CN102443169A - 一种氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体制备工艺，将小分子量PEI及1，4-丁二醇二氯甲酸酯及三乙胺加入反应溶剂，搅拌、摇动或震荡反应体系，使之发生缩合反应，然后用3500Da活化后的透析袋中透析48小时，最后用0.22μm的微孔滤膜过滤，冻干即得到产品。与现有技术相比，本发明制备了纯化的氨酯类聚乙烯亚胺衍生物PEI-Bu，与PEIC相比较，PEI-Bu在与DNA更低的质量比时显示了最高的转染活性和较小细胞毒性，为高效、低毒的基因物质载体，可以用于输送基因物质。

Description

一种氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体制备工艺

技术领域

本发明涉及一种高效、低毒聚阳离子载体，尤其是涉及一种体外试验中已证明在细胞中具有基因输送功能的小分子量PEI交联衍生物的制备、纯化方法。

背景技术

基因疗法是在先天和后天的多种疾病治疗中的一种有力工具，因为它可以通过调节细胞中的生物活性蛋白的表达来预防，治疗，甚至治愈疾病。基因治疗在其发展过程中遇到了一系列技术瓶颈，其中最重要的瓶颈之一是基因物质安全有效的体内输送。

目前常用的基因输送载体可以分为重组病毒载体及人工合成载体(即非病毒载体)。病毒载体虽然显示了高的转染效率，但由于病毒的变异会引起潜在的致病危险，并且病毒表面成分会引起人体免疫反应，同时病毒的制备和纯化困难且携载基因容量小。因此非病毒基因载体被认为是更理想的基因物质输送载体。

传统的生物可降解高分子材料(如PGA、PLA、PLGA)不具有基因内吞逃逸功能，所以转染率不高，改性天然高分子如壳聚糖，其结构在设计改造上具有局限性，而以聚乙烯亚胺(PEI)为代表的能够帮助基因物质内吞逃逸的聚阳离子则因高分子量而引起细胞毒性过大。

PEI是目前研究最为广泛的聚阳离子非病毒载体，分支状分子量为25kDa的PEI(PEI 25kDa)转染效率最高，但是PEI 25kDa同时因其烷基骨架无法降解而导致细胞累计毒性较大。多数的国内外研究集中在可降解的PEI交联衍生物。

本课题组徐松琳在控制释放杂志(Journal of controlled release，2008，130，64-68)发表了“Novel poly(ethylene imine)biscarbamate conjugate as an efficient and nontoxicgene delivery system”的文章，该文章中所合成的氨酯类衍生物PEIC在与报道基因复合质量比例为40/1时达到最大转染活性(与商业化聚乙烯亚胺25kDa对照)，质量比为40/1时会增加载体的载量从而会带来更大的毒性。同时在PEIC的合成操作部分没有考虑到纯化也会带来更大的毒性。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高效、低毒，可以用于输送基因物质的氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体制备工艺。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体制备工艺，包括以下步骤：

(1)将聚乙烯亚胺(PEI)及1，4-丁二醇二氯甲酸酯分别溶于氯仿中，首先向PEI的氯仿溶液中加入三乙胺，然后在无水无氧条件下将1，4-丁二醇二氯甲酸酯的氯仿溶液逐滴加入到反应体系中后搅拌、摇动或震荡反应体系，使之发生缩合反应，反应时间为24小时；

(2)用旋转蒸发仪在减压和降温的条件下把步骤(1)制备得到产品中的大部分有机溶剂除去，然后再把得到的粗产物至于真空干燥箱内干燥过夜；

(3)利用少量超纯水溶解步骤(2)得到的产品后置于截留分子量为3500Da活化后的透析袋中透析48小时；

(4)透析结束后产品用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后分别转移到西林瓶中，产品在-20℃冰箱预冻过夜后用冷冻干燥机冻干，24h后停止冻干，即得到氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体产品。

所述的聚乙烯亚胺的分子量为800Da。

所述的聚乙烯亚胺及1，4-丁二醇二氯甲酸酯的摩尔比为3∶2。

PEI的氯仿溶液与1，4-丁二醇二氯甲酸酯的氯仿溶液的体积比为3∶20。

PEI的氯仿溶液与三乙胺的体积比为1∶2.5。

所述的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体产品可与DNA或RNA混合形成纳米颗粒。

氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体(PEI-Bu)的分子结构如下所示：

与现有技术相比，本发明制备了纯化的氨酯类聚乙烯亚胺衍生物PEI-Bu，与PEIC相比较，在Cos-7细胞中，PEIC在质量比为40比1时达到最佳转染活性，而本专利得到的PEI-Bu在三种不同的细胞器(Cos-7，Hep G2和Hela)中均可以在与DNA(荧光素酶质粒)质量比为10比1达到最高转染活性(图5，6，7)，低的质量比会带来更为低的毒性，同时，在三种不同的细胞器(Cos-7，Hep G2和Hela)，PEI-Bu均显示出比阳性对照PEI 25kDa更为显著的细胞存活率(图8，9，10)，因此，PEI-Bu具有高效、低毒的特点，可以用于输送基因物质。

附图说明

图1为实施例4中高分子(PEI-Bu)与质粒复合物(Polyplex)的粒径图；

图2为实施例5中高分子(PEI-Bu)与质粒复合物(Polyplex)Zeta电位图；

图3为实施例6中高分子(PEI-Bu)与质粒复合物(Polyplex)的原子力显微镜照片；

图4为实施例7中高分子(PEI-Bu)与质粒复合物(Polyplex)的透射电镜照片；

图5为实施例8中Cos-7细胞转染活性实验结果；

图6为实施例8中Hep G2细胞转染活性实验结果；

图7为实施例8中Hela细胞转染实验结果；

图8为实施例9中Cos-7细胞毒性实验结果；

图9为实施例9中Hep G2细胞毒性实验结果；

图10为实施例9中Hela细胞毒性实验结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

分子量为800Da的PEI和1，4-丁二醇二氯甲酸酯在摩尔比为3∶2的条件下反应。氯仿和三乙胺分别加入氢化钙后在高纯氮保护下加热回流2小时，收集新鲜馏分备用。用氯仿分别溶解PEI800和1，4-丁二醇二氯甲酸酯，在无水无氧条件下将二者分别配成3mL和20mL的溶液，反应在冰浴条件下进行，首先在反应体系中加入PEI800的氯仿溶液，然后加入2.5倍过量的三乙胺，1，4-丁二醇二氯甲酸酯的氯仿溶液在无水无氧条件下逐滴加入到反应体系中反应24小时。反应停止后首先用旋转蒸发仪在减压和降温的条件下把其中的大部分有机溶剂除去，然后再把得到的粗产物至于真空干燥箱内干燥过夜。产品用少量超纯水溶解后置于截留分子量为3500Da活化后的透析袋中透析48小时。透析结束后产品用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后分别转移到预先准备好的西林瓶中。产品在-20℃冰箱预冻过夜后用冷冻干燥机冻干，24h后停止冻干，得到产品PEI-Bu。

实施例2

凝胶渗透色谱(GPC)法测定聚合物分子量

聚乙二醇(PEG)标准品以及PEI-Bu为样品，分别用纯水溶解得到10mg/ml的溶液，摇匀静置，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，进样20μl，记录色谱图。将PEI标准品的重均分子量的对数值lgMw与相应的保留时间(tR)进行线性回归，得回归方程。PEI-Sc样品通过下列公式计算分子量和分布：

Mn＝∑RIi/∑(RIi/Mi)；

Mw＝∑(RIi Mi)/∑RIi；

D＝Mw/Mn；

上式中Mn、Mw分别为数均分子量和重均分子量；D指分布系数；RIi为供试品在保留时间i时的峰高；Mi为供试品在保留时间i时的分子量。计算得：PEI-Sc的分子量Mn＝3278，Mw＝4289。

实施例3

高分子(PEI-Bu)与质粒复合物(Polyplex)的制备

称取定量的聚合物，加超纯水配置成2mg/mL的溶液，然后用0.22μm的无菌滤头过滤，质粒的浓度稀释成1mg/mL，配置不同质量比的复合物溶液，需要保持质粒溶液的浓度不变，然后按照不同的质量比稀释高分子溶液的浓度，注意保持稀释后的高分子溶液和质粒溶液的体积相等，最后将高分子溶液快速加入到质粒溶液中混合，室温下孵育20min，这样就得到一系列质量比的复合物，可用作进一步的物化性质测定。

实施例4

高分子(PEI-Bu)与质粒复合物(Polyplex)粒径测定

复合物粒径的测定的样品量为1.6mL，Luciferase质粒和高分子溶液的体积各位800μL，质粒的浓度均为20μg/mL，依据质量比对高分子溶液(原始浓度为2mg/mL)进行稀释，所需测定各的质量比为0.1，0.5，1，3，5，7，10，15，20，30。在混合时将高分子溶液加入质粒溶液中，吹打均匀，室温孵育20min，。检测采用Brookhaven Instruments公司的粒径仪，每个样品测定3次，取平均值作图，如图1所示。经检测，Polyplex可形成纳米颗粒用于基因输送。

实施例5

高分子(PEI-Bu)与质粒复合物(Polyplex)Zeta电位测定

复合物ζ点位的测定的样品量为1.6mL，Luciferase质粒和高分子溶液的体积各位800μL，质粒的浓度均为20μg/mL，依据质量比对高分子溶液(原始浓度为2mg/mL)进行稀释，所需测定各的质量比为0.1，0.5，1，3，5，7，10，15，20，30。在混合时将高分子溶液加入质粒溶液中，吹打均匀，室温孵育20min，然后检测。检测采用Brookhaven Instruments公司的粒径仪，每个样品测定3次，取平均值作图，如图2所示。实验证明Polyplex的Zeta电势为正，可包裹带负电荷的DNA。

实施例6

高分子(PEI-Bu)与质粒复合物(Polyplex)的原子力显微镜

依据测量粒径的结果，选取质量比为5∶1通过原子力显微镜(Atomic ForceMicroscope)来观察复合物的形态。首先PEI-Sc与DNA质粒配制成复合物溶液。然后用移液枪将约5-10μL的复合物溶液小心翼翼的滴加在新鲜获得的云母片上。云母片置于室温和干燥的环境中晾干。待进行原子力显微镜的测试时，检测在轻敲模式(Tapping Mode)下进行，在500nm比例下捕捉复合物颗粒的图片。如图3所示，Polyplex可形成纳米颗粒。

实施例7

高分子(PEI-Bu)与质粒复合物(Polyplex)的透射电镜

原子力显微镜的结果可以继续通过透射电子显微镜(Transmission ElectronMicroscopy)进行验证，复合物溶液依然采用测定原子力显微镜时配置的溶液，用移液枪取5-20μL的复合物溶液小心翼翼的滴加在透射电镜专用铜网上面，之后铜网置于白炽灯下烘干。约30min之后，待所有液体挥发后可以进行透射电镜的检测。如图4所示，Polyplex同样形成纳米颗粒。

实施例8

高分子(PEI-Bu)与质粒复合物(Polyplex)的细胞转染实验

首先，在48孔细胞培养板中，加入0.5mL的细胞悬液，密度是5.0-10×104/mL，培养过夜。48孔板转染时，每孔加入质粒的量是500ng，体积25μL，将聚合物配置成2mg/mL的溶液，并用0.22μm的滤膜无菌过滤，按照设置的待测样品与质粒的质量比，稀释成所需的比例，聚合物溶液的总体积为25μL，然后把聚合物溶液加入到质粒的溶液当中去，快速混匀，孵育20min。这样加入每孔的复合物的体积为50μL，为总体积(500μL)的十分之一，符合规定。每个质量比做三个复孔。阳性对照组PEI 25kDa和Lipofectamine 2000，以其最佳质粒比2时的结果各做三个对照孔，在孵育的这段时间里，从培养箱中拿出细胞，除去有血清的培养基，再用200μL的PBS溶液洗一遍，培养基换成250μL的无血清的培养基，然后将孵育好的复合物按顺序加入到细胞中去。4小时后，除去无血清的培养基，每孔加入含10％胎牛血清和1％双抗的心想培养基，再培养48小时，检测转染结果，Cos-7细胞转染活性、Hep G2细胞转染活性和Hela细胞转染实验结果如图5-7所示，PEI-Bu在不同细胞中均具有担载基因物质的能力，尤其是在Cos-7和Hep G2细胞株中与基因复合质量比为10/1时基因转染效率最高，并超过了阳性对照Lipo和PEI 25KDa。在Hela细胞中，质量比为3/1时基因转染效率最高，并超过PEI 25kDa。

实施例9

PEI-Sc的细胞毒性实验(Hep G2，Hela，Cos-7)

接种细胞，将细胞消化，稀释成密度为5-10×10⁴/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μL，培养过夜。第二步将2mg/mL的高分子DMEM溶液稀释成不同的浓度梯度，终体积为100μL，阳性对照组PEI 25KDa和PEI 800Da也稀释为与待测样品组一致的浓度梯度。取出细胞后，移除有血清的培养基，用100μL的PBS洗一遍，直接把配制好的高分子DMEM溶液加到各个细胞孔中，阴性对照组中加入100μL无血清无酚红DMEM。4小时之后，除去培养液和高分子溶液，每孔加入100μL的无血清无酚红培养基，避光条件下再加入25μL的MTT溶液(MTT溶液用PBS配制成5mg/mL)，置于细胞培养箱中培养6小时。显微镜下观察活细胞的结晶情况，如果还没有完全结晶，可适当延长放置时间。如果完全结晶，小心翼翼的倒出96孔板中的液体，然后在每孔中各加入150μL的DMSO，轻微摇晃96孔板使甲膜晶体充分溶解。由于加入DMSO后溶液颜色会随时间变化，因此最好酶标仪的检测在20min内进行，检测波长为490nm，通过样品组的在此波长的吸收值和空白对照组做比值，从而得到细胞的成活率，Cos-7细胞毒性、Hep G2细胞毒性和Hela细胞毒性实验结果如图8-10所示。在3种不同的细胞器中，PEI-Bu均显示了比PEI 25kDa更小的细胞毒性。

Claims (6)

1.一种氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体制备工艺，其特征在于，该工艺包括以下步骤：

(1)将聚乙烯亚胺(PEI)及1，4-丁二醇二氯甲酸酯分别溶于氯仿中，首先向PEI的氯仿溶液中加入三乙胺，然后在无水无氧条件下将1，4-丁二醇二氯甲酸酯的氯仿溶液逐滴加入到反应体系中后搅拌、摇动或震荡反应体系，使之发生缩合反应，反应时间为24小时；

(2)用旋转蒸发仪在减压和降温的条件下把步骤(1)制备得到产品中的大部分有机溶剂除去，然后再把得到的粗产物至于真空干燥箱内干燥过夜；

(3)利用少量超纯水溶解步骤(2)得到的产品后置于截留分子量为3500Da活化后的透析袋中透析48小时；

(4)透析结束后产品用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后分别转移到西林瓶中，产品在-20℃冰箱预冻过夜后用冷冻干燥机冻干，24h后停止冻干，即得到氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体产品。

2.根据权利要求1所述的一种氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体制备工艺，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺的分子量为800Da。

3.根据权利要求1所述的一种氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体制备工艺，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺及1，4-丁二醇二氯甲酸酯的摩尔比为3∶2。

4.根据权利要求1所述的一种氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体制备工艺，其特征在于，PEI的氯仿溶液与1，4-丁二醇二氯甲酸酯的氯仿溶液的体积比为3∶20。

5.根据权利要求1所述的一种氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体制备工艺，其特征在于，PEI的氯仿溶液与三乙胺的体积比为1∶2.5。

6.根据权利要求1所述的一种氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体制备工艺，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体产品可与DNA或RNA混合形成纳米颗粒。

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