン、アメリカ)100 μlを加えて、1分間の計数遅延で12秒間測定する。
【0227】
上記のインビボ実験の結果を以下の表に示す。
【表1】
【0228】
表は、スポンジ調製物を皮下に埋め込んだ場合のインビボ遺伝子移入を示す。スポンジは実施例15および16にそれぞれ記載したように調製し、実施例17に記載したようにウィスター系ラットの皮下に埋め込んだ。遺伝子発現をまず3日後に測定した。本発明のコポリマーをコーティングしたPEI-DNA複合体をローディングしたコラーゲンスポンジのみが、この実験セットアップにおいて検出可能なレポーター遺伝子発現を生じる(数値はfgルシフェラーゼ/mg蛋白質)。
【0229】
実施例18:様々なコラーゲンスポンジ-ベクター調製物からの放射活性標識DNAの放出
(a) ニックトランスレーションによるプラスミド DNA の放射活性標識
アマシャム社(Amersham)のニックトランスレーションキット(# N5500)を用いた。標識反応あたり、DNA1μg(pCMVβGal)を用いた。直鎖状DNAに関して提案された15℃で2時間の代わりに反応時間が15℃で15分となるように製造元のプロトコールを変更した。比活性3000 Ci/mmol(アマシャム社、フライブルク)の[α-32P]dATPをヌクレオシド三燐酸として用いた。取り込まれていない[α-32P]dATPの分離は、ゲル濾過の原理および「ヌクトラッププローブ精製カラム」とアクリルガラス遮蔽固定装置「プッシュカラムベータ遮蔽装置」(いずれもストラタジーン社(Stratagene))、ハイデルベルク)の製造元のプロトコールに従って実施した。得られたプラスミドをアガロースゲル電気泳動(1%アガロースゲル、100 V、35分、エチジウムブロマイド染色)によって調べた。これを非標識プラスミドと混合してローディングし、UV光の下で電気泳動後オートラジオグラフィーによって可視化して、ゲルを乾燥させた。これによって、ニック標識の間に形成されたプラスミド断片の大きさと相対的な画分を評価することができる。放射活性標識DNAを酵素から分離するために、「プロメガウィザード(Promega Wizard)(登録商標)PCRプレップスDNA精製システム」(プロメガ社、アメリカ)を、装置に関する製造元のプロトコールに軽微な改変を加えて用いた。
【0230】
(b) 放射活性標識 DNA を有する化学修飾されたスポンジの調製
(i) DOTAP/DNA-タコトップスポンジ
タコトップスポンジを約1.5×1.5 cmの小片に切断して、重量を測定した。平均重量は5 mgであった。次に、1 mg/ml DOTAPのクロロホルム溶液450 μlをピペットでスポンジに適用して、−20℃で1時間インキュベートした後、室温でクロロホルムを蒸発させ、スポンジの重量を測定した。これらのDOTAPスポンジを6ウェルプレートのウェルに入れた。非標識プラスミド20 μg(1例では40 μg)とスポンジ5mgあたり放射活性標識生成物それぞれ10 μlおよび30 μlとの混合物を、5%グルコース溶液の総容量200 μlでピペットを用いてスポンジに適用し、4℃で2〜24時間インキュベートして、凍結乾燥した。
【0231】
(ii) DNA-タコトップスポンジ
方法1:
タコトップスポンジを約1.5×1.5 cmの小片に切断して重量を測定した。スポンジを6ウェルプレートのウェルに入れた。スポンジ5 mgあたり非標識プラスミドDNA 20 μgと放射活性標識DNA 10または30 μl(5%グルコース溶液の総容量200 μl)をピペットでローディングして、4℃で2〜24時間インキュベートして凍結乾燥した。
【0232】
方法2:
4.5×5cmタコトップスポンジに、非標識プラスミドDNA 500 μgと放射活性標識DNA 122.1 μl(5%グルコース溶液の総容量2ml)をピペットでローディングして、4℃で12時間インキュベートして凍結乾燥した。スポンジを約1.5×1.5 cmの小片に切断して、各小片の重量を測定した。スポンジ調製の際の凍結乾燥時に細胞培養皿に残っている適用したDNA画分を決定するために、プレートの蓋と底を10×SDS2mlですすぎ、それぞれの40 μlアリコットを測定した。
【0233】
(iii) DOTAP/コレステロール/DNA-タコトップスポンジ
所望の荷電比(+/-)は、この場合も5:1であり、DNAとの所望の置換は、20 μg/cm2であった。したがって、DOTAP5mgとコレステロール2.95 mg(各305 nmol)をクロロホルム各2.5 mlに溶解して、その後合わせた。この溶液を4.5×5cmタコトップスポンジにピペットで適用し、−20℃で1時間インキュベートした後、室温でクロロホルムを蒸発させた。非標識プラスミドDNA 500 μlおよび放射活性標識DNA 122.1 μlを(総容積5%グルコース溶液2 ml)4.5×5cmスポンジにピペットでローディングして、4℃で24時間インキュベートして凍結乾燥した。スポンジを1.5×1.5 cmの小片に切断して、各小片の重量を測定した。スポンジ調製の際の凍結乾燥時に細胞培養皿に残っている適用したDNA画分を決定するために、プレートの蓋と底を10×SDS2mlですすぎ、それぞれの40 μlアリコットを測定した。
【0234】
(iv) ポリエチレンイミン/DNA-タコトップスポンジ
4.5×5cmタコトップスポンジにおいて、PEI/DNA複合体溶液(非標識プラスミドDNA 500 μgと放射活性標識DNA 122.1 μlをN/P比6)をピペットによってローディングした。4.5×5cmあたりのDNA 500 μgはDNA 20 μg/cm2に相当する。4℃で24時間インキュベートした後、調製物を凍結乾燥して、約1.5×1.5 cmの小片に切断して、各小片の重量を測定した。スポンジ調製の際の凍結乾燥時に細胞培養皿に残っている適用したDNA画分を決定するために、プレートの蓋と底を10×SDS2mlですすぎ、それぞれの40 μlアリコットを測定した。
【0235】
(v) DNA-ペプチドSPDPスポンジを、DNA成分が上記のように放射活性標識DNAを含むことを一つの例外として、実施例16に記載のように調製した。
【0236】
(vi) コポリマー保護ポリエチレンイミン/DNA-タコトップスポンジ
これらのスポンジは、プラスミドDNA溶液が放射活性標識DNAをさらに含むことを一つの例外として、実施例15に記載のように調製した。
【0237】
(c) スポンジからの放射標識 DNA の時間依存的放出の測定
様々なスポンジ調製物をシラン処理ガラス管(ARガラス製の16×100 mmねじ口培養管、ブランド社(Brand)、ドイツ)にそれぞれPBS1mlと共に入れた。試験管を3,000 rpmで手短に遠心して(セントリフュージ:メガフュージ2.0 R、ヘラエウス(Heraeus)、ミュンヘン)、80rpmまたは120 rpmの水浴シェーカー中で37℃で振とうした。1時間後、1日後、3日後、およびその後3日ごとに、上清中の放射活性DNAの量を決定した。この目的のため、試験管を3,000 rpmで遠心して、短く激しく攪拌した。上清40 μlを採取して、PBS 40 μlと交換した。試料を、白色96ウェル不透明プレートのウェル(タイプ、「平底、無処置」、コスター社、アメリカ)において、マイクロシント20 高効率LSC-カクテル(パッカード社、アメリカ)160 μlと共に混合し、トップカウント装置(キャンベラ-パッカード社、アメリカ)を用いて半減期を自動的に修正して計数した。計数時間は5分、計数遅延は10分、そして3回測定の平均値を得た。参考として、標識プラスミドDNA2μlを測定した。DNA(cpm/ml)の測定した濃度を予め採取した試料について補正した(予め採取した量を合計して、測定値に加えた)。スポンジ調製の際の凍結乾燥時に細胞培養皿に残っている適用したDNA量を決定するために、ディッシュをPBS 500 μlですすぎ、その40 μlアリコットを測定した。一連の測定の終了時(例えば、インキュベーション30日後)、適用した用量の100%を回収できるか否かを決定するために、スポンジを1%SDS溶液によって処理した。この目的のため、スポンジを新しいファルコンチューブに移して、1%SDS1mlを加え、試料を繰り返し激しく振とうさせながら1日インキュベートした。次に、上清40 μlを採取して、白色の96ウェル不透明プレートのウェルにおいて、マイクロシント20 160 μlと共に混合し、放射活性をトップカウント装置を用いて計数した。
【0238】
結果を図14に示す。
【0239】
裸のDNAをローディングしたスポンジは、適用した用量の50%を1時間以内に放出し、その後ほぼ直線的に遷延性の放出を示した。対照的に、ベクターローディングスポンジは、せいぜい5%の小さい初回放出を示し、その後時間単位あたり軽微な放出を長時間示す。このことは、調べたベクターのコラーゲンマトリクスとの効率的な結合を示す。
【0240】
(d) 放出された DNA の特徴付けのためのアガロースゲル電気泳動
DOTAP/DNAスポンジをPBS1ml中で振とうさせたそれぞれ5日後および30日後、小さいエチジウムブロマイド染色1%アガロースゲル上で、上清各20 μlに100 Vで35分間の電気泳動を行った。対照として、非標識プラスミドDNAとリポソーム-DNA複合体(荷電比5:1)1μgをゲルにローディングした。ゲルをUV光の下で写真を撮影し、その後乾燥させて、X線フィルム上に露出した。
【0241】
実施例19:インビトロでのベクターローディングコラーゲンスポンジによる/上でのNIH 3T3細胞のトランスフェクション
細胞培養プレート(TPP社の6ウェルプレート)において、ウェルあたりトリプシン処理したNIH 3T3マウス線維芽細胞(接着細胞)約50,000〜400,000個を、抗生物質(500単位ペニシリン、50 mgストレプトマイシン/500 ml)および10%仔ウシ胎児血清と共に1.028 g/l N-アセチル-L-アラニル-L-グルタミンを添加したDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)培地4mlにおいて播種する。細胞を5%二酸化炭素を含む空気中で37℃で1〜2日間インキュベートする。実施例15および16に従ってそれぞれ調製したコラーゲンスポンジ(1.5×1.5 cm)1個を、細胞を播種した1〜2日後にウェルの適当な数のそれぞれに入れて、5%二酸化炭素大気中で37℃で約3日間インキュベートする。ルシフェラーゼ発現の第一の測定は、1〜3日間の間に実施する。この目的のため、コラーゲンスポンジを除去した後、接着細胞を有するウェルを燐酸緩衝溶液(PBS)によって3回洗浄して、その後溶解緩衝液(0,1%トライトンの250 mMトリスpH 7.8溶液)500 μlによって処理した。その後、ルシフェラーゼ活性を下記のように決定する。
【0242】
遷延作用を証明するために、除去したコラーゲンスポンジを、播種した細胞を有する新鮮なウェルに入れ、5%二酸化炭素大気中で37℃で約3日間インキュベートする。その後、コラーゲンスポンジをウェルから除去して、接着細胞を洗浄し、上記のように溶解緩衝液によって処理し、下記のようなルシフェラーゼ活性の定量を行った。この方法は、開始するために選択した個々のセットアップの数に応じた任意の回数を繰り返す。このように、A)に従って調製したコラーゲンスポンジがトランスフェクトすることができる、すなわち細胞においてルシフェラーゼ活性の発現に至る程度を、少なくとも6週間の期間にわたって決定することができる。
【0243】
ルシフェラーゼアッセイ法:
定着したコラーゲンスポンジを組織培養皿から除去してPBSによって洗浄した。同じように、組織培養皿における細胞をPBSによって洗浄した。洗浄の際に最終的にスポンジから剥離した細胞を遠心分離により洗浄溶液から沈殿させて、ルシフェラーゼ発現を個別に調べた。これに由来する値をスポンジ上でのルシフェラーゼ発現に加えた。スポンジ上の細胞を溶解緩衝液1mlを加えることによって溶解した。ウェル中の細胞を溶解緩衝液500 μlを加えて溶解した。細胞溶解物10〜50 μlを黒色の96ウェルプレートにおいてルシフェリン基質緩衝液各100 μlと共に混合した。得られた光放出の測定は、マイクロプレートシンチレーションおよびルミネッセンスカウンター「トップカウント」(キャンベラ・パッカード社、ドライアイヒ)を用いて実施した。計数時間は12秒間であり、計測遅延時間は10分間、そしてバックグラウンド値は自動的に差し引いた。標準物質としてルシフェラーゼ100、50、25、12.6、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39、0.2、0.1、0.05、0.025、0.013、0.007 ng、および0 ngの溶解緩衝液溶液(=連続2倍希釈)各50 μlを同じ条件で測定した。較正曲線はこれらの測定から誘導した。
【0244】
緩衝液:
(a) 溶解緩衝液
0.1%トライトンX-100の250 mMトリスpH 7.8溶液
ルシフェリン基質緩衝液
60 mMジチオスレイトール、10 mM硫酸マグネシウム、1mM ATP、30 μM D-ルシフェリンの25 mMグリシル-グリシン緩衝液pH 7.8
【0245】
(b) HEPES緩衝生理食塩液(HBS)
20 mM HEPES pH 7.3;150 mM塩化ナトリウム
【0246】
細胞溶解物における蛋白質含有量測定:
溶解物の蛋白質含有量はバイオラッド蛋白質アッセイ法(バイオラッド社、ミュンヘン)を用いて決定した:溶解物10 μl(または5μl)に、蒸留水150 μl(または155 μl)とバイオラッド蛋白質アッセイ色素濃縮物40 μlを透明な96ウェルプレート(「平底」タイプ、ヌンク社、デンマーク)のウェルに加えた。吸光度は吸光度計「バイオルミン690」およびコンピュータープログラム「Xペリメント」(いずれもモレキュラー・ダイナミクス社、アメリカ)を用いて630 nmで測定した。較正曲線として、濃度50、33.3、22.3、15、9.9、6.6、4.4、2.9、2.0、1.3、0.9 ng BSA/μl、および0 ng BSA/μlを測定した。ウシ血清アルブミン(BSA)は、バイオラッド蛋白質アッセイ標準物質IIとして購入した。このように、結果は蛋白質1 mgあたりのルシフェラーゼのpgとして表記しうる。
【0247】
インビボ実験の結果を図15に示す。
【0248】
一連の実験の結果を、PEI-DNAに関して図16Aに、そして裸のDNAに関して図16Cに示す。コポリマー保護遺伝子ベクターをローディングしたスポンジに関する類似の実験を図16Bに示す。図16Dは、対照実験の結果を示す。この目的のため、トランスフェクションの前日に(すなわち1日目)、NIH3T3線維芽細胞を6ウェルプレートのウェルあたり細胞450,000個の密度で播種した。トランスフェクションの直前に、培地を新鮮な培地1.5 mlに交換した。DNA複合体を総容量500 μlで加え(2日目)、4時間インキュベートした後、培地を交換した。3日目、コラーゲンスポンジの大きさ1.5×1.5 cmの無処置の小片を各ウェルに加えた。6日目、新鮮な細胞を新鮮な6ウェルプレートに播種した(細胞450,000個/ウェル)。7日目、スポンジ3個を除く全てのスポンジをこれらのウェルに移動した。スポンジ3個と全てのスポンジを採取したウェルにルシフェラーゼアッセイ法を行った。10日目、スポンジ3個を除く全てを空のウェルに移動させて、培地2ml中でさらにインキュベートした。これらのスポンジおよびそこからスポンジを移動した全てのウェルにルシフェラーゼアッセイ法を行った。図16Dにおいて示したその後の時点で、スポンジ各3個と、ウェルの底に沈降した細胞をルシフェラーゼ発現に関して分析した。
【0249】
図16Dは、ルシフェラーゼ発現が当初は高いが、その後急速に減少し、もはや全く測定できなくなることを示している。このことは、他の場合(図15および16A〜C)、有意に高いルシフェラーゼ発現は、固定したベクターによる持続的なデノボトランスフェクションに帰因することを意味する。したがって、当初トランスフェクトした細胞のいかなる選択も扱っていない。この通りであれば、対照実験におけるルシフェラーゼ発現は、他の実験と同様に高いレベルで持続しなければならない。
【0250】
文献
【図面の簡単な説明】
【図1】 3-(2'-チオピリジル)-メルカプトプロピオニルグルタミン酸およびO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000、またはO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400からコポリマーバックボーンの調製。
【図2】 荷電ペプチドのコポリマーバックボーンとのカップリング。
【図3】 保護ペプチドE4EPROTおよびO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000からのコポリマーバックボーンの調製。
【図4】 補体活性化アッセイ法。
【図5】 赤血球溶解アッセイ法。
【図6】 コポリマーP3YE5Cの存在下でのPEI-DNA複合体(N/P=8)の電子顕微鏡写真。
【図7】 添加したコポリマーP3YE5CおよびP6YE5Cの量にそれぞれ依存したPEI-およびDOTAP/コレステロール-DNA複合体のゼータ電位。
【図8】 DNA/ポリカチオン/コポリマー複合体の調製。
【図9】 コポリマーP3YE5Cの存在下および非存在下におけるPEI(25 kD)-DNA複合体によるK562細胞への遺伝子移入。
【図10】 コーティングコポリマーP3INF7の存在下および非存在下におけるポリリジン-DNA複合体による乳癌細胞株MDA-MB435Sのトラスフェクション。
【図11】 コポリマーP3YE5Cの存在下および非存在下におけるNIH3T3細胞のリポフェクション。
【図12】 P6YE5Cの存在下および非存在下におけるDOTAP/コレステロール-DNAおよびPEI-DNAによるHepG2細胞のトランスフェクション。
【図13】 コポリマーをコーティングしたDNA/ポリカチオン複合体によるインビボ静脈内遺伝子移入。
【図14】 ベクターをローディングしたコラーゲンスポンジからの放射活性標識DNAの放出。スポンジは実施例 18に記載のように調製した。裸のDNAの場合、適用した用量の約50%が能動的に結合したのに対し、半数は直ちに放出される。その後の放出速度論は、ほぼ直線の経過をたどる。遺伝子ベクターをスポンジにローディングするとすると、90%の画分が堅固に結合し、指数的放出プロフィールによって長期間にわたって放出される。陽イオン誘導体化スポンジ(「PEI-SPDP」および「ペプチド-SPDP」)は、裸のDNAに効率よく結合して、ベクターをローディングしたスポンジと類似の放出速度論を示す。
【図15】 ベクターをローディングしたコラーゲンスポンジによるNIH3T3マウス線維芽細胞への遺伝子移入。スポンジは実施例16に記載のように調製し(変法に従って調製した裸のDNA、PEI-DNA、DOTAP-コレステロール-DNA)、実施例 19に記載するように遺伝子輸送に用いた。DOTAP-コレステロールスポンジの場合、調製物を細胞接着層に加えたか(左)、または新たにトリプシン処理した細胞をスポンジにローディングした(右)。その後の実験の過程は全てのセットアップについて同一であった。レポーター遺伝子発現は様々な時間経過に対してアッセイしたところ、特にスポンジ上/内で増殖する細胞において長期間にわたって持続する。
Claims (22)
- 担体と、一つまたはそれ以上の核酸分子と一つまたはそれ以上の一般式Iの荷電コポリマーとを含む複合体との配合剤:
式中Xは
i) アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体、ペプチドもしくはペプチド誘導体、またはスペルミンもしくはスペルミジン誘導体である;または
ii) Xは
aはH、または選択的にハロゲンもしくはジアルキルアミノ置換、C1〜C6アルキルである;ならびに
b、c、およびdは、同じまたは異なり、選択的にハロゲンもしくはジアルキルアミノ置換C1〜C6アルキレンである;または
iii) Xは
aは、選択的にハロゲンもしくはジアルキルアミノ置換C1〜C6アルキレンである、および
bおよびcは、同じまたは異なり、選択的にハロゲンもしくはジアルキルアミノ置換C1〜C6アルキレンである;または
iv) 式中、Xは三つの官能基W、Y、およびZを有する置換芳香族化合物である;
式中、
W、YまたはZは、同じまたは異なる基CO、NH、OもしくはS、またはSH、OH、NH、もしくはNH2と反応することができるリンカーを意味する;
およびイフェクター分子Eは、
陽イオン性もしくは陰イオン性ペプチドもしくはペプチド誘導体、スペルミンもしくはスペルミジン誘導体、グリコサミノグリカン、または非ペプチド性オリゴ/ポリカチオンもしくは陰イオンである;
それぞれのmは独立して互いに0、1、または2である;
それぞれのnは独立して互いに0、1、または2である;
pは3〜20である;ならびに
lは1〜5である。 - コポリマーの両親媒性ポリマーが酸化ポリアルキレンである、請求項1記載の配合剤。
- コポリマーの両親媒性ポリマーがポリアルキレングリコールである、請求項2記載の配合剤。
- コポリマーにおけるXまたはEが荷電ペプチドまたはペプチド誘導体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の配合剤。
- 高等真核細胞に対するリガンドがコポリマーにカップリングしている、請求項1〜4のいずれか一項に記載の配合剤。
- 核酸分子(群)が有機ポリカチオンまたは陽イオン性脂質分子と縮合し、それによって形成された複合体の表面に、一般式Iの一つまたはそれ以上の荷電コポリマーがイオン相互作用を通じて結合する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の配合剤。
- 治療的に有効な核酸分子を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の配合剤。
- 担体が生物学的に再吸収されない材料からなる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の配合剤。
- 前記生物学的に再吸収されない材料が、金属材料である、請求項8に記載の配合剤。
- 前記生物学的に再吸収されない材料が、チタンである、請求項8に記載の配合剤。
- 担体が生物学的に再吸収可能な材料からなる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の配合剤。
- 生物学的に再吸収可能な材料がコラーゲンである、請求項11記載の配合剤。
- 前記生物学的に再吸収可能な材料が、脂肪族ポリエステルである、請求項11に記載の配合剤。
- 前記生物学的に再吸収可能な材料が、ポリ乳酸である、請求項11に記載の配合剤。
- 前記配合剤が、インプラントのコーティングである、請求項1〜14のいずれかに記載の配合剤。
- 前記配合剤が、内部人工器官のコーティングである、請求項1〜14のいずれかに記載の配合剤。
- 担体がコラーゲンスポンジである、請求項12記載の配合剤。
- 担体が、請求項1において定義したコポリマーのクロスリンクによって得ることができる担体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の配合剤。
- 一般式Iにおけるlが1である、請求項1〜18のいずれかに記載の配合剤。
- インビトロで核酸を細胞に移入するための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の配合剤の使用。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の配合剤を含む薬学的組成物。
- 担体と、請求項1において定義したコポリマーまたは複合体とを含むキット。
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