CN111393640A - 单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物及其制备方法以及基因载体 - Google Patents

单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物及其制备方法以及基因载体 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物及其制备方法以及基因载体，涉及生物医药技术领域。所述单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物具有如下结构式(Ⅰ)所示结构。本发明以单宁酸为修饰基团，对聚乙烯亚胺进行分子修饰，得到具有结构式(Ⅰ)所示结构的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物，该化合物可以有效地凝聚DNA，形成纳米复合物，可以作为基因载体转运DNA，且由于采用生物兼容性好、细胞毒性低的天然多酚单宁酸为修饰基团，使得单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物具有毒性低、生物兼容性好、水溶性好的优势。此外，该化合物经两步反应即可获得，合成步骤少、反应操作简单，降低了合成成本。

Description

单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物及其制备方法以及基因载体
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物及其制备方法以及基因载体。
背景技术
基因治疗是指将正常基因或有治疗作用的基因导入靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到预防或治疗疾病的目的。作为一种的全新的治疗手段，基因治疗具有高靶向性、高效性和副作用小等优点，显示出巨大的应用潜力。基因载体是限制基因治疗发展的关键所在。
聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)的分子结构中氨基含量较高，且具有不同pKa值的伯胺、仲胺和叔胺，这使得PEI在较宽范围pH条件下均具有吸收质子的能力，即质子海绵效应，有利于实现细胞内的内涵体逃逸，因此，PEI也成为了目前公认的、最为有效的阳离子聚合物基因载体。然而，高分子量PEI虽然转染效率较高，但其正电荷密度过高且不可降解，从而会具有较高的细胞毒性；而低分子量PEI细胞毒性较小，但其转染效率却较低。因此，许多研究者对PEI进行接枝改性以期获得高转染效率、低细胞毒性的基因载体。目前报道的接枝改性的PEI基因载体多是采用天然和人工合成高分子化合物材料，如PAMAM、PLL、壳聚糖等，修饰PEI得到的阳离子共聚物，但由于其分子量较大，导致其细胞毒性并不理想，且合成步骤较复杂，也导致了其合成成本较高，从而限制了基因载体的发展和应用。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物及其制备方法以及基因载体，旨在提供一种合成步骤少且细胞毒性低的基因载体。
为实现上述目的，本发明提出一种单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物，所述单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物具有如下结构式(Ⅰ)所示结构：
Figure BDA0002480955330000021
其中，
Figure BDA0002480955330000022
为实现上述目的，本发明还提出一种如上所述的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法，所述单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法包括以下步骤：
将单宁酸、无水四氢呋喃、三乙胺混合后，加入氯乙酰氯，乙酰化反应生成中间体M；
将所述中间体M与无水四氢呋喃混合后，加入聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液，于25～45℃下搅拌，使反应生成单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物；
其中，所述中间体M具有如下结构式(Ⅱ)所示结构：
Figure BDA0002480955330000023
其中，
Figure BDA0002480955330000031
可选地，将单宁酸、无水四氢呋喃、三乙胺混合后，加入氯乙酰氯，乙酰化反应生成中间体M的步骤中，每克单宁酸对应加入12.5～15mol氯乙酰氯。
可选地，将单宁酸、无水四氢呋喃、三乙胺混合后，加入氯乙酰氯，乙酰化反应生成中间体M的步骤包括：
将单宁酸、无水四氢呋喃、三乙胺混合并搅拌均匀后，置于冰水浴中，滴加氯乙酰氯；
滴加完毕后，撤去冰水浴，搅拌使发生乙酰化反应形成混合溶液；
对所述混合溶液进行分离提纯以获得浓缩产物，将所述浓缩产物干燥处理，得到中间体M。
可选地，滴加完毕后，撤去冰水浴，搅拌使发生乙酰化反应形成混合溶液的步骤中，所述乙酰化反应的温度为25～45℃；和/或，
所述乙酰化反应的时间为18～24h。
可选地，对所述混合溶液进行分离提纯以获得浓缩产物，将所述浓缩产物干燥处理，得到中间体M的步骤包括：
采用截留分子量为2000～2500的透析袋，对所述混合溶液进行透析；
收集截留液进行低温真空浓缩以获得浓缩产物；
将所述浓缩产物在-18～-22℃条件下预冷冻22～26h后，冷冻干燥22～26h，得到中间体M。
可选地，将所述中间体M与无水四氢呋喃混合后，加入聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液，于25～45℃下搅拌，使反应生成单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的步骤中，每克所述中间体M对应加入0.6～0.75mol聚乙烯亚胺。
可选地，所述聚乙烯亚胺的分子量为300～800。
可选地，将所述中间体M与无水四氢呋喃混合后，加入聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液，于25～45℃下搅拌，使反应生成单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的步骤包括：
将所述中间体M与无水四氢呋喃混合并搅拌均匀后，向其中滴加聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液，滴加完毕后，于25～45℃下搅拌反应18～24h，形成反应溶液；
将冷却后的所述反应溶液置于截留分子量为400～600的透析袋中，流水透析22～26h后，去离子水透析10～15h，收集浓缩液；
将所述浓缩液进行低温真空浓缩后，于-18～-22℃条件下预冷冻22～26h，然后冷冻干燥22～26h，得到单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物。
此外，本发明还提出一种基因载体，所述基因载体包括如上所述的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法制得的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物。
本发明提供的技术方案中，以单宁酸为修饰基团，对聚乙烯亚胺进行分子修饰，得到具有结构式(Ⅰ)所示结构的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物，该化合物可以有效地凝聚DNA，形成纳米复合物，可以作为基因载体转运DNA，且由于采用生物兼容性好、细胞毒性低的天然多酚单宁酸为修饰基团，使得单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物具有毒性低、生物兼容性好、水溶性好的优势。此外，该化合物经两步反应即可获得，合成步骤少、反应操作简单，降低了合成成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1制得的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的红外表征图谱；
图2为实施例1制得的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物在琼脂糖凝胶阻滞实验中的电泳图；
图3为实施例2制得的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物在琼脂糖凝胶阻滞实验中的电泳图；
图4为实施例3制得的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物在琼脂糖凝胶阻滞实验中的电泳图；
图5为实施例1制得的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的转染效果检测的荧光显示图；
图6为实施例2制得的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的转染效果检测的荧光显示图；
图7为实施例3制得的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的转染效果检测的荧光显示图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
高分子量PEI虽然转染效率较高，但其正电荷密度过高且不可降解，从而会具有较高的细胞毒性；而低分子量PEI细胞毒性较小，但其转染效率却较低。因此，许多研究者对PEI进行接枝改性以期获得高转染效率、低细胞毒性的基因载体。目前报道的接枝改性的PEI基因载体多是采用天然和人工合成高分子化合物材料，如PAMAM、PLL、壳聚糖等，修饰PEI得到的阳离子共聚物，但由于其分子量较大，导致其细胞毒性并不理想，且合成步骤较复杂，也导致了其合成成本较高，从而限制了基因载体的发展和应用。
鉴于此，本发明提出一种单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物A，所述单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物A具有如下结构式(Ⅰ)所示结构：
Figure BDA0002480955330000061
其中，
Figure BDA0002480955330000062
本发明提供的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物A具有结构式(Ⅰ)所示的结构，该化合物A以生物兼容性好、细胞毒性低的天然多酚单宁酸为分子骨架，从而具有具有毒性低、生物兼容性好、水溶性好的优势，且结构稳定，能够有效地凝聚DNA，形成纳米复合物，可以作为基因载体转运DNA。
进一步地，本发明还提供了一种单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法，以天然多酚单宁酸和PEI为反应原料，经两步反应即可得到如上所述的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物A。
本实施例中，所述单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法包括以下步骤：
步骤S10、将单宁酸、无水四氢呋喃、三乙胺混合后，加入氯乙酰氯，乙酰化反应生成中间体M；
步骤S20、将所述中间体M与无水四氢呋喃混合后，加入聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液，于25～45℃下搅拌，使反应生成单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物A；
其中，所述中间体M具有如下结构式(Ⅱ)所示结构：
Figure BDA0002480955330000071
其中，
Figure BDA0002480955330000072
其合成路线如下：
Figure BDA0002480955330000073
本发明方法以单宁酸为起始原料，先经氯乙酰化反应制得中间体M，再将中间体M与PEI反应得到单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物，合成步骤少、反应操作简单，降低了合成成本。
在进行步骤S10时，先将单宁酸、无水四氢呋喃、三乙胺依次加入反应容器中混合，然后在乙酰化试剂的作用下进行反应，本实施例采用氯乙酰氯作为乙酰化试剂，且每克单宁酸对应加入12.5～15mol氯乙酰氯。
具体实施时，步骤S10包括：
步骤S11、将单宁酸、无水四氢呋喃、三乙胺混合并搅拌均匀后，置于冰水浴中，滴加氯乙酰氯。
步骤S12、滴加完毕后，撤去冰水浴，搅拌使发生乙酰化反应形成混合溶液。
乙酰化反应过程激烈，在加入氯乙酰氯时，宜将整个反应体系置于冰水浴环境下，并缓慢滴加氯乙酰氯。
此外，步骤S12中，乙酰化反应的温度为25～45℃；乙酰化反应的时间为18～24h。
步骤S13、对所述混合溶液进行分离提纯以获得浓缩产物，将所述浓缩产物干燥处理，得到中间体M。
具体实施时，步骤S13可以通过如下步骤进行操作：
步骤S131、采用截留分子量为2000～2500的透析袋，对所述混合溶液进行透析。
其中，在进行透析步骤时，先采用流水透析22～26h，再使用去离子水透析10～14h，且在使用去离子水进行透析期间，每1.5～2.5h更换一次透出液。
步骤S132、收集截留液进行低温真空浓缩以获得浓缩产物。
其中，低温真空浓缩的时间以截留液中刚好有固体物质析出的时间为准。
步骤S133、将所述浓缩产物在-18～-22℃条件下预冷冻22～26h后，冷冻干燥22～26h，得到中间体M。
在进行步骤S20时，先将中间体M和聚乙烯亚胺分别溶于四氢呋喃中，然后将两种溶液混合，并于25～45℃下搅拌使发生反应。其中，中间体M和聚乙烯亚胺定量加入，优选地，每克中间体M对应加入0.6～0.75mol聚乙烯亚胺。
进一步地，采用的聚乙烯亚胺优选分子量为300～800的聚乙烯亚胺。
具体地，在实施步骤S20时，步骤S20可以包括以下步骤：
步骤S21、将所述中间体M与无水四氢呋喃混合并搅拌均匀后，向其中滴加聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液，滴加完毕后，于25～45℃下搅拌反应18～24h，形成反应溶液；
步骤S22、将冷却后的所述反应溶液置于截留分子量为400～600的透析袋中，流水透析22～26h后，去离子水透析10～15h，收集浓缩液；
步骤S23、将所述浓缩液进行低温真空浓缩后，于-18～-22℃条件下预冷冻22～26h，然后冷冻干燥22～26h，得到单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物。
其中，在进行步骤S22时，先进行流水透析，再使用去离子水进行透析，且在使用去离子水进行透析时，每1.5～2.5h更换一次透出液；在进行步骤S23时，先将浓缩液低温真空浓缩至刚好有固体物质析出，然后进行预冷冻、冷冻干燥处理。
此外，本发明还提出一种基因载体，所述基因载体包括如上所述的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法制得的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物。该基因载体可以单独作为基因载体使用，也可以与其他载体材料共同制成基因载体使用，具有细胞毒性低、生物兼容性好、合成步骤少、制备成本低、水溶性优良的优点，应用范围更为广泛。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
往圆底烧瓶中依次加入2.0g单宁酸，25mL无水四氢呋喃，5mL三乙胺，搅拌均匀。在冰水浴条件下，向上述体系中缓慢滴加28mol氯乙酰氯，滴加完毕后，撤去冰水浴，于35℃下继续搅拌反应20h。将反应体系转移至截留分子量为2000的透析袋中，先采用流水透析24h，然后再采用去离子水透析12h。去离子水透析期间，每2h更新一次透出液，透析结束后收集截留液进行低温真空浓缩，再将浓缩产物在-20℃条件下预冷冻24h，最后再置于冷冻干燥器中冷冻干燥24h，得到中间体M。
往圆底烧瓶中加入2.0g上述得到的中间体M和25mL无水四氢呋喃，搅拌均匀，然后向其中缓慢滴加1.3mol的PEI(MW：600)的四氢呋喃溶液，滴加完毕后，于35℃下搅拌反应20h。将得到的反应溶液冷却至室温后，倒入截留分子量为500的透析袋，流水透析24h，然后去离子水透析12h。且去离子水透析期间，每2h更新一次透出液，透析结束后收集浓缩液低温真空浓缩至刚好有固体物质析出，再将浓缩产物在-20℃条件下预冷冻24h，最后置于冷冻干燥器中冷冻干燥24h，得到单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物(A)。
表征：采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)对单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物(A)的结构进行表征。结果如图1所示。参阅图1，已知红外光谱中3000cm-1处的吸收峰是由酚羟基引起的，1500cm-1处的吸收峰是由苯环引起的。与单宁酸的红外光谱相比，化合物A在1000cm-1处有一个明显的吸收峰，这是由于A中的C-N键所致，说明PEI被成功修饰于单宁酸。
实施例2
往圆底烧瓶中依次加入2.0g单宁酸，25mL无水四氢呋喃，5mL三乙胺，搅拌均匀。在冰水浴条件下，向上述体系中缓慢滴加28mol氯乙酰氯，滴加完毕后，撤去冰水浴，于25℃下继续搅拌反应24h。将反应体系转移至截留分子量为2000的透析袋中，先采用流水透析24h，然后再采用去离子水透析12h。去离子水透析期间，每2h更新一次透出液，透析结束后收集截留液进行低温真空浓缩，再将浓缩产物在-18℃条件下预冷冻26h，最后再置于冷冻干燥器中冷冻干燥24h，得到中间体M。
往圆底烧瓶中加入2.0g上述得到的中间体M和25mL无水四氢呋喃，搅拌均匀，然后向其中缓慢滴加1.3mol的PEI(MW：300)的四氢呋喃溶液，滴加完毕后，于45℃下搅拌反应20h。将得到的反应溶液冷却至室温后，倒入截留分子量为500的透析袋，流水透析22h，然后去离子水透析10h。且去离子水透析期间，每2h更新一次透出液，透析结束后收集浓缩液低温真空浓缩至刚好有固体物质析出，再将浓缩产物在-18℃条件下预冷冻26h，最后置于冷冻干燥器中冷冻干燥22h，得到单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物(A)。
实施例3
往圆底烧瓶中依次加入2.0g单宁酸，25mL无水四氢呋喃，5mL三乙胺，搅拌均匀。在冰水浴条件下，向上述体系中缓慢滴加27mol氯乙酰氯，滴加完毕后，撤去冰水浴，于45℃下继续搅拌反应18h。将反应体系转移至截留分子量为2300的透析袋中，先采用流水透析24h，然后再采用去离子水透析12h。去离子水透析期间，每2h更新一次透出液，透析结束后收集截留液进行低温真空浓缩，再将浓缩产物在-22℃条件下预冷冻22h，最后再置于冷冻干燥器中冷冻干燥25h，得到中间体M。
往圆底烧瓶中加入2.0g上述得到的中间体M和25mL无水四氢呋喃，搅拌均匀，然后向其中缓慢滴加1.4mol的PEI(MW：800)的四氢呋喃溶液，滴加完毕后，于30℃下搅拌反应18h。将得到的反应溶液冷却至室温后，倒入截留分子量为400的透析袋，流水透析26h，然后去离子水透析15h。且去离子水透析期间，每2h更新一次透出液，透析结束后收集浓缩液低温真空浓缩至刚好有固体物质析出，再将浓缩产物在-22℃条件下预冷冻22h，最后置于冷冻干燥器中冷冻干燥26h，得到单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物(A)。
实施例4
往圆底烧瓶中依次加入2.0g单宁酸，25mL无水四氢呋喃，5mL三乙胺，搅拌均匀。在冰水浴条件下，向上述体系中缓慢滴加30mol氯乙酰氯，滴加完毕后，撤去冰水浴，于40℃下继续搅拌反应22h。将反应体系转移至截留分子量为2400的透析袋中，先采用流水透析24h，然后再采用去离子水透析12h。去离子水透析期间，每2h更新一次透出液，透析结束后收集截留液进行低温真空浓缩，再将浓缩产物在-20℃条件下预冷冻25h，最后再置于冷冻干燥器中冷冻干燥22h，得到中间体M。
往圆底烧瓶中加入2.0g上述得到的中间体M和25mL无水四氢呋喃，搅拌均匀，然后向其中缓慢滴加1.2mol的PEI(MW：500)的四氢呋喃溶液，滴加完毕后，于25℃下搅拌反应24h。将得到的反应溶液冷却至室温后，倒入截留分子量为500的透析袋，流水透析24h，然后去离子水透析12h。且去离子水透析期间，每2h更新一次透出液，透析结束后收集浓缩液低温真空浓缩至刚好有固体物质析出，再将浓缩产物在-20℃条件下预冷冻24h，最后置于冷冻干燥器中冷冻干燥24h，得到单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物(A)。
实施例5
往圆底烧瓶中依次加入2.0g单宁酸，25mL无水四氢呋喃，5mL三乙胺，搅拌均匀。在冰水浴条件下，向上述体系中缓慢滴加25mol氯乙酰氯，滴加完毕后，撤去冰水浴，于37℃下继续搅拌反应20h。将反应体系转移至截留分子量为2500的透析袋中，先采用流水透析24h，然后再采用去离子水透析12h。去离子水透析期间，每2h更新一次透出液，透析结束后收集截留液进行低温真空浓缩，再将浓缩产物在-21℃条件下预冷冻23h，最后再置于冷冻干燥器中冷冻干燥26h，得到中间体M。
往圆底烧瓶中加入2.0g上述得到的中间体M和25mL无水四氢呋喃，搅拌均匀，然后向其中缓慢滴加1.5mol的PEI(MW：600)的四氢呋喃溶液，滴加完毕后，于40℃下搅拌反应22h。将得到的反应溶液冷却至室温后，倒入截留分子量为600的透析袋，流水透析24h，然后去离子水透析12h。且去离子水透析期间，每2h更新一次透出液，透析结束后收集浓缩液低温真空浓缩至刚好有固体物质析出，再将浓缩产物在-20℃条件下预冷冻24h，最后置于冷冻干燥器中冷冻干燥24h，得到单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物(A)。
对实施例1至3制得的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物(A)进行检测，检测项目包括细胞毒性检测、琼脂糖凝胶阻滞实验和转染效果检测。具体检测过程及结果如下：
(1)细胞毒性检测：采用噻唑蓝(MTT)比色法评价A的细胞毒性。在含有10％胎牛血清(FBS)和1％双抗(青霉素-链霉素)的DMEM培养基中，将细胞以约1×104个/孔的密度接种于96孔板中，然后在37℃、5％二氧化碳大气中孵化24h。弃去原培养基，加入含有不同浓度A(0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml)的完全培养基；培养24h后弃去含A的完全培养基，PBS冲洗细胞3次。然后每孔加入100mL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，孵育细胞4h，取出MTT溶液，加入二甲基亚砜，溶解晶臜。使用酶标仪测定570nm处的吸光值(A570)。将只加完全培养基的孔作为空白对照，并设置相同浓度的单宁酸和PEI作为对照组。采用公式1计算细胞存活率。本实验对样品进行了三次重复实验。记入下表1中。
公式1：细胞存活率＝A1/A0×100％
其中，A0为空白对照组的A570；A1为对照组或实验组的A570。
表1细胞存活率(％)
Figure BDA0002480955330000121
Figure BDA0002480955330000131
从表1可以看出，同一浓度下，各实施例实验组的细胞存活率均大于PEI对照组，说明A的细胞毒性相较PEI更小；此外，在A浓度达到250μg/ml时，实验组细胞存活率仍在80％以上，即A表现出了较小的细胞毒性，说明单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物具有良好的生物相容性，具有作为一种安全的基因递送载体的潜力。
(2)琼脂糖凝胶阻滞实验
称取各实施例制得的A 0.3g，溶于10ml去离子水中，得样品储液；将样品储液与质粒DNA(如绿色荧光蛋白质粒，GFP plasmid DNA)按N/P比(10:1、20:1、30:1、40:1、50:1)混合，在终浓度为20mM，pH7.4的PBS缓冲液(模拟生理条件)中反应30分钟，反应结束后加入上样缓冲液，取10μL加样于预制好的1％琼脂糖凝胶上样孔中，设置电压60～90V，电泳时间40～60分钟；电泳结束后用溴化乙锭染色凝胶，染色后凝胶通过凝胶成像仪观察并拍照，结果如图2至图4所示。
参阅图2至图4，随着N/P比的增加，各实施例制得的A对pDNA的凝聚能力均逐渐增加，且在N/P比为40时，完全凝聚DNA。结果表明，A在体外具有凝聚DNA的能力，说明本发明方法制得的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物具有凝聚DNA的能力。
(3)转染效果
将A与EGFP-pDNA质粒按N/P比为60:1混合，孵育30min后，加入无血清培养基，再与293T细胞共同培养5小时，然后换成新鲜的含10％胎牛血清的培养液继续培养48小时。使用荧光显微镜在蓝光激发下观察EGFP的表达情况，结果如图5至图7所示。
参阅图5至图7，各实施例分别对应的小图均显示多个绿色荧光(表现为图中的亮点)，说明绿色荧光蛋白可以在细胞内实现表达，表明单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物可以在胞内有效转运并表达DNA，可以作为有效的基因载体。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物，其特征在于，所述单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物具有如下结构式(Ⅰ)所示结构：
Figure FDA0002480955320000011
其中，
Figure FDA0002480955320000012
2.一种如权利要求1所述的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将单宁酸、无水四氢呋喃、三乙胺混合后，加入氯乙酰氯，乙酰化反应生成中间体M；
将所述中间体M与无水四氢呋喃混合后，加入聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液，于25～45℃下搅拌，使反应生成单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物；
其中，所述中间体M具有如下结构式(Ⅱ)所示结构：
Figure FDA0002480955320000013
其中，
Figure FDA0002480955320000021
3.如权利要求2所述的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法，其特征在于，将单宁酸、无水四氢呋喃、三乙胺混合后，加入氯乙酰氯，乙酰化反应生成中间体M的步骤中，每克单宁酸对应加入12.5～15mol氯乙酰氯。
4.如权利要求2所述的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法，其特征在于，将单宁酸、无水四氢呋喃、三乙胺混合后，加入氯乙酰氯，乙酰化反应生成中间体M的步骤包括：
将单宁酸、无水四氢呋喃、三乙胺混合并搅拌均匀后，置于冰水浴中，滴加氯乙酰氯；
滴加完毕后，撤去冰水浴，搅拌使发生乙酰化反应形成混合溶液；
对所述混合溶液进行分离提纯以获得浓缩产物，将所述浓缩产物干燥处理，得到中间体M。
5.如权利要求4所述的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法，其特征在于，滴加完毕后，撤去冰水浴，搅拌使发生乙酰化反应形成混合溶液的步骤中，所述乙酰化反应的温度为25～45℃；和/或，
所述乙酰化反应的时间为18～24h。
6.如权利要求4所述的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法，其特征在于，对所述混合溶液进行分离提纯以获得浓缩产物，将所述浓缩产物干燥处理，得到中间体M的步骤包括：
采用截留分子量为2000～2500的透析袋，对所述混合溶液进行透析；
收集截留液进行低温真空浓缩以获得浓缩产物；
将所述浓缩产物在-18～-22℃条件下预冷冻22～26h后，冷冻干燥22～26h，得到中间体M。
7.如权利要求2所述的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法，其特征在于，将所述中间体M与无水四氢呋喃混合后，加入聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液，于25～45℃下搅拌，使反应生成单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的步骤中，每克所述中间体M对应加入0.6～0.75mol聚乙烯亚胺。
8.如权利要求2所述的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法，其特征在于，将所述中间体M与无水四氢呋喃混合后，加入聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液，于25～45℃下搅拌，使反应生成单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的步骤中，所述聚乙烯亚胺的分子量为300～800。
9.如权利要求2所述的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法，其特征在于，将所述中间体M与无水四氢呋喃混合后，加入聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液，于25～45℃下搅拌，使反应生成单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的步骤包括：
将所述中间体M与无水四氢呋喃混合并搅拌均匀后，向其中滴加聚乙烯亚胺的四氢呋喃溶液，滴加完毕后，于25～45℃下搅拌反应18～24h，形成反应溶液；
将冷却后的所述反应溶液置于截留分子量为400～600的透析袋中，流水透析22～26h后，去离子水透析10～15h，收集浓缩液；
将所述浓缩液进行低温真空浓缩后，于-18～-22℃条件下预冷冻22～26h，然后冷冻干燥22～26h，得到单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物。
10.一种基因载体，其特征在于，所述基因载体包括如权利要求2至9任意一项所述的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物的制备方法制得的单宁酸修饰聚乙烯亚胺化合物。
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