CN113384480A - 一种大鲵肽-富勒烯复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于复合物技术领域，特别是涉及一种大鲵肽‑富勒烯复合物及其制备方法和应用。本发明提供的大鲵肽‑富勒烯复合物为大鲵肽和水溶性富勒烯形成的结合体。水溶性富勒烯经修饰后不仅失去了对人皮肤成纤维细胞产生毒性的缺陷，还能够促进人皮肤成纤维细胞的增殖，同时还有美白的功效。将0.05～1.00mg/mL浓度的大鲵肽‑富勒烯复合物与人皮肤成纤维细胞共培养48h后，不仅没有出现细胞毒性，人皮肤成纤维细胞的存活率高达101％～355％，同时，大鲵肽‑富勒烯复合物还具有酪氨酸酶抑制率，大鲵肽‑富勒烯复合物的浓度为50mg/mL时，抑制率高达83.52％。

Description

一种大鲵肽-富勒烯复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于复合物技术领域，特别是涉及一种大鲵肽-富勒烯复合物及其制备方法和应用。
背景技术
富勒烯是由碳组成的中空的球形、椭球形和柱形分子的总称。富勒烯表面有大量易于与自由基反应的共价双键，因此，它可以作为体内的抗氧化剂。然而富勒烯不容于水，限制了它的应用。为了使其能被人体吸收利用，人们对富勒烯进行化学修饰使其具有水溶性。但是对现有的水溶性富勒烯的生物毒性评估表明，当水溶性富勒烯的浓度为7.5μg/mL时，水溶性富勒烯与人皮肤成纤维细胞共孵育48h以内，对人皮肤成纤维细胞产生微小毒性，当水溶性富勒烯浓度大于7.5μg/mL时，或者与人皮肤成纤维细胞共孵育时间大于48h时，水溶性富勒烯则对人皮肤成纤维细胞产生显著毒性。只有减轻水溶性富勒烯的生物毒性，才能更好地发挥富勒烯清除自由基的作用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种大鲵肽-富勒烯复合物及其制备方法和应用。本发明提供的大鲵肽-富勒烯复合物不仅对人皮肤成纤维细胞无毒，而且还能够促进人皮肤成纤维细胞的生长，同时还具有美白的作用。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种大鲵肽-富勒烯复合物，包括大鲵肽和水溶性富勒烯。
优选的，所述大鲵肽的制备方法包括对大鲵组织匀浆依次进行首次酶解和再次酶解，得到大鲵肽；
所述首次酶解用酶为复合酶，所述再次酶解用酶为酸性蛋白酶。
优选的，所述复合酶的重量为大鲵组织匀浆的0.1％～1.0％；
所述首次酶解的温度为35℃～45℃，时间为12～48h。
优选的，所述复合酶包括酸性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶，以酶活力计，所述酸性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活力比为：(5～8):(2～3):(2～3):(1～2)；
所述酸性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活力单位均≥800000U/g。
优选的，所述再次酶解前还包括对首次酶解获得的产物进行处理获得冻干粉；所述酸性蛋白酶的重量为冻干粉的0.1％～1.0％；
所述再次酶解的温度为35℃～45℃，时间为12～48h。
优选的，所述再次酶解前还包括对首次酶解所得产物进行处理获得冻干粉，以冻干粉形式进行再次酶解。
本发明还提供了上述大鲵肽-富勒烯复合物的制备方法，包括以下步骤：
(Ⅰ)调节大鲵肽水溶液的pH值至5.00～6.00与水溶性富勒烯混合，得到半成品溶液；
(Ⅱ)将所述半成品溶液冷藏，得到成品溶液；
(Ⅲ)采用150D纳滤膜过滤所述成品溶液，得到大鲵肽-富勒烯复合物。
优选的，步骤(Ⅰ)中，所述大鲵肽水溶液液中大鲵肽与水溶性富勒烯的质量比为(1～2):(5～10)。
本发明提供了上述大鲵肽-富勒烯复合物或上述制备方法制备得到的大鲵肽-富勒烯复合物在制备美白效果产品中的应用。
本发明提供了上述大鲵肽-富勒烯复合物或上述制备方法制备得到的大鲵肽-富勒烯复合物在制备促进细胞增殖产品中的应用。
本发明提供了一种大鲵肽-富勒烯复合物，所述大鲵肽-富勒烯复合物为大鲵肽和水溶性富勒烯形成的结合体。本发明提供的大鲵肽-富勒烯复合物是由大鲵肽和水溶性富勒烯形成的复合物，水溶性富勒烯经大鲵肽修饰后不仅失去了对人皮肤成纤维细胞产生毒性的缺陷，还能够促进人皮肤成纤维细胞的增殖，同时还有美白的功效。由实施例可知，将0.05～1.00mg/mL浓度的大鲵肽-富勒烯复合物与人皮肤成纤维细胞共培养48h后，不仅没有出现细胞毒性，人皮肤成纤维细胞的存活率高达101％～355％，同时，大鲵肽-富勒烯复合物还具有酪氨酸酶抑制率，大鲵肽-富勒烯复合物的浓度为50mg/mL时，抑制率高达83.52％。
附图说明
图1为实施例1制备得到的大鲵肽-富勒烯复合物的红外光谱测试图；
图2为人皮肤成纤维细胞与1mg/mL浓度的大鲵肽-富勒烯复合物共孵育48h后的细胞活性。
具体实施方式
本发明提供了一种大鲵肽-富勒烯复合物，包括大鲵肽和水溶性富勒烯。在本发明中，所述大鲵肽和水溶性富勒烯的结合方式优选为：将大鲵肽的羧基端与水溶性富勒烯的羟基相缩合。本发明以大鲵肽对富勒烯进行修饰得到的大鲵肽-富勒烯复合物能够起到促进人皮肤成纤维细胞的增殖作用，还有抑制酪氨酸酶的作用，起到美白的技术效果。
在本发明中，所述大鲵肽的制备方法优选包括对大鲵组织匀浆依次进行首次酶解和再次酶解，得到大鲵肽；
所述首次酶解用酶为复合酶，所述再次酶解用酶为酸性蛋白酶。
本发明经过特定方式对大鲵组织进行酶解，得到的大鲵肽对富勒烯修饰效果更佳，以此得到的大鲵肽-富勒烯复合物对人皮肤成纤维细胞的增殖促进作用更突出，并且对酪氨酸酶有更高抑制性，进而美白效果进一步提升。
本发明优选对大鲵肉匀浆后获得大鲵组织匀浆。本发明对匀浆方式没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的即可。
获得大鲵组织匀浆后，本发明优选将所述大鲵组织匀浆与磷酸缓冲液和复合酶混合后进行首次酶解，得到酶解混合物。在本发明中，所述磷酸缓冲液的浓度优选为0.01～0.1M，进一步优选为0.01M，pH值优选为4～5；所述磷酸缓冲液与大鲵组织匀浆的体积比优选为(1～3):1，进一步优选为(2～3):1，最优选为3:1。本发明使用上述条件的磷酸缓冲液调节组织匀浆，有利于提高后续酶解的效率。
在本发明中，所述复合酶优选包括酸性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶；以酶活力计，所述酸性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活力比优选为(5～8):(2～3):(2～3):(1～2)，进一步优选为(5～6):(2～3):(2～3):(1～2)，最优选为5:2:2:1；所述酸性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活力单位优选均≥800000U/g；所述复合酶的重量优选为大鲵组织匀浆的0.1％～1.0％，进一步优选为0.1％～0.5％，最优选为0.1％。本发明使用复合酶能够解决复杂且精细的蛋白质水解过程，以便于有效酶解，获得目标产物。
在本发明中，所述首次酶解的温度优选为35℃～45℃，进一步优选为37℃；所述首次酶解的时间优选为12～48h，进一步优选为12h。本发明经过首次酶解，能够初步获得大鲵肽。
本发明优选将首次酶解产物进行再次酶解，得到大鲵肽。
再次酶解前，本发明优选对首次酶解混合物进行处理获得冻干粉，以冻干粉作为首次酶解产物进行再次酶解。
本发明优选对首次酶解混合物进行首次离心处理得到上清液A。在本发明中，所述离心时的转速优选为3000rmp，离心的时间优选为20min。
得到上清液A后，本发明优选对上清液A进行分离，对分离得到的产物进行冷冻干燥得到冻干粉。在本发明中，所述分离的方法优选包括：采用截留分子量为2000Da的超滤膜分离上清液A。在本发明的实施例中，所述分离具体采用超滤膜分离器进行。本发明经过特定条件的分离能够高效的获得目标产物。
本发明优选将首次酶解产物先与氨基酸混合物混合得到混合物A，将混合物A与磷酸缓冲液和酸性蛋白酶混合，再依次进行再次酶解和灭酶处理，得到混合物B；得到混合物B后，本发明对混合物B进行再次离心后得到上清液B，采用截留分子量为1000Da的超滤膜过滤上清液B，得到大鲵肽。在本发明中，所述氨基酸混合物优选包括天冬氨酸和谷氨酸，所述天冬氨酸和谷氨酸的质量比优选为1:(1～10)，进一步优选为1:(1～5)，最优选为1:1；所述氨基酸混合的用量以酶解产物所得冻干粉的质量为基准，所述冻干粉与氨基酸混合物的质量比优选为1:(1～10)，进一步优选为1:(1～5)，最优选为1:1。
在本发明中，所述磷酸缓冲液的浓度优选为0.01～0.1M，进一步优选为0.01M，pH值优选为5.00～6.00，进一步优选为5；所述磷酸缓冲液与混合物A的体积比优选为(1～3):1，进一步优选为(2～3):1，最优选为3:1。
在本发明中，所述酸性蛋白酶的重量优选为冻干粉的0.1％～1.0％，进一步优选为0.1％～0.5％，最优选为0.1％。本发明利用酸性蛋白酶能够酶解获得特定的酶解产物。
在本发明中，所述再次酶解的温度优选为35℃～45℃，进一步优选为37℃；所述再次酶解的时间优选为12～48h，进一步优选为12h。
所述灭酶时需要在酶解结束后迅速进行灭酶处理，以避免过度酶解。在本发明中，所述灭酶的方法优选为水浴灭酶法，温度优选为95℃～105℃，进一步优选为95℃，时间优选为10～20min，进一步优选为15min。
得到混合物B后，本发明对混合物B进行再次离心后得到上清液B，采用截留分子量为1000Da的超滤膜过滤上清液B，得到大鲵肽。本发明优选将混合物B冷却至室温后，对经过冷却的混合物B进行再次离心处理。在本发明中，所述过滤的方法优选包括以下步骤：采用截留分子量为1000Da的超滤膜过滤上清液B；所述再次离心处理时，转速优选为4000～10000rpm，进一步优选为6000rpm，离心的时间优选为15～30min，进一步优选为20min。本发明进行再次离心处理和过滤的目的是为了除去酶。
本发明还提供了上述技术方案所述大鲵肽-富勒烯复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(Ⅰ)调节大鲵肽水溶液的pH值至5.00～6.00与水溶性富勒烯混合，得到半成品溶液；
(Ⅱ)将所述半成品溶液冷藏，得到成品溶液；
(Ⅲ)采用150D纳滤膜过滤所述成品溶液，得到大鲵肽-富勒烯复合物。
本发明将经由上述制备方法制备得到的大鲵肽溶于蒸馏水中，得到大鲵肽水溶液。
得到大鲵肽水溶液后，本发明将大鲵肽水溶液的pH值调节至5.00～6.00与水溶性富勒烯混合，得到半成品溶液。在本发明中，所述混合液的pH值优选为5.61；所述大鲵肽与水溶性富勒烯质量比优选为(1～2):(1～10)，进一步优选为1:(5～10)，最优选为1:10。本发明对所述水溶性富勒烯的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的即可。在本发明中，所述水溶性富勒烯优选为富含羟基的富勒烯。在本发明的实施例中，使用的是厦门福纳新材料科技有限公司出产的纯度为99.9％的水溶性富勒烯。本发明在大鲵肽和水溶性富勒烯的反应过程中，额外添加大量的水溶性富勒烯是为了让大鲵肽在酸性条件下更容易键合，与水溶性富勒烯反应充分。
得到半成品溶液后，本发明将半成品溶液冷藏，得到成品溶液。在本发明中，所述冷藏的温度优选为1℃～10℃，进一步优选为4℃，冷藏的时间优选为10～24h，进一步优选为12h。本发明将成品溶液进行冷藏是为了让大鲵肽和富勒烯充分反应。
得到成品溶液后，本发明采用150D纳滤膜过滤所述成品溶液，得到大鲵肽-富勒烯复合物。在本发明中，过滤成品溶液的目的是为了去除未反应的水溶性富勒烯。
如无特殊说明，本发明对上述涉及到的材料的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
本发明还提供了上述技术方案所述大鲵肽-富勒烯复合物或上述述技术方案所述制备方法制备得到的大鲵肽-富勒烯复合物在制备美白效果产品中的应用。在本发明中，所述美白产品优选包括化妆品、药品等。本发明提供的应用能够有效抑制酪氨酸酶，当大鲵肽-富勒烯复合物的浓度为50mg/mL时，酪氨酸酶的抑制率高达83.52％。
本发明还提供了上述的大鲵肽-富勒烯复合物或上述述制备方法制备得到的大鲵肽-富勒烯复合物在制备促进细胞增殖产品中的应用。在本发明中，所述促进细胞增殖的产品优选包括化妆品、药品等。本发明提供的应用解决了不溶于水的富勒烯在应用过程中造成的环境污染，还解决了水溶性富勒烯的细胞毒性，当大鲵肽-富勒烯复合物与人皮肤成纤维细胞共培养48h后，不仅没有出现细胞毒性，人皮肤成纤维细胞的存活率高达101％～355％，能够有效促进细胞增殖。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种大鲵肽-富勒烯复合物及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将大鲵肉匀浆，得到组织匀浆，向组织匀浆中加入3倍体积的磷酸缓冲液(pH值为4～5，浓度为0.01M)，重量为组织匀浆0.1％的复合酶，在37℃条件下，酶解12h，得到酶解混合物；
复合酶为酸性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶，以酶活力计，酸性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活力比为5:2:2:1；酸性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶的活力单位均分别≥800000U/g；
离心酶解混合物取上清液A，采用截留分子量为2000Da超滤膜分离器分离上清液A，取透过超滤膜的液体，冷冻干燥，得到冻干粉；
将冻干粉与氨基酸混合物(天冬氨酸与谷氨酸以质量比1:1混合)混合得到混合物A，将混合物A与3倍体积的磷酸缓冲液(pH值为5，浓度为0.01M)及与冻干粉质量比为0.1％的酸性蛋白酶，在37℃条件下酶解12h后，迅速在95℃水浴中灭酶15min，冷却至室温后，在6000rpm条件下离心20min，得到上清液B；
冻干粉与氨基酸混合物的质量比为1:1；酸性蛋白酶的活力单位≥800000U/g；
将上清液B经过截留分子量为1000Da超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体，冷冻干燥得到大鲵肽；
按照大鲵肽溶于蒸馏水中，调节pH至5.61，然后加入水溶性富勒烯，进行混合，得到半成品溶液；
大鲵肽与水溶性富勒烯质量比为1:10；
将半成品溶液置于冰箱中冷藏12h后，利用150D纳滤膜除去未反应的水溶性富勒烯，将未透过纳滤膜的液体冻干，即得大鲵肽-富勒烯复合物。
对制备得到的大鲵肽-富勒烯复合物进行红外光谱测试，结果如图1所示。图1中，3295、3012和1615cm-1处吸收峰对应着-NH伸缩振动、-CH2伸缩振动和-C＝O伸缩振动，1038cm-1处为C-N伸缩振动峰，证明大鲵肽被键合至水溶性富勒烯上(依据张孝焱等所著精细化工，2019,36(4):582-587判断)。
实施例2
按照实施例1的方式制备大鲵肽-富勒烯复合物，区别在于将制备得到的大鲵肽溶于蒸馏水中，调节pH至5.00，然后加入水溶性富勒烯，进行混合，得到半成品溶液；大鲵肽与水溶性富勒烯质量比为1:5。
实施例3
按照实施例1的方式制备大鲵肽-富勒烯复合物，区别在于将制备得到的大鲵肽溶于蒸馏水中，调节pH至6.00，然后加入水溶性富勒烯，进行混合，得到半成品溶液；大鲵肽与水溶性富勒烯质量比为1:1。
应用例1
取处于对数生长期的人皮肤成纤维细胞，用胰蛋白酶消化，制成细胞密度为4×104个/ml的悬液。取100μL细胞悬液接种于96孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞贴壁生长良好、细胞密度达到50％左右时，分别加入不同浓度(0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL和1.0mg/mL)的实施例1提供的大鲵肽-富勒烯进行共孵育。在48h于每孔中加入10μLMTS，混匀后继续在培养箱中共孵育3.5h。用酶标仪测定450nm吸光值，计算细胞存活率，结果见表1，人皮肤成纤维细胞与1mg/mL浓度的大鲵肽-富勒烯复合物共孵育48h后的细胞活性见图2。
计算细胞存活率：
细胞存活率％＝(OD大鲵肽-富勒烯共孵育组/OD空白对照组)×100％
(OD空白对照组为不含有大鲵肽-富勒烯复合物的蒸馏水)表1人皮肤成纤维细胞与大鲵肽-富勒烯复合物共培养后的细胞存活率
Figure BDA0003119718070000091
由表1可知，随着低分子量大鲵肽-富勒烯浓度的增加，人皮肤成纤维细胞显著增加，这表明本发明实施例大鲵肽-富勒烯可以显著促进人皮肤成纤维细胞增殖作用，并且没有细胞毒性。
由图2可知，图2中细胞均处于存活状态，且形态正常，说明本发明提供的大鲵肽-富勒烯复合物与人皮肤成纤维细胞共培养后能够保持细胞活性。
应用例2
按照表2提供的各组药物组成，分别在试管(A1、A2、A3和A4)中加入磷酸缓冲液、实施例1提供的大鲵肽-富勒烯复合物溶液、L-酪氨酸溶液，于30℃水浴10min后加入酪氨酸酶溶液，摇匀反应10min后立即在475nm处测定吸光度值。按照如下公式计算酪氨酸酶抑制率：酪氨酸酶抑制率＝[(A3-A4)/(A1-A2)]×100％。
表2酪氨酸酶抑制率检测中各组药物组成
Figure BDA0003119718070000092
根据上述检测方法，本发明对实施例1提供的大鲵肽-富勒烯复合物、谷胱甘肽-富勒烯复合物和大鲵肽(实施例1制备得到的)对酪氨酸酶抑制作用结果见表3。谷胱甘肽-富勒烯复合物根据(张孝焱，马艺函，张爱清.谷胱甘肽-富勒烯光敏剂的合成及动力学.精细化工，2019,36(4)：582-587)中公开的方法制备获得的。
表3不同物质对酪氨酸酶的抑制率
Figure BDA0003119718070000101
由表3可知，本发明提供的大鲵肽-富勒烯复合物能够有效起到抑制酪氨酸酶的作用，发挥美白的效果。同时本发明提供的大鲵肽-富勒烯复合物的酪氨酸酶抑制率显著高于其物质，具有更强的美白效果。
同样，按照应用例1和应用例2的方式对实施例2和3所得大鲵肽-富勒烯复合物进行了细胞毒性及美白效果进行了验证，均能得到使得细胞存活率明显提升，具有较好美白效果的结果。
综上可知，本发明提供的用大鲵肽修饰水溶性富勒烯，能够提高细胞存活率，促进细胞增殖，避免了水溶性富勒烯的细胞毒性，同时还具有良好的美白效果，还兼顾对环境友好的优势。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种大鲵肽-富勒烯复合物，包括大鲵肽和水溶性富勒烯。
2.根据权利要求1所述的大鲵肽-富勒烯复合物，其特征在于，所述大鲵肽的制备方法包括：对大鲵组织匀浆依次进行首次酶解和再次酶解，得到大鲵肽；
所述首次酶解用酶为复合酶，所述再次酶解用酶为酸性蛋白酶。
3.根据权利要求2所述的大鲵肽-富勒烯复合物，其特征在于，所述复合酶的重量为大鲵组织匀浆的0.1％～1.0％；
所述首次酶解的温度为35℃～45℃，时间为12～48h。
4.根据权利要求2或3所述的大鲵肽-富勒烯复合物，其特征在于，所述复合酶包括酸性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶，以酶活力计，所述酸性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活力比为：(5～8):(2～3):(2～3):(1～2)；
所述酸性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活力单位均≥800000U/g。
5.根据权利要求2所述的大鲵肽-富勒烯复合物，其特征在于，所述酸性蛋白酶的重量为冻干粉的0.1％～1.0％；
所述再次酶解的温度为35℃～45℃，时间为12～48h。
6.根据权利要求2所述的大鲵肽-富勒烯复合物，其特征在于，所述再次酶解前还包括对首次酶解所得产物进行处理获得冻干粉，以冻干粉形式进行再次酶解。
7.权利要求1～6任一项所述大鲵肽-富勒烯复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(Ⅰ)调节大鲵肽水溶液的pH值至5.00～6.00与水溶性富勒烯混合，得到半成品溶液；
(Ⅱ)将所述半成品溶液冷藏，得到成品溶液；
(Ⅲ)采用150D纳滤膜过滤所述成品溶液，得到大鲵肽-富勒烯复合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(Ⅰ)中，所述大鲵肽水溶液液中大鲵肽与水溶性富勒烯的质量比为(1～2):(5～10)。
9.权利要求1～6任一项所述大鲵肽-富勒烯复合物或权利要求7或8所述制备方法制备得到的大鲵肽-富勒烯复合物在制备美白效果产品中的应用。
10.权利要求1～6任一项所述大鲵肽-富勒烯复合物或权利要求7或8任一项所述制备方法制备得到的大鲵肽-富勒烯复合物在制备促进细胞增殖产品中的应用。
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