CN103243122B - 含可降解亚胺键的核酸物质的载体、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含可降解亚胺键的核酸物质的载体，其结构式为：其中，x为1～20,y为1～20，n为1～20。本发明还公开了该含可降解亚胺键的核酸物质的载体的制备方法、在核酸药物输送中的应用和复合物。与现有技术相比，本发明制备的含有亚胺键结构的可降解低分子量PEI衍生物核酸物质的载体结构简单、易于合成，在不同的细胞株中均表现出较高的转染活性，同时具有较低的细胞毒性，是一种高效、低毒的基因输送载体。

Description

含可降解亚胺键的核酸物质的载体、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及含可降解亚胺键的低分子量PEI衍生物核酸物质的载体、其制备方法、在核酸药物（DNA和RNA）输送中的应用和复合物。

背景技术

基因治疗，是将外源性基因物质(DNA或RNA)导入细胞，促进或者抑制特定蛋白的表达，或者取代、修复有问题的基因，从而达到疾病治疗的目的。基因治疗在其发展过程中遇到了一系列技术瓶颈，其中最重要的瓶颈之一是基因物质安全有效的体内输送。

目前常用的基因输送载体可以分为病毒载体及非病毒载体。病毒载体虽然具有较高的转染效率，但由于病毒的变异会引起潜在的致病危险，并且病毒表面成分会引起人体免疫反应，同时病毒载体的制备和纯化困难且担载基因量小。而以为代表的非病毒基因载体具有基因担载密度和担载量大、制备简单，便于化学修饰等优势。因此，非病毒基因载体被认为是更理想的基因物质输送载体。但是载体也存在着化学毒性大的缺点，例如聚乙烯亚胺是目前研究最为广泛的非病毒载体，分支状分子量为25kDa的PEI转染效率最高，但是PEI25kDa同时因其烷基骨架无法降解而导致细胞累计毒性较大。多数的国内外专家将其研究集中在可降解的PEI衍生物。

犹他大学的SungWanKim等人在缓控释杂志(JournalofControlledRelease2005,103:209-219)发表“Polyethyleniminewithacid-labilelinkagesasabiodegradablegenecarrier”（用酸降解连接剂聚PEI作为基因载体）的文章，该文章采用戊二醛作为连接剂与低分子量PEI(1800Da)交联，生成特征性的含有亚胺键连接的可降解聚乙烯亚胺类，该类的结构特点是：与基因形成的复合物被细胞摄取后，凝聚基因的在细胞内的内吞体和溶酶体的酸性条件下，与低分子量PEI直接相连的亚胺键断开，生成无细胞毒性的低分量PEI，但是含亚胺键的聚合结构不能保证这一携带核酸进入细胞之前足够稳定，其转染活性也一般（与PEI25KDa对照）。

Jin等人申请一项题为“Polycationicgenecarriersformedofendogenousaminogroup-bearingmonomers”（内源性氨基基团的单体形成聚阳离子基因载体）的PCT专利（WO2009/100645A1），该专利中采用人体内源性专职凝聚基因的小分子单体精胺分别与1，4-丁二醇二氯甲酸酯、1，4-丁二酰氯和乙二醛等三个连接剂，缩合得到分别含有氨酯键、酰胺键和亚胺键等聚精胺阳离子，这些表现出良好的核酸输送能力，而且，聚合物通过生物响应性降解能够回归到精胺内源性单体的初始状态，具体的特征是良好的生物相容性，但该技术的缺陷在于：含有氨酯键、酰胺键的降解速率比较慢，导致核酸物质无法及时从内涵体里逃逸，影响核酸输送效率；含有亚胺键的降解速率比较快，但是载体的不稳定性致使其输送的核酸物质尚未到达胞质，便从胞外释放出来，转染效率大大降低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种含可降解亚胺键的核酸物质的载体、其制备方法、在核酸药物（DNA和RNA）输送中的应用和复合物。本发明制备的是具有高效、低毒、可降解为起始状态小分子的基因物质输送载体，可以用于基因物质(DNA和RNA)的输送。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种含可降解亚胺键的核酸物质的载体（PPI），其结构式为：

其中，x为1～20，y为1～20，n为1～20。

优选地，所述核酸物质的载体的基本构建单元为低分子量聚乙烯亚胺PEI，所述低分子量PEI为重均分子量Mw在2000Da以下的任一低分子量的PEI。

优选地，所述低分子量PEI的分子量为：Mw=800Da/Mn=600Da或Mw=1300Da/Mn=1200Da或Mw=2000Da/Mn=1800Da；其中，Mw为重均分子量，Mn为数均分子量。

本发明还涉及一种上述含可降解亚胺键的核酸物质的载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将低分子量PEI与咪唑二醛按摩尔比为1:1-3.5的比例加入到溶剂中，得到反应体系；

(2)搅拌、摇动或震荡反应体系，使之发生缩合反应，即得所述含可降解亚胺键的核酸物质的载体。

优选地，所述低分子量PEI为Mw在2000Da以下的任一低分子量的PEI。

优选地，所述低分子量PEI的分子量为：Mw=800Da/Mn=600Da或Mw=1300Da/Mn=1200Da或Mw=2000Da/Mn=1800Da；其中，Mw为重均分子量，Mn为数均分子量。

优选地，上述制备方法还包括以下分离纯化的步骤：将所述含可降解亚胺键的核酸物质的载体用超纯水溶解后，置于活化后的透析袋中透析；透析结束后，用微孔滤膜过滤，最后预冻、冻干。

优选地，所述透析袋的截留分子量为7k～20k。

优选地，所述透析的时间为12～48小时。

优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.22～0.45μm。

优选地，所述步骤(1)中的溶剂选自无水乙醇或氯仿。

本发明还包括一种含可降解亚胺键的核酸物质的载体在核酸药物（DNA和RNA）输送中的应用。

本发明还包括一种复合物，所述复合物是按照如下方法制备得到的：将上述含可降解亚胺键的核酸物质的载体的溶液加入到核酸溶液中，混合均匀，室温下孵育，即得。

优选地，所述核酸为DNA或RNA，其特征为DNA疫苗、siRNA和microRNA。

优选地，所述孵育的时间为20～120分钟。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明制备的含有亚胺键结构的可降解低分子量PEI衍生物核酸物质的载体结构简单、易于合成；

(2)本发明制备的含有亚胺键结构的可降解低分子量PEI衍生物核酸物质的载体在不同的细胞株中均表现出较高的转染活性(与PEI25KDa和lipofectamine2000相比)，同时具有较低的细胞毒性。

附图说明

图1为PPI的合成路线图；

图2为PPI的¹H-NMR谱图；

图3为PPI的FT-IR谱图；

图4为PPI-pDNA复合物在不同质量比条件下的琼脂糖凝胶电泳图（介质：水）；

图5为PPI-pDNA复合物在不同质量比条件下的Zeta电位；

图6为PPI-pDNA复合物在不同质量比条件下的粒径尺寸；

图7为PPI-pDNA复合物质量比为10条件下的原子力显微镜图（刻度尺最小值为1μm）；

图8为PPI-pDNA复合物质量比为10条件下的原子力显微镜图（刻度尺最小值为0.2μm）；

图9为PPI-pDNA复合物质量比为10条件下的透射电子显微镜图；

图10为PPI-pDNA复合物的细胞转染图；

图11为COS-7经不同浓度条件下PPI和PEI25KDa聚合物溶液培养后的细胞存活率；

图12为Hela经不同浓度条件下PPI和PEI25KDa聚合物溶液培养后的细胞存活率；

图13为PPI-siRNA复合物在不同质量比条件下的琼脂糖凝胶电泳图（介质：DEPC水）；

图14为不同质量比条件下PPI-siRNA复合物、PEI-25kDa-siRNA复合物对稳定表达荧光素酶基因SMMC-7721细胞的基因沉默活性。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。

本发明是以咪唑二醛和小分子量聚乙烯亚胺为构建单元的新型聚阳离子基因载体，使用低毒而无转染活性的低分子量聚乙烯亚胺与安全性已知的药物代谢产物咪唑二醛构建含双亚胺键的核酸物质的载体（低分子量PEI交联衍生物），其制备方法为：低分子量的聚乙烯亚胺PEI与咪唑二醛按摩尔比为1:1-3.5的条件，在无水无氧环境下，将咪唑二醛溶液缓慢滴加到聚乙烯亚胺溶液里搅拌，发生醛基与氨基的缩合反应，反应溶剂为无水乙醇或氯仿，反应温度是室温条件。

本发明构建的含亚胺键结构的PEI在内涵体的酸性条件下亚胺键降解，释放出的游离伯氨基能够增强质子海绵效应，有助于核酸物质从内涵体-溶酶体里逃逸，再释放到细胞质或者进入细胞核，最后本身代谢为无毒的低分子量化合物。具有较高的转染活性和较低的细胞毒性，在不同的细胞中均有较好的生物活性，是一种高效、低毒的基因输送载体。

本发明对与核酸物质形成纳米颗粒复合物（polyplex）的理化性质表征方法包括：琼脂糖凝胶电泳、原子力显微镜、透射电子显微镜、动态光散射和Zeta电位测试；与核酸物质形成纳米颗粒复合物（polyplex）的细胞摄取、基因转染选用的DNA质粒是荧光素酶质粒，与核酸物质形成纳米颗粒复合物（polyplex）的基因转染和细胞毒性测试选用的细胞是COS-7细胞、Hella细胞和SMMC-7721细胞。

实施例1

含可降解亚胺键的核酸物质的载体（PPI）的制备

合成路线如图1所示。具体包括以下步骤：

(1)反应溶剂为无水乙醇，无水乙醇加入无水硫酸镁后静置48h，然后蒸馏得到新鲜的无水乙醇备用；整个反应在无水无氧（高纯氮气保护）的环境中进行，取小分子PEI（Mw=800Da）与咪唑二醛的摩尔比为1:2.5，用无水乙醇分别溶解小分子PEI和咪唑二醛，分别配成20mL和50mL的溶液；

(2)用恒压滴液漏斗逐滴的把咪唑二醛溶液加入到小分子PEI溶液中，在室温条件下搅拌反应体系，使之发生缩合反应24小时；

(3)反应停止后，首先用减压旋转蒸发仪在减压和低温的条件下把其中的大部分溶剂除去，然后产品用少量超纯水溶解，置于截留分子量为10000Da活化后的透析袋中透析48小时；透析结束后溶液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，转移到预先准备好的西林瓶中；最后将产品在-20°C冰箱中预冻8h后用冷冻干燥机冻干，24h后停止冻干，得到最终产物含可降解亚胺键的核酸物质的载体PPI。

以低毒性、小分子量PEI800为基本构建单元，已上市的药物代谢产物咪唑-4,5-二甲醛为连接剂，通过亲核加成、缩合脱水等一步聚合反应，再经透析（截留分子量10KDa）、冻干等后续纯化步骤，制备得到目标聚合物聚乙烯咪唑-4,5-亚胺(PPI)，并用¹H-NMR（图2）和FT-IR（图3）进行了表征和结构确证。

如图2的¹H-NMR谱图所示，亚胺键的特征峰形成有力的证明PEI800与咪唑二醛是直接聚合形成高分子化合物，7.7-7.8之间出现了亚胺键的(-CH=N-)的特征吸收峰。咪唑环上的(CH)吸收峰的化学位移在8.2左右。

FT-IR谱图（图3）进一步验证了聚阳离子的结构，亚胺键(-CH=N-)的吸收频率约在1639.71cm^-1上，约3419.71cm^-1处出现了咪唑环上的氮氢(NH)及聚乙烯亚胺骨架上的氮氢(NH)伸缩振动叠加的强吸收峰。亚甲基(-CH₂-)的吸收峰较低，约在2954.80cm^-1上。

核磁共振和红外光谱数据证明成功得到目标PPI。

测定高分子PPI的分子量

测定方法为凝胶渗透色谱(GPC)法，聚乙二醇（PEG）标准品以及实施例1制备的PPI为样品，分别用超纯水溶解配制成l0mg/mL的溶液，摇匀静置，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，进样20μL，记录色谱图。

将PEG标准品的重均分子量的对数值与相应的保留时间(t_R)进行线性回归，得回归方程。PPI样品通过该回归方程的公式计算出分子量和分布：

$\stackrel{\‾}{M}n=\mathrm{\ΣHi}/\mathrm{\Σ}(\mathrm{Hi}/\mathrm{Mi});$

$\stackrel{\‾}{M}w=\mathrm{\ΣHiMi}/\mathrm{\Σ}\mathrm{Hi};$

$D=\stackrel{\‾}{M}w/\stackrel{\‾}{M}n;$

上式中 分别为数均分子量和重均分子量；D指分布系数；Hi为供试品在保留时间i时的峰高；Mi为供试品在保留时间i时的分子量。

计算得：PPI的分子量=10500，=13400。

实施例2

PPI与pDNA复合物的制备

称取一定量聚合物PPI溶解于超纯水中，浓度为2.0mg/mL，0.45μm的微孔滤膜过滤后备用；吸取一定量pDNA溶液并用超纯水稀释成20μg/mL的pDNA储备液。制备PPI与pDNA复合物时，按照设定的一系列PPI和pDNA的质量比，将PPI溶液稀释成相应浓度，再迅速加入到相同体积且浓度恒定的pDNA溶液中（pDNA终浓度是2μg/mL），最后轻轻吹打、均匀混合，室温下孵育20～30分钟，即得到一系列不同质量比的复合物溶液，用作进一步的理化性质表征。

实施例3

PPI与pDNA复合物的琼脂糖凝胶电泳

称取1.0g琼脂糖，加入100mL1×TAE缓冲液，在微波炉中加热溶解，待温度降至65℃，加入4μL溴化乙啶（EB），配制成1.0%琼脂糖溶液（含0.5μg/mL溴化乙啶），倒入制胶槽中，插入样品梳，室温放置0.5-1小时固化成胶。然后，拔出样品梳，电泳槽中加入TAE缓冲液稍稍没过凝胶，等待上样。接着，按照复合物的制备方法来配制不同质量比的复合物溶液，复合物质量比依次为0，0.5，1，3，5，10，20，30，50。Marker选用DS^TM5000（100–5000bp），上样5μL；6×上样缓冲液（溴酚兰-甘油指示剂，含0.25%溴酚兰，40%甘油）1μL与复合物溶液5μL均匀混合，上样6μL。在90mV电压下电泳50分钟，最后，置于紫外凝胶成像系统观察并记录电泳图。结果如图4所示，当PPI与pDNA复合物的质量比为0.5时，聚合物PPI已经完全阻滞了DNA分子的迁移。实验证明了PPI具有很强的凝聚质粒DNA形成复合物纳米颗粒的能力，从而发挥保护pDNA的作用，以避免其在细胞吞噬前被降解。

实施例4

PPI与pDNA复合物的粒径分布和Zeta电位测定

按照实施例2复合物的制备方法来配制不同质量比的复合物溶液，选择测定复合物的质量比依次为0.5,1,3,5,10,20,30,50,样品量各为2mL。在温室条件下，首先预热动态光散射纳米粒度分析仪30分钟，再吸取1mL复合物溶液加入到微量样品池中，然后将微量样品池放入粒度分析仪的测试槽中，设置测试温度为25℃，介质为水，粘度为0.890cP，折射率为1.330。对于复合物的粒径分布测试，光散射角度为90℃，检测波长为659.0nm，每个样品测试3次，每次运行时间为1.5分钟，记录每个样品粒径的平均值及其多分散性（PDI）；对于复合物的Zeta电位测试，介电常数为78.54，pH值为7.0，Zeta电位分析模型为Smoluchowski方程（极性溶剂：Henrys方程F(ka)近似于1.5），每个样品测试3次，每次自动运行10次，记录每个样品Zeta电位的平均值及其迁移率。结果如图5、6所示，复合物的粒径稳定在150-200nm；复合物的Zeta电位分布在2.5-20mV之间。

实施例5

PPI与pDNA复合物的原子力显微镜观察

依据测量粒径的结果，选取PPI/pDNA质量比为10:l的复合物，通过原子力显微镜(AtomicForceMicroscope)来观察该复合物的形态。

首先PPI与pDNA配制成复合物溶液，然后用移液枪吸取5-10μL的复合物溶液小心翼翼的滴加在新鲜剥离的云母片上。云母片置于干燥器中自然晾干。在轻敲模式(TappingMode)下进行原子力显微镜检测，记录200nm比例下捕捉复合物颗粒的图片，记录相位图和高度图；如图7、8所示，复合物可形成纳米颗粒，粒径在100-200nm之间，进一步证明了复合物可形成较小的纳米颗粒。

实施例6

PPI与pDNA复合物的透射电镜观察

按照复合物的制备方法来配制PPI/pDNA质量比为10:l时的复合物溶液，样品量为100μL。先吸取10μL复合物溶液缓慢滴于400目的铜网上，室温下自然晾干，最后使用透射电子显微镜来观察样品的形态，记录透射电镜图。结果如图9所示，当PPI加入到DNA分子里，通过静电作用力络合形成复合物，呈现出类球形的纳米颗粒，其形态规则、均匀，透射电镜图显示是DNA分子被包裹于聚合物里面，粒径尺寸在100-200nm之间，与动态光散射粒径仪测得的尺寸基本一致。

实施例7

PPI与核酸复合物的细胞转染实验

选择COS-7细胞和HepG2细胞作为研究PPI与核酸复合物细胞转染的受体细胞。按照5-10×10⁴个数/mL细胞液的细胞密度转48孔细胞板，将加入细胞的48孔板置于37℃5%细胞培养箱里培养24小时。24h后每孔加入复合物溶液的体积是50μL，平行3个复孔，每孔加入pDNA的质量是500ng，稀释介质是磷酸盐缓冲溶液（PBS），所需考察复合物的质量比依次为0，5，10，20，30，50,70,100。接着，从培养箱中取出48孔细胞板，吸去培养液，每孔用200μLPBS缓冲溶液冲洗一次，再吸去PBS缓冲溶液，每孔加入250μLDMEM高糖培养基（含酚红），随后将一系列不同质量比的复合物溶液依次加入到细胞板中，置于37℃5%细胞培养箱里培养4小时。然后，从培养箱中取出48孔细胞板，吸去培养液，每孔用200μLPBS缓冲溶液冲洗一次，再吸去PBS缓冲溶液，每孔加入500μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基（含酚红），最后再置于37℃5%细胞培养箱里培养。44小时之后，测定细胞转染的效率。同时，采用MicroBCA法测定细胞裂解液里的总蛋白含量。通过样品的相对发光强度除以样品的总蛋白浓度后所得数值（RLU/mgprotein）来衡量细胞转染效率（即荧光素酶蛋白的表达量），每个样品平行测试3次，取平均值作图。结果如图10所示，PPI在不同类型细胞中均具备理想的输送pDNA的能力。

实施例8

PPI的细胞毒性实验

采用噻唑兰法（MTT）定量考察PPI对COS-7细胞、Hela细胞和SMMC-7721细胞的细胞毒性。首先，按照5-10×10⁴个数/mL细胞液的细胞密度转96孔细胞板，置于37℃5%细胞培养箱里培养过夜。其次，配制一系列不同浓度的聚合物溶液，每孔加入聚合物溶液的体积是100μL，平行5个复孔，稀释介质是DMEM高糖培养基（无酚红），所需考察聚合物的浓度依次为0，5，10，20，40，50，100，单位是μg/mL。接着，从培养箱中取出96孔细胞板，吸去培养液，每孔用100μLPBS缓冲溶液冲洗一次，再吸去磷酸盐缓冲溶液，将一系列不同浓度的聚合物溶液依次加入到细胞板中，置于37℃5%细胞培养箱里培养4小时。然后，从培养箱中取出96孔细胞板，吸去培养液，每孔用100μLPBS缓冲溶液冲洗一次，再吸去PBS缓冲溶液，每孔加入112.5μLDMEM高糖培养基（无酚红）和12.5μLMTT溶液（5mg/mL），继续置于37℃5%细胞培养箱里培养。6小时之后，从培养箱中取出96孔细胞板，吸去培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜（分子生物级），轻微摇匀，待蓝紫色结晶物甲赞（formazan）完全溶解，最后，使用多功能酶标仪测定样品在570nm和630nm处的吸光度值。每个样品平行测试5次，取平均值作图（PEI800Da和PEI25KDa作为对照组）。细胞存活率（百分比）是以待测样的吸光度值相比正常细胞的吸光度值（即聚合物溶液的浓度为0）来表示。图11-12表明，PPI在一系列工作浓度范围内对COS-7细胞、Hela细胞的毒性均很低，细胞存活率均在80～120%，PPI对细胞的毒性随着浓度的增大而增大，在相同浓度下细胞存活率比PEI25KDa高60-80%。

实施例9

PPI与siRNA复合物的琼脂糖凝胶电泳

聚阳离子PPI与核酸相互作用将核酸包裹形成纳米颗粒，当纳米颗粒形成后将会是核酸表面的电荷在外界电场的作用下不能展现出来，故在反应前后核酸在琼脂糖凝胶电泳中表现出的特性会明显不同，基于此原理可以对聚阳离子PPI对核酸包裹的效率进行测定。构建的聚阳离子PPI是一种以含有氨基的构建单元为骨架构建出的阳离子聚合物，它的表面的正电荷可通过静电作用力凝聚并压缩带有负电荷的siRNA分子，然后形成包裹有siRNA的纳米颗粒。当聚阳离子PPI完成对DNA分子的完全包裹，表面带有正电荷的PPI-siDNA复合物在电场中的迁移会受到阻滞，故采用琼脂糖凝胶电泳来考察一系列不同质量比条件下的阳离子聚合物PPI对siDNA的包裹能力。

实验流程：配置3%（m/v）琼脂糖凝胶，称取3g琼脂糖加入到100ml1×TAE缓冲液中，微波炉中加热至完全溶解，置于室温冷却，待温度降至65℃左右，加入EB溴化乙啶，（含0.5μg/ml溴化乙啶），缓慢倒入制胶槽中，随即插入样品梳子，室温静置0.5-1小时等胶凝固。拔出样品梳子，电泳槽中加入TAE缓冲液没过凝胶，准备上样。接着，按照复合物的制备方法来配制不同质量比的复合物溶液，复合物质量比依次为0，3，5，10，15，20，25，30。Marker选用20bpDNA基因标记物大小，上样2μl；6×上样缓冲液1μl与复合物溶液5μl均匀混合，每个样品分别上样6μl。在110V电压下电泳45分钟，最后，置于紫外凝胶成像系统观察并记录电泳图（图13）。

实施例10

PPI与siRNA复合物的基因沉默活性

首先，37℃，5%CO₂细胞培养箱里培养过夜。分别配制antisensesiRNA混合溶液和nonsensesiRNA混合溶液。然后，按照PPI与siRNA混合溶液设置一系列不同的质量比来配制复合物溶液，其次，设置质量比为2的PEI25KDa-siRNA复合物溶液和质量比为1的Lipofectamine2000-siRNA复合物溶液，每孔加入复合物溶液的体积是50μl，平行3个复孔，每孔加入siRNA的质量是150ng，稀释介质是1×OPTI-MEMI低血清培养液。接着，从培养箱中取出48孔细胞板，吸去培养液，每孔用200μl1×PBS缓冲溶液冲洗一次，再吸去PBS缓冲溶液，每孔加入250μl1×OPTI-MEMI低血清培养基，随后将一系列不同质量比的复合物溶液依次加入到细胞板中，置于37℃5%CO2细胞培养箱里培养4小时。然后，从培养箱中取出细胞板，吸去培养液，每孔用200μl1×PBS缓冲溶液冲洗一次，再吸去PBS缓冲溶液，每孔加入500μl含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基（含酚红），最后再置于37℃5%CO2细胞培养箱里培养。44小时之后，检测荧光素酶基因的表达，通过样品的相对发光强度除以样品的总蛋白浓度后所得数值（RLU/mgprotein）来衡量细胞同步转染效率（正常细胞的荧光素酶基因表达设置为100%），每个样品平行测试3次，取平均值作图。通过细胞直接转染来比较PPI与两种商业化转染试剂PEI25KDa和Lipofectamine2000在其最理想或是推荐质量比的条件下输送siRNA沉默靶基因的能力，选择内源性稳定表达荧光素酶基因（pGL3-controlluciferasegene）SMMC-7721细胞作为研究对象。如图14所示，PPI凝聚antisensesiRNA沉默荧光素酶基因的能力高于PEI25KDa和Lipofectamine2000（nonsensesiRNA作为对照组），这样的结果是基于生物响应性降解的PPI，在siRNA输送过程中能够及时、快速的释放出siRNA，进而改善靶基因的沉默效率。

实施例11

一种含可降解亚胺键的核酸物质的载体的制备，包括以下步骤：

(1)整个反应在无水无氧（高纯氮气保护）的环境中进行，取小分子PEI（Mw=2000Da）与咪唑二醛的摩尔比为1:1，用氯仿分别溶解小分子PEI和咪唑二醛，分别配成20mL和50mL的溶液；

(2)用恒压滴液漏斗逐滴的把咪唑二醛溶液加入到小分子PEI溶液中，在室温条件下搅拌反应体系，使之发生缩合反应24小时；

(3)反应停止后，首先用减压旋转蒸发仪在减压和低温的条件下把其中的大部分溶剂除去，然后产品用少量超纯水溶解，置于截留分子量为7k活化后的透析袋中透析12小时；透析结束后溶液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，转移到预先准备好的西林瓶中；最后将产品在-20°C冰箱中预冻8h后用冷冻干燥机冻干，24h后停止冻干，得到最终产物含可降解亚胺键的核酸物质的载体。

实施例12

一种含可降解亚胺键的核酸物质的载体的制备，包括以下步骤：

(1)反应溶剂为无水乙醇，无水乙醇加入无水硫酸镁后静置48h，然后蒸馏得到新鲜的无水乙醇备用；整个反应在无水无氧（高纯氮气保护）的环境中进行，取小分子PEI（Mw=1300Da）与咪唑二醛的摩尔比为1:3.5，用无水乙醇分别溶解小分子PEI和咪唑二醛，分别配成20mL和50mL的溶液；

(2)用恒压滴液漏斗逐滴的把咪唑二醛溶液加入到小分子PEI溶液中，在室温条件下搅拌反应体系，使之发生缩合反应24小时；

(3)反应停止后，首先用减压旋转蒸发仪在减压和低温的条件下把其中的大部分溶剂除去，然后产品用少量超纯水溶解，置于截留分子量为20k活化后的透析袋中透析30小时；透析结束后溶液用孔径为0.35μm的微孔滤膜过滤，转移到预先准备好的西林瓶中；最后将产品在-20°C冰箱中预冻8h后用冷冻干燥机冻干，24h后停止冻干，得到最终产物含可降解亚胺键的核酸物质的载体。

以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。

Claims (4)

1.一种含可降解亚胺键的核酸物质的载体在制备核酸药物中的应用，其特征在于，所述载体的结构式为：

其中，x为1～20，y为1～20，n为1～20；

所述核酸物质的载体的基本构建单元为低分子量聚乙烯亚胺PEI，所述低分子量PEI为重均分子量Mw在2000Da以下的任一低分子量的PEI；

所述低分子量PEI的分子量为：Mw＝800Da/Mn＝600Da或Mw＝1300Da/Mn＝1200Da或Mw＝2000Da/Mn＝1800Da；其中，Mw为重均分子量，Mn为数均分子量；

所述的含可降解亚胺键的核酸物质的载体的制备方法包括以下步骤：

(1)将低分子量PEI与咪唑二醛按摩尔比为1:1-3.5的比例加入到溶剂中，得到反应体系；所述溶剂选自无水乙醇或氯仿；所述低分子量PEI为Mw在2000Da以下的任一低分子量的PEI，所述低分子量PEI的分子量为：Mw＝800Da/Mn＝600Da或Mw＝1300Da/Mn＝1200Da或Mw＝2000Da/Mn＝1800Da；其中，Mw为重均分子量，Mn为数均分子量；

(2)搅拌、摇动或震荡反应体系，使之发生缩合反应，即得所述含可降解亚胺键的核酸物质的载体；

所述制备方法还包括以下分离纯化的步骤：将所述含可降解亚胺键的核酸物质的载体用超纯水溶解后，置于活化后的透析袋中透析，所述透析袋的截留分子量为7k～20k，所述透析的时间为12～48小时；透析结束后，用微孔滤膜过滤，所述微孔滤膜的孔径为0.22～0.45μm，最后预冻、冻干。

2.一种复合物，其特征在于，所述复合物是按照如下方法制备得到的：将权利要求1中所述的含可降解亚胺键的核酸物质的载体的溶液加入到核酸溶液中，混合均匀，室温下孵育，即得。

3.根据权利要求2所述的复合物，其特征在于，所述核酸为DNA疫苗、siRNA或microRNA。

4.根据权利要求2所述的复合物，其特征在于，所述孵育的时间为20～120分钟。